CN110018319A - 与gdm辅助早期诊断相关的血清/血浆多肽标志物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与GDM辅助早期诊断相关的血清/血浆多肽标志物。与妊娠期糖尿病辅助早期诊断相关的血清/血浆多肽标志物，选自Q9Y4H2，或Q9Y4H2与选自Q6PFW1、P35658、P32004中的任意一个多肽或两个个多肽的组合。本发明所述的血清/血浆多肽标志物作为检测靶点在制备妊娠期糖尿病辅助早期诊断试剂中的应用。检测孕妇血清/血浆中上述标记物表达量能用于GDM辅助早期诊断。为临床医生准确预测孕妇的GDM发病结局，及时采取更具个性化的防治方案提供支持，从而最大限度的降低GDM的发病率，减少不良妊娠结局。

Description

与GDM辅助早期诊断相关的血清/血浆多肽标志物

分案说明

本申请是申请日为2018年9月6日，申请号为2018110390312，发明名称为“与妊娠期糖尿病辅助早期诊断相关的血清/血浆多肽标志物及其应用”的中国发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于蛋白质组学领域，涉及与GDM辅助早期诊断相关的血清/血浆多肽标志物。

背景技术

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是指妊娠期发生或首次发现的不同程度的葡萄糖耐量异常，若发生在妊娠早期不排除葡萄糖耐量异常在妊娠前就已经存在的可能性。GDM是最常见的妊娠期合并症之一，约有3％-8％的孕妇在妊娠期间出现GDM，尤为值得关注的是，随着育龄妇女肥胖率的增加，GDM的发生率不断上升。

GDM可给母体及胎儿带来一系列的并发症，如增加自然流产发生率、妊娠高血压综合征、羊水过多等，也增加了巨大儿、肩难产、产伤、早产、胎儿发育异常、胎儿宫内窘迫、死胎、死产发生率；并使新生儿易发生低血糖症、高胆红素血症，呼吸窘迫综合征、红细胞增多症等，同时增加了孕产妇发生2型糖尿病、代谢疾病和心血管疾病的风险。如果不及时进行诊断和治疗，不仅孕产妇及胎婴儿患病率和病死率将明显上升，产妇及其后代远期糖尿病患病率也将上升。因此，早期诊断、早期干预、及时合理治疗是预防GDM、减少母婴合并症的关键，是亟待解决的重大科学问题。

目前国际上对GDM的筛查和诊断方法及标准尚未完全统一，通常GDM需在第2孕期晚期或第3孕期才能进行诊断，根据美国糖尿病协会(American Diabetes Association，ADA) 和美国妇产科学会(American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG)指南，GDM 的血清学筛查在24-28孕周进行，这样可用于干预时间少之又少。因此，我们亟需发现更加明确而有效的生物标志物，对GDM做出辅助早期诊断，这将有助于早期干预，减少不良妊娠结局。

多年来，人们一直在研究基因和蛋白质组学，以寻找各种疾病的生物标志物。然而由于基因和蛋白质组学的特性，它们并不是常规分娩到生物液中，故而生物标志物的探索之路非常困难。而低分子量肽和分子质量的蛋白水解碎片被频繁地分泌到血清中，因此，多肽组学正成为血清生物标志物的研究的重点。

多肽组学，被定义为是对生物样本中肽的全面定性和定量分析。在体液或组织中产生的循环蛋白碎片可反映生物事件，并为诊断生物标记提供了丰富的库。现今，许多肽都被用来作为癌症的生物标志物。例如，血浆纤维蛋白1可以作为筛查和诊断肾细胞癌的一种手段，在肾细胞癌的早期，血浆纤维蛋白1水平上升。

现有的成熟多肽技术，包括对肽的定性和定量测定，表明利用血清肽作为分子生物标志物的方法比传统的特异蛋白分子标记方法将更加有效，为生物标志物开拓了新境界。

然而，目前还没有用于GDM辅助早期诊断的较为稳定的生物标志物的报道，若能筛选出GDM特异或异常表达的血清/血浆肽作为生物标志物，并研制相应的辅助早期诊断试剂盒，对我国GDM的诊断现状必将是一次有力的推动。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种与GDM辅助早期诊断相关的血清/血浆肽标志物。

本发明的另一目的是提供所述标志物的应用。

本发明的又一目的是提供一种GDM辅助早期诊断试剂盒。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

与妊娠期糖尿病辅助早期诊断相关的血清/血浆多肽标志物，其特征在于该标志物选自 Q6PFW1、P35658、P32004和Q9Y4H2中的任意一个多肽或多个多肽；其中Q6PFW1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，P35658的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，P32004的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，Q9Y4H2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

其中，Q6PFW1的前蛋白为肌醇己二磷酸和二磷酸肌醇/五磷酸激酶1(Inositolhexakisphosphate and diphosphoinositol-pentakisphosphate kinase 1)；P35658的前蛋白为核孔复合蛋白(Nuclear pore complex protein Nup214)；P32004的前蛋白为神经细胞粘附分子L1 (Neural cell adhesion molecule L1)；Q9Y4H2的前蛋白为胰岛素受体底物2(Insulin receptor substrate 2)。

本发明所述的血清/血浆多肽标志物作为检测靶点在制备妊娠期糖尿病辅助早期诊断试剂中的应用。

一种妊娠期糖尿病辅助早期诊断试剂盒，包含检测所述的血清/血浆多肽标志物的试剂；

所述的妊娠期糖尿病辅助早期诊断试剂，优选包含Q6PFW1、P35658、P32004和Q9Y4H2 中的任意一个多肽或多个多肽的ELISA检测试剂。

有益效果：

本发明采用严密的设计和评价体系，成熟的多肽实验方法获取疾病特异和异常表达的血清/血浆多肽，并随机挑选多肽进行验证，保证实验结果的稳定性。

本发明通过控制年龄等对疾病发展的影响因素，研究血清/血浆多肽标志物在GDM早期诊断的应用前景，阐述异常表达的多肽标志物对于GDM进展的影响，揭示其筛查和早期诊断价值。因此，本发明获得了GDM发病特异性血清/血浆多肽表达数据库和特异性标志物；通过测定血清/血浆多肽标志物，可使得GDM的早期诊断更加方便易行，为临床医生准确预测孕妇的GDM发病结局，及时采取更具个性化的防治方案提供支持，从而最大限度的降低GDM的发病率，减少不良妊娠结局。同时本发明帮助临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

附图说明

图1本发明多肽标志物的发现路线图

此图为本研究的技术路线图，包括早期血清样本的采集、差异多肽的筛选、差异多肽的选择性验证等。

图2本发明血清多肽标记物的选择性验证

在血清差异多肽筛选的基础上，选择7条在GDM转归组高表达或者只在GDM转归组表达的差异多肽，采集正常组和GDM转归组的早期血清各30例，应用质谱的方法进行验证。A图为正常转归组和GDM转归组中P35658的表达对比图，B图为正常转归组和GDM转归组中Q6PFW1的表达对比图，C图为正常转归组和GDM转归组中P32004的表达对比图，D图为正常转归组和GDM转归组中Q9Y4H2的表达对比图。

具体实施方式

实施例1、样品的收集和样品资料的整理

发明人于2015年4月至8月从南京市妇幼保健院收集了大量的14-18孕周孕妇的外周血样品(用于研究的样本为同期收取，采样、分装、保存条件均一)，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了200例符合下列标准的样本作为实验样品：

1、采血时为14-18孕周健康孕妇

2、上述研究对象在24-28孕周GDM筛查时经OGTT确诊为GDM的孕妇定义为病例

3、上述研究对象在24-28孕周GDM筛查时未发生GDM，与病例年龄、BMI、孕周匹配的健康孕妇定义为对照并系统采集了这些样本的人口学资料、临床资料等情况。

实施例2、样品制备、蛋白质组学(多肽组学)筛选及生物信息学分析

将上述符合条件的100例GDM病例和100例健康对照，进行超滤、TMT、LC-MS/MS 等实验，具体步骤为：

血清/血浆中样本的采集准备和超滤

1、将样本在4℃环境下以每分钟3000转的速度离心15分钟，将上层样本储存在-20℃，等待进一步的分析。通常能得到200-250ul血清或血浆。

2、将样本在4℃环境下以每分钟12000转的速度离心15分钟，丙烯氰加入离心的上层清液中，然后进行短暂的涡旋，室温下放置20分钟，然后根据说明书使用，使用10kDaMWCO过滤器(Millipore,USA)，获取10kDa以下的肽并冻干。

3、通过使用BCA(Pierce,Rockford,IL,USA)来测量蛋白的浓度。

4、进行肽淡化及使用TMT(TMT 6-plex Label Reagent,Thermo Scientific)标记。100ug 以下的多肽将会减少，通过使用60的10mMDTT清洗1个小时，并且在室温下使用55mMIAA烷基化45分钟，最后在vacuo淡化和干燥。基于总胎量，在室温下用等压标签标记AF肽需要一个小时。根据TMT使用说明书，TMT的结果是通过对等压标签组合的分析得出的。三个正常的AF样本被标记为试剂126、127、和128，而三个室间隔缺损的AF 样本册被标记为129、130和131。

6.使用液相色谱串联质谱法(Thermofisher Scientific Inc.、Easy-nLC，Thermofisher Scientific Inc.，San Jose，CA)对肽进行分析。使用缓冲液A(2％乙腈，0.5％乙酸)和缓冲液B(80％乙腈，0.5％乙酸)以梯度进行肽的反相分离。将洗脱的肽在1.8kV电压下喷射到配置为利用电喷雾过程中产生的离子(m/z 445.12002)过程中产生的聚二甲基环硅氧烷的锁定质量特征收集高分辨率(在m/z 400处R＝60,000)宽带质谱(m/z375-1800) 的质谱仪。使用35％的相对碰撞诱导解离(CID)能量选择从MS扫描动态确定的20种最丰富的肽分子离子用于串联质谱。选择MS2步骤中最强烈的产物离子用于更高能量碰撞诱导解离(HCD)MS3碎裂。

7.使用PEAKS软件(版本7.0，Bioinformatics Solutions，Waterloo，Canada)对肽进行识别。使用PEAKS软件(版本7.0，Bioinformatics Solutions，Waterloo，Canada)，对包含20,194个人蛋白质序列(2015年5月发布)的数据库搜索提取的MS/MS谱。融合目标-诱饵方法被用于估计错误发现率(FDR)，并且在蛋白质和肽水平均被设定为≤1％ (-10logP≥20.0)。只有当每个样品至少有两个光谱存在肽峰时才认为肽被正确鉴定。

8.在PEAKS Q模板中使用TMT标记法对肽进行相对定量。使用PEAKS Q模块中的TMT标记方法进行血清肽的相对定量。使用期望最大化算法分别对每个样本执行特征检测。使用高性能保留时间比对算法对来自不同样品的相同肽的特征进行比对。当p值<0.05且倍数变化>1.5时，认为肽和蛋白质在血清样品之间有显著改变。确定的结果包括在TMT 标记定量的最后一步中。

9.利用pI/Mw在线工具计算出每种肽的等电点(pI) (http://web.expasy.org/compute__pi/)。

10.利用路径和基因本体论(GO)分析(http://geneontology.org)确定潜在的生理功能。 GO结果包括三个类别：细胞成分、生物过程和分子功能。

11.利用IPA软件v7.1(Ingenuity Systems,Mountain View,CA)进一步分析之前所述的路径，以进一步探讨差异肽和前蛋白的意义。

12.利用Ingenuity Systems Knowledge Base生成相关蛋白功能网络。

13.利用MEROPS database(http://merops.sanger.ac.uk)为特定的卵裂点寻找候选酶。

根据用LC-MS/MS，本发明人检测到在“妊娠期糖尿病例”组和“健康女性对照”组的血清中存在差异表达的肽共297个(见表1)，而这些差异肽共有228个前蛋白，结果见表1。

表1 297个差异肽

备注：蛋白质序列号来源于数据库SWISS-PROT(Protein Sequence Database)(http://www.expasy.ch/sprot/sprot-top.html)。C：对照组；G：GDM组，G/C：GDM组表达量与对照组表达量的比值；T：T检验的T值

实施例3、随机验证

根据上述结果，随机选择7条在GDM转归组显著高表达或者只在GDM转归组表达的差异多肽作为验证目标，在我们早期建立的孕14-18周血清库中，选择正常转归组和GDM 转归组的血清样本各30例(两组年龄、BMI、孕周相互匹配)，进一步验证我们初筛的结果，研究证实7条多肽中，有4条(Q6PFW1、P35658、P32004和Q9Y4H2)的表达模式与初筛结果基本一致(表2)，在两组间的表达情况存在显著性差异，提示与妊娠期糖尿病发病相关联，它们有可能成为GDM早期预测和诊断的分子标记物(图2)。

表2 7条验证的多肽

注：1.粗体部分为验证结果与初筛结果基本一致的4条多肽

2.蛋白质序列号来源于数据库SWISS-PROT(Protein Sequence Database)(http://www.expasy.ch/sprot/sprot-top.html)。C：对照组；G：GDM组，G/C：GDM组表达量与对照组表达量的比值；T：T检验的T值。

序列表

<110> 南京市妇幼保健院

<120> 与GDM辅助早期诊断相关的血清/血浆多肽标志物

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人类(HomoSapiens)

<400> 1

Lys Lys Leu Pro Pro Ala Ser

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人类(HomoSapiens)

<400> 2

Phe Ser Ser Pro Asn Lys Thr Gly

1 5

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人类(HomoSapiens)

<400> 3

Arg Pro Gln Gly Thr

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人类(HomoSapiens)

<400> 4

Arg Thr Tyr Ser Leu Thr Thr

1 5

Claims (4)

1.与妊娠期糖尿病辅助早期诊断相关的血清/血浆多肽标志物，其特征在于该标志物选自Q9Y4H2，或Q9Y4H2与选自Q6PFW1、P35658、P32004中的任意一个多肽或两个个多肽的组合；其中Q6PFW1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，P35658的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，P32004的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，Q9Y4H2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.权利要求1所述的血清/血浆多肽标志物作为检测靶点在制备妊娠期糖尿病辅助早期诊断试剂中的应用。

3.一种妊娠期糖尿病辅助早期诊断试剂，其特征在于包含Q9Y4H2，或Q9Y4H2与选自Q6PFW1、P35658、P32004中的任意一个多肽或两个个多肽的检测试剂。

4.根据权利要求3所述的一种妊娠期糖尿病辅助早期诊断试剂，其特征在于包含Q9Y4H2，或Q9Y4H2与选自Q6PFW1、P35658、P32004中的任意一个多肽或两个个多肽的ELISA检测试剂。