CN111751529A - 一种抽动障碍的血清多肽标志物p及其检测方法 - Google Patents

一种抽动障碍的血清多肽标志物p及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属生物医药领域，具体涉及一类非创伤性诊断抽动障碍的血清多肽标记物。本发明提供了一种抽动障碍的血清多肽标记物,多肽标志物是多肽M2‑型丙酮酸激酶即多肽PKM2或其肽段R.LAPITSDPTEATAVGAVEASFK.C。本发明还提供了上述血清多肽标记物的检测方法和应用,还提供了根据上述血清多肽标记物制成的试剂盒。本发明抽动障碍的血清多肽标记物及其检测方法，有利于其早期诊断，对抽动障碍发病机制的探讨、早期干预及治疗药物的研发都具有重要意义。同时可以制备成不同的检验检测用品，如制成诊断试剂盒、诊断试纸、诊断试剂；治疗及预后评估相关试剂盒、试纸、试剂等。

Description

一种抽动障碍的血清多肽标志物P及其检测方法
技术领域
本发明属生物医药领域，涉及生物医学中诊断抽动障碍血清分子标志物，具体涉及一类非创伤性诊断抽动障碍的血清多肽标志物。
背景技术
抽动障碍(Tic disorders，TD)是一种儿童常见，以无目的、反复、快速、不自主的一个部位或多个部位运动性或发声性抽动为主要临床表现的慢性神经精神疾病。该病于1885年在国际上首次报道，近年来，TD发病率呈整体上升趋向，但TD的发病原因及发病机制至今仍不清楚。对TD的诊断目前采用的是临床描述性诊断，还没有发现特异性的客观诊断手段。医生在详细询问病史的情况下，依据患儿的临床表现及伴随神经精神行为表现，再依据体格检查及相关辅助检查排除其它疾病后给予诊断。这种诊断方法有一定的缺陷性：①因需排除相关疾病，检查花费高，耗时长；②多数TD患儿常伴有注意力不集中、情绪障碍、自伤行为等精神行为异常表现，繁琐的诊断过程增加了患儿敏感内心的负担，加重心理行为异常表现。基于TD的诊断特点，患儿往往在得病之初不能得到及时、准确的诊断，迫切需要开发客观的生物诊断指标。而且，TD生物学指标的筛查不仅有利于其早期诊断，对该病发病机制的探讨、早期干预及治疗药物的研发都具有重要意义。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一类抽动障碍的血清多肽标志物P及其检测方法。
本发明提供的技术方案是：
本发明提供了一种抽动障碍的血清多肽标志物P，所述的多肽标志物P是M2-型丙酮酸激酶即多肽PKM2或其肽段R.LAPITSDPTEATAVGAVEASFK.C。
本发明还提供了上述的血清多肽标志物P的检测方法，其特征在于，取血清样本并进行纯化，检测所述的血清多肽标志物P的含量。
进一步地，使用ELISA方法检测所述的血清多肽标志物多肽PKM2的含量。
进一步地，使用MALDI-TOF-MS方法检测所述的血清多肽标志物肽段R.LAPITSDPTEATAVGAVEASFK.C的含量。
本发明还提供了上述的血清多肽标志物P的应用，根据所述的血清多肽标志物P的含量诊断抽动障碍。
进一步地，血清样本中，正常儿童多肽PKM2的含量为抽动障碍儿童血清样本含量的1.2倍以上；或正常儿童肽段R.LAPITSDPTEATAVGAVEASFK.C的含量为抽动障碍儿童血清样本含量的2.02倍及以上，相应多肽标志物的含量异常，血清多肽标志物表达量(即含量)异常可初步判断为抽动障碍。
本发明还提供了抽动障碍的诊断试剂或诊断试剂盒，该诊断试剂或诊断试剂盒中含有所述的血清多肽标志物P或与该标志物P结合的物质。
进一步地，与该标志物P结合的物质为结合有糖链、脂质等修饰物的该标志物P。
本发明还提供了上述的血清多肽标志物P的应用，所述的血清多肽标志物P可以应用于抽动障碍诊断靶点。
本发明的有益效果是：
本发明公开了一种抽动障碍的血清多肽标志物PKM2或其肽段R.LAPITSDPTEATAVGAVEASFK.C，在抽动障碍患儿血清中呈现显著低表达，组间差异极显著(P＜0.001)。
鉴于多肽PKM2及其肽段R.LAPITSDPTEATAVGAVEASFK.C在抽动障碍血清中显著低表达，那么PKM2及其肽段就可以作为抽动障碍血清诊断标志物。应用ELISA方法检测PKM2或MALDI-TOF-MS技术对其肽段R.LAPITSDPTEATAVGAVEASFK.C的表达水平进行检测，可以作为抽动障碍患儿诊断的检测方法。PKM2及其肽段可以应用于制备血清检测抽动障碍诊断试剂或诊断试剂盒中，也可以作为检测药物的新靶点。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制，在附图中：
图1是随机选取的一例健康对照组儿童三次采样的蛋白多肽图谱；
图2是随机选取的一例TD组儿童三次采样的蛋白多肽图谱；
图3是M/Z为2175.98的蛋白多肽峰在TD组和健康对照组中的表达差异；
图4是M/Z为2175.98的蛋白多肽的LC-MS/MS鉴定质谱图；
图5是PKM2标准曲线；
图6是TD组和健康对照组血清多肽PKM2的表达水平(AB为TD组、Normal为健康对照组)。
具体实施方式
本发明公开了一种抽动障碍的血清多肽标志物PKM2及其肽段R.LAPITSDPTEATAVGAVEASFK.C，该多肽及其肽段R.LAPITSDPTEATAVGAVEASFK.C表达具有特异性，可以作为一种新的抽动障碍血清诊断标志物，可用于抽动障碍的诊断。下面结合具体的实施例对本发明抽动障碍的血清多肽标志物的验证做进一步的详细说明。所述是对本发明的解释而不是限定。
步骤1、样本的采集与处理
采集西安市儿童医院儿童保健科门诊2017年4—10月临床确诊的60例抽动障碍患儿，和同时期、同来源健康体检基本正常的30例健康对照儿童。经比较各组间性别、年龄均无统计学差异。使用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-k2)采血管采集入组研究对象空腹4小时的肘静脉血2mL，混匀后室温静置2小时。然后于10℃条件下，以3300rpm/min离心10min，将血清转移到样品管中并编号，-20℃冰箱保存，避免反复冻融。
步骤2和3为使用MALDI-TOF-MS方法检测所述的血清多肽标志物肽段R.LAPITSDPTEATAVGAVEASFK.C的含量。
步骤2、样本的纯化
应用Bruker公司的弱阳离(MB-WCX)试剂盒，对血清进行处理，具体操作步骤如下：
从-20℃冰箱中取出血清并置于冰上融化。
①从4℃冷藏储存室取出WCX磁珠悬浮液，完全混匀1min；
②取7μL磁珠置于200μL样品管中，并加入10μL磁珠结合缓冲液(binding buffer，BB)，吹打20次混匀，然后再加入5μL样本，吹打10次混匀，室温下静置5min；
③将样品管放入磁珠分离器，使磁珠贴壁2min，使液体澄清，然后弃上清液；
④向样品管中加入100μL清洗液(wash buffer，WB)，并使样品管在磁珠分离器中来回移动10次，静置1min，弃上清液，此清洗过程共重复3次；
⑤向样品管中加入5μL洗脱液(elution buffer，EB)，吹打20次混匀后使磁珠贴壁2min，然后转移上清液至新管；
⑥加入5μL稳定液(stabilization buffer，SB)，混匀。
步骤3、一级质谱分析
3.1点样、上机
在直径为600μL的AnchorChipTM质谱板上点加磁珠处理过的样品1μL，将点样后的质谱板室温条件下干燥；然后在每个样品干燥原点处点加1μL浓度为0.3g/L的HCCA溶液，室温条件下干燥。待干燥后将靶板放入质谱仪进行分析，校正并设置仪器参数，将质量范围设定为0.8-10kDa，每个样品孔均采集信息3次，如图1、图2，纵坐标代表波峰的强度，即蛋白质的相对含量，横坐标为分子量(M/Z)。
3.2数据采集与分析
应用flexControl 3.3采集软件对采集数据进行收集、处理。flexAnalysis 3.3及ClinproTools 2.2对蛋白波峰进行标峰、统计。经Anderson-Darling检验，若数据呈非正态分布，则选用Wilcoxon检验；若数据呈正态分布，则用两两比较t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。显著差异峰的选择标准:P<0.001，组间峰强度差异倍数>1.9，受试者工作特征曲线下面积(AUC)>0.78。
结果显示实验重复性好，同一样品孔的三次采样所得蛋白波谱图基本一致，如图1、图2为随机选取的一例TD组和一例健康对照组儿童三次采样的结果。分子量(M/Z)为2175.98的多肽峰在在抽动障碍患儿组显著低表达(如图3)，因此将其作为潜在标志物进行序列鉴定和ELSA验证。
步骤4、二级质谱分析
4.1样品制备
取出冻存于-20℃冰箱中分装的MB-WCX磁珠提取后样，放于冰盒上慢慢解冻，解冻后取样，离心5分钟后，取上清液，并通过nanodrop进行肽段水平定量，定量所得理论60μg，真空冻干。
使用C18固相萃取方法脱盐，具体步骤如下：
①柱激活：向C18脱盐柱中添加40μl的甲醇，并对柱加压，使液体通过。
②柱清洗：向脱盐柱中加入比值为80％ACN/0.2％TFA混合溶剂40μl，并重复一次。
③柱平衡：向脱盐柱中加入0.2％的TFA溶剂40μl，并重复两次。
④上样：用0.2％三氟乙酸溶液40μl重新溶解冻干的样品，并将其加入柱中，并对脱盐柱进行缓慢加压，并重复一次。
⑤脱盐清洗：向脱盐柱中加入0.2％的TFA溶剂40μl，并重复一次。
⑥肽段洗脱：向脱盐中加入比值为80％ACN/0.2％TFA混合溶剂40μl，并重复一次。
按以上步骤操作完成后，收集步骤⑥所得样品，真空冻干。
4.2液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)
采用高效液相色谱Easy-nLC 1000对上述所得样品进行分离。缓冲液：A溶液为0.1％甲酸水溶液，B溶液为0.1％甲酸乙腈溶液。色谱柱以95％的A液平衡。以上所得样品由自动进样器上样到质谱预柱C18 trap column(C18 3μm0.10×20mm)，再经分析柱C18column(C18 1.9μm0.15×120mm)分离，流速为600nl/min，分离后收集所得样品。将高效液相色谱分离后的每份样品用Q-Exactive HF质谱仪进行质谱分析。
4.3数据检索
用Mascot合并Proteome Discover2.0软件，检索质谱分析所得的原始数据并与uniprot_human_fasta数据库进行连接、比对数据及匹配寻找相应的差异性蛋白质。结果如下：
M/Z为2175.98的肽段其序列为：R.LAPITSDPTEATAVGAVEASFK.C，将此肽段通过mascot合并PD2.0软件在uniprot_human_fasta蛋白质库内进行检索，发现此肽段为PKM2的一个肽段。图4为鉴定M/Z为2175.98蛋白质时的部分肽段质谱图。
R.LAPITSDPTEATAVGAVEASFK.C作为PKM2的一个肽段，提示PKM2是与抽动障碍特异性相关的蛋白多肽，进一步进行ELISA检测进行验证。
步骤5、血清潜在标志物的鉴定：即PKM2表达的ELISA血清验证分析
5.1根据PKM2的ELISA(双抗体夹心法)试剂盒操作说明书，对前期收集离心的90例血清样品进行如下操作:
①标准品的稀释：试剂按照试剂盒说明书配制。分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。
②加样：在酶标板上准确加入50μl标准样品，在待测样品孔中加入40μl样品稀释液，再加入10μl待测样品至酶标板孔底(样品最终稀释5倍)。
③温育：用封板膜封板后放入温度为37℃条件下，温育30分钟。
④液体配制：用蒸馏水稀释30倍浓缩洗涤液备用。
⑤清洗：小心地揭下密封膜，倒掉液体，并拍干；在每个反应孔中注入备用的洗涤液，静置30s后倒掉；重复5次，拍干。
⑥加酶：除空白孔外，每孔加入50μl相应的酶标溶液，再用封板膜封板后放入37℃的温度下孵育30min。
⑦清洗：小心地撕下密封膜，倒掉液体，并拍干；在每个反应孔中注入备用洗涤液，放置30s后倒掉。重复5次，拍干。
⑧显色：每个反应孔中先加入50μl显色剂A溶液，再加入显色剂50μlB溶液后混匀，37℃温度下避光孵育10min。
⑨终止：每孔加入50μl终止溶液。(蓝色立即变为黄色)。
⑩测定：在450nm波长，读出每个孔的OD值；根据标准品的光吸收值绘制标准曲线，计算被检测样品的浓度。
5.2统计分析
采用SPSS21.0统计软件进行统计学分析，方差齐性检验采用Levene检验，两独立样本t检验分别用于分析TD组与健康对照组相关差异蛋白的浓度，P<0.05被认为具有统计学意义。通过标准品的OD值分别绘制出标准曲线(如图5)，再将待测样品的OD值带入公式得出TD组和健康对照组血清中的PKM2的浓度，结果显示：PKM2在TD组低表达，在健康对照组血清中高表达(P<0.05，如图6)。这表明PKM2低表达与抽动障碍密切相关，可以通过作为初步的抽动障碍诊断检测指标。
综上所述，本发明公开了一种抽动障碍血清多肽标志物P，所述的多肽标志物P是多肽PKM2或其肽段R.LAPITSDPTEATAVGAVEASFK.C。该多肽标志物P在抽动障碍患儿血清检测中呈现特异性表达，通过MALDI-TOF-MS检测其肽段R.LAPITSDPTEATAVGAVEASFK.C或ELISA方法检测PKM2的表达水平，可作为抽动障碍血清的诊断检测方法，填补了抽动障碍生化诊断的空白。

Claims (9)

1.一种抽动障碍的血清多肽标志物P，其特征在于，所述的多肽标志物P是M2-型丙酮酸激酶即多肽PKM2或其肽段R.LAPITSDPTEATAVGAVEASFK.C。
2.权利要求1所述的血清多肽标志物P的检测方法，其特征在于，取血清样本并进行纯化，检测权利要求1所述的血清多肽标志物P的含量。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，使用ELISA方法检测权利要求1所述的血清多肽标志物多肽PKM2的含量。
4.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，使用MALDI-TOP-MS方法检测权利要求1所述的血清多肽标志物肽段R.LAPITSDPTEATAVGAVEASFK.C的含量。
5.权利要求1所述的血清多肽标志物P的应用，其特征在于，根据权利要求1所述的血清多肽标志物的含量诊断抽动障碍。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，血清样本中，正常儿童多肽PKM2的含量为抽动障碍儿童的1.2倍以上；或正常儿童肽段R.LAPITSDPTEATAVGAVEASFK.C的含量为抽动障碍儿童的2.02倍及以上，相应多肽标志物P的含量异常。
7.抽动障碍的诊断试剂或诊断试剂盒，其特征在于，该诊断试剂或诊断试剂盒中含有权利要求1所述的血清多肽标志物P或与该标志物P结合的物质。
8.如权利要求7所述的诊断试剂或诊断试剂盒，其特征在于，与该标志物P结合的物质为结合有糖链、脂质等修饰物的标志物P。
9.权利要求1所述的血清多肽标志物P的应用，其特征在于，权利要求1所述的血清多肽标志物P可以应用于抽动障碍诊断靶点。
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