BRPI0611794A2

BRPI0611794A2 - métodos e composições para induzir respostas imunes multivalentes contra epìtopos dominantes e subdominantes, expressos em células de cáncer e estroma tumoral

Info

Publication number: BRPI0611794A2
Application number: BRPI0611794-5A
Authority: BR
Inventors: Zhiyong Qiu; Adrian Bot
Original assignee: Mannkind Corp
Priority date: 2005-06-17
Filing date: 2006-06-16
Publication date: 2010-09-28
Also published as: AU2006259220B2; SG162817A1; EP1896494B1; CA2612516C; IL188113A; IL188113A0; AU2006259220C1; KR20080026181A; CA2612516A1; US7999088B2; US20110269949A1; WO2006138567A2; US20070004662A1; JP5416968B2; MX2007015933A; ES2413079T3; CN101198620A; EP2385060A2; EP2385060A3; EP1896494A2

Abstract

METODOS E COMPOSIçõES PARA INDUZIR RESPOSTAS IMUNES MULTIVALENTES CONTRA EPITOPOS DOMINANTES E SUBDOMINANTES, EXPRESSOS EM CéLULAS DE CáNCER E ESTROMA TUMORAL. A presente invenção provê um método para tratar câncer pelo fornecimento a um sujeito necessitando da mesma, de uma composição imunogênica que compreende um construto de ácido nucléico codificando um polipeptideo que compreende epítopos CTL PSMA288-297 e PRAME425-433, ou um análogo reativo-cruzado. Em modalidades da presente invenção, são fornecidos métodos e composições para induzir, arrastar e/ou amplificar a resposta imune a epítopos restritos a MHC classe 1 de antígenos de carcinoma para gerar uma resposta imune anticâncer eficaz.

Description

MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA INDUZIR RESPOSTAS IMUNESMULTIVALENTES CONTRA EPÍTOPOS DOMINANTES E SUBDOMINANTES,EXPRESSOS EM CÉLULAS DE CÂNCER E ESTROMA TUMORAL

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

0 presente pedido reivindica o beneficio da datade depósito do pedido de patente provisional US no. desérie 60/691.579, depositado em 17 de junho de 2005, que éincorporado aqui a titulo de referência na integra semrenúncia.

Campo da Invenção

A invenção revelada aqui é dirigida à indução deuma resposta imune restrita a MHC classe-I e controle danatureza e magnitude da resposta, desse modo promovendointervenção imunológica eficaz em processos patogênicos. Ainvenção se refere a composições imunogênicas que podemestimular uma resposta imune celular contra uma célulaalvo. É revelada aqui, uma composição imunogênica quecompreende um construto de ácido nucléico codificando osepitopos CTL PRAME425-433 e PSMA288-297 ou um análogo reativocruzado de qualquer um ou ambos os epitopos. A invençãotambém provê métodos de utilizar a composição imunogênicadescrita para eliciar uma resposta imune equilibrada em umsujeito no qual tais composições são administradas.

Descrição da Técnica Relacionada

O Câncer se desenvolve, genericamente, quando ascélulas em uma parte do corpo continuam a crescer edividir, em um modo desordenado, ao contrário de célulasnormais que crescem, se dividem e morrem em um modoordenado. Embora haja muitos tipos de câncer, elesnormalmente têm inicio devido ao crescimento fora decontrole de células anormais.

Opções usuais de tratamento para câncer incluemcirurgia, terapia de radiação, e quimioterapia. CJma quartaramificação de tratamento é o desenvolvimento, que émencionado como imunoterapia. Imunoterapias tentam ajudar osistema imune a reconhecer células cancerosas, e/oureforçar uma resposta contra as células cancerosas paradestruir o câncer. Imunoterapias incluem imunoterapiasativa e passiva. Imunoterapias ativas tentam estimular opróprio sistema imune do corpo a combater a doença.Imunoterapias passivas não se baseiam, genericamente, nocorpo para atacar a doença; em vez disso, utilizamcomponentes do sistema imune (como anticorpos) criados forado corpo do paciente.

Apesar de vários tipos de tratamentos de câncer,existe uma necessidade continua de opções adicionais detratamento. A manipulação do sistema imune pelo uso de umavacina anticâncer é uma tal abordagem.

Para gerar uma vacina ou outra composiçãoimunogênica, um antigeno ou epitopo contra o qual umaresposta imune pode ser montada, é introduzido em umsujeito. Embora células neoplásicas (câncer) sejamderivadas de e, portanto, sejam substancialmente idênticasa células normais em um nivel genético, muitas célulasneoplásicas são conhecidas por apresentarem antigenosassociados a tumor (TuAAs). Na teoria, esses antigenospoderiam ser utilizados pelo sistema imune de um sujeitopara reconhecer e atacar as células neoplásicas comoestranhas. Infelizmente, células neoplásicas parecemgenericamente ser ignoradas pelo sistema imune do hospedeiro.

O sistema imune pode ser categorizado em doisbraços efetores distintos. O primeiro é imunidade inata,que envolve numerosos componentes celulares e fatoressolúveis que respondem a todos os desafios infecciosos. Ooutro é a resposta imune adaptativa, que é customizada pararesponder especificamente a epitopos precisos a partir deagentes infecciosos. A resposta imune adaptativa éadicionalmente dividida em dois braços efetores conhecidoscomo os sistemas imunes humoral e celular. O braço humoralé centrado na produção de anticorpos por B-linfócitosenquanto o braço celular envolve a atividade de célulaexterminadora de linfócitos T citotóxicos.

Linfócitos T citotóxicos (CTL) não reconhecemepitopos nos próprios agentes infecciosos. Em vez disso,CTL detecta fragmentos de antigenos derivados a partir deagentes infecciosos que são exibidos na superfície decélulas infectadas. Como resultado antigenos são visíveis aCTL somente após os mesmos terem sido processados pelacélula infectada e desse modo exibidos na superfície da célula.

O sistema de processamento e exibição de antígenona superfície de células foi bem estabelecido. CTLreconhece antigenos de peptídeo curtos, os quais sãoexibidos na superfície em associação não covalente amoléculas de complexo de histocompatibilidade principalclasse I (MHC) . Esses peptídeos de classe I são, por suavez, derivados da degradação de proteínas citosólicas.

Na maioria dos casos, processos neoplásicos sedesenvolvem para evitar os mecanismos de defesa imuneempregando uma gama de estratégias que resultam emignorância, tolerância ou desvio, imune. Os métodos querompem eficazmente a tolerância imune ou reparam o desvioimune contra antigenos expressos em células de câncer foramdescritos na literatura (Okano F., e outros, J. Immunol.2005, mar. 1; 174 (5) :2645-52; Mocellin S.,e outros, Exp.Cell Res. 2004 Io de out.; 299(2); 267-78; Banat GA, eoutros, Câncer Immunol Immunother. 2001 jan.; 49(11): 573-86) e apesar de sua associação com níveis significativos deimunidade sistêmica, raramente resultam em redução de cargade tumor. Fatores limitadores significativos que impactamesse processo são tráfico sub-ótimo, ativação local e/ ouatividade de células efetoras anti-tumores. Na realidade,foi mostrado na maioria dos casos que a presença intra-tumoral de células imunes é uma ocorrência rara - emcomparação com aquela associada a processos inflamatórioscomo rejeição de órgão, infecções ou síndromes auto-imunes.

A resposta imune que resulta da exposição aantígenos (em um contexto natural ou após vacinação) queabrangem múltiplos epítopos é inerentemente associada a umahierarquia em relação à magnitude da resposta imune contraepítopos individuais, diferentes. Isso ocorre no caso deepítopos de célula T como epítopos restritos a MHC classe Ie classe II, onde dominância e subdominância foram bemdocumentadas. Epítopos dominantes são aqueles que eliciamexpansões proeminentes e específicas de células T; ao passoque epítopos subdominantes eliciam respostas relativamentereduzidas caracterizadas por uma expansão limitada decélulas T específicas com funcionalidade diminuída.

Há múltiplos motivos para uma resposta imunefocar em um subconjunto de epítopos em um antígeno,independente de se o antígeno é natural ou construído.Esses motivos incluem, porém não são limitados aosseguintes: eficácia de geração de certos peptídeos ouprecursores de polipeptídeo em proteassomas (para restritoa classe I) ou endossomas (para restrito à classe II); seutransporte seletivo através de TAP (para peptídeos classeI) e mecanismos alternativos para compartimentos onde ocarregamento no MHC ocorre; sua afinidade por moléculas deMHC em relação a acompanhantes ou a cadeia não variante depolipeptídeo que ocupa a fenda de ligação de peptídeo demoléculas de MHC nascentes e em relação a outros peptideosconcorrentes que resultam do processamento de substratosiguais ou alternativos; a estabilidade do complexo depeptideo-MHC resultante; e a funcionalidade de repertóriode células T.

Além disso, dois ou mais epitopos a partir deantigenos diferentes reunidos na mesma molécula artificialassumem uma relação dominante /subdominante devido a suaspropriedades intrínsecas (como aquelas descritas acima).Isso limita a aplicabilidade prática de moléculascompósitas para fins de imunoterapia, particularmentequando se busca o co-alvejamento de células de câncer(neoplásicas) e elementos estromais (como neovasculatura).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Para amplificar o controle mediado imune deprocessos tumorais, as modalidades da presente invençãofornecem ataque mediado imune de neovasculatura, além doataque direto sobre células de tumor, como um componente deuma estratégia de vacina bi- ou multi-valente direcionadaao estabelecimento de um ambiente inflamatório no tumorresultando em encolhimento, estabilização ou diminuição dataxa de crescimento e invasão (local ou sistêmica). Essametodologia pode ser mais eficaz no controle de processosde tumor do que estratégias que alvejam células de câncerou a neovasculatura individualmente e tem implicaçõesbenéficas com relação ao índice terapêutico(eficácia/segurança).

Algumas modalidades se referem a métodos ecomposições que modulam as respostas imunes contra epitoposcom diferentes propriedades imunes intrínsecas (porexemplo, estado dominante versus subdominante em um dadocontexto de imunização), em um modo compatível com oaumento da atividade relativa de epitopos subdominantespara obter co-indução de respostas imunes equilibradascontra múltiplos epitopos. A presente invenção é útil aoco-alvejar múltiplos antigenos como aqueles expressos porcélulas de câncer e/ou estroma subjacente.

Em algumas modalidades, o co-alvejamento deneovasculatura de tumor e células cancerosas, ou demúltiplos antigenos em células de câncer, pode ser obtidopor composições imunoterapêuticas compreendendo vetores deexpressão como plasmideos que eliciam imunidade contracélulas transformadas, células de tumor e célulasendoteliais da neovasculatura. O desenho de plasmideos emum formato de "cordão de contas" é realizado como reveladono pedido de publicação de patente US no. 20030228634,intitulado "EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN", e aquiincorporado a titulo de referência na integra. Umamodalidade preferida é um plasmídeo bivalente compreendendoelementos imunogênicos derivados de molécula(s) expressa(s)em células de câncer e molécula(s) expressa(s) emneovasculatura. Em modalidades especificas da invenção,tais moléculas correspondem aos epitopos PRAME e PSMA eseus análogos reativos-cruzados.

Em outra modalidade, vetores como plasmideoexpressam elementos imunogênicos derivados de moléculas co-expressas por células de câncer e neovasculatura. Ainda emoutra modalidade, vetores como plasmideos expressamelementos imunogênicos derivados de um receptor e seuligando, onde o receptor ou ligando é expresso pelaneovasculatura, e células de câncer expressam o outro.

Ainda em outra modalidade, vetores codificamcomponentes imunogênicos a partir de moléculas expressaspor células de câncer ou neovasculatura (ou outras célulasestromais) juntamente com modificadores de respostabiológica, incluindo modificadores que atuam através dereceptores de antigeno em células BeTe aqueles que nãoatuam.

Em algumas modalidades, os vetores podem seradministrados em uma seqüência cronológica com outrosagentes imunogênicos - como peptideos - para fins deamplificar ou modular a atividade terapêutica contracélulas de câncer, neovasculatura ou ambos (revelado napublicação de pedido de patente US no. 20050079152intitulado "METHODS TO CONTROL MHC CLASS I-RESTRICTEDIMMUNE RESPONSE"; pedido de patente provisional US no.60/640.402, depositado em 29 de dezembro de 2004, epublicação US no., todos intitulados METHODS TOELICIT, ENHANCE, AND SUSTAIN IMMUNE RESPONSE AGAINST MHCCLASS I-RESTRICTED EPITOPES, FOR PROPHYLACTIC ORTHERAPEUTIC PURPOSES; e pedido provisional US no.60/691.581 depositado em 17 de junho de 2004, intituladoMULTIVALENT IMMUNOTHERAPEUTICS FOR CARCINOMA, e pedido depatente US no._/_, intitulado MULTIVALENTIMMUNOTHERAPIES FOR CARCINOMA (No. Do dossiê do procuradorMANNK.054A), depositado na mesma data desse pedido ambosintitulados, cada um dos quais é pela presente incorporadoa titulo de referência na integra) e equilibrando aresposta contra epitopos subdominante e dominante.

A indução de respostas imunes para epitopos quesão "subdominantes" no contexto de um antigeno nativofornece o beneficio no tratamento de câncer uma vez quetais epitopos podem ser envolvidos na seleção negativa(central ou periférica) que ocorre em indivíduos doentes.Desse modo, as construções abrangendo múltiplas cópias deum epítopo subdominante podem ser utilizadas para induziruma resposta aumentada contra tal epítopo enquanto preservaa imunidade contra os dominantes.Além disso, a co-indução eficaz de respostasimunes contra epitopos a partir de antigenos diferentesapresentados pela mesma molécula pode oferecer umaabordagem mais prática para gerar imunidade contramúltiplos antigenos. Isso tem implicações diretas paratratamento e prevenção de doenças infecciosas e tumorais.

No geral, as respostas imunes mais amplas obtidaspor tais métodos e composições são mais eficazes em lidarcom processos patogênicos ao contrário de respostas imunesaltamente dominadas por um número limitado deespecificidades. Além disso, a natureza prática de vetoresmultivalentes em tais métodos e composições pode aliviar anecessidade de utilizar numerosos componentes e protocolosde administração incômodos para obter respostasmultivalentes, equilibradas.

Algumas modalidades se referem a plasmideosbivalentes que expressam seqüências de epitopo de PRAME ePSMA (como aquelas reveladas na publicação do pedido depatente US nos. 20030220239, 20050221440, 20050142144 epublicação de patente PCT no. PCT/US/11101 intitulado"EPITOPE SEQUENCES", aqui incorporadas individualmente atitulo de referência na integra) e métodos de uso dessascomposições, individualmente ou em combinação com outrosplasmideos, para eliciar uma resposta imune equilibrada.

Tais métodos podem incluir uma etapa de iniciar ou arrastaronde a composição pode ser fornecida a vários locais noanimal, porém preferivelmente é fornecida ao sistemalinfático, por exemplo, um linfonodo. A etapa de arrastepode incluir um ou mais fornecimentos daquela composição,por exemplo, espalhamento durante um período de tempo ou emum modo contínuo durante um período de tempo.

Os métodos podem incluir ainda, uma etapa deamplificação que compreende administrar uma composiçãocompreendendo um imunógeno de peptideo, tendo similaridadesubstancial ou similaridade funcional aos epitoposcorrespondentes codificados pela composição de ácidonucléico. Por exemplo, o imunógeno pode ser uma seqüênciareativa cruzada do epitopo correspondente. A etapa deamplificação pode ser executada uma ou mais vezes, porexemplo, em intervalos durante um período de tempo, em umbolo, ou continuamente durante um período de tempo. Emboranão exigido em todas as modalidades, algumas modalidadespodem incluir o uso de composições que incluem umimunopotenciador ou adjuvante.

Foi observado que pelo uso desse tipo deprotocolo de imunização que não somente pode o plasmídeoiniciar uma resposta imune, como propende a resposta e suaamplificação subseqüente em direção a um efetor aocontrário de um caráter regulador. Sem essa imunizaçãobaseada em ácido nucléico anterior, a administraçãorepetida de peptideo leva a uma resposta ainda maisdominada por células T reguladoras. A propensão de vidalonga em direção a uma resposta de efetor é denominadaarraste.

Modalidades adicionais incluem aquelas nas quaisos plasmídeos revelados são utilizados individualmente ouem qualquer combinação. As composições de peptideocorrespondendo a esses epitopos e utilizadas na porção deamplificação da estratégia de imunização podem serseqüências nativas ou análogos de peptideo substancialmentesimilares ou funcionalmente similares à seqüência deepitopo nativo. Os peptídeos podem ser incorporados noprotocolo de amplificação individualmente ou em combinaçõesde 2, 3 ou 4 dos imunógenos. Os motivos para utilizar umaquantidade menor do que todos os epitopos de peptideoincluem, porém não são limitados, aos seguintes: 1)expressão sub-ótima de qualquer dos antígenos; 2) opaciente não expressa, ou não mais expressa o antigenocorrespondente; 3) uma resposta menos robusta está sendogerada para um ou outro dos epítopos, em cujo casotal(tais) peptídeo(s) podem ser dados na ausência dosoutros para obter uma resposta mais equilibrada; e 4) umpeptideo pode ser descontinuado se estiver gerando algumtipo de imunotoxicidade.

Modalidades adicionais se referem a métodos demodular a resposta imune pela alteração do número relativode epitopos imunógeno em uma composição de ácido nucléico.Essas modalidades também podem abranger a alteração daimunogenicidade intrínseca do imunógeno, por exemplo, pelacodificação de substituições de aminoácido no epítopoimunógeno.

As modalidades podem adicionalmente abrangermétodos de modular a resposta imune por regulaçãoascendente seletiva por reforço de peptideo. As composiçõesde peptideo correspondendo a essa etapa de amplificaçãopodem ser seqüências nativas ou análogos de peptideosubstancialmente similares ou funcionalmente similares àseqüência de epítopo nativo. A regulação ascendenteseletiva- pode ser obtida pela administração do peptideocorrespondendo ao epítopo subdominante para obter umaresposta imune equilibrada.

Ainda outras modalidades incluem plasmídeos quecodificam um análogo dos epítopos de PSMA ou PRAME.Modalidades adicionais podem incluir epítopos diferentes(como aqueles revelados na publicação de pedido de patenteUS nos. 20030220239 e 20040180354, ambas intituladas"EPITOPE SEQUENCES", e aqui incorporadas a título dereferência na íntegra) e análogos substituídos emcombinação similar como os epítopos expressos nosplasmídeos RP8 e RP12 e imunógenos de peptídeocorrespondentes (como aqueles revelados no pedido depatente provisional US no. 60/691.889 intitulado "EPITOPEANALOGUES", depositado em 17 de junho de 2005, e aquiincorporado a titulo de referência na integra)administrados como a porção de amplificação da estratégiade imunização.

Algumas modalidades se referem a construções deácido nucléico codificando um polipeptideo que inclui umaou mais cópias de epitopo CTL PSMA288-297 (SEQ ID NO: 6) euma ou mais cópias de epitopo CTL PRAME425-433 (SEQ IDNO: 5) ,ou um análogo reativo cruzado compreendendo 1-3substituições de um ou ambos os epitopos, onde opolipeptideo não inclui um antigeno inteiro. Um ou ambos osepitopos podem ser codificados em uma seqüência deliberação, por exemplo. 0 polipeptideo pode incluir aindauma seqüência que codifica um ou mais grupos de epitopo. 0construto de ácido nucléico pode incluir um agrupamento deepitopo PRAME, por exemplo, aminoácido 422-509 de PRAME. 0construto de ácido nucléico pode incluir um agrupamento deepitopo PSMA, por exemplo, um ou mais agrupamentos deepitopos podem ser aminoácidos 3-45 ou 217-297 de PSMA. 0análogo de epitopo PSMA pode conter uma substituição 1297V,por exemplo. 0 construto de ácido nucléico pode incluirainda um ou mais de uma seqüência de importação nuclear, umpromotor (por exemplo, um promotor de citomegalovírus(CMV) ) , uma seqüência poli-A, ou um ou mais de um motivoimunoestimulador CpG. A seqüência de liberação dos epitopostanto PRAME como PSMA pode ser localizada, por exemplo, naporção terminal-N do polipeptideo codificado. Opolipeptideo codificado pode ser, por exemplo, SEQ ID NO:2. A seqüência de liberação dos epitopos tanto PRAME comoPSMA pode ser localizada, por exemplo, na porção terminal-Cdo polipeptídeo codificado. Por exemplo, o polipeptideocodificado pode ser SEQ ID NO: 4.

Algumas modalidades se referem a composiçõesimunogênicas que incluem um construto de ácido nucléicodescrita acima e em outro lugar na presente invenção.

Algumas modalidades se referem a métodos detratar um indivíduo tendo câncer, os métodos podem incluira etapa de administrar uma quantidade eficaz de formaterapêutica de um construto de ácido nucléico descritoacima e em outro lugar na presente invenção. 0 construto deácido nucléico pode ser administrado de modo intranodal,por exemplo. 0 indivíduo pode ter um câncer que expressaPRAME, PSMA, ou ambos em células neoplásicas ou células deneovasculatura associadas a tumor.

Algumas modalidades se referem a métodos detratar um indivíduo tendo câncer. Os métodos podem incluiras etapas de administrar uma quantidade eficaz do construtode ácido nucléico descrito acima e em outro lugar napresente invenção para induzir uma resposta imune; eamplificar a resposta imune por reforço com pelo menos umanálogo de peptídeo correspondendo a um epítopo codificadopelo construto de ácido nucléico. 0 indivíduo pode ter, porexemplo, um câncer que expressa PRAME em células de câncere PSMA em células de vasculatura associadas a tumor. 0indivíduo pode ter um câncer que expressa PRAME, PSMA ouambos em células neoplásicas ou células de neovasculaturaassociadas a tumor.

Algumas modalidades se referem ao uso de umacomposição imunogênica ou construto de ácido nucléico comodescrito acima e em outro lugar na presente invenção, napreparação de um medicamento para o tratamento de umindivíduo tendo câncer. 0 medicamento pode ser para otratamento de um indivíduo tendo câncer pela administraçãodo medicamento de modo intranodal. 0 indivíduo pode ter umcâncer que expressa PRAME, PSMA ou ambos em célulasneoplásticas ou células de neovasculatura associadas atumor.

Algumas modalidades se referem ao uso de umacomposição imunogênica ou um construto de ácido nucléico,como descrito acima, e em outro lugar na presente invenção,na preparação de um medicamento para uso na indução de umalvejamento de resposta imune de neovasculatura associada atumor. Por exemplo, as células de vasculatura associadas atumor exibem PRAME.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

FIG. 1. Estrutura de dois plasmídeos monovalentese um plasmídeo bivalente.

FIG. 2. Ensaio de liberação de 51Cr representandoa % de Iise de célula específica em células que expressamos plasmídeos P2, R2 e RP5. Os dados são apresentados comoa seguir: o eixo geométrico-x mostra células alvoutilizadas com razão diferente de efetor para alvo; o eixogeométrico-y mostra a percentagem correspondente de Iiseespecífica.

FIG. 3. Estrutura de plasmídeos adicionaisprojetados expressando epítopos tanto PRAME como PSMA. Aestrutura do plasmídeo PRAME monovalente R2 é representada.P2 representa o plasmídeo PSMA monovalente.

FIG. 4. Análise ELISpot de PRAME e PSMArepresentando indução de respostas bivalentes obtidas porplasmídeos abrangendo epítopos a partir de antígenosdiferentes representados na figura 3. Os animais foramimunizados com 2 injeções de plasmídeo bivalente PRAME /PSMA (1 mg/ml) em linfonodos bilaterais. 5xl05 esplenócitosisolados foram incubados com 10 μg de peptídeo naturalPSMA288-297 ou 10 μg de peptídeo natural Prame425-433 por 42horas antes do desenvolvimento. Os gráficos representammédia +/- SEM.

FIG. 5. Análise de tetrâmetro de PRAME e PSMAapós imunização de plasmideo bivalente RP12. Os dadosmostram uma resposta imune bivalente a PRAME e PSMA comdominância relativa da resposta contra o epitopo PRAME emcamundongos iniciados com plasmideo somente.

FIGs. 6A — 6B. Análise de tetrâmero de PRAME ePSMA em camundongos que recebem imunização de plasmideobivalente RP12 ou RP8 seguido por um reforço de análogo depeptideo PSMA288_297 (I297V) (figura 6A) . Análise detetrâmero de PRAME e PSMA em animais individuais apósimunização de plasmideo bivalente RP12 ou RP8 e reforço deanálogo de peptideo PSMA288-297 (I297V) (figura 6B) .

FIG. 7. Análise ELISpot em animais sensibilizadoscom RP12 ou RP8 e reforçados com análogos de peptideoPSMA288-297 (I297V) e PRAME425-433 (L426Nva, L433Nle) .

FIG. 8. Seqüência de polipeptideo para RP8 (SEQID NO: 2).

FIG. 9. Seqüência de polipeptideo para RP12 (SEQID NO: 4).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA MODALIDADE PREFERIDA

As modalidades se referem a composições que podemeliciar respostas imunes multivalentes contra epitoposdominantes e subdominantes. Algumas modalidades também sereferem a métodos de projetar a composição por: selecionarantigenos que são expressos por células de câncer e/oucélulas estromais (neovasculatura) ; definir epitopos quepodem ter propriedades imunes intrínsecas diferentes, queconstituem alvos imunes válidos em tais células de câncerou estromais; e modular o número relativo de epitoposdominantes e subdominantes em uma certa molécula (comovetor terapêutico) pela diminuição da razão entre o númerode epítopos dominantes e subdominantes, enquanto forneceresíduos de flanquear ótimos para geração apropriada emcompartimentos de processamento.

Métodos adicionais são descritos como substituiruma ou múltiplas cópias de epítopos subdominantes comseqüências de análogo ou preferivelmente posicionarepítopos na molécula para modificar a imunogenicidaderelativa de tais epítopos e assegurar uma respostamultivalente mais equilibrada. O teste em relação àeficácia pode seguir o desenho de um conjunto de epítoposcandidatos. O uso de tais moléculas pode ser complementadopor amplificação seletiva de respostas contra epítopossubdominantes, no contexto de estratégias de imunização deiniciar-reforçar.

O método geral para desenho de vacina podeenvolver a utilização de um algoritmo definido que iniciacom uma seqüência natural ou artificial para encontrar arazão correta de epítopos dominante e subdominante paraplasmídeos, vetores e moléculas abrangendo múltiplas cópiasde epítopos dominante e subdominante; construir um conjuntode compostos; etapas de caracterização in vitro e in vivo;e seleção de plasmídeos apropriados ou outros vetoreseliciando a resposta imune equilibrada, desejada.

Um epítopo como mencionado aqui, é uma moléculaou substância capaz de estimular uma resposta imune. Emmodalidades preferidas, epítopos de acordo com essadefinição incluem, porém não são necessariamente limitadosa, um polipeptídeo e um ácido nucléico codificando umpolipeptídeo, em que o polipeptídeo é capaz de estimularuma resposta imune. Em outras modalidades preferidas,epítopos, de acordo com essa definição, incluem, porém nãosão necessariamente limitados a, peptídeos apresentados nasuperfície de células, os peptídeos sendo ligados de formanão covalente à fenda de ligação de MHC classe I, de talmodo que possam interagir com os receptores de célula T.

Um epitopo de MHC, como mencionado aqui, é umpolipeptideo tendo uma afinidade de ligação conhecida ouprevista para uma molécula de complexo dehistocompatibilidade principal classe I ou classe II, demamífero.

Um epitopo imune mencionado aqui, é um fragmentode polipeptideo que é um epitopo MHC, e que é exibido emuma célula na qual proteassomas imunes sãopredominantemente ativos. Em outra modalidade preferida, umepitopo imune é definido como um polipeptideo contendo umepitopo imune, de acordo com a definição acima, que éflanqueado por um a vários aminoácidos adicionais. Em outramodalidade preferida, um epitopo imune é definido como umpolipeptideo incluindo uma seqüência de agrupamento deepítopos, tendo pelo menos duas seqüências de polipeptideoque têm uma afinidade conhecida ou prevista para um MHCclasse I. Ainda em outra modalidade preferida, um epitopoimune é definido como um ácido nucléico que codifica umepitopo imune de acordo com qualquer uma das definiçõesacima.

SIMILARIDADE SUBSTANCIAL - esse termo é utilizadopara se referir a seqüências que diferem de uma seqüênciade referência em um modo inconseqüente como julgado porexame da seqüência. Seqüências de ácido nucléicocodificando a mesma seqüência de aminoácido sãosubstancialmente similares apesar de diferenças em posiçõesdegeneradas ou diferenças modestas em comprimento oucomposição de quaisquer regiões de não codificação.Seqüências de aminoácido diferindo somente por substituiçãoconservativa ou variações de comprimento menor sãosubstancialmente similares. Adicionalmente, seqüências deaminoácido compreendendo epitopos constitutivos que diferemno número de resíduos de flanquear terminal-N, ou epitoposimunes e agrupamentos de epitopos que diferem no número deresíduos de flanquear em qualquer extremidade, sãosubstancialmente similares. Ácidos nucléicos que codificamseqüências de aminoácidos substancialmente similares sãoeles próprios também substancialmente similares.

SIMILARIDADE FUNCIONAL - esse termo é utilizadopara se referir a seqüências que diferem de uma seqüênciade referência em um modo inconseqüente como julgado porexame de uma propriedade biológica ou bioquímica, embora asseqüências possam não ser substancialmente similares. Porexemplo, dois ácidos nucléicos podem ser úteis como sondasde hibridização para a mesma seqüência podem codificamseqüências de aminoácidos diferentes. Dois peptídeos queinduzem respostas CTL reativas-cruzadas são funcionalmentesimilares mesmo se diferirem por substituições deaminoácidos não conservativas (e desse modo não atendem àdefinição de similaridade substancial). Pares deanticorpos, ou TCRs, que reconhecem o mesmo epítopo podemser funcionalmente similares entre si apesar de quaisquerdiferenças estruturais que existam. No teste em relação àsimilaridade funcional de imunogenicidade, uma pessoaimunizaria, genericamente, com o antígeno "alterado" etestaria a capacidade da resposta eliciada (Ab, CTL,produção de citocina, etc.) para reconhecer o antígenoalvo. Por conseguinte, duas seqüências podem ser projetadaspara diferir em certos aspectos enquanto retêm a mesmafunção. Tais variantes de seqüência projetada estão entreas modalidades da presente invenção.

I. Construto de plasmídeo

Algumas modalidades da presente invenção fornecemum número de plasmídeos, por exemplo, pRP8 (SEQ ID NO: 1),pRP9, pRPlO, pRPll, pRP12 (SEQ ID NO: 3), e pRP13, tendo acapacidade de eliciar ou promover uma resposta bivalentecontra os antígenos associados a tumor PRAME e PSMA,especificamente contra os epitopos PRAME425-433 e PSMA288-297·Em modalidades especificas da invenção são fornecidos osplasmideos, pRP12 e pRP8 como composições imunogênicas. Ametodologia para gerar construções de plasmideo da invençãoé como detalhada abaixo.

A construção de plasmideo em modalidadespreferidas pode abranger ligação escalonada de conjuntos deoligonucleotideos complementares longos resultando nageração de epitopos que codificam seqüência de DNA reunidascomo um "cordão de contas". Esses DNAs contêm extremidadescoesas apropriadas para enzimas de restrição que podem serutilizadas para ligação adicional com regiões deagrupamentos de epitopos que codificam DNAs, os quais sãoamplificados pela execução de PCR em cDNA clonado para PSMAou PRAME como gabarito. A inserção inteira é então ligadana estrutura de vetor entre sítios de restrição Afl II eEcoR I. A seqüência de codificação inteira é verificada porsequenciamento de DNA. Mutagênese baseada em PCT pode serutilizada para gerar peptídeo de epítopo análogo quecodifica seqüência, ou ajustar o número de cópias deepitopos dominante/subdominante para obter a razãodesejada. As seqüências dos dois plasmideos, RP8 e RP12,são descritas em detalhe e reveladas como SEQ ID NO. 1 eSEQ ID NO. 3. Para os plasmideos específicos descritosaqui, a estrutura de vetor é uma versão modificada de pVAX,por Invitrogen (Carlsbad, CA), que foi previamente reveladana patente US 6.709.844 intitulada Avoidance of UndesirableReplication Intermediates in Plasmid Propagation, e pedidode patente US no. 09/561.572 intitulado Expression VectorsEncoding Epitopes of target-associated antigens, cada umdos quais é pelo presente incorporado a titulo dereferência na integra. Uma pessoa versada na técnicareconhecerá que as seqüências de codificação da presenteinvenção podem ser colocadas em qualquer vetor de ácidonucléico apropriado para uso como vacina sem exceder oescopo da invenção. Por exemplo, as seqüências quecodificam os outros plasmideos mencionados podem serinseridas na estrutura igual ou similar como utilizado emplasmideos pRP8 e pRP12.

pRP8 e pRP12 são plasmideos de DNA recombinantesque codificam um polipeptideo com epitopos de CTL restritosa HLA A2 a partir de PSMA (288-297 e um análogo do mesmo) ePRAME (425-433). Os dois polipeptideos também incluemregiões compreendendo agrupamentos de epitopos de PSMA (3-45, 217-297) e PRAME (422-509). Flanqueando epitopos PSMA ePRAME definidos estão seqüências de aminoácido curtasótimas para liberação dos epitopos em questão porprocessamento de imunoproteassoma. A. seqüência decodificação para o polipeptideo no plasmideo está sob ocontrole de seqüência intensificadora/promotora a partir decitomegalovirus (CMVp), que permite transcrição eficientede mRNA para o polipeptideo após absorção por APCs. 0 sinalde poliadenilação de hormônio de crescimento bovino (BGHpoliA) na extremidade 3' da seqüência de codificação provêum sinal para poliadenilação do mensageiro para aumentarsua estabilidade bem como para translocação para fora donúcleo para dentro do citoplasma para translação. A fim defacilitar transporte de plasmideo para dentro do núcleoapós absorção, uma seqüência de importação nuclear (NIS) apartir de virus simian 40 (SV40) foi inserida na estruturade plasmideo. 0 plasmideo contém duas cópias de um motivoimunoestimulador CpG, uma na seqüência NIS e um naestrutura de plasmideo. Por último, dois elementosgenéticos procarióticos no plasmídeo são responsáveis poramplificação em E. coli, o gene de resistência à canamicina(Kan R) e a origem bacteriana de replicação pMBl.

A. Plasmideo de DNA recombinante RP8

Para RP8, a seqüência de aminoácidos dopolipeptideo codificado (297 resíduos de aminoácido emcomprimento; SEQ ID NO: 2) contém duas seqüências deliberação, um substrato de 17 aminoácidos em suaextremidade-N para PRAME422-433 (MKRPSIKR- SLLQHLIGL; SEQ IDNO: _) e um substrato de 66 aminoácidos em suaextremidade-C para PSMA288-297 (RK-GLPSIPVHPI-LV-GLPSIPVHPI-KRISPEKEEQYAKR-GLPSIPVHPI-KRPSIK-RGLPSIPVHPV; SEQ ID NO:8). A seqüência de polipeptideo inteira do imunógenocodificado (SEQ ID NO: 2) é mostrada na figura 8.

O trecho dos primeiros 8 resíduos de aminoácidosé uma seqüência artificial que foi mostrada comofacilitando o processamento de epítopos CTL porimunoproteassomas. Os 9 aminoácidos seguintes (em itálico)são PRAME425-433, um epítopo CTL específico de HLA A-2potente que desencadeia respostas imunes anti-tumor fortestanto em imunização in vitro de PBMC humano como imunizaçãoin vivo em camundongos. Essa seqüência de epítopo PRAME éseguida por um segmento (aminoácido 18-105 do imunógeno) dePRAME422-509, compreendendo dois agrupamentos de epítopos:PRAME422-443 e PRAME459-487 . Dois grupos de epítopo de PSMA (emitálico), PSMA3-45 (aminoácido 108-150); e PSMA217-297(aminoácido 151-231), são colocados após o agrupamento deepítopo PRAME. Esses e outros grupos de epítopo PRAME ePSMA foram revelados nos pedidos de patente US nos.10/117.937, 11/067.064, e 11/067.159, cada um intituladoEpitope Sequences e cada um dos quais é pela presenteincorporado a título de referência na íntegra. Esses gruposde epítopo contêm um número de epítopos específicos de HLAΑ2 previstos e desse modo, podem ser úteis na geração deuma resposta a epitopos imunes (descritos na publicação dopedido de patente US no. 20030215425 intitulado EPITOPESYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS e publicação depedido de patente US nos. 20030228634; 20040132088; e20040203051, intitulados EPITOPE CLUSTERS, cada um dosquais é pelo presente incorporado a titulo de referência naintegra). Um conjunto de epitopos de "cordão de contas" commúltiplas cópias de PSMA288-297 (GLPSIPVHPI (SEQ ID NO: 6) ;em tipo negrito) constitui o resto do polipeptideo(aminoácido 232-297) . Quatro cópias de PSMA288-297 sãoincorporadas com a última cópia sendo um análogo(GLPSIPVHPV; SEQ ID NO: 7) . Tanto o PSMA288-297 nativo comoseu análogo foi mostrado como induzindo respostas CTLsignificativas tanto em imunização in vitro de PBMC humanocomo imunização in vivo em camundongos com o análogoexibindo ligação de MHC classe I e imunogenicidade,elevadas. Entre as seqüências de epitopo PSMA288-297 estãoseqüências de aminoácidos curtas designadas para serem"seqüências ajudantes de clivagem" a fim de facilitar, oprocessamento e liberação do epitopo. Esses dois epitopossão desse modo codificados de tal modo que possam serexpressos, processados e apresentados por pAPCs.

B. Plasmideo de DNA recombinante RP12Para o plasmídeo RP12, a seqüência de aminoácidodo polipeptideo codificado (275 resíduos de aminoácido emcomprimento; SEQ ID NO: 4) contém um substrato deaminoácido ou seqüência de liberação e um "cordão decontas" híbrido abrangendo um substrato em sua extremidade-C para a liberação dos epitopos tanto PRAME como PSMA. Aseqüência de polipeptideo inteira do imunógeno codificado émostrada na figura 9. A seqüência de liberação representadacomo SEQ ID NO: 9 é como a seguir: KR- SLLQHLIGL - G DAAY -SLLQHLIGL-ISPEKEEQYIA-SLLQHLIGL-KRPSIKR-GLPSIPVHPV.

Segmentos de aminoácido 2-44, 45-126, e 127-213do imunógeno codificado são agrupamentos de epitopos unidosum ao seguinte: PSMA3-45, PSMA217-297, e PRAME422-509,respectivamente. No substrato híbrido de "cordão decontas", há 3 cópias de PRAME422-433 (SLLQHLIGL; em tiponegrito; SEQ ID NO. : 5) e uma cópia de análogo PSMA288-297(GLPSIPVHPV; em sans serif tipo negrito; SEQ ID NO: 7) naextremidade-C do polipeptideo. Entre as seqüências deepítopo P RAME 4 25-433 e PSMA288-297 estão as seqüências deaminoácido curtas designadas para serem "seqüênciasajudantes de clivagem" a fim de facilitar processamento eliberação dos epitopos. Esses dois epitopos são desse modocodificados de tal modo que possam ser expressos,processados, e apresentados por pAPCs.

Detalhes adicionais sobre o plasmídeo RP12 sãorevelados no pedido de patente provisional US no.60/691.579, depositado em 17 de junho de 2005, intituladoMETHODS AND COMPOSITIONS TO ELICIT MULTIVALENT IMMUNERESPONSES AGAINST D0MINANT AND SUBDOMINANT EPITOPES,EXPRESSED ON CÂNCER CELLS AND TUMOR STROME, incorporadoaqui a título de referência na íntegra. Todos os outrosplasmídeos foram construídos em um modo similar utilizandoa metodologia como aplicada a RP8 e RP12. 0 plasmídeo R2,também mencionado como pCTLR2, é revelado nos Exemplos. 0plasmídeo P2 como mostrado nas figuras 1 e 3, é umplasmídeo PSMA monovalente. 0 plasmídeo RP5 abrangeelementos tanto de P2 como de R2.

Várias metodologias para construir ou projetarplasmídeos são bem estabelecidas na técnica como seriaconhecido ao técnico especializado. Tais metodologias sãodescritas em muitas referências, como por exemplo,Molecular Cloning, Sambrook J. e Russell D.W., CSHL Press,(2001), especificamente incorporada aqui a titulo dereferência.

Na construção dos ácidos nucléicos que codificamos epítopos de polipeptideo da invenção, a seqüência degene do antigeno associado a tumor associado (por exemplo,PRAME e PSMA) pode ser utilizada, ou o polinucleotideo podeser montado a partir de qualquer um dos códonscorrespondentes. Para um epitopo de 10 aminoácidos issopode constituir da ordem de IO6 seqüências diferentes,dependendo da composição de aminoácido especifica.

Embora grande, esse é um conjunto distinto e facilmente definivelrepresentando uma fração minúscula dos >1018polinucleotideos possíveis desse comprimento, e desse modoem algumas modalidades, equivalentes de uma seqüênciaespecífica revelada aqui abrangem tais variações distintase facilmente definíveis na seqüência listada. Ao escolheruma seqüência específica dessas seqüências para utilizar emuma vacina, considerações como uso de códon, auto-complementaridade, sítios de restrição, estabilidadequímica, etc., podem ser utilizadas como será evidente parauma pessoa versada na técnica.

Um cluster de epítopos, como considerado napresente invenção, é um polipeptideo, ou uma seqüência deácido nucléico codificando o mesmo, que é um segmento deuma seqüência de proteína nativa compreendendo dois ou maisepítopos conhecidos ou previstos com afinidade de ligaçãopara um elemento de restrição de MHC compartilhado, onde adensidade de epítopos no grupo é maior do que a densidadede todos os epítopos conhecidos ou previstos com afinidadede ligação para o elemento de restrição de MHCcompartilhado na seqüência de proteína completa. Grupos deepitopo e seus usos são descritos nas publicações de pedidode patente US nos. 20030220239, 20050221440, 20050142144;20030215425, 20030228634, 20040132088, 2004020351 epublicação do pedido de patente PCT no. PCT/US/11101; todosos quais são incorporados aqui a titulo de referência naintegra.

Um substrato ou seqüência de liberação comoempregado na presente invenção, é uma seqüência construídaou projetada compreendendo ou codificando um epítopo PRAMEe/ou PSMA incorporado em uma seqüência maior que provê umcontexto permitindo que o epítopo PRAME e/ou PSMA sejaliberado por processamento imunoproteassomal, diretamenteou em combinação com aparamento de terminal-N ou outrosprocessos.

O que se segue são exemplos adicionais deseqüências de polipeptídeo codificado que podem serutilizados em algumas modalidades, por exemplo, podem sercodificados pelos vários plasmídeos ou utilizados nosmétodos, etc.

R2

MALQSLLQHLIGLSNLTHVLYP VPLES YEDIHGTLHLERLAYLHARLRELLCELGRPSMVWLSANPCPHCGDRTFYDPEPILCPCFMPNKRSLLQHLIGLGDAAYSLLQHLIGLISPEKEEQYIASLLQHLIGLKRPSIBCRSLLQHLIGL

P2

MNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYR

RGIAEAVGLPSIPVHPIRKGLPSIPVHPILVGLPSIPVHPIKRISPEKEEQYIAKRGLPSIPVHPIKRPSIKRGLPSIPVHPI

RP5

MSPEKEEQYIASLLQHLIGLKRSLLQHLIGLKRPSIKRSLLQHLIGLALQSLLQHLIG

LSNLTHVLYPVPLESYEDIHGTLHLERLAYLHARLRELLCELGRPSMVWLSANPCP

HCGDRTFYDPEPILCPCFMPNKXNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFL

LGFLFGWFIKSAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGYQRGNIL

NLNGAGDPLTPGYP ANEYA YRRGIAEAVGLPSIPVHPIRKGLPSIPVHPILVGLPSIP

VHPIKRISPEKEEQYIAKRGLPSIPVHPIKRPSIKRGLPSIPVHPI

RP9

MISPEKEEQYIASLLQHLIGLKRPSIKRSLLQHLIGLALQSLLQHLIGLSNLTHVLYPVPLESYEDIHGTLHLERLAYLHARL RELLCELGRPSMV WLS ANPCPHCGDRTFYDPEPILCPCFMPNKLNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSAQLAGAKGVILYSDP AD YFAPGYKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYP ANEYA YRRGIAEAVGLPSIPVHPIRKGLPSIPVHPILVGLPSIPVHPVKRGLPSIPVHPVKRPSVKRGLPSIPVHPVRP10

MISPEKEEQYIASLLQHLIOLALQSLLQHLIGLSNLTHVLYPVPLESYEDIHGTLHLERLAYLHARLRELLCELGRFSMVWLSANPCPHCGDRTFYDPEPILCPCFMPNKLNLLHETDSA VATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSAQLAGAKGVIL YSDPAD YF APGVKS YPDGWNLPGGGVQRGMLNLNGAGDPLTPG YP ANEYA YRRGLAEA VGLPSIPVHPIRKGLPSIP VHPIL VGLPSIPVHPVKRGLPSIPVHPVKRPSVKRGLPSIPVHPV

RP11

MKRSLLQHLIGLKRPS1KRSLLQHLIGLALQSLLQHLDLSNLTHVLYPVPLESYEDIHGTLHLERLA YLHARL RELLCELGRPSMVWLSANPCPHCGDRTFYDPEPILCPCFMPNKLNLLHETDSAV ATARRPR WLCAGAL VLAGGFFLLGFLFGWFIKSAQLAGAKGVIL YSDPAD YF APGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYP ANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIRKGLPSIPVHPVLVGLPSPVHPVKRISPEKEEQYIAKRGLPSIPVHPIKRPSIKRGLPSIPVHPV

RP13

MKRSLLQHLIGLKRPSIKRSLLQHLIGLALQSLLQHLIGISNLTHVLYPVPLESYEDIHGTLHLERLA YLHARLRELLCELGRPSMVWLSANPCPHCGDRTFYDPEPILCPCFMPNKLNLLHETDSAVATARRPR WLCAGAL VLAGGFFLLGFLFGWFIKSAQLAGAKGVIL YSDPAD YF APGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYP ANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPVLVGLPSIPVHPVKRISPEKEEQYIAKRGLPSIPVHPIKRPSIKRGLPSIPVHPV

II. Composições imunogênicas da presente invenção

A presente invenção considera o uso de múltiplasmoléculas expressas por células de câncer e pelaneovasculatura como alvos terapêuticos no tratamento decâncer por imunoterapia ativa. Tais moléculas incluemantigenos associados a tumor (TuAAs) que são antigenosexpressos pela própria célula de câncer ou associados acomponentes não cancerosos do tumor, como neovasculaturaassociada a tumor ou outro estroma. A determinação deperfis de expressão de TuAA pode ajudar a combinar acondição ou tipo de câncer de um paciente com um regime ouagente imunoterapêutico apropriado. Em modalidadesespecificas, epitopos dos antigenos associados a tumorPRAME e PSMA são empregados no projeto de plasmideosbivalentes que podem eliciar uma resposta imune forte em umsujeito em quem tal plasmídeo são administrado comoterapêutica de câncer. Análogos reativos cruzados de PRAMEe PSMA são também considerados nas modalidades da presenteinvenção.O antigeno associado a tumor PRAME, empregado napresente invenção, também é conhecido como MAPE, DAGE e0IP4. PRAME é conhecido na técnica como um antigeno decâncer de testículos (CT). Entretanto, ao contrário demuitos antígenos CT, como: MAGE, GAGE e BAGE, é expresso emleucemias de mielóide agudas. PRAME como TuAA é revelado napatente US no. 5.830.753, incorporada aqui a título dereferência na íntegra. Em modalidades preferidas, apresente invenção provê epítopos de PRAME e seus análogos.

Outro TuAA empregado na presente invenção é oantigeno de membrana específico de próstata (PSMA).Verifica-se que PSMA é altamente expresso em células decâncer de próstata. Entretanto, a expressão de PSMA tambémé observada em epitélio normal de próstata e naneovasculatura de tumores não prostáticos. PSMA como umapreparação anti-neovasculatura é revelado no pedido depatente provisional US no. 60/274.063, e pedido depublicação de patente US nos. 20030046714 e 20050206234;cada um dos quais é incorporado aqui a título de referênciana íntegra. PSMA como um TuAA é descrito na patente US no.5.538.866 incorporada aqui a título de referência naíntegra. Em modalidades preferidas, a presente invençãoprovê epítopos de PSMA e análogos dos mesmos.

Análogo reativo cruzado, como utilizado aqui,pode se referir a um peptídeo compreendendo substituiçõesde 1-3 aminoácidos, e/ou deleção ou adição de um aminoácidocomo comparado com a seqüência de peptídeo nativo que induzfunção efetora (por exemplo, secreção de citocina oucitólise) distinguível do antecedente, de um CTL reativocom o peptídeo nativo. Em modalidades preferidas a funçãoefetora é pelo menos 30, 50, 60, 70 ou 80% daquela induzidapelo peptídeo nativo.

Em algumas modalidades da presente invenção,peptídeos compreendendo a seqüência nativa ou análogos(reativo-cruzado) de PRAME e PSMA também podem seradministrados como um reforço de peptideo em combinação comos plasmideos da invenção. Seqüências de peptideo nativo eanálogos de peptideo de PRAME e PSMA, são revelados nopedido de patente US no. 20060057674 e pedido de patenteprovisional no. 60/691.889, cada um dos quais é pelopresente incorporado a titulo de referência na integra. Osanálogos de peptideo, PRAME425-433 L426Nva, L433Nle e PSMA28S-297 1297V são descritos no pedido provisional US no.60/580.962; pedido de patente US no. 11/155.929; pedido depatente US no. 60/581.001; pedido de patente US no.11/156.253; pedido de patente US 11/156.369, pedido depatente provisional US no. 60/691.889, pedido de patente USno. _/_, intitulado PRAME PEPTIDE ANALOGUES (No. Dodossiê do procurador MANNK.052A), pedido de patente US no._/_ intitulado PSMA PEPTIDE ANALOGUES (No. Do dossiêdo procurador MANNK.0 5 2A2), e pedido de patente US no._/_ intitulado MELANOMA ANTIGEN PEPTIDE ANALOGUES(No. Do dossiê do procurador MANNK.052A3) cada um dos quaisé pelo presente incorporado a titulo de referência naintegra.

Como discutido acima, algumas modalidades sereferem a composições imunogênicas para o tratamento decâncer compreendendo plasmideos que codificam epitopos deCTL de PRAME e PSMA e análogos reativos cruzados dosmesmos. Tal composição imunogênica pode eliciar umaresposta imune mediada por célula forte ou robusta paraalvejar um câncer especifico desse modo eliminando,erradicando ou melhorando o câncer em um sujeito.

III. Terapêutica de arraste e amplificação paraadministração

Em uma modalidade preferida, a presente invençãoprovê uma composição imunogênica que compreende umconstruto de ácido nucléico codificando os epitopos CTLPRAME425-433 e PSMA288-297 ou um análogo reativo-cruzado dequalquer um ou ambos esses epitopos. Em algumas modalidadesda invenção uma abordagem de iniciador de plasmideo /reforço de peptideo pode ser empregada onde o plasmideo deDNA recombinante expressando os epitopos PRAME e PSMA podeser administrado em combinação com um peptideo sintéticocomo peptideo PRAME e ou PSMA ou análogo do mesmo.

A composição imunogênica da invençãocompreendendo um construto de ácido nucléico que codificaos epitopos CTL PRAME425-433 e PSMA288-297 ou um análogoreativo-cruzado de um ou ambos os epitopos, pode serfornecida através de injeção de linfonodo, diretamente nosórgãos onde as respostas imunes são iniciadas eamplificadas, de acordo com um programa de imunizaçãootimizado. As modalidades da presente invenção podem seradministradas em pacientes com tecido de tumor que expressaHLA-A2, particularmente HLA-A*0201. Portanto, a composiçãoimunogênica que compreende um plasmideo e um ou maispeptideos ou análogos dos mesmos pode ser administrada notratamento de câncer em um sujeito. As modalidadesreveladas da presente invenção se referem à terapêutica dearrastar-e-amplificar para câncer que pode ser utilizadapara obter um ataque bi- ou multivalente, oferecendo avantagem de aumentar a sensibilidade do tumor ao ataque.

Portanto, em modalidades especificas, a presenteinvenção provê terapêutica de arrastar-e-amplificarbivalente para o tratamento de câncer. Tal terapêuticabivalente pode alvejar mais de um antigeno em uma célula detumor. Em instâncias onde mais de um antigeno único em umacélula de tumor é alvejado, a concentração eficaz deterapêutica anti-tumor é aumentada de acordo. O ataque naestroma associada ao tumor, como vasculatura, pode aumentara acessibilidade das células de tumor ao(s) agente(s) quealveja as mesmas. Desse modo, mesmo um antígeno que éexpresso também em algum tecido normal pode receber maiorconsideração como antigeno alvo se os outros antigenos aserem alvejados em um ataque bi- ou multivalente não foremexpressos também por aquele tecido. Os plasmideos dapresente invenção podem ser utilizados em combinação complasmideos adicionais que expressam outros epitopos, epeptideos de amplificação correspondentes, para criarprotocolos terapêuticos de valência mais elevada. Produtosimunogênicos exemplares são revelados no pedido de patenteprovisional US no. 60/691.581, depositado em 17 de junho de2005 e pedido de patente US no. _/_ (No. Dossiê doprocurador MANNK.054A) depositado na mesma data do presentepedido, cada um intitulado MULTIVALENT ENTRAIN-AND-AMPLIFYIMMUNOTHERAPEUTICS FOR CARCINOMA, e cada um incorporado atitulo de referência na integra.

Um imunógeno "de arraste" como considerado napresente invenção, inclui em muitas modalidades uma induçãoque confere particularmente estabilidade no perfil imune dalinhagem induzida de células T.

Como considerado na presente invenção, o termo"amplificar ou amplificação", como de uma resposta decélula T, inclui em muitas modalidades um processo paraaumentar o número de células, o número de células ativadas,o nível de atividade, taxa de proliferação, ou parâmetrosimilar de células T envolvidos em uma resposta específica.

O protocolo arrastar-e-amplificar empregado napresente invenção é descrito em maior detalhe na publicaçãode patente US no. 20050079152, pedido de patenteprovisional US no. 60/640.402, e pedido de patente US no.11/323.572 cada um intitulado "METHODS TO ELICIT, ENHANCEAND SUSTAIN IMMUNE RESPONSES AGAINST MHC CLASS I-RESTRICTEDEPITOPES, FOR PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC PURPOSES," quesão incorporados aqui a título de referência na íntegra.

IV. Modlficadores de resposta biológica (BKMs) ouImunopotenciadores

Em algumas modalidades, a presente invenção podeempregar ainda um modificador de resposta biológica (BRM)ou imunopotenciador em combinação com as composiçõesimunogênicas compreendendo um plasmídeo de DNA recombinanteque codifica os epítopos CTL PRAME e PSMA, em eliciar umaresposta imune. Os imunopotenciadores ou BRMs consideradospela presente invenção, podem atuar em um modoimunossupressivo ou imunoestimulador para mediar umaresposta imune. Imunopotenciadores ou BRMs da presenteinvenção podem se referir a qualquer molécula que modula aatividade do sistema imune, ou as células dos mesmos,através de uma interação diferente de um receptor deantígeno. BRMs, como considerados na presente invenção,podem incluir adicionalmente moléculas orgânicas pequenasnaturais ou sintéticas que exercem efeitos de modulaçãoimune por estimular vias de imunidade inata.

Em modalidades específicas, a presente invençãotambém considera imunopotenciadores ou BRMs que podemincluir, porém não são limitados a, por exemplo: citocinascomo IL-12, IL-18, GM-CSF, ligando flt3 (flt3L),interferons, TNF-alfa, e similares; quimiocinas como IL-8,MIP-3alfa, ΜΙΡ-lalfa, MCP-1, MCP-3, RANTES, e similares.Outros exemplos de BRMs que podem ser utilizados napresente invenção são moléculas que desencadeiam produçãode citocina ou quimiocina, como ligandos para receptoressemelhantes a Toll (TLRs), peptidoglicanos, LPS ouanálogos, oligodesoxinucleotídeos CpG não metilados (CpGODNs); dsRNAs como dsDNA bacteriano (que contém motivosCpG) e dsRNA sintético (poliI:C) em APC e células imunesinatas que se ligam a TLR9 e TLR3, respectivamente. Umaclasse de BRM inclui principalmente moléculas naturais ousintéticas, orgânicas pequenas, que exercem efeitos demodulação imune por estimular vias de imunidade inata.Desse modo, moléculas pequenas que se ligam a TLRs como umanova geração de imidazoquinolinas anti-virais puramentesintéticas, por exemplo imiquimod e resiquimod, que severificou estimularem o percurso celular de imunidade porligação de TLRs 7 e 8 (Hemmi, H. e outros, Nat. Immunol. 3:196-200, 2002; Dummer, R. E outros, Dermatology 207: 116-118, 2003; cada um dos quais é aqui incorporado a titulo dereferência na integra) podem ser empregados. BRMs podemincluir, ainda, adjuvantes de imunopotenciação que ativampAPC ou células T incluindo, por exemplo: ligandos deReceptor de Reconhecimento de Padrão-endocitico (PRR),quillaja saponinas, tucaresol e similares.

V. Métodos de fornecimento de composições da presenteinvenção

Na presente invenção, a administração preferidada composição imunogênica compreendendo plasmideos de DNArecombinantes que codificam os epitopos CTL PRAME e PSMA,ou tais plasmideos seguidos por um ou mais peptídeo(s) comoum ou mais reforço, é através de injeção no linfonodo.Outros protocolos de imunização, por exemplo, utilizandoplasmideo para outra do que a dose(s) de iniciação, sebaseando somente em plasmideo, ou utilizando outros tiposde reagentes de reforço, embora modalidades menospreferidas, não são excluídas do escopo da invenção. Asmodalidades da presente invenção abrangem plasmideosbivalentes que expressam os imunógenos tanto PRAME comoPSMA. No fornecimento das composições imunogênicas dainvenção a um sujeito necessitando das mesmas, injeção delinfonodo é preferida, pois permite fornecimentodiretamente nos órgãos onde as respostas imunes sãoiniciadas e amplificadas de acordo com um programa deimunização otimizado.

Para introduzir a composição imunogênica nosistema linfático do paciente, a composição épreferivelmente dirigida a um vaso linfa, linfonodo, baçoou outra porção apropriada do sistema linfático. Em algumasmodalidades cada componente é administrado como um bolo. Emoutras modalidades, um ou mais componentes são fornecidospor infusão, genericamente através de várias horas a váriosdias. Preferivelmente, a composição é dirigida a umlinfonodo como um nodo inguinal ou axilar pela inserção deum cateter ou agulha no nodo e mantendo o cateter ou agulhadurante todo o fornecimento. Agulhas ou cateteresapropriados são disponíveis feitos de metal ou plástico(por exemplo, poliuretano, cloreto de polivinil (PVC),TEFLON, polietileno, e similares) . Na inserção do cateterou agulha no nodo inguinal por exemplo, o nodo inguinal éperfurado sob controla ultra-sonográfico utilizando umacânula Vialon™ Insyte™ e cateter de 24G3/4 (BectonDickinson, USA) que é fixa utilizando curativo transparenteTegaderm™ (Tegaderm™, St. Paul, MN, EUA). Um radiologistaexperiente faz genericamente esse procedimento. Alocalização da ponta do cateter dentro do linfonodoinguinal é confirmada por injeção de um volume mínimo desolução salina, que aumenta imediata e visivelmente otamanho do linfonodo. 0 procedimento mencionado por últimopermite confirmação de que a ponta está dentro do nodo.Esse procedimento pode ser executado para assegurar que aponta não deslize para fora do linfonodo e pode serrepetido em vários dias após implantação do cateter.

A(s) composição(ões) terapêutica(s) da presenteinvenção pode(m) ser administrada(s) a um paciente em ummodo compatível com protocolos de fornecimento de vacinapadrão que são bem conhecidos por uma pessoa comconhecimentos comuns na técnica. Os métodos de administrarcomposições imunogênicas da presente invenção compreendendoplasmídeos e peptídeos ou análogos de peptídeo dos TuTVAsPRAME e PSMA incluem, sem limitação, administraçãotransdérmica, intranodal, perinodal, oral, intravenosa,intradérmica, intramuscular, intraperitoneal e por mucosa,fornecimento por injeção ou instilação ou inalação. Ummétodo particularmente útil de fornecimento de vacina paraeliciar uma resposta CTL é revelado na patente australianano. 739189; patentes US nos. 6.994.851 e 6.977.074 ambasintituladas "A METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE".

Vários parâmetros podem ser levados emconsideração no fornecimento ou administração de umacomposição imunogênica a um sujeito. Além disso, um regimede dosagem e programa de imunização podem ser empregados.Genericamente, a quantidade dos componentes na composiçãoterapêutica variará de paciente para paciente e de antígenopara antígeno, dependendo de tais fatores como: a atividadedo antígeno em induzir uma resposta; a taxa de fluxo dalinfa através do sistema do paciente; o peso e idade dosujeito; o tipo de doença e/ou condição sendo tratada; agravidade da doença ou condição; intervenções terapêuticasprévias ou simultâneas; a capacidade do sistema imune doindivíduo em sintetizar anticorpos; o grau de proteçãodesejado; o modo de administração e similares, todos osquais podem ser facilmente determinados pelo médico.

Em geral a composição terapêutica pode serfornecida em uma taxa de aproximadamente 1 aaproximadamente 500 microlitros/hora ou aproximadamente 24a aproximadamente 12000 microlitros/dia. A concentração doantigeno é tal que aproximadamente 0,1 microgramas aaproximadamente 10.000 microgramas do antigeno serãofornecidos durante 24 horas. A taxa de fluxo se baseia noconhecimento de que cada minuto aproximadamente 100 aaproximadamente 1000 microlitros de fluido linfa fluiatravés de um linfonodo inguinal de adulto. O objetivo émaximizar concentração local de formulação de vacina nosistema linfa. Uma certa quantidade de investigaçãoempírica em pacientes será necessária para determinar onível mais eficaz de infusão para uma dada preparação devacina em seres humanos.

Em modalidades específicas, a composiçãoimunogênica da presente invenção pode ser administrada comoum número de doses seqüenciais. Tais doses podem ser 2, 3,4 ou mais doses conforme necessário para obter a respostaimune apropriada. Em modalidades adicionais da presenteinvenção, considera-se que as doses da composiçãoimunogênica seriam administradas em aproximadamentesegundos ou minutos entre si nos linfonodos inguinaisdireito ou esquerdo. Por exemplo, o plasmídeo (iniciador)pode ser primeiramente injetado no linfonodo direitoseguido em segundos ou minutos por um segundo plasmídeo noslinfonodos inguinais direito ou esquerdo. Em outrasinstâncias a combinação de um ou mais plasmídeo expressandoum ou mais imunógenos pode ser administrada. Prefere-se quea injeção subseqüente após a primeira injeção no linfonodoseja em aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oumais minutos porém não mais do que aproximadamente 30, 40,50 ou 60 minutos da primeira injeção. Consideraçõessimilares se aplicam à administração de dois peptídeosindividualmente aos linfonodos direito e esquerdo. Pode serdesejável administrar as doses da composição imunogênica dainvenção em um intervalo de dias, onde vários dias (1, 2,3, 4, 5, 6 ou 7 ou mais dias) decorrem entre administraçõessubseqüentes. Em outras instâncias, pode ser desejável paraadministração(ões) subseqüente(s) das composições dainvenção serem administradas através de injeção bilateralde linfonodo inguinal em aproximadamente 1, 2, 3 ou maissemanas ou em aproximadamente 1, 2, 3 ou mais meses após aadministração de dose inicial.

A administração pode estar em qualquer modocompatível com a formulação de dosagem e em tal quantidadecomo será terapeuticamente eficaz. Uma dose ou quantidadeeficaz de uma composição imunogênica da presente invenção éaquela quantidade necessária para fornecer uma respostadesejada no sujeito a ser tratado.

Além daqueles pedidos já revelados nesse pedido,os seguintes pedidos são pela presente expressamenteincorporados a titulo de referência na integra. Métodosúteis para utilizar os análogos revelados na indução,arraste, manutenção, modulação e amplificação de respostasde célula T restrita a MHC classe I, e particularmenterespostas de CTL de memória e efetor a antigeno, sãodescritas nas patentes US nos. 6.994.851 (7/2/06) e6.977.074 (20/12/2005) ambas intituladas "A method ofinducing a CTL response"; pedido provisional US no.60/479.393, depositado em 17 de junho de 2003, intitulado"METHODS TO CONTROL MHC CLASS I-RESTRICTED IMMUNERESPONSE"; e pedido de patente US no. 10/871.707 (pub. No.2005 0079152) e pedido de patente US provisional no.60/640.402 depositado em 29 de dezembro de 2004, ambosintitulados "METHODS TO ELICIT, ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNERESPONSES AGAINST MHC CLASS I-RESTRICTED EPITOPES, FORPROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC PURPOSE". Os análogos tambémpodem ser utilizados na pesquisa para obter análogosotimizados adicionais. Inúmeros epitopos constitutivos sãofornecidos nos pedidos US nos. 10/117.937, depositado em 4de abril de 2002 (pub. No. 20030220239 Al), e 10/657.022(20040180354), e no pedido PCT no. PCT/US2003/027706 (pub.No. W004022709A2), depositado em 5 de setembro de 2003; epedido provisional US nos. 60/282.211, depositado em 6 deabril de 2001; 60/337.017, depositado em 7 de novembro de2001; 60/363.210 depositado em 7 de março de 2002; e60/409.123, depositado em 5 de setembro de 2002; cada umdos pedidos é intitulado "EPITOPE SEQUENCES." Os análogospodem ser utilizados adicionalmente em qualquer um dosvários modos descritos nesses pedidos. Grupos de epitopo,que podem compreender ou incluir os presentes análogos, sãorevelados e mais completamente definidos no pedido depatente US no. 09/561.571, depositado em 28 de abril de2000, intitulado EPITOPE CLUSTERS. A metodologia parautilizar e fornecer os presentes análogos é descrita nospedidos de patente US 09/380.534 e 6977074 (expedidos em 20de dezembro de 2005) e no pedido PCT no. PCTUS98/14289(pub. No. WO9902183A2), cada um intitulado "METHOD OFINDUCING A CTL RESPONSE". Os princípios benéficos deseleção de epitopo para tal imunoterapêutica são reveladosnos pedidos de patente US nos. 09/560.464, depositado em 28de abril de 2000, 10/026.066 (pub. No. 20030215425 Al),depositado em 7 de dezembro de 2001, e 10/005.905depositado em 7 de novembro de 2001, todos intitulados"EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS";6.861.234 (expedido em 01 de março de 2005; pedido no.09/561.074), intitulado "METHOD OF EPITOPE DISCOVERY";09/561.571, depositado em 28 de abril de 2000, intituladoEPITOPE CLUSTERS; 10/094.699 (pub. No. 20030046714 Al),depositado em 7 de março de 2002, intitulado "ANTI-NEOVASCULATURE PREPARATIONS FOR CÂNCER"; pedidos nos.10/117.937 (pub. No. 20030220239 Al) e PCTUS02/11101 (pub.No. W002081646Α2), ambos depositados em 4 de abril de 2002,e ambos intitulados "EPITOPE SEQUENCES"; e pedidos nos.10/657.022 e Pedido PCT no. PCT/US2003/027706 (pub. No.W004022709A2), ambos depositados em 5 de setembro de 2003,e ambos intitulados "EPITOPE SEQUENCES". Os aspectos dodesenho geral de plasmideos de vacina são revelados nopedido de patente US nos. 09/561.572, depositado em 28 deabril de 2000, intitulado "EXPRESSION VECTORS ENCODINGEPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS" e 10/292.413 (pub.No. 20030228634 Al), depositado em 7 de novembro de 2002,intitulado "EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN";10/225.568 (pub. No. 2003-0138808), depositado em 20 deagosto de 2002, Pedido PCT no. PCT/US2003/026231 (pub. No.WO 2004/018666), depositado em 19 de agosto de 2003, ambosintitulados "EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OFTARGET-ASSOCIATED ANTIGENS"; e patente US no. 6.709.844,intitulado "AVOIDANCE OF UNDESIRABLE REPLICATIONINTERMEDIATES IN PLASMID PROPAGATION". Combinaçõesantigênicas especificas de beneficio especifico naorientação de uma resposta imune contra cânceresespecíficos são reveladas no pedido de patente USprovisional no. 60/479.554, depositado em 17 de junho de2003 e pedido de patente US no. 10/871.708, depositado em17 de junho de 2004 e pedido de patente PCT no.PCT/US2 004/019571 (pub. No. WO 2004/112825), todosintitulados "COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS INVACCINES FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS". Antigenosassociados a neovasculatura de tumor (por exemplo, PSMA,VEGFR2, Tie-2) são também úteis com relação a doençascancerosas, como revelado no pedido de patente US no.10/094.699 (pub. No. 2003046714 Al), depositado em 7 demarço de 2002, intitulado "ANTI-NEOVASCULATURE PREPARATIONSFOR CÂNCER". Métodos para desencadear, manter e manipularrespostas imunes por administração alvejada demodificadores de resposta biológica são revelados em pedidoprovisional US no. 60/640.727, depositado em 29 de dezembrode 2004. os métodos para desviar células CD4+ na indução deuma resposta imune são revelados no pedido provisional USno. 60/640.821, depositado em 29 de dezembro de 2004.Doenças, organismos e antigenos e epitopos exemplaresassociados a organismos, células e doenças alvo sãodescritos no pedido US no. 6977074 (expedido em 20 dedezembro de 2005), depositado em 2 de fevereiro de 2001 eintitulado "METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE." Ametodologia exemplar é encontrada no pedido provisional USno. 60/580.969, depositado em 17 de junho de 2004, e pedidode patente US no. 2006-0008468-A1, publicado em 12 dejaneiro de 2006, ambos intitulados "COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN DIAGNOSTICS FOR VARIOUS TYPES OFCANCERS". A metodologia e composições são também reveladasno pedido provisional US no. 60/640.598, depositado em 29de dezembro de 2004, intitulado "COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN COMPOSITIONS FOR VARIOUS TYPES OFCÂNCER." A integração de técnicas de diagnóstico paradeterminar e monitorar a capacidade de resposta imune commétodos de imunização incluindo a utilização dos presentesanálogos é discutida mais completamente no pedido depatente US provisional no. 60/580.964 depositado em 17 dejunho de 2004 e pedido de patente US no. US-2005-0287068-Al, publicado em 29 de dezembro de 2005, ambos intitulados"IMPROVED EFFICACY OF ACTIVE IMMUNOTHERAPY BY INTEGRATINGDIAGNOSTIC WITH THERAPEUTIC METHODS". Vetores decodificação de polipeptideo imunogênico são revelados nopedido de patente US no. 10/292.413 (pub. No. 20030228634Al), depositado em 7 de novembro de 2002, intituladoEXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATEDANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN, e no pedidoprovisional US no. 60/691.579, depositado em 17 de junho de2005, intitulado "METHODS AND COMPOSITIONS TO ELICITMULTIVALENT IMMUNE RESPONSES AGAINST DOMINANT ANDSUBDOMINANT EPITOPES EXPRESSED ON CÂNCER CELLS AND TUMORSTROMA". A revelação útil adicional, incluindo métodos ecomposições de matéria, é encontrada no pedido provisionalUS no. 60/691.581, depositado em 17 de junho de 2005,intitulado "MULTIVALENT ENTRAIN-AND-AMPLIFYIMMUNOTHERAPEUTICS FOR CARCINOMA." Metodologia adicional,composições, peptideos, e análogos de peptideo sãorevelados nos pedidos provisionais US nos. 60/581.001 e60/580.962, ambos depositados em 17 de junho de 2004, erespectivamente intitulados "SSX-2 PEPTIDE ANALOGS" e "NY-ESO PEPTIDE ANALOGS." Cada um dos pedidos e patentesmencionados nos parágrafos acima é pela presenteincorporado a titulo de referência na integra por tudo querevela. Análogos, peptideos e métodos adicionais sãorevelados na publicação do pedido de patente US no.20060063913, intitulado "SSX-2 PEPTIDE ANALOGS"; epublicação de patente US no. 2006-0057673 Al, publicado em16 de março de 2006, intitulado "EPITOPE ANALOGS"; ePublicação do pedido PCT no. W0/2006/009920, intitulado"EPITOPE ANALOGS"; todos depositados em 17 de junho de2005. Metodologia e composições adicionais são revelados nopedido provisional US 60/581.001, depositado em 17 de junhode 2005, intitulado "SSX-2 PEPTIDE ANALOGS", e ao pedidoprovisional US no. 60/580.962, depositado em 17 de junho de2004, intitulado "NY-ESO PEPTIDE ANALOGS"; cada um dosquais é incorporado aqui a titulo de referência na integra.

Como exemplo, sem ser limitado ao mesmo cada referência éincorporada a titulo de referência pelo que revela sobreepitopos restritos a MHC classe I, análogos, o desenho deanálogos, usos de epitopos e análogos, métodos de utilizare fazer epitopos, e o desenho e uso de vetores de ácidonucléico para sua expressão. Outros pedidos que sãoexpressamente incorporados aqui a titulo de referência são:pedido de patente US no. de série 11/156.253 (publicaçãono.20060063913), depositado em 17 de junho de 2005,intitulado "SSEX-2 PEPTIDE ANALOGS"; pedido de patente USno. de série 11/155.929, depositado em 17 de junho de 2005,intitulado "NY-ESO-1 PEPTIDE ANALOGS" (publicaçãono.20060094661); pedido de patente US no. 11/321.967,depositado em 29 de dezembro de 2005, intitulado "METHODSTO TRIGGER, MAINTAIN AND MANIPULATE IMMUNE RESPONSES BYTARGETED ADMINISTRATION OF BIOLOGICAL RESPONSE MODIFIERSINTO LYMPHOID ORGANS"; pedido de patente US no. de série11/323.572, depositado em 29 de dezembro de 2005,intitulado "METHODS TO ELICIT ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNERESPONSES AGAINST MCH CLASS I RESTRICTED EPITOPES, FORPROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC PURPOSES"; pedido de patente USno. de série 11/323.520, depositado em 29 de dezembro de2005, intitulado "METHODS TO BYPASS CD4+ CELLS IN THEINDUCTION OF AN IMMUNE RESPONSE"; pedido de patente US no.de série 11/323.049, depositado em 29 de dezembro de 2005,intitulado "COMBINATION OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS INCOMPOSITIONS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS"; pedido depatente US no. de série 11.323.964, depositado em 29 dedezembro de 2005, intitulado "COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN DIAGNOSTICS FOR VARIOUS TYPES OFCANCERS"; pedido provisional US número de série60/691.889, depositado em 17 de junho de 2005 intitulado"EPITOPE ANALOGS."

VI. EXEMPLOSOs exemplos a seguir são incluídos parademonstrar modalidades preferidas da invenção no projeto deplasmídeos contendo epítopos imunogênicos de PSiMlA e PRAMEque são capazes de eliciar uma resposta imune bivalente.Deve ser reconhecido por aqueles versados na técnica que ametodologia revelada nos exemplos que se seguem representammetodologias descobertas pelos inventores como funcionandobem na prática da invenção, e desse modo podem serconsideradas como constituindo modos preferidos para suaprática. Entretanto, aqueles versados na técnica devem, àluz da presente revelação, apreciar que muitas mudançaspodem ser feitas nas modalidades específicas que sãoreveladas e ainda obter um resultado similar sem se afastardo espírito e escopo da invenção.

EXEMPLO 1

PROJETO DE VETORES DE EXPRESSÃO DE PLASMÍDEO QUE CODIFICAMIMMUNOGENS

Os plasmídeos P2 e R2 (também mencionados comopCTLR2) contêm elementos a partir de PSMA (expresso naneovasculatura de uma ampla gama de carcinomas ou porcélulas de carcinoma de próstata) e PRAME (expresso porcélulas cancerosas), respectivamente, (FIG. 1). Cadainserção abrange um fragmento da seqüência do antígenojuntamente com múltiplas cópias de um epítopo expresso porcélulas alvo e endereçável através de ataque mediado imune.Flanqueando esses epítopos estão seqüências que codificamaminoácidos conhecidos por facilitar o processamento egeração de peptídeos de epítopo nos compartimentoscelulares. Além disso, o plasmídeo RP5 abrange elementostanto de P2 como de R2 com os imunógenos expressoscontíguos entre si.

O plasmídeo R2 foi construído seguindo oprotocolo de construção de plasmídeo discutido acima e comorevelado no pedido de patente provisional US no.60/691.889, depositado em 17 de junho de 2005 intituladoEPITOPE ANALOGS; e pedido de patente US no. _/_ (No. Dodossiê do procurador MANNK.052A) intitulado PRAME EPITOPEANALOGS, incorporado aqui a titulo de referência naintegra. R2, também mencionado como pCTLR2, é uma vacina deplasmideo de DNA recombinante que codifica um polipeptideocom um epitopo de CTL especifico de HLA A2 a partir dePRAME, SLLQHLIGL, resíduos de aminoácidos 425-433, e umaregião de agrupamento de epítopos de PRAME, aminoácidos422-509. Na construção desse plasmideo, a seqüência de DNAcodificando o polipeptideo no plasmideo é colocada sob ocontrole da seqüência intensificador/promotora a partir decitomegalovirus (CMVp) que permite transcrição eficiente demensageiro para o polipeptideo após absorção pelas célulasque apresentam antígeno. Um sinal de poliadenilação dehormônio de crescimento bovino (BGH poliA) na extremidade3' da seqüência de codificação provê um sinal parapoliadenilação do mensageiro para aumentar sua estabilidadebem como para translocação para fora do núcleo para dentrodo citoplasma. A fim de facilitar transporte de plasmideopara dentro do núcleo, uma seqüência de importação nuclear(NIS) a partir de vírus simian 40 (SV40) foi inserida naestrutura de plasmideo. Uma cópia de um motivoimunoestimulador CpG é construída no plasmideo parareforçar ainda mais as respostas imunes. Adicionalmente,dois elementos genéticos procarióticos no plasmideo sãoresponsáveis por amplificação em E. coli, o gene deresistência à canamicina (Kan R) e a origem bacteriana dereplicação pMB.

A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 19) dopolipeptideo codificado de R2 (pCTLR2) é de 150 resíduos deaminoácido em comprimento como mostrado abaixo:Malqsllqhliglsnlthvlypvplesyedihgtlhlerlaylharlrellcelgrpsmvwlsanpcphcgdrtfydpepilcpcfmpnkrsllqhliglgdaaysllqhliglispekeeqyasllqhliglkrpsikrsllqhligl

Resíduos de aminoácidos 2 a 89 correspondem a umaregião de agrupamentos de epítopos que representa PRAME422-509 - Nessa região de agrupamentos de epítopos, um número deepítopos CTL específicos de HLA-A2 em potencial foiencontrado utilizando uma variedade de algoritmos depredição de epítopo. Resíduos de aminoácidos 90-150 é umaseqüência de liberação de epítopo (synchrotope™) comquatro cópias embutidas do epítopo CTL PRAME425-433 (tiponegrito). Flanqueando o epítopo CTL de PRAME definido estãoseqüências de aminoácidos curtas que foram mostradas comodesempenhando um papel importante no processamento doepítopo CTL PRAME. Além disso, a seqüência de aminoácidoISPEKEEQYIA (SEQ ID NO: _; correspondendo ao aminoácidoPRAME 276-286, em itálico) é construído nessa região decordão de contas para facilitar a detecção baseada emanticorpo de expressão de polipeptídeo codificado.

EXEMPLO 2

HIERARQUIA DOMINANTE / SUBDOMINANTE DE ELEMENTOSIMUNOGÊNICOS CONSTRUÍDOS

Foi realizado um estudo para avaliar se aestratégia de elementos de construção de diferentesantígenos no mesmo vetor de expressão cria uma hierarquiadominante/subdominante entre aqueles elementos.

Quatro grupos de camundongos transgênicos HHDforam imunizados com plasmídeos P2, R2, RP5 ou uma misturade plasmídeos P2 e R2, por inoculação direta nos linfonodosinguinais de 25μg/plasmídeo em 25 μΐ de PBS em cadalinfonodo nos dias 1, 4, 15 e 18. Dez dias após o reforço,esplenócitos foram estimulados ex vivo com peptídeoPRAME425-433 ou PSMA288-297 e testados contra células T2revestidas com peptídeo rotulado 51Cr, em várias razões decélulas efetoras para alvo (razão E:T).

Resumidamente, células alvo expressando antigenoem sua superfície foram rotuladas com um isótopo radioativode cromo (51Cr). Esplenócitos foram então misturados com acélula alvo e incubados por várias horas. Após incubação,sobrenadantes foram colhidos e a atividade citolítica foimedida em amostras triplicatas utilizando um contador gama.Lise de células que expressam antigeno libera 51Cr no meio.Lise específica de célula é calculada comparando Iise (istoé, liberação de cromo) de células alvo expressando o(s)antigeno(s) de interesse ou antigeno(s) de controle napresença ou ausência de células efetoras, e é normalmenteexpresso como a % específica de lise.

A percentagem corrigida de lise foi calculadapara cada concentração de células efetoras, utilizando ocom médio para cada réplica de cavidades (FIG. 2). Apercentagem de lise específica foi calculada utilizando aseguinte fórmula: percentagem de liberação = 100 χ(liberação experimental-liberação espontânea) /(liberaçãomáxima - liberação espontânea). Os dados são apresentadoscomo a seguir: o eixo geométrico-x mostra a razão de efetorpara alvo; o eixo geométrico-y mostra a percentagemcorrespondente de lise específica. Os resultados sãoexpressos como % de citotoxicidade específica (o plasmídeoR2 também é mencionado como CTLR2).

Os resultados mostram que P2 e R2 eliciamseparadamente respostas imunes citotóxicas significativas.Entretanto, quando os imunógenos de P2 e R2 são integradosno plasmídeo RP5, imunidade contra o epítopo PRAME épreservada enquanto a resposta ao epítopo PSMA288-297 éofuscada. Isso indica que a partir de um ponto de vistaimunológico uma hierarquia é estabelecida entre esses doisepítopos. A mistura dos plasmídeos P2 e R2 recupera aimunidade bivalente.

EXEMPLO 3

ESTRUTURA DE PLASMÍDEOS ADICIONAIS

Para projetar vetores de expressão que resultemem uma imunidade mais equilibrada contra os epitopos tantoPRAME como PSMA (dominante e subdominante no contexto deRP5), um conjunto de imunógenos foi projetado e incorporadona mesma estrutura de plasmideo empregando váriascombinações dos três métodos a seguir:

1) a razão entre os números de cópia do epitopode PRAME425-433 (dominante) e aquele do epitopo PSMA288-297(subdominante) foi ajustada em favor do último.

2) o epitopo menos dominante foi colocado naposição terminal C de modo que teria a extremidade-Cadequada independente de processamento proteassomal.

3) o epitopo menos dominante (PSMA) foi mudado(uma ou múltiplas cópias na inserção expressa) paramelhorar propriedades imunogênicas intrínsecas como ligaçãoa, e meia-vida em, MHC classe I.

A figura 3 mostra o desenho dos vários plasmídeosfeitos. Na figura 3, "V" corresponde a epítopos PSMA266-297que contêm uma mutação I2 97V.

EXEMPLO 4

INDUÇÃO DE RESPOSTAS BIVALENTES OBTIDAS POR PLASMÍDEOSABRANGENDO EPÍTOPOS A PARTIR DE ANTÍGENOS DIFERENTES

Os plasmídeos projetados como descrito no Exemplo3 acima, foram testados para determinar sua capacidade eminiciar uma resposta imune bivalente contra os antígenosassociados a tumor PRAME425-433 e PSMA288-297.

Seis grupos de camundongos transgênicos HHD(n=8/grupos) foram imunizados com plasmídeos (RP8, RP9,RP10, RP11, RP12, ou RP13) contendo inserções representadasna figura 3, por inoculação direta nos linfonodos inguinaisde 25 μg em 25 μΐ de PBS em cada linfonodo no dia 1 e 4.Sete dias após a última injeção de plasmideo, no 11° dia,todos os animais imunizados foram sacrificados incluindocinco controles simples. A análise ELISPOT foi conduzidamedindo-se a freqüência de colônias de formação de ponto(SFC) que produzem IFN-γ, como descrito abaixo.

Em resumo, baços foram isolados no 11° dia apartir de animais submetidos à eutanásia e as célulasmononucleares, após centrifugação de densidade (LympholyteMamitia 1, Cedarlane Labs., Burlington, NC), foram suspensasnovamente em meio HL-I. Esplenócitos (5 χ IO5 ou 2,5 χ IO5células por cavidade) foram incubadas com 10 μg de PSMA288-297 ou PRAME425-433, peptideo natural em cavidades triplicatade uma placa de membrana de filtro com 96 cavidades (Multi-screen IP membrana placa de 96 cavidades, Millipore, MA).

As amostras foram incubadas por 42 horas a 37 0C com CO2 a5% e 100% de umidade antes do desenvolvimento. Anticorpo derevestimento de IFN-γ de camundongo (par de anticorpo IFN-γ, U-CyTech Biosciences, Holanda) foi utilizado como umreagente de revestimento antes da incubação comesplenócitos, seguido pelo anticorpo de detecçãobiotinilado associado. Substratos de propriedade econjugado GABA a partir de U-CyTech Biosciences foramutilizados para desenvolvimento de ponto IFN-γ. A respostaCTL em animais imunizados foi medida 24 horas apósdesenvolvimento na leitora de placa da AID Internationalutilizando versão de software de Leitora ELISpot 3.2.3calibrada para análise de ponto IFN-γ.

Os resultados representados na figura 4 mostram acontagem média de ponto IFN-γ para cada grupo experimental.Os dados são apresentados como a freqüência de pontos IFN-γ(representando uma colônia de células que secretam IFN-γ)por tratamento, como a média de respostas de animaisindividuais +/- o desvio padrão (Std). Os dados gerados apartir de esplenócitos isolados de camundongos imunizadosou simples e estimulados com o peptideo nativo PSMA288-2979indicaram que RP12 induziu a imunidade mais forte para oantigeno PSMA288-297 (55,8 +/- 1,6 pontos IFN-γ) emcomparação com o controle simples (12,8 + 2,4 pontos IFN-γ)ou os outros grupos de tratamento. Isso representou umaresposta imune de PSMA aumentada em 5 vezes com o plasmideoRP12.

Além disso, dados gerados a partir deesplenócitos isolados de camundongos imunizados ou simplese estimulados com o peptideo nativo PRAME425-433 tambémdemonstraram que animais imunizados com RP12 mostraram aresposta imune mais forte ao antigeno PRAME425-433 (234,5 +3,7 pontos IFN-γ) em comparação com os controles simples(8,5 +2,8 pontos IFN-γ) ou os outros grupos de tratamento.Isso representou uma resposta PRAME aumentada maior do que20 vezes com o plasmideo RP12.

No geral, os resultados representados na figura 4mostram indução de uma imunidade bivalente forte contra osepitopos PRAME e PSMA pelo plasmideo RP12. Alguma imunidadebivalente contra epitopos tanto PRAME como PSMA foiobservada com RP9 e em um grau menor RP13, RP10, RPll e RP8- todos tendo uma representação mais potente do epitopoPSMA em relação ao epitopo PRAME em comparação com oplasmideo RP5 (figura 2) . Essa observação se deve,aparentemente, em parte ao uso do análogo I297V de PSMA.

EXEMPLO 5

INDUÇÃO DE UMA. RESPOSTA BIVALENTE PELO PLASMIDEO RP12

Com base na comparação no Exemplo 4 dos seisplasmídeos (RP8, RP9, RP10, RP11, RP12 e RP13), RP12 foiselecionado para análise adicional, visto que era o únicoplasmideo que iniciou uma resposta imune bivalente, robustacontra PRAME425-433 e PSMA288-297 -

Dois camundongos transgênicos HHD representativosforam imunizados com plasmideo RP12 contendo uma inserção(representada na figura 3) por inoculação direta noslinfonodos inguinais de 25 μg em 25 μΐ de PBS em cadalinfonodo nos dias 1, 4, 15 e 18. Dez dias após a últimainjeção de plasmideo, a freqüência de células T CD8+especificas de epítopo PRAME e PSMA foi medida porcoloração de tetrâmero de células mononucleares de sangueperiférico e coloração em conjunto para expressão de CD8.

Em resumo, células mononucleares foram isoladasde sangue periférico após centrifugação de densidade(Lympholyte Mammal, Cedarlane Labs) e coloridas comtetrâmero MHC PRAME HLA-A*0201 (Beckman Coulter, T02001), etetrâmetro MHC PSMA HLA-A*0201 (Beckman Coulter, T02001).

Essas células foram então coloridas em conjunto utilizandoanticorpo monoclonal CD8a (Ly-2) anti-camundongo de ratoconjugado com FITC (BD Biosciences, 553031). Os dados foramcoletados utilizando um citômetro de fluxo Calibur FACS BDe analisados utilizando software Cellquest por gating apopulação de linfócitos e cálculo da percentagem de célulaspositivas de tetrâmero na população CTL CD8+.

Os resultados representados na figura 5, mostramque após imunização de plasmideo intranodal, o plasmideoRP12 eliciou imunidade dupla e a freqüência de células Tespecificas de PRAME425-433 foi várias vezes mais elevada doque aquela de células T especificas para o epitoposubdominante PSMA.

EXEMPLO 6

RESPOSTA IMUNE BIVALENTE EM CAMUNDONGOS INICIADOS COMPLASMÍDEO PRAME E PSMA E REFORÇADOS COM PEPTÍDEO

Para determinar se a imunização com os plasmideosRP12 e RP8 poderia induzir uma resposta bivalente contra osantigenos associados a tumor Prame425-433 e PSMA288-297, apósreforço de peptideo com o análogo I297V PSMA288-297, umaanálise de tetrâmero de animais imunizados foi realizada.

Camundongos transgênicos HHD foram imunizados complasmideos RP8 ou RP12 contendo inserções representadas nafigura 3, por inoculação direta nos linfonodos inguinais de100 μg em 25 μΐ de PBS em cada linfonodo nos dias 1, 4, 15e 18. Nos dias 29 e 32, os camundongos foram reforçados com25 μg de análogo de peptideo PSMA288-297 (i297v) . Um diaantes da iniciação de reforço de peptideo e dez dias após otérmino do reforço de plasmídeo, a freqüência de células Tespecificas de epitopo PRAME e PSMA foi medida porcoloração de tetrâmero (como descrito acima) e comparadacom resultados de tetrâmero sete dias após o último reforçode peptideo.

Os resultados mostrados na figura 6a, como média± SEM de freqüência de célula CD8+T especifica mostraramque plasmideo RP12 elicia uma imunidade especifica de PSMAlevemente mais elevada do que RP8 antes do reforço depeptideo. Além disso, nos dois casos de RP12 e RP8,verificou-se que a imunidade contra PRAME era dominanteantes do reforço de peptideo. Entretanto, após reforço como epitopo subdominante de PSMA, a reposta imune contraPRAME e PSMA apresentou um perfil mais equilibrado,particularmente no caso de RP12, indicando o beneficio deestratégias para eliciar respostas imunes equilibradascontra epitopos de hierarquia imune diferente.

A figura 6B mostra respostas imunes a PRAME ePSMA em três camundongos representativos a partir de cadagrupo e ilustra ainda a resposta bivalente aumentadaeliciada pelo plasmideo RP12 e o reforço de peptideo PSMA(I297V).

EXEMPLO 7

RESPOSTA IMUNE BIVALENTE APÓS REFORÇO DE PEPTÍDEO PSMA EREFORÇO DE PEPTÍDEO PRAME SUBSEQUENTE

Foi examinado se a imunização com os plasmideosRP12 e RP8 poderia induzir uma resposta bivalente contra osepitopos PRAME425-433 e PSMA288-297 aqueles antigenosassociados a tumor, após um primeiro reforço de peptideocom o análogo I2 97V PSMA288-297 e um segundo reforço comanálogo de peptideo Prame425-433 L426Nva, L433Nle.

Camundongos foram imunizados com 4 injeções doplasmideo RP8 ou RP12 (4 mg/ml) por inoculação direta noslinfonodos inguinais nos dias 1, 4, 15 e 18. Nos dias 29 e32, os camundongos foram reforçados com análogo de peptideoI297V PSMA288-297 (0,5 mg/ml) , seguido por um segundo reforçono dia 42 e 59 com análogo de peptideo Prame425-433 L426Nva,L433Nle em 0,5 mg/ml e 0,05 mg/ml, respectivamente. Oscamundongos foram sacrificados e uma análise ELISP0T(figura 7) foi conduzida como a seguir.

Em' resumo, os baços foram isolados dez dias apósa última injeção de peptideo Prame425-433 L426Nva, L433Nle apartir dos animais submetidos à eutanásia e as célulasmononucleares, após centrifugaçâo de densidade (LympholyteMammal, Cedarlane Labs., Burlington, NC), foram suspensasnovamente em meio HL-I. Esplenócitos (2 χ IO5 células porcavidade) foram incubadas com 10 μg de PSMA288-297 ouPRAME425-433, peptideo natural em cavidades triplicata de umaplaca de membrana de filtro com 96 cavidades (Multi-screenIP membrana placa de 96 cavidades, Millipore, MA) . Asamostras foram incubadas por 72 horas a 370C com CO2 a 5% e100% de umidade antes do desenvolvimento. Anticorpo derevestimento de IFN-γ de camundongo (par de anticorpo IFN-γ, U-CyTech Biosciences, Holanda) foi utilizado como umreagente de revestimento antes da incubação comesplenócitos, seguido pelo anticorpo de detecçãobiotinilado associado. Conjugado GABA e vários substratos apartir de U-CyTech Biosciences foram utilizados paradesenvolvimento de ponto IFN-γ. A resposta CTL em animaisimunizados foi medida 24 horas após desenvolvimento naleitora de placa da AID International utilizando versão desoftware de Leitora ELISpot 3.2.3 calibrada para análise deponto IFN-γ.

Os resultados mostram que o plasmideo RP12 eliciauma imunidade especifica a PSMA mais elevada do que RP8 emtodas as doses testadas. Para os plasmideos RP12 e RP8,verificou-se que a imunidade contra PRAME era dominante emtodas as doses testadas. Também, o plasmideo RP12 mostrouuma resposta imune equilibrada forte contra PRAME e PSMAapós reforço com os epitopos PSMA e PRAME.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> MANNKIND CORPORATIONQiu, ZhiyongBot, Adrian

<120> MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA INDUZIR RESPOSTAS IMUNESMULTIVALENTES CONTRA EPÍTOPOS DOMINANTES E SUBDOMINANTES,EXPRESSOS EM CÉLULAS DE CÂNCER E ESTROMA TUMORAL

<130> MANNK.053VPC

<140> PCT/US2 006/023498<141> 2006-06-17

<150> 60/691,579<151> 2005-06-17

<160> 18

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1<211> 3950<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Peptideo construído

<4 00> 1

cgttgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat 60agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg 120cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata 180gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta 240catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc 300gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac 360gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga 420tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg 480ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg 540caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact 600agagaaccca ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa 660gctggctagc gtttaaactt aagccaccat gaagaggcca agtattaaga ggagtctcct 720gcaacacctc atcgggcttg ccctgcagag tctcttgcag cacctcatcg ggctgagcaa 780tctgacccac gtgctgtatc ctgtccccct ggagagttat gaggacatcc atggtaccct 840ccacctggag aggcttgcct atctgcatgc caggctcagg gagttgctgt gtgagttggg 900gcggcccagc atggtctggc ttagtgccaa cccctgtcct cactgtgggg acagaacctt 960ctatgacccg gagcccatcc tgtgcccctg tttcatgcct aacaagctta atctccttca 1020cgaaaccgac tcggctgtgg ccaccgcgcg ccgcccgcgc tggctgtgcg ctggggcgct 1080ggtgctggcg ggtggcttct ttctcctcgg cttcctcttc gggtggttta taaaaagcgc 1140tcagctggca ggggccaaag gagtcattct ctactccgac cctgctgact actttgctcc 1200tggggtgaag tcctatccag atggttggaa tcttcctgga ggtggtgtcc agcgtggaaa 1260tatcctaaat ctgaatggtg caggagaccc tctcacacca ggttacccag caaatgaata 1320tgcttatagg cgtggaattg cagaggctgt tggtcttcca agtattcctg ttcatcctat 1380tcgaaagggc cttccaagta ttcctgttca tccaattctc gtcggtcttc caagtattcc 1440tgttcatcca attaagcgca tttccccgga gaaggaagag cagtatatcg ccaagcgcgg 1500tcttccaagt attcctgttc atccaattaa gaggccaagt attaagaggg gtcttccaag 1560tattcctgtt catccagttt agtgagaatt ctgcagatat ccatcacact ggcggccgct 1620cgagtctaga gggcccgttt aaacccgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca 1680gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac 1740tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat 1800tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca 1860tgctggggat gcggtgggct ctatggcttc tactgggcgg ttttatggac agcaagcgaa 1920ccggaattgc cagctggggc gccctctggt aaggttggga agccctgcaa agtaaactgg 1980atggctttct tgccgccaag gatctgatgg cgcaggggat caagctctga tcaagagaca 2040ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct 2100tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc 2160gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc 2220ggtgccctga atgaactgca agacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc 2280gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg 2340ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc 2400atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcatcaccaagcga aacatcgcat cgagcgagcacaggatgatc tggacgaaga gcatcaggggaaggcgagca tgcccgacgg cgaggatctcaatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttctgcggaccgct atcaggacat agcgttggctgaatgggctg accgcttcct cgtgctttacgccttctatc gccttcttga cgagttcttccggtattttc tccttacgca tctgtgcggtgggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgtttgctcatgaga caataaccct gataaatgctttaatttaaa aggatctagg tgaagatccttgtgagcaaa aggccagcaa aaggccaggatccataggct ccgcccccct gacgagcatcgaaacccgac aggactataa agataccaggctcctgttcc gaccctgccg cttaccggattggcgctttc tcatagctca cgctgtaggtagctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttcatcgtcttga gtccaacccg gtaagacacgacaggattag cagagcgagg tatgtaggcgactacggcta cactagaaga acagtatttgtcggaaaaag agttggtagc tcttgatccgtttttgtttg caagcagcag attacgcgcatcttttctac ggggtctgac gctcagtggaggccggaaac gtttggttgc tgactaattgggggagcctg gggactttcc acacctcgcg

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<210> 2<211> 297<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Peptideo construído

<400> 2Met Lys Arg Pro Ser Ile Lys Arg Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly

1 5 10 15

Leu Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Ser Asn Leu

20 25 30

Thr His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr Glu Asp Ile His

35 40 45

Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His Ala Arg Leu Arg

50 55 60

Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val Trp Leu Ser Ala65 70 75 80

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85 90 95

Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn Lys Leu Asn Leu Leu His Glu

100 105 110

Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala

115 120 125

Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe

130 135 140

Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly Val Ile145 150 155 160

Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys Ser Tyr

165 170 175

Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly Asn Ile

180 185 190

Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr Pro Ala

195 200 205

Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly Leu Pro

210 215 220

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Val290 295<210> 3<211> 3884<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Peptideo construído

<400> 3

cgttgacatt gattattgac tagttattaaagcccatata tggagttccg cgttacataacccaacgacc cccgcccatt gacgtcaatagggactttcc attgacgtca atgggtggagcatcaagtgt atcatatgcc aagtacgcccgcctggcatt atgcccagta catgaccttagtattagtca tcgctattac catggtgatgtagcggtttg actcacgggg atttccaagtttttggcacc aaaatcaacg ggactttccacaaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggagagagaaccca ctgcttactg gcttatcgaagctggctagc gtttaaactt aagccaccatggccaccgcg cgccgcccgc gctggctgtgctttctcctc ggcttcctct tcgggtggttaggagtcatt ctctactccg accctgctgaagatggttgg aatcttcctg gaggtggtgttgcaggagac cctctcacac caggttaccctgcagaggct gttggtcttc caagtattccgcagcacctc atcgggctga gcaatctgacttatgaggac atccatggta ccctccacctcagggagttg ctgtgtgagt tggggcggcctcctcactgt ggggacagaa ccttctatgagcctaacaag cgatcgctcc tgcaacacctcctgcaacac ctcatcgggc tgatttcccccctgcaacac ctcatcgggc tgaagaggcctgttcatcca gtttagtgag aattctgcagtagagggccc gtttaaaccc gctgatcagc

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<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Peptideo construído

<400> 4

Met Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg Arg

15 10 15

Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe Phe

20 25 30

Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ala Gln Leu Ala

35 40 45

Gly Ala Lys Gly Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala

50 55 60

Pro Gly Val Lys Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly65 70 75 80

Val Gln Arg Gly Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu

85 90 95

Thr Pro Gly Tyr Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala

100 105 110

Glu Ala Val Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Ala Leu Gln

115 120 125

Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Ser Asn Leu Thr His Val Leu

130 135 140

Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr Glu Asp Ile His Gly Thr Leu His145 150 155 160

Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His Ala Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys

165 170 175

Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val Trp Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro

180 185 190

His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr Asp Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro195 200 205Cys Phe Met Pro Asn Lys Arg Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu

210 215 220

Gly Asp Ala Ala Tyr Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Ile Ser225 230 235 240

Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Ser Leu Leu Gln His Leu Ile

245 250 255

Gly Leu Lys Arg Pro Ser Ile Lys Arg Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val260 265 270

His Pro Val275

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo Sapien

<400> 5

Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu1 5

<210> 6<211> 10<212> PRT<213> Homo Sapien

<400> 6

Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile15 10

<210> 7<211> 10<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Peptideo construído<400> 7

Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Val1 5 10

<210> 8<211> 66<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Peptideo construído<400> 8

Arg Lys Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Leu Val Gly Leu

15 10 15

Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Lys Arg Ile Ser Pro Glu Lys Glu

20 25 30

Glu Gln Tyr Ile Ala Lys Arg Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro

35 40 45

Ile Lys Arg Pro Ser Ile Lys Arg Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His

50 55 60

Pro Val65

<210> 9<211> 62<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Peptideo construído

<400> 9

Lys Arg Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Gly Asp Ala Ala Tyr

1 5 10 15

Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu

20 25 30

Gln Tyr Ile Ala Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Lys Arg Pro

35 40 45

Ser Ile Lys Arg Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Val50 55 60

<210> 10<211> 150<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Peptideo construído

<400> 10

Met Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Ser Asn Leu

15 10 15

Thr His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr Glu Asp Ile His

20 25 30

Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His Ala Arg Leu Arg

35 40 45

Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val Trp Leu Ser Ala50 55 60Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr Asp Pro Glu Pro65 70 75 80

Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn Lys Arg Ser Leu Leu Gln His

85 90 95

Leu Ile Gly Leu Gly Asp Ala Ala Tyr Ser Leu Leu Gln His Leu Ile

100 105 110

Gly Leu Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Ser Leu Leu

115 120 125

Gln His Leu Ile Gly Leu Lys Arg Pro Ser Ile Lys Arg Ser Leu Leu

130 135 140

Gln His Leu Ile Gly Leu145 150

<210> 11<211> 191<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Peptideo construído<4 00> 11

Met Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg Arg

15 10 15

Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe Phe

20 25 30

Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ala Gln Leu Ala

35 40 45

Gly Ala Lys Gly Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala

50 55 60

Pro Gly Val Lys Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly65 70 75 80

Val Gln Arg Gly Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu85 90 95Thr Pro Gly Tyr Pro Ala100

Glu Ala Val Gly Leu Pro115

Leu Pro Ser Ile Pro Val130

Pro Val His Pro Ile Lys145 150

Ile Ala Lys Arg Gly Leu165

Pro Ser Ile Lys Arg Gly180

Asn Glu Tyr Ala Tyr105

Ser Ile Pro Val His120

His Pro Ile Leu Val135

Arg Ile Ser Pro Glu155

Pro Ser Ile Pro Val170

Leu Pro Ser Ile Pro185

Arg Arg Gly Ile Ala110

Pro Ile Arg Lys Gly

125

Gly Leu Pro Ser Ile140

Lys Glu Glu Gln Tyr160

His Pro Ile Lys Arg

175

Val His Pro Ile190

<210> 12<211> 328<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Peptideo construído

<4 00> 12

Met Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Ser Leu Leu Gln

15 10 15

His Leu Ile Gly Leu Lys Arg Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu

20 25 30

Lys Arg Pro Ser Ile Lys Arg Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu

35 40 45

Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Ser Asn Leu Thr

50 55 60

His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr Glu Asp Ile His Gly65 70 75 80

Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His Ala Arg Leu Arg Glu

85 90 95

Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val Trp Leu Ser Ala Asn100 105 110Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr Asp Pro Glu Pro Ile115 120 125

Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn Lys Leu Asn Leu Leu His Glu Thr130 135 140

Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly145 150 155 160

Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly165 170 175

Trp Phe Ile Lys Ser Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly Val Ile Leu180 185 190

Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys Ser Tyr Pro

195 200 205

Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly Asn Ile Leu210 215 220

Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr Pro Ala Asn225 230 235 240

Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly Leu Pro Ser

245 250 255

Ile Pro Val His Pro Ile Arg Lys Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His260 265 270

Pro Ile Leu Val Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Lys Arg

275 280 285

Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Lys Arg Gly Leu Pro290 295 300

Ser Ile Pro Val His Pro Ile Lys Arg Pro Ser Ile Lys Arg Gly Leu305 310 315 320

Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile325

<210> 13<211> 297<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Peptideo construído<400> 13

Met Lys Arg Pro Ser Ile Lys Arg Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly

1 5 10 15

Leu Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Ser Asn Leu

20 25 30

Thr His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr Glu Asp Ile His

35 40 45

Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His Ala Arg Leu Arg

50 55 60

Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val Trp Leu Ser Ala65 70 75 80

Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr Asp Pro Glu Pro

85 90 95

Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn Lys Leu Asn Leu Leu His Glu

100 105 110

Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala

115 120 125

Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe

130 135 140

Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly Val Ile145 150 155 160

Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys Ser Tyr

165 170 175

Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly Asn Ile

180 185 190

Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr Pro Ala

195 200 205

Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly Leu Pro

210 215 220

Ser Ile Pro Val His Pro Ile Arg Lys Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val225 230 235 240

His Pro Ile Leu Val Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Lys

245 250 255

Arg Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Lys Arg Gly Leu

260 265 270

Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Lys Arg Pro Ser Ile Lys Arg Gly

275 280 285

Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Val290

295

<210> 14<211> 304<212> PRT<213> Seqüência

<220>

<223> Peptideo

rtificial

truido

<400> 14

Met Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Ser

1 5 10

His Leu Ile Gly Leu Lys Arg Pro Ser Ile Lys Arg Ser

20 25

His Leu Ile Gly Leu Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln His

35 40 45

Leu Ser Asn Leu Thr His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu

50 55 60

Glu Asp Ile His Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala65 70 75

Ala Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro

85 90

Trp Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg

100 105

Asp Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn115 120 125

Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg

130 135 140

Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe145 150 155

Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ala Gln Leu

165 170

Lys Gly Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe

180 185

Val Lys Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly195 200 205

Leu Leu Gln15

Leu Leu Gln30

Leu Ile Gly

Glu Ser Tyr

Tyr Leu His80

Ser Met Val95

Thr Phe Tyr110

Lys Leu Asn

Arg Pro Arg

Phe Leu Leu160

Ala Gly Ala175

Ala Pro Gly190

Gly Val GlnArg Gly Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro

210 215 220

Gly Tyr Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala

225 230 235 240

Val Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Arg Lys Gly Leu Pro

245 250 255

Ser Ile Pro Val His Pro Ile Leu Val Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val

260 265 270

His Pro Val Lys Arg Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Val Lys

275 280 285

Arg Pro Ser Val Lys Arg Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Val

290 295 300

<210> 15<211> 288<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Peptideo construído

<4 00> 15

Met Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Ser Leu Leu Gln

15 10 15

His Leu Ile Gly Leu Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly

20 25 30

Leu Ser Asn Leu Thr His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr

35 40 45

Glu Asp Ile His Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His

50 55 60

Ala Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val65 70 75 80

Trp Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr

85 90 95

Asp Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn Lys Leu Asn100 105 110Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg Arg Pro Arg

115 120 125

Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe Phe Leu Leu

130 135 140

Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ala Gln Leu Ala Gly Ala145 150 155 160

Lys Gly Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly

165 170 175

Val Lys Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln

180 185 190

Arg Gly Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro

195 200 205

Gly Tyr Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala

210 215 220

Val Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Arg Lys Gly Leu Pro225 230 235 240

Ser Ile Pro Val His Pro Ile Leu Val Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val

245 250 255

His Pro Val Lys Arg Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Val Lys

260 265 270

Arg Pro Ser Val Lys Arg Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Val275 280 285

<210> 16<211> 308<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Peptideo construído<400> 16

Met Lys Arg Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Lys Arg Pro Ser

15 10 15

Ile Lys Arg Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Ala Leu Gln Ser20 25 30Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Ser Asn Leu Thr His Val Leu Tyr

35 40 45

Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr Glu Asp Ile His Gly Thr Leu His Leu

50 55 60

Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His Ala Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu65 70 75 80

Leu Gly Arg Pro Ser Met Val Trp Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His

85 90 95

Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr Asp Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro Cys

100 105 110

Phe Met Pro Asn Lys Leu Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val

115 120 125

Ala Thr Ala Arg Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu

130 135 140

Ala Gly Gly Phe Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys145 150 155 160

Ser Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro

165 170 175

Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn

180 185 190

Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly

195 200 205

Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr

210 215 220

Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His225 230 235 240

Pro Ile Arg Lys Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Val Leu Val

245 250 255

Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Val Lys Arg Ile Ser Pro Glu

260 265 270

Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Lys Arg Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val

275 280 285

His Pro Ile Lys Arg Pro Ser Ile Lys Arg Gly Leu Pro Ser Ile Pro

290 295 300

Val His Pro Val305

<210> 17<211> 275<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Peptideo construído

<400> 17

Met Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg Arg1 5 10 15

Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe Phe

20 25 30

Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ala Gln Leu Ala35 40 45

Gly Ala Lys Gly Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala50 55 60

Pro Gly Val Lys Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly65 70 75 80

Val Gln Arg Gly Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu 85 90 95

Thr Pro Gly Tyr Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala

100 105 110

Glu Ala Val Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Ala Leu Gln115 120 125

Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Ser Asn Leu Thr His Val Leu130 135 140

Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr Glu Asp Ile His Gly Thr Leu His145 150 155 160

Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His Ala Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys 165 170 175

Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val Trp Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro

180 185 190

His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr Asp Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro195 200 205

Cys Phe Met Pro Asn Lys Arg Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu210 215 220

Gly Asp Ala Ala Tyr Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Ile Ser225 230 235 240Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Ser Leu Leu Gln His Leu Ile

245 250 255

Gly Leu Lys Arg Pro Ser Ile Lys Arg Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val260 265 270

His Pro Val275

<210> 18<211> 296<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Peptideo construído<4 00> 18

Met Lys Arg Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Lys Arg Pro Ser

15 10 15

Ile Lys Arg Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Ala Leu Gln Ser

20 25 30

Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Ser Asn Leu Thr His Val Leu Tyr

35 40 45

Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr Glu Asp Ile His Gly Thr Leu His Leu

50 55 60

Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His Ala Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu65 70 75 80

Leu Gly Arg Pro Ser Met Val Trp Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His

85 90 95

Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr Asp Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro Cys

100 105 110

Phe Met Pro Asn Lys Leu Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val

115 120 125

Ala Thr Ala Arg Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu

130 135 140

Ala Gly Gly Phe Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys145 150 155 160

Ser Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly Val Ile Leu Tyr Ser Asp ProAla Asp Tyr Phe Ala Pro180

Leu Pro Gly Gly Gly Val195

Ala Gly Asp Pro Leu Thr210

Arg Arg Gly Ile Ala Glu225 230

Pro Val Leu Val Gly Leu245

Ile Ser Pro Glu Lys Glu260

Ser Ile Pro Val His Pro275

Pro Ser Ile Pro Val His290

170

Gly Val Lys Ser Tyr185

Gln Arg Gly Asn Ile200

Pro Gly Tyr Pro Ala215

Ala Val Gly Leu Pro235

Pro Ser Ile Pro Val250

Glu Gln Tyr Ile Ala265

Ile Lys Arg Pro Ser280Pro Val295

175

Pro Asp Gly Trp Asn190

Leu Asn Leu Asn Gly205

Asn Glu Tyr Ala Tyr220

Ser Ile Pro Val His240

His Pro Val Lys Arg255

Lys Arg Gly Leu Pro270

Ile Lys Arg Gly Leu285

Claims

1. Construto de ácido nucléico que codifica umpolipeptideo compreendendo uma ou mais cópias de epitopoCTL PSMA288-297 (SEQ ID NO: 6) e uma ou mais cópias deepitopo CTL PRAME425-433 (SEQ ID NO: 5), ou um análogoreativo-cruzado compreendendo 1-3 substituições de um ouambos os epitopos, em que o polipeptideo não compreende umantigeno inteiro.

2. Construto de ácido nucléico, de acordo com areivindicação 1, em que um ou ambos os epitopos sãocodificados em uma seqüência de liberação.

3. Cônstruto de ácido nucléico, de acordo com areivindicação 1, em que o polipeptideo compreendeadicionalmente uma seqüência que codifica um ou maisagrupamentos de epitopos.

4. Construto de ácido nucléico, de acordo com areivindicação 3, compreendendo um agrupamento de epitopo dePRAME.

5. Construto de ácido nucléico, de acordo com areivindicação 4, em que os agrupamentos de epitopos sãoaminoácido 422-509 de PRAME.

6. Construto de ácido nucléico, de acordo com areivindicação 3, compreendendo um agrupamento de epitopo dePSMA.

7. Construto de ácido nucléico, de acordo com areivindicação 6, em que um ou mais agrupamentos de epitoposé escolhido do grupo que consiste em aminoácidos 3-45 e-217-297 de PSMA.

8. Construto de ácido nucléico, de acordo com areivindicação 1, em que o análogo de epitopo PSMA contémuma substituição I297V.

9. Construto de ácido nucléico, de acordo com areivindicação 1, compreendendo adicionalmente uma seqüênciade importação nuclear.

10. Construto de ácido nucléico, de acordo com areivindicação 1, compreendendo adicionalmente um promotor.

11. Construto de ácido nucléico, de acordo com areivindicação 10, em que o promotor é um promotor decitomegalovirus (CMV).

12. Construtò de ácido nucléico, de acordo com areivindicação 1, compreendendo adicionalmente uma seqüênciapoli-A.

13. Construto de ácido nucléico, dè acordo com areivindicação 1, compreendendo adicionalmente um ou mais deum motivo imunoestimulatório CpG.

14. Construto de ácido nucléico, de acordo com areivindicação 2, em que as seqüências de liberação dosepitopos PRAME e PSMA estão localizadas na porção terminal-N do polipeptideo codificado.

15. Construto de ácido nucléico, de acordo com areivindicação 14, em que o polipeptideo codificado é SEQ IDNO: 2.

16. Construto de ácido nucléico, de acordo com areivindicação 2, em que as seqüências de liberação dosepitopos PRAME e PSMA estão localizadas na porção terminal-C do polipeptideo codificado.

17. Construto de ácido nucléico, de acordo com areivindicação 16, em que o polipeptideo codificado é SEQ IDNO: 4.

18. Composição imunogênica, compreendendo oconstruto de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1.

19. Uso do construto de ácido nucléico, conformequalquer uma das reivindicações 1-17 na preparação de ummedicamento para o tratamento de um indivíduo com câncer.

20. Uso, conforme a reivindicação 19, em que omedicamento é para o tratamento de um indivíduo com câncerpor administração do medicamento por meio intranodal.

21. Uso conforme qualquer uma das reivindicações-19 ou 20, em que o indivíduo tem câncer que expressa PRAME,PSMA, ou ambos em células neoplásicas ou células deneovasculatura associadas a tumor.

22. Uso da composição imunogênica, conforme areivindicação 18, para a preparação de um medicamento parao tratamento de um indivíduo com câncer.

23. Uso, conforme a reivindicação 22, em que omedicamento é para o tratamento de um indivíduo com câncerpela administração do medicamento por via intranodal.

24. Uso, conforme qualquer uma das reivindicações-22 ou 23, em que o indivíduo tem câncer que expressa PRAME,PSMA, ou ambos em células neoplásicas ou células deneovasculatura associadas a tumor.

25. Uso de um ácido nucléico, conforme qualqueruma das reivindicações 1-17, para a preparação de ummedicamento para uso na indução de um alvo de respostaimune de neovasculatura associada a tumor.

26. Uso, conforme a reivindicação 25, em que ascélulas de vasculatura associadas a tumor exibem PRAME.