JP2008543315A - 癌細胞及び腫瘍間質上に発現される優勢及び亜優勢エピトープに対する多価免疫応答を誘発するための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＣＴＬエピトープＰＳＭＡ２８８〜２９７及びＰＳＭＡ４２５〜４３３或いは交差反応性類似体を含むポリペプチドをコードする核酸構築物を含む免疫原性組成物を、それを必要とする被験体に提供することにより癌を治療する方法を提供する。本発明の実施の形態では、有効な抗癌免疫応答を生じるために、癌腫抗原のＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープに対する免疫応答を誘導し、同調し及び／又は増幅するための方法及び組成物が提供される。

Description

本願は、米国特許仮出願第６０／６９１，５７９号（２００５年６月１７日出願）の出願日の利益を主張する（この記載内容は参照によりその全文が放棄されずに本明細書に援用される）。

本明細書中で開示される本発明は、ＭＨＣクラスＩ拘束性免疫応答を誘導し、応答の性質及び大きさを制御し、それにより病原性プロセスにおける有効な免疫性介入を促進することに関する。本発明は、標的細胞に対する細胞性免疫応答を刺激し得る免疫原性組成物に関する。本明細書に開示されるのは、ＣＴＬエピトープＰＲＡＭＥ_425-433及びＰＳＭＡ_288-297或いはエピトープのいずれか又は両方の交差反応性類似体をコードする核酸構築物を含む免疫原性組成物である。本発明は、このような組成物が投与される被験体における均衡の取れた免疫応答を誘発するための、記載された免疫原性組成物の使用方法も提供する。

［関連技術の説明］
癌は通常、規則的な様式で成長し、分裂し、死滅する正常細胞と異なり、体の一部の細胞が不規則な様式で成長及び分裂し続けると発症する。様々な種類の癌があるが、これらは大抵、異常細胞の制御不能成長のために起こる。

癌に対する通常の治療選択肢としては、手術、放射線療法及び化学療法が挙げられる。免疫療法と呼ばれる、第４の治療分野が開発されている。免疫療法は、免疫系が癌細胞を認識することを助け、且つ／又は癌を破壊するために癌細胞に対する応答を強めることを試みている。免疫療法には、能動免疫療法及び受動免疫療法が含まれる。能動免疫療法は、体自体の免疫系を刺激して病気と戦わせるように試みる。受動免疫療法は、通常、体が病気を攻撃することに依るものではなく、代わりに、患者の体の外で作られた免疫系成分（抗原等）を用いる。

種々の種類の癌治療にもかかわらず、付加的治療選択肢が依然として必要とされている。抗癌ワクチンの使用による免疫系の操作は、このような１つの手法である。

ワクチン又は他の免疫原性組成物を生成するために、免疫応答が開始され得る抗原又はエピトープが被験体に導入される。新生物（癌）細胞は正常細胞に由来し、したがって遺伝子レベルで正常細胞と実質的に同一であるが、多数の新生物細胞が腫瘍関連抗原（ＴｕＡＡ）を提示することが知られている。理論的には、これらの抗原は、新生物細胞を異物として認識し、攻撃するための被験体の免疫系により用いられ得る。残念ながら、新生物細胞は一般的に、宿主免疫系により無視されるようである。

免疫系は、２つの別個のエフェクター部門に分類され得る。第１のものは自然免疫であり、これは、多数の細胞性構成成分、及び全ての感染性攻撃誘発に応答する可溶性作用因子を包含する。他方は適応免疫応答であり、これは、感染性作用因子からの適格なエピトープに特異的に応答するようカスタマイズされる。適応免疫応答は、体液性及び細胞性免疫系として既知の２つのエフェクター部門にさらに分けられる。体液性部門はＢリンパ球による抗体の産生を中心に展開され、一方、細胞性部門は、細胞傷害性Ｔリンパ球のキラー細胞活性を包含する。

細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、感染性作用因子それ自体の上のエピトープを認識しない。むしろ、ＣＴＬは、感染細胞の表面に表示される感染性作用因子に由来する抗原の断片を検出する。その結果、抗原は、それらが感染細胞によりプロセシングされ、したがって細胞の表面に表示された後にだけ、ＣＴＬに対して可視的である。

細胞の表面における抗原プロセシング及び表示系は、十分に確立されている。ＣＴＬは、クラスＩ主要組織適合性複合体分子（ＭＨＣ）と非共有結合して表面に表示される短いペプチド抗原を認識する。これらのクラスＩペプチドは、次に、サイトゾルタンパク質の分解に由来する。

ほとんどの場合、新生物プロセスは、免疫無視、寛容又は偏向を生じる一連の戦略を用いることにより、免疫防御メカニズムを回避するよう進化する。免疫寛容を有効に中断し、又は癌細胞上に発現された抗原に対する免疫偏向を修復する方法は、文献（Okano F, et al. J Immunol. 2005, Mar 1; 174 (5): 2645-52；Mocellin S, et al., Exp Cell Res. 2004 Oct 1; 299 (2): 267-78；Banat GA, et al., Cancer Immunol Immunother. 2001
Jan; 49 (11): 573-86）に記載されており、有意レベルの全身免疫とのそれらの関連にかかわらず、めったに腫瘍による苦しみを低減しない。このプロセスに影響を及ぼす有意の限定因子は、準最適輸送、抗腫瘍エフェクター細胞の局所活性化及び／又は活性である。実際、ほとんどの場合に、免疫細胞の腫瘍内存在は、まれな出来事である（臓器拒絶、感染又は自己免疫症候群のような炎症性プロセスと関連するものと比べて）ということが示されている。

複数のエピトープを包含する抗原への曝露（天然状況における又はワクチン接種時）に起因する免疫応答は、異なる個々のエピトープに対する免疫応答の大きさに比して階層と固有に関連する。これは、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ拘束性エピトープのようなＴ細胞エピトープの場合に起こり、この場合、優勢及び亜優勢は十分に実証されている。優勢エピトープは、Ｔ細胞の顕著な且つ特異的な拡大を誘発するものである；一方、亜優勢エピトープは、機能性が減少した特異的Ｔ細胞の限定拡大を特徴とする相対的に低減された応答を誘発する。

抗原が天然であるか、操作されるかに関係なく、抗原内のエピトープのサブセットに免疫応答が集中する多数の理由がある。これらの理由としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：プロテアソーム（クラスＩ拘束について）又はエンドソーム（クラスＩＩ拘束について）内の或る種のペプチド又はポリペプチド前駆体の生成の効力；ＴＡＰによるそれらの選択的輸送（クラスＩペプチドについて）ならびにＭＨＣ上の負荷が起こる区画に対する代替的メカニズム；新生ＭＨＣ分子のペプチド結合間隙を占めるシャペロン又は不変ポリペプチド鎖に比しての、且つ同一又は代替的基質のプロセシングに起因する他の競合ペプチドに比しての、ＭＨＣ分子に対するそれらの親和性；結果得られたＭＨＣ−ペプチド複合体の安定性；並びにＴ細胞レパートリーの機能性。

さらに、同一の人工分子上に共にもたらされた異なる抗原からの２つ以上のエピトープは、それらの内因性特性（例えば上記のもの）のため、優勢／亜優勢関係を想定する。これは、特に癌細胞（新生物）及び間質因子（例えば新生血管系）の同時標的化が探求される場合、免疫療法の目的のための複合分子の実際的適用可能性を制限する。

腫瘤プロセスの免疫媒介性制御を増幅するために、本発明の実施の形態は、腫瘍細胞に直接攻撃するほかに、腫瘍内の炎症性環境を確立して、縮化、安定化又は増殖速度及び侵襲（局所的若しくは全身的）の減少につながることを目的とする二価ワクチン又は多価ワ
クチン戦略の一構成成分として、新生血管系の免疫媒介性攻撃を提供する。この方法は、癌細胞又は新生血管系のいずれかを標的化する戦略よりも腫瘍プロセスを制御するに際してより有効であり得、治療指数（効力／安全性）に関して有益な意味を有する。

いくつかの実施の形態は、複数のエピトープに対する均衡の取れた免疫応答の同時誘導を達成するために、亜優勢エピトープの相対的活性の増大と一致する方法で、異なる内因性免疫特性（例えば所定の免疫化状況における優勢対亜優勢状態）を有するエピトープに対する免疫応答を調節する方法及び組成物に関する。本発明は、癌細胞及び／又は基礎を成す間質により発現されるもののような多抗原を同時標的化する場合に有用である。

いくつかの実施の形態では、腫瘍新生血管系及び癌性細胞の、或いは癌細胞上の多抗原の同時標的化は、形質転換細胞、腫瘍細胞及び新生血管系の内皮細胞に対する免疫を誘発するプラスミドのような発現ベクターを含む免疫療法組成物により達成され得る。「数珠（string of beads：環状）」フォーマットでのプラスミドの設計は、米国特許公開第２００３０２２８６３４号（表題「EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN」）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示されるように成し遂げられる。好ましい実施の形態は、癌細胞上で発現される分子（複数可）及び新生血管系上で発現される分子（複数可）に由来する免疫原性因子を含む二価プラスミドである。本発明の特定の実施の形態では、このような分子は、ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡエピトープ並びにその交差反応性類似体に対応する。

別の実施の形態では、ベクター、例えばプラスミドは、癌細胞及び新生血管系により同時発現される分子に由来する免疫原性因子を発現する。さらに別の実施の形態では、プラスミドのようなベクターは、受容体及びそのリガンドに由来する免疫原性因子を発現し、この場合、受容体又はリガンドのいずれかは新生血管系により発現され、そして癌細胞は他のものを発現する。

さらに別の実施の形態では、ベクターは、生物学的応答修飾因子、例えばＢ細胞及びＴ細胞上の抗原受容体を介して作用する修飾因子並びに作用しないものと共に、癌細胞又は新生血管系（又は他の間質細胞）により発現される分子からの免疫原性構成成分をコードする。

いくつかの実施の形態では、ベクターは、癌細胞、新生血管系又はその両方に対する治療的活性を増幅するか又は調節し（米国特許出願公開番号２００５００７９１５２（表題「METHODS TO CONTROL MHC CLASS I-RESTRICTED IMMUNE RESPONSE」）；米国特許仮出願第６０／６４０，４０２号（２００４年１２月２９日出願）及び米国特許公開番号
（全て表題「METHODS TO ELICIT, ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNE RESPONSES AGAINST MHC CLASS I-RESTRICTED EPITOPES, FOR PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC PURPOSES」）；並びに米国特許仮出願第６０／６９１，５８１号（２００４年６月１７日出願）、表題「MULTIVALENT IMMUNOTHERAPEUTICS FOR CARCINOMA」並びに米国特許出願第 ／ 号（表題「MULTIVALENT IMMUNOTHERAPIES FOR CARCINOMA」）（代理人整理番号ＭＡＮＮＫ．０５４Ａ（本願と同日に出願）に開示される）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書に援用される））、且つ亜優勢及び優勢エピトープに対する応答を均衡させる目的のために、他の免疫原作用因子（例えばペプチド）と共に経時的に投与され得る。

ネイティブ抗原の状況で「亜優勢」であるエピトープに対する免疫応答の誘導は、このようなエピトープが疾患個体において起こる負の選択（中枢又は末梢的）に関与し得るため、癌の治療に際して利益を提供する。したがって亜優勢エピトープの多コピーを包含する構築物は、優勢エピトープに対する免疫を保存しながら、このようなエピトープに対す
る応答増大を誘導するために用いられ得る。

さらに、同一分子により提示される異なる抗原からのエピトープに対する免疫応答の有効な同時誘導は、多抗原に対する免疫を生じるためのより実際的な手法を提供し得る。これは、腫瘤および感染性疾患の治療および予防に直接の意味を有する。

全体的に、このような方法及び組成物により達成されるより広範な免疫応答は、限定数の特異性によってかなり支配される免疫応答とは対照的に、病原性プロセスの対処に際してより有効である。さらに、このような方法及び組成物における多価ベクターの実用性は、多数の構成成分及び厄介な投与プロトコルを用いて均衡の取れた多価応答を達成する必要性を軽減し得る。

いくつかの実施の形態は、ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡエピトープ配列を発現する二価プラスミド（米国特許公開第２００３０２２０２３９号、同第２００５０２２１４４０号、同第２００５０１４２１４４号及びＰＣＴ特許公開番号ＰＣＴ／ＵＳ／１１１０１（表題「EPITOPE SEQUENCES」）（これらの記載内容はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示されたもの）、並びに均衡の取れた免疫応答を誘発するためのこれらの組成物の、独立した、又は他のプラスミドと組合せた使用方法に関する。このような方法は、組成物が動物の種々の位置に送達され得るが、好ましくはリンパ系に、例えばリンパ節に送達される開始又は同調工程を包含し得る。同調工程は、例えば或る期間にわたって広げられるか又は或る期間にわたって連続する様式で、その組成物の１回又は複数回の送達を包含し得る。

当該方法はさらに、核酸組成物によりコードされる対応するエピトープと実質的に類似するか又は機能的類似性を有するペプチド免疫原を含む組成物を投与することを包含する増幅工程を包含し得る。例えば免疫原は、対応するエピトープの交差反応性配列であり得る。増幅工程は、例えば或る期間にわたる間隔で、１回又は複数回、１回大量投与で、或いは或る期間にわたって連続的に実施され得る。全ての実施の形態に必要とされるわけではないが、いくつかの実施の形態は、免疫増強剤又はアジュバントを含む組成物の使用を包含し得る。

プラスミドが免疫応答を開始し得るだけというわけではないこの型の免疫化プロトコルを用いることにより、これが、調節特質と対照的にエフェクターに対する応答及びその後のその増幅を偏らせる、ということが観察されている。この従来の核酸ベースの免疫化を伴わずに、ペプチドの反復投与は、調節性Ｔ細胞によりさらに優勢にされる応答をもたらす。エフェクター応答に対する長続きする偏向は、同調と呼ばれる。

さらなる実施の形態は、開示されるプラスミドが独立して又は任意の組合せで用いられるものを含む。これらのエピトープに対応する並びに免疫戦略の増幅部分に用いられるペプチド組成物は、ネイティブ配列であるか、又はネイティブエピトープ配列と実質的に類似しているか若しくは機能的に類似しているペプチド類似体であり得る。ペプチドは、独立して、或いは２、３又は４つの免疫原の組合せで、増幅プロトコルに組入れられ得る。全部より少ないペプチドエピトープを用いる理由としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：１）抗原のいずれかの亜最適発現；２）患者は対応する抗原を発現しないか、又はもはや発現しない；３）あまり強くない応答が１つの又は別のエピトープに対して生じており、この場合、このようなペプチド（複数可）は、より均衡の取れた応答を得るために、他のものの非存在下で与えられ得る；そして４）何らかの種類の免疫毒性を生じている場合、ペプチドは中断され得る。

付加的な実施の形態は、核酸組成物内の免疫原性エピトープの相対数を変えることによ
る免疫応答の調節方法に関する。これらの実施の形態は、例えば免疫原性エピトープ内のアミノ酸置換をコードすることにより、免疫原の固有の免疫原性を変えることも包含し得る。

実施の形態はさらに、ペプチド追加免疫による選択的上方制御により免疫応答を調節する方法を包含し得る。この増幅工程に対応するペプチド組成物は、ネイティブ配列、或いはネイティブエピトープ配列と実質的に類似しているか又は機能的に類似しているペプチド類似体であり得る。選択的上方制御は、均衡の取れた免疫応答を獲得するために、亜優勢エピトープに対応するペプチドの投与により達成され得る。

さらなる他の実施の形態は、ＰＳＭＡ又はＰＲＡＭＥエピトープのいずれかの類似体をコードするプラスミドを包含する。さらなる実施の形態は、異なるエピトープ（例えば米国特許公開番号２００３０２２０２３９及び同２００４０１８０３５４（共に表題「EPITOPE SEQUENCES」）（これらの記載内容は参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示されたもの）、並びに免疫戦略の増幅部分として投与されるＲＰ８及びＲＰ１２プラスミド中で発現されるエピトープ並びに対応するペプチド免疫原（例えば米国特許仮出願第６０／６９１，８８９号（表題「EPITOPE ANALOGUES」）（２００５年６月１７日出願））（この記載内容は参照によりその全体が本明細書に援用される）と似た組合せで置換される類似体を包含し得る。

いくつかの実施の形態は、ＣＴＬエピトープＰＳＭＡ_288-297（配列番号６）の１つ又は複数のコピー及びＣＴＬエピトープＰＲＡＭＥ_425-433（配列番号５）の１つ又は複数のコピー、或いは上記エピトープの一方又は両方の１〜３個の置換を含む交差反応性類似体を含むポリペプチドをコードする核酸構築物であって、上記ポリペプチドが全抗原を含まない、核酸構築物に関する。一方又は両方のエピトープは、例えば遊離配列内でコードされ得る。ポリペプチドは、１つ又は複数のエピトープクラスターをコードする配列をさらに含み得る。核酸構築物は、ＰＲＡＭＥエピトープクラスター、例えばＰＲＡＭＥのアミノ酸４２２〜５０９を含み得る。核酸構築物は、ＰＳＭＡエピトープクラスターを含み、例えば１つ又は複数のエピトープクラスターは、ＰＳＭＡのアミノ酸３〜４５又は２１７〜２９７であり得る。ＰＳＭＡエピトープ類似体は、例えばＩ２９７Ｖ置換を含有し得る。核酸構築物はさらに、１つ又は複数の核内移行配列、プロモーター（例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）、ポリＡ配列、或いは１つ又は複数のＣｐＧ免疫刺激モチーフを含み得る。ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡエピトープの両方の遊離配列は、例えばコード化ポリペプチドのＮ末端部分に位置し得る。コード化ポリペプチドは、例えば配列番号２であり得る。ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡエピトープの両方の遊離配列は、例えばコード化ポリペプチドのＣ末端部分に位置し得る。例えばコード化ポリペプチドは、配列番号４であり得る。

いくつかの実施の形態は、上記の並びに本明細書中の他の箇所に記載される核酸構築物を含む免疫原性組成物に関する。

いくつかの実施の形態は、治療有効量の上記及び本明細書中の他の箇所に記載される核酸構築物を投与する工程を包含する、癌を有する個体の治療方法に関する。核酸構築物は、例えば節内に投与され得る。個体は、新生物細胞又は腫瘍関連新生血管系細胞においてＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ又はその両方を発現する癌を有し得る。

いくつかの実施の形態は、癌を有する個体の治療方法に関する。当該方法は、有効量の上記及び本明細書中の他の箇所に記載される核酸構築物を投与して免疫応答を誘導する工程と；核酸構築物によりコードされるエピトープに対応する少なくとも１つのペプチド類似体で追加免疫することにより免疫応答を増幅する工程とを包含し得る。個体は、例えば
癌細胞上でＰＲＡＭＥを、腫瘍関連血管系細胞上でＰＳＭＡを発現する癌を有し得る。個体は、新生物細胞又は腫瘍関連新生血管系細胞においてＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ又はその両方を発現する癌を有し得る。

いくつかの実施の形態は、癌を有する個体を治療する薬剤の調製における上記及び本明細書中の他の箇所に記載されるような免疫原性組成物又は核酸構築物の使用に関する。薬剤は、節内に薬剤を投与することによる癌を有する個体の治療のためのものであり得る。個体は、新生物細胞又は腫瘍関連新生血管系細胞においてＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ又はその両方を発現する癌を有し得る。

いくつかの実施の形態は、腫瘍関連新生血管系の免疫応答標的化を誘導するのに用いるための薬剤の調製における、上記及び本明細書中の他の箇所に記載されるような免疫原性組成物又は核酸構築物の使用に関する。例えば腫瘍関連血管系細胞は、ＰＲＡＭＥを表示する。

実施形態は、優勢及び亜優勢エピトープに対する多価免疫応答を引き出し得る組成物に関する。いくつかの実施形態はまた、以下：癌細胞及び／又は間質（新生血管系）細胞により発現される抗原を選択すること；このような癌細胞又は間質細胞上の妥当な免疫標的を構成する異なる固有の免疫特性を有し得るエピトープを限定すること；及びプロセシング区画内での適切な生成のために最適な隣接残基を提供しながら、優勢及び亜優勢エピトープの数の間の比を低減することにより或る分子（例えば治療用ベクター）内の優勢及び亜優勢エピトープの相対数を調節することによる組成物の設計方法にも関する。

亜優勢エピトープの１つ又は複数のコピーを類似配列と取り換えるか、或いは分子内にエピトープを好適に配置して、このようなエピトープの相対免疫原性を修飾し、そしてより均衡の取れた多価応答を保証するような付加的方法が記載される。効能の試験が、一組の候補エピトープの設計に続いて行われ得る。このような分子の使用は、初回刺激−追加免疫・免疫化戦略の状況において、亜優勢エピトープに対する応答の選択的増幅により補足され得る。

ワクチン設計のための一般的方法は、優勢及び亜優勢エピトープの多コピーを包含するプラスミド、ベクター及び分子に関する優勢及び亜優勢エピトープの正確な比を見出すために、ネイティブ配列又は人工配列を用いて開始する規定アルゴリズムを利用すること；一組の化合物を操作すること；ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで特徴付ける工程；並びに所望の均衡の取れた免疫応答を誘発する適切なプラスミド又は他のベクターの選択を包含し得る。

本明細書中で言及されるようなエピトープは、免疫応答を刺激し得る分子又は物質である。好ましい実施形態では、この定義に従うエピトープとしては、ポリペプチド、ポリペプチドをコードする核酸（このポリペプチドは免疫応答を刺激し得る）が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。他の好ましい実施形態では、この定義に従うエピトープとしては、細胞の表面に提示されるペプチド（このペプチドは、それらがＴ細胞受容体と相互作用し得るように、クラスＩ ＭＨＣの結合間隙と非共有結合する）が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。

本明細書中で言及されるようなＭＨＣペプチドは、哺乳類クラスＩ又はＩＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に対する既知の又は予測結合親和性を有するポリペプチドである。

本明細書中で言及される免疫エピトープは、ＭＨＣエピトープであり、そして免疫プロテアソームが優勢に活性である細胞上に表示されるポリペプチド断片である。別の好ましい実施形態では、免疫エピトープは、上記定義に従う免疫エピトープを含有するポリペプチドと定義され、これは１個〜数個の付加的アミノ酸が隣接して位置する。別の好ましい実施形態では、免疫エピトープは、クラスＩ ＭＨＣに対する既知の又は予測親和性を有する少なくとも２つのポリペプチド配列を有するエピトープクラスター配列を含めたポリペプチドと定義される。さらに別の好ましい実施形態では、免疫エピトープは、上記の定義のいずれかに従う免疫エピトープをコードする核酸と定義される。

実質的類似性：本用語は、配列を調べることによって判断されるように、重要度が低い様式で（in an inconsequential way）参照の配列とは異なる配列を示すのに用いられる。同じアミノ酸配列をコードする核酸配列は、縮重(degenerate)位置の違い、又は任意の非コード領域の長さ又は組成におけるわずかな違いがあるにもかかわらず、実質的に類似している。保存的置換又はわずかな長さの変異のみにより異なるアミノ酸配列は、実質的に類似している。さらに、Ｎ末端に隣接している残基の数が異なるハウスキーピングエピトープ、又はいずれかの末端で隣接している残基の数が異なる免疫エピトープ及びエピトープクラスターを含むアミノ酸配列は、実質的に類似している。実質的に類似しているアミノ酸配列をコードする核酸も、それら自体が実質的に類似している。

機能的類似性：本用語は、配列が実質的に類似していなくてもよいが、生物学的又は生化学的特性を調べることによって判断されるように、重要度が低い様式で参照配列とは異なる配列を示すのに用いられる。例えば、２つの核酸は、異なるアミノ酸配列をコードする同じ核酸配列に対するハイブリダイゼーションプローブとして、有用であり得る。交差反応性ＣＴＬ応答を誘導する２つのペプチドは、それらが非保存的アミノ酸置換により異なっていても（したがって、実質的類似性の定義を満たさなくても）、機能的に類似する。同じエピトープを認識する対の抗体又はＴＣＲは、どのような構造的差異が存在しようとも、互いに機能的に類似し得る。免疫原性の機能的類似性を試験する際に、通常「改変」抗原で免疫化し、且つ引き出された応答（Ａｂ、ＣＴＬ、及びサイトカイン産生等）の能力を試験し、標的抗原を認識する。したがって、２つの配列は、同じ機能を保持しながら、或る観点では異なるように設計されてもよい。このように設計された配列改変体は、本発明の実施形態中に含まれる。

Ｉ． プラスミド構築
本発明のいくつかの実施形態は、腫瘍関連抗原ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡに対する、特にエピトープＰＲＡＭＥ_425-433及びＰＳＭＡ_288-297に対する二価応答を誘発するか又は促進する能力を有する多数のプラスミド、例えばｐＲＰ８（配列番号１）、ｐＲＰ９、ｐＲＰ１０、ｐＲＰ１１、ｐＲＰ１２（配列番号３）及びｐＲＰ１３を提供する。本発明の特定の実施形態では、免疫原性組成物としてプラスミドｐＲＰ１２及びｐＲＰ８が提供される。本発明のプラスミド構築物を生成するための方法は、以下で詳述されるような方法である。

好ましい実施形態におけるプラスミド構築物は、長い相補的オリゴヌクレオチドの組の段階的連結を伴い、「数珠」として整列されるエピトープをコードするＤＮＡ配列の生成をもたらすことができる。これらのＤＮＡは、鋳型としてのＰＳＭＡ又はＰＲＡＭＥのためのクローン化ｃＤＮＡでＰＣＲを実施することにより増幅されるエピトープクラスター領域をコードするＤＮＡによるさらなる連結のために用いられ得る制限酵素のための適切な付着末端を保有する。次に全挿入物が、Ａｆｌ ＩＩ及びＥｃｏＲ Ｉ制限部位間のベクター主鎖に連結される。全コード配列は、ＤＮＡ配列決定により立証される。ＰＣＲベースの突然変異誘発を用いて、類似エピトープペプチドをコードする配列を生成し、或いは優勢／亜優勢エピトープのコピー数を調整して所望の比を達成し得る。２つのプラスミ
ドＲＰ８及びＲＰ１２の配列は、配列番号１及び配列番号３として詳細に説明され、開示される。本明細書に記載される特定のプラスミドに関して、ベクター主鎖は、米国特許第６，７０９，８４４号（表題「Avoidance of Undesirable Replication Intermediates in Plasmid Propagation」）及び米国特許出願第０９／５６１，５７２号（表題「Expression Vectors Encoding Epitopes of Target-Associated Antigens」）（これらの記載内容はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）に以前に開示されているｐＶＡＸ（Invitrogen, Carlsbad、 CA）の修飾バージョンである。本発明のコード配列は、本発明の範囲を超えることなく、ワクチンとして用いるのに適した任意の核酸ベクター中に配置され得ることを当業者は認識するであろう。例えば他の記述されたプラスミドをコードする配列は、ｐＲＰ８及びｐＲＰ１２プラスミドに用いられたのと同一の又は類似の主鎖中に挿入され得る。

ｐＲＰ８及びｐＲＰ１２は、ＰＳＭＡ（２８８〜２９７及びその類似体）及びＰＲＡＭＥ（４２５〜４３３）からのＨＬＡ Ａ２拘束性ＣＴＬエピトープを伴う１つのポリペプチドをコードする組換えＤＮＡプラスミドである。両ポリペプチドはまた、ＰＳＭＡ（３〜４５、２１７〜２９７）及びＰＲＡＭＥ（４２２〜５０９）のエピトープクラスターを含む領域も包含する。拘束性ＰＳＭＡ及びＰＲＡＭＥエピトープに隣接するのは、免疫プロテアソーム・プロセシングによる問題のエピトープの遊離に最適な短いアミノ酸配列である。プラスミド中のポリペプチドに関するコード配列は、サイトメガロウイルスからのプロモーター／エンハンサー配列（ＣＭＶｐ）の制御下にあり、これがＡＰＣによる取り込み時のポリペプチドに関するｍＲＮＡの効率的転写を可能にする。コード配列の３’末端のウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨポリＡ）は、その安定性を増大するためのメッセンジャーのポリアデニル化のための、そして、翻訳のための細胞質中への核からの移行のためのシグナルを提供する。取り込み後の核中へのプラスミド輸送を促すために、サルウイルス４０（ＳＶ４０）からの核内移入配列（ＮＩＳ）がプラスミド主鎖中に挿入された。プラスミドは、ＣｐＧ免疫刺激モチーフの２つのコピー（即ち、ＮＩＳ配列中に１つ及びプラスミド主鎖中に１つ）を保有する。最後に、プラスミド中の２つの原核生物遺伝因子は、大腸菌、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ Ｒ）、及びｐＭＢ１細菌複製起点における増幅に関与する。

Ａ． ＲＰ８組換えＤＮＡプラスミド
ＲＰ８に関して、コード化ポリペプチドのアミノ酸配列（２９７アミノ酸残基長；配列番号２）は、２つの遊離配列、即ちＰＲＡＭＥ_425-433に関するそのＮ末端の１７アミノ酸基質（

；配列番号 ）、及びＰＳＭＡ_288-297に関するそのＣ末端の６６アミノ酸基質（

；配列番号８）を含有する。コード化免疫原の全ポリペプチド配列（配列番号２）を、図８に示す。

最初の８アミノ酸残基の伸長（stretch）は、免疫プロテアソームによるＣＴＬエピトープのプロセシングを促すために示された人工配列である。次の９アミノ酸（イタリック体）は、ＰＲＡＭＥ_425-433であり、これは、ヒトＰＢＭＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫化と
マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ免疫化の両方において強力な抗腫瘍免疫応答を誘発する強力なＨＬＡ Ａ２特異的ＣＴＬエピトープである。このＰＲＡＭＥエピトープ配列の後には、２つのエピトープクラスター：ＰＲＡＭＥ_422-443及びＰＲＡＭＥ_459-487を含むＰＲＡＭＥ_422-509のセグメント（免疫原のアミノ酸１８〜１０５）が続く。２つのＰＳＭＡエピトープクラスター（イタリック体）、即ちＰＳＭＡ_3-45（アミノ酸１０８〜１５０）及びＰＳＭＡ_217-297（アミノ酸１５１〜２３１）は、ＰＲＡＭＥエピトープクラスターの後に位置する。これらの及びその他のＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡエピトープクラスターは、米国特許出願第１０／１１７，９３７号、同第１１／０６７，０６４号及び同第１１／０６７，１５９号（それぞれ、表題「Epitope Sequences」）（これらの記載内容はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示されている。これらのエピトープクラスターは多数の予測ＨＬＡ Ａ２−特異的エピトープを含有し、したがって免疫エピトープに対する応答を生じるのに有用であり得る（米国特許出願公開番号２００３０２１５４２５（表題「EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS」）及び米国特許出願公開番号２００３０２２８６３４；同２００４０１３２０８８及び同２００４０２０３０５１（表題「EPITOPE CLUSTERS」）（これらの記載内容はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載）。ＰＳＭＡ_288-297（ＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号６）；太字）の多コピーを有する「数珠」エピトープアレイは、残りのポリペプチド（アミノ酸２３２〜２９７）を構成する。ＰＳＭＡ_288-297の４つのコピーは、類似体（ＧＬＰＳＩＰＶＨＰＶ；配列番号７）である最終コピーと共に組み込まれる。ネイティブＰＳＭＡ_288-297及びその類似体は共に、ＭＨＣクラスＩ結合及び免疫原性増大を示す類似体と共に、ヒトＰＢＭＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫化とマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ免疫化の両方において有意のＣＴＬ応答を誘導することが示された。ＰＳＭＡ_288-297エピトープ配列間は、エピトープのプロセシング及び遊離を促すための「切断ヘルパー配列」と呼ばれる短いアミノ酸配列である。したがってこれら２つのエピトープは、それらが発現され、プロセシングされ、ｐＡＰＣにより提示され得るようなやり方でコードされる。

Ｂ． ＲＰ１２組換えＤＮＡプラスミド
ＲＰ１２プラスミドに関して、コード化ポリペプチドのアミノ酸配列（２７５アミノ酸残基長；配列番号４）は、１つのアミノ酸基質又は遊離配列、及びＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡエピトープの両方の遊離のためにそのＣ末端に基質を包含するハイブリッド「数珠」を含有する。コード化免疫原の全ポリペプチド配列を、図９に示す。配列番号９として表される遊離配列は、以下の通りである：

コード化免疫原のアミノ酸２〜４４、４５〜１２６及び１２７〜２１３のセグメントは、次のものとそれぞれ１つに連結されるエピトープクラスターである：ＰＳＭＡ_3-45、ＰＳＭＡ_217-297及びＰＲＡＭＥ_422-509。「数珠」ハイブリッド基質では、ポリペプチドのＣ末端にＰＲＡＭＥ_425-433（ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ；太字；配列番号５）の３つのコピー及びＰＳＭＡ_288-297類似体（ＧＬＰＳＩＰＶＨＰＶ；サンセリフ体太字；配列番号７）の１つのコピーが存在する。ＰＲＡＭＥ_425-433及びＰＳＭＡ_288-297エピトープ配列間は、エピトープのプロセシング及び遊離を促すための「切断ヘルパー配列」と呼ばれる短いアミノ酸配列である。したがってこれら２つのエピトープは、それらが発現され、プロセシングされ、ｐＡＰＣにより提示され得るようなやり方でコードされる。

ＲＰ１２プラスミドに関するさらなる詳細は、米国特許仮出願第６０／６９１，５７９
号（２００５年６月１７日出願）（表題「METHODS AND COMPOSITIONS TO ELICIT MULTIVALENT IMMUNE RESPONSES AGAINST DOMINANT AND SUBDOMINANT EPITOPES, EXPRESSED ON CANCER CELLS AND TUMOR STROMA」）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示されている。他のプラスミドは全て、ＲＰ８及びＲＰ１２に適用されたような方法を用いて、類似の方法で構築された。プラスミドＲ２（ｐＣＴＬＲ２とも呼ばれる）は、実施例に開示される。図１及び図３に示すようなＰ２プラスミドは、一価ＰＳＭＡプラスミドである。ＲＰ５プラスミドは、Ｐ２及びＲ２の両方からの因子を包含する。

プラスミドを構築又は設計するための種々の方法は、当業者に既知であるように当該技術分野で十分に確立されている。このような方法は、多数の参考文献に、例えば「Molecular Cloning」Sambrook J and Russell D.W., CSHL Press, (2001)（この記載内容は参照によりその全体が本明細書に詳細に援用される）に記載されている。

本発明のポリペプチドエピトープをコードする核酸を構築するに際して、関連腫瘍関連抗原（例えばＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡ）の遺伝子配列を用いることができ、或いはポリヌクレオチドは、対応するコドンのいずれかから組み立てられ得る。１０アミノ酸エピトープに関しては、これは、特定のアミノ酸組成によって、１０⁶のオーダーで異なる配列を構築し得る。これは大きいが、この長さの＞１０¹⁸の考え得るポリヌクレオチドの非常に小さい分画を表す別個の且つ容易に限定可能なセットであり、したがっていくつかの実施形態では、本明細書に開示される特定の配列の均等物は、列挙された配列に関するこのような別個の且つ容易に限定可能なバリエーションを包含する。ワクチンに用いるためのこれらの配列のうちの特定の１つを選択するに際して、コドン用法、自己相補性、制限部位、化学的安定性等のような考慮すべき事柄は、当業者に明らかなように、用いられ得る。

本発明において意図されるようなエピトープクラスターは、共有ＭＨＣ拘束因子に対する結合親和性を有する２つ以上の既知の又は予測エピトープを含むネイティブタンパク質配列のセグメントであるポリペプチド、又はこれをコードする核酸配列であって、この場合、クラスター内のエピトープの密度は、完全タンパク質配列内の共有ＭＨＣ拘束因子に対する結合親和性を有する全ての既知の又は予測エピトープの密度より大きい。エピトープクラスター及びそれらの使用は、米国特許出願公開番号２００３０２２０２３９、同２００５０２２１４４０、同２００５０１４２１４４；同２００３０２１５４２５、同２００３０２２８６３４、同２００４０１３２０８８、同２００４０２０３０５１及びＰＣＴ特許出願公開ＰＣＴ／ＵＳ／１１１０１（これらの記載内容は全て参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されている。

本発明に用いられるような基質又は遊離配列は、直接的に、又はＮ末端トリミング又は他のプロセスと組合せて、免疫プロテアソーム・プロセシングにより、ＰＲＡＭＥ及び／又はＰＳＭＡエピトープを遊離させる状況を提供するより大きな配列中に埋め込まれるＰＲＡＭＥ及び／又はＰＳＭＡエピトープを含むか又はコードする、設計された又は操作された配列である。

以下に示すのは、いくつかの実施形態で用いられ得るコード化ポリペプチド配列の付加的例であって、例えばそれらは種々のプラスミドによりコードされることができるか、又は当該方法等に用いられ得る。

ＩＩ． 本発明の免疫原性組成物
本発明は、能動免疫療法による癌の治療における治療標的としての、癌細胞及び新生血管系により発現される多数の分子の使用を意図する。このような分子としては、癌細胞それ自体により発現されるか、又は腫瘍の非癌性構成成分、例えば腫瘍関連新生血管系又はその他の間質と関連づけられる抗原である腫瘍関連抗原（ＴｕＡＡ）が挙げられる。ＴｕＡＡ発現プロファイルの確定は、患者の癌状態又は型を、適切な免疫療法薬又はレジメンと一致させる助けとなり得る。特定の実施形態では、腫瘍関連抗原ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡのエピトープは、このようなプラスミドが癌療法薬として投与される被験体における強力な免疫応答を引き出し得る二価プラスミドを設計するのに用いられる。ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡの交差反応性類似体も、本発明の実施形態において意図される。

本発明に用いられる腫瘍関連抗原ＰＲＡＭＥは、ＭＡＰＥ、ＤＡＧＥ及びＯＩＰ４としても既知である。ＰＲＡＭＥは、癌−精巣（ＣＴ）抗原として当該技術分野で既知である。しかしながら多数のＣＴ抗原、例えば：ＭＡＧＥ、ＧＡＧＥ及びＢＡＧＥと違って、ＰＲＡＭＥは急性骨髄性白血病において発現される。ＴｕＡＡとしてのＰＲＡＭＥは、米国特許第５，８３０，７５３号（この記載内容は参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示されている。好ましい実施形態では、本発明は、ＰＲＡＭＥのエピトープ及びその類似体を提供する。

本発明で用いられる別のＴｕＡＡは、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）である。ＰＳＭＡは、前立腺癌細胞中で高度に発現されることが判明している。しかしながらＰＳＭＡ発現は、正常前立腺上皮において、及び非前立腺腫瘍の新生血管系においても認められる。抗新生血管系調製物としてのＰＳＭＡは、米国特許仮出願第６０／２７４，０６３号及び米国特許公開出願第２００３００４６７１４号及び同第２００５０２６０２３４号（これらの記載内容はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示されている。ＴｕＡＡとしてのＰＳＭＡは、米国特許第５，５３８，８６６号（この記載内容は参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されている。好ましい実施形態では、本発明は、ＰＳＭＡのエピトープ及びその類似体を提供する。

本明細書中で用いられるような交差反応性類似体は、バックグラウンドから、天然ペプチドと反応性であるＣＴＬから区別可能であるエフェクター機能（例えば細胞溶解又はサイトカイン分泌）を誘導する天然ペプチド配列と比較して、１つ〜３つのアミノ酸置換及び／又は１つのアミノ酸欠失又は付加を含むペプチドを指してもよい。好ましい実施形態では、エフェクター機能は、天然ペプチドにより誘導されるものの少なくとも３０、５０、６０、７０又は８０％である。

本発明のいくつかの実施形態において、ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡのネイティブ配列又は類似体（交差反応性）を含むペプチドはまた、本発明のプラスミドと組合せてペプチド追加免疫として投与されてもよい。ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡの天然ペプチド配列及びペプチド類似体は、米国特許出願第２００６００５７６７３号及び米国特許仮出願第６０／６９１，８８９号（これらの記載内容はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示されている。ペプチド類似体、ＰＲＡＭＥ_425-433Ｌ４２６Ｎｖａ、Ｌ４３３Ｎｌｅ及びＰＳＭＡ_288-297Ｉ２９７Ｖが、米国特許仮出願第６０／５８０，９６２号；米国特許出願第１１／１５５，９２９号；米国特許仮出願第６０／５８１，００１号；米国特許出願第１１／１５６，２５３号；米国特許出願第１１／１５６，３６９号、米国特許仮出願第６０／６９１，８８９号、米国特許出願第 ／ （表題「PRAME PEPTIDE ANALOGUES」）（代理人整理番号ＭＡＮＮＫ．０５２Ａ）、米国特許出願第 ／ （表題「PSMA PEPTIDE ANALOGUES」）（代理人整理番号ＭＡＮＮＫ．０５２Ａ２）、並びに米国特許出願第 ／ （表題「MELANOMA ANTIGEN PETIDE ANALOGUES」（代理人整理番号ＭＡＮＮＫ．０５２Ａ３）（これらの記載内容はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されている。

上記のように、いくつかの実施形態は、ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡのＣＴＬエピトープ及びその交差反応性類似体をコードするプラスミドを含む癌の治療のための免疫原性組成物に関する。このような免疫原性組成物は、強固且つ強力な細胞媒介性免疫応答を引き出して、特定の癌を標的化し、それにより被験体における癌を排除し、根絶し、又は改善し得る。

ＩＩＩ． 投与のための同調・増幅療法薬
好ましい実施形態では、本発明は、ＣＴＬエピトープＰＲＡＭＥ_425-433及びＰＳＭＡ_288-297或いはこれらのエピトープのいずれか又は両方の交差反応性類似体をコードする核酸構築物を含む免疫原性組成物を提供する。本発明のいくつかの実施形態では、プラスミド初回刺激／ペプチド追加免疫手法を用いることができ、この場合、ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡエピトープを発現する組換えＤＮＡプラスミドは、合成ペプチド、例えばＰＲＡＭＥ及び／又はＰＳＭＡペプチド又はその類似体と共に投与され得る。

ＣＴＬエピトープＰＲＡＭＥ_425-433及びＰＳＭＡ_288-297或いは一方又は両方のエピトープの交差反応性類似体をコードする核酸構築物を含む本発明の免疫原性組成物は、最適化された免疫化スケジュールに従って、免疫応答が開始され、増幅される器官中にリンパ節注射により直接送達され得る。本発明の実施形態は、ＨＬＡ−Ａ２、特にＨＬＡ−Ａ^*０２０１を発現する腫瘍組織を有する患者に投与され得る。したがって、プラスミド及び１つ又は複数のペプチド又はその類似体を含む免疫原性組成物は、被験体の癌を治療する際に投与され得る。本発明の開示される実施形態は、二価又は多価攻撃を達成するために用いて、攻撃に対する腫瘍の感受性を増大する利点を提供し得る癌のための同調・増幅療法薬に関する。

したがって特定の実施形態では、本発明は、癌の治療のための二価同調・増幅療法薬を提供する。このような二価療法薬は、腫瘍細胞上の２つ以上の抗原を標的化し得る。腫瘍細胞上の１つ以上の抗原が標的化される場合、抗腫瘍療法薬の有効濃度はそれにしたがって増大される。血管系のような腫瘍に関連した間質に対する攻撃は、それらを標的にする作用因子（複数可）への腫瘍細胞の接触性を増大し得る。したがっていくつかの正常組織上でも発現される抗原でも、二価又は多価攻撃において標的にされるべき他の抗原がその組織により同様に発現されない場合、標的抗原としてより大きく考慮され得る。本発明のプラスミドは、他のエピトープ及び対応する増幅ペプチドを発現する付加的なプラスミドと共に用いられて、より高い結合価の治療プロトコルを生じ得る。例示的な免疫原性産物は、米国特許仮出願第６０／６９１，５８１号（２００５年６月１７日出願）、及び米国特許出願第 ／ 号（代理人整理番号ＭＡＮＮＫ．０５４Ａ（本願と同日に出願））、それぞれ、表題「MULTIVALENT ENTRAIN-AND-AMPLIFY IMMUNOTHERAPEUTICS FOR CARCINOMA」）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書に援用される））に開示されている。

本発明において意図される「同調」免疫原は、多数の実施形態において、Ｔ細胞の誘導系統の免疫プロファイルに特定の安定性を付与する誘導を包含する。

本発明において意図されるように、「増幅する、又は増幅」という用語は、Ｔ細胞応答の場合のように、多数の実施形態において、特定の応答に関与するＴ細胞の細胞数、活性化細胞数、活性レベル、増殖速度、又は類似のパラメーターを増大するためのプロセスを包含する。

本発明に用いられる同調・増幅プロトコルは、米国特許公開番号２００５００７９１５２、米国特許仮出願第６０／６４０，４０２号及び米国特許出願第１１／３２３，５７２
号（それぞれ、表題「METHODS TO ELICIT, ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNE RESPONSES AGAINST MHC CLASS I-RESTRICTED EPITOPES, FOR PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC PURPOSES」）（これらの記載内容はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）により詳細に記載されている。

ＩＶ． 生物学的応答修飾因子（ＢＲＭ）又は免疫強化剤
いくつかの実施形態では、本発明はさらに、免疫応答を誘発するに際して、生物学的応答修飾因子（ＢＲＭ）又は免疫強化剤を、ＣＴＬエピトープＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡをコードする組換えＤＮＡプラスミドを含む免疫原性組成物と共に用い得る。本発明により意図される免疫強化剤又はＢＲＭは、免疫抑制的又は免疫刺激的様式で作用して、免疫応答を媒介することができる。本発明の免疫強化剤又はＢＲＭは、抗原受容体以外との相互作用により免疫系又はその細胞の活性を調節する任意の分子を指すことができる。本発明において意図されるようなＢＲＭは、自然免疫の経路を刺激することにより免疫調節作用を発揮する天然又は合成有機低分子をさらに含み得る。

特定の実施形態では、本発明は、例えばサイトカイン、例えばＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＧＭ−ＣＳＦ、ｆｌｔ３リガンド（ｆｌｔ３Ｌ）、インターフェロン、ＴＮＦ−α等；ケモカイン、例えばＩＬ−８、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−１α、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＲＡＮＴＥＳ等を包含し得る（これらに限定されない）免疫強化剤又はＢＲＭも意図する。本発明で利用され得るＢＲＭの他の例は、サイトカイン又はケモカイン産生を誘発する分子、例えばトール様受容体（ＴＬＲ）、ペプチドグリカン、ＬＰＳ又は類似体、非メチル化ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）；ｄｓＲＮＡ、例えばそれぞれＴＬＲ９及びＴＬＲ３と結合するＡＰＣ及び自然免疫細胞上の細菌ｄｓＤＮＡ（ＣｐＧモチーフを含有）及び合成ｄｓＲＮＡ（ポリＩ：Ｃ）である。ＢＲＭの一クラスは、大部分は、自然免疫の経路を刺激することにより免疫調節作用を発揮する有機天然低分子又は合成分子を包含する。したがって、ＴＬＲ７及び８を結合することにより免疫の細胞性経路を刺激することが判明している純合成抗ウイルスイミダゾキノリン、例えばイミキモド及びレシキモドの新規生成のようなＴＬＲと結合する低分子（Hemmi, H. et al., Nat Immunol 3: 196-200, 2002；Dummer, R. et al., Dermatology 207: 116-118, 2003；これらの記載内容はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）が用いられ得る。ＢＲＭはさらに、ｐＡＰＣ又はＴ細胞を活性化する免疫強化アジュバント（例えばエンドサイトーシス性パターン認識受容体（ＰＲＲ）リガンド、キラヤサポニン、ツカレソール等を包含する）を包含し得る。

Ｖ． 本発明の組成物の送達方法
本発明において、ＣＴＬエピトープＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡをコードする組換えＤＮＡプラスミド、或いはこのようなプラスミドとその後の１回又は複数回の追加免疫としての１つ又は複数のペプチド（複数可）を含む免疫原性組成物の好ましい投与は、リンパ節注射による。その他の免疫化プロトコル、例えば開始用量（複数可）以外のプラスミドの使用（プラスミド単独によるもの、又は他の型の追加免疫試薬の利用）は、あまり好ましい実施形態ではないが、本発明の範囲から除外されない。本発明の実施形態は、免疫原性ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡの両方を発現する二価プラスミドを包含する。必要とする被験体に本発明の免疫原性組成物を送達するに際しては、最適化された免疫化スケジュールに従って免疫応答が開始及び増幅される器官への直接的送達を可能にするので、リンパ節注射が選択される。

患者のリンパ系に免疫原性組成物を導入するために、組成物は好ましくは、リンパ管、リンパ節、脾臓又はリンパ系のその他の適切な部分に向けられる。いくつかの実施形態では、各構成成分はボーラス剤として投与される。他の実施形態では、１つ又は複数の構成成分は、注入により、一般的に数時間〜数日にわたって送達される。好ましくは、組成物
は、リンパ節にカテーテル又は針を挿入し、そして送達中ずっとカテーテル又は針を維持することにより、リンパ節、例えば鼠径部又は腋窩リンパ節に向けられる。適切な針又はカテーテルは、金属又はプラスチック（例えばポリウレタン、塩化ポリビニル（ＰＶＣ）、テフロン、ポリエチレン等）から作製されて利用可能である。例えば鼠径部リンパ節中にカテーテル又は針を挿入する場合、鼠径部リンパ節は、テガダーム（商標）透明な包帯材（Ｔｅｇａｄｅｒｍ（商標）, St. Paul, MN, USA）を用いて固定される２４Ｇ３／４のＶｉａｌｏｎ（商標）Ｉｎｓｙｔｅ Ｗ（商標）カニューレ及びカテーテル（Becton Dickinson, USA）を用いて、超音波診断制御下で穿刺される。この手法は一般に、経験をつんだ放射線学者により成される。鼠径部リンパ節内部のカテーテル先端の位置は、リンパ節のサイズを直ちに且つ可視的に増大する最小容積の生理食塩水の注射により確証される。後者の手法は、先端がリンパ節内部にあるという確証を可能にする。この手法は、先端がリンパ節から滑り出ない、そしてカテーテル移植後の種々の日で反復され得ることを保証するために実施され得る。

本発明の治療用組成物（複数可）は、当業者に既知である標準ワクチン送達プロトコルと一致する方式で患者に投与され得る。ＴｕＡＡ ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡのプラスミド及びペプチド又はペプチド類似体を含む本発明の免疫原性組成物の投与方法としては、経皮、リンパ節内、リンパ節周囲、経口、静脈内、皮膚内、筋肉内、腹腔内及び粘膜投与、注射又は点滴又は吸入による送達が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＴＬ応答を誘発するためのワクチン送達の特に有用な方法は、オーストラリア国特許第７３９１８９号；米国特許第６，９９４，８５１号及び同第６，９７７，０７４号（共に表題「A METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE」）に開示されている。

種々のパラメーターは、被験体に免疫原性組成物を送達するか又は投与するに際して、考慮される必要があり得る。さらに、投与量レジメン及び免疫化スケジュールが用いられ得る。一般的に、治療用組成物中の構成成分の量は、患者により、抗原により、以下のような因子：応答を誘導する場合の抗原の活性；患者の系を通過するリンパの流量；被験体の体重及び年齢；治療されている疾患及び／又は状態の型；疾患又は状態の重症度；前の又は共存する治療的介入；抗体を合成する個体の免疫系の能力；所望の防御程度；投与方式等（これらは全て、施術者により容易に確定され得る）によって変わる。

概して、治療用組成物は、約１〜約５００マイクロリットル／時間又は約２４〜約１２０００マイクロリットル／日の速度で送達され得る。抗原の濃度は、結果として、約０．１マイクログラム〜約１０，０００マイクログラムの抗原が２４時間中に送達される。流量は、毎分約１００〜約１０００マイクロリットルのリンパ液が成人鼠径部リンパ節を通って流れる、という知識に基づいている。目的は、リンパ系中のワクチン処方物の局所濃度を最大にすることである。患者に関する所定の量の経験的調査は、ヒトにおける所定のワクチン調製物に関する注入の最も効果的なレベルを確定するために必要であり得る。

特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、多数の逐次的用量として投与され得る。このような用量は、適切な免疫応答を得ることを必要とされる場合、２、３、４又はそれより多い用量であり得る。本発明のさらなる実施形態では、免疫原性組成物の用量は、互いに約数秒又は数分以内に右又は左鼠径部リンパ節に投与されることが意図される。例えばプラスミド（初回刺激）は、先ず右リンパ節に注射され、その後数秒又は数分以内に、第２のプラスミドが右又は左鼠径部リンパ節に注射され得る。他の場合、１つ又は複数の免疫原を発現する１つ又は複数のプラスミドの組合せが投与され得る。リンパ節への最初の注射後のその後の注射は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０分又はそれより長い分以内であるが、最初の注射の約３０、４０、５０又は６０分より長くない、というのが好ましい。同様の考察は、右及び左リンパ節への独立した２つのペプチドの投与に当てはまる。数日間隔での本発明の免疫原性組成物の複数の用量を投与することが望
ましい場合があるが、この場合、その後の投与間に数日（１、２、３、４、５、６又は７日以上）が経過する。他の場合、本発明の組成物のその後の投与（複数可）が、初回用量投与後、約１、２、３週間又はそれ以上の週間以内に、或いは約１、２、３ヶ月又はそれ以上の月数以内に、両側性鼠径部リンパ節注射により投与されるのが望ましい。

投与は、投与処方物と適合性である任意の方式であり、そして治療的に有効であるような量であり得る。本発明の免疫原性組成物の有効量又は用量は、治療されるべき被験体において望ましい応答を提供するのに必要な量である。

本出願で既に開示されたものに加えて、以下の出願が参照によりその全体が本明細書に明確に援用される。クラスＩ ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞応答、特に抗原に対するエフェクターおよびメモリーＣＴＬ応答を誘起、同調、維持、調節及び増幅する上で、開示されている類似体を使用するのに有用な方法は、米国特許第６，９９４，８５１号（２００６年２月７日）及び同第６，９７７，０７４号（２００５年１２月２０日）（共に表題「A Method
of Inducing a CTL Response」）；米国特許仮出願第６０／４７９，３９３号（２００３年６月１７日出願）（表題「METHODS TO CONTROL MHC CLASS I-RESTRICTED IMMUNE RESPONSE」）；並びに米国特許出願第１０／８７１，７０７号（公開番号２００５００７９１５２）及び米国特許仮出願第６０／６４０，４０２号（２００４年１２月２９日出願）（共に表題「Methods to elicit， enhance and sustain immune responses against MHC
class Ｉ-restricted epitopes， for prophylactic or therapeutic purpose」）に記載されている。また、類似体を研究に用いて、さらなる最適な類似体を得ることができる。多くのハウスキーピングエピトープは、米国特許出願第１０／１１７，９３７号（２００２年４月４日出願）（公開番号２００３０２２０２３９ Ａ１）及び同第１０／６５７，０２２号（公開番号２００４０１８０３５４）、及びＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２７７０６号（公開番号ＷＯ０４０２２７０９ Ａ２）（２００３年９月５日出願）；及び米国特許仮出願第６０／２８２，２１１号（２００１年４月６日出願）；同第６０／３３７，０１７号（２００１年１１月７日出願）；同第６０／３６３，２１０号（２００２年３月７日出願）；及び同第６０／４０９，１２３号（２００２年９月５日出願）（それぞれの出願は、表題「Epitope Sequences」である）に提示されている。類似体はさらに、これらの出願に記載されている種々の様式のいずれでも用いることができる。本発明の類似体から成るか又はこれを含み得るエピトープクラスターは、米国特許出願第０９／５６１，５７１号（２０００年４月２８日出願）（表題「EPITOPE CLUSTERS」）に開示及びより詳細に定義されている。本発明の類似体を使用及び送達する方法は、米国特許出願第０９／３８０，５３４号及び同第６９７７０７４号（２００５年１２月２０日公開）並びにＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２８９（公開番号ＷＯ９９０２１８３ Ａ２）（それぞれ、表題「A METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE」）に記載されている。このような免疫療法のための有益なエピトープ選択原理は、米国特許出願第０９／５６０，４６５号（２０００年４月２８日出願）、同第１０／０２６，０６６号（公開番号２００３０２１５４２５ Ａ１）（２００１年１２月７日出願）、及び同第１０／００５，９０５号（２００１年１１月７日出願）（全て表題「Epitope Synchronization in Antigen Presenting Cells」）；同第６，８６１，２３４号（２００５年３月１日発行、出願第０９／５６１，０７４号）（表題「Method of Epitope Discovery」）；同第０９／５６１，５７１号（２０００年４月２８日出願）（表題「EPITOPE CLUSTERS」）；同第１０／０９４，６９９号（公開番号２００３００４６７１４ Ａ１）（２００２年３月７日出願）（表題「Anti-Neovasculature Preparations for Cancer」）；米国特許出願第１０／１１７，９３７号（公開番号２００３０２２０２３９ Ａ１）及びＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／１１１０１（公開番号ＷＯ０２０８１６４６ Ａ２）（共に２００２年４月４日出願）（共に表題「EPITOPE SEQUENCES」）；並びに米国特許出願第１０／６５７，０２２号及びＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２７７０６（公開番号ＷＯ０４０２２７０９ Ａ２）（共に２００３年９月５日出願）（共に表題「EPITOPE SEQUEN
CES」）に開示されている。ワクチンプラスミドの全体的な設計の態様は、米国特許出願第０９／５６１，５７２号（２０００年４月２８日出願）（表題「Expression Vectors Encoding Epitopes of Target-Associated Antigens」）及び同第１０／２９２，４１３号（公開番号２００３０２２８６３４ Ａ１）（２００２年１１月７日出願）（表題「Expression Vectors Encoding Epitopes of Target-Associated Antigens and Methods for their Design」）；同第１０／２２５，５６８号（公開番号２００３−０１３８８０８）（２００２年８月２０日出願）、ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２６２３１号（公開番号ＷＯ２００４／０１８６６６）（２００３年８月１９日出願）（共に表題「EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS」）；並びに米国特許出願第６，７０９，８４４号（表題「AVOIDANCE OF UNDESIRABLE REPLICATION INTERMEDIATES IN PLASMID PROPAGATION」）に開示されている。特定の癌に対する免疫応答を指図するのに特に利益を有する具体的な抗原の組合せは、米国特許仮出願第６０／４７９，５５４号（２００３年６月１７日出願）、米国特許出願第１０／８７１，７０８号（２００４年６月１７日出願）、及びＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１９５７１号（公開番号ＷＯ２００４／１１２８２５）（全て表題「Combinations of tumor-associated antigens in vaccines for various types of cancers」）に開示されている。腫瘍新生血管系に関連する抗原（例えば、ＰＳＭＡ、ＶＥＧＦＲ２、Ｔｉｅ−２）も、癌疾患に関して有用であり、米国特許出願第１０／０９４，６９９号（公開番号２００３００４６７１４ Ａ１）（２００２年３月７日出願）（表題「Anti-Neovasculature Preparations
for Cancer」）に開示されている。生物学的応答調節因子の標的投与によって免疫応答を引き起こし、維持し且つ操作する方法は、米国特許仮出願第６０／６４０，７２７号（２００４年１２月２９日出願）に開示されている。免疫応答の誘起においてＣＤ４＋細胞をバイパスする方法は、米国特許仮出願第６０／６４０，８２１号（２００４年１２月２９日出願）に開示されている。例示的な疾患、生物体、並びに対象となる生物体、細胞及び疾患に関連する抗原及びエピトープは、米国特許出願第６９７７０７４号（２００５年１２月２０発行）（２００１年２月２日出願）（表題「METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE」）に記載されている。例示的な方法は、米国特許仮出願第６０／５８０，９６９号（２００４年６月１７日出願）及び米国特許出願第２００６−０００８４６８−Ａ１号（２００６年１月１２日公開）（共に表題「COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN DIAGNOTISTICS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS」）に見出されている。方法及び組成物は、米国特許仮出願第６０／６４０，５９８号（２００４年１２月２９日出願）（表題「COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCAITED ANTIGENS IN COMPOSITIONS FOR VARIOUS TYPES OF
CANCER」）にも開示されている。本発明の類似体を利用することを含む免疫化方法による免疫応答を評価及びモニタリングする診断技法の統合されたものは、米国特許仮出願第６０／５８０，９６４号（２００４年６月１７日出願）及び米国特許出願第２００５−０２８７０６８−Ａ１号（２００５年１２月２９日公開）（共に表題「Improved efficacy of active immunotherapy by integrating diagnostic with therapeutic methods」）においてより完全に記載される。ベクターをコードする免疫原性ポリペプチドは、米国特許出願第１０／２９２，４１３号（公開番号２００３０２２８６３４ Ａ１）（２００２年１１月７日出願）（表題「Expression Vectors Encoding Epitopes of Target-Associated Antigens and Methods for their Design」）及び米国特許仮出願第６０／６９１，５７９（２００５年６月１７日出願）（表題「Methods and compositions to elicit multivalent immune responses against dominant and subdominant epitopes， expressed on
cancer cells and tumor stroma」）に開示されている。問題の方法及び組成物を含むさらなる有用な開示は、米国特許仮出願第６０／６９１，５８１号（２００５年６月１７日出願）（表題「Multivalent Entrain-and-Amplify Immunotherapeutics for Carcinoma」）に見出されている。さらなる方法、組成物、ペプチド、及びペプチド類似体は、米国特許仮出願第６０／５８１，００１号及び同第６０／５８０，９６２号（それぞれ、２００４年６月１７日出願）（それぞれ、「SSX-2 PEPTIDE ANALOGS」及び「NY-ESO PEPTIDE ANALOGS」）に開示されている。上記の段落に記述されている出願及び特許はそれぞれ、教
示する全てのものに関して参照によりその全体が本明細書に援用される。さらなる類似体、ペプチド及び方法は、米国特許公開番号２００６００６３９１３（表題「SSX-2 PEPTIDE ANALOGS」；及び米国特許公開番号２００６−００５７６７３ Ａ１（２００６年３月１６日公開）（表題「EPITOPE ANALOGS」）；及びＰＣＴ出願公開番号ＷＯ／２００６／００９９２０（表題「EPITOPE ANALOGS」）（全て２００５年６月１７日出願）に開示されている。さらなる方法及び組成物が、米国特許仮出願第６０／５８１，００１号（２００４年６月１７日出願）（表題「SSX-2 PEPTIDE ANALOGS」及び米国特許仮出願第６０／５８０，９６２号（２００４年６月１７日出願）（表題「NY-ESO PEPTIDE ANALOGS」）（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示されている。一例であってそれらに限定されないが、各参考文献は、クラスＩ ＭＨＣ拘束性エピトープ、類似体、類似体の設計、エピトープ及び類似体の使用、並びにエピトープを使用及び生成する方法、それらの発現に関する核酸ベクターの設計及び使用について教示しているものに関して参照により援用される。参照により本明細書に明確に援用される他の出願は、米国特許出願第１１／１５６，２５３号（公開番号２００６００６３９１３）（２００５年６月１７日出願）（表題「SSX-2 PEPTIDE ANALOGS」）；米国特許出願第１１／１５５，９２９号（２００５年６月１７日出願）（表題「NY-ESO-1 PEPTIDE ANALOGS」）（公開番号２００６００９４６６１）；米国特許出願第１１／３２１，９６７号（２００５年１２月２９日出願）（表題「METHODS TO TRIGGER， MAINTAIN AND MANIPULATE IMMUNE RESPONSES BY
TARGETED ADMINISTRATION OF BIOLOGICAL RESPONSE MODIFIERS INTO LYMPHOID ORGANS」）；米国特許出願第１１／３２３，５７２号（２００５年１２月２９日出願）（表題「METHODS TO ELICIT ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNE REPONSES AGAINST MCH CLASS I RESTRICTED EPITOPES, FOR PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC PURPOSES」）；米国特許出願第１１／３２３，５２０号（２００５年１２月２９日出願）（表題「METHODS TO BYPASS CD４+ CELLS IN THE INDUCTION OF AN IMMUNE RESPONSE」）；米国特許出願第１１／３２３，０４９号（２００５年１２月２９日出願）（表題「COMBINATION OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN COMPOSITIONS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS」）；米国特許出願第１１，３２３，９６４号（２００５年１２月２９日出願）（表題「COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED
ANTIGENS IN DIAGNOSTICS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS」）；米国特許仮出願第６０／６９１，８８９号（２００５年６月１７日出願）（表題「EPITOPE ANALOGS」）である。

（実施例）
二価免疫応答を誘発することが可能なＰＳＭＡ及びＰＲＡＭＥの免疫原性エピトープを含有するプラスミドを設計するに際して本発明の好ましい実施形態を実証するために、以下の実施例を包含する。以下の実施例に開示される方法は、本発明の実行において良好に機能するために本発明者等により発見された方法を表す、と当業者により理解されるべきであり、したがってその実行のための好ましい方式を構成すると考えられ得る。しかしながら、本発明の開示の点から見て、開示されている特定の実施形態において多数の変更が成され得るし、そしてさらに本発明の精神及び範囲を逸脱しない限り、同様の又は類似の結果を得ることができる、と当業者は理解する。

免疫原をコードするプラスミド発現ベクターの設計
プラスミドＰ２及びＲ２（ｐＣＴＬＲ２とも呼ばれる）は、それぞれＰＳＭＡ（広範囲の癌腫の新生血管系上で、又は前立腺癌腫細胞により発現される）及びＰＲＡＭＥ（癌性細胞により発現される）からの因子を含有する（図１）。それぞれ挿入物は、抗原の配列の断片を、標的細胞により発現され、そして免疫媒介性攻撃により取組み可能な多コピーのエピトープと共に包含する。これらのエピトープに隣接するのは、細胞性区画中のエピトープペプチドのプロセシング及び生成を促すことが既知であるアミノ酸をコードする配列である。さらに、プラスミドＲＰ５は、Ｐ２及びＲ２の両方からの因子を、互いに接合
された発現免疫原と共に包含する。

上記の、そして米国特許仮出願第６０／６９１，８８９号（表題「EPITOPE ANALOGS」）（２００５年６月１７日出願））；及び米国特許出願第 ／ 号（代理人整理番号ＭＡＮＮＫ．０５２Ａ））（表題「PRAME EPITOPE ANALOGS」）（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示されたようなプラスミド構築プロトコルに従って、Ｒ２プラスミドを構築した。Ｒ２（ｐＣＴＬＲ２とも呼ばれる）は、ＰＲＡＭＥからのＨＬＡ Ａ２特異的ＣＴＬエピトープ、ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ、アミノ酸残基４２５〜４３３及びＰＲＡＭＥのエピトープクラスター領域、アミノ酸４２２〜５０９を伴う１つのポリペプチドをコードする組換えＤＮＡプラスミドワクチンである。このプラスミドを構築する場合、プラスミド中のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、サイトメガロウイルスからのプロモーター／エンハンサー（ＣＭＶｐ）の制御下に置かれ、これが抗原提示細胞による取り込み時のポリペプチドに関するメッセンジャーの効率的転写を可能にする。コード配列の３’末端のウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨポリＡ）は、その安定性を増大するためのメッセンジャーのポリアデニル化のための、そして、細胞質中への核からの移行のためのシグナルを提供する。核中へのプラスミド輸送を促すために、サルウイルス４０（ＳＶ４０）からの核内移入配列（ＮＩＳ）がプラスミド主鎖中に挿入された。ＣｐＧ免疫刺激モチーフの１つのコピーは、免疫応答をさらに高めるようにプラスミド中で操作される。さらに、プラスミド中の２つの原核生物遺伝因子は、大腸菌における増幅、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ Ｒ）、及びｐＭＢ細菌複製起点に関与する。

Ｒ２（ｐＣＴＬＲ２）のコード化ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１９）は、以下に示すように１５０アミノ酸残基長である：

アミノ酸残基２〜８９は、ＰＲＡＭＥ_422-509を表すエピトープクラスター領域に対応する。このエピトープクラスター領域内では、種々のエピトープ予測アルゴリズムを用いて、多数の潜在的ＨＬＡ Ａ２特異的ＣＴＬエピトープが見出されている。アミノ酸残基９０〜１５０は、ＰＲＡＭＥ_425-433ＣＴＬエピトープの４つの埋込みコピー（太字）を伴うエピトープ遊離（シンクロトープ(synchrotope)（商標））配列である。拘束性ＰＲＡＭＥ ＣＴＬエピトープに隣接するのは、ＰＲＡＭＥ ＣＴＬエピトープのプロセシングにおいて重要な役割を演じることが示されている短いアミノ酸配列である。さらに、アミノ酸配列ＩＳＰＥＫＥＥＱＹＩＡ（配列番号： ：ＰＲＡＭＥアミノ酸２７６〜２８６に対応する、イタリック体）は、コード化ポリペプチドの抗体ベースの発現の検出を促すようにこの数珠領域中で操作される。

操作された免疫原性因子の優勢／亜優勢階層
同一発現ベクター中での異なる抗原からの因子を操作する戦略がそれらの因子の間に優勢／亜優勢階層を作り出すか否かを査定するために、試験を実行した。

ＨＨＤトランスジェニックマウスの４群を、１、４、１５及び１８日目に、鼠径部リンパ節にＰＢＳ２５μｌ中の２５μｇ／プラスミドを直接接種することにより、プラスミドＰ２、Ｒ２、ＲＰ５又はＰ２及びＲ２プラスミドの混合物で免疫化した。追加免疫の１０
日後に、脾臓細胞をＰＲＡＭＥ_425-433又はＰＳＭＡ_288-297ペプチドでｅｘ ｖｉｖｏ刺激して、種々のエフェクター対標的細胞比（Ｅ：Ｔ比）で、⁵¹Ｃｒ標識ペプチド被覆Ｔ２細胞に対して試験した。

要するに、それらの表面に抗原を発現する標的細胞を、クロムの放射性同位体（⁵¹Ｃｒ）で標識した。次に脾臓細胞を標的細胞と混合し、数時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を収穫し、ガンマ計数器を用いて、三重反復実験試料で細胞溶解活性を測定した。抗原発現細胞の溶解は、培地中に⁵¹Ｃｒを放出する。エフェクター細胞の存在下又は非存在下で目的の抗原（複数可）又は対照抗原（複数可）を発現する標的細胞の溶解（即ちクロム放出）を比較することにより、細胞特異的溶解を算定し、通常は特異的溶解％として表す。

ウエルの各複製物に関する平均ｃｐｍを用いて、エフェクター細胞の各濃度に関して補正溶解％を算定した（図２）。以下の式を用いて、特異的溶解％を算定した：放出％＝１００×（実験放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）。データは、以下のように示される：ｘ軸はエフェクター対標的比を示す；ｙ軸は対応する特異的溶解パーセンテージを示す。結果は、特異的細胞傷害性％として表される（プラスミドＲ２は、ＣＴＬＲ２とも呼ばれる）。

結果は、Ｐ２及びＲ２が有意の細胞傷害性免疫応答を別個に誘発することを示す。しかしながらＰ２及びＲ２の免疫原がＲＰ５プラスミド内に組込まれる場合、ＰＲＡＭＥエピトープに対する免疫性は保存されるが、一方ＰＳＭＡ_288-297エピトープに対する応答は遮られる。これは、免疫学的見地から、これら２つのエピトープ間に階層が確立されることを示す。Ｐ２及びＲ２プラスミドの混合は、二価免疫性を回復させる。

付加的プラスミドの構造
ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡエピトープ（ＲＰ５の状況での優勢及び亜優勢）の両方に対するより均衡の取れた免疫を生じる発現ベクターを設計するために、以下の３つの方法の種々の組合せを用いることにより、一組の免疫原を設計し、同一プラスミド主鎖内に組入れた：
１）ＰＲＡＭＥ_425-433（優勢）エピトープのコピー数及びＰＳＭＡ_288-297（亜優勢）エピトープのコピー数間の比を、後者に有利となるように調整した。
２）プロテアソーム・プロセシングと無関係に適正Ｃ末端を有するようにＣ末端位置に低優勢エピトープを配置した。
３）低優勢エピトープ（ＰＳＭＡ）を変異させ（発現挿入物内に１又は多コピー）、固有の免疫原特性、例えばクラスＩ ＭＨＣとの結合及びそれについての半減期を改善した。

図３は、作製された種々のプラスミドの設計図を示す。図３中で、「Ｖ」は、Ｉ２９７Ｖ変異を保有するＰＳＭＡ_266-297エピトープに対応する。

異なる抗原からのエピトープを包含するプラスミドにより達成される二価応答の誘導
上記の実施例３に記載したように設計されたプラスミドを試験して、ＰＲＡＭＥ_425-433及びＰＳＭＡ_288-297腫瘍関連抗原に対する二価免疫応答を初回刺激するそれらの能力を確定した。

ＨＨＤトランスジェニックマウスの６群（ｎ＝８／群）を、１日目及び４日目に、鼠径部リンパ節にＰＢＳ２５μｌ中の２５μｇを直接接種することにより、図３に示した挿入
物を保有するプラスミド（ＲＰ８、ＲＰ９、ＲＰ１０、ＲＰ１１、ＲＰ１２又はＲＰ１３）で免疫化した。最終プラスミド注射の７日後、即ち１１日目に、免疫化動物全てを、５つのナイーブ対照を含めて、屠殺した。下記のように、ＩＦＮ−γ産生スポット形成コロニー（ＳＦＣ）の頻度を測定することにより、ＥＬＩＳＰＯＴ分析を実行した。

要するに、脾臓を１１日目に安楽死動物から単離し、単核球を、密度遠心分離（Lympholyte Mammal, Cedarlane Labs, Burlington, NC）後に、ＨＬ−１培地中に再懸濁した。脾臓細胞（５×１０⁵又は２．５×１０⁵細胞／ウエル）を、１０μｇのＰＳＭＡ_288-297又はＰＲＡＭＥ_425-433、天然ペプチドと共に、９６ウエルフィルター膜プレート（Ｍｕｌｔｉ−ｓｃｒｅｅｎ ＩＰ膜９６ウエルプレート, Millipore, MA）の三重反復実験ウエル中でインキュベートした。試料を、５％ＣＯ₂及び湿度１００％で３７℃で４２時間インキュベートした後、展開した。マウスＩＦＮ−γコーティング抗体（ＩＦＮ−γ抗体対、U-CyTech Biosciences, The Netherlands）をコーティング試薬として用いた後、脾臓細胞と共に、その後、ビオチン化検出抗体を伴ってインキュベートした。ＧＡＢＡ接合体及び専売の基質（U-CyTech Biosciences）を、ＩＦＮ−γスポット展開のために用いた。ＩＦＮ−γスポット分析用に調整されたＥＬＩＳｐｏｔリーダーソフトウエアバージョン３．２．３を用いて、AID Internationalプレート読取器上での展開の２４時間後、免疫化動物におけるＣＴＬ応答を測定した。

図４に示した結果は、各実験群に関する平均ＩＦＮ−γスポット数を示す。データは、ＩＦＮ−γスポットの頻度（ＩＦＮ−γ分泌細胞のコロニーを表す）／処置として、個々の動物応答の平均＋／−標準偏差（Ｓｔｄ）として示される。免疫化マウス又はナイーブマウスから単離され、ＰＳＭＡ_288-297天然ペプチドで刺激された脾臓細胞から生じたデータは、ナイーブ対照（１２．８＋２．４ ＩＦＮ−γスポット）又は他の処置群と比較して、ＲＰ１２がＰＳＭＡ_288-297抗原に対する最も強い免疫性（５５．８＋／−１．６
ＩＦＮ−γスポット）を誘導したことを示す。これは、ＲＰ１２プラスミドによるＰＳＭＡ免疫応答の５倍増強を表した。

さらに、免疫化マウス又はナイーブマウスから単離され、ＰＲＡＭＥ_425-433天然ペプチドで刺激された脾臓細胞から生じたデータも、ナイーブ対照（８．５＋２．８ ＩＦＮ−γスポット）又は他の処置群と比較して、ＲＰ１２で免疫化された動物がＰＲＡＭＥ_425-433抗原に対する最も強い免疫応答（２３４．５＋３．７ ＩＦＮ−γスポット）を示すことを実証した。これは、ＲＰ１２プラスミドによるＰＲＡＭＥ免疫応答の２０倍増大を表した。

全体的に、図４に示した結果は、プラスミドＲＰ１２によるＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡエピトープの両方に対する強力な二価免疫の誘導を示す。プラスミドＲＰ５と比較して、ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡエピトープの両方に対する二価免疫が、ＲＰ９を用いた場合は多少、そしてＲＰ１３、ＲＰ１０、ＲＰ１１及びＲＰ８（全て、ＰＲＡＭＥエピトープに比してＰＳＭＡエピトープのより強力な提示を有する）を用いた場合はより少ない程度に観察された（図２）。この観察は、明らかに、一部はＰＳＭＡのＩ２９７Ｖ類似体の使用に因るものである。

ＲＰ１２プラスミドによる二価応答の誘導
６つのプラスミド（ＲＰ８、ＲＰ９、ＲＰ１０、ＲＰ１１、ＲＰ１２及びＲＰ１３）のうちの４つの実施例における比較に基づいて、さらなる分析のために、ＰＲＡＭＥ_425-433及びＰＳＭＡ_288-297の両方に対する強固な二価免疫応答を初回刺激する唯一のプラスミドであったため、ＲＰ１２を選択した。

２つの代表的ＨＨＤトランスジェニックマウスを、１、４、１５及び１８日目に、鼠径部リンパ節にＰＢＳ２５μｌ中の２５μｇを直接接種することにより、挿入物を保有するＲＰ１２プラスミド（図３に示す）で免疫化した。最終プラスミド注射の１０日後、末梢血単核球の四量体染色及びＣＤ８発現に関する共染色により、ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡエピトープ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞の頻度を測定した。

要するに、密度遠心分離（Lympholyte Mammal, Cedarlane Labs）後に末梢血から単核球を単離し、ＨＬＡ−Ａ^*０２０１ ＰＲＡＭＥ ＭＨＣ四量体（Beckman Coulter, Ｔ０２００１）及びＨＬＡ−Ａ^*０２０１ ＰＳＭＡ ＭＨＣ四量体（Beckman Coulter, Ｔ０２００１）で染色した。次にこれらの細胞をＦＩＴＣ接合ラット抗マウスＣＤ８ａ（Ｌｙ−２）モノクローナル抗体（BD Biosciences, 553031）を用いて、共染色した。ＢＤ ＦＡＣＳ Caliburフローサイトメーターを用いてデータを収集し、そしてリンパ球集団をゲート制御(gating)、且つ、ＣＤ８⁺ＣＴＬ集団内の四量体陽性細胞の％を算定することにより、セルクエスト・ソフトウエアを用いて分析した。

図５に示した結果は、リンパ節内プラスミド免疫化後に、ＲＰ１２プラスミドが二重免疫を引き出し、そしてＰＲＡＭＥ_425-433特異的Ｔ細胞の頻度がＰＳＭＡ亜優勢エピトープに特異的なＴ細胞の頻度の数倍高かったことを示す。

ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡプラスミドで初回刺激し、ペプチドで追加免疫したマウスにおける二価免疫応答
プラスミドＲＰ１２及びＲＰ８による免疫化が、ＰＳＭＡ_288-297Ｉ２９７Ｖ類似体によるペプチド追加免疫後に、腫瘍関連抗原Ｐｒａｍｅ_425-433及びＰＳＭＡ_288-297に対する二価応答を誘導し得たか否かを判定するために、免疫化動物の四量体分析を実行した。

ＨＨＤトランスジェニックマウスを、１、４、１５及び１８日目に、鼠径部リンパ節のそれぞれにＰＢＳ２５μｌ中の１００μｇを直接接種することにより、図３に示した挿入物を保有するＲＰ８又はＲＰ１２プラスミドで免疫化した。２９及び３２日目に、マウスを２５μｇのＰＳＭＡ_288-297ペプチド類似体（Ｉ２９７Ｖ）で追加免疫した。ペプチド追加免疫開始の１日前、そしてプラスミド追加免疫の完了の１０日後に、ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡエピトープ特異的Ｔ細胞の頻度を四量体染色（上記）により測定し、最終ペプチド追加免疫の７日後に、四量体結果と比較した。

図６Ａに示した結果（特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞の頻度の平均±ＳＥＭ）は、ＲＰ１２プラスミドが、ペプチド追加免疫前に、ＲＰ８よりわずかに高いＰＳＭＡ特異的免疫を誘発することを示した。さらに、ＲＰ１２及びＲＰ８の場合とも、ＰＲＡＭＥに対する免疫はペプチド追加免疫前に優勢であることが判明した。しかしながらＰＳＭＡ亜優勢エピトープによる追加免疫後、ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡに対する免疫応答は、特にＲＰ１２の場合、より均衡の取れたプロファイルを表示したが、これは、異なる免疫階層のエピトープに対する平衡化免疫応答を誘発するための戦略の利益を示す。

図６Ｂは、各群からの３つの代表的マウスにおけるＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡに対する免疫応答を示し、さらに、ＲＰ１２プラスミド及びＰＳＭＡ（Ｉ２９７Ｖ）ペプチド追加免疫により引き出される二価免疫応答増強を例証する。

ＰＳＭＡペプチド追加免疫及びその後のＰＲＡＭＥペプチド追加免疫後の二価免疫応答
プラスミドＲＰ１２及びＲＰ８による免疫化が、ＰＳＭＡ_288-297Ｉ２９７Ｖ類似体による一次ペプチド追加免疫及びＰｒａｍｅ_425-433Ｌ４２６Ｎｖａ、Ｌ４３３Ｎｌｅペプ
チド類似体による二次追加免疫後に、それらの腫瘍関連抗原であるＰｒａｍｅ_425-433及びＰＳＭＡ_288-297エピトープに対する二価応答を誘導し得たか否かを検査した。

１、４、１５及び１８日目に、鼠径部リンパ節に直接接種することにより、ＲＰ８又はＲＰ１２プラスミド（４ｍｇ／ｍｌ）を４回注射して、マウスを免疫化した。２９及び３２日目に、マウスをＰＳＭＡ_288-297Ｉ２９７Ｖペプチド類似体（０．５ｍｇ／ｍｌ）で追加免疫し、その後、４２及び５９日目に、それぞれ０．５ｍｇ／ｍｌ及び０．０５ｍｇ／ｍｌでＰｒａｍｅ_425-433Ｌ４２６Ｎｖａ、Ｌ４３３Ｎｌｅペプチド類似体を用いて二次追加免疫した。マウスを屠殺し、ＥＬＩＳＰＯＴ分析（図７）を以下のように実行した。

要するに、最終Ｐｒａｍｅ_425-433Ｌ４２６Ｎｖａ、Ｌ４３３Ｎｌｅペプチド注射の１０日後に、安楽死動物から脾臓を単離し、そして単核球を、密度遠心分離（Lympholyte Mammal, Cedarlane Labs, Burlington, NC）後に、ＨＬ−１培地中に再懸濁した。脾臓細胞（２×１０⁵細胞／ウエル）を、１０μｇのＰＳＭＡ_288-297又はＰＲＡＭＥ_425-433、天然ペプチドと共に、９６ウエルフィルター膜プレート（Ｍｕｌｔｉ−ｓｃｒｅｅｎ ＩＰ膜９６ウエルプレート, Millipore, MA）の三重反復実験ウエル中でインキュベートした。試料を、５％ＣＯ₂及び湿度１００％で３７℃で７２時間インキュベートした後、展開した。マウスＩＦＮ−γコーティング抗体（ＩＦＮ−γ抗体対、U-CyTech Biosciences, The Netherlands）をコーティング試薬として用いた後、脾臓細胞と共に、その後、ビオチン化検出抗体を伴ってインキュベートした。ＧＡＢＡ接合体及び種々の基質（U-CyTech Biosciences）を、ＩＦＮ−γスポット展開のために用いた。ＩＦＮ−γスポット分析用に調整されたＥＬＩＳｐｏｔリーダーソフトウエアバージョン３．２．３を用いて、AID Internationalプレート読取器上での展開の２４時間後、免疫化動物におけるＣＴＬ応答を測定した。

結果は、試験した全ての用量で、ＲＰ１２プラスミドは、ＲＰ８より高いＰＳＭＡ特異的免疫を誘発することを示す。ＲＰ１２及びＲＰ８プラスミドの両方に関して、ＰＲＡＭＥに対する免疫は、試験した全ての用量で優勢であることが判明した。さらにまた、ＲＰ１２プラスミドは、ＰＳＭＡ及びＰＲＡＭＥエピトープによる追加免疫後、ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡに対する強力な均衡の取れた免疫応答を示した。

２つの一価プラスミド及び１つの二価プラスミドの構造。 Ｐ２、Ｒ２及びＲＰ５プラスミドを発現する細胞における特異的細胞溶解％を示す⁵¹Ｃｒ放出検定。データは以下のように示される：ｘ軸は異なるエフェクターと共に用いられる標的細胞対標的比を示す；ｙ軸は対応する特異的溶解パーセンテージを示す。 ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡエピトープの両方を発現するよう設計された付加的プラスミドの構造。一価ＰＲＡＭＥプラスミドＲ２の構造が示されている。Ｐ２は、一価ＰＳＭＡプラスミドを表す。 図３に示した異なる抗原からのエピトープを包含するプラスミドにより達成される二価応答の誘導を示すＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡのＥＬＩＳｐｏｔ分析。両側性リンパ節にＰＲＡＭＥ／ＰＳＭＡ二価プラスミド（１ｍｇ／ｍｌ）を２回注射して、動物を免疫化した。５×１０⁵の単離脾臓細胞を、１０μｇのＰＳＭＡ_288-297天然ペプチド又は１０μｇのＰｒａｍｅ_425-433天然ペプチドと共に４２時間インキュベートした後、展開した。グラフは、平均＋／−ＳＥＭを表す。 ＲＰ１２二価プラスミド免疫化後のＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡの四量体分析。データは、ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡに対する二価免疫応答を示し、プラスミド単独初回刺激マウスにおけるＰＲＡＭＥエピトープに対する応答の相対的優勢を伴う。 ＲＰ１２又はＲＰ８二価プラスミド免疫化を受け、その後、ＰＳＭＡ_288-297（Ｉ２９７Ｖ）ペプチド類似体追加免疫を受けたマウスにおけるＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡの四量体分析。 ＲＰ１２又はＲＰ８二価プラスミド免疫化及びＰＳＭＡ_288-297（Ｉ２９７Ｖ）ペプチド類似体追加免疫後の個々の動物におけるＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡの四量体分析。 ＲＰ１２又はＲＰ８で初回刺激され、ＰＳＭＡ_288-297（Ｉ２９７Ｖ）及びＰＲＡＭＥ_425-433（Ｌ４２６Ｎｖａ、Ｌ４３３Ｎｌｅ）ペプチド類似体で追加免疫された動物におけるＥＬＩＳｐｏｔ分析。 ＲＰ８に関するポリペプチド配列（配列番号２）。 ＲＰ１２に関するポリペプチド配列（配列番号４）。

Claims (32)

1. ＣＴＬエピトープＰＳＭＡ_288-297（配列番号６）の１つ又は複数のコピー及びＣＴＬエピトープＰＲＡＭＥ_425-433（配列番号５）の１つ又は複数のコピー、或いは該エピトープの一方又は両方の１〜３個の置換を含む交差反応性類似体を含むポリペプチドをコードする核酸構築物であって、前記ポリペプチドが全抗原を含まない、核酸構築物。
2. 前記一方又は両方のエピトープが遊離配列内でコードされる、請求項１に記載の核酸構築物。
3. 前記ポリペプチドが、１つ又は複数のエピトープクラスターをコードする配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸構築物。
4. ＰＲＡＭＥエピトープクラスターを含む、請求項３に記載の核酸構築物。
5. 前記エピトープクラスターがＰＲＡＭＥのアミノ酸４２２〜５０９である、請求項４に記載の核酸構築物。
6. ＰＳＭＡエピトープクラスターを含む、請求項３に記載の核酸構築物。
7. 前記１つ又は複数のエピトープクラスターがＰＳＭＡのアミノ酸３〜４５及び２１７〜２９７から成る群から選択される、請求項６に記載の核酸構築物。
8. 前記ＰＳＭＡエピトープ類似体がＩ２９７Ｖ置換を含有する、請求項１に記載の核酸構築物。
9. 核内移行配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸構築物。
10. プロモーターをさらに含む、請求項１に記載の核酸構築物。
11. 前記プロモーターがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである、請求項１０に記載の核酸構築物。
12. ポリＡ配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸構築物。
13. １つ又は複数のＣｐＧ免疫刺激モチーフをさらに含む、請求項１に記載の核酸構築物。
14. 前記ＰＲＡＭＥエピトープ及び前記ＰＳＭＡエピトープの両方の前記遊離配列がコード化ポリペプチドのＮ末端部分に位置する、請求項２に記載の核酸構築物。
15. 前記コード化ポリペプチドが配列番号２である、請求項１４に記載の核酸構築物。
16. 前記ＰＲＡＭＥエピトープ及び前記ＰＳＭＡエピトープの両方の前記遊離配列がコード化ポリペプチドのＣ末端部分に位置する、請求項２に記載の核酸構築物。
17. 前記コード化ポリペプチドが配列番号４である、請求項１６に記載の核酸構築物。
18. 請求項１に記載の核酸構築物を含む免疫原性組成物。
19. 治療的有効量の請求項１に記載の核酸構築物を投与する工程を包含する、癌を有する個
    体の治療方法。
20. 前記核酸構築物が節内に投与される、請求項１９に記載の方法。
21. 前記個体が、新生物細胞又は腫瘍関連新生血管系細胞においてＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ又はその両方を発現する癌を有する、請求項１９に記載の方法。
22. 有効量の請求項１に記載の核酸構築物を投与して免疫応答を誘導する工程と；
    前記核酸構築物によりコードされるエピトープに対応する少なくとも１つのペプチド類似体で追加免疫することにより免疫応答を増幅する工程と
    を包含する、癌を有する個体の治療方法。
23. 前記個体が、癌細胞上でＰＲＡＭＥを、且つ腫瘍関連血管系細胞上でＰＳＭＡを発現する癌を有する、請求項２２に記載の方法。
24. 前記個体が、新生物細胞又は腫瘍関連新生血管系細胞においてＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ又はその両方を発現する癌を有する、請求項２２に記載の方法。
25. 癌を有する個体の治療のための薬剤の調製における、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の核酸構築物の使用。
26. 前記薬剤が、節内に該薬剤を投与することによって癌を有する個体を治療するためのものである、請求項２６に記載の使用。
27. 前記個体が、新生物細胞又は腫瘍関連新生血管系細胞においてＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ又はその両方を発現する癌を有する、請求項２６又は２７に記載の使用。
28. 癌を有する個体の治療のための薬剤の調製における、請求項１８に記載の免疫原性組成物の使用。
29. 前記薬剤が、節内に該薬剤を投与することによって癌を有する個体を治療するためのものである、請求項２８に記載の使用。
30. 前記個体が、新生物細胞又は腫瘍関連新生血管系細胞においてＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ又はその両方を発現する癌を有する、請求項２８又は２９に記載の使用。
31. 腫瘍関連新生血管系の免疫応答標的化を誘導するのに用いるための薬剤の調製における、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の核酸構築物の使用。
32. 前記腫瘍関連血管系細胞がＰＲＡＭＥを表示する、請求項３１に記載の使用。

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