DE69334071T2

DE69334071T2 - Prostata-spezifisches membranantigen

Info

Publication number: DE69334071T2
Application number: DE69334071T
Authority: DE
Inventors: Ron S. Brooklyn ISRAELI; Warren D. W. New York HESTON; William R. New York FAIR
Original assignee: Sloan Kettering Institute for Cancer Research
Current assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 1992-11-05
Filing date: 1993-11-05
Publication date: 2007-10-25
Anticipated expiration: 2013-11-06
Also published as: DE69334071D1; EP0668777B1; JP4204642B2; JP4202375B2; US5538866A; DK0668777T3; PT668777E; JPH08506005A; EP0668777B2; EP1757695A2; JP2007014343A; CA2147499C; EP1757694A2; EP1757695A3; EP1757694A3; WO1994009820A1; CA2147499A1; EP0668777A1; ES2276390T3; ATE342356T1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die hierin offenbarte Erfindung wurde zum Teil mit Unterstützung der Regierung unter den NIH-Fördermittelzuwendungen Nr. DK47650 und CA58192 vom Department of Health and Human Services gemacht. Dementsprechend hat die U.S.-Regierung bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
In dieser Anmeldung wird überall auf verschiedene Quellenangaben in Klammern verwiesen. Die kompletten bibliographischen Literaturstellen für diese Quellenangaben können am Ende jeder Reihe von Experimenten gefunden werden.
Prostatakrebs zählt zu den bedeutendsten medizinischen Problemen in den Vereinigten Staaten, da die Krankheit heute die häufigste bei amerikanischen Männern diagnostizierte Malignität darstellt. 1992 gab es über 132.000 neu entdeckte Fälle von Prostatakrebs mit mehr als 36.000 Todefällen, welche der Krankheit zuzuschreiben sind, was einen Anstieg von 17,7% über die letzten 4 Jahre hinweg darstellt (2). Die Fünfjahresüberlebensrate für Patienten mit Prostatakrebs liegt in einem Bereich von 88% für diejenigen mit einer lokalisierten Erkrankung bis 29% für diejenigen mit einer metastasierenden Erkrankung. Der schnelle Anstieg in der Zahl der Fälle scheint zum Teil von einem erhöhten Krankheitsbewusstsein herzurühren ebenso wie von dem weit verbreiteten Einsatz von klinischen Markern wie z.B. den sezernierten Proteinen Prostata-spezifisches Antigen (PSA) und Prostata spezifische saure Phosphatase (PAP) (37).
Die Prostatadrüse ist ein pathologisch bedeutsamer Ort, der von Zuständen wie z.B. gutartigem Wachstum (BPH), Neoplasie (Prostatakrebs) und Infektion (Prostatitis) betroffen ist. Prostatakrebs stellt die zweithäufigste Todesursache von Krebserkrankungen bei Männern dar (1). Prostatakrebs ist jedoch die am häufigsten betroffene Stelle bei der Krebsentstehung bei Männern. Die Abweichung zwischen diesen beiden Tatsachen hängt damit zusammen, dass Prostatakrebs mit steigender Häufigkeit auftritt, wenn Männer altern, insbesondere in einem Alter über 60, zu einer Zeit, in der häufig Todesfälle aus anderen Gründen dazwischenkommen. Hinzu kommt, dass das Spektrum der biologischen Aggressivität von Prostatakrebs sehr groß ist, so dass bei manchen Männern der Tumor nach der Entdeckung ein latenter histologischer Tumor bleibt und klinsch nicht bedeutsam wird, wohingegen er bei anderen rasch fortschreitet, metastasiert und den Mann in einer relativ kurzen Zeit von 2-5 Jahren umbringt (1, 3).
Zwei spezifische Proteine, die in Prostatakrebszellen in sehr hohen Konzentrationen erzeugt werden, sind die Prostata spezifische saure Phosphatase (PAP) und das Prostata-spezifische Antigen (PSA) (4, 5, 6). Diese Proteine sind charakterisiert worden und sind dazu eingesetzt worden, um das Ansprechen auf eine Therapie zu verfolgen. Im Laufe der Entwicklung des Krebses ändert sich die normale Struktur der Drüse, wozu ein Verlust der normalen Struktur des Kanals zum Abfluss der Sekrete gehört, und deswegen erreichen die Sekrete das Serum. In der Tat wurde die Messung von Serum-PSA als mögliche Screeningmethode für Prostatakrebs vorgeschlagen. In der Tat verringert sich die relative Menge von PSA und/oder PAP im Krebs- im Vergleich zu normalem oder gutartigem Gewebe.
PAP war einer der frühesten Serummarker für den Nachweis einer metastatischen Ausbreitung (4). PAP hydrolysiert Tyrosinphosphat und hat eine breite Substratspezifität. Tyrosinphosphorylierung ist bei oncogenen Transformationen häufig erhöht. Man hat die Hypothese aufgestellt, dass während einer neoplastischen Transformation weniger Phosphataseaktivität zur Verfügung steht um Proteine zu inaktivieren, welche durch Phosphorylierung auf Tyrosinresten aktiviert sind. In einigen Fällen hat die Einführung von Phosphatasen, die Tyrosinphosphatase-Aktivität aufweisen, zu einer Rückentwicklung des malignen Phänotyps geführt.
PSA ist eine Protease und es ist nicht einfach zu verstehen, wie ein Verlust ihrer Aktivität mit der Krebsentwicklung in Beziehung steht (5, 6). Die proteolytische Aktivität von PSA wird durch Zink inhibiert. Die Zinkkonzentrationen sind in der normalen Prostata hoch und bei Prostatakrebs erniedrigt. Möglicherweise lässt der Verlust von Zink eine erhöhte proteolytische Aktivität durch PSA zu. Da Proteasen an der Metastasierung beteiligt sind und einige Proteasen die mitotische Aktivität stimulieren, könnte man die Hypothese aufstellen, dass die möglicherweise erhöhte Aktivität von PSA eine Rolle bei der Metastasierung und Ausbreitung des Tumors spielt (7).
Man findet sowohl PSA als auch PAP im Prostatasekret. Die Produktion von beiden scheint davon abhängig zu sein, dass Androgene vorhanden sind, und diese sind nach einem Androgenentzug deutlich vermindert.
Das Prostata-spezifische Membranantigen (PSM), das anscheinend in der Prostatamembran vorliegt, ist identifiziert worden. Dieses Antigen wurde als das Ergebnis der Herstellung von monoclonalen Antikörpern gegen eine Prostatakrebszelle, LNCaP identifiziert (8).
Dr. Horoszewicz etablierte eine als LNCaP bezeichnete Zelllinie aus dem Lymphknoten eines auf Hormonbehandlung nicht ansprechenden, stark vorbehandelten Patienten (9). Man stellte fest, dass diese Linie einen aneuploiden menschlichen männlichen Karyotyp aufwies. Sie erhielt insofern eine Prostata-Differenzierungsfunktionalität aufrecht, als sie sowohl PSA als auch PAP bildete. Sie besaß einen Androgenrezeptor hoher Affinität und Spezifität. Man immunisierte Mäuse mit LNCaP-Zellen und Hybridome wurden von sensibilisierten Tieren abgeleitet. Ein monoclonaler Antikörper wurde daraus abgeleitet und als 7E11-C5 bezeichnet (8). Die Antikörperfärbung stand im Einklang mit einer Membranlokalisierung, und isolierte Fraktionen von LNCaP-Zellmembranen zeigten eine stark positive Reaktion mit Immunoblotting- und ELISA-Techniken. Weder hemmte noch verstärkte dieser Antikörper das Wachstum von LNCaP-Zellen in vitro oder in vivo. Der Antikörper gegen dieses Antigen war bemerkenswert spezifisch für Prostataepithelzellen, da man keinerlei Reaktivität bei irgendeinem anderen Bestandteil beobachtete. Die immunhistochemische Färbung von krebsartigen Epithelzellen war stärker als die von normalen oder benignen Zellen.
Dr. Horoszewicz berichtete auch von dem Nachweis von immunreaktivem Material mit 7E11-C5 in Serum von Patienten mit Prostatakrebs (8). Die Immunreaktivität war in fast 60% der Patienten mit einer Erkrankung im Stadium D2 nachweisbar und in einem geringfügig niedrigeren Prozentsatz von Patienten mit einer Erkrankung in einem früheren Stadium, aber die Zahlen der Patienten in der letzteren Gruppe waren gering. Patienten mit benigner Prostatahyperplasie (BPH) waren negativ. Patienten ohne sichtbare Erkrankung waren negativ, aber 50-60% der Patienten in Remission, jedoch mit einer aktiven, stabilen Erkrankung oder mit einer Progression zeigten eine positive Serumreaktivität. Patienten mit anderen als Prostatatumoren zeigten keine Immunreaktivität mit 7E11-C5.
Der monoclonale Antikörper 7E11-C5 durchläuft zur Zeit klinische Untersuchungen. Die Aldehydgruppen des Antikörpers wurden oxidiert und der Linker-Chelatbildner Glycyltyrosyl-(n,ε-diethylentriamin-pentaessigsäure)-Lysin (GYK-DTPA) wurde an zwei reaktive Aldehyde der schweren Kette gekoppelt (10). Der so erhaltene Antikörper wurde als CYT-356 bezeichnet. Die immunhistochemischen Färbemuster waren ähnlich mit der Ausnahme, dass der modifizierte Antikörper CYT-356 Skelettmuskel anfärbte. Ein Vergleich des CYT-356 mit dem monoclonalen Antikörper 7E11-C5 legte nahe, dass beide eine Bindung an Muskelfasern vom Typ 2 zeigten. Es wurde behauptet, dass der Grund für die Diskrepanz mit der früheren Studie, in der berichtet wurde, dass Skelettmuskel negativ wäre, auf Unterschiede in den Gewebefixierungstechniken zurückzuführen sei. Dennoch wurde die stärkste und klarste Reaktion bei Prostataepithelzellen, insbesondere bei krebsartigen Zellen beobachtet. Eine Reaktivität mit Skelettmuskelzellen der Maus wurde mittels Immunhistochemie, aber nicht in bildgebenden Untersuchungen nachgewiesen. Der mit ¹¹¹Indium markierte Antikörper war in LNCaP-Tumoren lokalisert, die in Nacktmäusen herangezogen wurden, mit einer Aufnahme von fast 30% der injizierten Dosis pro Gramm Tumor nach vier Tagen. In vivo war keine selektive Retention des Antikörpers in Antigen-negativen Tumoren wie z.B. PC-3 und DU-145 oder in Skelettmuskel zu beobachten.
Über das PSM-Antigen war sehr wenig bekannt. Ein Versuch der Aufreinigung und Charakterisierung ist bei Treffen von Dr. George Wright und Kollegen beschrieben worden (11, 12). Diese Forscher haben gezeigt, dass das PSM-Antigen nach Elektrophorese auf Acrylamidgelen und Western Blotting ein Molekulargewicht von 100 Kilodaltons (kD) beibehält. Eine chemische und enzymatische Behandlung zeigte, dass sowohl die Peptid- als auch die Kohlenhydrateinheiten des PSM-Antigens für die Erkennung durch den monoclonalen Antikörper 7E11-C5 erforderlich sind. Kompetitive Bindungsstudien mit spezifischen Lectinen wiesen darauf hin, dass galNAc das vorherrschende Kohlenhydrat des antigenen Epitops darstellt.
Das für Prostatazellen und -Gewebe spezifische 100 kD große Glycoprotein wurde aufgereinigt und charakterisiert. Das Protein wurde proteolytisch mit Trypsin verdaut und neun Peptidfragmente wurden sequenziert. Unter Verwendung der Methode der degenerierten PCR (Polymerasekettenreaktion) wurde die 2,65 Kilobasen (kb) große, dieses Antigen codierende Volllänge-cDNA cloniert. Vorläufige Ergebnisse haben gezeigt, dass dieses Antigen in Prostatakrebsgewebe in großen Mengen exprimiert wird, einschließlich in Knochen- und Lymphknotenmetastasen (13). Die gesamte DNA-Sequenz für die cDNA, ebenso wie die vorhergesagte Aminosäuresequenz für das Antigen wurde ermittelt. Eine weitere Charakterisierung des PSM-Antigens wird momentan im Labor der Anmelder durchgeführt, hierzu gehört: eine Untersuchung der Genexpression von PSM in einer Vielzahl von Geweben, die Transfektion des PSM-Gens in Zellen, welche das Antigen nicht exprimieren, die Lokalisierung des PSM-Gens auf dem Chromosom, die Clonierung des genomischen PSM-Gens mit einer Analyse des PSM-Promotors und die Herstellung von polyclonalen und monoclonalen Antikörpern gegen hochantigene Peptiddomänen des PSM-Antigens sowie die Identifizierung von jeglichen endogenen PSM-bindenden Molekülen (Liganden).
Zur Zeit geben LNCaP-Zellen das beste in vitro-Modellsystem ab, um menschlichen Prostatakrebs zu untersuchen, da sie alle drei Prostata-Biomarker bilden: PSA, PAP und PSM. Die Zellen besitzen einen aneuploiden männlichen Karyotyp mit einem Y-Chromosom, exprimieren einen Androgenrezeptor von hoher Affinität und reagieren hormonell sowohl auf Testosteron als auch auf DHT. Da PSM ein Transmembran- Glycoprotein zu sein scheint, betrachtet man es als attraktives Zielmolekül für sowohl Antikörper-gesteuerte Bildgebung als auch für das Zielen auf Prostatatumorablagerungen (38). Wir haben gezeigt, dass das PSM-Protein in LNCaP-Zellmembranen und in mit PSM-cDNA transfizierten PC-3-Zellen exprimiert wird und auch die Expression der PSM-mRNA in menschlichen Geweben und in Reaktion auf Steroidhormone charakterisiert.
Kurze Beschreibung der Figuren
1: Das Signal in Spur 2 stellt das 100 kD große PSM-Antigen dar. Das EGFr wurde als positive Kontrolle eingesetzt und ist in Spur 1 gezeigt. Eine Inkubation mit Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper alleine diente als Negativkontrolle und ist in Spur 3 gezeigt.
2A-D: Die oberen zwei Photos zeigen LNCaP-„Cytospins" (zentrifugierte Zellpräparate), die positiv auf PSM-Antigen angefärbt sind. Das linke untere Photo stellt einen DU-145-„Cytospin" dar und das rechte untere Photo einen PC-3-„Cytospin", die beide für PSM-Antigen-Expression negativ sind.
3A-D: Die oberen beiden Felder stellen menschliche Prostataschnitte (BPH) dar, die positiv für PSM-Antigen angefärbt sind. Die unteren beiden Felder zeigen Schnitte eines invasiven Prostatakarzinoms von Menschen, die eine positive Färbung für die Expression von PSM-Antigen zeigen.
4: 100 kD großes PSM-Antigen nach Immunpräzipitation von mit ³⁵S-Methionin markierten LNCaP-Zellen mit dem Cyt-356-Antikörper.
5: Mit Ethidiumbromid gefärbte 3% Agarose-Gele, die PCR-Produkte zeigen, die mit den degenerierten PSM-Antigen-Primern erhalten wurden. Der Pfeil zeigt auf die Probe IN-20, welche ein 1,1 kb großes PCR-Produkt darstellt, von dem wir später bestätigt haben, dass es eine partielle cDNA darstellt, welche das PSM-Gen codiert.
6A-B: 2% Agarosegele von Plasmid-DNA, die von einer TA-Clonierung der PCR-Produkte stammt. Die Insertionen werden durch Verdauung mit EcoRI aus dem PCR II-Vektor (Invitrogen Corp.) ausgeschnitten. Das 1,1 kb große partielle cDNA-Produkt des PSM-Gens ist in Spur 3 von Gel 1 gezeigt.
7: Autoradiogramm, das die Größe der cDNA zeigt, die in der LNCaP-Bank der Anmelder repräsentiert ist, wobei M-MLV Reverse Transkriptase verwendet wurde.
8: Restriktionsanalyse von Volllänge-Clonen des PSM-Gens, die nach dem Durchmustern der cDNA-Bank erhalten wurden. Die Proben sind mit den Restriktionsenzymen Not I und Sal I geschnitten worden, um die Insertion freizusetzen.
9: Plasmid-Southern Autoradiogramm von Volllänge-Clonen des PSM-Gens. Die Größe beträgt ungefähr 2,7 kb.
10: Northern Blot, welcher zeigt, dass die Expression von PSM auf die LNCaP-Prostatakrebslinie und die Ras-transfizierte LNCaP-Zelllinie H26 beschränkt ist. PC-3, DU-145, T-24, SKRC-27, HeLa, MCF-7, HL-60 und andere ware alle negativ.
11: Autoradiogramm einer Northern-Analyse, welches zeigt, dass die Expression der 2,8 kb großen PSM-Boten-RNA spezifisch für die LNCaP-Zelllinie ist (Spur 1) und in der DU-145- (Spur 2) und der PC-3-Zelllinie (Spur 3) nicht auftritt. Eine RNA-Größenleiter ist auf der linken Seite gezeigt (kb) und die ribosomalen 28S- und 18S-RNA-Banden sind auf der rechten Seite angegeben.
12A-B: Ergebnisse der PCR von menschlichen Prostatageweben mit PSM-Gen-Primern. Die Spuren sind von links nach rechts nummeriert. Spur 1, LNCaP; Spur 2, H26; Spur 3, DU-145; Spur 4, normale Prostata; Spur 5, BPH; Spur 6, Prostatakrebs; Spur 7, BPH; Spur 8, normal; Spur 9, BPH; Spur 10, BPH; Spur 11, BPH; Spur 12, normal; Spur 13, normal; Spur 14, Krebs; Spur 15, Krebs; Spur 16, Krebs; Spur 17, normal; Spur 18, Krebs; Spur 19, IN-20-Kontrolle; Spur 20, PSM-cDNA.
13: Isoelektrischer Punkt des PSM-Antigens (nicht glycosyliert)
14: 1-8 Sekundärstruktur des PSM-Antigens.
15A-B: A. Hydrophiliediagramm des PSM-Antigens
B. Vorhersage der die Membran umspannenden Abschnitte
16: 1-11 Homologie mit der Transferrin-Rezeptor-Sequenz von Hühnchen, Ratte und Mensch.
17A-C: Immunhistochemischer Nachweis der Expression von PSM-Antigen in Prostata-Zelllinien. Das oberste Feld zeigt den gleichförmig hohen Expressionsspiegel in LNCaP-Zellen; das mittlere Feld und das untere Feld stellen DU-145- bzw. PC-3-Zellen dar, beide negativ.
18: Autoradiogramm eines Proteingels, das die Produkte einer gekoppelten in vitro-Transkription-Translation von PSM zeigt. Man sieht ein nicht-glycosyliertes PSM-Polypeptid bei 84 kDa (Spur 1), und nach der Zugabe von Mikrosomen wird ein synthetisiertes PSM-Glycoprotein bei 100 kDa beobachtet (Spur 2).
19: Western Blot-Analyse, in der die PSM-Expression in transfizierten, kein PSM exprimierenden PC-3-Zellen nachgewiesen wird. Eine 100 kDa große Spezies des PSM-Glycoproteins ist in den LNCaP-Membranen (Spur 1), in dem LNCaP-Rohlysat (Spur 2) und den PSM-transfizierten PC-3-Zellen klar zu sehen, ist aber in nativen PC-3-Zellen nicht nachweisbar (Spur 3).
20: Autoradiogramm eines „Ribonuclease Protection"-Gels, mit dem die Expression der PSM-mRNA in normalen menschlichen Geweben untersucht wird. Eine radioaktiv markierte 1 kb-DNA-Leiter (Gibco BRL) ist in der Spur 1 gezeigt. Die unverdaute Sonde hat eine Größe von 400 Nucleotiden (Spur 2), die erwartete geschützte PSM-Bande hat eine Größe von 350 Nucleotiden und die tRNA-Kontrolle ist gezeigt (Spur 3). Ein starkes Signal ist in menschlicher Prostata zu sehen (Spur 11), wobei sehr schwache, aber nachweisbare Signale in menschlichem Gehirn (Spur 4) und menschlicher Speicheldrüse (Spur 12) zu sehen sind.
21: Autoradiogramm eines „Ribonuclease Protection"-Gels, mit dem die Expression der PSM-mRNA in in Nacktmäusen angezogenen LNCaP-Tumoren und in menschlichem Prostatagewebe untersucht wird. Eine ³²P-markierte 1 kb DNA-Leiter ist in Spur 1 gezeigt. Die 298 Nucleotide große unverdaute Sonde ist gezeigt (Spur 2) und die tRNA-Kontrolle ist gezeigt (Spur 3). Die Expression von PSM-mRNA ist klar nachweisbar in LNCaP-Zellen (Spur 4), in LNCaP-Tumoren, die man in Nacktmäusen mit und ohne ohne Matrigel orthotop heranwachsen ließ (Spuren 5 und 6) und in LNCaP-Tumoren, die man subkutan in Nacktmäuse implantierte und wachsen ließ (Spur 7). Eine Expression von PSM-mRNA ist auch in normaler menschlicher Prostata zu sehen (Spur 8) und in einem mäßig differenzierten menschlichen Prostata-Adenocarcinom (Spur 10). Eine sehr schwache Expression ist in einer Probe von menschlichem Prostatagewebe mit einer gutartigen Hyperplasie zu sehen (Spur 9).
22: „Ribonuclease Protection"-Assay auf PSM-Expression in LNCaP-Zellen, die für 24 Stunden mit physiologischen Dosen verschiedener Steroide behandelt worden waren. Eine ³²P-markierte DNA-Leiter ist in Spur 1 gezeigt. Die 298 Nucleotide große unverdaute Sonde ist gezeigt (Spur 2) und die tRNA-Kontrolle ist gezeigt (Spur 3). Die Expression der PSM-mRNA ist am höchsten in unbehandelten LNCaP-Zellen in mit Aktivkohle gefilterten Medien (Spur 4). Die Anmelder sehen eine signifikant verringerte PSM-Expression in LNCaP-Zellen, die mit DHT (Spur 5), Testosteron (Spur 6), Östradiol (Spur 7) und Progesteron (Spur 8) behandelt wurden, mit einer schwachen Reaktion auf Dexamethason (Spur 9).
23: Daten, welche die Ergebnisse des Vorhandenseins von PSM-DNA und -RNA in transfizierten Dunning-Zelllinien veranschaulichen, wobei Southern und Northern Blotting-Methoden eingesetzt wurden.
24A-B: Figur A zeigt die Fähigkeit von Cytokin-transfizierten Zellen unmodifizierte Zellen zu unterrichten. Die Verabreichung war auf die parentale Flanke oder Prostatazellen gerichtet. Die Ergebnisse weisen auf die Bedeutung der Mikroumgebung hin.

Figur B zeigt die tatsächliche Wirksamkeit an einer bestimmten Stelle an. Der Tumor wurde in Prostatazellen implantiert und an zwei verschiedenen Stellen mit Immunzellen behandelt.
25A-B: Ordnet die Wirksamkeit von Cytokinen bei der Hemmung des Wachstums von primären Tumoren zu. Den Tieren wurden unmodifizierte parentale Tumorzellen verabreicht und als Impfstoff transfizierte Zellen. Eine Prostatektomie des Nagetiertumors führt zu einer Verlängerung der Überlebenszeit.
26: Eine PCR-Amplifikation mit verschachtelten Primern verbesserte unsere Nachweisgrenze von Prostatazellen von ungefähr einer Prostatazelle pro 10.000 MCF-7-Zellen auf unter eine Zelle pro einer Million MCF-7-Zellen bei Verwendung von beiden PSA.
27: Eine PCR-Amplifikation mit verschachtelten Primern verbesserte unsere Nachweisgrenze von Prostatazellen von ungefähr einer Prostatazelle pro 10.000 MCF-7-Zellen auf unter eine Zelle pro einer Million MCF-7-Zellen bei Verwendung von PSM-abgeleiteten Primern.
28: Photographie eines repräsentativen mit Ethidiumbromid gefärbten Gels von einer PSM-PCR. Die in Spur A gelaufenen Proben stellen PCR-Produkte dar, welche von den äußeren Primern erzeugt worden sind und die Proben in den mit B markierten Spuren sind Produkte der inneren Primerpaare.
29: Autoradiographie eines PSM-Southern Blots. Die Sensitivität der Southern Blot-Analyse überstieg die der Ethidiumbromidfärbung, wie man bei mehreren Proben sehen kann, bei denen das äußere Produkt auf 3A-D nicht sichtbar, aber durch Southern Blotting wie in 4 gezeigt nachweisbar ist.
30: Charakteristika der 16 Patienten, die hinsichtlich ihres klinischen Stadiums, der Behandlung, der PSA- und PAP-Werte im Serum und der Assay-Ergebnisse untersucht worden sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung stellt ein isoliertes Nucleinsäuremolekül eines Säugers bereit, welches ein Prostata-spezifisches Membran (PSM)-Antigen eines Säugers codiert. Bei der isolierten Säuger-Nucleinsäure kann es sich um DNA, cDNA oder RNA handeln.
Diese Erfindung stellt auch ein Nucleinsäuremolekül bereit, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einer Nucleinsäure, die ein menschliches Prostata-spezifisches Membranantigen-Polypeptid mit der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Sequenz codiert;
(b) einer Nucleinsäure mit der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz oder ein Fragment davon, das einen antigenischen Bereich codiert, gegen den ein Antikörper erzeugt werden kann, der spezifisch gegen menschliches Prostata-spezifisches Membranantigen mit der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Sequenz ist; und
(c) einer Nucleinsäure mit mindestens 15 aufeinanderfolgenden Nucleotiden der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz, oder dem komplementären Strang davon.

Das Nucleinsäuremolekül kann entweder DNA oder RNA sein.
Diese Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Nachweis der Expression des PSM-Antigens, umfassend das Erlangen von Gesamt-mRNA aus der Zelle und das Inkontaktbringen der so erhaltenen mRNA mit einem markierten, für das PSM-Antigen spezifischen Nucleinsäuremoleküls unter Hybridisierungsbedingungen, Bestimmen des Vorhandenseins von mRNA, die an die Sonde hybridisiert hat und dadurch das Nachweisen der Expression des PSM-Antigens durch die Zelle. Das PSM-Antigen in Gewebeschnitten kann auf ähnliche Weise nachgewiesen werden.
Diese Erfindung stellt ein isoliertes Nucleinsäuremolekül des PSM-Antigens bereit, das funktionell mit einem Promotor der RNA-Transkription verknüpft ist. Diese Erfindung stellt ferner einen Vektor bereit, welcher ein isoliertes Nucleinsäuremolekül des PSM-Antigens eines Säugers umfasst.
Diese Erfindung stellt auch eine Nucleinsäure bereit, die ein menschliches Prostata-spezifisches Membranantigen-Polypeptid codiert, welches die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Sequenz besitzt.
Diese Erfindung stellt ferner einen Vektor bereit, welcher das hierin offenbarte Nucleinsäuremolekül umfasst.
Diese Erfindung stellt ferner ein Wirtsvektorsystem für die Herstellung eines Polypeptids bereit, welches die biologische Aktivität eines Säuger-PSM-Antigens besitzt, umfassend den Vektor, welcher das ein Säuger-PSM-Antigen codierendes Nucleinsäuremolekül eines Säugers und einen geeigneten Wirt umfasst. Bei dem geeigneten Wirt für die Expression des PSM-Antigens kann es sich um eine bakterielle Zelle, eine Insektenzelle oder eine Säugerzelle handeln.
Darüber hinaus stellt diese Erfindung eine Säugerzelle bereit, welche den hierin offenbarten Vektor umfasst.
Diese Erfindung stellt ein Verfahren bereit, um festzustellen, ob ein Ligand an ein PSM-Antigen eines Säugers binden kann, umfassend das Inkontaktbringen einer Säugerzelle, welche ein isoliertes Säuger-DNA-Molekül aufweist, das ein PSM-Antigen eines Säugers codiert, mit dem Liganden unter Bedingungen, welche die Bindung von Liganden an das Säuger-PSM-Antigen erlauben, und Bestimmen, ob der Ligand an ein Säuger-PSM-Antigen bindet. Diese Erfindung stellt ferner Liganden bereit, welche an PSM-Antigen binden.
Diese Erfindung stellt aufgereinigtes Säuger-PSM-Antigen bereit. So stellt diese Erfindung ein Polypeptid mit der Sequenz des menschlichen Prostata-spezifischen Membranantigens bereit, welche in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist.
Diese Erfindung stellt auch ein Polypeptid bereit, welches von dem isolierten Nucleinsäuremolekül eines Säugers codiert wird, das ein Säuger-PSM-Antigen codiert.
Dementsprechend stellt diese Erfindung ein Polypeptid mit der Sequenz des menschlichen Prostata-spezifischen Membranantigens bereit, welche in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist oder einen antigenischen Bereich, der eine hydrophile Aminosäuresequenz dieses menschlichen Prostata-spezifischen Membranantigens darstellt, wobei das Polypeptid dazu verwendet werden kann, Antikörper zu erzeugen, welche spezifisch für dieses menschliche Prostata-spezifische Membranantigen sind, unter der Voraussetzung, dass der antigenische Bereich nicht aus Sequenzen besteht, die in SEQ ID NO: 35 gezeigt sind. Diese Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit, um Liganden von Säuger-PSM-Antigenen zu identifizieren und aufzureinigen.
Diese Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit, um sowohl polyclonale als auch monoclonale Antikörper mit Hilfe von aufgereinigten PSM-Antigenen oder Polypeptiden, die von einem isolierten Nucleinsäuremolekül eines Säugers codiert werden, das ein Säuger-PSM-Antigen codiert, zu erzeugen.
Dementsprechend stellt diese Erfindung einen monoclonalen Antikörper bereit, der gegen menschliches Prostata-spezifisches Membranantigen gerichtet ist, wobei die Sequenz dieses Antigens in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist.
Diese Erfindung stellt polyclonale und monoclonale Antikörper bereit, die höchstwahrscheinlich entweder gegen das Peptid Asp-Glu-Leu-Lys-Ala-Glu (SEQ ID NO: 35) oder gegen Asn-Glu-Asp-Gly-Asn-Glu (SEQ ID NO: 36) oder gegen Lys-Ser-Pro-Asp-Glu-Gly (SEQ ID NO: 37) des PSM-Antigens oder gegen die äußere Membrandomäne des PSM-Antigens oder gegen eine hydrophile Aminosäuresequenz des PSM-Antigens gerichtet, aber nicht darauf beschränkt sind. Die Antikörper dieser Erfindung sind ferner dadurch gekennzeichnet, dass sie in der Lage sind, an die Oberfläche einer Prostatakrebszelle zu binden.
Diese Erfindung stellt einen therapeutischen Wirkstoff bereit, umfassend einen gegen ein Säuger-PSM-Antigen gerichteten Antikörper und einen daran konjugierten cytotoxischen Wirkstoff.
Diese Erfindung stellt auch die Verwendung von mindestens einem gegen das PSM-Antigen gerichteten Antikörper zur Herstellung eines Diagnostikums zur Darstellung von Prostatakrebs in menschlichen Patienten bereit, wobei der Antikörper in der Lage ist, an eine Zelloberfläche der Prostatakrebszelle zu binden und mit einem bildgebenden Stoff unter solchen Bedingungen markiert ist, unter denen sich ein Komplex zwischen dem monoclonalen Antikörper und dem Zelloberflächen-PSM-Antigen bildet. Diese Erfindung stellt ferner eine Zusammensetzung bereit, umfassend eine wirksame bildgebende Menge des gegen das PSM-Antigen gerichteten Antikörpers und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Diese Erfindung stellt ferner eine Verwendung von mehreren gegen verschiedene PSM-Epitope gerichteten Antikörpern zur Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung zur Bildgebung von Prostatakrebs in menschlichen Patienten bereit.
Diese Erfindung stellt auch eine Verwendung einer markierten Nucleinsäure, die mindestens 15 aufeinanderfolgende Nucleotide der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz aufweist, zur Herstellung eines Diagnostikums zum Nachweis der Expression des PSM-Antigens in einer Zelle oder in einem Gewebeschnitt in einer Probe bereit.
Diese Erfindung stellt auch eine Verwendung des monoclonalen Antikörpers oder der hierin offenbarten Zusammensetzung zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Prostatakrebs in einem Subjekt bereit.
Diese Erfindung stellt einen Immunoassay zur Messung der Menge von PSM-Antigen in einer biologischen Probe, z.B. Serum, bereit, umfassend die Schritte a) Inkontaktbringen der biologischen Probe mit mindestens einem PSM-Antikörper, um einen Komplex mit diesem Antikörper und dem PSM-Antigen zu bilden und b) die Menge des PSM-Antigens in dieser biologischen Probe zu messen, indem man die Menge des Komplexes misst.
Diese Erfindung stellt ein Verfahren zur Aufreinigung von Säuger-PSM-Antigen bereit, umfassend die Schritte a) Koppeln des gegen das PSM-Antigen gerichteten Antikörpers an eine feste Matrix; b) Inkubieren des gekoppelten Antikörpers aus a) mit einem PSM-Antigen enthaltendem Zelllysat unter Bedingungen, die eine Bindung des Antikörpers und des PSM-Antigens erlauben; c) Waschen der gekoppelten festen Matrix, um Verunreinigungen zu entfernen und d) Eluieren des PSM-Antigens von dem gebundenen Antikörper.
Diese Erfindung stellt ferner nicht-menschliche transgene Säuger bereit, welche ein isoliertes Nucleinsäuremolekül des PSM-Antigens umfassen. Diese Erfindung stellt auch ein nicht-menschliches transgenes Säugetier bereit, dessen Genom Antisense-DNA umfasst, welche komplementär zu der DNA ist, die ein Säuger-PSM-Antigen codiert, und so platziert ist, dass sie in Antisense-mRNA transkribiert wird, welche komplementär zu der mRNA ist, die das PSM-Antigen codiert, und welche an die das PSM-Antigen codierende mRNA hybridisiert und dadurch deren Translation vermindert.
Diese Erfindung stellt die Verwendung eines DNA-Moleküls bereit, welches ein Prostata-spezifisches Membranantigen codiert, welches funktionell mit einem Prostata-spezifischen Membranantigen verknüpft ist, welches funktionell mit einem 5'-regulatorischen Element verknüpft ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Unterdrückung oder zur Modulierung der Metastasierungsfähigkeit von Prostatatumorzellen, des Wachstums von Prostatatumoren oder der Beseitigung von Prostatatumorzellen, wobei das Arzneimittel in eine Tumorzelle oder in ein Subjekt auf eine Art und Weise eingeführt wird, dass die Expression des Prostata-spezifischen Membranantigens unter der Kontrolle des regulatorischen Elements steht, wodurch die Metastasierungsfähigkeit der Prostatatumorzellen, das Wachstum des Prostatatumors oder die Beseitigung von Prostatatumorzellen unterdrückt oder moduliert werden.
Diese Erfindung stellt die Verwendung eines DNA-Moleküls bereit, welches ein Prostata-spezifisches Membranantigen codiert, welches funktionell mit einem 5'-regulatorischen Element verknüpft ist, das an eine therapeutische DNA gekoppelt ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Unterdrückung oder zur Modulierung der Metastasierungsfähigkeit von Prostatatumorzellen, des Wachstums von Prostatatumoren oder der Beseitigung von Prostatatumorzellen, wobei das Arzneimittel in eine Tumorzelle eines Subjekts eingeführt wird, wodurch die Metastasierungsfähigkeit der Prostatatumorzellen, das Wachstum des Prostatatumors oder die Beseitigung von Prostatatumorzellen unterdrückt oder moduliert werden.
Diese Erfindung stellt einen therapeutischen Impfstoff, um das Wachstum menschlicher Prostatatumoren oder die Stimulierung von Prostatatumorzellen in einem Subjekt zu verhindern. Dieser therapeutische Impfstoff und ein pharmazeutisch verträglicher Träger können in einer wirksamen Menge an die Prostatazelle verabreicht werden, wodurch das Tumorwachstum oder die Stimulierung von Tumorzellen in dem Subjekt verhindert werden.
Diese Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis von hämatogenen mikrometastatischen Tumorzellen eines Subjekts bereit, umfassend (A) Ausführen einer verschachtelten Polymerasekettenreaktion (PCR) von Blut-, Knochenmark- oder Lymphknotenproben des Subjekts, wobei die Primer des Prostata-spezifischen Membranantigen eingesetzt werden, und (B) Überprüfen der Mikrometastasen durch DNA-Sequenzierung und Southern-Analyse, wodurch hämatogene mikrometastatische Tumorzellen des Subjekts nachgewiesen werden.
Diese Erfindung stellt eine Verwendung eines das Prostata-spezifische Membranantigen codierenden DNA-Moleküls bereit, welches funktionell mit einem 5'-regulatorischen Element verknüpft ist, zur Herstellung eines Arzneimittels um die auf Transferrin zurückzuführende mitogene Antwort aufzuheben, wobei das Arzneimittel in eine Tumorzelle eingeführt wird, deren Genexpression direkt mit einer bestimmten pathologischen Wirkung innerhalb eines vielzelligen Organismus assoziiert ist, wodurch die auf Transferrin zurückzuführende Mitogenantwort aufgehoben wird.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
In der ganzen Anmeldung beziehen sich die Verweise auf spezifische Nucleotide auf die Nucleotide, die auf dem codierenden Strang der Nucleinsäure vorliegen. Die folgenden Standardabkürzungen werden in der ganzen Beschreibung verwendet, um spezifische Nucleotide anzugeben:

C: = Cytosin
A: = Adenosin
T: = Thymidin
G: = Guanosin

Ein „Gen" bedeutet ein Nucleinsäuremolekül, dessen Sequenz die gesamte Information beinhaltet, welche für die normale, regulierte Erzeugung eines bestimmten Proteins notwendig ist, wozu die die Struktur codierende Sequenz, Promotoren und Enhancer gehören.
Diese Erfindung stellt eine isolierte Nucleinsäure eines Säugers bereit, welche ein Prostata-spezifisches Membran (PSM)-Antigen eines Säugers codiert.
Diese Erfindung stellt ferner ein isoliertes Säuger-DNA-Molekül eines isolierten Nucleinsäuremoleküls eines Säugers bereit, das ein Prostata-spezifisches Membranantigen eines Säugers codiert. Diese Erfindung stellt auch ein isoliertes Säuger-cDNA-Molekül bereit, welches ein Prostata-spezifisches Membranantigen eines Säugers codiert. Diese Erfindung stellt ein isoliertes Säuger-RNA-Molekül bereit, welches ein Prostata-spezifisches Membranantigen codiert.
In der bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung handelt es sich bei der isolierten Nucleinsäuresequenz um cDNA vom Menschen wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt. Diese menschliche Sequenz wurde in GenBank (Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico) mit der Hinterlegungsnummer M99487 und der Beschreibung PSM, Homo sapiens, 2653 Basenpaare hinterlegt.
Hierin sind auch eine DNA und eine cDNA beschrieben, die Aminosäuresequenzen codieren, welche sich von denen des PSM-Antigens unterscheiden, die aber keine phänotypischen Änderungen hervorrufen sollten. Des Weiteren sind darin auch DNAs und cDNAs beschrieben, welche an die DNA und die cDNA er vorliegenden Erfindung hybridisieren. Hybridisierungsverfahren sind den Fachleuten wohlbekannt.
Die DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung schließen auch DNA-Moleküle ein, welche Polypeptidfragmente von antigenischen Polypeptiden codieren, welche sich von den natürlich vorkommenden Formen in Bezug auf die Identität oder die Lage von einem oder mehreren Aminosäureresten unterscheiden (Deletionsanaloga, welche weniger als alle der für das Protein angegebenen Reste enthalten, Substitutionsanaloga, in denen einer oder mehrere angegebene Reste durch andere Reste ausgetauscht sind, sowie Additionsanaloga, in denen ein oder mehrere Aminosäurereste zu einem endständigen oder in der Mitte gelegenen Teil der Polypeptide hinzugefügt sind) und die einige oder alle Eigenschaften der natürlich vorkommenden Formen gemeinsam haben. Diese Moleküle umfassen: den Einbau von Codons, welche für die Expression durch ausgewählte Nichtsäuger-Wirte „bevorzugt" sind; die Bereitstellung von Stellen für die Spaltung durch Restriktionsendonuclease-Enzyme; und die Bereitstellung von zusätzlichen Start-, terminalen oder dazwischenliegenden DNA-Sequenzen, welche die Konstruktion von leicht exprimierten Vektoren erleichtern.
Die hierin beschriebenen und beanspruchten DNA-Moleküle sind nützlich auf Grund der Information, die sie in Bezug auf die Aminosäuresequenz des Polypeptids zur Verfügung stellen sowie als Produkte für die Synthese des Polypeptids in großem Maßstab durch eine Vielzahl von Rekombinationsverfahren. Das Molekül ist nützlich um neue Clonierungs- und Expressionsvektoren, transformierte und transfizierte prokaryontische und eukaryontische Wirtszellen herzustellen, sowie neue und nützliche Verfahren für die Züchtung von solchen Wirtszellen, die in der Lage sind, das Polypeptid und verwandte Produkte zu exprimieren.
Darüber hinaus sind die isolierten Nucleinsäuremoleküle eines Säugers, welche ein Prostata-spezifisches Membranantigen eines Säugers codieren, nützlich für die Herstellung von Sonden, um die Tumorigenese von Prostatakrebs zu untersuchen.
Diese Erfindung stellt auch Nucleinsäuremoleküle mit einer Länge von mindestens 15 Nucleotiden bereit, welche in der Lage sind, spezifisch mit einer Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls zu hybridisieren, welches das Prostata-spezifische Membranantigen codiert.
Bei diesem hergestellten Nucleinsäuremolekül kann es sich entweder um DNA oder um RNA handeln. Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „spezifisch hybridisierend" auf die Fähigkeit eines Nucleinsäuremoleküls eine Nucleinsäuresequenz zu erkennen, die komplementär zu dessen eigener ist und doppelhelicale Abschnitte durch Wasserstoffbrückenbindung zwischen komplementären Basenpaaren auszubilden.
Dieses Nucleinsäuremolekül mit einer Länge von mindestens 15 Nucleotiden, welches in der Lage ist, spezifisch mit einer Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls zu hybridisieren, das das Prostata-spezifische Membranantigen codiert, kann als Sonde verwendet werden. Die Technologie von Nucleinsäuresonden ist den Fachleuten wohlbekannt, die leicht erkennen werden, dass sich solche Sonden in der Länge stark unterscheiden können und mit einem nachweisbaren Marker wie z.B. einem Radioisotop oder einem Fluoreszenzfarbstoff markiert werden können, um den Nachweis der Sonde zu erleichtern. DNA-Sonden-Moleküle können durch das Einfügen eines DNA-Moleküls, welches das PSM-Antigen codiert, in geeignete Vektoren wie z.B. Plasmide oder Bakteriophagen hergestellt werden, gefolgt von einer Transformation in geeignete bakterielle Wirtszellen, Replikation in den transformierten bakteriellen Wirtszellen und Ernten der DNA-Sonden, wobei auf dem Fachgebiet wohlbekannte Verfahren verwendet werden. Alternativ können Sonden chemisch von DNA-Synthesegeräten hergestellt werden.
RNA-Sonden können durch Einfügen des PSM-Antigen-Moleküls stromabwärts von einem Bakteriophagenpromotor wie z.B. T3, T7 oder SP6 hergestellt werden. Große Mengen einer RNA-Sonde können dadurch hergestellt werden, indem man die markierten Nucleotide mit dem linearisierten PSM-Antigen-Fragment, das einen stromaufwärts gelegenen Promotor enthält, in Gegenwart der geeigneten RNA-Polymerase inkubiert.
Diese Erfindung stellt auch ein Nucleinsäuremolekül mit einer Länge von mindestens 15 Nucleotiden bereit, welches in der Lage ist, spezifisch mit einer Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls zu hybridisieren, das komplementär zu dem Nucleinsäuremolekül eines Säugers ist, welches ein Prostata-spezifisches Membranantigen eines Säugers codiert. Bei diesem Molekül kann es sich entweder um ein DNA- oder um ein RNA-Molekül handeln.
Die gegenwärtige Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Nachweis der Expression eines PSM-Antigens eines Säugers in einer Zelle bereit, umfassend Erlangen von Gesamt-mRNA aus der Zelle, Inkontaktbringen unter Hybridisierungsbedingungen der so erhaltenen mRNA mit einem markierten Nucleinsäuremolekül mit einer Länge von mindestens 15 Nucleotiden, das in der Lage ist, spezifisch mit einer Sequenz des Nucleinsäuremoleküls zu hybridisieren, welches ein Säuger-PSM-Antigen codiert, Bestimmen des Vorliegens der an das Molekül hybridisierten mRNA und dadurch Nachweisen der Expression des Prostata-spezifischen Membranantigens eines Säugers in der Zelle. Die vorstehend synthetisierten Nucleinsäuremoleküle können dazu verwendet werden, die Expression eines PSM-Antigens nachzuweisen indem man das Vorliegen einer mRNA nachweist, welche das PSM-Antigen codiert. Gesamt-mRNA aus der Zelle kann mit vielen einem Fachmann mit durchschnittlichen Kenntnissen wohlbekannten Methoden isoliert werden. Die Hybridisierungsbedingungen der markierten Nucleinsäuremoleküle können durch auf dem Fachgebiet wohlbekanntes routinemäßiges Experimentieren bestimmt werden. Das Vorliegen von mRNA, die an die Sonde hybridisiert hat, kann durch Gelelektrophorese oder andere auf dem Fachgebiet bekannte Methoden bestimmt werden. Indem man die Menge des erzeugten Hybrids misst, kann man die Expression des PSM-Antigens durch die Zelle bestimmen. Die Markierung kann radioaktiv sein. Um ein Beispiel zu geben, es können eines oder mehrere radioaktive Nucleotide in die Nucleinsäure eingebaut werden, wenn diese hergestellt wird.
In einer Ausführungsform dieser Erfindung werden Nucleinsäuren durch Präzipitation aus lysierten Zellen extrahiert und die mRNA wird aus dem Extrakt mit Hilfe einer oligo-dT-Säule isoliert, welche die poly-A-Schwänze der mRNA-Moleküle bindet (13). Die mRNA wird dann auf einer Nitrocellulose-Membran einer radioaktiv markierten Sonde ausgesetzt, und die Sonde hybridisiert an und markiert dadurch komplementäre mRNA-Sequenzen. Die Bindung kann durch Lumineszenz-Autoradiographie oder Scintillationszählen nachgewiesen werden. Fachleuten sind jedoch andere Methoden zur Durchführung dieser Schritte wohlbekannt, und die vorstehende Diskussion stellt lediglich ein Beispiel dar.
Diese Erfindung stellt ferner ein anderes Verfahren bereit, um die Expression eines PSM-Antigens in Gewebeschnitten nachzuweisen, umfassend Inkontaktbringen unter Hybridisierungsbedingungen der Gewebeschnitte mit einem markierten Nucleinsäuremolekül mit einer Länge von mindestens 15 Nucleotiden, welches in der Lage ist, spezifisch mit einer Sequenz von Nucleinsäuremolekülen zu hybridisieren, die ein Säuger-PSM-Antigen codieren, Bestimmen des Vorliegens der an das Molekül hybridisierten mRNA und dadurch Nachweisen der Expression des Säuger-PSM-Antigens in Gewebeschnitten. Die Sonden sind auch nützlich für die in situ-Hybridisierung oder um Gewebe zu lokalisieren, welche dieses Gen exprimieren oder für andere Hybridisierungsassays auf das Vorliegen dieses Gens oder seiner mRNA in verschiedenen biologischen Geweben. Die in situ-Hybridisierung mit einem markierten Nucleinsäuremolekül ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Im Wesentlichen werden Gewebeschnitte mit dem markierten Nucleinsäuremolekül inkubiert, um die Hybridisierung stattfinden zu lassen. Das Molekül wird einen Marker für den Nachweis tragen, da es „markiert" ist, die Menge des Hybrids wird auf der Grundlage des Nachweises der Menge des Markers bestimmt werden und dasselbe gilt für die Expression des PSM-Antigens.
Diese Erfindung stellt ferner ein isoliertes PSM-Antigen-Nucleinsäuremolekül bereit, das funktionell mit einem Promotor der RNA-Transkription verknüpft ist. Die isolierte Sequenz des PSM-Antigens kann mit Vektorsystemen verknüpft werden. Verschiedene Vektoren, einschließlich Plasmidvektoren, Cosmidvektoren, Bakteriophagenvektoren und andere Viren sind durchschnittlich begabten Fachleuten wohlbekannt. Diese Erfindung stellt ferner einen Vektor bereit, welcher das isolierte Nucleinsäuremolekül umfasst, welches das PSM-Antigen codiert.
Als ein Beispiel dafür, wie diese Vektoren erhalten werden, können die DNA der Insertion und des Vektors beide einem Restriktionsenzym ausgesetzt werden, um komplementäre Enden auf beiden Molekülen zu erzeugen, welche miteinander Basenpaarung eingehen und dann zusammen durch eine DNA-Ligase ligiert werden. Alternativ können Linker an die DNA der Insertion ligiert werden, welche einer Restriktionsstelle des Vektors entsprechen, welcher dann mit dem Restriktionsenzym verdaut wird, welches an dieser Stelle schneidet. Es sind auch andere Verfahren verfügbar und einem Fachmann mit durchschnittlichen Kenntnissen bekannt.
In einer Ausführungsform ist die PSM-Sequenz in die NotI/SalI-Stelle des pSPORT-Vektors (Gibco^®-BRL) cloniert. Dieses Plasmid, p55A-PSM wurde am 14. August 1992 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA nach den Vorschriften des Budapester Vertrags zur Internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck von Patentverfahren hinterlegt. Dem Plasmid p55A-PSM wurde die ATCC Hinterlegungsnummer 75294 erteilt.
Diese Erfindung stellt ferner ein Wirt-Vektorsystem für die Herstellung eines Polypeptids bereit, welches die biologische Aktivität des Prostata-spezifischen Membranantigens besitzt. Diese Vektoren können in eine geeignete Wirtszelle transformiert werden um ein Wirtszell-Vektorsystem für die Herstellung eines Polypeptids zu bilden, welches die biologische Aktivität des PSM-Antigens besitzt.
Zu regulatorischen Elementen, welche für die Expression benötigt werden, gehören Promotorsequenzen, um RNA-Polymerase zu binden und Transkriptionsstartsequenzen für die Bindung an Ribosomen. Zum Beispiel umfasst ein bakterieller Expressionsvektor einen Promotor wie z.B. den lac-Promotor und für den Transkriptionsstart die Shine-Dalgarno-Sequenz und das Startcodon AUG (14). Ähnlich umfasst ein eukaryontischer Expressionsvektor einen heterologen oder homologen Promotor für die RNA-Polymerase II, ein stromabwärts gelegenes Polyadenylierungssignal, das Startcodon AUG und ein Terminationscodon für die Trennung vom Ribosom. Solche Vektoren können im Handel erhalten werden oder durch auf dem Fachgebiet wohlbekannte Methoden aus den beschriebenen Sequenzen zusammengefügt werden, zum Beispiel den vorstehend beschriebenen Methoden für die Konstruktion von Vektoren im Allgemeinen. Expressionsvektoren sind nützlich um Zellen zu erzeugen, welche das PSM-Antigen exprimieren.
Diese Erfindung stellt ferner ein isoliertes DNA- oder cDNA-Molekül bereit, welches hierin vorstehend beschrieben ist, wobei die Wirtszelle aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Bakterienzellen (wie z.B. E. coli), Hefezellen, Pilzzellen, Insektenzellen und Tierzellen. Geeignete Tierzellen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Vero-Zellen, HeLa-Zellen, Cos-Zellen, CV1-Zellen und verschiedene primäre Säugerzellen.
Diese Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids bereit, welches die biologische Aktivität des Prostata-spezifischen Membranantigens besitzt, umfassend Züchten von Wirtszellen eines die PSM-Antigen-Sequenz enthaltenden Vektorsystems unter geeigneten Bedingungen, die die Erzeugung des Polypeptids erlauben, und Gewinnen des auf diese Weise hergestellten Polypeptids.
Diese Erfindung stellt eine Säugerzelle bereit, welche ein DNA-Molekül umfasst, das ein Säuger-PSM-Antigen codiert, wie z.B. eine Säugerzelle, welche ein Plasmid umfasst, das für die Expression in einer Säugerzelle angepasst ist, welche ein DNA-Molekül umfasst, das ein Säuger-PSM-Antigen codiert, sowie die für die Expression der DNA in der Säugerzelle notwendingen regulatorischen Elemente, welche relativ zu der das Säuger-PSM-Antigen codierenden DNA so gelegen sind, dass sie deren Expression erlauben.
Viele Säugerzellen können als Wirte verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Maus-Fibroblastenzelle NIH3T3, CHO-Zellen, HeLa-Zellen, Ltk-Zellen, Cos-Zellen etc. Expressionsplasmide wie diejenigen, welche vorstehend beschrieben sind, können dazu verwendet werden, um Säugerzellen mit auf dem Fachgebiet wohlbekannten Methoden zu transfizieren, wie z.B. durch Calciumphosphat-Präzipitation, Elektroporation, oder man kann die das Säuger-PSM-Antigen codierende DNA auf andere Weise in Säugerzellen einführen, z.B. durch Mikroinjektion, um Säugerzellen zu erhalten, die eine ein Säuger-PSM-Antigen codierende DNA, z.B. cDNA oder ein Plasmid, enthalten.
Diese Erfindung stellt ein Verfahren bereit, um zu bestimmen, ob ein Ligand an ein Prostata-spezifisches Membranantigen eines Säugers binden kann, umfassend Inkontaktbringen einer Säugerzelle, welche ein isoliertes DNA-Molekül enthält, welches ein Prostata-spezifisches Membranantigen eines Säugers codiert, unter Bedingungen, welche die Bindung von Liganden an das Prostata-spezifische Membranantigen eines Säugers erlauben, und dadurch Bestimmen, ob der Ligand an ein Prostata-spezifisches Membranantigen eines Säugers bindet.
Hierin werden auch an das Säuger-PSM-Antigen gebundene Liganden bereitgestellt.
Darüber hinaus wird hierin auch ein therapeutischer Wirkstoff bereitgestellt, umfassend einen durch das vorstehend beschriebene Verfahren identifizierten Liganden und einen daran konjugierten cytotoxischen Wirkstoff. Bei dem cytotoxischen Wirkstoff kann es sich entweder um ein Radioisotop oder um ein Toxin handeln. Beispiele für Radioisotope oder Toxine sind einem Fachmann mit durchschnittlichen Kenntnissen wohlbekannt.
Pharmazeutisch verträgliche Träger sind einem Fachmann mit durchschnittlichen Kenntnissen wohlbekannt. Um ein Beispiel anzugeben, kann es sich bei einem solchen pharmazeutisch verträglichen Träger um physiologische Kochsalzlösung handeln.
Ein aufgereinigtes Säuger-PSM-Antigen wird ebenfalls durch diese Erfindung bereitgestellt. Sofern hierin verwendet soll der Begriff „aufgereinigtes Prostata-spezifisches Membranantigen" ein isoliertes natürlich vorkommendes Prostata-spezifisches Membranantigen oder Protein bedeuten (aufgereinigt aus der Natur oder so hergestellt, dass die Primär-, Sekundär- und Tertiärkonformation und posttranslationale Modifikationen identisch zu dem natürlich vorkommenden Material sind) ebenso wie nicht natürlich vorkommende Polypeptide, die eine Primärstrukturkonformation aufweisen (z.B. eine fortlaufende Sequenz von Aminosäureresten).
Derartige Polypeptide umfassen Derivate und Analoga.
Diese Erfindung stellt ferner ein Polypeptid bereit, welches von einer isolierten Nucleinsäuresequenz des PSM-Antigens eines Säugers codiert wird.
Man nimmt an, dass es einen natürlichen Liganden gibt, der mit dem PSM-Antigen interagiert. Diese Erfindung stellt ein Verfahren bereit, um einen solchen natürlichen Liganden oder einen anderen Liganden, der an das PSM-Antigen binden kann, zu identifizieren. Ein Verfahren um den Liganden zu identifizieren umfasst a) Koppeln des aufgereinigten Säuger-PSM-Antigen an eine feste Matrix, b) Inkubieren des gekoppelten aufgereinigten Proteins mit den potenziellen Liganden unter Bedingungen, welche die Bindung von Liganden und des aufgereinigten PSM-Antigens erlauben; c) Waschen des in b) gebildeten Komplexes aus Ligand und dem gekoppelten aufgereinigten Säuger-PSM-Antigen, um die unspezifische Bindung und Verunreinigungen auszuschließen und schließlich d) Eluieren des Liganden von dem gebundenen aufgereinigten Säuger-PSM-Antigen. Verfahren zur Kopplung von Proteinen an eine feste Matrix sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Potenzielle Liganden können entweder aus der Struktur des Säuger-PSM oder durch andere durchschnittlich begabten Fachleuten bekannte empirische Experimente abgeleitet werden. Die Bedingungen für die Bindung können ebenfalls leicht ermittelt werden und Protokolle, um solches Experimentieren durchzuführen, sind seit langem gut dokumentiert (15). Der Komplex aus Ligand und PSM-Antigen wird gewaschen werden. Schließlich wird der gebundene Ligand eluiert und charakterisiert werden. Standardverfahren zur Charakterisierung von Liganden sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt.
Das vorstehende Verfahren kann auch dazu eingesetzt werden, um Liganden aus jeder beliebigen biologischen Quelle aufzureinigen. Zur Aufreinigung von natürlichen Liganden in der Zelle, werden Zelllysate, Serum oder andere biologische Proben eingesetzt werden, um sie mit dem auf einer Matrix gebundenen Säuger-PSM-Antigen zu inkubieren. Ein spezifischer natürlicher Ligand wird dann wie vorstehend beschrieben identifiziert und aufgereinigt werden.
Mit Hilfe der Proteinsequenzinformation können antigenische Bereiche identifiziert werden, und man kann gegen diese Bereiche gerichtete Antikörper erzeugen und diese zielgerichtet auf Prostatakrebs zur bildlichen Darstellung des Krebses oder zur Therapie einsetzen.
Diese Erfindung stellt einen Antikörper bereit, der gegen die Aminosäuresequenz eines Säuger-PSM-Antigens gerichtet ist.
Diese Erfindung stellt ein Verfahren bereit, um spezifische Bereiche auf dem PSM-Antigen auszuwählen, um Antikörper zu erzeugen. Die Proteinsequenz kann aus der PSM-DNA-Sequenz bestimmt werden. Aminosäuresequenzen können mit Verfahren analysiert werden, welche Fachleuten wohlbekannt sind, um festzustellen, ob sie hydrophobe oder hydrophile Bereiche in den Proteinen bilden, welche sie aufbauen. Im Fall von Zellmembranproteinen ist es wohlbekannt, dass hydrophobe Bereiche den Teil des Proteins bilden, welcher in die Lipid-Doppelschicht der Zellmembran eingefügt ist, während hydrophile Bereiche an der Zelloberfläche, in einer wässrigen Umgebung, gelegen sind. Im Allgemeinen sind hydrophile Bereiche immunogener als die hydrophoben Bereiche. Daher können die hydrophilen Aminosäuresequenzen ausgewählt werden und dazu verwendet werden, Antikörper zu erzeugen, welche spezifisch für Säuger-PSM-Antigen sind. Um ein Beispiel zu geben, können hydrophile Sequenzen des in dem Hydrophilie-Diagramm von 16 gezeigten menschlichen PSM-Antigens leicht ausgewählt werden. Die ausgewählten Peptide können mit Hilfe von im Handel erhältlichen Maschinen hergestellt werden. Als eine Alternative kann eine DNA, wie z.B. eine cDNA oder ein Fragment davon cloniert und exprimiert werden, und das so erhaltene Polypeptid zurückgewonnen und als ein Immunogen eingesetzt werden.
Polyclonale Antikörper gegen diese Peptide können dadurch hergestellt werden, indem man Tiere mit den ausgewählten Peptiden immunisiert. Monoclonale Antikörper werden hergestellt, indem man Hybridomtechnologie einsetzt, wobei man Antikörper-produzierende B-Zellen von immunisierten Tieren mit Myelomzellen fusioniert und die so erhaltene Hybridomzelllinie, welche den gewünschten Antikörper erzeugt, durch Selektion erhält. Alternativ können monoclonale Antikörper durch in vitro-Techniken hergestellt werden, die einem Fachmann mit durchschnittlichen Kenntnissen bekannt sind. Diese Antikörper sind nützlich, um die Expression von Säuger-PSM-Antigen in lebenden Tieren, in Menschen oder in biologischen Geweben oder Flüssigkeiten nachzuweisen, die von Tieren oder Menschen isoliert sind.
In einer Ausführungsform sind die Peptide Asp-Glu-Leu-Lys-Ala-Glu (SEQ ID NO: 35), Asn-Glu-Asp-Gly-Asn-Glu (SEQ ID NO: 36) und Lys-Ser-Pro-Asp-Glu-Gly (SEQ ID NO: 37) des menschlichen PSM-Antigens ausgewählt.
Diese Erfindung stellt ferner polyclonale und monoclonale Antikörper gegen die Peptide Asp-Glu-Leu-Lys-Ala-Glu (SEQ ID NO: 35), Asn-Glu-Asp-Gly-Asn-Glu (SEQ ID NO: 36) und Lys-Ser-Pro-Asp-Glu-Gly (SEQ ID NO: 37) bereit.
Diese Erfindung stellt einen therapeutischen Wirkstoff bereit, umfassend Antikörper oder Ligand(en), welche gegen das PSM-Antigen gerichtet sind und einen daran konjugierten cytotoxischen Wirkstoff oder mit Antikörpern verbundene Enzyme, die eine Vorstufe eines Arzneimittels aktivieren, um den Tumor abzutöten. Bei dem cytotoxischen Wirkstoff kann es sich entweder um ein Radioisotop oder um ein Toxin handeln.
Diese Erfindung stellt die Verwendung eines gegen das Peptid des Säuger-PSM-Antigens gerichteten monoclonalen Antikörpers zur Herstellung eines Arzneimittels zur bildlichen Darstellung von Prostatakrebs in menschlichen Patienten bereit, wobei der monoclonale Antikörper in der Lage ist, an die Zelloberfläche der Prostatakrebszelle zu binden und mit einem bildgebenden Mittel markiert ist, unter Bedingungen, welche die Bildung eines Komplexes zwischen dem monoclonalen Antikörper und dem Prostata-spezifischen Membranantigen an der Zelloberfläche erlauben. Das bildgebende Mittel ist ein Radioisotop wie z.B. ¹¹¹Indium.
Diese Erfindung stellt ferner ein für Prostatakrebs spezifisches bildgebendes Mittel bereit, umfassend den gegen das PSM-Antigen gerichteten Antikörper und ein daran konjugiertes Radioisotop.
Diese Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung bereit, umfassend eine für die bildliche Darstellung wirksame Menge des gegen das PSM-Antigen gerichteten Antikörpers und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Die Methoden, um wirksame bildgebende Mengen zu bestimmen, sind einem Fachmann wohlbekannt. Eine Methode besteht in einer Titration, wobei verschiedene Mengen des Antikörpers eingesetzt werden.
Diese Erfindung stellt ferner einen Immunoassay zur Messung der Menge des Prostata-spezifischen Membranantigens in einer biologischen Probe bereit, umfassend die Schritte a) Inkontaktbringen der biologischen Probe mit mindestens einem gegen das PSM-Antigen gerichteten Antikörper, um einen Komplex mit dem Antikörper und dem PSM-Antigen zu bilden, und b) Messen der Menge des Prostata-spezifischen Membranantigens in dieser biologischen Probe durch Messen der Menge dieses Komplexes. Ein Beispiel für die biologische Probe ist eine Serumprobe.
Diese Erfindung stellt ein Verfahren bereit, um Prostata-spezifisches Membranantigen eines Säugers aufzureinigen, umfassend die Schritte a) Koppeln des gegen das PSM-Antigen gerichteten Antikörpers an eine feste Matrix; b) Inkubieren des gekoppelten Antikörpers aus a) mit einem Lysat, welches Prostata-spezifisches Membranantigen enthält, unter Bedingungen, unter denen der Antikörper und das Prostata-spezifische Membranantigen binden können; c) Waschen der festen Matrix, um Verunreinigungen zu beseitigen und d) Eluieren des Prostata-spezifischen Membranantigens von dem gekoppelten Antikörper.
Diese Erfindung stellt auch einen transgenen nicht-menschlichen Säuger bereit, welcher das isolierte Nucleinsäuremolekül enthält, das ein Säuger-PSM-Antigen codiert. Diese Erfindung stellt ferner einen transgenen nicht-menschlichen Säuger bereit, dessen Genom Antisense-DNA enthält, welche komplementär zu der ein Prostata-spezifisches Membranantigen eines Säugers codierenden DNA ist, wobei diese Antisense-DNA so platziert ist, dass sie in Antisense-mRNA transkribiert wird, welche komplementär zu der mRNA ist, welche das Prostata-spezifische Membran antigen codiert, und welche an die das Prostata-spezifische Membranantigen codierende mRNA hybridisiert und dadurch dessen Translation vermindert.
Tiermodellsysteme, welche die physiologischen und Verhaltensrollen von Säuger-PSM-Antigen aufklären, können dadurch entwickelt werden, indem man durch eine Vielzahl von Methoden transgene Tiere erzeugt, in denen die Expression des PSM-Antigens entweder erhöht oder vermindert ist, oder in denen die Aminosäuresequenz des exprimierten PSM-Antigens verändert ist. Beispiele die solche Methoden umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: 1) Insertion von normalen oder mutanten Versionen von DNA, die ein Säuger-PSM-Antigen codiert, durch Mikroinjektion, Elektroporation, retrovirale Transfektion oder anderen Fachleuten wohlbekannte Verfahren in geeignete befruchtete, nicht-menschliche Embryonen um ein nicht-menschliches transgenes Tier zu erzeugen (16), oder 2) homologe Rekombination (17) von mutanten oder normalen menschlichen oder tierischen Versionen dieser Gene mit dem nativen Genlokus in transgenen Tieren, um die Regulation der Expression oder die Struktur dieser PSM-Antigen-Sequenzen zu verändern. Das Verfahren der homologen Rekombination ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Es ersetzt das native Gen durch das eingefügte Gen und ist so nützlich, um ein Tier zu erzeugen, welches kein natives PSM-Antigen exprimieren kann, aber zum Beispiel ein eingefügtes mutantes PSM-Antigen exprimiert, welches das native PSM-Antigen in dem Genom des Tieres durch Rekombination ersetzt hat, was zu einer Unterexpression des Transporters führt. Mikroinjektion fügt Gene zu dem Genom hinzu, aber entfernt diese nicht, und ist somit nützlich, um ein Tier zu erzeugen, welches sein eigenes und hinzugefügte PSM-Antigene exprimiert, was zu einer Überexpression der PSM-Antigens führt.
Ein verfügbares Mittel zur Erzeugung eines nicht-menschlichen transgenen Tieres mit einer Maus als Beispiel funktioniert wie folgt: Weibliche Mäuse werden gepaart und die so erhaltenen befruchteten Eier werden aus deren Eileitern herausgeschnitten. Die Eier werden in einem geeigneten Medium wie z.B. MMP-2-Medium (16) gelagert. DNA oder cDNA, welche ein Säuger-PSM-Antigen codiert, wird von einem Vektor durch auf dem Fachgebiet wohlbekannte Methoden aufgereinigt. Induzierbare Promotoren können mit der codierenden Region der DNA fusioniert werden, um ein experimentelles Hilfsmittel bereitzustellen, um die Expression des Transgens zu regulieren. Alternativ oder zusätzlich können Gewebe-spezifische regulatorische Elemente mit der codierenden Region fusioniert werden, um eine Gewebe-spezifische Expression des Transgens zu erlauben. Die DNA wird in einer zweckdienlich gepufferten Lösung in eine Mikroinjektionsnadel gegeben (welche mit Hilfe eines Pipettenziehgeräts aus Kapillarröhren hergestellt werden kann), und das zu injizierende Ei wird in einen Hohlschliffobjektträger gelegt. Die Nadel wird in den Pronucleus des Eis eingeführt und die DNA-Lösung wird injiziert. Das injizierte Ei wird dann in den Eileiter einer scheinträchtigen Maus überführt (eine Maus, die durch geeignete Hormone dazu stimuliert wird, einen Trächtigkeitszustand aufrechtzuerhalten, aber die nicht wirklich trächtig ist), wo es sich weiter zum Uterus bewegt, sich einnistet und bis zur Geburt entwickelt. Wie vorstehend erwähnt ist Mikroinjektion nicht die einzige Methode, um DNA in die Eizelle einzufügen und wird hier nur zu dem Zweck verwendet, ein Beispiel zu geben.
Eine andere Verwendung der Sequenz des PSM-Antigens besteht darin, ein homologes Gen oder homologe Gene in verschiedenen Säugern zu isolieren. Das Gen oder die Gene können durch Durchmustern von entweder cDNA- oder genomischen Banken von verschiedenen Säugern mit niedriger Stringenz isoliert werden, indem Sonden von der PSM-Antigen-Sequenz eingesetzt werden. Die identifizierten positiven Clone werden weiter durch DNA-Sequenzierungstechniken untersucht werden, welche einem normalen Fachmann wohlbekannt sind. Zum Beispiel die Entdeckung von Mitgliedern der Proteinserinkinase-Familie durch Untersuchung auf Homologie (18).
Diese Erfindung stellt eine Verwendung eines DNA-Moleküls, welches ein Prostata-spezifisches Membranantigen codiert, das funktionell mit einem 5'-regulatorischen Element verknüpft ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Unterdrückung oder zur Modulierung der Metastasierungsfähigkeit von Prostatakrebszellen, von Wachstum von Prostatatumoren oder zur Beseitigung von Prostatatumorzellen bereit, wobei das Arzneimittel auf eine Weise in die Zellen eingeführt wird, dass die Expression des Prostata-spezifischen Membranantigens sich unter der Kontrolle des regulatorischen Elements befindet, wodurch die Metastasierungsfähigkeit von Prostatakrebszellen, das Wachstum von Prostatatumoren oder die Beseitigung von Prostatatumorzellen unterdrückt oder moduliert wird. Bei dem Subjekt kann es sich um einen Säuger oder spezifischer um einen Menschen handeln.
In einer Ausführungsform bildet das DNA-Molekül, welches ein Prostata-spezifisches Membranantigen codiert, das funktionell mit einem 5'-regulatorischen Element verknüpft ist, einen Teil eines Transfervektors, welcher in die Zelle oder in den Organismus eingefügt wird. Außerdem verfügt der Vektor über die Fähigkeit zur Replikation und zur Expression des Prostata-spezifischen Membranantigens. Das DNA-Molekül, welches Prostata-spezifisches Membranantigen codiert, kann in das Genom einer eukaryontischen oder prokaryontischen Zelle oder in eine Wirtszelle integriert werden, welche ein Prostata-spezifisches Membranantigen enthält und/oder exprimiert.
Des Weiteren kann das Prostata-spezifisches Membranantigen codierende DNA-Molekül durch ein bakterielles, virales, Pilz-, Tier- oder liposomales Transportvehikel eingeführt werden. Andere Mittel sind ebenfalls verfügbar und einem Fachmann mit durchschnittlichen Kenntnissen bekannt.
Des Weiteren kann das Prostata-spezifisches Membranantigen codierende DNA-Molekül mit einem Promotor oder Enhancer funktionell verknüpft werden. Es ist eine Anzahl von viralen Vektoren beschrieben worden, einschließlich jener, die aus verschiedenen Promotoren oder anderen regulatorischen Elementen erzeugt worden sind, die von Virusquellen abgeleitet sind. Promotoren bestehen aus kurzen Anordnungen von Nucleinsäuresequenzen, die spezifisch mit zellulären Proteinen interagieren, die an der Transkription beteiligt sind. Die Kombination verschiedener Erkennnungssequenzen und der zellulären Konzentration der dazugehörigen Transkriptionsfaktoren bestimmt die Effizienz, mit der ein Gen in einem bestimmten Zelltyp transkribiert wird.
Beispiele für geeignete Promotoren schließen einen viralen Promotor ein. Zu viralen Promotoren gehören: Adenovirus-Promotor, ein Simianvirus 40 (SV 40)-Promotor, ein Cytomegalievirus (CMV)-Promotor, ein Maus-Mammatumorvirus (MMTV)- Promotor, ein Moloney-Mausleukämievirus-Promotor, ein Maussarkomvirus-Promotor und ein Rous-Sarkomvirus-Promotor.
Des Weiteren ist ein anderer geeigneter Promotor ein Hitzeschockpromotor. Außerdem ist ein Bakteriophagenpromotor ein geeigneter Promotor. Beispiele für geeignete Bakteriophagenpromotoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf einen T7-Promotor, einen T3-Promotor, einen SP6-Promotor, einen Lambda-Promotor, einen Baculovirus-Promotor.
Ebenfalls als ein Promotor geeignet ist ein Tierzellenpromotor wie z.B. ein Interferon-Promotor, ein Metallothionein-Promotor, ein Immunoglobulin-Promotor. Ein Pilz-Promotor ist ebenfalls ein geeigneter Promotor. Beispiele für Pilz-Promotoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf einen ADC1-Promotor, einen ARG-Promotor, einen ADH-Promotor, einen CYC1-Promotor, einen CUP-Promotor, einen ENO1-Promotor, einen GAL-Promotor, einen PHO-Promotor, einen PGK-Promotor, einen GAPDH-Promotor, einen Paarungstypfaktor („Mating type factor")-Promotor. Des Weiteren sind Pflanzenzellenpromotoren und Insektenzellenpromotoren ebenfalls für die hierin beschriebenen Verfahren geeignet.
Diese Erfindung stellt die Verwendung eines DNA-Moleküls bereit, welches ein funktionell mit einem 5'-regulatorischen Element verknüpftes Prostata-spezifisches Membranantigen codiert, gekoppelt mit einer therapeutischen DNA zur Herstellung eines Arzneimittels zur Unterdrückung oder zur Modulierung der Metastasierungsfähigkeit von Prostatatumorzellen, des Wachstums von Prostatatumoren oder der Beseitigung von Prostatatumorzellen, wobei das Arzneimittel in eine Tumorzelle eines Subjekts eingeführt wird, wodurch die Metastasierungsfähigkeit von Prostatatumorzellen, das Wachstum von Prostatatumoren oder die Beseitigung von Prostatatumorzellen unterdrückt oder moduliert wird. Bei dem Subjekt kann es sich um einen Säuger oder spezifischer um einen Menschen handeln.
Des Weiteren kann die therapeutische DNA, welche an das DNA-Molekül gekoppelt ist, das ein Prostata-spezifisches Membranantigen codiert, das funktionell mit einem 5'-regulatorischen Element in einer Tumorzelle verknüpft ist, ein Cytokin, ein virales Antigen oder ein die Vorstufe eines Arzneimittels aktivierendes Enzym codieren. Andere Mittel sind ebenfalls verfügbar und einem Fachmann mit durchschnittlichen Kenntnissen bekannt.
Bei dem verwendeten Cytokin kann es sich um Interleukin-3, Interleukin-12, Interferon alpha, beta oder gamma, Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden-Faktor oder um andere Immunfaktoren handeln.
Außerdem stellt diese Erfindung eine Prostatakrebszelle bereit, welche ein von einer Säugernucleinsäure isoliertes DNA-Molekül enthält, welches ein Prostata-spezifisches Membranantigen eines Säugers unter der Kontrolle eines mit einem 5'-regulatorischen Element verknüpften Prostata-spezifischen Membranantigens codiert.
Wie hierin verwendet schließen DNA-Moleküle komplementäre DNA (cDNA), synthetische DNA und genomische DNA ein.
Diese Erfindung stellt einen therapeutischen Impfstoff bereit, um menschlichem Prostatatumorwachstum oder Stimulierung von Prostatatumorzellen in einem Subjekt vorzubeugen. Dieser therapeutische Impfstoff und ein pharmazeutisch verträglicher Träger können in einer wirksamen Menge der Prostatazelle verabreicht werden, wodurch dem Tumorwachstum oder der Stimulierung von Tumorzellen in dem Subjekt vorgebeugt wird. Andere Mittel sind ebenfalls verfügbar und einem Fachmann mit durchschnittlichen Kenntnissen bekannt.
Diese Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis von hämatogenen mikrometastatischen Tumorzellen eines Individuums bereit, umfassend (A) Ausführen einer verschachtelten Polymerasekettenreaktion (PCR) von Blut-, Knochenmark- oder Lymphknotenproben des Individuums, wobei die Primer des Prostata-spezifischen Membranantigen eingesetzt werden, und (B) Überprüfen der Mikrometastasen durch DNA-Sequenzierung und Southern-Analyse, wodurch hämatogene mikrometastatische Tumorzellen des Subjekts nachgewiesen werden. Bei dem Subjekt kann es sich um einen Säuger oder spezifischer um einen Menschen handeln.
Bei der mikrometastatischen Tumorzelle kann es sich um einen Prostatakrebs handeln und die DNA-Primer können von Prostata-spezifischem Antigen abgeleitet sein. Des Weiteren kann dem Individuum gleichzeitig eine wirksame Menge an Hormonen verabreicht werden, so dass die Expression des Prostata-spezifischen Membranantigens erhöht wird.
Diese Erfindung stellt die Verwendung eines DNA-Moleküls, welches ein mit einem 5'-regulatorischen Element verknüpftes Prostata-spezifisches Membranantigen codiert, für die Herstellung eines Arzneimittels bereit, um die auf Transferrin zurückzuführende mitogene Antwort aufzuheben, wobei das Arzneimittel in eine Tumorzelle eingeführt wird, deren Genexpression direkt mit einer bestimmten pathologischen Wirkung innerhalb eines vielzelligen Organismus assoziiert ist, wodurch die auf Transferrin zurückzuführende Mitogenantwort aufgehoben wird. Bei der Tumorzelle kann es sich um eine Prostatazelle handeln.
Experimentelle Details
Erste Serie von Experimenten
Material und Methoden
Der Ansatz zur Clonierung der Gene beinhaltete eine Aufreinigung des Antigens in großen Mengen durch Immunpräzipitation und Mikrosequenzierung mehrerer interner Peptide zur Verwendung beim Synthetisieren von degenerierten Oligonucleotid-Primern für die anschließende Polymerasekettenreaktion (19, 20). Eine partielle cDNA wurde als ein PCR-Produkt amplifiziert und dieses wurde als homologe Sonde eingesetzt, um das Volllänge-cDNA-Molekül aus einer cDNA-Plasmid-Bank der LNCaP (Lymphknotencarcinom der Prostata)-Zelllinie zu clonieren (8). Anfängliche Experimente zeigten uns, dass der Antikörper CYT-356 (9) nicht in der Lage war, das in Bakterien erzeugte Antigen nachzuweisen, da es sich bei dem Epitop um den glycosylierten Teil des PSM-Antigens handelte, und dies machte unseren schwierigeren, jedoch sorgfältig ausgearbeiteten Ansatz erforderlich.
Western-Analyse des PSM-Antigens
Membranproteine wurden aus Zellen durch hypotone Lyse isoliert, gefolgt von Zentrifugation über einen Sucrosedichtegradienten (21). 10-20 μg von LNCaP-, DU-145- und PC-3-Membranproteinen wurden durch ein 10% SDS-PAGE Trenngel mit einem 4% Sammelgel bei 9-10 Milliampere für 16-18 Stunden elektrophoretisch aufgetrennt. Die Proteine wurden mittels Elektroblotting in Transferpuffer (48 mM Tris-Base, 39 mM Glycin, 20% Methanol) bei 25 V und 4° C über Nacht auf PVDF-Membranen (Millipore^® Corp.) übertragen. Die Membranen wurden in TSB (0,15 M NaCl, 0,01 M Tris-Base, 5% BSA) für 30 Minuten bei Raumtemperatur blockiert, gefolgt von einer Inkubation für 2 Stunden mit 10-15 μg/ml des monoclonalen Antikörpers CYT-356 (Cytogen Corp.). Die Membranen wurden dann für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 10-15 μg/ml Kaninchen-Anti-Maus-Immunoglobulin (Accurate Scientific) inkubiert, gefolgt von einer Inkubation bei Raumtemperatur mit ¹²⁵I-Protein A (Amersham^®) bei 1 × 10⁶ cpm/ml. Die Membranen wurden dann gewaschen und für 12-24 Stunden bei –70° C autoradiographiert (1).
Immunhistochemische Analyse der Expression des PSM-Antigens
Die Avidin-Biotin-Methode für den immunhistochemischen Nachweis wurde eingesetzt, um sowohl menschliche Gewebeschnitte als auch Zelllinien auf die Expression von PSM-Antigen hin zu untersuchen (22). Cryostat-geschnittene Prostata-Gewebeschnitte (4-6 μm dick) wurden für 10 Minuten in Methanol/Aceton fixiert. „Cytospins" der Zellen wurden auf Glas-Objektträgern durchgeführt, wobei 50.000 Zellen/100 μl/Objektträger eingesetzt wurden. Die Proben wurden für 10-15 Minuten mit 1 % Wasserstoffperoxid in PBS behandelt, um jegliche endogene Peroxidase-Aktivität zu entfernen. Die Gewebeschnitte wurden mehrere Male in PBS gewaschen und dann mit dem geeigneten Suppressor-Serum für 20 Minuten inkubiert. Das Suppressor-Serum ließ man abfließen und die Schnitte oder Zellen wurden dann für 1 Stunde mit dem verdünnten monoclonalen Antikörper CYT-356 inkubiert. Die Proben wurden dann mit PBS gewaschen und nacheinander mit den Sekundärantikörpern (Pferd- oder Ziegen-Immunoglobuline, 1:200 Verdünnung für 30 Minuten) und mit den Avidin-Biotin-Komplexen (1:25 Verdünnung für 30 Minuten) inkubiert. DAB wurde als Chromogen eingesetzt, gefolgt von einer Hämatoxylin-Gegenfärbung und Einspannen. Gefrierschnitte von Prostataproben und „Cytospin"-Duplikate wurden für jedes Experiment als Kontrollen eingesetzt. Als positive Kontrolle wurde der monoclonale Anti-Cytokeratin-Antikörper CAM 5.2 eingesetzt, wobei man demselben Protokoll wie vorstehend beschrieben folgte. Wir betrachten Gewebeschnitte als PSM-Antigen exprimierend, wenn wenigsten 5% der Zellen Immunreaktivität zeigen. Unser Bewertungssystem ist wie folgt: 1 = < 5%; 2 = 5-19%; 3 = 20-75%; und 4 = > 75% positive Zellen. Homogenität im Gegensatz zu Heterogenität wurde berücksichtigt, indem positive und negative Zellen in 3-5 lichtmikroskopischen Feldern bei hoher Vergrößerung (400×) ausgewertet wurden, wobei der Prozentsatz an positiven Zellen unter 100-500 Zellen erfasst wurde. Die Intensität der Immunfärbung ist auf einer 1+ bis 4+-Skala abgestuft, wobei 1+ eine leichte, 2-3+ eine mittlere und 4+ eine starke Immunfärbung im Vergleich zu den positiven Kontrollen darstellt.
Immunpräzipitation des PSM-Antigens
80% konfluente LNCaP-Zellen in 100 mm-Petrischalen ließ man in RPMI-Medien ohne Methionin für 2 Stunden hungern, wonach ³⁵S-Methionin in einer Konzentration von 100 μCi/ml hinzugefügt wurde und man die Zellen für weitere 16-18 Stunden wachsen ließ. Die Zellen wurden dann gewaschen und durch Zugabe von 1 ml Lysispuffer (1 % Triton X-100, 50 mM HEPES pH 7,5, 10% Glycerin, 150 mM MgCl₂, 1 mM PMSF, und 1 mM EGTA) mit einer Inkubation für 20 Minuten bei 4° C lysiert. Die Zelllysate wurden dann mit Protein A Sepharose^® CL-4B-Kügelchen (Pharmacia^®) gemischt, an die zuvor für 3-4 Stunden bei 4° C der Antikörper CYT-356 (Cytogen Corp.) und der RAM-Antikörper (Accurate Scientific) gebunden worden waren. Es wurden 12 μg Antikörper pro 3 mg Kügelchen pro Petrischale eingesetzt. Die Kügelchen wurden dann mit HNTG-Puffer (20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 10% Glycerin und 2 mM Natriumorthovanadat) gewaschen, in β-Mercaptoethanol enthaltendem Probenladepuffer resuspendiert, bei 95° C für 5-10 Minuten denaturiert und auf einem 10% SDS-PAGE-Gel mit einem 4% Sammelgel bei 10 Milliampere über Nacht laufen gelassen. Die Gele wurden mit Coomassie-Blau angefärbt, mit Essigsäure/Methanol entfärbt und in einem Vakuumtrockner bei 60° C heruntergetrocknet. Die Gele wurden dann für 16-24 Stunden bei –70° C autoradiographiert (2A-D).
Immunpräzipitation in großem Maßstab und Peptidsequenzierung
Die vorstehend beschriebene Prozedur für die Immunpräzipitation wurde mit 8 konfluenten Petrischalen wiederholt, die ungefähr 6 × 10⁷ LNCaP-Zellen enthielten. Das Immunpräzipitationsprodukt wurde vereinigt und auf zwei Spuren eines 10% SDS-PAGE-Gels geladen und bei 9-10 Milliampere für 16 Stunden elektrophoretisch aufgetrennt. Die Proteine wurden mittels Elektroblotting für 2 Stunden bei 75 Volt und 4° C in Transferpuffer auf Nitrocellulose BA-85-Membranen (Schleicher und Schuell^®) übertragen. Die Membranen wurden mit Ponceau-Rot gefärbt, um die Proteine sichtbar zu machen, und die 100 kD große Proteinbande wurde ausgeschnitten, gelöst und proteolytisch mit Trypsin verdaut. Es wurde dann eine HPLC der verdauten Probe auf einem Applied Biosystems Modell 171 C durchgeführt und klare dominante Peptid-Peaks wurden ausgewählt und mit dem modifizierten Edman-Abbau auf einem modifizierten Nachflüssigphasen-Applied Biosystems Modell 477A Protein/Peptid-Mikrosequenziergerät (23) sequenziert. Sequenzierungsdaten von allen Peptiden sind in diesem Dokument eingeschlossen. Wir versuchten, den Aminoterminus des PSM-Antigens mit einer ähnlichen Methode zu sequenzieren, welche das Aufreinigen des Antigens durch Immunpräzipitation und Transfer mittels Elektroblotting auf eine PVDF-Membran (Millipore^®) beinhaltete. Das Protein wurde auf einem Applied Biosystems Modell 477A Protein/Peptid-Mikrosequenziergerät untersucht und man stellte fest, dass der Aminoterminus blockiert war, und daher konnten mit dieser Methode keine Sequenzdaten erhalten werden.
Peptidsequenzen des PSM-Antigens:

2T17 #5 S L Y E S (W) T K (SEQ ID NO: 3)
2T22 #9 (S) Y P D G X N L P G G (g) V Q R (SEQ ID NO:4)
2T26 #3 F Y D P M F K (SEQ ID NO: 5)
2T27 #4 I Y N V I G T L (K) (SEQ ID NO:6)
2T34 #6 F L Y X X T Q I P H L A G T E Q N F Q L A K (SEQ ID NO: 7)
2T35 #2 G/P V I L Y S D P A D Y F A P D/G V K (SEQ ID NO: 8,9)
2T38 #1 A F I D P L G L P D R P F Y R (SEQ ID NO: 10)
2T46 #8 Y A G E S F P G I Y D A L F D I E S K (SEQ ID NO: 11)
2T47 #7 T I L F A S (W) D A E E F G X X (q) S T E (e) A (E)... (SEQ ID NO: 12) Anmerkungen: X bedeutet, dass an dieser Position kein Rest identifiziert werden konnte. Großbuchstaben zeigen eine Identifizierung an, jedoch mit einem geringeren Konfidenzgrad. (Kleinbuchstaben) bedeuten, dass ein Rest vorhanden ist, jedoch in sehr kleinen Mengen. ... zeigt an, dass die Sequenz weitergeht, aber unter die Nachweisgrenze gefallen ist.

Es wurde nach einer vollständigen Homologiesuche des translatierten Genbank-Computerdatenbestands bestätigt, dass alle diese Peptidsequenzen einzigartig sind.
Degenerierte PCR
5'-unphosphorylierte degenerierte Sense- und Antisense-Oligonucleotid-Primer von 17 bis 20 Nucleotiden Länge, die Teilen der vorstehenden Peptide entsprachen, wurden auf einem Applied Biosystems Modell 394A DNA-Synthetisiergerät synthetisiert. Die verwendeten Primer sind nachstehend gezeigt. Die unterstrichenen Aminosäuren in den Peptiden stellen die Reste dar, die bei der Konstruktion der Primer verwendet wurden.
Peptid 3: F Y D P M F K (SEQ ID NO: 5)

PSM-Primer „A": T T (C oder T) - T A (C oder T) - G A (C oder T) - C C X - A T G - T T (SEQ ID NO: 13) PSM-Primer „B": A A C - A T X - G G (A oder G) - T C (A oder G) - T A (A oder G) - A A (SEQ ID NO: 14) Primer A ist der Sense-Primer und Primer B ist der Antisense-Primer. Die Degeneriertheit ist 32-fach.

Peptid 4: I Y N V I G T L (K) (SEQ ID NO: 6)

PSM-Primer „C": A T (T oder C oder A) - T A (T oder C) - A A (T oder C) - G T X - A T (T oder C oder A) - G G (SEQ ID NO: 15) PSM-Primer „D": C C (A oder T oder G) - A T X - A C (G oder A) - T T (A oder G) - T A (A oder G oder T) - A T (SEQ ID NO: 16) Primer C ist der Sense-Primer und Primer D ist der Antisense-Primer. Die Degeneriertheit ist 144-fach.

Peptid 2: G/P V I L Y S D P A D Y F A P D/G V K (SEQ ID NO: 8,9)

PSM-Primer „E": C C X - G C X - G A (T oder C) - T A (T oder C) - T T (T oder C) - G C (SEQ ID NO: 17) PSM-Primer „F": G C (G oder A) - A A (A oder G) - T A (A oder G) T X C - G C X - G G (SEQ ID NO: 18) Primer E ist der Sense-Primer und Primer F ist der Antisense-Primer. Die Degeneriertheit ist 128-fach.

Peptid 6: F L Y X X T Q I P H L A G T E Q N F Q L A K (SEQ ID NO: 7)

PSM-Primer „I": A C X - G A (A oder G) - C A (A oder G) - A A (T oder C) - T T (T oder C) - C A (A oder G) - C T (SEQ ID NO: 19) PSM-Primer „J": A G - (T oder C) T G - (A oder G) A A - (A oder G) T T - (T oder C) T G (T oder C) T C - X G T (SEQ ID NO: 20) PSM-Primer „K": G A (A oder G) - C A (A oder G) - A A (T oder C) - T T (T oder C) C A (A oder G) - C T (SEQ ID NO: 21) PSM-Primer „L": A G - (T oder C) T G - (A oder G) A A - (A oder G) T T - (T oder C) T G - (T oder C) T C (SEQ ID NO: 22) Primer I und K sind die Sense-Primer und Primer J und L sind die Antisense-Primer. Die Degeneriertheit von I und J ist 128-fach, die von K und L ist 32-fach.

Peptid 7: T I L F A S (W) D A E E F G X X (q) S T E (e) A (E) ... (SEQ ID NO:12)

PSM-Primer „M": T G G - G A (T oder C) - G C X - G A (A oder G) - G A (A oder G) - T T (C oder T) - G G (SEQ ID NO: 23) PSM-Primer „N": C C - (G oder A) A A - (T oder C) T C - (T oder C) T C - X G C - (A oder G) T C - C C A (SEQ ID NO: 24) PSM-Primer „O": T G G - G A (T oder C) - G C X - G A (A oder G) - G A (A oder G) – T T (SEQ ID NO: 25) PSM-Primer „P": A A - (T oder C) T C - (T oder C) T C - X G C - (A oder G) T C - C C A (SEQ ID NO: 26) Primer M und O sind die Sense-Primer und Primer N und P sind die Antisense-Primer. Die Degeneriertheit von M und N ist 64-fach, die von O und P ist 32-fach.

Die degenerierte PCR wurde unter Verwendung eines Perkin-Elmer Modell 480 DNA-PCR-Geräts durchgeführt. Die cDNA-Matrize für die PCR wurde aus LNCaP-Zellen präpariert, die mit Standardmethoden der Oligo-dT-Chromatographie (Collaborative Research) isoliert worden waren. Die cDNA-Synthese wurde wie folgt durchgeführt:

4,5 μl LNCaP poly A+-RNA (2 μg)

1,0 μl Oligo dT-Primer

4,5 μl dH₂O

10 μl

Inkubieren Sie bei 68° C für 10 Minuten.
Kühlen Sie schnell auf Eis für 5 Minuten.

Fügen Sie hinzu:

4 μl 5 × RT-Puffer

2 μl 0,1 mM DTT

1 μl 10 mM dNTPs

0,5 μl RNasin (Promega)

1,5 μl dH₂O

19 μl

Inkubieren Sie für 2 Minuten bei 37° C.
Fügen Sie 1 μl Superscript^® Reverse Transkriptase (Gibco^®-BRL) hinzu.
Inkubieren Sie für 1 Stunde bei 37° C.

Fügen Sie 30 μl dH₂O hinzu.
Setzen Sie 2 μl pro PCR-Reaktion ein.

Degenerierte PCR-Reaktionen wurden optimiert, indem die Anlagerungstemperaturen, Mg⁺⁺-Konzentrationen, Primerkonzentrationen, Pufferzusammensetzung, Verlängerungszeiten und die Anzahl der Zyklen variiert wurden. Unser optimales PCR-Profil war: Denaturierung bei 94° C für 30 Sekunden, Anlagerung bei 45-55° C für 1 Minute (abhängig von der mittleren T_m der eingesetzten Primer) und Verlängerung bei 72° C für 2 Minuten.

5 μl	10 × PCR-Puffer*
5 μl	2,5 mM dNTP-Gemisch
5 μl	Primergemisch (enthaltend jeweils 0,5-1,0 μg Sense- und Antisense-Primer)
5 μl	100 mM β-Mercaptoethanol
2 μl	LNCaP-cDNA-Matrize
5 μl	25 mM MgCl₂ (2,5 mM Endkonzentration)
21 μl	dH₂O
2 μl	verdünnte Taq-Polymerase (0,5 U/μl)
50 μl	Gesamtvolumen

Die Röhrchen wurden mit 60 μl leichtem Mineralöl überschichtet und für 30 Zyklen amplifiziert. PCR-Produkte wurden untersucht, indem 5 μl von jeder Probe auf einem 2-3% Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt wurden, gefolgt von Färben mit Ethidiumbromid und Photographie.
*10 × PCR-Puffer

166 mM NH₄SO₄
670 mM Tris, pH 8,8
2 mg/ml BSA

Repräsentative Photographien, die PCR-Produkte zeigen, sind in 5 gezeigt.
Clonierung der PCR-Produkte
Um diese PCR-Produkte weiter zu analysieren, wurden diese Produkte in einen geeigneten Plasmidvektor cloniert, wobei „TA Cloning" (Invitrogen^® Corp.) eingesetzt wurde. Die hier verwendete Clonierungsstrategie besteht darin, PCR-Produkte direkt in einen Plasmidvektor zu ligieren, der überhängende T-Reste an der Insertionsstelle besitzt, wobei man die Tatsache ausnutzt, dass Taq-Polymerase überhängende A- Reste an den Enden der PCR-Produkte hinterlässt. Die Ligierungsgemische werden in kompetente E. coli- Zellen transformiert und die so erhaltenen Kolonien lässt man wachsen, Plasmid-DNA wird mit der Methode der alkalischen Lyse (24) isoliert und wird durch Restriktionsanalyse durchmustert (6A-B).
DNA-Sequenzierung der PCR-Produkte
TA-Clone der PCR-Produkte wurden dann mit der Didesoxymethode (25) unter Verwendung von Sequenaze (U.S. Biochemical) sequenziert. 3-4 μg von jeder Plasmid-DNA wurde mit NaOH denaturiert und Ethanol-präzipitiert. Markierungsreaktionen wurden gemäß den Vorschriften der Hersteller mit ³⁵S-ATP durchgeführt und die Reaktionen wurden gemäß demselben Protokoll gestoppt. Sequenzierungsprodukte wurden dann auf 6% Polyacrylamid/7M Harnstoff-Gelen mit Hilfe eines IBI-Sequenziergeräts untersucht. Man ließ die Gele bei 120 Watt für 2 Stunden laufen. Nach der Elektrophorese wurden die Gele für 15-20 Minuten in 10% Methanol/10% Essigsäure fixiert, auf Whatman 3MM-Papier transferiert und in einem Biorad^® Vakuumtrockner bei 80° C für 2 Stunden getrocknet. Die Gele wurden dann bei Raumtemperatur für 16-24 Stunden autoradiographiert. Um zu bestimmen, ob es sich bei den PCR-Produkten um die richtigen Clone handelte, untersuchten wir die Sequenzen, welche an den 5'- und 3'-Enden der Moleküle erhalten worden waren, indem wir nach den korrekten Primersequenzen suchten ebenso wie nach angrenzenden Sequenzen, die Teilen der Peptide entsprachen, welche nicht bei der Konstruktion der Primer verwendet worden waren.
Es wurde bestätigt, dass IN-20 korrekt war und eine partielle cDNA für das PSM-Gen darstellte. In dieser PCR-Reaktion wurden die Primer I und N eingesetzt. Die DNA-Sequenz, welche wir erhielten, wenn wir von dem Primer I aus lasen, war:
Bei den unterstrichenen Aminosäuren handelte es sich um den Teil von Peptid 6, welcher verwendet worden war, um diesen Sense-Primer zu konstruieren, und die restlichen Aminosäuren, welche mit jenen übereinstimmen, die innerhalb unseres Peptids vorhanden sind, bestätigen, dass dieses Ende des Moleküls das korrekte Protein (PSM-Antigen) darstellt.
Als wir dann das andere Ende des Moleküls untersuchten, indem wir von dem Primer N aus lasen, war die Sequenz:

CTC TTC GGC ATC CCA GCT TGC AAA CAA AAT TGT TCT (SEQ ID NO: 32)
Da dies die Antisense-DNA-Sequenz darstellt, müssen wir die komplementäre Sense-Sequenz zeigen, um unser Peptid zu finden.
Sense-Sequenz:
Die unterstrichenen Aminosäuren stellen hier den Teil von Peptid 7 dar, welcher verwendet worden war, um den Primer N zu konstruieren. Alle der Aminosäuren stromaufwärts von diesem Primer sind in dem Clon IN-20 korrekt, in Übereinstimmung mit den in Peptid 7 gefundenen Aminosäuren. Weitere DNA-Sequenzierung hat es uns ermöglicht, das Vorhandensein unserer anderen PSM-Peptide innerhalb der DNA-Sequenz unseres positiven Clons zu ermitteln.
Es wurde festgestellt, dass diese partielle cDNA-Sequenz einzigartig ist, wenn man den Genbank-Computer-Datenbestand durchmustert.
Konstruktion der cDNA-Bank und Clonierung der Volllänge-PSM-cDNA
Eine cDNA-Bank aus LNCaP-mRNA wurde unter Verwendung des Superscript^® Plasmid-Systems (BRL^®-Gibco) konstruiert. Die Bank wurde transformiert, wobei kompetente DH5-α-Zellen verwendet wurden, und auf 100 mm Platten ausplattiert, welche LB plus 100 μg/ml Carbeniciillin enthielten. Man ließ die Platten über Nacht bei 37° C wachsen und die Kolonien wurden auf Nitrocellulose-Filter transferiert. Die Filter wurden wie nach Grunstein und Hogness (26) bearbeitet und durchmustert, wobei unsere 1,1 kb große homologe partielle cDNA-Sonde eingesetzt wurde, die mit ³²P-dCTP durch „Random Priming" (27) radioaktiv markiert war. Wir erhielten acht positive Kolonien, von denen sich nach DNA-Restriktion und Sequenzanalyse herausstellte, dass sie Volllänge-cDNA-Moleküle darstellten, die das PSM-Antigen codierten. In 7 ist ein Autoradiogramm gezeigt, welches die Größe der cDNA-Moleküle zeigt, die in unserer Bank repräsentiert sind, und in 8 ist eine Restriktionsanalyse von mehreren Volllänge-Clonen gezeigt. 9 ist eine Plasmid-Southern-Analyse der Proben in 8, die zeigt, dass sie alle an die 1,1 kb große partielle cDNA-Sonde hybridisieren.
Der Genbank-Computer-Datenbestand ist sowohl nach der cDNA als auch nach dem Antigen durchmustert worden, und es wurde festgestellt, dass diese einzigartig sind.
Northern-Analyse der PSM-Genexpression
Eine Northern-Analyse (28) des PSM-Gens hat zu Tage gebracht, dass die Expression auf die Prostata und auf Prostatacarcinome beschränkt ist.
RNA-Proben (entweder 10 μg Gesamt-RNA oder 2 μg poly A+-RNA) wurden denaturiert und auf 1,1 % Agarose/Formaldehyd-Gelen bei 60 Milliampere für 6-8 Stunden elektrophoretisch aufgetrennt. Die RNA wurde dann mittels Druckblotting in 10 × SSC mit einem Positive-Blotter (Stratagene^®) auf Nytran^®-Nylonmembranen (Schleicher und Schuell^®) transferiert. Die RNA wurde mit Hilfe eines Stratalinkers (Stratagene^®) mit den Membranen vernetzt und anschließend in einem Vakuumofen für 2 Stunden bei 65° C gebacken. Die Blots wurden für 2 Stunden bei 65° C in Prähybridisierungslösung (BRL^®) prähybridisiert und anschließend für 16 Stunden in Hybridisierungspuffer (BRL^®) hybridisiert, welcher 1-2 × 10⁶ cpm/ml einer ³²P-markierten „random primed" cDNA-Sonde enthielt. Die Membranen wurden bei 42° C zwei Mal in 1 × SSPE/1% SDS und zwei Mal in 0,1 × SSPE/1% SDS gewaschen. Die Membranen wurden dann luftgetrocknet und für 12-36 Stunden bei –70° C autoradiographiert.
PCR-Analyse der PSM-Genexpression in menschlichen Prostatageweben
Eine PCR wurde bei 15 menschlichen Prostataproben durchgeführt um die PSM-Genexpression zu bestimmen. Es wurden jeweils fünf Proben von normalem Prostatagewebe, von gutartiger Prostatahyperplasie und von Prostatakrebs (histologisch bestätigt durch die Pathologieabteilung des MSKCC) eingesetzt.
10 μg Gesamt-RNA von jeder Probe wurden mit Reverse Transkriptase überschrieben, um wie zuvor in Abschnitt IV beschrieben eine cDNA-Matrize herzustellen. Die verwendeten Primer entsprachen den 5'- und 3'-Enden unserer 1,1 kb großen partiellen cDNA IN-20 und daher ist die erwartete Größe der amplifizierten Bande 1,1 kb. Da der T_m unserer Primer 64° C beträgt, lagerten wir diese Primer in unserer PCR bei 60° C an. Wir führten die PCR für 35 Zyklen durch, wobei wir dieselben Bedingungen verwendeten wie zuvor in Abschnitt IV beschrieben.
LNCaP und mit H26-Ras transfizierte LNCaP (29) wurden als eine Positivkontrolle mit eingeschlossen und DU-145 als eine Negativkontrolle. Bei 14/15 Proben war die 1,1 kb große Bande eindeutig amplifiziert, und in diesen wird daher das Gen exprimiert.
Experimentelle Ergebnisse
Das Gen, welches das 100 kD große PSM-Antigen codiert, ist identifiziert worden. Die vollständige cDNA-Sequenz ist in SEQ ID # 1 gezeigt. Unterhalb dieser Nucleinsäuresequenz ist die vorhergesagte translatierte Aminosäuresequenz. Die Gesamtzahl der Aminosäuren ist 750, ID #2. Die Hydrophilie der vorhergesagten Proteinsequenz ist in 16 gezeigt. In 17 sind drei Peptide mit dem höchsten Punkt der Hydrophilie gezeigt. Diese sind: Asp-Glu-Leu-Lys-Ala-Glu (SEQ ID NO: 35); Asn-Glu-Asp-Gly-Asn-Glu (SEQ ID NO: 36); und Lys-Ser-Pro-Asp-Glu-Gly (SEQ ID NO: 37).
Mit Hilfe des Verfahrens von Klein, Kanehisa und DeLisi wurde eine spezifische die Membran umspannende Domäne identifiziert. Die Sequenz erstreckt sich von der Aminosäure #19 bis zur Aminosäure #44: Ala-Gly-Ala-Leu-Val-Leu-Ala-Gly-Gly-Phe-Phe-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Phe (SEQ ID NO: 38).
Diese vorhergesagte Membran umspannende Domäne wurde auf dem PC Gene (ein Computersoftwareprogramm) errechnet. Diese Daten ermöglichen die Vorhersage der inneren und äußeren Membrandomänen des PSM-Antigens, was bei der Konstruktion von Antikörpern für Anwendungen bei der zielgerichteten Therapie und der bildlichen Darstellung von Prostatakrebs.
Als die Sequenz des PSM-Antigens mit anderen bekannten Sequenzen der Gene-Bank verglichen wurde, fand man eine Homologie zwischen der Sequenz des PSM-Antigens und der Sequenz des Transferrin-Rezeptors. Die Daten sind in 18 gezeigt.
Diskussionen der Experimente
Mögliche Anwendungen für das PSM-Antigen
1. Tumornachweis
Mikroskopisch:
Eine eindeutige Tumorbestimmung kann mit Hilfe von Sonden für verschiedene Antigene erreicht werden. Für Prostatakrebs kann sich die PSM-Antigen-Sonde als günstig erweisen. So könnte PSM für diagnostische Zwecke eingesetzt werden und dies könnte auf der mikroskopischen Ebene mittels in situ-Hybridisierung bewerkstelligt werden, indem Sense-(Kontrolle) und Antisense-Sonden verwendet werden, welche von der codierenden Region der von den Anmeldern clonierten cDNA abgeleitet sind. Dies könnte bei der Bewertung von lokaler extraprostatischer Tumorausdehnung, Beteiligung von Lymphknoten, Knochen oder anderer metastatischer Stellen verwendet werden. Da die Knochenmetastasierung ein Hauptproblem bei Prostatakrebs darstellt, ist ein früher Nachweis der metastatischen Ausbreitung erforderlich, insbesondere für die Stadienbestimmung. Bei einigen Tumoren weist ein Nachweis von Tumorzellen im Knochenmark auf eine düstere Prognose hin und legt nahe, dass Interventionen ausprobiert werden sollten, die auf die Metastasierung gerichtet sind. Ein Nachweis der Expression von PSM-Antigen in Knochenmarkaspiraten oder -schnitten kann eine solche frühe Information zur Verfügung stellen. Hierfür kann eine PCR-Amplifikation oder eine in situ-Hybridisierung eingesetzt werden. Dies könnte für jede mögliche metastatische Region entwickelt werden.
2. Identifizierung der antigenischen Stelle
Die Kenntnis der cDNA für das Antigen ermöglicht auch die Identifizierung von Gebieten, die als gute Antigene für die Entwicklung von Antikörpern zum Einsatz gegen spezifische Aminosäuresequenzen des Antigens dienen würden. Solche Sequenzen können in unterschiedlichen Bereichen gelegen sein wie z.B. dem Äußeren, der Membran oder dem Inneren des PSM-Antigens. Die Entwicklung dieser spezifischen Antikörper würde die immunhistochemische Identifizierung des Antigens ermöglichen. Diese abgeleiteten Antikörper könnten dann zur Verwendung entwickelt werden, speziell diejenigen, die in Paraffin-fixierten Schnitten ebenso wie in Gefrierschnitten funktionieren, da diese die größte Verwendbarkeit für die Immundiagnose aufweisen.
3. Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus und genomische DNA
Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLPs) haben sich als nützlich bei der Dokumentierung des Fortschreitens der genetischen Schäden erwiesen, die während der Tumorentstehung und -förderung auftreten. Es kann sein, dass die RFLP-Analyse zeigen wird, dass Veränderungen in der Restriktionskartierung der PSM-Sequenz Indizien für eine Veranlagung bis zum Risiko oder dem malignen Potenzial oder dem Fortschreiten von Prostatakrebs liefern.
Je nach der chromosomalen Lage des PSM-Antigens kann das Gen des PSM-Antigens für die Chromosomanalyse als nützlicher Marker für die chroosomale Lage dienen.
4. Serum
Mit der Entwicklung von Antigen-spezifischen Antikörpern könnten diese, falls das Antigen oder ausgewählte Antigenfragmente im Serum auftauchen, einen Serummarker für das Vorliegen einer metastatischen Erkrankung ermöglichen und könnten einzeln oder in Kombination mit anderen Prostata-spezifischen Markern nützlich sein.
5. Bildliche Darstellung
Da die cDNA-Sequenz impliziert, dass das Antigen die Charakteristika eines Membran umspannenden Proteins aufweist, bei dem der Hauptteil des Proteins auf der Außenseite liegt, können Antikörper, insbesondere monoclonale Antikörper gegen exponierte und Tumor-spezifische Peptidfragmente die Tumorbildgebung von lokalen Ausdehnungen eines metastatischen Tumors oder des Tumorüberrests nach einer Prostatektomie oder einer Bestrahlung ermöglichen. Die Kenntnis der codierenden Region erlaubt die Herstellung von monoclonalen Antikörpern, und diese können in Kombination verwendet werden, um maximale Bildgebungsziele zu ermöglichen. Da das Antigen auf der Grundlage der cDNA-Analyse eine Ähnlichkeit mit dem Transferrin-Rezeptor aufweist (ungefähr 54%), kann es sein, dass es einen spezifischen normalen Liganden für dieses Antigen gibt und dass die Identifizierung dieses(r) Liganden ein anderes Mittel zur bildlichen Darstellung zur Verfügung stellen würde.
6. Isolierung von Liganden
Das PSM-Antigen kann dazu verwendet werden, um den (die) normalen Liganden zu isolieren, welche(r) an dieses bindet(n). Diese(r) Ligand(en) kann je nach Spezifität für die Bildgebung verwendet werden oder deren Serumspiegel können prädiktiv für das Stadium der Krankheit sein. Falls es festgestellt wird, dass es sich bei dem normalen Liganden für PSM um ein Transportmolekül handelt, dann kann es sein, dass PSM dazu verwendet werden könnte, um diesen Liganden zu Therapiezwecken zu binden (wie ein Stoff, der mit Eisen ein Chelat bildet), um zu helfen, den Liganden aus dem Kreislauf zu entfernen. Falls der Ligand das Tumorwachstum oder die Metastasierung fördert, dann würde die Bereitstellung von löslichem PSM-Antigen den Liganden aus der Bindung der Prostata entfernen. Die Kenntnis der Struktur des PSM-Antigens könnte sich zur Herstellung eines kleinen Fragments anbieten, das an den Liganden bindet, was demselben Zweck dienen könnte.
7. Therapeutische Anwendungen

a) Liganden. Die Kenntnis, dass die cDNA-Struktur des PSM-Antigens eine strukturelle Homologie mit dem Transferrin-Rezeptor gemeinsam hat (54% auf der Nucleinsäure-Ebene) impliziert, dass es vielleicht einen endogenen Liganden für den Rezeptor gibt, welcher Transferrin-ähnlich sein kann oder nicht. Man nimmt an, dass Trasferrin ein Ligand ist, der nach der Bindung an den Transferrin-Rezeptor Eisen in die Zelle transportiert. Allerdings wird darüber berichtet, dass Apotransferrin ein Wachstumsfaktor für einige Zellen sei, welche den Transferrin-Rezeptor exprimieren (30). Ob Transferrin ein Ligand für dieses Antigen ist oder ob irgendein anderer Ligand an diesen Liganden bindet, muss noch ermittelt werden. Falls ein Ligand identifiziert wird, kann er einen spezifischen Stoff wie z.B. ein Metallion (Eisen oder Zink oder ein anderes) in den Tumor transportieren und daher als ein Hilfsmittel dienen, toxische Stoffe (eine radioaktive oder cytotoxische Chemikalie, d.h. ein Toxin wie Ricin oder ein cytotoxisches Alkylierungsmittel oder eine cytotoxische Arzneistoffvorstufe) in den Tumor zu transportieren.

Die Hauptstelle der Metastasierung bei Prostatakrebs ist der Knochen. Der Knochen und das Knochenstroma sind reich an Transferrin. Kürzliche Studien legen nahe, dass es diese Mikroumgebung ist, die den richtigen „Boden" für die prostatische Metastasierung im Knochen zur Verfügung stellt (31). Es kann sein, dass dies auch die Anhaftung fördert; diese Faktoren, welche diese Fähigkeit vermindern, können die prostatische Metastasierung in den Knochen und prostatisches metastatisches Wachstum im Knochen verringern.
Man stellte fest, dass der Ligand für das neue Antigen (von dem man annimmt, dass es sich um ein Oncogen und einen Marker für einen malignen Phänotyp bei Brustcarcinomen handelt) dazu diente, um die Differenzierung von Brustkrebszellen zu induzieren und daher eher als ein Behandlungsmittel für die Krankheit dienen könnte als dass es sie fördern würde. Es kann sein, dass eine Bindung des Liganden an die richtige Region des PSM, ob mit natürlichem Liganden oder mit einem Antikörper eine ähnliche Funktion erfüllen könnte.
Antikörper gegen das PSM-Antigen, welche mit einem cytotoxischen Wirkstoff gekoppelt sind, werden nützlich sein, um Prostatakrebszellen zu eliminieren. Transferrinrezeptor-Antikörper mit Toxinkonjugaten sind für eine Reihe von Tumorzellen cytotoxisch, da Tumorzellen dazu tendieren, erhöhte Spiegel von Transferrinrezeptor zu exprimieren (32). Transferrinrezeptoren nehmen Moleküle durch Endocytose in die Zelle auf. Antikörper-Arzneistoff-Kombinationen können toxisch sein. Ein mit Transferrin verknüpftes Toxin kann toxisch sein.

b) Antikörper gegen das PSM-Antigen, welche mit einem cytotoxischen Wirkstoff gekoppelt sind, werden nützlich sein, um Prostatakrebszellen zu eliminieren. Bei dem cytotoxischen Wirkstoff kann es sich um ein Radioisotop oder ein Toxin handeln wie es in normalem Fachwissen bekannt ist. Die Verknüpfung des Antikörpers und des Toxins kann chemisch sein. Beispiele für direkt verknüpfte Toxine sind Doxorubicin, Chlorambucil, Ricin, Pseudomonas-Exotoxin etc., oder es kann ein hybrides Toxin hergestellt werden, zur Hälfte mit Spezifität für PSM und zur anderen Hälfte mit Spezifität für das Toxin. Ein solches bivalentes Molekül kann dazu dienen, an den Tumor zu binden und die andere Hälfte, um ein Zellgift in den Tumor zu transportieren oder an einen cytotoxischen Lymphocyten zu binden und diesen zu aktivieren, wie z.B. eine Bindung an den T₁-T₃-Rezeptorkomplex. Antikörper der erforderlichen Spezifität können auch in T-Zellen cloniert werden und durch Ersetzen der Immunoglobulin-Domäne des T-Zell-Rezeptors (TcR); Einclonieren der gewünschten schweren und leichten Ketten des mAb; Spleißen der U_h- und U_L-Genabschnitte mit den konstanten Regionen der α- und β-TCR-Ketten und Transfizieren dieser chimären Ab/TCR-Gene in die T-Zellen des Patienten, Vermehren dieser Hybridzellen und Infundierung von diesen in den Patienten (33). Eine spezielle Kenntnis der Gewebe-spezifischen Antigene für Zielobjekte und die Erzeugung von mAbs, die für diese Zielobjekte spezifisch sind, wird dabei helfen, dies zu einem verwertbaren Ansatz zu machen. Da die das PSM-Antigen codierende Region die Kenntnis der gesamten codierenden Region zur Verfügung stellt, ist es möglich, eine Anzahl von Antikörpern zu erzeugen, die dann in Kombination eingesetzt werden können, um eine additive oder synergistische Anti-Tumor-Wirkung zu erreichen. Die Antikörper können mit Enzymen verknüpft werden, welche nicht-toxische Vorstufen von Arzneistoffen an ihrer Stelle des Tumors aktivieren können, wie z.B. Ab-Carboxypeptidase und 4-(bis(2-Chlorethyl)amino)benzoyl-α-glutaminsäure und dessen aktiver parentaler Arzneistoff in Mäusen (34).

Es ist möglich, eine toxische genetische Chimäre wie z.B. TP-40 zu erzeugen, eine genetische Rekombinante, welche die cDNA von TGF-alpha und den toxischen Teil von Pseudomonas-Exotoxin besitzt, so dass der TGF und ein Teil des Hybrids an den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) bindet und der Pseudomonas-Teil enzymatisch in die Zelle aufgenommen wird und dort die Fähigkeit der Ribo somen inaktiviert, Proteinsynthese durchzuführen, was zum Zelltod führt. Wenn wir den Liganden für das PSM-Antigen kennen, können wir dasselbe tun.
Außerdem kann das Toxin, sobald der Ligand für das PSM-Antigen identifiziert ist, chemisch an den Liganden konjugiert werden. Solche konjugierten Liganden können therapeutisch nützlich sein. Beispiele für die Toxine sind Daunomycin, Chlorambucil, Ricin, Pseudomonas-Exotoxin etc. Alternativ kann ein chimäres Konstrukt erzeugt werden, indem die cDNA des Liganden mit der cDNA des Toxins verknüpft wird. Ein Beispiel für ein solches Toxin ist TGF-α und Pseudomonas-Exotoxin (35).
8. Andere
Das PSM-Antigen kann andere Verwendungen haben. Es ist wohlbekannt, dass die Prostata reich an Zink ist; falls das Antigen eine Funktion zur Verfügung stellt, die sich hierauf oder auf andere biologische Funktionen bezieht, kann das PSM-Antigen einen Nutzen bei der Behandlung von anderen prostatischen Pathologien bereitstellen, wie z.B. bei dem Wachstum der gutartigen Hyperplasie und/oder der Prostatitis.
Da aufgereinigtes PSM-Antigen hergestellt werden kann, kann das aufgereinigte PSM-Antigen an Kügelchen gebunden und wie eine Standard „Affinitäts"-Reinigung eingesetzt werden. Serum, Urin oder andere biologische Proben können verwendet werden, sie mit dem an Kügelchen gebundenen PSM-Antigen zu inkubieren. Die Kügelchen können gründlich gewaschen und dann mit Salz oder einem pH-Gradienten eluiert werden. Das eluierte Material wird über ein SDS-Gel aufgereinigt und als Probe für die Mikrosequenzierung verwendet. Die Sequenzen werden mit anderen bekannten Proteinen verglichen werden und, falls diese einzigartig sind, kann die Methode der degenerierten PCR benutzt werden, um den Liganden zu erhalten. Sobald dieser bekannt ist, wird die Affinität des Liganden durch Standardverfahren bestimmt werden (15).
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Zweite Serie von Experimenten
Expression des Prostata-spezifischen Membranantigens
Die Anmelder haben kürzlich eine 2,65 kb große komplementäre DNA cloniert, die PSM codiert, das Prostata-spezifische Membranantigen, das von dem monoclonalen Anti-Prostata-Antikörper 7E11-C5.3 erkannt wird. Eine immunhistochemische Untersuchung der Prostatakrebs-Zelllinien LNCaP, DU-145 und PC-3 auf PSM-Expression mit dem Antikörper 7E11-C5.3 zeigte eine starke Färbung in den LNCaP-Zellen, ohne nachweisbare Expression sowohl in den DU-145- als auch in den PC-3-Zellen. Eine gekoppelte in vitro-Transkription/Translation der 2,65 kb großen Volllänge-PSM-cDNA ergab ein 84 kD großes Protein, welches dem vorhergesagten Polypeptid-Molekulargewicht von PSM entsprach. Eine posttranslationelle Modifikation dieses Proteins mit Hundepankreas-Mikrosomen ergibt das erwartete 100 kD große PSM-Antigen. Nach einer Transfektion von PC-3-Zellen mit der Volllänge-PSM-cDNA in einem eukaryontischen Expressionsvektor weisen die Anmelder die Expression des PSM-Glycoproteins mittels Western-Analyse mit dem monoclonalen Antikörper 7E11-C5.3 nach. Eine Untersuchung mit dem „Ribonulease Protection Assay" zeigt, dass die Expression der PSM-mRNA in menschlichen Geweben fast vollständig Prostata-spezifisch ist. Die PSM-Expression scheint in Zuständen des Hormonentzugs am höchsten zu sein und wird hormonell durch Steroide moduliert, wobei DHT die PSM-Expression in der menschlichen Prostatakrebszelllinie LNCaP um das 8-10-fache herunterreguliert, Testosteron PSM um das 3-4-fache herunterreguliert und Corticosteroide keine signifikante Wirkung zeigen. Normale und maligne Prostatagewebe zeigen durchgängig eine hohe PSM-Expression, wohingegen wir eine heterogene und zu manchen Zeiten fehlende Expression von PSM in gutartigen Prostata-Hyperplasien beobachtet haben. LNCaP-Tumoren, die man implantiert und sowohl orthotop als auch subkutan in Nacktmäusen wachsen lässt, exprimieren PSM in großer Menge, was ein hervorragendes in vivo-Modellsystem zur Verfügung stellt, um die Regulation und Modulierung der PSM-Expression zu untersuchen.
Experimentelle Details
Material und Methoden
Zellen und Reagenzien:
Die Zelllinien LNCaP, DU-145 und PC-3 wurden von der American Type Culture Collection bezogen. Einzelheiten bezüglich der Etablierung und den Eigenschaften dieser Zelllinien sind früher veröffentlicht worden (5A, 7A, 8A). Sofern nicht anders angegeben, ließ man die LNCaP-Zellen bei 37° C in einem CO₂-Inkubator in RPMI 1640-Medien wachsen, die mit L-Glutamin, nicht-essentiellen Aminosäuren und 5 % fötalem Kälberserum (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) supplementiert waren. DU-145- und PC-3-Zellen ließ man in Minimal-Essential-Medium wachsen, das mit 10 % fötalem Kälberserum supplementiert war. Alle Zellmedien wurden von der Medienherstellungseinrichtung des MSKCC bezogen. Restriktions- und Modifikationsenzyme wurden, sofern nicht anders angegeben, von Gibco-BRL gekauft.
Immunhistochemischer Nachweis von PSM
Wir setzten die Avidin-Biotin-Nachweismethode ein, um die Prostatakrebszelllinien auf Expression des PSM-Antigens zu untersuchen (9 A). „Cytospins" von Zellen wurden auf Glasobjektträgern angefertigt, wobei 5 × 10⁴ Zellen/100 μl pro Objektträger eingesetzt wurden. Die Objektträger wurden zwei Mal mit PBS gewaschen und dann mit dem geeigneten Suppressorserum für 20 Minuten inkubiert. Man ließ das Suppressorserum abfließen und die Zellen wurden für 1 Stunde mit dem verdünnten monoclonalen Antikörper 7E11-C5.3 (5 g/ml) inkubiert. Die Proben wurden dann mit PBS gewaschen und nacheinander für 30 Minuten mit sekundären Antikörpern und für 30 Minuten mit Avidin-Biotin-Komplexen inkubiert. Diaminobenzidin diente als unser Chromogen und Farbentwicklung, gefolgt von Hämatoxylingegenfärbung und Aufziehen. „Cytospins" von Zellen im Duplikat wurden als Kontrollen für jedes Experiment eingesetzt. Als ein Positivkontrolle wurde der monoclonale Anti-Cytokeratin-Antikörper CAM 5.2 eingesetzt, wobei nach demselben Protokoll vorgegangen wurde wie vorstehend beschrieben. Menschliche EJ-Blasencarcinomzellen dienten als Negativkontrolle.
In vitro-Transkription/Translation des PSM-Antigens
Das Plasmid 55A, das die 2,65 kb große Volllänge-cDNA von PSM in dem Plasmid pSPORT 1 (Gibco-BRL) enthält, wurde mit dem Promega TNT-System (Promega Corp., Madison, WI) in vitro transkribiert. T7-RNA-Polymerase wurde in einem Reaktionsgemisch, welches ein Kaninchenretikulocyten-Lysat, ein Aminosäurengemisch ohne Methionin, Puffer und ³⁵S-Methionin (Amersham) enthielt, zu der cDNA hinzugefügt und für 90 Minuten bei 30° C inkubiert. Eine posttranslationelle Modifikation des so erhaltenen Proteins wurde durch die Zugabe von Mikrosomen aus Hundepankreas zu dem Reaktionsgemisch erreicht (Promega Corp., Madison, WI). Die Proteinprodukte wurden durch Elektrophorese auf 10% SDS-PAGE-Gelen untersucht, welche anschließend mit Amplify Autoradiographie-Enhancer (Amersham, Arlington Heights, IL) gemäß den Vorschriften des Herstellers behandelt und bei 80° C in einem Vakuumtrockner getrocknet wurden. Die Gele wurden über Nacht bei –70° C autoradiographiert, wobei Hyperfilm MP (Amersham) verwendet wurde.
Transfektion von PSM in PC-3-Zellen
Die Volllänge-PSM-cDNA wurde in den eukaryontischen Expressionsvektor pREP7 (Invitrogen, San Diego, CA) subcloniert. Plasmid-DNA wurde aus transformierten DH5-α-Bakterien (Gibco-BRL) aufgereinigt, wobei QIAGEN Maxi-Prep Plasmidreinigungssäulen (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) eingesetzt wurden. Aufgereinigte Plasmid-DNA (6-10 g) wurde mit 900 μl Optimem-Medium verdünnt und mit 30 μl Lipofectin-Reagenz (Gibco-BRL) gemischt, das zuvor mit 900 μl Optimem-Medium verdünnt worden war. Dieses Gemisch wurde zu T-75-Flaschen von 40-50% konfluenten PC-3-Zellen in Optimem-Medium hinzugefügt. Nach 24-36 Stunden wurden die Zellen trypsinisiert und in 100 mm-Platten aufgeteilt, welche RPMI 1640-Medium enthielten, das mit 10% fötalem Kälberserum und mit 1 mg/ml Hygromycin B (Calbiochem, LaJolla, CA) supplementiert war. Die eingesetzte Dosis Hygromycin war früher durch einen Zeitverlauf/Dosisreaktion-Cytotoxizitätsassay bestimmt worden. Die Zellen wurden in diesem Medium für 2-3 Wochen gehalten, wobei Medium und Hygromycin B alle 4-5 Tage gewechselt wurden bis einzelne Kolonien auftraten. Kolonien wurden mit Hilfe von 6 mm großen Klonierungszylindern isoliert und in demselben Medium expandiert. Als eine Kontrolle wurden PC-3-Zellen auch mit dem Plasmid pREP7 alleine transfiziert. RNA wurde aus den transfizierten Zellen isoliert und die Expression der PSM-mRNA wurde sowohl mit einer „RNase Protection"-Untersuchung (später beschrieben) als auch durch eine Northern-Analyse nachgewiesen.
Western-Blot-Nachweis der Expression von PSM
Proteinrohlysate wurden aus LNCaP-, PC-3- und PSM-transfizierten PC-3-Zellen wie früher beschrieben isoliert (10 A). LNCaP-Zellmembranen wurden ebenfalls nach veröffentlichten Methoden isoliert (10 A). Protein-konzentrationen wurden mit der Bradford-Methode quantifiziert, wobei das Biorad Protein Reagent Kit (BioRad, Richmond, CA) verwendet wurde. Nach der Denaturierung wurden 20 μg Protein auf einem 10% SDS-PAGE-Gel bei 25 mA für 4 Stunden elektrophoretisch aufgetrennt. Die Gele wurden mittels Elektroblotting über Nacht bei 4° C auf Immobilon P-Membranen (Millipore, Bedford, MA) transferiert. Die Membranen wurden in 0,15 M NaCl/0,01 M Tris-HCl, (TS) plus 5% BSA blockiert, gefolgt von einer Inkubation für 1 Stunde mit dem monoclonalen Antikörper 7E11-C5.3 (10 g/ml). Die Blots wurden 4 Mal mit 0,15 M NaCl/0,01 M Tris-HCl,/0,05% Triton X-100 (TS-X) gewaschen und für 1 Stunde mit Kaninchen-Anti-Maus-IgG (Accurate Scientific, Westbury, NY) bei einer Konzentration von 10 g/ml inkubiert.
Die Blots wurden dann 4 Mal mit TS-X gewaschen und mit ¹²⁵I-Protein A (Amersham, Arlington Heights, IL) bei einer Konzentration von 1 Million cpm/ml markiert. Die Blots wurden dann 4 Mal mit TS-X gewaschen und auf Whatman 3MM-Papier getrocknet, gefolgt von einer Autoradiographie über Nacht bei –70° C, wobei Hyperfilm MP (Amersham) eingesetzt wurde.
Orthotopes und subkutanes LNCaP-Tumorwachstum in Nacktmäusen
LNCaP-Zellen wurden aus subkonfluenten Kulturen durch eine einminütige Exposition gegenüber einer Lösung von 0,25% Trypsin und 0,02% EDTA geerntet. Die Zellen wurden in RPMI 1640-Medium mit 5% fötalem Rinderserum resuspendiert, gewaschen und entweder in Matrigel (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA) oder in Calcium- und Magnesium-freier Hanks' gepufferter Salzlösung (HBSS) verdünnt. Nur Einzelzellsuspensionen mit einer Lebensfähigkeit von mehr als 90% auf der Grundlage von Trypanblau-Ausschluss wurden für die in vivo-Injektion ver wendet. Männliche athymische Swiss (nu/nu) Nacktmäuse im Alter von 4-6 Wochen wurden von der Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Animal Facility bezogen. Für die subkutane Injektion von Tumorzellen wurden eine Million LNCaP-Zellen, die in 0,2 ml Matrigel resuspendiert waren, in den Hinterlauf jeder Maus injiziert, wobei eine Wegwerfspritze verwendet wurde, die mit einer 28-Gauge-Nadel ausgerüstet war. Für die orthotope Injektion wurden die Mäuse zunächst mit einer intraperitonealen Injektion von Pentobarbital anästhetisiert und in die Rückenlage gebracht. Der Unterleib wurde mit Betadin gereinigt und die Prostata wurde durch einen Mittellinienschnitt freigelegt. 2,5 Millionen LNCaP-Tumorzellen in 0,1 ml wurden direkt in den hinteren Lappen injiziert, wobei eine Wegwerfspritze und eine 28-Gauge-Nadel verwendet wurden. LNCaP-Zellen wurden mit und ohne Matrigel injiziert. Ein Unterleibverschluss wurde in einer Schicht mit Hilfe von Autoclip-Wundklammern (Clay Adams, Parsippany, NJ) bewerkstelligt. Die Tumoren wurden in 6-8 Wochen geerntet, histologisch vom Fachbereich der Pathologieabteilung des Memorial Sloan-Kettering Cancer Research Center bestätigt, und für die anschließende RNA-Isolierung in flüssigem Stickstoff eingefroren.
RNA-Isolierung
Zelluläre Gesamt-RNA wurde aus Zellen und Geweben durch Standardmethoden (11, 12) ebenso wie unter Verwendung von RNAzol B (Cinna/Biotecx, Houston, TX) isoliert. Die Konzentrationen und die Qualität der RNA wurden mittels UV-Spektroskopie auf einem Beckman DU 640 Spektrophotometer und durch Gelanalyse beurteilt. Gesamt-RNA-Proben von menschlichem Gewebe wurden von Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) gekauft.
Ribonuclease Protection Assays
Ein Teil der PSM-cDNA wurde in den Plasmidvektor pSPORT 1 (Gibco-BRL) subcloniert und die Orientierung der cDNA-Insertion relativ zu den flankierenden T7- und SP6-RNA-Polymerase-Promotoren wurde durch Restriktionsanalyse überprüft. Eine Linearisierung dieses Plasmids stromaufwärts von der PSM-Insertion, gefolgt von einer Transkription mit SP6-RNA-Polymerase ergibt eine 400 Nucleotide lange Antisense-RNA-Sonde, von welcher 350 Nucleotide durch die PSM-RNA vor dem RNase-Verdau geschützt sein sollten. Diese Sonde wurde in 20 verwendet.
Das Plasmid IN-20, welches eine 1 kb große partielle PSM-cDNA in dem Plasmid pCRII (Invitrogen) enthält, wurde ebenfalls zur Synthese einer „Riboprobe" (Ribonucleinsäure-Sonde) eingesetzt. Das mit XmnI (Gibco-BRL) linearisierte IN-20 ergibt eine 298 Nucleotide lange Antisense-RNA-Sonde, wen es mit Sp6-RNA-Polymerase transkribiert wird, wovon 260 Nucleotide durch die PSM-mRNA vor demRNase-Verdau geschützt sein sollten. Diese Sonde wurde in den 21 und 22 eingesetzt. Die Sonden wurden mit SP6-RNA-Polymerase (Gibco-BRL), rNTPs (Gibco-BRL), RNasin (Promega) und ³²P-rCTP (NEN, Wilmington, DE) gemäß veröffentlichten Protokollen (13) synthetisiert. Die Sonden wurden über NENSORB 20 Reinigungssäulen (NEN) aufgereinigt, und ungefähr 1 Million cpm gereinigte, radioaktiv markierte PSM-Sonde wurde mit 10 g jeder RNA gemischt und über Nacht bei 45° C hybridisiert, wobei die Puffer und Reagenzien aus dem RPA II-Kit (Ambion, Austin, TX) verwendet wurden. Die Proben wurden gemäß den Vorschriften des Herstellers bearbeitet und auf denaturierenden 5% Polyacrylamid/7 M Harnstoff-Gelen unter Verwendung von Seq ACRYL- Reagenzien (ISS, Natick, MA) analysiert. Die Gele wurden auf 55° C vorgewärmt und für 1-2 Stunden bei 25 Watt laufen gelassen. Die Gele wurden dann für 30 min in 10% Methanol/10% Essigsäure fixiert, auf Whatman 3MM-Papier bei 80° C in einem BioRad Vakuumtrockner getrocknet und über Nacht mit Hyperfilm MP (Amersham) autoradiographiert. Eine quantitative Bestimmung der PSM-Expression wurde mit Hilfe eines Scanning Laser-Densitometers (LKB, Piscataway, NJ) durchgeführt.
Experiment zur Steroidmodulierung
Man plattierte LNCaP-Zellen (2 Millionen) in T75-Fläschchen in RPMI 1640-Medium aus, das mit 5% fötalem Kälberserum supplementiert war, und ließ diese 24 Stunden wachsen bis sie ungefähr 30-40% konfluent waren. Die Fläschchen wurden dann mehrere Male mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und es wurde RPMI 1640 hinzugefügt, das mit 5% über Aktivkohle gefiltertem Serum supplementiert war. Man ließ die Zellen für weitere 24 Stunden wachsen, worauf zu diesem Zeitpunkt Dihydrotestosteron, Östradiol, Progesteron und Dexamethason (Steraloid Inc., Wilton, NH) in einer Endkonzentration von 2 nM hinzugefügt wurden. Man ließ die Zellen weitere 24 Stunden wachsen erntete dann die RNA wie früher beschrieben und untersuchte die PSM-Expression mittels „Ribonuclease Protection"-Analyse.
Experimentelle Ergebnisse
Immunhistochemischer Nachweis von PSM:
Mit dem monoclonalen Anti-PSM Antikörper 7E11-C5.3 ist die PSM-Expression in der LNCaP-Krebszelllinie eindeutig nachweisbar, nicht aber in den Zelllinien PC-3 und DU-145 (17), in Übereinstimmung mit früher veröffentlichten Ergebnissen (4 A). Alle untersuchten normalen und malignen Prostatagewebe wurden positiv für PSM-Expression angefärbt (unveröffentlichte Daten).
In vitro-Transkription/Translation des PSM-Antigens
Wie in 18 gezeigt ergibt eine gekoppelte in vitro-Transkription/Translation der 2,65 kb großen PSM-Volllänge-cDNA eine 84 kDa große Proteinspezies in Übereinstimmung mit dem erwarteten Proteinprodukt von dem 750 Aminosäuren großen offenen Leserahmen von PSM. Nach posttranslationeller Modifikation mit Mikrosomen aus Hundepankreas erhielten wir eine 100 kDa große glycosylierte Proteinspezies, passend zu dem reifen, nativen PSM-Antigen.
Nachweis des PSM-Antigens in LNCaP-Zellmembranen und transfizierten PC-3- Zellen
PC-3-Zellen, die mit der PSM-Volllänge-cDNA in dem Expressionsvektor pREP7 transfiziert worden waren, wurden mittels Northern-Analyse auf die Expression von PSM-mRNA hin untersucht (Daten nicht gezeigt). Ein Clon mit einer hohen PSM-mRNA-Expression wurde für eine PSM-Antigen-Analyse mittels Western Blotting mit dem 7E11-C5.3-Antikörper ausgewählt. In 19 ist das 100 kDa PSM-Antigen im LNCaP-Zelllysat und in den Membranfraktionen stark exprimiert, ebenso wie in PSM-transfizierten PC-3-Zellen, aber nicht in nativen PC-3-Zellen. Diese nachweisbare Expression in den transfizierten PC-3-Zellen beweist, dass die früher clonierte 2,65 kb große PSM-cDNA das Antigen codiert, das von dem monoclonalen Anti-Prostata-Antikörper 7E11-C5.3 erkannt wird, und dass das Antigen in den PC-3-Zellen richtig glycosyliert wird, da der Antikörper ein Carbohydrat-enthaltendes Epitop auf PSM erkennt.
Expression der PSM-mRNA
Die Expression der PSM-mRNA in normalen menschlichen Geweben wurde mittels „Ribonuclease Protection"-Assays untersucht. Die Gewebeexpression von PSM tritt vor allem innerhalb der Prostata auf, wobei sehr schwache Expressionsspiegel in menschlichem Gehirn und Speicheldrüse nachweisbar sind (20). Keine nachweisbare PSM-mRNA-Expression war in nicht-prostatischen menschlichen Geweben zu sehen, wenn diese mittels Northern-Analyse untersucht wurden (Daten nicht gezeigt). Wir haben auch gelegentlich eine nachweisbare Expression von PSM in normalem menschlichem Dünndarmgewebe bemerkt, jedoch variiert diese mRNA-Expression mit der jeweilig verwendeten Riboprobe (Daten nicht gezeigt). Alle untersuchten Proben von normaler menschlicher Prostata und von menschlichen Prostataadenocarcinomen haben eindeutig nachweisbare PSM-Expression gezeigt, wohingegen wir im Allgemeinen verminderte oder fehlende Expression von PSM in Geweben bemerkt haben, welche eine gutartige Hyperplasie zeigen (21). In menschlichen LNCaP-Tumoren, die wir in Nacktmäusen sowohl orthotop als auch subkutan wachsen ließen, entdeckten wir eine hohe PSM-Expression mit oder ohne Verwendung von Matrigel, welches für das Wachstum von subkutan implantierten LNCaP-Zellen benötigt wird (21). Die Expression der PSM-mRNA wird durch das Vorhandensein von Steroiden in physiologischen Dosen deutlich moduliert (22). DHT regulierte die Expression nach 24 Stunden 8-10-fach herunter und Testosteron verringerte die PSM-Expression um das 3-4-fache. Östradiol und Progesteron regulierten die PSM-Expression in LNCaP-Zellen ebenfalls herunter, vielleicht in Folge der Bindung an den mutierten Androgenrezeptor, der bekanntermaßen in den LNCaP-Zellen vorliegt. Insgesamt ist die PSM-Expression in den unbehandelten LNCaP-Zellen am höchsten, die man in Steroid-verarmtem Medium wachsen ließ, eine Situation, die nach unserer Meinung den in vivo-Zustand des Hormonentzugs (kastriert) simuliert. Dieses Experiment wurde mit ähnlichen Ergebnissen bei Steroiddosierungen wiederholt, welche von 2-200 nM reichten und zu Zeitpunkten von 6 Stunden bis 7 Tagen; eine maximale Herunterregulierung von PSM-mRNA wurde mit DHT bei 24 Stunden bei Dosen von 2-20 nM beobachtet.
Diskussion der Experimente
Um die Biologie der menschlichen Prostata sowohl in normalen wie auch in neoplastischen Zuständen besser zu verstehen, ist es notwendig, unser Wissen weiterzuentwickeln, indem wir die verschiedenen Proteine und andere Merkmale untersuchen, die für diese wichtige Drüse einzigartig sind. Frühere Forschungen haben zwei wertvolle prostatische Biomarker, PAP und PSA, zur Verfügung gestellt, von denen beide eine maßgebliche Bedeutung für die Diagnose, die Behandlung und das Management von Prostatamalignitäten hatten. Unsere vorliegende Arbeit, welche die vorläufige Charakterisierung des Prostata-spezifischen Membranantigens (PSM) beschreibt, lässt erkennen, dass es sich um ein Gen mit vielen interessanten Eigenschaften handelt. PSM ist fast vollständig Prostata-spezifisch, wie es das PAP und PSA sind, und kann als solches die weitere Abgrenzung der einzigartigen Funktionen und des Verhaltens der Prostata ermöglichen. Die vorhergesagte Sequenz des PSM-Proteins (3) und dessen Vorliegen in der LNCaP-Zellmembran, wie durch Western Blotting und Immunhistochemie bestimmt, weisen darauf hin, dass es sich um ein integrales Membranprotein handelt. Somit stellt PSM ein attraktives Zelloberflächenepitop für eine Antikörper-gesteuerte diagnostische Bildgebung und für Modalitäten der cytotoxischen Zielführung zur Verfügung (14). Die Fähigkeit, das PSM-Antigen in vitro zu synthetisieren und Tumorxenotransplantate herzustellen, die hohe Spiegel der PSM-Expression aufrechterhalten, stellt uns ein einfaches und attraktives Modellsystem zur Verfügung, um die Regulation und die Modulierung der PSM-Expression näher zu untersuchen und zu charakterisieren. Auch stellt der hohe Spiegel der PSM-Expression in den LNCaP-Zellen ein hervorragendes in vitro-Modellsystem zur Verfügung. Da die PSM-Expression hormonell auf Steroide reagiert und bei einer Hormon-refraktären Krankheit hoch exprimiert werden kann (15), ist es dringend notwendig, die mögliche Rolle von PSM bei der Entwicklung des Androgen-unabhängigen Prostatakrebses zu klären. Der Nachweis der Expression von PSM-mRNA in winzigen Mengen im Gehirn, in der Speicheldrüse und im Dünndarm rechtfertigt weitere Untersuchungen, obwohl diese Gewebe für die Expression des PSM-Antigens durch Immunhistochemie mit dem Antikörper 7E11-C5.3 negativ waren (16). In allen diesen Geweben, insbesondere im Dünndarm, wiesen wir die mRNA-Expression mit Hilfe einer Sonde nach, welche einer Region der PSM-cDNA in der Nähe des 3'-Endes entsprach, wohingegen wir nicht in der Lage waren, eine Expression nachzuweisen, wenn wir eine PSM-Sonde vom 5'-Ende verwendeten. Diese Ergebnisse können darauf hinweisen, dass das PSM-mRNA-Transkript in verschiedenen Geweben einem alternativen Spleißen ausgesetzt ist. Frühere Proteinstudien haben darauf hingedeutet, dass der Antikörper 7E11-C5.3 zusätzlich zu dem 100 kDa großen PSM-Antigen vielleicht sogar zwei andere, etwas größere Proteinspezies nachweist (17). Diese anderen Proteinspezies kann man in dem LNCaP-Lysat und in Membranproben in 19 sehen. Mögliche Entstehungsarten dieser Proteine umfassen alternativ gespleißte PSM-mRNA, andere Gene, welche von PSM verschieden, aber eng mit diesem verwandt sind, oder unterschiedliche posttranslationelle Modifikationen des PSM-Proteins. Wir untersuchen derzeit diese Möglichkeiten.
Der Ansatz der Anmelder basiert auf Prostatagewebe-spezifischen Promotor-Enzym oder -Cytokin-Chimären. Wir werden die Promotor-spezifische Aktivierung von Arzneistoffvorstufen wie z.B. von nicht-toxischem Gancyclovir untersuchen, das durch die Herpes simplex Thymidinkinase in einen toxischen Metaboliten umgewandelt wird, oder die Arzneistoffvorstufe 4-(bis(2-Chloroethyl)amino)benzoyl-1-Glutaminsäure, die durch die Pseudomonas Carboxypeptidase G2 in das Alkylierungsmittel Benzoesäure-Senfgas umgewandelt wird. Da diese Arzneistoffe spezifisch im Tumor durch das Enzym (die Chimäre) aktiviert werden, wird der aktive Wirkstoff nur lokal in der Tumorumgebung freigesetzt, wodurch er die umliegenden Tumorzellen zerstört. Wir werden auch die Promotor-spezifische Aktivierung von Cytokinen wie z.B. IL-12, IL-2 oder GM-CSF zur Aktivierung und zur spezifischen Antitumor-Impfung untersuchen. Schlussendlich kann sich auch eine Gewebe-spezifische Aktivierung des Zelltod induzierenden Gens in diesem Bereich als nützlich erweisen.
Gentherapie-Chimären
Die Schaffung von „chimärer DNA" für die Gentherapie erfordert das Miteinanderverbinden von verschiedenen DNA-Abschnitten, um eine neue DNA zu erzeugen, die die Eigenschaften von beiden Vorläufer-DNA-Spezies hat, die an der Verknüpfung beteiligt sind. Bei diesem Vorhaben umfassen die zwei Stücke, die verknüpft werden, unterschiedliche funktionelle Aspekte der DNA, die Promotorregion, welche das Ablesen der DNA zur Bildung von mRNA wird die Spezifität liefern und die die mRNA codierende DNA-Sequenz wird die therapeutische funktionelle DNA ermöglichen.
DNA-bestimmte Enzym- oder Cytokin-mRNA:
Wenn sie wirksam sind, können Antitumormittel die Regression von sehr großen Tumormengen bewirken. Die Hauptanforderungen für die Aktivität von Antitumormitteln ist das Erfordernis, sowohl eine ausreichend lange Zeit (t) und eine genügend hohe Konzentration (c) (c × t) der Exposition des Tumors gegenüber dem toxischen Arzneistoff zu erreichen, um ausreichende Zellschäden zu gewährleisten, damit der Zelltod eintritt. Der Arzneistoff muss auch „aktiv" sein und die Toxizität für den Tumor muss größer sein als für die normalen Zellen des Wirts (22). Die Verfügbarkeit des Arzneistoffs im Tumor hängt von dem Blutfluss des Tumors ab sowie vom Diffusionsvermögen des Arzneistoffs. Der Blutfluss zum Tumor gewährleistet keine Spezifität, da der Blutfluss zu vielen normalen Geweben häufig genauso groß oder größer ist als derjenige zum Tumor. Der Großteil der chemotherapeutischen cytotoxischen Arzneistoffe ist oft genauso toxisch für normale Gewebe wie für das Tumorgewebe. Sich teilende Zellen sind häufig empfindlicher als sich nicht teilende normale Zellen, aber in vielen langsam wachsenden festen Tumoren wie z.B. Prostatakrebs gewährleistet dies keine Antitumor-Spezifität (22).
Früher war ein Mittel, die Tumorspezifität von Antitumormitteln zu erhöhen, Tumor-assoziierte Enzyme einzusetzen, um nicht-toxische Arzneimittelvorstufen zu cytotoxischen Wirkstoffen zu aktivieren (19). Ein Problem mit diesem Ansatz war es, dass die meisten in Tumoren gefundenen Enzyme nicht absolut spezifisch in ihrer Aktivität waren und dass aktive Enzyme mit ähnlichem Substrat oder dasselbe Enzym in nur geringfügig niedrigeren Mengen in anderem Gewebe gefunden wurde und die normalen Gewebe daher immer noch Gefahr liefen, geschädigt zu werden.
Um eine absolute Spezifität und einzigartige Aktivität bereitzustellen, wurden virale, bakterielle und Pilz-Enzyme gefunden, welche eine einzigartige Spezifität für ausgewählte Arzneistoffvorstufen besitzen und die nicht in menschlichen oder anderen tierischen Zellen vorhanden waren. Versuche, Enzyme wie z.B. Herpes simplex Thymidinkinase, bakterielle Cytosindeaminase und Carboxypeptidase G-2 auszunutzen, waren mit mäßigem Erfolg mit Antikörper-Zielführungssystemen ver bunden (19). Leider beschränken mit zielführenden Antikörpern bestückte Enzyme die Anzahl der pro Zelle verfügbaren Enzyme. Auch haben die meisten Antikörper kein hohes Verhältnis von Tumorziel zu normalem Gewebe, so dass normale Gewebe immer noch exponiert sind, was die Spezifität dieser einzigartigen Enzyme vermindert. Antikörper sind große Moleküle, welche schlechte Diffusionseigenschaften aufweisen und das Hinzufügen des Molekulargewichts der Enzyme verringert die Diffusion der Antikörper noch weiter.
Gentherapie könnte das beste gewünschte Ergebnis erbringen, wenn sie die spezifische Expression eines Proteins in dem Tumor und nicht in normalen Zellen bewerkstelligen könnte, damit eine hohe lokale Konzentration des Enzyms für die Bildung des aktiven Arzneistoffs in der Tumorumgebung verfügbar ist (21).
Cytokine:
Die Forschungsgruppe der Anmelder hat gezeigt, dass die Anmelder in Modellen von Blasen- und Prostatakrebs ein Tier spezifisch und nicht-toxisch von einem bestehenden Tumor „heilen" können. Der Prostatakrebs war der schwieriger zu heilende, insbesondere wenn man ihn orthotop in der Prostata wachsen ließ.
Unsere Arbeit zeigte, dass Tumore wie z.B. Blasen- und Prostatatumore nicht immunogen waren, das heißt, die Verabreichung von bestrahlten Tumorzellen an das Tier vor einer anschließenden Verabreichung von nicht-bestrahlten Tumorzellen führte weder zu einer Verringerung der Zahl der Tumorzellen, die einen Tumor erzeugen, noch verminderte es die Wachstumsrate des Tumors. Aber wenn der Tumor mit einem Retrovirus transfiziert wurde und große Konzentrationen von Cytokinen wie z.B. IL-2 sezernierte, konnte dies als ein Antitumor-Impfstoff fungieren und konnte auch das Wachstumspotenzial eines bereits bestehenden und wachsenden Tumors verringern. IL-2 war das Beste, GM-CSF wies ebenfalls Aktivität auf, wohingegen eine Reihe anderer Cytokine sehr viel weniger aktiv waren. In klinischen Studien, in denen nur IL-2 zur Immunstimulierung eingesetzt wurde, mussten sehr hohe Konzentrationen gegeben werden, die sich als toxisch erwiesen. Der Schlüssel zum Erfolg der durch ein Cytokingen modifizierten Tumorzelle liegt darin, dass das Cytokin lokal an der Tumorstelle erzeugt wird und nicht toxisch ist und dass es die Immunerkennung des Tumors stimuliert und eine spezifische und nicht-toxische Erkennung und Zerstörung des Tumors erlaubt. Die genauen Mechanismen, wie die IL-2-Produktion durch die Tumorzelle die Immunerkennung aktiviert, versteht man nicht vollständig, aber eine Erklärung ist, dass diese die Erfordernis für eine Cytokinproduktion durch T-Helferzellen umgeht und durch das Tumorantigen aktivierte cytotoxische CD8-Zellen direkt stimuliert. Es könnte auch eine Aktivierung der Antigen-präsentierenden Zellen auftreten.
Gewebe-Promotor-spezifische Aktivierung der Chimären-DNA
Nicht-prostatische Tumorsysteme:
Es ist in nicht-prostatischen Tumoren beobachtet worden, dass die Verwendung einer Promotor-spezifischen Aktivierung selektiv zu einer Gewebe-spezifischen Genexpression des transfizierten Gens führen kann. In Melanomen bewirkte die Verwendung des Tyrosinase-Promotors, welcher das für die Melaninexpression zuständige Gen codiert, eine über 50-fach höhere Expression der Promotor-gesteuerten Reportergenexpression in Melanomzellen und nicht in Nicht-Melanomzellen. Eine ähnliche spezifische Aktivierung wurde in den transfizierten Melanomzellen beobachtet, als diese in Mäusen wuchsen. In diesem Experiment exprimierte keine Nicht-Melanom- oder Melanocytenzelle das Tyrosinase-gesteuerte Reportergenprodukt. Die Forschergruppe an den Welcome Laboratories hat die Promotorregion des Gens cloniert und sequenziert, welches das carcinoembryonale Antigen (CEA) codiert. CEA wird im Kolon und in Koloncarcinomzellen exprimiert, aber spezifisch auf metastatischer Cytosindeaminase, welche 5-Fluorocytosin in 5-Fluorouracil umwandelt, und beobachteten einen hohen Anstieg in der Fähigkeit, CEA-Promotor-gesteuerte Kolontumorzellen selektiv abzutöten, aber nicht sich teilende sich nicht teilende normale Leberzellen. In vivo beobachteten sie, dass in der Nähe befindliche Tumorzellen, die nicht mit dem Cytosindeaminase-Gen transfiziert waren, ebenfalls abgetötet wurden, und dass es keine Toxizität gegenüber dem Wirtstier gab, als die großen Tumore sich nach der Behandlung zurückbildeten. Die Thymidinkinase von Herpes simplex-Virus (HSV) aktiviert auf ähnliche Weise die Arzneimittelvorstufe Gancyclovir, so dass diese toxisch gegen sich teilende Krebszellen ist, und es ist gezeigt worden, dass die HSV Thymidinkinase durch Gewebe-spezifische Promoto ren spezifisch aktivierbar ist.
Prostatatumor-Systeme:
Der therapeutische Schlüssel zu einer wirksamen Krebstherapie liegt darin, Spezifität zu erreichen und dem Patienten Toxizität zu ersparen. Die Gentherapie kann einen Hauptteil zur Spezifität beisteuern, indem nicht-essenzielle Gewebe wie z.B. die Prostata und Prostatatumore Gewebe-spezifische Proteine wie z.B. saure Phosphatase (PAP), Prostata-spezifisches Antigen (PSA) und ein Gen, welches wir cloniert haben, Prostata-spezifisches Membranantigen (PSM), produzieren. Gewebe wie z.B. die Prostata enthalten ausgewählte Gewebe-spezifische Transkriptionsfaktoren, welche für die Bindung an die Promotorregion der DNA dieser Gewebe-spezifischen mRNAs verantwortlich sind. Der Promotor für PSA ist cloniert wir und wir untersuchen dessen Verwendung als Prostata-spezifischen Promotor für Prostatatumorzellen. Normalerweise sind Patienten, die auf metastatischen Prostatakrebs behandelt werden, auf eine Androgenentzugstherapie gesetzt worden, welche die Expression der mRNA für PSA drastisch vermindert. Auf der anderen Seite erhöht sich die Expression von PSM im Zuge einer Hormonentzugs, was bedeutet, dass es sogar noch stärker in Patienten exprimiert werden würde, die mit einer Hormontherapie behandelt werden. Vorläufige Arbeiten in Zusammenarbeit mit Dr. John Isaacs Labor zeigen, dass PSM exprimiert wird, wenn die menschliche Chromosomenregion, die das menschliche PSM-Gen enthält, in den Rattentumor AT-6 transferiert wird. AT-6 ist ein metastatischer Androgen-unabhängiger Tumor. Das gleiche Chromosom, das in Gewebe oder in Tumore transferiert wird, die nicht von der Prostata abgeleitet sind, wird nicht exprimiert, und demnach könnten diese Zellen als ein Tiermodell für diese Experimente verwendet werden. PSA-, PSM-positive menschliche LNCaP-Zellen werden zu Testzwecken in Nacktmäusen eingesetzt werden.
Literaturverzeichnis für die zweite Serie von Experimenten

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Dritte Serie von Experimenten
Sensitiver Nachweis von prostatischen hämatogenen Mikrometastasen unter Verwendung von PSA- und PSM-abgeleiteten Primern in der Polymerasekettenreaktion
Wir haben einen PCR-basierten Assay entwickelt, welcher einen sensitiven Nachweis von hämatogenen Mikrometastasen in Patienten mit Prostatakrebs erlaubt. Wir führten eine „verschachtelte PCR" aus, indem wir mRNA-Sequenzen amplifizierten, die für das Prostata-spezifische Antigen und für das Prostata-spezifische Membranantigen einzigartig sind und haben die jeweiligen Ergebnisse verglichen. Mikrometastasen wurden in 2/30 Patienten (6,7%) mittels PCR mit PSA-abgeleiteten Primern nachgewiesen, wohingegen PSM-abgeleitete Primer Tumorzellen in 19/30 Patienten (63,3%) nachwiesen. Alle 8 Negativkontrollen waren negativ sowohl in der PSA- als auch in der PSM-PCR. Die Assays wurden wiederholt, um die Ergebnisse zu bestätigen, und die PCR-Produkte wurden durch DNA-Sequenzierung und durch Southern-Analyse überprüft. Zu den Patienten, die zirkulierende Prostatatumorzellen beherbergten, die durch PSM- und nicht durch PSA-PCR nachgewiesen wurden, gehörten 4 Patienten, die zuvor mit einer radikalen Prostatektomie behandelt worden waren und keine messbaren PSA-Serumspiegel zum Zeitpunkt dieses Assays aufwiesen. Die Bedeutung dieser Befunde im Hinblick auf ein zukünftiges Wiederauftreten und Fortschreiten der Krankheit wird untersucht werden.
Eine Verbesserung in dem Überleben der Patienten mit Prostatakrebs insgesamt wird von einer früheren Diagnose abhängen. Eine lokalisierte Krankheit ohne Hinweise auf eine extra-prostatische Ausbreitung wird erfolgreich entweder mit einer radikalen Prostatektomie oder mit äußerer Bestrahlung mit ausgezeichneten Langzeitergebnissen (2, 3). Das Hauptproblem besteht darin, dass bei ungefähr zwei Dritteln der Männer, die mit Prostatakrebs diagnostiziert werden, zum Zeitpunkt der Diagnose bereits Hinweise auf eine fortgeschrittene extraprostatische Ausbreitung vorliegen, für die es zur Zeit keine Heilung gibt (4). Die Verwendung von klinischen Serummarkern wie z.B. Prostata-spezifisches Antigen (PSA) und saure Prostataphosphatase (PAP) haben Ärzte in die Lage versetzt, Prostatacarcinome früher zu entdecken und liefert nützliche Parameter, um das Ansprechen auf die Therapie zu verfolgen (5). Und doch sind wir, trotz der Einführung von sensitiven Serum-PSA-Assays, Knochenscans mit Radionukliden, CT-Scans und anderen bildgebenden Verfahren immer noch nicht in der Lage, das Vorhandensein von mikrometastatischen Zellen vor deren Etablierung als feste Metastasen zu entdecken. Frühere Arbeiten sind gemacht worden, in denen die Polymerasekettenreaktion benutzt worden ist, um mRNA-Sequenzen zu amplifizieren, die einzigartig für Brust-, Leukämie- und andere maligne Zellen im Kreislauf sind und ermöglichen den frühen Nachweis von Mikrometastasen (6, 7). Vor kurzem wurde ein PCR-basierter Ansatz veröffentlicht, bei dem Primer benutzt wurden, die von der PSA-DNA-Sequenz abgeleitet worden waren (8). In dieser Studie hatten 3/12 Patienten mit fortgeschrittenem Prostatakrebs im Stadium D nachweisbare hämatogene Mikrometastasen.
Wir haben vor kurzem eine 2,65 kb große cDNA identifiziert und cloniert, welche das 100 kDa große Prostata-spezifische Membranantigen (PSM) codiert, welches von dem monoclonalen Anti-Prostata-Antikörper 7E11-C5.3 erkannt wird (9). Bei PSM scheint es sich um ein integrales Membranglycoprotein zu handeln, das in Prostatatumoren und Metastasen sehr hoch exprimiert und fast vollständig Prostata-spezifisch ist (10). Viele anaplastische Tumore und Knochenmetastasen weisen eine veränderliche und zu manchen Zeitpunkten nicht nachweisbare Expression von PSA auf, wohingegen diese Läsionen durchgängig hohe Spiegel von PSM zu exprimieren scheinen. Prostatatumorzellen, welche von der Prostatadrüse entkommen und in den Kreislauf eintreten, haben wahrscheinlich das Potenzial, Metastasen zu bilden und sind möglicherweise die aggressiveren und möglicherweise anaplastischen Zellen, eine Population von Zellen, die vielleicht keine hohen Spiegel von PSA exprimieren, aber vielleicht die hohe Expression von PSM beibehalten. Wir entschieden uns daher in einem PCR-Assay DNA-Primer zu benutzen, welche von den Sequenzen von sowohl PSA als auch PSM abgeleitet waren, um mikrometastatische Zellen im peripheren Kreislauf nachzuweisen. Trotz des hohen Amplifikationsgrads und der Sensitivität herkömmlicher RNA-PCR haben wir einen „verschachtelten" PCR-Ansatz benutzt, in dem wir zuerst eine Zielsequenz amplifizieren und dieses PCR-Produkt anschließend als Matrize für eine andere Runde der PCR-Amplifikation mit einem neuen Set von Primern einsetzen, die vollständig innerhalb der Sequenz des vorherigen Produkts enthalten sind. Dieser Ansatz hat uns in die Lage versetzt, unsere Nachweisgrenze von einer Prostatatumorzelle pro 10.000 Zellen auf weniger als eine Zelle pro zehn Millionen Zellen zu steigern.
Experimentelle Details
Material und Methoden
Zellen und Reagenzien:
LNCaP- und MCF-7-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) bezogen. Die Einzelheiten, welche die Etablierung und die Eigenschaften dieser Zelllinien betreffen, sind früher veröffentlicht worden (11, 12). Man ließ die Zellen in einem CO₂-Inkubator bei 37° C in RPMI 1640-Medien wachsen, die mit L-Glutamin, nicht-essentiellen Aminosäuren, die von der Medienherstellungseinrichtung des MSKCC bezogen wurden, und mit 5% fötalem Kälberserum (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) supplementiert waren. Alle Zellmedien wurden von der Medienherstellungseinrichtung des MSKCC bezogen. Chemische Routinereagenzien wiesen den höchstmöglichen Qualitätsgrad auf und wurden von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO bezogen.
Blutproben von Patienten
Alle Blutproben, die in dieser Studie verwendet wurden, stammten von Patienten, die in den Ambulanzstationen von am MSKCC angestellten Urologen vorstellig wurden. Es wurden zwei Anti-Koagulationsröhrchen (lila Kappe) pro Patient zum Zeitpunkt von deren regelmäßig vorgesehenen Blutabnahmen erhalten. Die Beschaffung der Proben wurde mit Zustimmung des institutionellen Prüfungsausschusses des MSKCC durchgeführt. Die Proben wurden zur sofortigen Bearbeitung umgehend ins Labor gebracht. Bestimmungen von Serum-PSA und PAP wurden mit Hilfe von Standardmethoden vom Labor für klinische Chemie des MSKCC durchgeführt. PSA-Bestimmungen wurden mit Hilfe des Tandem PSA Assay (Hybritech, San Diego, CA) durchgeführt. Die acht als Negativkontrollen verwendeten Blutproben stammten von zwei männlichen Probanden mit normalen PSA-Serumwerten und einer durch eine Biopsie bestätigten BPH, von einer gesunden weiblichen Probandin, drei gesunden männlichen Probanden, einem Patienten mit einem Blasencarcinom und einem Patienten mit einer akuten promyelocytischen Leukämie.
Bearbeitung der Blutproben/RNA-Extraktion
4 ml von mit Antikoagulantien behandeltem venösem Vollblut wurde mit 3 ml eiskalter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gemischt und dann vorsichtig in einem 15 ml-Polypropylen-Röhrchen auf 8 ml Ficoll (Pharmacia, Uppsala, Schweden) überschichtet. Die Röhrchen wurden für 30 Minuten bei 4° C bei 200 × g abzentrifugiert. Mit einer sterilen Pasteurpipette wurde die Buffy-Coat-Schicht (ungefähr 1 ml) vorsichtig abgezogen und in einem 50 ml Polypropylen-Röhrchen bis auf 50 ml mit eiskalter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung zurückverdünnt. Dieses Röhrchen wurde dann bei 2000 × g für 30 Minuten bei 4° C zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgeschüttet und man ließ das Pellet durch Abtropfen trocknen. Ein ml RNazol B wurde dann zu dem Pellet hinzugefügt und Gesamt-RNA wurde nach den Vorschriften des Herstellers (Cinna/Biotecx, Houston, TX) isoliert. Die Konzentration und die Reinheit der RNA wurden mittels UV-Spektroskopie auf einem Beckman DU 640 Spektrophotometer und mittels Gelanalyse bestimmt.
Bestimmung der Sensitivität der PCR
RNA wurde aus LNCaP-Zellen und aus Gemischen von LNCaP- und MCF-7-Zellen in festgelegten Verhältnissen (d.h. 1:100, 1:1000 etc.) unter Verwendung von RNazol B isoliert. Es wurde dann eine verschachtelte PCR wie nachstehend beschrieben sowohl mit PSA- als auch mit PSM-Primern durchgeführt, um die Nachweisgrenze für den Assay zu bestimmen. LNCaP:MCF-7 (1:100.000) -cDNA wurde mit destilliertem Wasser verdünnt, um Konzentrationen von 1:1.000.000 und von 1:10.000.000 zu erhalten. Die MCF-7-Zellen wurden gewählt, weil diese zuvor getestet worden sind und man mittels PCR gezeigt hat, dass sie kein PSM exprimieren.
Polymerasekettenreaktion
Die verwendeten äußeren PSA-Primer umspannen Teile der Exons 4 und 5, um ein 486 bp großes PCR-Produkt zu ergeben und ermöglichen die Differenzierung zwischen der Amplifikation von cDNA und von möglicherweise kontaminierender genomischer DNA. Die stromaufwärts gelegene Primersequenz, die bei Nucleotid 494 in der cDNA-Sequenz von PSA beginnt, ist 5'-TACCCACTGCATCAGGAACA-3' (SEQ ID NO: 39) und der stromabwärts gelegene Primer bei Nucleotid 960 ist 5'-CCTTGAAGCACACCATTACA-3' (SEQ ID NO: 40). Der innere stromaufwärts gelegene Primer (der bei Nucleotid 559 beginnt) 5'-ACACAGGCCAGGTATTTCAG-3' (SEQ ID NO: 41) und der stromabwärts gelegene Primer (bei Nucleotid 894) 5'-GTCCAGCGTCCAGCACACAG-3' (SEQ ID NO: 42) ergeben ein 355 bp großes PCR-Produkt. Alle Primer wurden von der MSKCC Microchemistry Core Facility synthetisiert. 5 g Gesamt-RNA wurde in einem Gesamtvolumen von 20 l mit Reverse Transkriptase in cDNA überschrieben, wobei Superscript Reverse Transkriptase (Gibco-BRL) nach den Vorschriften des Herstellers eingesetzt wurde. 1 l dieser cDNA diente als die Start-Matrize für die PCR-Reaktion mit den äußeren Primern. Das 20 l-PCR-Gemisch enthielt: 0,5 U Taq Polymerase (Promega Corp, Madison, WI), Promega Reaktionspuffer, 1,5 mM MgCl₂, 200 mM dNTPs und 1,0 M von jedem Primer. Das Gemisch wurde dann in ein Perkin Elmer 9600 DNA-PCR-Gerät überführt und für 25 Zyklen inkubiert. Das PCR-Profil war wie folgt: 94° C für 15 Sek., 60° C × 15 Sek. und 72° C für 45 Sek. Nach 25 Zyklen wurden die Proben auf Eis gestellt und 1 l dieses Reaktionsgemisches diente als Matrize für eine andere RCR-Runde unter Verwendung der inneren Primer. Das erste Set von Röhrchen wurde in das PCR-Gerät für zusätzliche 25 Zyklen zurückgestellt. Die PSM-PCR erforderte die Auswahl von Primerpaaren, welche ebenfalls ein Intron umspannten, um sicher zu sein, dass cDNA und nicht genomische DNA amplifiziert wurde. Da die genomische DNA-Sequenz von PSM noch nicht bestimmt worden ist, beinhaltete dies das Ausprobieren von verschiedenen Primerpaaren, bis ein Paar gefunden wurde, welches ein PCR-Produkt der erwarteteten Größe erzeugte, wenn cDNA amplifiziert wurde, aber das keine Bande von einer genomischen DNA-Matrize erzeugte, was auf das Vorliegen eines großen Introns hindeutete. Die äußeren PSM-Primer ergeben ein 946 bp großes Produkt und die inneren Primer ein 434 bp großes Produkt. Der verwendete stromaufwärts gelegene äußere PSM-Primer war 5'-ATGGGTGTTTGGTATTGACC-3' (SEQ ID NO: 43) (beginnend bei Nucleotid 1401) und der stromabwärts gelegene Primer (bei Nucleotid 2348) war 5'-TGCTTGGAGCATAGATGACATGC-3' (SEQ ID NO: 44). Der innere stromaufwärts gelegene PSM-Primer (bei Nucleotid 1581) war 5'-ACTCCTTCAAGAGCGTGGCG-3' (SEQ ID NO: 45) und der stromabwärts gelegene Primer (bei Nucleotid 2015) war 5'-AACACCATCCCTCCTCGAACC-3' (SEQ ID NO: 46). Die verwendete cDNA war dieselbe wie für den PSA-Assay. Das 50 l PCR-Gemisch enthielt: 1 U Taq-Polymerase (Promega), 250 mM dNTPs, 10 mM β-Mercaptoethanol, 2 mM MgCl₂ und 5 l eines 10 × Puffergemisches, enthaltend: 166 mM NH₄SO₄, 670 mM Tris, pH 8,8 und 2 mg/ml acetyliertes BSA. Die PCR wurde in einem Perkin-Elmer 480 DNA PCR-Gerät mit den folgenden Parametern durchgeführt: 94° C × 4 Minuten für 1 Zyklus, 94° C × 30 Sek., 58° C × 1 Min. und 72° C × 1 Minute für 25 Zyklen, gefolgt von 72° C × 10 Minuten. Die Proben wurden dann auf Eis gestellt und 2 l dieses Reaktionsgemisches wurden als Matrize für weitere 25 Zyklen mit einem neuen Reaktionsgemisch eingesetzt, das die innneren PSM-Primer enthielt. Die Qualität der cDNA wurde überprüft, indem Kontrollreaktionen unter Verwendung von Primern durchgeführt wurden, welche von β-Actin abgeleitet waren, die ein 446 bp großes PCR-Produkt ergaben. Der verwendete stromaufwärts gelegene Primer war 5'-AGGCCAACCGCGAGAAGATGA-3' (SEQ ID NO: 47) (Exon 3) und der stromabwärts gelegene Primer war 5'-ATGTCACACTGGGGAAGC-3' (SEQ ID NO: 48) (Exon 4). Das gesamte PSA-Gemisch und 10 l von jedem PSM-Reaktionsgemisch ließ man auf 1,5-2% Agarosegelen laufen, die mit Ethidiumbromid gefärbt und in einem Eagle Eye Video Imaging System (Stratagene, Torrex Pines, CA) photographiert wurden. Die Assays wurden mindestens 3 Mal wiederholt, um die Ergebnisse zu überprüfen.
Clonierung und Sequenzierung der PCR-Produkte
Die PCR-Produkte wurden in den pCR II-Plasmidvektor cloniert, wobei das TA Cloning System (Invitrogen) verwendet wurde. Diese Plasmide wurden mit Hilfe von Standardmethoden (13) in kompetente E. coli-Zellen transformiert und Plasmid-DNA wurde mit Hilfe von Magic Minipreps (Promega) isoliert und mittels Restriktionsanalyse durchmustert. TA-Clone wurden dann mit der Didesoxy-Methode (14) sequenziert, wobei Sequenase (U.S. Biochemical) verwendet wurde. 3-4 g von jedem Plasmid wurden mit NaOH denaturiert und Ethanol-präzipitiert. Markierungsreaktionen wun nach den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt, wobei ³⁵S-dATP (NEN) verwendet wurde, und die Reaktionen wurden wie in demselben Protokoll diskutiert gestoppt. Die Sequenzierungsprodukte wurden dann auf 6% Polyacrylamid/7M Harnstoff-Gelen untersucht, die man bei 120 Watt für 2 Stunden laufen ließ. Die Gele wurden für 20 Minuten in 10% Methanol/10% Essigsäure fixiert, auf Whatman 3MM-Papier transferiert und in einem Vakuumtrckner für 2 Stunden bei 80° C heruntergetrocknet. Die Gele wurden dann bei Raumtemperatur für 18 Stunden autoradiographiert.
Southern-Analyse
Ethidium-gefärbte Agarose-Gele von PCR-Produkten wurden für 15 Minuten in 0,2 N HCl getränkt, gefolgt von jeweils 30 Minuten in 0,5 N NaOH/1,5 M NaCl und 0,1 M Tris, pH 7,5/1,5 M NaCl. Die Gele wurden dann für 10 Minuten in 10 × SSC (1,5 M NaCl/0,15 M Natriumcitrat) äquilibriert. Die DNA wurde in 10 × SSC mittels Druckblotting mit einem Positive-Blotter (Stratagene) auf Nytran Nylonmembranen (Schleicher und Schuell) transferiert. Die DNA wurde mit der Membran vernetzt, wobei ein UV-Stratalinker (Stratagene) eingesetzt wurde. Die Blots wurden für 2 Stunden bei 65° C prähybridisiert und anschließend mit denaturierten ³²P-markierten „random primed" cDNA-Sonden (entweder PSM oder PSA) hybridisiert (9, 15). Die Blots wurden für jeweils 20 Minuten zwei Mal bei 42° C in 1 × SSPE/0,5% SDS und zwei Mal bei 50° C in 0,1 × SSPE/0,5% SDS gewaschen. Die Membranen wurden Luft-getrocknet und für 30 Minuten bis zu 1 Stunde bei –70° C mit Kodak X-Omat-Film autoradiographiert.
Experimentelle Ergebnisse
Unsere Methode der PCR-Amplifikation mit verschachtelten Primern verbesserte unsere Nachweisgrenze von Prostatazellen von ungefähr einer Prostatazelle pro 10.000 MCF-7-Zellen auf weniger als eine Zelle pro Million MCF-7-Zellen, wenn entweder die PSA- oder die PSM-abgeleiteten Primer (26 und 27) eingesetzt wurden. Dies stellt eine substanzielle Verbesserung in unserer Fähigkeit dar, minimale Krankheit zu entdecken. Die Charakteristika der 16 untersuchten Patienten mit Hinblick auf ihr klinisches Stadium, ihre Behandlung, PSA- und PSM-Serumwerte und die Ergebnisse unseres Assays sind in der Tabelle 1 gezeigt. Insgesamt wies die PSA-PCR Tumorzellen in 2/30 Patienten (6,7%) nach, wohingegen die PSM-PCR Zellen in 19/30 Patienten (63,3%) nachwies. Es gab keine Patienten, die mit PSA, aber nicht mit PSM positiv für Tumorzellen waren, wohingegen PSM 8 positive Patienten lieferte, die mit PSA nicht nachgewiesen wurden. Die Patienten 10 und 11 in Tabelle 1, beide mit sehr weit fortgeschrittener Hormon-refraktärer Krankheit, wurden sowohl mit PSA als auch mit PSM nachgewiesen. Beide dieser Patienten sind seit der Zeit, zu der diese Proben erhalten wurden, gestorben. Die Patienten 4, 7 und 12, von denen alle mit einer radikalen Prostatektomie für eine klinisch lokalisierte Krankheit behandelt wurden und von denen alle 1-2 Jahre postoperativ nicht messbare PSA-Serumwerte haben, waren positiv für zirkulierende Prostatatumorzellen mit der PSM-PCR, aber negativ mit der PSA-PCR. Eine Photographie eines repräsentativen Ethidium-gefärbten Gels für die PSM-PCR ist in 28 gezeigt. Die in Spur A gelaufenen Proben stellen PCR-Produkte dar, die von den äußeren Primern erzeugt worden sind, und bei den Proben in den mit B markierten Spuren handelt es sich um Produkte der inneren Primerpaare. Die entsprechende Autoradiographie des PSM-Southern Blots ist in 29 gezeigt. Die Sensitivität der Southern Blot-Analyse übertraf diejenige der Ethidiumfärbung, wie man bei mehreren Proben sehen kann, bei denen das äußere Produkt auf 28 nicht sichtbar ist, aber durch Southern Blotting wie in 29 gezeigt nachweisbar ist. Außerdem scheint die Probe 3 auf den 28 und 29 (Patient 6 in 30) sowohl äußere als auch innere Banden zu enthalten, die kleiner sind als die entsprechenden Banden in den anderen Patienten. Eine DNA-Sequenzierung hat bestätigt, dass die Nucleotidsequenz dieser Banden mit der Ausnahme einer kleinen Deletion mit der von PSM übereinstimmt. Dies kann entweder ein PCR-Artefakt, alternatives Spleißen der PSM-mRNA in diesem Patienten oder eine PSM-Mutation darstellen. Wir haben ähnliche Befunde bei mehreren Gelegenheiten mit anderen Proben bemerkt (unveröffentlichte Daten). Alle Proben, die sequenziert und mittels Southern Blot-Analyse untersucht worden sind, sind als echte Positive für PSA und PSM bestätigt worden.
Experimentelle Details
Die Fähigkeit, das Stadium der Patienten mit Prostatakrebs zum Zeitpunkt der Diagnose genau zu bestimmen ist für die Auswahl der geeigneten Therapie und zur Vorhersage der Langzeit-Reaktion auf die Behandlung und eine mögliche Heilung von allerhöchster Bedeutung. Die Stadienbestimmung vor dem chirurgischen Eingriff besteht aus einer körperlichen Untersuchung, Bestimmungen des Serum-PSA und PAP, und zahlreichen bildgebenden Verfahren einschließlich einer transrektalen Ultrasonographie, CT-Scanning, Knochenscans mit Radionucliden und sogar MRI-Scanning. Kein derzeitiges Verfahren adressiert jedoch das Problem der hämatogenen mikrometastatischen Krankheit und den möglichen negativen Einfluss auf die Prognose, welchen diese bewirken kann. Eine frühere Arbeit hat gezeigt, dass nur ein Bruchteil des Prozentsatzes der zirkulierenden Tumorzellen sich unvermeidbar weiterentwickeln, um eine feste Metastase zu bilden (16), jedoch kann sich die Entdeckung von und die mögliche Quantifizierung der Belastung der zirkulierenden Tumorzellen als wertvoll erweisen, die Stadien der Krankheit genauer zu bestimmen. Die Langzeitwirkung der hämatogenen mikrometastatischen Krankheit muss durch einen Vergleich der klinischen Verläufe von Patienten, bei denen man diese Zellen in deren Kreislauf findet, mit Patienten eines ähnlichen Stadiums und Behandlung, die negativ getestet werden, untersucht werden.
Die signifikant niedrigere Nachweisgrenze von Tumorzellen mit PSM im Vergleich zu PSA ist nicht überraschend für uns, da wir eine eine beständigere Expression von PSM in Prostatacarcinomen aller Stadien und Schweregrade im Vergleich zu der veränderlichen Expression von PSA in weniger differenzierten und anaplastischen Prostatakrebs-Erkrankungen beobachtet haben. Wir waren erstaunt, Tumorzellen in den drei Patienten nachzuweisen, die sich einer radikalen Prostatektomie unterzogen hatten mit anschließend nicht nachweisbaren Mengen von Serum-PSA. Man würde annehmen, dass diese Patienten nach Standardkriterien chirurgisch geheilt sind, dennoch scheinen sie weiterhin Prostatatumorzellen zu beherbergen. Es wird interessant sein, den klinischen Verlauf dieser Patienten im Vergleich zu anderen ohne PCR-Befund von restlicher Krankheit zu verfolgen. Wir untersuchen derzeit eine größere Anzahl von Patientenproben, um diese Befunde zu überprüfen und vielleicht Patienten zu identifizieren, die ein Risiko für eine metastatische Krankheit haben.
Literaturverzeichnis

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Vierte Serie von Experimenten
EXPRESSION DES PROSTATA-SPEZIFISCHEN MEMBRANANTIGENS (PSM) VERRINGERT DIE MITOGENE STIMULIERUNG VON AGGRESSIVEN MENSCHLICHEN PROSTATACARCINOM-ZELLEN DURCH TRANSFERRIN
Von verschiedenen Forschern ist eine Assoziation zwischen Transferrin und menschlichem Prostatakrebs vorgeschlagen worden. Es ist gezeigt worden, dass die exprimierten prostatischen Sekrete von Patienten mit Prostatakrebs im Hinblick auf ihren Gehalt an Transferrin angereichert sind und dass Prostatakrebszellen reich an Transferrinrezeptoren sind (J. Urol. 143: 381, (1990)). Es ist gezeigt worden, dass vom Knochenmark abgeleitetes Transferrin selektiv das Wachstum von aggressiven Prostatakrebszellen stimuliert (PNAS 89: 6197 (1992)). Wir haben früher über die Clonierung der cDNA berichtet, welche das 100 kDa große PSM-Antigen codiert (Cancer Res. 53: 208 (1993)). Eine DNA-Sequenzanalyse hat gezeigt, dass ein Teil der codierenden Region von Nucleotid 1250 bis 1700 eine 54%ige Homologie zu dem menschlichen Transferrinrezeptor besitzt. PC-3-Zellen exprimieren keine PSM-mRNA oder -Protein und zeigen erhöhtes Zellwachstum in Reaktion auf Transferrin wohingegen LNCaP-Prostatakrebszellen, die hohe Mengen von PSM exprimieren, eine sehr schwache Reaktion auf Transferrin aufweisen. Um festzustellen, ob die PSM-Expression durch Prostatakrebszellen sich auf deren mitogene Reaktion auf Transferrin auswirkt, transfizierten wir die Volllänge-PSM-cDNA stabil in die PC-3-Prostatakrebszellen. Clone, die hohe Mengen an PSM-mRNA exprimierten, wurden durch Northern-Analyse identifiziert und die Expression des PSM-Proteins wurde durch eine Western-Analyse überprüft, wobei der monoclonale Anti-PSM-Antikörper 7E11-C5.3 eingesetzt wurde.
Wir plattierten 2 × 10⁴ PC-3- oder mit PSM transfizierte PC-3-Zellen pro Vertiefung in RPMI-Medium aus, das mit 10% fötalem Rinderseum supplementiert war, und fügten nach 24 Stunden 1 μg pro ml Holotransferrin zu den Zellen hinzu. Die Zellen wurden an Tag 1 als hoch mitogen auf die PC-3-Zellen gezählt. Die Zellen wurden am Tag 1 gezählt, um die Plattierungseffizienz zu bestimmen, und am Tag 5, um die Wirkung von Transferrin zu bestimmen. Die Experimente werden wiederholt, um die Ergebnisse zu überprüfen.
Wir stellten fest, dass die PC-3-Zellen einen durchschnittlichen Anstieg von 275% über die Kontrollen erfuhren wohingegen die LNCaP-Zellen nur zu 43% stimuliert wurden. Wachstumskinetiken zeigten, dass die mit PSM transfizierten PC-3-Zellen 30% langsamer wuchsen als native PC-3-Zellen. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Expression von PSM in aggressiven, metastatischen menschlichen Prostatakrebszellen deren mitogene Reaktion auf Transferrin signifikant außer Kraft setzt.
Die Verwendung von therapeutischen Impfstoffen, welche aus Cytokin-sezernierenden Tumorzellpräparationen zur Behandlung einer bestehenden Prostatakrebserkrankung bestehen, wu in dem Dunning R3327-MatLyLu-Prostataadnocarcinommodell der Ratte untersucht. Nur IL-2 sezernierende bestrahlte Tumorzellpräparationen ware in der Lage, Tiere von subkutan etablierten Tumoren zu heilen und erzeugten ein immunologisches Gedächtnis, welches die Tiere vor einer anderen Exposition mit dem Tumor schützte. Die Immuntherapie war weniger wirksam, wenn die Tumore orthotop induziert wurden, aber nichtsdestotrotz führten sie zu einem verbesserten Ergebnis, indem sie das Wiederauftreten von Tumoren nach einer Resektion der krebsbefallenen Prostata signifikant verzögerten und gelegentlich verhinderten. Die Induktion einer starken Immunantwort in Tieren, die einen Tumor tragen, gegen den nicht immunogenen MatLyLu-Tumor unterstützt die Ansicht, dass eine aktive Immuntherapie gegen Prostatakrebs therapeutischen Nutzen aufweisen kann.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nucleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Nucleinsäure, die ein menschliches Prostata-spezifisches Membranantigen-Polypeptid mit der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Sequenz codiert; (b) einer Nucleinsäure mit der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz oder ein Fragment davon, das einen antigenischen Bereich codiert, gegen den ein Antikörper erzeugt werden kann, der spezifisch gegen menschliches Prostata-spezifisches Membranantigen mit der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Sequenz ist; und (c) einer Nucleinsäure mit mindestens 15 aufeinanderfolgenden Nucleotiden der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz, oder der komplementäre Strang davon.
Nucleinsäure, die ein menschliches Prostata-spezifisches Membranantigen-Polypeptid mit der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Sequenz codiert.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, wobei der antigenische Bereich eine Sequenz hat, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) Asp-Glu-Leu-Lys-Ala-Glu (SEQ ID NO: 35); (b) Asn-Glu-Asp-Gly-Asn-Glu (SEQ ID NO: 36); (c) Lys-Ser-Pro-Asp-Glu-Gly (SEQ ID NO: 37); (d) (i) Asp-Glu-Leu-Lys-Ala-Glu (SEQ ID NO: 35); (ii) Asn-Glu-Asp-Gly-Asn-Glu (SEQ ID NO: 36); und (iii) Lys-Ser-Pro-Asp-Glu-Gly (SEQ ID NO: 37); (e) der äußeren Membrandomäne des menschlichen Prostata-spezifischen Membranantigens; und (f) einer hydrophilen Aminosäuresequenz des menschlichen Prostata-spezifischen Membranantigens.
Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder 3, umfassend Nucleotide mit der in SEQ ID NO:1 gezeigten Sequenz.
Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Nucleinsäure DNA oder cDNA ist.
Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Nucleinsäure RNA ist.
Nucleinsäure nach Anspruch 5 oder 6, die funktionell mit einem Promoter der RNA-Transkription verbunden ist.
Vektor, umfassend die Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
Vektor nach Anspruch 8, wobei der Vektor ein Plasmid, Cosmid, Bakteriophage oder ein anderes Virus ist.
Vektor nach Anspruch 9, wobei der Vektor das Plasmid ist, das als P55A-PSM (ATCC 75294) bezeichnet ist.
Wirt-Vektorsystem zur Herstellung eines Polypeptids, wobei das Wirt-Vektorsystem den Vektor nach einem der Ansprüche 8 bis 10 und eine geeignete Wirtszelle umfaßt.
Wirt-Vektorsystem nach Anspruch 11, wobei die geeignete Wirtszelle eine Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder Säugerzelle ist.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, umfassend das Züchten des Wirt-Vektorsystems nach Anspruch 11 oder 12 unter geeigneten Bedingungen, welche die Herstellung des Polypeptids erlauben, und das Ernten des so hergestellten Polypeptids.
Säugerzelle, die den Vektor nach einem der Ansprüche 8 bis 10 umfaßt.
Polypeptid mit der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Sequenz des menschlichen Prostata-spezifischen Membranantigens oder ein antigenischer Bereich, der eine hydrophile Aminosäuresequenz des menschlichen Prostata-spezifischen Membranantigens ist, wobei das Polypeptid verwendet werden kann, um Antikörper zu erzeugen, die spezifisch gegen das menschliche Prostata-spezifische Membranantigen sind, mit der Maßgabe, dass der antigenische Bereich nicht aus der in SEQ ID NO: 35 gezeigten Sequenz besteht.
Polypeptid nach Anspruch 15, wobei das Polypeptid aus der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Sequenz von menschlichem Prostata-spezifischen Membranantigen besteht oder einem antigenischen Bereich, der eine hydrophile Aminosäuresequenz von menschlichem Prostata-spezifischen Membranantigen ist, gegen den Antikörper erzeugt werden können, die spezifisch gegen menschliches Prostata-spezifisches Membranantigen sind, mit der Maßgabe, dass der antigenische Bereich nicht aus der in SEQ ID NO: 35 gezeigten Sequenz besteht.
Polypeptid mit der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Sequenz menschlichen Prostata-spezifischen Membranantigens.
Monoclonaler Antikörper, der gegen menschliches Prostata-spezifisches Membranantigen gerichtet ist, wobei die Sequenz des Antigens in SEQ ID NO:2 gezeigt ist.
Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 18, der an einen antigenischen Bereich des menschlichen Prostata-spezifischen Membranantigens bindet, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) Asp-Glu-Leu-Lys-Ala-Glu (SEQ ID NO: 35); (b) Asn-Glu-Asp-Gly-Asn-Glu (SEQ ID NO: 36); (c) Lys-Ser-Pro-Asp-Glu-Gly (SEQ ID NO: 37); (d) der äußeren Membrandomäne des menschlichen Prostata-spezifischen Membranantigens; und (e) einer hydrophilen Aminosäuresequenz des menschlichen Prostata-spezifischen Membranantigens.
Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 18 oder 19, zusätzlich dadurch gekennzeichnet, dass er an die Oberfläche einer Prostatakrebszelle binden kann.
Zusammensetzung, umfassend den monoclonalen Antikörper nach Anspruch 19 oder 20.
Zusammensetzung nach Anspruch 21, zusätzlich umfassend einen an den Antikörper konjugierten Wirkstoff.
Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei der Wirkstoff ein zur Darstellung geeigneter Wirkstoff, ein therapeutischer Wirkstoff, ein Toxin oder ein cytotoxischer Wirkstoff ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 21 bis 23, umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Zusammensetzung nach Anspruch 21, die eine pharmazeutische Zusammensetzung ist, umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Monoclonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 18 bis 20 oder eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 21 bis 25 zur Verwendung in der Prostatakrebstherapie oder -diagnose.
Verwendung eines monoclonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 18 bis 20 oder der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 21 bis 23 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Prostatakrebs in einem menschlichem Patienten.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 21 bis 25 für die Herstellung eines Diagnostikums zur Darstellung von Prostatakrebs in einem Subjekt.
Immunassay zum Messen der Menge an menschlichem Prostata-spezifischen Membranantigen in einer biologischen Probe, umfassend die Schritte: (a) Inkontaktbringen der biologischen Probe mit mindestens einem monoclonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 18 bis 20 oder der Zusammensetzung nach Anspruch 22 oder 23, um einen Komplex zwischen dem Antikörper und einem menschlichen Prostata-spezifischen Membranantigen, das in der Probe vorhanden ist, zu bilden; und (b) Messen der Menge des menschlichen Prostata-spezifischen Membranantigens in dem Komplex, so dass dadurch die Menge an menschlichem Prostata-spezifischen Membranantigen in der biologischen Probe gemessen wird.
Verwendung einer markierten Nucleinsäure nach Anspruch 1(c) für die Herstellung eines Diagnostikums zum Nachweisen der Expression eines menschlichen Prostata-spezifischen Membranantigens in einer Zelle oder in einem Gewebeschnitt in einer Probe.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei die Probe Blut, Lymphknoten oder Knochenmark ist.