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Die
Erfindung bezieht sich auf bestimmte antigenische Peptide nützlich als
ein Impfstoff zur Behandlung und Verhinderung von Krebs, und Antikörper, die
gegen diese gerichtet sind.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Krebs
(„Krebs
ist ein bösartiger
Tumor," wobei Tumor
eine abnormale Gewebsmasse ist, die nicht bösartig zu sein braucht; „Neoplasie" ist eine Form von
neuem Wachstum) ist eine Hauptursache für den Tod von Männern und
Frauen überall
auf der Welt. In den Vereinigten Staaten werden alleine über 1 Million
neue Fälle jedes
Jahr diagnostiziert, und über
0.5 Millionen Todesfälle
werden jährlich
gemeldet (Landis et al., 1998). Aus historischen Gründen werden
Tumore teilweise basierend auf den Geweben, in denen sie entstehen – zum Beispiel
Brustkrebs, Darmkrebs und Lungenkrebs, und ähnliche – gruppiert und behandelt.
Es ist jedoch, zum Beispiel, bei Lungenkrebs sehr bekannt, dass
diese Tumoren eine sehr heterogene Gruppe von Neoplasien sind. Zum
Teil wegen dieser Heterogenität
gibt es komplexe und inkonsistente Klassifikationsschemata, die
für menschliche
Tumoren verwendet werden. Frühere
Versuche Krebs zu behandeln wurden erschwert durch: (1) die willkürliche Klassifikation
von Tumoren, die innerhalb bestimmter Gewebe entstehen, und (2)
die Verwendung mikroskopischer Verfahren basierend darauf, wie diese
Tumoren aussehen (histologische Klassifikation). Obgleich die existierenden
Klassifikationen für
verschiedene Tumortypen einen gewissen prognostischen Wert besitzen,
scheitern falls alle Klassifikationen daran, die Wirkung von Therapien
und die Wahrscheinlichkeit von Heilung oder Krankheitsverlauf zu
prognostizieren. Verbesserte Klassifikationsschemata basierend auf
der biologischen Beschaffenheit dieser Neoplasien werden gebraucht,
um signifikant die Überlebensstatistiken
von Menschen, die Krebs haben, zu ändern. Ein Ansatz diese Probleme
zu lösen
ist es, Moleküle
spezifisch für
die Tumore zu lokalisieren, vorzugsweise Antigene auf Molekülen, die
Marker für
Krebszellen sind. (Ein „Marker" ist hier definiert
als jede Eigenschaft, die verwendet werden kann, um Krebs von normalen
Geweben und von anderen Krankheitszuständen zu unterscheiden.) Das
Vorhandensein der Marker ist dann die Basis für die Klassifikation.
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Monoklonale
Antikörper
(MCAs) hergestellt durch somatische Zellhybridisierungstechniken,
gewöhnlich
in Mäusen,
sind nützliche
molekulare Sonden für
die Detektion und Unterscheidung von zellulären Antigenen, und haben daher
großes
Potential bei der Detektion Krebs assoziierter Antigene. Diese Antikörper binden an
spezifische Antigene und die Bindung ist detektierbar durch wohl
bekannte Verfahren. Wenn es zur Bindung kommt, wird der Schluss
gezogen, dass ein spezifisches Antigen vorliegt. Diejenigen Krebs
assoziierten Antigene, die zur Zelloberfläche hin exponiert sind oder
in der Krebsmasse gefunden werden, sind molekulare Ziele für die Immunsysteme
(einschließlich
Wirtsantikörpern)
des Wirts. Kürzlich
gewonnene Erkenntnisse legen nah, dass es Krebspatienten, die Antikörper gegen
ihre Tumore haben, besser ergeht als denjenigen, die diesen Typ
von Immunantwort nicht zu Stande bringen (Livingston et al., 1994).
Daher sind natürliche
induzierte oder verabreichte Antikörper ein viel versprechender
therapeutischer Ansatz.
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Die
Humanisierung von nicht-humanen MCAs (der Vorgang durch den nicht
humane MCA reaktive Stellen in klonierte humane Antikörper geschleust
und exprimiert werden) führt
zu reduzierter Immunogenität der
fremden Antikörper
ohne den Verlust ihrer spezifischen Bindung in in vivo oder in ex
vivo Anwendungen. MCAs können
Anwendung finden in in vivo Visualierungsagentien, diagnostischen
Tests, und für
die Therapie (Radosevich et al., 1988, 1990; Rosen et al., 1988).
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Impfstofftherapie
ist ein sehr etablierter Ansatz, darauf zielend eine Immunantwort
zu induzieren, ohne Exponieren gegenüber dem verursachenden Agens
einer Krankheit oder eines Zustandes. Viele Impfstoffe sind verfügbar, um,
zum Beispiel, eine Reaktion in einem Wirt gegenüber bakteriellen oder viralen
Agentien zu stimulieren. Die Verwendung von Tumor assoziierten Antigenen
(Markern) in einem Impfstoff könnte
das Auftreten von primärem
Krebs verhindern, und könnte
auch ein Mittel zur Verfügung
stellen, um das Wiederauftreten der Krankheit zu verhindern.
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Gentherapie
ist ein Mittel, durch das die genetische Anlage von Zellen modifiziert
wird, um das interessierende Gen zu exprimieren. Es gibt viele Formen
der Gentherapie einschließlich:
Genaustausch, Antisense Suppressionstherapie und Ersatzgenexpression.
Das Entdecken von Genen, die für
Krebs assoziierte vorzugsweise Krebs spezifische Antigene (Marker)
kodieren, öffnet
die Tür
zur genetischen Intervention gegen die Krebszellproliferation. Der
genaue und konsistente Gebrauch von einem Krebsmarker zur Unterscheidung des
kanzerösen
vom normalem Gewebe, besitzt nicht nur diagnostisches Potential,
sondern ist auch wünschenswert
für Behandlung
und die Prognose. Daher wurden solche Marker gesucht.
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Kürzliche
vorgenommene Studien zeigten, dass das Enzym, das für humane
Aspartyl Beta-Hydoxylase
(HAAH) kodiert, in einigen humanen Adenocarcinomazelllinien und
primären
hepatozellulären
Krebsarten überexprimiert
wird, und daher ein Marker sein könnte. Das Gen, das für HAAH kodieren
soll, wurde geklont und sequenziert (Gronke et al., 1989, 1990;
Wang et al., 1991; Jia et al., 1992, 1994; Korioth et al., 1994;
Lavaissiere et al., 1996). Jedoch ist im Allgemeinen wenig über HAAH
Expression in humanen Tumoren bekannt (Lavaissiere et al., 1996).
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Die
Studie des HAAH Enzyms erwuchs aus einer Studie seines bovinen Gegenstücks (Gronke
et al., 1989, 1990; Wang et al., 1991; Jia et al., 1992). Bovine
Aspartyl Beta-Hydroxylase ist ein intrazelluläres glykosiliertes Protein,
lokalisiert im rauen endoplasmatischen Retikulum. Es wurde berichtet,
dass das Protein drei Molekül
Hauptformen besitzt; eine 85 Kilodalton Form, und zwei aktive Formen
mit Molekulargewichten von 56 und beziehungsweise 52 Kilodalton
(Lavaissiere et al., 1996). Unter der Verwendung von Standard biochemischen
Verfahren wurde bovine Beta-Hydroxylase
(bAAH) aufgereinigt und charakterisiert (Gronke et al., 1989, 1990;
Wang et al., 1991). Wie gezeigt wurde, korreliert die Aktivität des Enzyms
mit den 52 und 56 Kilodalton Formen, die aufgereinigt wurden.
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Immunologisch
wurde auch eine verwandte Form mit höherem Molekulargewicht beobachtet
(85-90 Kilodalton).
Als Teil der Aufreinigung wird bAAH an Con A Sepharose gebunden,
was konsistent ist mit der Schlussfolgerung, dass das Enzym glykolisiert
ist. (Spätere
Berichte über
die DNA Sequenz zeigten drei mögliche
Glykolisierungsstellen auf, wobei die eine Stelle sehr nah an der
bekannten aktiven Enzymdomäne
ist.) Das Protein ist in der Natur sehr sauer und eine Detergenz
ist nicht notwendig, um die aktive Fraktion zu solubilisieren. Die
aktive Enzymstelle des biochemisch isolierten bovinen Proteins (bAAH)
ist abhängig
von dem Vorhandensein eines Histidins an Position 675 (Jia et al.,
1992).
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Eine
Teilaminosäuresequenz
wurde für
HAAH erhalten. DNA Sonden (eine DNA Sonde ist ein Molekül mit einer
Nukleotidsequenz, die in der Lage ist an eine spezifische Nukleotidsequenz
unter bestimmten Bedingungen zu binden) abgeleitet aus dieser Aminosäuresequenz
wurden verwendet, um eine bovine cDNA Bibliothek zu durchmustern
(Jia et al., 1992). (Eine cDNA Bibliothek enthält die Abschnitte der DNA,
die für
Genprodukte kodieren – zum
Beispiel, Peptide, im Gegensatz zu genomischer DNA). Zahlreiche überlappende cDNA
Sequenzen in der Bibliothek enthielten eine 764 Aminosäure offene
Leserahmen (ORF) Sequenz, von der angenommen wird, dass sie ein
85 Kilodalton Protein kodiert. In dieser ORF Sequenz waren auch
zwei andere mögliche
Startcodons vorhanden, das heißt,
die Stellen, an denen das Kodieren beginnt. Den meisten 3' Startkodons ging
eine Ribosomenbindungsstelle voraus. Translation des Klons mit dieser
Sequenz resultierte in einem Protein, das ungefähr 85 Kilodalton besitzt. Antiserum
wurde gegen die Membranfraktion der humanen MG-63 Zellen erzeugt
und wurde verwendet, um eine cDNA Bibliothek, hergestellt aus MG-63
Zellen, immunologisch zu durchmustern. Daten über einen Klon wurden berichtet,
der ein 757 Aminosäureprotein
kodieren könnte,
und es stellt sich durch Sequenzanalyse heraus, dass er eine starke
N-terminale Homologie mit bAAH besitzt (Korioth et al., 1994). Wenn
dieser Klon in einem in vitro Translationssystem verwendet wurde (einem
künstlichen
Cocktail aus normalem Zellzytoplasma, der verwendet wird um mRNA
in Protein umzuwandeln), wurde ein 56 Kilodalton Protein produziert.
Es wurde vorgeschlagen, dass dies auf post-translationale Spaltung
zurückzuführen ist.
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Das
HAAH Enzym ist verantwortlich für
die Modifikation der spezifischen Asparaginsäure Reste innerhalb der Epidermalen
Wachstumsfaktor artigen Domänen
der Proteine. Es war die These aufgestellt worden, dass diese modifizierten
Asparaginsäure
Reste es den Wachstumsfaktor artigen Domänen erlauben Kalzium bindende
Domänen
zu werden. (Gronke et al., 1989, 1990; Wang et al., 1991; Jia et
al., 1992, 1994; Korioth et al., 1994; Lavaissiere et al., 1996).
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Ein
mit HAAH verwandtes Enzym, Aspartyl Beta-Hydroxylase (AAH), wurden
zuerst untersucht, da es speziell ausgewählte Asparaginsäure oder
Asparagin Reste in einer Gruppe von biologisch wichtigen Proteinen
einschließlich
der Vitamin K-abhängigen
Gerinnungsfaktoren VII, IX, und X modifizierte. Andere Proteine, wie
C, S und Z besitzen auch diese Modifikation (Gronke et al., 1989,
1990; Wang et al., 1991; Jia et al., 1992, 1994; Korioth et al.,
1994; Lavaissiere et al., 1996). Wie sich zeigte, waren Asparaginsäure und
Asparagin Reste durch HAAH in Proteinen, die Wachstumsfaktor artigen
Domänen
enthielten, modifiziert. Die Funktion der Beta-Hydroxyasparaginsäure und
Beta-Hydroxyasparagin Reste ist unbekannt, jedoch wurde spekuliert,
dass diese Modifikation notwendig ist für die Kalzium Bindung in den
Wachstumsfaktor (EGF)-artigen Domänen bestimmter Proteinen.
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Antikörper wurden
gegen hepatozelluläre
Karzinoma FOCUS Zellen hergestellt (Lavaissiere et al., 1996). Ein
MCA reagierte mit einem Antigen, dass in hepatozellulären Karzinomas
hoch exprimiert wurde. Immunologische Durchmusterung unter Verwendung
dieses Antikörpers
und einer Lambda gt11 HepG2 Bibliothek resultierte in der Isolierung
einer Teil-cDNA, die nachfolgend verwendet wurde, um einen größeren Klon zu
isolieren.
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Es
wurde berichtet, dass eine humane Adenokarzinoma-Zelllinie mit der
Bezeichnung A549 hohe Niveaus an HAAH Aktivität besitzt (Lavaissiere et al.).
Ein muriner monoklonaler Antikörper
mit der Bezeichnung MCA 44-3A6 (U.S. Patent Nr. 4,816,402) wurde
gegen die humane Adenokarzinom-Zelllinie A549 (ATCC Zugriffsnummer
CCL 185) hergestellt (Radosevich et al., 1985). Der Antikörper erkannt
ein Zelloberflächen-,
nicht glykolisiertes antigenisches Protein mit einem geschätzten Molekulargewicht
von 40 kDa.
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Das
Antigen wurde durch A549 Zellen exprimiert, und es stellte sich
als guter Adenokarzinom Marker heraus; das heißt, es wurde häufig durch
Krebsarten exprimiert, die wie Adenomakarzinome aussahen, wenn sie
histologisch untersucht wurden (Radosevich et al., 1990a; Lee et
al., 1985). MCA 44-3A6 ist dadurch einzigartig, dass er der erste
monoklonale Antikörper
ist, der diese Bindungspezifität
besitzt. Die Ergebnisse eines „International
Workshop for Lung Cancer" bestätigten andere
zugehörige
publizierten Erkenntnisse über
MCA 44-3A6 (Stahel, 1994).
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Der
Antikörper
mit der Bezeichnung MCA 44-3A6 ist klinisch anwendbar, da er Antigene,
die mit Adenokarzinomas assoziiert sind, differenziert. Die normale
und fötale
Verteilung im Gewebe des Antigens ist auf einige Drüsengewebe
beschränkt
(Radosevich et al., 1991). Detektion kann in Formalin fixierten
Paraffin eingebettetem Gewebe vorgenommen werden (Radosevich et
al., 1985, 1988, 1990a, 1990b; Lee et al., 1985, 1986; Piehl et
al., 1988; Combs et al., 1988b, 1988c; Banner et al., 1985). Der
Antikörper
besitzt ein beschränktes
Bindungsmuster innerhalb humaner Lungentumore (Lee et al., 1985;
Banner et al., 1985; Radosevich et al., 1990a, 1990b).
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In
einer Studie an über
zweihundert Lungenkrebsen, wurde festgestellt, dass MCA 44-3A6 mit
allen getesteten Adenokarzinomen, vielen der getesteten Großzellkarzinomen,
wie auch mit einer Untergruppe von intermediären neuroendokrinen Kleinzell
Lungenkrebsen, gut differenzierten neuroendokrinen Kleinzell Karzinomen,
Carcinoiden, aber nicht Mesotheliomen reagiert. MCA 44-3A6 reagiert nicht
mit Akanthomen, bronchiolalveolaren Karzinomen, oder Kleinzellkarzinomen
(Lee et al., 1985). MCA 44-3A6 ist nützlich bei der Unterscheidung
von Adenokarzinomen, die in das Rippenfell aus dem Mesothelioma
metastatisch streuen (Lee et al., 1986). Der Antikörper besitzt
eine selektive Reaktivität
unter Adenokarzinomen und in Großzellkarzinomen (Piehl et al.,
1988; Radosevich et al., 1990b).
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In
einer Studie von über
40 Fällen
von Lungenkrebs, wobei zytologische und histologische Befunde verglichen
wurden, stellte es sich heraus, dass MCA 44-3A6 nützlich ist
bei der zytologische Diagnose und dies war konsistent mit dem histologischen
Befund (Banner et al., 1985). Histologie ist die Untersuchung von Geweben
(die aus Zellen gemacht sind). Zytologie ist die Untersuchung von
Zellen, die aus ihrem organisatorischen Kontext entfernt wurden,
der gewöhnlich
als Gewebe bezeichnet wird. Zellen, die aus dem Gewebe entfernt
wurden, verhalten sich nicht immer, als wenn sie in dem Geweben
wären,
aus dem die stammten. Glücklicherweise
verhält
sich das Antigen, das durch MCA 44-3A6 in Adenokarzinoma Zellen
in Gewebe exprimiert wird, in der gleichen Weise, wie das, das in
Adenokarzinoma Zellen exprimiert wird, die aus den Geweben entfernt
wurden. Dies ist eine diagnostisch wichtige Eigenschaft. Ähnliche
Zusammenhänge,
unter Verwendung von zytologisch hergestellten Zellblöcken aus
Lungenkarzinomen, wie auch ACs, die in Körperflüssigkeiten von anderen Stellen überall im
Körper
vorhanden sind, wurden nachgewiesen (Lee et al., 1985; Spagnol et
al., 1991; Combs et al., 1988c). MCA 44-3A6 bindet auch an Adenokarzinomas
von anderen Stellen als Lungenkrebs. Die Expression des Antigens
in primären
und metastatischen Läsionen
wurde ebenfalls berichtet (Combs et al., 1988a). Die Verwendung
des MCA Antikörpers
bei der Unterscheidung von Krebs von gutartigen Läsionen in
humanem Brustgewebe wurde ebenfalls bemerkt (Duda et al., 1991).
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Die
zelluläre
Lokalisation des mit MCA 44-3A6 detektierten Antigens wurde bestimmt.
Es wurde gezeigt durch Verwendung von Lebendzell-Radioimmunassays
(eine radioaktiver Antikörper
Test darauf gerichtet Bindung des Antikörpers an lebende Zellen zu
bestimmen), Immunfluoreszenz und Lebendzell Fluoreszenz aktivierte
Zellsortierer (FACS) Analyse, dass das durch MCA 44-3A6 detektierte
Antigen an die äußere Oberfläche der
Zelle bindet (Radosevich et al., 1985). Zusätzliche Studien unter Verwendung
von Immunogold Elektronen Mikroskopie und FACS Analyse belegten,
dass dieses Antigen nicht moduliert ist (das heißt nicht durch die Krebszelle
internalisiert wird, wenn durch einen Antikörper gebunden), auf der extrazellulären Oberfläche der
Plasmamembran exprimiert wird und nicht Zellzyklus spezifisch ist,
d.h., die Zelle produziert Protein die ganze Zeit, während sie
den Prozess der Zellteplikation durchläuft, und auch wenn sie sich
nicht teilt (Radosevich et al., 1991). Das Antigen wird nicht im
Serum von normalen oder Tumor tragenden Patienten gefunden, und
wird nicht in das Kulturmedium durch positive Zelllinien (d.h.,
es ist bekannt, dass Krebszellen Teile ihrer Zellmembran zu Bläschen formen
und diese in die umgebenden Flüssigkeit
entlassen, Radosevich et al., 1985) geschieden. Kürzlich wurde
gefunden, dass 3 von 27 zufällig
getesteten Adenocarcinoma Patienten natürlich vorkommende Antikörper gegen
das Antigen besitzen. Außerdem
wurde radioaktiv markierter MCA 44-3A6 verwendet, um A549 Tumoren,
die in Nachtmäusen
wuchsen, zu identifizieren. Ein Doxorubicin Immunkonjugat von MCA
44-3A6 ist in vitro selektiv toxisch (Sinkule et al., 1991).
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Bestimmung
der Nukleotid und Aminosäure
Sequenzen des Antigens, das durch MCA 44-3A6 detektiert wird, würde die
Nützlichkeit
dieses Antigens bei der Krebsanalyse, Behandlung und Prävention
verstärken.
Das Antigen, das durch den Antikörper
MCA 44-3A6, wie oben beschrieben, detekiert wird, wird als „Labyrinthin" bezeichnet. Ein
Gen (bezeichnet als labyrinthin; abgekürzt lab) charakterisiert durch
eine einzigartige Nukleotidsequenz, die für das Antigen, das durch MCA
44-3A6 detektiert
wird, wurde isoliert und charakterisiert. Die Schreibung lab bezeichnet
die Nuklein DNA/RNA Formen; „Lab" Schreibung bezeichnet
das Protein, das von der lab RNA/DNA kodiert wird. Die Bindungsstelle
von MCA 44-3A6 auf Labyrinthin wurde unter Verwendung von PCR und
Expresssionsklonierung kartiert (Radosevich et al., 1996).
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Kurze Zusammenfassung
der Erfindung
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Der
Antikörper
MCA 44-3A6 wurde als ein Werkzeug verwendet, um das für Lab kodierende
Gen zu klonieren. Zusätzlich
wurde ein Epitop (die notwendige Bindungsstelle für einen
Antikörper,
der auf dem Antigen liegt) für
MCA 44-3A6 auf dem Lab Protein, das durch den Klon exprimiert wird,
als PTGEPQ (Standard Abkürzungen
für Aminosäuren) identifiziert.
Das Epitop stellt eine wichtige immunodominante Sequenz dar; das
heißt,
wenn sie in Tiere injiziert wird, produzieren die Tiere bereitwillig
Antikörper
gegen diese Sequenz.
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Ein
Aspekt dieser Erfindung ist ein Molekül mit einer Aminosäuresequenz
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus APPEDNPVED, EEQQEVPPDT, DGPTGEPQQE
und EQENPDSSEPV.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung von einem Molekül mit einer
Sequenz ausgewählt
aus der Gruppe der Peptide APPEDNPVED, EEQQEVPPDT, DGPTGEPQQE und
EQENPDSSEPV, und Kombinationen davon als ein Impfstoff um humane
Krebse zu verhindern und/oder Menschen mit Krebs zu behandeln. Für die Zwecke
dieser Erfindung sind „Menschen
mit Krebs" diejenigen
Personen, bei denen das Lab Antigen in ihren Zellen detektiert wurde.
Diese Moleküle
können
auch verwendet werden, um zu verhindern, dass Patienten diese Tumoren
vor ihrem ersten Auftreten jemals haben.
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Ein
anderer Aspekt der Erfindung ist ein Antikörper gerichtet gegen ein Peptid
mit einer Aminosäuresequenz
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus APPEDNPVED, EEQQEVPPDT, DGPTGEPQQE
und EQENPDSSEPV. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspektes
der Erfindung, ist der Antikörper
ein monoklonaler Antikörper.
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Monoklonale
Antikörper
gerichtet gegen das Lab Protein, oder antigenische Komponenten oder
Derivate von Lab Proteinen sind nützlich für die Detektion von Lab und
für andere
Zwecke. Monoklonale Antikörper, die
in anderen Spezies hergestellt sind als diejenigen, die mit dem
Lab Antigen reagieren, können
durch eine Reihe von Molekularklonierungsverfahren so modifiziert
werden, dass sie ihre Bindung mit den Labyrinth Peptiden beibehalten,
aber in Menschen nicht immunogen sind (Sastry et al., 1989; Sambrook
et al., 1990). Kurz gesagt wird dies gemacht durch Ersetzen der
Bindungsstellensequenz eines klonierten humanen Antikörper Gens
mit der Bindungsstellensequenz des interessierenden nicht humanen
monoklonalen Antikörpers.
Diese „humanisierten" MCAs werden als
therapeutische und diagnostische Reagentien in vivo, ex vivo und
in vitro verwendet.
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Die
Verwendung des Lab Proteins oder davon abgeleiteter antigenischer
Peptide in diagnostischen Assays für Krebs ist ein Weg Patienten
auf das Vorhandensein und die Menge an Antikörper, die sie in ihren Blut
oder anderen Körperflüssigkeiten
oder Gewebe besitzen, zu überwachen.
Diese Detektion ist nicht eingeschränkt auf Krebsarten einer Klasse
oder Klassen, die zuvor definiert wurden, sondern ist nützlich für Krebszellen,
die das Lab Marker Antigen besitzen. Der Grad der Serokonversion,
wie durch Techniken, die dem Fachmann bekannt sind gemessen [zum
Beispiel, ELISA, (Engvall und Perlmann, 1971)], können verwendet werden,
um die Behandlungseffekte zu beobachten.
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Behandlung
mit Antikörpern
gegen Lab in einer pharmazeutischen Zusammensetzung ist ein Ansatz Patienten
zu behandeln, die Lab in oder auf ihren Krebszellen haben.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
die Nukleinsäuresequenz
des lab Gens (SEQ ID NO: 1).
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2 ist
die Aminosäuresequenz
für Lab,
abgeleitet aus dem lab Gen (SEQ ID NO: 2).
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3 ist
eine Darstellung des lab Gens und seiner Verwandtschaft zum HAAH
Enzym.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Molekularbiologie
von Labyrinthin: Um zu demonstrieren, dass das Epitop MCA 44-3A6
durch eine Proteinsequenz kodiert wird, wurde hoch Molekulargewichts
DNA aus der Zelllinie A549 isoliert. Diese DNA wurde kopräzipitiert
(via Kalzium) mit einem Plasmid (pSVneo), und verwendet, um eine
als B78H1 bezeichnete Mauszelllinie zu transfizieren (Albino et
al., 1985). Diese Mauszelllinie ist negativ für die Expression des Epitops
und es wurde berichtet, dass sie eine hohe Frequenz an Inkorporation
und Expression für
jegliche humane DNA Sequenzen besitzt. Wenn eine vorgegebene B78H1
Zelle in einem Zustand war, DNA aufzunehmen, würde sie erwartungsgemäß sowohl
die humane als auch die Plasmid DNA aufgenommen haben. Die Plasmid
DNA macht die Zellen gegenüber
G418 resistent (ein normalerweise toxischer Wirkstoff). Wenn daher eine
Zelle, die normalerweise sensitiv gegenüber dem Wachstumsinhibitor
G418 ist, in G418 wächst,
muss sie das Plasmid aufgenommen haben, und hat vielleicht auch
eine oder mehrere A549 DNA Sequenzen aufgenommen. Nach G418 Selektion
(ein Weg, um nur Zellen auszuwählen,
die Resistenz gegen Wachstum in G418 durch Aufnahme/Expression des
Neo Gens auf dem pSVneo Plasmid besitzen, und daher Zellen darstellen,
die in einem Zustand waren zum gleichen Zeitpunkt andere DNA aufzunehmen)
wurden ungefähr
15 von 1 × 105 Klonen detektiert unter Verwendung von
Immunoselektion mit MCA 44-3A6. Dieses Ergebnis ist konsistent mit
der Schlussfolgerung, dass humane A549 Zellen DNA besitzen, die
für Lab
kodiert, und die regulatorischen Sequenzen besitzen, die für die Expression
von Lab, notwendig sind.
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Vergleich
von HAAH und Labyrinthin: Da die DNA Sequenz von lab bestimmt wurde,
wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, konnten HAAH und
lab verglichen werden. HAAH und die lab Nukleotidsequenzen haben
einige interne Teilähnlichkeiten,
sind aber auf jeder Seite des Fragments unterschiedlich, und beziehen
sich auf verschiedene Produkte. Dieser Schluss basiert zum Teil
auf der Analyse und Homologie der DNA Sequenzen, die für diese
zwei Gene berichtet wurden. Insbesondere hat die lab 5' Region keine Homologie
mit HAAH. Die Protein kodierende Region von lab hat ungefähr eine
99.6% Homologie mit einem internen Segment der vorgeschlagenen Protein
kodierenden Region von HAAH. Die 3' Region besitzt keine Homologie mit
der bekannten HAAH Sequenz. Fast alle anderen Daten, die HAAH und
Labyrinthin vergleichen sind unterschiedlich, zum Beispiel: (1)
Molekulargewichte der Proteine, (2) zelluläre Lokalisation, (3) Chromosomen Lokalisation,
(4) histologische Darstellung in normalen Geweben und Tumoren, (5)
Northern Blot Expression, (6) Immunologische Befunde.
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Obgleich
die Protein kodierende Region von lab mit einer internen Region
der Sequenz identisch ist, über
die für
HAAH berichtet wurde, ist die 5' untranslatierte
Region von HAAH verschieden, und ein Teil der 5' translatierten Protein kodierenden
Region von HAAH fehlt in der Region, die in dem lab Klon vorkommt.
Aufgrund sowohl der HAAH als auch der lab Klone würde erwartet
werden, dass die abgeleiteten Protein in der Natur sehr sauer sind,
und daher anomal in SDS Gelen laufen. Wie vorhergesagt wandern die
Lab Proteine anomal in SDS Gelen. Das, was in der vorliegenden Erfindung
kloniert und offenbart wurde, wandert identisch zu dem nativen Protein,
das in zahlreichen Zelllinien vorkommt. Ein überzeugender Beweis, dass das
korrekte Genfragment, das für
das Antigen kodiert, das durch MCA 44-3A6 detektiert wird, kloniert
wurde (mRNA), ist dass, wenn das rekombinante Protein produziert
wird, dieses rekombinante Protein sich in der gleichen Weise verhalten
sollte (in diesem Fall ein apparentes Molekulargewicht besitzen)
wie ein aus unabhängiger
biologischer Quelle bezogenes Protein. Lab bereitgestellt aus Klonen
besitzt die Eigenschaften von Lab aus Zellen.
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Die
abgeleitete durch HAAH kodierte Aminosäuresequenz benötigt die
Verwendung eines offenen Leserahmens, der ein Protein produzieren
würde,
welches 85-90 Kilodalton besitzt, und nicht berücksichtigt, dass es verschiedene
Startkodons und andere kürzere
offene Leserahmen gibt. Das abgeleitete HAAH Protein (biochemisch)
ist glykosiliert und die berichtete Sequenz besitzt Glykolisierungsstellen
(Korioth et al., 1994; Lavaissiere et al., 1996). Im Gegensatz dazu
ist Lab nicht glykolisiert, noch besitzt es vorhergesagte glykosilierte Stellen.
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Die
abgeleitete HAAH Aminosäuresequenz
enthält
eine Region, die die Lab Aminosäuresequenz ebenfalls
besitzt, von der vorhergesagt wird, dass sie sehr hydrophob ist.
Lab benötigt
starke Detergentien, um löslich
zu sein; HAAH benötigt
diese nicht. Die erhöhte
Expression von HAAH (durch Enzymaktivitätsmessungen) in der gleichen
Zelllinie (A549), die verwendet wurde, um lab zu klonieren und ausgiebig
zu studieren, lässt
vermuten, dass diese beiden Genprodukte vielleicht wichtig für den AC
Phänotyp
sind, und dass zumindest A549 Zellen sowohl funktionales HAAH als
auch Lab produzieren. Erfolgreiche Transfektionen des Antisense
zu lab in A549 resultierten in einem deutlichen Abfall der Expression
von lab und der Wachstumsrate der Zellen. Die Expression eines Sense
lab Konstrukts in NIH-3T3 Zellen (normalen Maus Fibroblasten) resultierte
in einer deutlichen Änderung
des Phänotyps,
einem Phänotyp,
der mit dem von ACs konsistent ist. Daher ist lab Expression mit
der Umwandlung von normalen Zellen in kanzeröse Zellen assoziiert. Lab und
HAAH besitzen beide potentielle Kalzium bindende Domänen.
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cDNA
Bibliothekskonstruktion und Klonierung: Eine cDNA lambda gt11 Phagenbibliothek
wurde konstruiert unter Verwendung von mRNA, die isoliert wurde
aus aktiv wachsenden A549 Zellen (Sambrook et al., 1990). Diese
oligo(dT) geprimte cDNA wurde in die Eco RI Stelle unter Verwendung
eines Eco RI Linkers kloniert. Die Bibliothek besitzt ungefähr 83% klare
(ein Insert enthaltende) Plaques mit einem Titer von 1.2 × 1010/ml, die ein Minimum an 1.46 × 106 unabhängigen
Plaques darstellen, die, durch Polymerase Ketten Reaktion, Insert
Größen im Bereich
von 0.6 bis 5 Kilobasen besitzen. Da Lab ein 40 Kilodalton integrales
Protein ist, (ein Protein, dass in der Plasmamembran eingebettet
ist) wird die theoretische Vollängen
mRNA, die für dieses
Protein kodiert einschließlich
einer potentiellen Leader Sequenz auf ungefähr 1.1 Kilobasen geschätzt. Die
Bibliothek wurde unter Verwendung des Antikörpers MCA 44-3A6 immunologisch
durchmustert. Acht unabhängig
abgeleitete Phagen Stocks (identische Phagen, die aus dem gleichen
Plaque stammen) wurden isoliert. All diese wurden durch wiederholte
Zyklen von immunologischer Durchmusterung/Isolation mittels Plaques
aufgereinigt. Nach Eco RI Verdau dieser acht Isolate wurden Inserte
von ungefähr
2 kb gesehen. Das größte Insert
wurde isoliert (2A1A1) und das Eco RI Fragment wurde in das pGEM-3Z
Plasmid kloniert.
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Sequenzierung und Sequenzanalyse:
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Es
wurde festgestellt, dass das als 2A1A1 bezeichnete DNA Fragment
ein Insert von 2442 Basenpaaren Länge (1) enthaltend
eine 5' untranslatierte
Region, eine Ribosomen Bindungsstelle und ein Startkodon, von dem
erwartet wird, ein 255 Aminosäure
Protein zu kodieren (2). Die 3' untranslatierte Region ist bemerkenswert,
das sie nur vier Instabilitätssequenzen
enthält;
ATTTA (Xu et al., 1997). Zusätzlich
gibt es Sequenzen in dem ganz endständigen Teil des 3' Endes der mRNA,
die in der Adenylierung der mRNA resultieren (Sambrook et al., 1990).
Die lab Sequenz enthält
sowohl eine suboptimale (ATTAAA) als auch eine optimale (AATAAA)
Polyadenylierungsstelle. Diese Sequenzen werden in dem endständigen Teil
des 3' Endes der mRNA,
die in der Adenylierung der mRNA resultieren. Dieses Ergebnis stellt
molekulare Daten zur Verfügung, die
die zellularen und biochemischen Daten stützen, die hier kurz dargestellt
wurden. (Der HAAH Klon besitzt ein Poly A Signal, aber die gesamte
3' Region wurde
nicht sequenziert.) Ein Kalzium Bindungsstellen Motiv wurde in der
Lab Aminosäuresequenz
bemerkt (2), jedoch befindet es sich
nicht im bekannten strukturellen Kontext, um eine Bindungsstelle
zu sein. In diesem Fall ist die Kalzium begrenzende Sequenz vorhanden,
aber befindet sich nicht in einem Proteinsequenzkontext, von dem
bekannt wäre,
dass sie als Bindungsstelle funktioniert. Es wurde Homologie bemerkt
mit lab und einem EST Klon (bezeichnet als #05501), der nur einen
Teil der 3' untranslatierten
Region darstellt und unabhängig
diesen Teil der Sequenz bestätigte.
Eine gewisse Homologie für
das interne Fragment wird auch für
HAAH festgestellt, aber die 5' untranslatierte
und ein Teil der 5' translatierten
Region sind verschieden (58 Aminosäuren), wie auch ein großer Teil
der 3' kodierenden
Region in lab fehlt (3).
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Genomische
DNA Klonierung und Analyse: Unter Verwendung eines PCR Fragments,
das die Protein kodierende Region von lab darstellt, als eine Sonde,
wurde eine genomische lambda FIX II Bibliothek, die aus humanen
Lungen Fibroblastenzellen hergestellt wurde, durchgemustert. Zehn
primäre
Plaques wurden aus ungefähr
1 × 106 durchmusterten Plaques isoliert. Unter
Verwendung von sieben dieser Plaques als Ziel-DNA, wurden Polymerase
Ketten Reaktions Bedingungen mit Primern für die Protein kodierende Region
etabliert, die ein 765 Basenpaar Fragment produzieren, der erwarteten
Protein kodierende Region für
lab. Auf Northern Blots (ein Verfahren, das verwendet wird, um qualitativ
mRNA abzuschätzen)
detektiert lab nur eine als 2.7 Kilobasen beobachtete Bande. Das
aus dem lab Klon hergestellte rekombinante Protein, hat, wenn es
auf Western Blots unter Verwendung von MCA 44-3A6 getestet wird
(ein Verfahren, das verwendet wird, um qualitativ Proteine zu definieren)
die gleiche relative Mobilität
wie das Lab Protein, wenn es in A549 gemacht wird.
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Lab
und HAAH Gene produzieren unterschiedliche Ergebnisse, was die Proteine
angeht, die sie kodieren. HAAH ergibt konsistent zwei Banden in
der Northern Blot Analyse (2.6 und 4.3 Kilobasen), was vermuten
lässt,
dass die 2.6 Kilobasen Bande auf alternatives Spleißen zurückführen ist – das heißt die Zelle
schneidet und spleißt
die mRNA. Wenn lab und HAAH das gleiche Gen sind, sollte HAAH auch
ihn allen Geweben und Krebszelllinien detektiert werden, in denen
Lab vorkommt. Jedoch wird Lab nicht auf Northern Blots der Zelllinien
EMT6 oder QU-DB gesehen, noch gibt es Immunoreaktivität in diesen
Zellen, was anzeigt, dass Lab mRNA nicht gemacht wird, und dass
Lab Protein nicht in diesen Zellen produziert wird. Lab Protein
wird selten in normalen Zellen exprimiert, in denen sowohl die HAAH
mRNA als auch das HAAH Protein gemäß Berichten exprimiert wurden,
in fast jedem untersuchtem Gewebe.
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mRNA
Analyse: Northern Blot Analyse des DNA Fragments aus der A549 Zelllinie
unter Verwendung der lab cDNA als Sonde identifizierte eine einzelne
Bande von ungefähr
2.7 Kilobasen. Dies wird erwartet aufgrund der cDNA (2442 Basenpaare)
und einem Poly-A Schwanz von ungefähr 300 Basenpaaren. Northern Blot
Analysen der Mauszelllinie, EMT6, und der humanen großen Zellen
Karzinomazelllinie, Qu-DB, bestätigen,
dass kein Transkript für
lab von diesen Zellen produziert wird. Dies ist konsistent mit den
Immunoassays, die für
lab Expression auf diesen Zellen negativ sind.
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Antisense
und Sense cDNA Expression: Das Plasmid (pBK-CMV) (Sambrook et al.,
1990) kann entweder die Sense oder Antisense Volllängen cDNA
lab in A549 und NIH 3T3 Zellen tragen. Ein Antisense Molekül kann,
zum Beispiel, eine Sequenz sein, komplementär zu einem Sense Molekül, das mit
dem Sense Molekül
hybridisiert, und seine Expression verhindert. Unter Verwendung
des MTT Assays (Siddique et al., 1992), um die Wachstumsrate der
A549 Zellen zu bestimmen, die Antisense zu lab exprimieren, wurde
eine merkliche Verringerung der Wachstumsrate festgestellt. Die
mit Antisense transfizierten A549 Zellen scheinen einen größeren Grad
an Kotaktinhibition zu besitzen. Eine nachweisbare Menge von Lab
ist in diesen mit Antisense transfizierten Zellen reduziert. NIH-3T3
Zellen wechseln von einer Fibroblastenartigen Zelltyp Morphologie (groß, dünn spindelförmig geformt)
zu großen
als Adenokarzinom erscheinenden Zellen (sehr rund, prall), wenn
Sense Expression auftritt.
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Chromosomen
Lokalisation: Die Chromosomen Lokalisation von lab, unter Verwendung
einer Volllängen
cDNA als einer Sonde über
in situ Hybridisierung (Sambrook et al., 1990) ist vorläufig auf
Chromosom 2q12-14, mit möglicherweise
einiger Reaktivität
mit Chromosomen 4 und 8. Unter Verwendung der gleichen Sonde (der
Volllängen
cDNA Sequenz von lab) und FACS sortierten Chromosomen (Lebo et al.,
1985) wurde Anfärbung
auch auf Chromosom 2 festgestellt, mit schwächer Anfärbung auf 4 und keiner auf
8. Die Verwendung von genomischen Klonen wird insbesondere beim
Verstehen dieser Daten wertvoll sein, da Bedingungen mit höherer Stringenz,
als diejenigen, die für
cDNA möglich
sind, verwendet werden können,
wodurch Hintergrundsignale reduziert werden. Dies ist ein weiterer
Beweis, dass das korrekte Gen kloniert wurde und dass die Ergebnisse
nicht auf Verfahrensartefakte zurückzuführen sind. Es können Mutationen
in der genomischen DNA der Tumoren sein und in der DNA, die in der
vorliegenden Erfindung offenbart ist, da die DNA aus Tumorzellen
(A549) kloniert wurde. Daher könnte
ein mutiertes Gen kloniert worden sein. Dies ist jedoch nicht der Fall,
da die genomische DNA aus einer normalen Zelle (DNA) die gleiche
Sequenz produzierte wie die, die kloniert wurde, wie hier beschrieben
wurde. Daher wurde ein normales Gen aus A549 Zellen kloniert. Die schwachen
Signale auf Chromosomen 4 und 8 sind konsistent mit einem Pseudogen
oder einem verwandten Gen. Zum Beispiel wurde bei in situ Hybridisierung
berichtet, dass HAAH auf Chromosom 8q12 ist, daher könnte dieses
Ergebnis auf Chromosom 8 die HAAH und lab Sequenz Homologie widerspiegeln.
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Molekulare
Protein Charakterisierung von Labyrinthin: Frühere Arbeiten unter Verwendung
von Western Blot Analyse (einem qualitativen Assay um Antigene abzuschätzen) zeigten,
dass das Lab Antigen ein 40 Kilodalton (durch relative Mobilität) Protein
ist, das in A549 Zellen nachweisbar ist (Radosevich et al., 1985). Das
Epitop scheint nicht durch Lectine moduliert oder geblockt zu werden,
und wird selektiv auf der Zelloberfläche exprimiert, primär auf der
Plasmamembran (Radosevich et al., 1985, 1991). Lab ist sensitiv
gegenüber Proteasen,
aber nicht gegenüber
Lipid oder Kohlenhydrat verändernden
Reaktionen (Radosevich et al., 1985). Die biochemischen Eigenschaften
von Lab sind konsistent mit Lab als einem integralen Membranprotein.
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Da
eine aus dem lab Gen, das in der vorliegenden Erfindung beschrieben
wird, abgeleitete Aminosäuresequenz
vorliegt, ist die weitere Charakterisierung des Lab Proteins möglich. Eingehende
Computer Analyse von Lab hat eine eukaryotische Leader-artige Sequenz
und theoretische Spaltstelle identifiziert, 3 Myristylierungs Sequenz
Stellen, eine schwache Membranankerdomäne (MAD I), und eine starke
Membranankerdomäne
(MAD II) (2). [(In der HAAH Sequenz, gibt
es 58 (theoretische) Aminosäuren
gefolgt von einer Sequenzhomologie der Lab Protein kodierende Sequenz
und von zusätzlichen
445 Aminosäuren
3' zu der lab Sequenz.)]
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Wenn
Lab als ein Fusionsprotein in einem bakteriellen GST Fusionsexpressionssystem
exprimiert wird (pGEMEX-2T) (Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway,
New Jersay, 08854, USA), einer Western Blot Analyse unter Verwendung
des Antikörpers
MCA 44-3A6 unterworfen wird, belegen die resultierenden Blots, dass
das exprimierte gespaltene Fusionsprotein die gleiche relative Mobilität wie das
Protein, das in A549 Zellen detektiert wird, hat. Das abgeleitete
Molekulargewicht für
Lab ist 28.8 Kilodalton und auf Western Blots hat es eine relative
Mobilität
identisch zu der Form, die in A549 Zellen exprimiert wird (apparente
relative Mobilität
= 40 Kilodalton). Die 55 Glutamat und 27 Asparaginsäure Reste
(82 Reste zusammengenommen) sind fast gleichmäßig über das Protein (255 Aminosäuren insgesamt;
228 ohne Leader Sequenz) verteilt, außer in der Leader Sequenz und
der stärksten
Membranankerdomäne
(MAD II). Die Daten lassen vermuten, das Lab anomal in SDS Gelen
wandert. In von A549 verschiedenen Zelllinien (zum Beispiel, Adenokarzinomen DU-145,
ATCC # HTB-81; ZR-75-1, ATCC # CRL-1504, und so weiter) wurde ein
Antigen mit dem gleichem Molekulargewicht wie Lab detektiert. Weder
eine 85-90 Kilodalton Molekulargewichts Spezies, noch eine 52 und
56 Kilodalton Molekulargewichts Spezies wird, wenn die Western Blots
für Lab
sondiert werden, bemerkt.
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Epitop
Kartierung unter Verwendung des Antikörpers MCA 44-3A6 und Vakzine
Machbarkeit von Lab: Unter Verwendung der Polymerase Kettenreaktion
und des GST Fusionsproteinsystems wurden Subklone der Protein kodierenden
Region hergestellt, und Epitope kartierten die Bindung von MCA 44-3A6
auf sechs Aminosäuren
(PTGEPQ), die die Aminosäuren
#117-122 von Lab darstellen („P" Peptid). Um dieses
Epitop zu bestimmen, wurde die gesamte kodierende Region in Regionen
unterteilt, Polymerase-Kettenreaktionsprimer wurden konstruiert,
um jede Region zu amplifizieren, und die nachfolgende Expression
von Polymerase Kettenreaktionsprimern wurde kloniert und durch Western
Blot Analyse unter Verwendung des Antikörpers MCA 44-3A6 getestet.
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Das
DNA Fragment, das das positive Western Blot Ergebnis darstellte,
wurde dann weiter unterteilt. Polymerase Kettenreaktionprodukte
wurden erzeugt und kloniert, exprimiert, und über Western Blot getestet. Konstrukte
wurden auf diese Weise sowohl vom 5' Ende als auch vom 3' Ende aus hergestellt und die Intervalle der
Anzahl der Aminosäuren
wurde nach jeder Runde reduziert. Dies resultierte darin, dass in
der letzten Runde ein ein Aminosäurenunterschied
gegenüber
der vorherigen Runde (in beide Richtungen) dargestellt wurde, so
dass man die genaue Bindungsstelle des MCA 44-3A6 ableiten konnte.
Dies zeigt, dass mindestens diese sechs Aminosäuren an der externen Zelloberfläche exponiert
sind. Um diesen Punkt weiter zu belegen, wurde die DNA, die nur
diese sechs Aminosäuren
kodiert, kloniert und das Fusionsprotein ist gemäß Western Blot Analyse positiv.
Synthetisch hergestelltes „P" Peptid kann durch
MCA 44-3A6 spezifisch detektiert werden, und das synthetische Peptid
war in 5 von 5 getesteten Mäusen
immunogen. Computer Analyse/Modelling sagte auch voraus, dass dieses
Epitop unter Verwendung von Computer assistierte Analyse (GCG Programme)
sehr immunogen sein würde
(Genetics Computer Group, Madison, WI 53703).
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Impfstoff
Herstellung: Ein Impfstoff ist eine Zubereitung von Antigen(en),
die, wenn sie an einen Wirt gegeben wird, darin resultiert, dass
der Wirt Antikörper
gegen das (die) Antigen(e) produziert. Die Wirtsantwort resultiert
darin, dass der Wirt gegenüber
der Krankheit immun wird, gegen die der Impfstoff gerichtet war.
Impfstoff Behandlung verhindert daher die klinische Ausbildung der
Krankheit, ohne den Wirt dem Krankheit auslösendem Agens auszusetzen. Lab
besitzt alle die Eigenschaften eines bevorzugten Krebsimpfstoffs.
Das lab Gen wird häufig
durch Tumore exprimiert, die wie Adenokarzinome aussehen, wird an
der Außenseite
der exprimiert, wird durch alle Zellen innerhalb eines gegeben Krebses
exprimiert, und selten durch normale Zellen exprimiert. Lab Protein
(Peptide) können
durch jede Anzahl an Verfahren unter Verwendung molekularer Klonierungstechniken
hergestellt, und können
in großen
Mengen produziert werden, weshalb es ein für die Verwendung als ein Impfstoff
praktisches Antigen ist. Nachdem das Lab Protein aufgereinigt wurde,
so dass es für
die Injektion in Menschen geeignet ist, wird es Individuen intradermal,
subkutan oder auf anderen Wegen verabreicht, um so das Immun System
anzuregen, Antikörper
gegen dieser Protein (Peptide) zu produzieren.
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Die
Verwendung von molekularen Modelling und Computer unterstützten Analyse
GCG Programmen (Genetics Crystal Group, Madison, WI 53703) ermöglicht die
Identifikation von kleinen Abschnitten eines Moleküls, wenig
größer als
ein Epitop (sechs bis sieben Aminosäuren für Proteine), von denen erwartet
wird, dass sie auf der Oberfläche
eines Proteinmoleküls
sind. Zusätzlich
können
der Grad der Hydrophobizität
oder Hydrophilität
einer gegebenen Sequenz, und wie immunogen die Sequenz in Tieren
sein würde,
bestimmt werden (Genetics Crystal Group, Madison, WI 53703). Nachdem
definiert wurde, welche Sequenzen diese Kriterien erfüllen, werden
die Peptide synthetische hergestellt, oder durch eine Anzahl von
Standardverfahren hergestellt. Eines oder mehrere dieser Peptide
können
dann formuliert werden, um als ein Impfstoff verwendet zu werden,
und dem Wirt, wie oben beschrieben, als ein Impfstoff verabreicht
werden.
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Ein
Impfstoff umfasst ein Molekül
mit einer Aminosäuresequenz
ausgewählt
aus der Gruppe aus den Peptiden APPEDNPVED (SEQ ID NO: 6), EEQQEVPPDT
(SEQ ID NO: 7), DGPTGEPQQE (SEQ ID NO: 8) und EQENPDSSEPV (SEQ ID
NO: 9), und Kombinationen davon.
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Ein
gegebener Impfstoff kann einmal an einen Wirt verabreicht werden,
oder mehrere Male. Damit einige Patienten einen gegebenen Impfstoff
erkennen, kann es notwendig sein ein Adjuvanz mit den Peptiden zu
verabreichen. Adjuvantien sind unspezifische Immmunstimulatoren,
die die Immunbereitschaft erhöhen
und den Wirt bei dem Übergang
von nicht detektierbaren Serumantikörper zu sehr hoch titrigen
Serumantikörper unterstützen. Es
ist dieser hohe Level (Titer) an Antikörpern, die den Wirt wirksam
vor den Krankheiten und Zuständen
schützen,
gegen die die Antikörper
gerichtet sind.
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Funktionale
Studien: Studien, die auf das Verständnis der zellulären Funktionen
von Lab zielen, sind Erweiterungen von Zell Lokalisierungs/Charakterisierungsstudien
(Siddique et al., 1992). Änderungen
der Levels von Lab in Reaktion auf das extrazelluläre Aussetzen
gegenüber
zahlreichen Kationen (Ca++, Mg++,
Cu++ und Fe++) wurden
durchgeführt.
Lab Expression in A549 Zellen wurde nur durch Ca++ moduliert.
Unter Verwendung des hoch spezifischen fluoreszierendem Fura-2/AM
Ca++ Verfahrens der Messung von zytosolischem Ca++, (Molecular Probes Inc., Eugene, OR 97402)
wurde gezeigt, dass: (1) die interne Ca++-Konzentration
in A549 Zellen höher
ist als in QU-DB Zellen; und (2) dass die A549 Zelllinie auf zahlreiche
externe Ca++ Levels reagiert (Siddique et
al., 1992). Da der pH intrazelluläre freie Ca++-Levels
modulieren kann, sollten die extrazellulären pH Manipulationen in Änderungen
der Expressionslevels von Lab resultieren: Extrazelluläre pH Änderungen
(in der Gegenwart von normalen Ca++ Konzentrationen)
resultieren in: (1) einer parallelen Änderung des intrazellullären pH,
wie gemessen durch SNARF-1 AM/FACS, (Molecular Probes Inc., Eugene,
OR 97402); (2) einem Transkript Level Anstieg von Lab (verglichen
mit der GAPDH Expression über
Northern Blot); und dass (3) Lab Protein auch ansteigt (unter Verwendung
einer Western/Slot Blot Analyse). Die intrazellulären Änderungen
des pH (aufgrund externer Änderungen)
von A549 Zellen sind denjenigen identisch, die für normale Zellen berichtet
werden. Die erhöhte
Expression von lab ist auch nicht auf Zelltod zurückzuführen (wie
durch MTT Assays gemessen) (Siddique et al. 1992). Zusätzlich ändert die
die Inkubation von rekombinantem Lab bei zahleichen pH Lösungen nicht
die Immunoreaktivität.
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Vorläufige Daten
lassen vermuten, dass wenn diese Experimente in A549 Zellen durchgeführt werden, die
bei einem verringertem Ca++ Spiegel wachsen,
die induzierte Expression von lab abgebrochen wird.
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Verfahren
zum Diagnostizieren von Krebszellen in einer Zellprobe: Biologische
Proben aus einem Subjekt werden verwendet, um zu bestimmen, ob Krebszellen
in dem Subjekt vorhanden sind. Beispiele für geeignete Proben schließen ein
Blut und Biopsie Material. Ein Diagnoseverfahren ist es, DNA aus
Zellen in der Probe einer markierten Sonde gegenüber zu exponieren, die die
in der Lage ist, mit dem lab Gen, oder einem Fragmente davon, unter
stringenten Bedingungen – zum
Beispiel, 6x SSC; 0.05x Blotto; 50% Formamid; 42°C (Sambrook et al., 1990) – zu hybridisieren.
Natürlich
werden die Hybridisierungsbedingungen geändert, um optimale Sensitivität und Spezifität zu erreichen,
in Abhängigkeit
von der Eigenart der biologischen Probe, dem Krebstyp, dem Verfahren
der Sondenherstellung, und dem Verfahren der Gewebepräparation.
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Nachdem
die Probe mit der Sonde in Kontakt gebracht wurde, ist der nächste Schritte
zu bestimmen, ob die Sonde mit den Nukleotidsequenzen der DNA aus
der Probe hybridisiert hat, woraus das Vorhandensein des lab Gens
abgeleitet wird, besagtes Vorhandensein ist die Diagnose für Krebs.
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Ein
anderes diagnostische Verfahren ist es, monoklonale Antikörper, vorzugsweise
markiert, zu beschaffen, die entweder schon existieren, oder neue
gerichtet gegen die antigenischen Peptide, die ein Aspekt der vorliegenden
Erfindung sind, und eine Probe mit diesen in Kontakt zu bringen,
um das Lab Antigen zu detektieren. Diese monoklonalen Antikörper sind
nützlich
bei der Entwicklung von sehr spezifischen Assays für die Detektion
von Lab Antigen, und ermöglichen,
dass die Tests in vielen verschiedenen Formaten ausgeführt werden;
was in einer breiteren Anwendung in Wissenschaft und Medizin resultiert.
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