CN100457922C - 检测酪丝亮肽抗肝癌效果的方法及所用试剂盒与基因芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种检测酪丝亮肽抗肝癌效果的方法，包括步骤：在酪丝亮肽作用后的生物材料中，检测基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Calreticulin、PTEN、Akt1、Akt2、P21以及P27表达水平的变化情况；当检测结果为：在酪丝亮肽作用后，基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Akt1、Akt2的表达水平下降，而基因Calreticulin、PTEN、P21、P27的表达水平上升，则表明酪丝亮肽对该生物材料具有抗肝癌的效果。本发明还公开了用于所述方法的试剂盒与基因芯片。本发明的方法提供了一种在分子水平快速检测酪丝亮肽抗肝癌效果的途径。

Description

检测酪丝亮肽抗肝癌效果的方法及所用试剂盒与基因芯片

技术领域

本发明涉及一种检测药物抗癌效果的方法以及制剂，特别是涉及一种分子水平检测酪丝亮肽抗肝癌效果的方法及所用试剂盒与基因芯片。

背景技术

原发性肝癌是人类最常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率居世界主要癌症的第八位，死亡率高，在恶性肿瘤死亡率中仅次于胃癌、食道癌而居第三位。中国是原发性肝癌的高发国家，发病率和死亡率均居世界之首，死亡率在各种癌症中占第二位，每年约有11万人死于肝癌，约占全世界肝癌死亡数的45％左右。肝癌的治疗目前仍以手术、放疗及化疗作为主要手段，但肝癌早期发现困难，手术切除率低，因而寻找有效的治疗药物是提高肝癌生存率的关键。

酪丝亮肽(Tyrosyl-seryl-leucine，YSL)，是一种三肽化合物，其化学结构组成为L-酪氨酰-L-丝氨酰-L-亮氨酸，分子式为C18H27N306，分子量为381.42，分子结构式如下所示：

动物实验结果显示，酪丝亮肽显示出一定的抑制肿瘤细胞生长的作用。该药在剂量为40～80μg/kg时，可使腹水型肝癌H22小鼠生命延长率达60％～90％。经四次重复实验结果稳定。在体外实验中酪丝亮肽显示出对人肝癌BEL-7402细胞增殖的抑制作用，最佳抑瘤率可达36.29％。在裸鼠移植瘤实验中，给药剂量为160～320μg/kg时，酪丝亮肽可以显著抑制人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤的生长，经五次重复实验，抑瘤率达40～50％。

酪丝亮肽在临床实验中也显示出良好的药效，能够明显延长肝癌病人的生存时间。但在临床研究中也发现，酪丝亮肽的抗肝癌作用在不同病人的个体之间存在差异，即不同的个体对酪丝亮肽的敏感度存在差异。有些病人在给予酪丝亮肽治疗后，肿瘤生长发生了明显抑制；而有些病人在注射酪丝亮肽后肿瘤生长未受到明显影响。

抗癌治疗是一个长期的过程，在治疗过程中需要经常性的评价药物对病人的治疗效果。如果某种药物在治疗过程中对该病人确实能起效，则提示可以继续施用该药物进行治疗。如果该病人对此种药物不敏感，则应该尽快停止预定治疗方案，减少药物毒副作用，并改用其他方案继续治疗。现阶段，一种抗癌药物是否对病人能发挥作用的评判往往是通过观察施用药物后病人肿瘤的形态变化。但从施用药物到肿瘤形态发生变化往往需要较长的一段时间，在这段时间内，该药物对该病人是否能起疗效则无法预知。酪丝亮肽作为一种抗肝癌的新药，同样也面临这样的问题。

线粒体是细胞内的能量合成场所，线粒体内膜上，主要包括由氧化还原酶复合体组成的呼吸链，ATP合成酶以及腺苷转运体。呼吸链由70多种多肽组成，按氧化还原电势的高低，可以分为四个复合体。分别为复合体I(NADH脱氢酶)、II(琥珀酸脱氢酶)、III(细胞色素还原酶)、IV(细胞色素氧化酶)。电子经呼吸链最终传递给氧，并在传递的过程中形成跨膜质子梯度，作为高能磷酸化合物形成的动力，在ATP合成酶的作用下ADP经磷酸化生成ATP，供给细胞代谢所需的能量。NDUFA2，NDUFA10和NDUFS1是复合体I(NADH脱氢酶)的组成部分，SUCLG1是复合体II(琥珀酸脱氢酶)的组成成分，这些基因的表达水平下降会引起细胞呼吸链功能的受损，从而影响细胞线粒体的功能。

Calreticulin是内质网中的一种钙结合蛋白，对于细胞内钙稳态的调节以及钙信号的传递有重要作用。Calreticulin过表达可增加Ca2+流通过内质网，减少线粒体Ca2+及膜的势能，使两种细胞器间Ca2+更新的增加。

PI3K途径是细胞内一条重要的信号传导通路，在凋亡、衰老、增殖等细胞生命活动中起重要作用。PTEN及AKT是此通路上起相反作用的两个制衡因素。PTEN功能的增强可抑制PI3K通路的细胞增殖信号传递，这将使其下游的AKT不被激活。

PTEN是位于人类10q23染色体上的肿瘤抑制基因，PTEN去磷酸化活化后，具有蛋白及脂质磷酸酶的双重作用。PTEN的蛋白磷酸酶作用能去掉酪氨酸上的磷酸，此作用与许多癌蛋白功能相反，而且可能因此与许多癌蛋白作用于共同的底物，发挥抑制肿瘤发生发展的作用。AKT则在多种细胞活动中发挥重要作用，AKT激酶被磷酸化活化后可通过磷酸化调节许多靶点，各种激酶、转录因子及其它调节分子。其中包括使促进凋亡靶基因(如Bad等)磷酸化，从而直接延长细胞生存时间。AKT还可影响细胞周期某些因子而推动细胞周期的进展。

在PTEN抑制PI3K活性而致AKT不被激活时，通路下游的p21、p27将被激活阻抑细胞周期，抗细胞增殖。p21和p27属于对CYC-CDK(细胞周期素-细胞周期素依赖激酶)复合物起抑制作用的Cip/Kip蛋白(p21、p27、p57)家族。p27为PTEN激活后抑制细胞周期演进的靶位点。激酶磷酸化抑制因子可取消其作用而促进细胞周期的进展。p21几乎可与每一种CYC-CDK复合物结合，使Rb蛋白和p53蛋白不能磷酸化而抑制细胞进入S期。p21还能抑制PCNA与DNA多聚酶的结合，从而抑制DNA复制的延伸过程，造成细胞周期阻抑，使肿瘤细胞走向凋亡。

发明内容

本发明的目的就是为了解决以上问题，提供一种在分子水平快速检测酪丝亮肽抗肝癌效果的方法，以及所用的试剂或基因芯片。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了一种检测酪丝亮肽抗肝癌效果的方法，所述方法包括步骤：

在酪丝亮肽作用后的生物材料中，检测基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Calreticulin、PTEN、Akt1、Akt2、P21或P27表达水平的变化情况；

当检测结果为：在酪丝亮肽作用后，基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Akt1、Akt2的表达水平下降，基因Calreticulin、PTEN、P21、P27的表达水平上升，则表明酪丝亮肽对该生物材料具有抗肝癌的效果。

具体的，所述在酪丝亮肽作用后的生物材料中，检测基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Calreticulin、PTEN、Akt1、Akt2、P21或P27表达水平的变化情况，是指，采用反转录PCR  的方法检测所述生物材料中该十个基因的mRNA在酪丝亮肽作用前后的表达变化情况，当在酪丝亮肽作用后，基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Akt1、Akt2的mRNA表达水平下降，基因Calreticulin、PTEN、P21、P27的mRNA表达水平上升，则表明酪丝亮肽对该生物材料具有抗肝癌的效果。

或者具体的，所述在酪丝亮肽作用后的生物材料中，检测基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Calreticulin、PTEN、Akt1、Akt2、P21或P27表达水平的变化情况，是指，采用基因芯片的方法，检测所述生物材料中该十个基因的cDNA在酪丝亮肽作用前后的表达变化情况，当在酪丝亮肽作用后，基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Akt1、Akt2的cDNA表达水平下降，基因Calreticulin、PTEN、P21、P27的cDNA表达水平上升，则表明酪丝亮肽对该生物材料具有抗肝癌的效果。

所述基因NDUFA2的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.23中第74～373位碱基所示的序列，该SEQ ID No.23中第74～373位范围内的碱基为该基因的开放阅读框(ORF)所在区域。

所述基因NDUFA10的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.24中第81～1148位碱基所示的序列；该SEQ ID No.24中第81～1148位范围内的碱基为该基因的开放阅读框(ORF)所在区域。

所述基因NDUFS1的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.25中第128～2311位碱基所示的序列；该SEQ ID No.25中第128～2311位范围内的碱基为该基因的开放阅读框(ORF)所在区域。

所述基因SUCLG1的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.26中第32～1033位碱基所示的序列；该SEQ ID No.26中第32～1033位范围内的碱基为该基因的开放阅读框(ORF)所在区域。

所述基因Calreticulin的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.27中第69～1322位碱基所示的序列；该SEQ ID No.27中第69～1322位范围内的碱基为该基因的开放阅读框(ORF)所在区域。

所述基因PTEN的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.28中第1032～2243位碱基所示的序列；该SEQ ID No.28中第1032～2243位范围内的碱基为该基因的开放阅读框(ORF)所在区域。

所述基因Akt1的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.29中第555～1997位碱基所示的序列；该SEQ ID No.29中第555～1997位范围内的碱基为该基因的开放阅读框(ORF)所在区域。

所述基因Akt2的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.30中第204～1649位碱基所示的序列；该SEQ ID No.30中第204～1649位范围内的碱基为该基因的开放阅读框(ORF)所在区域。

所述基因P21的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.31中第95～589位碱基所示的序列；该SEQ ID No.31中第95～589位范围内的碱基为该基因的开放阅读框(ORF)所在区域。

所述基因P27的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.32中第466～1062位碱基所示的序列。该SEQ ID No.32中第466～1062位范围内的碱基为该基因的开放阅读框(ORF)所在区域。

本发明还公开了一种用于检测酪丝亮肽作用效果的试剂盒，所述试剂盒中含有在反转录PCR方法中分别检测基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Calreticulin、PTEN、Akt1、Akt2、P21、P27的mRNA表达水平的引物序列。

优选的，所述检测基因NDUFA2的引物序列如序列表中SEQ ID No.1和2所示；

所述检测基因NDUFA10的引物序列如序列表中SEQID No.3和4所示；

所述检测基因NDUFS1的引物序列如序列表中SEQ ID No.5和6所示；

所述检测基因SUCLG1的引物序列如序列表中SEQ ID No.7和8所示；

所述检测基因Calreticulin的引物序列如序列表中SEQ ID No.9和10所示；

所述检测基因PTEN的引物序列如序列表中SEQ ID No.11和12所示；

所述检测基因Akt1的引物序列如序列表中SEQ ID No.13和14所示；

所述检测基因Akt2的引物序列如序列表中SEQ ID No.15和16所示；

所述检测基因P21的引物序列如序列表中SEQ ID No.17和18所示；

所述检测基因P27的引物序列如序列表中SEQ ID No.19和20所示。

所述试剂盒中进一步含有参照基因GAPDH的反转录PCR的引物序列，该引物序列如序列表中SEQ ID No.21和22所示。

本发明还公开了一种用于检测酪丝亮肽作用效果的基因芯片，在所述基因芯片的固相载体上固定有能分别与基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Calreticulin、PTEN、Akt1、Akt2、P21、P27的cDNA序列杂交的核酸序列。

由于采用了以上的方案，使本发明具有的有益效果在于：

本发明的方法提供了一种在分子水平快速检测酪丝亮肽抗肝癌效果的途径，通过检测在施用酪丝亮肽前后，十个基因(NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Calreticulin、PTEN、Akt1、Akt2、P21、P27)表达水平的变化情况，从而能较快了解酪丝亮肽对该个体的作用效果，这种从分子水平检测出结果的时间大大短于从个体表型上表现出治疗效果的时间。从而该方法能够为肝癌病人在施用酪丝亮肽相关药物的过程中，提供了确切的用药效果的参考，使服用该药物无效的病人可以及早停止服用该药物，节约了费用并将大大减少了服用药物的毒副作用。

本发明的试剂盒以及基因芯片，可应用于本发明的方法中，从分子水平快速检测酪丝亮肽的抗肝癌效果。

附图说明

图1是RT-PCR法检测酪丝亮肽对人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤组织细胞中线粒体呼吸链相关基因NDUFA2，NDUFA10、NDUFS1和SUCLG1 mRNA表达的影响的电泳结果图。

图2显示PT-PCR法检测酪丝亮肽对人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤组织细胞中线粒体呼吸链相关基因NDUFA2，NDUFA10、NDUFS1和SUCLG1mRNA表达的影响的统计图：同生理盐水组比较，酪丝亮肽组上述4种呼吸线粒体呼吸链相关基因mRNA表达均不同程度下降，具有统计学意义(P＜0.05)。

图3是RT-PCR法检测酪丝亮肽对人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤组织细胞中钙稳肽调节基因Calreticulin mRNA表达的影响的电泳结果图。

图4显示酪丝亮肽对人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤组织细胞中钙稳肽调节基因Calreticulin mRNA表达的影响的统计图：同生理盐水组比较，酪丝亮肽组Calreticulin基因mRNA表达明显升高，具有统计学意义(P＜0.05)。

图5是RT-PCR法检测酪丝亮肽对人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤组织细胞中PTENmRNA表达的影响的电泳结果图。

图6是RT-PCR法检测酪丝亮肽对人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤组织细胞中AKT1、AKT2mRNA表达的影响的电泳结果图。

图7是PT-PCR法检测酪丝亮肽对人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤组织细胞中P21、P27mRNA表达的影响的电泳结果图。

图8显示160μg/kg/d酪丝亮肽对人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤肿瘤增殖相关基因PTEN、AKT1、AKT2、P21、P27mRNA表达的影响的统计图：酪丝亮肽能够增加裸鼠移植瘤细胞中抑癌基因PTEN、P21、P27的mRNA表达，抑制癌基因AKT1、AKT2的表达，酪丝亮肽组上述基因表达结果数据同各自相应生理盐水组数据比较，具有统计学意义(P＜0.05)。

图9为YSL抗人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤实验电镜结果，其中

a为生理盐水组：生长良好的肝癌细胞(×7500)；

b为YSL组(160μg/kg/d)：凋亡细胞(×7500)；

c为YSL组(160μg/kg/d)：肝癌细胞线粒体肿胀、内质网扩张显著，线粒体和内质网池中可见钙过载(×12450)；

d为.YSL组(160μg/kg/d)：线粒体内质网性空泡化(×12450)。

具体实施方式

下面通过具体的实施例并结合附图对本发明作进一步详细的描述。

人肝癌BEL7402细胞由中国陈瑞铭等建立于1975年，各种特征与临床人肝细胞肝癌相似，保留了肿瘤的恶性特征，裸鼠人肝癌BEL7402移植瘤保存了人癌原有结构、功能，生长稳定。

下列实施例或实验例中未注明具体条件的实验方法，涉及常规分子生物技术的方法，该等技术在所属领域中广泛已知，通常按照常规条件如Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第3版，1-3卷，Sambrook等人编辑，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，2001中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实验例1

YSL抗人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤实验

裸鼠人肝癌模型的制备，可参见文献(韩锐.抗癌药物研究与实验技术[M].第一版.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社.1997，4：299)。

荷人肝癌BEL-7402裸鼠购自中国医学科学院肿瘤研究所物中心。于独立换气的无特定病原体的层流柜中饲养，所用饲料、垫料、饮用水均为无菌处理，严格按照NIH标准(安全操作号：A3873-1)进行。

在本发明中，选取肿瘤直径大于1cm，生长状态良好的荷人肝癌BEL-7402裸鼠，无菌条件下将新鲜的瘤组织切成2～4mm³的小块，置于RPMI1640培养液中，在裸鼠腹部外侧皮下剪一小口，用无钩眼科镊子将瘤块移植于皮下。将已接种肿瘤的裸鼠，随机分为生理盐水组(0.2ml只^-1d^-1)、YSL不同剂量组(320μgkg^-1d^-1、160μgkg^-1d^-1、80μgkg^-1d^-1)，各组药物分别溶于0.2ml生理盐水中，于肿瘤接种后次日，经腹腔注射，每日一次，连续给药60天。

实施例1

反转录PCR(RT-PCR)法检测YSL对BEL-7402裸鼠移植瘤细胞中线粒体呼吸链相关基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1，钙稳态调节蛋白基因Calreticulin，以及基因PTEN、Akt1/2、p27、p21的mRNA表达的影响

具体步骤如下：

(1)样本制备

在YSL抗人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤实验中，从生理盐水组和酪丝亮肽160μg/kg/d剂量组中，每组随机抽取5只荷瘤裸鼠，颈椎脱臼处死后，用无RNA酶的眼科剪剥离肿瘤组织，选取肿瘤生长情况良好，无明显坏死、破溃、质地较硬的部位，剪成约50mg的小块，锡纸包好后，立即放入液氮中冻存备用。

(2)总RNA提取

1)组织匀浆：从液氮中取出冻存肿瘤组织冰上称取50～100mg，每份组织加入1mlTRIZOL(Invitrogen，Inc.USA.)冰上匀浆，15～30℃静置5min。

2)RNA分离：以每1mlTRIZOL加入0.2ml的比例加入氯仿，剧烈震荡15s，15～30℃静置2～3min，4℃下12,000g离心15min，吸取上层水相至新管。

3)RNA沉淀：RNA水相中，以每1mlTRIZOL加入0.5ml的比例加入异丙醇，15～30℃静置10min，4℃下12,000g离心10min，弃上清。

4)RNA洗涤：沉淀按每1mlTRIZOL加入1ml的比例加入75％乙醇，剧烈震荡，4℃下7,500g离心5min，弃上清。

5)RNA复溶：沉淀空气干燥5～10min，溶于30μl去RNA酶水，55～60℃水浴10min。除用于RNA浓度及纯度鉴定的样本，其余都冻存于-80℃冰箱。

6)RNA定量分析：紫外分光光度计检测A325、A280、A260、A230以确定RNA的纯度和含量，A260/A280值在1.8～2.0之间。公式：RNA量(μg/ml)＝A260/0.025×稀释倍数。

(3)RT-PCR

50μl反应体积中5×/AMVTf1缓冲液10μl，AMV逆转录酶1μl，Tf1DNA聚合酶1μl，dNTP1μl，Mg²⁺2μl，上下游引物各50pmol，总RNA 1μg。逆转录条件为48℃逆转录45min，94℃AMV逆转录酶灭活/RNA/cDNA引物变性2min，PCR引物及扩增条件见下表1。并且每只裸鼠的总RNA分别进行这十个基因的RT-PCR检测，并对所得的结果进行统计学处理。

表1

(4)PCR产物的鉴定

1.5％琼脂糖凝胶电泳PCR产物，以100bp DNA Marker为分子量标记，80V恒压电泳40min，在紫外灯下观察照相。

(5)数据处理

采用Scion Image软件读取光密度值及灰度值。以GAPDH作为内参照，以靶基因灰度/GAPDH灰度比值作为mRNA的相对表达丰度，采用方差分析法统计各组数据。

(6)实验结果

1)RT-PCR结果显示，同生理盐水组相比，酪丝亮肽组(160μg/kg/d)裸鼠移植瘤细胞NDUFA2、NDUFA10，NDUFS1，SUCLG1基因的mRNA表达水平均不同程度下降。(图1，图2)

2)以GAPDH作为内参照，以靶基因/GAPDH灰度比值作为mRNA的相对表达丰度。结果显示，酪丝亮肽能够增加人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤细胞中Calreticulin的mRNA表达。(见图3，图4)

3)酪丝亮肽能构促进人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤组织中抑癌基因PTEN、P21、P27的mRNA的表达，抑制癌基因AKT的mRNA的表达。(图5至图8)

实施例2

用于检测酪丝亮肽作用效果的试剂盒

该试剂盒具有一盒体，盒体内包括分别盛装有SEQ ID No.1～22的固态干粉引物的密封容器。

该试剂盒内还可以含有分别盛装有下述物质的密封容器：

DEPC处理的灭菌双蒸水、2.5mmol/L dNTP、15mmol/L氯化镁、10X PCR缓冲液、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶。

其中，10X PCR缓冲液的配制(100ml体积)如下：

DEPC处理的灭菌双蒸水                    70mL

三羟甲基氨基甲烷(Tris)                  0.158g

氯化钾                                  0.373g

曲拉通X-100                             0.1mL

盐酸                                    调PH至9.0

DEPC处理的灭菌双蒸水                    加至100mL

该试剂盒在使用时，可先将固态干粉引物加灭菌双蒸水按浓度为10pmol/μL配成溶液，然后按照下述比例配成反应体系(25μL体系)：

DEPC处理的灭菌双蒸水         13μL

2.5mmol/L dNTP               2.5μL

10pmol/μL RT-PCR引物        1.5μL

15mmol/L氯化镁               2μL

10X PCR缓冲液                2.5μL

AMV反转录酶                  0.2μL

RNA酶抑制剂                  0.3μL，

Taq DNA聚合酶                1μL

提取的样品RNA                2μL

该试剂盒可用于实施例1中的实验过程。

实施例3

用基因芯片的方法检测YSL对BEL-7402裸鼠移植瘤细胞中线粒体呼吸链相关基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1，钙稳态调节蛋白基因Calreticulin，以及基因PTEN、Akt1/2、p27、p21的mRNA表达的影响

将实施例1中抽提得到的生理盐水组荷瘤裸鼠的总RNA，利用表1中NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Calreticulin、PTEN、Akt1/2、p27、p21的引物以及反应条件分别进行RT-PCR，得到该十个基因的cDNA序列。将得到的该十个基因的cDNA序列按常规的点样法在玻片载体上点样制备基因芯片。另外，该基因芯片上还点有GAPDH的cDNA序列作为阳性参照基因，空白点作为阴性参照点。

制备得到的基因芯片用于下面实验。

1 标本

在YSL抗人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤实验中，随机抽取生理盐水组人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤标本1份，酪丝亮肽组(160μg/kg/d)人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤标本2份。

2 总RNA的抽提及双链cDNA的合成

TRIZOL法抽提每份肿瘤组织标本中的总RNA，用RNeasy mini kit纯化，分光光度计检测RNA的纯度和浓度。以纯化后的总RNA为模板，分别用SupercriptII RT、E.coliDNA连结酶及E.coli DNA聚合酶逆转录合成cDNA的第一链和第二链。

3 cRNA的合成、标记及片段化

以cDNA为模板，用T7 RNA聚合酶体外转录合成生物素标记的cRNA，再用RNeasy minikit纯化，分光光度计检测cRNA的纯度和浓度。得到的cRNA样本在片段化缓冲液中分裂为长50～100核苷酸的片段。

4 Test芯片杂交测试

为检测每个样本cRNA的质量及杂交系统的稳定性，正式芯片杂交前，先用Test芯片进行杂交测试实验。片段化的cRNA加入杂交液，混匀，和Test基因芯片在45℃杂交16小时后，根据芯片类型选择相应的洗脱和染色程序。最后用基因芯片扫描仪扫描。结果显示背景信号符合实验要求，标准对照基因表达符合要求，芯片质量及杂交体系合格，样本质量合格(3’/5’＜3)，故可继续实验。

5 芯片杂交

片段化的cRNA加入杂交液，混匀，和基因芯片在45℃杂交16小时后，进行洗脱和染色程序。最后用基因芯片扫描仪扫描。

6 芯片结果数据分析

用Microarray Suite 5.0软件对数据进行综合分析比较，酪丝亮肽组(160μg/kg/d)人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤的基因表达与生理盐水组比较，差异有无显著性用one-sideWilcoxon’s signed rank test进行检验，p＜0.0025为基因表达上调有显著性；p＞0.9975为基因表达下调有显著性。

结果如下所示，且所示结果与用RT-PCR方法得到的结果一致：

基因	倍数	P值
			SUCLG1	2.32	0.9998
NDUFA10	2.41	0.9996
			NDUFA2	2.32	0.9991
NDUFS1	2.41	0.9979
			AKT1	2.08	0.9995
AKT2	1.16	0.9982
			PTEN	2.56	0.0009
CALR	2.79	0.0016
			p21	2.13	0.0021
p27	2.24	0.0018

实验例2

在YSL抗人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤实验中，在给药结束后次日，逐只剖取肿瘤，称量、记录瘤重，并检查肿瘤有无坏死感染等情况。用游标卡尺测量肿瘤的3个互相垂直的直径，代入下式计算：V＝(1/6)πABC。V为肿瘤体积，A、B、C为瘤体的3个直径。计算肿瘤抑制率(％)＝(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％。

结果如下，在YSL给药剂量为80μg/kg/d～320μg/kg/d时，肿瘤抑制率分别为21.66％、41.34％和34.78％，与生理盐水组比较均有显著性差异(P＜0.05)(表2)。

表2  YSL对裸鼠人肝癌BEL-7402移植瘤的抑制作用

^*：与生理盐水比较，P＜0.05

同时，选取肿瘤生长情况良好，无明显坏死、破溃、质地较硬部位剪取1-2mm³的瘤块立即浸泡于盛有2.5％戊二醛中，JEOL-100CX型透射电镜下观察肿瘤细胞超微结构改变。

结果为，YSL可引起肿瘤细胞的染色质溶解，细胞出现坏死和凋亡。线粒体肿胀，溶解，内质网扩张，多见扩张的内质网中有散在的钙颗粒，提示有钙过载现象发生。(见图9)

                            序列表

<110>一泰医药研究(深圳)有限公司

<120>检测酪丝亮肽抗肝癌效果的方法及所用试剂盒与基因芯片

<130>CY0510517

<160>32

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

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tgcttgactc gtaccatgtc c                                               21

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agttccggca agttctacgg                                                 20

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ggacgaactg gtgtaatgat atg                                             23

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tctactgttt ttgtgaagta cagc                                            24

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atgagcgacg tggctattgt gaat                                            24

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gaggccgtca gccacagtct ggatg                                           25

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tgcttgaggc tgttggcgac c                                               21

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aagaccatgt ggacctgtca                                                 20

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ggcttcctct tggagaagat                                                 20

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atgtcaaacg tgcgagtgtc t                                               21

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ttacgtttga cgtcttctga                                                 20

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ctcagacacc atggggaagg tga                                             23

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atgatcttga ggctgttgtc ata                                             23

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<211>600

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>23

gagggtccgc ggttggtcag accggggcac ttggcctgaa gacctggaat tggcgacttc     60

gatattaaca aggatggcgg cggccgcagc aagtcgagga gtcggggcaa agctgggcct    120

gcgtgagatt cgcatccact tatgtcagcg ctcgcccggc agccagggcg tcagggactt    180

cattgagaaa cgctacgtgg agctgaagaa ggcgaatccc gacctaccca tcctaatccg    240

cgaatgctcc gatgtgcagc ccaagctctg ggcccgctac gcatttggcc aagagacgaa    300

tgtccctttg aacaacttca gtgctgatca ggtaaccaga gccctggaga acgttctaag    360

tggtaaagcc tgaagcctcc actgaggatt aagagcaaca gccccagagc ctgggctctg    420

ctggacttag tataatgtga aaaaaatgtg ttctcctatt cctcataaag cttgtgctgt    480

aaaatacttt ctcagggtgt tcttgtcctc atctaccctc taccccttac tgtgcaacca    540

ctgaggcaaa gtagcttaat ataaaaataa aactttattc tgtctcaaaa aaaaaaaaaa    600

<210>24

<211>1557

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>24

ggcagcgcgc cggccgcgag agagggcccc gtcgcgaccg cgtccccttg ggtccttgat     60

cctgagctga ccgggtagcc atggccttgc ggctcctgaa gctggcagcg acgtccgcgt    120

ccgcccgggt cgtggcggcg ggcgcccagc gcgtgagagg aattcatagc agtgtgcagt    180

gcaaactgcg ctatggaatg tggcatttcc tacttgggga taaagcaagc aaaagactga    240

cagaacgcag cagagtgata actgtagatg gcaatatatg tactggaaaa ggcaaacttg    300

caaaagaaat agcagagaaa ctaggcttca agcactttcc tgaagcgggg attcattatc    360

cagacagtac cacaggagat gggaagcccc tcgccaccga ctataatggc aactgtagtt    420

tggagaaatt ttacgatgat ccgagaagca atgatggcaa cagttaccgc ctgcagtcct    480

ggttgtacag cagtcgcctg ctgcagtact cagatgcctt ggagcacttg ctgaccacag    540

gacaaggtgt tgtgttggag cgctccatct tcagtgactt tgtgttcctg gaggcgatgt    600

acaaccaggg attcatccga aagcagtgtg tggaccacta caacgaggtg aagagcgtca    660

ccatctgcga ttacctgccc ccccacctgg tgatttacat cgatgtgccc gttccagagg    720

tccagaggcg gattcagaag aaaggagatc cacatgaaat gaagatcacc tctgcctatc    780

tacaggacat tgagaatgcc tataagaaaa cctttctccc tgagatgagt gaaaaatgtg    840

aggttttaca atattctgca agggaagctc aagattcaaa aaaggtggta gaggacattg    900

aatacctgaa gttcgataaa gggccgtggc tcaagcagga caatcgcact ttataccacc    960

tgcgattact ggttcaggat aagtttgagg tgctgaatta cacaagcatt cctatctttc   1020

tcccggaagt caccattgga gctcatcaga ctgaccgtgt cttacatcag ttcagagagc   1080

tgccgggccg caagtacagc cctgggtaca acaccgaggt gggagacaag tggatctggc   1140

tgaagtgaac gggccgcctt ctgctccagc tgcatcacag tgatggccaa gctgcatcag   1200

ccgcactctc ctggacgcca tatagcttta agatcggggg agggtaaata atgcaaaaat   1260

tgcacagtgg aagaaggggt ctcacaaaaa gcaatccatc ctgtagtata ggtaatggag   1320

ttgggggaag cagcttccat tctggatgtt tggaaccctt tagctttgtt ttggaatggc   1380

ccaccattct cactggaaaa cagtggtctg ctgtgaaagg ccagctctcg gcagcccctg   1440

tggtttcagc gctgccgctc tgtgtcattc aggttgtgca cattgttttt cttctgactt   1500

ccagaaataa aagtgtttcc atgggaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa      1557

<210>25

<211>3417

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>25

ttctccaggc ccggctgaca gagttagccg aggccgccat attgaataag cgacccggcc     60

tcctaggggg tcgtcgtggt ccagacagtt tagcagaaca gcctccgcgg ctccggggag    120

aagcaatatg ttaaggatac ctgtaagaaa ggccttagta ggcctttcta agtctcctaa    180

aggatgtgtt cgaacaactg ccacagcagc aagcaacttg attgaagtat ttgttgatgg    240

tcagtctgtc atggtggaac cgggaacgac cgtcctccaa gcttgtgaga aggttggcat    300

gcagatccct cgattctgtt atcatgaaag gttgtctgtt gctggaaact gcaggatgtg    360

ccttgttgaa attgagaaag cccctaaggt tgtagctgct tgtgccatgc cagtaatgaa    420

gggttggaat atcctaacaa actcagaaaa atccaaaaaa gccagggaag gtgtgatgga    480

gttcttatta gcaaatcacc cattggactg tcctatttgt gaccagggag gtgaatgtga    540

tctgcaggac cagtccatga tgtttggaaa tgataggagc cgatttttag aggggaagcg    600

tgctgtggaa gacaagaaca ttgggccatt ggtaaagacc atcatgacaa gatgtataca    660

gtgtactcgc tgcatcaggt ttgcaagtga gattgcagga gtagatgatt tgggaacaac    720

aggcagagga aatgatatgc aagttggcac atacattgaa aagatgttca tgtctgaact    780

gtctgggaat atcattgata tctgccctgt aggtgcccta acctctaagc cctatgcctt    840

tactgcccgg ccttgggaaa caagaaagac agaatccatt gatgtaatgg atgcggttgg    900

aagtaatatt gtggttagca caagaactgg agaagtgatg aggattttgc cacgtatgca    960

tgaggacatc aatgaagagt ggatctctga taaaaccaga tttgcctatg atgggctaaa   1020

acgtcaaaga cttaccgagc caatggtcag aaatgaaaaa gggcttttaa cctatacttc   1080

ttgggaggat gcgctctctc gcgtagctgg aatgttgcag agttttcaag gcaaagatgt   1140

ggcagcaatt gcaggtggct tggtggatgc tgaagccctg gtagctctca aagatttgct   1200

taatagagtg gactctgaca ccttatgcac tgaagaggtc ttccccactg caggagctgg   1260

cacagatttg cgttccaatt atcttcttaa tactacaatt gctggtgtgg aagaggcaga   1320

tgttgttctt ctggttggta caaacccacg ttttgaggca ccactgttta atgctagaat   1380

tcgaaagagc tggctgcata atgacttaaa agtggccctt ataggcagtc cagtggacct   1440

cacttacaca tatgaccacc tgggagactc ccccaaaatt cttcaagaca ttgcttcggg   1500

aagccatcca tttagccagg tcctaaagga agctaaaaaa ccaatggtgg ttttaggcag   1560

ttctgcactc caaagaaatg atggagcagc aattcttgca gctgtttcta gcattgcaca   1620

aaagattcgg atgactagtg gtgttactgg tgattggaaa gttatgaata tccttcatag   1680

gattgcaagt caagtagctg ctttggacct tggctataag cctggggtgg aagcaattcg   1740

gaagaaccct cccaaggtgc tgtttctcct gggagcagat ggaggttgta tcacacgaca   1800

ggatttgcca aaggattgtt tcattattta tcaaggacat catggtgatg ttggggctcc   1860

catagctgat gttattctcc caggagctgc ttacacagag aagtctgcta catatgtcaa   1920

cactgagggt agagctcagc agactaaggt agcagtgaca cctcctggct tggcaagaga   1980

agactggaaa attataagag cactctctga gattgctgga atgactcttc catatgatac   2040

tctggatcaa gtaaggaaca gattggaaga agtctctcct aatcttgttc gatatgatga   2100

tattgaaggg gctaattact tccagcaagc aaatgagctc tcaaagctag tgaaccagca   2160

gcttcttgct gacccacttg ttccacctca gctaactata aaagacttct acatgacaga   2220

ttcaattagc agagcctcac agacaatggc caaatgtgtc aaagctgtca cagagggtgc   2280

ccaggcagta gaggaaccat ccatatgctg aagcttctac taggatccca gttttgccgc   2340

agataattaa tggacaactg tagtgcagtg atcctttaca ggtttatttc tttgtaaaaa   2400

aaaataataa taatttgaat catgtaatat ttaaggttat actatgccta tttgaaaatg   2460

atattagtta tcaactttgc agtttgaaaa acatgtattg tgtgtaaagg ttaaataaca   2520

aaactatgca gatgctctta aaagcattga taacctttgt gacgaacata aagagatcct   2580

taaattatga gttgttggct tatcttcata aataatttgt ctgtaaaatg gatgaaatga   2640

aaagaggttc aattaaaacc tacttttttc tagtgctaaa gaaaagattt aagcaccttg   2700

tcaagctggg taaataggaa aaatacataa tcatgctcag atatgtatct aggataatta   2760

taattaataa taatcatagt aacaatggct aatgataatt tagctttatt atatgtgcta   2820

agcactctgg ttttacatgc attatcttct tttgttcttg ctacaaccct gtgagatagt   2880

agtattatct cattttactg atgaagactg aagcctaggt atattaaata gcttgcccaa   2940

ggccacacag caaaagtcac caactcaaac ctacttctta tttactccaa agcctgttgt   3000

tcttaactgc aacatattat ttcgtctcat taatgttgat tctataggtt gttacttcta   3060

aaaattagta ttgagtttaa tggtgaacac atttttctat tttctcttga atctgcttct   3120

ataatgtcat ggtgatttat gtggcttttt tttttttata agttatacat gtatgcatgt   3180

atacttatga gacctccctt ggaatgaggg aggtctcaag agatataatt tagattctca   3240

ttgatgttct gtattcatta tcctaacacc atctgtagtg ttaaatcaac taaattattt   3300

cagcaatagg agacaaaaca accagctttc ataattttta attgtcaaaa ccaaaaggaa   3360

tcagaataag gatcactgag aatttaaaaa aataaaaaag gaagtaaaaa ttttaca      3417

<210>26

<211>1227

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>26

aacccttgcc gctgccgctg acatcgctac catggtctcc ggcagcagcg gcctcgccgc     60

cgcccgtctc ctgtcgcgca gcttcctcct gccgcagaat ggaattcggc attgttccta    120

cacagcttct cggcaacatc tctatgttga taaaaataca aagattattt gccagggttt    180

cactggcaaa cagggcacct ttcacagcca gcaggcattg gaatatggca ccaaactcgt    240

tggaggaaca ctcccaggga aaggaggcca gacacatctg ggcttacctg tctttaatac    300

tgtgaaggag gccaaagaac agacaggagc aacggcttct gtcatttatg ttcctccgcc    360

ttttgctgct gctgccatta atgaagctat tgaggcagaa attcccttgg ttgtgtgtat    420

cactgaagga attccccagc aggacatggt acgagtcaag cacaaactgc tgcgccagga    480

aaagacaagg ctaattgggc ccaactgccc tggagtcatc aatcctggag aatgtaaaat    540

tgggatcatg cctggccata ttcacaaaaa aggaaggatt ggcattgtgt ccagatctgg    600

caccctgact tatgaagcag ttcaccaaac aacgcaagtt ggattggggc agtctttgtg    660

cgttggcatt ggaggtgatc cttttaatgg aacagatttt attgactgcc tcgaaatctt    720

tttgaacgat tctgccacag aaggcatcat attgattggt gaaattggtg gtaatgcaga    780

agagaatgct gcagaatttt tgaagcaaca taattcaggt ccaaattcca agcctgtagt    840

gtccttcatt gctggtttaa ctgctcctcc tgggagaaga atgggtcatg ccggggcaat    900

tattgctgga ggaaaaggtg gagctaaaga gaagatctct gcccttcaga gtgcaggagt    960

tgtggtcagt atgtctcctg cacagctggg aaccacgatc tacaaggaat ttgaaaagag   1020

gaagatgcta tgaaagaaaa aaaaaattcc taaaactgtg gaatggatca cgtagacatg   1080

taacccagca gcagtttgct tctgttgtcc actgattaat cagcctatgt gcctgacact   1140

ggtcttgcag tacaactgga agccaaaaca aggtggaaga tgtcctgaat taagacgttt   1200

tcaccacatt gtattacaga gacagcc                                       1227

<210>27

<211>1899

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>27

gtccgtactg cagagccgct gccggagggt cgttttaaag ggccgcgttg ccgccccctc     60

ggcccgccat gctgctatcc gtgccgctgc tgctcggcct cctcggcctg gccgtcgccg    120

agcccgccgt ctacttcaag gagcagtttc tggacggaga cgggtggact tcccgctgga    180

tcgaatccaa acacaagtca gattttggca aattcgttct cagttccggc aagttctacg    240

gtgacgagga gaaagataaa ggtttgcaga caagccagga tgcacgcttt tatgctctgt    300

cggccagttt cgagcctttc agcaacaaag gccagacgct ggtggtgcag ttcacggtga    360

aacatgagca gaacatcgac tgtgggggcg gctatgtgaa gctgtttcct aatagtttgg    420

accagacaga catgcacgga gactcagaat acaacatcat gtttggtccc gacatctgtg    480

gccctggcac caagaaggtt catgtcatct tcaactacaa gggcaagaac gtgctgatca    540

acaaggacat ccgttgcaag gatgatgagt ttacacacct gtacacactg attgtgcggc    600

cagacaacac ctatgaggtg aagattgaca acagccaggt ggagtccggc tccttggaag    660

acgattggga cttcctgcca cccaagaaga taaaggatcc tgatgcttca aaaccggaag    720

actgggatga gcgggccaag atcgatgatc ccacagactc caagcctgag gactgggaca    780

agcccgagca tatccctgac cctgatgcta agaagcccga ggactgggat gaagagatgg    840

acggagagtg ggaaccccca gtgattcaga accctgagta caagggtgag tggaagcccc    900

ggcagatcga caacccagat tacaagggca cttggatcca cccagaaatt gacaaccccg    960

agtattctcc cgatcccagt atctatgcct atgataactt tggcgtgctg ggcctggacc   1020

tctggcaggt caagtctggc accatctttg acaacttcct catcaccaac gatgaggcat   1080

acgctgagga gtttggcaac gagacgtggg gcgtaacaaa ggcagcagag aaacaaatga   1140

aggacaaaca ggacgaggag cagaggctta aggaggagga agaagacaag aaacgcaaag   1200

aggaggagga ggcagaggac aaggaggatg atgaggacaa agatgaggat gaggaggatg   1260

aggaggacaa ggaggaagat gaggaggaag atgtccccgg ccaggccaag gacgagctgt   1320

agagaggcct gcctccaggg ctggactgag gcctgagcgc tcctgccgca gagcttgccg   1380

cgccaaataa tgtctctgtg agactcgaga actttcattt ttttccaggc tggttcggat   1440

ttggggtgga ttttggtttt gttcccctcc tccactctcc cccaccccct ccccgccctt   1500

tttttttttt tttttaaact ggtattttat cctttgattc tccttcagcc ctcacccctg   1560

gttctcatct ttcttgatca acatcttttc ttgcctctgt gccccttctc tcatctctta   1620

gctcccctcc aacctggggg gcagtggtgt ggagaagcca caggcctgag atttcatctg   1680

ctctccttcc tggagcccag aggagggcag cagaaggggg tggtgtctcc aaccccccag   1740

cactgaggaa gaacggggct cttctcattt cacccctccc tttctcccct gcccccagga   1800

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<210>28

<211>3416

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>28

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<210>29

<211>3008

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>29

taattatggg tctgtaacca ccctggactg ggtgctcctc actgacggac ttgtctgaac     60

ctctctttgt ctccagcgcc cagcactggg cctggcaaaa cctgagacgc ccggtacatg    120

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ttcaaatgca ttttgggggt ttttaatctt tgtgacagga aagccctccc ccttcccctt   2700

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<210>30

<211>1715

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<400>30

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<210>31

<211>2140

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>31

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<210>32

<211>2422

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>32

gtcagcctcc cttccaccgc catattgggc cactaaaaaa agggggctcg tcttttcggg     60

gtgtttttct ccccctcccc tgtccccgct tgctcacggc tctgcgactc cgacgccggc    120

aaggtttgga gagcggctgg gttcgcggga cccgcgggct tgcacccgcc cagactcgga    180

cgggctttgc caccctctcc gcttgcctgg tcccctctcc tctccgccct cccgctcgcc    240

agtccatttg atcagcggag actcggcggc cgggccgggg cttccccgca gcccctgcgc    300

gctcctagag ctcgggccgt ggctcgtcgg ggtctgtgtc ttttggctcc gagggcagtc    360

gctgggcttc cgagaggggt tcgggccgcg taggggcgct ttgttttgtt cggttttgtt    420

tttttgagag tgcgagagag gcggtcgtgc agacccggga gaaagatgtc aaacgtgcga    480

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cattttcttt tcacttcggg ctgtgtaaac acagtcaaaa taattctaaa tccctcgata   1920

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gctaaaaaaa aaaaaaaaaa aa                                            2422

Claims (4)

1、一种用于检测酪丝亮肽作用效果的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有在反转录PCR方法中分别检测基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Calreticulin、PTEN、Akt1、Akt2、P21、P27的mRNA表达水平的引物序列，

所述基因NDUFA2的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.23中第74～373位碱基所示的序列；

所述基因NDUFA10的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.24中第81～1148位碱基所示的序列；

所述基因NDUFS1的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.25中第128～2311位碱基所示的序列；

所述基因SUCLG1的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.26中第32～1033位碱基所示的序列；

所述基因Calreticulin的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.27中第69～1322位碱基所示的序列；

所述基因PTEN的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.28中第1032～2243位碱基所示的序列；

所述基因Akt1的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.29中第555～1997位碱基所示的序列；

所述基因Akt2的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.30中第204～1649位碱基所示的序列；

所述基因P21的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.31中第95～589位碱基所示的序列；

所述基因P27的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.32中第466～1062位碱基所示的序列。

2、根据权利要求1所述的一种用于检测酪丝亮肽作用效果的试剂盒，其特征在于：所述检测基因NDUFA2的引物序列如序列表中SEQ ID No.1和2所示；

所述检测基因NDUFA10的引物序列如序列表中SEQ ID No.3和4所示；

所述检测基因NDUFS1的引物序列如序列表中SEQ ID No.5和6所示；

所述检测基因SUCLG1的引物序列如序列表中SEQ ID No.7和8所示；

所述检测基因Calreticulin的引物序列如序列表中SEQ ID No.9和10所示；

所述检测基因PTEN的引物序列如序列表中SEQ ID No.11和12所示；

所述检测基因Akt1的引物序列如序列表中SEQ ID No.13和14所示；

所述检测基因Akt2的引物序列如序列表中SEQ ID No.15和16所示；

所述检测基因P21的引物序列如序列表中SEQ ID No.17和18所示；

所述检测基因P27的引物序列如序列表中SEQ ID No.19和20所示。

3、根据权利要求1或2所述的一种用于检测酪丝亮肽作用效果的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中进一步含有参照基因GAPDH的反转录PCR的引物序列，该引物序列如序列表中SEQ ID No.21和22所示。

4、一种用于检测酪丝亮肽作用效果的基因芯片，其特征在于：在所述基因芯片的固相载体上固定有能分别与基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Calreticulin、PTEN、Akt1、Akt2、P21、P27的cDNA序列杂交的核酸序列，

所述基因NDUFA2的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.23中第74～373位碱基所示的序列；

所述基因NDUFA10的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.24中第81～1148位碱基所示的序列；

所述基因NDUFS1的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.25中第128～2311位碱基所示的序列；

所述基因SUCLG1的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.26中第32～1033位碱基所示的序列；

所述基因Calreticulin的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.27中第69～1322位碱基所示的序列；

所述基因PTEN的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.28中第1032～2243位碱基所示的序列；

所述基因Akt1的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.29中第555～1997位碱基所示的序列；

所述基因Akt2的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.30中第204～1649位碱基所示的序列；

所述基因P21的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.31中第95～589位碱基所示的序列；

所述基因P27的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.32中第466～1062位碱基所示的序列。

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