CN1556221A - Ic53基因及其相关产物诊断和治疗结肠癌的用途及一种诊断结肠癌的试剂盒 - Google Patents

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CN1556221A CNA2004100000703A CN200410000070A CN1556221A CN 1556221 A CN1556221 A CN 1556221A CN A2004100000703 A CNA2004100000703 A CN A2004100000703A CN 200410000070 A CN200410000070 A CN 200410000070A CN 1556221 A CN1556221 A CN 1556221A
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Abstract

本发明公开了IC53基因及其相关产物在制备检测结肠癌的试剂中的应用，其相关产物包括蛋白、肽、抗体及本基因相关的正、反义寡核甘酸和小干扰RNA。本发明的有益效果是：1)首次发现了IC53基因超表达与结肠癌发生、发展之间的关系，提供了一种诊断结肠癌的新思路，为研究开发治疗结肠癌的药物提供了新的靶点；2)通过免疫组化和原位杂交分析了IC53在癌症组织与正常组织间的表达差异，并分析了IC53超表达对细胞增殖、迁移、粘附及裸鼠中瘤体生长的影响，发现IC53在结肠癌中高表达并对结肠癌的发展起促进作用。据此，提供了一种用于诊断结肠癌的检测试剂盒，利用免疫组化方法检测IC53在结肠癌病变组织中的表达情况，操作简单易行、结果安全可靠、易于临床推广。

Description

IC53基因及其相关产物诊断和治疗结肠癌的用途及一种诊断结肠癌的试剂盒
技术领域
本发明涉及IC53基因及其相关产物用于诊断和治疗结肠癌的用途及一种诊断结肠癌的试剂盒，属于生物工程领域。
背景技术
结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，以40岁～50岁年龄组发病率最高。据世界流行病学调查，结肠癌在北美、西欧、澳大利亚、新西兰等地的发病率最高，居内脏肿瘤前二位，在中国的发病率与死亡率低于胃癌、食管癌、肺癌等常见恶性肿瘤。近年来各地资料显示随着人民生活水平的提高，饮食结构的改变，其发病率呈逐年上升趋势。中国的有关资料显示，结肠癌发病率占全部恶性肿瘤的第4位，而且有逐年增加的趋势。上海市是中国结肠癌发病率和死亡率最高的城市。有数据显示，近年来，结肠癌中直肠癌多于结肠癌的情况有所改变，结肠癌的发病比例开始增加。1997年，上海大肠癌的发病率男性高达37.2/10万，女性也达到了35.5/10万。
在癌症的发生、发展过程中通常伴随许多基因的表达或活性异常，包括与细胞生长、分裂和增殖有关基因如：生长因子、生长因子受体、蛋白激酶、细胞周期相关基因3等，与凋亡相关基因如：肿瘤坏死因子(TNF)家族、Fas/fas的配体、Bcl-2/Bax、p53等，与浸润及转移有关的基因如：整合素(intergrins)家族、E-Cadherin(钙调蛋白)、VEGF及PDGF等。
参与癌症发生过程的基因主要有两大类：原癌基因和抑癌基因。原癌基因是被激活或失活的基因，其产物促进细胞生长。原癌基因产物包括肽生长因子、生长因子受体、信号传导因子、酪氨酸激酶和转录调节蛋白。超过30种原癌基因已经在人类基因组上定位。抑癌基因能正常调节细胞生长。这些基因通常编码核调节蛋白，这些蛋白与其他的调节蛋白作用以改变他们的活性。此外，与原癌基因和抑癌基因无关的基因也参与肿瘤的发生与发展。这些基因通常被归类于MMR基因。近来，发现它们存在于细菌或酵母中，研究者们已经找到了两个人类基因hMSH2和hMLH1，与酵母MMR基因有同源性。这些基因参与结肠、肺、膀胱、及卵巢肿瘤的发生。
IC53基因是一个从成人主动脉cDNA文库中克隆到的一个新基因，生物信息学分析发现它与C53互为变位剪接体，故命名为IC53(Isoform of C53)。该基因长2538bp，定位于17q21.31，与C53相比多708bp(IC53的357-1064位)，推断IC53蛋白包含419个氨基酸残基，与小鼠C53有84％的同一性，该蛋白无跨膜区，不包含任何已知的功能域。Northern杂交发现该基因有两个转录本，分别为3.2kb及2.0kb，在下列组织或细胞中广泛表达：脑、心脏、骨骼肌、结肠(不含粘膜)、胸腺、脾、肾脏、肝脏、小肠、胎盘、肺、外周血白细胞、早幼粒白血病HL-60细胞系、宫颈癌细胞系S3株、慢性粒细胞白血病K-562细胞系、淋巴母细胞性白血病MOLT-4细胞系、Burkitt′s淋巴瘤Raji细胞系、结肠腺癌SW480细胞系、肺癌A549细胞系及黑色素瘤G-361细胞系。以IC53特异的核甘酸序列(433-1065)做探针分析，发现IC53为3.2kb，在肝脏，外周血白细胞，早幼粒白血病HL-60细胞系，淋巴母细胞性白血病MOLT-4细胞系及Burkitt′s淋巴瘤Raji细胞系中高表达。
发明内容
本发明的目的是提供IC53基因及其产物(蛋白、肽、抗体及本基因相关的正、反义寡核甘酸、小干扰RNA(siRNA))在制备结肠癌诊断试剂中的应用。
本发明的另一个目的是提供IC53基因及其产物(蛋白、肽、抗体及本基因相关的正、反义寡核甘酸、小干扰RNA(siRNAs))在制备治疗结肠癌的药物中的应用。
本发明的再一个目的是提供一种诊断结肠癌的试剂盒及其用途。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
IC53基因及其相关产物在制备检测结肠癌的试剂中的应用，其相关产物包括蛋白、肽、抗体及本基因相关的正、反义寡核甘酸和小干扰RNA(siRNAs)。
所述的IC53基因相关产物是指IC53基因、IC53基因的剪接体、IC53基因的反义寡核苷酸、小干扰RNA、IC53基因编码的肽段和IC53基因的抗体中的一种或几种。
IC53基因在制备检测结肠癌的试剂中的应用。IC53基因在结肠癌中超表达，促进瘤体生长及癌细胞转移，是结肠癌的关键相关调控基因。根据Microarray的结果，IC53超表达可以上调一些与癌症相关的基因表达，如PDGF-B，fra-1，integrin □2，integrin □4，提示IC53可能与癌症相关。我们通过Clontech公司(California，USA)的多种癌组织芯片，免疫组化及原位杂交分析了IC53在癌组织与正常组织间的表达差异。并分析了IC53超表达对细胞增殖、迁移、粘附及裸鼠中瘤体生长的影响。结果发现IC53在结肠癌中表达较正常组织高，IC53超表达能促进HCT-116及HT-29细胞增殖并且在体内能促进瘤体(HCT-116接种裸鼠)生长，能促进NIH 3T3、HCT-116及HT-29细胞迁移，能促进HCT-116及HT-29细胞粘附。这表明IC53在结肠癌中高表达并对结肠癌的进展起促进作用。检测IC53在结肠癌病人中的表达情况有助于判断其预后，阻断这一过程，抑止结肠癌的生长及迁移，从而开发出用于诊断和治疗结肠癌的试剂及治疗性产品。
所述的IC53基因是指IC53基因、IC53基因的剪接体、IC53基因的反义寡核苷酸、IC53基因编码的肽段和IC53基因的抗体中的一种或几种。
IC53基因在制备治疗结肠癌的药物中的应用。
所述的药物由有效量的IC53基因、或IC53基因的剪接体、或IC53基因的反义寡核苷酸、或IC53基因编码的肽段、或IC53基因的抗体与一种或多种药学上可接受的载体或赋型剂组成。
所述药物中有效量的IC53基因、或IC53基因的剪接体、或IC53基因的反义寡核苷酸、或IC53基因编码的肽段、或IC53基因的抗体为天然分离得到的。
所述药物中有效量的IC53基因、或IC53基因的剪接体、或IC53基因的反义寡核苷酸、或IC53基因编码的肽段、或IC53基因的抗体为化学合成得到的。
所述药物中有效量的IC53基因、或IC53基因的剪接体、或IC53基因的反义寡核苷酸、或IC53基因编码的肽段、或IC53基因的抗体为通过生物工程方法制备得到的。
一种检测结肠癌的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含有以下试剂：
1)0.1％胰蛋白酶；
2)10％羊血清；
3)一抗：鼠抗人单克隆IC53抗体；
4)生物素化二抗工作液；
5)辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液；
6)DAB(3，3-二氨基联苯胺)，30mg溶于100ml磷酸盐缓冲液(PBS)；
7)细胞核分化液：100ml 75％酒精中加浓盐酸0.5ml，混匀。
本试剂盒采用免疫组织化学原理对IC53基因进行检测，是用标记的特异性抗体对组织细胞内抗原的分布进行定位并在组织原位显示其表达量的方法，其基本原理是利用抗原抗体特异反应，结合酶联放大系统进行检测。其基本过程主要包括抗原修复，非特异位点的封闭，抗原抗体反应，酶联显色等。
本试剂盒还可以在免疫组化试验的同时进行原位杂交试验，对前者的结果进行辅助验证。为此，试剂盒中还可以包括以下试剂：
1)特异性扩增引物：上游引物5’-GTCTGAGGGGACTGACTCT-3’，5PM；
                  下游引物5’-GAAGATCTCAAGCTCCATG-3’，5PM；
2)初级亲和素/辣根过氧化物酶工作液；
3)生物素标记的信号扩增工作液；
4)次级亲和素/辣根过氧化物酶工作液。
这种检测结肠癌的试剂盒用于检测结肠癌进程中IC53基因的表达情况，即通过免疫组化的方法对结肠癌患者的病理切片中表达的IC53基因进行检测，得到检测结果。
这种检测IC53基因的试剂盒用于开发针对IC53基因靶点的诊断和治疗结肠癌的药物。
这种检测IC53基因的试剂盒用于研究针对IC53基因靶点的结肠癌的关键通路。
本发明的有益效果是：
1)本发明首次发现了IC53基因超表达与结肠癌发生、发展之间的关系，从而提供了一种诊断结肠癌的新思路，并为人们研究开发治疗结肠癌的药物提供了新的靶点；
2)本发明通过免疫组化和原位杂交分析了IC53在癌症组织与正常组织间的表达差异，并分析了IC53超表达对细胞增殖、迁移、粘附及裸鼠中瘤体生长的影响，发现IC53在结肠癌中高表达并对结肠癌的发展起促进作用。根据这个发现，本发明提供了一种用于诊断结肠癌的检测试剂盒，可利用免疫组化方法检测IC53在结肠癌病变组织中的表达情况，操作简单易行、结果安全可靠、并且易于临床推广。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，并非对本发明的限制，凡依照本发明公开的内容进行的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
附图说明
图1显示IC53基因在癌症中表达上调：A为IC53特异探针与Cancer profilingarray杂交结果，B为对照基因(Ubiquitin)与Cancer profiling array杂交结果。
图2显示IC53基因在结肠癌中的高表达：A为IC53特异探针杂交结果，B为对照基因(Ubiquitin)杂交结果，A及B中由上至下第1，3行为正常组织，第2，4行为结肠癌组织。
图3显示IC53单克隆抗体的效价。
图4免疫组化表明：IC53在结肠癌组织中表达上调：A为正常结肠组织；B为结肠癌组织；C为结肠癌(右)及癌旁正常组织(左)；D为阴性对照。
图5显示IC53原位杂交结果：在结肠癌及其癌旁正常组织中的表达存在差异。
图6为Microarray杂交图：A为以稳定转染pcDNA3.1/Myc-His(-)A的ECV304细胞总RNA逆转录探针杂交结果；B为以稳定转染pcDNA3.1/Myc-His(-)A-IC53的ECV304细胞总RNA逆转录探针杂交结果。
图7为Northern验证PDGF-B表达上调，上图为总RNA胶图，下图为Northern杂交结果。
图8显示IC53超表达促进结肠癌细胞HCT-116及HT-29增殖。
图9显示IC53基因超表达促进结肠癌细胞HCT-116及HT-29迁移。
图10显示IC53超表达促进结肠癌细胞HCT-116的黏附。
具体实施方式
实施例1、IC53基因在结肠癌中表达上调——多种癌组织芯片分析
一、材料与方法
(一)多种癌组织芯片(Cancer Profiling Array，Catalog#：7841-1)购自Clontech公司，包括乳腺癌，子宫癌，结肠癌，卵巢癌，宫颈癌，肺癌，肾癌，直肠癌，甲状腺癌，前列腺癌，胰腺癌，小肠癌12种癌组织及对照正常组织。
(二)制备IC53基因特异探针的模板
由于IC53较C53多708bp(IC53的357-1064位)，以下列引物扩增IC53基因cDNA的433-1065位：上游引物：5’-GGAGGCACAGTCTGTGAGTGGGAA-3’，下游引物：5’-TGAGAAGTGCCCAGGAAATTC-3)。
1、PCR(聚合酶链式扩增反应)体系
    10×缓冲液   5.0ul
    脱氧核糖核酸(dNTP)   1.0ul
    上游引物(50PM)   1.0ul
    下游引物(50PM)   1.0ul
    Taq酶(5U/ul)   1.0ul
    模板   1.0ul(包含IC53 cDNA的质粒)
    无菌水   40.0ul
2、PCR参数
                94℃                             4分钟
                72℃                              10分钟
3、PCR产物纯化
1)加入6倍体积的醋酸氨/乙醇(1∶5)，-70℃30分钟；
2)4,000RPM(转/分)10分钟，12,000RPM 10分钟；
3)75％乙醇洗涤；
4)待乙醇挥发完，加50ul TE溶解。
(三)标记探针
在一0.5ml离心管中加入下列试剂：(室温1-3小时)
 模板(纯化的PCR产物)     25.0ng
 5X标记缓冲液     10.0ul
 dNTP(无dCTP)     2.0ul
 BSA     2.0ul
 Klenow酶     1.0ul
 [□-32P]dCTP     5.0ul
 无核酸酶水     至50ul
PCR产物需在98℃加热4分钟变性，冰上冷却2分钟。
(四)探针纯化
将柱子先颠倒混匀，去掉底部片状物放入离心管中，700g离心3分钟，将标记好的探针加到柱子中，换一个新的离心管，700g离心3分钟。
(五)预杂交
将膜用6XSSC浸5分钟，贴于杂交管壁，除去气泡，加入8ml预杂交液(15ml购于Clontech杂交液加150mg鲑精DNA变性5分钟后，立即冰浴2分钟，68℃1小时。
(六)杂交
倒掉预杂交液，加入上一步剩下的杂交液7ml及探针(纯化好的探针加入150ug鲑精DNA在98℃加热4分钟变性，冰上冷却2分钟)，68℃ 6小时。
(七)洗膜
先用200ml洗液I(2×SSC，0.05％SDS)在68℃洗膜四次，每次30分钟。再用200ml洗液II(0.1×SSC，0.1％SDS)在68℃洗30分钟，共两次，最后用200ml 2×SSC室温洗5分钟。
(八)压片
用滤纸吸去膜上的液体，用保鲜膜包好，贴于一张与X光片相同大小的滤纸上，压片，-70℃曝光适当时间，洗片。
二、实验结果
杂交结果显示IC53在乳腺癌，子宫癌，卵巢癌，宫颈癌，肺癌，肾癌，直肠癌，甲状腺癌，前列腺癌，胰腺癌，小肠癌及正常组织间表达无差异，在结肠癌中表达上调(如图1)。在34例结肠癌组织有19例表达较正常组织高(如图2)。
实施例2免疫组化验证IC53在结肠癌中表达上调
一、IC53单抗的制备
(一)免疫
可溶性抗原(IC53合成肽N-EELPEQVAEDAIDWGDC-C与KLH耦连产物)与福氏佐剂(Freund’s Adjuvant，GIBCO)等体积混匀，腹腔注射于Balb/c小鼠，50ug/只，免疫4-8只Balb/c小鼠。第一次免疫，抗原与完全佐剂混合，加强免疫时与不完全佐剂混合。每次免疫时间间隔2-4周，两次加强免疫后，抗原不与佐剂混合，尾静脉注射，4天后取脾与SP2/0细胞融合。
(二)ELISA检测抗体效价
1、包被：将抗原稀释为10ug/ml，加入酶标板中，100ul/well，37℃孵育一小时；
2、封闭：PBST洗板两次，弃去上清拍干。加入封闭液，100ul/well，37℃孵育一小时；
3、一抗孵育：弃去封闭液，加入稀释好的抗血清或培养上清，100ul/well，37℃孵育一小时；
4、洗涤：弃上清，PBST加满每孔，两秒后弃去，重复五遍，拍干；
5、二抗孵育：加入稀释好的anti-mouse IgG/HRP，100ul/well，37℃孵育一小时；
6、洗涤：弃上清，PBST加满每孔，两秒后弃去，重复五遍，拍干；
7、显色：底物缓冲液10ml+4mg OPD+30ul H2O2，混匀，100ul/well，RT，避光，10分钟后加入50ul终止液；
8、比色测量：酶标仪测定，490nm比色。
(三)细胞融合
1、取生长良好的SP2/0，吹打入50ml离心管，1,000rpm，10分钟；
2、小鼠眼球取血，处死后浸于70％酒精中，约1-2分钟；
3、无菌取脾，在平皿中加入10ml RPMI-1640，用镊子将脾捣碎，吹打数次，悬液移入50ml离心管中，用10ml RPMI-1640冲洗平皿，吹打数次后一并放入50ml离心管中；
4、SP2/0及脾细胞弃上清，加入20ml 1640重悬，1,000rpm，10分钟；
5、配制47％PEG，37℃预热(5g PEG+5.4ml RPMI-1640)；
6、细胞弃上清，加入20ml RPMI-1640重悬，分别取50ul于Eppendorft中计数，悬液1,000rpm，10分钟；
7、细胞弃上清，分别用10ml RPMI-1640重悬，按SP2/0：脾细胞约1∶10-1∶2混合，1,000rpm，10分钟；
8、配制好的HAT/30％FBS/RPMI-1640于37℃预热；
9、2ml RPMI-1640，7ml HAT/30％FBS/RPMI-1640于37℃预热；
10、细胞弃上清，弹开沉淀，37℃静置1分钟；
11、加入0.8-1ml 47％PEG，1分钟内加完；
12、37℃或室温放置1分钟；
13、加入2ml预热好的RPMI-1640，3分钟加完；
14、加入7ml HAT/30％FBS/RPMI-1640，3分钟加完；
15、将细胞稀释至80-100ml HAT/30％FBS/RPMI-1640中，加入96孔板中，每孔加100ul，37℃，5％CO2孵箱培养；
16、第二天每孔补加100ul HAT/30％FBS/RPMI-1640，5％CO2孵箱培养。
(四)杂交瘤上清的筛选：同ELISA。
(五)扩大培养及亚克隆化
1、ELISA检测呈阳性孔的细胞由96孔板转至24孔板，待细胞数目增加后并最终转至培养瓶中培养并冻存，此为原始种。经过数次单克隆化即可得到比较稳定的单克隆杂交瘤细胞株；
2、细胞亚克隆化：将细胞从培养板或培养瓶中吹打下来，镜下计数，将细胞稀释为1,000个/ml，加至96孔板的第一行，从第一行至第十二行作倍比稀释，37℃，5％CO2孵箱培养约一周，即可观察到细胞克隆。只有一个克隆的孔即为单克隆孔；
3、筛选阳性单克隆细胞：方法同杂交瘤上清的筛选；
4、阳性单克隆细胞扩大培养及进一步亚克隆化，方法同前。
(六)腹水制备
Balb/c经产鼠提前一至二周腹腔注射Pristone(Sigma，T-7640)，将单克隆杂交瘤细胞株扩大培养后，弃上清，吹打下来，以无菌生理盐水洗两遍，记数，稀释为105个/ml，腹腔注射于Balb/c经产鼠，一周后开始每天观察，将产生腹水的小鼠引流或处死，打开腹腔，吸取腹水。将得到的腹水3,000rpm离心10分钟，留取上清，加入NaN3，40℃保存。
二、免疫组化(免疫组化试剂盒：Histostain-plus Kit，美国Zymed公司)
(一)材料
组织切片包括结肠腺癌及其正常癌旁组织。
(二)方法
1、石蜡切片(4μm)60℃干烤2小时；
2、常规脱蜡至水(二甲苯I 15分钟-二甲苯II 15分钟-100％乙醇-95％-90％-80％-70％乙醇-水)；
3、3％H2O2室温孵育5分钟；
4、PBS冲洗3次；
5、0.1％的胰蛋白酶37℃消化30分钟；
6、0.1％Tritonx-100 PBS洗1分钟；
7、4℃预冷的4％多聚甲醛固定8分钟；
8、PBS冲洗3次；
9、3％H2O2室温孵育5分钟；
10、PBS冲洗3次；
11、羊血清室温封闭15分钟，倾去，勿洗；
12、滴加适当比例稀释(1∶100)的一抗，37℃孵育1小时；
13、PBS冲洗3次；
14、滴加生物素化二抗工作液，室温孵育10分钟；
15、PBS冲洗3次；
16、滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育30分钟；
17、PBS冲洗3次；
18、DAB镜下观察显色；
19、加自来水中止显色反应；
20、苏木素复染2分钟；
21、自来水冲洗；
22、细胞核分化液25秒；
23、流水冲洗2分钟；
24、梯度酒精(70％-80％-90％-95％-100％-100％)；
25、二甲苯透明5分钟；
中性树胶封片。
三、实验结果
1、单抗滴定，1-10依次表示抗IC53单抗腹水按1∶25，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12800，结果显示，该单抗效价为1∶100，如图3所示。
2、为了验证上面杂交结果，我们进一步通过免疫组化比较了IC53在结肠癌及其癌旁组织中的表达情况。结果免疫组化显示IC53在结肠癌组织表达较癌旁正常组织高，在50例结肠癌病人中，阳性率为72％，如图4所示。
实施例3、原位杂交进一步验证IC53在结肠癌中表达上调
一、材料与方法：
(一)模板准备
以下列引物扩增IC53特异片段：
上游引物5’-GTCTGAGGGGACTGACTCT-3’，
下游引物5’-GAAGATCTCAAGCTCCATG-3’。
1、PCR体系
10xbuffer                         5.0ul
dNTP(2.5mM)                       4.0ul
5’primer(5uM)                    1.0ul
3’primer(5uM)                    1.0ul
IC53 plasmid(50ng/ul)             1.0ul
Taq(5U/ul)                        0.5ul
ddH2O                            37.5ul
Total                             50.0ul
2、PCR参数
                  94℃                              5分钟
                  72℃                              10分钟
                  4℃                               ∞
3、PCR产物的纯化及定量
参照QIAquick Gel Extraction Kit Protocol。
1)切取含DNA片段的琼脂糖，捣碎后按重量比1∶3(琼脂糖∶溶液B)加入溶液B；
2)50℃水浴10分钟至胶完全溶化；
3)将溶液置于离心柱中，静置1-2分钟，8,000rpm或以上离心30-60秒；
4)倒掉液体，加入500ul溶液C(用无水乙醇1∶1稀释)于离心柱中8,000rpm或以上离心30-60秒；
5)重复洗一次；
6)15,000rpm或以上离心30-60秒，甩干剩余液体；
7)将离心柱置于新管中，加入适量(30-50ul)50℃预热的溶液D，静置2分钟，15000rpm或以上离心60秒；
8)测OD及跑胶定量。
(二)探针的定量检测
1、在硝酸纤维素膜(NC膜)上分别滴加已标记好的IC53探针，生物素化lambda对照，预先标记好的生物素化marker，各2ul；
2、将NC膜放入烤箱中，80℃，1小时；
3、254nm，紫外交联120秒(DNA面向上)；
4、将NC膜用PBS缓冲液润湿，滴加抗生物素抗体；
5、37℃孵育1小时；
6、DAB显色，双蒸水终止反应；
(三)探针标记
1、将1ug上述PCR纯化产物溶于无核酸酶水中，总体积为34ul；对照组为2ul(lug)非生物素化的lambda control DNA和32ul无核酸酶水；
2、沸水中变性5分钟；
3、快速冰置5分钟；
4、4℃短暂离心；
5、按次序向标记管和对照管中分别加入以下试剂：
10ul 5x labeling mix(contains biotinylated random octamers)
5ul dNTP mix(contains dNTPs and biotin-dATP)
1ul Klenow Fragment
6、在37℃孵育6小时；
7、每管加5ul 0.2M EDTA(pH8.0)终止反应；
8、每管加5ul 4M LiCl和150ul无水乙醇，-70℃放置半小时；
9、4℃，12,000rpm离心10分钟，弃上清；
10、每管加1ml 70％乙醇洗一次，4℃，12,000rpm离心5分钟，弃上清；
11、室温晾干，每管加20ul TE重悬，-20℃冻存。
二、原位杂交步骤(原位杂交试剂盒：GenPoint，美国DAKO公司)
(一)组织切片的准备工作
1、将石蜡切片(4-6um)60℃烘烤2小时，切片方向垂直；
2、脱腊至水(二甲苯5分钟-100％酒精2分钟-95％酒精1分钟-75％酒精1分钟-去离子水1分钟)；
3、37℃孵育5分钟，使切片完全干燥；
4、在切片上滴加2-3滴新稀释的1x蛋白酶K溶液，确保整个切片都被覆盖住，37℃孵育10分钟；
5、在室温条件下，将切片依次浸入下列溶液：去离子水1分钟-70％酒精1分钟-95％酒精1分钟-100％酒精1分钟；
6、37℃孵育5分钟。
(二)原位杂交及检测
1、将标记好的生物素化IC53探针与杂交液以1∶1稀释，在切片上滴加一滴混合好的探针杂交液(阴性对照不加标记探针，只加杂交液)；
2、在每张切片上加一张盖玻片，小心别含有气泡；
3、将加有盖玻片的切片放入烤箱中，95℃孵育10分钟，使DNA变性；
4、将切片放入湿盒中，37℃孵育4小时，使标记探针充分与靶核苷酸结合；
5、将切片浸入蛋白封闭液，直至盖玻片脱落，盖玻片脱落后，37℃继续孵育3分钟；
6、用预热的蛋白封闭液洗玻片，37℃，5分钟，2次；
7、去除组织切片上的多余封闭液，并在切片上滴加1-2滴初级亲和素/辣根过氧化物酶工作液，将切片放入湿盒中，37℃孵育40分钟；
8、去除切片上的多余试剂，将切片放入变性洗脱液中洗5分钟；
9、小心去除切片上的多余洗液，在切片上滴加1-2滴生物素标记的信号扩增工作液，将切片放入湿盒中，37℃孵育20分钟；
10、去除切片上的多余试剂，变性洗脱液洗5分钟；
11、去除切片上的多余洗液，在切片上滴加1-2滴次级亲和素/辣根过氧化物酶工作液，37℃孵育20分钟；
12、去除切片上的多余试剂，变性洗脱液洗5分钟；
13、去除切片上的多余洗液，在切片上滴加1-2滴DAB，室温孵育，显微镜下显色；
14、去除切片上的多余试剂，用去离子水洗2-3遍；
15、苏木素复染，梯度酒精脱水(95％-100％-100％)，二甲苯透明，中性树胶封片。
三、实验结果
我们进一步通过原位杂交比较了IC53在结肠癌及其癌旁正常组织中的表达情况。结果原位杂交显示IC53在结肠癌组织表达较癌旁正常组织高，如图5所示。
实施例4、IC53超表达调控一些与癌症相关的基因表达
一、材料与方法
(一)IC53真核表达载体构建
用下列引物(上游引物：5’-CTAGTCTAGAGGATGTGTGTGCATCCTGGGGCA-3’，下游引物：5’-CCCGGTACCTCACAGAGAGGTTCCCATCAG-3’)及Pfu经PCR扩增产生一具有XbaI及KpnI酶切位点的片段，经XbaI及KpnI(NEB)消化的片段及pCDNA3.1/Myc-His(-)A载体切胶回收产物用T4DNA连接酶连接，转化，碱裂解法小提质粒(步骤见下)，测序鉴定。
(二)碱裂解法小提质粒
1、将摇好的1.5ml菌液(将构建好的载体转化DH5α菌株后，在LB培养基中于37度摇16小时)，4,000rpm×10分钟，弃上清；
2、加预冷的溶液I 100ul(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.Cl(pH＝8.0)，10mmol/L EDTA(pH＝8.0))，振荡混匀；
3、加溶液II(0.2mol/L NaOH，1％ SDS)200ul，上下颠倒5次，冰置；
4、加溶液III(60ml 5mol/L+乙酸钾11.5ml冰乙酸+28.5ml水)150ul，上下颠倒数次，冰置5分钟；
5、12,000g×10分钟，取上清，转管；
6、加一倍体积的酚∶氯仿(1∶1)，上下颠倒混匀；
7、12,000g×10分钟，取上清，转管；
8、加无水乙醇1ml，室温置3分钟；
9、12,000g×5分钟，弃上清；
10、70％乙醇洗一次，12,000g×3分钟，弃上清；
11、空气干燥，加含RNase 100ng/ml的TE缓冲液25ul；
12、37℃消化。
(三)转染用质粒提取(按QIAGEN Plasmid Purification Handbook 1999关于QIAfilterTM Plasmid Mid Kit的提取方法。)
1、转化重组正确的质粒(测序鉴定)到大肠杆菌DH5α菌株(实验室自有)中；
2、挑单克隆接种于3mlLB培养基中(氨苄100ug/ml)，37℃，300rpm，8小时；
3、按1∶100将其接种于25ml LB培养基中(氨苄100ug/ml)，37℃，300rpm，12-16小时；
4、收获细菌，4℃，6,000g，15分钟；
5、用4ml已加RNaseA的Buffer P1重悬细菌，充分混匀；
6、加入4ml Buffer P2，温和混匀，室温放置5分钟(不能超过5分钟，以防止染色体DNA断裂)；
7、准备QIAfilter Cartridge，将螺帽拧在其下面的管口上，放于一无菌的50ml管中备用；
8、加入4ml预冷的Buffer P3，温和混匀以裂解细菌，不要置于冰上；
9、将裂解混合物加入QIAfilter Cartridge中，室温放置10分钟，不要插入活塞；
10、加4ml Buffer QBT平衡QIAGEN-tip100；
11、去掉QIAfilter Cartridge下面的螺帽，温和插入活塞，将裂解液滤入平衡好的QIAGEN-tip100中；
12、让液体靠重力通过柱子；
13、用Bffer QC按10ml/次，洗柱子两次；
14、用Bffer QF 5ml洗脱DNA(质粒)；
15、用3.5ml室温放置的异丙醇沉淀质粒，混匀，4℃，15,000g，30分钟；
16、用2ml室温放置的70％乙醇洗涤沉淀，小心去上清，4℃，15,000g，10分钟；
17、室温干燥沉淀(5-10分钟)；
18、用100ul无菌的TE溶解质粒，测OD定量并跑胶鉴定。
(四)稳定转染ECV304细胞
1、ECV304细胞(本实验室自备)按106cells/ml(0.5ml cells/孔)接种于6孔板中培养20小时；
2、用100ul无抗的RPMI 1640培养基稀释2ug pcDNA3.1/Myc-His(-)A-IC53或pcDNA3.1/Myc-His(-)A，为Solution A；
3、用100ul无抗的RPMI 1640培养基稀释5ul Lipofectin，室温20分钟，为Solution B；
4、将Solution A和B混匀，室温30分钟；
5、加入800ul无抗的RPMI 1640培养基，混匀后加入用无抗的RPMI 1640培养基洗过的细胞中，37℃，5％CO2培养4-6小时，换成2ml完全培养基；
6、48小时后，加入200ug/ml G418筛选14-20天，获得稳定克隆。
(五)Microarray分析
1、Total RNA提取：(Trizol一步法)
1)按1ml/cm2加入Trizol试剂，裂解细胞，室温2-3分钟；
2)加入Trizol 1/5体积的氯仿，剧烈振荡1分钟，室温2-3分钟；
3)4℃，12,000g离心20分钟；
4)小心吸取上清，加入等体积4℃预冷的异丙醇，混匀，室温10分钟；
5)4℃，12,000g离心20分钟；
6)沉淀用-20℃预冷的75％乙醇洗涤；
7)室温干燥沉淀后，用DEPC水溶解，测OD定量，备用或保存于-70℃。
2、DNaseI(RNase free)处理
1)在1.5ml小管中加入：
500ul                      Total RNA(500ug)
100ul                      10×DNaseI buffer
50ul                       DNaseI(1u/ul)
350ul                      RNase-free water
2)37℃水浴30分钟；
3)加入100ul 10×终止液，混匀，分成两管；
4)每管加入500ul水饱和酚及300ul氯仿，剧烈振荡1分钟；
5)15,000g，4℃离心10分钟，转移上清至另一管，加550ul氯仿，剧烈振荡1分钟；
6)15,000g，4℃离心10分钟，转移上清至另一管，加入十分之一体积的2M醋酸钠及二点五倍体积的95％乙醇，混匀，冰浴10分钟；
7)15,000g，4℃离心10分钟，弃上清，加入500ul 80％乙醇；
8)15,000g，4℃离心10分钟，弃上清，室温干燥沉淀10分钟；
9)加250ul RNase free water溶解，测OD，变性胶电泳鉴定。
3、PolyA+RNA分离及探针标记
1)准备Streptavidin Magnectic Beads：
①重悬磁珠，每个探针分装15ul磁珠到1.5ml管中；
②用磁珠分离器吸引磁珠，弃上清；
③用150ul结合缓冲液洗磁珠；
④用磁珠分离器吸引磁珠，弃上清；
⑤重复3次；
⑥用15ul结合缓冲液重悬磁珠。
2)PolyA+RNA富集
①预热PCR仪到70℃。
②分装30ug total RNA到0.5ml小管，并用无RNase水调整体积至45ul；
③加入1ul Biotinglated Oligo(dT)，用枪头吹打混匀；
④70℃加热2分钟，室温冷却10分钟；
⑤加入45ul 2×结合缓冲液，用枪头吹打混匀；
⑥每个样品加入15ul重悬好的磁珠；
⑦剧烈振荡25-30分钟；
⑧用磁珠分离器吸引磁珠，弃上清；
⑨用50ul 1×洗液温和重悬磁珠，用磁珠分离器吸引磁珠，弃上清，洗两次；
⑩用50ul 1×反应缓冲液温和重悬磁珠。用磁珠分离器吸引磁珠，弃上清；用6ul无RNase水重悬。
3)cDNA探针合成
①配制反应体系：
5×反应缓冲液                 4.0ul
10×dNTP                      2.0ul
[α-32P]dATP(10uci/ul)       5.0ul
DTT                           0.5ul
②预热PCR仪至65℃；
③在重悬的磁珠中加入1ul CDS引物，用枪头混匀；
④65℃加热2分钟；
⑤降温至50℃加热2分钟，在此过程中，每个反应加入2ul M-MLV逆转录酶；
⑥在50℃预热2分钟后，加入13.5ul反应混合物，混匀，50℃25分钟；
⑦加入2ul终止缓冲液终止反应；
4)探针纯化
①用缓冲液NT2稀释探针至200ul；
②将一个柱子放置于一个2ml收集管中，加入样品，14,000rpm离心1分钟；
③弃收集管，将管子转到另一个收集管中，加入400u1缓冲液NT3，洗3次；
④转移柱子到一个1.5ml管中，加入100ul缓冲液NE，室温2分钟，14,000rpm离心1分钟；
⑤取2ul加入到5ml闪烁液中，计数，期望值为1-10×106。
4、杂交
1)预热5ml杂交液，68℃30-60分钟；
2)加热(95-100℃)0.5mg鲑精DNA 5分钟，冰浴2分钟；
3)将处理后的鲑精DNA加入杂交液中，置于68℃；
4)将膜置于杂交桶中，小心除去气泡，加入含鲑精DNA的杂交液，68℃ 30分钟；
5)加入5ul cot-1 DNA到标记好的探针中，煮沸2分钟，冰浴2分钟；
6)将处理好的探针加入到杂交液中，68℃杂交12-16小时；
7)准备洗液I(2×SSC，1％SDS)及洗液II(0.1×SSC，0.5％SDS)，68℃预热30分钟；
8)用200ml洗液I 68℃洗30分钟，重复3-4次；
9)用200ml洗液II 68℃洗30分钟，200ml 2×SSC室温洗5分钟；
10)用镊子夹出膜，除去多余液体，包好压片，72小时后洗片。
二、实验结果
IC53超表达引起的其它基因表达改变：
为了进一步研究IC53的功能，我们通过Microarray分析了IC53超表达引起的其它基因表达情况，该膜购自Clontech公司，包含588个基因结果发现IC53超表达显著6个与癌症相关的基因表达(如表1)。改变倍数通过photoshop图像分析，部分杂交图片结果如图6所示。
表1：IC53超表达改变下列癌症相关基因的表达(U：上调，D：下调)
 GeneBank#  Protein Name  Fold  Gene/ProteinClassification
 X02811  PDGF-B  2.1U  Oncogenes，Growth factors
 M28249  Integrinα2  4.5U  Matrix Adhesion Receptors
 L12002  Integrinα4  6.8U  Cell-cell Adhesion Receptors
 X56134  Vimentin  2.3U  Intermediate Filament Proteins
 X16707  Fra1  2.3D  Oncogenes
 D29992  TFPI2  3.2D  Protease Inhibitors
实施例5、Northern验证IC53超表达上调PDGF-B
一、材料与方法
(一)实验材料
随机引物试剂盒(Prime-a-Gene Labeling System)购自Promega，杂交液(ExpressHyb Hybridization Solution)购自Clontech，，α-32P-dCTP购自北京亚辉公司，杂交炉(Hybridization Oven Red Roller II)为Phamacia Biotech产品。
(二)实验方法
1、以下列引物进行PCR扩增，制备PDGF-B探针模板。按Trizol法提取TotalRNA：
上游引物：5’-GTATTTGCTGTATTGCCCCCATG-3’；
下游引物：5’-TTCAGGGATCAGGCAGGCTATG-3’。
2、PCR(聚合酶链式扩增反应)体系
    10×缓冲液     5.0ul
    脱氧核糖核酸(dNTP)     1.0ul
    上游引物(50PM)     1.0ul
    下游引物(50PM)     1.0ul
    Taq酶(5U/ul)     1.0ul
    模板     1.0ul
    无菌水     40.0ul
PCR参数：         94℃                             3分钟
Figure A20041000007000251
                  72℃                             7分钟
3、PCR产物纯化
加入6倍体积的醋酸氨/乙醇(1∶5)，-70℃30分钟。4,000RPM(转/分)10分钟，12,000RPM 10分钟。75％乙醇洗涤。待乙醇挥发完，加50ul TE溶解。
4、转膜
1)称取0.6g琼脂糖凝胶加入52.2ml DEPC处理过的水中，加热溶解，待胶冷到65℃，加入6.0ml 10×MOPS，1.8ml甲醛，倒入胶槽；
2)取40-60ug(4.5ul)总RNA，加入2.0ul 10×MOPS，3.5ul甲醛，10ul甲酰胺，混匀，65℃变性15分钟冰上冷却2分钟，假加入2.0ul上样缓冲液，混匀；
3)50伏预电泳5分钟，上样；
4)待染料全部进入胶后，电压降为40伏，10分钟混合一次电泳缓冲液；
5)待溴酚兰泳动到凝胶底部，停止电泳，照相；
6)用DEPC处理过的水洗胶数次；
7)用50mM的NaOH处理45分钟；
8)用20×SSC处理45分钟；
9)尼龙膜先用去离子水浸湿，再用20×SSC处理45分钟；
10)在胶托上铺一层滤纸，用20×SSC浸湿，除去气泡；
11)将胶倒置于胶托上，在其上面放一中间挖空的塑料薄片；
12)小心将膜置于胶上，除去气泡；
13)在膜上铺两张20×SSC浸湿的滤纸，除去气泡；
14)在滤纸上铺上10cm高的吸水纸，压一500克的重物；
15)转膜16小时，中间换吸水纸2-3次；
16)小心取下膜，照相；
17)用6×SSC泡膜5分钟；
18)紫外交联，80℃烤膜1小时，4℃保存备用；
5、Northern杂交
1)标记探针：参照随机引物试剂盒(Prime-a-Gene Labeling System)：在0.5ml离心管中加入下列试剂：(室温1-3小时)
  模板(纯化的PCR产物)     25.0ng
  5×标记缓冲液     10.0ul
  dNTP(无dCTP)     2.0ul
  BSA     2.0ul
  Klenow酶     1.0ul
  [α-32P]dCTP     5.0ul
  无核酸酶水     至50ul
PCR产物需在98℃加热4分钟变性，冰上冷却2分钟；
2)预杂交：将膜用6×SSC浸5分钟，贴于杂交管壁，除去气泡，加入6ml购于Clontech的杂交液，68℃ 1小时；
3)杂交：倒掉杂交液，加入预热的杂交液6ml，加入探针(探针需在98℃加热4分钟变性，冰上冷却2分钟)，68℃ 3小时；
4)洗膜：先用200ml洗液I(2×SSC，0.05％SDS)在室温洗膜四次，每次10分钟，再用200ml洗液II(0.1×SSC，0.1％SDS)在50℃洗20分钟，56℃洗20分钟；
5)压片：用滤纸吸去膜上的液体，用保鲜膜包好，贴于一张与X光片相同大小的滤纸上，压片，-70℃曝光适当时间；
6)洗片(放射科)。
二、实验结果
Microarray结果发现IC53超表达能上调PDGF-B的表达，为了验证Microarray的结果，我们进行了Northern分析，结果与Microarray吻合，如图7所示。
实施例6、IC53基因超表达能促进结肠癌细胞HCT-116及HT-29增殖
一、材料与方法
(一)IC53真核表达载体构建
用下列引物(上游引物：5’-CTAGTCTAGAGGATGTGTGTGCATCCTGGGGCA-3’，下游引物：5’-CCCGGTACCTCACAGAGAGGTTCCCATCAG-3’)及Pfu经PCR扩增产生一具有XbaI及KpnI酶切位点的片段，经XbaI及KpnI(NEB)消化的片段及pCDNA3.1/Myc-His(-)A载体切胶回收产物用T4DNA连接酶连接，转化，碱裂解法小提质粒(步骤见下)，测序鉴定。
1、碱裂解法小提质粒
1)将摇好的1.5ml菌液(将构建好的载体转化DH5α菌株后，在LB培养基中于37度摇16小时)，4,000rpm×10分钟，弃上清；
2)加预冷的溶液I 100ul(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.Cl(pH＝8.0)，10mmol/L EDTA(pH＝8.0))，振荡混匀；
3)加溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)200ul，上下颠倒5次，冰置；
4)加溶液III(60ml 5mol/L+乙酸钾11.5ml冰乙酸+28.5ml水)150ul，上下颠倒数次，冰置5分钟；
5)12,000g×10分钟，取上清，转管；
6)加一倍体积的酚∶氯仿(1∶1)，上下颠倒混匀；
7)12,000g×10分钟，取上清，转管；
8)加无水乙醇1ml，室温置3分钟；
9)12,000g×5分钟，弃上清；
10)70％乙醇洗一次，12,000g×3分钟，弃上清；
11)空气干燥，加含RNase 100ng/ml的TE缓冲液25ul；
12)37℃消化。
2、转染用质粒提取(按QIAGEN Plasmid Purification Handbook 1999关于QIAfilterTM Plasmid Mid Kit的提取方法。)
1)转化重组正确的质粒(测序鉴定)到大肠杆菌DH5α菌株(实验室自有)中；
2)挑单克隆接种于3mlLB培养基中(氨苄100ug/ml)，37℃，300rpm，8小时；
3)按1∶100将其接种于25ml LB培养基中(氨苄100ug/ml)，37℃，300rpm，12-16小时；
4)收获细菌，4℃，6,000g，15分钟；
5)用4ml已加RNaseA的Buffer P1重悬细菌，充分混匀；
6)加入4ml Buffer P2，温和混匀，室温放置5分钟(不能超过5分钟，以防止染色体DNA断裂)；
7)准备QIAfilter Cartridge，将螺帽拧在其下面的管口上，放于一无菌的50ml管中备用；
8)加入4ml预冷的Buffer P3，温和混匀以裂解细菌，不要置于冰上；
9)将裂解混合物加入QIAfilter Cartridge中，室温放置10分钟，不要插入活塞；
10)加4ml Buffer QBT平衡QIAGEN-tip100；
11)去掉QIAfilter Cartridge下面的螺帽，温和插入活塞，将裂解液滤入平衡好的QIAGEN-tip100中；
12)让液体靠重力通过柱子；
13)用Bffer QC按10ml/次，洗柱子两次；
14)用Bffer QF 5ml洗脱DNA(质粒)；
15)用3.5ml室温放置的异丙醇沉淀质粒，混匀，4℃，15,000g，30分钟；
16)用2ml室温放置的70％乙醇洗涤沉淀，小心去上清，4℃，15,000g，10分钟；
17)室温干燥沉淀(5-10分钟)；
18)用100ul无菌的TE溶解质粒，测OD定量并跑胶鉴定。
(二)IC53稳定转染NIH3T3，HCT-116及HT-29细胞
1、NIH3T3，HCT-116及HT-29细胞按106cells/ml(0.5ml cells/孔)接种于6孔板中培养20小时，NIH3T3，HCT-116及HT-29细胞用含10％FBS的DMEM培养，37℃，5％CO2；
2、用100ul无抗的RPMI 1640培养基稀释2ug pcDNA3.1/Myc-His(-)A-IC53或pcDNA3.1/Myc-His(-)A，为Solution A；
3、用100ul无抗的RPMI 1640培养基稀释5ul Lipofectamine，室温20分钟，为Solution B；
4、将Solution A和B混匀，室温30分钟；
5、加入800ul无抗的RPMI 1640培养基，混匀后加入用无抗的RPMI 1640培养基洗过的细胞中，37℃，5％CO2培养4-6小时，换成2ml完全培养基；
6、48小时后，加入400ug/ml G418筛选14-20天，获得稳定克隆。
(三)MTT分析细胞增殖
接种1000个HCT-116及HT-29细胞(购买自北京金赛斯公司)(转染了pcDNA3.1/Myc-His(-)A或pcDNA3.1/Myc-His(-)A-IC53)到96孔板，接种前在含0.4％FBS的RPMI 1640培养基中饥饿24小时，培养6天后(每两天换液一次)，加入20ul MTT(5mg/ml，Sigma)，37℃，5％CO2培养4小时，弃上清，向沉淀中加入100ul DMSO，充分溶解后，490nm测OD，重复三次。
二、实验结果：
IC53超表达促进结肠癌细胞HCT-116及HT-29增殖：
HCT-116及HT-29两种结肠癌细胞稳定转染pcDNA3.1/Myc-His(-)A或pcDNA3.1/Myc-His(-)A-IC53，细胞转染后稳定克隆筛选采用含400ug/ml G418，10％FBS的DMEM培养基，细胞在实验前用含200ug/ml G418，0.4％FBS的DMEM培养基饥饿12小时。如图8所示，经MTT分析发现IC53超表达促进细胞增殖。
实施例7、IC53基因超表达促进结肠癌细胞HCT-116及HT-29迁移
一、材料与方法
(一)鼠尾胶原制备
1、材料：大鼠尾巴，1％醋酸，75％酒精
2、方法：
1)取大鼠尾巴，洗净，75％酒精浸泡5分钟；
2)手持尾巴，用止血钳夹住鼠尾的尖端，折断尾骨后拉出尾腱；
3)将尾腱剪断置于平皿中，称重至1g；
4)加入适量1％醋酸溶液，将尾腱置于平皿内剪碎，并转移至总体积为500ml的1％醋酸溶液中；
5)充分摇晃，使尾腱分散于醋酸溶液中，4℃放置一周；
6)4000转离心10分钟；
7)吸取上清并分装，4℃保存。
(二)Transwell检测细胞迁移
1、20ug/ml鼠尾I型胶原封闭8um-孔径，24孔Transwell(BD公司)聚乙烯膜(6.5-mm insert membrane)的下层，4℃过夜；
2、PBS洗膜，并用1mg/ml BSA封闭；
3、NIH 3T3，HCT-116及HT-29细胞用0.4％的DMEM培养液饥饿处理12小时；
4、用0.02％EDTA和0.125％trpsin消化液将细胞消化下来，0.1％BSA的DMEM培养液洗一遍之后，用0.1％BSA的DMEM培养液重悬细胞，并进行细胞计数，使细胞的最终浓度为1×106cells/ml；
5、Transwell下层各孔加600ul 0.5％FBS的DMEM培养液，对照组为0.5％BSA的DMEM培养液；
6、Transwell上层各孔加入100ul NIH 3T3细胞悬液(1×106cells/ml，0.1％BSA的DMEM培养液)；
7、37℃孵育4小时后，吸出上层细胞悬液，用PBS缓冲液洗上层Transwell膜；
8、10％中性福尔马林固定10分钟，PBS洗一遍；
9、0.5％结晶紫染色5分钟，双蒸水洗两遍，室温晾干；
10、计算迁移到下层膜上的细胞量，在高倍镜下(400×)随机选取10个视野计数；
11、数据处理：每一组数据用“均数±标准差”表示，组与组之间的比较用t检验。
二、实验结果：
用Transwell分析稳定转染pcDNA3.1/Myc-His(-)A-IC53或空载体的HCT-116和HT-29两种细胞发现，IC53超表达能显著促进其迁移，结果见图9。
实施例8、IC53超表达能促进结肠癌细胞HCT-116对基质的黏附
一、材料与方法
1、5ug/ml的Matrigel封闭24孔板，4℃过夜；
2、PBS洗一遍，并用2％的BSA封闭30分钟；
3、NIH 3T3，HCT-116及HT-29细胞用0.4％的DMEM培养液饥饿处理12小时；
4、用0.02％EDTA和0.125％trpsin消化液将细胞消化下来，0.1％BSA的DMEM培养液洗一遍之后，用0.1％BSA的DMEM培养液重悬细胞，并进行细胞计数，使细胞的最终浓度为2×106cells/ml；
5、24孔板各孔加入500ul NIH 3T3，HCT-116及HT-29细胞细胞悬液(2×106cells/ml，0.1％BSA的DMEM培养液)；
6、37℃孵育1小时后，吸去培养基，在高倍镜下(400×)随机选取10个视野照相；
7、然后用10％中性福尔马林固定10分钟，PBS洗一遍；
8、0.5％结晶紫染色5分钟，双蒸水洗两遍，室温晾干；
9、用100ul5％SDS+50％乙醇溶解，室温放置20分钟，吸出溶液转到酶标板中，490nm测OD，重复三次。
二、实验结果：
促进细胞黏附过程的基因有整合素等。而IC53超表达能上调integrinα2，和integrinα4。我们推测IC53超表达能促进细胞黏附，在稳定转染pcDNA3.1/Myc-His(-)A-IC53或空载体的HCT-116细胞中发现，IC53超表达能显著促进这种细胞的黏附，结果见图10。
实施例9、IC53基因促进结肠癌瘤体生长
一、材料
1、免疫缺陷小鼠：为了排除其它因素的干扰，本实验均用免疫缺陷小鼠，即俗称的裸鼠，购自中国医学科学院动物所，BALB/c Nude、5-6周龄、雌性。这种小鼠胸腺缺失，为第11对染色体隐性遗传；由于无胸腺，不能使T细胞正常分化，故T细胞免疫缺陷；B淋巴细胞正常，但功能缺陷，抗体主要为IgM，只有少量IgG；无接触敏感性，无移植排斥反应，因此广泛用于免疫学、肿瘤学和疾病发生机理的研究。
2、细胞：选用转染IC53基因、空载体及未转染的结肠癌细胞系HCT-116细胞，用DMEM完全培养基(10％FBS，100单位/ml的青霉素，100单位/ml的链霉素)，37℃，5％CO2进行培养。待HCT-116细胞长至70-80％汇合，用0.125％的胰酶消化下来，1×PBS洗两遍，再用适当体积的1×PBS重悬，用血球计数板进行细胞计数以调整细胞浓度，最后将细胞悬浮于适量PBS中，每只裸鼠接种0.7×106个细胞。
二、方法
1、肿瘤细胞皮下接种裸鼠
用带6号针头的一次性1ml注射器抽取上述准备好的细胞悬液接种于裸鼠(BALB/c Nude，♀，5～6周龄)右侧腹背部皮下。每个处理组(转染IC53基因、空载体及未转染HCT-116细胞)均有6只裸鼠。
2、观测肿瘤的生长状况
每3-4天观察一次肿瘤的形成情况，并用游标卡尺测量肿瘤的直径。肿瘤的体积用公式V＝a×b2/2来计算，其中a为肿瘤最长的直径，而b则是与这条长径垂直的直径。
三、实验结果：
转染IC53基因能显著促进结肠癌细胞HCT-116在裸鼠体内的瘤体生长。
实施例10、结肠癌的检测试剂盒
一、成分及含量
1、0.1％胰蛋白酶；
2、羊血清(10％)；
3、一抗：鼠抗人单克隆IC53抗体；(实验室制备)
4、生物素化二抗工作液；
5、辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液；(试剂盒中自带)
6、DAB，3，3-二氨基联苯胺，30mg溶于100ml PBS缓冲液后，加30ml到立式染缸中，显示8-10分钟。
7、细胞核分化液：100ml 75％酒精中加浓盐酸0.5ml，混匀；加30ml到立式染缸中，分化3-5秒。
8、中性树胶。(试剂盒中自带，用100ul封片)
二、本试剂盒的使用方法
(一)组织切片包括结肠腺癌及其正常癌旁组织。
1、石蜡切片(4μm)60℃干烤2小时；
2、常规脱蜡至水(二甲苯I15分钟-二甲苯II15分钟-100％乙醇-95％-90％-80％-70％乙醇-水)；
3、3％H2O2室温孵育5分钟；
4、PBS冲洗3次；
5、0.1％的胰蛋白酶37℃消化30分钟；
6、0.1％Tritonx-100PBS洗1分钟；
7、4℃预冷的4％多聚甲醛固定8分钟；
8、PBS冲洗3次；
9、3％H2O2室温孵育5分钟；
10、PBS冲洗3次；
11、10％羊血清室温封闭15分钟，倾去，勿洗；(盖住切片即可，约0.5ml)
12、滴加适当比例稀释(1∶100)的一抗，37℃孵育1小时；
13、PBS冲洗3次；
14、滴加生物素化二抗工作液，室温孵育10分钟；
15、PBS冲洗3次；
16、滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育30分钟；
17、PBS冲洗3次；
18、DAB镜下观察显色；
19、加自来水中止显色反应；
20、苏木素复染2分钟；
21、自来水冲洗；
22、细胞核分化液25秒；(加30ml到立式染缸中，分化3-5秒)
23、流水冲洗2分钟；
24、梯度酒精(70％-80％-90％-95％-100％-100％)；
25、二甲苯透明5分钟；
中性树胶封片。(用100ul封片)
三、实验结果
如图4所示，免疫组化显示IC53在结肠癌组织表达较癌旁正常组织高，在50例结肠癌病人中，阳性率为72％。
实施例11、判断结肠癌预后的检测试剂盒(含原位杂交试剂)
一、成分及含量
在实施例10的成分基础上添加下述试剂：1)特异性扩增引物：上游引物5’-gtctgaggggactgactct-3’，5pM/50ml；下游引物5’-gaagatctcaagctccatg-3’，5pM/50ml；2)初级亲和素/辣根过氧化物酶工作液；3)生物素标记的信号扩增工作液；4)次级亲和素/辣根过氧化物酶工作液。
二、本试剂盒的使用方法：见实施例3。
本发明通过免疫组化和原位杂交分析了IC53在癌症组织与正常组织间的表达差异，并分析了IC53超表达对细胞增殖、迁移、粘附及裸鼠中瘤体生长的影响，发现IC53在结肠癌中高表达并对结肠癌的发展起促进作用。根据这个发现，本发明提供了一种用于判断结肠癌预后的检测试剂盒，可利用免疫组化方法检测IC53在结肠癌组织中的表达情况，并还可通过原位杂交验证其特异性，操作简单易行、结果安全可靠、并且易于临床推广。

Claims (12)

1、IC53基因及其相关产物在制备检测结肠癌的试剂中的应用，其相关产物包括蛋白、肽、抗体及本基因相关的正、反义寡核甘酸和小干扰RNA。
2、根据权利要求1所述的IC53基因在制备检测结肠癌的试剂中的应用，其特征在于：所述的IC53基因相关产物是指IC53基因、IC53基因的剪接体、IC53基因的反义寡核苷酸、小干扰RNA、IC53基因编码的肽段和IC53基因的抗体中的一种或几种。
3、IC53基因在制备治疗结肠癌的药物中的应用。
4、根据权利要求3所述的IC53基因在制备治疗结肠癌的药物中的应用，其特征在于：所述的药物由有效量的IC53基因、或IC53基因的剪接体、或IC53基因的反义寡核苷酸、或IC53基因编码的肽段、或IC53基因的抗体与一种或多种药学上可接受的载体或赋型剂组成。
5、根据权利要求4所述的IC53基因在制备治疗结肠癌的药物中的应用，其特征在于：所述药物中有效量的IC53基因、或IC53基因的剪接体、或IC53基因的反义寡核苷酸、或IC53基因编码的肽段、或IC53基因的抗体为天然分离得到的。
6、根据权利要求4所述的IC53基因在制备治疗结肠癌的药物中的应用，其特征在于：所述药物中有效量的IC53基因、或IC53基因的剪接体、或IC53基因的反义寡核苷酸、或IC53基因编码的肽段、或IC53基因的抗体为化学合成得到的。
7、根据权利要求4所述的IC53基因在制备治疗结肠癌的药物中的应用，其特征在于：所述药物中有效量的IC53基因、或IC53基因的剪接体、或IC53基因的反义寡核苷酸、或IC53基因编码的肽段、或IC53基因的抗体为通过生物工程方法制备得到的。
8、一种检测结肠癌的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含有以下试剂：
1)0.1％胰蛋白酶；
2)10％羊血清；
3)一抗：鼠抗人单克隆IC53抗体；
4)生物素化二抗工作液；
5)辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液；
6)DAB：3，3-二氨基联苯胺，30mg溶于100ml PBS缓冲液；
7)细胞核分化液：100ml 75％酒精中加浓盐酸0.5ml，混匀。
9、根据权利要求8所述的检测结肠癌的试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包含有以下试剂：
1)特异性扩增引物：上游引物5’-gtctgaggggactgactct-3’，5PM；
                  下游引物5’-gaagatctcaagctccatg-3’，5PM；
2)初级亲和素/辣根过氧化物酶工作液；
3)生物素标记的信号扩增工作液；
4)次级亲和素/辣根过氧化物酶工作液。
10、权利要求8或9所述的一种检测结肠癌的试剂盒用于检测结肠癌进程中IC53基因的表达情况。
11、权利要求8或9所述的一种检测IC53基因的试剂盒用于开发针对IC53基因靶点的诊断和治疗结肠癌的药物。
12、权利要求8或9所述的一种检测IC53基因的试剂盒用于研究针对IC53基因靶点的结肠癌的关键通路。
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