CN1909927A - 抑制癌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供以将p53癌抑制基因或p53蛋白质活化，使其定位于核为特征的方法、以及含有促进p53癌抑制基因或p53蛋白质活化物质的医药组合物。

Description

抑制癌的方法

技术领域

本发明涉及活化p53癌抑制基因或p53蛋白质，使p53蛋白质定位于核的方法。另外，本发明还涉及含有促进p53癌抑制基因或p53蛋白质活化的物质的医药组合物。

背景技术

Synoviolin是作为在来源于风湿患者滑膜细胞过量表达的膜蛋白质而发现的新蛋白质(WO02/052007)。并且，经转基因动物研究表明，Synoviolin是类风湿性关节炎发病的必需分子。

由蛋白质结构预测系统显示Synoviolin具有RING finger基元。该基元常见于在蛋白质的泛素化中发挥重要作用的叫做E3泛素连接酶的酶中，事实上，证明Synoviolin具有E3泛素连接酶特征之一的自身泛素化活性(WO02/052007)。

要指出的是，p53基因定位于第17号染色体p13，是对癌细胞的产生和增殖非常重要的癌抑制基因。p53蛋白质识别DNA上的特异碱基序列[5′-(A/T)GPyPyPy-3′]，促进waf1/cip1、GADD45、BAX等特定基因的转录活化。而且，已知其具有下述生理活性：(i)抑制其他多种基因的转录、(ii)与SV40大T抗原、腺病毒EIB蛋白质、人类乳头瘤病毒E6等病毒性癌基因或mdm2等细胞性癌基因结合、(iii)与含有错配的DNA特异结合等。

因此，为了发现抑制癌的物质，研究控制p53癌抑制基因或p53蛋白质功能的分子是重要的。

发明内容

本发明的目的在于提供促进p53癌抑制基因或p53蛋白质活化的方法，以及促进p53癌抑制基因或p53蛋白质活化的医药组合物。

为了解决上述课题，本发明人进行了深入研究。于是在详细分析Synoviolin同源敲除动物时发现：与野生型相比，观察到更多发生调亡的细胞，而且，与调亡的诱导关系密切的p53蛋白质定位于核内，强表达。另外，发现通过抑制Synoviolin的功能，p53癌抑制基因或p53癌抑制蛋白质活化，阻止了癌细胞的增殖，由此完成了本发明。

即，本发明如下所述：

(1)医药组合物，其含有促进p53癌抑制基因活化或p53蛋白质活性的物质。

(2)(1)所述的医药组合物，其中，促进p53癌抑制基因或p53蛋白质活化的物质为抑制Synoviolin的表达和/或功能的物质。

(3)(2)所述的医药组合物，其中，抑制Synoviolin的表达和/或功能的物质为针对编码Synoviolin的基因的siRNA或shRNA。

(4)(3)所述的医药组合物，其中，编码Synoviolin的基因含有序列1所示的碱基序列。

(5)(3)所述的医药组合物，其中，siRNA以序列1所示的碱基序列中的一部分序列为靶。

(6)(1)～(5)中任意一项所述的医药组合物，其用于治疗癌症。

(7)p53癌抑制基因或p53蛋白质的活化方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表达和/或功能。

(8)使p53蛋白质定位于核的方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表达和/或功能。

(9)癌的抑制方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表达和/或功能，使p53蛋白质定位于核。

(10)权利要求9所述的方法，其特征在于，对定位于核的p53蛋白质进一步进行放射线照射或紫外线照射。

(11)权利要求9所述的方法，其特征在于，使含有定位于核的p53蛋白质的细胞进一步与抗癌剂接触，或对该细胞周围的脉管实施栓塞。

(12)将p53蛋白质的氨基酸残基的一部分磷酸化的方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表达和/或功能。

(13)(12)所述的方法，其中，氨基酸残基的一部分为第15位丝氨酸残基。

(14)活化磷酸化酶的方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表达和/或功能。

(15)(14)所述的方法，其中，磷酸化酶为ATM、ATR、或与它们具有同样活性的酶等。

(16)诱导p21蛋白质表达的方法，其中p53蛋白质通过抑制Synoviolin的表达和/或功能而活化，由此诱导p21蛋白质表达。

(17)癌的抑制方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表达和/或功能，由p53蛋白质诱导p21蛋白质的表达。

(18)抑制p53蛋白质泛素化的方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表达和/或功能。

(19)(7)～(18)中任意一项所述的方法，其中，Synoviolin表达的抑制利用针对编码Synoviolin的基因的siRNA或shRNA进行。

(20)(7)～(18)中任意一项所述的方法，其中，抑制Synoviolin功能是抑制Synoviolin与p53蛋白质结合的功能。

(21)(19)所述的方法，其中，编码Synoviolin的基因含有序列1所示的碱基序列。

(22)(19)所述的方法，其中，siRNA以序列1所示的碱基序列中的一部分序列为靶。

附图说明

图1为显示Synoviolin同源敲除小鼠胎仔成纤维细胞(MEFs)的免疫组织染色结果的照片。

图2为显示syno-/-的胚胎的抗p53抗体免疫组织染色结果的照片。

图3为显示p53相关的蛋白质印迹法结果照片。

图4为显示鉴定syno-/-的MEF培养细胞中p53的磷酸化部位的结果的照片。

图5为由针对Synoviolin的siRNA处理而亢进的Ser15的磷酸化因咖啡因的添加受到了怎样的影响的蛋白质印迹法照片。

图6为显示由针对Synoviolin的siRNA处理，p53和p21的表达增多的蛋白质印迹法照片。

图7为用流式细胞仪观察细胞周期的结果图。

图8为用抗Synoviolin抗体(10Da)对组织阵列进行免疫染色的结果的照片。

图9为用抗Synoviolin抗体(10Da)对组织阵列进行免疫染色的结果的照片。

图10为观察导入GFP野生型p53的细胞的p53定位的照片。

图11为使GFP野生型p53和FLAG野生型Synoviolin强表达，用稀释400倍的第一抗体α-FLAG抗体、稀释200倍的第二抗体α-小鼠IgG-TRITC或1μM DAPI对核进行染色，观察p53的定位的照片。

图12为使GFP野生型p53和FLAG Synoviolin C307S强表达，用稀释400倍的第一抗体α-FLAG抗体、稀释200倍的第二抗体α-小鼠IgG-TRITC或1μM DAPI对核进行染色，观察p53的定位的照片。

图13为利用MBP-Synoviolin dTM-His的显示GST-p53体外泛素化反应的照片。

图14为利用Synoviolin RNAi的RA滑膜细胞中p53 mRNA量的曲线。

图15为制备的p53结合区域缺失变异体的示意图和进行结合分析的结果的图。

图16为对p53结合区域缺失变异体和通过³⁵S-p53进行GSTpulldown assay的结果图。

具体实施方式

以下详细说明本发明。

本发明的特征在于，抑制Synoviolin的表达和/或功能，使p53(p53癌抑制基因或p53蛋白质)定位于核并活化，由此抑制癌。本发明是基于下述发现完成的：如果抑制Synoviolin的表达和/或功能，则p53被磷酸化酶磷酸化，p53活化，于是作为依赖于细胞周期蛋白的磷酸化酶抑制剂的p21的表达提高，结果防止癌细胞由G1期向S期转变，由此抑制癌的发生或增殖，以及Synoviolin通过泛素连接酶抑制p53的表达。

1.p53的活化

(1)Synoviolin的表达和/或功能的抑制和p53的活化

如将正常细胞暴露于紫外线等，则细胞内的p53活化，其结果是细胞增殖被抑制，因此可通过升高p53的浓度来阻止癌细胞增殖。也就是说，当p53不发挥作用时，癌细胞的增殖不停止，向癌发展。事实上，p53在正常个体的细胞中几乎观察不到，而在约半数的来源于癌患者的细胞中发生该p53的缺失变异。而且，如没有发生这种变异，那么就是p53的控制机关发生某种变异而失去了癌抑制功能。因此，要抑制癌的发展，必须使p53有效发挥作用。

在本发明中，由于将p53的活化作为治疗癌的有效方法之一，因此着眼于Synoviolin的功能。制备Synoviolin同源敲除动物，进行了详细研究，结果观察到比野生型更多的发生调亡的细胞。即，发现如果抑制Synoviolin的功能，则可促进与调亡密切相关的p53的活化，Synoviolin的功能抑制与癌抑制相关连。

在此，“Synoviolin的表达”是指编码Synoviolin的基因的转录和翻译，或由这些的转录、翻译生成Synoviolin蛋白质。另外，“Synoviolin的功能”是指抑制p53的活化，上述Synoviolin的功能也包括Synoviolin与p53结合的功能和将p53泛素化的功能。因此，“抑制Synoviolin的表达和/或功能”是指与野生型Synoviolin基因或蛋白质的量、功能或活性相比，其量、功能或活性降低或消失。上述“抑制”包括抑制功能和表达二者、以及抑制任何一方。

由于Synoviolin促进p53的泛素化，因此可通过抑制Synoviolin与p53的结合抑制p53的泛素化，假如抑制了p53的泛素化，则p53被活化，进一步意味着癌将受到抑制。

另外，调亡是指细胞自身启动的程序性细胞死亡，其特征是细胞核的染色体聚集、细胞核片段化、细胞表面微绒毛消失、细胞质聚集、Casp蛋白酶活化、线粒体膜电位消失等。当细胞产生上述特征时，判定为发生调亡。

在本发明中，如对胚胎(胎児胚)的p53进行免疫染色，则p53在Synoviolin homo剔除小鼠胚胎全身强表达。另外，从Synoviolin homo剔除小鼠胚胎分离的胎仔成纤维细胞(MEFs)与从野生型分离的相比表达也增强，而且p53在核内强势定位。这种核定位在野生型中完全没有观察到。另外，如使Synoviolin和p53强表达，则p53与Synoviolin在细胞质内共定位。这说明通过抑制Synoviolin的表达和/或功能，可使p53向核内转移。进一步，Synoviolin homo剔除小鼠胎仔MEFs表现强放射线敏感性、紫外线敏感性。因此，在本发明中，抑制癌细胞中Synoviolin的表达和/或功能，使p53向核内转移后，如对p53进行放射线照射或紫外线照射、则可有效抑制癌细胞的增殖。对放射线照射方法没有特别限定，可照射例如1～10Gy的γ线。另外，对于紫外线照射，可使用适当的紫外线照射装置(FUNACOSHI公司、Derumara公司、KEYENCE公司等生产)照射紫外线(波长100～400nm、优选290～400nm)。

进一步，在本发明中，可使含有定位于核中的p53的细胞(特别是癌细胞)进一步与抗癌剂接触，从而有效地抑制癌。或者，对上述含有定位于核中的p53的细胞的癌细胞周围的脉管(例如血管或淋巴管)实施栓塞，由此可抑制癌。

“抗癌剂”包括烷基化剂、抗代谢药、微管抑制剂、铂配位化合物、分子靶向治疗药等。作为这些抗癌剂的具体例子，可列举以下化合物，但并不限定于此。

<烷基化剂>

氮芥类：环磷酰胺(Endoxan)、苯丙氨酸氮芥(Melphalan)等

乙撑亚胺类：塞替哌(Thiotepa)等

烷基磺酸酯类：白消安(Busulphan)等

亚硝基脲类：尼莫司汀(Nimustine)、洛莫司汀(Lomustine)等

<抗代谢药>

叶酸衍生物：甲氨蝶呤等

嘌呤类：巯嘌呤(Mercaptopurine)、硫唑嘌呤(Azathioprine)等

嘧啶类衍生物：5-氟尿嘧啶、替加氟(Tegafur)、卡莫氟(Carmofur)等

<微管抑制药>

植物碱药物(Vinca alkaloid)：长春新碱、长春碱等

紫杉烷(taxane)：泰素、多烯紫杉醇(docetaxel)等

<类激素药>

他莫昔芬(Tamoxifen)、雌激素等

<铂配位化合物>

顺铂、卡铂(Carboplatin)等

<分子靶向治疗药>

伊马替尼(Imatinib)、利妥希玛(Rituximab)、吉非替尼(Gefitinib)等。

用于使癌细胞与抗癌剂接触的方法可采用向含有定位于核中的p53的细胞或组织(癌细胞或癌组织)添加抗癌剂的方法、或向癌患者或患癌动物施用抗癌剂的方法等。此时对抗癌剂的处理量没有特别限定，如为添加的情况，则为100pM～100μM，优选为1nM～10μM。向动物体内给药时，例如使用Endoxan作为抗癌剂时，为0.1～100mg/kg/day，优选为2～25mg/kg/day。对于Endoxan以外的抗癌剂，本领域技术人员可适当设定给药量和添加量。

对含有定位于核中的p53的细胞的癌细胞周围的脉管实施栓塞，可使含有定位于核中的p53的癌细胞的细胞团或组织周围形成血栓，对于血管或淋巴管也可以利用脂肪形成栓塞、也可以利用空气、气体形成栓塞。

(2)抑制Synoviolin表达和/或功能促使p53磷酸化和活化

进一步，本发明的特征在于，通过将p53的氨基酸残基的一部分磷酸化从而使p53活化。与p53的活化相关的作为磷酸化对象的氨基酸残基优选为p53氨基酸序列中的丝氨酸残基，进一步优选15位丝氨酸残基(Ser15)。

如p53的Ser15被磷酸化，则p53的表达升高，转录活性增强，其结果是转录产物增加。ATM(共济失调-毛细血管扩张突变)、ATR(共济失调-毛细血管扩张相关的)等磷酸化酶与该p53 Ser15的磷酸化密切相关。ATM是人常染色体隐性遗传疾病毛细血管扩张性运动失调症的原因蛋白质，其具有感知DNA的损伤，将癌抑制基因p53磷酸化，从而控制细胞增殖的功能。ATR是ATM家族中的一员，其是被在很大范围被化学疗法药物、紫外线照射、或蛋白质磷酸化酶的抑制诱导，且参与不涉及ATM的p53活化的磷酸化酶。

已知咖啡因抑制ATM和ATR的功能，在本发明中，在Synoviolin表达和/或功能抑制实验中通过使用咖啡因，表明Synoviolin调节ATM和ATR的活化。

即，在咖啡因不存在时，如抑制Synoviolin表达和/或功能，则p53活化。而在咖啡因存在的情况下，如果抑制Synoviolin表达和/或功能，则p53的活化被抑制。另外，还已知咖啡因抑制ATM和ATR的活性(p53的磷酸化)。

因咖啡因抑制ATM和ATR的活性，即使抑制了Synoviolin的表达和/或功能，p53也不活化，由此可认为机理如下：如果抑制Synoviolin的表达和/或功能，则ATM和ATR被活化，从而诱导p53活化。由此，可认为由于抑制了Synoviolin的表达和/或功能，这些磷酸化酶的活性提高。因此，本发明的特征在于通过抑制Synoviolin的表达和/或功能，促进磷酸化酶活化。与ATM和ATR具有同样活性的酶等(磷酸化p53的酶等)，DNA-PK或GSK3β等也可以。

作为由p53 Ser15的磷酸化诱导表达的物质，已知有p21蛋白质。p21起周期蛋白依赖性磷酸化酶(CDK)活性抑制剂的作用，是通过抑制CDK活性调节细胞周期的蛋白质。CDK是抑制细胞周期的主要物质，与作为其伙伴的周期蛋白质共同发挥作用，例如，控制由细胞休眠状态的G1期向DNA复制期的S期的顺利转变。在癌细胞中，如果p53活化，则作为CDK抑制剂的p21的表达升高，因此妨碍了癌细胞由G1期向S期的转变，从而抑制癌。因此，如上所述，本发明的特征在于，通过抑制Synoviolin表达和/或功能，提高p53的活化，诱导p21的表达，引起CDK的抑制，由此抑制癌。

(3)p53泛素化的抑制和稳定化

Synoviolin使p53泛素化。泛素化是指作为蛋白质降解标记分子的泛素对蛋白质翻译后的修饰反应。以往认为该泛素化的生理意义在于用于送往蛋白体(proteosome)类蛋白质分解机构的标记物修饰。通过后来的研究，目前将泛素化的意义定位为控制蛋白质功能的可逆蛋白质修饰系统。

具体而言，泛素化是通过泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)等酶协同的级联反应，在作为基体的蛋白质上键合枝状泛素分子，形成聚泛素链的过程。该聚泛素链通过泛素分子内的48号赖氨酸残基的ε-氨基而形成，成为26S蛋白酶体分解的信号，引导分解目标蛋白质。

本发明以通过抑制Synoviolin的表达和/或功能使p53活化为特征，这种p53的活化与上述p53的磷酸化机理不同，其着眼于抑制p53的泛素化这一机理。

(4)Synoviolin和p53结合部位的确定

Synoviolin和p53结合部位通过下述方法确定：例如，可制备多种Synoviolin氨基酸序列中某区域缺失的p53结合部位缺失突变体，通过对³⁵S-p53进行GST Pull-down分析来确定。具体地，将上述Synoviolin的p53结合部位缺失突变体以GST融合蛋白质的形式在大肠菌等中表达，通过GST Pull-down分析法确定与³⁵S-p53蛋白质的蛋白质蛋白质间结合。

由此，判定Synoviolin的p53结合部位为从Synoviolin蛋白质所含的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)的第236号至第270号的35个氨基酸残基。

如上所述，Synoviolin促进p53的泛素化。因此，通过抑制备为Synoviolin功能之一的与p53的结合功能，抑制了p53的泛素化，从而p53被活化。参与与p53结合的Synoviolin蛋白质区域优选为Synoviolin氨基酸序列的236号至第270号的区域。因此，优选主要选择上述区域作为用于抑制结合的目标区域。为了抑制Synoviolin和p53的结合，可以例如使Synoviolin的拮抗剂(低分子化合物、肽等)作用，通过结合分析法(binding assay)、酵母双杂交法或泛素化活性测定法进行评价。或者，也可以使识别Synoviolin的上述236号至第270号区域的抗体与Synoviolin反应，通过这些方法抑制Synoviolin和p53的结合。

2.Synoviolin表达和/或功能抑制以及活性抑制

为了使p53活化，采用抑制Synoviolin表达和/或功能的方法。

对Synoviolin表达和/或功能的抑制没有特别的限定，可以利用例如RNA干涉(RNAi)。设计和合成针对Synoviolin基因的siRNA(小分子干扰RNA)，将其导入细胞内，由此可引起RNAi。

RNAi是指dsRNA(双链RNA)特异性且选择性地与目标基因结合，并切断该目标基因，由此有效抑制其表述的现象。例如，如将dsRNA导入细胞内，则抑制(敲减)与该RNA序列相同的基因的表达。

siRNA的设计可如下所述进行。

(a)只要是编码Synoviolin的基因即可没有特别限制，可将任意区域作为候补。例如，在人的情况下，可将GenBank登录号AB024690(SEQ ID NO.1)的任意区域作为候补。

(b)从选择的区域中选择以AA开始的序列，该序列的长度为19～25个碱基，优选为19～21个碱基。可以选择序列的GC含量例如为40～60％的序列。具体而言，可使用SEQ ID NO.1中所示的碱基序列中，含有选自下述碱基序列的至少一个序列的DNA作为siRNA的目标序列。特别优选将(i)(SEQ ID NO.3)、(ii)(SEQ ID NO.4)、(vi)(SEQ ID NO.8)、(vii)(SEQ ID NO.9)、(viii)(SEQ ID NO.10)作为目标。

(i)AA TGTCTGCATCATCTGCCGA GA(SEQ.ID.No.：3)

(ii)AA GCTGTGACAGATGCCATCA TG(SEQ.ID.No.：4)

(iii)AA AGCTGTGACAGATGCCATC AT(SEQ.ID.No.：5)

(iv)AA GAAAGCTGTGACAGATGCC AT(SEQ.ID.No.：6)

(v)AA GGTTCTGCTGTACATGGCC TT(SEQ.ID.No.：7)

(vi)AA CAAGGCTGTGTACATGCTC TA(SEQ.ID.No.：8)

(vii)AA ATGTTTCCACTGGCTGGCT GA(SEQ.ID.No.：9)

(vii)AA GGTGTTCTTTGGGCAACTG AG(SEQ.ID.No.：10)

(ix)AA CATCCACACACTGCTGGAC GC(SEQ.ID.No.：11)

(x)AA CACCCTGTATCCAGATGCC AC(SEQ.ID.NO.：12)

(xi)AA GGTGCACACCTTCCCACTC TT(SEQ.ID.NO.：13)

(xii)AA TGTTTCCACTGGCTGGCTG AG(SEQ.ID.NO.：14)

(xiii)AA GAGACTGCCCTGCAACCAC AT(SEQ.ID.NO.：15)

(xiv)AA CGTTCCTGGTACGCCGTCA CA(SEQ.ID.NO.：16)

将siRNA导入细胞可采用下述方法：将在体外合成的siRNA与质粒DNA连接，将其导入细胞的方法、将2条RNA退火的方法等。

另外，本发明中，为了得到RNAi效果，可以使用shRNA。shRNA称为短发夹RNA(short haipin RNA)，是一条链的一部分区域具有与其他区域形成互补链的茎环(stem-loop)结构的RNA分子。

shRNA可设计为其一部分形成茎环结构。例如，以某区域的序列作为序列A，与序列A互补的链作为序列B，则设计为以序列A、间隔区、序列B的顺序使这些序列存在于一条RNA链上，整体为45～60个碱基的长度。序列A为目标Synoviolin基因(SEQ ID NO.1)的一部分区域的序列，对目标区域没有特别限定，可将任意的区域作为候补。序列A的长度为19～25个碱基，优选为19～21个碱基。

3.药物组合物

本发明中制备的shRNA、siRNA是抑制Synoviolin表达和/或功能的物质，可作为活化p53的药物组合物(特别是癌基因治疗剂)使用。

将本发明的药物组合物用作癌的基因治疗剂时，对使用部位没有特别限定，使用对象可以为脑癌、舌癌、咽喉癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆道癌、胆囊癌、十二指肠癌、大肠癌、肝癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、横纹肌肉瘤、纤维肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、皮肤癌、各种白血病(例如急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病、成人T细胞白血病、恶性淋巴瘤)等。上述癌可以为原发灶、可以为转移的、也可以为与其他疾病并发的。

将本发明的药物组合物用作基因治疗剂时，除了通过注射将本发明的药物组合物直接给药外，还可列举施用整合了核酸的载体的方法。作为上述载体，可列举腺病毒载体、腺伴随病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒(vaccinia yirus)载体、逆转录病毒(retrovirus)载体、慢病毒(Lentivirus)载体等，可通过使用这些病毒载体更有效地施用。

另外，也可将本发明的药物组合物导入核糖体等磷脂小胞体，施用该小胞体。将保有siRNA、shRNA的小胞体通过脂质转染法导入规定的细胞。然后，将得到的细胞通过例如静脉、动脉等施用于全身。也可以对脑等局部用药。

本发明的药物组合物的给药量因年龄、性别、症状、给药途径、给药次数、剂型而不同，例如为腺病毒时，给药量为每日每次10⁶～10¹³个左右，间隔1～8周给药。

为了将siRNA或shRNA导入目的组织或器官，可以使用市售的基因导入试剂盒(例如アデノエクスプレス：クロ一ンテツク公司)。

以下通过实施例进一步具体说明本发明。但是，本发明并不限于这些实施例。

[实施例1]MEF培养细胞p53活化的研究

用蛋白质印迹法检测Synoviolin剔除小鼠(syno-/-)胚胎成纤维细胞(MEFs)的p53，进一步将细胞通过免疫组织染色确认。

即，免疫染色法是将MEFs按照常规方法固定在载玻片上，用抗p53抗体(小鼠单克隆抗体BD：Becton，Dickinson公司)进行免疫染色。用0.3％牛血清白蛋白(BSA)稀释的抗p53抗体(BD：10μg/ml)与用0.3％牛血清白蛋白(BSA)封闭了30分钟的样品在室温下免疫反应60分钟。将反应后的样品用PBS洗涤后，将TRITC标记的抗小鼠IgG抗体(Dako公司)作为第二抗体进行免疫反应。用荧光显微镜确认与抗p53抗体免疫反应的抗原。

结果，确认syno-/-的MEFs培养细胞中发生p53活化的细胞与野生型相比要多(图1，“MEF-/-”的图)。

[实施例2]syno-/-小鼠p53活化的研究

syno-/-小鼠p53活化的研究用胚胎通过免疫染色进行。

即，syno-/-胎仔的免疫染色是按照常规方法将组织固定在载玻片上，采用VECTASTAIN ABC试剂盒(VECTOR公司)进行的。稀释为5μg/ml的抗p53抗体FL393在室温下与用封闭剂封闭30分钟的样品免疫反应60分钟。用PBS洗涤反应后的样品，将HRP标记抗兔IgG抗体作为第二抗体进行免疫反应。与抗p53抗体免疫反应的抗原通过基于HRP活性的3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐的显色进行确认。作为对比染色，进行甲基绿染色。

结果，确认syno-/-胚胎中的p53活化了(图2)。

[实施例3]Synoviolin对p53的效果

syno-/-的MEF培养细胞中的p53通过蛋白质印迹法检测。

即，将各种细胞用细胞裂解液(50mM Tris-HCl(Ph8.0)、150mMNaCl、1％NP40、1mM PMSF、0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)、2μg/ml亮抑酶肽、2μg/ml抑蛋白酶肽、2μg/ml抑胃酶肽)制备破碎细胞组分。然后，用SDS聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)分离破碎的细胞部分。进行SDS-PAGE后，来自细胞的蛋白质通过电印迹法转移至硝酸纤维素(NC)膜。对该NC膜用加入5％脱脂奶粉的Tris缓冲生理盐水(TBS)在室温下封闭1小时后，将抗p53抗体c-terminalaa；195-393或FL393用加入5％脱脂奶粉的TBS稀释，在室温免疫反应1小时。反应后的NC膜用0.1％Tween 20/TBS洗涤，将辣根过氧化物酶(HRP)标记抗兔IgG抗体作为第二抗体在室温下免疫反应1小时，用0.1％Tween 20/TBS洗涤，检测HRP活性，由此检测目的抗原。HRP活性检测使用ECL试剂盒(Amersham社)(ClinicalChemistry.25，p1531，1979)。

结果，通过蛋白质印迹法确认syno-/-的MEF培养细胞中的p53表达量增加(图3)。

[实施例4]syno-/-的MEF培养细胞中的p53的磷酸化部位的鉴定

在本实施例中，用抗p53抗体通过蛋白质印迹法对p53的磷酸化部位进行鉴定。

即，用识别p53(SEQ ID NO.17)的不同丝氨酸残基的磷酸化的4种抗磷酸化p53单克隆抗体(Phospho-p53(ser15)、Phospho-p53(ser20)、Phospho-p53(ser37)和Phospho-p53(ser46)；Becton，Dickinson公司)，将MEF细胞的蛋白质用SDS-PAGE分离，实施蛋白质印迹法。蛋白质印迹法的操作，除了使用抗磷酸化p53单克隆抗体作为第一抗体，抗小鼠IgG山羊-HRP作为标记抗体以外，其他如实施例3所述。

结果，在syno-/-的MEF培养细胞中，p53的氨基酸序列(SEQ IDNO.17)中，第15位丝氨酸残基的磷酸化显著(图4)。在图4中，左上图为第15位丝氨酸残基磷酸化得到的。53kDa附近的带明显较浓。

[实施例5]Ser15磷酸化亢进的机理研究

将确认表达野生型p53的RKO(来自人大肠癌的细胞株)作为细胞株，在60mm的板上以1.0×10⁵细胞/板/2mL接种细胞，用Oligofectamine转染GFP和针对Synoviolin siRNA后，在72小时后添加对Ser15的磷酸化很重要的ATM和ATR(ATM和Rad3相关的)的抑制剂咖啡因(10mM)，用针对磷酸化Ser15-p53的抗体Phospho-p53(Ser15)进行蛋白质印迹。

结果，由Synoviolin的siRNA促进的Ser15的磷酸化由于添加了咖啡因(添加后12小时，24小时)而被完全抑制(图5)。因此，表明通常通过抑制ATM和ATR的功能，抑制p53。

[实施例6]Synoviolin对由p53诱导的p21表达的影响

对RKO细胞进行针对Synoviolin的siRNA处理，用蛋白质印迹法研究作为p53转录产物的p21表达的变化。

即，用抗p21多克隆抗体(Santa Cruz公司)，将确认表达野生型p53的RKO(来自人大肠癌的细胞株)作为细胞株在60mm板上以1.0×10⁵细胞/板/2mL接种细胞，用Oligofectamine转染GFP和针对Synoviolin的siRNA后，用SDS-PAGE分离72小时后的蛋白质，实施蛋白质印迹法。蛋白质印迹法的操作除了使用抗p21多克隆抗体作为第一抗体，抗小鼠IgG山羊-HRP作为标记抗体以外，其他与实施例3所述相同。

结果，通过对Synoviolin siRNA处理，p53的表达升高的同时，p21的表达也增加了。该效果在72小时时明显示出(图6)。

[实施例7]Synoviolin的表达抑制对p53相关蛋白质的表达、细胞周期的影响等的研究

在本实施例中，研究利用RNAi抑制滑膜细胞中的Synoviolin时对p53相关蛋白质的表达、细胞周期的影响。

将RA滑膜细胞以9.0×10⁴细胞播种在10cm dish上，转染Synoviolin siRNA(终浓度25Nm)后，用流式细胞仪观察细胞周期。结果，在siRNA 25nM(No.589)观察到细胞周期在G0/G1期的延迟(图7)。

使用h589作为siRNA。

另外，h589是指将以下的有义链和反义链退火得到的双链RNA。

有义链h589：GGU GUU CUU UGG GCA ACU G TT(SEQ IDNO.18)

反义链h589：CAG UUG CCC AAA GAA CAC C TT(SEQ IDNO.19)

[实施例8]对癌组织的Synoviolin表达的研究

将Tissue array(CHEMICON公司：10个普通人癌组织和正常人组织)用抗Synoviolin抗体(10Da)进行免疫染色。

用于免疫染色的抗体浓度为8μg/ml，使用的试剂盒为Simple StainMAX(M)。

结果，对于正常组织，在大肠、肾、肺、卵巢、精囊、皮肤和乳腺确认了Synoviolin表达，而在神经和淋巴结没有确认。另外，对于各癌组织，确认Synoviolin表达的、特别是判断为表达明显增进的组织为神经、淋巴结(图8和图9)。

[实施例9]培养细胞中Synoviolin和p53共表达时对各自的定位的影响

将3种质粒，GFP-p53、FLAG-Synoviolin以及FLAG-SynoviolinC307S(无泛素(Ub)化活性)导入Saos 2细胞。

各质粒如下。

GFP-p53：绿荧光蛋白和野生型p53的融合蛋白表达

FLAG-Synoviolin：FLAG标记野生型Synoviolin表达

FLAG-Synoviolin C307S(无泛素(Ub)化活性)：FLAG标记失活型Synoviolin表达

用fuGENE6(Roche)进行转染处理，24小时后用10％福尔马林固定，用稀释400倍的第一抗体α-FLAG抗体、稀释200倍的第二抗体α-小鼠IgG-TRITC，1μM DAPI对核进行染色，观察其定位。

结果，观察到野生型p53的强表达和在核中的定位(图10)。野生型Synoviolin强表达且在细胞质(特别是核周围)定位。另外，如果使野生型p53和野生型Synoviolin强表达，则观察到本来定位于核的p53在核周围呈小点状分布，与Synoviolin共定位(图11)。如果野生型p53和Synoviolin C307S突变体强表达，则观察到p53在细胞质内形成大点，与Synoviolin共定位(图12)。

由上可知，Synoviolin和p53在一定条件下共定位。可以认为其定位形态因泛素化活性的有无而改变。

[实施例10]利用MBP-Synoviolin dam-His的GST-p53体外泛素化的研究

观察到p53的细胞内蛋白质的量因细胞内Synoviolin的增减而变化，说明p53受Synoviolin控制。因此，为了研究Synoviolin是否直接将p53泛素化(Ub)，用GST-p53和MBP-Synoviolin dTM-His进行体外Ub化反应的研究。

GST-p53：将N末端融合了GST的p53在大肠菌内表达，生成得到的部分。

MBP-Synoviolin dTM-His：将N末端融合了MBP、C末端融合了His标记的Synoviolin在大肠菌内表达，将其纯化得到的部分。

将保有pGEX/p53的大肠菌(BL21)用500mL的LB培养基培养，用IPTG诱导后(1mM、30℃、6h)，用含有0.5％NP-40的缓冲液由培养液配制大肠菌提取液。

在0.1％NP-40存在下，用GSH-琼脂糖凝胶树脂由大肠菌提取液纯化GST-p53。用该透析后的样品，将用于MBP-Synoviolin dTM-His和其他体外Ub化反应的组合物(ATP、PK-his-HA-Ub、酵母E1、His-UbcH5c)组合进行反应(图13)。反应后，用7.5％SDS-PAGE分离蛋白质，转印至PVDF膜上，通过抗p53抗体(FL393或DO-1)检测膜上的p53蛋白质。另外，改变GST-p53的添加量进行同样的反应和检测。

结果，添加含有GST-p53纯化部分和MBP-Synoviolin dTM-His的全部组合物时，观察到以约90kDa的位置为中心的p53来源的梯状信号(图13)。另外，这些信号依赖于GST-p53添加量而增强。由这些结果可以认为，Synoviolin直接参与p53的泛素化。因此，表明通过抑制Synoviolin的表达和/或功能，可以抑制p53的泛素化。

[实施例11]RNAi下的Synoviolin、p53mRNA量的研究

在本实施例中，在Synoviolin RNAi条件下，对于Synoviolin和相关基因的mRNA量的经时变化进行研究，由此研究Synoviolin对细胞周期、凋亡等的影响。

以30000细胞/10cm dish接种RA滑膜细胞，按照规定方法转染25nM siRNA(No.589)，细胞培养4天，在此期间经时回收细胞，得到mRNA。将1μg的mRNA作为模板，用随机引物进行逆转录PCR，得到cDNA。对得到的cDNA，用ABI TaqMan Gene expression assay(GEX)进行定量。将18S rRNA作为对照基因，算出mRNA量。

GEX试剂target assay No.(assay ID)，Synoviolin为Hs00381211_ml，TP53为Hs00153340_ml。

结果，确认在Synoviolin siRNA存在下，Synoviolin mRNA量减少，但p53的mRNA量没有变化(图14)。

[实施例12]Synoviolin p53结合区域的确定

GST-Synoviolin和p53在体外通过pulldown assay结合，对此，Synoviolin蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)的第236到第270号的35个氨基酸残基是必要的。

进一步，在本实施例中，为了确定Synoviolin与p53结合的必要的区域，如图15所示，制备Synoviolin的p53结合区域缺失突变体，对³⁵S-p53如下进行GST pulldown assay(图16)。

用1μL编码各GST蛋白质的质粒转化100μL的感受态细胞(BL-21株)。各GST蛋白质和质粒的名称如下：

GST蛋白质：质粒

GST：pGEX-6P-1(Pharmacia Biotech)

GST-SynoΔTM 236-617：pGEX-5-1/SΔTM

GST-SynoΔTM 236-270：p6-3

GST-SynoΔTM 271-617：pST490

接种于4mL的LB-Amp+，在37℃培养一晚。次日测定预培养的OD600。在15mL的LB-Amp+中接种达到OD600＝3.0(终浓度0.2)。在25℃恒温槽中培养约2小时，确认OD600＝0.6～0.8后，向恒温槽中加冰，冷却至20℃，将培养容器用10分钟冷却至20℃。加入0.1M的IPTG 15μL(终浓度＝0.1mM，通常的1/1000)、1mM ZnCl₂ 150μL(终浓度＝10μM)，在20℃振荡培养4小时，诱导GST蛋白质的表达。诱导后，离心回收细胞(5000rpm，5min，4℃)。将细胞再悬浮于1mlPBS(-)，转移至Enpendorf管，回收细胞(14000rpm，1min，4℃)。吸取全部上清后，再悬浮于500μL的PBS(-)/Z(PBS(-)/10μM ZnCl₂)，用液氮冷冻，在-20℃下保存。次日，将-20℃的样品置于37℃的恒温槽中10min，使其溶解，接着放到冰水中冷却至0℃。混合以下蛋白水解酶抑制剂，每个样品加6.5μL。

100mM PMSF(Final 1mM)                        20μl

抑蛋白酶肽(Final 0.1％)                      2μl

0.5mg/ml抑胃酶肽(Final 0.5μg/ml)            2μl

1mg/ml亮抑酶肽(Final 1μg/ml)                2μl

将各样品进行超声波破碎(Power Level 7、15秒，3次)。每次在冰水中冷却30秒。接着加入500μl的2x GST Buffer/Z(2％TritonX-100，720mM NaCl、1x PBS(-)、10μM ZnCl₂、10mMβ-巯基乙醇、2mM PMSF、0.1％抑蛋白酶肽)并混合后，进一步进行超声波破碎(Power Level 7、15秒、1次)。将破碎的液体在14000rpm30min 4℃的条件下离心。在此期间用1ml的1x PBS(-)将200μl的80％-匀浆谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Glutathione Sepharose)珠洗涤3次，加入160μl的1x PBS(-)，调整至50％-匀浆。向1ml离心后的上清中加入80μl的50％-匀浆谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠，在4℃下旋转2小时，使GST蛋白质结合于珠。用1mL的1x GST-Buffer/Z(1％TritonX-100，360mM NaCl、0.5x PBS(-)、5μM ZnCl₂、5mMβ-巯基乙醇、1mM PMSF、0.05％抑蛋白酶肽)将珠洗涤4次。离心在2000rpm、1min、4℃的条件下进行。残留的上清全部吸取后，加入60μL的1x GST-Buffer/Z，使合计为100μL。将其中10μL与等量的2xSDS Sample Buffer混合，在100℃下用加热器(heatblock)加热5min，每次10μl地加至10％凝胶中。同时还使用0.25～4μg的BSA。进行电泳(150V 50min)、CBB染色(用未使用的30min)、脱色(1小时2次)、甘油水(30～60min)、干燥凝胶(80℃、1小时)，检测GST蛋白质表达、回收效率。次日，进行³⁵S-p53的体外翻译。首先，混合以下试剂。

TNT网织红细胞裂解物(-80℃)                25μl

TNT网织红细胞缓冲液(-80℃)                2μl

氨基酸混合物(蛋氨酸)(-80℃)               1μl

DEPC-处理水                               15μl

RNase抑制剂(培养室-20℃)                1μl

TNT聚合酶(培养室-20℃)                  1μl

³⁵S-Met                                 4μl

质粒(p53·HA)                           1μl

                                        合计50μl

在30℃恒温槽中保温1.5～2.5小时，进行体外翻译。在此期间，将G-25柱的盖(ふた)轻缓离心(2500rpm，1min，4℃)，加入100μl的pulldown Buffer V(20mM HEPES pH 7.9、150mM NaCl、0.2％TritonX-100)，进一步离心，洗柱。将50μl体外翻译溶液全部加在该柱上，进行离心(2500rpm，1min，4℃)。再加200μl的pulldown BufferV，再次离心(2500rpm，1min，4℃)。将其用作体外翻译产物(IvTL)。将其中的4μl与16μl的Milli-Q，20μl的2xSDS Buffer混合，作为On put10％。向含有结合有30μg GST蛋白质的珠的1ml pulldown Buffer V中加入120μl的IvTL，在4℃旋转1小时。离心(10000rpm，1min，4℃)后，将上清每次以370μL的量加入含有GST、各GST-Synoviolin珠的1ml pulldown BufferV中，在4℃旋转1小时。将该珠用1mlpulldown Buffer V洗涤4次。此时必须剩余上清100μl，使其不吸取珠。离心在2500rpm、1min、4℃的条件下进行。吸取上清后，加入40μl的1x SDS Sample Buffer，作为Pulldown样品。将On put 10％和pulldown样品在100℃加热1小时，在-20℃保存。次日将样品在37℃的恒温槽中加热10分钟，每次以10μl的量加至10％凝胶。进行电泳(150V 50min)、CBB染色(30min)、脱色(1小时2次)、甘油水(30～60min)、干燥凝胶(80℃、1小时)后，对IP Plate曝光。14小时后，用BAS读取曝光的IP Plate，用ImageGauge定量。另外用膜扫描仪(filmscanner)读取C.B.B.染色的凝胶。

结果，p53结合区域缺失突变体几乎完全失去了结合活性。另外，由图15可知p53结合区域仅为从236开始到270氨基酸的35个氨基酸的一个部位。

产业实用性

通过本发明提供促进p53癌抑制基因活性的物质。该物质由于可活化p53，使p53转移至核，因此可用作癌治疗用药物组合物。在本发明中，通过抑制Synoviolin的表达和/或功能，可治疗癌。

序列表free text

SEQ ID NO.17：合成的寡聚核苷酸(DNA/RNA混合物)

SEQ ID NO.18：合成的寡聚核苷酸(DNA/RNA混合物)

                     序列表

<110>Locomogene，Inc

<120>抑制癌症的方法

<130>P04-232PCT

<150>JP2003-428300

<151>2003-12-24

<160>19

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>3374

<212>DNA

<213>(智人)Homo sapiens

<220>

<221>CDS

<222>(403)..(2256)

<223>

<400>1

gccctttctt atgagcatgc ctgtgttggg ttgacagtga gggtaataat gacttgttgg    60

ttgattgtag atatagggct ctcccttgca aggtaattag gctccttaaa ttacctgtaa    120

gattttcttg ccacagcatc cattctggtt aggctggtga tcttctgagt agtgatagat    180

tggttggtgg tgaggtttac aggtgttccc ttctcttact cctggtgttg gctacaatca    240

ggtggcgtct agagcagcat gggacaggtg ggtaagggga gtcttctcat tatgcagaag    300

tgatcaactt aaatctctgt cagatctacc tttatgtagc ccggcagtcg cgcggattga    360

gcgggctcgc ggcgctgggt tcctggtctc cgggccaggg ca atg ttc cgc acg       414

                                               Met Phe Arg Thr

gca gtg atg atg gcg gcc agc ctg gcg ctg acc ggg gct gtg gtg gct      462

Ala Val Met Met Ala Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gly Ala Val Val Ala

5                   10                  15                  20

cac gcc tac tac ctc aaa cac cag ttc tac ccc act gtg gtg tac ctg      510

His Ala Tyr Tyr Leu Lys His Gln Phe Tyr Pro Thr Val Val Tyr Leu

                25                  30                  35

acc aag tcc agc ccc agc atg gca gtc ctg tac atc cag gcc ttt gtc    558

Thr Lys Ser Ser Pro Ser Met Ala Val Leu Tyr Ile Gln Ala Phe Val

            40                  45                  50

ctt gtc ttc ctt ctg ggc aag gtg atg ggc aag gtg ttc ttt ggg caa    606

Leu Val Phe Leu Leu Gly Lys Val Met Gly Lys Val Phe Phe Gly Gln

        55                  60                  65

ctg agg gca gca gag atg gag cac ctt ctg gaa cgt tcc tgg tac gcc    654

Leu Arg Ala Ala Glu Met Glu His Leu Leu Glu Arg Ser Trp Tyr Ala

    70                  75                  80

gtc aca gag act tgt ctg gcc ttc acc gtt ttt cgg gat gac ttc agc    702

Val Thr Glu Thr Cys Leu Ala Phe Thr Val Phe Arg Asp Asp Phe Ser

85                  90                  95                  100

ccc cgc ttt gtt gca ctc ttc act ctt ctt ctc ttc ctc aaa tgt ttc    750

Pro Arg Phe Val Ala Leu Phe Thr Leu Leu Leu Phe Leu Lys Cys Phe

                105                 110                 115

cac tgg ctg gct gag gac cgt gtg gac ttt atg gaa cgc agc ccc aac    798

His Trp Leu Ala Glu Asp Arg Val Asp Phe Met Glu Arg Ser Pro Asn

            120                 125                 130

atc tcc tgg ctc ttt cac tgc cgc att gtc tct ctt atg ttc ctc ctg    846

Ile Ser Trp Leu Phe His Cys Arg Ile Val Ser Leu Met Phe Leu Leu

        135                 140                 145

ggc atc ctg gac ttc ctc ttc gtc agc cac gcc tat cac agc atc ctg    894

Gly Ile Leu Asp Phe Leu Phe Val Ser His Ala Tyr His Ser Ile Leu

    150                 155                 160

acc cgt ggg gcc tct gtg cag ctg gtg ttt ggc ttt gag tat gcc atc    942

Thr Arg Gly Ala Ser Val Gln Leu Val Phe Gly Phe Glu Tyr Ala Ile

165                 170                 175                 180

ctg atg acg atg gtg ctc acc atc ttc atc aag tat gtg ctg cac tcc    990

Leu Met Thr Met Val Leu Thr Ile Phe Ile Lys Tyr Val Leu His Ser

                185                 190                 195

gtg gac ctc cag agt gag aac ccc tgg gac aac aag gct gtg tac atg    1038

Val Asp Leu Gln Ser Glu Asn Pro Trp Asp Asn Lys Ala Val Tyr Met

            200                 205                 210

ctc tac aca gag ctg ttt aca ggc ttc atc aag gtt ctg ctg tac atg    1086

Leu Tyr Thr Glu Leu Phe Thr Gly Phe Ile Lys Val Leu Leu Tyr Met

        215                 220                 225

gcc ttc atg acc atc atg atc aag gtg cac acc ttc cca ctc ttt gcc    1134

Ala Phe Met Thr Ile Met Ile Lys Val His Thr Phe Pro Leu Phe Ala

    230                 235                 240

atc cgg ccc atg tac ctg gcc atg aga cag ttc aag aaa gct gtg aca    1182

Ile Arg Pro Met Tyr Leu Ala Met Arg Gln Phe Lys Lys Ala Val Thr

245                 250                 255                 260

gat gcc atc atg tct cgc cga gcc atc cgc aac atg aac acc ctg tat    1230

Asp Ala Ile Met Ser Arg Arg Ala Ile Arg Asn Met Asn Thr Leu Tyr

                265                 270                 275

cca gat gcc acc cca gag gag ctc cag gca atg gac aat gtc tgc atc    1278

Pro Asp Ala Thr Pro Glu Glu Leu Gln Ala Met Asp Asn Val Cys Ile

            280                 285                 290

atc tgc cga gaa gag atg gtg act ggt gcc aag aga ctg ccc tgc aac    1326

Ile Cys Arg Glu Glu Met Val Thr Gly Ala Lys Arg Leu Pro Cys Asn

        295                 300                 305

cac att ttc cat acc agc tgc ctg cgc tcc tgg ttc cag cgg cag cag    1374

His Ile Phe His Thr Ser Cys Leu Arg Ser Trp Phe Gln Arg Gln Gln

    310                 315                 320

acc tgc ccc acc tgc cgt atg gat gtc ctt cgt gca tcg ctg cca gcg    1422

Thr Cys Pro Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala Ser Leu Pro Ala

325                 330                 335                 340

cag tca cca cca ccc ccg gag cct gcg gat cag ggg cca ccc cct gcc    1470

Gln Ser Pro Pro Pro Pro Glu Pro Ala Asp Gln Gly Pro Pro Pro Ala

                345                 350                 355

ccc cac ccc cca cca ctc ttg cct cag ccc ccc aac ttc ccc cag ggc    1518

Pro His Pro Pro Pro Leu Leu Pro Gln Pro Pro Asn Phe Pro Gln Gly

            360                 365                 370

ctc ctg cct cct ttt cct cca ggc atg ttc cca ctg tgg ccc ccc atg    1566

Leu Leu Pro Pro Phe Pro Pro Gly Met Phe Pro Leu Trp Pro Pro Met

        375                 380                 385

ggc ccc ttt cca cct gtc ccg cct ccc ccc agc tca gga gag gct gtg    1614

Gly Pro Phe Pro Pro Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser Gly Glu Ala Val

    390                 395                 400

gct cct cca tcc acc agt gca gca gcc ctt tct cgg ccc agt gga gca    1662

Ala Pro Pro Ser Thr Ser Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Ser Gly Ala

405                 410                 415                 420

gct aca acc aca gct gct ggc acc agt gct act gct gct tct gcc aca    1710

Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala Ala Ser Ala Thr

               425                  430                 435

gca tct ggc cca ggc tct ggc tct gcc cca gag gct ggc cct gcc cct    1758

Ala Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Glu Ala Gly Pro Ala Pro

            440                 445                 450

ggt ttc ccc ttc cct cct ccc tgg atg ggt atg ccc ctg cct cca ccc    1806

Gly Phe Pro Phe Pro Pro Pro Trp Met Gly Met Pro Leu Pro Pro Pro

        455                 460                 465

ttt gcc ttc ccc cca atg cct gtg ccc cct gcg ggc ttt gct ggg ctg    1854

Phe Ala Phe Pro Pro Met Pro Val Pro Pro Ala Gly Phe Ala Gly Leu

    470                 475                 480

acc cca gag gag cta cga gct ctg gag ggc cat gag cgg cag cac ctg    1902

Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Leu Glu Gly His Glu Arg Gln His Leu

485                 490                 495                 500

gag gcc cgg ctg cag agc ctg cgt aac atc cac aca ctg ctg gac gcc    1950

Glu Ala Arg Leu Gln Ser Leu Arg Asn Ile His Thr Leu Leu Asp Ala

                505                 510                 515

gcc atg ctg cag atc aac cag tac ctc acc gtg ctg gcc tcc ttg ggg    1998

Ala Met Leu Gln Ile Asn Gln Tyr Leu Thr Val Leu Ala Ser Leu Gly

            520                 525                 530

ccc ccc cgg cct gcc act tca gtc aac tcc act gag ggg act gcc act    2046

Pro Pro Arg Pro Ala Thr Ser Val Asn Ser Thr Glu Gly Thr Ala Thr

        535                 540                 545

aca gtt gtt gct gct gcc tcc tcc acc agc atc cct agc tca gag gcc    2094

Thr Val Val Ala Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ile Pro Ser Ser Glu Ala

    550                 555                 560

acg acc cca acc cca gga gcc tcc cca cca gcc cct gaa atg gaa agg    2142

Thr Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Pro Pro Ala Pro Glu Met Glu Arg

565                 570                 575                 580

cct cca gct cct gag tca gtg ggc aca gag gag atg cct gag gat gga      2190

Pro Pro Ala Pro Glu Ser Val Gly Thr Glu Glu Met Pro Glu Asp Gly

                585                 590                 595

gag ccc gat gca gca gag ctc cgc cgg cgc cgc ctg cag aag ctg gag      2238

Glu Pro Asp Ala Ala Glu Leu Arg Arg Arg Arg Leu Gln Lys Leu Glu

            600                 605                 610

tct cct gtt gcc cac tga cactgcccca gcccagcccc agcctctgct             2286

Ser Pro Val Ala His

        615

cttttgagca gccctcgctg gaacatgtcc tgccaccaag tgccagctcc ctctctgtct    2346

gcaccaggga gtagtacccc cagctctgag aaagaggcgg catcccctag gccaagtgga    2406

aagaggctgg ggttcccatt tgactccagt cccaggcagc catggggatc tcgggtcagt    2466

tccagccttc ctctccaact cttcagccct gtgttctgct ggggccatga aggcagaagg    2526

tttagcctct gagaagccct cttcttcccc cacccctttc caggagaagg ggctgcccct    2586

ccaagcccta cttgtatgtg cggagtcaca ctgcagtgcc gaacagtatt agctcccgtt    2646

cccaagtgtg gactccagag gggctggagg caagctatga acttgctcgc tggcccaccc    2706

ctaagactgg tacccatttc cttttcttac cctgatctcc ccagaagcct cttgtggtgg    2766

tggctgtgcc ccctatgccc tgtggcattt ctgcgtctta ctggcaacca cacaactcag    2826

ggaaaggaat gcctgggagt gggggtgcag gcgggcagca ctgagggacc ctgccccgcc    2886

cctcccccca ggcccctttc ccctgcagct tctcaagtga gactgacctg tctcacccag    2946

cagccactgc ccagccgcac tccaggcaag ggccagtgcg cctgctcctg accactgcaa    3006

tcccagcgcc caaggaaggc cacttctcaa ctggcagaac ttctgaagtt tagaattgga    3066

attacttcct tactagtgtc ttttggctta aattttgtct tttgaagttg aatgcttaat    3126

cccgggaaag aggaacagga gtgccagact cctggtcttt ccagtttaga aaaggctctg    3186

tgccaaggag ggaccacagg agctgggacc tgcctgcccc tgtcctttcc ccttggtttt    3246

gtgttacaag agttgttgga gacagtttca gatgattatt taatttgtaa atattgtaca    3306

aattttaata gcttaaattg tatatacagc caaataaaaa cttgcattaa caaaaaaaaa  3366

aaaaaaaa                                                           3374

<210>2

<211>617

<212>PRT

<213>智人

<400>2

Met Phe Arg Thr Ala Val Met Met Ala Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gly

1               5                   10                  15

Ala Val Val Ala His Ala Tyr Tyr Leu Lys His Gln Phe Tyr Pro Thr

            20                  25                  30

Val Val Tyr Leu Thr Lys Ser Ser Pro Ser Met Ala Val Leu Tyr Ile

        35                  40                  45

Gln Ala Phe Val Leu Val Phe Leu Leu Gly Lys Val Met Gly Lys Val

    50                  55                  60

Phe Phe Gly Gln Leu Arg Ala Ala Glu Met Glu His Leu Leu Glu Arg

65                  70                  75                  80

Ser Trp Tyr Ala Val Thr Glu Thr Cys Leu Ala Phe Thr Val Phe Arg

                85                  90                  95

Asp Asp Phe Ser Pro Arg Phe Val Ala Leu Phe Thr Leu Leu Leu Phe

            100                 105                 110

Leu Lys Cys Phe His Trp Leu Ala Glu Asp Arg Val Asp Phe Met Glu

        115                 120                 125

Arg Ser Pro Asn Ile Ser Trp Leu Phe His Cys Arg Ile Val Ser Leu

    130                 135                 140

Met Phe Leu Leu Gly Ile Leu Asp Phe Leu Phe Val Ser His Ala Tyr

145                 150                 155                 160

His Ser Ile Leu Thr Arg Gly Ala Ser Val Gln Leu Val Phe Gly Phe

                165                 170                 175

Glu Tyr Ala Ile Leu Met Thr Met Val Leu Thr Ile Phe Ile Lys Tyr

            180                 185                 190

Val Leu His Ser Val Asp Leu Gln Ser Glu Asn Pro Trp Asp Asn Lys

        195                 200                 205

Ala Val Tyr Met Leu Tyr Thr Glu Leu Phe Thr Gly Phe Ile Lys Val

    210                 215                 220

Leu Leu Tyr Met Ala Phe Met Thr Ile Met Ile Lys Val His Thr Phe

225                 230                 235                 240

Pro Leu Phe Ala Ile Arg Pro Met Tyr Leu Ala Met Arg Gln Phe Lys

                245                 250                 255

Lys Ala Val Thr Asp Ala Ile Met Ser Arg Arg Ala Ile Arg Asn Met

            260                 265                 270

Asn Thr Leu Tyr Pro Asp Ala Thr Pro Glu Glu Leu Gln Ala Met Asp

        275                 280                 285

Asn Val Cys Ile Ile Cys Arg Glu Glu Met Val Thr Gly Ala Lys Arg

    290                 295                 300

Leu Pro Cys Asn His Ile Phe His Thr Ser Cys Leu Arg Ser Trp Phe

305                 310                 315                 320

Gln Arg Gln Gln Thr Cys Pro Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala

                325                 330                 335

Ser Leu Pro Ala Gln Ser Pro Pro Pro Pro Glu Pro Ala Asp Gln Gly

            340                 345                 350

Pro Pro Pro Ala Pro His Pro Pro Pro Leu Leu Pro Gln Pro Pro Asn

        355                 360                 365

Phe Pro Gln Gly Leu Leu Pro Pro Phe Pro Pro Gly Met Phe Pro Leu

    370                 375                 380

Trp Pro Pro Met Gly Pro Phe Pro Pro Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser

385                 390                 395                 400

Gly Glu Ala Val Ala Pro Pro Ser Thr Ser Ala Ala Ala Leu Ser Arg

                405                 410                 415

Pro Ser Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala

            420                 425                 430

Ala Ser Ala Thr Ala Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Glu Ala

        435                 440                 445

Gly Pro Ala Pro Gly Phe Pro Phe Pro Pro Pro Trp Met Gly Met Pro

    450                 455                 460

Leu Pro Pro Pro Phe Ala Phe Pro Pro Met Pro Val Pro Pro Ala Gly

465                 470                 475                 480

Phe Ala Gly Leu Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Leu Glu Gly His Glu

                485                 490                 495

Arg Gln His Leu Glu Ala Arg Leu Gln Ser Leu Arg Asn Ile His Thr

            500                 505                 510

Leu Leu Asp Ala Ala Met Leu Gln Ile Asn Gln Tyr Leu Thr Val Leu

        515                 520                 525

Ala Ser Leu Gly Pro Pro Arg Pro Ala Thr Ser Val Asn Ser Thr Glu

    530                 535                 540

Gly Thr Ala Thr Thr Val Val Ala Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ile Pro

545                 550                 555                 560

Ser Ser Glu Ala Thr Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Pro Pro Ala Pro

                565                 570                 575

Glu Met Glu Arg Pro Pro Ala Pro Glu Ser Val Gly Thr Glu Glu Met

            580                 585                 590

Pro Glu Asp Gly Glu Pro Asp Ala Ala Glu Leu Arg Arg Arg Arg Leu

        595                 600                 605

Gln Lys Leu Glu Ser Pro Val Ala His

    610                 615

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>智人

<400>3

aatgtctgca tcatctgccg aga                                          23

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>智人

<400>4

aagctgtgac agatgccatc atg                                            23

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>智人

<400>5

aaagctgtga cagatgccat cat                                            23

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>智人

<400>6

aagaaagctg tgacagatgc cat                                            23

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>智人

<400>7

aaggttctgc tgtacatggc ctt                                            23

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>智人

<400>8

aacaaggctg tgtacatgct cta                                            23

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>智人

<400>9

aaatgtttcc actggctggc tga                                            23

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>智人

<400>10

aaggtgttct ttgggcaact gag                                            23

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>智人

<400>11

aacatccaca cactgctgga cgc                                            23

<210>12

<211>23

<212>DNA

<213>智人

<400>12

aacaccc tgt atccagatgc cac                                           23

<210>13

<211>23

<212>DNA

<213>智人

<400>13

aaggtgcaca ccttcccact ctt                                            23

<210>14

<211>23

<212>DNA

<213>智人

<400>14

aatgtttcca ctggctggct gag                                            23

<210>15

<211>23

<212>DNA

<213>

<400>15

aagagactgc cctgcaacca cat                                            23

<210>16

<211>23

<212>DNA

<213>

<400>16

aacgttcctg gtacgccgtc aca                                            23

<210>17

<211>393

<212>PRT

<213>智人

<400>17

Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln

1                5                  10                  15

Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu

            20                  25                  30

Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp

        35                  40                  45

Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro

    50                  55                  60

Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Arg Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro

65                  70                  75                  80

Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser

                85                  90                  95

Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly

            100                 105                 110

Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro

        115                 120                 125

Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln

    130                 135                 140

Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met

145                 150                 155                 160

Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys

                165                 170                 175

Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln

            180                 185                 190

His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp

        195                 200                 205

Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu

    210                 215                 220

Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser

225                 230                 235                 240

Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr

                245                 250                 255

Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val

            260                 265                 270

Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn

        275                 280                 285

Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr

    290                 295                 300

Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys

305                 310                 315                 320

Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu

                325                 330                 335

Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp

            340                 345                 350

Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His

        355                 360                 365

Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met

    370                 375                 380

Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp

385                 390

<210>18

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸(DNA/RNA混合物)

<400>18

gguguucuuu gggcaacugt t                                            21

<210>19

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸(DNA/RNA混合物)

<400>19

caguugccca aagaacacct t                                            21

Claims (22)

1.医药组合物，其含有促进p53癌抑制基因或p53蛋白质活性的物质。

2.权利要求1所述的医药组合物，其中，促进p53癌抑制基因或p53蛋白质活化的物质是抑制Synoviolin的表达和/或功能的物质。

3.权利要求2所述的医药组合物，其中，抑制Synoviolin的表达和/或功能的物质是针对编码Synoviolin的基因的siRNA或shRNA。

4.权利要求3所述的医药组合物，其中，编码Synoviolin的基因含有SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

5.权利要求3所述的医药组合物，其中，siRNA以SEQ ID NO.1所示的碱基序列中的一部分序列为靶。

6.权利要求1～5中任意一项所述的医药组合物，其用于治疗癌。

7.p53癌抑制基因或p53蛋白质的活化方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表达和/或功能。

8.使p53蛋白质定位于核的方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表达和/或功能。

9.癌的抑制方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表达和/或功能，使p53蛋白质定位于核。

10.权利要求9所述的方法，其特征在于，对定位于核的p53蛋白质进一步进行放射线照射或紫外线照射。

11.权利要求9所述的方法，其特征在于，使含有定位于核的p53蛋白质的细胞进一步与抗癌剂接触，或对该细胞周围的脉管实施栓塞。

12.将p53蛋白质的氨基酸残基的一部分磷酸化的方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表达和/或功能。

13.权利要求12所述的方法，其中，氨基酸残基的一部分为第15位丝氨酸残基。

14.活化磷酸化酶的方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表达和/或功能。

15.权利要求14所述的方法，其中，磷酸化酶为ATM、ATR、或与它们具有同样活性的酶等。

16.诱导p21蛋白质表达的方法，其通过抑制Synoviolin的表达和/或功能活化p53蛋白质，由此诱导21蛋白质表达。

17.癌的抑制方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表达和/或功能，由p53蛋白质诱导p21蛋白质的表达。

18.活化p53蛋白质的方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表达和/或功能。

19.权利要求7～18中任意一项所述的方法，其中，Synoviolin表达的抑制利用针对编码Synoviolin的基因的siRNA或shRNA进行。

20.权利要求7～18中任意一项所述的方法，其中，抑制Synoviolin功能为抑制Synoviolin与p53蛋白质结合的功能。

21.权利要求19所述的方法，其中，编码Synoviolin的基因含有SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

22.权利要求19所述的方法，其中，siRNA以SEQ ID NO.1所示的碱基序列中的一部分序列为靶。

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