ES2287974T3 - Terapia genica supresora de tumor y quimioterapia combinadas en el tratamiento neoplasmas. - Google Patents

Abstract

En una realización, esta invención proporciona procedimientos ara tratar el cáncer en mamíferos o células hiperproliferativas, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto dichas células con una proteína supresora de tumores o un ácido nucleico supresor de tumores y poner en contacto también dicha célula con al menos un agente contra el cáncer adyuvante. La invención proporciona también una composición farmacéutica que comprende una proteína supresora de tumores o un ácido nucleico supresor de tumores y al menos un agente contra el cáncer adyuvante, y un estuche para el tratamiento del cáncer o células hiperproliferativas en un mamífero.

Description

Terapia génica supresora de tumor y quimioterapia combinadas en el tratamiento de neoplasmas.

Campo de la invención

La presente invención describe nuevas composiciones para tratar a sujetos que padecen enfermedades hiperproliferativas tales como tumores o enfermedades metastásicas. En particular, la presente invención provee composiciones para inhibir la hiperproliferación de células, más específicamente células neoplásicas, que comprenden un gen supresor de tumores y un antineoplásico auxiliar.

Antecedentes de la invención

Las anormalidades cromosómicas por lo general se asocian con trastorno genéticos, enfermedades degenerativas y cáncer. En particular, la deleción o multiplicación de copias de los cromosomas completos o segmentos de cromosomas, y las amplificaciones de nivel superior de regiones específicas del genoma son comunes en el cáncer. Véanse, por ejemplo Smith (1991) Breast Cancer Res. Treat., 18: Supl. 1: 5-14; van de Viler (1991) Became. Beefiest. Acta. 1072; 33-50, Sato (1990) Cancer. Res., 50: 7184-7189. De hecho, la amplificación de secuencias de ADN que contienen proto-oncogenes y la deleción de secuencias de ADN que contienen genes supresores de tumores, son cada una frecuentemente características de oncogénesis. Dutrillaux (1990) Cancer Genet. Cytogenet. 49; 203-217.

La mutación del gen p53 es la alteración genética más común en el cáncer humano (Banek (1991) Oncogene 6: 1699-1703, Hollstein (1991) Science, 253: 49-53). Además, la introducción de p53 natural a células mamíferas cancerosas que carecen de la proteína p53 natural suprime el fenotipo neoplásico de esas células (véase, p. ej., la patente estadounidense No. 5,532,220).

De los diversos fármacos quimioterapéuticos disponibles, el paclitaxel, (NSC número: 125973) ha generado interés debido a su eficacia en ensayos clínicos contra tumores resistentes a los fármacos, incluyendo tumores ováricos y de glándulas mamarias (Hawkins (1992) Oncology, 6: 17-23, Horwitz (1992) Trends Pharmacol. Sci. 13: 134-146, Rowinsky (1990) J. Natl Canc, Inst. 82: 1247-1259). Los estudios recientes sobre la interacción del paclitaxel y la terapia génica supresora de tumores muestran que los niveles reducidos de supresor de tumores (es decir, p53) se correlacionaron con una mayor interrupción de la fase G2/M, micronucleación y apoptosis inducida por paclitaxel independiente de p53. En contraste, las células sobrevivientes con p53 intacto progresaron a través de la mitosis y transitoriamente se acumularon en la fase G1 subsiguiente, coincidentemente con el aumento de los niveles de proteína p53 y p21^{cipl.waft} (Wahl (1996) Nature Med. 2:72-79). De modo similar, Hawkins (1996) Canc. Res. 56: 892-898, demostró que la inactivación de p53 potenció la sensibilidad a ciertos agentes antimitóticos, incluyendo paclitaxel. Los autores sugirieron que p53 cumple una función en la reparación del ADN, permitiendo así que las células progresen más fácilmente a través de la fase S, incluso en presencia de fármacos. El documento WO 95/28948 analiza el tratamiento contra el cáncer con una combinación de ácido nucleico de p53 y un agente que daña el ADN, como cisplatino.

Estos estudios sugieren así que la terapia génica supresora de tumores y la farmacoterapia con agentes antimitóticos (especialmente terapia de paclitaxel) actúan en propósitos cruzados.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona composiciones para tratar células mamíferas hiperproliferativas. La invención se basa, en parte, en el sorprendente descubrimiento de que los antineoplásicos auxiliares en combinación con la terapia génica supresora de tumores (p. ej., p53) proporciona un efecto potenciado que inhibe la proliferación de células neoplásicas y otras células que tienen actividad supresora de tumores deficiente.

Por lo tanto, en una realización, la presente invención provee el uso de un ácido nucleico supresor de tumores que es un ácido nucleico que codifica una proteína supresora de tumores que comprende una proteína p53 natural o una proteína retinoblastoma (RB), en combinación con

(a) un agente que afecta los microtúbulos seleccionado del grupo que consiste en paclitaxel, Taxotere® o un derivado de paclitaxel, o

(b) un inhibidor de poliprenil-proteína transferasa seleccionado entre un inhibidor de geranilgeranil-proteína transferasa o un inhibidor de farnesil-proteína transferasa (FPT) que se selecciona del grupo que consiste en FPT39, un compuesto mimético de péptido farnesilado, una benzocicloheptapiridina tricíclica de anillo y un derivado de farnesilo, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar células cancerosas o hiperproliferativas en mamíferos.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico supresor de tumores y el antineoplásico auxiliar se utilizan con por lo menos un agente quimioterapéutico. Por ejemplo, un ácido nucleico supresor de tumores (p. ej., un ácido nucleico que codifica p53) se puede administrar con un antineoplásico auxiliar (p. ej., paclitaxel) y un agente que daña el ADN tal como carboplatino, navelbina (tartrato de vinorelbina).

Las células cancerosas o hiperproliferativas son a menudo células neoplásicas. Cuando las células están presentes en un tumor, la composición farmacéutica inhibe el crecimiento del tumor y es por lo tanto útil para tratar un cáncer. Dichos tipos de cáncer incluyen cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, hepatocarcinoma, melanoma, retinoblastoma, tumor de mama, carcinoma colorrectal, leucemia, linfoma, tumor cerebral, carcinoma de cuello uterino, sarcoma, tumor de próstata, tumor vesical, tumor de los tejidos reticuloendoteliales, tumor de Wilm, astrocitoma, glioblastoma, neuroblastoma, carcinoma ovárico, osteosarcoma, cáncer renal o cáncer de cabeza y cuello.

El antineoplásico auxiliar es paclitaxel o un derivado de paclitaxel, mientras que el ácido nucleico supresor de tumores es un ácido nucleico que codifica una proteína supresora de tumores seleccionada del grupo que consiste en la proteína p53 natural y una proteína retinoblastoma (RB). Una proteína retinoblastoma particularmente preferida es p110^{RB} o p56^{RB}.

El ácido nucleico supresor de tumores preferiblemente es administrado a la célula diana por un vector. Los virus de dichos vectores han sido modificados por tecnología de ADN recombinante para permitir la expresión del ácido nucleico supresor de tumores en la célula diana. Estos vectores pueden derivar de vectores de origen no vírico (p. ej., plásmidos) o de origen vírico (p. ej., adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus, herpes virus, virus variolovacunal). En la práctica preferida de la invención, el vector es un vector adenovírico recombinantemente modificado. Los vectores no víricos preferiblemente forman complejo con agentes para facilitar la entrada del ADN a través de la membrana celular. Los ejemplos de dichos complejos de vectores no víricos incluyen la formulación con agentes policatiónicos que facilitan la condensación del ADN y los sistemas de administración a base de lípidos. Un ejemplo de un sistema de administración a base de lípidos incluiría una administración de los ácidos nucleicos a base de liposomas.

Los vectores adenovíricos particularmente adecuados (p. ej., para administración de un ácido nucleico que codifica una proteína p53 natural) comprenden una deleción parcial o total del ADN de una proteína IX. En una realización, la deleción de la secuencia génica de la proteína IX se extiende entre aproximadamente 3500 bp desde el extremo vírico 5' y aproximadamente 4000 bp desde el extremo vírico 5'. El vector puede además comprender una deleción de una secuencia de ADN no esencial en la región temprana del adenovirus 3 y/o en la región temprana del adenovirus 4, y en una realización, la deleción es la secuencia de ADN E1a y/o E1b. Un vector adenovírico recombinante particularmente preferido para administración de p53 ADNc humano comprende el promotor tardío principal de adenovirus de tipo 2 o el promotor CMV humano, y el ADNc guía tripartito de adenovirus tipo 2. Un vector adenovírico preferido es ACN53.

El paclitaxel o los derivados de paclitaxel preferidos incluyen paclitaxel y/o Taxotere®, prefiriéndose el paclitaxel. Otro antineoplásico auxiliar preferido es epotilona. En una realización particularmente preferida, el supresor de tumores es A/C/N/53 y el antineoplásico auxiliar es paclitaxel.

El ácido nucleico supresor de tumores puede dispersarse en un excipiente farmacológicamente aceptable. De modo similar, el antineoplásico auxiliar (p. ej., paclitaxel o derivado de paclitaxel) puede dispersarse en un excipiente farmacológicamente aceptable. El ácido nucleico supresor de tumores y dicho paclitaxel o derivado de paclitaxel pueden dispersarse ambos en una única composición (que comprende uno o múltiples excipientes).

El supresor de tumores y el antineoplásico auxiliar pueden administrarse por vía intrarterial, intravenosa (p. ej., por inyección), intraperitoneal y/o intratumoral, juntos o en secuencias. Los sitios preferidos de administración incluyen la arteria intrahepática, intraperitoneal o, si se desea tratar células en la cabeza (p. ej., células neurológicas), en el sistema de las arterias carótidas.

El ácido nucleico supresor de tumores se puede administrar en una única dosis o en una multiplicidad de tratamientos, p. ej., cada uno con una separación de por lo menos aproximadamente 6 horas, más preferiblemente en por lo menos tres tratamientos separados por aproximadamente 24 horas.

En otra realización preferida, el ácido nucleico supresor de tumores se administra (con o sin un antineoplásico auxiliar) en una dosis total en el intervalo de 1 x 10^{9} a 1 x 10^{14}, o 1 x 10^{9} a 7,5 x 10^{15}, preferiblemente 1 x 10^{11} a 7,5 x 10^{13} partículas de adenovirus en un régimen de tratamiento seleccionado entre: la dosis total en una dosis única, la dosis total administrada diariamente durante 5 días, la dosis total administrada diariamente durante 15días y la dosis total administrada diariamente durante 30 días. La dosis también se puede administrar continuamente durante 1 a 30 días. El paclitaxel o el derivado de paclitaxel se administra en una dosis total en el intervalo de 75-350 mg/m^{2} durante 1 hora, 3 horas, 6 horas o 24 horas en un régimen de tratamiento seleccionado entre la administración en una dosis única, en la dosis total administrada diariamente en cada uno del día 1 y del día 2, en la dosis total administrada diariamente en cada uno del día 1, día 2 y día 3, en una dosis diaria durante 15 días, en una dosis diaria durante 30 días, en una infusión continua diaria durante 15 días, en una infusión continua diaria durante 30 días. Una dosis preferida es 100-250 mg/m^{2} en 24 horas. Alternativamente, el paclitaxel o su derivado se pueden administrar semanalmente a 60 mg/m^{2}. Este método de administración se puede repetir por dos o más ciclos (más preferiblemente por tres ciclos) y los dos o más ciclos se pueden espaciar por tres o cuatro semanas.

En algunas realizaciones preferidas, se puede administrar una dosis diaria en el intervalo de 7,5 x 10^{9} a aproximadamente 7,5 x 10^{15}, preferiblemente 1 x 10 ^{12} a 7,5 x 10^{13} partículas de adenovirus cada día durante un máximo de 30 días, p. ej., un régimen de 2 días o 2 a 5 días a 14 días o 30 días, administrando la misma dosis todos los días). El régimen múltiple se puede repetir en ciclos recurrentes de 21 a 28 días. Las rutas preferidas de administración incluyen la intrarterial (p. ej., arteria intrahepática), intratumoral o intraperitoneal.

Cuando el ácido nucleico supresor de tumores (p. ej., p53) se administra en un vector adenovírico con un antineoplásico auxiliar (p. ej., paclitaxel) y un agente que daña el ADN (p. ej., cisplatino, carboplatino o navelbina), el vector adenovírico se administra durante 5-14 días a 7,5 x 10^{12} a 7,5 x 10^{13} partículas adenovíricas por día. Si el vector adenovírico y el paclitaxel se administran con carboplatino, la dosis es típicamente 7,5 x 10^{13} partículas adenovíricas por día. Por ejemplo, se puede usar una dosis diaria de 7,5 x 10^{12} partículas adenovíricas para administración al pulmón.

En otra realización, la presente invención provee composiciones farmacológicas que comprenden el ácido nucleico supresor de tumores y el antineoplásico auxiliar. En diversas realizaciones, la composición farmacológica puede opcionalmente incluir cualquiera de los otros compuestos quimioterapéuticos descritos en el presente documento. Una composición particularmente preferida incluye un ácido nucleico p53 (p. ej., A/C/N/53) y paclitaxel. El ácido nucleico supresor de tumores o la proteína y el otro agente quimioterapéutico (p. ej., paclitaxel) pueden estar en diferentes excipientes o se pueden contener en un solo excipiente tal como se describe en la presente memoria. Cuando haya múltiples excipientes, los excipientes se podrán intermezclar o mantener separados (p. ej., como en microcápsulas).

Incluso en otra realización, la presente invención provee el uso de cualquiera de los ácidos nucleicos supresores de tumores descritos en la presente memoria y los antineoplásicos auxiliares descritos en la presente memoria para la preparación de una composición farmacéutica para tratar una célula metastásica. La célula se conecta con el ácido nucleico supresor de tumores o con un polipéptido supresor de tumores. En una realización particularmente preferida, el ácido nucleico supresor de tumores es para administración tópica a una herida quirúrgica.

En otra realización, la presente invención provee un régimen de administración particularmente preferido. Por lo tanto, en una realización, se administra a las células una dosis total del ácido nucleico supresor de tumores, donde dicha dosis total se administra en una multiplicidad de administraciones en dosis incrementales de dicho ácido nucleico supresor de tumores. Las administraciones múltiples preferidas se separan cada una por al menos aproximadamente 6 horas. Una administración preferida es en por lo menos tres tratamientos separados por aproximadamente 24 horas.

En otra realización, la presente invención comprende preparar una composición farmacéutica para tratar una célula mamífera. La composición es para la administración a la célula de la dosis total de un ácido nucleico supresor de tumores, donde la dosis total se administra en una multiplicidad de administraciones de dosis incrementales del ácido nucleico supresor de tumores. Las administraciones se pueden espaciar por al menos aproximadamente seis horas. La administración puede implicar al menos comprender por lo menos tres dosis incrementales, y las dosis se pueden administrar diariamente. En una realización, la administración puede comprender por lo menos tres tratamientos separados por aproximadamente 24 horas. En otra realización, el ácido nucleico supresor de tumores se administra en una dosis total en el intervalo de 1 x 10^{9} a 7,5 x 10^{15}, o 1 x 10^{11} a 7,5 x 10^{13} partículas de adenovirus en un régimen de tratamiento seleccionado entre la dosis total en una dosis única, la dosis total administrada diariamente durante 5 días, la dosis total administrada diariamente durante 15 días; y la dosis total administrada diariamente durante 30 días. El régimen puede además comprender administrar paclitaxel o un derivado de paclitaxel en una dosis total en el intervalo de 7,5 mg/m^{2} a 350 mg/m^{2} durante 24 horas en una administración con un régimen de tratamiento de una sola dosis, en una dosis administrada diariamente en el día 1 y en el día 2, en una dosis administrada diariamente en el día 1, el día 2 y el día 3, en una dosis diaria durante 15 días, en una dosis diaria durante 30 días, en una infusión continua diaria durante 15 días, en una infusión continua diaria durante 30 días. Estos regímenes de tratamiento pueden repetirse por dos o más ciclos y los dos o más ciclos pueden espaciarse entre tres o cuatro semanas. Las células así tratadas incluyen células neoplásicas que comprenden un cáncer tal como cáncer de ovario, mesotelioma, cáncer pancreático, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, hepatocarcinoma, melanoma, retinoblastoma, tumor mamario, carcinoma colorrectal, leucemia, linfoma, tumor cerebral, carcinoma de cuello uterino, sarcoma, tumor de próstata, tumor vesical, tumor de los tejidos reticuloendoteliales, tumor de Wilm, astrocitoma, glioblastoma, neuroblastoma, osteosarcoma, cáncer renal y cáncer de cabeza y cuello. El tratamiento preferiblemente produce una inhibición del crecimiento o la proliferación de un tumor según lo ensayado por la medición del volumen
del tumor.

La invención también provee una composición farmacológica que comprende un ácido nucleico supresor de tumores y por lo menos un antineoplásico auxiliar. El antineoplásico auxiliar puede ser paclitaxel o un derivado de paclitaxel. El ácido nucleico supresor de tumores se selecciona del grupo que consiste en un ácido nucleico que codifica una proteína p53 natural, un ácido nucleico que codifica una proteína retinoblastoma (RB).

La proteína retinoblastoma puede ser pl 10^{RB} o p56^{RB}. El ácido nucleico puede estar contenido en un vector adenovírico recombinante. El ácido nucleico puede estar contenido en un vector adenovírico recombinante que comprende una deleción parcial o total del ADN de una proteína IX y que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína P53. En una realización, la deleción de la secuencia génica de la proteína IX puede extenderse entre aproximadamente 3500 bp desde el extremo vírico 5' y aproximadamente 4000 bp desde extremo vírico 5'. La deleción del ADN puede incluir la secuencia designada E1a y E1b. El vector adenovírico recombinante puede además comprender el promotor tardío principal de adenovirus tipo 2 o el promotor CMV humano, el ADNc guía tripartito de adenovirus tipo 2 y un ADNc de p53 humano. En una realización preferida, el vector es A/C/N/53. La composición puede comprender paclitaxel o un derivado de paclitaxel o un análogo de paclitaxel.

La invención provee además una composición que comprende una célula cancerosa o hiperproliferativa mamífera, donde dicha célula contiene el ácido nucleico supresor de tumores exógeno y el antineoplásico auxiliar.

El ácido nucleico supresor de tumores es un ácido nucleico que codifica una proteína supresora de tumores seleccionada del grupo que consiste en la proteína p53 natural y una proteína retinoblastoma (RB). La proteína retinoblastoma puede ser p110^{RB} o p56^{RB}. Las células pueden estar presentes en un mamífero. Las células pueden ser células neoplásicas y las células neoplásicas pueden comprender un tipo de cáncer seleccionado entre el grupo que consiste en cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, hepatocarcinoma, melanoma, retinoblastoma, tumor mamario, carcinoma colorrectal, leucemia, linfoma, tumor cerebral, carcinoma de cuello uterino, sarcoma, tumor de próstata, tumor vesical, tumor de los tejidos reticuloendoteliales, tumor de Wilm, astrocitoma, glioblastoma, neuroblastoma, osteosarcoma, cáncer renal y cáncer de cabeza y cuello.

La invención provee una composición para tratar una célula metastásica, que comprende poner en contacto dicha célula con el ácido nucleico supresor de tumores y el antineoplásico auxiliar. El contacto puede comprender la administración tópica de un ácido nucleico supresor de tumores a una herida quirúrgica. La composición puede además incluir un agente quimioterapéutico para co-administración, y el agente quimioterapéutico puede ser cisplatino, carboplatino o navelbina.

Definiciones

La expresión "antineoplásico auxiliar" se refiere a un agente que tiene por lo menos una de las siguientes actividades: la capacidad de modular la formación o acción de microtúbulos, la capacidad de inhibir la actividad de la poliprenil-proteína transferasa, la capacidad de inhibir la angiogénesis o la capacidad de inhibir la actividad endocrina. Los antineoplásicos auxiliares útiles en la invención se describen en más detalle a continuación. Tal como se emplean en la presente memoria, los antineoplásicos auxiliares de la invención no incluyen compuestos con actividad que daña el ADN.

"Genes supresores de tumores" son ácidos nucleicos para los cuales las mutaciones de pérdida de la función son oncogénicas. Por lo tanto, la ausencia, mutación o interrupción de la expresión normal de un gen supresor de tumores en una célula de lo contrario sana aumenta la probabilidad, o produce, que la célula logre un estado neoplásico. A la inversa, cuando un gen o proteína funcional supresora de tumores está presente en una célula, su presencia suprime la tumorigenicidad, malignidad o el fenotipo hiperproliferativo de la célula hospedante. Los ejemplos de ácidos nucleicos supresores de tumores dentro de esta definición incluyen p110^{RB}, p56^{RB}, p53 y otros supresores de tumores descritos en el presente documento y en la solicitud conjuntamente en trámite USSN 08/328,673 presentada el 25 de octubre de 1994. Los ácidos nucleicos supresores de tumores incluyen genes supresores de tumores o ácidos nucleicos derivados de ellos (p. ej., ADNc, ARNc, ARNm y sus sub-secuencias que codifican fragmentos activos del polipéptido supresor respectivo, como también vectores que comprenden estas secuencias.

Un "polipéptido o proteína supresora de tumores" se refiere a un polipéptido que, cuando está presente en una célula, reduce la tumorigenicidad, malignidad o el fenotipo hiperproliferativo de la célula.

La expresión "partícula vírica" se refiere a un virión intacto. La concentración de partículas víricas de adenovirus infecciosas típicamente se determina por detección espectrofotométrica de ADN, como lo describe, por ejemplo, Huyghe (1995) Human Gene Ther. 6:1403-1416.

Los términos "neoplasia" o "neoplásica" pretenden describir una célula que crece y/o se divide a un índice más allá de los límites normales de crecimiento para ese tipo de célula.

Los términos "oncógeno" o "tumorigenicidad" significan que tienen la capacidad de formar tumores o son capaces de causar la formación de tumores.

La frase "tratar una célula" se refiere a la inhibición o mejora de una o más características de enfermedad de una célula enferma. Cuando se usa con referencia a una célula cancerosa que es neoplásica (p. ej., una célula cancerosa mamífera que carece de una proteína supresora de tumores endógena natural), la frase "tratar una célula" se refiere a la mitigación o eliminación del fenotipo neoplásico. Típicamente, dicho tratamiento produce la inhibición (una reducción o cesación del crecimiento y/o proliferación) de la célula según lo comparado con la misma célula bajo las mismas condiciones pero para el tratamiento (p. ej., antineoplásico auxiliar y/o ácido nucleico o polipéptido supresor de tumores). Dicha inhibición puede incluir muerte celular (p. ej., apoptosis). Estos términos, cuando se usan con referencia a un tumor, se refieren a la inhibición del crecimiento o la proliferación de la masa tumoral (p. ej., según lo medido volumétricamente). Dicha inhibición puede estar mediada vía la reducción del índice de crecimiento y/o el índice de proliferación y/o muerte de las células que comprenden la masa tumoral. La inhibición del crecimiento o la inhibición de la proliferación pueden estar acompañadas de una alteración del fenotipo celular (p. ej., restauración de la morfología característica de células sanas, restauración de inhibición de contacto, pérdida del fenotipo invasivo, inhibición del crecimiento independiente del anclaje, etc.). Para los propósitos de esta descripción, una célula enferma tendrá uno o más rasgos patológicos. Estos rasgos en una célula enferma pueden incluir, entre otros, expresión defectuosa de una o más proteínas supresoras de tumores. La expresión "defectuosa" puede caracterizarse por una pérdida completa de una o más proteínas funcionales supresoras de tumores o una reducción en el nivel de expresión de una o más proteínas funcionales supresoras de tumores. Dichas células son por lo general neoplásicas y/u oncógenas.

La expresión "administración sistémica" se refiere a la administración de una composición o fármaco, como los vectores adenovíricos recombinantes de la invención o el antineoplásico auxiliar o los compuestos quimioterapéuticos descritos en la presente memoria, en un modo que resulta en la introducción de la composición o el fármaco al sistema circulatorio. La expresión "administración regional" se refiere a la administración de una composición o fármaco a un espacio anatómico específico, como intraperitoneal, intratecal, subdural, o a un órgano específico, y similares. Por ejemplo, la administración regional incluye la administración de la composición o el fármaco a la arteria hepática para administración regional al hígado. La expresión "administración local" se refiere a la administración de una composición o fármaco a un espacio anatómico limitado o circunscrito, como inyección intratumoral a la masa tumoral, inyecciones subcutáneas, inyecciones intramusculares y similares. La persona con experiencia en la técnica entendería que la administración local o regional puede también producir el ingreso de la composición del fármaco al sistema circulatorio.

La expresión "tumorigenicidad reducida" se usa en la presente memoria para referirse a la conversión de células hiperproliferativas (p. ej., neoplásicas) a un estado menos proliferativo. En el caso de células tumorales, "tumorigenicidad reducida" significa las células tumorales que se han tornado menos oncógenas o no oncógenas o células no tumorales cuya capacidad de convertirse en células tumorales ha sido reducida o eliminada. Las células con tumorigenicidad reducida bien no forman tumores in vivo o tienen un tiempo de demora extendido de semanas a meses antes de la aparición del crecimiento de tumores in vivo. Las células con tumorigenicidad reducida también pueden producir una masa tumoral tridimensional de crecimiento más lento en comparación con el mismo tipo de células que tienen un crecimiento génico supresor de tumores no funcionales en el mismo medio fisiológico (p. ej., tejido, edad del organismo, sexo del organismo, tiempo del ciclo menstrual, etc.).

Tal como se emplea en la presente memoria "fragmento activo" de un gen o polipéptido incluye (sub-secuencias) de una porción o porciones más pequeñas del gen o ácido nucleico derivado de allí (p. ej., ADNc) que retienen la capacidad de codificar proteínas que tienen actividad de supresión tumoral. De modo similar, un fragmento activo de un polipéptido se refiere a una sub-secuencia de un polipéptido que tiene una proteína supresora. Un ejemplo de un fragmento activo es p56^{RB} como se describe, p. ej., en el documento conjuntamente en trámite USSN 08/328,673 presentado el 25 de octubre de 1994.

El término "malignidad" tiene como fin describir una célula oncógena que tiene la capacidad de metastatizarse.

"Ácidos nucleicos", tal como se emplea en la presente memoria, puede ser ADN o ARN. Los ácidos nucleicos pueden también incluir nucleótidos modificados que permiten la lectura correcta a través de una polimerasa y no alteran la expresión de un polipéptido codificado por ese ácido nucleico.

La frase "secuencia de nucleótidos" incluye tanto las cadenas sentido como las antisentido bien como monocadenas individuales o como dúplex.

La frase "secuencia de ADN" se refiere a una molécula de ADN mono o bicatenaria compuesta por bases de nucleótidos, adenosina, timidina, citosina y guanosina.

La frase "secuencia de ácido nucleico que codifica" se refiere a un ácido nucleico que dirige la expresión de una proteína o péptido específico. Las secuencias de ácido nucleico incluyen tanto la secuencia de la cadena de ADN que se transcribe a ARN como la secuencia de ARN que se traduce a proteína. Las secuencias de ácido nucleico incluyen tanto las secuencias de ácido nucleico de longitud total como también las secuencias sin longitud total derivadas de las secuencias de longitud total. Se entiende además que la secuencia incluye los codones degenerados de la secuencia o secuencias nativas que pueden introducirse para proveer preferencia del codón en una célula hospedante específica.

La frase "casete de expresión", se refiere a secuencias de nucleótidos que son capaces de afectar la expresión de un gen estructural en hospedantes compatibles con dichas secuencias. Dichos casetes incluyen por lo menos promotores y opcionalmente, señales de terminación de transcripción. Los factores adicionales necesarios o útiles para efectuar la expresión pueden también utilizarse tal como se describe en este documento.

La expresión "unido operativamente" tal como se emplea en la presente memoria se refiere a un ligamiento de un promotor en dirección 5' de una secuencia de ADN de modo que el promotor medie la transcripción de la secuencia de ADN.

"Aislado" o "sustancialmente puro", cuando se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína o polipéptido supresor de tumores o sus fragmentos, se refiere a ácidos nucleicos aislados que no codifican proteínas o péptidos que no sean la proteína o péptido supresor de tumores o sus fragmentos.

El término "recombinante" se refiere a ADN que ha sido aislado de su fuente nativa o endógena y ha sido modificado bien química o enzimáticamente para eliminar nucleótidos flanqueadores naturales o proveer nucleótidos flanqueadores que no son naturales. Nucleótidos flanqueadores son aquellos nucleótidos que se encuentran en dirección 5' o en dirección 3' de la secuencia o sub-secuencia de nucleótidos descrita.

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Un "vector" comprende un ácido nucleico que puede infectar, transfectar, transducir transitoria o permanentemente una célula. Se ha de reconocer que un vector puede ser un ácido nucleico desnudo, o un ácido nucleico que forma complejo con una proteína o lípido. El vector opcionalmente comprende ácidos nucleicos víricos o bacterianos y/o proteínas, y/o membranas (p. ej., una membrana celular, una cubierta de lípido vírico, etc.). Se ha de reconocer que los vectores con frecuencia incluyen un casete de expresión que pone el ácido nucleico de interés bajo el control de un promotor.

Los vectores incluyen replicones (p. ej., plásmidos, bacteriófagos) a los que los fragmentos de ADN pueden estar unidos y replicarse. Los vectores incluyen, por lo tanto, ARN y ADN circular autorreplicante autónomo (plásmidos), como también los plásmidos de expresión y no expresión. Cuando se describa un microorganismo o cultivo celular recombinante como hospedante de un "vector de expresión", esto incluirá tanto ADN circular extracromosómico como ADN que ha sido incorporado al cromosoma(s) hospedante. Si un vector es mantenido por una célula hospedante, el vector puede ser replicado establemente por las células durante la mitosis como una estructura autónoma, o estar incorporado dentro del genoma del hospedante.

La expresión cantidad eficaz significa la cantidad de vector o fármaco que logra un resultado positivo en controlar el crecimiento y/o la proliferación celular. La abreviatura "C.I.U.", tal como se emplea en la presente memoria, equivale a "unidades celulares infecciosas". La C.I.U. se calcula midiendo las células que son positivas para la proteína del hexón vírico (p. ej., células 293) después de un período infeccioso de 48 h (Huyghe (1995) Human Gene Ther. 6:1403-1416).

La abreviatura "m.o.i.", tal como se emplea en la presente memoria, se refiere a "multiplicidad de infección" y es la C.I.U. por célula.

El término "paclitaxel", tal como se emplea en la presente memoria, se refiere al fármaco comercialmente conocido como Taxol®. Paclitaxel inhibe la replicación de células eucarióticas potenciando la polimerización de restos de tubulina en haces de microtúbulos estabilizados que son incapaces de reorganizarse en las estructuras correctas para mitosis.

La expresión "poner en contacto una célula", cuando se refiere a poner en contacto con un fármaco y/o ácido nucleico, se usa en la presente memoria para referirse a poner en contacto en un modo tal que el fármaco y/o el ácido nucleico se internalice en la célula. En este contexto, poner en contacto una célula con un ácido nucleico es equivalente a transfectar una célula con un ácido nucleico. Si el fármaco es lipófilo o el ácido nucleico forma complejo con un lípido (p. ej., un lípido catiónico) el simple contacto producirá el transporte (activo, pasivo y/o difusivo) hacia la célula. Alternativamente, el fármaco y/o el ácido nucleico podrán por sí mismos, o en combinación con una composición vehículo, transportarse activamente hacia la célula. Por lo tanto, por ejemplo, si el ácido nucleico está presente en un vector infectivo (p. ej., un adenovirus), el vector podrá mediar la absorción del ácido nucleico hacia la célula. El ácido nucleico podrá formar complejo con agentes que interactúan específicamente con los receptores extracelulares que facilitan la administración del ácido nucleico a la célula, los ejemplos incluyen complejos ligando/policatión/ADN según lo descrito en las patentes estadounidenses Nos. 5,166,320 y 5,635,383. Además, la administración vírica puede potenciarse por la modificación recombinante de dominios abultados fibrosos del genoma vírico para incorporarse a los restos que se dirigen a la célula.

Los constructos designados en la presente memoria como "A/C/N/53", "A/M/N/53", pl 10^{RB}, p56^{RB} se refieren a los constructos así designados en la patente estadounidense No. 6,210,939 presentada el 25 de octubre de 1994, solicitud internacional WO 95/11984.

Una "sustitución conservadora", cuando describe una proteína, se refiere a un cambio en la composición de aminoácidos de la proteína que no altera sustancialmente la actividad de la proteína. Por lo tanto, "variaciones modificadas en forma conservadora" de una secuencia de aminoácidos particular se refiere a sustituciones de aminoácidos de aquellos aminoácidos que no son críticos para la actividad de la proteína o la sustitución de aminoácidos con otros aminoácidos que tienen propiedades similar (p. ej., ácidos básicos positiva o negativamente cargados, polares o no polares, etc.) de modo tal que las sustituciones incluso de aminoácidos críticos no alteran sustancialmente la actividad. Las tablas de sustitución conservadora que proveen aminoácidos funcionalmente similares se conocen en la técnica. Por ejemplo, los siguientes seis grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí:

1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);

2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);

3) Asparagina (N). Glutamina (Q);

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).

Véase, también, Oreighton (1984) Proteins W.H. Freeman and Company. Además, las sustituciones, deleciones o adiciones individuales que alteran, añaden o eliminan un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en una secuencia codificada son también "variaciones modificadas en forma conservadora".

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra la inhibición in vitro de células de tumor ovárico SK-OV-3 mediante distintas concentraciones de p53 (A/C/N/53) y/o Paclitaxel.

La Figura 2 provee un análisis de isobolograma para los experimentos ilustrados en la Figura 1. Se observó sinergia entre Paclitaxel y p53 (A/C/N/53) cuando las células se pretrataron con Paclitaxel 24 horas antes del tratamiento con p53.

Las Figuras 3a, 3b y 3c ilustran la eficacia de Ad p53 contra xenoinjertos de cáncer de mama humano en ratones lampiños. A los ratones se les administró una dosis total de 2,2 x 10^{9} C.I.U. adenovirus (A/C/N/53 o Ad) por ratón dividida en 10 inyecciones en los días 0-4 y 7-11. Los ratones se trataron con Ad p53, Ad beta-gal o vehículo solo. La Fig. 3a ilustra los resultados con tumores MDA-MB-231. La Fig. 3b ilustra los resultados con tumores MDA-MB-468 (-468) y la Fig. 3c ilustra los resultados con tumores MDA-MB-435 (-435).

Las Figuras 4a y 4b proveen curvas de dosis y respuesta de Ad p53 (A/C/N/53) para tumores MDA-MB-231 (-231) (Fig. 4a) y para tumores MDA-MB.468 (Fig. 4b). Los ratones se dosificaron con 1 x -10^{7}-1 x 10^{9} C.I.U. de Ad p53 (A/C/N/53) dividido en 10 dosis administradas peritumoralmente en los días 0-4 y 7-11. Las inhibiciones en porcentaje promedio se calcularon comparando los volúmenes del tumor en cada dosis de Ad p53 con tumores tratados con tampón en los días 14/15, 18, 21, 24, 28, 30/32 y 35 (tumores MDA-MB-468 únicamente en el día 35). Los tumores -231 promediaron 22,5\pm 1,2 mm^{3} en el día 0, mientras que los tumores -468 promediaron 33,1 \pm 1,8 mm^{3} en el día 0.

La Figura 5 provee una comparación de la eficacia del agente terapéutico cuando se administra como una única inyección intravenosa o como dosis divididas. Los tumores (MDA-MB-231) se dosificaron con un total de 2,2 x 10^{8} C.I.U. de Ad p53 por semana administrado durante las semanas 1 y 3.

La Figura 6 ilustra la eficacia de ciclos múltiples de bajas dosis de Ad p53 contra tumores grandes y bien consolidados. Se administró un total de 1,32 x 10^{9} C.I.U. Ad p53 durante 6 semanas a xenoinjertos de MDA-MB-468. (P = meseta en el índice de crecimiento del tumor de control; E = fin de la administración).

Las Figuras 7a, 7b y 7c ilustran la inhibición in vivo de tumores MDA-MB-468 en ratones lampiños a los que se les administró 1 x 10^{9} C.I.U. de Ad p53 (A/C/N/53) como una única inyección intravenosa (Fig. 7a) o 3 inyecciones separadas (Fig. 7b) o 5 inyecciones separadas (Fig. 7c).

La Figura 8 ilustra la capacidad de la dexametasona en baja dosis de suprimir la inhibición del crecimiento del tumor mediado por células NK en ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID). A los tumores MDA-MB-231 se les administró un total de 2 x 10^{9} C.I.U. de Ad beta-gal (1,1 x 1011 partículas víricas) dividido en 10 inyecciones administradas en los días 14-18 y 21-25. Los pelets de dexametasona subcutánea (o placebo) liberaron 83,3 \mug de esteroides por día.

Figura 9. Comparación de combinación de terapia de cisplatino y p53 en células normales y tumorales.

Descripción detallada

La presente invención provee nuevos planteamientos para inhibir el crecimiento y/o la proliferación de células, más particularmente el crecimiento y la proliferación de células cancerosas. En una realización, las células se ponen en contacto con un ácido nucleico supresor de tumores y con un antineoplásico auxiliar. Típicamente, el ácido nucleico supresor de tumores utilizado será de la misma especie que la proteína supresora de tumores de la que se carece. Por lo tanto, si la célula carece de actividad endógena de p53, se usará una proteína p53 o ácido nucleico p53.

Fue un descubrimiento sorprendente de la presente invención que, contrariamente a los resultados descritos en estudios previos (véanse, p. ej., Wahl et al. (1996) Nature Med., 2(1): 72-79, y Hawkins et al. (1996) Canc. Res. 56: 892-898), el tratamiento de células mamíferas que carecen o son deficientes de proteínas supresoras de tumores endógenas naturales (es decir, muchas células neoplásicas), tanto con antineoplásico auxiliar (p. ej., paclitaxel) y un gen o polipéptido supresor de tumores (p. ej., p53) produce la inhibición de la proliferación y/o el crecimiento de las células mayor que aquella observada con el tratamiento químico o con el constructo supresor de tumores solo. Además, fue un descubrimiento de la presente invención que el pretratamiento con antineoplásico auxiliar aumenta drásticamente el efecto anti-proliferativo de un ácido nucleico supresor de tumores. Sin desear estar influenciados por una teoría en particular, se cree que el medio posible por el que un antineoplásico auxiliar puede contribuir a este efecto potenciado consiste en: aumentar la eficacia de la transfección de diversos vectores de terapia génica (p. ej., vectores de adenovirus); o aumentar los niveles de expresión del gen supresor tumoral; o estabilizar los microtúbulos para ayudar en el transporte de virus intracelulares; o proveer un efecto potenciado a través de la interacción de diversos mecanismos intracelulares (p. ej., vías de señalización, vías apoptóticas, vías de ciclización celular).

Por lo tanto, en una realización, la presente invención provee el uso de un antineoplásico auxiliar y un ácido nucleico supresor de tumores para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir las células mamíferas enfermas que carecen o son deficientes de una proteína supresora de tumores endógena natural. Cuando las células están presentes en un tumor, la composición farmacéutica inhibe el crecimiento del tumor y provee así un tratamiento contra el cáncer. Los ácidos nucleicos supresores de tumores son p53 o h RB (véase, p. ej., Chen (1995) Cell Growth Differ. 6:199-210) o sus fragmentos activos (p. ej., p110RB, p56RB), mientras que los antineoplásicos auxiliares (compuestos) particularmente preferidos incluyen paclitaxel y compuestos con actividad de tipo paclitaxel tales como derivados de paclitaxel (p. ej., análogos).

Fue también un descubrimiento de la presente invención que al poner en contacto las células con un ácido nucleico supresor de tumores se pueden inhibir células metastásicas. Dicha inhibición puede tomar la forma de inhibición de la formación, crecimiento, migración o reproducción de células metastásicas. En una realización, la inhibición se puede caracterizar por la inhibición (p. ej., reducción y/o eliminación) en la aparición de neoplasmas remotos del tumor primario. La composición farmacéutica se utiliza para tratar (mitigar o eliminar) la progresión de la enfermedad metastásica. Los métodos implican poner en contacto las células metastásicas con un ácido nucleico supresor de tumores. En una realización particularmente preferida, las células en un sitio de herida quirúrgico (p. ej., después de la extirpación (citorreducción quirúrgica) de una masa tumoral) se ponen en contacto con un ácido nucleico supresor de tumores en combinación con un antineoplásico auxiliar. Las células pueden además ponerse en contacto con un antineoplásico auxiliar tal como se describe en el presente documento.

Incluso en otra realización, la presente invención provee regímenes de tratamiento ventajosos que utilizan genes supresores de tumores. En parte, estos regímenes de tratamiento se basan en el sorprendente descubrimiento de que los ácidos nucleicos supresores de tumores son más eficaces para inhibir el crecimiento de células o tumores cuando se administran en administraciones múltiples en lugar de una única inyección intravenosa.

El orden en el que se administran el supresor y el antineoplásico auxiliar no es crítico para la invención. Por lo tanto, la composición o composiciones se pueden administrar simultánea o secuencialmente. Por ejemplo, en una realización, el pretratamiento de una célula con por lo menos un antineoplásico auxiliar (solo o en combinación con un agente quimioterapéutico) aumenta la eficacia de un ácido nucleico supresor de tumores administrado posteriormente. En una realización, el agente quimioterapéutico se administra antes que el antineoplásico auxiliar y el ácido nucleico supresor de tumores. En otra realización, el antineoplásico auxiliar (solo o en combinación con un agente quimioterapéutico) se administra simultáneamente con el ácido nucleico supresor de tumores. En otra realización, el ácido nucleico supresor de tumores se administra después del ácido nucleico supresor de tumores.

El efecto antitumoral de administrar la composición y los métodos de la invención también incluye un efecto antitumoral no específico, llamado "efecto espectador", (véanse, p. ej., Zhang (1996) Cancer Metastasis Rev. 15:385-401 y Okada (1996) Gene Ther. 3:957-96). Además, el sistema inmunitario puede también manipularse par acentuar (o deprimir) selectivamente el brazo humoral o celular del sistema inmunitario, es decir, modular la respuesta de las células B y/o las células T (p. ej., un linfocito citotóxico (CTL) o un linfocito infiltrante en el tumor (TIL)). Por ejemplo, se observa un incremento en los TIL tras la administración de un adenovirus que expresa p53 a seres humanos. Específicamente, se observa un incremento en los TIL (linfocitos T cooperadores fenotípicamente, CD3^{+} y CD4^{+}) tras la administración arterial intrahepática de un adenovirus que expresa p53 para el tratamiento de carcinoma hepático metastásico, tal como se describe en detalle a continuación.

Se reconoce que el uso de la presente invención no está restringido al uso de un solo antineoplásico auxiliar ni incluso al uso de un solo quimioterapéutico. Por lo tanto, la presente invención provee una composición para inhibir células mamíferas enfermas que carecen de una proteína endógena supresora de tumores, o un tumor que comprende dichas células, poniendo en contacto las células o el tumor con un ácido nucleico supresor de tumores y uno o más antineoplásicos auxiliares tal como se describe en la presente memoria.

I. Antineoplásicos auxiliares A) Agentes que afectan los microtúbulos

Tal como se explicó anteriormente, en una realización, la presente invención provee composiciones para inhibir las células enfermas que carecen de una proteína endógena supresora de tumores, poniendo en contacto las células con un ácido nucleico supresor de tumores y un antineoplásico auxiliar tal como un agente que afecta los microtúbulos (p. ej., paclitaxel, un derivado de paclitaxel o un compuesto de tipo paclitaxel). Tal como se emplea en la presente memoria, un agente que afecta los microtúbulos es un compuesto que interfiere con la mitosis celular, es decir, que tiene un efecto antimitótico, que afecta la formación y/o acción de los microtúbulos. Dichos agentes pueden ser, por ejemplo, agentes estabilizadores de microtúbulos o agentes que interrumpen la formación de microtúbulos.

Los expertos en la técnica conocen los agentes que afectan los microtúbulos útiles en la invención, que incluyen alocolquicina (NSC 406042), Halicondrina B (NSC 609395), colquicina (NSC 757), derivados de colquicina (p. ej., NSC 33410), dolastatina 10 (NSC 376128), maytansina (NSC 153858), rizoxina (NSC 332598), paclitaxel (NSC 125973), derivados de paclitaxel (p. ej., NSC 608832), tiocolquicina (NSC 361792), tritil cisteína (NSC 83265), sulfato de vinblastina (NSC 49842), sulfato de vincristina (NSC 67574), epotilona A, epotilona y discodermolida (véase Service, (1996) Science, 274: 2009) estramustina, nocodazol o MAP4. Los ejemplos de dichos agentes se describen también en la bibliografía científica y de patentes, véanse, p. ej., Bulinski (1997) J. Cell Sci. 110:3055-3064; Panda (1997) Proc. Natl Acad. Sci EE. UU. 94:10560-10564; Muhlradt (1997) Cancer Res. 57:3344-3346; Nicolaou (1997) Nature 387:268-272; Vasquez (1997) Mol Biol. Cell. 8:973-985; Panda (1996) J. Biol. Chem. 271:29807-29812.

Los agentes particularmente preferidos son compuestos con actividad del tipo paclitaxel. Éstos incluyen, aunque sin limitarse a ello, paclitaxel y derivados de paclitaxel (compuestos de tipo paclitaxel) y análogos. El paclitaxel y sus derivados se comercializan. Además, los expertos en la técnica conocen los métodos para elaborar el paclitaxel y los derivados de paclitaxel y análogos (véanse, p. ej., las patentes estadounidensesNos: 5,569,729; 5,565,478; 5,530,020; 5,527,924; 5,508,447; 5,489,589; 5,488,116; 5,484,809; 5,478,854; 5,478,736; 5,475,120; 5,468,769; 5,461,169;
5,440,057; 5,422,364; 5,411,984; 5,405,972; y 5,296,506).

Otros agentes que afectan los microtúbulos se pueden evaluar usando uno de los muchos ensayos conocidos en la técnica, p. ej., un ensayo semiautomático que mide la actividad polimerizante de tubulina de los análogos de paclitaxel en combinación con un ensayo celular para medir el potencial de estos compuestos para bloquear las células en mitosis (véase, Lopes (1997) Cancer Chemother Pharmacol 41:37-47).

En general, la actividad de un compuesto de ensayo se determina poniendo en contacto una célula con ese compuesto y determinando si se rompe o no el ciclo celular, en particular, a través de la inhibición de un evento mitótico. Dicha inhibición puede estar mediada por la ruptura del aparato mitótico, p. ej., la ruptura de la formación de huso normal. Las células en las que la mitosis está interrumpida pueden caracterizarse por morfología alterada (p. ej., compactación de microtúbulos, aumento del número de cromosomas, etc.).

En una realización preferida, los compuestos con actividad posible de polimerización de tubulina se estudian in vitro. En una realización preferida, los compuestos se estudian contra células WR21 cultivadas (derivadas de la línea 69-2 wap-ras de ratón) para inhibición de proliferación y/o para morfología celular alterada, en particular para compactación de microtúbulos. Se pueden realizar luego estudios in vivo de compuestos positivos usando ratones lampiños que portan las células tumorales WR21. Los protocolos detallados de este método de estudio son descritos por Porter (1995) Lab. Anim. Sci., 45(2): 145-150.

Otros métodos para estudiar la actividad deseada de los compuestos se conocen en la técnica. Típicamente, dichos ensayos implican ensayos para inhibición del ensamble y/o desensamble de microtúbulos. Los ensayos para el ensamble de microtúbulos son descritos, por ejemplo, por Gaskin et al. (1974) J. Molec. Biol, 89: 737-758. La patente estadounidense No. 5569,720 también proporciona ensayos in vitro e in vivo para compuestos con actividad de tipo paclitaxel.

B) Inhibidores de poliprenil-proteína transferasa

Incluso en otra realización, la presente invención provee el uso combinado de ácidos nucleicos supresores de tumores e inhibidores de poliprenil-proteína transferasa. Inhibidores de proteína transferasa, inhibidores de farnesil-proteína transferasa (FPT), inhibidores de geranilgeranil-proteína transferasa. Los ejemplos de compuestos que son inhibidores de poliprenil-proteína transferasa se conocen en la bibliografía científica y de patentes, véanse, p. ej., Zhang (1997) J. Biol, Chem. 272:10232-10239; Njoroge (1997) J. Med, Chem. 40:4290-4301; Mallams (1997) Bioorg. Med. Chem. 5:93-99.

Los compuestos ilustrativos que son inhibidores de farnesil-proteína transferasa se exponen a continuación:

Inhibidor de FPT, designado "FPT39," según se describe en la solicitud internacional WO 97/23478, presentada el 19 de diciembre de 1996, donde FPT39 es designado compuesto "39.0", véase pág 95 del documento WO 97/23478.

Compuesto FPT39: 100

Como se describe a continuación, cuando FPT39 se usó en una terapia de combinación con un adenovirus de la invención que expresa p53 contra células tumorales de próstata y células tumorales de mama, la combinación fue más eficaz para destruir las células tumorales que cualquiera de los agentes solo.

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Oligopéptidos (en su mayoría tetrapéptidos, pero también los pentapéptidos que incluyen la fórmula Cys-Xaal-Xaa2-Xaa3: EPA 461,489; EPA 520,823; EPA 528,486; y WO 95/11917).

Compuestos péptido-miméticos, especialmente Cys-Xaa-Xaa-Xaa miméticos: EPA 535,730, EPA 535,731; EPA 618,221; WO 94/09766; WO 94/10138; WO 94/07966; US 5,326,773, US 5,340,828, US 5,420,245; WO 95/20396; US 5,439,918; y WO 95/20396.

Compuestos péptido-miméticos farnesilados - específicamente el mimético Cys-Xaa-Xaa-Xaa específicamente farnesilado: GB-A2.276,618.

Otros compuestos péptido-miméticos: US 5,352,705, WO 94/00419; WO 95/00497; WO 95/09000; WO 95/09001; WO 91/12612; WO 95/25086; EPA 675,112 y FR-A 2,718,149.

Benzocicloheptapiridinas tricíclicas de anillos condensados: WO 95/10514; WO 95/10515; WO 95/10516; WO 96/30363; WO 96/30018; WO 96/30017; WO 96/30362; WO 96/31111; WO 96/31478; WO 96/31477; WO 9631505; solicitud de patente internacional No. PCT/U596/19603, WO 97/23478.

Derivados de farnesilo; EPA 534,546; WO 94/19357; WO 95/08546, EPA 537,007; y WO 95/13059.

Productos naturales y derivados: WO 94/18157; U.S. 5,430,055; GB-A 2,261.373, GB-A 2,261.374, GB-A
2,261.375; U.S. 5,420,334, U.S. 5,436,263.

Otros compuestos: WO 94/26723; WO 95/08542; US 5,420,157; WO 95/21815; y WO 96731501.

C) Administración de antineoplásicos auxiliares: Composiciones farmacéuticas Composiciones farmacéuticas

Los antineoplásicos auxiliares utilizados en los métodos de la invención típicamente se combinan con un vehículo (excipiente) farmacéuticamente aceptable para formar una composición farmacológica. La composición farmacéutica de la invención puede comprender uno o más antineoplásicos auxiliares con o sin un gen supresor de tumores p53 o RB.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden contener un compuesto fisiológicamente aceptable que actúa, p. ej., para estabilizar la composición o aumentar o disminuir la absorción del agente y/o la composición farmacéutica. Los compuestos fisiológicamente aceptables pueden incluir, por ejemplo, carbohidratos, como glucosa, sacarosa, o dextranos, antioxidantes, como ácido ascórbico o glutationa, agentes quelantes, proteínas de bajo peso molecular, composiciones que reducen el aclaramiento o la hidrólisis de los antineoplásicos auxiliares, o excipientes o estabilizadores y/o tampones. Los detergentes pueden también utilizarse para estabilizar la composición o aumentar o disminuir la absorción de la composición farmacéutica (véase a continuación para detergentes ilustrativos).

Otros compuestos fisiológicamente aceptables incluyen agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes dispersantes o conservantes que son particularmente útiles para prevenir el crecimiento o la acción de microorganismos. Se conocen diversos conservantes e incluyen, por ejemplo, fenol y ácido ascórbico. La persona con experiencia en la técnica apreciarían que la opción de un vehículo farmacéuticamente aceptable, incluyendo un compuesto fisiológicamente aceptable, depende, por ejemplo, de la ruta de administración del antineoplásico auxiliar y de las características físico-químicas particulares del antineoplásico auxiliar.

Las composiciones para administración comúnmente comprenderán una disolución del antineoplásico auxiliar disuelta en un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un vehículo acuoso para antineoplásicos auxiliares solubles en agua. Se puede utilizar una diversidad de vehículos, p. ej., disolución salina tamponada y similares. Estas disoluciones son estériles y en general libres de material indeseado. Estas composiciones pueden esterilizarse por técnicas de esterilización convencional conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximar las condiciones fisiológicas tales como agentes que ajustan el pH y agentes tampón, agentes que ajustan la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La concentración de antineoplásico auxiliar en estas formulaciones puede variar ampliamente, y se seleccionarán principalmente en base a los volúmenes de fluido, viscosidades, peso corporal y similares de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado y de las necesidades de los pacientes.

Rutas de administración

Los antineoplásicos auxiliares utilizados en la invención son útiles y se pueden administrar solos o como composiciones farmacéuticas (con o sin un supresor de tumores, p. ej., p53) por cualquier método conocido en la técnica, p. ej., administración sistémica, regional o localmente; por administración intrarterial, intratumoral, intravenosa (IV), parenteral, en la cavidad intrapleural, tópica, oral o local, como subcutánea, intratraqueal (p. ej., por aerosol) o transmucosal (p. ej., bucal, vesical, vaginal, uterina, rectal, nasal mucosa), intratumoral (p. ej., aplicación transdérmica o inyección oral). Los modos particularmente preferidos de administración incluyen inyecciones intrarteriales, especialmente cuando se desea un "efecto regional", p. ej., para concentrarse en un órgano específico (p. ej., cerebro, hígado, bazo, pulmones). Por ejemplo, se prefiere la inyección en la arteria intrahepática si se desea un efecto regional anti-tumoral en el hígado; o, inyección de la arteria intracarótida, si se desea administrar una composición al cerebro, (p. ej., para tratamiento de tumores cerebrales), una arteria carótida o una arteria del sistema de arterias carótidas (p. ej., arteria occipital, arteria auricular, arteria temporal, arteria cerebral, arteria maxilar, etc.).

El paclitaxel y ciertos derivados de paclitaxel son solamente marginalmente solubles en disoluciones acuosas. En una realización preferida, estas composiciones se administran bien directamente al sitio del tumor (p. ej., por inyección, canalización o aplicación directa durante un procedimiento quirúrgico) o se solubilizan en un excipiente aceptable. Los expertos en la técnica conocen los métodos para administrar paclitaxel y sus derivados (véanse, p. ej., las patentes estadounidenses Nos 5,583,153, 5,565,478, 5,496,804, 45,484,809. Otros derivados de paclitaxel son análogos y/o profármacos solubles en agua (véanse, las patentes estadounidenses 5,411,984 y 5,422,364) y se administran convenientemente mediante una diversidad de métodos tal como se describió anteriormente.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención son particularmente útiles para administración tópica, p. ej., en heridas quirúrgicas para tratar tumores incipientes, células neoplásicas y metastásicas y sus precursores. En otra realización, las composiciones son útiles para administración parenteral, como administración intravenosa o administración a una cavidad corporal o lumen de un órgano.

Regímenes de tratamiento

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en una diversidad de formas de administración unitaria, dependiendo del método de administración. Por ejemplo, las formas de administración unitarias para administración oral incluyen polvos, comprimidos, píldoras, cápsulas y pastillas. Se reconoce que los compuestos antineoplásicos auxiliares (p. ej., el paclitaxel y los compuestos relacionados descritos, cuando se administran oralmente, deben protegerse de la digestión. Esto típicamente se logra formando complejo del antineoplásico auxiliar con una composición para tornarlo resistente a hidrólisis ácida y enzimática, o envasando el antineoplásico auxiliar en un vehículo apropiadamente resistente como un liposoma. Los medios para proteger los compuestos de la digestión se conocen en la técnica (véase, p. ej., la patente estadounidense 5,391,377 que describe composiciones de lípidos para administración oral de agentes terapéuticos). Las dosis para quimioterapéuticos típicos se conocen en la técnica. Además, dichas dosis son típicamente aconsejables por naturaleza y se pueden ajustar dependiendo del contexto terapéutico particular, la tolerancia del paciente, etc. Por lo tanto, por ejemplo, la dosis de una composición farmacéutica típica (p. ej., paclitaxel) para administración intravenosa (IV) sería de aproximadamente 135 mg/m^{2} administrada durante 1-24 horas (típicamente a 1, 3 ó 6 horas, más preferiblemente 3 horas) y más preferiblemente se repite cada tres semanas entre 3 y 6 ciclos. Para disminuir la frecuencia y la gravedad de las reacciones de hipersensibilidad, los pacientes pueden también recibir aproximadamente 20 mg de dexametasona (Decadrón, y otros) oralmente aproximadamente 12 horas y 6 horas antes, y aproximadamente 50 mg de difenhidramina (Benadryl®, y otros) más aproximadamente 300 mg de cimetidina (Tagamet®) o 50 mg de rantidina (Zantac®) IV entre 30 y 60 minutos antes del tratamiento con paclitaxel. Se pueden usar dosis considerablemente mayores (p. ej., en el intervalo de hasta aproximadamente 350 mg/m^{2} por día, particularmente cuando el fármaco se administra a un sitio aislado y no en el torrente circulatorio, como en una cavidad corporal o en el lumen de un órgano. Son posibles dosis sustancialmente superiores mediante cualquier ruta seleccionada, por ejemplo, administración tópica. Los métodos reales para preparar composiciones parenteralmente administrables serán conocidos u obvios para el experto en la técnica y se describen en más detalles en publicaciones tales como Remington's Pharmaceutical Science, 15ª ed., Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania (1980) y en las patentes estadounidenses Nos: 5,583,153, 5,565,478, 5,496,804 y 5,484,809. Las dosis típicas, p. ej., para administración intraperitoneal, serán de 20-150 mg/m^{2} semanalmente, o aproximadamente 250 mg/m^{2} cada 3 semanas.

Las composiciones que contienen los antineoplásicos auxiliares se pueden administrar para tratamientos terapéuticos. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran al paciente que padece una enfermedad caracterizada por hiperproliferación de uno o más tipos de células en una cantidad suficiente para curar o por lo menos detener parcialmente la enfermedad y/o sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado general de salud del paciente.

Las administraciones únicas o múltiples de las composiciones se pueden administrar dependiendo de la dosis y la frecuencia según lo requerido y tolerado por el paciente. En cualquier caso, la composición deberá proveer una cantidad suficiente de los antineoplásicos auxiliares de la presente invención para tratar eficazmente al paciente.

II. Genes y productos génicos supresores de tumores A) Supresores de tumores conocidos preferidos

Como se explicó anteriormente, en una realización, la presente invención provee una composición para inhibir el crecimiento y/o la proliferación de células, poniendo en contacto las células con un ácido nucleico supresor de tumores y un antineoplásico auxiliar (p. ej., paclitaxel, un derivado de paclitaxel o un compuesto del tipo paclitaxel).

Los genes supresores de tumores, tal como se usan en la presente invención, son RB y p53. El gen RB o retinoblastoma es el supresor de tumores prototípico y ha sido bien caracterizado (véanse, p. ej., Bookstein (1990) Science 247: 712-715, Benedict (1980) Cancer invest. 8: 535-540, Riley (1990) Ann. Rev, Cell Biol. 10-1-29 y Wienberg (1992) Science 254: 1138-1146. Quizás el supresor de tumores mejor caracterizado sea p53, que ha estado implicado en muchos neoblastomas como también en la predisposición genética al desarrollo de diversos tumores en familias con el síndrome Li-Fraumeni (véanse, p. ej, Wills (1994) Hum. Gene Therap. 5:1079-1088, patente estadounidense 5,532,220, WO 95/289048 y Harris (1996) J. Nat. Canc Inst. 88(20): 1442) que describen la expresión de clonación y el uso de p53 en la terapia génica).

B) Identificación y estudio de supresores de tumores

El experto en la técnica conoce los métodos para identificar o ensayar los genes supresores de tumores. Las células típicamente hiperproliferativas se estudian para pérdida de genes que se asocian, o cuya mutación se asocia (correlaciona) con el estado hiperproliferativo. La prueba más rigurosa para que un gen califique como gen supresor de tumores (TSG) es su capacidad de suprimir el fenotipo oncógeno de un tumor o de células derivadas de un tumor. El ácido nucleico supresor de tumores preferiblemente se introduce en las células tumorales como ADNc clonado en un vector de expresión apropiado, o un cromosoma individual que aloja un gen supresor de tumores candidato se introduce en las células tumorales por técnicas de transferencia microcelular. Alternativamente, el producto génico supresor de tumores (p. ej., un polipéptido supresor de tumores) se introduce en la célula(s) y se mide el índice de proliferación (p. ej., contando las células o midiendo el volumen del tumor, etc.). La inhibición completa o parcial de la proliferación (p. ej., disminución del índice de proliferación), la inhibición del contacto, la pérdida del fenotipo invasivo, la diferenciación celular y la apoptosis son todos indicadores de supresión del fenotipo oncógeno (susceptibilidad reducida al estado neoplásico).

Los métodos para estudiar tumores a fin de identificar ácidos nucleicos alterados o no expresados se conocen en la técnica. Dichos métodos incluyen, aunque sin limitarse a ello, hibridación sustractiva (véase, p. ej., Hampson (1992) Nucleic Acids Res. 20:2899), hibridación genómica comparativa ((CGH), véase, p. ej., el documento WO 93/18186, Kallioniemi (1992) Science, 258: 818) y monitorización de expresión que matrices de alta densidad de sondas de ácido nucleico (véase, p. ej., Lockhart (1996) Nature Biotechnology, 14(13): 1675-1680).

C) Preparación de p53 y otros supresores de tumores

Como se indicó anteriormente, la presente invención implica poner en contacto una célula, p. ej., in vitro, en solución fisiológica (p. ej., sangre), en un órgano de tejido, u organismo con un ácido nucleico supresor de tumores. El ácido nucleico supresor de tumores menor puede ser un ácido nucleico RB o p53 como ya se describió.

En una realización más preferida, el ácido nucleico supresor de tumores p53 o RB está presente en un casete de expresión bajo el control de un promotor que expresa el gen supresor del tumor o ADNc cuando está ubicado en la célula diana (p. ej., un tumor). Las personas con experiencia en la técnica conocen los métodos para construir casetes y/o vectores de expresión que codifican los genes supresores de tumores tal como se describe a continuación.

1. Preparación de ácidos nucleicos supresores de tumores. El ADN que codifica las proteínas o sub-secuencias de proteínas supresoras de tumores de la presente invención se puede preparar por cualquier método adecuado, incluyendo, por ejemplo, clonación y restricción de las secuencias apropiadas o síntesis química directa (p. ej., usando la información de la secuencia existente como se indicó anteriormente) por métodos tales como el método de fosfotriéster de Narang (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99; el método de fosfodiéster de Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109-151 (1979); el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al., Tetra. Lett., 22: 1859-1862 (1981); y el método de soporte sólido de la patente estadounidense No. 4,458,066.

La síntesis química produce un oligonucleótido monocatenario. Éste se puede convertir a un ADN bicatenario por hibridación con una secuencia complementaria, o por polimerización con una ADN polimerasa, usando la cadena sencilla como molde. El experto en la técnica reconocería que si bien la síntesis química de ADN está limitada a secuencias de aproximadamente 100 bases, se pueden obtener secuencias más largas por ligación de secuencias más cortas.

Alternativamente, se pueden clonar sub-secuencias y las sub-secuencias apropiadas escindirse usando enzimas de restricción apropiadas. Los fragmentos pueden luego ligarse para producir la secuencia de ADN deseada.

En una realización, los ácidos nucleicos supresores de tumores de la presente invención se pueden clonar usando métodos de amplificación de ADN tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Por lo tanto, por ejemplo, la secuencia o sub-secuencia de ácido nucleico se amplifica por PCR usando un cebador sentido que contiene un sitio de restricción (p. ej., Ndel) y un cebador antisentido que contiene otro sitio de restricción (p. ej., HindIII). Esto producirá un ácido nucleico que codifica la secuencia o sub-secuencia supresora de tumores deseada y que tiene sitios de restricción terminales. Este ácido nucleico puede luego ligarse fácilmente a un vector que contiene un ácido nucleico que codifica la segunda molécula y que tiene los correspondientes sitios de restricción apropiados. Los expertos en la técnica pueden determinar los cebadores de PCR adecuados, usando la información sobre secuencias publicada para cualquier ADNc, proteína o gen supresor de tumores particular. Los sitios de restricción apropiados pueden también agregarse al ácido nucleico que codifica la proteína o sub-secuencia de proteínas supresoras de tumores por mutagénesis dirigida al sitio. El plásmido que contiene la secuencia o sub-secuencia supresora de tumores se escinde con la endonucleasa de restricción adecuada y luego se liga al vector que codifica la segunda molécula de acuerdo con métodos convencionales.

Como ya se indicó, se conocen las secuencias de ácido nucleico de muchos genes supresores de tumores. Por consiguiente, por ejemplo, el ácido nucleico de p53 se halla en Lamb et al. (1986) Mol Cell Biol. 6: 1379-1385, Nº de acceso en GenBank: M13111). De modo similar, la secuencia de ácido nucleico de RB es descrita por Lee et al. (1987) Nature, 329: 642-645 (Nº de acceso en GenBank: M28419). Usando la información sobre secuencias existente, la persona con experiencia ordinaria en la técnica puede clonar los genes supresores de tumores en vectores adecuados para la práctica de la presente invención.

Los supresores de tumores p53 y RB se usan en la presente invención. Los métodos para clonar p53 y RB en vectores adecuados para expresión de las respectivas proteínas supresoras de tumores o para aplicaciones de terapia génica se conocen en la técnica. Por lo tanto, por ejemplo, la clonación y el uso de p53 son descritos en detalle por Wills (1994) supra; en la patente estadounidense No: 5,532,220, en el documento conjuntamente en trámite USSN 08/328,673 presentado el 25 de octubre de 1994, y en el documento WO 95/11984. Típicamente, el casete de expresión se construye con el ADNc supresor de tumores operativamente unido a un promotor, más preferiblemente a un promotor más fuerte (p. ej., el promotor tardío principal Ad2 (Ad2 MLP), o el promotor del gen temprano inmediato del citomegalovirus humano (CMV)). En una realización particularmente preferida, el promotor es seguido por ADNc guía tripartito y al ADNc supresor de tumores le sigue un sitio de poliadenilación (p. ej., el sitio de poliadenilación E1b) (véanse, p. ej., el documento conjuntamente en trámite USSN 08/328,673, el documento WO 95/11984 y Wills (1994) supra). Se ha de apreciar que son también adecuados diversos promotores específicos de tejidos. Por lo tanto, por ejemplo, se puede usar un promotor de tirosinasa para dirigir la expresión a melanomas (véase, p. ej., Siders (1996) Cancer Res. 56:5638-5646). En una realización particularmente preferida, el ADNc supresor de tumores se expresa en un vector adecuado para la terapia génica, como se describe a continuación.

La persona con experiencia en la técnica apreciará que muchas de las variaciones conservadoras de las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente memoria proporcionan productos funcionalmente idénticos. Por ejemplo, debido a la degeneración del código genético, las "sustituciones silenciosas" (es decir, sustituciones de una secuencia de ácido nucleico que no produce una alteración en un polipéptido codificado) son una característica implícita de cada secuencia de ácido nucleico que codifica un aminoácido. De modo similar, las "sustituciones de aminoácidos conservadoras" en uno o en unos cuantos aminoácidos de una secuencia de aminoácidos se sustituyen con diferentes aminoácidos con propiedades muy similares (véase la sección de definiciones, supra), también se identifican fácilmente como muy similares a una secuencia de aminoácidos revelada, o a una secuencia de aminoácidos revelada que codifica un aminoácido. Dichas variaciones sustituidas en forma conservadora de cada secuencia explícitamente descrita son una característica de la presente invención.

El experto en la técnica reconocerá que se pueden efectuar modificaciones a las proteínas supresoras de tumores sin disminuir su actividad biológica. Algunas modificaciones se pueden efectuar para facilitar la clonación, expresión o incorporación de la molécula diana a una proteína de fusión. Dichas modificaciones se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, una metionina añadida en el extremo amino para proveer un sitio de inicio, o aminoácidos adicionales (p. ej., poly His) dispuestos en cualquiera de los extremos para crear sitios de restricción convenientemente dispuestos o codones de terminación o secuencias de purificación.

Las modificaciones a los ácidos nucleicos y polipéptidos se pueden evaluar por técnicas de estudio de rutina en ensayos adecuados para la característica deseada. Por ejemplo, los cambios en el carácter inmunológico de un polipéptido pueden detectarse mediante un ensayo inmunológico adecuado. Las modificaciones de otras propiedades tales como hibridación del ácido nucleico a un ácido nucleico diana, oxidorreducción o estabilidad térmica de una proteína, hidrofobicidad, susceptibilidad a la proteólisis o la tendencia a agregarse se ensayan todos de acuerdo con técnicas convencionales.

D) Administración de supresores de tumores a células diana

Los supresores de tumores empleados en los métodos de la presente invención se pueden introducir a las células como un ácido nucleico. Si el supresor de tumores es un ácido nucleico supresor de tumores (p. ej., un gen, un ADNc, un ARNm, etc.), el ácido nucleico se introduce a la célula usando métodos convencionales de administración de ácidos nucleicos a las células. Estos métodos típicamente implican los métodos de administración de terapia génica in vivo o ex vivo que se describen a continuación. Los métodos particularmente preferidos para administrar p53 o RB incluyen la administración de lípidos o liposomas y/o el uso de vectores retrovíricos o adenovíricos.

1. Terapia génica in vivo

En una realización más preferida, los ácidos nucleicos supresores de tumores (p. ej., ADNc que codifican la proteína supresora de tumores) se clonan en vectores de terapia génica que son competentes con las células transfectadas (como células humanas u otras células de mamíferos) in vitro y/o in vivo.

Se han utilizado diversos planteamientos para introducir ácidos nucleicos a las células in vivo, ex vivo e in vitro. Éstos incluyen la administración de genes basada en lípidos o liposomas (WO 96/18372; WO 93/24640; Mannino (1988) BioTechniques 6(7): 682-691; Rose, patente estadounidense No. 5,279,833; WO 91/06309; y Feigner (1987) Proc. Natl Acad. Sci EE. UU. 84: 7413-7414) y vectores retrovíricos defectuosos en la replicación que alojan una secuencia de polinucleótidos terapéutica como parte del genoma retrovírico (véanse, p. ej., Miller (1990) Mol. Cell. Biol. 10:4239 (1990); Kolberg (1992) J. NIH Res. 4: 43, y Coraetta (1991) Hum. Gene Ther. 2: 215).

Para una revisión de procedimientos de terapia génica, véanse, p. ej., Zhang (1996) Cancer Metastasis Rev. 15:385-401; Anderson, Science (1992) 256: 808-813; Nabel (1993) TIBTECH 11: 211-217; Mitani (1993) TIBTECH 11: 162-166; Mulligan (1993) Science, 926-932; Dillon (1993) TIBTECH 11: 167-175; Miller (1992) Nature 357: 455-460; Van Brunt (1988) Biotechnology 6(10): 1149-1154; Vigne (1995) Restorative Neurology and Neuroscience 8: 35-36; Kremer (1995) British Medical Bulletin 51(1) 31-44; Haddada (1995) en Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler and Böhm (eds) Springer-Verlag, Heidelberg, Alemania; y Yu (1994) Gene Therapy, 1:13-26.

Los vectores útiles en la práctica de la presente invención típicamente derivan de genomas víricos. Los vectores que se pueden emplear incluyen virus de ADN y ARN recubiertos y no recubiertos recombinantemente modificados, preferiblemente seleccionados entre baculoviridiae, parvoviridiae, picornoviridiae, herpesveridiae, poxviridae, adenoviridiae o picornnaviridiae. También se pueden emplear vectores quiméricos que explotan las ventajas de cada una de las propiedades del vector principal (Véase, p. ej., Feng (1997) Nature Biotechnology 15:866-870. Dichos genomas víricos pueden modificarse por técnicas de ADN recombinante para incluir el gen supresor de tumores y pueden modificarse para ser deficientes de replicación, condicionalmente replicantes o competentes de replicación. En la práctica preferida de la invención, los vectores son deficientes de replicación o condicionalmente replicantes. Los vectores preferidos derivan de los genomas adenovíricos, víricos adenoasociados y retrovíricos. En la práctica más preferida de la invención, los vectores son vectores incompetentes de replicación derivados del genoma de adenovirus humano.

Los vectores víricos condicionalmente replicantes se utilizan para lograr la expresión selectiva en tipos de células particulares, a la vez que evitan la infección de amplio espectro desfavorable. Los ejemplos de vectores condicionalmente replicantes se describen en Bischoff, et al.(1996) Science 274:373-376; Pennisi, E. (1996) Science 274:342-343; Russell, S.J. (1994) Eur. J. of Cancer 30A(8): 1165-1171. Además, el genoma vírico puede modificarse para incluir promotores inducibles que logran la replicación o expresión del transgen únicamente bajo determinadas condiciones. Los ejemplos de promotores inducibles se conocen en la bibliografía científica (Véanse, p. ej., Yoshida y Hamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230:426-430; Iida, et al. (1996) J. Virol. 70(9):6054-6059; Hwang, et al.(1997) J. Virol 71(9):7128-7131; Lee, et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17(9):5097-5105; y Dreher, et al.(1997) J. Biol. Chem 272(46); 29364-29371. El transgen puede además estar bajo el control de una región promotora específica de tejidos permitiendo la expresión del transgen únicamente en tipos de células particulares.

Los vectores retrovíricos ampliamente utilizados incluyen aquellos basados en el virus de leucemia murina (MuLV), virus de leucemia de gibón ape (GaLV), virus de inmunodeficiencia de simios (SIV), virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y sus combinaciones. Véanse, p. ej., Buchscher (1992) J. Virol. 66(5) 2731-2739; Johann (1992) J. Virol. 66 (5): 1635-1640 (1992); Sommerfelt (1990) Virol. 176:58-59; Wilson (1989) J. Virol. 63:2374-2378; Miller (1991) J. Virol. 65:2220-2224; Wong-Staal et al, PCT/US94/05700 y, Rosenburg y Fauci (1993) en Fundamental Immunology, Tercera Edición, Paul (ed) Raven Press, Ltd., New York y las referencias allí citadas, y Yu (1994) supra). Los vectores opcionalmente se seudotipifican para extender el intervalo hospedante del vector a las células que no están infectadas por el retrovirus correspondiente al vector. Se ha utilizado la glucoproteína de la membrana del virus de estomatitis vesicular (VSV-G) para construir los vectores de VIH VSV-G-seudotipificados que pueden infectar las células madre hematopoyéticas (Naldini et al (1996) Science 272:263, y Akkina (1996) J Virol 70:2581).

Los vectores basados en virus adenoasociados (AAV) también se utilizan para transducir células con ácidos nucleicos diana, p. ej., en la producción in vitro de ácidos nucleicos y péptidos, y en los procedimientos de terapia génica in vivo y ex vivo. Véanse, Okada (1996) Gene Ther. 3:957-964; West (1987) Virology 160:38-47; Carter (1989) patente estadounidense No. 4,797,368; Carter et al. WO 93/24641 (1993); Kotin (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Muzyczka (1994) J. Clin. Invst. 94:1351, para un resumen de los vectores AAV. La construcción de vectores AAV recombinantes se describe en una serie de publicaciones que incluyen Lebkowski, patente estadounidense No. 5,173,414; Tratschin (1985) Mol. Cell. Biol. 5(ll):3251-3260; Tratschin (1984) Mol. Cell. Biol. 4: 2072-2081; Hermonat (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 81: 6466-6470; McLaughlin (1988) y Samulski (1989) J. Virol, 63:03822-3828. Las líneas celulares que se pueden transformar por rAAV incluyen aquellas descritas en Lebkowski (1988) Mol. Cell. Biol., 8:3988-3996. Otros vectores víricos adecuados incluyen el herpes virus y el virus variolovacunal.

En una realización particularmente preferida, el gen supresor de tumores se expresa en un vector adenovírico adecuado para la terapia génica. El uso de vectores adenovíricos in vivo, y para terapia génica, se describe en la bibliografía científica y de patentes, p. ej., véanse, Hermens (1997) J. Neurosci. Methods., Jan., 71(1): 85-98; Zeiger (1996) Surgery 120:921-925; Channon (1996) Cardiovasc Res. 32:962-972; Huang (1996) Gene Ther. 3:980-987; Zepeda (1996) Gene Ther. 3:973-979; Yang (1996) Hum. Mol. Genet. 5:1703-1712; Caruso (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 93:11302-11306; Rothmann (1996) Gene Ther. 3:919-926; Haecker (1996) Hum. Gene Ther. 7:1907-1914. El uso de vectores adenovíricos se describe en detalle en el documento WO 96/25507. Los vectores adenovíricos particularmente preferidos son descritos por Wills (1994) supra; en el documento conjuntamente en trámite USSN 08/328,673 y en el documento WO 95/11984.

Los vectores adenovíricos particularmente preferidos incluyen una deleción de todo o parte del gen de la proteína IX. En una realización, los vectores adenovíricos incluyen deleciones de las secuencias E1a y/o E1b. En una realización más preferida, el constructo adenovírico es un constructo que codifica p53, como A/C/N/53 o A/M/N/53 (véanse, p. ej., USSN 08/328,673 y WO 95/11984).

También se prefieren los vectores derivados del adenovirus humano tipo 2 o tipo 5. Dichos vectores son preferiblemente deficientes de replicación por modificaciones o deleciones en las regiones codificadoras Ela y/o Elb. Se prefieren otras modificaciones al genoma vírico para lograr las características particulares de expresión o para permitir la administración repetida o una respuesta inmunitaria inferior. Se prefieren más los vectores adenovíricos recombinantes que tienen deleciones completas o parciales de la región codificadora E4, que opcionalmente retienen E4 ORF6 y ORP 6/7. La secuencia codificadora E3 se puede eliminar pero preferiblemente se retiene. En particular, se prefiere que la región operadora del promotor de E3 se modifique para aumentar la expresión de E3 a fin de lograr un perfil inmunológico más favorable para los vectores terapéuticos. Se prefieren más los vectores adenovíricos humanos tipo 5 que contienen una secuencia de ADN que codifica p53 bajo el control de la región promotora del citomegalovirus y la secuencia guía tripartita que tiene E3 bajo el control del promotor de CMV y la deleción de las regiones codificadoras de E4 mientras se retienen E4 ORF6 y ORF 6/7. En la práctica más preferida de la invención, tal como se ilustra en la presente memoria, el vector es ACN53.

El gen supresor de tumores es p53 o RB. Como se explicó anteriormente, la clonación y el uso de p53 son descritos en detalle por Wills (1994) supra; en el documento conjuntamente en trámite USSN 08/328,673 presentado el 25 de octubre de 1994, y en el documento WO 95/11984.

2. Terapia génica ex vivo

En una realización, la composición de la presente invención consiste en células hiperproliferativas (p., ej., neoplásicas) en un sujeto (p. ej., un mamífero, incluyendo, aunque sin limitarse a ello, ratas, murinos, bovinos, porcinos, equinos, canino, felinos, lagomorfos o seres humanos). Las células hiperproliferativas patológicas son características de patologías que incluyen, aunque sin limitarse a ello, enfermedad de Grave, soriasis, hipertrofia prostática benigna, síndrome Li-Fraumeni, cáncer de mama, sarcomas, cáncer vesical, cáncer de colon, cáncer de pulmón, diversas leucemias y linfomas, y otros neoplasmas.

La aplicación ex vivo de la composición de la invención, en particular, provee medios para eliminar una muestra adecuada de células hiperproliferativas patológicas. Por lo tanto, por ejemplo, las células hiperproliferativas que contaminan los precursores hematopoyéticos durante la reconstitución de la médula ósea pueden eliminarse por aplicación ex vivo de los métodos de la presente invención. Típicamente, dichas aplicaciones implican obtener una muestra del organismo del sujeto. La muestra es típicamente una preparación de células heterogéneas que contiene tanto células fenotípicamente normales como patogénicas (hiperproliferativas). La muestra se pone en contacto con los ácidos nucleicos supresores de tumores y el antineoplásico auxiliar. El gen supresor de tumores se puede administrar, p. ej., en un vector vírico, tal como un vector retrovírico o un vector adenovírico. El tratamiento reduce la proliferación de las células patógenas proporcionando así una muestra que contiene una relación mayor de células normales a patógenas que pueden reintroducirse al organismo del sujeto.

La transformación de las células ex vivo para diagnóstico, investigación o para terapia génica (p. ej., vía re-infusión de las células transformadas en el organismo hospedante) se conoce en la técnica. En una realización preferida, las células se aíslan del organismo del sujeto, se transfectan con el gen supresor de tumores o ADNc de la presente invención y se re-infunden en el organismo del sujeto (p. ej., un paciente). Las personas con experiencia en la técnica conocen los diversos tipos de células adecuados para transformación ex vivo. Las células particularmente preferidas son células madre o progenitoras (véase, p. ej., Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edición Wiley-Liss, New York, y las referencias allí citadas para un análisis de cómo aislar y cultivar células de pacientes). Las células transformadas se cultivan por métodos conocidos en la técnica. Véanse también Kuchler (1977) Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Kuchler, R.J., Dowden, Hutchinson and Ross, Inc., y Atlas (1993) CRC Handbook of Microbiological Media (Parks ed) CRC press, Boca Raton, Fl. Los sistemas de células mamíferas a menudo tendrán la forma de monocapas de células, aunque las suspensiones celulares de mamíferos también se utilizan. Alternativamente, las células pueden derivar de aquellas conservadas en un banco de células (p. ej., un banco de sangre). Los ejemplos ilustrativos de líneas celulares de mamíferos incluyen la línea celular HEC-1-B, las células VERO y Hela, las líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO) o las líneas celulares W138, BHK, Cos-7 o MDCK (véase, p. ej., Freshney, supra).

En una realización particularmente preferida, las células madre se usan en procedimientos ex-vivo para transformación de células y terapia génica. La ventaja de usar células madre es que pueden diferenciarse de otros tipos de células in vitro, o se pueden introducir a un mamífero (tal como el donante de las células) donde se injertarán en la médula ósea. Se conocen los métodos para diferenciar células madre (p. ej., CD34^{+}) in vitro en tipos de células inmunitarias clínicamente importantes que usan citocinas tales como GM-CSF, IFN-gamma y TNF-alfa (véase, p. ej., Inaba (1992) J. Exp. Med. 176:1693-1702; Szabolcs (1995) 154:5851-5861).

En lugar de usar células madre, también se usan células T o células B en algunas realizaciones en procedimientos ex vivo. Se conocen diversas técnicas para aislar células T y B. La expresión de marcadores de superficie facilita la identificación y purificación de dichas células. Los métodos de identificación y aislamiento de células incluyen FACS, incubación en matraces con anticuerpos fijos que se unen al tipo de célula particular y técnica de panning con microesferas magnéticas.

Las células se aíslan para transducción y diferenciación usando métodos conocidos. Por ejemplo, en ratones, las células de médula ósea se aíslan sacrificando al ratón y cortando los huesos de la pierna con una tijera. Las células madre se aíslan de las células de médula ósea aplicando la técnica de panning a las células de médula ósea con anticuerpos que se unen a las células no deseadas, como CD4^{+} y CD8^{+} (células T), CD45^{+} (células panB), GR-1 (granulocitos) y Ia^{d} (células que presentan antígenos diferenciados). Para un ejemplo de este protocolo, véase, p. ej., Inaba (1992) supra.

En seres humanos, las aspiraciones de célula ósea de las crestas ilíacas se realizan, p. ej., con anestesia general en un quirófano. Las aspiraciones de médula ósea consisten en aproximadamente 1.000 ml en cantidad y se recogen de los huesos y crestas ilíacos posteriores. Si la cantidad total de células recogida es menos que aproximadamente
2 x 10^{8}/kg, se realiza una segunda aspiración usando el esternón y las crestas ilíacas anteriores además de las crestas posteriores. Durante la operación, se administran concentrados de eritrocitos irradiados para reemplazar el volumen de médula extraído con la aspiración. Las células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas se caracterizan por la presencia de un antígeno de membrana de superficie CD34. Este antígeno se usa para purificación, p. ej., en columnas de afinidad que se unen a CD34. Después de cosechar la médula ósea, las células mononucleares se separan de los otros componentes mediante centrifugación en gradiente de ficol. Esto se puede realizar con un método semiautomático, usando un separador de células (p. ej., una máquina Baxter Fenwal CS3000 + o Terumo). Se recogen las células de densidad liviana, compuestas principalmente por células mononucleares, y las células se incuban en matraces de plástico a aproximadamente 37ºC durante aproximadamente 1,5 h. Las células adherentes (monocitos, macrófagos y células B) se desechan. Las células no adherentes se recogen luego e incuban con un anticuerpo anti-CD34 monoclonal (p. ej., el anticuerpo murino 9C5) a 4ºC durante 30 minutos con rotación moderada. La concentración final del anticuerpo anti-CD34 es preferiblemente aproximadamente 10 \mug/ml. Después de dos lavados, las microesferas paramagnéticas (p. ej., Dyna Beads, provistas por Baxter Immunotherapy Group, Santa Ana, California) recubiertas con anticuerpo IgG anti-ratón de oveja (Fc) se añaden a la suspensión celular en una relación de aproximadamente 2 células/esfera. Después de un período de incubación adicional de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 4ºC, las células rosetadas con esferas magnéticas se recogen con un imán. Se puede añadir quimiopapaína (Baxter Immunotherapy Group, Santa Ana, California) a una concentración final de 200 U/ml para liberar las esferas de las células CD34+.

Alternativa y preferiblemente, se puede usar un procedimiento de aislamiento en columna de afinidad que se une a CD34, o a los anticuerpos unidos a CD34 (véanse, p. ej., Ho (1995) Stem Cells 13 (supl. 3): 100-105 y Brenner (1993) Journal of Hematotherapy 2: 7-17).

En otra realización, se pueden aislar células hematopoyéticas de sangre de cordón fetal. Yu (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 92: 699-703 describe un método preferido para transducir células CD34^{+} de sangre de cordón fetal humano usando vectores retrovíricos.

3. Administración de ácido nucleico que expresa un supresor de tumores: Vectores y casetes de expresión Rutas de administración

Los casetes y vectores de expresión (p. ej., retrovirus, adenovirus, liposomas, etc.) que contienen los ácidos nucleicos que expresan supresores de tumores terapéuticos de la invención se pueden administrar directamente al organismo para transducción de células in vivo. La administración se realiza mediante cualquiera de las rutas normalmente utilizadas para introducir una molécula en contacto íntimo con sangre o células de tejido, p. ej., sistémica, regional o localmente, como se describió en detalle anteriormente para la administración de antineoplásicos auxiliares. Los ácidos nucleicos "envasados" (como mínimo, una secuencia que codifica el supresor de tumores con un promotor) se administran de cualquier forma adecuada, preferiblemente con vehículos farmacéuticamente aceptables, también anteriormente analizados. Los métodos adecuados para administrar dichos ácidos nucleicos envasados están disponibles y se conocen en la técnica y, aunque se puede emplear más de una ruta para administrar una composición particular, una ruta particular a menudo proveer una reacción más inmediata y eficaz que otra ruta.

Por ejemplo, la administración de un adenovirus recombinante para expresar un gen supresor de tumores puede producir una respuesta inmunitaria, específicamente, una respuesta de los anticuerpos, contra el vector adenovírico. Algunos pacientes pueden tener anticuerpos pre-existentes que reaccionan contra los adenovirus. Por lo tanto, en algunas circunstancias, la administración regional o local, en lugar de la administración sistémica del vector adenovírico que expresa el supresor de tumores, es la óptima y la más eficaz. Por ejemplo, como se describe a continuación, el cáncer de ovario limitado a la cavidad abdominal es un escenario clínico en el que la terapia con el gen p53 regional, es decir, administración intraperitoneal (IP), se debe considerar el plan de tratamiento preferido. La administración IP de adenovirus recombinantes también produce una infección del revestimiento peritoneal y absorción del vector adenovírico en la circulación sistémica (otros métodos de administración regional también pueden producir la introducción del vector adenovírico a la circulación sistémica). El grado de este efecto puede depender de la concentración y/o cantidad total de partículas víricas administradas IP. Si se desea el efecto sistémico, puede ser preferible una concentración mayor de varios días consecutivos.

La administración local del vector adenovírico que expresa el supresor de tumores de la invención también se prefiere en algunas circunstancias, p. ej., cuando el paciente tienen anticuerpos reactivos antiadenovíricos pre-existentes. Dicha "administración local" puede ser, p. ej., por inyección intratumoral, si es interna, o aplicación mucosal, si es externa. Alternativamente, el efecto de una "administración local" se puede lograr dirigiendo el vector adenovírico hacia el tumor, usando, p. ej., reactivos que reconocen antígenos específicos del tumor (como anticuerpos) en liposomas o en el adenovirus propiamente dicho.

Formulaciones

Los vehículos farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se esté administrando, como también por el método particular que se utilice para administrar la composición. Por ende, existe una diversidad de formulaciones adecuadas de las composiciones farmacéuticas de la presente invención.

Las formulaciones adecuadas para administración oral de las composiciones farmacéuticas que comprenden los ácidos nucleicos que expresan el supresor de tumores pueden consistir en (a) disoluciones líquidas, como una cantidad eficaz del ácido nucleico envasado suspendido en diluyentes, como agua, disolución salina o PEG 400; (b) cápsulas, sachets o comprimidos, conteniendo cada uno una cantidad predeterminada del ingrediente activo, como líquidos, sólidos, gránulos o gelatina; (c) suspensiones en un líquido adecuado; y (d) emulsiones adecuadas. Las formas en comprimido pueden incluir uno o más de lactosa, sacarosa, manitol, sorbitol, fosfatos de calcio, almidón de maíz, almidón de patata, tragacanto, celulosa microcristalina, goma arábiga, gelatina, dióxido de silicio coloidal, croscarmelosa sódica, talco, estearato de magnesio, ácido esteárico y otros excipientes, colorantes, cargas, aglutinantes, diluyentes, agentes tampón, agentes humectantes, conservantes, saporíferos, tinturas, agentes desintegrantes y vehículos farmacéuticamente compatibles.

Las formas en pastillas pueden comprender el principio activo en un saborizante, usualmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto, como también pastillas que comprenden el principio activo en una base inerte, como gelatina y glicerina o sacarosa y emulsiones de goma arábiga, geles y similares que contienen, además del principio activo, vehículos conocidos en la técnica.

Los ácidos nucleicos envasados, solos o en combinación con otros componentes adecuados, se pueden elaborar en formulaciones en aerosol (es decir, pueden "nebulizarse") para administrarse vía inhalación. Las formulaciones en aerosol se pueden disponer en propulsores presurizados aceptables, como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares.

Las formulaciones adecuadas para administración rectal incluyen, por ejemplo, supositorios, que consisten en el ácido nucleico envasado con una base de supositorio. Las bases de supositorio adecuadas incluyen triglicéridos naturales o sintéticos o hidrocarburos de parafina. Además, es también posible usar cápsulas rectales de gelatina que consisten en una combinación del ácido nucleico envasado con una base que incluye, por ejemplo, triglicéridos líquidos, polietilenglicoles e hidrocarburos de parafina.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral, como por ejemplo por ruta intrarticular (en las articulaciones), intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal y subcutánea, incluyen disoluciones acuosas y no acuosas isotónicas estériles, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que tornan la formulación isotónica con la sangre del receptor, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizadores y conservantes. En la práctica de la presente invención, las composiciones se pueden administrar, por ejemplo, por infusión intravenosa, oral, tópica, intraperitoneal, intravesical o intratecal. La administración parenteral e intravenosa son los métodos de administración preferidos. Las formulaciones de ácido nucleico envasado se pueden presentar en envases sellados de una sola dosis o de dosis múltiples, tales como ampollas y viales.

Las formulaciones de la invención como disoluciones y suspensiones para inyección se pueden preparar a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos del tipo previamente descrito. La composición exacta de la formulación, la concentración de los reactivos y el ácido nucleico en la formulación, su pH, tampones y otros parámetros variarán dependiendo del modo y el sitio de administración (p. ej., si es administración sistémica, regional o local) y se debe relacionar con la conservación, el manipuleo y el envío, y la vida útil de la composición farmacéutica en particular. La optimización de estos parámetros, dependiendo de la necesidad particular de la formulación, se puede llevar a cabo por métodos de rutina; y se puede usar cualquier ingrediente y parámetro conocidos para formulaciones inyectables. Un ejemplo de una formulación adecuada es, p. ej., un vector de adenovirus que expresa p53 recombinante natural de la invención (rAd5/p53) a una concentración de 7-5 x 10^{11} a 7,5 x 10^{10} partículas por ml, fosfato sódico monohidratado a 0,42 mg/ml, fosfato de sodio dibásico anhidro a 2,48 mg/ml, cloruro de sodio a fosfato de sodio monohidratado a 5,8 mg/ml, sacarosa a 20,0 mg/ml, cloruro de magnesio a 0,40 mg/ml, típicamente conservados en dosis de 1,0 ml.

Las células transducidas por el ácido nucleico envasado tal como se describió anteriormente en el contexto de la terapia ex vivo también pueden administrarse intravenosa o parenteralmente, como ya se describió.

La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente invención, deberá ser suficiente para efectuar una respuesta terapéutica beneficiosa en el paciente con el paso del tiempo. La dosis será determinada por la eficacia del vector particular empleado y la condición del paciente, como también el peso corporal o el área de superficie del paciente que se ha de tratar. El tamaño de la dosis también será determinado por la existencia, naturaleza y grado de cualquier efecto adverso que acompañe a la administración de un vector particular, o tipo de célula transducida en un paciente en particular.

Para determinar la cantidad eficaz del vector que se ha de administrar en el tratamiento, el médico evalúa los niveles en el plasma circulante del vector, las toxicidades del vector, la progresión de la enfermedad y la producción de anticuerpos anti-vector. La dosis típica de un ácido nucleico depende en gran medida de la ruta de administración y del sistema de administración del gen. Dependiendo del método de administración, la dosis puede estar fácilmente en el intervalo de 1 \mug a 100 mg o más. En general, la dosis equivalente de un ácido nucleico desnudo de un vector estará entre 1 \mugy 100 \mug para un paciente típico de 70 kilogramos, y las dosis de los vectores que incluyen una partícula vírica se calculan para producir una cantidad equivalente de ácido nucleico terapéutico.

Para administración, las células transducidas de la presente invención se pueden administrar a un índice determinado por el LD_{50} del vector, o el tipo de célula transducida y los efectos colaterales del vector o el tipo de célula en diversas concentraciones, según corresponda a la masa y la salud general del paciente. La administración se puede lograr a través de una sola dosis o dosis divididas, como se describe a continuación.

En una realización preferida, antes de la infusión, se obtienen las muestras de sangre y se conservan para análisis. Los signos vitales y la saturación de oxígeno por oximetría de pulso se vigilan de cerca. Las muestras de sangre se obtienen preferiblemente 5 minutos y 1 hora después de la infusión y se conservan para el análisis subsiguiente. En la terapia ex vivo, la leucoféresis, transducción y reinfusión se pueden repetir cada 2 ó 3 meses. Después del primer tratamiento, las infusiones se pueden realizar en forma ambulatoria según el criterio del médico. Si la reinfusión se administra en forma ambulatoria, el participante debe controlarse durante por lo menos 4 y preferiblemente 8 horas después de la terapia.

Como se describió anteriormente, los constructos adenovíricos se pueden administrar sistémicamente (p. ej., intravenosamente), regionalmente (p. ej., intraperitonealmente) o localmente (p. ej., inyección intra o peritumoral o inyección intraquística, p. ej., para tratar cáncer vesical). Los modos de administración particularmente preferidos incluyen inyección intrarterial, más preferiblemente inyección arterial intrahepática (p. ej., para tratamiento de tumores hepáticos), o, si se desea administrar una composición a un tumor cerebral, a una arteria carótida o a una arteria del sistema de arterias carótidas (p. ej., arteria occipital, arteria auricular, arteria temporal, arteria cerebral, arteria maxilar, etc.). La administración para el tratamiento del cáncer de pulmón se puede lograr, p. ej., mediante el uso de un broncoscopio. Típicamente, dicha administración se realiza en un tampón acuoso farmacológicamente aceptable según se describió anteriormente. No obstante, en una realización particularmente preferida, los constructos adenovíricos o los casetes de expresión supresores de tumores se administran en una formulación de lípidos, más particularmente bien formando complejo con liposomas para formar complejos de lípido/ácido nucleico (p. ej., como lo describen Debs y Zhu (1993) WO 93/24640; Mannino (1988) supra; Rose, patente estadounidense No. 5,279,833; Brigham (1991) WO 91/06309; y Feigner (1987) supra) o se encapsulan en liposomas, más preferiblemente en inmunoliposomas dirigidos a marcadores de tumores específicos. Se ha de apreciar que dichas formulaciones de lípidos pueden también administrarse tópicamente, sistémicamente o vía aerosol.

4. Potenciación de la administración del supresor de tumores

La administración del supresor de tumores se puede potenciar mediante el uso de uno o más "agentes potenciadores de la administración". Un "agente potenciador de la administración" se refiere a cualquier agente que potencie la administración de un gen terapéutico, como un gen supresor de tumores a un tejido u órgano canceroso. Dicha administración potenciada se puede lograr mediante diversos mecanismos. Uno de dichos mecanismos puede implicar la ruptura de la capa de glucosaminoglucano protectora en la superficie epitelial de un órgano o tejido (p. ej., la vejiga). Los ejemplos de dichos agentes potenciadores de la administración son detergentes, alcoholes, glicoles, tensioactivos, sales biliares, antagonistas de heparina, inhibidores de cicloxigenasa, disoluciones salinas hipertónicas y acetatos. Los alcoholes incluyen, por ejemplo, los alcoholes alifáticos tales como etanol, N-propanol, isopropanol alcohol butílico, alcohol acetílico. Los glicoles incluyen glicerina, propilenglicol, polietilenglicol y otros glicoles de bajo peso molecular tales como glicerol y tioglicerol. Los acetatos tales como ácido acético, acetato de gluconol y acetato de sodio son otros ejemplos de agentes potenciadores de la administración. Las disoluciones salinas hipertónicas como NaCl 1M son también ejemplos de agentes potenciadores de la administración. Los ejemplos de tensioactivos son dodecilsulfato sódico (SDS) y lisolecitina, polisorbato 80, nonilfenoxipolioxietileno, lisofosfatidilcolina, polietilenglicol 400, polisorbato 80, polioxietilenéteres, tensioactivos de poliglicoléteres y DMSO. Se pueden utilizar sales biliares tales como taurocolato, tauro-desoxicolato sódico, desoxicolato, quenodesoxicolato, ácido glicocólico, ácido glicoquenodesoxicólico y otros astringentes como nitrato de plata. También se pueden usar antagonistas de heparina como aminas cuaternarias tales como sulfato de prolamina. Se pueden emplear inhibidores de cicloxigenasa tales como salicilato de sodio, ácido salicílico y fármacos antinflamatorios no esteroideos (AINE) como indometacina, naproxeno,
diclofenac.

Los detergentes incluyen detergentes aniónicos, catiónicos, zwitteriónicos y no iónicos. Los detergentes ilustrativos incluyen taurocolato, deosoxicolato, taurodesoxicolato, cetilpiridio, cloruro de benzalconio, detergente
ZWITTERGENT®3-14, CHAPS hidrato de (3-[(3-Colamidopropi)dimetiamoniol]-1-propanoulfonato, Aldrich), Big CHAP (como se describe en el documento USSN 08/889,355, presentado el 8 de julio de 1997; y en la solicitud internacional WO 97/25072, 17 de julio de 1997), Desoxi Big CHAP (ibídem), detergente TRITON®-X-100, C12E8, Octil-B-D-Glucopiranósido, detergente PLURONIC®-F68, detergente TWEEN® 20 y detergente TWEEN® 80 (CALBIOCHEM® Biochemicals).

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En una realización, el agente potenciador de la administración se incluye en el tampón en el que se formula el sistema de administración del vector adenovírico recombinante. El agente potenciador de la administración se puede administrar antes del virus recombinante o concomitante con el virus. En algunas realizaciones, el agente potenciador de la administración se provee con el virus mezclando una preparación de virus con una formulación del agente potenciador de la administración justo antes de la administración al paciente. En otras realizaciones, el agente potenciador de la administración y el virus se proveen en un solo vial al cuidador para administración.

En el caso de una composición farmacéutica que comprende un gen supresor del tumor contenido en un sistema de administración del vector adenovírico recombinante formulado en un tampón que además comprende un agente potenciador de la administración, la composición farmacéutica preferiblemente se administra con el tiempo en un intervalo de aproximadamente 5 minutos a 3 horas, preferiblemente aproximadamente 10 minutos a 120 minutos, y más preferiblemente aproximadamente 15 minutos a 90 minutos. En otra realización, el agente potenciador de la administración se puede administrar antes de la administración del vector adenovírico recombinante que contiene el gen supresor de tumores. La administración previa del agente potenciador de la administración puede estar en el intervalo de aproximadamente 30 segundos a 1 hora, preferiblemente aproximadamente 1 minuto a 10 minutos, y más preferiblemente aproximadamente 1 minuto a 5 minutos antes de la administración del sistema de administración del vector adenovírico que contiene el gen supresor de tumores.

La concentración del agente potenciador de la administración dependerá de una serie de factores conocidos para la persona con experiencia en la técnica, como el agente potenciador de la administración que se utilice, el tampón, el pH, el tejido u órgano diana y el modo de administración. La concentración del agente potenciador de la administración estará en el intervalo de 1% a 50% (v/v), preferiblemente 10% a 40% (v/v) y lo más preferiblemente 15% a 30% (v/v). Preferiblemente, la concentración de detergente en la formulación final administrada al paciente es aproximadamente 0,5 - 2X la concentración de la micelización crítica (CMC). Una concentración preferida de Big CHAP es aproximadamente 2-20 mM, más preferiblemente aproximadamente 3,5-7 mM.

El tampón que contiene el agente potenciador de la administración puede ser cualquier tampón farmacéutico tal como disolución salina tamponada con fosfato fosfato/sulfato de sodio, tampón Tris, tampón de glicina, agua estéril y otros tampones conocidos por el experto en la técnica, como lo describen Good et al. (1966) Biochemistry 5:467. El pH del tampón en la composición farmacéutica que comprende el gen supresor de tumores contenido en el sistema de administración del vector adenovírico puede estar en el intervalo de 6,4 a 8,4, preferiblemente 7 a 7,5 y lo más preferiblemente 7,2 a 7,4.

Una formulación preferida para la administración de un adenovirus recombinante es 10^{9} - 10^{11} PN/ml virus, Big CHAP 2-10 mM o detergente TRITON®-X-100 0,1-1,0 mM, en disolución salina tamponada con fosfato (PBS), más aproximadamente 2-3% sacarosa (p/v) y MgCl_{2} 1-3 mM, a pH 6,4-8,4. El uso de agentes potenciadores de la administración se describe en detalle en la patente estadounidense conjuntamente en trámite No. 6,165,779 presentada el 7 de enero de 1997.

Con el fin de facilitar la transferencia mejorada del gen para las formulaciones de ácido nucleico que comprenden preparaciones de Big-CHAP comerciales, la concentración de Big CHAP variará dependiendo de su fuente comercial. Cuando la fuente de Big CHAP sea CALBIOCHEM, se prefiere que la concentración esté en el intervalo de 2 a 10 milimolares. Se prefiere más que esté entre 4 y 8 milimolares. Lo que más se prefiere es aproximadamente 7 milimolares.

Cuando la fuente de Big CHAP sea Sigma, se prefiere que la concentración de Big CHAP esté en el intervalo de 15 a 35 milimolares. Se prefiere más que sea de 20 a 30 milimolares. Lo que más se prefiere es 25 milimolares.

En otra realización de la invención, se proveen agentes potenciadores de la administración que tienen la fórmula I:

1

en la que n es un número entre 2-8, X_{1} es un grupo ácido cólico o ácido desoxicólico, y X_{2} y X_{3} se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en un grupo ácido cólico, un grupo ácido desoxicólico y un grupo sacárido. Por lo menos uno de X_{2} y X_{3} es un grupo sacárido. El grupo sacárido puede seleccionarse entre el grupo que consiste en grupos pentosa monosacárido, grupos hexosa monosacárido, grupos pentosa-pentosa disacárido, grupos hexosa-hexosa disacárido, grupos pentosa-hexosa disacárido y grupos hexosa-pentosa disacárido. En una realización preferida, los compuestos de la presente invención tienen la Fórmula II:

2

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en la que X_{3} y X_{2} se seleccionan del grupo que consiste en un grupo ácido cólico y un grupo ácido desoxicólico, y X_{3} es un grupo sacárido.

Estos compuestos preferiblemente se utilizan en el intervalo de 0,002 a 2 mg/ml, más preferiblemente 0,02 a 2 mg/ml, lo más preferiblemente 0,2 a 2 mg/ml en las formulaciones de la invención. Lo que más se prefiere es 2 mg/ml.

La disolución salina tamponada con fosfato (PBS) es el agente solubilizante preferido para estos compuestos. No obstante, la persona con experiencia ordinaria en la técnica reconocerá que ciertos excipientes y aditivos adicionales pueden ser convenientes para lograr características de solubilidad de estos agentes para diversas formulaciones farmacéuticas. Por ejemplo, la adición de agentes solubilizantes conocidos tales como detergentes, ésteres de ácido graso, tensioactivos pueden añadirse en concentraciones adecuadas como para facilitar la solubilización de los compuestos de diversos disolventes que se han de emplear. Cuando el disolvente sea PBS, un agente solubilizante preferido será Tween 80 en una concentración de 0,15%.

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III. Productos farmacéuticos de combinación

El supresor de tumores y el antineoplásico auxiliar pueden administrarse individualmente administrando el ácido nucleico o polipéptido supresor de tumores antes del antineoplásico auxiliar (pretratamiento supresor de tumores) o administrando el antineoplásico auxiliar antes del ácido nucleico y/o polipéptido supresor de tumores (pretratamiento con fármacos contra el cáncer). Por supuesto, el ácido nucleico supresor de tumores y el antineoplásico auxiliar se pueden administrar simultáneamente.

En una realización, el ácido nucleico supresor de tumores y el antineoplásico auxiliar se administran como una única composición farmacológica. En esta realización, el ácido nucleico supresor de tumores y el antineoplásico auxiliar pueden suspenderse o solubilizarse en un único vehículo de administración homogénea. Alternativamente, el ácido nucleico supresor de tumores y el antineoplásico auxiliar pueden cada uno suspenderse o solubilizarse en diferentes vehículos de administración que, a su vez, se suspenden en un único excipiente bien al momento de la administración o continuamente. Por lo tanto, por ejemplo, un antineoplásico auxiliar se puede solubilizar en un disolvente polar (p. ej., paclitaxel en etanol) y el ácido nucleico supresor de tumores puede formar complejo con un lípido, y luego se conservan juntos en una suspensión o, alternativamente, se combinan al momento de la administración. Anteriormente en la presente se han descrito diversos vehículos de administración adecuados.

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IV. Régimen de tratamiento: terapia combinada e individual A) Régimen de tratamiento supresor de tumores

Fue un descubrimiento de la presente invención que los ácidos nucleicos supresores de tumores muestran mayor eficacia para inhibir el crecimiento del tumor cuando se administran en múltiples dosis en lugar de una dosis única. Por consiguiente, la invención provee un régimen de tratamiento para un gen supresor de tumores que comprende múltiples administraciones del ácido nucleico supresor de tumores.

El ácido nucleico supresor de tumores se puede administrar (con o son antineoplásico auxiliar) en una dosis total en el intervalo de (1 x 10^{9} a 1 x 10^{14}, aproximadamente 1 x 10^{9} a 7,5 x 10^{15}, preferiblemente aproximadamente 1 x 10^{11} 7,5 x 10^{13} partículas de adenovirus en un régimen de tratamiento seleccionado entre: la dosis total en una dosis única, la dosis total dividida en 5 días o administrada diariamente durante 5 días, la dosis total dividida en 15 días o administrada diariamente durante 15 días, y la dosis total dividida en 30 días o administrada diariamente durante 30 días. Este método de administración se puede repetir durante dos o más ciclos (más preferiblemente durante tres ciclos) y los dos o más ciclos se pueden espaciar en tres o cuatro semanas.

El tratamiento puede consistir en un solo ciclo de administración o los ciclos de administración pueden estar en el intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 12, más preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 ciclos.

El régimen de tratamiento particularmente preferido incluye la dosis total dividida en 5 días y administrada diariamente, la dosis total dividida en 15 días y administrada diariamente y la dosis total dividida en 30 días y administrada diariamente.

En algunas realizaciones preferidas, una dosis diaria en el intervalo de 7,5 x 10^{9} a 7,5 x 10^{15}, preferiblemente 1 x 10^{12} a 7,5 x 10^{15} partículas de adenovirus puede administrarse cada día por un máximo de 30 días (p. ej., un régimen de 2 días, 2 a 5 días, 7 días, 14 días o 30 días administrando la misma dosis cada día). El régimen múltiple se puede repetir en ciclos recurrentes de 21 a 28 días.

En algunas realizaciones, las diferentes rutas de administración producirán el uso en diferentes intervalos de administración preferidos. Por ejemplo, para administración arterial intrahepática, un intervalo preferidos típicamente será entre 7,5 x 10^{9} y 1 x 10^{15}, más preferiblemente 1 x 10^{11} a 7,5 x 10^{13} partículas de adenovirus por día durante 5 a 14 días. Estos regímenes pueden además incluir la administración de antineoplásicos auxiliares, FUDR o 5'-desoxi-5-fluorouridina (5'-DFUR) o hidrocloruro de irinotecan (CPT-11; 7-etil-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]carboniloxicamptotecina). Para administración intratumoral, un intervalo preferido estará típicamente entre 7,5 x 10^{9} y 1 x 10^{13}, más preferiblemente aproximadamente 1 x 10^{11} a 7,5 x 10^{12} partículas de adenovirus por día. Para administración intraperitoneal, un intervalo preferido estará típicamente entre 7,5 x 10^{9} y 1 x 10^{15}, más preferiblemente 1 x 10^{11} a 7,5 x 10^{13} partículas de adenovirus por día durante 5-10 días.

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B) Régimen de tratamiento de la terapia de combinación

Si el supresor de tumores se utiliza en combinación con un antineoplásico auxiliar, el ácido nucleico supresor de tumores se administra en una dosis total tal como se describió anteriormente. En combinación, el antineoplásico auxiliar se administra en una dosis total dependiente del agente utilizado. Por ejemplo, el paclitaxel o un derivado de paclitaxel se administra en una dosis total en el intervalo de 75-350 mg/m^{2} durante 1 hora, 3 horas, 6 horas o 24 horas en un régimen de tratamiento seleccionado del grupo que consiste en la administración en una única dosis, en una dosis administrada diariamente en el día 1 y en el día 2, en una dosis administrada diariamente en el día 1, en el día 2 y en el día 3, en una administración diaria durante 15 días, en una administración diaria durante 30 días, en una infusión continua diaria durante 15 días, en una infusión continua diaria durante 30 días. Una dosis preferida es 100-250 mg/m^{2} en 24 horas.

El pretratamiento con un antineoplásico auxiliar (p. ej., paclitaxel) antes del tratamiento con un ácido nucleico supresor de tumores potencia la eficacia del supresor de tumores. Por lo tanto, en una realización particularmente preferida, la célula, el tejido o el organismo se trata con el antineoplásico auxiliar antes del ácido nucleico supresor de tumores. El tratamiento con el antineoplásico auxiliar preferiblemente precede al tratamiento con el ácido nucleico supresor de tumores por aproximadamente veinticuatro horas, aunque son aceptables períodos más extensos o más cortos.

El pretratamiento es particularmente eficaz cuando el antineoplásico auxiliar es un compuesto de tipo paclitaxel, más preferiblemente paclitaxel o un derivado de paclitaxel. Los supresores de tumores son RB y p53, prefiriéndose más p53, en particular p53 en un vector adenovírico (p. ej., A/C/N/53).

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V. Tratamiento y profilaxis de metástasis

Como se ilustra en los Ejemplos 2 y 3, se ha demostrado que la terapia de reemplazo del gen supresor de tumores (p. ej., p53) tiene eficacia contra células tumorales humanas in vitro, xenoinjertos tumorales humanos en hospedantes inmunocomprometidos y tumores pulmonares humanos (in vivo). La citorreducción quirúrgica de tumores primarios en pacientes por lo general resulta en un recrecimiento del tumor en el sitio primario y en la metástasis tumoral de ese sitio debido a "nidos" microscópicos de células tumorales que el cirujano no logra atacar. Alternativamente, con el fin de asegurar que se extirpe todo el tumor de un sitio primario, el paciente puede someterse a una cirugía desfigurante que extirpa una gran cantidad de tejido normal que rodea el sitio del tumor primario.

En otra realización, la presente invención provee una composición para inhibir el crecimiento y/o la proliferación de metástasis (células metastásicas). Esto en general implica la administración sistémica o tópica de un supresor de tumores, más preferiblemente la administración tópica de p53 o RB.

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A) Tratamiento sistémico

Como se explica en los Ejemplos 2 y 3, el tratamiento sistémico (p. ej., inyección intravenosa) de vectores supresores de tumores (p. ej., A/C/N/53) inhibió la progresión de metástasis in vivo. Por lo tanto, en una realización, la presente invención provee composiciones para inhibir la progresión de la enfermedad metastásica administrando a un organismo un ácido nucleico supresor de tumores tal como se describió anteriormente. El supresor de tumores es preferiblemente un ácido nucleico supresor de tumores p53 y más preferiblemente un ácido nucleico p53 en un vector adenovírico (p. ej., A/C/N/53). En otra realización preferida, el ácido nucleico supresor de tumores se provee encapsulado en un liposoma o forma complejo con un lípido (véase, p. ej., Debs y Zhu (1993) WO 93/24640; Mannino y Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6(7): 682-691; Rose patente estadounidense No. 5,279,833; Brigham (1991) WO 91/06309; y Feigner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 84: 7413-7414).

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B) Tratamiento tópico

En otra realización, se prefiere la aplicación tópica del ácido nucleico supresor de tumores junto con la cirugía. En esta realización, el supresor de tumores, preferiblemente en la forma de un vector infeccioso, se aplica junto en la superficie de la cavidad de la herida después de la extirpación del tumor. Las partículas infecciosas portarán el p53 en las células tumorales residuales en el sitio de la herida, induciendo su apoptosis (muerte celular programada). Este tratamiento impactará la supervivencia del paciente a largo plazo y/o reducirá la cantidad de tejido normal que circunda al sitio del tumor, que necesita extirparse durante la cirugía.

El supresor de tumores preferiblemente se combina en una de las muchas formulaciones conocidas por los expertos en la técnica adecuada para aplicación tópica. Por lo tanto, por ejemplo, la preparación de una infección del gen supresor de tumores humano p53 (p. ej., A/C/N/53) se suspende en un vehículo adecuado (p. ej., vaselina u otra crema o ungüento) adecuado para esparcir por la superficie de la cavidad de la herida. Alternativamente, el supresor de tumores se puede preparar en un vehículo en aerosol para aplicación como una pulverización dentro de la cavidad de la herida. En otras realizaciones, el supresor de tumores se puede preparar en materiales degradables (reabsorbibles), p. ej., esponjas reabsorbibles que se pueden introducir en la cavidad de la herida y que liberan la proteína o el vector supresor de tumores en un modo dependiente del tiempo.

Las realizaciones preferidas para aplicación de vectores adenovíricos recombinantes a ciertas áreas tópicas definidas, p. ej., córnea, tubo digestivo, sitios de resección tumoral, usan vehículos sólidos para soportar un tiempo de incubación más largo y facilitar la infección vírica. Los vehículos pueden ser gasa o ungüentos embebidos con la disolución del adenovirus recombinante. El virus se puede aplicar vía el soporte de gasa a la córnea para lograr efectos transgénicos no probados. La gasa drenada puede también aplicarse en forma profiláctica a las áreas tumorales resecadas con el fin de evitar la recurrencia. Los ungüentos se pueden aplicar tópicamente a áreas del tubo digestivo o tópicamente a áreas del páncreas para terapia génica supresora de tumores.

Los vehículos con ungüento ilustrativos incluyen Puralube® a base de petróleo o KJ-Jelly® soluble en agua. En un método ilustrativo, las gasas estériles (5 x 5 cm) o tiras reactivas de flujo lagrimal se pueden embeber en una disolución del vector adenovírico (p. ej., 1 x 10^{9} PN/ml) hasta humedecer por completo. Las gasas o tiras se disponen en capas en la parte superior del tejido diana y se incuban a 37 grados C durante 30 minutos. La persona experta en la técnica reconocerá que se pueden incluir otras telas, gelatinas o ungüentos que puedan absorber o mezclarse con agua. Además, se pueden añadir otros excipientes que potencien la transferencia de genes, como se describió anteriormente.

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VI. Tratamientos de combinación con otros quimioterapéuticos A) Supresores de tumores administrados en combinación con múltiples combinaciones quimioterapéuticas

Se ha de apreciar que los usos de la presente invención no se limitan a una combinación de un supresor de tumores con un solo antineoplásico auxiliar. Si bien las composiciones típicamente son para poner en contacto una célula con un supresor de tumores (p. ej., p53) y un antineoplásico auxiliar tal como paclitaxel, las composiciones de la invención son también para poner en contacto la célula con una combinación de un gen supresor de tumores y dos, tres o una multiplicidad de antineoplásicos auxiliares y opcionalmente otros fármacos quimioterapéuticos.

En la bibliografía científica y de patentes se conocen muchos fármacos quimioterapéuticos; los fármacos ilustrativos que se pueden emplear en los métodos de la invención incluyen, aunque sin limitarse a ello: agentes que dañan el ADN (incluyendo agentes alquilantes de ADN) p. ej., cisplatino, carboplatino (véanse, p. ej., Dufrull (1997) Clin Pharmacokinet. 33:161-183); Droz (1996) Ann Oncol. 7:997-1003), navelbina (vinorelbina), Asaley, AZQ, BCNU, Busulfan, carboxiftalatoplatino, CBDCA, CCNU, CHIP, clorambucil, clorozotocin, cis-platino, clomesona, cianomorfolino-doxorubicina, ciclodisona, Citoxan, dianhidrogalactitol, fluorodopan, hepsulfam, hicantona, melfalan, metil CCNU, mitomicina C, mitozolamida, mostaza de nitrógeno, PCNU, alquilador de piperazina, piperazinadiona, pipobroman, porfiromicina, mostaza de espirohidantoína, teroxirona, tetraplatino, tio-tepa, trietilenomelamina, mostaza de uracilo y nitrógeno, Yoshi-864); inhibidores de topoisomerasa I (p. ej., hidrocloruro de topotecan, hidrocloruro de irinotecan (CPT 11), camptotecina, sal de Na de camptotecina, aminocamptotecina, CPT-11 y otros derivados de camptotecina); inhibidores de topoisomerasa II (doxorubicina, incluyendo doxorubicina encapsulada en liposomas (véanse las patentes estadounidenses Nos. 5,013,556 y 5,213,804) amonafida, m-AMSA, derivados de antrapirazol, pirazoloacridina, HCl de bisantreno, daunorubicina, desoxidoxorubicina, mitoxantrona, menogaril, N,N-dibencil daunomicina, oxantrazol, rubidazona, VM-26 y VP-16); antimetabolitos de ARN/ADN (p. ej., L-alanosina, 5-azacitidina, 5-fluorouracilo, acivicin, aminopterin, derivados de aminopterin, un antifol soluble de Baker, dicloroalil lawsona, brequinar, ftorafur (profármaco), 5,6-dihidro-5-azacitidina, metotrexato, derivados de metotrexato, N-(fosfonoacetil)-L-aspartato (PALA), pirazofurin y trimetrexato); y antimetabolitos de ADN (p. ej., 3-HP, 2'-desoxi-5-fluorouridina, 5-HP, alfa-TGDR, afidicolin glicinato, ara-C, 5-aza-2'-deosoxicitidina, beta-TGDR, ciclocitidina, guanazol, hidroxiurea, inosina, glucodialdehído, macbecin II, pirazoloimidazol, tioguanina y tiopurina). El ácido nucleico supresor de tumores puede también administrarse en combinación con agentes quimioterapéuticos tales como vincristina, temozolomida (véase, p. ej., la patente estadounidense No. 5,260,291), y toremifeno (véase, p. ej., la patente estadounidense 4,696,949 para información sobre toremifeno).

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Los estudios preclínicos en modelos animales relevantes han demostrado que el adenovirus p53 combinado con cisplatino, carboplatino, navelbina, doxorubicina, 5-fluorouracilo, metotrexato o etopósido, inhibe la proliferación celular más eficazmente que la quimioterapia sola para tratar los tumores: células de los tumores SSC-9 de cabeza y cuello, SSC-15 de cabeza y cuello, SSC-25 de cabeza y cuello, SK-OV-3 de ovario, DU-145 de próstata, MDA-MB-468 de mama y MDA-MB-231 de mama. En otra realización, se observa una eficacia antitumoral mejorada con el uso de una combinación de tres fármacos con el gen p53 (expresado, p. ej., en un vector de adenovirus), un antineoplásico auxiliar (p. ej., paclitaxel) y un agente que daña el ADN (p. ej., cisplatino). Se ha demostrado que la combinación de p53, paclitaxel y cisplatino es eficaz en un modelo de tumor ovárico. Estos datos validan la combinación de la terapia del gen p53 con quimioterapia en ensayos clínicos.

Estos otros fármacos quimioterapéuticos se pueden usar en combinación con el ácido nucleico supresor de tumores en presencia de un antineoplásico auxiliar. La presente invención también contempla el uso de radioterapia junto con los supresores de tumores anteriormente descritos combinados con un antineoplásico auxiliar.

Cuando el ácido nucleico supresor de tumores (p. ej., p53) se administra en un vector adenovírico con un antineoplásico auxiliar (p. ej., paclitaxel) y un agente que daña el ADN (p. ej., cisplatino, carboplatino o navelbina), el vector adenovírico típicamente se administra durante 5 a 14 días 7,5 x 10^{12} a 7,5 x 10^{13} partículas adenovíricas por día. Por ejemplo, se puede usar una dosis diaria de 7,5 x 10^{13} partículas adenovíricas en combinación con carboplatino. En una realización, se puede usar una dosis diaria de 7,5 x 10^{12} partículas adenovíricas para administración al pulmón.

Típicamente, el agente que daña el ADN se administrará en la dosis recomendada, véase, p. ej., Physician's Desk Reference, 51 ed. (Medical Economics, Montvale, NJ 1997). Por ejemplo, el carboplatino se administra para lograr un AUC (área bajo la curva) de 6-7,5 mg/ml/min.

VII. Células que contienen ácidos nucleicos o polipéptidos supresores de tumores heterólogos, y otros agentes

La invención también provee una célula hospedante procariótica o eucariótica transfectada o tratada de algún otro modo, por ejemplo una célula animal (p. ej., una célula mamífera) que contiene un ácido nucleico supresor de tumores heterólogo y un antineoplásico auxiliar, p. ej., paclitaxel u otro agente que afecta los microtúbulos.

Las células procarióticas adecuadas incluyen, aunque sin limitación, células bacterianas tales como células de E. coli. Las células animales adecuadas preferiblemente incluyen células mamíferas, más preferiblemente células humanas. Las células hospedantes incluyen, aunque sin limitarse a ello, cualquier célula mamífera, más preferiblemente cualquier célula neoplásica o tumoral tal como cualquiera de las células descritas en la presente memoria.

Las células hospedantes transfectadas descritas en la presente memoria son útiles como composiciones para diagnóstico o terapia. Cuando se usan farmacéuticamente, se pueden combinar con diversos vehículos farmacéuticamente aceptables, tal como se describió anteriormente para la terapia génica ex vivo. Las células se pueden administrar terapéutica o profilácticamente en las cantidades eficaces descritas anteriormente en detalle en la presente memoria.

En un contexto diagnóstico, las células se pueden usar para fines de enseñanza o de referencia, y proveer modelos adecuados para identificación de células así transfectadas y/o tratadas.

IX. Eficacia preclínica y clínica de la terapia génica de adenovirus p53

La terapia con el gen p53 mediado por adenovirus está actualmente en ensayos clínicos de fase I/II en varios países. La composición farmacéutica utilizada en estos ensayos clínicos incluye un adenovirus ilustrativo que expresa el p53 natural de la invención (rAd/p53) que consiste en un vector de adenovirus tipo 5 deficiente de replicación que expresa el gen supresor de tumores humano bajo el control del promotor de citomegalovirus ("rAd5/p53"), según se describe en la presente memoria (véase Wills (1994) supra).

Administración regional

El cáncer de ovario limitado a la cavidad abdominal es un escenario clínico en el que la terapia del gen p53 regional, es decir, la administración intraperitoneal, debe considerarse el plan de tratamiento preferido.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar, la invención reivindicada.

Ejemplo 1 Terapia de combinación con p53 y paclitaxel

La invención provee composiciones para la administración combinada de ácido nucleico que expresa un polipéptido supresor de tumores y paclitaxel en el tratamiento de neoplasmas. El siguiente ejemplo detalla la capacidad de un adenovirus que expresa p53 de la invención en combinación con paclitaxel para tratar neoplasmas, y que la terapia de combinación fue más eficaz en destruir las células tumorales que cualquiera de los agentes solo.

Terapia de combinación in vitro

Las células se sometieron a uno de tres regímenes de tratamiento: en el tratamiento I, las células se pretrataron con paclitaxel veinticuatro horas antes de la exposición al constructo de adenovirus p53 A/C/N/53. En el tratamiento dos, las células se pretrataron con el constructor de adenovirus p53 y más tarde se pusieron en contacto simultáneamente con el paclitaxel y el adenovirus p53. Por lo tanto, el Ad p53 y paclitaxel se pueden administrar dentro del mismo período de veinticuatro (24) horas o concurrentemente.

Aproximadamente 1,5 x 10^{4} células en medio de cultivo (líneas celulares de cabeza y cuello SCC-9, SCC-15 y SCC-25 en una mezcla 1:1 de DMEM 4- medio Ham F12 con 0,4 \mug/ml Cortisol y 10% FBS y 1% aminoácidos no esenciales, DU-145 de próstata y SK-OV-3 de ovario en medio esencial Eagles más 10% FBS) se añadieron a cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos y se cultivaron durante aproximadamente 4 horas a 37ºC y 5% CO_{2}. El fármaco paclitaxel, el adenovirus p53 o el vehículo/tampón apropiado se añadieron a cada pocillo. Ya que paclitaxel no es soluble en agua, el fármaco se disolvió en alcohol etílico antes de la administración. Las células se cultivaron luego toda la noche a 37ºC y 5%CO_{2}. Se administraron los adenovirus p53 en tampón de fosfato (NaH_{2}PO_{4} 20 mM, pH 8,0, NaCl 130 mM, MgCl_{2}2 mM, 2% sacarosa).

Se cuantificó luego la muerte celular de acuerdo con el método de Mosmann (1983) J. Immunol. Meth., 65: 55-63. En síntesis, se añadieron aproximadamente 25 \mulde 5 mg/ml tintura vital MTT [bromuro de 3-(4,5 dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio] a cada pocillo y se dejó incubar durante 3-4 horas a 37ºC y 5% CO_{2}. Luego se añadieron 100 \mul de detergente SDS al 10% a cada pocillo y se dejó incubar durante la noche a 37ºC y 5% CO_{2}. La señal de cada pocillo se cuantificó luego usando una lectora de placas de microtitulación Molecular devices (Thermo-Max). Las líneas celulares particulares utilizadas y los resultados allí obtenidos se exponen en la Tabla 1.

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TABLA 1 Evaluación in vitro del antineoplásico auxiliar paclitaxel combinado con ácido nucleico supresor de tumores

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En general, el adenovirus p53 fue más eficaz cuando se añadió después o concurrentemente con el paclitaxel que cuando se añadió primero. Estos resultados sugieren una interacción sinérgica entre A/C/N/53 y paclitaxel.

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El análisis de isobolograma establece un efecto sinérgico.

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Se trataron células de tumor de ovario SK-OV-3 (p53 nulo) con combinaciones de paclitaxel y p53/adenovirus (A/C/N/53) según se ilustra en la Tabla 2. La administración se realizó como se describió anteriormente. La muerte celular se cuantificó en el día 3 usando el ensayo MTT según se describió antes. Además, se generó una curva de dosis y respuesta para Ad p53 solo (usando las dosis mencionadas en la Tabla 2) (después de una exposición celular de 2 días al fármaco) y se generó una curva de dosis y respuesta para paclitaxel solo, usando las dosis anteriormente mencionadas (exposición celular de 3 días al fármaco).

TABLA 2 Grupos de tratamiento para tratamientos combinados de paclitaxel y Ad p53 (A/C/N/53)

3

La Figura 1 ilustra la inhibición de la proliferación celular (según lo comparado con el tampón control) como una función del tratamiento. En general, el aumento de la dosis bien de paclitaxel o de p53 disminuyó el índice de proliferación celular con la combinación de p53 y paclitaxel, produciendo mayor efecto que cualquiera de los fármacos solo.

La Figura 2 ilustra un análisis de isobolograma de estos datos que usa el método de Isobole según lo revisado por Berenbaum (1989) Pharmacol. Rev. 93-141. Se observó sinergia entre el paclitaxel y p53 (A/C/N/53) cuando las células se pretrataron 24 horas antes del tratamiento con p53 (A/C/N/53). En la Figura 2, la línea recta (isobole para ED_{30}) representa los efectos sobre la proliferación celular que se esperarían si el tratamiento con los dos fármacos fuese puramente aditivo. De hecho, los efectos observados caen en la parte inferior izquierda de la línea isobole, indicando que fueron necesarias concentraciones inferiores a las pronosticadas de cada fármaco y que ocurrió una interacción sinérgica entre los dos fármacos.

Ejemplo comparativo 2

Terapia génica mediada por el adenovirus p53 contra metástasis

La invención provee composiciones para la administración de ácido nucleico que expresa un polipéptido supresor de tumores en el tratamiento de metástasis. El siguiente ejemplo detalla la capacidad de un adenovirus que expresa p53 de la invención para infectar diversos tejidos en el cuerpo y para tratar metástasis.

Se inyectaron ratones scid hembra (ratones homocigóticos ya que la mutación SCID carece de células T y B debido a un defecto en la recombinación V(D)J) con 5 x 10^{6} MDA-MB-231 células de carcinoma de mama en sus panículos adiposos mamarios. Después de que los tumores primarios se habían consolidado y habían tenido tiempo de formar metástasis en los pulmones, los tumores primarios se extirparon quirúrgicamente (en el día 11). Los ratones se trataron con A/C/N/53 intravenoso o con tampón de control en los días 23, 30, 37, 44 (1qW) con tampón de control o con A/C/N/53 (p53 en un adenovirus) a 4 x 10^{8} C.I.U./inyección. En el día 49, se cosecharon los pulmones, se fijaron, se tiñeron y se examinaron microscópicamente.

Los resultados se ilustran a continuación en la Tabla 3.

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TABLA 3 Inhibición de metástasis de pulmón MDA-MB-231 usando A/C/N/53

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El tratamiento con A/C/N/53 disminuyó la cantidad de metástasis en los ratones que las tenían.

En un segundo experimento, se administraron inyecciones peritumorales de A/C/N/53a 231 tumores en los panículos adiposos mamarios de ratones scid o scid-beige. Una dosis total de 2-4 x 10^{9} C.I.U. administrada en 10 inyecciones disminuyó la cantidad de ratones con metástasis pulmonar por 80% en ratones scid y 60% en ratones scid-beige. Además, la cantidad de metástasis por ratón se redujo significativamente y hubo ratones sin ningún tumor en absoluto. Como se indicó anteriormente, el tratamiento con Ad p53 redujo significativamente la cantidad de metástasis por pulmón, en comparación con los grupos tampón y Ad beta-gal (p< 0,001 y p< 0,002, respectivamente). Además de la reducción en la cantidad de metástasis, hubo también una importante reducción en el tamaño del pulmón en el grupo de Ad p53. En los grupos de control, las secciones de tejido de la mayoría de los pulmones estuvieron > 50% ocupadas por tejido neoplásico y ya no se reconocieron tumores individuales en grandes áreas de los pulmones. En cambio, las metástasis pulmonares en la mayoría del grupo Ad p53 fueron pequeñas y fácilmente distinguibles como tumores individuales.

Distribución de tejido de adenovirus

Los tejidos hepáticos tuvieron la cantidad más alta de células infectadas (aproximadamente 50%) y la actividad de beta-galactosidasa fue intensa. En el pulmón, se observaron placas diseminadas de células infectadas uniformemente distribuidas en todo el tejido. Los intestinos y el estómago tuvieron infección periódica de las células en la pared de músculo liso externa que rodea los órganos. Hubo también actividad de beta-galactosidasa en microvellosidades diseminadas a lo largo del lumen. La pared de músculo liso externa que rodea el útero tuvo infección periódica de las células similar a aquella observada en los intestinos. La mayoría de las células estromales en el ovario estuvieron infectadas. El bazo había distribuido actividad de beta-galactosidasa en los componentes de músculo liso del órgano. Hubo muy pocas células infectadas (< 1%) dentro del volumen principal de músculo cardíaco estriado. Prácticamente no hubo células infectadas en los tumores primarios en el panículo adiposo mamario ni en el músculo estriado subyacente. No hubo células infectadas en el riñón.

Patología hepática

Todos los hígados se observaron macroscópicamente normales en la autopsia. No hubo necrosis evidente en ningún hígado. No obstante, los ratones tratados con adenovirus tuvieron anormalidades hepatocelulares (no presentes en el grupo tampón) que incluyeron cantidades elevadas de células en mitosis, inclusiones celulares y cambios en el tamaño y la forma de los hepatocitos.

Ejemplo comparativo 3

Terapia génica mediada por adenovirus p53 contra xenoinjertos de cáncer de mama humano

La invención provee composiciones para el tratamiento de diversos tipos de cáncer mediante la administración de ácido nucleico que expresa un polipéptido supresor de tumores. El siguiente ejemplo detalla la capacidad de un adenovirus que expresa p53 de la invención para tratar cáncer de mama humano.

La introducción de p53 natural con tumores con p53 nulo o mutante ofrece una nueva estrategia para controlar el crecimiento tumoral. Casey (1991) Oncogene 6: 1791-1797, introdujo p53 natural en células cancerosas mamarias in vitro vía un vector de ADN plásmido. La cantidad de colonias de MDA-MB-468 (p53^{mut}) y T47D (p53^{mut}) que surgen después de la transfección de plásmidos se redujo en un 50% por el p53 natural. Además, ninguna de las colonias resultantes expresó el transfectante de p53 natural. En cambio, la cantidad de colonias de MCF-7 (p53wt) no se vio afectada. Negrini (1994) Cancer Res. 54: 1818-1824, realizó un estudio similar usando células MDA-MB-231. La formación de colonias se redujo en un 50% por transfección con un plásmido que contiene p53 natural, y ninguna de las colonias resultantes expresó p53 natural. Paradójicamente, en este estudio se observaron resultados similares con células MCF-7.

En el estudio descrito en este ejemplo, se ensayó la eficacia de un adenovirus p53 deficiente de replicación, recombinante con la región El eliminada (Ad p53; (A/C/N/53) Wills (1994) supra) contra tres líneas celulares de cáncer de mama que expresan p53 mutante, MDA-MB-231, MDA-MB-468 y MDA-MB-435. Las células MDA-MB-231 portan una mutación Arg-a-Lys en el codón 280 del gen p53 (Bartek (1990) Oncogene 5: 893-899). Las células MDA-MB-468 portan una mutación Arg-a-His en el codón 273 (Id.). Las células MDA-MB-435 portan una mutación Gly-a-Glu en el codón 266 del gen p53 (Lesoon-Wood (1995) Hum. Gene Ther. 6:395-405).

Los estudios previos han demostrado altos niveles de expresión de p53 natural en células de tumores de mama, ovario, pulmón, colorrecto, hígado, cerebro y vejiga humanos después de la infección con Ad p53 in vitro (Wills (1994) supra., Harris et al. (1996) Cancer Gene Therapy 3: 121-130). La expresión de p53 mediada por adenovirus en último lugar produjo cambios en la morfología celular y la inducción de apoptosis en células tumorales con p53 mutante o p53 nulo. La infección de 468 células con cáncer de mama por Ad p53 a 10 m.o.i. (multiplicidad de infección) causó casi el 100% de la inhibición de la síntesis de ADN a las 72 horas de la infección. Además, la infección con Ad p53 in vitro inhibió la proliferación de células MDA-MB-468 y MDA-MB-231 con valores ED_{50} de 3\pm2 y 12\pm 10 m.o.i., respectivamente. La proliferación de otras tres líneas de carcinoma de mama de p53 mutante se inhibió también en bajas concentraciones de Ad p53. Los valores ED_{50} fueron 16\pm4 m.o.i. para células SK-BR-3, 3\pm3 m.o.i. para células T-47D y 2+2 m.o.i. para células BT-549. La infección de células MDA-MB-468 y MDA-MB-231 con 30 m.o.i. de una beta-galactosidasa de E. coli que expresa adenovirus equivalente, recombinante (beta-gal), en lugar de p53, produjo >67% de células beta-gal positivas MDA-MB-468 y 34-66% de células beta-gal positivas MDA-MB-231. Al correlacionar el porcentaje de células positivas beta-gal con los efectos antiproliferativos de p53 en un gran panel de células tumorales con p53 alterado, Harris et al. (supra.) demostraron una fuerte correlación positiva entre el grado de inhibición inducida por p53 y el grado de transducción de adenovirus. En contraste, las líneas celulares que expresan niveles normales de p53 natural estuvieron mínimamente afectadas por la transducción de p53, independiente del índice de transducción de adenovirus.

La proliferación de células MCF7 y HBL-100, dos líneas celulares mamarias humanas que contienen p53 natural, estuvo relativamente no afectada por concentraciones de Ad p53 mayores o iguales a 99 m.o.i. in vitro. En otros términos, la inhibición del crecimiento de células MCF-7 y HBL-100 requirió concentraciones de Ad p53 por lo menos 8 y 33 veces mayores que los valores ED_{50} para las células -231 y -468, respectivamente. Usando un Ad p53 recombinante similar, Katayose (1995) Clin. Cancer Res. 1:889-897, demostró un aumento en la expresión de la proteína p53, una disminución de la proliferación celular y un aumento de la muerte celular apoptótica en células -231 transducidas in vitro. Este estudio extiende estos resultados in vitro con células -468 y -231 a xenoinjertos de cáncer de mama in vivo. La eficacia de la terapia con el gen p53 mediado por adenovirus se evalúa en otra línea celular de cáncer de mama (MDA-MB-435) que es resistente a la transducción del adenovirus in vitro.

Materiales y métodos Líneas celulares e infecciones de adenovirus in vitro

Las líneas celulares de cáncer de mama humano MDA-MB-231, -468 y -435 se obtuvieron de ATCC (Rockville, Maryland, EE. UU.). Las células -231 se cultivaron en DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY) con suero de ternero fetal al 10% (FCS; Hyclone, Logan, Utah) a 37ºC y 5% CO_{2}. Las células -468 se cultivaron en medio L-15 de Leibovitz (Life Technologies) que contenía 10% FCS a 37ºC. Las células -435 se cultivaron en medio L-15 de Leibovitz con 15% FCS y 10 \mug/ml insulina bovina (Sigma Chem. Co., St. Louis, Missouri) a 37ºC.

La construcción y propagación de los adenovirus recombinantes (rAd) que expresan p53 natural humano y beta-galactosidasa (beta-gal) de E. coli, donde la expresión transgénica es dirigida por el promotor de citomegalovirus humano, se han descrito previamente (Wills (1994) supra). Los adenovirus se administraron en tampón de fosfato (NaH_{2}PO_{4} 20 mM, pH 8, NaCl 0,130 mM, MgCl_{2} 2 mM, 2% sacarosa). C.I.U. se define como las unidades celulares infecciosas. La concentración de partículas víricas infecciosas se determinó midiendo las 293 células que son positivas para la proteína del hexón vírico después de un período de infección de 48 h (Huyghe (1995) supra).

Para estudios de infección in vitro con Ad p53, las células se dispusieron en placas a una densidad de 1-5 x 10^{4} células/pocillo en placas de cultivo de tejido de 12 pocillos (Becton Dickinson, Lincoln Park, New Jersey, EE. UU.). Las células transdujeron con 0, 10 ó 50 m.o.i. (multiplicidad de la infección = C.I.U./célula) de Ad p53 y se cultivaron durante 72 h como se describió previamente (Wills (1994) supra.). Para estudios de infección in vitro con Ad beta-gal, las células se dispusieron en placas a una densidad de 1 x 10^{5} células/pocillo. Las células se transdujeron con 0, 10, 50 ó 100 m.o.i. de Ad beta-gal. Después de 48 horas, las células se fijaron con 0,2% glutaraldehído (Sigma Chemical Co.), luego se lavaron 3 veces con PBS (Life Technologies). Las células se ensayaron luego en 1 ml de disolución X-Gal [MgCl_{2} 1,3 mM, NaCl 15 mM, tampón Hepes 44 mM, pH 7,4, ferricianuro de potasio 3 mM y 1 mg/ml X-Gal en N,N-dimetilformamida (10% conc. final)]. X-Gal se adquirió de Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Indiana. Todas las demás sustancias químicas se adquirieron de Sigma.

Para determinar el porcentaje de células transducidas, se contaron 5 campos de microscopios de cada pocillo de cultivo y el porcentaje promedio que expresaba beta-galactosidasa se calculó para 3 pocillos en cada m.o.i.

Tratamiento de adenovirus in vivo

Se adquirieron ratones atímicos, lampiños, hembra de Charles River Laboratories (Wilmington, Massachusetts, EE. UU.). Todos los ratones se mantuvieron en una instalación con barrera libre de anticuerpos víricos (VAF) y todos los procedimientos animales se realizaron de acuerdo con las normas expuestas en la N.I.H. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Se inyectaron células tumorales subcutáneamente o al panículo adiposo mamario.

Las inoculaciones de células fueron: 5 x 10^{6} -231 células/ratón, 1x 10^{7} MDA-MB-468 células/ratón o 1 x 10^{7} MDA-MB-435 células/ratón. Se dejaron crecer los tumores in vivo durante 10-11 días antes de comenzar la administración, excepto por un experimento de -468 en el que los tumores se desarrollaron durante 33 días antes de comenzar el tratamiento. El volumen del tumor se calculó como el producto de las mediciones en tres dimensiones. Los volúmenes de los tumores para diferentes grupos de tratamiento en cada día se compararon por la prueba t de Student usando el software Statview II (Abacus Concepts, Berkeley, California). Las inhibiciones en porcentaje promedio para los grupos que recibieron la administración en los días 0-4 y 7-11 se calcularon usando valores significativos (p<0,05) desde el día 14 hasta el final del estudio.

Los efectos específicos de p53 se distinguieron de los efectos del vector de adenovirus sustrayendo la inhibición del crecimiento del tumor promedio provocada por Ad beta-gal de la inhibición del crecimiento provocada por Ad p53. Todas las inyecciones de virus fueron peri/intra-tumorales. En general, se administraron cursos de 5 días de terapia para tumores (es decir, 5 inyecciones) a cada ratón, separadas por un "período de reposo" de 2 días. En algunos casos, este régimen de administración se extendió por más de 2 semanas y/o se sustituyó el virus por vehículo tampón para algunas inyecciones. Las curvas de crecimiento del tumor muestran el error estándar de la media del volumen del tumor.

Histología e inmunohistoquímica Apoptag

Se fijaron muestras de tejido en formalina tamponada al 10% y se procesaron durante la noche en un procesador de tejido Miles VIP, luego se embebieron en parafina. Se cortaron cinco secciones micrométricas de tejido con un micrótomo Leitz. Los cortes se tiñeron con un tinte de rutina Harris de hematoxilina eosina (Luna et al. (1968), Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. New York: McGraw Hill Book Co.).

Los kits de detección de apoptosis apoptag in situ se adquirieron de Oncor (Gaithersburg, Maryland, EE. UU.). Las muestras se ensayaron según las instrucciones del kit. En síntesis, las secciones de tejido desparafinizadas y rehidratadas se trataron con enzima que digiere la proteína Oncor, se incubaron con TdT y se revelaron usando un kit de avidina-peroxidasa (IgG de conejo - Sigma Chem. Co. ^{#}EXTRA-3) y DAB (Vector Lab. ^{#}SK4100). Los cortes se contratiñeron con verde metilo.

Ensayo de beta-galactosidasa

Los tumores se embebieron en TBS (Triangle Biomedical Sciences, Durham, North Carolina, EE. UU.) y se congelaron rápidamente en un baño de 2-metilbutano/hielo seco. Las secciones de tejido congeladas (8 \mum de espesor) se fijaron en 0,5% glutaraldehído a 4ºC durante 5 min y luego se ensayaron para expresión de beta-gal como se describió anteriormente.

Análisis FACS de integrina

Las células se suspendieron por tratamiento con 0,02% EDTA, se sedimentaron y luego se lavaron 2X con PBS. Las células se suspendieron luego a una concentración de 1 x 10^{6} células/ml y se incubaron con anticuerpos primarios (conc. final l:250/ml) a 4ºC durante 1 h. Las suspensiones celulares se lavaron 2X con PBS para eliminar el anticuerpo primario excesivo. Las células se incubaron luego con anticuerpo auxiliar anti-ratón de conejo conjugado con FITC (conc. final 1:250/ml, Zymed) a 4ºC durante 1 h. Las células se lavaron como antes con PBS y se analizaron inmediatamente. Se midió la fluorescencia con un citómetro de flujo FACS Vantage (Becton Dickinson, Mountain View, California, EE. UU.). La dispersión frontal y la dispersión lateral se determinaron simultáneamente, y todos los datos se recogieron con un ordenador Hewlett Packard equipado con un software de investigación FACS (Becton.Dickenson). Los anticuerpos primarios utilizados para detectar los receptores de integrina se obtuvieron de los siguientes proveedores: anti-alfa_{v}, (12084-018, Gibco BRL); anti-beta_{3} (550036, Becton Dickenson); anti-alfa_{v}beta_{3} (MAP1976, Chemicon); anti-beta_{1}, (550034, Becton Dickenson); y anti-alfa_{v}beta_{5} (MAB 1961, Chemicon).

Resultados Eficacia de la transducción de adenovirus e inhibición del crecimiento de p53 in vitro

Las células -231 y -468 fueron ambas altamente transducidas in vitro a un m.o.i. de 10. En contraste, las células -435 se transdujeron en casos excepcionales, incluso a 100 m.o.i. Para células -231, 8% (10 m.o.i.), 46% (50 m.o.i.) y 62% (100 m.o.i.) de las células fueron transducidas por Ad beta-gal. Para células 468, 78% (10 m.o.i.), 84% (50 m.o.i.) y 97% (100 m.o.i.) de las células fueron transducidas por Ad beta-gal. Para células 435, 0,5% (10 m.o.i.), 1% (50 m.o.i.) y 1,3% (100 m.o.i.) de las células fueron transducidas por Ad beta-gal.

La infección con 50 m.o.i. Ad p53 produjo la muerte celular casi completa en los cultivos celulares 231 y 468. En cambio, el Ad p53 no tuvo un efecto detectable sobre el crecimiento de las células 435.

Eficacia de Ad p53 contra xenoinjertos de cáncer de mama humano

La terapia del gen p53 mediado por adenovirus fue altamente eficaz contra los xenoinjertos -231 y -468 (Fig. 3a y 3b). En el experimento de 231, 1 ratón del grupo Ad beta-gal y 3 ratones del grupo Ad p53 estuvieron libres de tumores al final del estudio, y todos los tumores regresaron durante el tratamiento con Ad p53. La inhibición del crecimiento del tumor -231 promedió 86% (p\leq0,01). El componente de inhibición del crecimiento debido a p53 promedió 37%, mientras que la inhibición específica del adenovirus promedió 49% (p\leq0,01). La inhibición del crecimiento del tumor -468 promedió 74% (p\leq0,001). Un ratón del grupo Ad p53 estuvo libre de tumores al final del estudio y todos los tumores regresaron durante el tratamiento con Ad p53. El componente de inhibición del crecimiento debido a p53 promedió 45% (p<0,001), mientras que la inhibición específica del adenovirus promedió 28% (p\leq0,05). No se observaron efectos colaterales en ninguno de los experimentos. Los valores ED_{50} para la inhibición del crecimiento de los tumores -231 y -468 fueron 3 x 10^{8} C.I.U. (unidades celulares infecciosas) y 2 x 10^{8} C.I.U., respectivamente (Fig. 4). Los tumores -435 fueron casi completamente resistentes al tratamiento con Ad p53 (Fig. 3c). La inhibición del crecimiento en los grupos del tumor 435 tratados con adenovirus no fue significativa.

La Figura 5 muestra una comparación de la eficacia de los dos regímenes de administración de Ad p53 contra los tumores -231. A ratones AH se les administraron 5 inyecciones peritumorales por semana. Los ratones AH tratados con el agente terapéutico (Ad p53) recibieron un total de 2,2 x 10^{9} C.I.U./ratón por semana. Un grupo recibió una sola inyección intravenosa que contenía toda la dosis de adenovirus de la semana. Las otras 4 inyecciones para la semana consistían en un tampón vehículo (grupo IX). El otro grupo tratado recibió la misma dosis de Ad dividida en cinco inyecciones por semana (grupo 5X). Este régimen de administración se proporcionó durante las semanas 1 y 3 (días 0-4, 14-18). La inhibición del crecimiento promedió 73% para el grupo 5X (p-<0,01), pero solamente 44% para el grupo IX (p<0,05 para las primeras tres semanas del estudio, no significativo después del día 21). El primer ciclo de terapia con el gen p53 fue más eficaz que el segundo ciclo. Después del primer ciclo de terapia, 4 ratones del grupo IX, 5 ratones del grupo 5X y 1 ratón del vehículo de control estuvieron libres de tumores. Un ratón del grupo 5X tuvo recidiva con un tumor muy pequeño alrededor del día 21. No se observaron otras "curas" después del segundo ciclo de terapia.

La Figura 6 muestra un experimento que usa tumores 468 que inicialmente eran 4 veces más grandes que los tumores 468 que se muestran en la Fig. 3b, tratados con una dosis 10 veces menor de adenovirus. Se administró una dosis total de 2,2x 10^{8} C.I.U. Ad p53/ratón por semana. Un grupo recibió una única inyección intravenosa del virus, seguida de 4 inyecciones de tampón por semana (grupo IX). El otro grupo tratado recibió la misma dosis vírica dividida en cinco inyecciones por semana (grupo 5X). Estos esquemas de administración se proporcionaron durante 6 semanas. La dosis vírica total administrada durante 6 semanas fue aproximadamente la mitad de la dosis utilizada en la Fig 3.

Este régimen de administración produjo un efecto citoestático en el volumen del tumor en los ratones tratados con Ad p53 (p\leq0,05). Los tratamientos suministrados temprano en el estudio parecieron ser más eficaces que aquellos suministrados durante las semanas posteriores. Un ratón del grupo 5X estuvo libre de tumores alrededor del día 21. No obstante, cuando se comparó la inhibición del crecimiento del tumor en todos los ratones, el régimen de administración IX (60%) fue levemente, pero no significativamente, más eficaz que el régimen 5X (55%). Alrededor de una semana después del final de la administración, el índice de crecimiento del tumor en el grupo 5X comenzó a aumentar. Un mes después del comienzo del estudio, los tumores del vehículo de control comenzaron a necrosarse y el crecimiento llegó a la meseta.

Infectividad in vivo después de la exposición repetida al adenovirus

Al final de los estudios que se muestran en las Figuras 5 y 6, a algunos tumores se les inyectó Ad beta-gal. Estos tumores se cosecharon 24 h después y las secciones de tejido congeladas se ensayaron para expresión de beta-galactosidasa. Los tumores tratados con Ad p53 durante 2 ó 6 semanas fueron todavía transducidos por Ad beta-gal, aunque la transducción fue la más baja en los tumores -468 tratados durante 6 semanas con Ad p53 5X por semana. Las secciones de únicamente 1 de los 3 tumores -468 inyectados del grupo 5X tenían células que expresaban beta-galactosidasa.

Inducción de apoptosis in vivo por Ad p53

Los xenoinjertos de cáncer de mama MDA-MB-231 y MDA-MB-468 en ratones lampiños se inyectaron con 1-5 x 10^{8} C.I.U. de Ad p53 o tampón 48 a 72 h antes de la cosecha. La inducción de apoptosis por Ad p53 se ensayó usando inmunohistoquímica Apoptag en las secciones de tejido. Los tumores a los que se le inyectó Ad p53 tuvieron áreas de apoptosis extensa a lo largo de el o los trayectos de las agujas de tumores inyectados intratumoralmente y alrededor del borde externo de los tumores inyectados peritumoralmente. En contraste, los tumores inyectados con tampón tuvieron únicamente unas pocas células apoptóticas diseminadas, según lo esperado.

Comparación de expresión de integrina en células MDA-MB-231 y MDA-MB-435

El análisis FACS de expresión de integrina se realizó en células MDA-MB-231 y MDA-MB-435 para determinar si la baja transducción de Ad de células MDA-MB-435 se debió a una deficiencia en las integrinas alfa_{v} necesarias para internalización de Ad de tipos 2, 3 y 4 (Wickham et al, (1993) Cell, 73: 309-319; Wickham et al. (1994) J. Cell Biol., 127: 257-264; y Mathias et al. (1994) J. Virol. 68: 6811-6814). Ambos tipos celulares expresaban restos integrina alfa_{v}, alfa_{v}beta_{3}, alfa_{v}beta_{1} y beta en aproximadamente los mismos niveles. La expresión de integrina alfa_{v}beta_{3} y beta_{3} fue mayor en células MDA-MB-435 que en células MDA-MB-231.

Análisis: cuando se administró una dosis total de 2,2 x 10^{9} C.I.U. de Ad p53 en 10 inyecciones, la inhibición del crecimiento del tumor fue de 74% para tumores MDA-MB-468 y de 86% para tumores MDA-MB-231, pero no fue significativa para tumores MDA-MB-435. En tumores MDA-MB-468, 61% de la respuesta total fue específica de p53, mientras que en tumores MDA-MB-231, 43% de la respuesta total fue específica de p53. La capacidad de Ad beta-gal para transducir células MDA-MB-231, MDA-MB-468 y MDA-MB-435 in vitro en general pronosticó los resultados in vivo. En las mismas concentraciones del virus, las células -468 tuvieron un índice de transducción levemente mayor que las células MDA-MB-231, mientras que las células MDA-MB-435 fueron resistentes a la transducción de adenovirus. Los resultados de MDA-MB-435 in vitro se correlacionaron con la respuesta muy deficiente in vivo.

El tratamiento sistémico de ratones lampiños que portan tumores MDA-MB-435, con un vector de liposoma p53, ha demostrado que causa la inhibición del crecimiento del tumor y, en algunos casos, la recesión (Lesoon-Wood et al. (1995) Hum. Gene Ther., 6: 395-405). El tratamiento con liposoma p53 también redujo la cantidad de metástasis pulmonar. Estos resultados demuestran que la falta de respuesta del tumor MDA-MB-435 al tratamiento con Ad p53 en este estudio no se debió a una incapacidad del p53 de inhibir el crecimiento y la metástasis de tumores MDA-MB-435. En cambio, estos resultados sugieren que fue la baja eficacia de la transducción del adenovirus de las células MDA-MB-435 lo que causó la falta de respuesta al tratamiento con Ad p53.

Las integrinas alfa_{v} se han implicado como elementos celulares requeridos para la internalización eficiente de los adenovirus de tipo 2, 3 y 4 (Wickham (1993) supra.; Wickham (1994) supra.; y Mathias (1994) supra.). Es probable que las integrinas alfa_{v} cumplan la misma función para el Ad tipo 5. Wickham et al (1994) supra., observaron una internalización 5-10 veces mayor de un adenovirus recombinante tipo 5 en células transfectadas con alfa_{v}beta_{5} en comparación con células que carecen de expresión de alfa_{v} o transfectadas con alfa_{v}beta_{3}. Las células -293 de riñón embrionario humano utilizadas para la producción del Ad p53 utilizado en la presente memoria expresan integrinas alfa_{v}beta_{1}, pero no integrinas alfa_{v}beta_{3} (Bodary (1990) J. Biol. Chem. 265: 5938-5941). Por lo tanto, parece prudente medir la expresión de células -435 de las subunidades de integrina alfa_{v}, beta_{1}, beta_{3} y alfa_{5}. Tanto las células MDA-MB-231 y MDA-MB-435 expresaron niveles aproximadamente equivalentes de las moléculas de la familia de integrinas. Por consiguiente, la falta de transducción de Ad de las células MDA-MB-435 no se debe a una deficiencia en la expresión de integrina alfa_{5}. Actualmente, no existe bibliografía sobre la identidad del receptor celular requerido para unión de Ad a células diana. Es posible que las células MDA-MB-435 sean deficientes en este receptor o que algún otro componente requerido para unión vírica, internalización o expresión génica sea defectuoso.

La eficacia continuada del Ad p53 en múltiples ciclos de terapia se examinó en modelos de tumores MDA-MB-231 y MDA-MB-468; parece ser que la eficacia disminuye con la administración continua, no obstante, este efecto debe ser examinado en más detalle. La teoría predominante sostiene que la infección con adenovirus genera una rápida respuesta inflamatoria y citolítica mediada por células T citotóxicas en hospedantes con sistemas inmunitarios totalmente funcionales (revisado por Wilson (1995) Nature Med. 4: 887-889). Esta respuesta de las células T es estimulada por los antígenos del adenovirus producidos en las células hospedantes y presentados junto con los restos MHC en la superficie celular. Los anticuerpos neutralizantes específicos de células transducidas por el adenovirus se producen más tarde en la respuesta inmunitaria y se cree que son responsables de la capacidad reducida para reinfectar las células hospedantes con el adenovirus después de las inoculaciones iniciales. Los ratones atímicos lampiños utilizados en estos estudios tienen una respuesta inmunitaria defectuosa de las células T a los antígenos exógenos, pero son capaces de generar una respuesta de los anticuerpos mediados por las células B (Boven (1991) The Nude Mouse in Oncology Research. Boston: CRC Press). La producción de anticuerpos anti-adenovirus neutralizantes podría explicar la eficacia reducida de la terapia con el adenovirus p53 (Ad p53) con el transcurso del tiempo en los estudios actuales. La función inmunitaria obstaculizada en ratones lampiños y el riego sanguíneo deficiente al interior de los xenoinjertos de tumor podrían explicar la eficacia parcial del Ad p53 incluso después de 6 semanas de administración y la capacidad de infectar algunas células tumorales con Ad beta-gal incluso después de inyecciones repetidas de Ad p53.

Además del cáncer de mama, se ha tratado una diversidad de otros tipos de cáncer con los adenovirus recombinantes que expresan p53 natural. Estos informes incluyen modelos de cáncer cervical (Hamada (1996) Cancer Res. 56: 3047-3054), cáncer de próstata (Eastham (1995) Cancer Res. 55: 5151-5155), cáncer de cabeza y cuello (Clayman (1995) Cancer Res. 55: 1-6), cáncer de pulmón (Wills (1994) supra.), cáncer de ovario (13), glioblastoma (27, 28) y cáncer colorrectal (13, 29). Colectivamente, estos datos validan las investigaciones clínicas en curso que evalúan los efectos de la terapia con el gen p53 mediado por adenovirus. Los resultados presentes demuestran la capacidad del p53 natural de reducir el crecimiento de células cancerosas in vivo en xenoinjertos de cáncer de mama que expresan p53 mutante. Los estudios presentes también confirman que el adenovirus parece ser un vehículo de administración eficaz para el 53 cuando las células diana expresan el receptor o "receptores" víricos apropiados.

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Ejemplo comparativo 4

Otras investigaciones del régimen de tratamiento sobre la inhibición del tumor

La invención provee composiciones para el tratamiento de diversos tipos de cáncer mediante la administración de ácido nucleico que expresa un polipéptido supresor de tumores, usando diversos regímenes de administración. El siguiente ejemplo detalla el aumento de la eficacia de la administración en dosis divididas del adenovirus que expresa p53 de la invención.

Con el fin de investigar el efecto de un régimen de una sola dosis en comparación con un régimen de dosis divididas administradas en un período de tiempo, los ratones scid a los que se les habían inyectado tumores MDA-MB-468 y MDA-MB-231 se trataron con una dosis total por ratón de 1 x 10^{9} I.U de Ad p53. (A/C/N/53) administrada como una única inyección intravenosa o dividida en 3 ó 5 inyecciones una vez al día durante el curso de una semana (se indica con flechas en la Fig. 7).

Los resultados obtenidos con tumores MDA-MB-468 fueron similares a aquellos obtenidos con tumores MDA-MB-23 y se ilustran en las Figuras 7a, 7b y 7c. En general, las dosis divididas inhibieron el crecimiento del tumor mejor que las inyecciones intravenosas únicas, teniendo el régimen de 5 inyecciones una mejora significativa en comparación con el régimen de 3 inyecciones.

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Ejemplo 5 La dexametasona silencia la inhibición del crecimiento del tumor asociada con la respuesta inmunitaria del anti-adenovirus mediado por células NK

Se ha demostrado que la administración repetida de vectores de adenovirus puede inducir una respuesta inmunitaria anti-adenovirus. Para investigar si las propiedades inmunosupresoras de bajas dosis de dexametasona (Dex) pueden inhibir la respuesta inmunitaria anti-adenovirus (p. ej., respuesta de células NK), se trataron tumores MDA-MB-231 en ratones scid con el virus recombinante de la invención en ausencia y en presencia de dexametasona.

Se inyectaron aproximadamente 5 x 10^{6} MDA-MB-231 células/ratón en los panículos adiposos mamarios de ratones scid hembra en el día 0. En el día 11, se implantaron pelets de dexametasona o placebo subcutáneamente. Los pelets de 5 mg se diseñaron para liberar 83,3 \mug de dexametasona por día continuamente durante 60 días (Innovative Research of America, Sarasota, FL). Todos los ratones recibieron un total de 10 inyecciones peritumorales aplicadas una vez al día en los días 14-18 y 21-25 (0,1 ml por inyección). La dosis total del virus fue de 2 x 10^{9} C.I.U./ratón (Ad p53 (A/C/N/53 o Ad beta-galactosidasa). Los tratamientos se enumeran en la Tabla 5.

TABLA 5 Tratamiento de tumores MDA-MB-231 en ratones scid

6

El tratamiento con bajas dosis de dexametasona no tuvo un efecto significativo sobre el índice de crecimiento de los tumores MDA-MB-231 en ratones scid (p > 0,05). No se observaron efectos colaterales de la dexametasona. El tratamiento de los tumores con el adenovirus de beta-galactosidasa causó la inhibición significativa del crecimiento del tumor en tumores de control por placebo (p\leq0,001, días 21-30), pero no en tumores tratados con dexametasona (P>0.05, véase Fig. 8). Los tumores tratados con placebo y Ad beta-gal crecieron más lentamente que los tumores tratados con placebo y dexametasona (p\leq0,01, días 23-30).

No hubo una inhibición del crecimiento del tumor específica de p53 significativa en los tumores controlados por placebo (p>0,05). En contraste, los tumores tratados con dexametasona y Ad p53 crecieron significativamente más lentamente que los tumores tratados con dexametasona y Ad beta-gal (P\leq0,02, días 21-30) o placebo y Ad p53 (p\leq0,04, días 21-30).

El tratamiento con bajas dosis de dexametasona suprimió entonces la inhibición del crecimiento del tumor asociada con la respuesta inmunitaria anti-adenovirus (p. ej., respuesta de células NK) en ratones scid sin efectos adversos. Los datos también sugieren que el tratamiento con bajas dosis de dexametasona puede estimular la expresión transgénica (p. ej., p53) conducida por el promotor de CMV en adenovirus recombinantes. A la inversa, la dexametasona puede aumentar la eficacia de la transducción del adenovirus y aumentar así la muerte celular.

Se utilizó luego el modelo de cáncer de mama MDA-MB-231 para evaluar la eficacia anti-tumoral de Ad con y sin p53 en ratones con capacidades diferentes para montar una respuesta inmunitaria a los antígenos exógenos. Se estudiaron ratones lampiños con células T no funcionales, ratones scid con células T y B no funcionales pero con células NK elevadas, y ratones scid-beige con células T, B, y NK no funcionales.

Para estudiar la eficacia de rAd5/p53 (descrito supra) contra xenoinjertos de MDA-MD-231: a los ratones lampiños se les administró una dosis total de 2,2 x 10^{9} C.I.U. de Ad por ratón dividida en 10 inyecciones en los días 0 a 4 y 7 a 11. A los ratones SCID se les dio una dosis total del virus = 4x 10^{9} C.I.U. dividida en 10 dosis administradas en los días 0-4 y 7-11. A los ratones SCID-Beige se les administró una dosis total del virus = 1,6 x 10^{9} C.I.U. dividida en 10 dosis administradas en los días 0-4 y 7-11. Todos los ratones fueron tratados con Ad p53, Ad beta-galo vehículo solo.

En los ratones lampiños (células T no funcionales) o en los ratones scid (células T y B no funcionales; células NK elevadas), la administración intratumoral del vector Ad de control (sin inserción de p53) provocó cierta inhibición del crecimiento del tumor. El Ad que expresa p53 (rAd5/p53) había potenciado en gran medida la eficacia anti-tumoral en comparación con el Ad control. En contraste, en los ratones scid-beige (células T, B y NK no funcionales), la eficacia antitumoral se debió a la expresión de p53 sin ningún componente del vector Ad para la inhibición del crecimiento del tumor. Estos datos demuestran una función previamente no reconocida de las células NK en la inhibición del crecimiento de tumores mediados por Ad. Los datos también sugieren que la supresión del sistema inmunitario podría anular algunos efectos colaterales mediados por las células NK específicos del vector.

Ejemplo 6 Tratamiento combinado de Adenovirus p53 y quimioterapia

La invención provee composiciones para la administración combinada de ácido nucleico que expresa un polipéptido supresor de tumores y agentes quimioterapéuticos en el tratamiento de neoplasmas. El siguiente ejemplo detalla la capacidad de un adenovirus que expresa p53 de la invención en combinación con diversos fármacos antineoplásicos, cisplatino, doxorubicina, 5-fluorouracilo (5-FU), metotrexato y etopósido, para tratar neoplasmas, y que la terapia combinada fue más eficaz, es decir, fue sinérgica, en destruir células tumorales que cualquiera de los otros agentes solo.

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p53 administrado con fármacos quimioterapéuticos in vitro

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Cisplatino, doxorubicina, 5-fluorouracilo (5-FU), metotrexato y etopósido, en combinación con p53

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El efecto de los fármacos antineoplásicos clínicamente relevantes cisplatino, doxorubicina, 5-fluorouracilo (5-FU), metotrexato y etopósido, en combinación con un vector supresor de tumores de la invención (A/C/N/53), se investigó in vitro. Las células de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello SCC-9, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello SCC-15, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello SCC-25 y carcinoma de próstata DU-145 se sometieron a uno de los tres regímenes de tratamiento siguientes: en el tratamiento 1, las células se pretrataron con el quimioterapéutico antineoplásico veinticuatro horas antes de la exposición al constructo de adenovirus p53 A/C/N/53. En el tratamiento 2, las células se pretrataron con el constructo de adenovirus p53 y luego se pusieron en contacto con el quimioterapéutico antineoplásico. En el tratamiento 3, las células se pusieron en contacto simultáneamente con el quimioterapéutico antineoplásico y el adenovirus p53.

Todas las líneas celulares se obtuvieron de ATCC (Rockville, MD). Las células de tumores de cabeza y cuello SCC-9, SCC-15 y SCC-25 (p53^{nulo}) se cultivaron en una mezcla 1:1 de DMEM y Ham F-12 (GIBCO/Life Technologies, Grand Island, NY) con 10% suero de ternero fetal (FCS; Hyclone, Logan, Utah), 0,4 \mug/ml hidrocortisona (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) y 1% aminoácidos no esenciales (GIBCO) a 37ºC y 5% CO_{2}.

Se cultivaron células de tumor ovárico humano SK-OV-3 (p53^{nulo}) y células de tumor de próstata humano DU-145 (p53^{mut}) en MEM de Eagle más 10% FCS a 37ºC y 5% CO_{2}. Se cultivaron células de tumor de mama humano MDA-MB-231 (p53^{mut}) en DMEM (GE3CO) con 10% suero de ternero fetal (Hyclone) a 37ºC y 5% CO_{2}. Se cultivaron células de tumor de mama humano MDA-MB-468 (P53^{mut}) en medio L-15 de Leibovitz (GEBCO) que contenía 10% FCS a 37ºC, sin CO_{2}.

Las células del tumor de mama MDA-MB-231 portan una mutación Arg-a-Lys en el codón 280 del gen p53 y expresan p53 mutante (Bartek (1990) supra). Las células de tumor de próstata DU-145 portan dos mutaciones de p53 en diferentes cromosomas, una mutación Pro-a-Leu en el codón 223 y una mutación Val-a-Phe en el codón 274 (Isaacs (1991) Cancer Res. 51:4716-4720), y expresan p53 mutante. Las células de tumor ovárico SK-OV-3 tienen p53 nulo (Yaginuma (1992) Cancer Res. 52:4196-4199). Las células SCC-9 tienen una deleción entre los codones 274 y 285 que produce una mutación del marco de lectura; no se detecta la proteína p53 inmunorreactiva en los núcleos de SCC-9 (Jung (1992) Cancer Res. 52:6390-6393; Caamano (1993) Am J. Pathol. 142:1131-1139; Min (1994) Eur. J. Cancer 30B:338-345). Las células SCC-15 tienen una inserción de 5 pares de bases entre los codones 224 y 225; producen niveles reducidos de p53 ARNm, pero ninguna proteína p53 detectable (Min (1994) supra). Las células SCC-25 tienen pérdida de hetercigosidad (LOH) en el cromosoma 17 y una deleción de 2 pares de bases en el codón 209 en el alelo restante; El p53 ARNm no es detectable en las células SCC-25 y no se observa la proteína p53 inmunorreactiva en sus núcleos (Caamano (1993) supra). Aproximadamente 1,5 x 10^{4} células en el medio de cultivo (como se describió en el ejemplo 1) se añadieron a cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos y se cultivaron durante aproximadamente 4 horas a 37ºC y 5% CO_{2}.

La construcción y propagación de adenovirus (Ad) de p53 humano natural y de galactosidasa (beta-gal) de E. coli se han descrito previamente (Wills (1994) supra). La concentración de partículas víricas infecciosas se determinó midiendo la concentración de 293 células que son positivas para la proteína del hexón vírico después de un período de infección de 48 horas (Huyghe (1995) supra). C.L.U. se define como las unidades celulares infecciosas. Los adenovirus que expresan p53 se administraron en tampón de fosfato (NaH_{2}PO_{4} 20 mM, pH 8,0, NaCl 130 mM, MgCl_{2} 2 mM, 2% sacarosa). El fármaco, el adenovirus p53 o el vehículo/tampón adecuado se añadió a cada pocillo. Para estudios in vitro con Ad p53, las células se dispusieron en placas a una densidad de 1,5 x 10^{4} células/pocillo en una placa de 96 pocillos y se cultivaron durante 4 horas a 37ºC y 5% CO_{2}. El fármaco, Ad p53 o el vehículo apropiado se añadió a cada pocillo, y el cultivo celular continuó durante la noche. Luego el fármaco, Ad p53 o el vehículo apropiado se añadió a cada pocillo. El cultivo celular continuó durante otros 2 días.

La muerte celular se cuantificó luego de acuerdo con el ensayo MTT descrito por Mosmann (1983) J. Immunol. Meth., 65: 55-63. En síntesis, se añadieron aproximadamente 25 \mul de 5 mg/ml de tintura vital MTT [bromuro de 3-(4,5 dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio] a cada pocillo y se dejó incubar durante 3-4 horas a 37ºC y 5% CO_{2}. Luego, se añadieron 100 \mul de detergente SDS al 10% a cada pocillo y se dejó incubar durante la noche a 37ºC y 5% CO_{2}. La señal en cada pocillo se cuantificó luego usando una lectora de placas de microtitulación Molecular devices.

En todos los casos, usando cisplatino (véase Tabla 6 para resultados del sumario), doxorubicina (véase Tabla 7 para resultados del sumario), 5-FU, metotrexato y etopósido, la terapia de combinación fue más eficaz en destruir las células tumorales que cualquiera de los agentes solos. La combinación de metotrexato y Ad p53 se ensayó en una línea celular. Cuando las células SCC-15 se trataron con metotrexato 0,7 \muM 24 horas antes de 5 m.o.i. Ad p53, el efecto antiproliferativo combinado de los dos fármacos fue solamente 5% más que con Ad p53 solo, aunque esta diferencia fue estadísticamente significativa (p\leq0,003). El pretratamiento de células DU-145 con etopósido 2,6 \muM 24 horas antes o 5 ó 10 m.o.i. de Ad p53 resultó en una eficacia combinada mayor que cualquier fármaco solo (p\leq0,0001). Cuando las células SCC-15 se trataron con etopósido 0,3 \muM 24 horas antes de 5 m.o.i. Ad p53, el efecto antiproliferativo combinado de los dos fármacos fue solamente 5% más que con Ad p53 solo, aunque esta diferencia fue también estadísticamente significativa (p\leq0,003). La combinación de la terapia génica supresora de tumores y los antineoplásicos no demostró efectos antagonísticos.

En un segundo experimento, la eficacia del tratamiento de células normales (células MRC-9) se comparó con células tumorales (Figura 9). En este experimento, el crecimiento se ensayó como la incorporación de ^{3}H-timidina en lugar de usar el ensayo MTT. Las células normales (células MRC-9 de fibroblastos diploides) no mostraron efectos más pronunciados con el tratamiento de combinación. Como se esperaría, el efecto del supresor de tumores solo fue insignificante en células normales y altamente significativo en células tumorales. En contraste, el quimoterapéutico antineoplásico solo (p. ej., cisplatino, doxorubicina, 5-FU, metotrexato y etopósido) fue más eficaz en células normales que en células cancerosas (véase Figura 9).

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TABLA 6 Efectos antiproliferativos de Ad p53 en combinación con cisplatino

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TABLA 7 Efectos anti-proliferativos de Ad p53 en combinación con doxorubicina

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Efectos de la doxorubicina y el p53 sobre el carcinoma hepatocelular humano

El siguiente ejemplo detalla la capacidad de un adenovirus que expresa p53 de la invención en combinación con doxorubicina para tratar neoplasmas, y que la terapia de combinación fue más eficaz, es decir, fue sinérgica, en destruir las células tumorales que cualquiera de los agentes solo. Los resultados demuestran una interacción sinérgica entre el vector que expresa p53 de la invención (ACN53) y la doxorubicina.

La doxorubina (Adriamicina) y el p53 (ACN53, el constructo de adenovirus recombinante que expresa el transgen p53 humano natural) se administraron a las siguientes líneas celulares: HLE, una línea celular de carcinoma hepatocelular humano (Hsu (1993) Carcinogenesis 14:987-992; Farshid (1992) J. Med. Virol. 38:235-239; Dor (1975) Gann. 66:385-392), con un p53 mutado; HLF, una línea celular de carcinoma hepatocelular humano con un p53 mutado (ibídem); Hep 3B, un carcinoma hepatocelular humano con p53 nulo (Hasegawa (1995) In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31:55-61); Hep G2, un carcinoma hepatocelular humano con p53 natural (ibídem); y SK-HEP-1, un adenocarcinoma hepático humano con p53 natural (Lee (1995) FEBS Lett. 368:348-352). La viabilidad de las células se midió con la sonda de células vivas Calcien AM (Molecular Probes) (véase, p. ej., Poole (1993) J. Cell Sci. 106:685-691). El sustrato calcien AM es escindido por esterasas celulares para generar un producto fluorescente.

Las células se dispusieron en placas de 96 pocillos (5 x 10^{3} células/pocillo), se dejaron adherir toda la noche, se trataron con diluciones triples de ACN53 y diluciones de doxorubicina en el día 0, de modo tal que se generara una curva de dosis y respuesta para el tratamiento de doxorubicina con cada dosis de ACN53. En el día 3, el medio se aspiró y se añadió calcien AM in PBS a las células. La intensidad fluorescente de cada pocillo se determinó usando una lectora de placas fluorescentes. Se sustrajo el valor fluorescente de las células y los datos se expresaron como el porcentaje de viabilidad (intensidad fluorescente) en comparación con los pocillos de control no tratados. Los valores ED_{50} se usaron para generar trazados de isobolograma para determinar la interacción entre ACN53 y la doxorubicina.

El análisis de isobolograma para cada línea celular demostró una interacción sinérgica entre el vector que expresa p53 de la invención (ACN53) y la doxorubicina; esta sinergia fue independiente del estado del p53 de la línea celular. No obstante, se ha de observar que el ED_{50} para ACN53 en ausencia de doxorubicina es más alto en las líneas celulares de p53 natural que en las líneas alteradas de p53.

En otro experimento similar, se colocaron células HLE en placas de 96 pocillos (5 x 10^{3} células/pocillo); se dejaron adherir durante la noche; y se trataron por triplicado con diluciones de ACN53 y diluciones de doxorubicina de modo tal que se generara una curva de dosis y respuesta para el tratamiento con doxorubicina con cada dosis de ACN53. Se emplearon tres grupos para ensayar los efectos del orden de la administración sobre la interacción entre ACN53 y la doxorubicina.

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Las células se incubaron durante 3 días después del primer tratamiento. El medio se aspiró y se añadió calcien AM en PBS a las células. La intensidad fluorescente de cada pocillos se determinó usando una lectora de placas fluorescente. Se sustrajo el valor fluorescente de los pocillos sin células, y los datos se expresaron como el porcentaje de viabilidad (intensidad fluorescente) comparado con los pocillos de control no tratados. Los valores ED_{50} se usaron para generar trazados de isobolograma para determinar la interacción entre ACN53 y doxorubicina. Los análisis de isobolograma para cada régimen de administración mostraron una interacción similar, coherente con la sinergia, entre ACN53 y la doxorubicina en las células HLE que fue independiente del orden de administración del tratamiento.

p53 con fármacos quimioterapéuticos in vivo

El efecto de los fármacos antineoplásicos clínicamente relevantes cisplatino, doxorubicina y 5-fluorouracilo (5-FU), en combinación con un vector supresor de tumores de la invención (A/C/N/53), se investigó adicionalmente in vivo.

Se adquirieron ratones C.B. 17/ICR-scid de Taconic Farms (Germantown, NY) o Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Se adquirieron ratones atímicos lampiños de Charles River Laboratories. Todos los ratones se mantuvieron en una instalación con barrera VAF y todos los procedimientos animales se realizaron de acuerdo con las normas expuestas en la N.I.H. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Los volúmenes de los tumores para los diferentes grupos de tratamiento en cada día se compararon con la prueba t de Student, usando el software Statview II (Abacus Concepts, Berkeley, CA). Las curvas de crecimiento del tumor se construyeron para demostrar el error estándar de la media del volumen del tumor. Normalmente hubo diez ratones por grupo.

Modelo de tumor ovárico SK-OV-3

Se trataron tumores intraperitoneales consolidados SK-OV-3 con dosis intraperitoneales de vehículos, Ad p53, cisplatino o ambos fármacos. Se les aplicaron a los ratones seis inyecciones de Ad p53 durante un período de dos semanas. La dosis total del virus fue de 1,5 x 10^{9} C.I.U. (3,1 x 10^{10} partículas víricas).

Eficacia del cisplatino: Se inyectaron ratones scid hembra con 5 x 10^{6} células de tumor ovárico SK-OV-3, I.P., en el día 0. Los ratones recibieron administraciones I.P. en los días 6, 8, 10, 13, 15 y 17 (Ad p53 solamente en D17). Los ratones recibieron un volumen total de 0,2 ml (0,1 ml de vehículo de cisplatino o cisplatino más 0,1 ml tampón Ad o Ad p53). La dosis de Ad p53 fue de 2,5 x 10^{8} C.L.U./ratón/día (5,2 x 10^{9} partículas víricas). La dosis de cisplatino fue de 2 mg/kg/día. Los tumores se cosecharon y pesaron en el día 20.

Los ratones en un grupo de tratamiento recibieron cinco dosis de cisplatino simultáneamente con las primeras cinco dosis de Ad p53. Esta dosis de Ad p53 intraperitoneal redujo la masa tumoral del ratón únicamente en un 17% alrededor del día 20 (p\leq0,01). No obstante, cuando se combinó con cisplatino, el Ad p53 causó una disminución del 38% en la masa tumoral según lo comparado con el cisplatino solo (p\leq0,0008). Los ratones tratados con los fármacos vehículo o con Ad p53 solo tuvieron ascitis hemorrágica y nódulos tumorales invasivos en el músculo de diafragma. Estos síntomas estuvieron ausentes en ratones tratados con cisplatino solo o cisplatino con Ad p53.

Eficacia de cisplatino/paclitaxel: a ratones scid hembra se les inyectaron 2,5 x -10^{6} de células de tumores ováricos SK-OV-3, I.P., en el día 0. Los ratones recibieron administraciones I.P. en los días 7, 9, 11, 16 y 18. Los ratones recibieron un volumen total de 0,3 ml (0,1 ml cisplatino vehículo o cisplatino más 0,1 ml de paclitaxel vehículo o paclitaxel más 0,1 ml tampón Ad o Ad p53). La dosis de Ad p53 fue de 2,5 x 10^{8} C.I.U./ratón/día (5,2 x 10^{9} partículas víricas). La dosis de cisplatino fue de 0,5 mg/kg/día. La dosis de paclitaxel fue de 1 mg/kg/día. Los tumores se cosecharon y pesaron en el día 30. n = 7=10 ratones por grupo.

En este segundo estudio, se trataron tumores ováricos SK-OV-3 con dosis intraperitoneales de vehículos, Ad p53, cisplatino más paclitaxel, o los tres fármacos simultáneamente. La combinación de los tres fármacos redujo la masa tumoral 34% más que la combinación de cisplatino más paclitaxel, lo que demuestra la eficacia potenciada de la combinación de los tres fármacos (p\leq0,0006).

Modelo de tumor de próstata DU-145 Eficacia de cisplatino

Se trataron tumores DU-145 intraperitoneales con dosis intraperitoneales de vehículos, Ad p53, cisplatino o ambos fármacos. A ratones scid macho se les inyectaron 2,5 x 10^{6} células DU-145, I.P., en el día 0. Los ratones recibieron administraciones I.P. en los días 7, 9, 11, 14 y 16. Los ratones recibieron un volumen total de 0,2 ml (0,1 ml de cisplatino vehículo o cisplatino más 0,1 ml tampón Ad o Ad p53). La dosis de Ad p53 fue de 8,3 x 10^{8} C.I.U./ratón/día (2,9 x 10^{10} PN). La dosis de cisplatino fue de 1 mg/kg/día. Los tumores se cosecharon y pesaron en el día 22. La combinación de Ad p53 y cisplatino tuvo una eficacia antitumoral ampliamente potenciada comparada con cualquiera de los dos fármacos solos (p\leq0,0004).

Modelo de tumor de mama MPA-MB-468 Eficacia del cisplatino

Se trataron tumores MDA-MB-468 consolidados con vehículos, Ad p53, cisplatino o ambos fármacos. A ratones scid hembra se les inyectaron 1 x 10^{7} células MDA-MB-468 en el panículo adiposo mamario, 11 días antes del inicio de la administración de las dosis en el día 0. La dosis de cisplatino intraperitoneal fue de 1 mg/kg/día. La dosis de Ad p53 intratumoral fue de 8,3 x 10^{8} CIU/ratón/día (2,9 x 10^{10} partículas víricas) administrada simultáneamente en los días 0-4. Ad p53 potenció la eficacia cuando se combinó con cisplatino (días 8-31, p\leq0,0004).

Eficacia de doxorubicina

En un segundo experimento, se trataron tumores MDA-MB-468 con vehículos, Ad p53, doxorubicina o ambos fármacos. A ratones lampiños hembra se les inyectaron 1 x 10^{7} célulasMDA-MB-468 subcutáneamente 12 días antes del inicio de la administración de las dosis en el día 0. La dosis de doxorubicina intraperitoneal fue de 4 mg/kg/día en los días 0, 2, 7 y 9. La dosis de Ad p53 intratumoral fue de 5 x 10^{8} CIU/ratón/día (1,03 x 10^{10} partículas víricas) en los días 0-4 y 7-11.

El Ad p53 tuvo mayor eficacia cuando se administró en combinación con doxorubicina (días 14-24, p\leq0,05).

Modelo de tumor de cabeza y cuello SCC-15 Eficacia de 5-Fluorouracilo

Se trataron tumores SCC-15 subcutáneos con vehículos, Ad p53, 5-fluorouracilo (5-FU) o ambos fármacos. A ratones scid se les inyectaron 5 x 10^{6} células SCC-15 subcutáneamente 7 días antes del inicio de la administración de las dosis en el día 0. La dosis de 5-fluorouracilo intraperitoneal fue de 50 mg/kg/día en 40% hidroxipropil-beta-ciclodextran (Cerestar Inc., Hammond, IN) administrada I.P. en los días 0, 7 y 14 (una vez por semana durante 3 semanas). La dosis de Ad p53 fue de 2 x 10^{8} CIU/ratón/día (4 x 10^{9} partículas víricas), en los días 0, 1, 7, 8, 14 y 15 (6 inyecciones intratumorales durante un período de 3 semanas). Se administró una dosis de 5-FU de 50 mg/kg. La combinación de Ad p53 y 5-FU produjo mayor actividad antitumoral que cuando se utilizó cualquiera de los fármacos solo (p\leq0,04).

p53 con inhibidor de FPT

Se investigó in vitro el efecto de un inhibidor de farnesil proteína transferasa en combinación con un vector supresor de tumores designado A/C/N/53. Los siguientes ejemplos detallan la capacidad de un adenovirus que expresa p53 de la invención en combinación con el inhibidor de FPT designado "FPT39", como se describe en la solicitud internacional 97/23478, presentada el 19 de diciembre de 1996, donde FPT39 se designa como el compuesto "39.0", véase pág 95 del documento WO 97/23478) para tratar neoplasmas, y que la terapia de combinación contra células de tumor de próstata y células de tumor de mama fue más eficaz en destruir células tumorales que cualquiera de los agentes solo.

Eficacia antiproliferativa de rAd5/p53 y FPT39 contra el tumor de ovario SK-OV-3

Métodos: se dividieron en alícuotas células de tumor ovárico humano SK-OV-3 (p53^{nulo}) en placas de 96 pocillos a una densidad de 250 células por pocillo en MEM de Eagle más 1,0% suero bovino fetal. Las células se incubaron luego a 37ºC y 5% CO_{2} durante 4 horas. Se añadió FPT39 o fármaco vehículo a cada pocillo y el cultivo celular siguió durante 3 días. Después de 3 días, las células no tratadas en algunos pocillos se contaron con el fin de calcular la cantidad de rAd5/p53 a añadir. Luego se añadió rAd5/p53 o fármaco vehículo a cada pocillo y el cultivo celular continuó durante otros 3 días. La proliferación celular se midió usando el ensayo MTT. En síntesis, se añadieron 25 ul de 5 mg/ml de tintura vital MTT [bromuro de 3-(4,5 dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio] a cada pocillo y se dejó incubar durante 3-4 horas a 37ºC y 5% CO_{2}. Luego, se añadieron 100 ul de detergente SDS al 10% a cada pocillo y la incubación continuó durante toda la noche. La fluorescencia en cada pocillo se cuantificó usando una lectora de placas de microtitulación Molecular Devices. Los datos de la proliferación celular se analizaron usando la metodología estadística de la placa delgada (Thin Plate Spline) de O'Connell y Wolfinger (1997) J. Comp. Graph. Stat. 6: 224-241.

Resultados: rAd5/p53 y FPT39 tuvieron una eficacia aditiva en inhibir el crecimiento celular. No se demostraron sinergia (p>0,05) ni antagonismo (p>0,05) en este experimento.

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Eficacia anti-proliferativa y sinérgica de rAd5/p53 y FPT39 (inhibidor de FPT) contra células de tumor de próstata DU-145

Métodos: Se trataron células de tumor de próstata humano DU-145 (p53^{mi}'') con FPT39 o fármaco vehículo y rAd5/p53, y los cultivos celulares se analizaron posteriormente, según lo anteriormente descrito para las células de tumor ovárico humano SK-OV-3. El experimento se repitió dos veces.

Resultados: Experimento 1: rAd5/p53 y FPT39 tuvieron eficacia aditiva en inhibir el crecimiento celular. No se demostraron ni sinergia (p>0,05) ni antagonismo (p>0,05) en este experimento.

Experimento 2: rAd5/p53 y FPT39 tuvieron eficacia sinérgica (p=0,0192).

Estos resultados demuestran que rAd5/p53 y FPT39 pueden interactuar y tener eficacia sinérgica contra la proliferación celular de tumores de próstata.

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Eficacia anti-proliferativa y sinérgica de rAd5/p53 y FPT39 (inhibidor de FPT) contra células de tumor de mama MDA-MB-231

Métodos: se trataron células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 (p53^{mut}) con FPT39 o fármaco vehículo y rAd5/p53, y los cultivos celulares se analizaron posteriormente, como se describió antes para las células de tumor ovárico humano SK-OV-3. El experimento se repitió dos veces.

Resultados: Experimento 1: rAd5/p53 y FPT39 tuvieron eficacia aditiva. No se demostró sinergia (p > 0,05) en este experimento.

Experimento 2: rAd5/p53 y FPT39 tuvieron eficacia aditiva en la mayor parte de la superficie de respuesta. No obstante, la sinergia fue evidente en isoboles mayores o iguales a 70 (es decir, menos de 30% de las células destruidas, p=0,0001). Estos resultados demuestran que rAd5/p53 y FPT39 pueden interactuar y tienen eficacia sinérgica contra la proliferación celular del cáncer de mama humano.

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Ejemplo comparativo 7

Perfil de respuesta inmunitaria en pacientes con carcinomas hepáticos metastásicos tratados con el vector de adenovirus que porta p53

La invención provee la administración combinada in vivo de ácido nucleico que expresa p53 y otros agentes quimioterapéuticos en el tratamiento de neoplasmas. El siguiente ejemplo detalla la capacidad del adenovirus que expresa p53 de la invención para aumentar los niveles de linfocitos que destruyen tumores observados dentro de un carcinoma hepático humano.

El objetivo de este estudio fue caracterizar los genotipos y fenotipos de los linfocitos infiltrantes del tumor (TIL) en carcinomas hepáticos metastásicos de las mutaciones de p53 que se alojan en el colon (para análisis, de TIL, véanse, p. ej., Wang (1997) Mol. Med. 3:716-731; Marrogi (1997) Int. J. Cancer 74:492-501). Se trató un total de 16 pacientes con un modo de dosis escalonada, 10^{9}-10^{11} partículas, a través de la canalización de la arteria hepática con un vector de adenovirus que porta el gen p53 natural. Se obtuvo un total de cuatro biopsias de cada paciente 3 a 7 días después de administrar el vector adenovírico.

Se realizó el análisis inmunohistoquímico en los tejidos congelados obtenidos de los sitios de interfase de tejido con tumores y hepático normal. El análisis de imágenes asistidas por ordenador se realizó para cuantificar la inmunorreactividad a los siguientes anticuerpos monoclonales: CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD56, HLA-DR, IFN-gamma, TNF-alfa y IL-2. Se observó un incremento en la población de TIL (CD3^{+} y CD4^{+}) con el máximo a 7,5x10^{10} partículas. En dosis más altas, se observó una disminución en la población de CD3^{+} y CD4^{+}. Se observó una correlación inversa para células CD8^{+}. En la dosis más alta (2,5x10^{11}) se observó un incremento en la población de CD3^{+}, CD4^{+} y CD8^{+} en el tumor, en comparación con las células normales. Estos resultados demuestran que la administración de dosis más altas de partículas de adenovirus produce un incremento en TIL compuesto por población de CD4^{+} y CD8^{+}.

Claims (6)

1. Uso de un ácido nucleico supresor de tumores, que es un ácido nucleico que codifica una proteína supresora de tumores que comprende una proteína p53 natural o una proteína retinoblastoma (RB), en combinación con

(a) un agente que afecta los microtúbulos seleccionado del grupo que consiste en paclitaxel, Taxotere® o un derivado de paclitaxel, o

(b) un inhibidor de poliprenil-proteína transferasa seleccionado entre un inhibidor de geranilgeranil-proteína transferasa o un inhibidor de farnesil-proteína transferasa (FPT) que se selecciona del grupo que consiste en FPT39, un compuesto péptido-mimético farnesilado, una benzocicloheptapiridina tricíclica de anillo condensado y un derivado de farnesilo, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar células mamíferas cancerosas o hiperproliferativas.

2. El uso según la reivindicación 1, que además comprende el uso de un agente quimioterapéutico seleccionado del grupo que consiste en agentes que dañan el ADN, inhibidores de topoisomerasa I, inhibidores de topoisomerasa IX, antimetabolitos de ARN/ADN y antimetabolitos de ADN.

3. El uso según la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico está contenido en un vector seleccionado del grupo que consiste en un plásmido de ADN desnudo, un plásmido dentro de un liposoma, un plásmido que forma complejo con un lípido, un vector vírico, un vector AAV y un vector adenovírico recombinante.

4. El uso según la reivindicación 3, en el que dicho vector es A/C/N/53.

5. El uso según la reivindicación 1, en el que la composición farmacéutica se formula para la administración de dicho ácido nucleico supresor de tumores en una dosis total en el intervalo de 1 x 10^{9} a 7,5 x 10^{15} partículas de adenovirus en un régimen de tratamiento seleccionado del grupo que consiste en: la dosis total en una dosis única, la dosis total dividida en 5 días y administrada diariamente, la dosis total dividida en 15 días y administrada diariamente y la dosis total dividida en 30 días y administrada diariamente; y

se formula para la administración de dicho paclitaxel o derivado de paclitaxel en una dosis total en el intervalo de 75 a 350 mg/m^{2} durante 24 horas en un régimen de tratamiento seleccionado del grupo que consiste en la administración en una dosis única, en una dosis administrada diariamente en el día 1 y en el día 2, en una dosis administrada diariamente en el día 1, en el día 2 y en el día 3, en una administración diaria durante 15 días, en una administración diaria durante 30 días, en una infusión diaria continua durante 15 días, en una infusión diaria continua durante 30 días.

6. Una composición farmacológica que comprende

un ácido nucleico supresor de tumores, y

un agente que afecta los microtúbulos seleccionado del grupo que consiste en paclitaxel, Taxotere® o un derivado de paclitaxel,

o un inhibidor de poliprenil-proteína transferasa seleccionado entre un inhibidor de geranilgeranil-proteína transferasa o un inhibidor de farnesil-proteína transferasa (FPT) seleccionado del grupo que consiste en FPT39; un compuesto péptido-mimético farnesilado, benzociclo-heptapiridina de anillo condensado y un derivado de farnesilo,

donde dicho ácido nucleico supresor de tumores es un ácido nucleico que codifica una proteína supresora de tumores que comprende una proteína p53 natural o una proteína retinoblastoma (RB).