CZ298488B6

CZ298488B6 - Farmaceutický prostredek s obsahem tumor-supresorové nukleové kyseliny

Info

Publication number: CZ298488B6
Application number: CZ0293399A
Authority: CZ
Inventors: Nielsen@Loretta; Ann Horowitz@Jo; C. Maneval@Daniel; G. Demers@William; Ellen Rybak@Mary; Resnick@Gene
Original assignee: Canji, Inc.
Priority date: 1997-02-18
Filing date: 1998-02-17
Publication date: 2007-10-17
Also published as: HK1026579A1; NO993943D0; JP2001511815A; CN1248731C; EP0969720A2; EP0969720B1; SK112299A3; DE69837754D1; HUP0004326A2; NO993943L; IL195605A0; KR100620939B1; PL193767B1; CZ293399A3; EP0969720A4; IL131447A0; CN1252689A; DE69837754T2; WO1998035554A2; ES2287974T3

Abstract

Použití tumor-supresorové nukleové kyseliny, kterou je nukleová kyselina, která kóduje tumor-supresorový protein, zahrnující prirozený p53 protein nebo retinoblastomový protein, v kombinaci s inhibitorem polyprenyl-protein transferázy, vybraným meziinhibitorem geranylgeranyl-protein transferázy nebo inhibitorem farnesyl-protein transferázy, kterýje vybrán ze skupiny sestávající z FPT39, farnesylované peptidomimetické slouceniny, kondenzovanéhotricyklického benzocykloheptapyridinu a farnesylového derivátu, pro prípravu farmaceutického prostredku pro lécbu savcích rakovinných nebo hyperproliferativních bunek. Dále muže být prítomno chemoterapeutické cinidlo.

Description

Farmaceutický prostředek s obsahem tumorsupresorové nukleové kyseliny (57) Anotace:

Použití tumor-supresorové nukleové kyseliny, kterou je nukleová kyselina, která kóduje tumor-supresorový protein, zahrnující přirozený p53 protein nebo retinoblastomový protein, v kombinaci s inhibitorem polyprenyl-protein transferázy, vybraným mezi inhibitorem geranylgeranyl-protein transferázy nebo inhibitorem famesyl-protein transferázy, který je vybrán ze skupiny sestávající z FPT39, famesylované peptidomimetické sloučeniny, kondenzovaného tricyklického benzocykloheptapyridinu a farnesylového derivátu, pro přípravu farmaceutického prostředku pro léčbu savčích rakovinných nebo hyperproliferativních buněk. Dále může být přítomno chemoterapeutické činidlo.

Farmaceutický prostředek s obsahem tumor-supresorové nukleové kyseliny

Oblast techniky

Předkládaný vynález popisuje použití tumor-supresorové kyseliny pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčbu subjektů postižených hyperproliferativním onemocněním jako jsou nádory nebo metastatická onemocnění. Přesněji, vynález obsahuje použití těchto prostředků pro inhibici hyperproliferace buněk, přesněji nádorových buněk, které obsahuje kombinované použití tumorsupresorového genu nebo produktu tohoto genu a protinádorového činidla.

Dosavadní stav techniky

Chromosomální abnormality jsou často spojeny s genetickými chorobami, degenerativními chorobami a nádory. Konkrétně, delece nebo multiplikace kopií celých chromosomů nebo chromosomálních segmentů a vyšší úroveň aplikace specifických regionů genomu se často vyskytují u nádorů. Viz například Schmith (1991), Breast Cancer Res. Treat., 18: Suppl. 1: 5-14; Van den Viler (1991) Became. Beefiest. Acta. 1072: 33-50; Sáto (1990) Cancer Res. 50: 7184-7189. Skutečně, aplikace DNA sekvencí obsahujících protoonkogeny a delece DNA sekvencí obsahujících tumor-supresorové geny jsou častými rysy tumorogenese. Dutrilleux (1990) Cancer Genet. Cytogenet. 49: 203-217.

Mutace p53 genu je nejčastější genetickou alterací u lidských nádorů (Bartek (1991) Oncogene 6: 1699-1703; Hollstein (1991) Science 253: 49-53). Kromě toho, vložení přirozeného P53 do savčích nádorových buněk postrádajících endogenní přirozený p53 protein potlačuje neoplastický fenotyp těchto buněk (viz například patent US 5 532 220).

Z mnoha dostupných chemoterapeutických léků vzbudil paclitaxel, komerčně dostupný jako Taxol^(R) (NSC č. 125973) zájem, protože je účinný v klinických pokusech proti nádorům resistentním na cytostatika, včetně nádorů ovaria a prsu (Hawkins (1992) Oncology 6: 17-23; Horwitz (1992) Trends Pharmacol. Sci. 13: 134-146; Rowinsky (1990) J. Nati. Canc. Inst. 82: 1247-1259). Poslední studie týkající se interakcí mezi paclitaxelem a terapií tumor-supresorovým genem ukázaly, že redukované hladiny tumor-supresorového genu (tj. p53) korelují s vyšším arestem v G2/M fázi, s mikroenukleací a s paclitaxelem indukovanou apoptózou nezávislou na p53. Oproti tomu, přežívání buněk s intaktním p53, které prošly mitosou a přechodně se akumulovaly v následné Gl fázi, korelovalo se zvýšením hladin proteinů p53 ap21^c'^{pl waf1} (Wahl (1996) Nátuře Med. 2:72-79). Podobně, Hawkins (1996) Cancer Res. 56: 892-898, ukázal, že inaktivace p53 zvyšuje sensitivitu na některá antimitotická činidla, včetně paclitaxelu. Autoři naznačili, že p53 může mít funkci v opravách DNA, a to může umožňovat snadnější přechod buněk S fází I v přítomnosti léků. Tyto studie proto naznačují, že terapie tumor-supresorový genom a cytostatická terapie antimitotickými činidly (zejména terapie paclitaxelem) má protichůdné účinky.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je použití tumor-supresorové nukleové kyseliny, kterou je nukleová kyseliny, která kóduje tumorsupresorový protein, zahrnující přirozený p53 protein nebo retinoblastomový protein (RB), v kombinaci s inhibitorem polyprenyl-protein transferázy, vybraným mezi inhibitorem geranylgeranyl-protein transferázy nebo inhibitorem famesyl-protein transferázy (FPT), který je vybrán ze skupiny sestávající z

-1 CZ 298488 B6

famesylované peptidomimetické sloučeniny, kondenzovaného tricyklického benzocykloheptapyridinu a famesylového derivátu, pro přípravu farmaceutického prostředku pro léčbu savčích rakovinných nebo hyperproliferativních buněk.

Vynález je částečně založen na překvapivém zjištěním že současná cytostatická terapie v kombinaci s terapií tumorsupresorovým genem (např. p53) umožňuje vyšší účinek v inhibici proliferace neoplastických nebo jiných buněk s deficitem tumor-supresorové aktivity.

Použití podle vynálezu přednostně dále zahrnuje použití chemoterapeutického činidla vybraného ze skupiny sestávající z prostředků poškozujících DNA, inhibitorů topoizomerázy I, inhibitorů topoizomerázy II, antimetabolitů RNA/DNA a antimetabolitů DNA.

Například tumor-supresorová nukleová kyselina (například nukleová kyselina kódující p53) může být podána společně s adjuvantním protinádorovým činidlem (například paclitaxelem) a činidlem způsobujícím poškození DNA, jako je cis-platina, karbo-platina, navelbin (vinorelbin-tartrát).

Předmětem vynálezu je rovněž odpovídající farmakologický prostředek.

Nádorové nebo hyperproliferativní buňky jsou často neoplastické buňky. Pokud jsou buňky přítomny v nádoru, pak prostředek podle předkládaného vynálezu inhibuje růst nádoru a tak umožňuje léčbu nádoru. Mezi takové nádory patří - bez omezení - karcinom ovaria, karcinom slinivky břišní, nemalobuněčný karcinom plic, malobuněčný karcinom plic, hepatocelulámí karcinom melanom, retinoblastom, karcinom prsu, kolorektální karcinom, leukemie, lymfomy, mozkové nádory, karcinom čípku děložního, sarkomy, karcinom prostaty, karcinom močového měchýře, nádory retikuloendotelu, Wilmsův tumor, astrocytom, glioblastom, neuroblastom, osteosarkom, nádor ledvin a nádory hlavy a krku.

Výhodným adjuvantním protinádorovým činidlem je paclitaxel nebo derivát paclitaxelu a výhodnou tumor-supresorovou nukleovou kyselinou je nukleová kyselina kódující tumor-supresorový protein vybraný ze skupiny skládající se z p53 proteinu a jeho analogů a retinoblastomového (RB) proteinu.

Konkrétní výhodná tumor-supresorová nukleová kyselina kóduje přirozený P53 protein a konkrétní výhodný retinoblastomový protein je pl 10^RB nebo p56^RB.

Tumor-supresorová nukleová kyselina je výhodně dopravena do cílových buněk pomocí vektoru. Takové virové vektory jsou modifikované technikou rekombinantní DNA tak, aby umožňovaly expresi tumor-supresorové nukleové kyseliny v cílových buňkách. Tyto vektory mohou být

-2CZ 298488 B6 odvozeny od vektorů nevirového (například plazmidového) nebo virového zdroje (například od adenovirovu, adeno-asociovaného viru, retroviru, herpes viru, viru vakcinie). Ve výhodném provedení vynálezu je vektorem rekombinantně modifikovaný adenovirový vektor. Nevirové vektory jsou výhodně v komplexu s činidly usnadňujícími přenos DNA přes buněčnou membránu. Příklady takových nevirových vektorových komplexů zahrnují prostředky s polykationtovými činidly, které usnadňují kondenzaci DNA a přenosové prostředky založené na lipidech. Příkladem přenosového prostředku založeného na lipidech je podání nukleových kyselin v liposomech.

Zejména vhodné adenovirové vektory (například pro podání nukleové kyseliny kódující přirozený p53 protein) obsahují částečné nebo úplné delece DNA pro protein IX. V jednom provedení je delece genové sekvence pro protein IX v rozsahu přibližně 3500 bp od 5' konce viru do přibližně 4000 bp od 5' konce viru. Vektor může také obsahovat deleci neesenciální DNA sekvence v adenovirovém časném regionu 3 a/nebo v adenovirovém časném regionu 4 a v jednom provedení je deleci delece DNA sekvence Ela a/nebo Elb. Zejména výhodný rekombinantní adenovirový vektor pro přenos lidské cDNA pro p53 obsahuje hlavní pozdní promotor adenoviru typu 2 nebo lidský CMV promotor a trojité vedoucí cDNA adenoviru typu 2. jedním takovým výhodným adenovirovým vektorem je ACN53.

Výhodným paclitaxelem nebo derivátem paclitaxelu je paclitaxel a/nebo Taxotere^R, a nejvýhodnější je paclitaxel (Taxol^R). Jiným výhodným adjuvantním protinádorovým činidlem je Epothilon. V jednom výhodném provedení vynálezu je tumorsupresorovým činidlem A/C/N/53 a adjuvantním protinádorovým Činidlem je paclitaxel.

Tumor-supresorový protein nebo tumor-supresorová nukleová kyselina mohou být dispergovány ve farmaceuticky přijatelné přísadě. Podobně může být adjuvantní protinádorové činidlo (například paclitaxel) dispergováno ve farmaceuticky přijatelné přísadě. Tumor-supresorový protein a tumor-supresorová nukleová kyselina a uvedený paclitaxel nebo derivát paclitaxelu mohou být dispergovány v jednom prostředku (obsahujícím jedno nebo více pomocných činidel).

Tumor-supresorový protein nebo tumor-supresorová nukleová kyselina a/nebo adjuvantní protinádorové činidlo mohou být podány intraarteriálně, intravenózně (například injekčně), intraperitoneálně a/nebo intratumorálně, současně nebo sekvenčně. Výhodnými způsoby podání jsou podání do arteria hepatica, intraperitoneální podání, nebo při léčbě v oblasti hlavy (například při léčbě nádorů nervového systému) a aplikace do arteria carotis.

Tumor-supresorový protein nebo tumor-supresorová nukleová kyselina mohou být podány v jedné dávce nebo může léčba obsahovat více dávek, například v časovém rozmezí alespoň 6 hodin, lépe alespoň tři podání v odstupu přibližně 24 hodin.

V jiném výhodném provedení je tumor-supresorový protein nebo tumor-supresorová nukleová kyselina podána (s nebo bez adjuvantního protinádorového činidla) v celkové dávce v rozmezí od přibližně 1 x 10⁹ do přibližně 1 x 10¹⁴, nebo přibližně 1 x 10⁹ až přibližně 7,5 x 10¹⁵, výhodně v dávce přibližně 1 x 10^!1 až přibližně 7,5 x 10¹³ adenovirových částic, v jednom z následujících léčebných režimů: celá dávka v jedné dávce, celá dávka podaná denně během 5 dnů, celá dávka podaná denně během 15 dnů a celá dávka podaná denně během 30 dnů. Dávka může být také podávána kontinuálně po dobu 1 až 30 dnů. Paclitaxel nebo derivát paclitaxelu je podán v celkové dávce v rozmezí od 75-350 mg/m² během 1 hodiny, 3 hodiny, 6 hodin nebo 24 hodin v jednom z následujících léčebných režimů: podání v jedné dávce, celková dávka podávána denně v den 1 a 2, celková dávka podávána denně v den 1, 2 a 3, celková dávka podaná v 15 dnech, celková dávka podaná ve 30 dnech, denní kontinuální infuse podobu 15 dnů, denní kontinuální infuse podobu 30 dnů. Výhodná dávka je 100-250 mg/m² během 24 hodin. Alternativně může být paclitaxel nebo derivát paclitaxelu podáván jednou týdně v dávce 60 mg/m². Tento způsob podání může být opakován ve dvou nebo více cyklech (nejlépe ve třech cyklech) a cykly jsou podány s odstupem tří až čtyř týdnů.

-3CZ 298488 B6

V některých výhodných provedeních může být denní dávka 7,5 x 10⁹ až přibližně 7,5 x 10¹⁵, lépe přibližně 1 x 10¹² až přibližně 7,5 x 10¹³ adenovirových částic podána každý den po dobu až 30 dnů (například režimy, ve kterých je stejná dávka podávána každý den po dobu 2 dnů, 2-5-14-30 dnů). Režimy opakovaného podání mohou být opakovány v cyklech s odstupem 21 až 28 dnů. Výhodnými způsoby podání jsou intraarteriální (například do arteria hepatica), intratumorální a intraperitoneální podání.

Pokud je tumor-supresorová nukleová kyselina (například p53) podána v adenovirovém vektoru s adjuvantním protinádorovým činidlem (například paclitaxelem) a činidlem způsobující poškození DNA (jako je například cis-platina, karbo-platina nebo navelbin), tak je adenovirový vektor podáván po dobu 5—14 dnů v dávce přibližně 7,5 x 10¹² až přibližně 7,5 x 10¹³ adenovirových částic na den. Pokud je adenovirový vektor a paclitaxel podán spolu s karbo-platinou, pak je dávka obvykle 7,5 x 10¹³ adenovirových částic na den. Například denní dávka 7,5 x 10¹² adenovirových částic může být použita pro podání do plic.

Prostředek podle vynálezu je možno použit v kitech pro léčbu savčích hyperproliferativních nebo nádorových buněk. Kity obsahují zde popsaný tumor-supresorový protein nebo tumor-supresorovou nukleovou kyselinu (výhodně přirozený p53 protein nebo nukleovou kyselinu (například ve virovém nebo nevirovém vektoru) nebo retinoblastomový (RB) protein nebo nukleovou kyselinu); a adjuvantní protinádorové činidlo, jak je zde popsáno (například paclitaxel nebo derivát paclitaxelu) a/nebo volitelně jakékoliv jiné cytostatické činidlo, která jsou zde popsána. Kit může také obsahovat návod popisující podání jak tumor-supresorového proteinu nebo tumor-supresorové nukleové kyseliny, tak adjuvantního protinádorového činidla (a volitelně jiného cytostatického činidla) při inhibici růstu nebo proliferace nádorových nebo hyperproliferativních buněk. Konkrétní výhodný kit obsahuje A/C/N/53 a paclitaxel.

Prostředek podle vynálezu je vhodný pro léčbu savčích buněk. Přitom je buňkám podána celková dávka tumor-supresorového proteinu nebo tumor-supresorové nukleové kyseliny, kde uvedená celková dávka je podána opakovaně se zvyšující se dávkou uvedeného tumor-supresorového proteinu nebo tumor-supresorové nukleové kyseliny. Výhodně jsou opakované dávky podány s odstupem alespoň 6 hodin. Léčba by měla zahrnovat podání alespoň tří zvyšujících se dávek a dávky mohou být podány denně. V jednom provedení může být zahrnuto podání alespoň tří dávek s odstupem přibližně 24 hodin. V jiném provedení je zahrnuto podání tumor-supresorové nukleové kyseliny v celkové dávce v rozmezí od přibližně 1 x 10⁹ do přibližně 7,5 x 10¹⁵, nebo od přibližně 1 x 10¹¹ do přibližně 7,5 x 10¹³, adenovirových částic v jednom z následujících léčebných režimů: celá dávka v jedné dávce, celá dávka podaná denně během 5 dnů, celá dávka podaná denně během 15 dnů a celá dávka podaná denně během 30 dnů. Způsob může dále obsahovat podání paclitaxelu nebo derivátu paclitaxelu v celkové dávce v rozmezí od 75 až 350mg/m² během 24 hodin v jednom z následujících léčebných režimů: podání v jedné dávce, celková dávka podávána denně v den 1 a 2, celková dávka podávána denně v den 1, 2 a 3, celková dávka podaná v 15 dnech, celková dávka podaná ve 30 dnech, denní kontinuální infuse podobu 15 dnů, denní kontinuální infuse podobu 30 dnů. Tento dávkovači režim může být opakován dvakrát nebo vícekrát a dva cykly mohou být podány s odstupem tří až 4 týdnů. Takto léčenými buňkami mohou být neoplastické buňky nádorů vybraných ze skupiny zahrnující karcinom ovaria, mesoteliom, karcinom slinivky břišní, nemalobuněčný karcinom plic, malobuněčný karcinom plic, hepatocelulámí karcinom, melanom, retinoblastom, karcinom prsu, kolorektální karcinom, leukemie, lymfomy, mozkové nádory, karcinom čípku děložního, sarkomy, karcinom prostaty, karcinom močového měchýře, nádory retikuloendotelu, Wilmsův tumor, astrocytom glioblastom, neublastom, osteosarkom, nádor ledvin a nádory hlavy a krku. Léčba vede k inhibici růstu nebo proliferace nádoru, jak je stanovena podle objemu nádoru.

Retinoblastomový protein může být pl 10^RB nebo p56^5B. Nukleová kyselina může být obsažena v rekombinantním adenovirovém vektoru. Nukleová kyselina může být obsažena v rekombinantním adenovirovém vektoru obsahujícím částečnou nebo úplnou deleci DNA pro protein IX a obsahujícím nukleovou kyselinu kódující p53 protein. V jednom provedení je delece genomu

-4CZ 298488 B6 sekvence pro protein IX v rozsahu přibližně 3500 bp od 5' konce viru do přibližně 4000 bp od 5' konce viru. Delece DNA může obsahovat sekvence označené Ela a Elb. Rekombinantní adenovirový vektor může dále obsahovat hlavní pozdní promotor adenoviru typu 2 nebo lidský CMV promotor, trojitou vedoucí cDNA adenoviru typu 2 a lidskou cDNA pro p53. Ve výhodném provedení je vektorem ACN53. Protinádorovým činidlem může být paclitaxel, derivát paclitaxelu nebo analog paclitaxelu.

Prostředek podle vynálezu může dále obsahovat savčí nádorové nebo hyperproliferativní buňky, kde uvedené buňky obsahují exogenní tumor-supresorovou nukleovou kyselinu nebo tumorsupresorový protein a adjuvantní protinádorové činidlo. Tumor-supresorová nukleová kyselina může být nukleová kyselina kódující tumor-supresorový protein vybraný ze skupiny obsahující přirozený p53 protein a retinoblastomový (RB) protein. Retinoblastomový protein může být pl 10^RB nebo p56^RB. Buňky mohou být přítomné u savců. Buňkami mohou být neoplastické buňky nádorů vybraných ze skupiny zahrnující karcinom ovaria, mesoteliom, karcinom slinivky břišní, nemalobuněčný karcinom plic, malobuněčný karcinom plic, hepatocelulámí karcinom, melanom, retinoblastom, karcinom prsu, kolorektální karcinom, leukemie, lymfomy, mozkové nádory, karcinom čípku děložního, sarkomy, karcinom prostaty, karcinom močového měchýře, nádory retikuloendotelu, Wilmsův tumor, astrocytom, glioblastom, neuroblastom, osteosarkom, nádor ledvin a nádory hlavy a krku.

Prostředek podle vynálezu je možno použít pro léčbu metastatických buněk, která zahrnuje kontaktování buněk s tumor-supresorovou nukleovou kyselinou nebo tumor-supresorovým polypeptidem a adjuvantním protinádorovým činidlem. Kontaktováním může být lokální podání tumorsupresorové nukleové kyseliny do chirurgické rány. Způsob může dále obsahovat současné podání chemoterapeutického činidla, kterým může být cis-platina, karboplatina nebo navelbin.

Definice

Termín „adjuvantní protinádorové činidlo“ označuje činidlo, které má alespoň jednu z následujících aktivit: schopnost modulovat tvorbu nebo funkci mikrotubulů, schopnost inhibovat aktivitu polyprenyl-protein transferázy, schopnost inhibovat angiogenezi, nebo schopnost inhibovat endokrinní aktivitu. Pomocná protinádorová činidla jsou podrobněji popsána dále. Jak je zde použit, nezahrnuje termín adjuvantní protinádorové činidlo sloučeniny způsobující poškození DNA.

„Tumor-supresorové geny“ jsou nukleové kyseliny, pro které jsou mutace způsobující ztrátu funkce onkogenní. Proto absence, mutace nebo porušení normální exprese tumor-supresorového genu v jinak zdravé buňce zvyšuje pravděpodobnost nebo vede k maligní transformaci buňky. Naopak, pokud je funkční tumor-supresorový gen nebo protein přítomen v buňce, potlačuje jeho přítomnost tumorigenní, maligní nebo hyperproliferativní fenotyp buňky. Příklady tumor-supresorových nukleových kyseliny podle této definice jsou - bez omezení - pl 10^RB, p56^RGB, p53 a jiné tumor-supresorové sekvence, jak jsou popsány zde a v souvisejícím patentu US 6 210 939. Tumor-supresorové nukleové kyseliny zahrnují tumor-supresorové geny a jejich sekvence kódující aktivní fragmenty příslušného tumor-supresorového polypeptidu, stejně jako vektory obsahující takové sekvence.

„Tumor-supresorový polypeptid nebo protein“ označuje polypeptid, který - pokud je přítomen v buňce - redukuje tumorigenní, maligní nebo hyperoproliferativní fenotyp buňky.

Termín „virová částice“ označuje intaktní virion. Koncentrace infekčních adenovirových virových částic je obvykle určena spekrofotometrickou detekcí DNA, jak je popsána, například, v Huyghe (1995) Human Gene Ther. 6: 1403-1416.

Termíny „neoplasie“ nebo „neoplastický“ popisují buňky rostoucí a/nebo dělící se vyšší rychlostí, než je normální rychlost růstu pro daný typ buněk.

-5CZ 298488 B6

Termín „tumorigenicita“ nebo „tumorigenní“ označují schopnost tvorby nádorů nebo schopnost vyvolat tvorbu nádorů.

Termín „léčba buněk“ označuje inhibici nebo zmírnění jednoho nebo více onemocnění vyvolaných přítomností chorobně změněných buněk. Při použití v souvislosti s nádorovými buňkami, tzn. neoplastickými buňkami (například buňkami, kterým chybí endogenní přirozený tumorsupresorový protein) označuje termín „léčba buněk“ zmírnění nebo eliminaci neoplastického fenotypu. Typicky vede taková léčba k inhibici (redukci nebo zpomalení růstu a/nebo proliferace) buněk ve srovnání se stejnými buňkami za stejných podmínek, ale bez léčby (například adjuvantním protinádorovým činidlem a/nebo tumor-supresorovou nukleovou kyselinou nebo polypeptidem). Taková inhibice může zahrnovat buněčnou smrt (například apoptózu). Při použití v souvislosti s nádory označují tyto termíny inhibici růstu nebo proliferace nádoru (jak je například stanoven měřením objemu). Taková inhibice může být způsobena redukcí rychlosti růstu a/nebo rychlostí proliferace a/nebo smrtí buněk v nádoru. Inhibice růstu nebo inhibice proliferace může být doprovázena změnou buněčného fenotypu (například obnovením morfologie charakteristické pro zdravé buňky, obnovením kontaktní inhibice, ztrátou invazivního fenotypu, inhibici růstu nezávislého na zakotvení buněk atd.). Pro účely tohoto vynálezu budou mít chorobné buňky jeden nebo více patologických rysů. Těmito rysy může být, mimo jiné, defektní exprese jednoho nebo více tumor-supresorových proteinů. Defektní exprese může být charakterizována kompletní ztrátou jednoho nebo více funkčních tumor-supresorových proteinů nebo redukcí exprese ztrátou jednoho nebo více funkčních tumor-supresorových proteinů. Takové buňky jsou často neoplastické a/nebo tumorigenní.

Termín „systémové podání“ označuje podání prostředku nebo léku, jako jsou rekombinantní adenovirové vektory podle předkládaného vynálezu nebo pomocná protinádorová nebo cytostatická činidla podle předkládaného vynálezu, takovým způsobem, který vede k dopravení prostředku nebo léku do cirkulace. Termín „regionální podání“ označuje podání prostředku nebo léku do určitého anatomického prostoru, jako je podání intraperitoneální, intrathekální, subdurální nebo podání do určitého orgánu, a podobně. Například, regionálním podáním je podání prostředku nebo léku do arteria hepatica pro regionální podání do jater. Termín „lokální podání“ označuje podání prostředku nebo léku do určitého omezeného nebo ohraničeného anatomického prostoru, jako je intranádorová injekce do nádoru, subkutánní injekce, intramuskulární injekce a podobně. Odborníkům v oboru bude jasné, že lokální podání nebo regionální podání může také vést ke vstupu prostředku nebo léku do systémové cirkulace.

Termín „redukovaná tumorigenicita“ označuje přeměnu hyperproliferativních buněk (například neoplastických) na buňky s nižší proliferativní aktivitou. V případě nádorových buněk označuje termín „redukovaná tumorigenicita“ nádorové buňky, které se staly méně tumorigenními nebo netumorigenními nebo nádorovými a jejichž schopnost přeměny na nádorové buňky je snížena nebo eliminována. Buňky s redukovanou tumorigenicitou ani netvoří nádory in vivo, ani nemají prodloužený lag čas v řádech týdnů až měsíců před objevem nádorového růstu in vivo. Buňky s redukovanou tumorigenicitou mohou také způsobit pomalejší objemový růst nádoru ve srovnání se stejným typem buněk, které mají plně inaktivovaný nebo nefunkční tumorsupresorový gen a které jsou kultivované za stejných fyziologických podmínek (například při stejné tkáni, věku organismu, pohlaví organismu, době menstruačního cyklu atd.).

Jak je zde použit, znamená termín „aktivní fragment“ genu nebo polypeptidů menší úsek (subsekvence) genu nebo nukleové kyseliny odvozené z genu (například cDNA), které si uchovávají schopnost kodovat proteiny mající tumor-supresorovou aktivitu. Obdobně, aktivní fragment polypeptidů označuje subsekvence polypeptidů tumor-supresorového proteinu. Jedním příkladem je aktivní fragment p56^RD, který je popsán například v související USSN 08/328673, podané 25. 10. 1994.

Termín „malignita“ popisuje tumorigenní buňky mající schopnost metastázovat.

-6CZ 298488 B6

Termín „nukleové kyseliny“ označuje DNA nebo RNA. Nukleové kyseliny mohou obsahovat také modifikované nukleotidy, které umožňují správné čtení DNA polymerázou a které nemění expresi polypeptidu kódovaného nukleovou kyselinou.

Termín „nukleotidová sekvence“ zahrnuje jak kódující, tak protismyslné řetězce, jak ve formě samostatných řetězců, tak ve formě duplexu.

Termín „DNA sekvence“ označuje jednořetězcovou nebo dvouřetězcovou DNA molekulu složenou z nukleotidových bází, adenosinu, thymidinu, cytosinu a guanosinu.

Termín „sekvence nukleové kyseliny kódující“ označuje nukleovou kyselinu, která řídí expresi specifického proteinu nebo peptidu. Mezi sekvence nukleové kyseliny patří jak DNA sekvence, která je transkribována na RNA, tak RNA sekvence, která je translatována na protein. Sekvence nukleové kyseliny zahrnuje jak kompletní sekvence nukleové kyseliny, tak nekompletní sekvence nukleové kyseliny získané z kompletních sekvencí, mělo by být dále jasné, že sekvence zahrnují degenerované kodony přirozených sekvencí nebo sekvence, které mohou být vloženy pro získání přednostních kodonů pro specifické hostitelské buňky.

Termín „expresní kazeta“ označuje nukleotidová sekvence, které mohou ovlivňovat expresi strukturálního genu v hostitelích, kteří jsou kompatibilní s takovými sekvencemi. Takové kazety obsahují alespoň promotory a volitelně signální sekvence pro ukončení transkripce. Další faktory nezbytné pro nebo vhodné pro ovlivnění exprese mohou být také obsaženy, jak je podrobněji popsáno dále.

Termín „operativně navázaný“ označuje vazbu promotoru proti směru kódující sekvence vzhledem k DNA sekvenci, takže může promotor zprostředkovat transkripci DNA sekvence.

Termín „izolovaná“ nebo „významně přečištěná“, jak je použit ve vztahu k sekvencím nukleových kyselin kódujících tumorsupresorový protein nebo polypeptid nebo jeho fragmenty označuje izolované nukleové kyseliny, které nekódují jiné proteiny nebo peptidy než tumor-supresorový protein nebo polypeptid nebo jeho fragment.

Termín „rekombinantní“ označuje DNA, která byla izolována z přirozeného nebo endogenního zdroje a která byla modifikována chemicky nebo enzymaticky tak, že došlo k deleci přirozených sousedních nukleotidů nebo tak, že byly vloženy sousedící nukleotidy, které se přirozeně nevyskytují. Sousedící nukleotidy jsou ty nukleotidy, které jsou buď ve směru, nebo proti směru kódující sekvence od popsané sekvence nebo subsekvence nukleotidů.

Termín „vektor“ označuje nukleovou kyselinu, která může infikovat, transfektovat, přechodně nebo trvale transformovat buňku. Je známo, že vektorem může být holá nukleová kyselina nebo nukleová kyselina v komplexu s proteinem nebo lipidem. Vektor volitelně obsahuje virové nebo bakteriální nukleové kyseliny a/nebo proteiny a/nebo membrány (například buněčnou membránu, virový lipidový obal a podobně). Je známo, že vektory často obsahují expresní kazetu, která umísťuje požadovanou nukleovou kyselinu pod kontrolu promotoru. Vektory zahrnují, ale nejsou omezeny na, replikony (například plazmidy nebo bakteriofágy), na které mohou být fragmenty DNA připojeny a replikovány. Vektory tak zahrnují, bez omezení, RNA, autonomní samoreplikující se cirkulámí DNA (plazmidy) a zahrnují jak expresní, tak neexpresní plazmidy. Pokud je uvedeno, že rekombinantní mikroorganismus nebo buněčná kultura je hostitelem „expresního vektoru“, tak to znamená, že buď extrachromosomální cirkulámí DNA, nebo DNA byla vložena do chromosomu hostitele. Pokud je vektor uchováván v hostitelské buňce, tak může být buď stabilně replikován buňkou během mitosy jak autonomní struktura, nebo je inkorporován do genomu hostitele.

Termín „účinné množství“ označuje takové množství vektoru nebo léčiva, které je účinné v kontrole růstu a/nebo proliferace buněk.

-7CZ 298488 B6

Zkratka „C.I.U.“ označuje „buněčné infekční jednotky“. Hodnota C.l.U. je vypočítána měřením buněk pozitivních nebo virový hexon protein (například 293 buněk) po 48 hodinovém infekčním období (Huyghe (1995) Human Gene Ther. 6: 1403-1416).

Zkratka „m.o.i.“ znamená „mohutnost infekce“ a je uvedena v C.I.U. na buňku.

Termín „paclitaxel“ označuje lék, který je komerčně dostupný jako Taxol^R. Taxol^R inhibuje replikaci eukaryotických buněk zvýšením polymerizace tubulinových skupin ve stabilizovaných svazcích mikrotubulů, které potom nejsou schopné reorganizace na správné struktury nutné pro mitosu.

Termín „kontaktování buněk“ v souvislosti s kontaktováním s lékem a/nebo nukleovou kyselinou označuje kontaktování provedené tak, že lék a/nebo nukleová kyselina je intemalizován do buňky. V tomto významu je kontaktování buněk s nukleovou kyselinou ekvivalentní transfekci buněk nukleovou kyselinou. Pokud je lék lipofilní nebo pokud je nukleová kyselina v komplexu s lipidem (například kationtovým lipidem), tak prosté kontaktování vede k transportu (aktivnímu, pasivnímu a/nebi difusi) do buňky. Alternativně mohou být lék a/nebo nukleová kyselina samotné, nebo v kombinaci s nosičem, aktivně transportovány do buněk. Například, pokud je nukleová kyselina přítomna v infekčním vektoru (např. adenoviru), tak může vektor zprostředkovat vychytávání nukleové kyseliny buňkou. Nukleová kyselina může být v komplexu s činidly, která specificky interagují s extracelulámími receptory pro usnadnění přenosu nukleové kyseliny do buněk, jak je tomu například v komplexech ligand/polykationt/DNA, které jsou popsány v patentech US 5 166 320 a US 5 635 383. Dále, virový přenos může být zesílen rekombinantní modifikací klubkových nebo vláknových domén virového genomu tak, aby obsahovaly cílové skupiny buněk.

Konstrukty označené „A/C/N/53“ a „A/M/N/53“, P100^RB, p56^RD označují konstrukty takto označené v souvisejících přihláškách USSN 08/328673, podané 25. 10. 1994 a v Mezinárodní patentové přihlášce WO 95/11 984.

Termín „konzervativní substituce“, jak je použit v souvislosti s proteiny, označuje změnu v aminokyselinovém složení proteinu, která významným způsobem nemění aktivitu proteinu. Tak označuje termín „konzervativně modifikované variace“ určené aminokyselinové substituce takových aminokyselin, které nejsou zásadní pro aktivitu proteinu nebo substituce takovými aminokyselinami, které mají podobné vlastnosti (například acidických, bazických, pozitivně nebo negativně nabitých, polárních nebo nepolárních atd.), takže I substituce zásadních aminokyselin významným způsobe nemění aktivitu. Tabulky konzervativních substitucí obsahujících funkčně podobné aminokyseliny jsou v oboru dobře známé. Například, každý ze šesti následujících skupin obsahuje aminokyseliny, které jsou navzájem konzervativní:

1) alanin (A), serin (S), threonin (T);

2) kyselina asparagová (D), kyselina glutamová (E);

3) asparagin (N), glutamin (Q);

4) arginin (R), lysin (K);

5) isoleucin (I), leucin (L), methionin (M, valin (V); a

6) fenylalanin (F), tyrosin (Y), tryptofan (W).

Viz též Creighton (1984), Proteins W.H. Freeman and Company. Dále, jednotlivé substituce, delece nebo adice, které alterují, přidávají nebo deletují jednu aminokyselinu nebo malé procento aminokyselin v kodonové sekvence, jsou také považovány za „konzervativně modifikované variace“.

-8CZ 298488 B6

Popis obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje in vitro inhibici SK-OV-3 buněk ovariálního nádoru různými koncentracemi p53 (A/C/N/53) a/nebo Taxolu^R.

Obr. 2 je isobologram pro pokus uvedený na obr. 1. Byl pozorován synergismus mezi Taxolem^R a p53 (A/C/N/53), když byly buňky vystaveny působení Taxolu^R 24 hodin před léčbou p53.

Obr. 3a, 3b a 3c ilustrují účinnost p53 Ad na xenotransplantáty lidského karcinomu prsu na holých myších. Myším byla podána celková dávka 2,2 x 10⁹ C.I.U. adenoviru (A/C/N/53 nebo Ad) na myš v 10 injekcích ve dny 0-4 a 7-11. Myši byly ošetřeny p53 Ad, β-gal Ad nebo vehikulem samotným. Obr. 3a ilustruje výsledky při použití nádorů MDA-MB-231. Obr. 3b ilustruje výsledky při použití nádorů MDA-MB^168 (-468). Obr. 3c ilustruje výsledky při použití nádorů MDA-MB-435 (-435).

Obr. 4a a 4b ukazují křivky dávky-odpověď pro p53 (A/C/N/53) pro tumory MDA-MB-231 (-231) (obr. 4a) a pro tumory MDA-NB-468 (obr. 4b). Myším byla podána dávka 1 x 10⁷ - 1 x 10⁹ C.I.U. p53 Ad (A/C/N/53) rozdělená do 10 dávek podaných peritumorálně v dny 0—4 a 7-10. Průměrné procento inhibice bylo vypočítáno srovnáním objemů tumoru pro každou dávku p53 Ad s nádory ošetřenými pufrem v dny 14/15, 18, 21, 24, 28, 30/32 a 35 (nádory MDA-MB-468 pouze v den 35). Průměrný objem -231 nádorů byl v den 0 přibližně 22,5 ± 1,2 mm³, zatímco průměrný objem -468 nádorů byl v den 0 přibližně 33,1 ± 1,8 mm³.

Obr. 5 ukazuje srovnání účinnosti terapeutického činidla podaného v jedné bolusové dávce a v dělených dávkách. Do nádorů byla podána celková dávka 2,2 x 10⁸ C.I.U. p53 Ad za týden během týdnu 1 a 3.

Obr. 6 ukazuje účinnost více cyklů nízká dávky p53 Ad na velké, dobře uchycené nádory. Do xenotransplantátů MDA-MB-468 byla podána celková dávka 1,32 x 10⁹ C.I.U. p53 Ad během 6 týdnů. (P = plato v kontrole růstu nádorů; E = konec aplikace).

Obr. 7a, 7b a 7c ukazují in vivo inhibici MA-MB^168 nádorů u holých myší po dávkách 1,10⁹C.I.U. p53 Ad (A/C/N/53) v jedné bolusové dávce (7a), ve třech injekcích (7b) nebo v 5 injekcích (7c).

Obr. 8 ukazuje schopnost nízkých dávek dexamethasonu potlačovat inhibici nádorového růstu zprostředkovanou NK buňkami u SCID myší. Do MDA-MB-231 nádorů byla podána celková dávka 2 x 10⁹ A/C/N/53 β-gal Ad (1,1 x 10¹¹ virových částic) v 10 injekcích podaných v den 14 - 18 a 21 -25. Subkutánní pelety obsahující dexamethasou (nebo placebo) uvolňovaly 83,3 pg steroidu za den.

Obr. 9 ukazuje srovnání kombinace terapie p53 a cisplatinou na normálních a na nádorových buňkách.

Předkládaný vynález obsahuje nové způsoby pro inhibici růstu a/nebo proliferace buněk, přesně růstu a proliferace nádorových buněk. V jednom provedení způsoby obsahují kontaktování buněk s tumor-supresorovou nukleovou kyselinou nebo tumor-supresorovým proteinem a s adjuvantním protinádorovým činidlem. Obvykle bude tumor-supresorový protein nebo nukleová kyselina stejného druhu, jako je chybějící tumor-supresorový protein. Tak, pokud buňkách chybí endogenní aktivita p53, bude použit p53 protein nebo nukleová kyselina pro p53.

Překvapivým objevem předkládaného vynálezu je zjištění, které je v protikladu ke dřívějším studiím (viz například Wahl et al., (1996) Nátuře Med. 2(1): 72-79 a Hawkins et al., (1996) Cancer Res. 56: 892-898), že terapie savčích buněk, kterým chybí nebo které mají deficit endogenního

-9CZ 298488 B6 přirozeného tumor-supresorového proteinu (tj. mnoha neoplastických buněk) kombinací adjuvantního protinádorového činidla (například paclitaxelu (Taxol)^R)) a tumor-supresorového genu nebo polypeptidu (například p53), vede k inhibici proliferace a/nebo růstu buněk, která je vyšší, než je inhibice pozorována při použití chemické léčby nebo léčby tumor-supresorovým konstruktem samotným. Kromě toho bylo zjištěno, že předléčení adjuvantním protinádorovým činidlem vede k výraznému zvýšení antiproliferačního účinku tumor-supresorové nukleové kyseliny. Bez vazby na konkrétní teorii se soudí, že mechanismus tohoto účinku adjuvantního protinádorového činidla je: zvýšení transfekční účinnosti různých vektorů pro genovou terapii (například adenovirových vektorů); nebo zvýšení exprese tumor-supresorového genu; nebo stabilizace mikrotubulů usnadňující intracelulámí přenos viru; nebo zvýšená účinnost způsobená interakcemi různých intracelulámích mechanismů (například signální drah, apoptotické dráhy, drah řídících buněčných cyklus).

Prostředek podle vynálezu je možno dále použít pro inhibici chorobně změněných savčích buněk postrádajících nebo deficitních na endogenní přirozený tumor-supresorový protein, která zahrnuje kontaktování buněk s adjuvantním protinádorovým činidlem a s tumor-supresorovou nukleovou kyselinou a/nebo tumor-supresorovým polypeptidem. Pokud jsou buňky přítomny v nádoru, pak toto ošetření inhibuje růst nádoru. Zejména výhodnými tumor-supresorovými nukleovými kyselinami nebo polypeptidy jsou p53, RB, h-NUC (viz například Chen (1995) Cell Growth Differ, 6: 199-210) nebo jejich aktivní fragmenty (například pl 10RB, p56RB) a zejména výhodným pomocnými protinádorovými činidly (sloučeninami) jsou paclitaxel a sloučeniny s aktivitou podobnou paclitaxelu, jako jsou deriváty paclitaxelu (například analogy paclitaxelu).

Objevem předkládaného vynálezu také je, že kontaktování buněk s tumor-supresorovou nukleovou kyselinou a/nebo polypeptidem může inhibovat metastatické buňky. Taková inhibice může mít formu inhibice tvorby, růstu, migrace nebo reprodukce metastatických buněk. V jednom provedení může být inhibice charakterizována inhibici (například redukcí a/nebo eliminací) vzniku nádorů oddělujících se od primárního tumoru. Provádí se přitom kontaktování metastatických buněk s tumor-supresorovou nukleovou kyselinou a/nebo tumor-supresorovým polypeptidem. V zejména výhodném provedení jde o kontaktování buněk v místě chirurgického zásahu (například po odstranění (debulkingu) nádorové hmoty) s tumor-supresorovou nukleovou kyselinou a/nebo tumor-supresorovým polypeptidem v kombinaci s adjuvantním protinádorovým činidlem. Buňky mohou být dále kontaktovány s adjuvantním protinádorovým činidlem, jak je zde popsáno.

Aplikace prostředku podle vynálezu zahrnuje léčebné režimy využívající tumor-supresorové geny a genové produkty. Částečně jsou tyto režimy založeny na překvapivém objemu, že tumorsupresorové nukleové kyseliny a/nebo polypeptidy jsou účinnější v inhibici buněčného nebo nádorového růstu, když jsou podány ve více dávkách oproti podání v jedné bolusové dávce.

Pořadí podání tumor-supresorového a protinádorového činidla není zásadní. Proto mohou být prostředky podány simultánně nebo sekvenčně. Například, v jednom provedení zvyšuje předléčení alespoň jedním adjuvantním protinádorovým činidlem (samostatný nebo v kombinaci s cytostatickým činidlem) účinnost následně podané tumor-supresorové nukleové kyseliny a/nebo polypeptidu. V jednom provedení je cytostatické činidlo podáno před adjuvantním protinádorovým činidlem a tumor-supresorovou nukleovou kyselinou a/nebo polypeptidem. V jiném provedení je adjuvantní protinádorové činidlo (samostatně nebo v kombinaci s cytostatickým činidlem) podáno simultánně s tumor-supresorovou nukleovou kyselinou a/nebo polypeptidem. V ještě jiném provedení je tumor-supresorová nukleová kyselina a/nebo polypeptid podána před podáním adjuvantního protinádorového činidla.

Protinádorový účinek podaných prostředků také zahrnuje protinádorový, nespecifický účinek, takzvaný „vedlejší účinek“, (viz například Zhang (1996) Cancer Metastasis Rev. 15: 385^401 aOkada (1996) Gene Ther. 3: 957-96). Kromě toho, imunitní systém může být také buněčný systém imunity, tj. může být ovlivňována odpověď B buněk a/nebo T buněk (například cyto-10CZ 298488 B6 toxických lymfocytů (CTL) nebo lymfocytů infiltrujících nádor (TIL)). Zvýšení TIL je například pozorováno po podání adenoviru exprimujícího p53 lidem. Přesněji, zvýšení TIL (fenotypicky

T_H buněk, CD3+ a CD4+) je pozorováno po podání adenoviru exprimujícího p53 do arteria hepatica při léčbě metastáz karcinomu do jater, jak je podrobněji popsána dále.

Je jasné, že vynález není omezen na použití jednoho adjuvantního protinádorového činidla, ani na použití jednoho cytostatika. Tak je možno je použít pro inhibici chorobně změněných savčích buněk postrádajících endogenní přirozený tumor-supresorový protein, nebo inhibici nádoru obsahujícího takové buňky, zahrnující kontaktování buněk nebo nádoru s tumor-supresorovou nukleovou kyselinou a jedním nebo více pomocnými protinádorovými činidly, jak jsou zde popsána.

I. Pomocná protinádorová činidla

A. Činidla ovlivňující mikrotubuly

Jak je uvedeno výše, v jednom provedení je vynález použitelný pro inhibici chorobně změněných savčích buněk postrádajících endogenní přirozený tumor-supresorový protein, která zahrnuje kontaktování buněk nebo nádoru s tumor-supresorovým proteinem nebo tumor-supresorovou nukleovou kyselinou a adjuvantním protinádorovým činidlem, jako je činidlo ovlivňující mikrotubuly (například paclitaxel, derivát paclitaxelu nebo sloučenina podobná paclitaxelu). V předkládaném vynálezu je činidlo ovlivňující mikrotubuly sloučenina, která interferuje s mitózou, tj. sloučenina mající antimitotický účinek, tím, že ovlivňuje tvorbu a/nebo účinek mikrotubulů. Takovými činidly jsou například činidla stabilizující mikrotubuly nebo činidla, která narušují tvorbu mikrotubulů.

Činidla ovlivňující mikrotubuly použitelná v předkládaném vynálezu jsou v oboru dobře známá a patří sem, bez omezení, allokolchicin (NCS 406042), Halichondrin B (NSC 609395), kolchicin (NSC 757), deriváty kolchicinu (například NCS 33410), dolastatin 10 (NSC 3761128), maytansin (NSC 153858), rhizoxin (NSC 332598), paclitaxel (Taxol^R, NSC 125973) deriváty Taxolu^R(například NCS 608832) thiokolchicin (NSC 361792), tritylcystein (NSC 83265), vinblastin sulfát (NSC 49842), vinkristin sulfát (NSC 67574), epothilon A, epothilon a discodermolid (viz Serice, (1996), Science 274: 2009), estramustin, nocodazol, MAP4, a podobně. Příklady takových činidel jsou popsány v odborné a patentové literatuře, viz například Bulinksky (1997)

J. Cell Sci. 110: 3055-3064; Panda (1997) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94: 10560-10564; Muhlradt (1997) Cancer Res. 57: 3344-3346; Nicolau (1997) Nátuře 387: 286-272; Vasquez (1997) Mol. Biol. Cell. 8: 973-985; Panda (1996) J. Biol. Chem. 271: 29807-29812.

Zejména výhodnými činidly jsou sloučeniny s aktivitou podobnou paclitaxelu. Sem patří, bez omezení, paclitaxel a deriváty paclitaxel (sloučeniny podobné paclitaxelu) a analogy paclitaxelu. Paclitaxel a jeho deriváty jsou komerčně dostupné. Kromě toho, způsoby výroby paclitaxelu a derivátů paclitaxelu a analogů paclitaxelu jsou odborníkům v oboru dobře známé (viz například patenty U.S. 5 569 729; US 5 565 478; US 5 530 020; US 5 527 924; US 5 508 447;

US 5 489 589; US 5 488 116; US 5 484 809; US 5 484 809; US 5 478 854; US 5 478 736;

US 5 475 120; US 5 486 769; US 5 461 169; US 5 440 057; US 5 422 364; US 5 411 984;

US 5 405 972; a US 5 296 506.

Další činidla ovlivňující mikrotubuly mohou být hodnocena pomocí jednoho z testů, které jsou známé v oboru, například pomocí semiautomatizovaného testu, který měří tubulinpolymerizační aktivitu analogů paclitaxelu v buněčném testu pro stanovení potenciálu těchto sloučenin pro blokování buněk v mitose (viz Lopes (1997) Cancer Chemotherap. Pharmacol. 41: 37^47).

Obecně je aktivita testované sloučeniny určena kontaktováním buňky se sloučeninou a určením toho, zdaje či není narušen buněčný cyklus, zejména z důvodů inhibice mitosy. Taková inhibice může být způsobena narušením mitotického aparátu, například narušením normální tvorba vře

-11 CZ 298488 B6 ténka. Buňky s poruchou mitosy mohou být charakterizovány změnou morfologií (například skladbou mikrotubulů, zvýšeným počtem chromosomů atd.).

Ve výhodném provedení jsou sloučeninou s možnou polymerizační aktivitou na tubulin vyhledávány in vitro. Ve výhodném provedení jsou sloučeniny vyhledávány na kultivovaných WR21 buňkách (odvozených z linie 69-2 wap-ras myší), kde je stanovována inhibice proliferace a/nebo změněná buněčná morfologie, zejména skladba mikrotubulů. In vivo skríning pozitivních sloučenin může být potom proveden za použití holých myší nesoucích WR21 nádorové buňky. Podrobný protokol pro tuto skríningovou metodu je popsán v Porter (1995) Lab. Anim. Sci. 45 (2): 145-150.

Další metody pro vyšetřování sloučenin na požadovanou aktivitu jsou v oboru dobře známé. Typicky takové testy obsahují testy na inhibici tvorby a/nebo rozkladu mikrotubulů. Testy na tvorbu mikrotubulů jsou popsány například v Gaskin et al. (1974) J. Molec. Biol. 89: 737-758. patent US 5 569 720 také obsahuje in vitro a in vivo testy na vyhledávání sloučenin s aktivitou podobnou paclitaxelu.

B. Inhibitory polyprenyl-protein transferázy

Do vynálezu je zahrnuto i kombinované použití tumor-supresorových nukleových kyselin a/nebo polypeptidů a inhibitorů polyprenyl-protein transferázy. Mezi zejména výhodné inhibitory polyprenyl-protein transferázy patří, bez omezení, inhibitory famesyl-protein transferázy (FPT), inhibitory geranylgeranyl-protein transferázy a jiných monoterpen-protein transferáz. Příklady sloučenin, které jsou inhibitory polyprenyl-protein transferázy, jsou dobře známé v odborné a patentové literatuře, viz například Zhang (1997). J. Biol. Chem. 272: 10232-10239; Njoroge (1997) J. Med. Chem. 40: 4290-4301; Mallams (1997) Bioorg. Med. Chem. 5: 93-99.

Příklady inhibitorů famesyl-protein transferázy jsou uvedeny dále:

FPT inhibitor, označený „FPT39“, je popsán v mezinárodní přihlášce WO 97/23478, podané 19.12, 1996, ve které je jako FTP39 označena sloučenina „39.0“, viz strana 95 WO 97/23 478.

Sloučenina FPT39:

Cl (39.0)

Jak je popsáno dále, FTP39 je použit v kombinované terapii s p53 exprimujícím adenovirem podle předkládaného vynálezu při léčbě buněk nádoru prostaty a nádorů prsu, kdy kombinace je účinnější v usmrcení buněk než léčba každým činidlem samostatně.

Oligopeptidy (většinou tetrapeptidy, ale také pentapeptidy mající vzorec Cas-Xaal-Xaa2-Xaa3; EPA 461 489; EPA 520 823; EPA 528 486 a WO 95/11917).

Peptidomimetické sloučeniny, zejména Cys-Xaa-Xaa-Xaa mimetika: EPA 535 730;

EPA 535 731; EPA 618 221; WO 94/09 766; WO 94/10 138; WO 94/07 966; US 5 326 733;

US 5 340 828; US 5 420 245; WO 95/20 396; US 5 439 918 a WO 95/20 396.

Famesylované peptidomimetické sloučeniny - zejména famesylované Cas-Xaa-Xaa-Xaa mimetikum: GB-A2 276 618.

Jiné peptidomimetické sloučeniny: US 5 352 705; WO 94/00 419; WO 95/00 497; WO 95/09 000; WO 95/09 001; WO 91/12 612; WO 95/25 086; EPA 675 112 a FR-A 2 718 149.

Kondenzované tricyklické benzocykloheptapyridiny: WO 95/10 514; WO 95/10 515; WO 95/10 516; WO 96/30 363; WO 96/30 018; WO 96/30 017; WO 96/ 362; WO 96/31 111; WO 96/31 478; WO 96/31 477; WO 96/31 505; Mezinárodní patentová přihláška PCT/US96/19603 WO 97/23 478.

Deriváty famesylu: EPA 534 546; WO 94/19 357; WO 95/08 546; EPA 537 007 aWO 95/13 059.

Přirozené produkty a deriváty: WO 94/18 157; US 5 430 055; GB-A2 261 373; GB-A 2 261 374; GB-A 2 261 375; US. 5 420 334; US 5 436 263.

Jiné sloučeniny: WO 94/26 723; WO 95/08 542; US 5 420 157; WO 95/21 815 a WO 96/31 501.

C. Sloučeniny s antiangiogenní aktivitou

Tumor-supresorové proteiny a nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou být podány také společně se sloučeninami s antiangiogenní aktivitou. Výhodné sloučeniny s antiangiogenní aktivitou inhibují tvorbu nebo proliferaci cév, lépe tvorbu a/nebo proliferaci cév v národu.

Mezi vhodné sloučeniny s antiangiogenní aktivitou patří - bez omezení - galardin (GM6001, Glycomed, lne., Alameda, CA), inhibitory odpovědi endotelu (například interferon α, TNP-470 a inhibitory vaskulámího endotelového růstového faktoru), činidla, která napomáhají rozrušení buněčné matrix (například Vitaxin (lidská LM-609 protilátka, Ixsys CO., San Diego, CA; Metastat, CollaGenex, Newtown, PA; a Marimastat BB2516, British Biotech), a činidla, která působí přímo na růst cév (například CM-101, který je odvozen od exotoxinu antigenú streptokoku skupiny A a který se váže na nové krevní cévy a způsobuje intenzivní zánětlivou odpověď u hostitele, a Thalidomid).

Také bylo zjištěno, že několik druhů steroidů vykazuje antiangiogenní aktivitu. Konkrétně, několik studií uvedlo, že medroxyprogesteronacetát (MPA), syntetický progesteron, výrazně inhibuje neovaskularizaci v testu na králičí rohovce (Oikawa (1988) Cancer Lett. 43: 85). Proléčivo 5-Fu, 5'-deoxy-5-fluorerudin (5'-FUDR), může být také charakterizováno jako antiangiogenní sloučenina, protože 5'DFUR je konvertován na 5FU thymidin-fosforylázovou aktivitou PDECGF/TP. 5'DFUR může být selektivně aktivní pro PD-ECGF/TP pozitivní nádorové buňky s vysokým angiogenním potenciálem. Poslední klinické studie ukázaly, že 5'DFUR je pravděpodobně účinný pro PD-ECGF/TD pozitivní nádory. Bylo prokázáno výrazné zvýšení protinádorového účinku 5-DFUR a PD-ECGF/TP transfektovaných buněk ve srovnání anetransfektovanými přirozenými buňkami (Haraguchi (1993) Cancer Res. 53: 5680-5682). Kromě toho, kombinované sloučeniny 5'DFUR a MPA vykazují také silný antiangiogenní účinek (Yayoi (1994) Int. J. Oncol. 5: 27-32). Kombinace 5'DFUR a MPA může být charakterizována jako kombinace dvou inhibitorů angiogeneze s různými spektry, tj. kombinace inhibitoru endotelového růstového faktoru s inhibitorem proteázy. Kromě toho, v in vivo pokusech využívajících

- 13CZ 298488 B6

DMBA-indukovaný karcinom prsu u krys vykazoval 5' DFUR kombinovaný účinek s AGM1470 (Yamamoto (1995) Oncol. Report 2: 793-796).

Jinou skupinou sloučenin s antiangiogenní aktivitou, které jsou použitelné v předkládaném vynálezu, jsou polysacharidy, které mohou interferovat s funkcí růstových faktorů s vazbou na heparin, které navozují angiogenezi (například pentosanpolysulfat).

Mezi další modulátory angiogeneze patří destičkový faktor IV a AGM 1470. Ještě další modulátory angiogeneze jsou získány z přirozených zdrojů a patří sem inhibitor kolagenázy, analogy vitaminu D3, fumigallin, herbimycin A a isoflavony.

D) Endokrinní terapie

Endokrinní terapie, která je známou a dobře zavedenou cytostatickou léčbou, může vést k přechodu hormonálně-dependentních buněk do klidové fáze a může redukovat počet nádorových buněk in vivo a může inhibovat růst nádorů u pacientů s hormonálně-dependentními nádory. Očekává se, že taková terapie zvýší účinek tumor-supresorových činidel v léčbě hyperproliferativních buněk. Tak obsahuje vynález v dalším aspektu kombinované použití tumor-supresorové nukleové kyseliny a/nebo polypeptidu a antiestrogenu, antiandrogenu nebo antiprogestinu. Hormonální léčiva jsou v oboru dobře známá a patří sem, například, tamoxifen, toremifen (viz např. US 4 696 949), flutamid, megace a lupron (viz též například WO 91/00 732); WO 93/10 741; WO 96/26 201 a Gauthier et al., J. Med. Chem. 40: 2117-2122 (1997).

E) Podání adjuvantních protinádorových činidel: Farmaceutické prostředky

Farmaceutické prostředky

Pomocná protinádorová činidla použitá ve způsobech podle předkládaného vynálezu jsou obvykle kombinována s farmaceuticky přijatelným nosičem (přísadou) za vzniku farmaceutického prostředku. Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat jedno nebo více adjuvantních protinádorových činidel s nebo bez tumor-supresorového genu nebo polypeptidu, například p53 nebo RB.

Farmaceuticky přijatelné nosiče mohou obsahovat fyziologicky přijatelnou sloučeninu, která například stabilizuje prostředek nebo zvyšuje nebo snižuje absorpci činidla a/nebo farmaceutického prostředku. Mezi fyziologicky přijatelné sloučeniny patří, například, uhlovodany, jako je glukóza, sacharóza nebo dextrany, antioxidační činidla, jako je kyselina askorbová nebo glutathion, chelační činidla, proteiny s nízkou molekulovou hmotností, prostředky, které redukují klírens nebo hydrolýzu adjuvantních protinádorových činidel, nebo přísady nebo jiná stabilizační činidla a/nebo pufry. Detergenční činidla mohou být také použita pro stabilizaci prostředků nebo pro zvýšení nebo snížení absorpce farmaceutického prostředku (příklady detergenčních činidel viz dále).

Mezi další fyziologicky přijatelné sloučeniny patří smáčivá činidla, emulgační činidla, dispergační činidla nebo konzervační činidla, která jsou zejména vhodná pro prevenci růstu nebo působení mikroorganismů. Různá konzervační činidla jsou dobře známá a patří mezi ně například fenol nebo kyselina askorbová. Odborníkům v oboru bude jasné, že volba farmaceuticky přijatelného nosiče, včetně fyziologicky přijatelné sloučeniny, závisí, například, na způsobu podání adjuvantního protinádorového činidla a na fyzikálně chemických vlastnostech adjuvantního protinádorového činidla.

Prostředky pro podání budou obvykle obsahovat roztok adjuvantního protinádorového činidla ve farmaceuticky přijatelném nosiči, výhodně ve vodném nosiči pro adjuvantní protinádorové činidlo rozpustné ve vodě. Mohou být použity různé nosiče, například pufrovaný salinický roztok a podobně. Tyto roztoky jsou sterilní a prosté nežádoucího materiálu. Tyto prostředky mohou být

- 14CZ 298488 B6 sterilizovány běžnými, dobře známými technikami sterilizace. Prostředky mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné pomocné složky, které jsou nutné pro přiblížení prostředku fyziologickým podmínkám, jak jsou činidla pro úpravu pH a pufrovací činidla, činidla upravující tonicitu a podobně, jako je například octan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, laktát sodný a podobně. Koncentrace adjuvantního protinádorového činidla v těchto prostředcích se může velmi lišit a může být vybrána primárně podle objemu kapaliny, podle viskozity, tělesné hmotnosti a podobně, podle vybraného způsobu podání a potřeb pacienta.

Způsoby podání.

Pomocná protinádorová činidla použitá ve způsobech podle předkládaného vynálezu mohou být podána samostatně nebo ve farmaceutických prostředcích (s nebo bez tumor-supresorového činidla, například p53) jakýmkoliv v oboru známým způsobem, například systémově, regionálně nebo lokálně; intraarteriálně, intratumorálně, intravenózně (IV), parenterálně, do pleurální dutiny, lokálně, orálně, nebo lokálně, například subkutánně, intratracheálně (například ve formě aerosolu) nebo transmukosálně (například bukálně, intravesikálně, vaginálně, do děložní dutiny, rektálně, nasálně), intratumorálně (například transdermálně nebo lokální injekcí). Zejména výhodným způsobem podání je podání intraarteriální, zejména tehdy, pokud je žádoucí „regionální účinek“, například zaměřený na specifický orgán (například mozek, játra, slezinu, plíce). Například, injekce do a. hepatica je výhodná, pokud je žádoucí regionální protinádorový účinek v játrech; nebo, injekce do a. carotis je výhodná, pokud je žádoucí podání prostředku od mozku (například pro léčbu mozkových nádorů), karotidy, nebo artérie patřící ke karotickému systému (například a. occipitalis, a. auricularis, a. temporalis, mozkové artérie, a. maxilaris, atd.).

Paclitaxel a deriváty paclitaxelu jsou pouze částečně rozpustné ve vodných roztocích. Ve výhodném provedení jsou tyto prostředky podány přímo do nádoru lokálně (například injekcí, kanalizací, nebo přímou aplikací během chirurgického zákroku), nebo jsou solubilizovány v přijatelném činidle. Způsoby pro podání paclitaxelu a derivátů paclitaxelu jsou v oboru dobře známé (viz například patenty US 5 583 153; US 5 565 478; US 5 496 804; 4 548 809). Jiné deriváty paclitaxelu jsou ve vodě rozpustné analogy a/nebo proléčiva (viz patent US 5 411 984 a US 5 422 364) a výhodně mohou být podány jakoukoliv technikou popsanou výše.

Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu jsou zejména vhodné pro lokální podání, například po podání do chirurgických ran pro prevenci počínajících nádorů, neoplastických a metastatických buněk a jejich prekurzorů. V jiném provedení jsou prostředky vhodné pro parenterální podání, jako je intravenózní podání nebo podání do tělesných dutin nebo do lumen orgánu.

Léčebné režimy

Farmaceutické prostředky mohou být podány v různých dávkových jednotkách, v závislosti na způsobu podání. Například, mezi jednotlivé dávkové formy vhodné pro orální podání patří prášek, tablety, pilulky, kapsle a lékařské oplatky. Je známo, že adjuvantní protinádorové sloučeniny (například paclitaxel a podobné sloučeniny) musí být při orálním podání chráněny před trávením. Toto chránění je obvykle provedeno vyrobením komplexu adjuvantního protinádorového činidla s prostředkem který je činí resistentním na kyselou nebo enzymatickou hydrolýzu, nebo obalením adjuvantního protinádorového činidla vhodným resistentním nosičem, jako jsou například liposomy. Prostředky pro chránění sloučeniny před trávením jsou v oboru dobře známé (viz například patent US 5 391 377, který popisuje liposomové prostředky pro orální podání terapeutických činidel).

Dávky obvyklých chemoterapeutických činidel jsou v oboru dobře známé. Kromě toho, tyto dávky jsou obyčejně doporučenými dávkami a mohou být upraveny podle terapeutických souvislostí, tolerance pacienta atd.. Tak je například obvyklá dávka farmaceutického prostředku (například paclitaxelu) pro intravenózní podání (IV) přibližně 135 mg/m² během 1 až 24 hodin

- 15 CZ 298488 B6 (obvykle během 1, 3 nebo 6 hodin, nejlépe během 3 hodin) a tato dávka je nejlépe opakována každé tři týdny, celkem ve 3 až 6 cyklech. Pro snížení frekvence a závažnosti hypersensitivních reakcí může být pacientům také podáno přibližně 20 mg dexamethasonu (Decadron nebo jiné výrobky) orálně přibližně 12 a 6 hodin před aplikací paclitaxelu a přibližně 50 mg diphenhydraminu (BenadryÚ nebo jiné) plus přibližně 300 mg cimetidinu (Tagamet^R) nebo 50 mg ranitidinu (Zantac^R) IV 30 až 60 minut před aplikací paclitaxelu. Mohou být podány výrazně vyšší dávky (například až do 350 mg/m² na den), zejména pokud se jedná o aplikaci do ohraničeného regionu a ne do krevního řečiště, jak je tomu při aplikaci do tělesných dutin nebo do lumen orgánu. Podání významně vyšších dávek je také možné jakýmkoliv vybraným způsobem, například lokálním podáním. Způsoby pro přípravu prostředků pro parenterální podání jsou v oboru dobře známé a jsou podrobněji popsány v publikacích jako je Remingtonů Pharmaceutical Science, 15. vydání, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980) a v patentech US 5 583 153; US 5 496 804 a US 5 484 809. Obvyklé dávky pro intraperitoneální podání budou přibližně 20 až 150 mg/m² jednou týdně nebo přibližně 250 mg/m² jednou za 3 týdny.

Prostředky obsahující pomocná protinádorová činidla mohou být podány pro terapeutickou léčbu. V terapeutických aplikacích jsou prostředky podány pacientům s onemocněním charakterizovaným hyperproliferací jednoho nebo více typů buněk v takovém množství, které je dostatečné pro vyléčení nebo alespoň částečné zastavení onemocnění a/jeho komplikací. Takové množství je definováno jako „terapeuticky účinná dávka“. Účinné množství pro takové použití bude záviset na závažnosti onemocnění a celkovém zdravotním stavu pacienta.

Může být použito jednorázové nebo opakované podání prostředků, podle požadované dávky a frekvenci a tolerance pacienta. Při jakémkoliv způsobu podání by měl prostředek dodat dostatečné množství adjuvantních protinádorových činidel pro účinnou léčbu pacienta.

II. Tumor-supresorové geny a genové produkty

A) Výhodné známé tumor-supresorové geny

Jak bylo uvedeno výše, obsahuje v jednom provedení vynález způsoby pro inhibici růstu a/nebo proliferaci buněk, které obsahují kontaktování buněk s tumor-supresorovou nukleovou kyselinou a s adjuvantním protinádorovým činidlem (například paclitaxelem, derivátem paclitaxelu nebo sloučeninou podobnou paclitaxelu).

Tumor-supresorové geny jsou v oboru dobře známé a patří mez ně, například, RB, p53, APC, FHIT (viz např. Siprashvili (1997) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94: 13771-13776), BRCA1 a BRCA2, VHL, WT, DCC, FAP, NF, MEN, E-kadherin, nm23, MMCI a PCT. RB neboli retinoblastomový gen je prototypem tumor-supresorového genu a byl dobře prozkoumán (viz například Bookstein (1990) Science 247: 712-715; Benedict (1980) Cancer Invest. 8: 535-540; Riley (1990) Ann. Rev. Cell Biol. 10: 1-29; a Wienberg (1992) Science 254: 1138-1146). Snad nejlépe charakterizovaným tumor-supresorovým genem je p53, jehož vliv se předpokládá u mnoha neoplastických onemocnění, stejně jako u genetických předpokladů pro vznik různých nádorů v rodinách s Li-Freumani syndromem (viz například Wills (1994, hum. Gene Therap. 5: 1079-1088; patent US 5 532 220; WO 95/289 048 a Harris (1996) J. Nat. Canc. Inst. 88 (20): 14 42), kde tyto odkazy popisují klonování, expresi a použití p53 v genové terapii). Mezi další tumor-supresorové geny patří WT (tj. WT1 v pozici 1 lpi3) gen, který je charakteristický pro Wilmsův tumor (viz Call et al„ (1990), Cell 60:509-520; Gessler (1990), Nátuře 343: 774-778; a Rose et al., (1990), Cell 60: 495-508). Tumor-supresorový gen FHIT, pro Fragile Histidin Triad, byl zjištěn v regionu chromosomu 3 (3pl4.2, též popsaný v 3p21), o které je známo, že je častým místem translokací, zlomů a mezer a soudí se, že vede ke vzniku nádorů jícnu, žaludku a tlustého střeva (viz například Ohta et al„ (1996) Cell 84: 587-597; GenBank přírůstkové č. U469227). Tumor-supresorové geny DCC (18q21) a FAP jsou asociovány s karcinomem tlustého střeva (viz například Hedrick et al. (1994) Genes Dev. 8 (10): 1174-1184; Gen Bank přírůstkové č. X76132 pro DCC; a Wienberg (1992), Science 254:

-16CZ 298488 B6

1138-1146 pro FAP). NF tumor-supresorové geny (NFl v pozici 17ql 1 a NF2 v pozici 22ql2) jsou asociovány s neurologickými nádory (například s neurofibromatosou v případě NFl, viz například Caivthon et al. (1990) Cell 62: 193-201; Viskochil et al„ (1990); Cell 62, 187-192; Wallace et al. (1990) Science 249: 181-186; a Xug et al. (1990) Cell 62: 599-608; a s meningeomy a schwanomy v případě NF2). MEN tumor-supresorový gen je asociován s nádory v rámci syndromu mnohotné endokrinní neoplasie (viz například Weinberg, Science 254: 1138-1146; a Marshall (1991) Cell 64: 313-326). VHL tumor-supresorový gen je asociován svon Hippel-Landouvou chorobou (Latif (1993) Science 260: 1317-1320,; GenBank přírůstkové č. LI 5409). Rozsáhlé studované geny BRCA1 a BRCA2 jsou asociovány s karcinomem prsu (viz například Skolnick (1994) Science 266: 66-71,; GenBank přírůstkové č. U14680 pro BRCA1; a Teng (1996) Nátuře Genet. 13: 241-244; GenBank přírůstkové č. U43746)). Dále. Ekadheringen je asociován s invasivním fenotypem karcinomu prostaty (Umbas (1992) Cancer Res. 52: 5104-5109; Bussemakers (1992) Cancer Res. 52: 2916-2999; GenBank přírůstkové č. 272397). NM23 gen je asociován s metastázami nádorů (Dooley (1994) Hum. Genet. 93(1): 6366; GenBank přírůstkové č. X75598). K dalším tumor-supresorovým genům patří DPC4 (identifikovaný v 18q21) asociovaný s karcinomem slinivky břišní, hMLHl (3p) a mHSH2 (2q) asociované s karcinomem tlustého střeva a CDKN2 (pl6) a (9p) asociovaný smelanomem, karcinomem slinivky břišní a jícnu. Nakonec, lidský PTC gen (homolog drosophilla „patched“ (ptc) genu) je asociován se syndromem nevoidního bezacelulámího karcinomu (NBCCS) a se somatickými bazacelulárními karcinomy (viz například Hahn et al. (1996) Cell 85. 841-851). Tento seznam tumor-supresorových genů není vyčerpávající ani limitující a je míněn pouze jako ilustrace velkého počtu známých tumor-supresorových genů.

B) Identifikace a skríning dosud neznámých tumor-supresorových genů

Způsoby pro identifikaci a nebo testování tumor-supresorových genů jsou v oboru dobře známé. Obvykle jsou hyperproliferativní buňky vyšetřovány na ztrátu nebo mutaci genu, která je spojena (koreluje) s hyperproliferativním stavem. Nejpřísnějším testem pro gen, který má být kvalifikován jako tumor-supresorový gen (TSG), je jeho schopnost potlačovat tumorigenní fenotyp nádoru nebo nádorových buněk odvozených z nádoru. Tumor-supresorová nukleová kyselina je výhodně vložena do nádorových buněk jako klonován cDNA ve vhodném expresním vektoru nebo je jednotlivý chromosom nesoucí gen, který je kandidátem na tumor-supresorový gen, vložen do nádorových buněk technikou mikrobuněčného přenosu. Alternativně je produkt tumorsupresorového genu (například tumor-supresorový polypeptid) vložen do buněk a měří se proliferace buněk (například stanovením počtu buněk nebo měřením objemu nádoru, atd.). Kompletní nebo částečná inhibice proliferace (např. snížení rychlosti proliferace), kontaktní inhibice, ztráta invazivního fenotypu, diferenciace buněk a apoptóza jsou indikátory suprese tumorigenního fenotypu (redukované schopnosti neoplastického růstu).

Způsob pro skríning nádorů pro identifikaci změněných nebo neexprimovaných nukleových kyselin jsou v oboru dobře známé. Takové metody zahrnují, bez omezení, substriktivní hybridizaci (viz například Hampson (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2899), komparativní genomovou hybridizaci ((CGH), viz například WO 93/18186; Kallioniemi (1992) Science 257: 818) a monitorování exprese za použití sestav nukleokyselinových sond s vysokou hustotou (viz například Lockhart (1996) Nátuře Biotechnology 14(13): 1675-1680).

C. Příprava p53 a jiných tumor-supresorových genů

Jak bylo uvedeno výše, vynález obsahuje kontaktování buněk, například in vitro, ve fyziologickém roztoku (například v krvi), ve tkáni orgánu, nebo v organismu, s tumor-supresorovou nukleovou kyselinou nebo produktem tumor-supresorového genu, jako je například polypeptid. Tumor-supresorovou nukleovou kyselinou nebo polypeptidem může být nukleová kyselina nebo polypeptid jakéhokoliv známého tumor-supresorového genu, včetně - bez omezení - RB., p53, h-NUC (Chen (1995), výše), APC, FHIT, BRCA1, BRCA2, VHL, WT, DCC, FAP, NF, MEN, E-kadherinu, nm23, MMCI a PTC, jak jsou popsány výše. Ve výhodném provedení je tumor- 17CZ 298488 B6 supresorem RB nukleová kyselina nebo polypeptid nebo p53 nukleová kyselina nebo polypeptid nebo jejich aktivní fragment.

V nej výhodnějším provedení je RB nebo p53 tumor-supresorová nukleová kyselina přítomna v expresní kazetě pod kontrolou promotoru, která exprimuje tumor-supresorový gen nebo cDNA při jejím umístění v cílových (například nádorových) buňkách. Způsoby pro konstrukci expresních kazet a/nebo vektorů kódujících tumor-supresorové geny jsou v oboru dobře známé a jsou popsány dále.

1. Příprava tumor-supresorové nukleové kyseliny

DNA kódující tumor-supresorové proteiny nebo subsekvence proteinů podle předkládaného vynálezu může být připravena jakoukoliv vhodnou technikou, včetně například klonování a restrikce vhodných sekvencí nebo přímou chemickou syntézou (například za použití známých informací o sekvenci, jak byly uvedeny výše), technikami jako je fosfotriesterová metoda (Narang, (1979), Meth. Enzymo. 68. 90—99), fosfodiesterová metoda (Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109-151 (1979), dietylfosforamiditová metoda (Becauge et al. (1981), Tetrahedr. lett. 22: 1859-1862), a metoda syntézy na pevném nosiči (patent US 4 458 066).

Při chemické syntéze se získá jednořetězcový oligonukleotid. Tento oligonukleotid může být přeměněn na dvojřetězcovou DNA hybridizací s komplementární sekvencí, nebo polymerizací s DNA polymerázou za použití jediného řetězce jako templátu. Odborníkům v oboru bude známo, že chemická syntéza DNA je omezena na sekvence přibližně 100 bází, delší sekvence mohou být získány ligací kratších sekvencí.

Alternativně mohou být subsekvence klonovány a vhodné subsekvence mohou být štěpeny za použití vhodných restrikčních enzymů. Fragmenty mohou být potom ligovány za vzniku požadované DNA sekvence.

V jednom provedení může být tumor-supresorová nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu klonována za použití techniky pro amplifikaci DNA, jako je polymerázová řetězová reakce (PCR). Tak je například sekvence nebo subsekvence nukleové kyseliny amplifikována PCR, za použití kódujícího primerů obsahujících jedno restrikční místo (například Ndel) a protismyslného primerů obsahujícího jiné restrikční místo (například HindlII). Takto se získá nukleová kyselina kódující požadovanou tumor-supresorovou sekvenci nebo subsekvenci, která má koncová restrikční místa. Nukleová kyselina může být potom snadno ligována do vektoru obsahujícího nukleovou kyselinu kódující druhou molekulu, který má vhodná odpovídající restrikční místa. Vhodné PCR primery mohou být vybrány odborníkem v oboru za použití publikovaných sekvencí pro jakýkoliv známý tumor-supresorové gen, cDNA nebo protein. Vhodná restrikční místa mohou být také přidány k nukleové kyselině kódující tumor-supresorový protein nebo subsekvence protein místně cílenou mutagenezí. Plazmid obsahující tumor-supresorovou sekvenci nebo subsekvenci je štěpen vhodnými restrikčními endonukleázami a potom je ligován do vektoru kódujícího druhou molekulu za použití běžných technik.

Jak je uvedeno výše, sekvence nukleových kyselin pro mnoho tumor-supresorových genů jsou známé. Tak například, sekvence nukleové kyseliny po p53 je uvedena v Lamb et al. (1986) Mol Cell Biol. 6: 1379-1385, GenBank přírůstkové č. M13111). Obdobně, sekvence nukleové kyseliny pro RB je uvedena vUee et al (1987) Nátuře 329: 642-645 (GenBank přírůstkové č. M28419). Sekvence nukleových kyselin pro další tumor-supresorové geny jsou dostupné, jak je uvedeno výše v části II(a). Za použití dostupných informací o sekvencích může odborník v oboru klonovat tumor-supresorové geny do vektorů vhodných pro provedení předkládaného vynálezu.

p53 a RB tumor-supresorové geny jsou zejména vhodné pro použití v přípravcích podle předkládaného vynálezu. Způsoby pro klonování p53 a RB do vektorů vhodných pro expresi příslušných

-18CZ 298488 B6 tumor-supresorových proteinů nebo pro použití v genové terapii jsou v oboru dobře známé. Například klonování a použití p53 je podrobně popsáno v Wills (1994), výše; v patentu US 5 532 220; v patentu US 6 210 939 a ve WO 95/11 984. Obvykle je konstruována expresní kazeta s tumor-supresorovou cDNA v operativní vazbě na promotor, nejméně na silný promotor (například Ad2 hlavní pozdní promotor (Ad2 MLP), nebo na lidský cytomegalovirový bezprostřední časný genový promotor (CMV)). V zejména výhodném provedení po promotoru následuje trojitá vedoucí cDNA a pro tumor-supresorové cDNA následuje polyadenylační místo (například Elb polyadenylační místo) (viz například patent US 6 210 939, WO 95/11 984 a Wills (1994), výše). Mělo by být jasné, že vhodné jsou také různé tkáňové specifické promotory. Například, promotor tyrosinázy může být použit pro cílení exprese na melanomy (viz například Siders (1996) Cancer Res. 56: 5638-5646). V zejména výhodném provedení je tumor-supresorová cDNA exprimována ve vektoru vhodném pro genovou terapii, jak je popsáno dále.

2. Příprava tumor-supresorového proteinu

a) Chemická syntéza de novo

Za použití známých sekvencí mohou být syntetizovány tumor-supresorové polypeptidy, tumor-supresorové proteiny nebo jejich subsekvence, za použití standardních technik peptidové syntézy, pokud jsou požadované subsekvence relativně krátké (například pokud je požadována určitá antigenní determinanta), může být molekula syntetizována jako jediný souvislý polypeptid. Pokud je požadována větší molekula, tak mohou být subsekvence syntetizovány zvlášť (v jedné nebo ve více jednotkách) a potom mohou být fúzovány kondenzací amino-konce jedné molekuly na karboxy-konec druhé molekuly, za vzniku peptidové vazby.

Syntéza na pevné fázi, ve které je C-koncová aminokyselina sekvence připojena na nerozpustný nosič a potom následuje adice zbývajících aminokyselin sekvence, je výhodnou technikou pro syntézu polypeptidů podle předkládaného vynálezu. Techniky pro syntézu na pevné fázi jsou popsány v Barany and Marrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis, str. 3-284 v The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 2: Speciál Methods in Peptide Synthesis, Part a; Merrifíeld et al., J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2156 (1963); a v Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2. vydání, Pierce Chem. Co., Rockford, 111. (1984).

b) Rekombinantní exprese

Ve výhodném provedení jsou tumor-supresorové proteiny nebo jejich subsekvence syntetizována technikou rekombinantní DNA. Obecně tato technika vyžaduje vytvoření DNA sekvence, která kóduje tužní protein, umístění DNA do expresní kazety pod kontrolou určitého promotoru, expresi proteinu v hostiteli, izolaci exprimovaného proteinu a pokud je to žádoucí, tak renaturaci proteinu.

Způsoby pro klonování tumor-supresorových nukleových kyselin do určitých vektorů jsou popsány výše. Sekvence nukleových kyselin kódující tumor-supresorový protein nebo subsekvence proteinu mohou být potom exprimovány v celé řadě hostitelů, včetně E. coli, jiných bakteriálních hostitelů, kvasinek a různých vyšších eukaryotických buněk jako jsou COS, CHO a HeLa buněčné linie a myelomové buněčné linie. Protože se tumor-supresorové proteiny obvykle vyskytují v eukaryotických buňkách, jsou přednostně použity eukaryotické hostitelské buňky. Gen pro rekombinantní protein je operativně navázán na vhodné sekvence kontrolující expresi pro každého hostitele. Pro E. coli to znamená vazbu na promotor, jako je T7, trp nebo lambda promotor, vazebné místo pro ribosomy a transkripční terminační signál. Pro eukaryotické buňky kontrolní sekvence zahrnují promotor a výhodně zesilovač transkripce odvozený od genů pro imunoglobuliny, SV40, cytomegaloviru atd., a polyadenylační sekvenci, a mohou sem také patřit sestřižené donorové a akceptorové sekvence.

-19CZ 298488 B6

Plazmidy podle předkládaného vynálezu mohou být přeneseny do vybrané hostitelské buňky za použití dobře známých technik, jak transformace E. coli za použití chloridu vápenatého a zpracování fosforečnanem vápenatým nebo elektroporace pro savčí buňky. Buňky transformované plazmidy mohou být selektovány podle resistence na antibiotika, která je způsobena geny obsaženými v plazmidech, jako jsou amp, gpt, neo a hyg geny.

Po expresi může být rekombinantní tumor-supresorový protein přečištěn za použití standardních technik, jako jsou srážení síranem amonným, afinitní kolony, chromatografie na koloně, gelová elektroforesa a podobně (viz, obecně, R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982); Deutscher, Methods in Enzymology, Vol. 182: Guide to Protein Purification., Academie Přes, lne. N.Y. (1990)). Výhodné jsou významně přečištěné sloučeniny s homogenitou alespoň 90 až 95 %, lépe s homogenitou 98 až 99 % nebo vyšší. Po přečištění na požadovanou homogenitu může být polypeptid použit (například jako imunogen pro produkci protilátek).

Odborníkům v oboru bude známo, že po chemické syntéze, biologické expresi nebo po přečištění může mít tumor-supresorový protein takovou konformaci, která se významně liší od přirozené konformace polypeptidů tvořících protein. V tomto případě je nutné denaturovat a redukovat polypeptid a potom složit polypeptid do výhodné konformace. Způsoby pro redukci a denaturaci proteinů a pro indukci opětovného složení jsou v oboru dobře známé (viz Debinsky (1993) J. Biol. Chem. 298: 14065-14070; Kreitman (1993) Bioconjug. Chem. 4: 581-585; a Buncher (1992) Anal. Biochem. 205: 263-270). Debinsky (1993) výše, například, popisuje denaturaci a redukci proteinů inkluzních tělísek v guanidin-DTE. Protein je potom znovu složen v redukčním pufru obsahujícím oxidovaný glutathion a L-arginin.

Odborníkům v oboru bude známo, že při obsažení mnoha konzervativních variací v sekvenci nukleových kyselin a polypeptidů vznikne funkčně identický produkt. Například, z důvodu degenerace genetického kódu jsou „silentní substituce“ (tj. substituce sekvence nukleové kyseliny které nevedou k alteraci kódového polypeptidů) předpokládaným rysem každé sekvence nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinu. Podobně, při „konzervativní aminokyselinové substituci“ jedné nebo několika aminokyselin v sekvenci nukleové kyseliny, při kterých jsou substituovány aminokyseliny s podobnými vlastnostmi (viz definice uvedený výše), vzniká sekvence, kteráje také značně podobná popsané aminokyselinové sekvenci, nebo popsané sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje aminokyseliny. Takové konzervativně substituované variace každé přesně popsané sekvence jsou rysem předkládaného vynálezu.

Odborníkům v oboru bude jasné, že mohou být připraveny modifikace tumor-supresorových proteinů, bez zmenšení jejich biologické aktivity. Mohou být připraveny některé modifikace pro usnadnění klonování, exprese nebo inkorporace cílové molekuly do fúzního proteinu. Takové modifikace jsou dobře známé odborníkům v oboru a patří sem, například, přidání methioninu na amino-konec pro vložení iniciačního místa, nebo přidání aminokyselin (například polyHis) na jeden z konců pro vytvoření výhodně umístěného restrikčního místa nebo terminačních kodonů nebo sekvencí usnadňujících přečištění.

Modifikace nukleových kyselin a polypeptidů mohou být hodnoceny běžnými vyšetřovacími technikami ve vhodných testech na požadovanou charakteristiku. Například, změny imunologického charakteru polypeptidů mohou být určeny vhodným imunologickým testem. Modifikace jiných vlastností, jako je hybridizace nukleové kyseliny na cílovou nukleovou kyselinu, redukční nebo termální stabilita proteinu, hydrofobní charakter, citlivost na proteolýzu, nebo tendenci k agregaci, jsou všechny testovány standardními technikami.

D) Přenos tumor-supresorové nukleové kyseliny nebo proteinu do cílových buněk

Tumor-supresorové nukleové kyseliny nebo proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být vloženy do buněk buď jako proteiny, nebo jak nukleové kyseliny. Pokud je použit tumor-supresorový protein, tak je produkt exprese tumor-supresorového genu (například p53 nebo RB

-20CZ 298488 B6 polypeptid nebo jeho fragment s tumor-supresorovou aktivitou) dopraven do cílových buněk za použití standardních metod pro dopravu proteinů (viz dále). Alternativně, pokud je použitá tumor-supresorová nukleová kyselina (například gen, cDNA, mRNA atd.), tak je nukleová kyselina vložena do buněk za použití běžných technik pro přenos nukleových kyselin do buněk. Tyto techniky obvykle zahrnují metody in vivo nebo ex vivo genové terapie, jak jsou popsány dále. Zejména výhodnou technikou pro přenos p53 a RB je přenos v lipidech nebo liposomech a/nebo použití retrovirových nebo adenovirových vektorů.

1. Genová terapie in vivo

Ve výhodném provedení jsou tumor-supresorové nukleové kyseliny (například cDNA kódující tumor-supresorový protein) klonovány do vektorů pro genovou terapii, které jsou kompetentní s transfektovanými buňkami (jako jsou lidské nebo jiné savčí buňky) in vitro a/nebo in vivo.

Pro vložení nukleových kyselin do buněk in vivo, ex vivo a in vitro bylo použito několik přístupů. Patří mezi ně přenos na bázi liposomů (WO 96/18 372; WO 93/24 640; Mannino (1988) BioTechniques 6(7): 682-691; patent US 5279833; WO 91/06309; a Flegner (1987) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414) a replíkace-defektní retrovirové vektory nesoucí sekvenci terapeutického polypeptidu jako část retrovirového genomu (viz například Milleř (1990), Mol. Cell Biol. 10: 4239 (1990); Kolbert (1992); J. NIH Res. 4: 43 a Cometta (1991) Hum. Gene Tehr. 2: 215).

Před přehled postupů genové terapie viz například Zhang (1996) Cancer Metastasis Rev 15: 385^101; Anderson, Science (1992) 256: 808-813; Nabel (1993) TIBTECH 1: 211-217; Mitani (1993) TIBTECH 11: 162-166; Mulligan (1993) Science 926-932; Dillon (1993) TIBTECH 11: 167-175; Milleř (1992) Nátuře 357: 455^160; Van Brunt (1988) Biotechnology 6 (10): 1149-1154; Vigne (1995) Restorative Neurology and neuroscience 8: 35-36; Kremer (1995) British Medical Bulletin 51 (1): 31-44; Haddada (1995), Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler and Bohm (vyd.), Springer-Verlag, Heidelberg, Germany; a Yu (1994) Gene Therapy 1: 13-26.

Vektory použitelné ve způsobech podle předkládaného vynálezu jsou obvykle virové vektory. Mezi použitelné vektory patří rekombinantně modifikované obalené nebo neobalené DNA aRNA viry, výhodně vybrané z baculoviridiae, parvoviridiae, picomaviridiae, herpesviridiae, poxviridiae, adenoviridiae, nebo picomoviridiae. Mohou být použity chimérické vektory, které využívají výhodných charakteristik použitých původních vektorů (viz například Feng (1997) Nátuře Biotechnology 15: 866-870). Takové virové genomy mohou být modifikovány rekombinantními DNA technikami tak, aby obsahovaly tumor-supresorový gen a mohou být upraveny tak, aby nebyly schopné replikace, aby byly schopné podmíněné replikace nebo kompetentní replikace. Ve výhodné provedení vynálezu jsou vektory schopné replikace nebo jsou schopné podmíněné replikace. Výhodnými vektory jsou vektory odvozené od adenovirových, adeno-asociovaných virových nebo retrovirových genomů. V nej výhodnějším provedení jsou vektory neschopné replikace odvozené od genomu lidského adenoviru.

Virové vektory schopné podmíněné replikace jsou použity pro dosažení selektivní exprese v určitých typech buněk, za vyloučení nežádoucího širokého spektra infekce. Příklady indukované se replikujících vektorů jsou uvedeny v Bischoff et al. (1996) Science 274: 373-376; Pennisi, E. (1996) Science 274: 342-343; Russell, S.J. (1994) Eur. J. of Cancer 30A(8): 1165-1171. Kromě toho, virový genom může být upraven tak, aby obsahoval indukovatelné promotory, které umožňují replikaci nebo expresi transgenu pouze za určitých podmínek. Příklady indukovatelných promotorů jsou v oboru známé (viz například Yoshida and Hamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230: 426-430; Iida et al., (1996); J. Virol. 70(9): 6054-6059; Hwang et al., (1997) J. Virol. 71(9): 7128-7131; Lee et al., (1997), Mol Cell Biol. 17(9): 5097-5105; a Dreher et al., (1997) J. Biol. Chem. 272(46): 29364-29371. Transgen může

-21 CZ 298488 B6 být také pod kontrolou tkáňově specifického promotoru, který umožňuje expresi transgenu pouze v určitém typu buněk.

Mezi používané retrovirové vektory patří ty, které jsou založeny na viru myší leukemie (MuLV), viru leukemie gibbonů (GaLV), viru opičí imunodeficience (SIV), viru lidské imunodeficience (HIV) a jejich kombinacích. Viz například Buchscher (1992) J. Virol. 66(5): 2731-2739; Johann (1992) J. Virol. 66(5): 1635-1640; Sommerfelt (1990), Virol. 176: 58-59; Wilson (1989) J. Virol. 63: 2374-2378; Miller (1991) J. Virol. 65: 2220-2224; Wong Staal et al., PCT/US94/05700; a Rosenburg and Fauci (1993) ve Fundamental Immunology, 3. vydání, Paul (Vyd.) Reval Press, Ltd., New York a odkazy zde uvedené, a Yu (1994), výše. Vektory jsou obvykle upraveny tak, aby se rozšířil rozsah působnosti vektoru na buňky, které nejsou infikovány retrovirem odpovídajícím vektoru. Obalový protein viru vesikulámí stomatitidy (VSV-G) byl použit pro konstrukci VSV-G-pseudotypizovaných HIV vektorů, které mohou infikovat hepatopoetické kmenové buňky (Naldini et al., (1996) Science 272: 263 a Akkina (1996) J. Virol. 70: 2581).

Vektory odvozené od adeno-asociovaného viru (AAV) jsou také používány k přenosu nukleové kyseliny do cílových buněk, například pro in vitro produkci nukleových kyselin a peptidů a v postupech pro in vivo a ex vivo genovou terapii. Pro přehled AAV vektorů viz Okada (1996) Gene Ther. 3: 957 - 964; West (1987) Virology 160: 68-47; Canter (1989) patent US 4 797 368; Carter et al., WO 93/24 641 (1993); Kotin (1994) Human Gene Therapy 5: 793-801; Muzyczka (1994) J. Clin. Invest. 94: 1351. Konstrukce rekombinantních AAV vektorů jsou popsány v mnoha publikacích, včetně Lebkowski, patent US 5 173 414; Tratschin (1985) Mol. Cell. Biol. 5(11): 3251-3260; Tratschin (1984) Mol. Cell Biol. 4: 2072-2081; Hermonat (1984) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 6466-6470; McLeughlin (1988) a Samulski (1989) J. Virol. 63: 3822-3828. K buněčným liniím, které mohou být transformovány rAAV patří linie popsané v Lebkowski (1988) Mol. Cell Biol. 8: 3988-3996. K dalším vhodným virovým vektorům patří herpes virus a virus vakcinie.

V zejména výhodném provedení je tumor-supresorový gen exprimován v adenovirovém vektoru vhodném pro genovou terapii. Použití adenovirových vektorů in vivo a pro genovou terapii, je dobře popsáno v obdobné a patentové literatuře, například v Hemens (1997) J. Neurosci. Methods., leden, 71 (1): 85-98; Zeiger (1996) Surgery 120: 921-925; Channon (1996) Cardiovasc. Res. 32: 962-972; Huang (1996) Gene Ther. 3: 980-987; Zepeda (1996) Gene Ther. 3: 973-979; Yang (1996) Hum Mol. Genet. 5: 1703-1712; Caruso (1996) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93: 11302-11306; Rothmann (1996) Gene Ther. 3: 919-926; Haecker (1996) Hum. Gene Ther. 1970-1914. Použití adenovirových vektorů je podrobně popsáno ve WO 96/25 507. Zejména výhodné adenovirové vektory jsou popsány ve Wills (1994) výše; v USSN 08/328673 a ve WO 95/11 984.

Zejména výhodné adenovirové vektory obsahující deleci části nebo celého genu pro protein IX.

V jednom provedení obsahují adenovirové vektory delece Ela a/nebo Elb sekvencí. V nej výhodnějším provedení je adenovirovým konstruktem konstrukt kódující p53 jako je A/C/N/53 nebo A/M/N/53 (viz například patent US 6 210 939 a WO 95/11 984).

Také jsou výhodné vektory odvozené od lidského adenoviru typu 2 nebo typu 5. Takové vektory jsou výhodně neschopné replikace díky delecím nebo modifikacím Ela a/nebo Elb kódujících regionů. Jsou možné také další modifikace virového genomu pro dosažení určitých expresních charakteristik nebo pro umožnění opakovaného podání nebo nižší imunitní odpovědi. Výhodnější jsou rekombinantní adenovirové vektory obsahující kompletní nebo částečné delece E4 kódujícího regionu, volitelně za zachování E4 ORF6 a ORF6/7. E3 kódující sekvence může být deletová, ale lépe je zachována. Konkrétně, je výhodné, aby promotorový/operátorový region E3 byl upraven tak, aby byla umožněna vyšší exprese E3 pro dosažení lepšího imunologického profilu pro terapeutické vektory. Nejvýhodnější jsou vektory lidského adenovirovu typu 5 obsahujícího DNA sekvenci kódující p53 pod kontrolou cytomegalovirového promotoru a trojité vedoucí sek

-22CZ 298488 B6 vence mající E3 pod kontrolou CMV promotoru a obsahující deleci E4 kódujících regionů za zachování E4 ORF6 a ORF6/7. V nej výhodnějším provedení vynálezu je vektorem ACN53.

Ve výhodném provedení je tumor-supresorovým genem p53 nebo RB. Jak bylo uvedeno výše, klonování a použití p53 je podrobně popsáno ve Wills (1994) výše; a patentu US 6 210 939 a ve WO 95/11 984.

2. Genová terapie ex vivo

V jednom provedení jsou prostředky podle předkládaného vynálezu použity pro inhibici hyperproliferativních (například neoplastických) buněk u subjektu (například u savce, včetně, bez omezení, krys, myší, skotu, prasat, koní, psů, koček nebo lidí). Patologické hyperproliferativní buňky jsou charakteristickým rysem onemocnění jako je například Gravesova nemoc, psoriasa, benigní hypertrofie prostaty, Li-Fraumeniho syndrom, karcinom prsu, sarkomy, karcinom močového měchýře, karcinom tlustého střeva, karcinom plic, leukemie, lymfomy a jiná nádorová onemocnění.

Použití prostředků podle předkládaného vynálezu ex vivo umožňuje odstranění patologických hyperproliferativních buněk z vhodného vzorku. Například mohou být v ex vivo použití odstraněny hyperproliferativní buňky kontaminující prekurzorové hematopoetické buňky během rekonstituce kostní dřeně. Obvykle takové metody obsahují získání vzorku od organismu. Vzorek obvykle obsahuje heterogenní populaci buněk, ve které jsou přítomné jak fenotypicky normální, tak patogenní (hyperproliferativní) buňky. Vzorek je kontaktován s tumorsupresorovými nukleovými kyselinami nebo proteiny a adjuvantním protinádorovým činidlem podle předkládaného vynálezu. Tumor-supresorový gen může být popsán například ve virovém vektoru, jak je retrovirový vektor nebo adenovirový vektor. Léčba redukuje proliferaci patogenních buněk, což vede k zisku vzorku, který obsahuje vyšší poměr normálních buněk k patogenním buňkám, který může být potom navrácen do organismu.

Transformace buněk ex vivo pro diagnostiku, význam nebo pro genovou terapii (například pro zpětnou infusi transformovaných buněk do organismu) jev oboru dobře známá. Ve výhodném provedení jsou izolovány z organismu, jsou transfektovány tumor-supresorovým genem nebo cDNA podle předkládaného vynálezu a jsou podány infusi zpět do organismu (například pacientovi). Různé typy buněk vhodné pro ex vivo transformaci jsou v oboru známé. Zejména výhodnými buňkami jsou progenitorové nebo kmenové buňky (pro popi izolace a kultivace buněk od pacienta viz například Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 3. vydání, Wiley-Liss, New York, a odkazy zde uvedené). Transformované buňky jsou kultivovány za použití dobře známých technik. Viz též Kuchler (1977) Biochemical methods in Cell Culture and Virology, Kuchler, R.J., Hutchinson and Ross, lne., a Atlas (1993) CRC Handbook of Microbilogical Mecia (Parks ed). >* CRC Press, Boča Raton, FI. Savčí buněčné systémy budou obvykle ve formě monovrstvy buněk, ačkoliv mohou být také použity buněčné suspenze. Alternativně mohou být buňky získány z buněk uskladněných v buněčné bance (například krevní bance). Ilustrativní příklady savčích buněčných linií jsou buněčná linie HEC-l-B, VĚRO a HeLa buňky, buněčná linie z ovaria čínského křečka (CHO), W138, BHK, Cos-7 nebo MDCK buněčné linie (viz například Freshney, výše).

V jednom konkrétním provedení jsou kmenové buňky použity v ex vivo technice pro transformaci buněk a genovou terapii. Výhodou použití kmenových buněk je to, že mohou být diferencovány na jiné buněčné typy in vitro, nebo mohou být vloženy do savce (jako je dárce buněk), kde budou osídlovat kostní dřeň. Způsoby pro diferenciaci kmenových buněk (například CD34+) in vitro na klinicky významné typy imunitních buněk využívající cytokiny jako je GM-CSF, IFN-γ a TNF-α, jsou v oboru dobře známé (viz například Inaba (1992) J. Exp. Med. 176: 1693-1702; Szabolcs (1995) 154: 5851-5861).

-23CZ 298488 B6

V některých postupech ex vivo jsou také kromě kmenových buněk používány T buňky a B buňky. Je známo několik technik pro izolaci T buněk. Exprese povrchových markérů usnadňuje izolaci a přečištění takových buněk. Mezi způsoby pro identifikaci a izolaci buněk patří FACS, inkubace ve zkumavkách s fixovanými protilátkami, které se váží na určitý typ buněk a panorámování s magnetickými korálky.

Kmenové buňky jsou izolovány pro přenos a diferenciaci pomocí známých technik. Například, u myší jsou buňky kostní dřeně izolovány usmrcení myší a rozříznutím kostí končetin. Kmenové buňky jsou izolovány z buněk kostní dřeně panorámováním buněk kostní dřeně s protilátkami, které se váží na nežádoucí buňky, jako je CD4+ a CD8+ (T buňky), CD45+ (panB buňky), GR-1 (granulocyty) a Ia^d (diferencované antigen-presentující buňky). Tento protokol je uveden například v Inaba (1992), výše.

U lidí se provede aspirace kostní dřeně z crista iliaca, například v celkové anestesii na operačním sále. Asirát kostní dřeně má objem přibližně 1000 ml a je odebrán ze zadní části os ilium a crista iliaca posterior. Pokud je celkové množství buněk nižší než 2 χ 10⁸/kg, provede se druhá asirace ze sterna a z crista iliaca anterior. Během operace jsou podány ozářené erytrocyty, pro nahrazení objemu kostní dřeně odebrané aspirací. Lidské hematopoetické progenitorové a kmenové buňky jsou charakterizovány přítomností povrchového membránového antigenů CD34. Tento antigen je použit pro přečištění, například na afínitních kolonách, která vážou CD34. Po odběru kostní dřeně jsou munonukleámí buňky separovány od dalších složek centrifugací s fíkolovým gradientem. Toto může být provedeno semi-automatizovanou technikou za použití separátoru buněk (například baxter Fenwal CS3000+ nebo Terumo přístroje). Buňky s nízkou hustotou, které se skládají hlavně z mononukleámích buněk, jsou odebrány a inkubují se v plastových zkumavkách při 37 °C po dobu přibližně 1,5 hodiny. Adherující buňky (monocyty, makrofágy aB-buňky) jsou odstraněny. Neadherující buňky jsou potom odebrány a inkubují se s monoklonální protilátkou proti CD34 (například s myší protilátkou 9C5) při 4 °C po dobu 30 minut s mírným třepáním.

Konečná koncentrace anti-CD34 protilátky je výhodně přibližně 10 pg/ml. Po dvou promytích se do suspenze buněk přidají paramanetické mikrosféry (například Dyna Beads, dodávané Baxter Immunotherapy Group, Santa Ana, Califomia) potažené ovčí (Fc) protilátkou proti myšímu IgG, v poměru přibližně 2 buňky na korálek. Po další inkubaci po dobu 30 minut při přibližně 4 °C se rozety buněk s magnetickými kolárky odeberou pomocí magnetu. Pro uvolnění korálků od CD34+ buněk se přidá chymopapain (Baxter Immuntherapy Group, Santa Ana, Califomia) v konečné koncentraci 200 U/ml).

Alternativně a výhodně může být použit postup izolaci na afinitní koloně, která se váže na CD34 nebo na protilátku navázanou na CD34 (viz například Ho (1995) Stem Cells (13 (suppl 3): 100-105 a Brenner (1993) Journal of Hematotherapy 2: 7-17).

V jiném provedení mohou být hematopoetické kmenové buňky izolovány zpupečníkové krve. Yu (1995) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92: 699-703, popisuje výhodnou metodu pro transdukci CD34+ buněk z lidské fetální pupečníkové krve za použití retrovirových vektorů.

3. Podání tumor-supresorových nukleových kyselin: Vektory a expresní kazety

Způsob podání

Expresní kazety a vektory (například retroviry, adenoviiy, liposomy) obsahující terapeutické tumor-supresorové nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou být podány přímo do organismu pro přenos do buněk in vivo. Podán je provedeno jakoukoliv technikou, která je běžně používány pro kontaktování molekul s buňkami krve nebo tkání, jako je například systémové podání, regionální nebo lokální podání, jak jsou podrobně popsána výše pro podání adjuvantního protinádorového činidla. „Balík“ nukleových kyselin (minimálně tumor-supresorová

-24CZ 298488 B6 kódující sekvence s promotorem) je podán vhodným způsobem, výhodně s farmaceuticky přijatelnými nosiči, jako jsou také popsány výše. Vhodné metody pro podání takových nukleových kyselin jsou dostupné a dobře známé v oboru a ačkoliv mohou být použity různé způsoby, může určitý způsob dosáhnout časnější a účinnější účinek než jiný.

Například podání rekombinantního adenovirového vektoru zpracovaného tak, aby exprimoval tumor-supresorový gen, může vyvolat imunitní odpověď, zejména protilátkovou odpověď, proti adenovirovému vektoru. U některých pacientů mhou být již předem přítomné protilátky proti adenoviru. Proto je za určitých okolností optimální a nejúčinnější regionální nebo lokální podání adenovirového vektoru exprimujícího tumor-supresorový gen. Například, jak je uvedeno dále, karcinom ovaria omezený na dutinu břišní je jednou klinickou situací, ve které je výhodnou léčbou regionální terapie p53 genem, tj. intraperitoneální (IP) aplikace. IP podání adenovirového vektoru také vede k infekci peritonea a k absorpci adenovirového vektoru do systémové cirkulace (jiné způsoby regionálního podání také vedou k průniku adenovirového vektoru do systémové cirkulace). Rozsah tohoto účinku závisí na koncentraci a/nebo celkovém množství virových části podaných IP. Pokud je žádoucí systémový účinek, pak je výhodně podávání vyšších koncentrací po dobu několika následujících dnů.

Lokální podání adenovirového vektoru exprimujícího tumor-supresorový gen je také výhodné za určitých okolností, například tehdy, pokud jsou u pacienta přítomny protilátky proti adenoviru. Takové lokální podání může být například intratumorální injekce, pokud se jedná o vnitřní podání, nebo aplikace na sliznici, pokud se jedná o zemní podání. Alternativně může být lokální podání provedeno pomocí zesílení adenovirového vektoru na nádor, například za použití činidel rozpoznávajících nádorově specifické antigeny (jako jsou protilátky) na liposomech nebo na adenoviru samotném.

Prostředky

Farmaceuticky přijatelné nosiče jsou určeny částečně charakterem určitého podaného prostředku, stejně jako určitým způsobem podání. V souladu s tím existuje velké množství vhodných prostředků podle předkládaného vynálezu.

Prostředky vhodné pro orální podání farmaceutických prostředků obsahujících tumor-supresorové nukleové kyseliny zahrnují (a) kapalné roztoky, jako je například účinné množství nukleové kyseliny v ředidlu, jako je voda, salinický roztok nebo PEG 400; (b) kapsle, sáčky s práškem nebo tablety, které obsahují předem určené množství aktivní složky, jako jsou kapaliny, pevné látky, granule nebo želatina; (c) suspenze ve vhodné kapalině; a (d) vhodné emulze. Tablety mohou obsahovat laktosu, sacharózu, mannit, sorbitol, fosforečnan vápenatý, kukuřičný škrob, bramborový škrob, tragant, mikrokrystalickou celulosu, arabskou klovatinu, želatinu, koloidní oxid křemičitý, kroskarmelózu sodnou, talek, stearan hořečnatý, kyselinu stearovou a další přísady, barviva, plniva, pojivá, ředidla, pufrovací činidla, zvlhčující činidla, konzervační činidla, chuťová korigens, barviva, činidla podporující rozpadavost a farmaceuticky přijatelné nosiče. Mechanické oplatky obsahují aktivní složku v ochucené bázi, obvykle v sacharóze a arabské klovatině nebo tragentu, a pastilky obsahují aktivní složku v inertní bázi, jako je želatina a glycerin nebo sacharóza a arabská klovatina, a emulse, gely a podobně obsahují kromě aktivní složky známé nosiče.

Nukleové kyseliny, samostatně nebo v kombinaci s dalšími vhodnými složkami, mohou být vyrobeny v aerosolovém prostředku (tj. mohou být nebulizovány) tak, aby mohly být podány inhalačně. Aerosolové prostředky mohou být obsaženy v tlakovém přijatelném hnacím plynu, jako je dichlordifluormethan, propan, dusík a podobně.

Mezi vhodné prostředky pro rektální podání patří například čípky, které se skládají z připravené nukleové kyseliny a čípkové báze. Mezi vhodné čípkové báze patří přirozené nebo syntetické triacyklyceridy nebo parafínové uhlovodíky. Kromě toho je také možné použití želatinových

-25CZ 298488 B6 rektálních kapslí, které se skládají z kombinace připravené nukleové kyseliny s bází, jako jsou například kapalné triacylkglyceridy, polyethylenglykoly a prafinové uhlovodíky.

Mezi vhodné prostředky pro parenterální podání, jako je například intraartikulámí (nitrokloubní), intravenózní, intramuskulární, intradermální, intraperitoneální a subkutánní, patří například vodné a nevodné izotonické sterilní injekční roztoky, které mohou obsahovat antioxidační činidla, pufrovací činidla, bakteriostatická činidla a činidla pro úpravu izotonicity s krví příjemce, a vodné nebo nevodné sterilní suspenze, které mohou obsahovat suspendační činidla, solubilizační činidla, zahušťovací činidla, stabilizační činidla a konzervační činidla. Ve způsobech podle předkládaného vynálezu mohou být prostředky podány například intravenózní infusí, orálně, lokálně, intraperitoneálně, intravesikálně nebo intrathekálně. Výhodnými způsoby podání jsou parenterální podání a intravenózní podání. Prostředky obsahující nukleové kyseliny mohou být připraveny v zásobnících pro jednu dávku nebo pro více dávek, jako jsou například ampulky nebo lékovky.

Prostředky podle předkládaného vynálezu ve formě injekčních roztoků nebo suspenzí mohou být připraveny ze sterilních prášků, granulí nebo tablet známými způsoby. Přesné složení prostředku, koncentrace činidel a nukleové kyseliny v prostředku, pH prostředku, pufry a jiné parametry se sebou lišit podle způsobu a místa podání (například podle systémového, regionálního nebo lokálního podání) a podle potřeb skladování, manipulace, transportu a životnosti určitého farmaceutického prostředku. Optimalizace těchto parametrů pro určité potřeby prostředku může být provedena rutinními metodami; a může být použita jakékoliv přísada a parametr, který je používán pro injekční roztoky. Příkladem vhodného prostředku je rekombinantní adenovirový vektor (exprimující přirozený p53 (rAd5/p53) v koncentraci přibližně 7,5 x 10¹¹ až 7,5 x 10¹⁰ částic na ml, monohydrát fosforečnanu sodného v koncentraci 0,42 mg/ml, dvojsytný anhydrid fosforečnanu sodného v koncentraci 2,48 mg/ml, chlorid sodný v monohydrátu fosforečnanu sodného v koncentraci 5,8 mg/ml, sacharóza v koncentraci 20,0 mg/ml, hexahydrát chloridu hořečnatého v koncentraci 0,40 ml/ml, obvykle v celkovém objemu 1,0 ml.

Buňky s přenesenou nukleovou kyselinou, jak jsou popsány výše v souvislosti s genovou terapií ex vivo, mohou být také podány intravenózně nebo parenterálně, jak je popsáno výše.

Dávka podaná pacientovi ve způsobech podle předkládaného vynálezu by měly být dostatečná pro požadovaný terapeutický účinek u pacienta. Dávka bude určena podle účinnosti určitého použitého vektoru a podle stavu pacienta, stejně jako podle tělesné hmotnosti nebo tělesného povrchu léčeného pacienta. Dávka bude také záviset na existenci, charakteru a rozsahu jakýchkoliv nežádoucích účinků, které jsou spojeny s podáním určitého vektoru nebo transformovaných buněk určitému pacientovi.

Při stanovení účinného množství vektoru, které má být podáno při léčbě, bude lékař hodnotit plasmatické koncentrace cirkulujícího vektoru, toxicitu vektoru, progresi onemocnění a produkci protilátek proti vektoru. Obvyklá dávka nukleové kyseliny je značně závislá na způsobu podání o systému pro genový přenos. V závislosti na způsobu podání se dávka pohybuje v rozmezí od 1 pg do 100 mg nebo více. Obecně je dávkový ekvivalent holé nukleové kyseliny z vektoru od přibližně 1 pg do 100 pg pro obvyklého 70 kg pacienta a dávky vektorů, které obsahují virové částice, jsou vypočítány tak, aby dodaly ekvivalentní množství terapeutické nukleové kyseliny.

Při podání mohou být transformované buňky podle předkládaného vynálezu podány rychlostí určenou LD₅₀ vektoru nebo transformovaného typu buněk a vedlejšími účinky vektoru nebo buněčného typu v různých koncentracích, při dané hmotnosti a celkovém zdravotním stavu pacienta. Podání může být provedeno v jedné dávce nebo v dělených dávkách, jak je popsáno dále.

Ve výhodném provedení jsou před infusí odebrány vzorky krve a jsou uskladněny pro analýzu. Pečlivě se sledují vitální příznaky a saturace kyslíkem pomocí pulzní oxymetrie. Vzorky krve

-26CZ 298488 B6 jsou výhodně odebrány 5 minut před a 1 hodinu po infusi a jsou uskladněny na analýzu. Při terapii ex vivo může být leukoferesa, transformasa na reinfuse provedena každé 2 až 3 měsíce. Při první léčbě může být infuse provedena ambulantně pod dohledem lékaře. Pokud je reinfuse podávána ambulantně, pak je pacient sledován po dobu nejméně 4, lépe 8 hodin po terapii.

Jak je uvedeno výše, mohou být adenovirové konstrukty podány systémově (například intravenózně), regionálně (například intraperitoneálně) nebo lokálně (například intra- nebo peritumorální nebo intracystickou injekcí, například při léčbě karcinomu močového měchýře). Zejména výhodným způsobem podání je intraarteriální injekce, lépe injekce do a. hepatica (například pro léčbu nádorů jater), nebo při léčbě mozkových nádorů podání do a. carotis nebo do artérie náležící do systému karotických arterií (například do a. occipitalis, a. auricularis, a. temporalis, mozkové artérie, a. maxilaris, atd.). Podání při léčbě karcinomu plic může být provedeno například pomocí bronchoskopu. Typicky je takové podání provedeno za použití vodného farmaceuticky přijatelného pufru, jak jsou popsány výše. Nicméně, v jednom výhodném provedení jsou adenovirové konstrukty nebo expresní kazety obsahující tumor-supresorový gen podány v lipidovém prostředku, přesněji buď v komplexu s liposomy jako komplexy lipid/nukleová kyselina (například Debs and Zhu (1993) WO 93/24 640; Mannino (1988, výše; Rose, patent SU 5 279 833; Brigham (1991) WO 91/06 309; a Felgner (1987), výše), nebojsou enkapsulované v liposomech, přesněji v imunoliposomech cílených na specifické nádorové markéry. Mělo by být jasné, že takové lipidové prostředky mohou být také podány lokálně, systémově nebo v aerosolu.

4. Zesílení přenosu tumor-supresorového genu

Přenos tumor-supresorového genu může být zesílen použitím jednoho nebo více „činidel zesilujících přenos“. Termín „činidlo zesilující přenos“ označuje jakékoli činidlo, které zvyšuje přenos terapeutického genu, jako je tumor-supresorový gen, do nádorové tkáně nebo orgánů. Takovéto zesílení přenosu může být dosaženo různými prostředky. Jeden takový mechanismus obsahuje narušení ochranné glykosaminoglykanové vrstvy na epitelovém povrchu orgánu nebo tkáně (například močového měchýře). Příklady takových činidel zesilujících přenos jsou detergenční činidla, alkoholy, glykoly, surfaktanty, soli žlučových kyselin, antagonisté heparinu, inhibitory cyklooxygenázy, hypertonické roztoky solí a acetáty. Alkoholy zahrnují například alifatické alkoholy jako je ethanol, N-propanol, isopropanol, butylalkohol, acetylakohol. Glykoly zahrnují glycerin, propylenglykol, polyethylenglykol a další glykoly s nízkou molekulovou hmotností jako je glycerol a thioglycerol. Acetáty jako je kyselina octová, glukonolacetát a octan sodný jsou dalšími příklady činidel zesilujících přenos. Hypertonické roztoky solí, jako je 1M NaCl, jsou také příklady činidel zesilujících přenos. Příklady surfaktantů jsou dodecylsíran sodný (SDS) a lesolecitin, polysorbát 80, nonylfenoxypolyoxyethylen, lysofosfátidylcholin, polyethylenglykol 400, polysorbát 80, ethery polyoxyethylenu, polyglykoletherové surfaktanty aDMSO. Také mohou být použity soli žlučových kyselin jako je taurocholat, taurodeoxycholat sodný, deoxycholat, chenodeoxycholat, kyselina glykocholová, kyselina glykochenodeoxycholová a další adstringens jako je dusičnan stříbrný. Také mohou být použity antagoností heparinu jako jsou kvartémí aminy jako prolaminsulfat. Mohou být použity inhibitory cyklooxygenázy, jako je salicylat sodná, kyselina salicylová, a nesteroidní antirevmatika (NSAID) jako je indometacin, naproxen, diklofenak.

Detergenční činidla zahrnují aniontová, kationtová, obojetná a neiontová detergenční činidla. Příklady detergenčních činidel jsou taurocholat, deoxycholat, taurodeoxycholat, cetylpyridium, benzalkoniumchlorid, ZWINTTERGENT^r3-14, CHAPS (3[(3-cholamidopropyl)dimethylammoniol]-l-propansulfonathydrat, Aldrich), Big CHAP (jak je popsáno vUSSN 08/889355, podané 8.6. 1997; a v Mezinárodní přihlášce WO 97/25 072, 17. 6. 1997), Deoxy Big Chap (ibid), TRITON^<r,-X-100 detergenční činidlo, C12E8, oktyl-B-D-glukopyranosid, PLURONIC^(R-f68 detergenční činidlo, TWEEN^(R)20 detergenční činidlo a TWEEN^(R)80 detergenční činidlo (CALB10CHEM^(R) Biochemicals).

-27CZ 298488 B6

V jednom provedení je činidlo zesilující přenos obsaženo v pufru, ve kterém je připraven rekombinantní adenovirový vektorový systém pro přenos. Činidlo zesilující přenos může být podáno před podáním rekombinantního viru nebo současně s virem. V některých provedeních je činidlo zesilující přenos podáno s virem, kdy prostředek obsahující virus je smísen s činidlem zesilujícím přenos těsně před podáním pacientovi. V jiných provedeních jsou činidlo zesilující přenos a virus obsaženy v jedné ampulce pro podání.

V případě farmaceutických prostředků obsahujících tumorsupresorový gen obsažený v rekombinantním adenovirovém vektorovém systému v pufru, které dále obsahuje činidlo zesilující přenos, je farmaceutický prostředek výhodně podán během 5 minut až 3 hodin, lépe během 10 minut až 120 minut a nejlépe během 15 minut až 90 minut. V jiném provedení může být činidlo zesilující přenos podáno před podáním rekombinantního adenovirového vektorového systému obsahujícího tumor-supresorový gen. Podání činidla zesilujícího přenos může být provedeno 30 minut až jednu hodinu, lépe 1 minutu až 10 minut a nejlépe 1 minutu až 5 minut před podáním adenovirového vektorového systému obsahujícího tumor-supresorový gen.

Koncentrace činidla zesilujícího přenos bude záviset na mnoha faktorech, které jsou odborníkům známé, jako je typ použitého činidla zesilujícího přenos, pufru, pH, cílové tkáni nebo orgánu a způsobu podání. Koncentrace činidla zesilujícího přenos bude v rozmezí od 1 do 50 % (obj./obj.), lépe do 10 do 40 % (obj./obj.) a nejlépe od 15 do 30 % (obj./obj.). Výhodně bude koncentrace detergenčního činidla v konečném podaném prostředku přibližně 0,5 až 2-násobek kritické micelizační koncentrace (CMC). Výhodná koncentrace Big CHAP je přibližně 2 až 20 mM, lépe přibližně 3,5 až 7 mM.

Pufrem obsahujícím činidla zesilujícího přenos může být jakýkoliv farmaceutický pufr, jako je fosfátem pufrovaný salinický roztok nebo fosforečnan sodný/síran sodný, Tris pufr, glycinový pufr, sterilní voda a jiné pufry známé v oboru, jak jsou popsány například v Good et al., (1966), Biochemistry 5: 467. pH pufru ve farmaceutickém prostředku obsahujícím tumor-supresorový gen obsažený v rekombinantním adenivirovém vektorovém systému může být v rozmezí od 6,4 do 8,4, lépe od 7 do 7,5 a nejlépe od 7,2 do 7,4.

Výhodný prostředek pro podání rekombinantního adenoviru obsahuje přibližně 10⁹ až 10¹¹ PN/ml viru, přibližně 2 až 10 mM Big CHAP nebo přibližně 0,1 až 1,0 nM TRITON^(R-X-100 detergenčního činidla, ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS) a přibližně 2 až 3 % sacharózy (hmotn./obj.) a přibližně 1 až 3 mM MgCl₂, při pH přibližně 6,4 až 8,4. Použití činidel zesilujících přenos je podrobně popsáno v související přihlášce USSN 08/889627, podané 7.1. 1997.

V prostředcích obsahujících přípravek Bgi CHAP pro zlepšení genového přenosu nukleových kyselin je koncentrace Big-CHAP závislá na jeho komerčním zdroji. Pokud je Big-CHAP získán od CALB1OCHEM, je jeho koncentrace výhodně v rozmezí od 2 do 10 mmol. lépe je tato koncentrace 4 až 8 mmol. Nejlepší koncentrace je 7 mmol.

Pokud je Big-CHAP získán od Sigma, je jeho koncentrace výhodně v rozmezí od 15 do 35 mmol. Lépe je tato koncentrace 20 až 30 mmol. Nejlepší koncentrace je přibližně 25 mmol.

V dalším provedení vynálezu jsou poskytnuta činidla zesilující přenos mající vzorek I:

OO

Xi—C-HN-CCHzh-N-ťCHřh-NH-C-Xa...

C=O i

Xí

-28CZ 298488 B6 kde n je celé číslo od 2 do 8, Xi je skupina kyseliny cholové nebo skupina kyseliny deoxycholové a X₂ a X₃ jsou každý nezávisle vybrány ze skupiny skládající se ze skupiny kyseliny cholové, skupiny kyseliny deoxycholové a sacharidové skupiny. Alespoň jedna z X₂ a X₃ je sacharidová skupina. Sacharidová skupina mže být vybrána ze skupiny skládající se z pentosamonosacharidových skupin, hexasamonosacharidových skupin, pentosa—pentosa disacharicových skupin, hexosa-hexosa disacharidových skupin, pentosa-hexosa disacharidových skupin a hexosa-pentosa disacharidových skupin. V jednom výhodném provedení mají sloučeniny podle předkládaného vynálezu vzorec II:

(Π), kde Xi a X₂ jsou vybrány ze skupiny skládající se ze skupiny kyseliny cholové a skupiny kyseliny deoxycholové a X₃ je sacharidová skupina.

Tyto sloučeniny jsou v prostředcích podle předkládaného vynálezu výhodně použity v koncentracích přibližně 0,002 až 2 mg/ml, lépe přibližně 0,02 až 2 mg/ml a nejlépe přibližně 0,2 až 2 mg/ml. Nejvýhodnější koncentrace je přibližně 2 mg/ml.

Fosfátem pufrovaný salinický roztok (PBS) je výhodným solubilizačním činidlem pro tyto sloučeniny. Nicméně, odborníkům v oboru bude jasné, že pro dosažení požadované solubility těchto sloučenin v různých farmaceutických prostředcích může být žádoucí přidání dalších přísad nebo pomocných činidel. Například mohou být přidány dobře známá solubilizační činidla, jako jsou detergenční činidla, estery mastných kyselin, surfaktanty, ve vhodných koncentracích, pro usnadnění solubilizace sloučenin v různých rozpouštědlech. Pokud je rozpouštědlem PBS, pak je výhodným solubilizačním činidlem Tween 80 v koncentraci přibližně 0,15 %.

5. Podání tumor-supresorových proteinů.

Tumor-supresorové proteiny (polypeptidy) mohou být podány injekčně přímo do nádoru, nebo mohou být podány systově, jak je popsáno výše. Ve výhodném provedení jsou tumor-supresorové proteiny kombinovány s farmaceuticky přijatelným nosičem (přísadou) za vzniku farmaceutického prostředku, jak je popsán výše. Tumor-supresorový polypeptid je podán v terapeuticky účinné dávce. Tak je prostředek podán v dávce, která je dostatečná pro vyléčení nebo alespoň částečné zastavení onemocnění a/nebo jako komplikací. Účinné množství pro tento účel závisí na závažnosti onemocnění a na celkovém zdravotním stavu pacienta.

Je jasné, že tumor-supresorové polypeptidy, pokud jsou podány orálně, musí být chráněny před trávením. Toto chránění je obvykle provedeno vyrobením komplexu polypeptidu s prostředkem, který je činí resistentním na kyselou nebo enzymatickou hydrolýzu, nebo obalením polypeptidu vhodným resistentním nosičem, jako jsou například liposomy popsané výše. Prostředky pro chránění polypeptidů při orálním podání jsou v oboru dobře známé (viz například patent US 5 391 377, který popisuje liposomové prostředky pro orální podání terapeutických činidel).

III. Kombinované farmaceutické prostředky

Tumor-supresorové činidlo a adjuvantní protinádorové činidlo mohou být podány separované, kdy je buď tumor-supresorová nukleová kyselina či polypeptid podán před adjuvantním protinádorovým činidlem (předléčení tumor-supresorovým činidlem), nebo je adjuvantní protinádorové činidlo podáno před tumor-supresorovou nukleovou kyselinou při polypeptidem (předléčení protinádorovým činidlem). Tumor-supresorová nukleová kyselina a/nebo polypeptid a adjuvantní protinádorové činidlo mohou být samozřejmě podány simultánně.

-29CZ 298488 B6

V jednom provedení jsou tumor-supresorová nukleová kyselina a/nebo polypeptid a adjuvantní protinádorové činidlo podány v jednom farmaceutickém prostředku. V tomto provedení mohou být tumor-supresorová nukleová kyselina a/nebo polypepid a adjuvantní protinádorové činidlo suspendovány a/nebo solubilizovány v jednom homogenním vehikulu. Alternativně, tumorsupresorová nukleová kyselina a/nebo polypeptid a adjuvantní protinádorové činidlo mohou být suspendovány nebo solubilizovány v různých vehikulech, která jsou nakonec suspendována v jedné pomocné přísadě, buď v době podání, nebo trvale. Například, adjuvantní protinádorové činidlo může být solubilizováno v polárním rozpouštědle (například paclitaxel v ethanolu) a tumor-supresorová nukleová kyselina může být v komplexu s lipidem a obě složky jsou společně uskladněny v suspenzi, nebojsou smíseny v době podání.

IV. Léčebný režim: kombinovaná a individuální terapie

A) Léčebný režim pro tumor-supresorové činidlo

Objem předkládaného vynálezu je, že tumor-supresorové nukleové kyseliny nebo polypeptidy, přesněji tumor-supresorové nukleové kyseliny, mají vyšší účinnost v inhibicí nádorového růstu, pokud jsou podány v opakovaných dávkách, než když jsou podány v jedné dávce. Vynález proto obsahuje léčebný režim pro tumor-supresorový gen nebo polypeptid, který obsahuje opakovaná podání tumor-supresorové nukleové kyseliny nebo polypeptidu.

Tumor-supresorový protein nebo tumor-supresorová nukleová kyselina může být podána v celkové dávce (s nebo bez adjuvantního protinádorového činidla) v rozmezí od přibližně 1 x 10⁹ do přibližně 1 x 10¹⁴, lépe od přibližně 1 x 10⁹ do přibližně 7,5 x 10¹⁵, lépe od přibližně 1 x 10¹¹ do přibližně 7,5 x 10¹³ adenovirových částic v jednom z následujících léčebných režimů: celá dávka v jedné dávce, celá dávka podaná denně během 5 dnů nebo podaná během 5 dnů, celá dávka podaná denně během 15 dnů nebo podaná během 15 dnů a celá dávka podaná denně během 30 dnů nebo podaná během 30 dnů. Tento způsob podání může být opakován dvakrát nebo vícekrát (nejlépe třikrát) a cykly jsou podány s odstupem tří až čtyř týdnů. Léčba může obsahovat jeden cyklu nebo více cyklů, výhodně v rozmezí od 2 do 12, nejlépe od 2 do 6 cyklů.

Zejména výhodným léčebným režimem je celková dávka rozdělená do 5 dnů a podávaná denně, celková dávka rozdělená do 15 dnů se podávaná denně a celková dávka rozdělená do 30 dnů a podávaná denně.

V některých výhodných režimech může být denní dávka od 7,5 x 10⁹ do 7,5 x 10¹⁵, výhodně od 1 do 10¹² do 7,5 x 10¹³ adenovirových částic podávána každý den po dobu až 30 dnů (například režim trvající 2 dny, 2 až 5 dnů, 7 dnů, 14 dnů nebo 30 dnů, kde stejná dávka je podávána každý den. Režimy obsahující více dávek mohou být opakovány v cyklech trvajících 21 až 28 dnů.

V některých provedeních povedou různé způsoby podání k použití různých výhodných dávek. Například, pro intraarteriální podání do a. hepatica je výhodná dávka v rozmezí od 7,5 x 10⁹ do 1 x 10¹⁵, lépe o 1 x ÍO¹¹ do 7,5 x 10¹³ adenovirových částic za den po dobu 5 až 14 dnů. Tyto režimy mohou být dále obsahovat podání adjuvantních protinádorových činidel, například FUDR nebo 5'-deoxy-5-fluoruridinu (5-DFUR) nebo hydrochloridové soli irinotekanu (CPT-11; 7-ethyl-l 0-[4-(l-piperidino)-l-piperidino]karbonyloxycamptothecinu). Pro intratumorální podání je výhodná dávka v rozmezí 7,5 x 10⁹ do 1 x 10¹³, lépe od 1 x 10¹¹ do 7,5 x 10¹² adenovirových částic za den. Pro intraperitoneální podání je výhodná dávka v rozmezí od 7,5 x 10⁹ do 1 x 10¹⁵, lépe od 1 x 10¹¹ do 7,5 x 10¹³ adenovirových částic za den.

B) Léčebné režimy pro kombinovanou terapii

Pokud je tumor-supresorové činidlo použito v kombinaci s adjuvantním protinádorovým činidlem, tak je tumor-supresorová nukleová kyselina podaná ve výše uvedené dávce. V kombinaci je adjuvantní protinádorové činidlo použito v celkové dávce, která je závislá na použitém činidle.

-30CZ 298488 B6

Například, paclitaxel nebo deriváty paclitaxelu jsou podány v celkové dávce v rozmezí od 75 do 350 mg/m² během 1 hodiny, 3 hodin, 6 hodin nebo 24 hodin v léčebném režimu vybraném z podání v jedné dávce, dávce podané v den 1 a 2, dávce podané v den 1, 2 a 3, denní dávce podané v 15 dnech, denní dávce podané ve 30 dnech, denní kontinuální infuse po dobu 15 dnů a 5 denní kontinuální infuse po dobu 30 dnů. Výhodná dávka je 100 až 250 mg/m² za 24 hodin.

Předléčení adjuvantním protinádorovým činidlem (například paclitaxelem) před podáním tumorsupresorové nukleové kyseliny zvyšuje účinnost tumor-supresorové nukleové kyseliny. Proto je v jednom výhodném provedení buňka, tkáň nebo organismu předléčen adjuvantním protinádoroio vým činidlem před podáním tumor-supresorové nukleové kyseliny. Podání adjuvantního protinádorového činidla výhodně předchází podání tumor-supresorové nukleové kyseliny o přibližně 24 hodin, ačkoliv kratší nebo delší období je také přijatelné.

Předléčení je zejména výhodné tehdy, pokud je adjuvantním protinádorovým činidlem sloučenina 15 podobná paclitaxelu, lépe paclitaxel nebo derivát paclitaxelu (například Taxol^{A) * * * * * * * * * * * * * * * * (R)} nebo

Taxotere^(R)). Zejména výhodnými tumor-supresorovými činidly jsou RB a p53, nejlépe p53 v adenovirovém vektoru (například A/C/N/53).

V. Léčba a profylaxe metastáz

Jak je uvedeno v příkladech 2 a 3, léčba tumor-supresorovým (například p53) genem je účinná v léčbě lidských nádorových buněk in vitro, v léčbě xenotransplantátů lidských nádorů u imunokompromitovaných hostitelů a v léčbě lidských nádorů plic (in vivo). Chirurgické odstranění primárních nádorů u pacientů často vede k recidivě nádoru v primárním místě a k metastázování 25 nádoru z tohoto místa, které je způsobeno mikroskopickými „hnízdy“ nádorových buněk, které jsou chirurgem ponechána v těle. Alternativně může být pro zajištění odstranění primárního nádoru proveden mutilující zákrok, při kterém je odstraněno velké množství normální tkáně sousedící s místem primárního tumoru.

V jiném provedení je prostředek podle vynálezu použitelný pro inhibici růstu a/nebo proliferace metastáz (metastatických buněk). Ta obecně zahrnuje buď systémové, nebo lokální podání tumor-supresorového činidla, lépe lokální podání p53 nebo RB.

A) Systémová léčba

Jak je uvedeno v příkladech 2 a 3, systémová léčba (například intravenózní injekce) vektorů obsahujících tumor-supresorovou nukleovou kyselinu (například A/C/N/53) inhibuje progresi metastáz in vivo. Proto je při inhibici progrese metastáz organismu podána tumor-supresorová nukleová kyselina a/nebo tumor-supresorový polypeptid, jak jsou popsány výše. Tumor40 supresorovým činidlem je výhodně tumor-supresorová nukleová kyselina, lépe p53 tumorsupresorová nukleová kyselina a nejlépe p53 nukleová kyselina v adenovirovém vektoru (například A/C/N/53). V jiném výhodném provedení je tumor-supresorová nukleová kyselina obsažena v liposomech nebo je v komplexu s lipidem (viz například Debs and Zhu (1993)

WO 93/24640; Mannino and Gold-Fogerite (1988) BioTechniques 6(7): 682-691; Rose, patent 45 US 5 279 833; Brigham (1991) Wo 91/06309; a Felgner et al. (1987), Proč. Nati. Acad. Sci.

USA 84: 7413-7414).

B. Lokální léčba

V jiném provedení je lokální aplikace tumor-supresorového proteinu nebo tumor-supresorové nukleové kyseliny provedeno spolu s chirurgickým zákrokem. V tomto provedení je tumorsupresorové činidlo, výhodně ve formě infekčního vektoru, aplikováno do chirurgické rány po odstranění tumoru. Infekční částice vnesou p53 do jakýchkoliv residuálních nádorových buněk v místě chirurgického zákroku, což indikuje jejich apoptózu (programovou smrt buněk). Tato

-31 CZ 298488 B6 léčba ovlivní dlouhodobé přežívání pacienta a/nebo redukuje množství normální tkáně v sousedství nádoru, která musí být chirurgicky odstraněna.

Tumor-supresorové činidlo je výhodně obsaženo v prostředku pro lokální podání, jak jsou v oboru známy. Například, infekční přípravek lidského p53 tumor-supresorového genu (například A/C/N/53) se suspenduje ve vhodném vehikulu (jako je například žlutá vazelína nebo jiný krém nebo mast), které je vhodné pro aplikaci do místa chirurgického zákroku. Alternativně může být tumor-supresorové činidlo připraveno v aerosolovém prostředku pro aplikaci ve formě spreje do místa zákroku. V jiném provedení může být tumor-supresorové činidlo připraveno jako degradovatelný (resorbovatelný) materiál, například jako resorbovatelný porésní materiál, který může být vložen do tělesné dutiny a který může uvolňovat tumor-supresorový protein nebo vektor pro určitou dobu.

Výhodná provedení pro aplikaci rekombinantních adenovirových vektorů do určitých definovaných oblastí, například na rohovku, do gastrointestinálního traktu,do resekčních míst nádorů využívají pevných nosičů pro dosažení dlouhodobé inkubační doby a pro usnadnění virové infekce. Nosiče mohou být gázy nebo masti namočené do roztoku rekombinantního adenoviru. Virus může být aplikován pomocí gázy na rohovku pro dosažení zlepšené účinnosti transgenu. Drenovaná gáza může být také profylakticky aplikována do resekční plochy po tumoru, aby se předešlo recidivě. Masti mohou být aplikovány lokálně do oblastí gastrointestinálního traktu, nebo lokálně na slinivku břišní, za účelem terapie tumor-supresorovým genem.

Příkladné masťové nosiče zahrnují Puralube^(R) založený na bázi žluté vazelíny nebo ve vodě rozpustný KJ-Jelly^(R>. V případě techniky je sterilní gázový tampon (5x5 cm) nebo testovací kroužek pro testování tvorby slz namočen do roztoku adenovirového vektoru (například 1 x 10⁹PN/ml), takže je zcela vlhký. Tampony nebo proužky jsou položeny na povrch cílové tkáně a jsou inkubovány při 37 °C po dobu 30 minut. Odborníkům v oboru bude jasné, že mohou být použity jiné tkaniny, želatiny nebo masti, které mohou být přidány další činidla, které zvyšují přenos, jak jsou popsána výše.

VI. Kombinovaná léčba s jinými chemoterapeutickými činidly

A. Tumor-supresorové činidlo podané v kombinaci s kombinovanými chemoterapeutickými režimy

Mělo by být jasné, že prostředky podle předkládaného vynálezu nejsou omezeny na kombinaci tumor-supresorového činidla s jedním adjuvantním protinádorovým činidlem. Ačkoliv dochází obvykle ke kontaktování buněk s tumor-supresorovým činidlem (například p53) a adjuvantním protinádorovým činidlem jako je paclitaxel, je možné také kontaktování buněk s tumor-supresorovým genem nebo polypeptidem a dvěma, třemi nebo více adjuvantními protinádorovými činidly a volitelně s dalšími chemoterapeutickými činidly. Kromě toho, je jasné, že chemoterapeutické činidlo může být také použito s tumorsupresorovými proteiny nebo geny, za absence adjuvantního protinádorového činidla.

Množství chemoterapeutických léků je známo v obdobné a patentové literatuře; příklady léků, které mohou být použity ve způsobech podle předkládaného vynálezu, jsou: činidla způsobující poškození DNA (včetně alkylačních činidel), jako je např. cisplatina, karboplatina (viz např. Duffull (1997) Clin. Pharmacokinet. 33: 161-183); Droz (1996) Ann. Oncol. 7: 997-1003), navelbin (vinorelbin), Asaley, AZQ, BCNU, busulfan, karboxyftalatoplatina, CBDCA, CCNU, CHIP, chlorambucil, chlorotozocin, cis-platina, clomeson, kyanmorfolino-doxorubicin, cyklodison, cytoxan, dianhydrogalaktitol, fluorodopan, hepsulfam, hycanthon, melfalan, methylCCNU, mitomycin C, mitozolamid, nitrogen nustard, PCNU, piperazin alkylator, piperazindion, pipobroman, porfiromycin, spirohydantoin mustard, teroxiron, tetraplatin, thiotepa, triethylenmelamin, uráčil nitrogen mustard, Yoshi-864); inhibitory topoizomerázy I (například topotekan hydrochlorid, irinotekan hydrochlorid (CPT-11), camptothecin, Na sůl

-32CZ 298488 B6 camptothecinu, aminocamptothecin, CPT-11 a další deriváty camptothecinu); inhibitory topoizomerázy II (doxorubicin, včetně doxorubicinu v liposomech (viz patenty US 5 013 556 a US 5 213 804), amonafid, m-AMSA, anthrapyrazolové deriváty, pyrazoloakridin, bisanthren Hel, daunorubicin, deoxydoxorubicin, mitoxantron, menogaril, Ν,Ν-dibenzyl daumomycin, oxythrazol, rubidazon, VM-26 a VP-16); antimetabolity RNA/DNA (například L-alanosin,

5-azecytidin, 5-fluorouracil, acivicin, aminopterin, deriváty aminopterinu, antifol, Bakerův solubilní antifol, dichlorally lawson, brequinar, florafur (proléčivo), 5,6-dihydro-5-azacytidin, methotraxat, deriváty methotrexatu, N-(fosfonoacetyl)-L-aspartat (PALA), pyrazofurin a trimetrexat); a antimetabolity DNA (například 3HP, 2'-deoxy-5-fluoruridin, 5-HP, alfaTGDR, aphidicolin glicinat, ara-C, 5-aza-2'-deoxycytidin, beta-TGDR, cyklocytidin, guanazol, hydroxymočovina, inosin, glykodialdehyd, macbecin II, pyrazolimidazol, thiguanin a thiopurin). Tumor-supresorová nukleová kyselina a/nebo polypeptid mohou být také podány v kombinaci s chemoterapeutickými činidly jako je vinkristin, temozolomid (viz např. patent US 5 260 291) toremifen (viz například patent US 4 696 949 pro informace o toremifenu).

Preklinické studie provedené na relevantních zvířecích modelech ukázaly, že p53 adenovirus kombinovaný s cisplatino, karboplatinou, novelbinem, doxorubicinem, 5-fluoruracilem, methotrexatem nebo etoposidem inhibuje proliferaci účinněji než chemoterapie samotná při léčbě nádorových buněk linií: SSC-9 hlavy a krku, SSC-15 hlavy a krku, SK-OV-3 ovaria, DU-145 prostaty, MDA-MB-468 prsu a MDA-MB-231 prsu. V jiném provedení je zvýšená protinádorová účinnost pozorována při použití trojkombinace obsahující p53 gen (exprimovaný například v adenovirovém vektoru), adjuvantní protinádorové činidlo (například paclitaxel) a činidlo způsobující poškození DNA (například cisplatinu). Byla prokázána účinnost kombinace p53, paclitaxelu a cisplatiny v modelu ovariálního karcinomu. Tato data podporují použití genové terapie genem p53 v kombinaci s jedním nebo více zde popsanými tumor-supresorovými činidly nebo v kombinaci s tumor-supresorovými činidly a adjuvantním protinádorovým činidlem.

Také se předpokládá, že jakékoliv z těchto chemoterapeutických činidel může být použito jednotlivě v kombinaci s tumor-supresorovou nukleovou kyselinou nebo polypeptidem podle předkládaného vynálezu.

Pokud je tumor-supresorová nukleová kyselina (například p53) podaná v adenovirovém vektoru s adjuvantním protinádorovým činidlem (například paclitaxel) a činidel způsobujícím poškození DNA (například cisplatinou, karboplatinou nebo navelbinem), tak, je acenovirový vektor obvykle podáván po dobu 5 až 14 dnů v dávce 7,5 x 10¹² až 7,5 x 10¹³ adenovirových částic na den. Například může být použita denní dávka přibližně 7,5 x 10¹³ adenovirových částic v kombinaci s karboplatinou. V jednom provedení je denní dávka přibližně 7,5 x 10¹² adenovirových částic použita pro podání do plic. V jiném provedení je p53 podán v kombinaci s topotecanem.

Obvykle je činidlo způsobující poškození DNA podáno v doporučené dávce, viz například Physician's Desk Reference, 51. vydání (Medical Economics, Montvale, NJ, 1997). Například karboplatina je podána v takové dávce, aby bylo dosaženo AUC (plochy pod křivkou) přibližně 6 až 7,5 mg/ml/min.

Inhibitory proteáz

V ještě jiném provedení obsahuje předkládaný vynález kombinované použití tumor-supresorové nukleové kyseliny a/nebo polypeptidů a inhibitoru proteázy. Mezi výhodné inhibitory proteáz patří - bez omezení - inhibitory kolagenázy, inhibitory matrixových metaloproteináz (MMP) (viz například Chambers (1997) J. Nati. Cancer Inst. 86: 1260-1270). Ve výhodném provedení obsahuje způsob podle předkládaného vynálezu současné nebo sekvenční podání účinného množství inhibitoru proteázy a účinného množství tumor-supresorového polypeptidů a/nebo nukleové kyseliny. Příklady sloučenin, které jsou inhibitory proteáz, jsou dobře známé v obdobné a v patentové literatuře.

-33CZ 298488 B6

Imunomodulátory

Tumor-supresorové proteiny a nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou být použity spolu s imunomodulátory, které buď zvyšují imunitní odpověď namířenou proti hyperproliferativním nebo nádorovým buňkám (například imunitní odpověď namířenou proti nádorově specifickým antigenům), nebo snižují imunitní odpověď namířenou proti tumor-supresorovému proteinu, tumor-supresorové nukleové kyselině, tumor-supresorovému vektoru (například antiadenovirovou reakci) a/nebo kombinovaným chemoterapeutickým činidlům. Například, způsob podle předkládaného vynálezu obsahuje kombinované současné nebo sekvenční podání účinného množství tumor-supresorového polypeptidu a/nebo nukleové kyseliny a účinného množství imunomodulátoru. Mezi imunomodulátory patří, bez omezení, cytokiny jak je IL-2, IL-4, IL-10 (U.S. 5231012; Lalani (1997) Ann. Allergy Asthma Immunol. 79. 468-483; Geissler (1996) Curr. Opin. Hematol. 3: 203-208), IL-122 (viz například Branson (1996) Human Gene Ther. 1: 1995-2002) a interferon-γ.

Imunomodulátory, které působí jako imunosupresiva, mohou být použity pro zmírnění imunitní odpovědi namířené proti terapeutickému činidlu (tumor-supresorovému proteinu nebo nukleové kyselině nebo adjuvantními protinádorovému činidlu, atd.). Imunosupresiva jsou v oboru dobře známá. Mezi výhodná imunosupresiva patří například cyklophosphamid, dexamethason, cyklosporin, FK506 (tacrolimus) (Lochmuller (1996) Gene Therapy 3: 706-716), IL-10 a podobně. Také mohou být použity protilátky proti povrchovým buněčným receptorům. Pro tento účel mohou být použity například protilátky, které blokují vazbu ligandu na receptory B buněk, T buněk, NK buněk makrofágů a nádorových buněk. Pro příklady této strategie viz například Yang (1996) Gene Therapy 3: 412-420; Lei (1996) Human Gene Therapy 7: 2273-2279; Yang (1996) Science 275: 1862-1867.

VII. Terapeutické kity

V jiném provedení vynález obsahuje terapeutické kity. Kity obsahují tumor-supresorovou nukleovou kyselinu nebo polypeptid nebo farmaceutický prostředek obsahující tumor-supresorovou nukleovou kyselinu nebo polypeptid. Kity mohou také obsahovat adjuvantní protinádorové činidlo nebo farmaceutický prostředek. Různé prostředky mohou být obsaženy v oddělených zásobnících pro separované podání nebo pro smísení před podáním. Alternativně mohou být různé prostředky obsaženy v jednom zásobníku. Kity mohou také obsahovat různé prostředky, pufry, testovací činidla a podobně, které jsou vhodné pro provedení způsobů podle předkládaného vynálezu. Kromě toho mohou kity obsahovat instrukce pro použití kitu v různých způsobech podle předkládaného vynálezu (například při léčbě nádorů, při profylaxi a/nebo léčbě metastáz a podobně).

Kit může volitelně obsahovat jeden nebo více imunomodulátorů (například imunosupresiv). Zejména výhodnými imunomodulátory jsou imunomodulátory, které zde byly popsány.

VIII. Buňky obsahující heterologní tumor-supresorové nukleové kyseliny nebo polypeptidy a jiná činidla

Dále obsahují předkládaný vynález transfektované nebo jinak zpracované eukaryotické nebo prokaryotické hostitelské buňky (například savčí buňky) obsahující heterologní tumor-supresorovou nukleovou kyselinu a/nebo tumor-supresorový polypeptid. Buňky mohou dále obsahovat adjuvantní protinádorové činidlo, například paclitaxel, nebo jiné činidlo ovlivňující činnost mikrotubulů.

Mezi vhodné prokaryotické buňky patří například bakteriální buňky jako jsou buňky E. coli. Mezi vhodné živočišné buňky patří například jakékoli savčí buňky, lépe jakékoliv neoplastické nebo nádorové buňky, jako jsou buňky, které jsou zde popsané.

-34CZ 298488 B6

Transfektované hostitelské buňky podle předkládaného vynálezu jsou použitelné jako prostředky pro diagnostiku nebo terapii. Při farmaceutickém použití mohou být kombinovány s farmaceuticky přijatelnými nosiči jak jsou popsány výše pro genovou terapii ex vivo. Buňky mohou být podány profylakticky nebo terapeuticky v účinných množstvích, jak byla podrobně popsána výše.

V diagnostice mohou být buňky použity pro výukové nebo jiné referenční účely a jsou vhodným modelem pro identifikaci takto transfektovaných a/nebo ošetřených buněk.

IX. Preklinická a klinická účinnost genové terapie p53 adenovirem

V několika zemích v současnosti probíhá fáze I/II klinických studií adenovirem zprostředkované p53 genové terapie. Farmaceutické prostředky použité v těchto klinických studiích jsou například adenovirus exprimující přirozený p53 podle předkládaného vynálezu (rAd/p53), který se skládá z replikačně defektního, adenovirového (typ 5) vektoru exprimujícího lidský tumor-supresorový gen pod kontrolou cytomegalovirového promotoru („rAd5/p53“), jak je zde popsán (viz Willms (1994), výše).

Regionální podání

Karcinom ovaria omezený na dutinu břišní je jednou klinickou studií, ve které je výhodnou léčbou regionální terapie p53 genem, tj. intraperitoneální aplikace.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady ilustrují, ale neomezují příkladný vynález.

Příklad 1: Kombinovaná terapie p53 a Taxolem^(R)

Vynález obsahuje kombinované podána nukleové kyseliny exprimující tumor-supresorový polypeptid a paclitaxelu pro léčbu neoplastických onemocnění. Následující příklad podobně popisuje schopnost adenoviru exprimujícího p53 podle předkládaného vynálezu v kombinaci s Taxolem^(R)léčit nádory a uvádí, že kombinovaná terapie je účinnější v usmrcení nádorových buněk než terapie každým činidlem samostatně.

Kombinovaná terapie in vitro

Buňky byly podrobeny jednomu ze tří léčebných režimů: v léčbě 1 byly buňky nejprve předošetřeny Taxolem^(R) 24 hodin před expozicí p53 adenovirovému konstrukci A/C/N/53; v léčbě 2 byly buňky předem ošetřeny p53 adenovirovým konstruktem a později byly vystaveny taxolu^(R); v léčbě 3 byly buňky vystaveny zároveň působení Taxolu^(R> a p53 adenoviru. p53 Ad a Taxol^(R)mohou tedy být podány ve stejné 24-hodinové periodě.

Přibližně 1,5 x 10⁴ buněk v kultivačním médiu (buněčná linie nádorů hlavy a kruku SCC-9, SCC-15, a SCC-29 v 1:1 směsi DMEM + Ham's F12 média s 0,4 pg/ml kortisolu a 10 % FBS a 1% neesenciálních aminokyselin; prostatická buněčná linie Du-145 a ovariální buněčná linie SK-OV-3 vEaglově esenciálním médiu s 10% FBS) se přidá do každé jamky 96-jamkové mikrotitrační plotny a provede se kultivace po dobu přibližně 4 hodin při 37 °C a 5% CO2. Do každé jamky se přidá lék (Taxol^(R)), p53 adenovirus nebo vhodné vehikulu/pufr. Protože paclitaxel není rozpustný ve vodě, rozpustí se lék před aplikací v alkoholu. Buňky se potom kultivují přes noc při 37 °C a v 5% CO2. p53 adenovirus se aplikuje ve fosfátovém pufru (20 mM NaH₂PO₄, pH 8,0, 130 mM NaCI, 2 mM MgCl₂, 2% sacharóza).

Smrt buněk se kvantifikuje za použití techniky, kterou popsal Mosmann (1983) J. Immunol. Meth. 65: 55-63. Stručně, 25 pl 5 mg/ml MTT vital barviva [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5

-35CZ 298488 B6 difenyltetrazoliumbromid] se přidá do každé jamky a provede se inkubace po dobu 3 až 4 hodin při 37 °C a v 5% CO₂. Potom se do každé jamky přidá 100 μΐ 10% SDS detergentu a provede se inkubace přes noc při 37 °C a v 5% CO₂. Signál v každé jamce je kvantifikován za použití čtečky mikroploten (Thermo-max, Molecular devices). Použité buněčné linie a získané výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1: In vitro hodnocení adjuvantního protinádorového činidla (Taxol^(R)) v kombinaci s tumor-supresorovou nukleovou kyselinou

Léčba

Buněčná linie nádor	Dávka Taxolu® (pg/ml)	Dávka A/C/N/53 (m.o.i.)	Předléčeni Taxolem®	Předléčení p53	Současné podání
SK-OV-3 Karcinom ovaria	0,37	40	aditivní efekt p<0,0001	bez efektu p>0,2000	aditivní efekt p<0,0001
SCC-25 Karcinom hlavy a krku	0,10 nebo 0,01	2,5 nebo 5,0	aditivní efekt p<0,0001	velmi malý efekt p=0,0606	aditivní efekt p<0,0001
SCC-15 Karcinom hlavy a krku	0,10 nebo 0,01	2,5 nebo 5,0	aditivní efekt p^0,002	aditivní efekt p<0,0001	aditivní efekt p<0,0001
Du-145 Karcinom prostaty	0,36 nebo 0,036 nebo 0,0036	2,5 nebo 5,0	aditivní efekt p<0,03	aditivní efekt p<0,0001	aditivní efekt p^O,0001
SCC-9 Karcinom hlavy a krku	0,12 nebo 0, 012 nebo 0,0012	2,5 nebo 5, 0	aditivní efekt p<0,01	aditivní efekt p<0,0001	aditivní efekt p<0,0001

Obecně je p53 adenoviru účinnější, když je podán po nebo současně s Taxolem^(R), než když je před Taxolem^(R). Tyto výsledky ukazují na synergismus mezi A/C/N/53 a Taxolem^(R).

Isobologramová analýza určující synergistický účinek

SK-OV-3 (p53-nulová varianta) ovariální nádorových buněk je ošetřena kombinace Taxolu^(R)a p53/adenovirem (A/C/N/53), jak je uvedeno v tabulce 2. Dávkování je stejné, jak je uvedeno výše. Smrt buněk byla kvantifikována v den 3 za použití MTT testu, jak je popsán výše. Kromě toho byly vytvořeny křivka dávka-odpověď pro p53 Ad samotný (za použití dávek uvedených v tabulce 2) (po 2 dnech expozice buněk léku) a křivka dávka-odpověď pro Taxol^(R) samotný za použití dávek uvedených výše (po 3 dnech expozice buněk léku).

-36CZ 298488 B6

Tabulka 2: Léčebné skupiny pro kombinovaná ošetření Taxolem^<R) a p53 Ad (A/C/N/53)

Skupina	Taxol® (pg/ml)	p53 Ad (m.o.i.)	Skupina	Taxol® (gg/ml)	p53 Ad (m.o.i.)
1	0, 001	0,5	25	0, 001	10
2	0,01	0,5	26	0,01	10
3	0,1	0, 5	27	0,1	10
4	0, 5	0,5	28	0,5	10
5	1	0, 5	29	1	10
6	5	0,5	30	5	10
7	10	0,5	31	10	10
8	20	0,5	32	20	10
9	0,001	1	33	0, 001	25
10	0, 01	1	34	0, 01	25
11	0,1	1	35	0,1	25
12	0, 5	1	36	0,5	25
13	1	1	37	1	25
14	5	1	38	5	25
15	10	1	39	10	25
16	2 0	1	40	20	25
17	0, 001	5	41	0,001	50
18	0, 01	5	42	0, 01	50
19	0,1	5	43	0,1	50
20	0, 5	5	44	0, 5	50
21	1	5	45	1	50
22	5	5	46	5	50
23	10	5	47	10	50
24	20	5	48	20	50

Obr. 1 ilustruje inhibici proliferace buněk (ve srovnání s kontrolními buňkami ošetřenými pufrem) v závislosti na typu ošetření. Obecně, stoupající dávky buď Taxolu^(R), nebo p53 snižují rychlost proliferace buněk, kdy kombinace p53 a Taxolu^(R) má vyšší účinnost než každé léčivo samostatně.

io Obr. 2 ilustruje isobologramovou analýzu těchto dat za použití Isobole metody, která je popsána vBerenbaum (1989) Pharmacol. Rev. 93-141. Synergismus mezi Taxolem^(R) a p53 (A/C/N/N53) byl pozorován tehdy, když byly buňky předem ošetřeny Taxolem^(R) 24 hodin před expozicí p53 (A/C/NP53). Na obr. 2 představuje přímka (isobola pro ED₃₀) vliv na proliferaci buněk, který by byl očekáván, pokud by účinek dvou léků byl pouze aditivní. Ve skutečnosti jsou

-37CZ 298488 B6 pozorované účinky více vlevo od předpokládané přímky, což ukazuje, že byly nutné nižší než předpokládané koncentrace pro každé léčivo a že došlo k synergismu mezi těmito dvěma léčivy.

Příklad 2: Genová terapie zprostředkovaná p53-adenovirem při léčbě metastáz

Vynález obsahuje způsob pro podání nukleové kyseliny exprimující tumor-supresorový polypeptid při léčbě metastáz. Následující příklad podrobně popisuje schopnost p53 exprimující adenoviru podle předkládaného vynálezu infikovat různé tkáně v těle a léčit metastázy.

Samicím SCID myší (myší homozygotních pro SCID mutaci, kterých chybí jak B, tak T buňky z důvodů V(D)J rekombinace) byly podány do tukové vrstvy v oblasti první žlázy buňky karcinomu prsu MDA-MB-231 v dávce 5 x 10⁶. Po uchycení primárních nádorů a po jejich metastázování do plic byly primární nádory chirurgicky odstraněny (v den 11). Myši byly léčeny intravenózním podáním A/C/N/53 nebo kontrolního pufru v den 23, 30, 37, 44 (lqW), kdy A/C/N/53 (p53 v adenoviru) byl podán v dávce 4 x 10⁸ C.I.U./injekci. V den 49 byly plíce odebrány, fixovány, barveny a mikroskopicky vyšetřovány.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.

Tabulka 3: Inhibice plísních metastáz MDA-MB-231 za použití A/C/N/53.

Léčba	Počet metastas	< 6 metastas	> 84 metastas
Pufr n = 17	11 (65%)	1 (6%)	5 (29%)
A/C/N/53 n = 10	5 (50%)	4 (40%)	1 (10%)

Léčba A/C/N/53 snižuje počet metastáz u myší s prokázanými metastázami.

Ve druhém pokusu do 231 tumorů v tukové tkáni prsních žláz SCID nebo SCID-beige myší podány peritumorální injekce A/C/N/53. Celková dávka 2-4 x 10⁹. C.I.U. podaná v 10 injekcích snížila počet myší s plicními metastázami o 80 % u SCID myší a o 60 % u SCID-beige myší. Také počet metastáz na myš se výrazně snížil u myší s jakýmikoliv plicními nádory. Jak je uvedeno výše, intravenózní podání A/C/N/53 je také účinně při léčbě plicních metastáz u SCID. myší. Tato data ukazují, že protinádorová genová terapie A/C/N/53 může ovlivňovat kromě růstu primárního nádoru také závažnost metastatického onemocnění.

V jiném pokusu bylo samicím SCID myší podáno 5 x 10⁶ MDA-MB-231 buněk nádoru prsu/myš do tukové tkáně prsní žlázy v den 0. Primární (prsní) nádory byly chirurgicky odstraněny v den 18. Myši byly léčeny intravenózní injekcí pufru, β-gal AD, nebo p53 Ad (A/C/N/53) ve dny 21, 24, 32, 39 a 36. Dávka viru na injekci byla 4 x 10⁸ C.I.U (A/C/N/53) (PN/C.I.U = 23,3) a 9,3 x 10⁹ částic β-gal Ad (PN/C.I.U. = 55,6; 1,7 x 10⁸ C.I.U.).

Plíce a játra byly odebrány v den 51 a byly fixovány ve formalinu. Tkáňové řezy byly vyšetřovány na přítomnost plicních nádorů a na poškození jater. Hlavní orgány od 2 myší ošetřených pufrem a od 2 myší ošetřených β-gal Ad byly zmrazený pro prokrájení za zmrazeného stavu a analýzu β-galaktosidázové enzymatické aktivity.

-38CZ 298488 B6

Tabulka 4: Inhibice plicních metastáz MDA-MB-231 za použití A/C/N/53

Plicní metastasy na myš	Pufr *	β-gal Ad *	p53 Ad
á 20	11% (1)	8% (1)	21% (3)
> 20 a á 100	11% (1)	33% (4)	79% (11)
> 100 a < 200	33% (3)	33% (4)	0% (0)
> 200 a < 300	33% (3)	17% (2)	0% (0)
> 300	11% (1)	8% (1)	0% (0)
Celkový hodnocený počet	9	12	14
Opětovný růst primárního nádoru	82% (9/11)	88% (14/16)	100% (14/14)

* Počet metastáz je podhodnocen. V plicích rostly vícečetné nádory.

Počet metastáz na plíci ve skupině léčené pufrem a β-gal Ad nebyl signifikantně odlišný (p = 0,268, viz tabulka 4).

Léčba p53 Ad významně redukuje počet metastáz na plíci ve srovnání s léčbou pufrem I β-Ad (p < 0,001 a p < 0,002, v příslušném pořadí). Kromě redukce počtu metastáz byla také pozorována výrazná redukce velikosti plicních metastáz ve skupině léčené p53 Ad. V kontrolních skupinách byly tkáňové řezy z většiny plic zvíce než 50% tvořeny nádorovou tkání a jednotlivé metastázy již nebylo možno v plicích rozeznat. Oproti tomu, plicní metastázy u většiny případů ze skupiny léčené p53 Ad byly malé a snadno rozlišitelné jako jednotlivé nádory.

Tkáňová distribuce adenoviru

Vjatemí tkáni byl detekován velký počet infikovaných buněk (přibližně 50 %) a aktivita β-galaktosidázy byla silná. V plících byly rozptýlené plochy infikovaných buněk rovnoměrně distribuovány ve tkáni. Ve střevu a v žaludku byla pozorována periodická infekce buněk v zevní stěně hladkého svalu okolo orgánů. Byla také detekována aktivita β-galaktosidázy v rozptýlených mikroklecích v lumen. Zevní vrstva hladkého svalu dělohy vykazovala podobný periodický charakter infekce jako byl pozorován ve střevu. Většina buněk stromatu vaječníků byla infikována. Ve slezině byla detekována rozptýlená aktivita β-galaktosidázy ve složce hladkého svalu orgánu. Velmi málo infikovaných buněk (< 1%) bylo detekováno v příčně pruhovaném srdečním svalu. Téměř nebyly detekovány infikované buňky v tukové vrstvě prsních žláz, ani v příčně pruhovaném svalu pod prsní žlázou. Žádné infikované buňky nebyly detekovány v ledvinách.

Jatemí patologie

Všechna játra byla při pitvě vizuálně normálního vzhledu. NV žádných játrech nebyla detekována přítomnost nadměrných nekros. Nicméně, u myší léčebných adenovirem byly detekovány abnormality hepatocytů (které nebyly přítomné u skupin léčené pufrem), které zahrnovaly vyšší počet buněk v mitose, buněčné inkluze a změny velikosti a tvaru hepatocytů.

-39CZ 298488 B6

Příklad 3: Genová terapie p53 adenovirem při léčbě xenotransplantátů lidského karcinomu prsu

Vynález zahrnuje způsoby pro léčbu různých nádorů, které zahrnují podání nukleové kyseliny exprimující tumor-supresorový polypeptid. Následující příklad popisuje schopnost adenoviru exprimujícího p53 podle předkládaného vynálezu léčit lidský karcinom prsu.

Vložení přiloženého p53 do nádorů bez p53 nebo s mutantním p53 je novou strategií pro kontrolu nádorového růstu. Casey (1991) Oncogene 6: 1791-1797, vložil přirozený p53 do buněk karcinomu prsu in vitro pomocí plazmidového DNA vektoru. Počet rostoucích kolonií MDA-MB-468 (p53^mut) a T47D (p53^mut) se po piazmidové transfekci snížil o 50%. Žádná z výsledných kolonií také neexprimovala přirozený p53. Oproti tomu, počet kolonií MCF-7 (přirozený P53) nebyl ovlivněn. Negrini (1994) Cancer Res. 54: 1818-1824, provedl podobnou studii za použití MDA-MB-231 buněk. Tvorba kolonií se po transfekci plazmidem obsahujícím přirozený P53 snížila o 50 % a žádná z výsledných kolonií neexprimovala přirozený p53. Paradoxně byly v této studii podobné výsledky pozorovány pro MCF-7 buňky.

Ve studii popsané v tomto příkladu byla účinnost replikace defektního, rekombinantního p53 adenoviru s deletovaným El regionem (p53 Ad; (A/C/N/53) Wills (1994), výše) testována na nádorových liniích lidského karcinomu prsu exprimujících mutantní p53 MDA-MB-231, MDA-MB-468 a MDA-MB^435. Buňky MDA-MB-231 obsahují mutaci Arg na Lys v kodonu 280 genu pro p53 (Bartek (1990) Oncogene 5: 893-899). MDA-MB-468 obsahují mutaci Arg na His v kodonu 273 (Id.). MDA-MB^135 buňky obsahují mutaci Gly na Glu v kodonu 266 genu pro p53 (Lesoon-Wood (1995) Hum. Gene Ther. 6: 395-405).

Dřívější studie prokázaly vysoké hladiny exprese přirozeného p53 v nádorových buňkách odvozených z nádorů prsu, ovaria, plic, kolorekta, jater, mozku a močového měchýře po infekci p53 Ad in vitro (Wills (1994), výše; Harris et al., (1996) Cancer Gene Therapy 3:1 121-130). Adenovirem zprostředkovaná exprese p53 nakonec vede ke změnám v morfologii buněk a k indukci apoptózy u nádorových buněk bez p53 nebo buněk s mutantním p53. Infekce buněk karcinomu prsu 468 p53 Ad v dávce 10 m.o.i. (opakovaná infekce) způsobuje téměř 100% inhibicí syntézy DNA za 72 hodin po infekci. Kromě toho, infekce p53 Ad in vitro také inhibuje proliferaci MDA-MB-468 a MDA-MB-231 buněk s hodnotami ED₅₀ 3 ± 2, resp. 12 ± 1% m.o.i. Proliferace tří dalších nádorových linií karcinomu prsu s mutací p53 byla také inhibována při nízkých koncentracích p53 Ad.

Hodnoty ED₅₀ byly 16 ± 4 m.o.i. pro SK-BR-3 buňky, 3 ± 3 m.o.i. pro T-A7D buňky a 2 ± 2 m.o.i. pro BT-549 buňky. Infekce MDA-MB^468 a MDA-MB-231 buněk dávkou 30 m.o.i. ekvivalentního, rekombinantního adenoviru exprimujícího β-galaktosidázu E. coli (β-gal) místo p53, vedla ke vzniku > 67 % β-gal pozitivních MDA-MB-468 buněk a 33 až 66 % β-gal pozitivních MDA-MB-231 buněk. Při korelaci procenta β-gal pozitivních buněk s antiproliferativním účinkem p53 na velkém panelu nádorových buněk Harris et al. (výše) prokázali silnou pozitivní korelaci adenoviru. Naopak, buněčné linie exprimující normální hladiny přirozeného p53 byly minimálně ovlivněny přenosem p53, bez závislosti na rychlosti přenosu adenoviru.

Proliferace MCF7 a HBL-100 buněk, dvou buněčných linií lidského karcinomu prsu, které obsahují přirozený p53, byla in vitro relativně neovlivněna p53 Ad v koncentracích vyšších nebo rovných 99 m.o.i. Jinými slovy, inhibiee růstu MCF-7 a HBL-100 buněk vyžaduje koncentrace p53 Ad alespoň 8-, resp. 33-krát vyšší, než jsou hodnoty ED₅₀ pro MDA-MB-231, resp. MDA-MB-468 buňky. Při použití podobného rekombinantního p53 Ad prokázal Katayose, (1995) Clin. Cancer Res. 1: 889-897, vyšší expresi p53 proteinu, nižší proliferaci buněk a vyšší stupeň apoptózy u MDA-MB-231 buněk transformovaných in vivo. Tato studie rozšiřuje in vitro výsledky pro MDA-MB-468 a MDA-MB-231 buňky na xenotransplantáty karcinomu prsu in vivo. Účinnost genové terapie p53 adenovirem je hodnocena najiné buněčné linii karcinomu prsu (MDA-MB-435). která je resistentní na transformaci adenovirem in vitro.

-40CZ 298488 B6

Materiál a metody

Buněčné linie a adenovirová infekce in vitro

Buněčná linie lidského karcinomu prsu MDA-MB-231, -468 a —435 byly získány od ATCC (Rockville, Maryland, USA). MDA-MB-231 byly kultivovány v DMEM (Life Technologie, Grand Island, NY) s 10% fetálním telecím sérem (FCS; Hyclone, Logan, utah) při 37 °C a v 5% CO₂. MDA-MB^168 buňky byly kultivovány v Leibovitzově L-15 médiu (Life Technologies) obsahujícím 10% FCS při 37 °C. MDA-MB-435 buňky byly kultivovány v Leibovitzově L-15 médiu obsahujícím 15% FCS a lOpg/ml hovězího inzulínu (Sigma Chem. CO., St. Lois, Missouri) při 37 °C.

Konstrukce a propagace rekombinantních adenovirů (rAd) exprimujících lidský přirozený p53 a β-galaktosidázu E. coli, ve kterých je exprese transgenu řízena lidským cytomegalovirovým promotorem, byla popsána dříve (Wills (1994), výše). Adenoviry byly podány ve fosfátovém pufru (20 mM NaH₂PO4, pH 8,0, 130 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 2% sacharóza). C.I.U. označuje buněčné infekční jednotky. Koncentrace infekčních virových částic byly stanovena měřením 293 buněk pozitivních na virový hexenový protein 48 po infekci (Huyghe (1995) výše).

Pro in vitro studie infekce p53 Ad byly buňky umístěny v hustotě 1 x 5 x 10⁴buněk/jamku ve 12jamkových tkáňových kultivačních plotnách (Becton Dickinson, Lincoln Park, New Jersey, USA). Buňky byly transformovány 0, 10 nebo 50 m.o.i. (množství infekce = C.I.U./buňku) p53 Ad a byly kultivovány po dobu 72 hodin, jak bylo popsáno dříve (Wills (1994, výše). Pro in vitro studie infekce Pgal Ad byly buňky umístěny v hustotě 1 x 10⁵ buněk/jamku. Buňky byly transformovány 0, 10, 50 nebo 100 m.o.i. β-gal Ad. Po 48 hodinách byly buňky fixovány 0,2 % glutaraldehydem (Sigma Chemical Co.) a potom byly 3-krát promyty PBS (Life Technologies). Buňky byly potom testovány v 1 ml X-Gal roztoku (1,3 mM MgCl₂, 15 mM NaCl, 44 mM Hepes pufru, pH 7,4, 3 mM ferrikyanidu draselného a 1 mg/ml X-Gal v N,N-dimethylformamidu (10% konečná koncentrace)). X-Gal byla získána od Boehringer Mannheim Corp. Indianapolis, Indiana. Všechny ostatní chemialie byly získány od Sigma.

Pro určení procenta transformovaných buněk bylo z každé kultivační jamky prohlíženo 5 mikroskopických polí a pro 3 jamky při každé m.o.i. bylo vypočítáno průměrně procento buněk exprimujících β-gal.

Léčba adenovirem in vivo

Athymické samice holých myší byly získány od Charle River Laboratories (Wilmington, Massachusetts, USA). Všechny myši byly chovány ve VAF—barrier boxer a všechny pokusy na zvířatech byly provedeny podle pravidel uvedených vN.I.H. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Nádorové buňky byly injekčně podány buď podkožně, nebo do tukové vrstvy prsních žláz.

Inokulační dávky buňky byly: 5 x 10⁶ buněk MDA-MB-231/myš; 1 x 10⁷ buněk MDA-MB468/myš a 1 x 10⁷ MDA-MB-435 buněk/myš. Nádory se nechaly růst in vivo po dobu 10 až 11 dní před podáním první dávky, s výjimkou pokusu s buňkami MDA-MB^168, ve kterých rostliny nádory po dobu 33 dní před zahájením léčby. Objem nádorů byl stanoven měřením ve třech rozměrech. Objemy nádorů pro každou skupinu každý den byly srovnávány za použití Student testu pomocí Statview II softwaru (Abacus Concepts, Barkeley, Califomia). Průměrná procenta inhibice pro skupiny s podanou dávkou ve dny 0 až 4 a 7 až 11 byly vypočítány za použití hodnot statické významnosti (p < 0,05) po dny od 14. až do konce studie.

-41 CZ 298488 B6

Specifické účinky p53 byly odlišeny od účinků adenovirového vektoru odečtením průměrné inhibice růstu způsobu β-gal Ad od inhibice růstu způsobené p53 Ad. Všechny injekce viru byly peri/intranádorové. Obecně byly každé myši podány dvě 5 denní série protinádorové terapie (tj. 5 injekcí), které byly odděleny 2 denní „odpočinkovou periodou“. V některých případech bylo podávání dávky prodlouženo na více než 2 týdny a/nebo byl místo některých injekcí viru podán pufr. Křivky růstu nádoru uvádějí průměrný objem nádoru ± SEM:

Histologické a Apoptag imunohistochemické vyšetření

Vzorky tkáně byly fixovány v 10% pufrovaném formalinu, byly zpracovány přes noc vMiles VIP Tissue Processor a potom byly ponořeny do parafinu. Tkáňové řezy o síle 5 mikronů byly vyrobeny za použití Leitzova mikrotomu. Řezy byly barveny běžným Harrisovým hematoxylinem a eosinem (Luna et al. (1968), Manual of Histologie Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology, New York, McGraw Hill Book Co.).

Apoptag in šitu kitu pro detekci apoptózy byly získány od oncor (Gaitherburg, Maryland, USA). Vzorky byly analyzovány podle návodu pro použití kitu. Stručně, deparafinované, rehydratované tkáňové řezy byly zpracovány s Oncor Protein Digesting Enzyme, byly inkubovány s TdT a byly vyvíjeny za použití avidin-peroxidasového kitu (králičí IgG - Sigma Chem. Co., č. Extra-3) a DAB (Vector Lab. č. SK4100). Řezy byly kontrastně barveny methylovou zelení.

β-galaktosidázový test

Nádory byly ponořeny v TBS (Triangle Biomedical Sciences, Durham, North Caroline, USA) a byly rychle zmrazený v lázni 2-methylbutan/suchý led. Zmrazené tkáňové řezy (tloušťky 8 pm) byly fixovány v 0,5% glutaraldehydu při 4 °C po dobu 5 minut a potom byly testovány na expresi β-gal způsobem popsaným výše.

FACS analýza integrinu

Buňky byly suspendovány pomocí 0,02% EDA, byly peletovány a potom byly promyty 2x PBS. Potom byly buňky resuspendovány v koncentraci 1 x 10⁶ buněk/ml a byly inkubovány s primárními protilátkami (konečný koncentrace 1:250/ml) při 4 °C po dobu 1 hodiny. Buněčné suspenze byly promyty 2x PBS pro odstranění nadbytku primární protilátky. Potom byly buňky inkubovány s FITC-konjugovanou králičí anti-myší pomocnou protilátkou (konečná koncentrace l:250/ml, Zymed) při 4 °C po dobu 1 hodiny. Buňky byly opět promyty PBS a ihned byly analyzovány. Fluorescence byla měřena za použití FACS Vantage průtokového cytometru (Becton Dickinson, Mountain View, Califomia, USA). Vedlejší rozptyl a rozptyl vpřed byly stanoveny simultánně a všechna data byla zpracovávána za použití počítače Hewlett packard vybaveného FACS research softwarem (Becton Dickinson). Primární protilátky použité pro detekci receptorů pro integriny byly získány od následujících dodavatelů: anti-a_v (12084-018, Gibco BRL; πηΐΐ-β₃(550036, Becton Dickenson); ηηΐί-α_νβ₃ (MAP 1976, Chemicon); anti-βι (550034, Becton Dickenson); a anti-o^₅ (MAB 1961, Chemicon).

Výsledky

Transformační účinnost adenoviru a inhibitoru růstu způsobená p53 in vitro

MDA-MB-231 a MDA-MB^168 buňky byly vysoce účinně transformovány in vitro při m.o.i. 10. Naopak, MDA-MB-435 buňky byly transformovány ojediněle, a to i při 100 m.o.i. Pro MDA-MB-231 buňky bylo 8 % (10 m.o.i), 46% (50 m.o.i.) a 62 % (100 m.o.i.) buněk transformovány β-gal Ad. Pro MDA-MB-468 buňky bylo β-gal Ad transformováno 78 % (10 m.o.i). 84 % (50 m.o.i.) a 97 % (100 m.o.i.) buněk. Pro MDA-MB^135 buňky bylo β-gal Ad transformováno 0,5 % (10 m.o.i.) 1 % (50 m.o.i.) a 1,3 % (100 m.o.i.) buněk.

-42CZ 298488 B6

Infekce 50 m.o.i. p53 Ad vedla téměř ke kompletní smrti buněk v kulturách MDA-MB-468 aMDA-MB-231 buněk. Naopak, p53 Ad neměl žádný detekovatelný vliv na MDA-MB^135 buňky.

Účinnost p53 Ad proti xenotransplantátům lidského karcinomu prsu p53 genová terapie zprostředkovaná adenovirem byla vysoce účinná proti xenotransplantátům MDA-MB—468 a MDA-MB-231 buněk (obr. 3a a 3b). V pokusech sMDA-MB-231 byla myš ve skupině β-gal Ad a 3 myši ve skupině p53 Ad bez nádoru na konci pokusu a všechny nádory regredovaly během léčby p53 Ad. Inhibice růstu -231 nádorů byla průměrně 86 % (p < 0,01). Složka inhibice růstu způsobené p53 byla průměrně 37 %, zatímco inhibice specifická pro adenovirus byla průměrně 37 %, zatímco inhibice specifická pro adenoviru byla průměrně 499 % (p < 0,01). Jedna myš ve skupině p53 Ad byla bez nádoru na konci pokusu a všechny nádory regredovaly během léčby p53 Ad. Inhibice růstu —468 nádorů způsobená p53 byla průměrně 45%( (p<0,001), zatímco inhibice specifická pro adenovir byla průměrně 28 % (p < 0,005). V žádném pokusu nebyly pozorovány vedlejší účinky. Hodnoty ED₅₀ pro inhibice růstu -231 až —468 nádorů byly 3 χ 10⁸ C.I.U. (buněčných infekčních jednotek), resp.

χ 10⁸ C.I.U. (obr. 4). -435 nádory byly téměř úplně resistentní na léčbu p53 Ad (obr. 3c). Inhibice růstu ve skupině —435 nádorů léčených adenovirem nebyla statisticky významná.

Obr. 5 ukazuje srovnání účinnosti dvou režimů podání p53 Ad při léčbě -231 nádorů. Všem myším bylo podáno 5 perinádorových injekcí za týden. Všechny myši léčené terapeutickým činidlem (p53 Ad) dostaly celkem 2,2 χ 10⁹ C.I.U./myš/týden. Jedné skupině byla podána bolusová injekce celé týdenní dávky adenovirum. Další 4 injekce pro daný týden obsahovaly vehikulum (skupina IX). V dalších léčených skupinách byla podána stejná dávka Ad rozdělená do 5 injekcí za týden (skupina 5X). Tento dávkovači režim byl podán během týdnů 1 a 3 (dny 0-4, 14-18). Inhibice růstu byla průměrně 73 % pro skupinu 5X (p < 0,01), ale pouze 44 % pro skupinu IX (p < 0,05 pro první tři týdny pokusu, nesignifíkantní po dvou 21). První cyklus genové terapie p53 byl účinnější než druhý cyklus. Po prvním cyklu byly 4 myši ve skupině IX, 5 myší ve skupině 5X a 1 myš v kontrolní skupině (vehikulum) bez nádoru. U jedné myši ve skupině 5X došlo k relapsu velmi malého nádoru v den 21. Po druhém cyklu terapie nebylo pozorováno žádné další „vyléčení“.

Obr. 6 ukazuje pokusy na 468 nádorech, které byly na počátku 4-krát větší než 468 nádory uvedené na obr. 3b a které byly léčeny 10-krát nižší dávkou adenoviru. Byla podána celková dávka 2,2 χ 10⁸ C.I.U/myš/týden. Jedné skupině byla podána jediná bolusová injekce viru a další 4 injekce pro daný týden obsahovaly pufr (skupina IX). Další léčené skupině byla podána stejná dávka Ad rozdělená do 5 injekcí za týden (skupina 5X). Tyto dávkovači režimy byly podávány po dobu 6 týdnů. Celková podaná dávka viru byla přibližně poloviční ve srovnání s dávkou použitou na obr. 3. Toto schéma dávkování mělo cytostatický účinek na objem nádoru u myší léčených p53 Ad (p < 0,05). Dávky podané v pokusu dříve se jevily jako účinnější než dávky podané později. Jedna myš ve skupině 5X byla bez nádoru v den 21. Nicméně, pokud byla srovnávána inhibice růstu nádoru u všech myší, tak bylo schéma IX (60 %) o něco účinnější, ale ne statisticky významně účinnější, než schémat 5X (55 %). Za jeden týden po skončení dávkování se rychlost růstu nádorů ve skupině 5X začaly zvyšovat. Jeden měsíc po zahájení studie začaly nádory ve skupině léčené vehikulem nekritizovat a dosáhly fáze plato.

In vivo infekčnost po opakované expozici adenoviru

Na konci studií uvedených na obr. 5 a 6 byla do některých nádorů podána injekce β-gal Ad. Tyto nádory byly odebrány od 24 hodin později a zmrazené tkáňové řezy byly vyšetřovány na expresi β-galaktosidázy. Nádory léčené p53 Ad po dobu 2 nebo 6 týdnů ještě stále exprimovaly β-gal Ad, ačkoliv transformace byla nejnižší u —468 nádorů léčených po dobu 6 týdnů p53 Ad

-43CZ 298488 B6

5x týdně. V řezech pouze z 1 ze 3 —468 nádorů ve skupině 5X byly identifikovány buňky exprimující β-galaktosidázu.

Indukce apoptózy p53 Ad in vivo

Do xenotransplantátů MDA-MB-231 a MDA-MB-468 karcinomu prsu na holých myších bylo podáno injekčně 1-5 x 10⁸ C.l.U. p53 Ad nebo pufru 48 až 72 hodin před odběrem. Indukce apoptózy způsobená p53 Ad byla stanovena za použití Apoptag imunohistochemické metody na tkáňových řetězec. U nádorů, do kterých byl aplikován p53 Ad, byly prokázány rozsáhlé plochy apoptotických buněk podél dráhy jehly i intranádorové aplikace a v zevní hranici nádorů u parinádorové aplikace. Naopak, u nádorů s aplikací pufru byly identifikovány pouze rozptýlené apoptotické buňky, jak bylo očekáváno.

Srovnání exprese integrinu u MDA-MB-231 a MDA-MB-435 buněk

FACS analýza exprese integrinu byla provedena na MDA-MB-231 a MDA-MB-435 buňkách pro určení toho, zda nízký stupeň transformace MDA-MB-435 buněk byl způsoben deficitem cc_vintegrinů nutných při intemalizaci Ad typů 2, 3 a 4 (Wickham et al. (1993) Cell 73: 309-319; Wickham et al. (1994) J. Cell Biol. 127: 257-264; a mathias et al. (1994) J. Virol. 68: 68116814). Oba typy buněk exprimovaly α_ν, α_νβ₃, α_νΒ₅ a βι integríny přibližně na stejné úrovni. Exprese integrinu α_νβ3 a β₃ byla vyšší než MDA-MB-435 buňkách než na MDA-MB-231 buňkách.

Diskuse: Při aplikaci 2,2 x 10⁹ C.l.U. p53 Ad v 10 injekcích je inhibice růstu nádoru 74 % pro MDA-MB-468 nádory a 86 % pro MDA-MB-231 nádory, ale žádná významná inhibice není pozorována pro MDA-MB-435 nádory. U MDA-MB-468 nádorů je 61 % celkové odpovědi specifických pro p53, zatímco u MDA-MB-231 nádorů je 43 % celkové odpovědi specifických pro p53. Schopnost β-gal Ad transformovat MDA-MB-231, MDA-MB^168 a MDA-MB-435 buňky in vitro je obyčejně prediktivní pro výsledky in vivo. Při stejné koncentraci viru mají MDA-MB-468 buňky o něco vyšší rychlost transformace než MDA-MB-231 buňky, zatímco MDA-MB^135 buňky jsou resistentní na transformaci adenovirem. Výsledky pro MDA-MB-45 buňky získané in vitro korelují velmi špatné odpovědi in vivo.

Bylo prokázáno, že systémová léčba holých myší s MDA-MB-435 nádory vektorem p53-liposom způsobuje inhibici růstu nádoru a v některých případech regresi nádoru (LesoonWood et al. (Hum. Gene. Ther. 6: 395-405). Léčba p53-lisomy také redukuje počet plicních metastáz. Tyto výsledky naznačují, že chybění odpovědi MDA-MB^435 nádorů na terapii p53 ad nebylo způsobeno neschopností inhibovat růst a metastázování MDA-MB-435 nádorů. Pravděpodobněji bylo toto chybění odpovědi na léčbu p53 ad způsobeno nízkou účinností adenovirové transformace MDA-MB-435 buněk.

oiv integríny se považují za buněčné elementy nutné pro účinnou intemalizaci adenovirů typu 2, 3 a 4 (Wickham (1993) výše; Wickham (1994), výše; a Mathias (1994), výše). Je pravděpodobné, že oc_v integríny mají stejnou úlohu pro Ad typu 5. Wickham et al. (1994), výše pozorovat 5-10-násobně vyšší intemalizaci rekombínantního adenovirů typu 5 v buňkách transformovaných α_νβ₅ ve srovnání s buňkami bez exprese oc_v nebo s buňkami transformovanými α_νβ₃. Zde použité -293 buňky lidské embryonální ledviny použité pro produkci p53 Ad exprimují α_νβι integríny, ale nikoliv α_νβ₃ integríny (Bodary (1990) J. Biol. Chem. 265: 5938-5941). proto se zdá rozumné měřit expresi cc_v, βι, β₃ a oc₅ integrinových podjednotek na —435 buňkách. MDA-MB231 a MDA-MB-435 buňky exprimují přibližně stejná množství molekul integrinové rodiny. Proto není chybění Ad transformace MDA—MB^135 buněk způsobeno deficitem v expresi 0C5 integrinu. V současnosti není v literatuře známá totožnost buněčných receptorů nutných pro vazbu Ad na cílové buňky. Je možné, že MDA-MB-435 buňky jsou deficitní pro tento receptor

-44CZ 298488 B6 nebo pro nějakou jinou složku nutnou pro vazbu viva, pro intemalizaci nebo pro genovou expresi.

Přetrvávající účinnost p53 Ad během opakovaných cyklů terapie byla vyšetřována na MDAMB-231 a MDA-MB-468 nádorových modelech. Zde se, účinnost se snižuje s pokračujícím podáváním; nicméně tento účinek musí být prozkoumán podrobněji. Převažující teorie tvrdí, že infekce adenovirem vyvolává rychlou zánětlivou a cytolytickou odpověď zprostředkovanou cytotoxickými T buňkami u hostitele spině funkčním imunitním systémem (Wilson (1995), Nátuře Med. 4: 887 - 889). Tato odpověď T buněk je stimulována adenovirovými antigeny produkovanými v hostitelských buňkách a presentovanými spolu s MHC molekulami na povrchu buněk. Neutralizační protilátky specifické pro cílové buňky transformované adenovirem jsou produkovány v imunitní odpovědi později a soudí se, že jsou odpovědné za redukovanou schopnost adenoviru reinfíkovat hostitelské buňky po počáteční inokulaci. Athymické hole myši použité v těchto pokusech měly defektní T-buněčnou imunitní odpověď na cizorodé antigeny, ale byly schopné B-buňkami zprostředkované protilátkové odpovědi (Boven (1991) The Nudě Mouše in Oncology Research, Boston: CRC Press). Produkce neutralizačních anti-adenovirových protilátek může vysvětlit redukovanou účinnost terapie p53-adenovirem (p53 Ad) s postupujícím podáváním dávky v presentovaných pokusech. Porušená funkce imunitního systému u holých myší a špatné krevní zásobení centra nádorových xenotransplantátů může vysvětlit částečnou účinnost p53 Ad I po 6 týdnech léčby a schopnost β-gal Ad infikovat malé množství nádorových buněk i po opakovaných injekcích p53 Ad.

Kromě nádorů prsu bylo velké množství nádorů léčeno rekombinantními adenoviry exprimujícími přirozený p53. Mezi tyto studie patří modely karcinomu čípku děložního (Hamada (1996) Cancer Res. 56: 3047-3054), karcinomu prostaty (Eastham (1995) Cancer Res. 55: 51515155), nádorů hlavy a krku (Clayman (1995)) Cancer Res. 55: 1-6), karcinomu plic (Wills (1994), výše), karcinomu vaječníků (13), glioblastomu (27, 28), a kolorektálního karcinomu (13,29). Dohromady tyto studie podporují probíhající klinický výzkum hodnocení účinků adenovirem zprostředkované terapie genem p53. Předkládané výsledky demonstrují schopnost přirozeného p53 omezit růst nádorových buněk in vivo u xenotransplantátů nádoru prsu exprimujících mutantní p53. Tyto studie také potvrzují, že acenoviru je účinným prostředkem pro přenos p53, pokud exprimují cílové buňky odpovídající virové „receptory“.

Příklad 4: Další výzkum léčebných režimů pro inhibici nádorů

Vynález dále obsahuje způsoby pro léčbu různých nádorů podáním nukleové kyseliny exprimující tumor-supresorový polypeptid, které využívají různých schémat dávkování. Následující příklad popisuje vyšší účinnost rozděleného dávkování při dodání adenoviru exprimujícího p53 podle předkládaného vynálezu.

Pro srovnání účinků režimu jedné dávky s režimem více dávek za určitou dobu byla SCID myším s implantovaným MDA-MB-468 a MDA-MB-231 nádory podána celková dávka 1 χ 10⁹ I.U. p53 Ad (A/C/N/53) na myš, která byla podána buď jako bolusová injekce, nebo ve 3 nebo 5 dávkách podaných jednou denně během týdne (jak ukazují šipky na obr. 7).

Výsledky získané pro MDA-MB-468 nádory byly podobné jako výsledky získané pro MDA-MB-231 nádory, jakje uvedeno na obr. 7a, 7b a 7c. Obecně, režimy obsahující více dávek inhibují růst nádoru lépe než jediná bolusová injekce, kdy režim 5 injekcí je významně lepší než režim 3 injekcí.

-45CZ 298488 B6

Příklad 5: Dexamethason mírní inhibici růstu nádorů spojenou s anti-adenovirovou imunitní odpovědí zprostředkovanou NK-buňkami

Bylo prokázáno, že opakované podání adenovirových vektorů může indukovat imunitní odpověď proti adenoviru. Pro výzkum toho, zda mohou imunosupresivní vlastnosti nízkých dávek dexamethasonu (dex) inhibovat imunitní odpověď proti adenoviru (například odpověď NK buněk) byly MDA-MB-231 nádory u SCID myší léčeny rekombinantním virem podle předkládaného vynálezu za absence nebo za přítomnosti dexamethasonu.

přibližně 5 x 10⁶ MDA-MB-231 buněk/myš bylo injekčně podáno do tukové vrstvy prsní žlázy samic SCID myší v den 0. V den 11 byly podkožně implantovány pelety obsahující dexamethason nebo placebo. 5 mg pelety byly navrženy tak, aby uvolňovaly 83,3 pg dexamethasonu/de kontinuálně po dobu 60 dnů (Innovative Research of America, Sarasota, FL). Všem myším bylo 15 podáno celkem 10 perinádorových injekcí podaných jednou denně v dny 14-18 a 21-25 (0,1 ml na injekci). Celková dávka viru byla 2 x 10⁹ C.I.U/myš (p53 Ad (A/C/N/53) nebo β-galaktosidáza Ad). Léčba je uvedena v tabulce 5.

Tabulka 5: Léčba MDA-MB-231 nádoru u SCID myší

Skupina	Hormon	genová terapie
1	placebo	puf r
2	placebo	β-gal Ad
3	placebo	p53 Ad
4	dexamethason	pufr
5	dexamethason	β-gal Ad
6	dexamethason	p53 Ad

Léčba nízkými dávkami dexamethasonu neměla statisticky významný vliv na růst MDA-MB231 nádorů u SCID myší (p > 0,05). Nebyly pozorovány žádné nežádoucí účinky dexamethasonu. Léčba nádorů β-gal adenovirem způsobila signifikantní inhibici růstu nádorů u kontrolních 25 nádorů s podáváním placebo (p < 0,001, dny 21-30), ale ne ve skupině léčené dexamethasonem (p > 0,05, viz obr. 8). Nádory léčené placebem a β-gal ad rostly pomaleji, než nádory léčené placebem a dexamethasonem (p <0,01, dny 23-30).

Nebyla pozorována signifikantní p53-specifická inhibice růstu nádorů ve skupině kontrolních 30 nádorů léčených placebem (p > 0,05). Naopak, nádory léčené dexamethasonem a p53 Ad rostly významně pomaleji, než nádory léčené dexamethasonem a β-gal Ad (p < 0,02, dny 21-30) nebo placebem a p53 Ad (p < 0,04, dny 21-30).

Léčba nízkými dávkami dexamethasonu tak mírní inhibici růstu nádorů spojenou s anti-adeno35 virovou imunitní odpovědí (např. zprostředkovanou NK-buňkami) u SCID myší bez nežádoucích vedlejších účinků. Tato data také naznačují, že léčba nízkými dávkami dexamethasonu může stimulovat expresi transgenu (například p53) řízenou CMV promotorem v rekombinantním adenoviru. Naopak, dexamethason může zvyšovat transdukční účinnost adenoviru a tak zvyšovat odumírání nádorových buněk.

-46CZ 298488 B6

Model MDA-MB-231 karcinomu prsu byl potom použit pro hodnocení protinádorové účinnost

Ad s nebo bez p53 u myší lišících se schopností imunitní odpovědi na cizorodé antigeny. Byly studovány holé myši s nefunkčními T-buňkami, SCID myši s nefunkčními T a B buňkami, ale se zvýšeným množstvím NK buněk a SCID-beige myši s nefunkčními T, B a NK buňkami.

Pro výzkum účinnost rAd/p53 (popsaný výše) proti MDA-MB-231 xenotransplantátům byla: holým myším podána celková dávka 2,2 x 10⁹ C.I.U. Ad na myš v 10 injekcích v den 0 až 4 a 7 až 11; SCID myším podána celková dávka 4 x 10⁹ C.I.U. Ad na myš v 10 injekcích v den 0 až 4 a 7 až 11; SCID-beige myším podána celková dávka 1,6 x 10⁹ C.I.U. Ad na myš v 10 injekcích v den 0 až 4 a 7 až 11. Všem myším byl podán p53 Ad, β-gal Ad nebo vehikulum samotné.

U holých myší (s nefunkčními T buňkami) a u SCID myší (s nefunkčními T a B buňkami, ale se zvýšeným NK buňkami) způsobilo intranádorové podání kontrolního Ad vektoru (bez p53 insertu) určitou inhibici růstu nádoru. Ad exprimující p53 (rAd5/p53) měl výrazně vyšší protinádorovou účinnost ve srovnání s kontrolním Ad. Naopak, u SCID-beige myší (s nefunkčními T, B a NK buňkami) byla veškerá protinádorová účinnost způsobena p53, bez složky ad vektoru v inhibici růstu nádoru. Tato data ukazují na dříve neznámou úlohu NK buněk v inhibici nádorového růstu zprostředkované adenovirem. Tato data také naznačují, že suprese imunitního systému může zrušit některé vedlejší účinky specifické pro vektor, které jsou zprostředkované NK buňkami.

Příklad 6: Kombinovaná terapie p53 adenovirem a chemoterapie

Vynález obsahuje kombinované podání nukleové kyseliny exprimující tumor-supresorový polypeptid a chemoterapeutického činidla při léčbě nádorů. Následující příklad popisuje schopnost adenoviru exprimujícího p53 podle předkládaného vynálezu v kombinaci s různými protinádorovými léky, jako je cis-platina, doxorubicin, 5-fluoruracil (5-FU), methotrexat a etoposid, léčit nádory a dále popisuje to, že kombinovaná terapie je účinnější, tj. synergní, v působení na nádorové buňky, než terapie každým činidlem samostatně.

p53 podaný s chemoterapeuticky in vitro

Cis-platina, doxorubicin, 5-fluoruracil, methotrexat a etoposid v kombinaci s p53

Účinek klinicky relevantních protinádorových léků cis-platiny, doxorubicinu, 5-fluoruracilu, methotrexatu a etoposidu v kombinaci s tumor-supresorovým vektorem podle předkládaného vynálezu (A/C/N/53), byl zkoumán in vitro. Buňky SCC-9 spinocelulámího karcinomu hlavy a krku, SCC-15 spinocelulámího karcinomu hlavy a krku, SCC-25 spinocelulámího karcinomu hlavy a krku a Du-145 karcinomu prostaty byly léčeny jedním z následujících režimů: v režimu 1 byly buňky nejprve léčeny protinádorovým chemoterapeutickým lékem 24 hodin před léčbou p53 adenovirovým konstruktem A/C/N/53; v režimu 2 byly buňky léčeny nejprve p53 adenovirovým konstruktem a potom byly léčeny protinádorovým chemoterapeutickým lékem; a v režimu 3 byly buňky léčeny současně protinádorovým chemoterapeutickým lékem a p53 adenovirem.

Všechny buněčné linie byly získány od ATCC (Rockville, MD). SCC-9, SCC-15 a SCC-25 buňky nádoru hlavy a krku (p53^nu11) byly kultivovány v 1:1 směsi DMEM a Ham F-12 (GIBCO/Life) Technologies, Graned Island, NY) s 10% fetálním telecím sérem (FCS; Hyclone, Logan, Utah), 0,4 pg/ml hydrokortisonu (Sigma Chem. Co., St. Lous, MO) a 1% neesenciálních aminokyselin (GIBCO) při 37 °C a 5% CO2. SK-OV-3 lidské ovariální nádorové buňky (p53^nu11) byly kultivovány v Eaglově MEM plus 10 % FCS při 37 °C a 5% CO2. MDA-MB-231 buňky lidského karcinomu prsu (p53^mut) byly kultivovány v DMEM (GIBCO) s 10% fetálním telecím sérem (Hyclone) při 37 °C a 5% CO2. MDA-MB-468 buňky lidského karcinomu prsu (p53^mut) byly kultivovány v Leibovitzově L-15 mediu (GIBCO) s 10 % FCS při 37 °C, bez CO2.

-47CZ 298488 B6

MDA-MB-231 buňky karcinomu prsu mají Arg na Lys mutaci vkodonu 280 genu pro p53 aexprimují mutantní p53 (Barterk (1990), výše). Du-145 buňky karcinomu prostaty mají dvě mutace p53 na různých chromosomech, Pro na Leu mutaci v kodonu 223 a Val na Phe mutaci v kodonu 274 (Issacs (1991) Cancer Res. 51. 4716-4720) a exprimují mutantní p53. SK-OV-3 ovariální nádorové buňky neobsahují p53 (Yaginuma (1992) Cancer Res. 52: 4196-4199). SCC-9 buňky obsahují deleci mezi kodony 274 a 285, která vede k mutaci ve čtecím rámci; v jádrech SCC-9 není detekovatelný žádný imunoreaktivní p53 protein (Jung (1992) Cancer Res. 52: 6390-6393; Caamano (1993) Am. J. Pathol. 142. 1131-1139; Min (1994) Eur. J. Cancer 30B: 338-345). SCC-15 buňky obsahují inserci 5 párů bází mezi kodony 224 a 225; produkují nízké hladiny p53 mRNA, ale ne detekovatelný p53 protein (Min (1994), výše). SCC-25 obsahují ztrátu heterozygotnosti (LOH) na chromosomu 17 a deleci 2 párů bází v kodonu 209 na zbylé alele; p53 mRNA není detekovatelná v SCC-25 buňkách a v jejich jádře není detekovatelný žádný imunoreaktivní p53 protein (Caamono (1993) výše). Přibližně 1,5 x 10⁴ buněk v kultivačním médiu (j^ak je popsáno v příkladu 1) se přidá do každé jamky 96-jamkové mikrotitrační plotny a provede se kultivace po dobu přibližně 4 hodin při 37 °C a v 5% CO₂.

Konstrukce a propagace adenovirů (Ad) exprimujících lidský přirozený P53 a β-galaktosidázu E. coli byla popsána dříve (Wills (1994), výše). Koncentrace infekčních virových částic byla stanoveny měřením 293 buněk pozitivních na virový hexonový protein 48 po infekci (Huyghe (1995) výše). C.I.U. označuje buněčné infekční jednotky. Adenoviry exprimující p53 byly podány ve fosfátovém pufru (20 mM NaH₂PO₄, pH 8,0, 130 mM NaCI, 2 mM MgCl₂m, 2% sacharóza). Do každé jamky byl podán lék, p53 adenovirus nebo vhodné vehikulum/pufr. Pro in vitro pokusy sp53 Ad byly buňky umístěny na plotnách v hustotě 1,5 x 10⁴ buněk/jamku 96-jamkové plotny a provedla se kultivace po dobu 4 hodin při 37 °C a v 5% CO₂. Lék. p53 Ad nebo vhodné vehikulum se přidalo do každé jamky a kultivace pokračovala přes noc. Potom se lék, p53 Ad nebo vhodné vehikulum se přidalo do každé jamky a kultivace pokračovala po dobu další 2 týdnů.

Smrt buněk se kvantifikovala za použití MTT testu, který popsal Mosmann (1983) J. Immuno. Meth. 65: 55-63. Stručně, 25 μΐ 5 mg/ml MTT vítal barviva [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5difenyltetrazoliumbromid] se přidalo do každé jamky a provedla sel inkubace po dobu 3 až hodin při 37 °C a v 5% CO₂. Potom se do každé jamky přidalo 100 μΐ 10 % SDS detergentu a provedla se inkubace přes noc při 37 °C a v 5% CO₂. Signál v každé jamce je kvantifikován za použití čtečky mikroploten (Molecular Devices).

Ve všech případech bylo použití cis-platiny (viz tabulka 6, souhrnné výsledky), doxorubicinu (viz tabulka 7, souhrnné výsledky), 5-FU, methotrexatu a etoposidu v kombinované terapii účinnější v usmrcení buněk než terapie každým činidlem zvlášť. Kombinace methotrexatu a p53 Ad byla testována na jedné buněčné linii. Když byly SCC-15 buňky ošetřeny 0,7 μΜ methotrexatu 24 hodin před podání 5 m.o.i. p53 Ad, byl kombinovaný antiproliferativní účinek těchto dvou léčiv pouze o 5 % vyšší než účinek p53 samotného, ačkoliv nebyl tento rozdíl statisticky významný (p < 0,003). Předléčení Du-145 buněk 2,6 μΜ etoposidu 24 hodin před ošetřením nebo 10 m.o.i. p53 Ad vedlo k většímu kombinovanému účinku než podání léků samostatně (p < 0,0001). Když byly SCC-15 buňky ošetřeny 0,3 μΜ etoposidu 24 hodin před podání 5 m.o.i. p53 Ad, byl kombinovaný antiproliferativní účinek těchto dvou léčiv pouze o 5 % vyšší než účinek p53 samotného, ačkoliv nebyl tento rozdíl statisticky významný (p < 0,003). Kombinace terapie tumorsupresorovým genem a protinádorovým činidlem nevykazovala antagonistické účinky.

Ve druhém pokusu byl účinek léčby na normální buňky (MRC-9) srovnáván s účinkem na buňky nádorové (obr. 9). V tomto pokusu byl růst hodnocen spíše podle inkorporace ³H-thymidinu, než MTT testem. Normální buňky (diploidní fibroblasty MRC-9) nevykazovaly zvýrazněné účinky při kombinované terapii. Jak bylo očekáváno, účinek tumor-supresorového činidla samotného byl u normálních buněk zanedbatelný a byl vysoce signifikantní u buněk nádorových. Naopak,

-48CZ 298488 B6 protinádorové činidlo samotné (například cis-platina, doxorubicinu, 5-FU, methotrexat a etoposid) bylo účinnější u normálních buněk než u buněk nádorových (viz obr. 9).

Tabulka 6: Antiproliferativní účinky p53 Ad v kombinaci s cis-platinou

Vyšší účinnost v kombinaci?

Buněčná linie	p53 protein	Typ tkáně	První cisplatina	První p53 Ad	Simultářhě
SK-OV-3	bez	ovarium	ano	ano	ano
			p<0,0001	p<0,0001	p<0,0001
SCC-9	bez	hlava a	ano	ano	ano
		krk	p<0,0001	p<0,0001	p<0,0001
SCC-15	bez	hlava a	ano	ND	ND
		krk	p<0,0001
SCC-25	bez	hlava a	ano	ano	ano
		krk	p<0,0001	p<0,0001	p<0,0001
MDA-MB-	mutantní	prs	ano	ND	ano
468			páO,0001		p<0,0001
MDA-MB-	mutantní	prs	ano	ano	ano
231			p<0,0002	p<0,0001	p<0,0001

ND = neprovedeno

-49CZ 298488 B6

Tabulka 7: Antiproliferativní účinky p53 Ad v kombinaci s doxorubicinem

Vyšší účinnost v kombinaci?

Buněčná linie	p53 protein	Typ tkáně	První doxorubicin	První p53 Ad	Simultáně
SK-OV-3	bez	ovarium	ano	ano	ano
			p<0,0001	p<0,0001	pšO,0001
SCC-9	bez	hlava a	ano	ano	ano
		krk	p<0,0001	p<0,0001	p<0,0001
SCC-15	bez	hlava a	ano	ano	ano
		krk	p<0,0001	p<0,0001	p<0,0001
SCC-25	bez	hlava a	ano	ano	ano
		krk	p<0,0001	p<0,0001	pšO,0001
Du-145	mutantní	prostata	ano	ano	ano
			p<0,0001	p<0,0001	p<0,0001
MB-231	mutantní	prs	ano	ano	ano
			p<0,0001	p<0,0001	p<0,0001

Účinky doxorubicinu a p53 na lidský hepatocelulámí karcinom

Následující příklad popisuje schopnost adenoviru exprimujícího p53 podle předkládaného vynálezu v kombinaci s doxorubicinem léčit nádory a dále popisuje to, že kombinovaná terapie je účinnější, tj. synergní, v působení na nádorové buňky, než terapie každým činidlem samostatně. Výsledky demonstrují synergistickou kombinaci mezi p53 expresním vektorem podle předkládaného vynálezu (A/C/N/53) a doxorubicinem.

Doxorubicin (Adriamycin) a p53 (A/C/N/53. rekombinantní adenovirový konstrukt exprimující přirozený lidský p53 transgen) byly testovány na následujících buňkách liniích: HLE, buněčná linie lidského hepatocelulámího karcinomu (Hsu (1993) Carcinogenesis 14: 987-992; Farshid (1992) J. Med. Viro.. 38: 235-239; Dor (1975) Gann. 66: 385-392), s mutovaným p53; HLF, buněčná linie lidského hepatocelulámího karcinomu s mutovaným p53 (ibid); Hep 3B, buněčná linie lidského hepatocelulámího karcinomu bez p53 (Hasegawa (1995) In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 31: 55: 55-61; Hep G2, buněčná linie lidského hepatocelulámího karcinomu s přirozeným p53 (ibid); a SK-HEP-1, lidský adenokarcinom jater s přirozeným p53 (Lee (1995) FEBS Lett 368: 348-352). Životaschopnost buněk byla měřena za použití calcein AM sondy pro živé buňky (Molecular Probes) (viz například Poole (1993) J. Cell Sci. 106: 685-691). Substrát calcei AM je štěpen buněčnými esterasami za vzniku fluorescentní sloučeniny.

Buňky byly umístěny v 96-jamkových plotnách (5 x 10³ buněk/jamku), nechaly se přes noc adherovat, trojitě se ošetřily různými ředěními A/C/N/53 a doxorubicinu v den 0, takže byla stanovena křivka dávka-odpověď pro doxorubicin a každou dávku A/C/N/53. V den 3 bylo médium aspirováno a k buňkám byl přidán calcein AM v PBS. Intenzita fluorescence každé jamky byla určena za použití čtečky mikroploten. Hodnoty fluorescence a jamek bez buněk byly odečteny a hodnoty byly vyjádřeny jako procento životaschopnosti (intenzita fluorescence) vzhledem

-50CZ 298488 B6 k neošetřeným kontrolní jamkám. Pro vytvoření isobolografů pro stanovení interakce mezi

A/C/N/53 a doxorubicinem byly použity hodnoty EC₅₀.

Isobologramová analýza pro každou buněčnou linii ukazuje synergní interakce mezi p53 expri5 mujícím vektorem podle předkládaného vynálezu (A/C/N/53) a doxorubicinem; tato synergie byla nezávislá na p53 stavu buněčné linie. Nicméně, ED₅₀ pro A/C/N/53 za absence doxorubicinu je vyšší u buněčných linií s přirozeným p53 než u buněčných linií s alterovaným p53.

V jiném pokusu byly HLE buňky umístěny v 96-jamkových plotnách (5 x 10³ buněk/jamku), 10 nechaly se přes noc adherovat, ošetřily různými ředěnými A/C/N/53 (trojmo) a doxorubicinu v den 0, takže byla stanovena křivka dávka-odpověď pro doxorubicin a každou dávku A/C/N/53. Tři skupiny byly použity pro testování účinků pořadí dávek na interakce mezi A/C/N/53 a doxorubicinem.

skupina	den 0	den 1	den 2 den 3
simultáně	A/C/N/53,		odběr
	doxorubicin
první A/C/N/53	A/C/N/53	doxorubicin	odběr
první	doxorubicin	A/C/N/53	odběr
doxorubi ci n

Buňky byly inkubovány po dobu tří dnů po první léčbě. Médium bylo aspirováno a k buňkám byl přidán calcien AM v PBS. Intenzita fluorescence v každé jamce byla určena pomocí čtečky fluorescence mikroploten. Hodnoty fluorescence z jamek bez buněk byly odečteny a hodnoty byly vyjádřeny jako procento životaschopnosti (intenzity fluorescence) vzhledem k neošetřeným kontrolním jamkám. Pro vytvoření isobolografů pro stanovení interakcí mezi A/C/N/53 a doxo20 rubidinem byly použity hodnoty EC₅₀. Isobologramová analýza pro každý režim ukazovala na podobné interakce odpovídající synergii mezi A/C/N/53 a doxorubicinem u HLE buněk, kde tato synergie nebyla závislá na pořadí podání dávek.

p53 s chemoterapeutickými léky in vivo

Účinek klinicky relevantních protinádorových léků (cis-platina, doxorubicinu a 5-fluoruracilu (5-Fu)) v kombinaci s tumor-supresorovým vektorem podle předkládaného vynálezu (A/C/N/53) byl dále zkoumán in vivo.

C.B. 17/ICR-scid myši byl zakoupeny od Taconic Farms (Germantown, NY) nebo od Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Athymické nu/nu myši byly získány od Charles River Laboratories. Všechny myši byly chovány ve VAF-barrier boxech a všechny pokusy na zvířatech byly provedeny podle pravidel uvedených v N.I.H. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Objemy nádorů pro každou skupinu každý den byly srovnávány za použití Student testu pomocí Statview II softwaru (Abacus Concepts, Berkeley, Califomia). Byly vypracovány křivky růstu nádorů a ukazují průměrný objem nádoru ± s.e.m. Obyčejně bylo 10 myší na skupinu.

Model SK-OV-3 nádoru ovaria

Uchycené intraperitoneální SK-OV-3 nádory byly léčeny intraperitoneálními dávkami vehikula, p53 Ad, cis-platina nebo oběma léky. Myším bylo podáno šest injekcí p53 Ad během dvou týdnů. Celková dávka viru byla 1,5 x 10⁹ C.I.U. (3,1 x 10¹⁰ virových částic).

-51 CZ 298488 B6

Účinnost cis-platiny: Samicím scid myší bylo injekčně podáno 5 x 10⁶ SK-OV-3 ovariálních nádorových buněk, i.p. v den 0. Ve dny 6, 8, 10, 13, 15 a 17 byly myším podány dávky (p53 Ad pouze v den 17). Byl podáván celkový objem 0,2 ml (0,1 ml vehikula pro cis-platinu nebo cis-platina plus 0,1 Ad pufru nebo p53 Ad). Dávka p53 byl 2,5 x 10⁸ C.U.I./myš/den (5,2 x 10⁹ virových částic). Dávka cis-platiny byla 2 mg/kg/den. Nádory byly odebrány a zváženy v den 20.

Myši v jedné léčené skupině dostaly pět dávek cis-platiny simultánně s prvními pěti dávkami p53 Ad. Tato dávka p53 Ad redukovala růst nádorů u myší pouze o 17 % v den 20 (p < 0,01). Nicméně, při kombinaci s cis-platinou způsobil p53 Ad 38% redukci růstu nádorů ve srovnání s podáním cis-platiny samotné (p < 0,0008). Myši léčené vehikuly nebo p53 Ad samotným měly krvavý ascites a invazivní nádorové uzly na bránici. Tyto příznaky nebyly přítomné u myší léčených cis-platinou samotnou nebo cis-platinou s p53 Ad.

Účinnost cis-platiny/paclitaxelu: Samicím scid myší bylo injekčně podáno 2,5 x 10⁶ SK-OV-3 ovariálních nádorových buněk, i.p. v den 0. Ve dny 7, 9, 11, 16 a 18 byly myším podávány dávky. Byl podáván celkový objem 0,3 ml (0,1 ml vehikula pro cis-platinu nebo cis-platina plus 0,1 vehikula pro paclitaxel nebo paclitaxel plus 0,1 Ad pufru nebo p53 Ad). Dávka p53 Ad byla 2,5 x 10⁸ C.I.U./myš/den (5,2 x 10⁹ virových částic). Dávka cis-platiny byla 0,5 mg/kg/den. Dávka paclitaxelu byla 1 mg/kg/den. Nádory byly odebrány a zváženy v den 30. n = 7 = 10 myší na skupinu.

V této druhé studii byly SK-OV-3 ovariální nádory léčeny intraperitoneálními dávkami vehikula, p53 Ad, cis-platiny a paclitaxelu nebo všemi třemi léky zároveň. Kombinace všech tří léků redukovala růst nádorů o 34 % více než kombinace cis-platiny a paclitaxelu, což ukazuje na vyšší účinnost trojkombinace (p < 0,006).

Model Du-145 nádoru prostaty

Účinnost cis-platiny: Intraperitoneální Du-145 nádory byl léčeny intraperitoneálními dávkami vehikula, p53 Ad, cis-platiny nebo oběma léky zároveň. Samcům scid myší bylo injekčně podáno 2,5 x 10⁶ Du-145 buněk, i.p. v den 0. Ve dny 7, 9, 11, 14 a 16 byly myším podány dávky. Byl podáván celkový objem 0,2 ml (0,1 ml vehikula pro cis-platinu nebo cis-platina plus 0,1 Ad pufru na p53 Ad). Dávka p53 byla 8,3 x 10⁸ C.I.U./myš/den (2,9 x 10¹⁰ PN). Dávka cis-platiny byla 1 mg/kg/den. Nádory byly odebrány a zváženy v den 22. Kombinace p53 Ad a cis-platiny měla výrazně vyšší protinádorovou účinnost ve srovnání s každým lékem samostatně (p < 0,0004).

Model MDA-MB-468 nádoru prsu

Účinnost cis-platiny: Uchycené MDA—MB—468 nádory byly léčeny buď vehikulem nebo p53, nebo cis.platinou nebo oběma léky. Samicím scid myší bylo injekčně podáno 1 x 10⁷MDA-MB-468 buněk do tukové vrstvy prsní žlázy, 11 dní před podáním první dávky v den 0. Intraperitoneální dávka cis-platiny byla 1 mg/kg/den. Intranádorová dávka p53 AD byla 8,3 x 10⁸ C.I.U./myš/den (2,9 x 10¹⁰ virových částic) podaných simultánně ve dny 0-4. p53 Ad měl vyšší účinnost při kombinaci s cis-platinou (dny 8-31, p < 0,0004).

Účinnost doxorubicinu: Ve druhém pokusu byly MDA-MB-468 nádory léčeny buď vehikulem, p53, nebo doxorubicinem nebo oběma léky. Samicím scid myší bylo injekčně podáno 1 x 10⁷ MDA-MB^I68 buněk subkutánně, 12 dní před podáním první dávky v den 0. Intraperitoneální dávka doxorubicinu byla 4 mg/kg/den v den 0, 2, 7 a 9. Intranádorová dávka p53 Ad byla 5 x 10⁸ C.I.U./myš/den (1,03 x I0¹⁰ virových částic) ve dny 0^1 a 7-11. p53 Ad měl vyšší účinnost při kombinaci s doxorubicinem (dny 14-24, p< 0,05).

-52CZ 298488 B6

Model SCC-15 nádoru hlavy a krku:

Účinnost 5-fluorouracilu: Subkutánní SCC-15 nádory byly léčeny buď vehikulem, nebo p53, nebo 5-fluorouracilem nebo oběma léky. Scid myším bylo injekčně podáno 5 x 10⁶ SCC-15 buněk subkutánně, 7 dní před podáním první dávky v den 0. Intraperitoneální dávka 5-fluorouracilu byla 50 mg/kg/den ve 40% hydroxypropyl-p-cyklodextranu (Cerestar lne., Hammond, IN) v den 0, 7 a 14. Dávka p53 Ad byla 2 x 10⁸ C.I.U./myš/den (4 x 10⁹ virových částic) ve dny 0, 1, 7, 8, 14 a 15 (6 intranádorových injekcí během 3 týdnů). Dávka 5-Fu byla 50 mg/kg. Kombinace p53 Ad a 5-Fu měla vyšší protinádorovou účinnost než podání každého léku zvlášť, (p < 0,04).

p53 s FPT inhibitorem

Účinnost inhibitoru femesyl-protein transferázy v kombinaci s tumor-supresorovým vektorem označeným A/C/N/53 byla zkoumána in vitro. Následující příklad popisuje schopnost adenoviru exprimujícího p53 podle předkládaného vynálezu v kombinaci s FPT inhibitorem označeným „FOT39“, jak je popsán v mezinárodní přihlášce WO 97/23 478, podané 19. 12. 1996, kde je jako FPT39 označena sloučenina „39.0“, viz str. 95 WO 97/23 478), léčit nádoiy a dále popisuje to, že kombinované terapie proti buňkám karcinomu prostaty a proti buňkám karcinomu prsu je účinnější než terapie každým lékem zvlášť.

Antiproliferativní účinnost rAd5/p53 a FPT39 proti SK-OV-3 ovariálnímu nádoru

Metody: SK-OV-3 lidské ovariální nádorové buňky (p53'^lull) byly umístěny do 96-jamkových ploten v hustotě 250 buněk na jamku v Eaglově MEM + 10% fetální hovězí sérum. Buňky byly potom inkubovány při 37 °C a v 5% CO₂ po dobu 4 hodin. Po každé jamky se přidalo FPT39 nebo vehikulum a kultivace buněk pokračovala po dobu 3 dnů. Po třech dnech se neošetřené buňky v některých jamkách spočítaly pro stanovení množství rAd5/p53, které má být přidáno. Do každé jamky se potom přidal rAd5/p53 nebo vehikulum a kultivace buněk pokračovala po dalších dobu 3 dnů. Proliferace buněk se kvantifikovala za použití MTT testu. Stručně, 25 μΐ 5 mg/ml MTT vital barviva [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid] se přidalo do každé jamky a provedla se inkubace po dobu 3 až 4 hodin při 37 °C a v 5% CO₂. Potom se do každé jamky přidalo 100 μΐ 10%S DS detergentu a provedla se inkubace přes noc. Fluorescence v každé jamce se kvantifikovala za použití čtečky mikroploten (Molecular Devices). Data týkající se proliferace buněk byla analyzována za použití Thin Plate Spline statistické metody, kterou popsali 0'Connell a Wolfínger (1997) J. Comp. Graph. Stát. 6: 224-241.

Výsledky: rAd5/p53 a FPT39 mají aditivní účinek v inhibicí růstu buněk. V tomto pokusu nebyl prokázán ani synergismus (p > 0,05), ani antagonismus (p > 0,05).

Antiproliferativní a synergní účinnost rAd5/p53 a FPT39 (inhibitoru FPT) na Du-145 buňky karcinomu prostaty

Metody: DU-145 lidské buňky karcinomu prostaty (p53^mut) byly ošetřeny FPT39 nebo vehikulem a rAd5/p53 a buněčné kultury byly potom analyzovány způsobem popsaným výše pro SK-OV-3 lidské buňky karcinomu ovaria. Pokus byl opakován dvakrát.

Výsledky: Pokus 1: rAd5/p53 a FPT39 měly aditivní účinek v inhibicí růstu buněk. V tomto pokusu nebyl prokázán ani synergismus (p > 0,05), ani antagonismus (p > 0,05).

Pokus 2: rAd5/p53 a FPT39 měly synergní účinek (p = 0,0192). Tyto výsledky ukazují, že rAd5/p53 aFP39 mohou integrovat a mají synergistický účinek na proliferaci buněk karcinomu prostaty.

-53 CZ 298488 B6

Antiproliferativní a synergní účinnost rAd5/p53 a FPT39 (inhibitoru FPT) na MDA-MB-231 buňky karcinomu prsu

Metody: MDA-MB-231 lidské buňky karcinomu prsu (p53^mut) byly ošetřeny FPT39 nebo vehikulem a rAd5/p53 a buněčné kultury byly potom analyzovány způsobem popsaným výše pro SK-OV-3 lidské buňky karcinomu ovaria. Pokus byl opakován dvakrát.

Výsledky: Pokus 1: rAd5/p53 a FPT39 měly aditivní účinek v inhibici růstu buněk. V tomto pokusu nebyl prokázán žádný synergismus (p > 0,05).

Pokus 2: rAd5/p53 a FPT39 měly aditivní účinek ve většině odpovědí. Nicméně, synergní účinek byl zjevný při isobolách vyšších nebo rovných 70 (tj. méně než 30% usmrcených buněk, p = 0,0001). Tyto výsledky ukazují, že rAd5/p53 a FPT39 mohou interagovat a mají synergistický účinek na proliferaci buněk karcinomu prsu.

Příklad 7: Profil imunitní odpovědi u pacientů s metastázami karcinomu do jater léčených adenovirovým vektorem nesoucím p53

Vynález obsahuje způsob pro kombinované in vivo podání nukleové kyseliny exprimující p53 a jiného chemoterapeutického činidla v léčbě nádorů. Následující příklad popisuje schopnost adenoviru exprimujícího p53 podle předkládaného vynálezu zvyšovat hladiny lymfocytů usmrcujících nádorové buňky, které jsou nacházeny v lidském karcinomu jater.

Cílem této studie byla charakterizace genotypů a fenoytypů lymfocytů infiltrujících nádory (TIL) v metastázách karcinomu střeva nesoucího mutaci p53 do jater (pro diskusi o TIL viz např. Wang (1997) Mol. Med. 3: 716-731; Marrogi (1997) Int. J. Cancer 74: 492-501). Celkem 16 pacientů bylo léčeno zvyšující se dávkou 10⁹—10¹¹ částic adenovirového vektoru nesoucího přirozený p53 přes a. hepatica. 3 až 7 dní po podání adenovirového vektoru byly od každého pacienta získány celkem 4 biopsie. Imunohistochemické analýzy byly provedeny na zmrazené tkáni získané z normálních jater a z přechodné zóny hostitel-nádor. Počítačová analýza byla provedena pro kvantifikaci imunoreaktivity následujících monoklonálních protilátek: CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD56, HLA-Dr, IFN-γ, TNF-α a IL-2. Zvýšení populace TIL (CD3+ a CD4+) bylo pozorováno s aximem při 7,5 x 10¹⁰ částic. Při vyšších dávkách bylo pozorováno snížení CD3+ a CD4+ populace. Inversní korelace byla pozorována pro CD8+ buňky. Při nejvyšší dávce (2,5 x 10¹¹) bylo pozorováno zvýšení CD3+, CD4+ a CD8+ populace v nádorech ve srovnání s normální tkání. Tyto výsledky ukazují, že podání vysokých dávek adenovirových částic vede ke zvýšení TIL, které jsou složeny z CD4+ a CD8+ populace.

Mělo by být jasné, že příklady a provedení zde uvedené jsou pouze ilustrativní a že mohou být provedeny různé variace a modifikace těchto provedení, která spadají do rozsahu předkládaného vynálezu, jak je vymezen v připojených patentových nárocích. Všechny citované publikace, patenty a patentové přihlášky jsou zde uvedeny jako odkazy.

-54CZ 298488 B6

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití tumor-supresorové nukleové kyseliny, kterou je nukleová kyselina, která kóduje tumor-supresorový protein, zahrnující přirozený p53 protein nebo retinoblastomový protein, v kombinaci s inhibitorem polyprenyl-protein transferázy, vybraným mezi inhibitorem geranylgeranyl-protein transferázy nebo inhibitorem famesyl-protein transferázy, který je vybrán ze skupiny sestávající z

O famesylované peptidomimetické sloučeniny, kondenzovaného tricyklického benzocykloheptapyridinu a famesylového derivátu, pro přípravu farmaceutického prostředku pro léčbu savčích rakovinných nebo hyperproliferativních buněk.
2. Použití podle nároku 1, dále zahrnující použití chemoterapeutického činidla vybraného ze skupiny sestávající z prostředků poškozujících DNA, inhibitorů topoizomerázy I, inhibitorů topoizomerázy II, antimetabolitů RNA/DNA a antimetabolitů DNA.
3. Použití podle nároku 1, kde uvedená nukleová kyselina je obsažena ve vektoru vybraném ze skupiny zahrnující holý DNA plazmid, plazmid v liposomů, plazmid v komplexu s lipidem, virový vektor, AAV vektor a rekombinantní adenovirový vektor.
4. Použití podle nároku 3, kde uvedeným vektorem je A/C/N/53.
5. Použití podle nároku 1, kde uvedený farmaceutický prostředek je formulován pro podávání uvedené tumor-supresorové nukleové kyseliny v celkové dávce od 1 x 10^{3 4 5 6 * * 9} do 7,5 x 10¹⁵ adenovirových částic v léčebném režimu vybraném ze skupiny skládající se z: celkové dávky v jedné dávce, celkové dávky rozdělené do 5 dnů s podáním denně, celkové dávky rozdělené do 15 dnů s podáním denně a celkové dávky rozdělené do 30 dnů s podáním denně.
6. Farmakologický prostředek, vyznačující se tím, že zahrnuje tumor-supresorovou nukleovou kyselinu a inhibitor polyprenyl-protein transferázy, vybraný mezi inhibitorem geranylgeranyl-protein transferázy nebo inhibitorem famesyl-protein transferázy (FPT) vybraným ze skupiny sestávající z

-55CZ 298488 B6 famesylované peptidomimetické sloučeniny, kondenzovaného tricyklického benzocyklo-heptapyridinu a famesylového derivátu,

5 kde uvedenou tumor-supresorovou nukleovou kyselinou je nukleová kyselina, která kóduje přirozený p53 protein nebo retinoblastomový protein.

13 výkresů

-56CZ 298488 B6

Obr. 1 proliferace

-57CZ 298488 B6

Obr. 2

-58CZ 298488 B6

Obr. 3a

Objem nádoru (mm³)

Dny

-59CZ 298488 B6

Obr. 3b

-60CZ 298488 B6

Obr. 3c

Objem nádoru (mm³)

-61 CZ 298488 B6

Obr. 4a

Celková dávka p53 Ad (C.I.U./myš) inhibice

Celková dávka p53 Ad (C.I.U./myš)

-62CZ 298488 B6

Objem ná

Dny

-63CZ 298488 B6

Obr. 6

Objem nádoru (mm³)

-64CZ 298488 B6