KR20050113287A - 신생물에 대한 종양 억제 유전자 요법 및 화학 요법의 조합치료 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 포유동물 암세포 또는 과다증식 세포를 종양 억제 단백질 또는 종양 억제 핵산과 접촉시키고, 추가로 상기 세포를 1종 이상의 보조 항암제와 접촉시키는 단계를 포함하는 상기 세포의 치료 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 종양 억제 단백질 또는 종양 억제 핵산 및 1종 이상의 보조 항암제를 포함하는 제약 조성물 및 포유동물 암세포 또는 과다증식 세포 치료용 키트를 제공한다.

Description

신생물에 대한 종양 억제 유전자 요법 및 화학 요법의 조합 치료 방법 {Combined Tumor Suppressor Gene Therapy and Chemotherapy in the Treatment of Neoplasms}

본 발명은 종양 또는 전이성 질병과 같은 과다증식성 질병으로 고통받는 대상의 신규 치료 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 종양 억제 유전자 또는 유전자 생성물 및 보조 항암제의 조합 사용을 포함하는, 세포, 보다 구체적으로는 신생 세포의 과다증식 억제 방법을 제공한다.

염색체 이상은 종종 유전 질환, 퇴행성 질병 및 암과 관련된다. 특히, 많은 카피수의 전체 염색체 또는 염색체 세그먼트의 결실 또는 증가 및 게놈의 특정 영역의 높은 수준의 증폭은 암에서 흔히 발생한다 (예를 들어 문헌 1, 문헌 2 및 문헌 3 참조). 사실상, 원암유전자를 함유하는 DNA 서열의 증폭 및 종양 억제 유전자를 함유하는 DNA의 결실은 각각 종양 발생의 흔한 특징이다 (문헌 4).

p53 유전자의 변이는 인간 암에서 가장 흔한 유전자 변이이다 (문헌 5 및 문헌 6). 또한, 내인성 야생형 p53 단백질이 결여된 포유동물 암세포에 야생형 p53을 도입하면 상기 세포의 신생물 표현형이 억제된다 (예를 들어 문헌 7 참조).

많은 유용한 화학치료 약물 중에서, 탁솔(Taxol; 등록상표명; NSC 번호 125973)로서 시판되는 파클리탁셀은 난소 및 유선 종양을 포함하여 약물 내성 종양에 대한 임상 시험에서의 효능때문에 관심의 대상이 되어 왔다(문헌 8, 문헌 9 및 문헌 10). 파클리탁셀과 종양 억제 유전자 요법의 상호 작용에 대한 최근의 연구는 종양 억제물질 (즉, p53)의 농도 저하가 증가된 G2/M기 정지, 미세핵화 및 p53과 독립적인 파클리탁셀 유도 세포자멸 (apoptosis)와 관련이 있음을 보여주었다. 이와 대조적으로, 완전한 p53을 갖는 생존 세포는 유사분열을 통하여 진행되고, p53 및 p21^{cipl . wafl} 단백질 농도의 증가와 동시에 후속 G1기에 일시적으로 축적되었다(문헌 11). 이와 유사하게, 문헌 12는 p53의 불활성화가 파클리탁셀을 포함하여 특정 항유사분열제에 대한 감수성을 증가시킴을 보여주었다. 상기 문헌은, p53이 DNA 복구에 특정 역할을 수행하여 약물의 존재시에도 S기를 통하여 보다 용이하게 세포를 진행시킬 수 있음을 시사하였다. 상기 연구는 종양 억제 유전자 요법 및 항유사분열제를 사용한 약물 요법 (특히 파클리탁셀 요법)이 상충적으로 작용함을 제시한다.

[문헌 1] Smith (1991) Breast Cancer Res. Treat., 18:Suppl. 1: 5-14

[문헌 2] van de Viler (1991) Became. Beefiest. Acta. 1072: 33-50

[문헌 3] Sato (1990) Cancer. Res., 50: 7184-7189

[문헌 4] Dutrillaux (1990) Cancer Genet. Cytogenet. 49:203-217

[문헌 5] Bartek (1991) Oncogene 6: 1699-1703

[문헌 6] Hollstein (1991) Science, 253: 49-53

[문헌 7] 미국 특허 제5,532,220호

[문헌 8] Hawkins (1992) Oncology, 6: 17-23

[문헌 9] Horwitz (1992) Trends Pharmacol. Sci. 13: 134-146

[문헌 10] Rowinsky (1990) J. Natl. Canc. Inst. 82: 1247-1259

[문헌 11] Wahl (1996) Nature Med. 2:72-79

[문헌 12] Hawkins (1996) Canc. Res. 56: 892-898

본 발명은 과다증식성 포유동물 세포의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 보조 항암제를 종양 억제물질 (예를 들어 p53) 유전자 요법과 조합하여 사용할 경우 종양 억제물질의 활성이 결여된 신생 세포 또는 다른 세포의 증식 억제시에 증가된 효과를 제공한다는 놀라운 발견에 부분적으로 기초한 것이다.

따라서, 한 실시태양에서 본 발명은 암세포 또는 과다증식 세포를 종양 억제 단백질 또는 종양 억제 핵산, 및 1종 이상의 항암제와 접촉시킴으로써 암세포 또는 과다증식 세포의 치료 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 종양 억제 단백질 또는 핵산 및 보조 항암제와 1종 이상의 화학요법제의 동시 투여를 포함한다. 예를 들어, 종양 억제 핵산 (예를 들어 p53을 코딩하는 핵산)은 보조 항암제 (예를 들어 파클리탁셀) 및 DNA 손상제, 예를 들어 시스플라틴, 카르보플라틴, 나벨빈 (비노렐빈 타르테이트)와 함께 투여될 수 있다.

암 또는 과다증식 세포는 종종 신생 세포이다. 세포가 종양에 존재할 때, 상기 방법은 종양 성장을 억제하고, 이에 의해 암 치료 방법을 제공한다. 상기 암의 예로는 난소암, 췌장암, 비(非) 소세포 폐암, 소세포 폐암, 간암, 흑색종, 망막아세포종, 유방 종양, 결장직장암, 백혈병, 임파종, 뇌 종양, 경부암, 육종, 전립선 종양, 방광 종양, 세망내피계 조직의 종양, 윌름(Wilm) 종양, 성상세포종, 신경교아세포종, 신경아세포종, 난소암종, 골육종, 신장암, 및 두부 및 목암을 들 수 있다.

바람직한 보조 항암제는 파클리탁셀 또는 파클리탁셀 유도체이고, 바람직한 종양 억제 핵산은 p53 단백질 및 그의 유사체 및 망막아세포종 (RB) 단백질로 이루어지는 군 중에서 선택되는 종양 억제 단백질을 코딩하는 핵산이다. 특히 바람직한 종양 억제 핵산은 야생형 p53 단백질을 코딩하고, 특히 바람직한 망막아세포종 단백질은 p110^RB 또는 p56^RB이다.

종양 억제 핵산은 벡터에 의해 표적 세포로 전달되는 것이 바람직하다. 상기 벡터는 표적 세포에서 종양 억제 핵산의 발현을 가능하게 하기 위해서 재조합 DNA 기술에 의해 변형된 것이다. 이들 벡터는 비바이러스성 벡터 (예를 들어 플라스미드) 또는 바이러스 (예를 들어 아데노바이러스, 아데노계 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스) 기원의 벡터로부터 유도될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시에서, 벡터는 재조합적으로 변형된 아데노바이러스 벡터이다. 비바이러스성 벡터는 DNA의 세포막 통과를 촉진시키는 물질과 복합체를 형성하는 것이 바람직하다. 상기 비바이러스성 벡터 복합체의 예는 DNA의 농축을 촉진시키는 다가 양이온성 물질 및 지질 기재 전달 시스템을 갖는 제제를 포함한다. 지질 기재 전달 시스템의 예는 핵산의 리포좀 기재 전달을 포함한다.

특히 적합한 아데노바이러스 벡터(예를 들어 야생형 p53 단백질을 코딩하는 핵산의 전달을 위한)는 단백질 IX DNA의 일부 또는 전체 결실을 포함한다. 한 실시태양에서, 단백질 IX 유전자 서열의 결실은 5' 바이러스 말단으로부터의 약 3,500 bp 내지 5' 바이러스 말단으로부터의 약 4,000 bp까지 이른다. 벡터는 또한 아데노바이러스 초기 영역 3 내의 및(또는) 아데노바이러스 초기 영역 4 내의 비필수 DNA 서열의 결실을 포함할 수 있고, 한 실시태양에서 결실은 DNA 서열 E1a 및(또는) E1b이다. 인간 p53 cDNA의 전달에 특히 바람직한 재조합 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 2형 주요 후기 프로모터 또는 인간 CMV 프로모터, 및 아데노바이러스 2형 세부분으로 이루어진 리더 cDNA를 포함한다. 바람직한 아데노바이러스 벡터의 하나는 A/C/N/53이다.

바람직한 파클리탁셀 또는 파클리탁셀 유도체는 파클리탁셀 및(또는) 탁소테레(Taxotere, 등록상표)를 포함하고, 파클리탁셀 (Taxol; 등록상표)이 가장 바람직하다. 다른 바람직한 보조 항암제는 Epothilone이다. 특히 바람직한 한 실시태양에서, 종양 억제제는 A/C/N/53이고, 보조 항암제는 파클리탁셀이다.

종양 억제 단백질 또는 종양 억제 핵산은 제약상 허용되는 부형제 중에 분산될 수 있다. 이와 유사하게, 보조 항암제 (예를 들어 파클리탁셀 또는 파클리탁셀 유도체)는 제약상 허용되는 부형제 중에 분산될 수 있다. 종양 억제 단백질 또는 종양 억제 핵산 및 상기 파클리탁셀 또는 파클리탁셀 유도체는 모두 하나의 조성물 (하나 또는 복수개의 부형제(들)를 포함함) 중에 분산될 수 있다.

종양 억제제 (단백질 또는 핵산) 및(또는) 보조 항암제는 동맥내, 정맥내 (예를 들어 주사), 복강내 및(또는) 종양내에 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 바람직한 투여 부위는 간동맥내, 복강내, 또는 두부의 세포 (예를 들어 신경세포)를 치료할 경우에는 동맥의 경동맥 내 투여를 포함한다.

종양 억제 단백질 또는 핵산은 1회 투여로 또는 각각 약 6시간 이상, 바람직하게는 약 24시간 이상의 시간 간격으로 3회 이상 다중 투여될 수 있다.

또다른 바람직한 실시태양에서, 종양 억제 단백질 또는 종양 억제 핵산은 아데노바이러스 입자 약 1 x 10⁹ 내지 약 1 x 10¹⁴, 또는 약 1 x 10⁹ 내지 약 7.5 x 10¹⁵, 바람직하게는 약 1 x 10¹¹ 내지 약 7.5 x 10¹³개의 총투여량을 1회 투여, 5일 동안 매일 투여, 15일 동안 매일 투여 및 30일 동안 매일 투여하는 방법 중에서 선택되는 치료 처방으로 (보조 항암제와 함께 또는 보조 항암제 없이) 투여된다. 또한, 투여량은 1 내지 30일 동안 연속적으로 투여될 수 있다. 파클리탁셀 또는 파클리탁셀 유도체는 75 내지 350 mg/m²의 총 투여량을 1회 투여, 2일 동안의 1일 투여량 투여, 3일 동안의 1일 투여량 투여, 15일 동안의 1일 투여량 투여, 30일 동안의 1일 투여량 투여, 15일 동안의 매일 연속 주입, 30일 동안의 매일 연속 주입 중에서 선택되는 투여 요법으로 1시간, 3시간, 6시간 또는 24시간 동안 투여된다. 바람직한 투여량은 24시간에 100 내지 250mg/m²이다. 별법으로, 파클리탁셀 또는 유도체는 60 mg/m²로 매주 투여될 수 있다. 상기 투여 방법은 2 이상의 싸이클 (바람직하게는 3 싸이클) 동안 반복될 수 있고, 2 이상의 싸이클을 3 또는 4주 간격으로 실시할 수 있다.

일부 바람직한 실시태양에서, 아데노바이러스 입자 7.5 x 10⁹ 내지 약 7.5 x 10¹⁵, 바람직하게는 약 1 x 10¹² 내지 약 7.5 x 10¹³개의 1일 투여량은 30일 이하의 기간 동안 매일 투여될 수 있다 (예를 들어 매일 동일한 투여량의 2일 또는 2 또는 5일 내지 14일 또는 30일의 투여 요법). 다중 투여 요법을 21 내지 28일의 순환 싸이클로 반복할 수 있다. 바람직한 투여 경로는 동맥내 (예를 들어 간동맥내), 종양내 및 복강내를 포함한다.

종양 억제 핵산 (예를 들어 p53)을, 보조 항암제 (예를 들어 파클리탁셀) 및 DNA 손상제 (예를 들어 시스플라틴, 카르보플라틴 또는 나벨빈)을 함유하는 아데노바이러스 벡터로 투여할 경우, 아데노바이러스 벡터는 1일당 약 7.5 x 10¹² 내지 약 7.5 x 10¹³ 아데노바이러스 입자를 5 내지 14일 동안 투여된다. 아데노바이러스 벡터 및 파클리탁셀이 카르보플라틴과 함께 투여될 경우, 투여량은 일반적으로 1일당 7.5 x 10¹³개의 아데노바이러스 입자이다. 예를 들어, 약 7.5 x 10¹²개의 아데노바이러스 입자의 1일 투여량을 폐에 투여하기 위하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 포유동물 암 세포 또는 과다증식 세포 치료용 키트를 제공한다. 키트는 상기한 종양 억제 단백질 또는 핵산 (바람직하게는 야생형 p53 단백질 또는 핵산 (예를 들어 바이러스 또는 비바이러스성 벡터 중의), 또는 망막아세포종 (RB) 단백질 또는 핵산); 및 상기한 보조 항암제 (예를 들어 파클리탁셀 또는 파클리탁셀 유도체) 및(또는) 임의로 상기한 화학치료제를 포함한다. 키트는 임의로 종양 억제 단백질 또는 핵산, 및 보조 항암제 (및 임의로 다른 화학치료제)의 암 또는 과다증식 세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위한 투여를 설명하는 지시서를 추가로 포함할 수 있다. 특히 바람직한 한 키트는 A/C/N/53 및 파클리탁셀을 포함한다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 종양 억제 단백질 또는 종양 억제 핵산 및 보조 항암제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 다양한 실시태양에서, 제약 조성물은 임의로 상기한 바와 같은 화학치료 화합물을 포함한다. 특히 바람직한 한 조성물은 p53 핵산 (예를 들어 A/C/N/53) 및 파클리탁셀을 포함한다. 종양 억제 핵산 또는 단백질 및 화학치료제 (예를 들어 파클리탁셀)은 상이한 부형제 중에 존재하거나 상기한 바와 같이 하나의 부형제 중에 함유될 수 있다. 다수의 부형제가 존재하는 경우, 부형제는 상호혼합되거나 분리되어(예를 들어 마이크로캡슐 중에) 존재할 수 있다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 외인성 종양 억제 핵산 또는 종양 억제 단백질을 함유하는 포유동물의 암 또는 과다증식 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 세포는 임의로 파클리탁셀 또는 파클리탁셀 유도체와 같은 보조 항암제를 포함한다. 외인성 종양 억제 핵산 또는 종양 억제 단백질은 상기한 1종 이상의 종양 억제 핵산 및(또는) 단백질일 수 있다. 이와 유사하게, 세포는 상기한 바와 같은 1종 이상의 과다증식 세포 및(또는) 암세포일 수 있다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 전이 세포의 치료 방법을 제공한다. 이 방법은 세포를 종양 억제 핵산 또는 종양 억제 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 수반한다. 적합한 종양 억제 핵산 또는 폴리펩티드는 상기한 바와 같은 종양 억제 핵산 및(또는) 폴리펩티드를 포함한다. 상기 방법은 추가로 세포를 상기한 바와 같은 보조 항암제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 방법은 종양 억제 핵산 및(또는) 폴리펩티드를 외상에 국소 투여하는 단계를 포함한다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 특히 바람직한 투여 요법을 제공한다. 한 실시태양에서, 본 발명은 종양 억제 단백질 또는 종양 억제 핵산의 총 투여량을 포유동물 세포에 점증 투여량으로서 다중 투여하는 단계를 수반하는, 포유동물 세포의 치료 방법을 제공한다. 바람직한 다중 투여는 약 6시간 이상의 간격으로 실시된다. 한 바람직한 투여는 약 24시간 간격의 3회 이상의 치료를 포함한다.

한 실시태양에서, 본 발명은 포유동물 세포의 치료 방법을 제공한다. 이 방법은 종양 억제 단백질 또는 종양 억제 핵산의 총 투여량을 포유동물 세포에 점증 투여량으로서 다중 투여하는 단계를 수반한다. 투여는 약 6시간 이상의 간격으로 실시될 수 있다. 상기 방법은 3회 이상의 점증적 투여를 적어도 포함할 수 있고, 투여량은 매일 투여될 수 있다. 한 실시태양에서 상기 방법은 약 24시간 간격의 3회 이상 치료를 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서, 상기 방법은 종양 억제 핵산을 아데노바이러스 입자 약 1 x 10⁹ 내지 약 7.5 x 10¹⁵ 또는 약 1 x 10¹¹ 내지 약 7.5 x 10¹³개의 총투여량을 1회 투여, 5일 동안의 매일 투여, 15일 동안의 매일 투여 및 30일 동안의 매일 투여 방법 중에서 선택되는 치료 처방으로 종양 내 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 추가로 약 75 내지 약 350 mg/m²의 파클리탁셀 또는 파클리탁셀 유도체 총 투여량을 1회 투여, 2일 동안의 매일 투여, 3일 동안 매일 투여, 15일 동안의 매일 투여, 30일 동안의 매일 투여, 15일 동안의 매일 연속 주입, 30일 동안의 매일 연속 주입 중에서 선택되는 투여 요법으로 24시간에 걸친 투여를 포함할 수 있다. 상기 치료 처방은 2회 이상의 싸이클 동안 반복될 수 있고, 2 이상의 싸이클을 3 또는 4주 간격으로 실시할 수 있다. 이와 같이 처리되는 세포는 난소암, 췌장암, 비(非) 소세포 폐암, 소세포 폐암, 간암, 흑색종, 망막아세포종, 유방 종양, 결장직장암, 백혈병, 임파종, 뇌 종양, 경부암, 육종, 전립선 종양, 방광 종양, 세망내피계 조직의 종양, 윌름(Wilm) 종양, 성상세포종, 신경교아세포종, 신경아세포종, 골육종, 신장암, 및 두부 및 목암으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 암을 포함하는 종양 세포를 포함한다. 치료는 종양의 부피 측정에 의해 분석되는 바와 같이 종양의 성장 또는 증식을 억제하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 종양 억제 단백질 또는 종양 억제 핵산 및 1종 이상의 보조 항암제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 보조 항암제는 파클리탁셀 또는 파클리탁셀 유도체일 수 있다. 종양 억제 단백질 또는 종양 억제 핵산은 야생형 p53 단백질을 코딩하는 핵산, 망막아세포종 단백질 (RB) 단백질을 코딩하는 핵산, 야생형 p53 단백질 및 망막아세포종 단백질로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다.

망막아세포종 단백질은 p110^RB 또는 p56^RB일 수 있다. 핵산은 재조합 아데노바이러스 벡터에 함유될 수 있다. 핵산은 단백질 IX DNA의 일부 또는 전체 결실을 포함하고 P53 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터에 함유될 수 있다. 한 실시태양에서, 단백질 IX 유전자 서열의 결실은 5' 바이러스 말단으로부터의 약 3,500 bp 내지 5' 바이러스 말단으로부터의 약 4,000 bp까지 이른다. DNA 결실은 E1a 및 E1b로 명명된 서열을 포함할 수 있다. 재조합 아데노바이러스 벡터는 추가로 아데노바이러스 2형 주요 후기 프로모터 또는 인간 CMV 프로모터, 아데노바이러스 2형 3부분 리더 cDNA 및 인간 p53 cNDA를 더 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 벡터는 A/C/N/53이다. 조성물은 파클리탁셀, 또는 파클리탁셀 유도체 또는 유사체를 포함할 수 있다.

본 발명은 추가로 외인성 종양 억제 핵산 또는 종양 억제 단백질 및 보조 항암제를 함유하는 포유동물 암 또는 과다증식 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 종양 억제 핵산은 야생형 p53 단백질 및 망막아세포종 (RB) 단백질로부터 선택되는 종양 억제 단백질을 코딩하는 핵산일 수 있다. 망막아세포종 단백질은 p110^RB 또는 p56^RB일 수 있다. 세포는 포유동물에 존재할 수 있다. 세포는 신생 세포일 수 있으며, 신생 세포는 난소암, 췌장암, 비(非) 소세포 폐암, 소세포 폐암, 간암, 흑색종, 망막아세포종, 유방 종양, 결장직장암, 백혈병, 임파종, 뇌 종양, 경부암, 육종, 전립선 종양, 방광 종양, 세망내피계 조직의 종양, 윌름(Wilm) 종양, 성상세포종, 신경교아세포종, 신경아세포종, 골육종, 신장암, 및 두부 및 목암으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 암을 포함할 수 있다.

본 발명은 전이 세포를 종양 억제 핵산 또는 종양 억제 폴리펩티드 및 보조 항암제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 전이 세포의 치료 방법을 제공한다. 접촉은 종양 억제 핵산의 외상에 대한 국소 투여를 포함할 수 있다. 이 방법은 추가로 화학치료제의 동시 투여를 포함할 수 있고, 화학치료제는 시스플라틴, 카르보플라틴 또는 나벨빈일 수 있다.

"보조 항암제"라는 용어는 하나 이상의 다음 활성, 즉 미세소관 형성 또는 작용의 조절 능력, 폴리프레닐-프로틴 트랜스퍼라제 활성의 억제 능력, 혈관 형성의 억제 능력, 또는 내분비 활성의 억제 능력이 있는 약물을 가리킨다. 본 발명에 유용한 보조 항암제는 하기에 보다 상세히 기재하였다. 본 원에 사용된 본 발명의 보조 항암제에는 DNA 손상 활성이 있는 화합물은 포함되지 않는다.

"종양 억제 유전자"는 그의 기능 상실 돌연변이가 종양원성이 되는 핵산이다. 따라서, 다른 건강한 세포에서 종양 억제 유전자의 정상적인 발현이 결여, 변이 또는 파괴되면 세포는 신생물 단계를 유지할 가능성이 증가한다. 이와 반대로, 기능성 종양 억제 유전자 또는 단백질이 세포 중에 존재하면 숙주 세포의 종양형성, 악성종양 또는 과다증식 표현형이 억제된다. 이 정의 내에 속하는 종양 억제 핵산의 예로는 p110^RB, p56^RB, p53과, 본 원과 동시 계류중인 USSN 08/328,673 (1994년 10월 25일 출원)에 기재되어 있는 다른 종양 억제 유전자가 있으나, 이에 제한되지 않는다. 종양 억제 핵산으로는 종양 억제 유전자 또는 그로부터 유래된 핵산 (예를 들어, cDNA, cRNA, mRNA, 및 각각의 종양 억제 폴리펩티드의 활성 단편을 코딩 하는 그의 부분 서열)은 물론 이들 부분 서열을 포함하는 벡터가 있다.

"종양 억제 폴리펩티드 또는 단백질"은 세포 내에 존재하는 경우 세포의 종양형성, 악성종양 또는 과다증식성 표현형을 감소시키는 폴리펩티트를 가리킨다.

"바이러스 입자"라는 용어는 비리온 자체를 가리킨다. 감염성 아데노바이러스 입자의 농도는 통상적으로, 예를 들어 문헌 [Huyghe (1995) Human Gene Ther. 6:1403-1418]에 기재된 DNA의 분광광도 검측으로 측정한다.

"신생" 또는 "신생물"이라는 용어는 세포 종류에 대해 정상적인 성장 제한 을 넘는 속도로 세포가 성장 및(또는) 분할되는 것을 가리킨다.,

"종양형성의" 또는 "종양형성"이라는 용어는 종양을 형성하는 능력 또는 종양 형성을 초래할 수 있는 능력을 의미한다.

"세포를 치료하는"이라는 구는 질병에 걸린 세포의 하나 이상의 질병 특성을 억제 또는 개선시키는 것을 가리킨다. 이 구가 신생물인 암세포 (예를 들어, 내인성 야생형 종양 억제 단백질이 결여된 포유동물의 암 세포)에 관해 사용되는 경우 "세포를 치료하는"이라는 구는 신생물 표현형을 완화 또는 제거하는 것을 가리킨다. 통상적으로, 이러한 치료는 치료법 (예를 들어, 항암제 및(또는) 종양 억제 핵산 또는 폴리펩티드)을 제외한 동일한 조건 하의 동일한 세포와 비교해 볼 때 세포의 억제 (성장 및(또는) 증식의 감소 또는 정지)를 일으킨다. 이러한 억제에는 세포 사멸 (예를 들어, 세포자멸)이 포함된다. 이러한 용어가 종양에 관해 사용되는 경우 종양 덩어리의 성장 또는 증식을 억제 (예를 들어, 부피 측정과 같이)하는 것을 가리킨다. 이러한 억제는 종양 덩어리를 구성하는 세포의 성장 속도 및(또는) 증식 속도 및(또는) 사멸의 감소를 통해 매개될 수 있다. 성장의 억제 또는 증식의 억제는 세포 표현형을 변형 (예를 들어, 건강한 세포의 형태적 특성의 회복, 접촉 억제의 회복, 침입성 표현형의 상실, 고착 비의존적 성장의 억제 등)시킴으로써 달성될 수 있다. 이를 위해서, 질병에 걸린 세포는 하나 이상의 벙리학적 형질을 가질 것이다. 질환 세포의 이러한 형질에는 특히 1종 이상의 종양 억제 단백질의 불완전한 발현이 포함될 수 있다. 불완전한 발현은 1종 이상의 기능성 억제 단백질의 완전한 상실 또는 1종 이상의 기능성 종양 억제 단백질의 발현 수준에서의 감소를 특징으로 할 수 있다. 이러한 세포는 종종 신생물 및(또는) 종양이다.

"전신 투여"라는 용어는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터 또는 보조 항암제, 또는 본 원에 사용된 화학요법 화합물과 같은 조성물 또는 약물을 이들이 순환계에 도입될 수 있는 방식으로 투여하는 것을 가리킨다. "국소 투여 (regional administration)"라는 것은 특정 해부학적 공간, 예를 들어 복강내, 초내, 경막하, 또는 특정 기관 등으로 조성물 또는 약물을 투여하는 것을 가리킨다. 예를 들어, 국소 투여는 간에 국소 투여를 하기 위해 간장 동맥으로 조성물 또는 약물을 투여하는 것을 포함한다. "국부 투여 (local administration)"라는 용어는 제한되었거나 한정된 해부학적 공간으로 조성물 또는 약물을 투여하는 것을 가리키는데, 예로 들 수 있는 것은 종양 덩어리로의 종양내 주사, 피하 주사, 근육내 주사 등이다. 당업자라면 모두 국부 투여 또는 국소 투여에 의해 조성물 또는 약물이 순환계로도 투입될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

본 원에 사용된 "감소된 종양 형성"이라는 용어는 과다증식 (예를 들어, 신생물) 세포가 증식이 저하되는 상태로 전환되는 것을 가리킨다. 종양 세포의 경우, "감소된 종양형성"은 종양 세포로 전환되는 능력이 감소 또는 제거된 종양형성 감소 세포, 또는 비종양형성성 또는 비종양 세포로 되는 종양 세포를 의미한다. 종양형성이 감소된 세포는 생체 내에서 종양을 형성하지 않거나, 또는 지체기가 생체 내 종양 성장이 발생하기 수 주 내지 수 개월 전까지 연장된다. 종양형성이 감소된 세포는 또한 완전히 불활성화된 세포, 또는 동일한 생리학적 환경 (예를 들어, 조직, 유기체 연령, 유기체 성별, 월경 주기 등)에서 성장한 비기능성 종양 억제 유전자를 갖는 세포와 비교해 볼 때 3차원적 종양 덩어리가 서서히 성장할 수 있다.

본 원에 사용된 유전자 또는 폴리펩티드의 "활성 단편"은 종양 억제 활성이 있는 단백질을 코딩하는 능력을 보유한 유전자 또는 그로부터 유래된 핵산 (예를 들어, cDNA)의 보다 작은 부분(들) (부분 서열)을 포함한다. 이와 유사하게, 폴리펩티드의 활성 단편은 종양 억제 단백질을 함유하는 폴리펩티드의 부분 서열을 가리킨다. 활성 단편의 한 예로 들 수 있는 것은 예를 들어 동시 계류중인 USSN 08/328,673 (1994년 10월 25인 출원)에 기재된 p56^RB이다.

"악성 종양"이라는 용어는 전이 능력이 있는 종양 세포를 가리킨다.

본 원에 사용된 "핵산"은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 핵산은 폴리머라제에 의해 정확히 판독될 수 있고 그 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드의 발현을 변형시키지 않는 변형 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

"뉴클레오티드 서열"이라는 구는 각각 단일 사슬이거나, 또는 이중 사슬에서의 센스 사슬 및 안티센스 사슬 모두가 포함된다.

"DNA 서열"이라는 구는 뉴클레오티드 염기인 아데노신, 티미딘, 시토신 및 구아노신으로 구성된 단일 또는 이중 사슬 DNA 분자를 가리킨다.

"코딩하는 핵산 서열"이라는 구는 특정 단백질 또는 펩티드의 발현을 지시하는 핵산을 가리킨다. 핵산 서열에는 RAN로 전사된 후 단백질로 번역되는 양쪽 DNA 사슬 서열이 포함된다. 핵산 서열에는 완전한 길이의 핵산 서열은 물론, 완전한 길이의 핵산 서열로부터 유래된 단편 길이의 서열도 둘 다 포함된다. 또한 서열에는 특정 숙주 세포에서 코돈 우세성을 제공하도록 도입될 수 있는 고유 서열(들)의 동의적 코돈이 포함되는 것으로 이해된다.

"발현 카세트"라는 표현은 이러한 서열과 상응할 수 있는 숙주의 구조 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있는 뉴클레오티드 서열을 가리킨다, 이러한 카세트는 적어도 프로모터와, 또한 전사 종결 신호를 포함한다. 발현을 수행하는데 필요하거나 도움이 되는 추가의 인자는 본 원에 기재된 것과 같이 사용될 수도 있다.

본 원에 사용된 "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 프로모터가 DNA 서열의 전사를 매개하도록 DNA 서열로부터 프로모터 상위 서열이 연결된 것을 가리킨다.

종양 억제 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 또는 그 단편에 대하여 설명하는 경우 "독립된" 또는 "사실상 순수"하다는 것은 종양 억제 단백질 또는 폴리펩티드 또는 그의 단편 이외의 단백질 또는 펩티드를 코딩하지 않는 독립된 핵산 서열을 가리킨다.

"재조합"이라는 용어는 천연 또는 내인성 공급원으로부터 단리되었거나, 또는 화학적으로나 효소적으로 변형되어 자연 발생적인 플랭킹 (flanking) 뉴클레오티드를 제거하는 DNA, 또는 자연 발생적이지 않은 플랭킹 뉴클레오티드를 제공하는 DNA를 가리킨다. 플랭킹 뉴클레오티드는 설명된 뉴클레오티드 서열 또는 부분 서열로부터 상위 또는 하위인 뉴클레오티드이다.

"벡터"는 세포를 감염, 형질감염, 일시적으로 또는 영구히 형질도입시킬 수 있는 핵산을 포함한다. 벡터는 핵산 자체, 또는 단백질 또는 지질과 복합된 핵산일 수 있는 것으로 인식될 것이다. 벡터는 임의로 바이러스 또는 세균의 핵산 및(또는) 단백질, 및(또는) 막 (예를 들어, 세포막, 바이러스 지질 외피 등)을 포함할 수 있다. 벡터에는 종종 프로모터의 통제 하에서 목적하는 핵산이 위치해 있는 발현 카세트가 포함된다. 벡터는 DNA의 단편이 부착될 수 있거나 복제될 수 있는 레플리콘 (예를 들어, 플라스미드, 박테리오파지)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 벡터는 RNA, 자율적 자기 복제 원형 DNA (플라스미드)와, 발현 및 비발현 플라스미드 모두를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 재조합 미생물 또는 세포 배양액이 "발현 벡터"를 함유하는 것으로 설명되는 경우, 이것은 세포외 염색체의 원형 DNA와, 숙주 세포로 도입된 DNA 모두를 포함한다. 벡터가 숙주 세포에 의해 유지되는 경우 벡터는 자율 구조로서 유사분열 동안 세포에 의해 안정하게 복제될 수 있거나, 또는 숙주의 게놈으로 도입된다.

"유효량"이라는 용어는 세포 성장 및(또는) 증식을 조절하는데 양성 결과를 달성하는 벡터 또는 약물의 양을 가리킨다.

본 원에 사용된 약어 "C.I.U."는 "세포 감염 단위"를 나타낸다. C.I.U.는 48 시간의 감염 시간 후 바이러스 헥손 단백질 양성 세포 (예를 들어, 293 세포)를 측정하여 계산한다 [Huyghe (1995) Human Gene Ther. 6:1403-1416].

본 원에 사용된 약어 "m.o.i."는 "다중감염도"를 가리키며 세포 당 C.I.U.이다.

본 원에 사용된 "파클리탁셀"이라는 용어는 탁솔 (Taxol, 등록상표)로 알려진 시판되는 약물을 가리킨다. 탁솔 (등록상표)은 튜불린 성분이 유사분열에 적절한 구조로 재구성될 수 없는 안정화된 미세소관다발로 중합되는 것을 증진시켜 진핵 세포의 복제를 억제한다.

약물 및(또는) 핵산과 접촉시키는 것에 관한 경우 "세포를 접촉시키다"라는 용어는 약물 및(또는) 핵산이 세포로 내재화되는 것을 가리키는데 본 원에 사용되었다. 이러한 내용에서 세포를 핵산과 접촉시키는 것은 세포를 핵산으로 형질감염시키는 것과 같다. 약물이 친지질성이거나, 핵산이 지질 (예를 들어, 양이온계 지질)과의 복합체인 경우, 단순한 접촉은 세포로의 이송 (예를 들어, 능동수송, 수동수송 및(또는) 확산)을 일으킬 것이다. 이와 달리, 약물 및(또는) 핵산 단독, 또는 담체와 합해진 조성물인 경우 세포로 능동 수송될 것이다. 즉, 예를 들어 핵산이 감염 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스)로 존재하는 경우 벡터는 세포로의 핵산의 흡수를 매개할 수 있다. 핵산은 세포외 수용체와 특이적으로 상호작용하여 세포로 핵산의 전달을 촉진시키는 약물과 복합체를 이룰 수 있는데, 이것의 예는 미국 특허 번호 제5,166,320호 및 동 제5,635,383호에 기재된 바와 같은 리간드/다가양이온/DNA 복합체이다. 또한, 바이러스에 의한 전달은 바이러스 게놈의 구형돌기물 또는 섬유 도메인을 재조합 변형시켜 세포의 목표 성분으로 도입시킴으로써 증진될 수 있다.

본 원에 "A/C/N/53", "A/M/N/53", p110^RB, p56^RB로 표시된 구성물은 동시 계류중인 출원 USSN 08/328,673 (1994년 10월 25일 출원, 국제 공개 제95/11984호)에 표시된 구성물을 가리킨다.

단백질을 설명하는 경우 "보존적 치환"은 실질적으로는 단백질의 활성을 변형시키지 않는 단백질의 아미노산 조성에서의 변화를 가리킨다. 따라서, 특정 아미노산 서열의 "보존적으로 변형된 변형물"은 심지어 중요한 아미노산이 치환되었을지라도 실질적으로 활성을 변형시키지 않는, 단백질의 활성에는 중요하지 않는 아미노산 중의 아미노산 치환, 또는 유사 특성 (예를 들어, 산성, 염기성, 양 또는 음전하, 극성 또는 비극성 등)을 갖는 다른 아미노산에 의한 아미노산의 치환을 가리킨다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공할 수 있는 보존적 치환은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 하기 6 개 군 각각은 서로에 대해 보존적 치환체인 아미노산을 포함한다.

1) 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T)

2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E),

3) 아스파라진 (N), 글루타민 (Q)

4) 아르기닌 (R), 리신 (K)

5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V) 및

6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W).

(참조 문헌 [Creighton (1984) Proteins W.H. Freeman and Company]). 또한 코딩된 서열 중의 한 아미노산 또는 적은 백분율의 아미노산을 변형, 부가 또는 결실시키는 치환, 결실 또는 부가 각각도 또한 "보존적으로 변형된 변이"이다.

본 발명은 세포의 성장 및(또는) 증식, 보다 구체적으로는 암 세포의 성장 및 증식을 억제하는 신규 방법에 관한 것이다. 한 실시태양에 있어서, 본 발명은 세포를 종양 억제 핵산 또는 종양 억제 단백질 및 보조 항암제와 접촉시키는 것을 포함한다. 통상적으로, 사용되는 종양 억제 단백질 또는 핵산은 활성이 결여된 종양 억제 단백질과 동일한 종류일 것이다. 즉, 세포가 내인성 p53 활성이 결여된 경우 p53 단백질 또는 p53 핵산이 사용될 것이다.

선행 연구 (참조 문헌 [Wahl et al. (1996) Nature Med., 2(1):72-79 및 Hawkins et al. (1996) Canc. Res. 56:892-898])의 결과와 달리, 놀랍게도 본 발명의 연구자들은 보조 항암제 (예를 들어, 파클리탁셀 (탁솔, 등록상표) 및 종양 억제 유전자 또는 폴리펩티드 (예를 들어, p53)로 내인성 야생형 종양 억제 단백질 (즉, 많은 신생물 세포)이 결여되어 있거나, 결함이 있는 포유동물 세포를 처리하면 화학 치료 또는 종양 억제 구성물 단독으로 처리한 것 보다 더 큰 정도로 세포의 증식 및(또는) 성장의 억제를 일으킨다는 것을 발견해 내었다. 또한, 본 발명자들은 보조 항암제로 예비처리하면 종양 억제 핵산의 증식 방지 효과가 극적으로 증가된다는 것을 발견해 내었다. 특정 이론에 결부되기를 바라지 않지만, 항암제가 기여할 수 있는 가능한 수단에 의해 다음과 같은 효과, 즉, 다양한 유전자 치료 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스)의 감염 효율을 증가시키거나, 종양 억제 유전자의 발현 수준을 증가시키거나, 세포간 바이러스 수송을 유지시키기 위해 미세소관을 안정화시키거나, 다양한 세포간 메카니즘 (예를 들어, 신호 경로, 세포자멸 경로, 세포 순환 경로)의 상호작용을 경유하여 효과를 증가시키는 것으로 여겨진다.

즉, 한 실시양태에 있어서, 본 발명은 세포의 내인성 야생형 종양 억제 단백질이 결여되어 있거나, 결함이 있는 질병에 걸린 포유동물 세포를 보조 항암제, 및 종양 억제 핵산 및(또는) 종양 억제 폴리펩티드와 접촉시켜 억제하는 방법을 제공한다. 세포가 종양에 존재하는 경우, 본 방법은 종양 성장을 억제함으로써 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특히 바람직한 종양 억제 핵산 또는 폴리펩티드로는 p53, RB, h-NUC (예를 들어, 문헌 [Chen (1995) Cell Growth Differ. 6:199-210] 참조) 또는 그의 활성 단편 (예를 들어, p110^RB, p56^RB)이 있고, 특히 바람직한 보조 항암제 (화합물)로는 파클리탁셀 및 파클리탁셀 유사 활성을 갖는 화합물, 예를 들어 파클리탁셀 유도체 (예를 들어 유사체)가 있다.

본 발명자들은 또한 세포를 종양 억제 핵산 및(또는) 폴리펩티드와 접촉시키면 전이 세포를 억제 할 수 있다는 것도 발견해 내었다. 이러한 억제는 전이 세포의 형성, 성장, 이동 또는 재생성을 억제하는 형태를 취할 수 있다. 한 실시양태에 있어서, 억제는 1차 종양으로부터 원거리 신생물의 발생을 억제 (예를 들어, 감소 및(또는) 제거)하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명은 따라서 전이성 질병의 진행을 치료 (경감 또는 제거)하는 방법을 제공한다. 본 발명은 전이 세포를 종양 억제 핵산 및(또는) 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에 있어서, 본 발명은 외과적 상처 부위 (종양 덩어리를 제거 (디벌크화) 한 후)의 세포를 보조 항암제와 합해진 종양 억제 핵산 및(또는) 종양 억제 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 이 세포는 본 원에 기재된 보조 항암제와 추가로 접촉시킬 수 있다.

또 다른 실시양태에 있어서, 본 발명은 종양 억제 유전자 및 유전자 생성물을 사용하는 유리한 치료 양생법을 제공한다. 부분적으로, 이들 치료 양생법은 세포 또는 종양을 억제하는 것에 있어서 종양 억제 핵산 및(또는) 폴리펩티드가 단일 거환 보다는 오히려 다중 투여로 전달되는 경우가 더 효과적이라는 놀라운 발견을 토대로 한다.

종양 억제제 및 보조 항암제가 투여되는 순서는 본 발명에 있어서 중요하지 않다. 즉, 조성물(들)은 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에 있어서, 세포를 (단독 또는 화학요법제와 합해진) 1종 이상의 보조 항암제로 로 예비처리하면 순차적으로 투여되는 종양 억제 핵산 및(또는) 폴리펩티드의 효율을 증가시킬 수 있다. 한 실시양태에 있어서, 보조 항암제 및 종양 억제 핵산 및(또는) 폴리펩티드 전에 화학요법제를 투여한다. 또 다른 실시양태에 있어서, (단독 또는 화학요법제와 합해진) 보조 항암제를 종양 억제 핵산 및(또는) 폴리펩티드와 동시에 투여한다. 추가의 실시양태에 있어서, 종양 억제 핵산 및(또는) 폴리펩티드는 종양 억제 핵산 및(또는) 폴리펩티드 후에 투여한다.

본 발명의 방법 및 투여되는 조성물의 항암 효과로는 항종양, 바이스탠더 효과라 불리는 비특이적 효과가 있다 (예를 들어, 문헌 [Zhang (1996) Cancer Metastasis Rev. 15:385-401 및 Okada (1996) Gene Ther. 3:957-996) 참조). 또한, 면역계도 면역계의 체액성 또는 세포성 암 (arm)이 선택적으로 강화 (또는 저하)되도록 조절될 수 있는데, 즉 B 세포 및(또는) T 세포 (예를 들어, 세포독성 임파구 (CTL) 또는 종양 침입 임파구 (TIL)) 반응을 조절할 수 있다. 예를 들어, TIL의 증가는 p53-발현 아데노바이러스를 사람에게 투여하였을 때 관찰된다. 특히, TIL (표현형적으로 T 헬퍼 (helper) 세포, CD3⁺, 및 CD4⁺)의 증가는 하기에 상세히 설명된 바와 같이 전이성 간장암을 치료하기 위해 p53-발현 아데노바이러스를 간장 동맥내 투여하였을 때 관찰된다.

본 발명의 방법은 단일 보조 항암제를 사용하거나, 심지어 단일 화학요법제를 사용하는 것에 제한되지 않는다. 따라서 본 발명은 세포 또는 종양을 본 원에 기재된 종양 억제 핵산 및 1종 이상의 보조 항암제와 접촉시켜, 내인성 종양 억제 단백질이 결여되어 있는 질병에 걸린 포유동물 세포, 또는 이러한 세포를 포함하는 종양을 억제하는 방법을 제공한다.

Ⅰ. 보조 항암제

A) 미세소관 작용제

한 실시양태에서 설명된 바와 같이, 본 발명은 세포를 종양 억제 단백질 또는 종양 억제 핵산, 미세소관 작용제와 같은 보조 항암제 (예를 들어, 파클리탁셀, 파클리탁셀 유도체 또는 파클리탁셀 유사 화합물)와 접촉시켜 내인성 종양 억제 단백질이 결여되어 있는 질병에 걸린 세포를 억제하는 방법을 제공한다. 본원에 사용된 미세소관 작용제는 미세소관 형성 및(또는) 작용에 작용하여 세포 유사분열 효과를 나타내는 화합물이다. 이러한 약물은 예를 들어, 미세소관 안정화제, 또는 미세소관 형성 파괴제일 수 있다.

본 발명에 유용한 미세소관 작용제는 당업계에 잘 공지되어 있으며, 알로콜키신 (NSC 406042), 할리콘드린 B (NSC 609395), 콜키신 (NSC 757), 콜키신 유도체 (예를 들어, NSC 33410), 돌라스타틴 10 (NSC 376128), 마이탄신 (NSC 153858), 리족신 (NSC 332598), 파클리탁셀 (탁솔 (등록상표), NSC 125973), 탁솔 (등록상표) 유도체 (예를 들어, NSC 608832), 티오콜키신 (NSC 361792), 트리틸 시스테인 (NSC 83265), 빈블라스틴 술페이트 (NSC 49842), 빈크리스틴 술페이트 (NSC 67574), 에포틸론 A, 에포틸론 및 디스코데몰리드 (예를 들어, 문헌 [Service, (1996), Science, 274:2009]), 에스트라무스틴, 노코다졸, MAP4 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 약물의 예는 과학 및 특허 문헌 (예를 들어, Bulinski (1997) J. Cell Sci. 110:3055-3064; Panda (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10560-10564; Muhlradt (1997) Cancer Res. 57:3344-3346; Nicolaou (1997) Nature 387:268-272; Vasquez (1997) Mol. Biol. Cell. 8:973-985; Panda (1996) J. Biol. Chem. 271:29807-29812)에도 기재되어 있다.

특히 바람직한 약물은 파클리탁셀 유사 활성이 있는 화합물이다. 이들의 예에는 파클리탁셀 및 파클리탁셀 유도체 (파클리탁셀 유사 화합물) 및 유사체가 있으나 이에 제한되지 않는다. 파클리탁셀 및 그의 유도체는 시판되고 있다. 또한, 파클리탁셀 및 파클리탁셀 유도체 및 유사체의 제조 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들어 미국 특허 번호 제5,569,729호; 제5,565,478호; 제5,530,020호; 5,527,924호, 제5,508,447호; 제5,489,589호; 제5,488,116호; 제5,484,809호; 5,478,854호; 제5,478,736호; 제5,475,120호; 5,468,769호; 제5,461,169호; 제5,440,057호;제 5,422,364호; 제5,411,984호; 제5,405,972호; 제5,297,506호).

추가의 미세소관 작용제는 당업계에 공지된 다수의 분석법 중 하나, 예를 들어 유사분열시 세포를 봉쇄하는 화합물의 능력을 평가하기 위한 세포 분석과 함께 파클리탁셀 유사체의 튜불린 중합 활성을 평가하는 반자동화 분석을 이용하여 평가할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Lopes (1997) Cancer Chemother. Pharmacol. 41:37-47] 참조).

일반적으로 시험 화합물의 활성은 그 화합물을 세포와 접촉시키고 특히 유사분열을 억제함으로써 세포 주기가 파괴되었는지의 여부를 측정하여 결정한다. 이러한 억제는 유사분열 기관의 파괴, 예를 들어 방추체 형성의 파괴에 의해 매개될 수 있다. 유사분열이 방해받은 세포는 변형된 형태 (예를 들어, 미세소관 압축, 염색체 수 증가)를 특징으로 한다.

바람직한 실시양태에 있어서, 튜불린 중합 활성의 가능성이 있는 화합물을 생체 외에서 선별하였다. 바람직한 실시양태에 있어서, 증식의 억제 및(또는) 변형된 세포 형태, 특히 미세소관 압축을 위해서 화합물을 배양된 WR21 세포 (세포주 69-2 웹-라스 생쥐)에 대해 선별하였다. 이어서 WR21 종양 세포를 함유하는 누드 마우스를 이용하여 양성 시험 화합물의 생체 내 선별을 수행하였다. 이 선별 방법에 대한 상세한 프로토콜은 문헌 [Porter (1995) Lab. Anim. Sci., 45(2): 145-150]에 기재되어 있다.

목적하는 활성에 대한 화합물을 선별하기 위한 다른 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 통상적으로 이러한 분석은 미세소관 회합 및(또는) 분해의 억제를 분석하는 것을 포함한다. 미세소관 회합을 위한 분석은 예를 들어 문헌 [Gaskin et al. (1974) J. Molec. Biol., 89:737-758]에 기재되어 있다. 미국 특허 번호 제5569,720호도 파클리탁셀 유사 활성이 있는 화합물에 대한 생체 외 및 생체 내 분석법을 제공한다.

B) 폴리프레닐-프로틴 트랜스퍼라제 억제제

또 다른 실시양태에 있어서, 본 발명은 종양 억제 핵산 및(또는) 폴리펩티드 및 폴리프레닐-프로틴 트랜스퍼라제 억제제를 함께 사용하는 것을 제공한다. 특히바람직한 폴리프레닐-프로틴 트랜스퍼라제 억제제로는 파네실-프로틴 트랜스퍼라제 (FPT) 억제제, 제라닐제라닐-프로틴 트랜스퍼라제 억제제와, 다른 모노테르펜 프로틴 트랜스퍼라제가 있으나 이에 제한되지 않는다. 폴리프레닐-프로틴 트랜스퍼라제 억제제인 화합물의 예는 과학 및 특허 문헌에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Zhang (1997) J. Biol. Chem. 272:10232-10239; Njoroge (1997) J. Med. Chem. 40:4290-4301; Mallamx (1997) Bioorg. Med. Chem. 5:93-99] 참조).

파네실-프로틴 트랜스퍼라제의 예로 들 수 있는 화합물을 하기에 나타냈다.

국제 공개 제97/23478호 (1996년 12월 19일 출원)에 기재된 "FPT39"로 표시된 FPT 억제제는 국제 공개 제97/23478호의 95 페이지에서 화합물 "39.0"으로 표시된 화합물이다.

<화합물 FPT39>

하기된 바와 같이 FPT39가 전립선 종양 세포 및 유방 종양 세포에 대해 본 발명의 p53 발현 아데노바이러스와 함께 조합 요법으로 사용되는 경우 조합물은 단독으로 사용되는 다른 어떠한 것 보다 종양 세포를 사멸시키는데 보다 더 효과적이다.

올리고펩티드 (대개는 테트라펩티드이나 식 Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3를 포함하는 펜타펩티드도 포함; 유럽 특허 공개 제461,489호; 동 제520,823호; 동 제528,486호 및 국제 공개 제95/11917호).

펩티도 유사체 화합물, 특히 Cys-Xaa-Xaa-Xaa 유사체; 유럽 특허 공개 제535,730호; 동 제535,731호; 동 제618,221호; 국제 공개 제94/09766호; 국제 공개 제94/10138호; 국제 공개 제94/07966호; 미국 특허 제5,326,773호, 동 제 5,340,828호, 동 제5,420,245호; 국제 공개 제95/20396호; 미국 특허 제5,439,918호 및 국제 공개 제95/20396호.

파네실화 펩티드 유사체 화합물 - 특히 파네실화 Cys-Xaa-Xaa-Xaa 유사체: 영국 특허 공개 제2,276,618호.

다른 펩티도 유사체 화합물: 미국 특허 제5,352,705호, 국제 공개 94/00419호; 동 제95/00497호; 동 제95/09000호; 동 제95/09001호; 동 제91/12612호; 동 제95/25086호; 유럽 특허 공개 제675,112호 및 프랑스 특허 공개 제2,718,149호.

융합 고리 트리시클릭 벤조시클로헵타피리딘: 국제 공개 제95/10514호; 동 제95/10515호; 동 제95/10516호; 동 제96/30363호; 동 제96/30018호; 동 제96/30017호; 동 제96/30362호; 동 제96/31111; 동 제96/31478호; 동 제96/31477호; 동 제9631505호; PCT/US96/19603호, 국제 공개 제97/23478호; 미국 특허 출원 번호 제08/728104호; 동 제08/712,989호 동 제08/713,326호, 동 제08/713,908호, 동 제08/713,705호, 동 제08/713,703호, 동 제08/710,225호, 동 제08/711,925호, 동 제08/712,924호, 동 제08/713,323호, 동 제08/713,297호.

파네실 유도체: 유럽 특허 공개 제534,546호, 국제 공개 제94/19357호, 동 제95/08546호, 유럽 특허 공개 제537,007호 및 국제 공개 제95/13059호.

천연 생성물 및 유도체: 국제 공개 94/18157호; 미국 특허 제5,430,055호; 영국 특허 공개 제2,261,373호, 동 제2,261,374호, 동 제2,261,375호; 미국 특허 5,420,334호, 동 제5,436,263호.

기타 화합물: 국제 공개 제94/26723호; 동 제95/08542호; 미국 특허 제5,420,157호; 국제 공개 제95/21815호 및 동 제96/31501호.

C) 항맥관형성 화합물

본 발명의 종양 억제 단백질 또는 핵산은 또한 항맥관형성 화합물과 함께 투여할 수 있다. 바람직한 항맥관형성 조성물은 혈관의 형성 또는 증식, 더욱 바람직하게는 혈관에서 종양으로의 형성 및(또는) 증식을 억제한다.

적절한 항맥관형성 조성물로는 갈라르딘 (미국 캘리포니아주 알라메다 소재 Glycomed Inc.사 제품 GM6001), 내피 반응 억제제 (예를 들어, 인터페론 알파, TNP-470 및 도관 내피 성장 인자 억제제와 같은 약물), 세포 매트릭스를 촉진 및 분해시키는 약물 (예를 들어, 비탁신 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재 Ixsys Co.,사 제품, 사람 LM-609 항체) 및 혈관 성장에 직접 영향을 미치는 약물 (예를 들어, 그룹 A 스트렙토코카스 (Streptococcus) 항원의 외독소로부터 유래되어 신규 혈관에 결합하여 강한 숙주 염증 반응을 유도하는 CM-101, 및 탈리도미드).

몇몇 종류의 스테로이드류도 항맥관형성 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 특히, 합성 프로게스테론인 메드록시프로게스테론 아세테이트 (MPA)가 토끼 각막 분석 (Oikawa (1988) Cancer Lett. 43:85)에서 신생혈관형성을 강하게 억제하는 것을 설명하는 다수의 보고가 있었다 (Oikawa (1988) Cancer Lett. 43. 85). 5FU의 프로드러그인 5'-데옥시-5-플루오로우리딘 (5'DFUR)은 또한 항맥관형성 화합물이라는 것을 특징으로 할 수 있는데, 그 이유는 5'DFUR이 PD-ECGF/TP의 티미딘 포스포릴라제 활성에 의해 5-FU로 전환되기 때문이다. 이 연구에서 5'DFUR은 고도의 맥관형성 가능성을 가진 PD-ECGF /TP에 대해 선택적으로 활성일 수 있다. 최근의 임상 연구에서 5'DFUR은 PD-ECGF /TP 양성 종양에 대해 효과적일 수 있는 가능성이 제시되었다. 5'DFUR의 항암 효과의 극적인 증가는 형질감염되지 않은 야생형 세포와 비교해 볼 때 PD-ECGF/TP로 형질감염된 세포에서 나타난 것으로 제시되었다 (Haraguchi (1993) Cancer Res. 53:5680-5682)). 또한, 5'DFUR + MPA의 화합물 조합도 효과적인 항맥관형성제이다 (Yayoi (1994) Int J Oncol. 5:27-32). 5'DFUR + MPA의 조합물은 상이한 스펙트럼을 갖는 두 맥관형성 억제제, 내피 성장 인자 억제제 및 프로테아제 억제제의 조합물로 분류될 수 있다. 또한, DMBA로 유도된 쥐 유방암을 이용한 생체 내 실험에서 5'DFUR은 AGM-1470과의 조합 효과를 나타냈다 (Yamamoto (1995) Oncol Reports 2:793-796).

본 발명에 유용한 다른 군의 항맥관형성 화합물에는 맥관형성을 촉진시키는 헤파린 결합 성장 인자의 기능을 방해할 수 있는 다당류 (예를 들어, 펜토산 폴리술페이트)가 포함된다.

맥관형성의 다른 조절자로는 혈소판 인자 Ⅳ 및 AGM 1470이 있다. 또 다른 예는 천연 공급원인 콜라게나제 억제제, 비타민 D3-유사체, 푸미갈린, 헤르비마이신 A, 및 이소플라본이 있다.

D) 내분비 요법

이미 잘 확립된 대표적인 세포정지 (cytostatic) 치료법인 내분비 요법은 호르몬 의존적 세포를 비활성으로 만들어 생체 내 종양 세포 수를 감소시키고 호르몬 의존적 종양이 있는 환자에서 종양 성장을 억제할 수 있다. 이러한 요법은 과도 증식 세포의 치료에 종양 억제의 효과를 증가시키는 것으로 예상된다. 따라서 또 다른 실시양태에 있어서 본 발명은 예를 들어, 종양 억제 핵산 및(또는) 폴리펩티드 및 항에스트로겐, 항안드로겐 또는 항프로게스테론을 합하여 사용하는 것을 제공한다. 내분비 요법은 당업자에게 잘 공지되어 있고, 그 예로는 타목시펜, 토레미펜 (예를 들어 미국 특허 제4,696,949호 참조), 플루타미드, 메가세 및 루프론 (예를 들어, 국제 공개 제91/00732호, 국제 공개 제93/10741호, 국제 공개 96/26201호 및 문헌 [Gauthier et al. J. Med. Chem. 40:217-2122 (1997)] 참조)이 있으나 이에 제한되지 않는다.

E) 보조 항암제의 전달: 제약 조성물

제약 조성물

본 발명의 방법에 사용되는 보조 항암제는 통상적으로 제약학적으로 허용 가능한 담체 (부형제)와 합해져 약리 조성물을 형성한다. 본 발명의 제약 조성물은 종양 억제 유전자 또는 폴리펩티드, 예를 들어 p53, 또는 RB 함유 또는 무함유하는 1종 이상의 보조 항암제를 포함할 수 있다.

제약학적으로 허용 가능한 담체는 예를 들어, 조성물을 안정화시키거나, 약물 및(또는) 제약 조성물의 흡수를 증가 또는 감소시키는 작용을 하는 생리학적으로 허용 가능한 화합물을 함유할 수 있다. 생리학적으로 허용 가능한 화합물의 예로는 탄수화물 (예컨대, 글루코스, 수크로스, 또는 덱스트란), 산화방지제 (예컨대, 아스코르브산 또는 글루타티온), 킬레이트제, 저분자량 단백질, 보조 항암제의 제거 또는 가수분해를 감소시키는 조성물, 또는 부형제, 또는 다른 안정화제 및(또는) 완충제가 있을 수 있다. 세제도 조성물을 안정화시키거나, 제약 조성물의 흡수를 증가 또는 감소시키는데 사용될 수 있다 (특히 예가되는 세제는 하기를 참조).

다른 생리학적으로 허용 가능한 화합물로는 습윤제, 유화제, 분산제, 또는 미생물의 성장 또는 작용을 막는데 특히 유용한 방부제가 있다. 다양한 방부제가 당업계에 잘 공지되어 있는데, 그 예로는 페놀 및 아스코르브산이 있다. 당업자는 제약적으로 허용 가능한 화합물을 비롯하여 제약학적으로 허용 가능한 담체를 선택하는 것은 예를 들어, 보조 항암제의 투여 경로 및 보조 항암제의 특정한 생리-화학적 특성에 의존한다는 것을 인식할 것이다.

투여하기 위한 조성물은 통상적으로 제약학적으로 허용 가능한 담체, 바람직하게는 수용성 보조 항암제용 수성 담체 중에 용해된 보조 항암제의 용액을 포함할 것이다. 다양한 담체, 예를 들어, 완충 염수 등이 사용될 수 있다. 이 용액은 멸균 용액이고, 일반적으로 바람직하지 않은 물질을 함유하지 않는다. 이 조성물은 당업계에 잘 공지된 통상적인 멸균 기술로 멸균시킬 수 있다. 조성물은 pH 조절제 및 완충제, 독성 조절제 및 기타, 예를 들어 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 락트산나트륨 등의 유사한 생리학적 조건에 요구되는 제약학적으로 허용 가능한 보조물질을 함유할 수 있다. 이 제형 중의 보조 항암제의 농도는 매우 다양할 수 있고, 선택된 특정 투여 방식 및 환자의 필요 조건에 따라 주로 유체 부피, 점도, 체중 등을 기준으로 하여 선택될 것이다.

<전달 경로>

본 발명의 방법에 사용되는 보조 항암제는 당업계에 공지된 어떠한 방법으로든지, 예를 들어 전신, 국소, 국부적으로; 동맥내 , 종양내, 정맥내 (Ⅳ), 비경구, 흉막내 공동, 국소, 경구 또는 국소 투여로, 피하, 기관내 (예를 들어, 에어로졸로) 또는 경점막 (예를 들어, 볼, 방광, 질, 자궁, 직장, 비점막), 종양내 (예를 들어, 경피 도포 또는 국소 주입)으로, 단독 또는 제약 조성물 (종양 억제제, 예를 들어 p53 함유 또는 무함유)로서 전달될 수 있고 그에 유용하다. 특히 바람직한 투여 경로에는 동맥 내 주입이 포함되며, 이는 특히 예를 들어 특정 기관 (예를 들어, 뇌, 간, 비장, 폐)에 집중되는 국부 효과를 가지는 경우 바람직하다. 예를 들어, 항암 국부 효과가 간에 필요하다면 간장 동맥내 주입이 바람직하고, 조성물이 뇌 (예를 들어, 뇌 종양 치료 시), 경동맥 또는 동맥계의 경동맥 중 한 동맥 (후두 동맥, 심이 동맥, 측두골 동맥, 중추 동맥, 상악골 동맥 등)으로 전달될 필요가 있다면 (예를 들어, 뇌 종양 치료 시) 경동맥내 주입이 바람직하다.

파클리탁셀 및 특정 파클리탁셀 유도체는 수용액 중에서 조금만 용해된다. 바람직한 실시양태에 있어서, 이 조성물은 종양 부위로 직접 전달 (주입, 관형성, 또는 외과적 수술 동안 직접 도포에 의해)되거나, 또는 허용 가능한 부형제 중에서 용해된다. 파클리탁셀 및 그 유도체의 투여 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 제5,583,153호, 동 제5,565,478호, 동 제5,496,804호, 동 제45,484,809호 참조). 다른 파클리탁셀 유도체는 수용성 유사체 및(또는) 프로드러그 (예를 들어, 미국 특허 제5,411,984호 및 동 제5,422,364호 참조)이고, 상기된 다양한 방법에 의해 용이하게 투여될 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 국소 투여, 예를 들어 초기 종양, 신생물 및 전이 세포와 다른 과정을 치료하기 위한 외과적 상처에서 특히 유용하다. 또 다른 실시양태에 있어서, 본 발명의 조성물은 비경구적 투여, 예를 들어, 정맥내 투여, 또는 체강 또는 장기의 관강으로 투여하는데 유용하다.

<치료 양생법>

제약 조성물은 투여 방법에 따라 다양한 단위 투여형으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여에 적합한 단위 투여형으로는 분말, 정제, 환제, 캡슐 및 로젠지가 있다. 보조 항암 화합물 (예를 들어, 파클리탁셀 및 기재된 관련 화합물)은 경구 투여되는 경우 소화로부터 보호되어야 하는 것으로 인식되어 있다. 이것은 통상적으로 보조 항암제를 조성물과 합하여 산 및 효소적 가수분해에 내성을 갖게 하거나, 또는 리포좀과 같은 적절히 내성을 갖는 담체 중에 보조 항암제를 팩킹함으로써 달성될 수 있다. 화합물을 소화로부터 보호하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, 치료제의 경구적 전달을 위한 지질 조성물을 기재하고 있는 미국 특허 제5,391,377호 참조).

통상적인 화학요법을 위한 투여량은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 또한, 이러한 투여량은 통상적으로는 본래의 권장량이 있고 특정한 치료 내용, 환자의 인내심 등에 따라 조절될 수 있다. 즉, 예를 들어 정맥 내 (Ⅳ) 투여를 위한 통상적인 제약 조성물 (예를 들어, 파클리탁셀)의 투여량은 1 내지 24 시간 (통상적으로 1, 3 또는 6 시간, 더욱 바람직하게는 3 시간)에 걸쳐 약 135 mg/m²로 투여될 것이고, 더욱 바람직하게는 매 3주 마다 3 내지 6 주기로 반복한다. 과민 반응의 빈도 및 심함을 감소시키기 위해서 또한 환자에게 파클리탁셀로 치료하기 약 12 시간 및 6 시간 전에, 약 20 mg의 덱사메타손 (데카드론 (Decadron) 및 기타)을, 30 내지 60분 전에 50 mg의 디페닐히드라민 (베나드릴 (Benadryl, 등록상표) 및 기타) + 약 300 mg의 시메티딘 (타가메트 (Tagamet, 등록상표)) 또는 50 mg의 란티딘 (잔탁크 (Zantac, 등록상표))을 경구적으로 투여할 수 있다. 1일 당 약 350 mg/m² 이하의 상당히 많은 양의 투여량이 사용될 수 있고, 특히 약물이 체강 또는 장기의 관강과 같이 혈류가 아닌 격리된 부위로 투여되는 경우에 사용될 수 있다. 실질적으로 보다 많은 양의 투여량은 선택된 어떠한 경로에 의해서든지, 예를 들어 국부 투여가 가능하다. 비경구적으로 투여될 수 있는 조성물을 제조하는 현행 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있고, 간행물 [Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980) 및 미국 특허 번호 제5,583,153호, 동 제5,565,478호, 동 제5,496,804호 및 동 제5,484,809호]에 기재되어 있다. 통상적인 투여량은 예를 들어, 복강내 투여의 경우 주 당 20 내지 150 mg/m²이거나, 또는 매 3주 마다 약 250 mg/m²일 것이다.

보조 항암제를 함유하는 조성물은 치료 처치를 위해 투여될 수 있다. 요법 적용에 있어서, 조성물은 1종 이상의 세포 유형의 과다증식을 특징으로 하는 질병을 앓는 환자에게 치료하기에 충분한 양 또는 적어도 부분적으로 질병 및(또는) 합병증을 정지시키기에 충분한 양으로 투여된다. 이러한 것을 달성하는데 필요한 양을 "치료상 유효한 투여량"으로 정의한다. 이러한 용도에 효과적인 양은 질병의 심함 및 환자 건강의 종합적인 상태에 따라 다를 것이다.

본 발명의 조성물의 단일 또는 다수회 투여는 환자가 요구하고 견디는 투여량 및 빈도에 따라 다르게 투여될 수 있다. 어떠한 경우일지라도, 본 발명의 조성물은 환자를 효과적으로 치료하기에 충분한 양의 보조 항암제를 제공해야 한다.

Ⅱ. 종양 억제 유전자 및 유전자 생성물

A) 바람직한 것으로 공지된 종양 억제제

한 실시양태에 있어서, 상술한 바와 같이 본 발명은 세포를 종양 억제 핵산 및 보조 항암제 (예를 들어, 파클리탁셀, 파클리탁셀 유도체 또는 파클리탁셀 유사 화합물)와 접촉시켜 세포의 성장 및(또는) 증식을 억제하는 방법을 제공한다.

종양 억제 유전자는 당업자에게 잘 공지되어 있고, 예로 들 수 있는 것으로는 RB, p53, APC, FHIT (예를 들어, 문헌 [Siprashvili (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:13771-13776]참조), BRACA1, BRCA2, VHL, WT, DCC, FAP, NF, MEN, E-카드헤린, nm23, MMACI 및 PTC가 있으나 이에 제한되지 않는다. RB 또는 망막아종 유전자는 원형 종양 억제제이고 그 특성이 잘 분류되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Science 247:712-715, Benedict (1980) Cancer Invest., 8:535-540, Riley (1990) Ann. Rev. Cell Biol. 10-1-29. 및 Wienberg (1992) Science 254:1138-1146] 참조). 특성이 가장 잘 분류된 종양 억제제는 많은 신생종 뿐만 아니라 Li-프라우메니 (Fraumeni) 증후군을 갖는 패밀리 중 다양한 종양으로 발전하는 유전적 체질과 관련된 p53이다. (예를 들어, 문헌 [Wills (1994) Hum. Gene Therao. 5:1079-1088, 미국 특허 제5,532,220호, 국제 공개 제95/289048호 및 유전자 치료에서의 p53의 클로닝 발현 및 용도를 기재하고 있는 Harris (1996) J. Nat. Canc. Inst. 88(20):1442] 참조). 다른 종양 억제제로는 WT (즉, 11p13에서 WT1), 윌름(Wilm's) 종양의 유전적 특성 (예를 들어 문헌 [Call et al. (1990) Cell. 60:60:509-520, Gessler (1990) Nature 343:774-778 및 Rose et al. (1990) Cell, 60:495-508] 참조). 프레자일 히스티딘 트라이애드 (Fragile Histidine Triad)에 있어서 FHIT로 불리는 종양 억제 유전자는 특히 전이, 절단 및 갭이 생기는 경향이 있는 것으로 공지된 염색체 3(3p14.2와 또한 3p21도 보고됨)에서 국부적으로 위치하는 것으로 밝혀졌고, 식도, 위 및 결장 암을 초래하는 것으로 여겨진다 (예를 들어 문헌 [Ohta et al. (1994) Cell, 84: 587-597, GenBank Accession No:U469227] 참조). 종양 억제 유전자 DCC (18q21) 및 FAP는 결장암과 관련되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Hedrick et al. (1994) Genes Dev., 8(10):1174-1183. GenBank Accession No:X76132 for DCC, 및 Wienberg (1992) Science, 254:1138-1146 for FAP]). NF 종양 억제제 (17q11에서 NF1 및 22q12에서 NF2)는 신경학적 종양과 관련되어 있다 (예를 들어, NF1에 대한 신경섬유종증 [Caivthon et al. (1990) Cell, 62:193-201, Viskochil et al. (1990) Cell, 62:187-192, Wallace et al. (1990) Science, 249:181-186, 및 Xug et al. (1990) Cell, 62:599-608]과 NF2에 대한 수막종 및 신경초종). MEN 종양 억제제는 다중 내분비 신형성 증후군의 종양과 관련되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Wienberg Science, 254:1138-1146, 및 Marshall (1991) Cell, 64:313-326] 참조). VHL 종양 억제제는 본 히펠 란다우 (von Hippel-Landau) 질병과 관련되어 있다 [Lafit (1993) Science 260:1317-1320, GenBank Accession No:L15409]. 널리 알려진 BRCA1 및 BRCA2 유전자는 유방암과 관련되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Skolnick (1994) Science, 266:66-71, GenBank Accession No:U14680 for BRCA1, 및 Teng (1996) Nature Genet. 13:241-244, GenBank Accession No:U43746]참조). 또한, E-카드헤린 유전자는 전립선 암의 침입적 표현형과 관련되어 있다 [Umbas (1992) Cancer Res. 52:5104-5109, Bussemakers (1992) Cancer Res. 52:2916-2999, GenBank Accession No:272397]. NM23 유전자는 종양 전이와 관련되어 있다 [Dooley (1994) Hum. Genet., 93(1):63 66, GenBank Accession No:X75598]. 다른 종양 억제제로는 췌장암과 관련된 DPC4 (18q21에서 확인), 결장암과 관련된 hMLH1(3p) 및 hMSH2(2p)와, 흑색종 , 췌장암 및 식도암과 관련된 CDKN2(p16) 및 (9p)가 있다. 마지막으로, 사람 PTC 유전자 (초파리 단편 (ptc) 유전자)는 모반 기저 세포암 증후군 (NBCCS) 및 체강 기저 암 증후군과 관련되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Hahn et al. (1996) Cell, 85:841-851] 참조). 이 목록의 종양 억제 유전자는 모든 것을 열거한 것도 아니며 제한하고자 하는 것도 아니며, 단순히 여러 가지 공지된 종양 억제제를 예시하고자 한다.

B) 종래 공지되지 않은 종양 억제제의 확인 및 스크리닝

종양 억제 유전자의 확인 또는 분석 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 통상적으로, 과다증식 세포는 과다증식 상태와 관련되어 있는 유전자가 상실 또는 돌연변이된 유전자에 대해 스크리닝하였다. 종양 억제 유전자 (TSG)로 여겨지는 유전자에 대한 가장 엄격한 시험은 종양 또는 종양으로부터 유래된 세포의 종양형성 표현형을 억제하는 능력이다. 종양 억제 핵산을 적절한 발현 벡터내 클로닝된 cDNA로서 종양 세포로 도입시키거나, 또는 후보 종양 억제 유전자를 함유하는 개별 염색체를 미세세포 전달 기술로 종양 세포로 도입시키는 것이 바람직하다. 이와 달리, 종양 억제 유전자 생성물 (예를 들어, 종양 억제 폴리펩티드)을 세포(들)로 도입시키고 세포의 증식 속도를 측정한다 (예를 들어, 세포를 계수하거나 종양 부피를 측정하는 등). 완전하거나 부분적인 증식 억제, 접촉 억제, 침입 표현형의 상실, 세포 분화 및 세포자멸은 모든 종양형성 표현형의 억제에 대한 척도이다 (신생물 상태에 대한 감소된 감응성).

변형되거나 발현되지 않은 핵산을 확인하기 위해 종양을 스크리닝하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 이러한 방법으로는 제거 혼성화 (subtractive hybridization) (예를 들어, 문헌 [Hampson (1992) Nucleic Acids Res. 20:2899]참조), 비교 게놈 혼성화 (CGH) (예를 들어, 국제 공개 제93/18186호, Kallioniemi (1992) Science, 258:818 참조) 및 고밀도로 배열된 핵산 프로브를 사용하는 발현 모니터링 (예를 들어, 문헌 [Lockhart (1996 Nature Biotechnology, 14(13):1675-1680]참조)이 있으나 이에 제한되지 않는다.

C) p53 및 기타 종양 억제 물질의 제조

상기한 바와 같이 본 발명은 예를 들어 생체외 세포, 생리학적 용액 (예를 들어 혈액) 중 세포, 조직 기관의 세포 또는 유기체를 종양 억제 핵산 또는 종양 억제 유전자 생성물, 예를 들어 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함한다. 종양 억제 핵산 또는 폴리펩티드는 상기 RB, p53, h-NUC (Chen의 상기 문헌 (1995)), APC, FHIT, BRACA1, BRCA2, VHL, WT, DCC, FAP, NF, MEN, E-카드헤린, nm23, MMACI, 및 PTC 등의 임의의 공지된 종양 억제 핵산 또는 폴리펩티드일 수 있으나 그에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 실시태양에 있어서 종양 억제 물질은 RB 핵산 또는 RB 폴리펩티드 또는 p53 핵산 또는 p53 폴리펩티드, 또는 이들의 활성 단편(들)이다.

가장 바람직한 실시태양에 있어서 p53 또는 RB 종양 억제 핵산은 표적 (예를 들어 종양) 세포에 위치할 경우 프로모터의 조절 하에 종양 억제 유전자 또는 cDNA를 발현하는 발현 카세트 내에 위치한다. 종양 억제 유전자를 코딩하는 발현 카세트 및(또는) 벡터를 작제하는 방법은 하기에 기술하는 바와 같이 당업계의 숙련자에게 잘 알려져 있다.

1. 종양 억제 핵산의 제조

본 발명의 종양 억제 단백질 또는 단백질 서열을 코딩하는 DNA는 예를 들어 클로닝 및 적절한 서열을 제한 효소로 처리하는 방법 또는 (예를 들어 상기에 나타낸 바와 같이 존재하는 서열 정보를 이용한) 직접적인 화학적 합성법, 예를 들어 Narang의 문헌 [Meth. Enzymol. 68: 90-99 (1979)]에 기재된 포스포트리에스테르법; Brown 등의 문헌 [Meth. Enzymol. 68: 109-151 (1979)]에 기재된 포스포디에스테르법; Beaucage 등의 문헌 [Tetra. Lett., 22: 1859-1862 (1981)]에 기재된 디에틸포스포르아미다이트법; 및 미국 특허 제4,458,066호의 고상 지지체법 등의 적절한 방법으로 제조할 수 있다.

화학적 합성에 의해 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 이것은 상보성 서열과 혼성화하거나 단일 가닥을 주형으로 이용하여 DNA 폴리머라제를 사용하여 중합함으로써 이중 가닥 DNA로 전환시킬 수 있다. 숙련자라면 DNA를 화학적으로 합성하는 것은 약 100개의 염기 서열에 한정되지만 더 짧은 서열을 라이게이션하여 더 긴 서열을 얻을 수 있음을 알 것이다.

별법으로 부분 서열을 클로닝하여 적절한 부분 서열을 적절한 제한 효소를 사용하여 절단할 수 있다. 이어서 프래그먼트를 원하는 DNA 서열이 되도록 라이게이션시킬 수 있다.

한 실시태양에 따르면 DNA 증폭 방법, 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 본 발명의 종양 억제 핵산을 클로닝할 수 있다. 이와 같이 하나의 제한 효소 부위 (예를 들어 NdeI)를 보유하는 센스 프라이머와 다른 제한 효소 부위 (예를 들어 HindIII)를 보유하는 안티센스 프라이머를 사용하여 예를 들어 핵산 서열 또는 부분서열을 PCR로 증폭시켰다. 이렇게 하면 원하는 종양 억제 서열 또는 부분서열을 코딩하고 말단 제한 효소 부위를 보유하는 핵산이 생성될 것이다. 이어서 제2 분자를 코딩하는 핵산을 포함하고 상응하는 적절한 제한 효소 부위를 보유하는 벡터에 상기 핵산을 쉽게 라이게이션시킬 수 있다. 적합한 PCR 프라이머는 공지된 임의의 특정 종양 억제 유전자, cDNA, 또는 단백질에 대한 널리 알려진 서열 정보를 사용하여 당업계의 숙련자에 의해 결정될 수 있다. 적절한 제한 효소 부위도 위치 지정 (site-directed) 돌연변이로 종양 억제 단백질 또는 단백질 부분서열을 코딩하는 핵산에 첨가할 수 있다. 표준 방법에 따라 종양 억제 서열 또는 부분서열을 포함하는 플라스미드를 적절한 제한 효소 엔도뉴클레아제로 절단하고 이어서 제2 분자를 코딩하는 벡터에 라이게이션시켰다.

상기한 바와 같이 다수의 종양 억제 유전자의 핵산 서열이 알려져 있다. 따라서 예를 들어 p53의 핵산 서열은 Lamb 등의 문헌 [Mol. Cell Biol. 6: 1379-1385 (1986), GenBank 접근 번호: M13111]에서 찾을 수 있다. 유사하게는 RB의 핵산 서열은 Lee 등의 문헌 [Nature, 329: 642-645 (1987), GenBank 접근 번호: M28419)]에 기재되어 있다. 기타 종양 억제 물질의 핵산 서열은 상기 II(a) 단락에 나타낸 바와 같이 입수가능하다. 당업계의 숙련자는 입수가능한 서열 정보를 사용하여 종양 억제 유전자를 본 발명에서 실시하기에 적합한 벡터 내로 클로닝할 수 있다.

p53과 RB 종양 억제 물질이 본 발명의 방법에 사용하기에 특히 바람직하다. 각각의 종양 억제 단백질의 발현 또는 유전자 요법의 응용에 적합한 벡터 내로 p53과 RB를 클로닝하는 방법은 당업계의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 이와 같이 p53의 클로닝 및 용도는 Wills의 상기 문헌 (1994); 미국 특허 제5,532,220호, 함께 계류 중인 1994년 10월 25일에 출원된 USSN 08/328,673호, 및 WO 95/11984호에 상세하게 기술되어 있다. 전형적으로 발현 카세트는 프로모터, 더 바람직하게는 강한 프로모터 (예를 들어 Ad2 주요 후기 프로모터 (Ad2 MLP)), 또는 사람 사이토메갈로바이러스 (CMV) 즉시 초기 (immediate early) 유전자 프로모터)에 작동가능하게 결합된 종양 억제 cDNA로 작제하였다. 특히 바람직한 실시태양에 따르면 이 프로모터 뒤에는 세부분으로 이루어진 리더 cDNA가 위치하고 종양 억제 cDNA 뒤에는 폴리아데닐화 부위 (예를 들어 E1b 폴리아데닐화 부위)가 위치한다 (예를 들어 함께 계류중인 USSN 08/328,673호, WO 95/11984 및 Wills의 상기 문헌 (1994) 참조). 여러 조직 특이성 프로모터도 적합하다는 것이 이해될 것이다. 따라서 예를 들어 티로시나제 프로모터를 흑색종에 대한 발현을 표적화하는데 사용할 수 있다 (예를 들어 Siders의 문헌 [Cancer Res. 56: 5638-5646 (1996)] 참조). 특히 바람직한 실시태양에 있어서 종양 억제 cDNA를 하기 유전자 요법에 적절한 벡터 내에서 발현시킨다.

2. 종양 억제 단백질의 제조

a) 드 노보 (De novo) 화학 합성

종양 억제 폴리펩티드의 공지된 서열을 사용하여 표준 화학적 펩티드 합성 기술을 사용, 종양 억제 단백질 또는 그의 부분서열을 합성할 수 있다. 원하는 부분서열이 비교적 짧을 경우 (예를 들어 특정 항원성 결정 인자를 원할 경우) 이 분자는 단일 연속 폴리펩티드로 합성할 수 있다. 더 큰 분자를 원할 경우 부분서열을 개별적으로 (하나 이상의 단위) 합성하고 이어서 한 분자의 아미노 말단과 다른 분자의 카르복실 말단을 축합하여 융합시킴으로써 펩티드 결합을 형성시킬 수 있다.

서열의 C-말단 아미노산을 불용성 지지체에 부착시키는 고상 합성에 이어 서열의 나머지 아미노산을 연속적으로 첨가하는 것이 본 발명의 폴리펩티드의 화학적 합성에 있어서 바람직한 방법이다. 고상 합성 기술은 Barany 및 Merrifield의 문헌 [Solid-Phase Peptide Synthesis, 3 내지 284페이지 in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology 제2권; Special Methods in Peptide Synthesis, Part a.], Merrifield 등의 문헌 [J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963)] 및 Stewart 등의 문헌 [Solid Phase Peptide Synthesis, 제2판, Pierce Chem. Co., Rockford, III (1984)]에 기술되어 있다.

b) 재조합 발현

바람직한 실시태양에 따르면 종양 억제 단백질 또는 그의 부분 서열을 재조합 DNA 방법을 사용하여 합성한다. 일반적으로 이러한 방법은 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 만들고 이 DNA를 특정 프로모터의 조절 하의 발현 카세트 내에 두고 숙주 내에서 단백질을 발현하고 발현 단백질을 단리시키고 필요할 경우 이 단백질을 환원시키는 것을 포함한다.

종양 억제 핵산을 특정 벡터에 클로닝하는 방법은 상기에 기술되어 있다. 이어서 종양 억제 단백질 또는 단백질 부분 서열을 코딩하는 핵산 서열을 이. 콜라이, 기타 박테리아 숙주, 효모, 및 여러 고등 진핵 세포, 예를 들어 COS, CHO 및 HeLa 세포주와 골수종 세포주 등의 다양한 숙주 세포에서 발현시킬 수 있다. 종양 억제 단백질은 통상 진핵 세포에서 발견되므로 진핵 세포 숙주가 바람직하다. 재조합 단백질 유전자를 각각의 숙주에 있어서 적합한 발현 조절 서열에 작동가능하게 결합시킨다. 이. 콜라이의 경우 이것은 프로모터, 예를 들어 T7, trp, 또는 람다 프로모터, 리보좀 결합 부위 및 바람직하게는 전사 종결 신호를 포함한다. 진핵 세포의 경우 조절 서열은 프로모터 및 바람직하게는 면역글로불린 유전자, SV40, 사이토메갈로바이러스 등으로부터 유래한 인핸서, 및 폴리아데닐화 서열을 포함할 것이고 스플라이스 공여 서열 및 수용 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 플라스미드는 이. 콜라이의 경우 염화칼슘 형질 전환법, 그리고 포유동물 세포의 경우 인산칼슘 처리법 또는 전기천공법 등의 잘 알려진 방법으로 선택된 숙주 세포 내로 이송할 수 있다. 플라스미드로 형질전환시킨 세포는 플라스미드 상에 포함된 유전자, 예를 들어 amp, gpt, neo 및 hyg 유전자에 의해 부여되는 항생제에 대한 내성으로 선발할 수 있다.

재조합 종양 억제 단백질은 일단 발현되면 황산암모늄 침전법, 친화 칼럼, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동법 등의 당업계의 표준 방법에 따라 정제할 수 있다 (일반적으로 R. Scopes의 문헌 [Protein Purification, Springer-Verlag, 미국 뉴욕 (1982); Deutcher의 문헌 [Methods in Enzymology, 182권: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. 미국 뉴욕 (1990)] 참조). 실질적으로 약 90 내지 95％ 이상의 동질성을 가지는 순수 조성물이 바람직하며 98 내지 99％ 이상의 동질성이 가장 바람직하다. 폴리펩티드는 부분적으로 또는 원하는 만큼의 동질성으로 일단 정제한 후 예를 들어 항체 제조를 위한 면역원으로 사용할 수 있다.

당업계의 숙련자는 종양 억제 단백질(들)이 화학적 합성, 생물학적 발현, 또는 정제 후에 구성 폴리펩티드의 천연 구조와 실질적으로 다른 구조를 보유할 수 있다는 것을 알 것이다. 이러한 경우 폴리펩티드를 변성시키고 환원시킨 후 폴리펩티드를 바람직한 구조로 재폴딩시키는 것이 필요할 수 있다. 단백질을 환원시키고 변성시키며 재폴딩을 유도하는 방법은 당업계의 숙련자에게 잘 알려져 있다 (Debinski (1993) J. Biol. Chem. 268: 14065-14070; Kreitman (1993) Bioconjug. Chem. 4: 581-585; 및 Buchner (1992) Anal. Biochem. 205: 263-270 참조). 예를 들어 Debinski (1993)의 상기 문헌에는 구아니딘-DTE 중에서 봉입체 단백질을 변성시키고 환원시키는 것이 기술되어 있다. 이어서 이 단백질을 산화 글루타티온과 L-아르기닌을 함유하는 산화 환원 완충제 중에서 재폴딩시킨다.

숙련자라면 본 명세서에 기술된 아미노산 및 폴리펩티드의 여러 보존적 변형에 의해 기능적으로 동일한 생성물이 만들어진다는 것을 알 것이다. 예를 들어 유전자 코드의 동의성에 의하면 "사일런트 (silent) 치환" (즉, 코딩되는 폴리펩티드를 변화시키지 않는 핵산 서열의 치환)은 아미노산을 코딩하는 모든 핵산 서열의 내포된 특성이다. 유사하게는 아미노산 서열이 매우 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환된 하나 또는 여러개의 아미노산에서의 "보존적 아미노산 치환"도 개시된 아미노산 서열, 또는 아미노산을 코딩하는 개시된 핵산 서열과 매우 유사한 것으로 쉽게 동정된다. 이와 같이 명백하게 기재된 서열의 보존적으로 치환된 변형이 본 발명의 특징이다.

숙련자라면 종양 억제 단백질을 그의 생물학적 활성을 감소시키지 않고서 변경시킬 수 있음을 알 것이다. 몇몇은 표적 분자를 융합 단백질로 클로닝하거나 발현시키거나 또는 혼입시키는 것을 도와주기 위하여 변경시킬 수 있다. 그와 같은 변경은 당업계의 숙련자에게는 잘 알려져 있으며 예를 들어 아미노 말단에 메티오닌을 가하여 개시 부위를 제공하거나 추가의 아미노산 (예를 들어 폴리 His)을 두 말단 중 어느 하나에 위치하게 하여 편리하게 위치한 제한 효소 부위 또는 종결 코돈 또는 정제 서열을 만드는 것을 포함한다.

핵산 및 폴리펩티드에 대한 변경은 원하는 특성에 대하여 적절한 분석법으로 통상적인 스크리닝 기술을 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들어 폴리펩티드의 면역학적 특성에서의 변화는 적당한 면역학적 분석법으로 검출할 수 있다. 다른 특성, 예를 들어 표적 핵산으로의 핵산 혼성화, 단백질의 산화 환원 또는 열 안정성, 소수성, 단백질 분해에 대한 민감성, 또는 응집 경향의 변경은 모두 표준 기술에 따라 분석한다.

D) 종양 억제 물질의 표적 세포로의 이송

본 발명의 방법에 사용되는 종양 억제 물질은 단백질 또는 핵산으로서 세포로 도입할 수 있다. 종양 억제 물질을 단백질로 제공할 경우 종양 억제 유전자 발현 산물 (예를 들어 p53 또는 RB 폴리펩티드 또는 종양 억제 활성을 보유하는 그의 단편)을 단백질 이송의 표준 방법을 사용하여 표적 세포에 이송시킨다 (하기에서 논의되는 것을 참조하기 바람). 별법으로 종양 억제 물질이 종양 억제 핵산 (예를 들어 유전자, cDNA, mRNA 등)일 경우 이 핵산은 핵산을 세포에 이송시키는 통상적인 방법을 사용하여 세포 내로 도입시킨다. 이 방법은 전형적으로 하기하는 바와 같은 생체내(in vivo) 또는 생체외 (ex vivo) 유전자 요법의 이송 방법을 포함한다. 특히 바람직한 p53 또는 RB의 이송 방법은 지질 또는 리포좀 이송 및(또는) 레트로바이러스 또는 아데노바이러스 벡터를 사용하는 것을 포함한다.

1. 생체내 유전자 요법

더 바람직한 실시태양에서 종양 억제 핵산 (예를 들어 종양 억제 단백질을 코딩하는 cDNA(들))을 시험관내 및(또는) 생체내에서 세포 (예를 들어 사람 또는 기타 포유동물 세포)를 형질감염시킬 수 있는 유전자 요법을 위한 벡터 내로 클로닝시킨다.

생체내, 생체외 및 시험관내에서 핵산을 세포 내로 도입시키는 여러가지 접근법이 사용되었다. 이러한 것으로는 지질 또는 리포좀을 기재로 하는 유전자 이송법 (WO 96/18372; WO 93/24640; Mannino (1988) BioTechniques 6(7): 682-691; Rose의 미국 특허 제5,279,833호; WO 91/06309; 및 Felgner (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414) 및 레트로바이러스 게놈의 일부로 치료적 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 복제 결함 레트로바이러스 벡터가 있다 (예를 들어 Miller (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 4239 (1990); Kolberg (1992) J. NIH Res. 4: 43, 및 Cornetta (1991) Hum. Gene Ther. 2: 215 참조).

유전자 요법 방법을 검토하기 위하여 문헌 [Zhang (1996) Cancer Metastasis Rev. 15: 385-401; Anderson, Science (1992) 256: 808-813; Nabel (1993) TIBTECH 11: 211-217; Mitani (1993) TIBTECH 11: 162-166; Mulligan (1993) Science, 926-932; Dillon (1993) TIBTECH 11: 167-175; Miller (1992) Nature 357: 455-460; Van Brunt (1988) Biotechnology 6(10): 1149-1154; Vigne (1995) Restorative Neurology and Neuroscience 8: 35-36; Kremer (1995) British Medical Bulletin 51(1) 31-44; Haddada (1995) in Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler 및 Bohm (편집) Springer-Verlag, 독일 하이델베르크 소재; 및 Yu (1994) Gene Therapy, 1: 13-26]을 참조하기 바란다.

본 발명의 실시에 유용한 벡터는 일반적으로 바이러스 게놈으로부터 유래한 것이다. 사용될 수 있는 벡터로는 재조합적으로 변형된 외피를 갖거나 외피를 갖지 않는 DNA 및 RNA 바이러스, 바람직하게는 배큘로바이러스과, 파르보바이러스과, 피코르노바이러스과, 헤르페스바이러스과, 폭스바이러스과, 아데노바이러스과 또는 피코르나바이러스과로부터 선택된 것을 들 수 있다. 각각의 부모 벡터 특성의 유리한 수단을 이용하는 키메라 벡터도 사용할 수 있다 (예를 들어 Feng (1997) Nature Biotechnology 15: 866-870 참조). 상기 바이러스 게놈은 재조합 DNA 기술로 변경시켜 종양 억제 유전자를 포함하도록 할 수 있으며 복제 결함, 조건부 복제 또는 복제 능력이 있도록 조작될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시에 있어서 벡터는 복제에 결함이 있거나 조건부로 복제하는 것이다. 바람직한 벡터는 아데노바이러스, 아데노계 바이러스 및 레트로바이러스 게놈으로부터 유래한 것이다. 본 발명의 가장 바람직한 실시에 있어서 벡터는 사람 아데노바이러스 게놈으로부터 유래한 복제 능력이 없는 벡터이다.

조건부로 복제하는 바이러스 벡터를 사용하여 광범위한 스펙트럼의 감염은 피하는 반면 특정 세포형에서 선택적으로 발현하게 한다. 조건부로 복제하는 벡터의 예는 문헌 [Bischoff 등, Science 274: 373-376 (1996); Pennisi, E. (1996) Science 274: 342-343; Russell, S. J. (1994) Eur. J. of Cancer 30A(8): 1165-1171]에 기재되어 있다. 추가로 특정 조건 하에서만 트랜스유전자를 복제하거나 발현하는 유도성 프로모터를 포함하도록 바이러스 게놈을 변경시킬 수 있다. 유도성 프로모터의 예는 과학 문헌에 공지되어 있다 (예를 들어 Yoshida 및 Hamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230: 426-430; Iida 등 (1996) J. Virol. 70(9): 6054-6059; Hwang 등 (1997) J. Virol 71(9): 7128-7131; Lee 등 (1997) Mol. Cell. Biol. 17(9): 5097-5105; 및 Dreher 등 (1997) J. Biol. Chem 272 (46): 29364-29371 참조). 트랜스유전자는 특정 세포형에서만 트랜스유전자를 발현되게 하는 조직 특이성 프로모터 영역의 조절 하에 있을 수도 있다.

널리 사용되는 레트로바이러스 벡터로는 쥐과 백혈병 바이러스 (MuLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스 (GaLV), 유인원 면역결핍 바이러스 (SIV), 사람 면역결핍 바이러스 (HIV), 및 이들의 조합체를 기재로 하는 것을 들 수 있다 (예를 들어 Buchscher (1992) J. Virol. 66(5) 2731-2739; Johann (1992) J. Virol. 66(5): 1635-1640 (1992); Sommerfelt (1990) Virol. 176: 58-59; Wilson (1989) J. Virol. 63: 2374-2378; Miller (1991) J. Virol. 65: 2220-2224; Wong-Staal 등의 PCT/US94/05700; 및 Rosenburg 및 Fauci (1993) in Fundamental Immunology, 제3판, Paul 편집, Raven Press, Ltd., 뉴욕 및 이들 문헌의 참조문헌과 Yu (1994)의 상기 문헌을 참조하기 바람). 벡터는 벡터에 상응하는 레트로바이러스에 의해 감염되지 않는 세포까지 벡터의 숙주 범위를 확장시키기 위하여 필요에 따라 위형화(pseudotyping)한다. 소포성 구내염 바이러스 외피 당단백질(VSV-G)를 사용하여 조혈줄기세포를 감염시킬 수 있는 VSV-G-위형 HIV 벡터를 작제하였다 (Naldini 등 (1996) Science 272: 263, 및 Akkina (1996) J Virol 70: 2581).

아데노계 바이러스 (AAV)를 기재로 하는 벡터도 예를 들어 핵산 및 단백질의 시험관내 생산, 및 생체내와 생체외 유전자 치료 방법에서 표적 핵산을 세포에 형질도입하는데 사용된다. AAV 벡터를 개략적으로 살펴보기 위해서는 문헌 [Okada (1996) Gene Ther. 3: 957-964; West (1987) Virology 160: 38-47; Carter (1989) 미국 특허 제4,797,368호; Carter 등의 WO 93/24641 (1993); Kotin (1994) Human Gene Therapy 5: 793-801; Muzyczka (1994) J. Clin. Invst. 94: 1351]를 참조하기 바란다. 재조합 AAV 벡터의 작제는 문헌 [Lebkowski의 미국 특허 제5,173,414호; Tratschin (1985) Mol. Cell. Biol. 5(11): 3251-3260; Tratschin (1984) Mol. Cell. Biol. 4: 2072-2081; Hermonat (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6466-6470; McLaughlin (1988) 및 Samulski (1989) J. Virol., 63: 03822-3828] 등의 다수의 간행물에 기재되어 있다. rAAV에 의해 형질전환될 수 있는 세포주로는 Lebkowski의 문헌 [Mol. Cell. Biol., 8: 3988-3996 (1988)]에 기재된 것을 들 수 있다. 기타 적당한 바이러스 벡터로는 헤르페스 바이러스 및 백시니아 바이러스를 들 수 있다.

특히 바람직한 실시태양에 있어서, 종양 억제 유전자는 유전자 치료에 적당한 아데노바이러스 벡터에서 발현시킨다. 아데노바이러스 벡터를 생체내에서, 그리고 유전자 치료에 사용하는 것은 특허 및 과학 문헌에 잘 기술되어 있다 (예를 들어 문헌 [Hermens (1997) J. Neurosci. Methods., 1월, 71(1): 85-98; Zeiger (1996) Surgery 120: 921-925; Channon (1996) Cardiovasc Res. 32: 962-972; Huang (1996) Gene Ther. 3: 980-987; Zepeda (1996) Gene Ther. 3: 973-979; Yang (1996) Hum. Mol. Genet. 5: 1703-1712; Caruso (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11302-11306; Rothmann (1996) Gene Ther. 3: 919-926; Haecker (1996) Hum. Gene Ther. 7: 1907-1914] 참조). 아데노바이러스 벡터의 용도는 WO 96/25507에 상세하게 기술되어 있다. 특히 바람직한 아데노바이러스 벡터는 Wills의 상기 문헌 (1994); 함께 계류중인 USSN 08/328,673, 및 WO 95/11984에 기술되어 있다.

특히 바람직한 아데노바이러스 벡터는 단백질 IX 유전자의 일부 또는 모두가 결손된 것을 포함한다. 한 실시태양에 있어서, 아데노바이러스 벡터는 E1a 및(또는) E1b 서열의 결손을 포함한다. 가장 바람직한 실시태양에 있어서, 아데노바이러스 작제물은 p53 코딩 작제물, 예를 들어 A/C/N/53 또는 A/M/N/53이다 (예를 들어 USSN 08/328,673, 및 WO 95/11984 참조).

또한 바람직한 벡터는 사람 아데노바이러스 2형 또는 5형으로부터 유래한 것이다. 이러한 벡터는 바람직하게는 E1a 및(또는) E1b 코딩 영역이 변경되거나 결손되어 복제 결함이 있는 것이다. 특정 발현 특성을 성취하거나 반복 투여 또는 더 낮은 면역 응답을 가능하게 하기 위하여 바이러스 게놈을 변경시킨 다른 것도 바람직하다. 더 바람직한 것은 E4 코딩 영역이 완전히 또는 부분적으로 결손되고, 필요에 따라 E4 ORF6 및 ORF 6/7은 보유하는 재조합 아데노바이러스 벡터이다. E3 코딩 서열은 결손될 수 있지만 바람직하게는 보유된다. 특히 E3의 프로모터 오퍼레이터 영역을 변경시켜 E3의 발현량을 증가시켜 치료적 벡터의 더 유리한 면역학적 프로파일을 성취하는 것이 바람직하다. 가장 바람직한 것은 시토메갈로바이러스 프로모터 영역의 조절 하에 있는 p53을 코딩하는 DNA 서열 및 CMV 프로모터의 조절 하에 있는 E3을 갖는 세부분으로 이루어진 리더 서열을 포함하고 E4 코딩 영역은 결손된 반면 E4 ORF6과 ORF6/7은 보유하는 사람 아데노바이러스 5형 벡터이다. 본 명세서에 예시되어 있는 본 발명의 가장 바람직한 실시에서 벡터는 ACN53이다.

특히 바람직한 실시태양에 있어서 종양 억제 유전자는 p53 또는 RB이다. 상기에서 설명된 바와 같이 p53의 클로닝 및 용도는 Wills의 상기 문헌 (1994); 함께 계류중인, 1994년 10월 25일에 출원된 USSN 08/328,673, 및 WO 95/11984에 상세하게 기술되어 있다.

2. 생체외 유전자 요법

한 실시태양에 있어서 본 발명의 방법을 사용하여 대상자 (예를 들어 쥐, 쥐과, 소과, 돼지, 말, 개, 고양이, 라르고모프 (largomorph) 또는 사람 등의 포유동물) 내에서 과다증식성 (예를 들어 신생) 세포를 억제한다. 병리학적 과다증식성 세포는 그레이브병, 건선, 양성 전립선 비대증, 리-프라우메니 증후군, 유방암, 육종, 방광암, 결장암, 폐암, 여러 백혈병 및 림프종과 기타 종양을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 질환 상태의 특징이다.

특히 본 발명의 방법의 생체외 응용은 병리학적 과다증식성 세포의 적당한 시료를 고갈시키는 수단을 제공한다. 따라서 골수 재구성 동안 예를 들어 조혈 전구체를 오염시키는 과다증식성 세포를 본 발명의 방법의 생체외 적용으로 제거할 수 있다. 일반적으로 그러한 방법은 대상 유기체로부터 시료를 얻는 것을 포함한다. 일반적으로 이 시료는 표현형이 정상이거나 병원성인 (과다증식성) 세포 모두를 포함하는 이종성 세포 제제이다. 시료를 본 발명의 방법에 따른 종양 억제 핵산 또는 단백질 및 보조 항암제와 접촉시킨다. 종양 억제 유전자는 예를 들어 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터에 이송할 수 있다. 이러한 처리는 병원성 세포의 증식을 감소시켜 정상 세포 대 병원성 세포의 비가 큰 시료를 제공하는데, 이것은 대상 유기체 내로 재도입할 수 있다.

진단용, 연구용 또는 유전자 치료를 위한 생체외 세포 형질전환 (예를 들어 숙주 유기체 내로의 형질 전환 세포의 재주입을 통하여)은 당업계의 숙련자에게는 잘 알려져 있다. 바람직한 실시태양에 따르면 세포를 대상 유기체로부터 단리하고 본 발명의 종양 억제 유전자 또는 cDNA로 형질감염시키고 대상 유기체 (예를 들어 환자) 내로 다시 재주입한다. 생체외 형질 전환에 적당한 여러 세포형은 당업계의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 특히 바람직한 세포는 프로제니터 (progenitor) 세포 또는 줄기세포이다 (예를 들어 문헌 [Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 제3판, 미국 뉴욕 소재의 Wiley-Liss] 및 환자로부터의 세포를 단리 및 배양하는 방법에 관한 논의를 위하여 상기 문헌에 인용된 참조문헌을 참조하기 바람). 형질전환된 세포는 당업계에 잘 알려진 방법으로 배양한다. 문헌 [Kuchler (1977) Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Kuchler, R.J., Dowden, Hutchinson and Ross, Inc., 및 Atlas (1993) CRC Handbook of Microbiological Media (Parks 편집), CRC press, Boca Raton, Fl]을 참조하기 바란다. 포유동물 세포 시스템은 포유동물 세포 현탁물도 사용하지만 종종 세포의 단일층 형태이다. 다르게는 세포는 세포 은행 (예를 들어 혈액 은행)에 보관된 것으로부터 유래될 수 있다. 포유동물 세포주의 예시적인 예로는 HEC-1-B 세포주, VERO 및 HeLa 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주, W138, BHK, Cos-7 또는 MDCK 세포주가 있다 (예를 들어 Freshney의 상기 문헌 참조).

특히 바람직한 한 실시태양에 있어서, 세포 형질 전환 및 유전자 치료를 위하여 줄기세포를 생체외 방법에 사용한다. 줄기세포를 사용할 경우의 잇점은 줄기세포가 생체외에서 다른 세포형으로 분화되거나 포유동물 (예를 들어 세포의 공여체) 내로 도입되어 골수에 융합될 수 있다는 것이다. 사이토카인, 예를 들어 GM-CSF, INF-감마 및 TNF-알파를 사용하여 줄기세포 (예를 들어 CD34⁺)를 시험관내에서 임상적으로 중요한 면역 세포형으로 분화시키는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어 문헌 [Inaba (1992) J. Exp. Med. 176: 1693-1702; Szabolcs (1995) 154: 5851-5861]을 참조하기 바람).

줄기세포를 사용하는 대신 T 세포나 B 세포도 생체외 방법에서의 몇몇 실시태양에서 사용한다. T 세포 및 B 세포를 단리시키는 여러 기술이 공지되어 있다. 표면 마커의 발현은 상기 세포의 동정 및 정제를 돕는다. 세포의 동정 및 단리 방법으로는 FACS, 특정 세포형과 결합하는 항체가 고정된 플라스크에서의 인큐베이션 및 자성 비드로 가려내는 것이 있다.

줄기세포는 공지된 방법을 사용하여 형질도입 및 분화를 위하여 단리한다. 예를 들어 생쥐에서 골수 세포는 생쥐를 희생시키고 다리 뼈를 가위로 절단하여 단리한다. 줄기세포는 원하지 않는 세포, 예를 들어 CD4⁺ 및 CD8⁺ (T 세포), CD45⁺ (panB 세포), GR-1 (과립구), 및 Ia^d (분화된 항원 제시 세포)에 결합하는 항체를 사용하여 골수 세포를 가려냄으로써 골수 세포로부터 단리한다. 이 프로토콜의 예로 Inaba (1992)의 상기 문헌을 참조하기 바란다.

사람에 있어서, 장골 크레스트 (crest)로부터 골수 세포를 흡출하는 것은 예를 들어 수술실에서 일반적인 마취 하에 수행한다. 골수 흡출량은 약 1000 ml이며 후부 장골 뼈 및 크레스트로부터 수집한다. 수집된 세포의 총수가 약 2 x 10 ⁸개/kg 미만일 경우 후부 크레스트 뿐만 아니라 흉골 및 전방부 장골 크레스트를 이용하여 두번째 흡출을 수행한다. 작업 동안 흡출로 얻어지는 골수의 부피를 대신하기 위하여 조사된 패킹 적혈구 세포를 투여한다. 사람 조혈 프로제니터 세포 및 줄기세포의 특징은 CD34 표면 막 항원이 있다는 것이다. 이 항원은 예를 들어 CD34에 결합하는 친화성 칼럼에서의 정제에 사용된다. 골수를 수확한 후 피콜 구배 원심분리법으로 단핵 세포를 다른 성분으로부터 분리한다. 이것은 세포 분리기 (예를 들어 Baxter Fenwal CS3000+ 또는 Terumo 기계)를 사용하여 반자동법으로 수행할 수 있다. 주로 단핵 세포로 이루어진 밀도가 가벼운 세포를 수집하고 이 세포를 플라스틱 플라스크에서 약 37℃에서 약 1.5시간 동안 배양한다. 부착성 세포 (단핵 세포, 마크로파지 및 B 세포)를 버린다. 이어서 비부착성 세포를 수집하고 모노클로날 항-CD34 항체 (예를 들어 쥐과 항체 9C5)와 함께 온화하게 회전시키면서 4℃에서 30분 동안 배양한다. 항 CD34 항체의 최종 농도는 바람직하게는 약 10 μg/ml이다. 2회 세척한 후 양 항-생쥐 IgG (Fc) 항체가 코팅된 상자성 미세구 (예를 들어 Dyna 비드, Baxter Immunotherapy Group이 공급, 미국 캘리포니아주 산타 아나 소재)를 약 2개의 세포/비드의 비로 세포 현탁액에 첨가한다. 4℃에서 추가로 약 30분 동안 인큐베이션한후 자성 비드로 로제트화된 세포를 자석으로 수집한다. 키모파파인 (미국 캘리포니아 산타 아나 소재의 Baxter Immunotherapy Group 제품)을 200 U/ml의 최종 농도로 첨가하여 CD34+ 세포로부터 비드가 떨어지게 할 수 있다.

별법으로, 그리고 바람직하게는 CD34, 또는 CD34에 결합된 항체에 결합하는 친화성 칼럼을 사용한 단리 방법을 사용할 수 있다 (예를 들어 문헌 [Ho (1995) Stem Cells 13 (suppl. 3): 100-105 및 Brenner (1993) Journal of Hematotherapy 2: 7-17]을 참조하기 바람).

다른 실시태양에 따르면 조혈줄기세포를 태아 제대혈액으로부터 단리할 수 있다. Yu의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92: 699-703 (1995)]에는 레트로바이러스 벡터를 사용하여 사람 태아 제대혈액으로부터의 CD34⁺를 형질도입시키는 바람직한 방법이 기술되어 있다.

3. 종양 억제 물질을 발현하는 핵산의 투여: 벡터 및 발현 카세트

투여 경로

본 발명의 종양 억제 물질을 발현하는 치료적 핵산을 포함하는 발현 카세트 및 벡터 (예를 들어 레트로바이러스, 아데노바이러스, 리포좀 등)을 생체내에서 세포의 형질도입을 위하여 유기체에 직접 투여할 수 있다. 투여는 분자를 혈액 또는 조직 세포와 최종적으로 접촉되게 도입하는 데 정상적으로 사용되는 경로, 예를 들어 보조 항암제의 투여에 대하여 상기 문헌에 상세하게 논의된 바와 같이 전신적 투여, 국부적 투여, 또는 국소적 투여 경로 중 임의의 경로를 사용하여 수행한다. "일괄 (packaged)" 핵산 (최소한으로는 프로모터를 포함하는 종양 억제 코딩 서열)을 임의의 적당한 방식으로, 바람직하게는 상기 문헌에서도 논의된 바와 같이 제약적으로 허용가능한 담체와 함께 투여한다. 이와 같은 일괄 핵산의 적당한 투여 방법은 당업계의 숙련자가 사용할 수 있으며 당업계의 숙련자에게 잘 알려져 있고, 하나 이상의 경로를 특정 조성물의 투여에 이용할 수 있다 하더라도 종종 특정 경로가 다른 경로에 비해 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다.

예를 들어 종양 억제 유전자를 발현하도록 공학적으로 조작된 재조합 아데노바이러스 벡터를 투여하면 아데노바이러스 벡터에 대한 면역 응답, 구체적으로는 항체 응답을 야기할 수 있다. 몇몇 환자는 이미 존재하는 항아데노바이러스 반응 항체를 보유할 수 있다. 따라서 몇몇 환경에서는 종양 억제 물질을 발현하는 아데노바이러스 벡터를 전신 투여하는 것보다 국부적 또는 국소적으로 투여하는 것이 최적이며 가장 효과적이다. 예를 들어 하기에서 논의되는 바와 같이 복강에 한정되는 난소암은 국부적 p53 유전자 치료, 예를 들어 복막내 (IP) 투여가 바람직한 치료 방법으로 생각되어야 하는 한 임상 시나리오이다. 재조합 아데노바이러스의 IP 투여에 의해서도 아데노바이러스 벡터가 복막 내층에 감염 흡수되어 전신 순환계로 들어간다 (기타 국부적 투여 방법에 의해서도 아데노바이러스 벡터가 도입되어 전신 순환계로 들어갈 수 있음). 이러한 효과의 정도는 IP로 투여되는 바이러스 입자의 농도 및(또는) 총량에 따라 달라질 수 있다. 전신적 효과를 원한다면 여러 연속일에 걸쳐 고농도를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.본 발명의 종양 억제 물질 발현 아데노바이러스 벡터의 국소적 투여도 몇몇 경우, 예를 들어 환자가 이미 존재하는 항아데노바이러스 반응성 항체를 보유할 경우 바람직하다. 이와 같은 "국소적 투여"는 예를 들어 만약 내복용이라면 종양내 주사로, 또는 외용이라면 점막 도포에 의한 것일 수 있다. 다르게는 "국소적 투여" 효과는 예를 들어 리포좀 상의, 또는 아데노바이러스 그 자체의 종양 특이성 항원 인지 시약 (예를 들어 항체)를 사용하여 종양에 아데노바이러스 벡터를 표적화함으로써 초래될 수 있다.

제제

제약적으로 허용가능한 담체는 투여되는 특정 조성물, 및 이 조성물을 투여하는 데 사용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서 본 발명의 제약 조성물의 적당한, 광범위한 제제가 존재한다.

종양 억제 물질 발현 핵산을 함유하는 제약 조성물의 경구 투여에 적합한 제제는 (a) 액상 용액, 예를 들어 희석제 (예를 들어 물, 염수 또는 PEG 400)에 현탁된 유효량의 일괄 핵산; (b) 각각 소정량의 활성 성분을 액체, 고체, 과립 또는 젤라틴으로 포함하는 캡슐제, 사세제 또는 정제; (c) 적당한 액체 중의 현탁액; 및 (d) 적당한 에멀젼으로 이루어질 수 있다. 정제 제형은 하나 이상의 락토스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 인산칼슘, 옥수수 전분, 감자 전분, 트래거캔쓰, 미정질 셀룰로스, 아라비아 고무, 젤라틴, 콜로이드성 이산화규소, 크로스카르벨로스 나트륨, 활석, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 및 기타 부형제, 착색제, 충전제, 결합제, 희석제, 완충제, 습윤제, 방부제, 향미제, 염료, 붕해제, 및 제약적으로 사용될 수 있는 담체를 포함할 수 있다. 로젠지 제형은 향미제, 보통 수크로스 및 아라비아검 또는 트래거캔쓰 중의 활성 성분을 함유할 수 있으며 파스틸제는 활성 성분 뿐만 아니라 당업계에 공지된 담체도 함유하는 불활성 기재 (예를 들어 젤라틴 및 글리세린 또는 수크로스 및 아라비아 검 에멀젼, 겔 등) 중 활성 성분을 함유할 수 있다.

일괄 핵산은 단독으로 또는 다른 적당한 성분과 조합되어 흡입 투여되는 (즉, 분무될 수 있는) 에어로졸 제제로 제조될 수 있다. 에어로졸 제제는 가압 가능한 추진체 (예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등)로 제형화될 수 있다.

직장 투여에 적합한 제제로는 예를 들어 좌약 기재의 일괄 핵산으로 이루어진 좌약제가 있다. 적당한 좌약 기재는 천연 또는 합성 트리글리세라이드 또는 파라핀 탄화수소를 포함한다. 또한 일괄 핵산과 기재, 예를 들어 액상 트리글리세라이드, 폴리에틸렌 글리콜, 및 파라핀 탄화수소의 조합물로 이루어진 직장용 젤라틴 캡슐을 사용할 수 있다.

비경구 투여 (예를 들어 관절내, 정맥내, 근육내, 피내, 복강내 및 피하 경로)에 적합한 제제로는 산화방지제, 완충제, 박테리아 억제제, 및 의도된 수용체의 혈액과 이 제제가 등장성이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 등장성의 수성 및 비수성 살균 주사 용액과, 현탁제, 용해제, 증점제, 안정제, 및 방부제를 함유할 수 있는 수성 및 비수성 살균 현탁액이 있다. 본 발명의 실시에서 조성물은 예를 들어 정맥내 주입, 경구 투여, 국소 투여, 복강내 투여, 방광내 투여 또는 척수강내 투여로 투여할 수 있다. 일괄 핵산 제제는 단위 투여형 또는 다회투여형의 밀봉된 용기, 예를 들어 앰플 및 바이알로 제공될 수 있다.

주사 용액 및 현탁액으로서의 본 발명의 제제는 상기한 류의 살균 분말, 과립, 및 정제로부터 제조할 수 있다. 본 제제의 정확한 조성, 제제 중의 시약 및 핵산의 농도, pH, 완충제, 및 기타 파라미터는 투여 양식 및 투여 부위 (예를 들어 전신 투여, 국부적 투여 또는 국소적 투여)와, 관련된 특정 제약 조성물의 보관, 취급, 운반 및 저장 수명에 대한 요구 조건에 따라 달라진다. 본 제제의 특정 요구 조건에 따른 이들 파라미터의 최적화는 통상적인 방법으로 행할 수 있으며 공지된 주사가능한 제제의 임의의 성분 및 파라미터를 사용할 수 있다. 적당한 제제의 한 예는 일반적으로 1.0 ml의 투여량에 보관된, 예를 들어 농도가 ml 당 약 7.5 x 10¹¹ 내지 7.5 x 10¹⁰개의 입자인 본 발명의 재조합 야생형 p53 발현 아데노바이러스 벡터, 0.42 mg/ml의 인산나트륨 일수화물, 2.48 mg/ml의 이인산나트륨 무수물, 염화나트륨, 5.8 mg/ml의 인산나트륨 일수화물, 20.0 mg/ml의 수크로스, 0.40 mg/ml의 염화마그네슘 육수화물이다.

생체외 치료법에서 상기 일괄 핵산으로 형질도입된 세포도 상기와 같이 정맥내 또는 비경구로 투여할 수 있다.

본 발명에 있어서, 환자에게 투여되는 투여량은 환자 내에서 일정 시간에 걸쳐 유익한 치료적 응답을 야기하기에 충분하여야 한다. 투여량은 사용되는 특정 벡터의 효능 및 치료할 환자의 상태와 체중 또는 표면적에 의해 결정될 것이다. 투여 크기도 특정 환자 내에서 특정 벡터의 투여에 수반되는 해로운 부작용의 존재 유무, 성질, 및 정도, 또는 형질도입된 세포형에 의해 결정될 것이다.

치료에 있어서 투여되는 벡터의 유효량을 결정함에 있어서, 의사는 순환 혈장에서의 벡터의 농도, 벡터 독성, 질환의 진행, 및 항벡터 항체의 생성을 평가한다. 일반적인 핵산의 투여량은 투여 경로 및 유전자 이송 시스템에 매우 의존적이다. 이송 방법에 따라 손쉽게는 투여량이 1 μg 내지 100 mg 정도의 범위일 수 있다. 일반적으로 벡터로부터의 네이키드 핵산의 투여량은 일반적으로 70 kg 환자의 경우 약 1 μg 내지 100 μg이며 바이러스 입자를 포함하는 벡터의 투여량은 치료적 핵산의 양이 되도록 계산한다.

본 발명의 형질도입된 세포는 환자의 체중 및 전체적인 건강에 따라 벡터 또는 형질도입된 세포형의 LD₅₀, 및 여러 농도에서의 벡터 또는 세포형의 부작용에 의해 결정된 비율로 투여할 수 있다. 투여는 하기하는 바와 같이 단일 또는 분할 투여량으로 행해질 수 있다.

바람직한 실시태양에 있어서, 주입 전에 혈액 시료를 얻어 분석용으로 보관한다. 펄스 산소농도계로 살아있다는 신호 및 산소 포화도를 자세히 모니터링한다. 혈액 시료는 바람직하게는 주입한지 5분 및 1시간 후에 얻어 이후의 분석용으로 보관한다. 생체외 치료법에서 백혈구 제거, 형질도입 및 재주입을 2 내지 3개월마다 반복할 수 있다. 첫번째 치료 후 임상의의 재량에 의해 주입을 외래환자에게 행할 수 있다. 주입을 외래 환자에게 행할 경우 치료 후 4시간 이상, 바람직하게는 8시간 동안 관계자를 모니터링한다.

상기한 바와 같이 아데노바이러스 작제물은 전신 투여 (예를 들어 정맥내 투여), 국부 투여 (복강내 투여) 또는 국소 투여 (예를 들어 방광암 치료를 위하여 예를 들어 종양내 또는 종양 주위, 또는 방광내 주사)로 투여할 수 있다. 특히 바람직한 투여 양식으로는 동맥내 주사, 더 바람직하게는 간동맥내 주사 (예를 들어 간암 치료를 위하여), 또는 조성물을 뇌암에 이송할 필요가 있을 경우 , 동맥의 경동맥 시스템의 경동맥 또는 동맥 (예를 들어 후두골 동맥, 심방 동맥, 측두 동맥, 대뇌 동맥, 상악골 동맥 등) 주사가 있다. 폐암 치료를 위한 이송은 예를 들어 기관지경을 사용하여 성취될 수 있다. 일반적으로 이러한 투여형은 상기한 바와 같이 약리학적으로 허용가능한 수성 완충제 중의 형태로 존재한다. 그러나 특정의 한 바람직한 실시태양에 있어서 아데노바이러스 작제물 또는 종양 억제 물질 발현 카세트는 액상 제형, 더 구체적으로는 지질/핵산 복합체로 만들기 위하여 리포좀과 복합되거나 (예를 들어 Debs 및 Zhu의 WO 93/24640 (1993); Mannino의 상기 문헌 (1988); Rose의 미국 특허 제5,279,833호; Brigham (1991)의 WO 91/06309; 및 Felgner (1987)의 상기 문헌에 기재된 것을 참조하기 바람) 리포좀, 더 바람직하게는 특정 종양 마커를 위한 면역리포좀 내에 캡슐화된 액상 제형으로 투여한다. 이와 같은 액상 제제도 국소 투여, 전신 투여로 투여하거나 에어로졸로 이송될 수도 있음을 알 것이다.

4. 증가된 종양 억제 물질 이송률

종양 억제 물질의 이송은 1종 이상의 "이송 강화제"를 사용함으로써 증가될 수 있다. "이송 강화제"는 치료 유전자, 예를 들어 종양 억제 유전자를 암 조직 또는 기관에 이송하는 것을 증강시키는 임의의 제제를 의미한다. 이러한 증강된 이송은 여러 기작에 의해 성취될 수 있다. 이러한 기작 중 하나는 기관 또는 조직 (예를 들어 방광)의 상피 표면의 보호성 글리코사미노글리칸 층을 파괴하는 것을 포함할 수 있다. 상기와 같은 이송 강화제의 예로는 세정제, 알콜, 글리콜, 계면활성제, 담즙산염, 헤파린 길항제, 시클로옥시게나제 억제제, 고장 염 용액, 및 아세테이트가 있다. 알콜로는 예를 들어 지방족 알콜, 예를 들어 에탄올, N-프로판올, 이소프로판올, 부틸 알콜, 아세틸 알콜이 있다. 글리콜로는 글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 및 기타 저분자량의 글리콜, 예를 들어 글리세롤 및 티오글리세롤이 있다. 이송 증강제의 다른 예로는 아세테이트, 예를 들어 아세트산, 글루콘올 아세테이트, 및 아세트산나트륨이 있다. 1 M NaCl 등의 고장 염 용액도 이송 증강제의 예이다. 계면활성제의 예로는 나트륨 도데실 설페이트 (SDS) 및 리소레시틴, 폴리소르베이트 80, 노닐페녹시폴리옥시에틸렌, 리소포스파티딜콜린, 폴리에틸렌글리콜 400, 폴리소르베이트 80, 폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리글리콜 에테르 계면활성제 및 DMSO가 있다. 타우로콜레이트, 나트륨 타우로-데옥시콜레이트, 데옥시콜레이트, 케노데속시콜레이트, 글리코콜산, 글리코케노데옥시콜산 등의 담즙산염과 질산은 등의 기타 수렴제를 사용할 수 있다. 프로라민 설페이트와 같은 4급 아민 등의 헤파린-길항제도 사용할 수 있다. 살리실산나트륨, 살리실산 등의 시클로옥시게나제 억제제와, 인도메타신, 나프록센, 디클로페낙 등의 비스테로이드성 항염증약 (NSAIDS)를 사용할 수 있다.

세정제로는 음이온성, 양이온성, 쯔비터이온성, 그리고 비이온성 세정제가 있다. 세정제의 예로는 타우로콜레이트, 데옥시콜레이트, 타우로데옥시콜레이트 세틸피리듐, 베날코늄 클로라이드, ZWITTERGENT (등록상표) 3-14 세정제, CHAPS (3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니올]-1-프로판술포네이트 수화물, Aldrich 제품), Big CHAP (1997년 7월 8일에 출원된 USSN 08/889,355; 및 국제 특허 출원 WO 97/25072 (1997년 7월 17일)에 기재되어 있음), 데옥시 Big CHAP (동일 문헌), Triton (등록상표) X-100 세정제, C12E8, 옥틸-B-D-글루코피라노사이드, PLURONIC (등록상표)-F68 세정제, Tween (등록상표) 20 세정제, 및 Tween 80 세정제 (CALBIOCHEM Biochemicals 제품)이 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

한 실시태양에 있어서, 이송 증강제는 재조합 아데노바이러스 벡터 이송 시스템이 제형화되는 완충제 내에 함유된다. 이송 증강제는 재조합 바이러스 투여 이전에, 또는 바이러스와 함께 투여될 수 있다. 몇몇 실시태양에 있어서, 이송 증강제는 바이러스 제제를 환자에게 투여하기 직전 이송 증강제 조성물과 혼합함으로써 바이러스와 함께 제공한다. 다른 실시태양에 있어서, 이송 증강제 및 바이러스는 투여를 위하여 환자를 돌보는 사람에게 단일 바이알로 제공된다.

이송 증강제를 더 함유하는 완충제에 제형화된 재조합 아데노바이러스 벡터 이송 시스템에 포함된 종양 억제 유전자를 함유하는 제약 조성물의 경우, 이 제약 조성물은 바람직하게는 약 5분 내지 3시간 범위, 바람직하게는 약 10분 내지 120분, 가장 바람직하게는 약 15분 내지 90분 범위의 시간에 걸쳐 투여한다. 다른 실시태양에 있어서 이송 증강제는 종양 억제 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터 이송 시스템의 투여 전에 투여할 수 있다. 종양 억제 유전자를 포함하는 아데노바이러스 벡터 이송 시스템을 투여하기 약 30초 내지 1시간 전, 바람직하게는 1분 내지 10분 전, 가장 바람직하게는 약 1분 내지 5분 전에 이송 증강제를 투여할 수 있다.

이송 증강제의 농도는 사용되는 이송 증강제, 완충제, pH, 표적 조직 또는 기관 및 투여 양식과 같은 당업계의 숙련자에게 알려진 다수의 인자에 따라 달라질 것이다. 이송 증강제의 농도는 1 내지 50％ (v/v), 바람직하게는 10 내지 40％ (v/v) 및 가장 바람직하게는 15 내지 30％ (v/v)의 범위 내이다. 바람직하게는 환자에게 투여되는 최종 제제 중의 세정제 농도는 약 0.5 내지 2배의 임계 미셀 농도 (CMC)이다. Big CHAP의 바람직한 농도는 약 2 내지 20 mM, 더 바람직하게는 약 3.5 내지 7 mM이다.

이송 증강제를 함유하는 완충제는 임의의 제약 완충제, 예를 들어 인산 완충된 염수 또는 인산나트륨/황산나트륨, 트리스 완충제, 글리신 완충제, 살균수 및 Good 등의 문헌 [Biochemistry 5: 467 (1966)]에 기술된 바와 같이 당업계의 숙련자에게 공지된 기타 완충제일 수 있다. 아데노바이러스 벡터 이송 시스템에 포함된 종양 억제 유전자를 함유하는 제약 조성물 중 완충제의 pH는 6.4 내지 8.4, 바람직하게는 7 내지 7.5, 가장 바람직하게는 7.2 내지 7.4의 범위 내일 수 있다.

재조합 아데노바이러스의 투여에 바람직한 제제는 pH가 약 6.4 내지 8.4인, 인산 완충 염수 (PBS) 중 바이러스 ml 당 약 10⁹ 내지 10¹¹개의 PN, 약 2 내지 10 mM Big CHAP 또는 약 0.1 내지 1.0 mM TRITON (등록상표)-X-100 세정제에 더하여 약 2내지 3％ 수크로스 (w/v) 및 약 1 내지 3 mM MgCl₂이다. 이송 증강제의 용도는 1997년 1월 7일에 출원된 함께 계류중인 USSN 08/779,627에 상세하게 기술되어 있다.

시판중인 Big-CHAP 제제를 함유하는 핵산 조성물의 유전자 이송을 향상시키는 것을 돕기 위하여 Big-CHAP의 농도는 시판되는 원천에 기초하여 달라질 것이다. Big CHAP를 CALBIOCHEM으로부터 구매할 경우 그의 농도는 2 내지 10 밀리몰의 범위 내인 것이 바람직하다. Big CHAP의 농도는 더 바람직하게는 4 내지 8 밀리몰, 가장 바람직하게는 약 7 밀리몰이다.

Big CHAP를 Sigma로부터 구입할 경우 그의 농도는 15 내지 35 밀리몰, 더 바람직하게는 20 내지 30 밀리몰, 가장 바람직하게는 약 2.5 밀리몰이다.

본 발명의 다른 실시태양에 따르면 하기 화학식 1의 이송 증강제가 제공된다.

상기 식 중, n은 2 내지 8의 정수이고, X₁은 콜산기 또는 데옥시콜산기이고, X₂ 및 X₃은 각각 독립적으로 콜산기, 데옥시콜산기, 및 사카라이드기로 구성된 군으로부터 선택된다. 하나 이상의 X₂ 및 X₃은 당류기이다. 사카라이드기는 펜토스 모노사카라이드기, 헥소스 모노사카라이드기, 펜토스-펜토스 디사카라이드기, 헥소스-헥소스 디사카라이드기, 펜토스-헥소스 디사카라이드기, 및 헥소스-펜토스 디사카라이드기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 한 실시태양에 있어서, 본 발명의 화합물은 하기 화학식 2를 가진다.

상기 식 중, X₁ 및 X₂는 콜산기 및 데옥시콜산기로 구성된 군으로부터 선택되며 X₃은 사카라이드기이다.

이들 화합물은 본 발명의 제제 중에서 약 0.002 내지 2 mg/ml, 더 바람직하게는 약 0.02 내지 2 mg/ml, 가장 바람직하게는 약 0.2 내지 2 mg/ml의 범위로 사용하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 약 2 mg/ml이다.

인산 완충 염수 (PBS)는 상기 화합물의 바람직한 용해제이다. 그러나 당업계의 숙련자는 추가로 특정 부형제 및 첨가제가 여러 제약 조성물에 있어서 이들 제제의 용해성을 성취하는 데 바람직할 수 있음을 알 것이다. 예를 들어 잘 알려진 용해제, 예를 들어 세정제, 지방산 에스테르, 계면활성제를 적당한 농도로 첨가하여 사용되는 여러 용제 중에서의 화합물의 용해를 도울 수 있다. 용제가 PBS일 경우 바람직한 용해제는 약 0.15％ 농도의 Tween 80이다.

5. 종양 억제 단백질의 투여

종양 억제 단백질 (폴리펩티드)는 주입법으로 종양 부위에 직접 이송하거나 상기와 같이 전신 투여할 수 있다. 바람직한 실시태양에 따르면 종양 억제 단백질을 제약적으로 허용가능한 담체 (부형제)와 조합하여 상기한 바와 같이 약리학적 조성물을 제조한다. 종양 억제 폴리펩티드는 치료적 유효량으로 투여한다. 따라서 본 조성물은 질병 및(또는) 그의 합병증을 치료하거나 적어도 부분적으로 중단시키기에 충분한 양으로 투여한다. 이러한 용도에서의 유효량은 질환의 심각성 및 환자 건강의 종합적인 상태에 따라 달라진다.

종양 억제 폴리펩티드를 경구로 투여할 경우 이 폴리펩티드가 소화되는 것을 보호해야 한다는 것을 알 것이다. 이것은 일반적으로 폴리펩티드를 조성물과 복합시켜 산에 의한 가수분해 및 효소에 의한 가수분해에 견디도록 하거나 폴리펩티드를 적당한 내성을 가지는 담체, 예를 들어 상기한 리포좀 내에 포장함으로써 성취된다. 경구 이송에서 폴리펩티드를 보호하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어 치료제의 경구 이송을 위한 지질 조성물이 개지되어 있는 미국 특허 제5,391,377호 참조).

III. 조합 제약

종양 억제제 및 보조 항암제는 개별적으로 보조 항암제 전에 투여하고자 하는 종양 억제제 핵산 또는 폴리펩티드를 투여하거나 (종양 억제제 전처리) 종양 억제제 핵산 및(또는) 폴리펩티드 전에 투여하고자 하는 보조 항암제를 투여할 수 있다 (암 약물 전처리). 물론 종양 억제제 핵산 및(또는) 폴리펩티드 및 보조 항암제는 동시에 투여될 수도 있다.

하나의 실시태양에서 종양 억제제 핵산 및(또는) 폴리펩티드 및 보조 항암제는 단일 약리 조성물로서 투여된다. 상기 실시태양에서 종양 억제제 핵산 및(또는) 폴리펩티드 및 보조 항암제는 단일 균일 운반 비히클 중에 현탁되거나 용해될 수 있다. 별법으로 종양 억제제 핵산 및(또는) 폴리펩티드 및 보조 항암제는 투여시 또는 연속적으로 단일 부형제에 다시 현탁 (분산)되는 상이한 운반 비히클 중에 현탁되거나 용해될 수 있다. 따라서, 예를 들면 보조 항암제는 극성 용매 (예, 에탄올 중 파클리탁셀) 중에 용해될 수 있고, 종양 억제제 핵산은 지질과 복합된 후 현탁액 중에 함께 저장되거나 별법으로는 투여될 때 조합될 수도 있다. 다양한 적합한 운반 비히클, 부형제 등은 상기 기재되어 있다.

IV. 처리 요법: 조합 및 개별 치료법

A) 종양 억제제 치료 요법

본 발명에 의해 종양 억제제 핵산 또는 폴리펩티드, 보다 구체적으로는 종양 억제제 핵산은 단일 투여량보다는 다중 투여량로 투여되는 경우 종양 성장을 억제하는데 보다 큰 효능을 나타냄을 알게 되었다. 따라서 본 발명은 종양 억제제 핵산 또는 폴리펩티드의 다중 투여를 포함하는, 종양 억제제 유전자 또는 폴리펩티드의 치료 요법을 제공한다.

종양 억제제 단백질 또는 종양 억제제 핵산은 단일 투여량에서의 총 투여량, 5일에 걸쳐 나누어지거나 5일 동안 날마다 투여되는 총 투여량, 15일에 걸쳐 나누어지거나 15일 동안 날마다 투여되는 총 투여량, 및 30일에 걸쳐 나누어지거나 30일 동안 날마다 투여되는 총 투여량으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료 요법으로 아데노바이러스 입자 총 투여량 약 1 x 10⁹ 내지 약 1 x 10¹⁴, 약 1 x 10⁹ 내지 약 7.5 x 10¹⁵, 바람직하게는 약 1 x 10¹¹ 내지 약 7.5 x 10¹³으로 (보조 항암제의 존재 또는 부재하에) 투여될 수 있다. 상기 투여 방법은 2 이상의 싸이클 (보다 바람직하게는 3 싸이클) 동안 반복될 수 있고 2 이상의 싸이클은 3 또는 4주에 의해 분리될 수 있다. 치료는 단일 투여량 싸이클 또는 약 2 내지 약 12, 보다 바람직하게는 약 2 내지 약 6 싸이클로 변할 수 있는 투여량 싸이클을 포함할 수 있다.

특히 바람직한 치료 요법으로는 5일에 걸쳐 나누어지거나 날마다 투여되는 총 투여량, 15일에 걸쳐 나누어지거나 날마다 투여되는 총 투여량 및 30일에 걸쳐 나누어지거나 날마다 투여되는 총 투여량이 있다.

몇몇의 바람직한 실시태양에서 아데노바이러스 입자의 매일 투여량 7.5 x 10⁹ 내지 약 7.5 x 10¹⁵, 바람직하게는 약 1 x 10¹² 내지 약 7.5 x 10¹³은 30일 이하 동안 매일 투여될 수 있다 (예, 매일 동일 투여량이 투여되는 2일, 2 내지 5일, 7일, 14일, 또는 30일 요법). 다중 요법이 21 내지 28일의 순환 싸이클로 반복될 수 있다.

몇몇의 실시태양에서 상이한 투여 경로에 의해 상이하며 바람직한 투여량 범위를 사용하게 될 것이다. 예를 들면, 간내 동맥 운반에 대하여 바람직한 범위는 통상적으로 5 내지 14일 동안 1일 당 아데노바이러스 입자 7.5 x 10⁹ 내지 약 1 x 10¹⁵, 보다 바람직하게는 약 1 x 10¹¹ 내지 약 7.5 x 10¹³일 것이다. 상기 요법은 보조 항암제인 FUDR 또는 5'-데옥시-5-플루오로우리딘 (5'-DFUR), 또는 이리노테칸 히드로클로라이드 (CPT-11; 7-에틸-10-[4-(1-피페리디노)-1-피페리디노]카르보닐옥시캄프토테신)의 투여를 추가로 포함할 수 있다. 종양내 운반에 대하여 바람직한 범위는 통상적으로 1일 당 아데노바이러스 입자 7.5 x 10⁹ 내지 약 1 x 10¹³, 보다 바람직하게는 약 1 x 10¹¹ 내지 약 7.5 x 10¹²일 것이다. 복강내 운반에 대하여 바람직한 범위는 5 내지 10일 동안 1일 당 아데노바이러스 입자 7.5 x 10⁹ 내지 약 1 x 10¹⁵, 보다 바람직하게는 약 1 x 10¹¹ 내지 약 7.5 x 10¹³일 것이다.

B) 조합 치료법 치료 요법

종양 억제제가 보조 항암제와 조합되어 사용되는 경우에 종양 억제제 핵산은 상기 기재된 바와 같은 총 투여량으로 투여된다. 조합에서 보조 항암제는 사용되는 시약에 의존하는 총 투여량으로 투여된다. 예를 들면, 파클리탁셀 또는 파클리탁셀 유도체는 단일 투여량, 1일 및 2일째에 매일 투여되는 투여량, 1일, 2일 및 3일째에 매일 투여되는 투여량, 15일 동안의 매일 투여량, 30일 동안의 매일 투여량, 15일 동안의 매일 연속 주입, 30일 동안 매일 연속 주입의 투여로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료 요법으로 1시간, 3시간, 6시간 또는 24시간에 걸쳐 75 내지 350 ㎎/㎡의 총 투여량으로 투여된다. 바람직한 투여량은 24시간 동안 100 내지 250 ㎎/㎡이다.

종양 억제제 핵산의 처리 전에 보조 항암제 (예를 들면, 파클리탁셀)의 전처리는 종양 억제제의 효능을 개선시킨다. 따라서, 특히 바람직한 하나의 실시태양에서 세포, 조직 또는 유기체는 종양 억제제 핵산 전에 보조 항암제로 처리된다. 보조 항암제는 바람직하게는 보다 길거나 짧은 시간이 허용되지만 종양 억제제 핵산보다 약 24시간 전에 처리된다.

보조 항암제가 파클리탁셀형 화합물, 보다 바람직하게는 파클리탁셀 또는 파클리탁셀 유도체 (예, Taxol 또는 Taxotere)인 경우 전처리가 특히 유효하다. 특히 바람직한 종양 억제제는 RB 및 p53이며, p53, 특히 아데노바이러스 벡터 중 p53 (예, A/C/N/53)이 가장 바람직하다.

V. 전이의 치료 및 예방

실시예 2 및 3에 예시되는 바와 같이 종양 억제제 (예, p53) 유전자 치환 치료법은 시험관내 인간 종양 세포, 면역약화 숙주에서의 인간 종양 이종이식, 및 인간 폐 종양 (생체내)에 대한 효능을 가짐을 나타내고 있다. 환자에서의 1차 종양의 외과적 용적축소(debulking)은 1차 부위에서의 종양 재성장, 및 종종 외과의에 의해 빗나간 종양 세포의 현미경적 "소(nests)"로 인한 상기 부위로부터의 종양 전이를 유발한다. 다르게는, 모든 종양이 1차 부위로부터 제거되는 것을 확실히 하기 위하여 환자는 1차 종양 부위를 포함하는 다량의 정상 조직을 제거하는 외관손상 (dicfiguring) 외과수술로 처리될 수 있다.

또다른 실시태양에서 본 발명은 전이체 (전이 세포)의 성장 및(또는) 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로 종양 억제제의 전신 또는 국소적 투여, 보다 바람직하게는 p53 또는 RB의 국소 투여를 포함한다.

A) 전신 치료

실시예 2 및 3에 설명되어 있는 바와 같이, 종양 억제제 벡터 (예, A/C/N/53)의 전신 치료(예, 정맥내 주사)는 생체내 전이의 진전을 억제하였다. 따라서, 하나의 실시태양에서 본 발명은 상기 기재된 바와 같이 유기체에 종양 억제제 핵산 및(또는) 종양 억제제 폴리펩티드를 투여함으로써 전이성 질병의 진전을 억제하는 방법을 제공한다. 종양 억제제는 바람직하게는 종양 억제제 핵산, 보다 바람직하게는 p53 종양 억제제 핵산 및 가장 바람직하게는 아데노바이러스 벡터 중 p53 핵산 (예, A/C/N/53)이다. 또다른 바람직한 실시태양에서 종양 억제제 핵산은 세포내지방입자 내에 캡슐화되거나 지질과 복합되어 제공된다 (예를 들면 문헌 [Debs 및 Zhu (1993) WO 93/24640; Mannino 및 Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6(7): 682-691; Rose 미국 특허 제5,279, 833호; Brigham (1991) WO 91/06309; 및 Felgner 등 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414] 참고).

B) 국소 치료

또다른 실시태양에서 종양 억제제 단백질 또는 종양 억제제 핵산의 국소 도포는 외과 수술과 관련하여 바람직하다. 상기 실시태양에서 바람직하게는 감염 벡터 형태의 종양 억제제는 종양 제거 후에 창상강의 표면을 따라 적용된다. 감염 입자는 창상 부위에서 임의의 남아 있는 종양 세포로 p53을 운반하여 이의 세포자멸 (프로그램화된 세포 사멸)을 유도한다. 상기 치료는 장기간의 환자의 생존에 영향을 주고(주거나) 외과 수술 동안에 제거될 필요가 있는 종양 부위를 포함하는 소정량의 정상 조직을 감소시킬 것이다.

종양 억제제는 바람직하게는 국소 도포에 적합하게 당업자들에게 공지된 다수의 제제 중 하나와 조합된다. 따라서, 예를 들면 인간 p53 종양 억제제 유전자 (예, A/C/N/53)의 감염 제제는 창상강의 표면을 따라 분무하기에 적합한 비히클 (예, 석유 젤리 또는 기타 크림 또는 연고) 중에 현탁된다. 별법으로는, 종양 억제제는 창상강 내부에 스프레이로서 도포하기 위한 에어로졸 비히클로 제조될 수 있다. 또다른 실시태양에서 종양 억제제는 창상강에 충전되어 시간 의존 방식으로 종양 억제제 단백질 또는 벡터를 방출할 수 있는 분해성 (재흡수 가능한) 물질, 예를 들면 재흡수 가능한 스폰지로 제조될 수 있다.

특정 제한된 국소 영역, 예를 들면 각막, 위장관, 종양 절제 부위에 대한 재조합 아데노바이러스 벡터의 적용에 대한 바람직한 실시태양은 보다 긴 시간의 인큐베이션 시간을 지지하고 바이러스 감염을 용이하게 하기 위하여 고상 담체를 사용한다. 담체는 재조합 아데노바이러스 용액으로 침지된 가아제 또는 연고일 수 있다. 바이러스는 가아제 지지체를 통해 각막에 도포되어 개선된 이식 유전자 (transgene) 효과를 얻을 수 있다. 배농된 가아제는 또한 재발을 피하기 위하여 절제된 종양 영역에 예방적으로 도포될 수 있다. 연고는 위장관 영역에 국소적으로 도포되거나 종양 억제제 유전자 치료를 위하여 췌장의 영역에 국소적으로 도포될 수 있다.

대표적인 연고 담체로는 석유 기재의 프랄루브 (Puralube^(R)) 또는 수용성 KJ-젤리 (KJ-Jelly^(R))가 있다. 대표적인 방법에서 멸균 가아제 패드 (5 x 5 ㎝) 또는 유루(tear flow) 시험 스트립은 완전히 습윤될 때까지 아데노바이러스 벡터 용액 (예, 1 x 10⁹ PN/㎖) 중에 침지될 수 있다. 패드 또는 스트립을 표적 조직의 상부에 놓고 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션시킨다. 당업자는 흡수할 수 있거나 물과 혼합될 수 있는 기타 포, 젤라틴 또는 연고가 있음을 인식할 것이다. 또한, 기타 부형제는 첨가되어 상기 기재된 바와 같이 유전자 전이를 개선할 수 있다.

VI. 기타 화학치료제에 의한 조합 치료

A) 다중 화학치료제 조합물과 조합되어 투여되는 종양 억제제

본 발명의 방법은 단일 보조 항암제와 종양 억제제의 조합에 제한되지 않음을 인지할 것이다. 방법이 전형적으로 세포를 종양 억제제 (예, p53) 및 파클리탁셀과 같은 보조 항암제와 접촉시키는 것을 포함하지만, 본 발명의 방법은 또한 세포를 종양 억제제 유전자 또는 폴리펩티드 및 2중 또는 3중 또는 다중 보조 항암제 및 임의의 기타 화학치료제의 조합물과 접촉시키는 것을 포함한다. 또한, 당업자는 화학치료제(들)가 보조 항암제(들)의 부재하에 종양 억제제 단백질 또는 유전자와 함께 사용될 수 있음을 인지할 것이다.

다수의 화학치료제는 과학 및 특허 문헌에 잘 알려져 있으며, 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 대표적인 약물로는 DNA 손상제 (DNA 알킬화제를 포함함), 예를 들면 시스플라틴, 카르보플라틴 (문헌 [Duffull (1997) Clin Pharmacokinet. 33 161-183); Droz (1996) Ann Oncol. 7:997-1003] 참고), 나벨빈 (비노렐빈), 아살레이(Asaley), AZQ, BCNU, 부술판(Busulfan), 카르복시프탈라토플래티늄, CBDCA, CCNU, CHIP, 클로람부실, 클로로조토신, 시스-플래티늄, 클로메존, 시아노모르폴리노-독소루비신, 시클로디존, 시톡산, 디안히드로갈락티톨, 플루오로도판, 헵술팜, 히칸톤, 멜팔란, 메틸 CCNU, 미토마이신 C, 미토졸아미드, 니트로겐 머스타드, PCNU, 피페라진 알킬화제, 피페라진디온, 피포브로만, 포르피로마이신, 스피로하이단토인 머스타드, 테록시론, 테트라플라틴, 티오-테파, 트리에틸렌멜라민, 우라실 니트로겐 머스타드 (Yoshi-864); 토포이성질화효소 I 억제제 (예, 토포테칸 히드로클로라이드, 이리노테칸 히드로클로라이드 (CPT 11), 캄프토테신, 캄프토테신 Na 염, 아미노캄프토테신, CPT 11 및 기타 캄프토테신 유도체); 토포이성질화효소 II 억제제 (세포내지방입자에 캡슐화된 독소루비신을 비롯하여 독소루비신 (미국 특허 제5,013,556호 및 동 제5,213,804호 참고), 아모나피드, m-AMSA, 안트라피라졸 유도체, 피라졸로아크리딘, 비산트렌 HCL, 다우노루비신, 데옥시독소루비신, 미톡산트론, 메노가릴, N,N-디벤질 다우노마이신, 옥산트라졸, 루비다존, VM-26 및 VP-16); RNA/DNA 항대사산물 (예, L-알라노신, 5-아자시티딘, 5-플루오로우라실, 아시비신, 아미노프테린, 아미노프테린 유도체, 안티폴, 베이커 (Baker) 가용성 안티폴, 디클로랄릴 로손, 브레퀴나르, 프토라푸르 (프로드러그), 5,6-디히드로-5-아자시티딘, 메토트렉세이트, 메토트렉세이트 유도체, N-(포스포노아세틸)-L-아스파르테이트 (PALA), 피라조푸린, 및 트리메트렉세이트); 및 DNA 항대사산물 (예, 3-HP, 2'-데옥시-5-플루오로우리딘, 5-HP, 알파-TGDR, 아피디콜린 글리시네이트, ara-C, 5-아자-2'-데옥시시티딘, 베타-TGDR, 시클로시티딘, 구아나졸, 히드록시우레아, 이노신, 글리코디알데히드, 맥베신 II, 피라졸로이미다졸, 티오구아닌 및 티오푸린)이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 종양 억제제 핵산 및(또는) 폴리펩티드는 또한 빈크리스틴, 테모졸로미드 (미국 특허 제5,260,291호 참고) 및 토레미펜 (예, 토레미펜에 관한 정보를 위하여 미국 특허 제4,696,949호 참고)과 같은 화학치료제와 조합되어 투여될 수 있다.

관련 동물 모델에서의 예비임상 연구는 시스플라틴, 카르보플라틴, 나벨빈, 독소루비신, 5-플루오로우라실, 메토트렉세이트, 또는 에토포시드와 조합된 p53 아데노바이러스가 종양: SSC-9 두경부, SSC-15 두경부, SSC-25 두경부, SK-OV-3 난소, DU-145 전립선, MDA-MB-468 유방 및 MDA-MB-231 유방 종양 세포를 단독으로 치료하는 화학치료제보다 훨씬 효율적으로 세포 증식을 억제하였음을 나타내고 있다. 또다른 실시태양에서 개선된 항종양 효능은 p53 유전자 (예, 아데노바이러스 백터에 발현됨), 보조 항암제 (예, 파클리탁셀) 및 DNA 손상제 (예, 시스플라틴)의 3종 약물의 혼합물을 사용하여 나타난다. p53, 파클리탁셀 및 시스플라틴의 조합물은 난소 종양 모델에 효과적인 것으로 나타나 있다. 상기 데이타는 임상 시험에서 화학치료와 p53 유전자 치료의 조합을 지지한다.

상기 기타 화학치료제는 보조 항암제의 존재 또는 부재하에 종양 억제제 핵산 및(또는) 폴리펩티드와의 조합으로 사용될 수 있다. 또한 본 발명은 상기 기재된 임의의 종양 억제제와의 조합 또는 보조 항암제와 조합된 상기 기재된 종양 억제제와 함께 방사선 치료의 사용을 고려한다.

또한 임의의 화학치료제가 본 발명의 방법에 따라 종양 억제제 핵산 또는 폴리펩티드와 조합되어 개별적으로 사용될 수 있음을 인지할 것이다.

종양 억제제 핵산 (예, p53)이 보조 항암제 (예, 파클리탁셀) 및 DNA 손상제 (예, 시스플라틴, 카르보플라틴 또는 나벨빈)와 함께 아데노바이러스 벡터 중에 투여되는 경우 아데노바이러스 벡터는 1일 당 아데노바이러스 입자 약 7.5 x 10¹² 내지 약 7.5 x 10¹³으로 5 내지 14일 동안 국소 투여된다. 예를 들면, 카르보플라틴과 조합된 아데노바이러스 입자의 매일 투여량 약 7.5 x 10¹³이 사용될 수 있다. 하나의 실시태양에서 아데노바이러스 입자의 매일 투여량 약 7.5 x 10¹²이 폐에 대한 투여를 위하여 사용될 수 있다. 또다른 실시태양에서 p53이 토포테칸과 함께 투여된다.

통상적으로, DNA 손상제는 권고되는 투여량으로 투여될 것이다 (문헌 [Physician's Desk Reference, 제51판, Medical Economics, Montvale, NJ 1997 참고). 예를 들면, 카르보플라틴은 AUC (곡선 아래 면적) 약 6 내지 7.5 ㎎/㎖/분으로 투여된다.

<프로테아제 억제제>

또다른 실시태양에서 본 발명은 종양 억제제 핵산 및(또는) 폴리펩티드 및 프로테아제 억제제의 조합된 사용을 제공한다. 특히 바람직한 프로테아제 억제제로는 콜라게나제 억제제, 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP) 억제제를 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다 [예를 들면, Chambers (1997) J. Natl. Cancer Inst. 89:1260-1270 참고]. 바람직한 실시태양에서 방법은 프로테아제 억제제 유효량 및 종양 억제제 폴리펩티드 및(또는) 핵산 유효량을 동시에 또는 순서대로 투여하는 것을 포함한다. 프로테아제 억제제인 화합물의 예는 과학 및 특허 문헌에 잘 알려져 있다.

<면역조절제>

본 발명의 종양 억제제 단백질 및 핵산은 과다증식 또는 암 세포에 반향하는 면역 반응 (예, 종양 특정 항원에 반향하는 면역 반응)을 상향조절하거나, 종양 억제제 단백질, 종양 억제제 핵산, 종양 억제제 벡터 (예, 항아데노바이러스 반응) 및(또는) 조합된 화학치료제에 반향하는 면역 반응을 하향조절하는 면역조절제와 함께 사용될 수 있다.

따라서, 예를 들면 본 발명은 면역조절제 유효량과 종양 억제제 핵산 및(또는) 종양 억제제 폴리펩티드 유효량의 조합된 순서적 또는 동시 투여를 제공한다. 면역조절제로는 IL-2, IL-4, IL-10 (미국 특허 제5,231,012호; Lalani (1997) Ann. Allergy Asthma Immunol. 79:469-483: Geissler (1996) Curr. Opin. Hematol. 3:203-208), IL-12 [예, Branson (1996) Human Gene Ther. 1:1995-2002]과 같은 시토킨, 및 감마-인터페론이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

면역억제제로서 작용하는 면역조절제는 치료제 (예, 종양 억제제 단백질 또는 핵산 또는 보조 항암제 등)에 대해 표적되는 면역 반응을 완화시키는데 이용될 수 있다. 면역억제제는 당업자들에게 잘 알려져 있다. 적합한 면역억제제로는 시클로-포스파미드, 덱사메타존, 시클로스포린, FK506 (탁클로리무스) (문헌 [Lochmuller (1996) Gene Therapy 3:706-716], IL-10 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 면역 반응을 조절하는 세포 표면 수용체에 대한 항체를 또한 사용할 수 있다. 예를 들면, B 세포, T 세포, NK 세포, 대식세포 및 종양 세포에 대한 세포 수용체에 결합하는 리간드를 방해하는 항체가 상기 목적에 사용될 수 잇다. 상기 방법의 예는 문헌 [Yang (1996) Gene Therapy 3:412-420; Lel (1996) Human Gene Therapy 7:2273-2279; Yang (1996) Science 275:1862-1867]을 참고로 한다.

VII. 치료 키트

또다른 실시태양에서 본 발명은 치료 키트를 제공한다. 상기 키트는 종양 억제제 핵산 또는 폴리펩티드 또는 이의 제약 조성물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 또한 키트는 보조 항암제 또는 이의 제약 조성물을 포함한다. 다양한 조성물은 개별적 투여 또는 투여 전에 조합을 위하여 개별적인 콘테이너에 제공될 수 있다. 별법으로 다양한 조성물은 단일 콘테이너에 제공될 수 있다. 또한 키트는 다양한 장치, 완충액, 분석 시약 등을 본 발명의 방법의 수행을 위하여 포함할 수 있다. 또한, 키트는 본 발명의 다양한 방법 (예, 종양 치료, 전이의 예방 및(또는) 치료 등)에서 키트의 사용을 유도하는 지시 물질을 함유할 수 있다.

임의로 키트는 1종 이상의 면역조절제 (예, 면역억제제)를 포함할 수 있다. 특히 바람직한 면역조절제는 본원에 기재된 임의의 면역조절제를 포함한다.

VIII. 이종 종양 억제제 핵산 또는 폴리펩티드, 및 기타 시약 함유 세포

본 발명에 의해 형질감염되거나 이 밖에 처리된 원시핵 또는 성숙핵 숙주 세포, 예를 들면 이종 종양 억제제 핵산 및(또는) 종양 억제제 폴리펩티드 함유 동물 세포 (예, 포유동물 세포)가 추가로 제공된다. 이러한 세포는 임의로 보조 항암제, 예를 들면 파클리탁셀 또는 기타 미세소관 작용제를 추가로 함유할 수 있다.

적합한 원시핵 세포로는 이.콜라이(E. coli) 세포와 같은 박테리아 세포가 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 적합한 동물 세포로는 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간 세포를 포함한다. 숙주 세포로는 임의의 포유동물 세포, 보다 바람직하게는 상기 기재된 바와 같은 임의의 신생물 또는 종양 세포가 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에 기재된 형질감염된 숙주 세포는 진단 또는 치료용 조성물로서 유용하다. 제약적으로 사용되는 경우 생체외 유전자 치료를 위하여 상기 기재된 바와 같이 다양한 제약적으로 허용되는 담체와 조합될 수 있다. 세포는 상기 자세히 기재된 유효량으로 치료적 또는 예방적으로 투여될 수 있다. 진단에 있어서, 세포는 교시하거나 기타 참고 목적으로 사용될 수 있고 형질감염되고(되거나) 치료된 세포의 동정을 위한 적합한 모델을 제공한다.

IX. p53 아데노바이러스 유전자 치료의 예비임상 및 임상 효능도

아데노바이러스 매개 p53 유전자 치료는 몇몇의 나라에서 상 I/II 임상 시험을 동시에 수행하고 있다. 상기 임상 시험에 사용되는 제약 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 시토메갈로바이러스 촉진제 ("rAd5/p53)의 제어하에 인간 종양 억제제 유전자를 발현하는 복제 결함성 5형 아데노바이러스 벡터를 포함하는 본발명의 대표적인 야생형 p53-발현 아데노바이러스를 들 수 있다 [Willis (1994) 참고].

<국소 투여>

복강에 제한된 난소암은 국소 p53 유전자 치료, 즉 복막내 투여가 바람직한 치료 계획으로서 고려되어야 하는 하나의 임상 시나리오이다.

<실시예>

하기 실시예는 예시를 하기 위한 것이며 본 발명을 제한하지는 않는다.

<실시예 1>

p53 및 탁솔(Taxol^(R))의 조합 치료

본 발명은 신생물의 치료에서 종양 억제제 폴리펩티드를 발현하는 핵산 및 파클리탁셀의 조합된 투여를 제공한다. 하기 실시예는 신생물을 치료하는 탁솔과 조합된 본 발명의 p53 발현 아데노바이러스의 성능을 자세히 설명하고, 조합 치료는 단독 시약보다 종양 세포를 사멸시키는데 보다 효율적이었다.

<시험관내 조합 치료>

세포를 세가지 치료 요법 중 하나로 처리하였다. 처리 1에서 세포를 p53 아데노바이러스 구조물 A/C/N/53에 노출시키기 24시간 전에 탁솔로 전처리하였다. 처리 2에서, 세포를 p53 아데노바이러스 구조물로 전처리한 후 탁솔과 접촉시켰다. 처리 3에서, 세포를 탁솔 및 p53 아데노바이러스와 동시에 접촉시켰다. 따라서, p53 Ad 및 탁솔은 동일 24시간 내에 또는 동시에 투여될 수 있다.

배양액 (0.4 ㎍/㎖ 코르티졸과 DNEM + 햄 F12 배양액 1:1 혼합물 및 10 ％ FBS 및 1 ％ 비필수 아미노산 중 두경부 세포주 SCC-9, SCC-15 및 SCC-25, 이글즈 필수 배양액 및 10 ％ FBS 중 전립선 PU-145 및 난소 SK-OV-3) 중에 대략 1.5 x 10⁴ 세포를 96 웰 미세적정 플레이트 상의 각각의 웰에 첨가하고 4시간 동안 37 ℃ 및 5 ％ CO₂에서 배양하였다. 약물 (탁솔), p53 아데노바이러스, 또는 적절한 비히클/완충액을 각각의 웰에 첨가하였다. 파클리탁셀이 수용성이 아니므로, 약물을 투여 전에 에틸 알콜 중에 용해시켰다. 이어서 세포를 밤새 37 ℃ 및 5 ％ CO₂에서 배양하였다. p53 아데노바이러스를 포스페이트 완충액 (20 mM NaH₂PO₄, pH 8.0, 130 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 2 ％ 수크로스) 중에 투여하였다.

이어서 세포 사멸을 모스만 (Mosmann) (1983, J. Immunol. Meth., 65: 55-63) 방법에 따라 정량화하였다. 간단하게는, 5 ㎎/㎖ MTT 생체 염료 [3-(4,5 디메틸티아졸-2일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드] 대략 25 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고 3-4시간 동안 37 ℃ 및 5 ％ CO₂에서 인큐베이션시켰다. 이어서 10 ％ SDS 세정제 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고 밤새 37 ℃ 및 5 ％ CO₂에서 인큐베이션시켰다. 이어서 각각의 웰의 신호를 분자 장치 미세적정 플레이트 판독기 (TermoMax)를 사용하여 정량화하였다. 사용된 구체적인 세포주 및 이에 따라 얻은 결과를 하기 표 1에 열거하였다.

일반적으로, p53 아데노바이러스는 먼저 첨가되는 경우보다 탁솔과 동시에 또는 후에 첨가되는 경우에 보다 효율적이었다. 상기 결과는 A/C/N/53 및 탁솔 사이에 상승 작용을 제시한다.

<이소볼로그램 분석에 의해 확립된 상승 효과>

SK-OV-3 (p53 부재) 난소 종양 세포를 하기 표 2에 예시한 바와 같이 탁솔 및 p53/아데노바이러스 (A/C/N/53)의 조합물로 처리하였다. 투여를 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 세포 사멸을 상기 기재된 바와 같이 MTT 분석을 사용하여 3일째에 정량화하였다. 또한, p53 Ad 단독에 대한 투여량 반응 곡선 (표 2에 열거된 투여량을 사용함)을 얻었고 (약물에 대한 세포 노출 2일 후), 탁솔 단독에 대한 투여량 반응 곡선을 상기 기재된 투여량을 사용하여 수행하였다 (약물에 대한 세포 노출 3일).

도 1은 처리의 기능으로서 세포 증식의 억제를 예시한다 (완충액 조절에 비교한 바와 같음). 일반적으로 탁솔 또는 p53의 증가되는 투여량은 세포 증식의 속도를 감소시키며 p53 및 탁솔의 조합은 약물 단독에서보다 휠씬 큰 효과를 갖는다.

도 2는 문헌 [Berenbaum (1989) Pharmacol. Rev. 93-141]과 같은 이소볼 (Isobole) 방법을 사용하는 상기 데이타의 이소볼로그램 분석을 예시한다. 세포를 p53 (A/C/N/53) 처리 24시간 전에 탁솔로 전처리하는 경우 탁솔 및 p53 (A/C/N/53) 사이의 상승 작용을 관찰하였다. 도 2에서 직선 (ED₃₀에 대한 이소볼)은 2종 약물에 의한 처리가 단지 부가적인 경우 예상되는 세포 증식에 대한 효과를 나타낸다. 사실상, 관찰된 효과는 이소볼선의 하부 좌측에 해당하며, 이는 각각의 약물의 예상된 농도보다 낮은 농도가 필요하고 2종 약물 사이의 상승 작용이 발생하였음을 나타낸다.

<실시예 2>

전이에 대한 p53 아데노바이러스-매개 유전자 치료

본 발명은 전이의 치료에서 종양 억제제 폴리펩티드를 발현하는 핵산의 투여를 제공한다. 하기 실시예는 신체내의 다양한 조적을 감염하고 전이를 치료하는 본 발명의 p53 발현 아데노바이러스의 성능을 상세히 설명한다.

시드 (scid) 마우스 암컷 [V(D)J 재조합에서의 결함으로 인하여 T 및 B 세포가 부족한 SCID 돌연변이에 대한 동형 마우스]에 이의 유방 지방 패드로 5 x 10⁶ MDA-MB-231 유방 암종 세포를 주사하였다. 1차 종양이 잘 달성되고 폐에 전이되는 시간이 지난 후에 1차 종양을 외과 수술로 제거하였다 (11일째). 마우스를 정맥내 A/C/N/53 또는 23, 30, 37, 44 (1qW)일째에 조절 완충액, 조절 완충액 또는 A/C/N/53 (아데노바이러스 중 p53)으로 4 x 10⁸ C.I.U/주사로 처리하였다. 49일째에 폐를 수거하고 고정시키고 염색하고 현미경으로 조사하였다.

결과를 하기 표 3에 예시하였다.

A/C/N/53 처리는 이들을 갖고 있는 마우스 중의 전이의 수를 감소시켰다.

제2의 실험에서 시드 또는 시드-베이지 마우스의 유방 지방 패드 중의 231 종양을 A/C/N/53에 의해 종양 주위로 주사하였다. 10회 주사에 의한 총 투여량 2 내지 4 x 10⁹ C.I.U는 시드 마우스 중 80 ％ 및 시드-베이지 마우스 중 60 ％로 폐 전이된 마우스의 수를 감소시켰다. 또한 1마리 마우스 당 전이의 수를 임의의 폐 종양을 갖는 마우스에서 상당히 감소시켰다. 상기 제시된 바와 같이 A/C/N/53에 의한 정맥내 투여는 시드 마우스 중의 폐 전이에 대한 효능을 나타내었다. 상기 데이타는 A/C/N/53에 의한 암 유전자 치료가 전이성 질병의 심각성에 영향을 줄 뿐만 아니라 1차 종양을 감소시킬 수도 있음을 나타낸다.

또다른 실시태양에서 암컷 시드 마우스에 0일째에 유방 지방 패드로 5 x 10⁶ MDA-MB-231 유방 종양 세포/마우스로 주사하였다. 1차 (유방) 종양을 18일째에 외과수술로 제거하였다. 마우스를 21, 24, 32, 39 및 36일째에 완충액, 베타-갈 (beta-gal) AD, 또는 p53 Ad (A/C/N/53)의 정맥내 주사로 처리하였다. 주사 당 바이러스 투여량은 4 x 10⁸ C.I.U.(A/C/N/53) (PN/C.I.U. = 23.3) 및 9.3 x 10⁹ 입자 베타-갈 Ad (PN/C.I.U. = 55.6; 1.7 x 10⁸ C.I.U.)이었다.

폐 및 간을 51일째에 수거하고 포르말린에 고정하였다. 조직 부위를 폐 종양 및 간 손상에 대하 평가하였다. 2 완충액 및 2 베타-갈 Ad 마우스로부터의 주요 기관을 한랭절개 및 B-갈락토시다제 효소 활성에 대한 분석을 위하여 냉동시켰다.

완충액 및 베타-갈 Ad 군 중의 폐 1개 당 전이의 수는 유의적으로 상이하지는 않았다. (p = 0.268, 표 4 참고).

p53 Ad 처리는 베타-갈 Ad 군의 완충액 중 어느 하나 (각각 p < 0.001 및 p < 0.002)에 비교하는 경우 폐 1개 당 전이의 수를 현저히 감소시켰다. 전이의 수의 감소 뿐만 아니라 또한 p53 Ad 군에서의 폐 전이의 크기가 대단히 감소되었다. 비교군으로서 대부분의 폐로부터의 조직 부위는 신생물 조직이 50 ％ 초과로 존재하여, 개별적인 종양이 폐의 큰 영역에 걸쳐 더 이상 인식될 수 없었다. 대조적으로 대부분의 p53 Ad 군에서의 폐 전이는 작았고 개별적인 종양으로서 구별되었다.

<아데노바이러스 조직 분포>

간 조직은 최고수의 감염된 세포 (약 50 ％)를 가졌고 베타 갈락토시다제 활성은 강력하였다. 폐는 조직을 통해 균일하게 분포된 감염 세포의 패치를 분산시켰다. 장 및 위는 기관 주위의 외부 평활근에 세포의 주기적 감염을 가졌다. 또한 루멘을 따라 분산된 미세융모에 베타-갈락토시다제 활성이 존재하였다. 자궁 주위의 위부 평활근 벽은 장에서 나타난 바와 유사한 세포의 주기적 감염을 가졌다. 난소 내의 대부분의 간질 세포가 감염되었다. 비장은 기관의 평활근 성분 중에 베타-갈락토시다제 활성을 분산시켰다. 횡문심근의 주요 벌크 내부에는 매우 적은 (1 ％ 미만) 감염 세포가 존재하였다. 유방 지방 패드 또는 해당 횡문근에도 1차 종양 중의 감염 세포는 거의 존재하지 않았다. 신장에도 감염된 세포는 존재하지 않았다.

<간 병리학>

모든 간은 부검하는 경우에 전체적으로 정상이었다. 어느 간에서도 명백한 괴사는 존재하지 않았다. 그러나, 아데노바이러스로 처리된 마우스는 유사분열, 세포 봉입, 및 간세포 크기 및 형상의 변화에서의 세포의 증가된 갯수를 포함하여 간세포 비정상이었다 (완충액 군에는 존재하지 않음).

<실시예 3> 인간 유방암 이종이식에 대한 p53 아데노바이러스-매개 유전자 치료

본 발명은 종양 억제제 폴리펩티드를 발현하는 핵산의 투여에 의한 다양한 암의 치료 방법을 제공한다. 하기 실시예는 인간 유방암을 치료하는 본 발명의 p53 발현 아데노바이러스의 성능을 상세히 설명한다.

부재 또는 돌연변이 p53이 있는 종양으로의 야생형 p53의 도입은 종양 성장의 신규 제어 방법을 제공한다. 문헌 [Casey (1991) Oncogene 6: 1791-1797]에서는 플라스미드 DNA 벡터를 통해 시험관내 유방암 세포에 야생형 p53을 도입하였다. 플라스미드 형질감염 이후에 발생하는 MDA-MB-468 (p53^mut) 및 T47D (p53^mut) 군체의 갯수는 야생형 p53에 의해 50 ％ 감소하였다. 또한, 생성된 군체의 어느 것도 야생형 p53 형질감염체를 발현하지 않았다. 대조적으로 MCF-7 (p53wt) 군체의 수는 영향을 받지 않았다. 문헌 [Negrini (1994) Cancer Res. 54: 1818-1824]에서는 MDA-MB-231 세포를 사용하는 유사 연구를 수행하였다. 군체 형성이 야생형 p53 함유 플라스미드에 의한 형질감염에 의해 50 ％ 감소하였고 임의의 생성된 군체는 야생형 p53을 발현하지 않았다. 역설적으로는 상기 연구에서 유사 결과를 MCF-7 세포에 대해서도 관찰하였다.

상기 실시예에 기재된 연구에서 복제 부족한 재조합의 EI 지역 제거된 p53 아데노바이러스 [p53 Ad; (A/C/N/53) Wills (1994)]의 효능을 돌연변이 p53 발현 세개의 인간 유방암 세포주인 MDA-MB-231, MDA-MB-468, 및 MDA-MB-435에 대해 시험하였다. MDA-MB-231 세포는 p53 유전자의 코돈 280 중의 Arg-to-Lys 돌연변이를 함유하였다 [Bartek (1990) Oncogene 5: 893-899]. MDA-MB-468 세포는 코돈 273 중의 Arg-to-His 돌연변이를 함유하였다. MDA-MB-435 세포는 p53 유전자의 코돈 266 중의 Gly-to-Glu 돌연변이를 함유하였다 [Lesoon-Wood (1995) Hum. Gene Ther. 6:395-405].

종래 연구에서는 시험관내 p53 Ad에 의한 감염 후에 인간 유방, 난소, 폐, 결장직장, 간, 뇌 및 방광으로부터의 종양 세포내에 높은 수준의 야생형 p53 발현을 나타내었다 [Wills (1994), Harris 등 (1996) Cancer Gene Therapy 3: 121-130]. 아데노바이러스 매개 p53 발현은 궁극적으로 세포 형태를 변화시키고, p53 부재 또는 돌연변이 p53 종양 세포내의 세포자멸을 유도하였다. 10 m.o.i. (다중 감염)에서의 p53 Ad에 의한 468 유방암 세포의 감염은 감염 후 72시간 동안의 DNA 합성의 거의 100 ％ 억제를 유발하였다. 또한, 시험관내 p53 Ad에 의한 감염은 각각 3 ±2 및 12 ± 10 m.o.u.의 ED₅₀ 값을 갖는 MDA-MB-468 및 MDA-MB-231 세포 증식을 억제하였다. 또한, 3개의 다른 p53 돌연변이 유방 암종주의 증식은 p53 Ad의 저농도에서도 억제하였다. ED₅₀ 값은 SK-BR-3 세포에 대하여 16 ± 4 m.o.i., T-47D 세포에 대하여 3 ± 3 m.o.i., 및 BT-549 세포에 대하여 2 ± 2 m.o.i.이었다. p53 대신에 동량의 재조합 아데노바이러스 발현 E. Coli 베타-갈락토시다제 (베타-갈) 30 m.o.i.에 의한 MDA-MB-468 및 MDA-MB-231 세포의 감염은 67 ％ 초과의 베타-갈 양성 MDA-MB-468 세포 및 34 내지 66 ％의 베타-갈 양성 MDA-MB-231 세포를 얻게 하였다. 변질된 p53을 갖는 종양 세포의 큰 패널에서의 p53 항증식 효과와 베타-갈 양성 세포의 백분율을 연관시킴으로써 해리스 (Harris) 등은 p53 유도 억제도 및 아데노바이러스 형질도입 사이의 강한 양성 관계를 나타내었다. 대조적으로 정상 수준의 야생형 p53을 발현하는 세포주는 아데노바이러스 형질도입 비율과는 독립적으로 p53 형질도입에 의해 최소로 영향을 받았다.

야생형 p53을 함유하는 2개의 인간 유방 세포주인 MCF7 및 HBL-100 세포의 증식은 시험관내에서 99 m.o.i. 이상의 p53 Ad 농도에 의해 상대적으로 영향을 받지 않았다. 즉, MCF-7 및 HBL-100 세포의 성장 억제는 개별적으로 -231 및 -468 세포에 대한 ED₅₀ 값보다 8 및 33배 이상 높은 p53 Ad 농도를 필요로 하였다. 유사 재조합 p53 Ad를 사용하여 문헌 [Katayose (1995), Clin. Cancer Res. 1: 889-897]에서는 시험관내 형질도입된 -231 세포에서의 증가된 p53 단백질 발현, 감소된 세포 증식, 및 증가된 세포자멸 세포 사멸을 나타내고 있다. 상기 연구는 생체내 유방암 이종이식에 대한 -468 및 -231 세포에 의한 시험관내 상기 결과를 연장한다. 아데노바이러스-매개 p53 유전자 치료의 효능은 시험관내 아데노바이러스 형질도입에 대해 내성인 또다른 유방암 세포주 (MDA-MB-435)에서 평가된다.

<물질 및 방법>

<시험관내 세포주 및 아데노바이러스 감염>

인간 유방암 세포주 MDA-MB-231, -468 및 -435는 ATCC (Rockville, Maryland, USA)로부터 얻었다. -231 세포를 37 ℃ 및 5 ％ CO₂에서 10 ％ 태아 송아지 혈청 (FCS; Hyclone, Logan, Utah)으로 DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY)에서 배양하였다. -468 세포를 37 ℃에서 10 ％ FCS 함유 레이보비쯔 (Leibovitz) L-15 배양액 (Life Technologies)에서 배양하였다. -435 세포를 37 ℃에서 15 ％ FCS 및 10 ㎍/㎖ 소 인슐린 (Sigma Chem. Co., St. Louis, Missouri)으로 레이보비쯔 L-15 배양액에서 배양하였다.

이식 유전자 발현이 인간 시토메갈로바이러스 촉진제에 의해 수행되는 인간 야생형 p53 발현 및 E. Coli 베타-갈락토시다제 (베타-갈) 발현 재조합 아데노바이러스 (rAd)의 구조 및 증식을 상기 기재하였다 [Wills (1994)]. 아데노바이러스를 포스페이트 완충액 (20 mM NaH₂PO₄, pH 8.0, 130 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 2 ％ 수크로스)에 투여하였다. C.I.U를 세포 감염 단위로서 정의하였다. 감염 바이러스 입자의 농도를 48시간 감염 기간 후에 바이러스 헥손 단백질 양성 293 세포를 측정함으로써 결정하였다 [Huyghe (1995)].

p53 Ad에 의한 시험관내 감염 연구를 위하여 세포를 12 웰 조직 배양 접시내에 1-5 x 10⁴ 세포/웰의 밀도에 놓았다 (Becton Dickinson, Lincoln Park, New Jersey, USA). 세포를 상기 기재한 바와 같이 0, 10 또는 50 m.o.i. (다중 감염 = C.I.U./세포) p53 Ad로 형질도입하고 72시간 동안 배양하였다 [Wills (1994)]. 베타-갈 Ad에 의한 시험관내 감염 연구를 위하여 세포를 1 x 10⁵ 세포/웰의 밀도에 놓았다. 세포를 0, 10, 50 또는 100 m.o.i. 베타-갈 Ad로 형질도입하였다. 48시간 후에 세포를 0.2 ％ 글루타르알데히드 (Sigma Chemical Co.)로 고정한 후 PBS로 3회 세척하였다 (Life Technologies). 이어서 세포를 X-Gal 용액 [N,N-디메틸포름아미드 중 1.3 mM MgCl₂, 15 mM NaCl, 44 mM 헤페스 완충액, pH 7.4, 3 mM 포타슘 페리시아나이드, 및 1 ㎎/㎖ X-Gal (10 ％ 최종 농도)] 1 ㎖ 중에서 분석하였다. X-Gal은 인디아나주 인디애나폴리스 소재의 베링거 만하임 코포레이션 (Boehringer Mannheim Corp.)으로부터 시판되고 있다. 모든 기타 화학물질은 시그마 (Sigma)로부터 시판되고 있다.

형질 도입된 세포의 백분율을 측정하기 위하여 5개의 현미경 필드에서 각각의 배양 웰로부터 수를 세고, 베타-갈락토시다제를 발현하는 평균 백분율을 각각의 m.o.i.에서 3개의 웰에 대해 계산하였다.

<생체내 아데노바이러스 처리>

무흉선증 누드 마우스 암컷을 찰스 리버 (Charles River) 실험실 (미국 매사츄세츠 윌밍턴 소재)로부터 구입하였다. 모든 마우스를 VAF-배리어 시설에 유지시키고 모든 동물 절차를 문헌 [N.I.H. Guide for the Care] 및 [Use of Laboratory Animals]에 기재된 규칙에 따라 수행하였다. 종양 세포를 피하내 또는 유방 지방 패드에 주사하였다.

세포 접종은 5 x 10⁶ -231 세포/마우스, 1 x 10⁷ MDA-MB-468 세포/마우스 또는 1 x 10⁷ MDA-MB-435 세포/마우스였다. 종양을 생체내에서 10 내지 11일 동안 성장시킨 후, 처리를 개시하기 전 33일 동안 종양이 성장한 하나의 -468 실험을 제외하고는 투여를 시작하였다. 종양 부피를 3 치수에서 측정값의 곱으로서 계산하였다. 매일 상이한 처리 군에 대한 종양 부피를 스타뷰 (Starview) II 소프트웨어 (Abacus Conceps, Berkeley, California) 스튜던트 t-시험에 의해 비교하였다. 0-4 및 7-11일째에 투여된 군에 대한 평균 억제 백분율을 14일 내지 연구의 최종일 동안 유의 수준 (p < 0.05)을 사용하여 계산하였다.

p53 Ad에 의해 유발된 성장 억제율로부터 베타-갈 Ad에 의해 유발된 평균 종양 성장 억제율을 공제함으로써 p53의 특정 효과를 아데노바이러스 벡터 효과와 구별하였다. 모든 바이러스 감염은 종양주변/종양내였다. 일반적으로, 2회의 종양 치료 5일 과정 (즉, 5 주사)을 각각의 마우스에게 수행하고 2일 "휴지기"에 의해 분리하였다. 몇몇의 경우에는 상기 투여 요법을 2주 초과 동안 연장하고(하거나) 몇몇의 주사에서 바이러스 대신 완충액 비히클을 사용하였다. 종양 성장 곡선은 평균 종양 부피 ± s.e.m.을 나타내었다.

<조직학 및 아폽태그 (apoptag) 면역조직화학>

조직 시료를 10 ％ 완충 포르말린에 고정하고 마일즈 (Miles) VIP 티슈 프로세스에서 밤새 진행시킨 후 파라핀 중에 함침시켰다. 5개의 미크론 조직 부위를 레이쯔 마이크로톰으로 절단하였다. 슬라이드를 통상적인 해리스 헤마톡실린 및 에오진 염색약으로 염색하였다 [Luna 등 (1968), Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. New York; McGraw Hill Book Co.]

아폽태그 동일계 세포자멸 검출 키트는 온코사 (Oncor, Gaithersburg, Maryland, U.S.A.)로부터 시판되고 있다. 시료를 키트 지시에 따라 분석하였다. 간단하게는, 탈파라핀화되고 재수화된 조직 부위를 온코 단백질 소화 효소로 처리하고 TdT와 함께 인큐베이션하고 아비딘-과산화효소 키트 (rabbit IgG-Sigma Chem, Co. EXTRA-3) 및 DAB (Vector Lab. SK4100)를 사용하여 전개하였다. 슬라이드를 메틸 그린으로 역염색하였다.

β- 갈락토시다제 분석

종양을 TBS (Triangle Biomedical Sciences, 미국 노쓰 캐롤라이나 듀르햄 소재)에 함침시키고, 2-메틸부탄/드라이 아이스조에서 급속 냉동시켰다. 냉동된 조직 절편 (8 ㎛ 두께)을 5분 동안 4 ℃에서 0.5 ％ 글루타르알데히드 중에서 고정시킨 후, 상기한 바와 같이 β-갈락토시다제 발현에 대해 분석했다.

인테그린 FACS 분석

세포를 0.02 ％ EDTA로 처리하여 현탁시키고, 펠렛화한 후, PBS를 2회 세척했다. 그 다음 세포를 1 x 10⁶ 세포/ml의 농도로 재현탁시키고, 1차 항체 (최종 농도 1 : 250 /ml)로 1 시간 동안 4 ℃에서 인큐베이션시켰다. 세포 현탁액을 PBS로 2회 세척하여 과량의 1차 항체를 제거했다. 그 다음 세포를 1 시간 동안 4 ℃에서 FITC-접합 토끼 항마우스 보조 항체 (최종 농도 1 : 250 /ml, Zymed)로 2회 세척했다. 세포를 앞에서처럼 PBS로 세척하고, 즉시 분석했다. 형광을 FACS Vantage 유동 세포계수기 (Becton Dickinson, 미국 캘리포니아주 마우틴 뷰 소재)로 측정했다. 측면 산란 및 전향 산란을 동시에 측정하고, 모든 데이타를 FACS 연구 소프트웨어 (Becton Dickinson)가 설치된 휴렛 패커드 컴퓨터로 수집했다. 인테그린 수용체의 검출에 사용된 1차 항체는 다음과 같은 공급사로부터 입수했다. 항-알파_v(12084-018, Gibco BRL), 항-베타₃ (550036, Becton Dickinson), 항-알파_v베타₃ (MAP1976, Chemicon), 항-알파₁ (550034, Becton Dickinson), 항-알파_v베타₅ (MAB 1961, Chemicon).

결과

시험관내 아데노바이러스 형질도입 효율 및 p53 성장 억제

-231 및 -468 세포는 둘다 10 m.o.i.에서 고도로 형질도입되었다. 반대로 -435 세포는 100 m.o.i.에서 조차도 거의 형질도입되지 않았다. -231 세포의 경우에는 8 ％ (10 m.o.i.), 46 ％ (50 m.o.i.) 및 62 ％ (100 m.o.i.)의 세포가 β-갈락토시다제 아데노바이러스에 의해 형질도입되었다. 468 세포의 경우에는 78 ％ (10 m.o.i.), 84 ％ (50 m.o.i.), 및 97 ％ (100 m.o.i.)의 세포가 β-갈락토시다제 아데노바이러스에 의해 형질도입되었다. 435 세포의 경우에는 0.5 ％ (10 m.o.i.), 1 ％ (50 m.o.i.) 및 1.3 ％ (100 m.o.i.)의 세포는 β-갈락토시다제 아데노바이러스에 의해 형질도입되었다.

50 m.o.i. p53 Ad로 감염시키면 231 및 468 세포 배양물에서 거의 완전히 세포가 죽었다. 이와 대조적으로 p53 Ad는 435 세포의 성장에 대해서는 검출가능한 효과를 내지 못했다.

사람 유방암 이종이식편에 대한 p53 Ad 효능

아데노바이러스 매개 p53 유전자 요법은 -231 및 -468 이종이식편 (도 3a 및 3b)에 대해 매우 효과적이었다. 231 실험에서, β-gal Ad군에서 마우스 1마리와 p53 Ad군에서 마우스 3마리는 연구의 말미에 종양이 없었고, 모든 종양은 p53 Ad 치료 동안에 퇴행되었다. -231 종양 성장의 억제율은 평균 86 ％ (p ≤ 0.01)였다. p53으로 인한 성장 억제 분율은 평균 37 ％인 반면, 아데노바이러스 특이적 억제율은 평균 49 ％ (p ≤ 0.01)였다. -468 종양 증식의 억제율은 평균 74 ％ (p ≤ 0.001)였다. p53 Ad군에서 마우스 한 마리는 연구 말미에 종양이 없었고, 모든 종양이 p53 Ad 치료 동안에 퇴행되었다. p53에 의한 성장 억제 분율은 평균 45 ％ (p ＜ 0.001)인 반면, 아데노바이러스 특이적 억제율은 평균 28 ％ (p ≤ 0.05)였다. 어떠한 실험에서도 아무런 부작용이 나타나지 않았다. -231 및 -468 종양 성장 억제에 대한 ED₅₀ 값은 각각 3 x 10⁸ C.I.U. (세포 감염 유닛) 및 2 x 10⁸ C.I.U.이었다 (도 4). -435 종양은 p53 Ad 처리에 대해 거의 완벽하게 내성이 있었다 (도 3c). 아데노바이러스로 처리한 435 종양군에서 성장 억제율은 미미했다.

도 5는 -231 종양에 대한 p53 Ad 투여 체계 두 개의 효능을 비교하여 보여준다. 모든 마우스는 1 주마다 5회씩 종양주위 주입하였다. 치료제 (p53 Ad)로 처리한 모든 마우스는 마우스 한마리당 1 주일에 총 2.2 x 10⁹ C.I.U.를 투여받았다. 한 군에게는 아데노바이러스 1주일 전체 투여량이 함유된 볼러스로 투여했다. 그 주의 나머지 4회는 완충 비히클을 주입했다 (1X 군). 다른 처리군에게는 동일한 Ad 투여량을 1주일에 5회로 나누어 주입했다 (5X 군). 이 투여량 체계는 1주 및 3주 (0-4일, 14-18일) 동안에 제공되었다. 성장 억제율은 연구 시작 첫 3주 동안 5X 군의 경우 평균 73 ％였으나 (p < 0.01), 1X 군의 경우에는 평균 44 ％에 지나지 않았으며 (p < 0.05), 21일 이후에는 미미했다. p53 유전자 치료의 첫번째 싸이클은 두번째 싸이클보다는 더 효과적이었다. 제1 치료 싸이클 이후에, 1X 군에서 4마리, 5X 군에서 5마리 및 비히클 대조군에서 1마리가 종양이 없었다. 5X 군에서 1마리는 21일까지 매우 작은 종양이 재발했다. 제2 싸이클 치료 이후에는 추가의 치료 흔적은 관찰되지 않았다.

도 6은 도 3b에 도시된 468 종양 보다는 처음에 4배 이상 컸던 468 종양을 써서 아데노바이러스 10배 저투여량으로 처리한 실험을 보여준다. 마우스 한마리당 1 주일에 총 2.2 x 10⁸ C.I.U. p53 Ad 투여량을 투여했다. 한 군에게는 하나의 볼러스 주입으로 바이러스를 투여한 후, 한 주에 4회 완충액을 주입했다 (1X 군). 처리된 다른 군에게는 동일한 바이러스 투여량을 1 주일에 5회로 나누어 주입했다 (5X 군). 이들 투여 일정은 6주 동안 이루어졌다. 6주에 걸쳐 투여된 총 바이러스 투여량은 도 3에 사용된 투여량의 대략 절반이었다. 이 투여 체계는 p53 Ad로 처리된 마우스에서 종양 부피에 대해 세포정지(cytostatic) 효과를 낳았다 (p ≤ 0.05). 연구 초기에 행해진 치료는 연구 후반에 제공된 치료보다 효과적인 것으로 나타났다. 5X 군 중 한 마리는 21일까지 종양이 없었다. 그러나 모든 마우스에서 종양 성장 억제를 비교할 때, 1X 투여 체계 (60 ％)는 5X 군 (55％) 보다 약간 더 효과적이었으나 의미있는 정도의 차이는 아니었다. 다 투여한 지 1 주일 후, 5X 군에서 종양 성장률은 증가하기 시작했다. 연구를 시작한 지 1 개월 후에, 비히클 대조 종양은 괴사하기 시작했고, 성장은 정체되었다.

반복된 아데노바이러스 노출 후 생체내 감염도

도 5 및 6에 나타낸 연구의 말미에, 일부 종양에 β-gal Ad를 주입했다. 이들 종양을 24 시간 후에 수거하고, 냉동된 조직 절편을 β-갈락토시다제 발현에 대해 분석했다. p53 Ad로 2 또는 6주 동안 처리한 종양을 β-gal Ad로 형질도입했으나 형질도입은 1 주일에 5회씩 p53 Ad를 6 주 동안 처리한 468 종양의 경우가 가장 저조했다. 5X 군에서 주입된 3 - 468 종양 중 단지 하나로부터 얻은 절편만이 β-갈락토시다제를 발현하는 세포를 갖고 있었다.

p53 Ad에 의한 생체내 세포자멸 ( apopotosis )의 유발

누드 마우스에서 MDA-MB-231 및 MDA-MB-468 유방암 이종이식편에 1-5 x 10⁸ C.I.U. p53 Ad 또는 완충액을 주입한지 48 내지 72 시간 후에 수거했다. p53 Ad에 의한 세포자멸의 유발율을 Apoptag 면역조직화학법을 써서 조직 절편에 대해 분석했다. p53 Ad를 주입한 종양은 종양내 주입된 종양의 바늘 진로 및 종양주위 주입된 종양의 외부 둘레를 따라서 대규모 세포자멸 면적이 나타났다. 반대로, 완충액을 주입한 종양은 예상했던 바와 같이 단지 몇군데에 산발적인 세포자멸만이 나타났다.

MDA -MB-231 및 MDA -MB-435 세포에서 인테그린 발현의 비교

MDA-MB-231 및 MDA-MB-435 세포에서 인테그린 발현에 대한 FACS 분석을 수행하여, MDA-MB-435 세포의 낮은 Ad 형질도입이 Ad 2, 3, 및 4형의 내부진입 (internalization)에 필요한 알파_v 인테그린의 부족 때문인지를 결정했다 (Wickham et al. (1993) Cell, 73: 309-319; Wickham et al. (1994) J. Cell Biol., 127: 257-264; 및 Mathias et al. (1994) J. Viol. 68 : 6811-6814). 두 종류의 세포 모두 알파_v, 알파_v베타₃, 알파_v베타₅ 및 베타₁ 인테그린 부분을 대략 동일한 수준으로 발현했다. 인테그린 알파_v베타₃, 및 베타₃ 발현은 MDA-MB-231 세포에서 보다 MDA-MB-435 세포에서 더 높았다.

토론: 총 2.2 x 10⁹ C.I.U. p53 Ad의 투여량을 10회 주입으로 투여했을 경우, 종양 성장 억제율은 MDA-MB-468 종양의 경우 평균 74 ％이고 MDA-MB-231 종양은 86 ％였으나, MDA-MB-435 종양의 경우에는 미미했다. MDA-MB-468 종양에서는 총 반응의 61 ％가 p53에 특이적이었고, MDA-MB-231 종양에서는 총 반응의 43 ％가 p53에 특이적이었다. β-gal Ad가 MDA-MB-231, MDA-MB-468 및 MDA-MB-435 세포에 시험관내 형질도입하는 능력은 대개 생체내 결과로 추정했다. 동일한 바이러스 농도에서 -468 세포는 MDA-MB-231 세포 보다 약간 높은 형질도입율을 나타냈고, MDA-MB-435 세포는 아데노바이러스 형질도입에 대해 내성이 있었다. MDA-MB-435는 생체내의 매우 저조한 반응과 관련된 시험관내 결과가 나왔다.

p53-리포솜 벡터를 이용한, MDA-MB-435 종양이 있는 누드 마우스의 전신 처리는 종양 성장 억제를 일으키는 것으로 관찰되었으며, 몇몇 경우에는 종양을 소멸시켰다 (Lesoon-Wood et al. (1995) Hum. Gene Ther., 6: 395-405). p53-리포솜 처리로 인해 또한 폐 전이의 수가 감소되었다. 이 결과는, 이 연구에서 MDA-MB-435 종양의 p53 Ad 처리에 대한 반응의 결여가 p53이 MDA-MB-435 종양의 성장 및 전이를 억제하는 능력이 없어서가 아니라는 것을 입증한다. 오히려 이 결과가 의미하는 것은 p53 Ad 처리에 대해 MDA-MB-435 세포의 무반응성을 초래하는 이들 세포의 아데노바이러스 형질도입율이 낮기 때문이라는 것이다.

알파_v 인테그린은 2, 3, 4형 아데노바이러스의 효과적인 내부진입에 필요한 세포 요소로 이해되었다 (Wickham (1993) 앞의 책; Wickham (1994) 앞의 책; 및 Mathias (1994) 앞의 책). 알파_v 인테그린은 5형 Ad와 동일한 역할을 수행하는 것으로 보인다. 문헌 (Wickham et al. (1994) 앞의 책)에서는 알파_v를 발현시키지 않거나 또는 알파_v베타₃으로 형질감염된 세포와 비교할 때 알파_v베타₅로 형질감염된 세포에서 재조합 5형 아데노바이러스의 내부진입이 5 내지 10배 크게 관찰되었다. 본원에서 p53 Ad의 생산에 사용된 사람 배아 신장 -293 세포는 알파_v베타₁을 발현하지만, 알파_v베타₃ 인테그린을 발현하지는 않았다 (Bodary (1990) J. Biol. Chem. 265: 5838-5941). 따라서, -435 세포의 알파_v, 베타₁, 베타₃ 및 알파₅ 인테그린 서브유닛 발현을 측정하는 것이 경제적인 것으로 생각되었다. MDA-MB-231 및 MDA-MB-435 세포는 둘다 인테그린 패밀리 분자를 대강 동일한 수준으로 발현했다. 따라서, MDA-MB-435 세포의 Ad 형질도입의 결여는 알파₅ 인테그린 발현의 부족 때문은 아니다. 현재 어떠한 문헌도 표적 세포에 대한 Ad 결합에 필요한 세포 수용체의 동정을 기재한 것이 없다. MDA-MB-435 세포는 이 수용체에 결함이 있거나, 바이러스 결합, 내부진입 또는 유전자 발현에 필요한 일부 다른 성분에 결함이 있을 수 있다.

다중 싸이클 치료에 대한 계속된 p53 Ad의 효능을 MDA-MB-231 및 MDA-MB-468 종양 모델에서 시험했다. 그 효능은 투여를 계속함에 따라 감소하는 것으로 나타났으나 이 효과는 더 자세하게 시험할 필요가 있다. 아데노바이러스 감염은 완전히 기능적인 면역계를 가진 숙주내에서 세포독성 T 세포에 의해 매개되는 급속한 염증성 및 세포용해성 반응을 일으킨다는 것이 유력한 이론이었다 (Wilson (1995) Nature Med. 4: 887-889). 이 T 세포 반응은 숙주 세포에서 생산되는 아데노바이러스 항원에 의해 자극되며, 세포 표면에서 MHC 부분과 함께 제공된다. 아데노바이러스에 의해 형질도입된 세포에 특이적인 항체의 중화는 면역 반응 후반부에 발생하며, 초기 접종 후에 아데노바이러스로 숙주 세포를 재감염시키는 능력의 감소에 원인이 되는 것으로 생각된다. 이 연구에 사용된 무흉선 누드 마우스는 외래 항원에 대한 T 세포 면역 반응에 결함이 있으나 B 세포 매개 항체 반응을 일으킬 수 있다 (Boven (1991) The Nude Mouse in Oncology Research. Boston: CRC Press). 항-아데노바이러스 항체의 중화 발생은 본 연구에서 시간에 따라 p53 아데노바이러스 (p53 Ad) 치료의 효능이 감소하는 것을 설명할 수 있었다. 누드 마우스에서 손상된 면역 기능 및 종양 이종이식편의 내부로의 빈약한 혈액 공급이 투약 6 주 후에도 존재하는 p53 Ad의 부분적 효능 및 반복된 p53 Ad 주입 후에도 β-gal Ad로 수개의 종양 세포를 감염시키는 능력을 설명할 수 있었다.

유방암 이외에, 많은 다른 암을 야생형 p53을 발현시키는 재조합 아데노바이러스로 처리했다. 이들 보고서 가운데에는 자궁경부암 (Hamada (1996) Cancer Res. 56: 3047-3054), 전립선암 (Eastham (1995) Cancer Res. 55: 5151-5155), 두부 및 경부암 (Clayman (1995) Cancer Res. 55: 1-6), 폐암 (Wills (1994) 앞의 책), 난소암 (13), 신경교아세포종 (27, 28), 및 결장직장암 (13, 29)의 모델이 있다. 이들 데이타는 총괄적으로, 아데노바이러스 매개 p53 유전자 치료의 효과를 평가하는 진행중인 임상 연구들을 뒷받침한다. 본 결과는 p53 돌연변이체를 발현하는 유방암 이종이식편내에서 생체내 암세포 성장을 축소시키는 야생형 p53의 능력을 입증한다. 본 연구는 또한 표적 세포가 적절한 바이러스성 "수용체(들)"을 발현할 때 아데노바이러스가 p53에 대한 효과적인 운반체임을 확인시켜 준다.

<실시예 4>

종양 억제율에 대한 치료 체계의 추가 연구

본 발명은 각종 투여 체계를 써서 종양 억제 폴리펩티드를 발현하는 핵산을 투여함으로써 각종 암을 치료하는 방법을 제공한다. 다음의 실시예는 본 발명의 p53 발현 아데노바이러스의 분할 투여의 효능 증가에 대해 상세히 설명한다.

일정한 기간에 걸쳐 투여되는 분할 투여와 단일 투여 체계의 효과를 비교 연구하기 위해서, MDA-MB-468 및 MDA-MB-231 종양을 주입한 중증 복합 면역결핍증 (SCID) 마우스를 마우스 한 마리당 총투여량 1 x 10⁹ C.I.U. p53 Ad (A/C/N/53)를 하나의 볼러스로 주입하거나 또는 3 또는 5회 분할하여 일주일에 걸쳐 하루에 한번 투여했다 (도 7에서 화살표로 표시).

MDA-MB-468 종양으로 얻은 결과는 MDA-MB-23 종양으로 얻은 것과 유사했으며, 도 7a, 7b 및 7c에 나타냈다. 일반적으로 분할 투여는 단일 볼러스 주입보다 종양 성장을 더 잘 억제하였으며, 5회 주입 투여 체계가 3회 주입 투여 체계 보다 훨씬 더 개선되었다.

<실시예 5>

덱사메타손이 NK 세포 매개 항- 아데노바이러스 면역 반응과 관련된 종양 성장의 억제를 잠재운다.

아데노바이러스 벡터의 반복 투여는 항-아데노바이러스 면역 반응을 유발시킬 수 있다는 것이 입증되었다. 저투여량 덱사메타손 (Dex)의 면역 억제인자 성질이 항-아데노바이러스 면역 반응 (예를 들면, NK 세포 반응)을 억제할 수 있는지를 연구하기 위해서, 중증복합면역결핍증 마우스에서 MDA-MB-231 종양을 본 발명의 재조합 바이러스로 덱사메타손의 존재 및 부재하에 처리했다.

마우스 한 마리당 대략 5 x 10⁶ MDA-MB-231 세포를 0일에 암컷 중증복합면역결핍증 마우스의 유방 지방 패드로 주입했다. 11일째 덱사메타손 또는 위약 펠렛을 피하 이식했다. 5 mg 펠렛을 하루에 83.3 ㎍씩 60일간 계속해서 덱사메타손을 방출할 수 있도록 설계했다 (Innovative Research of America, 미국 플로리다주 사라소타 소재). 모든 마우스에게 하루에 1번씩 14 내지 18 및 21 내지 25일째에 (1회 주입당 0.1 ml씩) 총 10회의 종양주위 주입을 수행했다. 총 바이러스 투여량은 마우스 한 마리당 2 x 10⁹ C.I.U. p53 Ad (A/C/N/53 또는 β-갈락토시다제 Ad)였다. 치료제는 표 5에 열거했다.

저투여량의 덱사메타손을 처리하면 중증복합면역결핍증 마우스에서 MDA-MB-231 종양의 성장률에 미치는 효과는 미미했다 (p > 0.05). 덱사메타손의 불리한 부작용은 전혀 관찰되지 않았다. β-갈락토시다제 아데노바이러스를 이용한 종양의 치료는 위약 대조 종양에서 종양 성장을 상당히 억제했으나 (p ≤ 0.001, 21-30일), 덱사메타손 처리 종양에서는 그렇지 않았다 (p > 0.05, 도 8 참조). 위약 및 β-gal Ad 처리한 종양은 위약 및 덱사메타손을 처리한 종양보다 더 느리게 성장했다 (p ≤ 0.01, 23-30 일).

위약 대조 종양에서 종양 성장의 p53-특이적 억제는 미미했다 (p > 0.05). 반대로 덱사메타손 및 p53 Ad로 처리한 종양은 덱사메타손 및 β-gal Ad (p ≤ 0.02, 21-30일째) 또는 위약 및 p53 Ad (p ≤ 0.04, 21-30일째)로 처리한 종양보다 훨씬 더 느리게 성장했다.

따라서 저투여량 덱사메타손 처리는 중증복합면역결핍증 마우스 내에서 항-아데노바이러스 면역 반응 (예를 들면 NK 세포 반응)과 관련된 종양 성장 억제를 불리한 부작용 없이 잠재웠다. 이 데이타가 의미하는 바는 저투여량 덱사메타손 처리가 재조합 아데노바이러스에서 CMV 프로모터에 의해 유발되는 트랜스유전자 (예를 들면, p53) 발현을 자극할 수 있다는 것이다. 거꾸로, 덱사메타손은 아데노바이러스 형질도입 효능을 증가시킬 수 있기 때문에, 종양 세포 사멸율을 증가시킬 수 있다.

그 다음에는 MDA-MB-231 유방암 모델을 사용해서, 외래 항원에 대한 면역 반응을 일으키는 능력에 차이가 있는 마우스에서 p53과 함께 또는 p53 없이 Ad의 항종양 효능을 평가했다. T 세포가 기능을 상실한 누드 마우스, T 및 B 세포가 기능을 상실한 중증복합면역결핍증 마우스, 및 T, B 및 NK 세포가 기능을 상실한 중증복합면역결핍증 베이지 마우스를 연구했다.

MDA-MD-231 이종이식편에 대한 rAd5/p53 (상기함)의 효능을 연구하기 위해서, 누드 마우스에게 마우스 한 마리당 총투여량 2.2 x 10⁹ C.I.U. Ad를 0 내지 4일 및 7 내지 11일에 10회로 나누어 투여했다. 중증복합면역결핍증 마우스는 총 바이러스 투여량 4 x 10⁹ C.I.U.를 0-4일째 및 7-11일째에 10회로 나누어 투여했다. 중증복합면역결핍증 베이지 마우스는 총 바이러스 투여량 1.6 x 10⁹ C.I.U.를 0-4일째 및 7-11일째에 10회로 나누어 투여했다. 모든 마우스를 p53 Ad, β-gal Ad, 또는 비히클만으로 처리했다.

누드 마우스 (T 세포 기능 상실) 또는 중증복합면역결핍증 마우스 (T 및 B 기능상실; NK 세포 활발)에서 대조 Ad 벡터 (p53 삽입체 없음)를 종양내 투여하면 종양 성장을 어느 정도 억제했다. p53을 발현하는 Ad (rAd5/p53)는 대조 Ad와 비교할 때 항종양 효능이 크게 향상되었다. 반대로, 중증복합면역결핍증 베이지 마우스 (T, B, NK 세포 모두 기능 상실)에서는 항종양 효능은 전적으로 p53 발현에 의한 것이며, Ad 벡터는 종양 성장 억제에 전혀 기여하지 못했다. 이들 데이타를 통해 Ad 매개 종양 성장 억제에서 NK 세포에 대해 사전에 인식하지 못했던 역할이 입증되었다. 이 데이타는 또한 면역계의 억제가 일부 벡터 특이적, NK 세포 매개 부작용을 방지할 수 있음을 의미한다.

<실시예 6>

p53 아데노바이러스 및 화학요법 치료의 조합

본 발명은 신생물 치료에 있어서 종양 억제 폴리펩티드를 발현하는 핵산 및 화학치료제의 조합 투여법을 제공한다. 다음의 실시예는 각종 항암제, 시스플라틴, 독소루비신, 5-플루오로우라실 (5-FU), 메토트렉세이트 및 에토포시드와 조합한 본 발명의 p53 발현 아데노바이러스의 신생물 치료 능력에 대해 상세하게 설명했으며, 조합 치료법이 각 작용제를 단독으로 처리했을 때 보다 종양 세포를 죽이는데 있어서 더 효과적이었다 (즉, 상승 효과가 있다).

시험관내에서 화학치료제와 p53 의 조합 투여

p53과 시스플라틴, 독소루비신, 5-플루오로우라실 (5-FU), 메토트렉세이트, 및 에토포시드의 조합

임상적으로 적합한 항암제들인 시스플라틴, 독소루비신, 5-플루오로우라실 (5-FU), 메토트렉세이트, 및 에토포시드를 본 발명의 종양 억제 벡터 (A/C/N/53)와 조합투여한 효과를 시험관내에서 연구했다. SCC-9 두부 및 경부 판상(squamous) 세포 암종, SCC-15 두부 및 경부 판상 세포 암종, SCC-25 두부 및 경부 판상 세포 암종, 및 DU-145 전립선 암종 세포에 다음 3가지 치료 체계 하나를 적용했다. 치료법 1에서는 세포를 p53 아데노바이러스 제작물 A/C/N/53에 노출시키기 24시간 전에 항암 화학요법으로 미리 처리했다. 치료법 2에서는 세포를 p53 아데노바이러스 제작물로 예비처리한 후, 항암 화학치료제와 접촉시켰다. 치료법 3에서는 세포를 항암 화학치료제 및 p53 아데노바이러스와 동시에 접촉시켰다.

모든 세포주는 ATCC (미국 메릴랜드주 록빌소재)에서 얻었다. SCC-9, SCC-15 및 SCC-25 두부 및 경부 종양 세포 (p53^null)를 37 ℃ 및 5 ％ CO₂에서, 10 ％ 태송아지 혈청 (FCS; Hyclone, 미국 유타주 로간 소재), 0.4 ㎍/ml 히드로코르티손 (Sigma Chem. Co., 미국 미주리주 세인트루이스 소재), 및 1 ％ 비필수 아미노산 (Gibco)이 함유된 Ham's F-12 (Gibco/Life Technologies, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재) 및 DMEM의 1 : 1 혼합물에서 배양했다. SK-OV-3 사람 난소 종양 세포 (p53^null) 및 DU-145 사람 전립선 종양 세포 (p53^mut)를 37 ℃ 및 5 ％ CO₂에서 이글스 MEM + 10 ％ FCS에서 배양했다. MDA-MB-231 사람 유방 종양 세포 (p53^mut)를 37 ℃, 5 ％ CO₂에서 10 ％ 태송아지 혈청 (Hyclone)이 함유된 DMEM (Gibco)에서 배양했다. MDA-MB-468 사람 유방 종양 세포 (p53^mut)를 37 ℃의 CO₂ 부재하에서 10 ％ FCS가 함유된 Leibovitz의 L-15 배지 (Gibco)에서 배양했다.

MDA-MB-231 유방 종양 세포는 p53 유전자의 280 코돈에서 Arg에서 Lys로의 돌연변이를 보유하고 있어서, 돌연변이 p53을 발현한다 (Barteck (1990) 앞의 책). DU-145 전립선 종양 세포는 상이한 염색체 상의 p53 돌연변이 2 개, 즉, 223 코돈에서 Pro에서 Leu로의 돌연변이 및 274 코돈에서 Val에서 Phe로의 돌연변이를 보유하며 (Isaacs (1991) Cancer Res. 51: 4716-4720), 돌연변이 p53을 발현한다. SK-OV-3 난소 종양 세포는 p53-무효이다 (p53-null) (Yaginuma (1992) Cancer Res. 52: 4196-4199). SCC-9 세포는 274 코돈 및 285 코돈 사이에 결실이 있어서, 프레임 이동 돌연변이가 유발되기 때문에 SCC-9 핵에서는 아무런 면역반응성 p53 단백질이 검출되지 않는다 (Jung (1992) Cancer Res. 52: 6390-6393; Caamano (1993) Am. J. Pathol. 142: 1131-1139; Min (1994) Eur. J. Cancer 30B: 338-345). SCC-15 세포는 224 코돈과 225 코돈 사이에 5 개 염기쌍이 삽입되어, 이들 세포는 p53 mRNA를 소량 생산하기는 하지만 p53 단백질은 전혀 검출되지 않는다 (Min (1994) 앞의 책). SCC-25는 17번 염색체에 이형접합성이 상실 (LOH)되었으며, 나머지 대립유전자에서 2개의 염기쌍이 코돈 209에서 결실된 것이다. p53 mRNA는 SCC-25 세포에서 검출되지 않으며, 어떠한 면역반응성 p53 단백질도 이들 핵에서 관찰되지 않는다 (Caamano (1993) 앞의 책). 배양 배지에서 대략 1.5 x 10⁴ 세포 (실시예 1에 기재됨)를 96 웰 마이크로적정 플레이트의 각 웰마다 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO₂에서 약 4 시간 동안 배양했다.

사람 야생형 p53 및 대장균 갈락토시다제 (β-gal) 아데노바이러스 (Ad)의 제작 및 증식은 상기 기재한 바와 같다 (Wills (1994) 앞의 책). 감염성 바이러스 입자의 농도는 48 시간의 감염 기간 후에 바이러스 헥손 단백질 양성 293 세포의 농도를 측정함으로써 결정되었다 (Huyghe (1995) 앞의 책). C.I.U.는 세포감염 유닛으로 정의된다. p53 발현 아데노바이러스를 인산염 완충액 (20 mM NaH₂PO₄ (pH 8.0), 130 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 2 ％ 수크로오즈)에 투여했다. 이 약물, p53 아데노바이러스 또는 적절한 비히클/완충액을 각 웰마다 첨가했다. p53 Ad를 이용한 시험관내 연구를 위해서, 96 웰 플레이트에서 웰 하나 당 1.5 x 10⁴ 세포의 밀도로 세포를 플레이팅하고, 37 ℃, 5 ％ CO₂에서 4 시간 동안 배양했다. 약물, p53 Ad 또는 적당한 비히클을 각 웰마다 첨가하고 세포를 밤새 계속 배양했다. 그 다음 약물, p53 Ad 또는 적당한 비히클을 각 웰에 첨가했다. 세포 배양은 추가로 2일 동안 계속했다.

세포 사멸율은 문헌 (Mosmann (1983) J. Immunol. Meth., 65: 55-63)에 기재된 바와 같이 MTT 분석법에 따라 정량했다. 간단하게 요약하자면, 대략 25 ㎕의 5 mg/ml MTT 생체염료 [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드]를 각 웰마다 첨가하고, 3 내지 4 시간 동안 37 ℃, 5 ％ CO₂에서 인큐베이션시켰다. 그 다음 10 ％ SDS 세정제 100 ㎕를 각 웰마다 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO₂에서 밤새 인큐베이션시켰다. 그 다음 각 웰에서의 신호를 Molecular 장치 마이크로적정 플레이트 판독기를 써서 정량했다.

모든 경우에, 시스플라틴 (결과 요약은 표 6 참조), 독소루비신 (결과 요약은 표 7 참조), 5-FU, 메토트렉세이트 및 에토포시드를 사용하여 조합 치료하면 작용제 어느 하나를 단독으로 사용하는 것보다 종양 세포를 죽이는데 더 효과적이었다. 메토트렉세이트 및 p53 Ad를 조합하는 것은 하나의 세포주에 대해 시험했다. SCC-15 세포를 0.7 μM 메토트렉세이트로 처리한지 24 시간 후 5 m.o.i. p53 Ad로 처리했을 경우에는 두 약물의 조합 항증식 효과가 p53 Ad 단독으로 처리했을 때보다 겨우 5 ％ 정도가 컸지만, 이런 차이는 통계적으로 의미있는 것이었다 (p ≤ 0.003). DU-145 세포를 2.6 μM 에토포시드로 예비처리한 지 24 시간 후에 5 또는 10 m.o.i. p53 Ad로 처리하면, 두 약물 중 어느 하나를 단독으로 처리하는 것에 비해 더 큰 조합 효능이 얻어졌다 (p ≤ 0.001). SCC-15 세포를 0.3 μM 에토포시드로 처리한지 24 시간 후 5 m.o.i. p53 Ad로 처리했을 경우에는 두 약물의 조합 항증식 효과는 p53 Ad 단독 보다 겨우 5 ％가 더 컸지만 이 차이는 통계적으로 의미있는 것이었다 (p ≤ 0.003). 종양 억제 유전자 치료 및 항신생물 작용제의 조합은 길항 효과를 나타내지는 않았다.

제2 실험에서, 정상 세포 (MRC-9 세포)의 치료 효능을 종양 세포와 비교했다 (도 9). 이 실험에서, 성장은 MTT 분석보다는 ³H-티미딘 혼입량으로 분석했다. 정상 세포 (배수체 섬유아세포 MRC-9 세포)는 조합 처리에 따른 더 두드러진 효과를 나타내지는 않았다. 예상했던 바와 같이 종양 억제인자 단독 효과는 정상 세포에서는 무시할 수 있을 정도였고, 종양 세포에서는 매우 컸다. 반대로 항암 화학치료제 단독 (예를 들면, 시스플라틴, 독소루비신, 5-FU, 메토트렉세이트, 및 에토포시드)은 암 세포에서보다 정상세포에서 더 효과적이었다 (도 9 참조).

사람 간세포 암종에 대한 독소루비신 및 p53 효과

다음의 실시예는 독소루비신과 조합하여 신생물을 치료하는 본 발명의 p53 발현 아데노바이러스의 능력과, 조합 치료가 각 작용제를 단독으로 사용하는 것보다 종양 세포를 죽이는데 있어서 더 효과적이다, 즉 상승 효과가 있다는 것을 상세하게 설명한다. 결과는 본 발명의 p53 발현 벡터 (ACN 53)과 독소루비신 사이의 상승 관계를 보여준다.

독소루비신 (Adriamycin) 및 p53 (ACN53, 사람 야생형 p53 트랜스유전자를 발현하는 재조합 아데노바이러스 제작물)을 돌연변이 p53이 있는 사람 간세포 암종 세포주 HLE (Hsu (1993) Carcinogenesis 14: 987-992; Farshid (1992) J. Med. Virol. 38: 235-239; Dor (1975) Gann. 66: 385-392), 돌연변이 p53이 있는 사람 간세포 암종 세포주 HLF (같은 책), 무효 p53이 있는 사람 간세포 암종 Hep 3B (Hasegawa (1995) In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31: 55-61); p53 야생형이 있는 사람 간세포 암종 Hep G2 (같은 책) 및 p53 야생형이 있는 사람 간 선암 SK-HEP-1 (Lee (1995) FEBS Lett. 368 : 348-352)에 투여했다. 세포 생존능력을 간세포 프로브 칼시엔 AM (Molecular Probes)로 측정했다 (예를 들면, Poole (1993) J. Cell Sci. 106: 685-691). 기질 칼시엔 AM이 세포내 에스테라제에 의해 절단되면, 형광물이 발생한다.

세포를 96 웰 플레이트에 플레이팅 (5 x 10³ 세포/웰)하고, 밤새 부착하도록 하고, 0일에 ACN53 희석액 및 독소루비신 희석액을 3회 반복 처리하여, 독소루비신 처리에 대한 투여량 반응 곡선을 ACN53의 각 투여량에 대해 얻었다. 3일에 배지를 빨아내고, PBS 중의 칼시엔 AM을 세포에 가했다. 각 웰에서 형광 세기를 형광 플레이트 판독기를 써서 측정했다. 세포가 없는 웰의 형광치를 빼고, 데이타를 미처리 대조 웰과 비교하여 생존율(％) (형광세기)로 나타냈다. ED₅₀ 값을 써서 이소볼로그램 그래프를 만들고, ACN53 및 독소루비신 사이의 상호 관계를 평가했다.

각 세포주에 대한 이소볼로그램 분석은 본 발명의 p53 발현 벡터 (ACN53)와 독소루비신 간의 상승 관계를 보여주었으며, 이 상승효과는 세포주의 p53 상태와 무관했다. 그러나 독소루비신이 없는 상태에서 ACN53에 대한 ED₅₀은 p53 변형 세포주에서 보다 p53 야생형 세포주에서가 높았다.

다른 유사한 실험에서, HLE 세포를 96 웰 플레이트 (5 x 10³ 세포/웰)에 플레이팅하고, 밤새 부착시키고, ACN53의 희석액과 독소루비신의 희석액을 3회 반복 처리하여 독소루비신에 대한 투여량 반응 곡선을 각 ACN53 투여량에 대해 얻었다. 3개의 군을 써서 ACN53과 독소루비신 사이의 상호관계에 대한 투여 순서에 대한 효과를 시험했다.

세포를 처음 처리한 후 3 일 동안 인큐베이션시켰다. 배지를 빨아내고, PBS 중의 칼시엔 AM를 세포에 가했다. 각 웰에서 형광 세기를 형광 플레이트 판독기를 써서 측정했다. 세포가 없는 웰의 형광치를 빼고, 데이타를 미처리 대조 웰과 비교하여 생존율(％) (형광세기)로 나타냈다. ED₅₀ 값을 써서 이소볼로그램 그래프를 만들고, ACN53 및 독소루비신 사이의 상호 관계를 평가했다. 각각의 투여 체계에 대한 이소볼로그램 분석을 통해, 처리의 투여 순서와는 무관하고 상승 효과와 일치하는 HLE 세포에서의 ACN53과 독소루비신 사이의 유사한 상호관계를 입증했다.

체내에서 화학치료제와 p53 의 사용

본 발명의 종양 억제 벡터 (A/C/N/53)와 조합 사용된 임상 관련 항암 약물인 시스플라틴, 독소루비신 및 5-플루오로우라실 (5-FU)의 효과를 체내에서 더 연구하였다. C.B. 17/ICR-SCID 마우스를 Taconic Farms (미국 뉴욕주 저먼타운 소재) 또는 Charles River Laboratories (미국 매사추세츠주 윌밍톤 소재)로부터 구입하였다. 무흉선 nu/nu 마우스는 Charles River Laboratories로부터 구입하였다. 모든 마우스를 VAF-배리어 장치에 유지시키고, 모든 동물 과정을 실험 동물 관리 및 사용에 대한 N.I.H. 가이드에 제시된 규칙에 따라 수행하엿다. 매일 상이한 처리군에 대한 종양 부피를 Statview II 소프트웨어 (미국 캘리포니아주 버클리 소재의 Abacus Concepts)를 사용하여 Student 시험에 의해 비교하였다. 종양 성장 곡선을 평균 종양 부피 ± s.e.m.을 나타내도록 작성하였다. 군당 10 마리의 마우스를 사용하였다.

SK- OV -3-난소 종양 모델:

확립된 복강내 SK-OV-3 종양을 비히클, p53 Ad, 시스플라틴 또는 두개의 약물 모두의 복강내 투여로 처리하였다. 마우스에게 2주에 걸쳐 p53 Ad를 6회 주사하였다. 총 바이러스 투여량은 1.5 x 10⁹ C.I.U. (3.1 x 10¹⁰ 바이러스 입자)였다.

시스플라틴 효능: SCID 마우스 암컷에 대해 0일차에 5 x 10⁶ SK-OV-3 난소 종양 세포를 복강내 주사하였다. 마우스에게 6, 8, 10, 13, 15 및 17일에 복강내 주사하였다 (17일에는 p53 Ad만 주사함). 총 0.2 ml 부피 (시스플라틴 비히클 또는 시스플라틴 0.1 ml + Ad 완충액 또는 p53 Ad 0.1 ml)가 마우스에게 투여되었다. p53 Ad 투여량은 2.5 x 10⁸ C.I.U./마우스/일 (5.2 x 10⁹ 바이러스 입자)이었다. 시스플라틴 투여량은 2 mg/kg/일이었다. 종양을 수거하여 20일차에 중량을 측정하였다.

한 처리군의 마우스에 대해서는 제1의 p53 Ad 5회 투여량과 동시에 시스플라틴 5회 투여량을 투여하였다. 이 복강내 p53 Ad 투여는 마우스의 종양을 20일에 단지 17％만을 저하시켰다 (p≤0.01). 그러나, 시스플라틴과 조합한 경우에는, p53 Ad는 시스플라틴 단독의 경우에 비해 종양을 38％ 감소시겼다 (p≤0.0008). 약물 비히클 또는 p53 Ad 단독으로 처리된 마우스에는 출혈 복수증 및 횡경막 근육의 침윤성 종양 결절이 발생하였다. 이러한 증상은 시스플라틴 단독 또는 시스플라틴과 p53 Ad로 처리한 마우스에서는 발생하지 않았다.

시스플라틴/파클리탁셀 효능: SCID 마우스 암컷에 대해 0일차에 2.5 x 10⁶ SK-OV-3 난소 종양 세포를 복강내 주사하였다. 마우스에게 7, 9, 11, 16 및 18일에 복강내 주사하였다. 총 0.3 ml 부피 (시스플라틴 비히클 또는 시스플라틴 0.1 ml + 파클리탁셀 비히클 또는 파클리탁셀 0.1 ml + Ad 완충액 또는 p53 Ad 0.1 ml)가 마우스에게 투여되었다. p53 Ad 투여량은 2.5 x 10⁸ C.I.U./마우스/일 (5.2 x 10⁹ 바이러스 입자)이었다. 시스플라틴 투여량은 0.5 mg/kg/일이었다. 파클리탁셀 투여량은 1 mg/kg/일이었다. 종양을 수거하여 30일차에 중량을 측정하였다. 군당 7 내지 10마리의 마우스를 사용하였다.

이 제2 연구에서, SK-OV-3 난소 종양은 비히클, p53 Ad, 시스플라틴 + 파클리탁셀, 또는 세가지 약물 모두를 동시에 복강내 투여하여 처리하였다. 3개의 약물 모두의 조합은 시스플라틴 + 파클리탁셀의 조합보다 34％ 더 종양을 저하시켜 3가지 약물의 조합의 증가된 효능을 입증하였다 (p≤0.0006).

DU-145 전립선 종양 모델

시스플라틴 효능: 복강내 DU-145 종양을 비히클, p53 Ad, 시스플라틴 또는 두 약물 모두의 복강내 투여로 처리하였다. SCID 마우스 수컷에 대해 0일차에 2.5 x 10⁶ DU-145 세포를 복강내 주사하였다. 마우스에게 7, 9, 11, 14 및 16일에 복강내 주사하였다. 총 0.2 ml 부피 (시스플라틴 비히클 또는 시스플라틴 0.1 ml + Ad 완충액 또는 p53 Ad 0.1 ml)가 마우스에게 투여되었다. p53 Ad 투여량은 8.3 x 10⁸ C.I.U./마우스/일 (2.9 x 10¹⁰ PN)이었다. 시스플라틴 투여량은 1 mg/kg/일이었다. 종양을 수거하여 22일차에 중량을 측정하였다. p53 Ad과 시스플라틴의 조합은 어느 한 약물 단독 처리에 비해 항종양 효능을 크게 증가시켰다 (p≤0.0004).

MDA -MB-468-유방 종양 모델:

시스플라틴 효능:

확립된 MDA-MB-468 종양을 비히클, p53 Ad, 시스플라틴 또는 두개의 약물 모두의 복강내 투여로 처리하였다. SCID 마우스 암컷에 대해 0일차 투여 시작 11일 전에 유방 지방 패드에 1 x 10⁷ MDA-MB-468 세포를 주사하였다. 시스플라틴 투여량은 1 mg/kg/일이었다. 종양내 p53 Ad 투여량은 0-4일차에 동시에 투여한 8.3 x 10⁸ C.I.U./마우스/일 (2.9 x 10¹⁰ 바이러스 입자)이었다. p53 Ad는 시스플라틴과 조합사용된 경우 증가된 효능을 보였다 (8-31일, p≤0.0004).

독소루비신 효능:

제2 실험에서, MDA-MB-468 종양을 비히클, p53 Ad, 독소루비신 또는 두개의 약물 모두로 처리하였다. 누드 마우스 암컷에 대해 0일차 투여 시작 12일 전에 1 x 10⁷ MDA-MB-468 세포를 피하 주사하였다. 복강내 독소루비신 투여량은 0, 2, 7 및 9일차에 4 mg/kg/일이었다. 종양내 p53 Ad 투여량은 0-4일 및 7-11일에 5 x 10⁸ C.I.U./마우스/일 (1.03 x 10¹⁰ 바이러스 입자)이었다. p53 Ad는 독소루비신과 조합 투여된 경우에 보다 큰 효능을 보유하였다 (14-24일, p≤0.05).

SCC -15 두부 및 목 종양 모델

5-플루오로우라실 효능:

피하 SCC-15 종양을 비히클, p53 Ad, 5-플루오로우라실 또는 두 약물 모두로 처리하였다. SCID 마우스에 대해 0일차 투여 개시 7일 전에 5 x 10⁶ SCC-15 세포를 피하 주사하였다. 복강내 5-플루오로우라실 투여량은 0, 7 및 14일 (3주 동안 1주에 1회) 복강내 투여되는 40％ 히드록시프로필-베타-시클로덱스트란 (미국 인디애나주 하몬드 소재의 Cerestar Inc.) 중의 50 mg/kg/일이었다. p53 Ad 투여량은 0, 1, 7, 8, 14 및 15일 (3주 동안 6회의 종양내 주사)에 2 x 10⁸ C.I.U./마우스/일 (4 x 10⁹ 바이러스 입자)이었다. 5-FU 투여량은 50 mg/kg이었다. p53 Ad와 5-FU의 조합은 어느 한 약물 단독 처리에 비해 항종양 효능을 증가시켰다 (p≤0.004).

FPT 억제제와 조합한 p53

A/C/N/53으로 명명된 종양 억제 벡터와 조합한 파르네실 단백질 트랜스퍼라제 억제제의 효과를 시험관 내에서 조사하였다. 하기 실시예는 1996년 12월 19일 출원된 국제 출원 공개 제 WO97/23478호 (여기서 FPT39는 화합물 "39.0"으로 명명됨, 95페이지 참조)에 기재된 바와 같이, "FPT39"로 명명된 FPT 억제제와 조합사용된 본 발명의 p53 발현 아데노바이러스의 신생물 치료 능력 및 전립선 종양 세포 및 유방 종양 세포에 대한 조합 치료가 약물 단독 사용시보다 더 큰 종양 세포 사멸 효과를 갖는다는 것을 상세하게 설명한다.

SK-OV-3 난소 종양에 대한 rAd5/p53 및 FPT39의 항증식 효능

방법: SK-OV-3 인간 난소 종양 세포 (p53^null)를 Eagle MEM + 10％ 태아 소 혈청 중에 웰당 250세포의 밀도로 96웰 플레이트에 분취하였다. 세포를 37℃ 및 5％ CO₂에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. FPT39 또는 약물 비히클을 각각의 웰에 첨가하고 세포 배양을 3일 동안 계속하였다. 3일 후에, rAd5/p53의 첨가량을 계산하기 위해 일부 웰의 비처리 세포를 계수하였다. 이어서, rAd5/p53 또는 약물 비히클을 각 웰에 첨가하고 세포 배양을 추가로 3일 동안 계속하였다. 세포 증식을 MTT 분석을 사용하여 측정하였다. 5 mg/ml MTT 생염료 [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드] 25 ㎕를 각 웰에 첨가하고 3 내지 4시간 동안 37℃ 및 5％ CO₂에서 인큐베이션하였다. 이어서, 10％ SDS 세제 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고 철야 인큐베이션하였다. 각 웰의 형광을 Molecular Devices 마이크로타이터 플레이트 판독기를 사용하여 정량하였다. 세포 증식 데이타는 문헌 [O'Connell and Wolfinger (1997) J. Comp. Graph. Stat. 6: 224-241]의 Thin Plate Spline 통계법을 사용하여 분석하였다.

결과: rAd5/p53 및 FPT39는 세포 성장 억제시에 부가 효능을 보유하였다. 시너지 효과 (p>0.05) 또는 길항작용 (p>0.05)은 상기 실험에서 보이지 않았다.

DU-145 전립선 종양 세포에 대한 rAd5 / p53 및 FPT39 ( FPT39 억제제)의 항증식 및 시너지 효능

방법: DU-145 인간 전립선 종양 세포 (p53^mut)를 FPT39 또는 약물 비히클 및 rAd5/p53로 처리하고, 세포 배양물을 SK-OV-3 인간 난소 종양 세포에 대해 기술한 바와 같이 분석하였다. 실험은 2회 반복하였다.

결과: 실험 1: rAd5/p53 및 FPT39는 세포 성장 억제시에 부가 효능을 보유하였다. 시너지 효과 (p>0.05) 또는 길항작용 (p>0.05)은 상기 실험에서 보이지 않았다.

실험 2: rAd5/p53 및 FPT39는 시너지 효능을 보였다 (p=0.0192). 이 결과는 rAd5/p53 및 FPT39가 상호작용하여 전립선 종양 세포 증식에 대해 시너지 효과를 가질 수 있음을 입증한다.

MDA -MB-231 유방 종양 세포에 대한 rAd5 / p53 및 FPT39 ( FPT39 억제제)의 항증식 및 시너지 효능

방법: MDA-MB-231 인간 유방암 세포 (p53^mut)를 FPT39 또는 약물 비히클 및 rAd5/p53로 처리하고, 세포 배양물을 SK-OV-3 인간 난소 종양 세포에 대해 기술한 바와 같이 분석하였다. 실험은 2회 반복하였다.

결과: 실험 1: rAd5/p53 및 FPT39는 부가 효능을 보유하였다. 시너지 효과 (p>0.05)는 상기 실험에서 보이지 않았다.

실험 2: rAd5/p53 및 FPT39는 대부분의 반응 표면에서 부가 효능을 보였다. 그러나, 시너지 효과는 70 이상(즉 세포 사멸율 30％ 미만, p=0.0001)의 이소볼(isobole)에서 분명하였다. 이 결과는 rAd5/p53 및 FPT39가 상호작용하여 인간 유방암 세포 증식에 대해 시너지 효과를 가질 수 있음을 입증한다.

실시예 7

p53을 보유한 아데노바이러스 벡터로 처리된 전이 간암종을 갖는 환자에서의 면역 반응 프로필

본 발명은 신생물 치료시에 p53 발현 핵산 및 다른 화학치료제의 체내 조합 투여를 제공한다. 하기 실시예는 인간 간암종 내에서 발견되는 종양 사멸 임파구의 수준을 증가시키는 본 발명의 p53 발현 아데노바이러스의 능력을 상세하게 설명한다.

본 연구의 목적은 결장에 존재하는 p53 변이를 보유하는 결장으로부터의 전이 간암종에서 종양 침윤 임파구 (TIL)의 유전형 및 표현형을 특성화하는 것이다 (TIL에 대한 논의는 예를 들어 Wang (1997) Mol. Med. 3:716-731; Marrogi (1997) Int. J. Cancer 74:492-501 참조). 총 16명의 환자에게 야생형 p53 유전자를 보유하는 아데노바이러스 벡터를 사용하여 간 동맥 공급을 통하여 점증적인 방식으로 10⁹-10¹¹ 입자를 처리하였다. 각 환자로부터 총 4개의 생체 시료를 아데노바이러스 벡터 투여 3 내지 7일 후에 수득하였다. 정상 간 및 종양-숙주 조직 공유부위로부터 수득한 동결 조직에 대해 면역조직화학적 분석을 수행하였다. 컴퓨터 화상 분석을 수행하여 모노클로날 항체 CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD56, HLA-DR, IFN-감마, TNF-알파 및 IL-2에 대한 면역 반응성을 정량하였다. 7.5 x 10¹⁰ 입자에서 TIL (CD3⁺ 및 CD4⁺)의 증가가 최대로 관찰되었다. 높은 투여량에서, CD3⁺ 및 CD4⁺ 군집의 감소가 관찰되었다. CD8⁺ 세포에 대해서는 반대 관계가 관찰되었다. 가장 높은 투여량 (2.5 x 10¹¹)에서 CD3⁺, CD4⁺ 및 CD8⁺ 군집은 정상세포에 비해 종양 세포에서 증가된 것으로 관찰되었다. 이 결과는 아데노바이러스 입자의 높은 투여량의 전달이 CD4⁺ 및 CD8⁺ 군집으로 이루어진 TIL을 증가시켰음을 입증한다.

본원에서 기술된 실시예 및 실시태양은 단지 본 발명을 예시하고자 한 것으로서, 그의 상이한 변형을 당업자는 이해할 것이며 이러한 변형은 본 출원의 정신 및 영역 및 첨부된 청구의 범위 내에 포함됨을 이해할 것이다. 모든 문헌, 특허 및 특허 출원은 본원에 참고로 포함된 것이다.

본 발명에 의해, 보조 항암제를 종양 억제물질 (예를 들어 p53) 유전자 요법과 조합하여 사용함으로써 종양 억제물질의 활성이 결여된 신생 세포 또는 다른 세포의 증식 억제에 있어서 보조 항암제 또는 종양 억제물질의 단독 투여에 비해 현저한 상승 효과를 달성함으로써 종양 등의 질환을 효과적으로 치료할 수 있게 되었다.

도 1은 다양한 농도의 p53(A/C/N/53) 및(또는) 탁솔 (등록상표)에 의한 SK-OV-3 난소 종양 세포의 생체 외 억제를 예시한다.

도 2는 도 1에 예시된 실험을 위한 이소볼로그램 분석을 제공한다. 탁솔 (등록상표) 및 p53(A/C/N/53)간의 상승작용은 세포를 p53으로 처리하기 24 시간 전 탁솔 (등록상표)로 예비처리하였을 때 관찰되었다.

도 3a, 3b 및 3c는 누드 마우스로 이종이식된 사람 유방 암에 대한 p53 Ad의 효율을 예시한다. 생쥐에게 생쥐 당 총 2.2 x 10⁹ C.I.U.의 아데노바이러스 (A/C/N/53 또는 Ad)를 0 내지 4일 및 7 내지 11일째에 10번의 주입 회수로 나누어 투여하였다. 생쥐를 p53 Ad, 베타-갈 Ad 또는 비히클 단독으로 처리하였다. 도 3a는 MDA-MB-231 종양에 의한 결과를 예시한다. 도 3b는 MDA-MB-468(-468) 종양에 의한 결과를 예시하고 도 3c는 MDA-MB-435(-435) 종양에 의한 결과를 예시한다.

도 4c 및 4b는 MDA-MB-231(-231) 종양 (도 4a)과 MDA-MB-468 종양에 대한 p53 Ad(A/C/N/53) 투여량 반응 곡선을 제공한다. 생쥐에게 0 내지 4일과 7 내지 11일째에 1 x 10⁷ C.I.U.p53 Ad(A/C/N/53)를 10회의 투여량으로 나누어 복막내로 투여하였다. 평균 억제 백분율은 14/15, 18, 21, 24, 28, 30/32 및 35일째 ((MDA-MB-468 종양은 35일 째에만)에 각각의 p53 Ad 투여량에서 종양 부피를 완충제로만 처리된 종양과 비교하여 계산하였다. -231 종양은 0일 째에 평균 22.5±1.2 mm³이지만, -468 종양은 0일 째에 평균 33.1±1.8 mm³이었다.

도 5는 단독 거환 또는 분할 투여되는 경우 치료제로서의 효율을 비교한 것을 제공한다. 종양 (MDA-MB-231)은 1 및 3주 동안 투여된 후 매주 당 총 2.2 x 10⁸C.I.U.p53 Ad로 투여하였다.

도 6은 크고 잘 확립된 종양에 대해 적은 투여량의 p53 Ad의 다수 주기의 효율을 예시한다. 전체 1.32 x 10⁹ C.I.U.p53 Ad를 MDA-MB-468 이종이식편에 6주에 걸쳐 투여하였다 (P = 대조용 종양 성장 속도의 안정수준기; E = 투여 끝).

도 7 a 7b 및 7c는 1 x 10⁹C.I.U.p53 Ad(A/C/N/53)을 단일 거환 주입 (도 7a), 또는 3회 (도 7b) 또는 5회 (도 7c)로 나누어 주입된 누드 마우스에서의 MDA-MB-468 종양의 생체 내 억제를 예시한다.

도 8은 시드 (scid) 마우스의 NK 세포에 의해 매개된 종양 성장의 억제를 저해하는 적은 투여량의 덱사메타손의 능력을 예시한다. MDA-AB-231 종양에 전체 2 x 10⁹C.I.U. 베타-갈 Ad(1.1 x 1011 바이러스 입자)를 10회 주입 회수로 나누어 14 내지 18일 및 21 내지 25일 째에 투여하였다. 피하성 덱사메타손 (또는 위약) 펠릿은 1일 당 83.3 ㎍의 스테로이드를 방출하였다.

도 9는 정상 및 종양 세포에 미치는 조합 p53 및 시스플라틴 조합 치료요법을 비교한 것이다.

Claims (6)

1. 야생형 p53 종양 억제 단백질 또는 이 단백질을 코딩하는 종양 억제 핵산, 및 미세소관 작용제를 포함하는, 난소암, 췌장암, 비(非)소세포 폐암, 소세포 폐암, 간암, 흑색종, 망막아세포종, 유방 종양, 결장직장암, 백혈병, 임파종, 뇌 종양, 경부암, 육종, 전립선 종양, 방광 종양, 세망내피계 조직의 종양, 윌름(Wilm) 종양, 성상세포종, 신경교아세포종, 신경아세포종, 골육종, 신장암, 및 두부 및 목암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 종양 치료용 제약 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 미세소관 작용제가 파클리탁셀(paclitaxel), 탁솔 (Taxol, 등록상표), 탁소테레 (Taxotere, 등록상표) 또는 파클리탁셀 유도체인 제약 조성물.
3. 제1항에 있어서, 화학치료제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 핵산이 네이키드(naked) DNA 플라스미드, 리포좀 내의 플라스미드, 지질과 결합된 플라스미드, 바이러스 벡터, AAV 벡터 및 재조합 아데노바이러스 벡터로 이루어지는 군 중에서 선택되는 벡터에 의해 전달되는 것인 제약 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 벡터가 A/C/N/53인 제약 조성물.
6. 제2항에 있어서, 상기 종양 억제 단백질 또는 종양 억제 핵산이 약 1 x 10⁹ 내지 약 7.5 x 10¹⁵개의 아데노바이러스 입자의 총 투여량을 1회 투여, 5일 동안 매일 분할 투여, 15일 동안 매일 분할 투여 및 30일 동안 매일 분할 투여하는 방법으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 치료 처방으로 투여되고, 상기 파클리탁셀 또는 파클리탁셀 유도체는 약 75 내지 약 350 mg/m²의 총 투여량을 24시간 간격으로 하여 1회 투여, 2일 동안 매일 투여, 3일 동안 매일 투여, 15일 동안 매일 투여, 30일 동안 매일 투여, 15일 동안의 매일 연속 주입, 30일 동안의 매일 연속 주입 중에서 선택되는 치료 처방으로 투여되는 제약 조성물.