PL193767B1

PL193767B1 - Zastosowanie kompozycji farmaceutycznej do leczenia rakowych lub hiperproliferujących komórek ssaków i kompozycja farmaceutyczna do leczenia rakowychlub hiperproliferujących komórek ssaków

Info

Publication number: PL193767B1
Application number: PL98335334A
Authority: PL
Inventors: Loretta Nielsen; Jo Ann Horowitz; Daniel C. Maneval; G. William Demers; Mary Ellen Rybak; Gene Resnick
Original assignee: Canji
Priority date: 1997-02-18
Filing date: 1998-02-17
Publication date: 2007-03-30
Also published as: WO1998035554A2; JP2001511815A; CZ293399A3; CZ298488B6; KR20050113287A; HUP0004326A3; SK112299A3; KR100620939B1; EP0969720A2; AU6438098A; IL195605A0; EP0969720A4; WO1998035554A3; DE69837754D1; PL335334A1; KR20000071185A; NO993943L; AU737621B2; ATE361668T1; CN1248731C

Abstract

1. Zastosowanie kompozycji farmaceutycznej do leczenia rakowych lub hiperproliferujacych komórek ssaków, znamienne tym, ze stosuje sie kompozycje farmaceutyczna zawierajaca bialko supresorowe guza zawierajace bialko p53 typu dzikiego albo kwas nukleinowy supresorowego guza, który koduje bialko supresorowe guza zawierajace bialko p53 typu dzikiego, i paklitaksel albo 4-(2-{4- -[(11R)-3,10-dibromo-8-chloro-6,11-dihydro-5H-benzo[5,6]cyklohepta[1,2-b]pirydyno-11-yl]piperydyno-1-yl}- -2-oksoetyl)piperydyno-1-karboksyamid (FPT39) jako inhibitor transferazy farnezylo-bialkowej. 6. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia rakowych lub hiperproliferujacych komórek ssa- ków, znamienna tym, ze zawiera bialko supresorowe guza zawierajace bialko p53 typu dzikiego albo kwas nukleinowy supresorowego guza, który koduje bialko supresorowe guza zawierajace bial- ko p53 typu dzikiego, i paklitaksel albo 4-(2-{4-[(11R)-3,10-dibromo-8-chloro-6,11-dihydro-5H-benzo- [5,6]cyklohepta[1,2-b]pirydyno-11-yl]piperydyno-1-yl}-2-oksoetyl)piperydyno-1-karboksyamid (FPT39) jako inhibitor transferazy farnezylo-bialkowej. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kompozycji farmaceutycznej do leczenia rakowych lub hiperproliferujących komórek ssaków i kompozycja farmaceutyczna do leczenia rakowych lub hiperproliferujących komórek ssaków, przeznaczone do stosowania w leczeniu chorych dotkniętych chorobami hiperproliferacyjnymi takimi jak nowotwory lub przerzuty nowotworowe, w hamowaniu rozwoju hiperproliferacji komórek - a dokładniej komórek nowotworowych poprzez skojarzone wykorzystaniem genu supresorowego guza lub jego produktu oraz pomocniczego leku przeciwrakowego.

Nieprawidłowości chromosomowe są często kojarzone z zaburzeniami genetycznymi, chorobami zwyrodnieniowymi i rakiem.

Szczególnie w przypadku raka występuje często łącznie delecja lub duplikacja kopii całych chromosomów lub segmentów chromosomalnych oraz amplifikacja określonych obszarów genomu. Patrz np.: Smith (1991) Breast Cancer Res. Treat, Suplement 1: 5-14; van de Viler (1991) Became. Beefiest. Acta. 1072: 33-50, Sato (1990) Cancer. Res., 50: 7184-7189.

W rzeczywistości charakterystyczna dla onkogenezy jest zarówno amplifikacja sekwencji DNA zawierających protoonkogeny, jak i delecja sekwencji DNA zawierających geny supresorowe guza. Dutrillaux (1990) Cancer Genet. Cytogenet. 49: 203-217.

Najczęstszą genetyczną zmianą w przypadku ludzkich raków jest mutacja genu p53 (Bartek (1991) Oncogene 6: 1699-1703, Hollstein (1991) Science, 253: 49-53).

Ponadto wprowadzenie dzikiego genu p53 do rakowych komórek ssaków niezawierających endogennego dzikiego białka p53 tłumi nowotworowy fenotyp tych komórek (przykładowo opisane w publikacji opisu patentowego USA nr 5,532,220).

Spośród wielu dostępnych leków w chemoterapii zainteresowanie wzbudził paklitaxel, dostępny w sprzedaży jako Taxol® (numer NSC: 125973) z powodu skuteczności w próbach klinicznych na guzach opornych na leki, łącznie z próbami na guzach jajnika i guzach gruczołu sutkowego. (Hawkins (1992) Oncology, 6: 17-23, Horowitz (1992) Trends Pharmacol. Sci. 13: 134-146, Rowinsky (1990) J. Natl. Canc. Inst. 82: 1247-1259).

Ostatnie badania nad współdziałaniem paklitaxelu i terapii genem supresorowym guza wskazują, że obniżony poziom supresorów guza (tj. p53) korelował ze wzmożoną mikronukleacją zatrzymania fazy G2/M i niezależną od p53 apoptozą indukowaną przez paklitaxel.

Z drugiej strony komórki, które przeżyły i miały nienaruszony gen p53, uległy mitozie i przejściowo zgrupowały się w następnej w kolejności fazie G1, co było zgodne z podwyższonymi poziomami białek p53 i p21^cip!.wafl (Wahl (1996) Nature Med. 2: 72-79).

W podobny sposób Hawkins (1996) Canc.Res. 56: 892-898, wykazał, że inaktywacja p53 wzmogła czułość na pewne środki przeciwmitotyczne takie jak paklitaxel. Autorzy zasugerowali, że p53 może odgrywać pewną rolę w procesach naprawy DNA, tym samym ułatwiając im przejście przez fazę S nawet w obecności leków.

Badania sugerujące, że zarówno terapia genem supresorowym guza, jak i terapia lekami zawierającymi środki przeciwmitotyczne (a szczególnie terapia paklitaxelem) działają w sposób krzyżowy.

Według wynalazku zastosowanie kompozycji farmaceutycznej do leczenia rakowych lub hiperproliferujących komórek ssaków, charakteryzuje się tym, że stosuje się kompozycję farmaceutyczną zawierającą białko supresorowe guza zawierające białko p53 typu dzikiego albo kwas nukleinowy supresorowego guza, który koduje białko supresorowe guza zawierające białko p53 typu dzikiego, i paklitaksel albo 4-(2-{4-[(11R)-3,10-dibromo-8-chloro-6,11-dihydro-5H-benzo[5,6]cyklohepta[1,2-b]pirydyno-11-yl]piperydyno-1-yl}-2-oksoetyl)piperydyno-1-karboksyamid (FPT39) jako inhibitor transferazy farnezylo-białkowej.

Korzystnie stosuje się czynnik chemoterapeutyczny w postaci cisplatyny.

Korzystnie jest także, gdy jako kwas nukleinowy supresorowego guza stosuje się kwas nukleinowy zawarty w wektorze wybranym z grupy składającej się z nieosłoniętego plazmidu DNA, plazmidu w liposomie, plazmidu złożonego z lipidu, wektora wirusowego, wektora AAV i rekombinowanego wektora adenowirusowego.

Korzystnie jest również, gdy jako wektor stosuje się A/C/N/53.

Korzystnie jest według wynalazku, gdy wymieniony kwas nukleinowy supresorowego guza jest przygotowywany do wprowadzania w całkowitej dawce rzędu od 1 x 10⁹ do 7,5 x 10¹⁵ cząstek adenowirusa, w sposobie dawkowania wybranym z grupy składającej się z: całkowitej dawki podanej jednorazowo, całkowitej dawki podzielonej na5 dni i podawanej codziennie, całkowitej dawki podzielonej na

PL 193 767 B1 dni i podawanej codziennie i całkowitej dawki podzielonej na 30 dni i podawanej codziennie, jednocześnie wymieniony paklitaksel jest przygotowany do podawania w całkowitej dawce w zakresie od 75 do 350 mg/m² na 24 godziny sposobem dawkowania wybranym z grupy składającej się z: całkowitej dawki podanej jednorazowo, całkowitej dawki podawanej codziennie 1 i 2 dnia, całkowitej dawki podawanej codziennie 1, 2 i 3 dnia, całkowitej dawki podawanej codziennie przez 15 dni, całkowitej dawki podawanej codziennie przez 30 dni, we wlewie ciągłym podawanym codziennie przez 15 dni, we wlewie ciągłym podawanym codziennie przez 30 dni.

Kompozycja farmaceutyczna do leczenia rakowych lub hiperproliferujących komórek ssaków, według wynaklazku charakteryzuje się tym, że zawiera białko supresorowe guza zawierające białko p53 typu dzikiego albo kwas nukleinowy supresorowego guza, który koduje białko supresorowe guza zawierające białko p53 typu dzikiego, i paklitaksel albo 4-(2-{4-[(11R)-3,10-dibromo-8-chloro-6,11-dihydro-5H-benzo[5,6]cyklohepta[1,2-b]pirydyno-11-yl]piperydyno-1-yl}-2-oksoetyl)piperydyno-1-karboksyamid (FPT39) jako inhibitor transferazy farnezylo-białkowej.

Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku korzystnie dalej zawiera czynnik chemoterapeutyczny w postaci cisplatyny.

Korzystnie jest także, gdy według wynalazku kwas nukleinowy supresorowego guza jest zawarty w wektorze wybranym z grupy składającej się z nieosłoniętego plazmidu DNA, plazmidu w liposomie, plazmidu złożonego z lipidu, wektora wirusowego, wektora AAV i rekombinowanego wektora adenowirusowego.

Korzystnie również według wynalazku kompozycja farmaceutyczna jako wymieniony wektor zawiera A/C/N/53.

Rozwiązania według wynalazku wspomagają metody leczenia hiperproliferujących komórek ssaków. Nieoczekiwanie okazało się, że uzyskano lepsze wyniki zastosowania pomocniczych środków przeciwrakowych w połączeniu z terapią genem supresorowym guza (np.: p53) w hamowaniu proliferacji komórek nowotworowych i innych komórek mających niepełną aktywność supresorową guza.

Opisane rozwiązania wspomagają metody leczenia raka lub komórek hiperproliferujących przez dostarczenie im białka supresorowego guza lub supresorowego kwasu nukleinowego oraz przynajmniej jednego pomocniczego środka przeciwrakowego.

Z drugiej strony rozwiązania te obejmują dodatkowe podanie białka supresorowego guza lub kwasu nukleinowego oraz pomocniczego środka przeciwrakowego z przynajmniej jednym chemoterapeutykiem.

Na przykład kwasem nukleinowym supresora nowotworu, przykładowo kwasem nukleinowym kodującym p53, który może być podany wraz z pomocniczym środkiem przeciwrakowym, przykładowo paklitakselem oraz środkiem niszczącym DNA takim, jak cisplatyna. Takim środkiem może też być carboplatyna lub navelbina (winian winorelbinu).

Komórki rakowe oraz komórki hiperproliferujące są często komórkami nowotworowymi. Jeżeli są one obecne w guzie, leczenie wykorzystujące rozwiązania według wynalazku doprowadza do hamowania wzrostu guza i staje się tym samym metodą leczenia raka.

Do tego typu raka zalicza się raka jajnika, raka trzustki, niedrobnokomórkowy i drobnokomórkowy raka płuc, raka wątroby, czerniaka, glejaka siatkówki, raka sutka, raka okrężniczo-odbytniczego, białaczkę, chłoniaka, guza mózgu, raka szyjki macicy, mięsaka, guza gruczołu krokowego, guza pęcherza, guza tkanek siateczkowo-nabłokowych, guza Wilmsa, gwiaździaka, glejaka, nerwiaka niedojrzałego, kostniakomięsaka, raka nerki, raka głowy i szyi.

Zalecanym przeciwrakowym środkiem pomocniczym jest paklitaxel lub pochodna paklitaxelu, a preferowanym kwasem nukleinowym supresorowym nowotworu jest kwas nukleinowy kodujący białko supresorowe guza wybrany z grupy obejmującej białko p53 i jego odpowiedniki, oraz białko glejaka siatkówki.

Zalecany supresorowy kwas nukleinowy guza koduje dzikie białko p53, a szczególnie zalecaRB RB nym białkiem glejaka siatkówki jest p110^RB lub p56^RB.

W najbardziej korzystnym wykonaniu supresorowy kwas nukleinowy zostanie dostarczony do wnętrza komórki docelowej za pomocą wektora. Wirusy wektorowe są modyfikowane przy pomocy techniki rekombinacji DNA w celu umożliwienia ekspresji kwasu nukleinowego supresorowego guza w komórce docelowej. Takie wektory mogą zostać pozyskane z wektorów pochodzenia niewirusowego (np.: plazmidów), lub wirusowego (np.: adenowirusów, wirusów adenopodobnych, retrowirusów, wirusów opryszczki, wirusów krowianki).

PL 193 767 B1

W czasie wykonywania doświadczeń według opisanych wynalazków najlepiej sprawdził się zmodyfikowany za pomocą technik rekombinacji wektor adenowirusowy.

Wektory niewirusowe najlepiej łączyć w kompleksy z odpowiednimi środkami w celu ułatwienia przejścia DNA przez błonę komórkową.

Przykładem takiego niewirusowego kompleksu jest preparat ze środkami wielokationowymi, które ułatwiają kondensację DNA i układów wprowadzania na bazie lipidów. Przykładowy układ wprowadzania na bazie lipidów to wprowadzanie kwasów nukleinowych na podłożu liposomowym.

Najbardziej właściwymi wektorami adenowirusowymi (np.: do wprowadzenia kwasu nukleinowego kodującego dzikie białko p53) są wektory, w których częściowej lub całkowitej delecji uległo białko IX DNA.

W jednym z ujęć delecja sekwencji genów białka IX rozciąga się od około 3500 bp od wirusowego końca 5' do około 4000 bp od wirusowego końca 5'. Wektor może posiadać delecję sekwencji bezsensownej DNA wczesnego regionu 3 adenowirusa i/lub delecję wczesnego regionu 4 adenowirusa -w jednej z wersji występuje delecja odcinków E1a i/lub E1b sekwencji DNA.

Szczególnie zalecanym rekombinowanym wektorem adenowirusowym do wprowadzania ludzkiego p53 cDNA jest główny późny promoter adenowirusa typu drugiego lub ludzki promoter MCV, oraz lider trójek cDNA adenowirusa typu drugiego. Jednym z takich zalecanych wektorów adenowirusowych jest ACN53.

Paklitaxel lub pochodne paklitaxelu obejmują paklitaxel i/lub Taxotere®, z czego najbardziej zalecany jest paklitaxel (Taxol®). Kolejnym zalecanym przeciwrakowym środkiem pomocniczym jest Epothilone. W jednej z wersji supresorem guza jest A/C/N/53 a przeciwrakowym środkiem pomocniczym jest paklitaxel, co tworzy szczególnie zalecany układ.

Białko lub kwas nukleinowy supresorowy guza mogą zostać rozproszone w farmakologicznie możliwej do przyjęcia zaróbce.

W analogiczny sposób w farmakologicznie możliwej do przyjęcia zaróbce może zostać rozproszony przeciwrakowy środek pomocniczy (na przykład paklitaxel lub pochodna paklitaxelu).

Zarówno białko supresorowe guza lub kwas nukleinowy supresorowy guza, jak i omawiany paklitaxel lub pochodna paklitaxelu mogą ulegać rozproszeniu w układzie pojedynczym (składającym się z jednej lub wielu zaróbek).

Białko supresorowe guza lub kwas nukleinowy supresorowy guza i/lub przeciwrakowy środek pomocniczy mogą być podawane dotętniczo, dożylnie (np.: wstrzyknięte), dootrzewnowo, i/lub doguzowo, równocześnie, jak i kolejno. Zalecane miejsca podawania leków obejmują tętnicę wątrobową, podanie dootrzewnowe lub, w przypadku leczenia komórek w rejonie głowy (np.: komórki nerwowe), tętnicę szyjną.

Białko lub kwas nukleinowy supresorowy guza może zostać podany w pojedynczej dawce lub w dawkach wielokrotnych, przykładowo z co najmniej sześciogodzinnymi przerwami, a w przypadku trzech ostatnich dawek z przerwą długości 24 godzin.

W innej zalecanej wersji białko supresorowe guza lub kwas nukleinowy supresorowy guza podawany jest (z przeciwrakowym środkiem pomocniczym lub bez niego) w całkowitej dawce mieszczącej się w zakresie od 1x 10⁹do 1x 10¹⁴ lub od 1x 10⁹do 7,5 x 10¹⁵, najlepiej jednak podawać od 1x 10¹¹do 7,5 x 10¹³.

Sposób dawkowania cząstki adenowirusa zostaje wybrany z grupy składającej się z: dawki całkowitej podanej jednorazowo, dawki całkowitej podawanej codziennie przez 5 dni, dawki całkowitej podawanej codziennie przez 15 dni, dawki całkowitej podawanej codziennie przez 30 dni.

Dawka może być także podawana ciągle przez okres od 1do 30 dni. Paklitaxel lub pochodna ₂ paklitaxelu jest podawana w całkowitej dawce w zakresie od 75-350 mg/m² przez okres 1 godziny, 3 godzin, 6 godzin, 24 godzin w trybie leczenia wybranym spośród następujących sposobów podawania leku: w dawce pojedynczej, w dawce całkowitej codziennie dnia pierwszego i drugiego, w dawce całkowitej codziennie dnia pierwszego, drugiego i trzeciego, w dawce codziennej przez 15 dni, w dawce codziennej przez 30 dni, w codziennej ciągłej infuzji przez 15 dni, w codziennej ciągłej infuzji przez 30 dni.

₂

Zalecana dawka to 100-250 mg/m² na 24 godziny. W innym wariancie paklitaxel lub pochodna ₂ mogą być podawane co tydzień dawce 60 mg/m².

Ten sposób podawania leków może być powtórzony w dwóch lub więcej cyklach (bardziej zalecane w trzech cyklach) podzielonych okresem trzech lub czterech tygodni.

PL 193 767 B1

Dzienna dawka może wahać się w granicach od 7,5 x 10⁹ do 7,5 x 10¹⁵, zalecana dawka od 1x 10¹²do 7,5 x 10¹³. Cząstki adenowirusa mogą być podawane codziennie do 30 dni (np.: dawkowanie przez 2 dni lub 2-5 dni do 14 lub 30 dni z tą samą dawką dzienną).

Tryb wielokrotny może powtarzać się w cyklach co 21 do 28 dni. Zalecane drogi podawania leku obejmują podawanie dotętnicze (do tętnicy wątrobowej), doguzowe oraz dootrzewnowe.

Kiedy kwas nukleinowy supresorowy guza (np.: p53) jest podawany drogą adenowirusowego wektora z przeciwrakowym środkiem pomocniczym (np.: paklitaxelem) oraz środkiem niszczącym DNA (np.: cisplatyna, karboplatyna, nawelbina), to wektor ten podaje się przez okres 5 do 14 dni w ilości od 7,5 x 10¹² do 7,5 x 10¹³ cząstek adenowirusa dziennie. Jeżeli wektor adenowirusowy i paklitaxel podaje się łącznie z karboplatyną, dawka cząstek adenowirusa dziennie przybiera typową wartość 7,5 x 10¹³. Dawka o przykładowej wielkości 7,5 x 10¹² cząstek adenowirusa dziennie jest stosowana w przypadku podawania do płuca.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku do leczenia raka u ssaków lub hiperproliferujących komórek obejmują białko supresorowe guza lub opisany tu kwas nukleinowy (bardziej zalecane dzikie białko p53 lub kwas nukleinowy (np.: w wektorze wirusowym lub niewirusowym), białko glejaka siatkówki (RB) lub kwas nukleinowy), opisany tu przeciwrakowy środek pomocniczy (paklitaxel lub jego pochodna) i/lub do wyboru jeden z innych opisanych tu chemoterapeutyków.

Kompozycja może zawierać także polecenia opisujące sposób podawania zarówno białka supresorowego guza lub kwasu nukleinowego, jak i przeciwrakowego środka pomocniczego (i dowolnego chemoterapeutyka) niezbędnego do hamowania wzrostu lub proliferacji raka lub hiperproliferujących komórek. Jeden ze szczególnie zalecanych zestawów kompozycji według wynalazku obejmuje A/C/N/53 i paklitaxel.

W innym wykonaniu kompozycja farmaceutyczna według wynalazku ustala skład farmakologiczny białka supresorowego guza, kwasu nukleinowego supresorowego guza i przeciwrakowego środka pomocniczego. W różnych wersjach skład farmakologiczny może dowolnie zawierać opisany tu chemoterapeutyk.

Jeden ze szczególnie zalecanych układów zawiera kwas nukleinowy p53 (np.: A/C/N/53) oraz paklitaxel. Kwas nukleinowy supresorowy guza lub białko supresorowe guza i chemoterapeutyk (np.: paklitaxel) mogą znajdować się w jednej zaróbce lub - jak w niniejszym opisie - w osobnych zaróbkach. W przypadku korzystania z metody wielu zaróbek można je zmieszać z innymi substancjami lub przechowywać osobno (np.: w mikrokapsułkach).

W jeszcze innym wykonaniu kompozycji farmaceutycznej wynalazek ustala skład obejmujący komórkę rakową ssaka lub komórkę hiperproliferującą, w której znajduje się egzogenny kwas nukleinowy supresorowy guza lub białko supresorowe guza.

Komórka może dodatkowo zawierać przeciwrakowy środek pomocniczy, taki jak paklitaxel lub jego pochodna. Egzogenny kwas nukleinowy supresorowy guza lub białko supresorowe guza może stanowić każdy z opisanych tu kwasów nukleinowych supresorów guza lub każde białko supresorowe guza. Podobnie w przypadku komórki, którą stanowić może każda z opisanych tu komórek hiperproliferatywnych lub rakowych.

W innym wykonaniu wynalazek wspomaga leczenie komórki przerzutowej i obejmuje kontakt komórki z kwasem nukleinowym supresorowym guza lub polipeptydem supresorowym guza.

Właściwe jest zastosowanie każdego z opisanych tu kwasów nukleinowych supresorów guza i/lub polipeptydów. Zastosowanie to może dodatkowo obejmować kontakt komórki z każdym z opisanych tu pomocniczych środków przeciwrakowych.

Jedna ze szczególnie zalecanych wersji mówi o miejscowym podawaniu kwasu nukleinowego supresorowego guza i/lub polipeptydu do rany operacyjnej.

W innym wykonaniu wynalazek ustala szczególnie zalecany tryb postępowania w dawkowaniu. Tak więc wynalazek ustala metody leczenia komórek ssaków, gdzie stosuje się podawanie komórkom całkowitej dawki białka supresorowego guza lub kwasu nukleinowego supresorowego guza, która to dawka jest podawana wielokrotnie w ilościach wzrastających. Zaleca się podawanie w co najmniej trzech kursach z dwudziestoczterogodzinną przerwą.

Wynalazek wspomaga także leczenie komórki ssaka. Obejmuje to podawanie komórce całkowitej dawki białka supresorowego guza lub kwasu nukleinowego supresorowego guza, podawanej wielokrotnie w ilościach wzrastających. Dawki nie mogą być podawane częściej niż co 6 godzin. Zastosowanie to obejmuje co najmniej 3 podawane codziennie wzrastające dawki.

PL 193 767 B1

W jednej z wersji metoda obejmuje podawanie kwasu nukleinowego supresorowego guza do wnętrza guza w dawce całkowitej z zakresu od 1x 10⁹ do około 7,5 x 10¹⁵ lub od 1x 10¹¹ do

7,5 x 10¹³. Dawkowanie cząstek adenowirusa w leczeniu można wybrać spośród następującej grupy:

dawka całkowita podana jednorazowo, dawka całkowita podawana codziennie przez 5 dni, dawka całkowita podawana codziennie przez 15 dni, dawka całkowita podawana codziennie przez 30 dni.

Zastosowanie może dalej obejmować podawanie paklitaxelu lub jego pochodnej w dawce cał22 kowitej z zakresu od około 75 mg/m² do około 350 mg/m² w ciągu 24 godzin w dawkowaniu wybranym spośród następującej grupy: dawka jednorazowa, dawka podawana codziennie pierwszego i drugiego dnia, dawka podawana codziennie pierwszego, drugiego i trzeciego dnia, dawka podawana codziennie przez 15 dni, dawka podawana codziennie przez 30 dni, dawka podawana w ciągłej infuzji przez 15 dni, dawka podawana w ciągłej infuzji przez 30 dni.

Taki sposób dawkowania w leczeniu można powtórzyć w co najmniej dwóch cyklach, a cykle te mogą być od siebie oddzielone przerwą długości trzech lub czterech tygodni.

Komórki leczone tym sposobem to komórki nowotworowe pochodzące z grupy następujących rodzajów raka: rak jajnika, międzybłoniak, rak trzustki, niedrobnokomórkowy rak płuc, drobnokomórkowy rak płuc, rak wątroby, czerniak, glejak siatkówki, rak sutka, rak okrężniczo-odbytniczy, białaczka, chłoniak, guz mózgu, rak szyjki macicy, mięsak, guz gruczołu krokowego, guz pęcherza moczowego, guz tkanek siateczkowo-śródbłonkowych, guz Wilma, gwiaździak, glejak, nerwiak niedojrzały, kostniakomięsak, rak nerki, rak głowy i szyi. Leczenie przynosi rezultaty hamowania wzrostu lub proliferacji, co sprawdzono metodą pomiaru objętości guza.

Wynalazek niniejszy ustala także kompozycję farmaceutyczną, która składa się z białka supresorowego guza, kwasu nukleinowego supresorowego guza oraz przynajmniej jednego pomocniczego środka przeciwrakowego. Pomocniczym środkiem przeciwrakowym może być paklitaxel lub jego pochodna. Białko supresorowe guza i kwas nukleinowy supresorowy guza mogą zostać wybrane z następującej grupy: kwas nukleinowy kodujący dzikie białko p53, kwas nukleinowy kodujący białko glejaka siatkówki (RB), dzikie białko p53, białko glejaka siatkówki.

RB RB

Białko glejaka siatkówki może być białkiem p110^RB lub białkiem p56 ^RB. Kwas nukleinowy można poddać rekombinacji z genomem wektora adenowirusowego. Można tego dokonać przez częściową lub całkowitą delecję sekwencji DNA kodującej białko IX oraz dołączenie do wektora kwasu nukleinowego kodującego białko p53.

W jednej z wersji delecja sekwencji genu białka IX rozciąga się od około 3500 bp od końca 3' do około 4000 bp od końca 5'. Delecja DNA może obejmować sekwencje oznaczone jako E1a i E1b. Rekombinowany wektor adenowirusowy może dalej zawierać główny późny promotor adenowirusa typu drugiego lub ludzki promotor CMV, lider trójek cDNA adenowirusa typu drugiego i ludzkie cDNA p53. W zalecanej wersji wektorem jest A/C/N/53. W skład układu może wchodzić paklitaxel, jego pochodna lub odpowiednik.

Wynalazek pozwala na stworzenie układu obejmującego rakową komórkę ssaka lub komórkę hiperproliferującą, w której to zawarty jest kwas nukleinowy supresorowy guza lub białko supresorowe guza oraz przeciwrakowy środek pomocniczy. Kwas nukleinowy supresorowy guza może być kwasem nukleinowym kodującym białko supresorowe guza wybranym z następującej grupy białek: dzikie białRB ko p53, białko glejaka siatkówki (RB). Białko glejaka siatkówki może być białkiem p110^RB lub białkiem RB p56^RB. Komórki te mogą występować u ssaków. Komórki te mogą być także komórkami nowotworowymi zaliczanymi do następujących rodzajów raka: rak jajnika, rak trzustki, niedrobnokomórkowy rak płuc, drobnokomórkowy rak płuc, rak wątroby, czerniak, glejak siatkówki, rak sutka, rak okrężniczo-odbytniczy, białaczka, chłoniak, guz mózgu, rak szyjki macicy, mięsak, guz gruczołu krokowego, guz pęcherza moczowego, guz tkanek siateczkowo-śródbłonkowych, guz Wilma, gwiaździak, glejak, nerwiak niedojrzały, kostniakomięsak, rak nerki, rak głowy i szyi.

Rozwiązania według wynalazku wspomagają leczenie przerzutowej komórki przez jej kontakt z kwasem nukleinowym supresorowym guza lub polipeptydem supresorowym guza i pomocniczym środkiem przeciwrakowym. Kontakt może obejmować podanie miejscowe kwasu nukleinowego supresorowego guza do rany operacyjnej. Metoda ta może także zawierać dodatkowe podanie chemoterapeutyku, którym może być cisplatyna.

DEFINICJE

Termin „przeciwrakowy środek pomocniczy odnosi się do środka mającego przynajmniej jedną z niżej wymienionych cech: zdolność modulacji budowy mikrotubul lub ich działalności, zdolność hamowania aktywności transferazy białko-polifrenyl, zdolność hamowania angiogenezy, zdolność haPL 193 767 B1 mowania wydzielania endokrynnego. Przeciwrakowe środki pomocnicze przydatne w wynalazku opisane są bardziej szczegółowo w dalszej części tego dokumentu. Wykorzystane w wynalazku przeciwrakowe środki pomocnicze nie zawierają składników niszczących DNA.

„Geny supresorowe guza to kwasy nukleinowe, których mutacje utraty funkcji są onkogenne. Tym samym brak genu supresorowego guza, jego mutacja lub zaburzenia jego prawidłowej ekspresji zwiększają prawdopodobieństwo przybrania przez komórkę postaci nowotworowej lub objawiają się jako nowotwór. Odwrotna sytuacja zachodzi w przypadku, gdy do komórki guzowej wprowadza się czynny gen supresorowy guza lub białko supresorowe guza - wtedy jego obecność tłumi rakotwórczość, złośliwość lub hiperproliferatywny fenotyp komórki gospodarza. Przykłady kwasów nukleinoRB RB wych supresorowych guza w obrębie tego opisu obejmują między innymi p110^RB, p56 ^RB, p53 i inne supresory nowotworów opisane w tym dokumencie oraz w USSN 08/328,673 złożonym dwudziestego piątego października 1994 roku. Kwasy nukleinowe supresorowe guza obejmują zarówno geny supresorowe guza lub pochodzące od nich kwasy nukleinowe (np.: cDNA, cRNA, mRNA i pochodzące od nich aktywne fragmenty kodujące odpowiednie polipeptydy supresorowe guza), jak i wektory zawierające te sekwencje.

„Polipeptyd lub białko supresorowe guza to termin odnoszący się do polipeptydu, którego obecność w komórce obniża rakotwórczość, złośliwość lub hiperproliferatywny fenotyp tej komórki.

Termin „cząstka wirusa odnosi się do nienaruszonego wirionu. Stężenie zakaźnych adenowirusowych cząstek wirusa jest ustalane typowo za pomocą metody spektrofotometrycznego wykrywania DNA, co opisane jest przez np.: Huyghe (1995) Human Gene Ther. 6: 1403-1416.

Terminy „nowotwór oraz „nowotworowy mają na celu opisanie komórki rosnącej i/lub dzielącej się z częstotliwością przekraczającą normalne ograniczenia wzrostu komórki tego typu.

Terminy „rakotwórczy lub „rakotwórczość oznaczają zdolność do tworzenia nowotworów lub potencjalną możliwość tworzenia się nowotworów.

Zwrot „leczenie komórki odnosi się do hamowania lub do poprawy co najmniej jednej z cech chorobowych chorej komórki. Podczas stosowania w odniesieniu do komórki rakowej o charakterystyce nowotworowej (np.: do komórki rakowej ssaka z ubytkiem endogennego dzikiego białka supresorowego guza), zwrot „leczenie komórki będzie się odnosił do łagodzenia lub eliminacji fenotypu nowotworowego.

Typowo leczenie takie prowadzi do hamowania komórki (np.: zmniejszenia lub zatrzymania wzrostu i/lub proliferacji) w porównaniu do komórki tego samego typu utrzymywanej w tych samych warunkach za wyjątkiem poddania jej samemu procesowi leczenia (np.: przeciwrakowymi środkami pomocniczymi i/lub kwasem nukleinowym supresorowym guza bądź polipeptydem supresorowym guza).

Tego typu hamowanie może prowadzić do śmierci komórki (np.: apoptozy). Termin „leczenie komórki użyty w odniesieniu do guza oznacza hamowanie wzrostu lub proliferacji masy guza (mierzonej objętościowo). Hamowanie takie może także pośredniczyć w obniżeniu częstotliwości wzrostu i/lub częstotliwości proliferacji i/lub śmierci komórek tworzących masę guza. Hamowaniu wzrostu lub hamowaniu proliferacji towarzyszyć może zmiana fenotypu komórek (odzyskanie morfologii typowej dla komórek zdrowych, odzyskanie zdolności hamowania kontaktowego, utrata inwazyjnego fenotypu, hamowanie wzrostu niezależnego od miejsca przyłączenia, itd.).

Założono więc, że chora komórka ma co najmniej jedną cechę patologiczną. Na takie cechy chorej komórki może składać się między innymi nieprawidłowa ekspresja co najmniej jednego białka supresorowego guza. Nieprawidłowa ekspresja może charakteryzować się całkowitą utratą co najmniej jednego rodzaju funkcjonalnych białek supresorowych guza lub obniżeniem poziomu ekspresji co najmniej jednego rodzaju czynnościowych białek supresorowych guza. Tego typu komórki są często komórkami nowotworowymi i/lub rakotwórczymi.

Termin „podawanie ogólnoustrojowe odnosi się do podawania związków lub leków - opisanych w wynalazku rekombinowanych wektorów adenowirusowych, pomocniczych środków przeciwrakowych lub opisanych tu także składników chemoterapeutycznych -w sposób umożliwiający im dotarcie do układu krążenia. Termin „podawanie regionalne odnosi się do sposobu podawania związku lub leku do określonej przestrzeni anatomicznej, np.: dootrzewnowo, dooponowo, podtwardówkowo lub do wnętrza wybranego organu. Podawanie regionalne obejmuje na przykład podawanie układu lub leku do tętnicy wątrobowej dla podawania regionalnego do wątroby. Termin „podawanie lokalne odnosi się do sposobu podawania związku lub leku do ograniczonej i zawężonej przestrzeni anatomicznej, takiej jak: zastrzyk doguzowy do wnętrza masy guza, zastrzyki podskórne, zastrzyki domięśniowe,

PL 193 767 B1 itp. Nie zmienia to faktu, że podawanie lokalne lub regionalne może spowodować dostanie się związku lub leku do układu krążenia.

Termin „obniżona rakotwórczość używany jest tutaj do opisania przekształcania się komórek hiperproliferujących (np.: nowotworowych) w komórki charakteryzujące się stanem o niższej proliferacji. W przypadku komórek rakowych termin ten oznacza przemianę komórek guza w komórki mniej rakotwórcze, w komórki nierakotwórcze lub komórki, które przestały być komórkami guza i których zdolność do przekształcania się w komórki rakowe jest obniżona, lub które są tej zdolności pozbawione. Komórki o obniżonej rakotwórczości albo nie tworzą in vivo żadnych guzów, albo mają przedłużony okres latencji dochodzący do miesięcy przed ukazaniem się narośli guzowej in vivo. Komórki o obniżonej rakotwórczości mogą również przejawiać się wolniej rosnącą masą guza w porównaniu z tym samym typem komórek mającym w pełni dezaktywowany lub niefunkcjonalny gen supresorowy guza, rosnącym w tym samym środowisku fizjologicznym (np.: tkanka, wiek organizmu, płeć organizmu, etap cyklu miesiączkowego, itp.).

Używane tutaj pojęcie „aktywnego fragmentu genu lub polipeptydu oznacza mniejsze fragmenty (podsekwencje) genu lub uzyskanego z niego kwasu nukleinowego (np.: cDNA), które zachowują zdolność kodowania białek o własnościach supresji guza. W podobny sposób aktywny fragment polipeptydu posiada swoje odniesienie do podsekwencji kodującej polipeptyd i wchodzący w skład białka supresorowego guza. Jednym z przykładów takiego aktywnego fragmentu jest p56 opisane w USSN 08/328.673 złożonym 25 października 1994 roku.

Termin „złośliwość opisuje rakotwórczą komórkę mającą zdolność do przerzutów.

Termin „kwasy nukleinowe określa w tym dokumencie DNA lub RNA. Kwasy nukleinowe mogą zawierać zmodyfikowane nukleotydy, które nie zakłócają prawidłowego odczytu przez polimerazę i nie zmieniają ekspresji polipeptydów kodowanych przez ten kwas nukleinowy.

Zwrot „sekwencja nukleotydówobejmuje nić odczytywaną i nieodczytywaną zarówno w postaci pojedynczej nici, jak i w postaci podwójnego łańcucha.

Zwrot „sekwencja DNA odnosi się do pojedynczej nici lub dwuniciowego fragmentu DNA składającego się z nukleotydów, w skład których wchodzą: adenina, tymina, cytozyna i guanina.

Zwrot „kodująca sekwencja kwasu nukleinowego odnosi się do sekwencji kwasu nukleinowego prowadzącego ekspresję określonego białka lub peptydu. Sekwencja kwasu nukleinowego oznacza zarówno sekwencję nici DNA transkrybowaną na RNA, jak i sekwencję RNA ulegającą translacji, w wyniku czego powstaje białko. Sekwencje kwasu nukleinowego obejmują zarówno długie sekwencje kwasu nukleinowego, jak i krótkie sekwencje kwasu nukleinowego wywodzące się z długich sekwencji. Autorzy dokumentu zakładają także, że sekwencja zawiera kodony degenerujące pierwotnej sekwencji, które można wprowadzić dla zapewnienia uprzywilejowania kodonów w określonej komórce gospodarza.

Zwrot „kaseta ekspresji odnosi się do sekwencji nukleotydów zdolnych do wywierania wpływu na ekspresję u gospodarzy genów strukturalnych zgodnych z tego typu sekwencjami. Kasety takie obejmują co najmniej promotory, a mogą zawierać także sygnały zakończenia transkrypcji. Opisane w tym dokumencie dodatkowe czynniki wpływające na ekspresję mogą również wchodzić w skład kasety ekspresji.

Stosowany dalej termin „połączony funkcjonalnie odnosi się do połączenia promotora z sekwencją DNA pod prąd w taki sposób, że promotor pośredniczy w transkrypcji sekwencji DNA.

„Izolowany lub „o istotnym stopniu czystości to terminy, które - jeśli dotyczą sekwencji kwasów nukleinowych kodujących białko supresorowe guza, polipeptyd supresorowy guza lub ich fragmenty odnoszą się do izolowanych kwasów nukleinowych, które nie kodują białek lub peptydów innych niż białko supresorowe guza, polipeptyd supresorowy guza lub ich fragmenty.

Termin „rekombinowany odnosi się do DNA wyizolowanego z pierwotnego lub endogennego źródła i modyfikowanego chemicznie lub enzymatycznie w celu usunięcia naturalnie występujących nukleotydów pobocznych lub w celu przyłączenia nukleotydów pobocznych, których dane DNA nie posiada. Nukleotydy poboczne to takie nukleotydy, które ustawione są albo z prądem, albo pod prąd w stosunku do opisywanej sekwencji lub podsekwencji nukleotydów.

Pojęcie „wektor rozumieć należy jako kwas nukleinowy zdolny do zakażenia, transfekcji oraz przejściowej lub trwałej transdukcji komórki. Wektor jest niczym nie okrytym kwasem nukleinowym lub kwasem nukleinowym połączonym z białkiem lub lipidem. Wektor może posiadać kwasy nukleinowe bakteryjne lub wirusowe i/lub białka bakteryjne lub wirusowe i/lub błony bakteryjne lub wirusowe (np.: błonę komórkową, wirusową lipidową otoczkę, itp.) Uznaje się, że wektory często posiadają kasetę

PL 193 767 B1 ekspresji poddającą odpowiedni kwas nukleinowy kontroli promotora. Wektory obejmują między innymi replikony (np.: plazmidy, bakteriofagi), do których można dołączyć i zreplikować DNA.

Wektory zawierają zatem między innymi RNA, autonomiczne i samoreplikujące się koliste DNA (plazmidy), a te ostatnie mogą być ekspresyjne lub nie podlegające ekspresji. Kiedy rekombinowany genetycznie mikroorganizm lub hodowla bakteryjna jest określana jako gospodarz „wektora ekspresyjnego oznacza to, że zawiera zarówno pozachromosomalny kulisty DNA, jak i DNA wcielony do swoich chromosomów. Po wniknięciu do komórki gospodarza wektor może podlegać stałej replikacji w procesie mitozy będąc uznawanym przez komórki za strukturę autonomiczną, lub może zostać wcielony do genomu gospodarza.

Termin „ilość efektywna ma oznaczać ilość wektora lub leku, która daje pozytywne rezultaty w kontroli wzrostu i/lub proliferacji komórki.

Używany w dokumencie skrót „C.I.U. oznacza jednostki zakażenia komórkowego (cellular infectious units). Wartość C.I.U. oblicza się przez zmierzenie ilości komórek zawierające białko heksonu wirusa (np.: 293 komórki) po 48 godzinach od zarażenia (Huyghe (1995) Human Gene Ther. 6: 1403-1416)

Używany w dokumencie skrót „m.o.i. oznacza mnogość zakażeń (multiplicity of infection) i stanowi ilość C.I.U. na komórkę.

Termin „paklitaxel odnosi się do leku znanego w sprzedaży jako Taxol®. Taxol® hamuje replikację komórek eukariotycznych przez wzmożenie polimeryzacji części tubulinowych w ustabilizowane wiązki mikrotubul niezdolne do reorganizacji w struktury niezbędne do przeprowadzenia mitozy.

Termin „kontakt z komórką stosowany jest w odniesieniu do kontaktu komórki z lekiem i/lub kwasem nukleinowym w sposób prowadzący do wcielenia leku i/lub kwasu nukleinowego do wnętrza komórki. W świetle tych wyjaśnień kontakt z komórką za pomocą kwasu nukleinowego będzie oznaczał transfekcję komórki kwasem nukleinowym.

W przypadku, kiedy lek ma własności lipofilowe, lub gdy kwas nukleinowy jest związany z lipidem (np.: lipidem kationowym), zwykłe zetknięcie się umożliwi transport (aktywny, bierny i/lub dyfuzyjny) do wnętrza komórki. Na tej właśnie zasadzie lek i/lub kwas nukleinowy może być aktywnie przetransportowany do wnętrza komórki pojedynczo lub w połączeniu z układem nośników. Tak więc na przykład nieaktywny wektor (np.: adenowirus) zawierający kwas nukleinowy może pośredniczyć w transporcie kwasu nukleinowego do wnętrza komórki. Kwas nukleinowy może być kompleksowo połączony ze środkami specyficznie oddziałującymi z receptorami pozakomórkowymi w celu ułatwienia wprowadzenia kwasu nukleinowego do wnętrza komórki. Przykładem są kompleksy ligandów/polikationów/ DNA opisanych patentem U.S.A. nr 5,166,320 i 5,635,383. Dodatkowo wprowadzenie wirusa może być wzmocnione przez rekombinacyjną modyfikację domen guzkowych i włókienkowych genomu wirusa w celu wcielenia cząstek docelowych komórki.

Struktury oznaczone tu jako „A/C/N/53, „A/M/N/53, p110^RB, p56^RB odnoszą się do struktur oznaczonych w taki sam sposób w USSN 08/328,673 złożonym dwudziestego piątego października 1994 roku, wniosek International Application WO 95/11984.

„Podstawienie konserwatywne dotyczące białka odnosi się do zmian składu aminokwasów w białku nie zmieniających w istotny sposób aktywności białka. Stąd „konserwatywnie zmodyfikowana zmienność danej sekwencji aminokwasów odnosi się do zamiany aminokwasów, które nie są niezbędne dla czynności białka, lub do podstawienia aminokwasów mających podobne właściwości (np.: kwaśne, obojętne, mające ładunek dodatni lub ujemny, polarne lub niepolarne, itd.) w taki sposób, że nawet gdy zamiana ma miejsce w miejscach istotnych dla czynności białka, nie powoduje ona żadnych zmian w jego funkcjonowaniu. Znane są tabele konserwatywnego podstawiania, umożliwiające poznanie funkcjonalnie podobnych aminokwasów. Każda z poniższych sześciu grup zawiera aminokwasy będące względem siebie podstawnikami konserwatywnymi:

1. Alanina (A), Seryna (S), Treonina (T)

2. Kwas asparaginowy (D), Kwas glutaminowy (E)

3. Asparagina (N), Glutamina (Q)

4. Arginina (R), Lizyna (K)

5. Izoleucyna (I), Leucyna (L), Metionina (M), Walina (V)

6. Fenyloalanina (F), Tyrozyna (Y), Tryptofan (W)

Patrz także, Creighton (1984), Proteins W. H. Freeman and Company.

Dodatkowo pojedyncze substytucje, delecje, lub insercje, które zmieniają, dodają lub odejmują pojedynczy aminokwas lub niewielki procent aminokwasów w sekwencji kodującej są także zaliczane do „konserwatywnie modyfikowanej zmienności.

PL 193 767 B1

Przedmiot wynalazku został bliżej przedstawiony w przykładowych wykonaniach podanych poniżej objaśnionych rysunkiem, na którym:

Fig. 1 ilustruje inhibicję in vitro komórek guza jajnika SK-OV-3 za pomocą różnych stężeń p53 (A/C/N/53) i/lub preparatu Taxol®.

Fig. 2 przedstawia analizę izobologramową eksperymentu przedstawionego na rysunku 1. Zaobserwowano działanie synergiczne pomiędzy preparatem Taxol® i p53 (A/C/N/53) po wcześniejszym zastosowaniu preparatu Taxol® na 24 godziny przed zastosowaniem p53.

Fig. 3a, 3b i 3c ilustrują skuteczność p53 Ad przeciwko heteroprzeszczepom ludzkiego raka sutka na myszy bezfuterkowe. Każdej myszy podano całkowitą dawkę 2,2 x 10⁹ C.I.U. adenowirusa (A/C/N/53 lub Ad) podzieloną na 10 zastrzyków w dniach 0-4 i 7-11. Myszom podano p53 Ad, beta-gal Ad, lub samą zaróbką. Fig. 3a ukazuje wyniki z guzami MDA-MB-231. Fig. 3b ukazuje wyniki z guzami MDA-MB-468 (-468), a Fig. 3c ukazuje wyniki z guzami MDA-MB-435 (-435).

Fig. 4a i 4b ukazują krzywe odpowiedzi na dawkę p53 (A/C/N/53) w przypadku terapii guzów

MDA-MB-231 (Fig. 4a) oraz w przypadku guzów MDA-MB-468 (Fig. 4b). Myszy poddano leczeniu

1x 10⁷ -1x 10⁹ C.I.U. p53 Ad (A/C/N/53) w formie 10 pojedynczych dawek podawanych okołoguzowo w dniach 0-4 i 7-11. Średnie procentowe inhibicje zostały obliczone przez porównanie objętości guzów przy każdej dawce p53 Ad z guzami poddanymi działaniu bufora w dniach 14/15, 18, 21, 24, 28, 30/32 ₃ i 35 (guzy MDA-MB-468 tylko 35. dnia). Średnia objętość guzów -231 wynosiła 22,5 ± 1,2 mm³ w dniu 0, podczas gdy średnia objętość guzów -468 wynosiła 33,1 ±1,8 mm³ w dniu 0.

Fig. 5 ukazuje porównanie skuteczności środka terapeutycznego podanego w dawce pojedynczej i w wielu dawkach. Guzy (MDA-MB-231) zostały poddane dawkowaniu całkowitej ilości 2,2 x 10⁸C.I.U. p53 Ad na tydzień w pierwszym i trzecim tygodniu.

Fig.6 ilustruje skuteczność podawania preparatów w cyklach wielokrotnych z niską dawką p53 Ad przeciwko dużym, dobrze rozwiniętym guzom. Podano całkowitą dawkę 1,32 x 10⁹ C.I.U. p53 Ad na przestrzeni 6 tygodni przeciwko heteroprzeszczepom MDA-MB-468. (P = faza plateau kontroli tempa wzrostu guza; E = koniec dawkowania).

Fig. 7a, 7b i 7c ilustrują inhibicję in vivo guzów MDA-MB-468 w organizmie myszy bezfuterkowej w przypadku podania 1 x 10⁹ C.I.U. p53 Ad (A/C/N/53) w pojedynczej dawce (Fig. 7a), w dawce podzielonej na 3 zastrzyki (Fig. 7b) oraz w dawce podzielonej na 5 zastrzyków (Fig. 7c).

Fig.8 ilustruje sposób, w jaki sposób niska dawka deksametazonu tłumi inhibicję wzrostu guza spowodowaną aktywnością komórek NK w organizmie myszy scid. Guzom MDA-MB-231 podano dawkę całkowitą 2 x 10⁹ C.I.U. beta-gal Ad (1,1 x 1011 cząstek wirusa) podzieloną na 10 zastrzyków wykonanych w dniach 14-18 i 21-25. Wszczepiane podskórnie tabletki preparatu deksametazonu (lub placebo) uwalniały 83,3 mg steroidów dziennie.

Rozwiązania według wynalazku wprowadzają nowe metody inhibicji wzrostu i/lub proliferacji komórek, a dokładniej - wzrostu i proliferacji komórek rakowych. Metody te obejmują kontakt komórek z kwasem nukleinowym supresorowym guza lub białkiem supresorowym guza i z pomocniczym środkiem przeciwrakowym. Zwykle sztuczne wprowadzenie białka supresorowego guza lub kwasu nukleinowego spowoduje ten sam efekt jak naturalne białko supresorowe guza, którego w tym przypadku brakuje.

Stąd, jeśli w komórce nie stwierdza się czynności endogennego p53, stosuje się białko p53 lub kwas nukleinowy p53.

Nieoczekiwanie według wynalazku okazało się, że w przeciwieństwie do poprzednich badań (patrz np.: Wahl et al. (1996) Nature Med., 2(1): 72-79, oraz Hawkins et al. (1996) Canc. Res. 56: 892-898) leczenie komórek ssaków z utratą lub niedoborem endogennego dzikiego białka supresorowego guza (wiele komórek nowotworowych) za pomocą zarówno przeciwrakowego środka pomocniczego (np.: paklitaxel (Taxol®)), jak i za pomocą genu lub polipeptydu (np.: p53) supresorowego guza przynosi rezultaty w postaci większej inhibicji proliferacji i/lub wzrostu komórek niż w przypadku stosowania osobnej chemoterapii i osobnej terapii konstruktami supresorowymi guza.

Ponadto zgodnie z wynalazkiem stwierdzono, że leczenie wstępne pomocniczymi środkami przeciwrakowymi doprowadzało do gwałtownego obniżenia proliferacji kwasu nukleinowego supresorowego guza. Bez związku z konkretną teorią, uważa się, że efekt wywołany przeciwrakowym środkiem pomocniczym przyczynia się do podwyższenia wydajności różnych wektorów wykorzystywanych w terapii genowej (np.: wektorów adenowirusowych), do podwyższenia poziomu ekspresji genu supresorowego guza, do stabilizacji mikrotubul pomocniczych, międzykomórkowego transportu wirusów,

PL 193 767 B1 lub do zapewnienia wzmocnionego efektu przez wzajemne oddziaływanie różnych międzykomórkowych mechanizmów (np.: dróg sygnałowych, dróg apoptozy, dróg obiegu komórek).

Tym samym rozwiązania według wynalazku wspomagają hamowanie chorych komórek ssaków z brakującym lub wadliwym endogennym dzikim białkiem supresorowym guza za pomocą kontaktu z pomocniczym środkiem przeciwrakowym i kwasem nukleinowym supresorowym guza i/lub polipeptydem supresorowym guza. Obecność takich komórek w guzie powoduje hamowanie wzrostu guza i tym samym działanie to staje się sposobem leczenia raka. Szczególnie zalecanymi kwasami nukleinowymi lub polipeptydami supresorowymi guza są: p53, RB, h-NUC (patrz, np.: Chen (1995) Cell Growth Differ. 6: 199-210) lub ich aktywne fragmenty (np.: p110RB, p56RB), podczas gdy do szczególnie zalecanych pomocniczych środków przeciwrakowych zalicza się paklitaxel i środki mające do niego zbliżone działanie, np.: jego pochodne lub odpowiedniki.

Kolejnym korzystnym skutkiem uzyskanym dzięki rozwiązaniom według wynalazku jest fakt, że kontakt komórek z kwasem nukleinowym supresorowym guza i/lub polipeptydem supresorowym guza może hamować komórki przerzutowe. Takie hamowanie może przybrać formę inhibicji powstawania, wzrostu, migracji lub reprodukcji komórek przerzutowych. W jednej z wersji inhibicja może charakteryzować się inhibicją (np.: redukcją i/lub eliminacją) pojawiania się nowotworów odległych od pierwotnego guza. Wynalazki te wspomagają także metody leczenia (migracji lub eliminacji) progresji choroby przerzutowej. Obejmuje to kontakt komórek przerzutowych z kwasem nukleinowym supresorowym guza i/lub polipeptydem supresorowym guza. W szczególnie zalecanej wersji obejmuje to także kontakt komórek okolicy rany operacyjnej (np.: po usunięciu masy guza) z kwasem nukleinowym supresorowym guza i/lub polipeptydem supresorowym guza w połączeniu za pomocniczym środkiem przeciwrakowym. Komórki mogą dodatkowo mieć kontakt z innymi z opisywanych tutaj pomocniczych środków przeciwrakowych.

Zastosowanie według wynalazku pozwala także na ustalanie korzystnych sposobów dawkowania w leczeniu wykorzystujących geny supresorowe guza i ich produkty. Te sposoby dawkowania w leczeniu są po części oparte na zaskakującym odkryciu: kwasy nukleinowe supresorowe guza i/lub polipeptydy supresorowe guza są bardziej skuteczne w inhibicji komórek lub wzrostu guza, jeśli podaje się je w wielu dawkach zamiast w pojedynczej dużej dawce.

Kolejność podawania supresora guza i pomocniczych środków przeciwrakowych nie jest w wynalazku istotna. Składniki mogą być zatem podawane równocześnie lub jeden po drugim.

Jedno z ujęć wynalazku pokazuje przykładowo, że leczenie wstępne komórki za pomocą co najmniej jednego pomocniczego środka przeciwrakowego (podanego osobno lub w połączeniu z chemoterapeutykiem) zwiększa skuteczność podanego później kwasu nukleinowego supresorowego guza i/lub polipeptydu supresorowego guza. Inne ujęcie wynalazku przedstawia podanie chemoterapeutyka przed pomocniczym środkiem przeciwrakowym i kwasem nukleinowym supresorowym guza i/lub polipeptydem supresorowym guza. Jeszcze inne ujęcie przedstawia równoczesne podanie pomocniczego środka przeciwrakowego (osobno lub w połączeniu z chemoterapeutykiem) i kwasu nukleinowego supresorowego guza i/lub polipeptydu supresorowego guza.

Kwas nukleinowy supresorowy guza i/lub polipeptyd supresorowy guza zastosowano także po podaniu kwasu nukleinowego supresorowego guza i/lub polipeptydu supresorowego guza.

Efekt przeciwguzowy podawania związku według wynalazku obejmuje także przeciwguzowy efekt niespecyficzny zwany „efektem stojącego obok (bystander effect) (patrz, np.: Zhang (1996) Cancer Metastasis Rev. 15: 385-401 i Okada (1996) Gene Ther. 3:957-96). Możliwe jest także sterowanie układem immunologicznym przez wybiórcze wzmocnienie (lub osłabienie) odpowiedzi humoralnej lub komórkowej układu immunologicznego, tj. modulowanie odpowiedzi komórek typu B i/lub komórek typu T (limfocytów cytotoksycznych (CTL) lub odpowiedź limfocytów (TIL) infiltracji guza). Obserwuje się wzrost poziomu TIL po podaniu człowiekowi ekspresyjnego adenowirusa p53. Szczególny wzrost poziomu TIL (fenotypowo komórek pomocniczych typu T, CD3⁺ i CD4⁺) obserwuje się po podaniu ekspresyjnego adenowirusa p53 do tętnicy wątrobowej w leczeniu przerzutowego raka wątroby, opisanego szczegółowo poniżej.

Należy stwierdzić, że leczenie wspomagane rozwiązaniami według wynalazku nie jest ograniczone do korzystania z jednego przeciwrakowego środka pomocniczego lub nawet do korzystania z jednego typu chemoterapeutyka. Rozwiązania według wynalazku pozwalają na wykorzystanie metod inhibicji chorych komórek ssaków nie zawierających endogennego białka supresorowego guza lub guzów powstałych z takich komórek przez kontakt tych komórek z kwasem nukleinowym supresorowym guza i co najmniej jednym z opisanych tu przeciwrakowych środków pomocniczych.

PL 193 767 B1

I. Pomocnicze środki przeciwrakowe

A) Środki oddziałujące na mikrotubule

Jak już wyjaśniono powyżej, jedno z ujęć wynalazku przedstawia metody umożliwiające inhibicję chorych komórek nie zawierających endogennego białka supresorowego guza przez kontakt tych komórek z białkiem supresorowym guza i przeciwrakowym środkiem pomocniczym, takim jak środek oddziałujący na mikrotubule (np.: paklitaxel, jego pochodna lub preparat o podobnych do niego właściwościach).

Środek oddziałujący na mikrotubule opisany w tym dokumencie jest związkiem utrudniającym mitozę w komórce, tj. ma działanie antymitotyczne przez oddziaływanie na powstawanie mikrotubul i/lub ich czynność. Takimi środkami mogą być na przykład środki stabilizujące mikrotubule lub środki przerywające ich tworzenie. Środki oddziałujące na mikrotubule przydatne w tym wynalazku są dobrze znane specjalistom. Obejmują między innymi takie związki chemiczne, jak: allokolchicyna (NSC 406042), Halichondrin B (NSC 609395), kolchicyna (NSC 757), pochodne kolchicyny (np.: NSC 33410), dolastatin 10 (NSC 376128), maytansine (NSC 153858), rhizoxin (NSC 332598), paklitaxel (Taxol®, NSC 125973), pochodne Taxol®'u (np.: NSC 608832), tiokolchicyna (NSC 361792), trityl cysteine (NSC 83265), vinblastin sulfate (NSC 49842), siarczan vinkrystyny (NSC 67574), epothilone A, epothilone i discodermolide (patrz: Service, (1996) Science, 274: 2009), estramustine, nocodazole, MAP4, itp. Przykłady działania tych środków opisane są w literaturze naukowej i pozycjach z zakresu patentów, patrz np.: Bulinski (1997) J. Cell. Sci. 110:3055-3064; Panda (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10560-10564; Muhlradt (1997) Cancer Res. 57:3344-3346; Nicolaou (1997) Nature 387:268-272; Vasquez (1997) Mol. Biol. Cell. 8:973-985; Panda (1996) J. Biol. Chem. 271:29807-29812. Szczególnie zalecanymi środkami są związki o działaniu podobnym do paklitaxelu. Obejmują one między innymi paklitaxel oraz jego pochodne i odpowiedniki. Paklitaxel i jego pochodne są dostępne w sprzedaży. Metody otrzymywania paklitaxelu i jego pochodnych są dobrze znane specjalistom. (patrz, np.: U.S. Patent nr: 5,569,729; 5,565,478; 5,530,020; 5,527,924; 5,508,447; 5,489,589; 5,488,116; 5,484,809; 5,478,854; 5,478,736; 5,475,120; 5,468,769; 5,461,169; 5,440,057; 5,422,364; 5,411,984; 5,405,972; i 5,296,506). Dodatkowe środki oddziałujące na mikrotubule można określić za pomocą jednej z wielu prób znanych specjalistom, np.: w połowie zautomatyzowana próba mierząca aktywność polimeryzacji tubuliny indukowanej odpowiednikami paklitaxelu w połączeniu z komórkową próbą pomiaru potencjału tych związków do zatrzymywania komórek w mitozie. (patrz Lopes (1997) Cancer Chemother. Pharmacol. 41:37-47). Ogólnie aktywność próbnego związku jest określana przez kontakt komórki z tym związkiem i zależy od tego, czy cykl komórkowy został przerwany, a szczególnie od tego, czy zaszła inhibicja mitozy. Inhibicja taka może być spowodowana przez uszkodzenie aparatu mitotycznego, np.: uszkodzenie normalnej budowy wrzeciona. Komórki, w których doszło do przerwania mitozy mogą charakteryzować się odmienną morfologią (np.: zbitym upakowaniem mikrotubul, zwiększoną liczbą chromosomów, itd.) W jednym z istotnych doświadczeń związki mogące wykazywać aktywność polimeryzacji tubulin zostały zbadane in vitro. W doświadczeniu tym skriningowi poddano hodowane komórki WR21 (pozyskanych z linii myszy 69-2 wap-ras) na obecność inhibicji proliferacji i/lub odmiennej morfologii komórki, w szczególności poszukiwano zbitego upakowania mikrotubul. Skrining in vivo związków zweryfikowanych pozytywnie można przeprowadzić na myszach bezfuterkowych będących nosicielami komórek guza WR21. Szczegółowy przebieg tej metody osłaniania opisano w protokołach Porter (1995) Lab. Anim. Sci., 45(2):145-150. Inne metody skriningu związków na określony rodzaj aktywności są dobrze znane specjalistom. Typowo próby takie obejmują analizy na obecność inhibicji zespalania i/lub rozłączania mikrotubul. Analizy zespalania mikrotubul opisał na przykład Gaskin et. al. (1974) J. Molec. Biol., 89: 737-758: Patent USA nr 5569,720 umożliwia także przeprowadzanie analiz in vitro oraz in vivo dla związków o aktywności podobnej do paklitaxelu.

B) Inhibitory transferazy poliprenylo-białkowej

W innym ujęciu wynalazek ten zapewnia połączone zastosowanie supresorujących guzy kwasów nukleinowych i/lub polipeptydów oraz inhibitorów transferazy poliprenylo-białkowej. Szczególnie preferowane inhibitory transferazy poliprenylo-białkowej zawierają między innymi inhibitory transferazy farnezylo-białkowej (FPT - skrót od Farnesyl-Protein Transferase), inhibitory transferazy geranylogeranyl-białkowej i inne transferazy monoterpeno-białkowej. Przykłady związków stanowiących inhibitory transferazy poliprenylo-białkowej są dobrze znane w nauce i literaturze patentowej, patrz np.: Zhang (1997) J. Biol. Chem 272: 10232-10239; Njoroge (1997) J. Med. Chem. 40:4290-4301; Mallams

PL 193 767 B1 (1997) Bioorg. Med. Chem. 5:93-99.Przykłady związków stanowiących inhibitory transferazy farnezylo-białkowej podano poniżej:

ο

Inhibitor transferazy farnezylo-białkowej FPT, oznaczony „FPT39”, jak opisano w publikacji międzynarodowego zgłoszenia WO 97/23478, złożonego 19 grudnia 1996, gdzie 4-(2-{4-[(11R)-3,10-dibromo-8-chloro-6,11-dihydro-5H-benzo[5,6]cyklohepta[1,2-b]pirydyno-11-yl]piperydyno-1-yl}-2-oksoetyl)piperydyno-1-karboksyamid, w skrócie (FPT39) stanowi oznaczony składnik „39.0, patrz strona 95 w WO 97/23478.

Jak opisano poniżej, gdy FPT39 stosuje się w terapii połączonej z adenowirusem ekspresji p53 wynalazku przeciw komórkom guza prostaty i komórkom guza gruczołu sutkowego, połączenie to było bardziej efektywne w zabijaniu komórek guza, aniżeli każdy ze składników osobno.

Oligopeptydy (głównie tetrapeptydy, lecz także peptapeptydy zawierające wzór Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3): EPA 461, 489; EPA 520, 823; EPA 528, 486; oraz WO 95/11917).

Związki peptydomimetyczne, w szczególności mimetyki Cys-Xaa-Xaa-Xaa: EPA 535,730, EPA 535,731; EPA 618,221; WO 94/097/09766; WO 94/10138; WO 94/07966; USA 5,326,773, USA 5,340,828, USA 5,420,245; WO 95/20396; USA 5,439,918; oraz WO 95/20396.

Farnezylowane mimetyki peptydów - w szczególności farnezylowane mimetyki Cys-Xaa-Xaa-Xaa: zgłoszenie patentowe GB-A2.276,618.

Inne mimetyki peptydów: USA 5,352,705, WO 94/00419; WO 95/00497; WO 95/09000; WO 95/09001; WO 91/12612; WO 95/25086; EPA 675,112, oraz FR-A 2,718,149.

Tricykliczne skondensowane pierścienie benzocykloheptapirydyn: publikacje międzynarodowe: WO 95/10514; WO 95/10515; WO 95/10516; WO 96/30363; WO 96/30018; WO 96/30017; WO 96/30362; WO 96/31111; WO 96/31478; WO 96/31477; WO 96/31505; międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr PCT/US96/19603, WO 97/23478; zgłoszenie patentowe USA nr 08/728104; zgłoszenie patentowe USA nr 08/712,989, zgłoszenie patentowe USA nr 08/713326; zgłoszenie patentowe USA nr 08/713908; zgłoszenie patentowe USA nr 08/713,705; zgłoszenie patentowe USA nr 08/713,703; zgłoszenie patentowe USA nr 08/710,225; zgłoszenie patentowe USA nr 08/711,925; zgłoszenie patentowe USA nr 08/712,924; zgłoszenie patentowe USA nr 08/713,323; oraz zgłoszenie patentowe USA nr 08/713,297.

Pochodne farnezylu: EPA 534,546; WO 94/19357; WO 95/08546, EPA 537,007; oraz WO 95/13059.

Produkty naturalne oraz pochodne: WO 94/18157; USA 5,430,055; GB-A 2,261,373, GB-A 2,261,374, GB-A 2,261,375; USA 5,420,334, USA 5,436,263.

Inne związki: WO 94/26723; WO 95/08542; USA 5,420,157; WO 95/21815; oraz WO 96/31501.

C) Związki anty-angiogenne

Supresorowe białka lub kwasy nukleinowe nowotworów według wynalazku można podawać w połączeniu ze związkami przeciwdziałającymi angiogenezie. Preferowane związki antyangiogenne zapobiegają tworzeniu się lub proliferacji naczyń krwionośnych, najlepiej, gdy zapobiegają tworzeniu się i/lub proliferacji naczyń krwionośnych do guzów.

Odpowiednie składniki anty-angiogenne zawierają jednak nie tylko Garladynę (GM6001, Glycomed Inc., Alameda, CA), inhibitory odpowiedzi śródbłonka (np.: czynniki takie jak interferon alfa, TNP-470 i inhibitory naczyniowego czynnika wzrostu nabłonka), środki pobudzające załamanie macierzy komórkowej (np.: Vitaksin (przeciwciała ludzkie LM-609, Ixys Co., San Diego, CA; Metastat, CollaGenex, Newtown, PA; oraz Marimastat BB2516, British Biotech) oraz środki działające bezpośrednio na wzrost naczyń (np.: CM-101, pochodzący od egzotoksyny antygenów grupy A Streptococcus

PL 193 767 B1 i wiążący się z nowymi naczyniami krwionośnymi indukując odpowiedź zapalną gospodarza; oraz Thalidomide).

Różne rodzaje steroidów mają także działanie anty-angiogenne. W szczególności różne doniesienia wskazywały, że octan medroksyprogesteronu (MPA), syntetyczny progesteron, ma potencjalne właściwości inhibicji nowotworzenia naczyń w próbie z rogówką królika (Oikawa (1988) Cancer Lett. 43:85). Prolek 5FU, 5'-deoksy-5-fluorourydyna (5'DFUR) można także scharakteryzować jako związek anty-angiogenny, gdyż 5'DFUR podlega konwersji do 5-FU dzięki działaniu fosforylazy tymidyny PD-ECGF/TP.5'DFUR może działać selektywnie na komórki guza posiadające PD-ECGF/TP z wysokim potencjałem angiogenetycznym.

Ostatnie badania kliniczne wykazały, że 5'DFUR działa skutecznie w stosunku do guzów PD-ECGF/TP-pozytywnych. Wykazano znaczne wzmocnienie działania przeciwnowotworowego 5'DFUR, które miało miejsce dla komórek transfekowanych PD-ECGF/TP w porównaniu z komórkami typu dzikiego (Haraguchi (1993) Cancer Res. 53: 5680-5682).

Dodatkowo połączone związki 5'DFUR + MPA wykazują także działanie anty-angiogenne (Yayoi (1994) Int J. Oncol. 5: 27-32). Połączenie 5'DFUR + MPA można zaliczyć do kategorii połączeń dwóch związków inhibitorów angiogenezy o różnym spektrum, inhibitora czynnika wzrostu śródbłonka i inhibitora proteazy. Co więcej, w eksperymentach in vivo z zastosowaniem indukowanego komórek raka sutka DMBA, 5'DFUR wykazywał połączony efekt z AGM-1470 (Yamamoto (1995) Oncol Reports 2: 793-796).

Inna grupa związków anty-angiogennych znajdujących zastosowanie w omawianym wynalazku zawiera polisacharydy zdolne do kolidowania z funkcją czynnika wzrostu wiążącego heparynę, pobudzającego angiogenezę (np.: polisiarczan pentozy).

Innymi modulatorami angiogenezy są czynnik płytkowy IV oraz AGM 1470. Dalsze pochodzą od naturalnych inhibitorów kolagenazy, analogów witaminy D3, fumigaliny, herbimycyny A i izoflawonów.

D) Terapia endokrynna

Terapia endokrynna, stanowiąca uznany i reprezentatywny dział leczenia cytostatycznego może prowadzić do zatrzymania wzrostu komórek hormono-zależnych i redukcji ilości komórek guza in vivo, a także może hamować wzrost guza u pacjentów z guzami hormono-zależnymi. Terapia taka ma zwiększać działanie supresorów nowotworowych w działaniu na komórki hiperproliferujące. W innym ujęciu wynalazek zapewnia, np.: połączone zastosowanie kwasów nukleinowych i/lub polipeptydów supresorujących guzy z anty-estrogenami, anty-androgenami, lub antyprogesteronem. Leki endokrynologiczne są dobrze znane ludziom czynnym na przedmiotowym polu, jednak nie ograniczają się do tamoxifenu, toremifenu (patrz np.: USA 4,696,949), flutamidu, megace i lupronu, patrz także np.: WO 91/00732, WO 93/10741, WO 96/26201 oraz Gauthier et al. J Med. Chem. 40:2117-2122 (1997).

E) Dostarczanie pomocniczych środków przeciwrakowych: związki farmaceutyczne

Kompozycje farmaceutyczne

Pomocnicze środki antyrakowe stosowane według wynalazku są typowo połączone z akceptowanym farmaceutycznie nośnikiem dla stworzenia związku farmaceutycznego. Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może składać się z jednego lub większej ilości pomocniczych środków przeciwrakowych z lub bez genu lub polipeptydu supresorowego guza, np.: p53 lub RB.

Farmaceutycznie możliwe do przyjęcia nośniki mogą zawierać związki możliwe do przyjęcia fizjologicznie działające np.: stabilizująco na związek, zwiększające lub zmniejszające absorpcję środka i/lub związku farmaceutycznego. Związki możliwe do przyjęcia farmaceutycznie to na przykład węglowodany, jak glukoza, cukroza lub dekstrany, antyoksydanty jak kwas askorbinowy lub glutation, środki chelatujące, proteiny o małej masie cząsteczkowej, związki zmniejszające klirens lub hydrolizę pomocniczych związków antyrakowych, lub zaróbki lub inne stabilizatory i/lub bufory. Do stabilizacji związku, zwiększenia lub zmniejszenia absorpcji związku farmaceutycznego mogą zostać także użyte detergenty (przykładowe detergenty patrz poniżej).

Inne możliwe do przyjęcia fizjologicznie składniki to środki zwilżające, emulsyfikujące, rozpraszające lub konserwujące będące szczególnie przydatne dla zahamowania wzrostu lub działania mikroorganizmów. Znane są dobrze różne konserwanty, jak np.: fenol i kwas askorbinowy. Ważny jest wybór farmaceutycznie możliwego do przyjęcia nośnika, łącznie z fizjologicznie możliwym do przyjęcia składnikiem uzależnionym od, na przykład, drogi podania pomocniczych środków antyrakowych i od danej charakterystyki fizjo-chemicznej pomocniczego środka przeciwrakowego.

PL 193 767 B1

Podawane związki będą zwykle obejmowały roztwór pomocniczych środków antyrakowych rozpuszczonych w akceptowalnym farmaceutycznie nośniku, zaleca się nośnik wodny dla rozpuszczalnych w wodzie pomocniczych środków przeciwrakowych. Istnieje możliwość zastosowania różnych nośników, jak np.: buforowanego roztworu soli i podobnych. Omawiane roztwory są sterylne i ogólnie rzecz biorąc wolne od niepożądanych składników. Wspomniane związki można sterylizować z pomocą konwencjonalnych, dobrze znanych technik sterylizacji. Mogą one zawierać możliwe do przyjęcia farmaceutycznie substancje dodatkowe, wymagane przy zbliżeniu warunków fizjologicznych jak regulacja pH i składników buforujących, środków regulujących toksyczność i podobnych, przykładowo octan sodu, chlorek sodu, chlorek potasu, chlorek wapnia, mleczan sodu i podobne. Stężenie pomocniczych środków przeciwrakowych w powyższych recepturach może się zmieniać, będzie ono wybierane pierwotnie na podstawie objętości płynów, lepkości, masy cząsteczkowej i podobnych, w zależności od danego wybranego sposobu podania i potrzeb pacjenta.

Drogi podania

Pomocnicze środki przeciwrakowe stosowane według wynalazku są użyteczne i można je stosować pojedynczo, lub w związkach farmaceutycznych (z lub bez supresorów guza, np.: p53) w każdy znany sposób, np.: ogólnoustrojowo, regionalnie lub lokalnie; poprzez podanie dotętnicze, do guza, dożylne (IV), parenteralnie, do jamy otrzewnej, miejscowo, doustnie, lub lokalnie, podskórnie, dotchawiczo (np.: w aerozolu) lub podśluzówkowo (np.: śluzowka policzka, pęcherza moczowego, pochwy, macicy, odbytnicy, nosa), do guza (np.: podanie przezskórne lub lokalne). Szczególnie zalecane sposoby podania to iniekcje dotętnicze, w szczególności, gdy wymagany jest efekt „regionalny, np.: skupiając się na określonym organie (np.: mózg, wątroba, śledziona, płuca). Przykładowo, zaleca się podanie do tętnicy wewnątrzwątrobowej, gdy pożądane jest wywołanie regionalnego efektu przeciwnowotworowego w wątrobie; lub podanie do tętnicy szyjnej, gdy pożądane jest dostarczenie związku do mózgu (np.: w terapii guzów mózgu), tętnicy szyjnej lub tętnic układu tętnicy szyjnej (np.: tętnicy potylicznej, tętnicy usznej, tętnicy skroniowej, tętnicy mózgowej, tętnicy szczękowej itp.).

Paklitaxel i poszczególne pochodne paklitaxelu są jedynie śladowo rozpuszczalne w roztworach wodnych. W zalecanych połączeniach wspomniane związki są dostarczane albo bezpośrednio do lokalizacji guza (np.: poprzez iniekcję, przezprzewodowo lub poprzez podanie bezpośrednie podczas procedur chirurgicznych) lub są rozpuszczane w możliwej do przyjęcia zaróbce. Metody podania paklitaxelu i jego pochodnych są dobrze znane ekspertom (patrz np.: patenty USA nr: 5,583,153, 5,565,478, 5,496,804, 45,484,809). Inne pochodne paklitaxelu to analogi wodnorozpuszczalne i/lub proleki (patrz patent USA 5,411,984 oraz 5,422,364), podaje się konwencjonalnie różnymi, opisanymi powyżej metodami.

Kompozycje farmaceutyczne opisywanego wynalazku są szczególnie przydatne do podania miejscowego np.: w ranach operacyjnych w leczeniu guzów w stadium początkowym, rozwoju komórek nowotworowych lub przerzutowych i ich prekursorów. Innym rozwiązaniem są związki użyteczne w podawaniu parenteralnym, jak podanie dożylne lub podanie do jamy ciała lub światła organu.

Dawkowanie

Kompozycje farmaceutyczne można podawać w różnych formach jednostek dozujących uzależnionych od metody podania. Przykładowo, formą podania przy podaniu doustnym może być proszek, tabletki, pigułki, kapsułki, pastylki do ssania. Stwierdzono, że pomocnicze składniki przeciwrakowe (np.: paklitaxel i odpowiednie związki) przy podaniu doustnym, muszą być chronione przed strawieniem. W sposób typowy uzyskuje się powyższe poprzez powiązanie pomocniczego środka przeciwrakowego określonym związkiem w celu otrzymania odporności na hydrolizę kwasową i enzymatyczną, lub poprzez opakowanie pomocniczego środka przeciwrakowego w odpowiednio odporny nośnik jak liposomy. Znaczenie składników chroniących przed strawieniem jest dobrze znane (patrz np.: patent USA 5,391,377 opisujący związki lipidowe służące podaniu doustnemu środków terapeutycznych).

Dawkowanie dla typowych chemioterapeutyków jest dobrze znane. Co więcej, powyższe dawkowanie zaleca się typowo i reguluje w zależności od danego kontekstu terapeutycznego, tolerancji pacjenta itp. Przykładowo typowe dawkowanie związku farmaceutycznego (np.: paklitaxelu) do podania dożylnego (IV) wynosi 135 mg/m² podanego w ciągu 1-24 godzin (typowo w 1, 3 lub 6 godzin, preferowane 3 godziny), preferuje się powtarzanie co 3 tygodnie na 3 do 6 cykli. Dla zmniejszenia częstotliwości i ciężkości reakcji nadwrażliwości pacjenci mogą także otrzymywać około 20 mg deksametazonu (Decadron i inne) doustnie około 12 godzin i 6 godzin przed, oraz około 50 mg difenhydraminy (Benadryl® i inne) plus około 300 mg cymetydyny (Tagamet®) lub 50 mg ranitydyny (Zan16

PL 193 767 B1 tac®) IV 30 do 60 minut przed podaniem paklitaxelu. Istnieje możliwość stosowania znacznie wyższych dawek (np.: sięgających około 350 mg/m² na dzień), szczególnie, gdy lek jest podawany do oddzielonego miejsca, a nie do krwioobiegu, jak jamy ciała, lub światło organu. Możliwe jest zastosowanie znacząco wyższych dawek przy wybranych drogach podania, na przykład podanie miejscowe. Rzeczywiste metody przygotowania związków podawanych parenteralnie są znane i zostały szczegółowo opisane w takich publikacjach jak Remington's Pharmaceutical Science, wydanie 15, Mack Publishing Company,

Easton, Pennsylvania (1980) oraz patent USA nr: 5,583,153, 5,565,478, 5,496,804 oraz 5,484,809. Typo22 we dawki np. dla podania dootrzewnowego to 20-150 mg/m² na tydzień, lub około 250 mg/m² co 3 tygodnie.

Związki zawierające pomocnicze środki przeciwrakowe można podawać terapeutycznie. W zastosowaniu terapeutycznym wspomniane związki podaje się pacjentom cierpiącym na chorobę charakteryzującą się hiperproliferacją jednej lub większej ilości typów komórek w ilości odpowiedniej dla wyleczenia lub przynajmniej zahamowania postępu choroby i/lub jej powikłań. Ilość odpowiednia dla osiągnięcia powyższego celu jest określana jak „dawka efektywna terapeutycznie. Stosowaną ilość uzależnia się od ciężkości choroby lub ogólnego stanu zdrowia pacjenta.

Podanie jednorazowe lub wielokrotne związku jest uzależnione od wymaganego dawkowania, jego częstotliwości oraz od tolerancji pacjenta. W każdym wypadku związek powinien posiadać odpowiednią ilość pomocniczych środków przeciwrakowych niniejszego wynalazku dla efektywnego leczenia pacjenta.

II Geny i produkty genowe supresorujące nowotwory

A) Preferowane znane supresory nowotworów

Jak wyjaśniono poniżej, niniejszy wynalazek zapewnia metody inhibicji wzrostu i/lub proliferacji komórek poprzez kontaktowanie komórek z działającymi hamująco na guz kwasami nukleinowymi i pomocniczymi środkami przeciwrakowymi (np.: paklitaxel, pochodne paklitaxelu, lub związki podobne do paklitaxelu).

Geny supresujące guzy są dobrze znane i zawierają między innymi RB, p53, APC, FHIT (patrz np.: Siprashvili (1997) Proc. Natl. Acad. Sci USA 94:13771-13776), BRACA1 i BRACA2, VHL, WT, DCC, FAP, NF, MEN, E-cadherin, nm23, MMACI i PTC.RB lub gen retinoblastoma będący prototypowym genem supresorowym i dobrze scharakteryzowanym (patrz np.: Bookstein (1990) Science 247:712-715, Benedict (1980) Cancer Invest, 8:535-540, Riley (1990) Ann. Rev.Cell Biol. 10-1-29 oraz Wienberg (1992) Science 254:1138-1146. Być może najlepiej scharakteryzowanym supresorem guza jest p53 znajdujący zastosowanie w wielu nowotworach, podobnie jak w predyspozycji genetycznej do rozwoju rozmaitych guzów występujących rodzinnie w zespole Li-Fraumeni (patrz np.: Wills (1994) Hum. Gene Therap. 5:1079-1088, patent USA 5,532,220, WO 95/289048 oraz Haris (1996) J. Nat. Canc. Inst. 88(20): 1442) opisujący ekspresję klonowania i zastosowania p53 w terapii genowej). Do innych supresorów guzów jak WT (tj. WT1 w 11p13) gen charakterystyczny dla guza Wilmsa (patrz Cell et al. (1990) Cell, 60:60:509-520, Gessler (1990) Nature 343: 774-778 oraz Rose et al. (1990) Cell 60: 495-508). Gen supresji guza zwany FHIT, od Fragile Histidine Triad (nietrwała trójka histydynowa) znaleziono na chromosomie 3 (3p14.2, opisywany także na 3p21), w rejonie znanym jako szczególnie narażonym na translokację, złamanie lub luki, co ma prowadzić do raka przełyku, żołądka lub okrężnicy (patrz np.: Ohta et al. (1996) Cell, 84: 587-597), GenBank Accesion nr: U469227). Geny supresorowe guzów DCC (18q21) oraz FAP są związane z rakiem okrężnicy (patrz np.: Hedrick et al. (1994) Genes Dev., 8(10): 1174-1183, GenBank Accesion nr X76132 dla DCC oraz Wienberg (1992) Science, 254:1138-1146 dla FAP). Supresory guzów NF (NF1 na 17q11 oraz NF2 na 22q12) są związane z guzami neurologicznymi (np.: neurofibromatoza dla NF1 patrz np.: Caivthon et al. (1990) Cell, 62: 193-201, Voskochil et al. (1990) Cell, 62: 187-192, Wallace et al. (1990) Science, 249: 181-186 oraz Xug et al. (1990) Cell, 62: 599-608; a także oponiaki i schwannoma [guzy otoczki nerwowej] dla NF2). Supresor guzów MEN jest związany z guzami zespołu wielokrotnych nowotworów endokrynnych (patrz np.: Wienberg Science 254: 1138-1146 oraz Marshall (1991) Cell, 64: 313-326). Supresor guza VHL jest związany z chorobą Hippel-Landaua (Latif (1993) Science 260: 1317-1320, GenBank Accesion nr: L15409). Szeroko publikowane geny BRCA1 i BRCA2 są związane z rakiem sutka (patrz np.: Skolnick (1994) Science 266: 66-71, GenBank Accesion nr: U43746)). Dodatkowo gen E-cadherin jest związany z inwazyjnym fenotypem raka prostaty (Umbas (1992) Cancer Res. 52: 5104-5109, Bussemakers (1992) Cancer Res. 52: 2916-2999, GenBank Accesion nr: 272397). Gen NM23 jest związany z przerzutami nowotworowymi (Dooley (1994) Hum. Genet, 93 (1): 63-66, GenBank Accesion nr: X75598). Inne supresory guzów jak DPC4 (zidentyfikowany na 18q21) związany z rakiem

PL 193 767 B1 trzustki, hHLH1 (3p) oraz hHLH2 (2p) związany z rakiem okrężnicy oraz CDKN2 (p16) oraz (9p) związane z czerniakiem, rakami trzustki i przełyku. Na koniec ludzki gen PTC (homologiczny z łatanym genem drosophila (ptc)) jest związany z rakiem komórek podstawnych newoidu (NBCCS) oraz z rakami somatycznych komórek podstawnych (patrz np.: Hahn et al. (1996) Cell, 85:841-851). Ta lista genów supresorowych nowotworów nie jest wyczerpująca, ani nie ogranicza się do wymienionych, lecz miała na celu zilustrowanie dużej różnorodności znanych supresorów nowotworowych.

B) Identyfikacja i skrining znanych wcześniej supresorów guza

Metody identyfikacji lub analizowania supresorów nowotworowych są dobrze znane fachowcom. Typowo komórki hiperproliferujące oznacza się na utratę lub mutację genu, związanego (korelującego) ze stanem hiperproliferacji. Najostrzejszym testem genu dla zakwalifikowania jako gen supresorowy (TSG) jest jego zdolność do supresji fenotypu onkogenetycznego guza lub komórek pochodzących z guza. Kwasy nukleinowe hamujące rozwój guza są najchętniej wprowadzane do komórek guza jako klonowane cDNA w odpowiednim wektorze ekspresji, lub na indywidualnym chromosomie zawierającym gen kandydat na supresor, wprowadzane do komórek guza za pomocą techniki transferu mikrokomórkowego. Alternatywnie produkt genu supresji nowotworu (np.: polipeptyd supresji guza) wprowadza się do komórki (komórek) i mierzony stopień proliferacji komórek (np.: przez liczenie komórek lub mierzenie objętości guza itp.). Całkowite lub częściowe zahamowanie proliferacji (tj. zmniejszenie stopnia proliferacji), zahamowanie kontaktowe, utrata fenotypu inwazyjności, różnicowanie komórek oraz apoptoza stanowią wskaźniki supresji fenotypu onkogenetycznego (zredukowana czułość na stan nowotworowy).

Metody skriningu guzów w celu identyfikacji zmienionego kwasu nukleinowego lub o niepełnej ekspresji są dobrze znane fachowcom. Metody takie zawierają między innymi hybrydyzację subtrakcyjną (patrz np.: Hampson (1992) Nucleic Acids Res. 20:2899), porównawczą hybrydyzację genomu ((CGH) patrz np.: WO 93/18186, Kailioniemi (1992) Science 258: 818) oraz monitorowanie ekspresji stosując tablice wysokiej gęstości próbek kwasów nukleinowych (patrz np.: Lockhart (1996 Nature Biotechnology, 14(13): 1675-1680).

C) Przygotowanie p53 i innych supresorów guzów

Jak wskazano powyżej, wynalazek obejmuje kontakt z komórką, np.: in vitro w roztworze fizjologicznym (np.: krew), w tkance organu lub organizmie z kwasem nukleinowym supresującym nowotwór lub genowym produktem supresorowym jak polipeptyd. Kwasu nukleinowy supresujący guz lub polipeptyd jakiegokolwiek znanego supresora genu jak między innymi RB, p53, h-NUC (Chen (1995) supra), APC, FHIT, BRACA1, BRCA2, VHL, WT, DCC, FAP, NF, MEN, E-cadherin, nm23, MMACI oraz PTC jak opisano powyżej. W preferowanym ujęciu supresorem guza jest kwas nukleinowy RB lub kwas nukleinowy p53 lub polipeptyd lub ich aktywny fragment (y).

W większości preferowanych ujęć kwas nukleinowy supresorów guza p53 lub RB jest obecny w kasecie ekspresji pod kontrolą promotora prowadzącego ekspresję genu supresora nowotworu lub cDNA, gdy jest zlokalizowany w docelowej komórce (komórce guza). Metody konstrukcji kaset ekspresji i/lub wektorów kodujących geny supresorowe guza są dobrze znane fachowcom, jak opisano poniżej.

1. Przygotowanie kwasów nukleinowych supresji guza

Kodowanie DNA białek lub podsekwencji białek supresorowych guza niniejszego wynalazku można przygotować każdą właściwą metodą, na przykład poprzez klonowanie i ograniczanie odpowiednich sekwencji lub za pomocą bezpośredniej syntezy chemicznej (np.: stosując istniejące informacje o sekwencjach, jak opisano powyżej) metodą taką jak metoda fosfotriestrowa Naranga (1979) Meth. Enzymol., 68: 90-99; metodą fosfodiestrową Browna i wsp. Meth. Enzymol. 68: 109-151 (1979); metodą dietylofosforoamidu Beaucage'a i wsp., Tetra Lett, 22: 1859-1862 (1981); oraz metodą stałego wsparcia patent USA nr: 4,458,066.

Metodą syntezy chemicznej produkuje się pojedyncze łańcuchy oligonukleotydów. Mogą one zostać przekształcone w podwójne nici DNA poprzez hybrydyzację z sekwencją komplementarną, lub poprzez polimeryzację z polimerazą DNA stosując pojedynczy łańcuch jako matrycę. Wiadomo, że podczas gdy chemiczna synteza DNA ogranicza się do sekwencji około 100 zasad, dłuższe sekwencje można uzyskać za pomocą ligacji krótszych sekwencji.

Alternatywnie podsekwencje można klonować, a odpowiednie podsekwencje rozcinać stosując właściwe enzymy restrykcyjne. Fragmenty można następnie łączyć wytwarzając żądaną sekwencję DNA.

PL 193 767 B1

Kwasy nukleinowe supresji guza niniejszego wynalazku można klonować stosując metody amplifikacji DNA jak reakcja łańcucha polimerazy (PCR). W ten sposób można przykładowo amplifikować poprzez PCR sekwencję lub podsekwencję kwasu nukleinowego stosując polimer odczytujący zawierający jedno miejsce restrykcyjne (np.: Ndel) oraz primer anty-odczytujący zawierający drugie miejsce restrykcyjne (np.: Hindlll). Spowoduje to wytworzenie kwasu nukleinowego kodującego żądaną sekwencję lub podsekwencję supresji nowotworu i posiadającą końcowe miejsca restrykcyjne. Kwas nukleinowy można wtedy łatwo dołączyć do wektora zawierającego kwas nukleinowy kodujący drugą cząsteczkę i posiadający właściwe, odpowiadające miejsca restrykcyjne. Odpowiednie primery PCR można określić stosując opublikowane informacje o sekwencji dla każdego znanego genu supresji nowotworu, cDNA lub białka. Właściwe miejsca restrykcyjne można także dodać do kwasu nukleinowego kodującego supresorowe białko lub podsekwencję białkową nowotworu w procesie bezpośredniej mutagenezy. Plazmid zawierający sekwencję lub subsekwencję supresorową jest rozcinany za pomocą odpowiedniej endonukleazy restrykcyjnej i następnie dołączany do wektora kodującego drugą cząsteczkę zgodnie z metodą standardową.

Jak wskazano powyżej, są znane sekwencje kwasów nukleinowych wielu genów supresorowych. Przykładowo sekwencja kwasów nukleinowych p53 znajduje się w Lamb et al. (1986) Mol. Cell Biol.6: 1379-1385, GenBank Accesion nr: M13111). Podobnie sekwencja kwasu nukleinowego RB została opisana przez Lee et al. (1987) Nature, 329: 642-645 (GenBank Accesion nr: M28419). Sekwencje kwasów nukleinowych innych supresorów są dostępne, jak opisano powyżej w rozdziale II(a). Stosując dostępne informacje o sekwencji można klonować geny supresorowe guzów do wektorów odpowiednich dla praktycznej strony niniejszego wynalazku.

Supresory p53 oraz RB zaleca się szczególnie do zastosowania w opisywanym wynalazku. Są dobrze znane metody klonowania p53 i RB do wektorów odpowiednich dla ekspresji właściwych białek supresorowych guza lub dla celów terapii genowej. Tak przykładowo klonowanie i zastosowanie p53 opisano w szczegółach przez Willsa (1994) powyżej; w patencie USA nr: 5,532,220, w USSN 08/328,673 złożonym 25 listopada 1994 oraz w WO 95/11984. Typowo kaseta ekspresji jest skonstruowana z supresorowym cDNA guza operacyjnie związanym z promoterem, a lepiej w silnym promotorem (np.: Ad2 MLP), lub promotorem ludzkiego wirusa cytomegalii (CMV)). W szczególnie preferowanym ujęciu za promotorem występuje lider trójek cDNA, a po supresorowym cDNA występuje miejsce poliadenylacji (patrz np.: USSN 08/328,673, WO 95/11984 oraz Wills (1994) powyżej). Właściwe będzie także umieszczenie specyficznych promotorów tkankowych. Tak przykładowo promotor tyrozynazy można zastosować jako docelową ekspresję dla melanoma (patrz np.: Siders (1996) Cancer Res. 56:5638-5646). W szczególnie preferowanym układzie supresorowe cDNA wyraża się w wektorze odpowiednim dla terapii genowej jak opisano poniżej.

2. Przygotowanie białka supresorowego nowotworu

a) Synteza chemiczna de novo

Stosując znane sekwencje polipeptydów supresorowych guza można syntetyzować białka supresorowe lub ich podsekwencje stosując standardowe techniki syntezy chemicznej peptydów. Jeżeli żądane sekwencje są relatywnie krótkie (np.: gdy wymagana jest określona determinanta antygenowa) cząsteczkę można syntetyzować w formie pojedynczego ciągłego polipeptydu. Jeżeli wymagane są większe cząsteczki, podsekwencje można syntetyzować osobno (w jednej lub kilku częściach), a następnie łączyć w procesie kondensacji końca aminowego jednej cząsteczki z końcem karboksylowym drugiej tworząc wiązanie peptydowe.

Synteza fazy stałej, w której dołącza się koniec C aminokwasu sekwencji do nierozpuszczalnego stałego wspornika, po którym następuje kolejna addycja pozostałych aminokwasów sekwencji jest zalecaną metodą syntezy chemicznej polipeptydów mniejszego wynalazku. Technikę syntezy fazy stałej opisali Barany i Merrifielda, Solid-Phase Peptide Synthesis; str. 3-284 w The Piptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part a., Merrifield et al. J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963) oraz Steward et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2^nd ed. Pierce Chem. Co.,RockfordIll (1984).

b) Ekspresja rekombinowana

W preferowanym ujęciu proteiny lub podsekwencje supresorowe nowotworu syntetyzuje się z zastosowaniem metodologii rekombinowanego DNA. Ogólnie rzecz biorąc wymaga to stworzenia sekwencji DNA kodującej proteiny łączące, umieszczające DNA w kasecie ekspresji pod kontrolą poPL 193 767 B1 szczególnych promotorów, powodujących ekspresję proteiny u gospodarza, izolując wytworzoną proteinę i w razie potrzeby jej renaturowanie.

Metody klonowania kwasów nukleinowych do określonego wektora opisano powyżej. Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca białka lub podsekwencje białek supresorowych mogą ulegać ekspresji w różnych komórkach gospodarza, łącznie z E. Coli, innymi bakteriami, drożdżami i różnymi wyższymi komórkami eukariotycznymi jak linie komórkowe COS, CHO i HeLa oraz linią komórkową szpiczaka. Białka supresorowe znajdujemy typowo u eukariota, więc preferowanym gospodarzem jest komórka eukariotyczna. Rekombinowany gen proteinowy dołącza się funkcjonalnie do odpowiedniej sekwencji kontroli ekspresji dla każdego gospodarza. Dla E. coli dotyczy to promotora T7, trp lub promotora lambda, miejsca wiązania rybosomu i chętnie miejsca zakończenia sygnału transkrypcji. Dla komórek eukariotycznych sekwencje kontrolne będą zawierać promotor i preferowalnie wzmacniacz uzyskany z genów immunoglobulin, SV40, cytomegalowirusa itp. oraz sekwencję poliadenylacji, a także mogą zawierać sekwencje rozszczepiające donor i akceptor.

Plazmidy wynalazku można przenosić do wybranej komórki gospodarza za pomocą dobrze znanych metod jak transformacja chlorku wapnia dla E.coli oraz działanie fosforanem wapnia lub metoda elektropolacji dla komórek gruczołu sutkowego. Komórki transformowane przez plazmidy można wybierać metodą oporności na antybiotyki wytwarzane przez geny zawarte w plazmidach, jak amp, gpt, neo oraz hyg.

Po ekspresji proteiny supresorowe można oczyszczać zgodnie ze standardowymi procedurami jak precypitacja na siarczku amonu, kolumny powinowactwa, chromatografia kolumnowa, elektroforeza na żelu i temu podobne (patrz ogólnie R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982), Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification., Academie Press, Inc N.Y. (1990)). Preferowane są czyste składniki protein o minimalnej homogeniczności 90 do 95%, a najbardziej o homogenności 98 do 99%. Po częściowym lub całościowym oczyszczeniu polipeptydy można wykorzystać (np.: jako immunogeny do wytwarzania przeciwciał).

Wiadomo, że po syntezie chemicznej, ekspresji biologicznej lub oczyszczaniu białka supresorowe guza mogą posiadać budowę znacznie różniącą się od pierwotnej składowych polipeptydów. W takim przypadku może okazać się konieczna denaturacja i redukcja polipeptydu, a następnie ponowne przyłączenie polipeptydu do żądanego układu. Metody redukcji i denaturacji protein, łącznie z ponownym wiązaniem są znane (patrz Debinski (1993) J. Biol. Chem. 268: 14065-14070; Kreitman (1993) Bioconjug. Chem. 4: 581-585; oraz Buchner (1992) Anal. Biochem. 205: 263-270).

Przykładowo Debinski (1993) powyżej opisuje denaturację i redukcję ciał wtrętowych w guanidyno-DTE. Proteiny łączy się następnie w buforze redoks zawierającym utleniony glutation i L-argininę.

Można zauważyć, że wiele konserwatywnych odmian sekwencji kwasów nukleinowych i polipeptydów dają funkcjonalnie identyczne produkty. Przykładowo z powodu degeneracji kodu genetycznego „ciche substytucje” (tj. substytucja kwasu nukleinowego sekwencją nie wynikającą ze zmiany w kodowanym polipeptydzie) są wprowadzane w każdej sekwencji kwasu nukleinowego kodującej aminokwas. Podobnie, „konserwatywna substytucja aminokwasu”, jeden lub kilka aminokwasów w ich sekwencji zostaje podstawionych innymi aminokwasami o bardzo podobnych właściwościach (patrz rozdział definicji, powyżej), jest także identyfikowana jako wysoce podobna do odkrytej sekwencji aminokwasów, lub od odkrytej sekwencji kwasów nukleinowy kodujących aminokwasy. Takie konserwatywnie podstawiane zmiany każdej dokładnie opisanej sekwencji są podstawą przyszłych wynalazków.

Istnieje możliwość dokonania modyfikacji w białkach supresorowych guza bez zmniejszania ich aktywności biologicznej. Niektóre z modyfikacji można dokonać w celu ułatwienia klonowania, ekspresji lub włączania docelowej cząsteczki do syntetyzowanej proteiny. Takie modyfikacje są dobrze znane i zalicza się do nich, między innymi dodanie metioniny do końca aminowego, w celu zapewnienia miejsca inicjacji, lub umieszczenie dodatkowego aminokwasu (np., poly His) na jednym z końców dla stworzenia konwencjonalnie umiejscowionego miejsca restrykcyjnego, kodonu końcowego, lub sekwencji oczyszczającej.

Modyfikacje kwasów nukleinowych i polipeptydów można ocenić rutynowymi technikami skriningu w odpowiednich próbach immunologicznych. Standardowe techniki pozwalają na ocenę modyfikacji innych właściwości jak hybrydyzacja kwasów nukleinowych do docelowego kwasu nukleinowego, stabilność redoks lub termiczna proteiny, hydrofobowość, wrażliwość na proteolizę lub tendencja do agregacji.

PL 193 767 B1

D) Wprowadzanie supresorów guzów do komórki docelowej

Supresory guzów stosowane w metodzie niniejszego wynalazku można wprowadzić do komórki zarówno w formie proteiny, jak i kwasu nukleinowego. Jeżeli supresor wprowadza się w formie białka, produkty ekspresji genu supresorowego (np.: polipeptydy p53 lub RB, lub ich fragmenty posiadające aktywność supresorową) wprowadza się do komórki docelowej z zastosowaniem standardowych metod wprowadzania protein (patrz dyskusja, poniżej). Alternatywnie, gdy supresorem guza jest kwas nukleinowy (np.: gen, cDNA, mRNA itp.), wprowadza się go do komórki z zastosowaniem konwencjonalnej metody wprowadzania kwasów nukleinowych do komórek. Typowo stosuje się metody terapii genowej in vivo i ex vivo, jak opisano poniżej. W szczególności preferowane metody dostarczania p53 lub RB zawierają dostawę liposomalną i/lub zastosowanie wektorów retrowirusowych lub adenowirusowych.

1. Terapia genowa in vivo

W bardziej preferowanym ujęciu supresorowe kwasy nukleinowe (np.: cDNA kodujące białka supresorowe guza) klonuje się do wektorów terapii genowej kompetentnych do transfekowania komórek (takich jak ludzkie lub inne komórki gruczołu sutka) in vitro i/lub in vivo.

Stosuje się kilka różnych sposobów wprowadzania kwasów nukleinowych do komórek in vivo, ex vivo oraz in vitro. Zalicza się do nich dostawy genowe bazujące na lipidach lub liposomach (WO 96/183/2; WO 93/24640; Mannino (1988) BioTechniques 6(7): 682-691; Rose, patent USA nr: 5,279,833; WO 91/06309; oraz Felgner (1987) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84: 7413-7414) oraz replikacji uszkodzonych wektorów retrowirusów zawierających sekwencję terapeutyczną polinukleotydów jako część genomu retrowirusa (patrz np.: Miller (1990) mol. Cell. Biol. 10:4239 (1990); Kolberg (1992) J. NIH Res. 4: 43 oraz Cornetta (1991) Hum. Gene Ther. 2:215).

Jako podsumowanie procedur terapii genowej, patrz np.: Zhang (1996) Cancer Metastasis Rev. 15:385-401; Anderson, Science (1992) 256: 808-813; Nabel (1993) TIBTECH 11: 211-217; Mitani (1993) TIBTECH 11: 162-166; Mulligan (1993) Science, 926-932; Dillon (1993) TIBTECH 11: 167-175; Miller (1992) Nature 357: 455-460; Van Brunt (1988) Biotechnology 6(10): 1149-1154; Vigne (1995)

Restorative Neurology and Neuroscience 8: 35-36; Kremer (1995) British Medical Bulletin 51(1) 31-44;

Haddada (1995) w Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler and Bohm (eds) Springer-Verlag, Heidelberg Germany; oraz Yu (1994) Gene Therapy, 1:13-26.

Wektory użyteczne w praktyce niniejszego wynalazku typowo uzyskuje się z genomu wirusowego. Wektory stosowane do włączenia rekombinowanego otoczkowego i nieotoczkowego DNA i RNA są najchętniej wybierane z baculoviridiae, parvoviridiae, picornoviridiae, herpesviridiae, poxviridiae, adenoviridiae lub picornnaviridiae. Istnieje także możliwość zastosowania wektorów chimerycznych wykorzystujących zaawansowane właściwości obu wektorów pierwotnych (patrz np.: Feng (1997) Nature Biotechnology 15: 866-870). Takie genomy wirusowe można modyfikować poprzez techniki rekombinacyjne DNA w celu umieszczenia genu supresorowego i dla uzyskania niepełnej replikacji, warunkowej replikacji lub replikacji kompetencyjnej. W praktyce chętnie stosuje się wektory pochodzące z genomów adenowirusów, wirusów adenopochodnych i retrowirusów. Najchętniej dla potrzeb niniejszego wynalazku wykorzystywano wektory niereplikujące pochodzące z genomu ludzkiego adenowirusa.

Warunkowo replikujące wektory wirusowe wykorzystywano dla osiągnięcia selektywnej ekspresji w określonych typach komórek unikając jednak szerokiego spektrum infekcji. Przykłady warunkowo replikujących wektorów opisał Bishoff et al. (1996) Science 274: 373-376; Pennisi, E. (1996) Science 274: 342-343; Russell, S.J. (1994) Eur. J. Of Cancer 30A(8): 1165-1171. Dodatkowo genom wirusowy można modyfikować włączając indukowalne promotory uzyskujące replikację lub ekspresję transgeniczną jedynie w określonych warunkach. Przykłady indukowalnych promotorów są znane w literaturze naukowej (patrz np.: Yoshida i Hamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230: 426-430; Iida et al. (1996) J. Virol. 70(9): 6054-6059; Hwang et al. (1997) J. Virol. 71(9): 7128-7131; Lee et al.;. (1997) Mol. Cell. Biol. 17(9): 5097-5105; oraz Dreher et al. (1997) J. Biol. Chem 272(46): 29364-29371. Transgeny mogą znajdować się także pod kontrolą regionów promotorowych specyficznych dla tkanki pozwalających na ekspresję transgenu jedynie w określonych typach komórek.

Do szeroko stosowanych wektorów retrowirusowych zalicza się bazujące na wirusie mysiej białaczki (MuLV), wirusie białaczki gibbonów ape (GaLV), wirusie braku odporności simian (SIV), ludzkim wirusie braku odporności (HIV) i ich kombinacjach. Patrz np.: Buchscher (1992) J. Virol. 66(5) 2731-2739; Johann (1992) J. Virol. 66(5): 1635-1640 (1992); Sommerfelt (1990) Virol. 176: 58-59; Wilson (1989) J. Virol 63: 2374-2378; Miller (1991) J. Virol 65:2220-2224; Wong-Staal et al., PCT/US94/05700 oraz

PL 193 767 B1

Rosenburg i Fauci (1993) w Fundamental Immunology, Third Edition Paul (ed) Raven Press, Ltd., New York i znajdujące się w niej referencje oraz Yu (1994) powyżej). Wektory są opcjonalnie pseudotypowane w celu rozszerzenia zakresu gospodarzy o komórki nieinfekowane przez retrowirus odpowiadający wektorowi. Glikoproteinę otoczkową wirusa pęcherzykowego zapalenia żołądka (VSV-G) wykorzystano do skonstruowania wektorów HIV pseudotypu VSV-G mogących infekować macierzyste komórki hematopoetyczne (Naldini et al. (1996) Science 272: 263 oraz Akkina (1996) J. Virol. 70:2581).

Wektory bazujące na wirusie związanym z adenowirusem (AAV) stosuje się także do transdukcji komórek docelowymi kwasami nukleinowymi np.: w produkcji in vitro kwasów nukleinowych i peptydów oraz w procedurach terapii genowej in vivo i ex vivo dla przeglądu wektorów AAV patrz Okada (1996) Gene Ther, 3: 957-964; West (1987) Virology 160: 38-47; Carter (1989) patent USA nr: 4,797,368; Carter et al. WO 93/24641 (1993) Kotin (1994) Human Gene Therapy 5: 793-801; Muzyczna (1994) J. Clin. Invst. 94:1351. Konstrukcję wektorów rekombinowanych AAV opisano w wielu publikacjach, jak Lebkowski, patent USA nr: 5,173,414; Tratschin (1985) Mol Cell Biol. 5(11): 3251-3260; Tratchin (1984) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Hermonat (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; McLaughlin (1988) oraz Samulski (1989) J. Virol., 63: 03822-3828. Linie komórkowe można transformować poprzez rAAV łącznie z opisanymi przez Lebkowskiego (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 3988-3996. Inne możliwe do wykorzystania wektory, to między innymi wirus opryszczki i wirus krowianki.

W szczególnie preferowanym ujęciu gen supresorowy nowotworu posiada ekspresję w wektorze adenowirusa odpowiednim do terapii genowej. Zastosowanie wektorów adenowirusowych in vivo oraz dla terapii genowej zostało dobrze opisane w patencie i literaturze naukowej, np.: patrz Hermens (1997) J. Neurosci. Methods., Jan., 71(1): 85-98; Zeiger (1996) Surgery 120: 921-925; Channon (1996) Cardiovasc Res. 32: 962-972; Huang (1996) Gene Ther. 3: 980-987; Zepeda (1996) Gene Ther., 3: 973-979; Yang (1996) Hum. Mol. Genet. 5: 1703-1712; Caruso (1996) Proc. Natl. Acad. Sci USA 93: 11302-11306; Rothmann (1996) Gene Ther. 3: 919-926; Haecker (1996) Hum. Gene Ther. 7: 1907-1914. Zastosowanie wektorów adenowirusowych szczegółowo opisano w WO 96/25507. Najchętniej stosowane wirusy opisano u Willisa (1994) powyżej; w USSN 08/328,673 oraz WO 95/11984.

Preferowane wektory adenowirusowe zawierają delecję, w niektórych lub wszystkich genach proteinowych IX. W jednym u zastosowań wektory adenowirusowe zawierają delecję sekwencji E1a i/lub E1b. W większości opracowań konstrukcja adenowirusowa jest kodowana p53 tak, że A/C/N/53 lub A/M/N/53 (patrz np.: USSN 08/328,673 oraz WO 95/11984).

Zaleca się także wektory pochodzące z ludzkich adenowirusów typu 2 lub typu 5. Wektory takie nie replikują dzięki modyfikacji lub delecji w regionach kodowych E1a i/lub E1b. Chętnie stosowane są także modyfikacje genomu wirusa dla osiągnięcia poszczególnych charakterystyk ekspresji, lub dla umożliwienia powtórnej administracji, lub obniżenia odporności immunologicznej. Chętniej stosowane są rekombinowane wektory adenowirusów zawierające kompletną lub częściową delecję regionu kodowego E4, opcjonalnie utrzymujących E4 ORF6 oraz ORF 6/7. Sekwencja kodowa E3 może ulec delecji, przy czym zaleca się jej pozostawienie. W szczególności zaleca się modyfikację promotora E3 w celu zwiększenia ekspresji E3 dla osiągnięcia bardziej pożądanego profilu immnunologicznego dla wektorów terapeutycznych. Najchętniej stosowane są wektory adenowirusów ludzkich typu 5 zawierające sekwencję kodową p53 pod kontrolą regionu promotora cytomegalowirusa i potrójnej wiodącej sekwencji kodowej posiadającej E3 pod kontrolą promotora CMV oraz delecję regionów kodowych E4 z utrzymaniem E4 ORF6 lub ORF 6/7. Najchętniej stosowaną praktyką niniejszego wynalazku, jaki podano na przykładzie, jest wektor ACN53.

Najczęściej stosowanym genem supresorowym jest p53 lub RB. Jak wyjaśniono powyżej, klonowanie z wykorzystaniem p53 zostało szczegółowo opisane przez Willsa (1994) powyżej; w USSN 08/328,673 złożonego 25 listopada 1994 oraz w WO 95/11984.

2. Terapia genowa ex vivo

Metody niniejszego wynalazku są stosowane dla zahamowania komórek hiperproliferujących (np.: nowotworowych) w organizmie (np.: u ssaków między innymi szczura, myszy, krowy, świni, konia, królika, kota, largomorph, lub ludzkich). Patologiczne komórki hiperproliferujące znajdujące się wśród prekursorów hematopoetycznych podczas odtwarzania szpiku kostnego można eliminować podaniem ex vivo metodami niniejszego wynalazku. Metody takie obejmują typowo próbkę z danego organizmu. Próbkę stanowi typowo preparat komórek heterogennych zawierających zarówno fenotyp prawidłowych jak i patogennych (hiperproliferujących) komórek. Próbkę poddaje się działaniu supreso22

PL 193 767 B1 rowych kwasów nukleinowych lub protein oraz pomocniczych środków przeciwnowotworowych zgodnie z metodami niniejszego wynalazku. Geny supresorowe można wprowadzić np.: w wektorze wirusowym, takim jak wektor retrowirusowy lub adenowirusowy. Postępowanie zmniejsza proliferację komórek patogennych dając próbkę zawierającą wyższy współczynnik komórek prawidłowych do patogennych, możliwych do wprowadzenia do organizmu ludzkiego.

Znana jest dobrze transformacja komórek ex vivo dla celów diagnostycznych, badawczych lub terapii genowej (np.: na drodze reinfuzji transformowanych komórek do organizmu gospodarza). Komórki izoluje się z danego organizmu, transfekuje genem supresorowym guza lub cDNA niniejszego wynalazku i wprowadza na powrót do organizmu (np.: pacjenta). Znane są różne typy komórek nadających się do transformacji ex vivo. Preferowane są komórki rodzice lub komórki macierzyste (patrz np.: Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition Wiley-Liss, New York i kolejne poprawione wydania opisujące sposoby izolacji i prowadzenia kultur komórek pobieranych od pacjentów). Komórki transformowane hoduje się w znany sposób. Patrz także Kuchler (1977) Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Kuchler R.J. Dowden, Hutchinson and Ross Inc. oraz Atlas (1993) CRC Handbook of Microbiological Media (Parks ed) CRC press Boca Raton F1. Systemy komórek ssaków znajdują się często w formie pojedynczych warstw komórkowych, mimo, ze stosuje się także ich zawiesiny. Alternatywnie komórki można uzyskać z zapasów przechowywanych w banku komórek (np.: banku krwi). Przykłady ilustrujące linie komórek ssaków to linia komórkowa HEC-1-B, komórki VERO i Hela, linie komórkowe jajnika chomika chińskiego (CHO), linie komórkowe W138, BHK, Cos-7 lub MDCK (patrz np.: Freshney, supra).

Komórki macierzyste stosuje się często w procedurach ex vivo do transformacji komórkowej i terapii genowej. Zaletą komórek macierzystych jest ich możliwość różnicowania do innych typów komórek in vitro, lub możliwość ich wprowadzenia do ssaka (jak i donora komórek), gdzie zostaną wszczepione do szpiku kostnego. Znane są metody różnicowania komórek macierzystych (np.: Cd34*) in vitro do klinicznie istotnych typów komórek immunologicznych z zastosowaniem cytokin jak GM-SCF, IFN-gamma oraz TFN-alfa (patrz np.: Inaba (1992) J. Exp. Med. 176: 1693-1702; Szabolcs (1995) 154: 5851-5861).

Zamiast stosowania komórek macierzystych do procedur ex vivo stosuje się także limfocyty T lub B. Znane są różne techniki izolowania komórek T i B. Ekspresja markerów powierzchniowych pozwala na identyfikację i oczyszczanie wspomnianych komórek. Metody identyfikacji i izolacji komórek zawierają FASC, inkubację w kolbach ze stałymi antygenami wiążącymi dany typ komórki oraz paning kulkami magnetycznymi.

Komórki macierzyste izoluje się do celów transdukcji i różnicowania z zastosowaniem znanych metod. Przykładowo w przypadku myszy komórki szpiku kostnego izoluje się poświęcając mysz i przecinając nożyczkami kości nóg. Komórki macierzyste izoluje się z komórek szpiku poprzez paning komórek szpikowych z przeciwciałami wiążącymi niechciane komórki, jak CD4* oraz CD8* (komórki T), CD45* (komórki panB), GR-1 (granulocyty) oraz la⁴ (zróżnicowane komórki prezentujące antygen). Przykład takiego protokołu patrz Inaba (1992) powyżej.

U ludzi aspirację szpiku kostnego z talerza biodrowego przeprowadza się np.: w znieczuleniu ogólnym w sali operacyjnej. Podczas aspiracji szpiku kostnego pobiera się około 1,000 ml, zbierając z tylnych części kości biodrowej i z talerza biodrowego. Jeżeli całkowita ilość komórek jest mniejsza od około 2x10⁸/kg, przeprowadza się powtórną aspirację z mostka i talerzy biodrowych części tylnej i przedniej. Podczas operacji wprowadza się napromieniowane krwinki czerwone na miejsce aspirowanego szpiku.

Ludzkie komórki hematopoetyczne rodzica i komórki macierzyste charakteryzują się obecnością błonowego antygenu powierzchniowego CD34. Antygen ten stosuje się do oczyszczania np.: na kolumnach powinowactwa wiążących CD34. Po pobraniu szpiku kostnego komórki jednojądrowe oddziela się od innych składników poprzez wirowanie gradientowe z fikolem. Można je przeprowadzić metodą półautomatyczną stosując separator komórkowy (np.: urządzenie Baxter Fenwal CS3000+ lub Terumo). Komórki o małej gęstości, głównie komórki monojądrowe izoluje się i inkubuje w plastikowych kolbach w około 37°C na około 1,5 godziny. Odrzuca się komórki przylegające (monocyty, makrofagi i komórki B). Następnie pobiera się komórki nieprzylegające i inkubuje z przeciwciałem monoklonalnym anty-CD34 (np.: przeciwciało mysie 9C5) w 4°C na 30 minut z łagodnym mieszaniem. Ostateczne stężenie przeciwciał anty-CD34 powinno wynosić około 10 mg/ml. Po dwukrotnym przemyciu do zawiesiny komórek dodaje się paramagnetyczne mikrokule (np.: Dyna Baeds, dostarczane przez

PL 193 767 B1

Baxter Immunotherapy Group, Santa Ana, California) pokryte owczym przeciwciałem przeciw komórkom myszy IgG (Fc) w ilości około 2 komórki na kulkę. Po dalszych 30 minutach inkubacji w około 4°C zbiera się rozetowane komórki z kulkami magnetycznymi z zastosowaniem magnesu. Na koniec dodaje się chymopapainę (Baxter Immunotherapy Group, Santa Ana, California) w stężeniu 200U/ml w celu uwolnienia komórek CD34+ z kulek.

Alternatywnie można zastosować procedurę izolowania na kolumnach powinowactwa wiążących do CD34 lub do przeciwciał związanych z CD34 (patrz np.: Ho(1995) Stem Cells 13 (suppl. 3): 100-105 oraz Brenner (1993) Journal of Hematotherapy 2: 7-17).

Można także izolować hematopoetyczne komórki macierzyste z niemowlęcej krwi pępowinowej. Yu (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 699-703 opisuje preferowaną metodę transdukcji komórek CD34* z ludzkiej krwi pępowinowej z zastosowaniem wektorów retrowirusowych.

3. Podawanie wektorów ekspresji supresorowych kwasów nukleinowych: wektory i kasety ekspresji

Drogi podania

Kasety ekspresji i wektory (np.: retrowirusy, adenowirusy, liposomy itp.) zawierające terapeutyczne, supresorowe kwasy nukleinowe wynalazku można podawać bezpośrednio do organizmu dla transdukcji komórek in vivo. Możliwe jest podanie każdą zwykle stosowaną drogą wprowadzania cząsteczki do kontaktu z komórkami krwi lub tkanek, np.: ogólnoustrojowe, regionalne lub lokalne, jak w szczegółach opisano powyżej dla podawania pomocniczych środków przeciwrakowych. „Opakowane kwasy nukleinowe (minimum sekwencja kodująca supresor z promotorem) podaje się w odpowiedni sposób, na możliwych do przyjęcia farmaceutycznie nośnikach, co omówiono powyżej. Istnieją odpowiednie i metody administracji tak opakowanych kwasów nukeinowych, można zastosować więcej niż jedną drogę podania danego związku, a określona droga może zapewniać natychmiastową i bardziej efektywną reakcję od innej.

Przykładowo, podanie rekombinowanego wektora adenowirusowego stworzonego w celu ekspresji genu supresorowego może pobudzić odpowiedź immunologiczną, w szczególności powstawanie przeciwciał przeciwko wektorowi adenowirusowemu. Niektórzy pacjenci mają obecne przeciwciała anty-adenowirusowe. Wtedy, w większości przypadków podanie regionalne lub lokalne będzie bardziej optymalne i efektywne, niż podanie ogólnoustrojowe adenowirusowego wektora ekspresji supresora. Przykładowo, jak opisano poniżej, rak jajnika ograniczony do jamy otrzewnej stanowi jeden ze scenariuszy klinicznych regionalnej terapii genowej p53, tj. należy rozważyć jako preferowany plan leczenia podanie dootrzewnowe (IP). Podanie rekombinowanego adenowirusa dootrzewnowo powoduje także infekcję błony otrzewnej i absorpcję wektorów adenowirusa do krążenia ogólnoustrojowego (inaczej rzecz biorąc podanie regionalne może prowadzić do wprowadzenia wirusa do krążenia systemowego). Zakres działania może zależeć od stężenia i/lub całkowitej ilości podanych cząstek wirusa IP. Jeżeli pożądany jest efekt ogólnoustojowy zaleca się podawanie w wyższym stężeniu lub przez kilka kolejnych dni.

Podanie lokalne wektorów adenowirusowych wywołujących ekspresję supresora guza zaleca się w niektórych sytuacjach, jak np.: gdy pacjent posiada reaktywne przeciwciała anty-adenowirusowe. Takie „podanie lokalne może być iniekcją do guza, jeżeli wewnętrznie, lub podaniem do śluzówki, jeżeli zewnętrznie. Alternatywnie, efekt podania lokalnego można wywołać poprzez wykonanie wektora adenowirusowego jako komórki docelowej dla guza np.: stosując specyficzne dla guza reagenty rozpoznawane antygenowo (jak przeciwciała) na liposomach lub na samym adenowirusie.

Receptury

Farmaceutycznie akceptowane nośniki są częściowo uzależnione od podawanych związków, jak i od danej metody podania związku. Zgodnie z tym istnieje szeroka gama receptur związków farmaceutycznych niniejszego wynalazku.

Receptury odpowiednie dla podania doustnego związków farmaceutycznych zawierające kwasy nukleinowe wywołujące ekspresję supresora guza mogą składać się z (a) roztworów płynowych, jak efektywna ilość opakowanych kwasów nukleinowych zawieszonych w rozpuszczalniku, jak woda, roztwór soli lub PEG 400; (b) kapsułki, saszetki lub tabletki, każda zawierająca określoną ilość aktywnych składników, jak płyny, ciała stałe, granulaty i żele; zawiesiny w odpowiednim płynie oraz (d) odpowiednie emulsje. Forma tabletek może zawierać jeden lub więcej z poniższych: laktoza, cukroza, mannitol, sorbitol, fosforany wapniowe, skrobia kukurydziana, skrobia ziemniaczana, tragakant, celuloza mikrokrystaliczna, guma arabska, żelatyna, koloid,

PL 193 767 B1 dwutlenek krzemu, kroskarmeloza sodowa, talk, stearynian magnezu, kwas stearynowy i inne zaróbki, barwniki, wypełniacze, substancje wiążące, rozcieńczalniki, środki buforujące, środki zwilżające, konserwanty, środki smakowe, barwniki, środki dezintegrujące i kompatybilne nośniki farmaceutyczne. Forma tabletek do ssania może się składać z aktywnych składników w nieczynnej bazie jak emulsje żelatyny i gliceryny lub cukrozy i gumy arabskiej, żele i temu podobne zawierające poza aktywnym składnikiem nośnik.

Opakowane same kwasy nukleinowe, lub w połączeniu z innymi właściwymi składnikami można wyprodukować w recepturach aerozolu (tj. można je „nebulizować) do podania na drodze inhalacji. Receptury aerozoli można umieścić w propelentach pod ciśnieniem, takich jak dichlorodifluorometan, propan, azot i im podobne. Receptury do podawania doodbytniczego, to przykładowo czopki, zawierające opakowane kwasy nukleinowe z nośnikiem czopka. Odpowiednie substancje podstawowe czopków zawierają naturalne lub syntetyczne trójglicerydy lub węglowodory parafinowe. Dodatkowo, możliwe jest zastosowanie żelatynowych kapsułek doodbytniczych zawierających połączenie opakowanych kwasów nukleinowych z podstawą zawierającą płynne trójglicerydy, glikol polietylenowy i węglowodory parafinowe.

Receptury do podania parenteralnego, jak na przykład dostawowego (do jamy stawu), dożylnego, domięśniowego, śródskórnego, dootrzewnowego i podskórnego to między innymi wodne i niewodne, sterylne roztwory do iniekcji zawierające antyoksydanty, bufory, substancje bakteriostatyczne i substancje rozpuszczone, substancje zagęszczające, stabilizatory i konserwanty. W praktyce niniejszego wynalazku związki można podawać przykładowo w postaci infuzji dożylnych, doustnie, miejscowo, dootrzewnowo, dopęcherzowo lub dooponowo. Zalecane metody podawania to podanie parenteralne i dożylne. Receptury opakowanych kwasów nukleinowych można zawrzeć w pojemnikach z jedną lub wieloma dawkami, takich jak ampułki i fiolki.

Receptury wynalazku w formie roztworów i zawiesiny do iniekcji, można przygotowywać ze sterylnych proszków, granulek i tabletek wcześniej opisywanych rodzajów. Dokładny skład receptury, stężenie reagentów i kwasów nukleinowych w recepturze, jak pH, buforowość i inne parametry zmieniają się w zależności od sposobu i miejsca podania (np.: podanie ogólnoustrojowe, regionalne lub lokalne) oraz wymogów związanych z przechowywaniem, postępowaniem, wysyłką i długością okresu przechowywania poszczególnych związków farmaceutycznych. Można przeprowadzić optymalizację w/w parametrów, uzależnioną od określonych wymagań stawianych danej recepturze, metodami rutynowymi; można zastosować każdy ze składników i parametrów dla znanych receptur iniekcyjnych.

Jeden z przykładów właściwej receptury stanowi np.: rekombinowany adenowirusowy wektor ekspresji 11 10 p53 w wynalazku (rAd5/p53) w stężeniu około 7,5 x 10¹¹ do 7,5 x10¹⁰ cząstek na ml, jednowodny fosforan sodowy w stężeniu 0,42 mg/ml, dwuzasadowy bezwodnik fosforanu sodowego w stężeniu 2,48 mg/ml, chlorek sodu w jednowodnym fosforanie sodu w stężeniu 5,8 mg/ml, cukroza w stężeniu 20,0 mg/ml, chlorek magnezu w stężeniu 0,40 mg/ml, przechowywany typowo w dawkach 1,0 ml.

Komórki transdukowane przez opakowane kwasy nukleinowe, jak opisano powyżej w kontekście terapii ex vivo można także podawać dożylnie lub parenteralnie, jak opisano powyżej.

Podawana pacjentowi dawka, w kontekście niniejszego wynalazku, powinna być wystarczająca dla właściwej odpowiedzi terapeutycznej u pacjenta z biegiem czasu. Dawkę określa się poprzez wydajność stosowanego wektora, stanu pacjenta, masy ciała lub powierzchni ciała leczonego pacjenta. Wielkość dawki jest także określana poprzez obecność, naturę i rozmiary niepożądanych reakcji ubocznych towarzyszących podaniu danego wektora, lub transdukowanego typu komórki u danego pacjenta.

W określaniu efektywnej ilości wektora do podania podczas leczenia lekarz ocenia poziom wektora w osoczu, toksyczność wektora, progresję choroby oraz wytwarzanie przeciwciał anty-wektorowych. Typową dawką kwasu nukleinowego uzależnia się wysoce od drogi podania i genowego systemu wprowadzania. W zależności od metody wprowadzania dawka może wahać się w od 1 mg do 100 mg i więcej. Ogólnie rzecz biorąc, ekwiwalent dawki czystego kwasu nukleinowego z wektora wynosi od 1 m g do 100 mg dla typowego, 70-kilogramowego pacjenta, a dawki wektora zawierające cząsteczki wirusa są liczone dla zapewnienia odpowiedniej dawki terapeutycznej kwasu nukleinowego.

Transdukowane komórki niniejszego wynalazku można podawać z częstotliwością określaną przez LD50 wektora lub komórki transdukowanej oraz przez objawy uboczne podania wektora lub komórki danego typu w różnych stężeniach, co odnosi się do masy pacjenta i jego stanu ogólnego. Preparat podaje się w pojedynczej lub podzielonych dawkach, jak opisano poniżej.

PL 193 767 B1

Przed infuzją pobiera się próbki krwi i przechowuje do analizy. Szczegółowo monitoruje się ważne życiowo objawy i saturację tlenem mierzona pulsoksymetrem. Próbki krwi najlepiej pobierać w 5 minut i 1 godzinę po infuzji i przechowuje się do kolejnych analiz. W przypadku terapii ex vivo leukoferezę, transdukcję i reinfuzję można powtarzać co 2 do 3 miesięcy. Po pierwszym podaniu infuzje można wykonywać ambulatoryjnie pod nadzorem lekarza. W przypadku podania pacjentowi ambulatoryjnemu reinfuzji należy go monitorać przez minimum 4 do 8 godzin po podaniu.

Jak opisano powyżej, konstrukcje adenowirusowe można podawać ogólnoustrojowo (np.: dożylnie), regionalnie (np.: dootrzewnowo) lub lokalnie (np.: iniekcje do lub okołoguzowe lub do torbieli, np.: w terapii raka pęcherza). Szczególnie zaleca się typy podań zawierające iniekcje dotętnicze, najlepiej do tętnicy wewnątrzwątrobowej (np.: w leczeniu guzów wątroby), lub gdy wymagane jest dostarczenie związku do guzów mózgu, tętnicy szyjnej lub tętnicy układu tętnicy szyjnej (np.: tętnica potyliczna, skroniowa, mózgowa, szczękowa, itp.). W przypadku raka płuc lek można dostarczyć np. za pomocą bronchoskopu. Typowe podanie w takim przypadku obejmuje wodny, farmaceutycznie akceptowalny bufor, jak opisano powyżej. Mimo to jedno z zalecanych rozwiązań stanowi podawanie konstrukcji adenowirusowych lub kaset ekspresji supresorów guza w recepturze lipidowej, w szczególności w kompleksach z liposomami dla kompleksów lipid/kwas nukleinowy (np.: jak opisano przez Debsa i Zhu (1993) WO 93/24640; Mannino 91988) supra; Rose, patent USA nr: 5,279,833; Brigham (1991) WO 91/06309; oraz Felgner (1987) supra) lub otoczkowanych liposomami, najlepiej immunoliposomami skierowanymi na konkretne markery guza. Takie receptury lipidowe można podawać także miejscowo, ogólonoustrojowo lub dostarczany w aerozolu.

4. Wzmacnianie wprowadzania supresorów guza

Wprowadzanie supresorów guza można wzmocnić poprzez zastosowanie jednego lub większej ilości „środków wzmacniających dostawę. „Środek wzmacniający wprowadzanie odnosi się do każdego środka wzmacniającego działanie terapeutyczne genu, jak efekt supresorowy genu na tkankę rakową lub organ. Takie wzmocnione wprowadzanie można osiągnąć w różnym mechanizmie. Jednym z nich jest przerwanie ochronnej warstwy glikozaminoglikanów na powierzchni nabłonka organu lub tkanki (np. pęcherz). Przykłady takich środków to detergenty, alkohole, glikole, surfaktanty, sole żółciowe, antagoniści heparyny, inhibitory cyklooksygenazy, hipertoniczne roztwory soli i octany. Alkohole to na przykład alkohole alifatyczne jak etanol, N-propanol, izopropanol, alkohol butylowy, alkohol acetylowy. Glikole to gliceryna, propylenoglikol, polietylenoglikol i inne glikole o małej masie cząsteczkowej jak glicerol i tioglicerol. Octany jak kwas octowy, octan glukonowy i octan sodowy stanowią dalsze przykłady środków wzmacniających wprowadzanie. Hipertoniczne roztwory soli, przykładowo 1 m. NaCl stanowią także przykłady środków wzmacniających. Przykłady surfaktantów to dodecylowy siarczan sodowy (SDS) oraz lizolecytyna, polisorbat 80, etery polioksyetylenowe, eter poliglikolowy oraz DMSO. Sole żółciowe takie jak taurocholina, deoksycholina, taurodeoksycholan sodowy, deoksycholan, chenodeoksycholan, kwas glikocholowy, kwas glikochenodeoksycholowy oraz inne jak siarczan prolaminy można także zastosować. Stosuje się inhibitory cyklooksygenazy takie jak salicylany sodowe, kwas salicylowy i niesterydowe leki przeciwzapalne (NLPZ) jak indometacyna, naproxen, diklofenac.

Detergenty stanowią grupę detergentów anionowych, kationowych, zwitterionowych i niejonowych. Przykładowymi detergentami są między innymi taurocholina, deoksycholina, taurodeoksycholina, cetylopirimidyna, chlorek benzalkonium, ZWITTERGENT®3-14, CHAPS (wodzian 3-[(3cholamidopropylo)dimetylamonio]-1-propanosiarczanu, Aldrich)big CHAP (jak opisano w USSN 08/889/355, złożonym 8 lipca 1997 oraz wniosek International Application WO 97/25072, 17 lipca 1997), deoksy Big CHAP (ibid), detergent TRITON®-X-100, detergent C12E8, Octylo-B-D-Glukopyranozyd, detergent PLURONIC®-F68, detergent TWEEN® 20 oraz TWEEN® 80 (CALBIOCHEM® Biochemicals).

Środek wzmacniający wprowadzanie występuje w buforze obejmującym rekombinowany system wprowadzający wektor adenowirusowy. Środek wzmacniający można podawać przed lub łącznie z rekombinowanym wirusem. W niektórych rozwiązaniach środki wzmacniające dostarczono z wirusem na drodze mieszania preparatu wirusowego ze środkiem wzmacniającym bezpośrednio przed podaniem pacjentowi. W innych rozwiązaniach środek wzmacniający i wirus znajdują się w jednej fiolce.

W przypadku związków farmaceutycznych zawierających gen supresorowy guza w rekombinowanym systemie dostawy w wektorze adenowirusowym umieszczony w buforze zawierającym dodatkowo środek wzmacniający, środek farmaceutyczny należy podawać przez okres 5 minut do 3 godzin, lepiej w 10 do 120 minut, a najlepiej 15 minut do 90 minut. Innym rozwiązaniem jest podawanie środ26

PL 193 767 B1 ka wzmacniającego przed podaniem rekombinowanego adenowirusowego wektorowego systemu wprowadzania genu supresorowego. Wstępne podanie środka wzmacniającego może sięgać 30 sekund do 1 godziny, lepiej około 1 minuty do 10 minut, a najlepiej 1 minutę do 5 minut przed podaniem rekombinowanego wektora adenowirusowego wprowadzającego gen supresorowy.

Stężenie środków wzmacniających dostawę uzależnia się od wielu znanych czynników jak rodzaju stosowanego środka, buforu, pH, docelowej tkanki lub organu, trybu podania. Stężenie środka wzmacniającego wprowadzanie powinno wahać się w granicach 1% do 50% (v/v), lepiej 10% do 40% (v/v), a najlepiej 15% do 30% (v/v). Stężenie detergentu w ostatecznym składzie podawanej pacjentowi receptury wynosi około 0,5 do 2x krytyczne stężenie micelarne (CMC). Preferowane stężenie Big CHAP wynosi około 2-20 mM, najlepiej około 3,5-7 mM.

Bufor zawierający środek wzmacniający może być dowolnym buforem farmaceutycznym jak roztwór soli buforowany siarczanami, lub fosforan sodowy/siarczan sodowy, bufor tris, bufor glicynowy, sterylna woda i inne znane bufory, jak opisane przez Gooda et al. (1966) Biochemistry 5:467. PH buforu w związku farmaceutycznym obejmującym gen supresorowy guza zawarty w wektorze adenowirusowym może się wahać od 6,4 do 8,4, lepiej pomiędzy 7 a 7,5, a najlepiej 7,2 do 7,4.

Preferowana receptura do podawania rekombinowanego wirusa to około 10⁹ - 10¹¹ PN/ml wirusa, około 2-10 mM Big CHAP lub około 0,1 - 1,0 mM detergentu TRITON®-X-100 w buforze roztworu soli buforowanej siarczanem (PBS) plus około 203% cukrozy (w/v) oraz około 1-3mM MgCl2, przy pH około 6,4 - 8,4. Zastosowanie środka wzmacniającego wprowadzanie opisano w szczegółach w uzupełniającym wniosku USSN 08/779,627 złożonym 7 stycznia 1997.

W celu uzyskania lepszego transferu genu do receptur kwasu nukleinowego zawierających preparat Big-CHAP, stężenie Big CHAP będzie się zmieniać w zależności od źródła jego zakupu. Big CHAP zakupiony w CALBIOCHEM jest w stężeniu 2 do 10 milimoli. Lepsze jest stężenie 4-8 milimoli. Najlepsze około 7 milimoli.

Jeżeli Big CHAP zakupiono w firmie Sigma, jego stężenie będzie się wahać od 15 do 30 milimoli. Lepsze jest stężenie 20 do 30 milimoli. Najlepsze około 25 milimoli.

Inne ujęcie wynalazku zapewnia środek wzmacniający o wzorze I:

ο ο

II II

Χι—C-HN—(CI-h)n-N—(CH2)n^-NH-C-X₃

C=O

I

Χ₂ gdzie n jest współczynnikiem od 2-8, X1 stanowi grupę kwasu cholowego lub deoksycholowego, a X2 oraz X3 stanowią niezależnie wybierane zmienne z grupy kwasu cholowego, grupy kwasu deoksycholowego i grupy cukrowców. Przynajmniej jeden z X2 i X3 jest grupą cukrowcową. Grupę cukrowcową można wybrać z grup monocukrów pentozowych, monocukrów heksozowych, grup dwucukrów pentoza-pentoza, grup dwucukrów heksoza-heksoza, grup dwucukrów pentoza-heksoza oraz grup dwucukrów heksoza-pentoza. W preferowanym ujęciu związki niniejszego wynalazku mają wzór II:

Ρ

II

X,—C-HN-fCHjb-N-CCHjb-NH-C-Kj c=o

I χ₂ gdzie X1 i X2 jest wybierany z grupy kwasu cholowego lub deoksycholowego, a X3 stanowi grupę cukrowcową. Związki te są stosowane w stężeniach około 0,002 do 2 mg/ml, lepiej w stężeniu około 0,02 do 2 mg/ml, a najlepiej około 2 mg/ml.Buforowany fosforanem roztwór soli (PBS) stanowi zalecany rozpuszczalnik dla w/w związków. Mimo to niektóre dodatkowe zaróbki i domieszki mogą okazać

PL 193 767 B1 się konieczne dla uzyskania charakterystyki rozpuszczalności omawianych środków dla różnych receptur farmaceutycznych. Przykładowo dodatek dobrze znanych rozpuszczalników, jak detergenty, estry kwasów tłuszczowych, surfaktanty w odpowiednich stężeniach pomaga w rozpuszczeniu składników w różnych stosowanych rozpuszczalnikach. Jeżeli rozpuszczalnikiem jest PBS, zalecanym środkiem rozpuszczającym jest TWEEN 80 w stężeniu około 0,15%.

5. Podawanie białek supresorowych guza.

Białka supresorowe guza (polipeptydy) mogą być podawane bezpośrednio w okolicę guza poprzez iniekcję albo ogólnoustrojowo w sposób opisany powyżej. W preferowanej postaci, białka supresorowe guza są połączone z farmaceutycznie możliwym do przyjęcia nośnikiem tworząc mieszaninę farmakologiczną opisaną powyżej. Polipeptyd supresorowy guza zostanie podany w efektywnej terapeutycznie dawce. Związki będą więc podawane w ilościach odpowiednich do wyleczenia lub przynajmniej częściowego zahamowania rozwój choroby i/lub jej powikłań. Ilości te będą zależały od ciężkości schorzenia i ogólnego stanu zdrowia pacjenta.

Zostanie stwierdzone, czy polipeptydy supresorowe guza podawane doustnie muszą być chronione przed strawieniem. Osiąga się to poprzez wytworzenie odpornego na hydrolizę kwasową bądź enzymatyczną kompleksu polipeptydu ze związkiem, lub przez umieszczenie polipeptydu wewnątrz odpowiednio odpornego nośnika np. liposomu w sposób opisany powyżej. Sposoby ochrony polipeptydów podawanych doustnie są dobrze znane (patrz np. U.S. Patent 5,391,377 opisujący mieszaniny lipidowe wykorzystywane do doustnego podawania substancji terapeutycznych).

III. Łączenie składników farmaceutycznych.

Supresor guza i pomocniczy środek przeciwnowotworowy mogą być podawane zarówno z supresorowym kwasem nukleinowym lub polipeptydem podawanych przed wspomagającym środkiem przeciwnowotworowym (wstępne leczenie supresorowe guza), albo wspomagający środek przeciwnowotworowy podawany przed supresorowym kwasem nukleinowym guza i/lub supresorowym polipeptydem (wstępne leczenie nowotworu). Oczywiście supresorowy kwas nukleinowy i/lub supresorowy polipeptyd oraz wspomagający środek przeciwnowotworowy mogą być podawane jednocześnie.

Supresorowy kwas nukleinowy i/lub supresorowy polipeptyd oraz pomocniczy środek przeciwnowotworowy są podawane jako jedna mieszanina farmakologiczna. W tej postaci supresorowy kwas nukleinowy i/lub supresorowy polipeptyd oraz pomocniczy środek przeciwnowotworowy mogą być zawieszone albo rozpuszczone w jednorodnym nośniku. Alternatywnie, supresorowy kwas nukleinowy guza i/lub supresorowy polipeptyd oraz wspomagający środek przeciwnowotworowy mogą osobno zostać rozpuszczone lub zawieszone w różnych nośnikach, które z kolei są zawieszone (rozpuszczone) w pojedynczej zaróbce albo w czasie podawania albo w sposób ciągły. Tak więc na przykład wspomagający środek nowotworowy może być rozpuszczony w rozpuszczalniku polarnym (np. paklitaxel w etanolu) a supresorowy kwas nukleinowy może być połączony z lipidem i następnie zostają łącznie umieszczone w zawiesinie, albo alternatywnie zostają połączone w czasie podawania.

Właściwe nośniki wprowadzające, zaróbki itp., opisano powyżej.

IV. Schemat leczenia; terapia łączona lub indywidualna.

A) Schemat leczenia supresyjnego guza.

Odkryciem niniejszego wynalazku był fakt, że supresorowe kwasy nukleinowe guza czy supresorowe polipeptydy, szczególnie jednak supresorowe kwasy nukleinowe guza wykazują większą skuteczność w hamowaniu wzrostu guza jeżeli są podawane w wielokrotnych dawkach w porównaniu z dawką pojedynczą. Niniejszy wynalazek wprowadza schemat leczenia genu lub polipeptydu supresorowego guza poprzez wielokrotne podawanie supresorowego kwasu nukleinowego guza lub supresorowego polipeptydu.

Białko supresorowe guza lub supresorowy kwas nukleinowy guza mogą być podane (z lub bez pomocniczego środka przeciwnowotworowego) w ogólnej dawce od 1x10⁹ do 1x10¹⁴, lepiej od 1x10⁹do 7,5x10¹⁵, a najlepiej od 1x10¹¹ do 7,5x10¹⁵ cząstek adenowirusów, w schemacie leczenia wybranym spośród grup, w których: ogólna dawka jest podawana jednorazowo, ogólna dawka jest podzielona na 5 dni albo jest podawana codziennie przez 5 dni, ogólna dawka jest podzielona na 15 dni albo jest podawana codziennie przez 15 dni, lub gdzie ogólna dawka jest podzielona na 30 dni albo jest podawana codziennie przez 30 dni. Ta metoda podawania może być powtarzana przez 2 lub więcej cykli (bardziej preferowane trzy cykle) a drugi i następne cykle następują z trzy- lub czterotygodnio28

PL 193 767 B1 wymi przerwami. Leczenie może składać się z pojedynczego cyklu dawkowania albo liczba cykli dawkowania może zawierać się między 2 a 12, najlepiej od 2 do 6 cykli.

Szczególnie zalecany schemat leczenia zawiera ogólną dawkę podzieloną na 5 dni podawaną codziennie, ogólną dawkę podzieloną na 15 dni podawaną codziennie i ogólną dawkę podzieloną na 30 dni podawaną codziennie.

15

W preferowanych schematach dawkowania dzienna dawka w ilości od 7,5x10⁹ do 7,5x10¹⁵, najlepiej między 1x10¹² do 7,5x10¹³ cząstek adenowirusów może być podawana codziennie do 30 dni (np. schemat 2-dniowy, 2 do 5 dniowy, 7-dniowy, 14-dniowy, albo 30-dniowy z taką samą dawką podawaną codziennie). Schemat wielokrotny może być powtarzany w 21 do 28-dniowych cyklach.

W niektórych schematach różne drogi podania skutkują w odmiennych wielkościach stosowanych dawek. Na przykład dla dotętniczego podania wewnątrzwątrobowego preferowana dawka wyniesie pomiędzy 7,5x10⁹ a 1x10¹⁵, najlepiej między 1x10¹¹ do 7,5x10¹³ cząstek adenowirusa dziennie przez 5 do 14 dni. Schematy te mogą następnie objąć podawanie wspomagającego środka przeciwnowotworowego, FUDR albo 5'-deoxy-5 fluorourydina (5'-DFUR), albo hydrochlorku irinotektanu (CPT-11;

7-ethylo-10-[4(1-piperidyno)-1-piperidyno]karbonyloksycamptotektyna). Dla podania doguzowego 9 13 11 12 typowa, preferowana dawka będzie wynosić między 7,5x10⁹ a 1x10¹³ najlepiej 1x10¹¹ do 7,5x10¹² cząstek adenowirusa na dzień. W podaniu dootrzewnowym preferowana dawka będzie typowo zawieQ ή G ή ή ή Ο rać się między 7,5x10⁹, a 1x10¹⁵, najlepiej od 1x10¹¹ do7,5x10¹³ cząsteczek adenowirusa na dzień przez 5-10 dni.

B) Schemat terapii skojarzonej

Jeśli supresor guza jest stosowany łącznie ze środkiem przeciwnowotworowym, supresorowy kwas nukleinowy jest podawany w dawce całkowitej podanej wcześniej. W tym połączeniu całkowita dawka wspomagającego środka przeciwnowotworowego zależy od rodzaju użytego środka. Na przykład paklitaksel lub jego pochodna podawany jest w dawce całkowitej od 75 do 350 mg/m² przez 1 godz., 3 godz., 6 godz., lub 24 godz. w schemacie leczenia wybranym ze sposobów podawania w dawce pojedynczej, w dawce podawanej codziennie w pierwszym i drugim dniu, w dawce podawanej codziennie w 1, 2 i 3 dniu, z dawkowania codziennie przez 15 dni, z podawania codziennie przez 30 dni, z wlewu ciągłego codziennie przez 15 dni, we wlewie ciągłym codziennie przez 30 dni. Preferowana dawka wynosiła 100 do 250 mg/m² na 24 h.

Zastosowanie wstępnego leczenia wspomagającym środkiem przeciwnowotworowym przed podaniem supresorowego kwasu nukleinowego zwiększa skuteczność supresora guza. Dlatego też szczególnie zalecanym sposobem leczenia komórki, tkanki lub organizmu jest podanie pomocniczego środka przeciwnowotworowego przed supresorowym kwasem nukleinowym. Podanie pomocniczego środka przeciwnowotworowego powinno wyprzedzać podanie kwasu nukleinowego o około 24 godziny, choć dopuszczalne są krótsze lub dłuższe przerwy.

Leczenie wstępne jest szczególnie skuteczne jeśli pomocniczym środkiem przeciwnowotworowym jest związek podobny do paklitaxelu, najlepiej sam paklitaxel lub jego pochodna np. Taxol® lub Taxotere®. Zalecanymi supresorami guza są RB i p53, najlepiej p53, szczególnie na wektorze adenowirusowym np. A/C/N/53.

V. Leczenie i profilaktyka przerzutów.

Jak pokazano w przykładach 1 i 2, gen supresora guza np. p53, wykazuje skuteczne działanie przeciw ludzkim komórkom nowotworowym in vitro, przeciw heteroprzeszczepom ludzkich guzów u biorców o obniżonej odporności oraz ludzkim guzom płuc in vivo. Chirurgiczne usunięcie ogniska pierwotnego u pacjentów daje często wznowę w pierwotnej lokalizacji lub powstanie przerzutów z powodu mikroskopijnych ognisk nowotworowych przeoczonych przez chirurga. Z kolei, aby uzyskać pewność, że guz pierwotny został usunięty całkowicie, pacjent musi zostać poddany okaleczającemu zabiegowi usunięcia dużej części zdrowej tkanki otaczającej guz.

Z drugiej strony, wynalazek zapewnia metodę zahamowania wzrostu i/lub proliferacji przerzutów (komórek przerzutowych). Ogólnie rzecz biorąc metoda ta polega na ogólnoustrojowym, lub miejscowym podaniu supresora guza, najlepiej miejscowym podaniu p53 lub RB.

A) Leczenie ogólnoustrojowe.

Jak wykazano w przykładach 2 i 3, leczenie ogólnoustrojowe /np. dożylne podanie/, nośnikiem supresora guza np. A/C/N/53 zahamowało rozwój przerzutów in vivo. Tak więc wynalazek opracowuje metodę hamowania rozwoju fazy przerzutowej choroby nowotworowej przez podawanie organizmowi

PL 193 767 B1 kwasu nukleinowego supresora guza i/lub polipeptydu supresorowego w sposób wcześniej opisany. Zalecanym supresorem jest kwas nukleinowy supresora, najlepiej p53 i najlepiej na nośniku adenowirusowym np. A/C/N/53. W innej zalecanej formie terapii kwas nukleinowy jest połączony z liposomem lub kompleksem lipidowym patrz np. Debs i Zhu /1993/ WO 93.24640; Mannino i Gould-Fogerite /1988/ BioTechniques 6/7/,682 -691; Rose U.S. Pat. No. 5,279,833; Brigham /1991/ WO 91/06309; i Felgner et al. /1987/ Proc Natl. Acad. USA. 84,7413-7414.

B) Leczenie miejscowe.

Miejscowe podanie białka supresorowego guza lub supresorowego kwasu nukleinowego powinno być skojarzone z leczeniem chirurgicznym.

W tym przypadku, supresor guza, najlepiej w postaci wektora infekującego, podawany jest na powierzchnię rany powstałej po usunięciu guza.

Wektory zakaźne przeniosą p53 do komórek guza pozostałych w otoczeniu rany, indukując ich apoptozę (programowaną śmierć komórki).

Takie leczenie zapewnia pacjentowi długoterminowe przeżycie i/lub redukuje ilość zdrowej tkanki, którą należy usunąć wokół guza podczas zabiegu.

Supresor guza powinien być stworzony w taki sposób by mógł być podany miejscowo zgodnie z obowiązującymi zasadami.

Tak więc na przykład preparat zakaźny ludzkiego genu supresorowego guza p53 (np. A/C/N/53) jest zawieszony w odpowiednim nośniku (np. w wazelinie lub innym kremie lub maści), który łatwo rozprowadza się na powierzchni rany po usunięciu guza. Supresor guza może także zostać przygotowany w postaci aerozolu do rozpylenia wewnątrz rany.

W innym przypadku supresor może być umieszczony w materiałach rozkładalnych (wchłanialnych) np. wchłanianie gąbki, umieszczanych wewnątrz rany, które uwalniają białko supresorowe guza lub jego nośnik w zależności od upływu czasu.

W preferowanych sposobach podania rekombinowanych nośników adenowirusowych do pewnych określonych okolic np. rogówka, przewód pokarmowy, miejsce po resekcji guza, używa się trwałych nośników w celu zapewnienia dłuższego okresu inkubacji i ułatwienia infekcji wirusami.

Nośnikiem może być gaza lub maść wysycona roztworem rekombinowanych wirusów. Wirus można podać poprzez gazę przymocowaną do rogówki, aby osiągnąć lepszy efekt transgeniczny.

Nasączona gaza może zostać również umieszczona w celach profilaktycznych w miejscu po usuniętym guzie w celu zapobieżenia nawrotom. W genowej terapii supresorowej, maści może być zastosowana miejscowo w obrębie przewodu pokarmowego i trzustki.

Przykładowe maści służące jako nośniki to: Puralube na bazie wazeliny i rozpuszczalna w wodzie KJ-Jelly.

W przykładowej metodzie moczy się sterylne gaziki (5x5 cm) lub paski używane do testu łzowego w roztworze z nośnikami adenowirusowymi (np. 1x 10⁹ PN/ml).

Gaziki lub paski są kładzione na maksymalnie dużej powierzchni tkanki docelowej i inkubuje się w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Jednym z celów będzie poznanie innych materiałów, żeli i maści, które wchłaniają się bądź są mieszalne z wodą.

Dodatkowo mogą więc zostać włączone inne nośniki przyspieszające opisany wcześniej transfer genów.

VI. Leczenie skojarzone z innymi chemoterapeutykami.

A) Supresory guza podawane w połączeniu z wielokrotnymi kursami chemoterapii

Ocenia się, czy metodyka wynalazku ogranicza się do łączenia supresora guza z pojedynczym wspomagającym czynnikiem przeciwnowotworowym. Podczas gdy obecnie znane metody polegają na łączeniu się komórki z supresorem guza (np. p53) i pomocniczym czynnikiem przeciwrakowym takim jak np. paklitaksel, w niniejszym wynalazku komórki zostaną zmuszone do łączenia się z kombinacją genu lub polipeptydu supresorowego z dwoma, trzema lub wielokrotnością wspomagających czynników przeciwnowotworowych i dodatkowo innych chemoterapeutyków.

Wiele z chemoterapeutyków jest dobrze znanych z literatury naukowej oraz patentowej: przykładowo leki używane w metodyce tego wynalazku zawierają lecz nie ograniczają się jedynie do: czynników uszkadzających DNA (łącznie z lekami alkilującymi DNA) np. cisplatyna, karboplatyna (zob. np. Duffull (1997) Clin Pharmacokinet. 33:161-183); Droz (1996) Ann oncol. 7:997-1003), nawelbina (vinorelbina), Asaley, AZQ, BCNU, Busulfan, karboksyfalatoplatyna, CBDCA, CCNU, CHIP, chloram30

PL 193 767 B1 bucyl, chlorozotocin, cis-platyna, klomezon, cyjanomorfolinodoksorubicyna, (cyanomorpholino-doxorubicin), cyclodisone, cytoksan, dianhydrogalakcitol, fluorodopan, hepsulfam, hykanton, melfalan, metyl CCNU, mitomycyna C, mitozolamid, nitrogen mustard, PCNU, piperazyna alkilator, piperazynodion, pipobroman, porfiromycyna, spirohydantoin mustard, teroxirone, tetraplatyna, tio-tepa, trietylenomelamina, uracil nitrogen mustard, Yoshi-864); inhibitory topoizomerazy I (np. chlorowodorek topotekanu, chlorowodorek irinotekanu, (CPT 11), kamptotecyna, sól sodowa kamptotecyny, aminokamptotecyna, CPT-11 i inne pochodne kamptotecyny); inhibitory topoizomerazy II (doxorubicyna, także doxorubicyna połączona z liposomami (patrz, U.S. Patent Nr 5,013,556 i 5,213,804) amonafide, m-AMSA, pochodne antrapirazolu, pirazoloakrydyna, bisantrene HCL, daunorubicyna, deoxydorubicyna, mitoxantrone, menogaril, N,N-dibenzyl daunomycyna, oxanthrazole, rubidazon, VM-26, i VP-16 ); RNA/DNA antymetabolity (np. L-alanozyna, 5-azacytydna, 5-fluorouracyl, acivicin, aminopteryna, pochodne aminopteryny, antifol, roztwór antifolu Bakera, dichlorallil lawsone, brequinar, ftorafur (pro-lek), 5,6dihydro-5-azacytydyna, methotreksat, pochodne metotreksatu, N-(fosfonoacetyl)-L-aspartat (PALA), pyrazofurin, i trimetreksat ); i DNA antymetabolity (np. 3-HP,2'-deoxy-5-fluorourydyna, 5-HP,alfaTGDR, aphidicolin glycinate, ara-C,5-aza-2'-deoxycytydyna, beta-TGDR, cyclocytydyna, guanazole, hydroxymocznik, inozyna, glycodialdehyd, macbecin II, pyrazoloimidazol, thioguanina i thiopuryna). Supresorowy kwas nukleinowy i/lub polipeptyd mogą także być podawane w połączeniu z chemoterapeutykami takimi jak winkrystyna, temozolomid (patrz np. U.S. Patent No. 55,260,291) i toremifen (patrz np. U.S. 4,696,949 informacje o toremifenie).

Badania przedkliniczne na zwierzętach wykazały, że adenowirus p53 połączony z cisplatyną, karboplatyną, nawelbiną, doxorubicyną, 5-fluorouracylem, metotreksatem lub etopozydem, hamował proliferację komórek efektywniej niż sama chemoterapia w przypadku nowotworów: SSC-9 głowy i szyi, SSC-15 głowy i szyi, SSC-25 głowy i szyi, SK-OV-3 jajników, DU-145 prostaty, MDA-MB-468 piersi i MDA-MB-231 piersi. Z drugiej strony, wzmocnioną przeciwguzową skuteczność działania zaobserwowano w przypadku zastosowania kombinacji trzech leków: genu p53 (obecnego np. wektora adenowirusa), pomocniczego czynnika przeciwnowotworowego (np. paklitaksel) i czynnika uszkadzającego DNA (np. cisplatyna). Połączenie genu p53, paklitakselu i cisplatyny okazało się skuteczne w przypadku guzów jajnika. Dane z doświadczeń klinicznych przemawiają za połączeniem terapii genem p53 z chemoterapią.

Inne chemoterapeutyki mogą zostać użyte w połączeniu z supresorowym kwasem nukleinowym guza i/lub polipeptydem bez lub z obecnością wspomagającego czynnika przeciwnowotworowego. W projekcie tym jest również brane pod uwagę zastosowanie radioterapii w połączeniu z każdym z supresorów guza opisanych wcześniej albo razem z supresorami guza połączonymi z wspomagającym czynnikiem przeciwnowotworowym.

Jeżeli supresorowy kwas nukleinowy guza (np. p53) jest podawany w nośniku adenowirusowym wraz z pomocniczym czynnikiem przeciwnowotworowym (np. paklitaxel) i czynnikiem uszkadzającym

DNA (np. cisplatyna, karboplatyna, nawelbina), nośnik adenowirusowy typowo jest podawany przez 5 12 13 do 14 dni w ilości 7,5 x 10¹² do 7,5 x 10¹³ cząstek adenowirusa dziennie. Na przykład może zostać użyta dzienna dawka 7,5 x 10¹³ cząstek adenowirusa w połączeniu z karboplatyną. Z kolei dzienna dawka 7,5 x 10¹² cząstek adenowirusa może zostać użyta, gdy jest on podawany do płuc. Gen p53 jest podawany z topotecanem.

Czynnik uszkadzający DNA podawany będzie typowo w zalecanych dawkach, zobacz np. Physician's Desk Reference, 51^st ed. (Medical Economics, Montvale, NJ 1997). Dla przykładu karboplatyna jest podawana by uzyskać AUC (an area under the curve <pole pod krzywą>) na poziomie około 6-7,5 mg/ml/min.

Inhibitory proteazy

Wynalazek zapewnia połączone zastosowanie supresorowych kwasów nukleinowych guza i/lub polipeptydów z inhibitorami proteazy. Szczególnie preferowane są między innymi inhibitory kolagenazy, inhibitory metaloproteinazy matrix (MMP) (zob. np. Chambers <1997> J. Natl. Cancer Inst. 89:1260-1270). Metodyka obejmuje równoczesne lub kolejno następujące po sobie podawanie efektywnych ilości inhibitorów proteazy i efektywnych ilości supresorowego polipeptydu guza i/lub kwasu nukleinowego. Przykłady preparatów będących inhibitorami proteazy są dobrze znane w literaturze naukowej i patentowej.

PL 193 767 B1

Immunomodulatory

Białka supresorowe guza i kwasy nukleinowe mogą zostać użyte w niniejszym wynalazku w połączeniu z immunomodulatorami gdzie immunomodulatory albo uczulają odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciwko hyperproliferującym komórkom rakowym (np. odpowiedź immunologiczna skierowana przeciwko specyficznym antygenom guza) albo obniżają czułość odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko białkom supresorowym guza, supresorowym kwasom nukleinowym guza, nośnikom supresorowym guza (np. reakcja przeciwadenowirusowa) i/lub współtowarzyszącą chemoterapią.

Przykładowo wynalazek niniejszy zapewnia połączone kolejno po sobie następujące lub jednoczesne podanie efektywnej ilości supresorowego kwasu nukleinowego guza i/lub supresorowego polipeptydu guza z efektywną ilością immunomodulatora. Immunomodulatory obejmują między innymi cytokiny takie jak: IL-2, IL-4, IL-10 (U.S. 5,231,012; Lalani (1997) Ann. Allergy Asthma Immunol. 79:469-483; Geissler (1996) Curr. Opin. Hematol. 3:203-208), IL-12 (zob. np. Branson (1996) Human Gene Ther. 1:1995-2002) i gamma-interferon.

Immunomodulatory funkcjonujące jako immunosupresory mogą zostać wykorzystane w celu osłabienia odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko terapeutykom (np. białko supresorowe guza albo kwas nukleinowy albo wspomagający czynnik przeciwnowotworowy itp.). Immunosupresory są substancjami dobrze znanymi. Odpowiednie immunosupresory obejmują między innymi cyklofosfamid, deksametazon, cyklosporyny, FK506 (tacrolimus) (Lochmuller (1996) Gene Therapy 3:706-716) IL-10 itp. Mogą również zostać wykorzystane przeciwciała przeciwko antygenom powierzchniowym komórki modulujące odpowiedź immunologiczną. W tym celu mogą być wykorzystane na przykład przeciwciała blokujące ligandy przyłączane do receptorów komórkowych na leukocytach B, T, NK, makrofagach i komórkach guza (zob. np. Yang (1996) Gene Therapy 3:412-420; Lei (1996) Human Gene Therapy 7:2273-2279; Yang (1996) Science 275:1862-1867.

VII. Kompozycje terapeutyczne

Wynalazek dotyczy również określonych kompozycji terapeutycznych. Kompozycje te zawierają między innymi supresorowy kwas nukleinowy lub polipeptyd lub też ich składniki farmaceutyczne. Kompozycje te mogą także zawierać wspomagający czynnik przeciwnowotworowy lub jego związki farmaceutyczne. Różne czynniki mogą być dostarczane w oddzielnych pojemnikach do indywidualnego zastosowania bądź też do połączenia przed podaniem. W jednym pojemniku mogą się też znajdować różne mieszaniny. W kompozycjach mogą także znajdować się różne przyrządy, bufory, odczynniki itp. przydatne w metodyce wynalazku. Ponadto w zestawach mogą znajdować się materiały instruktażowe do obsługi kompozycji farmaceutycznych używanych w metodach opisanych w projekcie (np. leczenie guzów, profilaktyka i/lub leczenie przerzutów itp.).

Kompozycje farmaceutyczne mogą dodatkowo zawierać jeden lub kilka immunomodulatorów (np. immunosupresanty). Szczególnie pożądana jest zawartość immunomodulatorów opisanych w wynalazku.

VIII. Komórki zawierające heterologiczne supresorowe kwasy

Wynalazek wymaga także transfektowanych lub inaczej przygotowanych prokariotycznych lub eukariotycznych komórek żywiciela np. zwierzęcych (np. komórek ssaków) zawierających heterologiczny supresorowy kwas nukleinowy i/lub supresorowy polipeptyd. Komórki mogą dodatkowo zawierać wspomagający czynnik przeciwnowotworowy np. paklitaxel lub inny czynnik działający na mikrotubule.

Odpowiednie komórki prokariotyczne obejmują komórki bakteryjne np. E. coli. Najbardziej odpowiednie komórki zwierzęce to komórki ssaków a spośród nich komórki ludzkie. Najbardziej odpowiednimi komórkami żywiciela pochodzącymi od ssaków są komórki nowotworowe.

Opisane tutaj transfektowane komórki gospodarza są stosowane w diagnozowaniu i terapii. Stosowane jako farmaceutyki mogą zostać połączone z różnymi możliwymi do zaakceptowania nośnikami farmaceutycznymi jak opisano powyżej dla terapii genowej ex vivo. Komórki mogą być podawane w celach profilaktycznych lub terapeutycznych w efektywnych ilościach opisanych szczegółowo powyżej. W diagnostyce komórki mogą być wykorzystane w szkoleniu lub celach informacyjnych będąc odpowiednimi modelami komórek transfektowanych lub leczonych.

IX. Skuteczność przedkliniczna i kliniczna terapii genowej Adenowirusem p53.

W niektórych krajach terapia genem p53 za pośrednictwem adenowirusa jest obecnie w I/II fazie badań klinicznych. Zestawy farmaceutyczne używane w tych badaniach zawierają wzorcowy, dziki typ adenowirusa z genem p53 (rAd5/p53) zawierający niereplikujący nośnik typu 5 adenowirusa dzia32

PL 193 767 B1 łający na ludzki supresorowy gen guza kontrolowany przez miejsce dla syntezy RNA cytomegalowirusa (rAd/P53) (patrz Wills (1994) powyżej).

Stosowanie regionalne.

Rak jajnika ograniczony do jamy brzusznej jest jednym z nowotworów, w którym jako zalecany sposób leczenia należy rozważyć terapię regionalną tj. podawanie dootrzewnowe genu p53.

P r z y k ł a d y

Przytoczone przykłady obrazują, lecz nie wyczerpują rozwiązań według wynalazku.

P r z yk ł ad 1. Terapia skojarzona genem p53 i Preparatem Taxol.

Wynalazek przewiduje skojarzone podawanie kwasu nukleinowego działającego na supresorowy polipeptyd guza i paklitaxelu w leczeniu nowotworów.

Przykład ilustruje możliwość leczenia nowotworów adenowirusem p53 w połączeniu z Taxolem, oraz wykazuje większą skuteczność w niszczeniu komórek guza, niż przy użyciu każdego ze środków z osobna.

Terapia skojarzona in vitro.

Komórki poddano jednemu z trzech schematów leczenia:

W pierwszym schemacie komórki poddano działaniu Taxolu 24 godziny przed ekspozycją na adenowirus p53 A/C/N/53. W schemacie drugim komórki wstępnie poddano działaniu adenowirusa p53, a następnie Taxolu. W trzecim schemacie komórki poddano równoczesnemu działaniu z Taxolu i adenowirusa p53. Adenowirus p53 i Taxol podawano w ciągu tego samego 24 godzinnego okresu b jednocześnie.

W przybliżeniu 1,5 x 10⁵ komórek z hodowli (linie komórkowe z głowy i szyi SCC-9, SCC-15 i SCC-25 zmieszane w stosunku 1:1 z DMEM + Ham F12 z kortyzolem w stężeniu 0,4 m g/ml i 10% FBS z 1% aminokwasami, DU-145 prostaty i jajnikowe SK-OV-3 w niezbędnej pożywce Eagle'a, plus 10% FBS) dodano do każdego dołka na płytce laboratoryjnej (96-dołkowej) i następnie poddano je 4 godzinnej hodowli w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% CO2. Lek (Taxol®), adenowirus p53 lub odpowiedni nośnik/bufor dodano do każdego dołka. Przed podaniem lek rozpuszczono w alkoholu etylowym, gdyż jest on nierozpuszczalny w wodzie. Następnie komórki hodowano przez całą noc w 37°C, w atmosferze 5% CO2. Adenowirus p53 podawano w buforze fosforanowym (20 mM NaH2PO4, pH 8,0, 130 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 2% sacharoza).

Śmierć komórek oszacowano według metody Mosmanna (1983) J. Immunol. Meth., 65: 55-63. Na koniec do każdego dołka na płytce dodano około 25 ml barwnika przyżyciowego MTT o stężeniu 5 mg/ml [bromek 3-(4,5 dimetylotiazolo-2yl)-2,5-difenylotetrazolowy], a następnie całość inkubowano na 3-4 godziny w 37°C w atmosferze 5% CO2.

Tabel a 1. Wyniki osiągnięte w hodowli in vitro w terapii skojarzonej z użyciem pomocniczego środka przeciwrakowego (Taxol®) i supresorowych kwasów nukleinowych guza.

Linia komórkowa Nowotwór	Dawka całkowita (mg/ml)	Dawka A/C/N/53 (m.o.i.)	Leczenie
Leczenie wstępne Taxolem	Leczenie wstępne p53	Leczenie jednoczasowe
SK-OV-3 Rak jajnika	0,37	40	Efekt addytywny p < 0,0001	Bez efektu p > 0,2000	Efekt addytywny p < 0,0001
SCC-25	0,10 lub	2,5 lub	Efekt addytywny	Bardzo mały efekt	Efekt addytywny
Rak głowy i szyi	0,01	5,0	p < 0,0001	p = 0,0606	p < 0,0001
SCC-15	0,10 lub	2,5 lub	Efekt addytywny	Efekt addytywny	Efekt addytywny
Rak głowy i szyi	0,01	5,0	p < 0,002	p < 0,0001	p < 0,0001
DU-145	0,36 lub	2,5 lub	Efekt addytywny	Efekt addytywny	Efekt addytywny
Rak prostaty	0,036 lub 0,0036	5,0	p < 0,03	p < 0,0001	p < 0,0001
SCC-9	0,12 lub	2,5 lub	Efekt addytywny	Efekt addytywny	Efekt addytywny
Rak głowy i szyi	0,012 lub 0,0012	5,0	p < 0,01	p < 0,0001	p < 0,0001

PL 193 767 B1

Następnie do każdego dołka dodano po 100 ml 10% detergentu SDS, a całość inkubowano przez noc w temperaturze 37°C.

Następnie oceniano sygnały z każdego zagłębienia, używając czytnika płytkowego Thermo-Max. Stosowane linie komórkowe i osiągnięte wyniki przedstawiono w powyższej tabeli 1.

Ogólnie rzecz biorąc adenowirus p53 działał efektywniej stosowany równocześnie z Taxolem, niż podawany jako pierwszy. Rezultaty sugerują interakcję synergiczną pomiędzy A/C/N/53 a Taxolem.

Analiza izobologramu oceniająca efekt synergiczny.

Komórki nowotworu jajnika SK-OV-3 (p53 null) leczono kombinacją Taxolu® i adenowirusa p53 (A/C/N/53), co ilustruje tabela 2.

Dawkowanie przedstawiono powyżej. Śmierć komórek oszacowano trzeciego dnia przy użyciu testu MTT opisanego wcześniej.

Dodatkowo wykreślono krzywą skuteczności dawki dla samego p53 Ad (używając dawek wymienionych w tabeli 2) (po 2 dniach ekspozycji komórek na działanie leku) a krzywą skuteczności dawki dla samego Taxolu® przeprowadzono z zastosowaniem dawek wypisanych powyżej (3 dni ekspozycji komórek na działanie leku).

Rysunek 1 ilustruje zahamowanie proliferacji komórek (w porównaniu buforem kontrolnym) jako funkcję leczenia.

Wzrastająca dawka obydwu: Taxolu i p53, powoduje hamowanie proliferacji komórek w większym stopniu, gdy stosujemy terapię złożoną, niż w przypadku stosowania obu leków osobno.

Tabela 2. Grupy w skojarzonej terapii Taxolem® i p53 Ad (A/C/N/53).

Grupa	Taxol (mg/ml)	p53AD (m.o.i.)	Grupa	Taxol (mg/ml)	p53AD (m.o.i.)
1	0,001	0,5	25	0,001	10
2	0,01	0,5	26	0,01	10
3	0,1	0,5	27	0,1	10
4	0,5	0,5	28	0,5	10
5	1	0,5	29	1	10
6	5	0,5	30	5	10
7	10	0,5	31	10	10
8	20	0,5	32	20	10
9	0,001	1	33	0,001	25
10	0,01	1	34	0,01	25
11	0,1	1	35	0,1	25
12	0.5	1	36	0.5	25
13	1	1	37	1	25
14	5	1	38	5	25
15	10	1	39	10	25
16	20	1	40	20	25
17	0,001	5	41	0,001	50
18	0,01	5	42	0,01	50
19	0,1	5	43	0,1	50
20	0,5	5	44	0,5	50
21	1	5	45	1	50
22	5	5	46	5	50
23	10	5	47	10	50
24	20	5	48	20	50

PL 193 767 B1

Rysunek 2 ilustruje analizę izobologramu wg. Berenbauma (1989) Pharmacol. Rev.93-141. Zaobserwowano synergizm pomiędzy Taxolem® a p53 (A/C/N/53), gdy komórki poddano działaniu Taxolu® 24 godziny przed zastosowaniem p53 (A/C/N/53).

Na rysunku 2 linia prosta (izobola dla ED30) przedstawia oczekiwany wpływ na proliferację komórek, przewidywany w przypadku addytywnego dwoma lekami.

Obserwowany efekt obniżenia lewej izoboli wykazał, że pojawiła się synergiczna interakcja między obydwoma lekami, pomimo niższego od przewidzianego stężenia leków.

P r z yk ład 2

Terapia genowa adenowirusem p53 przeciwko przerzutom

W projekcie zostało przewidziane podawanie kwasów nukleinowych oddziałujących na supresorowy polipeptyd guza w leczeniu przerzutów. Przykład ten wykazuje zdolność adenowirusa p53 do infekowania różnych tkanek w organizmie oraz do leczenia przerzutów.

Myszom scid płci żeńskiej (homozygoty z mutacją SCID wykazują brak limfocytów B i T spowodowany defektem w rekombinacji V(D)J) wstrzyknięto do poduszki tłuszczowej sutka 5 x 10⁶ komórek nowotworu piersi MDA-MB-231. Po czasie, w którym rozwinął się guz pierwotny i dał przerzuty do płuc (11 dni), został on usunięty chirurgicznie. Myszy leczono dożylnie A/C/N/53 (adenowirus z genem p53) (zawartość p53 = 4x10⁸ C.I.U./ iniekcję) albo buforem kontrolnym podawanym w 23, 30, 37, 44, (1qW) dniu terapii. W 49 dniu terapii płuca zostały wycięte, utrwalone, wybarwione i ocenione pod mikroskopem.

Rezultaty przedstawiono poniżej w tabeli 3.

Ta bela 3. Zahamowanie przerzutów MDA-MB-231 do płuc przy użyciu A/C/N/53

Leczenie	Brak przerzutów	< 6 przerzutów	> 84 przerzuty
Bufor n=17	11 (65%)	1 (6%)	5 (29%)
A/C/N/53 n=10	5 (50%)	4 (40%)	1 (10%)

Leczenie A/C/N/53 obniżyło u myszy liczbę występujących u nich przerzutów.

W drugim doświadczeniu 231 myszom typu scid i scid-beige, u których stwierdzono guzy poduszki tłuszczowej sutka podano okołoguzowo iniekcje z A/C/N/53. Całkowitą dawkę 2-4 x 10⁹ C.I.U. podano w 10 zastrzykach uzyskując spadek liczby myszy, u których stwierdzono przerzuty w płucach do 80% u myszy typu scid i do 60 % u myszy typu scid-beige. Znacznemu obniżeniu uległa także ogólna liczba przerzutów na mysz u tych typów myszy, które nie wykazywały obecności guzów płuc. Jak określono powyżej podanie dożylne A/C/N/53 było również skuteczne u myszy scid. Dane te wskazują, że terapia genowa A/C/N/53 może wpływać na liczbę przerzutów, dodatkowo obniżając liczbę guzów pierwotnych.

W innym eksperymencie wstrzyknięto w dniu 0 myszom płci żeńskiej typu scid, 5 x 10⁶ na mysz, komórek nowotworu sutka MDA-MB-231. Pierwotny guz sutka był chirurgicznie usunięty w 18 dniu. Myszy były leczone dożylnymi zastrzykami buforu, beta-gal AD lub p53 Ad (A/C/N/53) w 21, 24, 32, 36 i 39 dniu kuracji. Dawka wirusa przypadająca na jedną iniekcję wynosiła 4 x 10⁸ C.I.U. (A/C/N/53) (PN/C.I.U.=23,3) a 9,3 x 10⁹ cząstek beta-gal Ad (PN/C.I.U. = 55,6; 1,7 x 10⁸ C.I.U.).

Płuca i wątroby zostały usunięte i utrwalone w formalinie w 51 dniu eksperymentu. Wykonano sekcje by stwierdzić guzy płuc oraz uszkodzenia wątroby. Najważniejsze narządy pobrane od myszy z grupy buforowej i 2 beta-gal były błyskawicznie zamrożone w celu wykonania skrawków mrożonych oraz analizy aktywności B-galaktozydazy.

Tabela 4. Zahamowanie przerzutów do płuc nowotworu MDA-MB-231 przy użyciu A/C/N/53

Przerzuty w płucach na 1 mysz	Grupa buforowa *	Grupa Beta-gal Ad*	Grupa p 53 Ad
< 20	11% (1)	8% (1)	21% (3)
> 20 a < 100	11% (1)	33% (4)	79% (11)
> 100 a < 200	33% (3)	33% (4)	0% (0)
> 200 a < 300	33% (3)	17% (2)	0% (0)
>300	11% (1)	8% (1)	0% (0)
Ogólna liczba	9	12	14
Ponowny wzrost guza pierwotnego	82% (9/11)	88% (14/16)	100% (14/14)

* Liczba przerzutów jest niedoszacowana. W płucach wiele guzów było zrośniętych razem.

PL 193 767 B1

Liczba przerzutów w przeliczeniu na płuco w grupach buforowej i beta-gal nie różniła się istotnie w ujęciu statystycznym (p=0,268, patrz tabela 4).

W grupie leczonej p53 Ad znacznemu obniżeniu uległa liczba przerzutów na jedno płuco jeżeli porównamy z grupami buforową i beta-gal Ad (odpowiednio p < 0,001 i p < 0,002). Dodatkowo nastąpił znaczny spadek rozmiarów przerzutów do płuc w grupie p53 Ad. W grupie kontrolnej sekcje płuc wykazały w ponad 50% masy narządu obecność tkanki nowotworowej tak, że trudno było rozpoznać pojedyncze guzy. Dla kontrastu przerzuty w płucach w grupie p53 Ad były tak małych rozmiarów, iż łatwością wyróżniały się w postaci drobnych guzów.

Dystrybucja tkanki zawierającej adenowirusy.

Komórki wątroby posiadają największą liczbę zainfekowanych komórek (około 50%) oraz wysoką aktywność galaktozydazy. W płucach znajdują się rozsiane skupiska zainfekowanych komórek równomiernie rozprowadzonych w całym narządzie. Jelita i żołądek okresowo posiadają zarażone komórki w mięśniówce gładkiej ich ściany. Znajdowano również aktywność beta-galaktozydazy w rozsianych wzdłuż światła mikrokosmkach. Ściana macicy zbudowana z mięśniówki gładkiej jest zainfekowana komórkami podobnymi do tych widzianych w jelitach. Większość komórek zrębu jajnika jest zainfekowana. Śledziona wykazuje rozsianą aktywność beta-galaktozydazy w swojej mięśniówce gładkiej. Tylko niewielka liczba zainfekowanych komórek (< 1%) znajduje się w poprzecznie prążkowanym mięśniu serca. Prawie zupełny brak zainfekowanych komórek stwierdza się w utkaniu tłuszczowym sutka i w leżącym poniżej mięśniu poprzecznie prążkowanym. Nie stwierdzono zainfekowanych komórek w nerkach.

Patologia wątroby.

W większości przypadków podczas sekcji stwierdza się prawidłowe wątroby. Nie stwierdzono jawnej martwicy w żadnej wątrobie. Jednakże u myszy leczonych adenowirusem stwierdzano nieprawidłowości w budowie komórek wątroby (nieobecne w grupie buforowej) w postaci zwiększonej liczby komórek dzielących się, zmianach w cytoplazmie oraz wielkości i kształcie komórek.

P r z yk ład 3

Terapia genowa za pomocą pośredniczących adenowirusów p53 przeciwko heteroprzeszczepom ludzkiego raka sutka

Wynalazek zapewnia leczenie różnych rodzajów raka poprzez podawanie kwasów nukleinowych powodujących ekspresję polipeptydu supresorowego nowotworu. Poniższy przykład podaje szczegółowe informacje o zdolności adenowirusa ekspresji p53 wynalazku do leczenia ludzkiego raka sutka.

Wprowadzenie komórek typu p53 wild z zerowym lub zmutowanym p53 oferuje nową strategię kontrolowania wzrostu guza. Casey (1991) Oncogene 6: 1791-1797 wprowadził in vitro komórki typu p53 wild do komórek raka sutka stosując wektor plazmidu DNA. Ilość kolonii MDA-MB-468 (p53mut) oraz T47D (p53mut) powstałych po transfekcji plazmidem zawierającym p53 wild została zredukowana o 50%. Podobnie żadna z powstałych kolonii nie wykazywała ekspresji transfektantu p53 wild. Z kolei ilość kolonii MCF-7 (p53wt) nie zmieniła się. Negrini (1994) Cancer Res. 54: 1818-1824 przeprowadził podobne badania stosując komórki MDA-MB-231. Tworzenie się kolonii zostało zredukowane o 50% przy transfekcji plazmidem zawierającym p53 wild i żadna z powstałych kolonii nie wykazywała ekspresji p53 wild. Paradoksalnie, w tych badaniach podobne wyniki uzyskano dla komórek MCF-7.

W badaniach opisanych w tym przykładzie skuteczność niedoborowa replikacji rekombinowanego adenowirusa p53 z delecją regionu E1 (p53 Ad; (A/C/N/53) Wills (1994) powyżej) była badana w porównaniu z liniami ludzkich komórek raka sutka wykazujących ekspresję mutanta p53 MDA-MB-231, MDA-MB-468 oraz MDA-MB-435. Komórki MDA-MB-231 przenoszą mutację Arg-Lys w kodonie 280 genu p53 (Bartek (1990) Oncogene 5: 893-899). Komórki MDA-MB-468 przenoszą Arg-His w kodonie 273 (Id.). Komórki MDA-MB-435 przenoszą Gly-Glu w kodonie 266 genu p53 (Lesoon-Wood (1995) Hum. Gene. Ther. 6: 395-405).

Wcześniejsze badania wykazywały wysokie poziomy ekspresji p53 typu wild w komórkach guza sutka ludzkiego, jajnika, płuc, guzów okrężniczo-odbytniczych, wątroby, mózgu i pęcherza po infekcji p53 Ad in vitro (Wills (1994) powyżej), Harris et al. (1996) Cancer Gene Therapy 3: 121-130). Ekspresja p53 za pośrednictwem adenowirusów ostatecznie zaowocowała zmianami w morfologii komórek i wprowadzeniem apoptozy w komórkach p53 null lub mutantów p53. Infekowanie komórek raka sutka przez p53 Ad przy stężeniu 10 m.o.i. (infekcja wielokrotna) powodowało prawie 100% inhibicję syntezy

PL 193 767 B1

DNA w 72 godziny po infekcji. Dodatkowo infekcja p53 Ad in vitro zahamowała proliferację komórek MDA-MB-231 z wartościami ED50 odpowiednio 3±2 oraz 12 ±10 m.o.i. Proliferacja trzech innych mutantów p53 linii komórkowej raka sutka została także zahamowana przy niskich stężeniach p53 Ad. Wartości ED50 wynosiły 16±4 m.o.i. dla komórek SK-BR-3, 3±3 m.o.i. dla komórek T-47D oraz 2±2 m.o.i. dla komórek BT-549. Infekcja komórek MDA-MB-468 oraz MDA-MB-231 ekwiwalentnym rekombinowanym adenowirusem w stężeniu 30 m.o.i., powodującym ekspresję betagalaktozydazy (beta-gal) E. Coli, w miejsce p53 zaowocowała >67% beta-gal pozytywnych komórek MDA-MB-468 oraz 34-66% beta-gal pozytywnych komórek MDA-MB-231. Porównując procent beta-gal pozytywnych komórek z anty-proliferacyjnym efektem p53 w komórkach wielu guzów Harris et al. (powyżej) wykazał silną pozytywną korelację pomiędzy stopniem inhibicji indukowanej p53 a stopniem transdukcji adenowirusa. Z drugiej strony linie komórkowe wykazujące ekspresję prawidłowych poziomów p53 wild były minimalnie dotknięte transdukcją p53, niezależnie od współczynnika transdukcji adenowirusa.

Proliferacja komórek MCF7 oraz HBL-100, dwóch linii ludzkich komórek zawierających p53 wild była relatywnie niezainfekowana p53 Ad w stężeniu większym lub równym 99 m.o.i. in vitro. Innymi słowy, hamowanie wzrostu komórek MCF-7 oraz HBL-100 wymaga stężenia p53 Ad minimum 8 do 33 razy większego od wartości ED50 odpowiednio dla komórek -231 oraz -468. Stosując podobny rekombinant p53 Ad, Katayose (1995) Clin Cancer Res. 1: 889-897 wykazał wzrost ekspresji proteiny p53, zmniejszoną proliferację komórek i zwiększoną śmiertelność komórek apoptotycznych w linii -231 transdukowanej in vitro. Badanie te rozszerzają wyniki in vitro z komórkami -468 i -231 o heteroprzeszczepy raka sutka in vivo. Wydajność terapii genowej wspomaganej adenowirusem p53 jest oceniana w innej linii komórek raka sutka (MDA-MB-435), która jest oporna na transdukcję adenowirusa in vitro.

Materiał i metoda

Linie komórkowe i infekcja adenowirusem in vitro

Linie ludzkich komórek raka sutka MDA-MB-231, -468 oraz -435 uzyskano z ATCC (Rockville, Maryland, USA). Komórki -231 hodowano w DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY) z 10% cielęcym osoczem płodowym (FCS; Hyclone, Logan, Utah) w 37°C i atmosferze 5% CO2. Komórki -468 były hodowane na pożywce Liebovitz'a L-15 (Life Technologies) zawierającej 10% FCS w 37°C. Komórki -435 hodowano na pożywce Leibovitz'a z 15% FCS i 10 mg/ml insuliny krowiej (Sigma Chem. Co., St, Louis, Missouri) w 37°C.

Konstrukt i namnażanie się rekombinantów ludzkich adenowirusów (rAd) ekspresji p53 wild oraz E. Coli beta-galaktozydazy (beta-gal), gdzie ekspresja transgeniczna jest kierowana przez ludzki promotor cytomegalowirusa, została opisana wcześniej (Wills (1994) powyżej). Adenowirusy były podawane w buforze fosforanowym (20nM NaH2PO4, pH 8,0, 130nM NaCl, 2nM MgCl2, 2% cukroza). C.I.U. jest określane jako jednostka infekcji komórkowej. Stężenie cząsteczek wirusa było określane poprzez mierzenie ilości komórek 293 zawierających białko heksonu wirusa po 48 godzinach czasu infekcji (Huyghe (1995) powyżej).

Dla badań infekcji in vitro z p53 Ad komórki zostały umieszczone na płytce w stężeniu 1-5 x 10⁴ komórek / dołek w 12-dołkowej płytce do kultury tkankowej (Becton Dickinson, Lincoln Park, New Jersey, USA). Komórki zostały transdukowane z 0, 10, 50 lub 100 m.o.i. beta-gal Ad. Po 48 godzinach komórki unieruchomiono 0,2% glutaraldehydzie (Sigma Chemical Co.), następnie przemywano trzykrotnie PBS (Life Technologies). Następnie komórki były analizowane w 1 ml roztworu X-Gal [1,3 mM

MgCl2, 15 nM NaCl, 44nM buforu Hepes, pH 7,4, 3nM ferrocyjanku potasu oraz 1 mg/ml X-Gal w N,N-dimetyloformamidzie (10% stężenie ostateczne)]. X-Gal został zakupiony z Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Indiana. Wszystkie inne chemikalia zakupiono w firmie Sigma.

W celu określenia procentowej ilości transdukowanych komórek zliczano 5 pól mikroskopowych z każdej kultury danego dołka i obliczano średnią procentową ekspresję beta-galaktozydazy dla 3 dołków w każdym m.o.i.

Terapia adenowirusowa in vivo

Bezfuterkowe, pozbawione grasicy samice myszy zakupiono z Charles River laboratories (Wilmington, Massachusetts, USA). Wszystkie myszy były trzymane w obiekcie z barierą VAF i wszystkie procedury związane ze zwierzętami były wykonywane zgodnie z zasadami ustalonymi w Wytycznych dotyczących opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych Narodowego Instystutu Zdrowia. Komórki guza podawano podskórnie lub do warstwy tłuszczowej sutka.

PL 193 767 B1

Komórki inokulowano następująco: 5 x 10⁶ komórek -231 na mysz, 1x 10⁷ komórek MDA-MB-435 na mysz. Guzy wzrastały in vitro przez 10-11 dni przed rozpoczęciem dawkowania, poza jednym eksperymentem -468, gdzie guz rósł przez 33 dni przed rozpoczęciem podawania. Objętość nowotworu obliczano mierząc w 3 wymiarach. Objętości guzów dla różnych grup na każdy dzień porównywano stosując test t studenta z zastosowaniem oprogramowania Statview II (Abacus Concepts, Berkeley, California). Średni procent hamowania dla grup dozowanych w dniach 0-4 i 7-11 obliczano stosując wartości znaczące (P. < 0,05) od 14 dnia do końca badań.

Swoiste efekty p53 rozróżniono od efektów wektorów adenowirusowych poprzez odjęcie średniej inhibicji wzrostu guza powodowanej przez beta-gal Ad od inhibicji wzrostu powodowanej przez p53 Ad. Wszystkich iniekcji wirusa dokonywano około/doguzowo. Ogólnie rzecz biorąc każdej myszy podano dwa 5-dniowe kursy terapii guza (tj. 5 zastrzyków) oddzielone 2-dniowym okresem „odpoczynku. W niektórych przypadkach dawkowanie zostało rozszerzone na 2 tygodnie i/lub nośnik buforowy został zastąpiony wirusem w niektórych zastrzykach. Krzywe wzrostu guza pokazują średnią objętość guza ± standardowe odchylenie błędu.

Histologia i immunohistochemia apoptag

Próbki tkankowe utrwalono w 10% buforowanej formalinie i obrabiano przez noc w procesorze tkankowym Miles VIP Tissue Processor, następnie zatopiono w parafinie. Wykonano skrawki grubości 5 mikronów na mikrotomie Leitz. Skrawki zostały wybarwione rutynowo hematoksyliną Harrisa i barwnikiem eozynowym (Luna et al. (1968) Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. New York: McGraw Hill Book Co.).

Zestawy wykrywające apoptag in situ zakupiono z Oncor (Gaithersburg, Maryland, USA). Próbki analizowano zgodnie z instrukcją w zestawach. Odparafinizowane, uwodnione skrawki tkankowe traktowano krótko proteinowym enzymem wytrawiającym Oncor, inkubowano z TdT i wywoływano stosując zestaw peroksydazy avidinowej (IgG królika - Sigma Chem. Co. EXTRA-3) oraz DAB (Vector Lab. SK4100). Skrawki barwiono ponownie zielenią metylową.

Analiza beta-galaktozydazy

Guzy zatapiano w TBS (Triangle Biochemical Sciences, Durham, North Carolina, USA) i szybko zamrażano w suchej kąpieli lodowej 2-metylobutanie. Zamrożone skrawki tkankowe (grubości 8 mm.) umocowano w 0,5% glutaraldehydzie w 4°C przez 5min, a następnie oznaczano ekspresję beta-gal, jak opisano powyżej.

Analiza integryn FACS

Komórki zawieszono z 0,02% EDTA, poddawano granulacji, a następnie przemywano 2x PBS. Komórki zostały ponownie zawieszone w stężeniu 1 x 10⁶ komórek na mililitr i inkubowane z pierwotnymi przeciwciałami (stęż. ostateczne 1 : 250/ml) w 4°C na 1 godzinę. Zawiesina komórkowa została przemyta 2x PBS w celu usunięcia nadmiaru przeciwciał pierwotnych. Następnie inkubowano komórki z króliczymi, konjugowanymi FITC przeciwciałami pomocniczymi przeciw myszy (stęż. ostateczne 1 : 250/ml, Zymed) w 4°C przez 1 godzinę. Komórki przemyto jak poprzednio w PBS i natychmiast poddano analizie. Mierzono fluorescencję cytometrem przepływowym FACS Vantage (Becton Dickinson, Mountain View, California, USA). Rozrzut boczny i przedni określano równocześnie, a wszystkie dane zbierano w komputerze Hewlett Packard wyposażonym w oprogramowanie badawcze PACS (Becton Dickinson). Pierwotne przeciwciała stosowane do wykrywania receptorów integryn uzyskiwano od następujących dostawców: anty-alfav (12084-018, Gibco BRL); anty-beta3 (550036, Becton Dickinson); anty-alfav-beta3 (MAP1976, Chemicon); anty-beta1, (550034, Becton Dickinson); antyalfavbeta5 (MAB 1961,Chemicon).

Wyniki

Wydajność transdukcji adenowirusa i inhibicja wzrostu p53 in vitro

Komórki -231 oraz -435 rzadko podlegają transdukcji, nawet przy 100 m.o.i. Dla komórek -231 transdukcji uległo 8% (10 m.o.i.). 46% (50 m.o.i.) oraz 62% (100 m.o.i.) w przypadku beta-gal Ad. Dla komórek 468 transdukcji beta-gal Ad uległo 78% (10 m.o.i.), 84% (50 m.o.i.) oraz 97% (100 m.o.i.). Komórki 435 zostały poddane transdukcji beta-gal w stopniu 0,5% (10 m.o.i.), 1% (50 m.o.i.) oraz 1,3% (100 m.o.i.).

Infekcja p53 Ad przy 50 m.o.i. spowodowała prawie całkowitą śmierć kultur komórkowych 231 i 468. Przez kontrast p53 Ad nie oddziałuje w sposób wykrywalny na wzrost komórek 435.

PL 193 767 B1

Wydajność p53 przeciw heteroprzeszczepom ludzkich komórek raka sutka.

Terapia genowa z pośrednictwem adenowirusa p53 odznaczała się wysoką efektywnością przeciw heteroprzeszczepom -231 oraz -468 (Rys. 3a i 3b). W eksperymencie 231, jedna mysz w grupie beta-gal Ad i 3 myszy w grupie p53 Ad na koniec badań nie wykazywały obecności guza, a wszystkie guzy uległy regresji podczas terapii p53 Ad. Hamowanie wzrostu guza -231 sięgało średnio 86% (p £ 0,01). Inhibicja wzrostu składowych spowodowana p53 sięgała 49%. Hamowanie wzrostu guza -468 sięgała 74% (p < 0,001). Jedna mysz w grupie p53 Ad na koniec badań nie wykazywała obecności guza, a wszystkie guzy uległy regresji podczas terapii p53 Ad. Inhibicja wzrostu składowych spowodowana p53 sięgała średnio 45%, (p.<0,001), podczas gdy inhibicja specyficzna dla adenowirusa sięgała 28% (p £ 0,05). W żadnym z eksperymentów nie zaobserwowano objawów ubocznych. Wartości ED50 dla hamowania wzrostu -231 i -468 wynosiły odpowiednio 3 x 10⁸ C.I.U. (jednostek infekcji komórkowej) oraz 2 x 10⁸ C.I.U. (Rys. 4). Guzy -435 wykazywały prawie całkowitą oporność na leczenie p53 Ad (Rys. 3c). Hamowanie wzrostu w grupie guzów 435 leczonej adenowuirusami nie było znaczące.

Rysunek 5 pokazuje wydajność dwóch sposobów dawkowania p53 Ad w stosunku do guzów -231. Wszystkim myszom podawano 5 okołoguzowych iniekcji na tydzień. Wszystkie myszy leczone środkiem terapeutycznym (p53 Ad) otrzymały całościowo 2,2 x 10⁹ C.I.U. na mysz na tydzień. Jedna grupa otrzymywała iniekcję w postaci pojedynczego bolusa zawierającego całą tygodniową dawkę adenowirusa. Inne 4 iniekcje w tygodniu stanowiły nośnik buforowy (grupa IX). Inna grupa otrzymywała taką samą dawkę podzieloną na 5 iniekcji tygodniowo (grupa 5X). Sposób dawkowania był podawany w tygodniu 1, 3 (dni 0-4 oraz 14-18). Inhibicja wzrostu sięgała średnio 73% dla grupy 5X (p.< 0,01), lecz jedynie 44% dla grupy IX (p.< 0,05 dla pierwszych trzech tygodni badań, nie znaczące po dniu 21). Pierwszy cykl terapii genowej p53 był bardziej efektywny od cyklu drugiego. Po pierwszym cyklu terapeutycznym 4 myszy grupy IX, 5 myszy grupy 5X oraz 1 mysz grupy kontrolnej z nośnikiem nie wykazały obecności guza. U jednej myszy z grupy 5X wystąpił nawrót małego guza w dniu 21. Nie zaobserwowano dalszych „wyleczeń po drugim cyklu terapii.

Rysunek 6 pokazuje eksperyment z zastosowaniem guzów 468 będących początkowo 4-krotnie większymi niż guzy 468 pokazane na rysunku 3b, leczone 10-krotnie mniejszą dawką adenowirusa. Podana została całkowita dawka p53 Ad wysokości 2,2 x 10⁸ C.I.U. na mysz na tydzień. Jedna grupa otrzymała pojedynczą iniekcję wirusa w bolusie, a następnie 4 iniekcje buforu na tydzień (grupa 5X). Taki system dawkowania utrzymano przez 6 tygodni. Całkowita dawka wirusa podana przez okres 6 tygodni stanowiła w przybliżeniu połowę dawki użytej na rys. 3. Taki sposób dawkowania wykazywał efekt cytostatyczny na objętości guza u myszy, którym podano p53 Ad (p £ 0,05). Leczenie zastosowane podczas wcześniejszych badań okazało się być bardziej efektywne niż zastosowane w późniejszych tygodniach. U jednej myszy w grupie 5X aż do 21 dnia nie stwierdzono obecności nowotworu. Kiedy porównano zahamowanie wzrostu guza u wszystkich myszy grupy IX sposób dawkowania (60%) był nieznacznie, lecz nie znacząco, bardziej efektywny niż w grupie 5X (55%). Po tygodniu od zakończenia dawkowania wskaźnik wzrostu guza w grupie 5X zaczął wzrastać. Miesiąc po rozpoczęciu badań, w grupie podawania samego nośnika guzy zaczęły ulegać martwicy i wzrost osiągnął plateau.

Infekcyjność in vivo po powtórnej ekspozycji na adenowirusy

Pod koniec badań, jak pokazano na rysunku 5 i 6, do niektórych guzów wstrzyknięto beta-gal. Ad. Guzy te hodowano 24 godziny, następnie zamrożono i wykonano preparaty tkankowe, które poddano próbom chemicznym z beta-galaktozą. Guzy poddane działaniu p53 Ad przez 2 do 6 tygodni wykazywały wciąż transdukcję przez beta-gal Ad, chociaż transdukcja była niższa niż w 468 guzach leczonych przez 6 tygodni p53 Ad 5X przez tydzień. Tylko 1 z 3 guzów -468, którym wstrzykniętych w grupie 5X wykazywał obecność komórek z ekspresją beta-galaktozydazą.

Indukcja apoptozy in vivo przez p53 Ad

MDA-MB-231 i MDA-MB-468 heteroprzeszczepu komórek raka sutka u myszy, którym wstrzyknięto 1-5 x 10⁸ C.I.U. p53 Ad albo bufor 48 do 72 godzin przed hodowlą. Indukcję apoptozy przez p53 Ad analizowano na preparatach tkankowych przy użyciu immunohistochemicznego Apoptag. Guzy, do których wstrzyknięto p53 Ad wykazywały intensywną apoptozę wzdłuż kanału przejścia igły w przypadku wstrzyknięć do guza i wokół granic guza przy iniekcjach okołoguzowych.

Z drugiej strony guzy, do których wstrzyknięto bufor miały jedynie pojedyncze rozproszone komórki apoptotyczne, tak jak oczekiwano.

PL 193 767 B1

Porównanie ekspresji integryn w komórkach MDA-MB-231 i MDA-MB-435

Analizy FACS ekspresji integryny wykonywane na komórkach MDA-MB-231 i MDA-MB-435, miały określić czy niska transdukcja Ad komórek MDA-MB-435 spowodowała brak alfav integryn potrzebnych do internalizacji Ad typem 2,3 i 4 ( Wickham et al.(1993) Cell, 73: 309-319; Wickham et al. (1994) J. Cell Biol.,127: 257-264; and Mathias et al. (1994) J. Virol. 68; 6811-6814). Oba typy komórek miały ekspresje integryn alfav, alfavbeta3, beta5, i beta1 w przybliżeniu na tym samym poziomie.

Integryny alfavbeta3 i beta3 miały wyższą ekspresję w komórkach MDA-MB-453 niż w komórkach MDA-MB-231.

Dyskusja: W przypadku, gdy całkowita dawka 2,2 x 10⁹ C.I.U p53 Ad była podawana w 10 iniekcjach, zahamowanie wzrostu guza było rzędu 74% dla guzów MDA-MB-468 i 86% dla guzów MDA-MB-231, lecz nie było znaczące dla guzów MDA-MB-435. W guzach MDA-MB-468 61% całkowita odpowiedź była specyficzna dla p53, podczas gdy dla MDA-MB-231 specyficzność dla wykazywało jedynie 43% całości. Zdolność beta-gal Ad do transdukcji komórek MDA-MB-231, MDA-MB-468 i MDA-MB-435 były przewidywalne zgodnie z wynikami badań in vivo. W tych samych stężeniach wirusa komórki -468 wykazywały nieznacznie wyższy wskaźnik transdukcji niż komórki MDA-MB-231 podczas gdy komórki MDA-MB-435 były odporne na transdukcję adenowirusa. Wyniki badań MDA-MB-435 in vitro korelują z bardzo słabą odpowiedzią in vivo.

Ogólnoustrojowe leczenie myszy bezfuterkowych, u których występują guzy MDA-MB-435 wektorem liposomu p-53 powodowało zahamowanie wzrostu guza i w kilku przypadkach jego regresję (Lesoon-Wood et al.(1995) Hum. Gene Ther.,6: 395-405). Terapia liposomem p53 spowodowała zredukowanie liczby przerzutów do płuc. Wyniki tych badań wskazują, że brak odpowiedzi guza MDA-MB-435 na leczenie p53 Ad był powodowany niezdolnością p53 Ad do inhibicji wzrostu i powstawania przerzutów w guzach MDA-MB-435. Wyniki te sugerują raczej, że niska wydajność adenowirusów do transdukcji komórek MDA-MB-435 spowodowała brak odpowiedzi z ich strony na leczenie p53 Ad.

Integryny alfav wprowadzane jako elementy komórkowe wymagają internalizacji typem 2, 3 i 4 adenowirusa (Wickham (1993) powyżej; Wickham (1994) powyżej; i Mathias (1994) powyżej). Możliwe jest, że integryny alfav odgrywają tę samą rolę dla typu 5 Ad. Wickham et al. (1994) powyżej, zaobserwował 5-10 razy wyższą internalizację rekombinowanego typu 5 adenowirusa w komórkach transfektowanych z alfavbeta3, w porównaniu z ekspresją komórek z brakującym alfav lub transfektowanych z alfavbeta3. Do produkcji p53 Ad użyto komórki -293 z nerki embrionu ludzkiego z ekspresją integryn alfavbeta1 a nie alfavbeta3 (Bodary (1990) J. Biol. Chem. 265: 5938-5941). Decydujące wydaje się mierzenie ekspresji komórek -435 integryn podgrup alfav, beta1, beta3, i alfa5. Oba typy komórek MDA--MB-231 i MDA-MB-435 wykazują ekspresję podobnych poziomów jednej rodziny komórek integryn.

Z tego względu brak transdukcji Ad komórek MDA-MB-435 nie powstał na skutek braku ekspresji integryny alfa5. Obecnie, nie istnieje literatura opisująca receptor komórkowy konieczny do wiązania wirusa Ad do komórek docelowych. Możliwe jest, że w komórkach MDA-MB-435 występuje brak receptora, lub wadliwe są konieczne składniki dla wiązania wirusa, internalizacji lub genu ekspresji.

Stała wydajność p53 Ad nad wielokrotnymi typami terapii była badana na modelach guzów MDA-MB-231 i MDA-MB-468. Okazuje się, że skuteczność maleje wraz z kontynuacją leczenia, jednak efekt ten należy jeszcze zbadać bardziej szczegółowo. Obecnie obowiązująca teoria podaje, że infekcja adenowirusowa generuje szybką odpowiedź zapalną i cytolityczną za pośrednictwem cytolitycznych komórek T u gospodarza z prawidłowo funkcjonującym systemem immunologicznym (recenzowane przez Wilsona (1995) Nature Med. 4:887-889). Odpowiedź komórek T jest stymulowana przez antygeny adenowirusa wytwarzane przez komórki gospodarza i prezentowana w połączeniu z cząstkami MHC na powierzchni komórki. Przeciwciała neutralizujące specyficzne dla komórek transdukowanych przez adenowirus są wytwarzane później w czasie odpowiedzi immunologicznej i uważa się, że są one odpowiedzialne za zredukowanie zdolności do reinfekowania komórek gospodarza przez adenowirus po pierwotnej inokulacji. Myszy nie posiadające grasicy stosowane do tych badań mają wadliwą komórkową odpowiedź immunologiczną T na obce antygeny, lecz są zdolne do generowania za pośrednictwem komórek B odpowiedzi humoralnej (Boven (1991) The Nude Mouse in Oncology Research., Boston: CRC Press). Wytwarzanie neutralizujących przeciwciał anty-adenowirusowych może wyjaśniać zredukowaną wydajność p53 adenowirusa (p53 Ad) w czasie w niniejszych badaniach. Osłabiony system immunologiczny myszy bezfuterkowych oraz słabe ukrwienie heteroprzeszczepów guza może wyjaśniać częściową

PL 193 767 B1 nieefektywność p53 Ad nawet po 6 tygodniach dawkowania i zdolność do infekcji kilku komórek guza przez beta-gal Ad nawet po powtórnej iniekcji p53 Ad.

Poza rakiem sutka, w innych nowotworach zastosowano leczenie rekombinowanymi adenowirusami z ekspresją p53 typu dzikiego. Te doniesienia obejmują różne typy raka szyjki macicy (Hamada (1996) Cancer Res. 56:3047-3054), raka prostaty (Estham (1995) Cancer Res. 55:5151-5155), raka głowy i szyi (Clayman (1995) Cancer Res. 55:1-6), raka płuca (Wills (1994) powyżej), raka jajników (13), glioblastomę (27,28), i raka okrężniczo-odbytniczego (13,29). Dane te wspomagają trwające badania kliniczne oceniające efekty genowej terapii adenowirusem p53. Obecne wyniki wskazują na zdolność zmniejszenia wzrostu komórek nowotworowych przez dziki typ p53 in vivo w heteroprzeszczepach raka sutka wywołujących ekspresję mutanta p53. Obecne badania potwierdzają także, że adenowirusy wydają się być efektywne we wprowadzaniu p53, gdy docelowe komórki wykazują ekspresję właściwych „receptorów wirusowych.

P r z yk ład 4

Dalsze badania dotyczące trybu leczenia hamującego rozwój nowotworów

Wynalazek pozwala na leczenie różnych rodzajów raka poprzez podawanie kwasu nukleinowego z ekspresją polipeptydu supresorowego guza przy zastosowaniu różnych sposobów dawkowania. Następujący przykład opisuje zwiększoną skuteczność podzielonego dawkowania adenowirusa z ekspresją p53 stanowiącego wynalazek.

Aby zbadać wpływ jednorazowego dawkowania w porównaniu z podzielonymi dawkami podawanymi przez określony czas, myszy SCID, którym wstrzyknięto nowotwory MDA-MB-468 oraz MDA-MB-231, otrzymały łączną dawkę na mysz wysokości 1 x 10⁹ I.U. p53 Ad (A/C/N/53) w formie pojedynczej iniekcji w bolusie lub podzielonych na 3 lub 5 iniekcji podawanych raz dziennie w ciągu tygodnia (zaznaczone strzałkami na rys. 7).

Wyniki otrzymane w przypadku guzów MDA-MB-468 były podobne do wyników uzyskanych przy guzach MDA-MB-23 i są pokazane na rys. 7a, 7b oraz 7c. Ogólnie, podzielone dawki hamowały rozwój nowotworów lepiej niż dawki jednorazowe, przy czym dawkowanie w pięciu iniekcjach było znacznie skuteczniejsze, niż dawkowanie w trzech iniekcjach.

P r z yk ład 5

Deksametazon tłumi hamowanie wzrostu nowotworów związane z odpowiedzią immunologiczną skierowaną przeciw adenowirusowi za pośrednictwem komórek NK

Wykazano, że ponawiane stosowanie wektorów adenowirusów może wywołać odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciw adenowirusom. Aby zbadać, czy własności immunosupresyjne małych dawek deksametazonu (Dex) mogą stłumić odpowiedź immunologiczną przeciw adenowirusom (np. odpowiedź komórek NK), nowotwory MDA-MB-231 u myszy scid poddawano działaniu rekombinowanego wirusa, będącego podstawą wynalazku, w obecności i przy braku deksametazonu.

Około 5 x 10⁶ komórek MDA-MB-231 na mysz wstrzyknięto w ciało tłuszczowe sutków samic myszy scid w dniu 0. W dniu 11 podskórnie wszczepiono tabletki deksametazonu lub placebo. Tabletki 5 mg miały wydzielać 83,3 mg deksametazonu dziennie przez 60 dni bez przerwy (Innovative Research of America, Sarasota, FL). Wszystkie myszy otrzymały łącznie 10 zastrzyków okołoguzowych raz dziennie w dniach 14-18 oraz 21-25 (0,1 ml w zastrzyku). Łączna dawka wirusa wynosiła 2 x 10⁹ C.I.U. p53 Ad na mysz (A/C/N/53 lub Ad beta-galaktozydazy). Leczenie odbywało się w sposób opisany w tabeli 5.

T ab el a 5. Leczenie nowotworów MDA-MB-23 u myszy scid

Grupa	Hormon	Terapia genowa
1	placebo	bufor
2	placebo	Ad beta-gal
3	placebo	Ad p53
4	deksametazon	bufor
5	deksametazon	Ad beta-gal
6	deksametazon	Ad p53

PL 193 767 B1

Stosowanie małych dawek deksametazonu nie miało znaczącego wpływu na tempo rozwoju nowotworów MDA-MB-231 u myszy SCID (p > 0,05). Nie stwierdzono szkodliwych skutków ubocznych deksametazonu. Leczenie nowotworów adenowirusem beta-galaktozydazy powoduje znaczne zahamowanie rozwoju nowotworów w grupie myszy z nowotworami otrzymującej placebo (p £ 0,001, dni 21-30), ale nie w grupie myszy z guzami leczonymi deksametazonem (P > 0,05, patrz rys. 8). Nowotwory leczone placebo i adenowirusem beta-gal rozwijały się wolniej niż nowotwory leczone za pomocą placebo i deksametazonu (p < 0,01, dni 23-30).

Nie wystąpiło zahamowanie rozwoju nowotworów związane z p53 w nowotworach w grupie otrzymującej placebo (p > 0,05). Z drugiej strony, nowotwory leczone deksametazonem i p53 Ad rozwijały się znacznie wolniej niż nowotwory leczone deksametazonem i Ad beta-gal (P £ 0,02, dni 21-30) oraz placebo i p53 Ad (p £ 0,04, dni 21-30).

Terapia małymi dawkami deksametazonu tłumiła hamowanie rozwoju nowotworów w związku z odpowiedzią immunologiczną skierowaną przeciw adenowirusom (np. odpowiedź komórek NK) u myszy SCID, bez niepożądanych skutków ubocznych. Dane sugerują również, że terapia małymi dawkami deksametazonu może stymulować ekspresję transgeniczną (np. p53) powodowaną promotorem CMV w adenowirusach rekombinacyjnych. I odwrotnie, deksametazon może zwiększyć skuteczność transdukcji adenowirusów i w ten sposób zwiększyć śmiertelność komórek rakowych.

Model raka piersi MDA-MB-231 użyto następnie do określenia skuteczności zwalczania nowotworów przez Ad z lub bez p53 u myszy o różnej zdolności do wytworzenia odpowiedzi immunologicznej przeciw obcym antygenom. Badano myszy bezfuterkowe z niefunkcjonującymi komórkami T, myszy SCID z niefunkcjonującymi komórkami T i B oraz podwyższoną ilością komórek NK, oraz myszy SCID-beige z niefunkcjonującymi komórkami T, B oraz NK.

Aby zbadać skuteczność rAd5/p53 (opisanego powyżej) w zwalczaniu heteroprzeszczepów MDA-MD-231 myszy bezfuterkowe otrzymały całkowitą dawkę w wysokości 2,2 x 10⁹ C.I.U. adenowirusa na mysz podzieloną na 10 zastrzyków w dniach 0 do 4 oraz 7 do 11. Myszy SCID otrzymały łącznie dawkę wirusa = 4 x 10⁹ C.I.U. podzieloną na dziesięć dawek podawanych w dniach 0-4 oraz 7-11. Myszy SCID-beige otrzymały łącznie dawkę wirusa = 1,6 x 10⁹ C.I.U. podzieloną na 10 dawek podawanych w dniach 0-4 oraz 7-11. Wszystkie myszy otrzymały adenowirus p53, beta-gal lub sam nośnik.

U myszy bezfuterkowych (niefunkcjonujące komórki T) lub myszy SCID (niefunkcjonujące komórki T i B, podwyższona liczba komórek NK), dawkowanie okołoguzowe wektora adenowirusowego (bez p53) powodowało pewne zahamowanie rozwoju nowotworów. Adenowirus z ekspresją p53 (rAd5/p53) znacznie zwiększał skuteczność zwalczania nowotworów w porównaniu z adenowirusem kontrolnym. Z drugiej strony, u myszy SCID-beige (niefunkcjonujące komórki T, B oraz NK), skuteczność zwalczania nowotworów zależała wyłącznie od zawartości p53 bez wpływu wektora adenowirusowego na hamowanie rozwoju nowotworów. Powyższe dane wskazują na uprzednio niezauważoną rolę komórek NK w hamowaniu wzrostu nowotworów za pomocą adenowirusów. Dane te sugerują również, że supresja układu immunologicznego może anulować niektóre skutki uboczne zależne od wektorów, przy udziale komórek NK.

P r z yk ład 6

Skojarzona terapia adenowirusem p53 oraz chemoterapia

Wynalazek umożliwia skojarzone stosowanie kwasu nukleinowego z ekspresją polipeptydu supresorowego nowotworów oraz czynników chemoterapeutycznych w leczeniu nowotworów. Następujący przykład opisuje możliwość leczenia nowotworów adenowirusem z ekspresją p53 stanowiącym wynalazek w połączeniu z różnorodnymi lekami przeciwnowotworowymi, takimi jak cisplatyna, doksorubicyna, 5-fluorouracyl (5-FU), metrotreksat i etoposid oraz wyższą skuteczność terapii skojarzonej, tj. synergię w zabijaniu komórek rakowych, niż każdego z tych czynników osobno.

p53 stosowany z lekami chemoterapeutycznymi in vitro

Cisplatyna, doksorubicyna, 5-fluorouracyl (5-FU), metotreksat i etoposid skojarzone z p53

Działanie leków przeciwrakowych potwierdzonych klinicznie, takich jak cisplatyna, doksorubicyna, 5-fluorouracyl (5-FU), metrotreksat i etoposid wraz z wektorem supresorowym guza stanowiącym wynalazek (A/C/N/53), było badane in vitro. Komórki raka płaskokomórkowego głowy i szyi SCC-9, raka płaskokomórkowego głowy i szyi SCC-15, raka płaskokomórkowego głowy i szyi SCC-25 oraz raka prostaty DU-145 poddano jednej z trzech terapii: w terapii 1, komórki poddano wstępnie działaniu chemoterapeutyków przeciwnowotworowych dwadzieścia cztery godziny przed zastosowaniem ade42

PL 193 767 B1 nowirusa p53 A/C/N/53. W terapii 2 komórki wstępnie poddano działaniu adenowirusa p53, następnie działaniu chemoterapeutyków przeciwnowotworowych. W terapii 3 komórki były wystawione jednocześnie na działanie chemoterapeutyków przeciwnowotworowych i adenowirusa p53.

Wszystkie linie komórek uzyskano z ATCC (Rockville, MD). Komórki raka głowy i szyi SCC-9, SCC-15 oraz SCC-25 (p53^null) hodowano w mieszaninie 1:1 DMEM i Ham F-12 (GIBCO/LIFE Technologies, Grand Island, NY) z 10% cielęcą surowicą płodową (FCS: Hyclone, Logan, Utah), 0,4 mg/ml hydrokortyzonu (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) i 1% endogennymi aminokwasami (GIBCO) w temp. 37°C oraz w atmosferze 5% CO2. Ludzkie komórki raka jajników SK-OV-3 (p53^null) oraz komórki raka prostaty DU-145 (p53^mut) hodowano w MEM Eagle'a plus 10% FCS w temp. 37°C i z 5% CO2. Ludzkie komórki raka sutka (p53^mut) MDA-MB -231, hodowano w DMEM (GIBCO) z 10% cielęcą surowicą płodową (Hyclone) temp. 37°C i z 5% CO2. Ludzkie komórki raka sutka (p53^mut) MDA-MB-468, hodowano w roztworze L-15 Leibovitza (GIBCO) zawierającym 10% FCS w temp. 37°C, bez CO2.

Komórki raka sutka MDA-MB-231 zawierają mutację Arg-Lys w kodonie 280 genu p53 i jawny mutant p53 (Bartek (1990) powyżej). Komórki raka prostaty DU-145 zawierają dwie mutacje p53 na różnych chromosomach, mutację Pro-Leu w kodonie 223 i Val-Phe w kodonie 274 (Isaacs (1991) Cancer Res. 51:4716-4720) i jawny mutant p53. Komórki raka jajników SK-OV-3 nie zawierają p53 (Yaginuma (1992) Cancer Res. 52:4196-4199).

Komórki SCC-9 mają delecję pomiędzy kodonami 274 i 285, co powoduje mutację strukturalną z przemieszczenim, nie wykryto proteiny immunoreaktywnej p53 w jądrze SCC-9 (Jung (1992) Cancer Res. 52:6390-6393; Caamano (1993) Am. J. Pathol. 142:1131-1139; Min (1994) Eur. J. Cancer 308:338-345). Komórki SCC-15 zawierają insercję pięciu par zasad pomiędzy kodonami 224 i 225; produkują niewielkie ilości mRNA p53, ale nie wykrywalne ilości proteiny p53 (Min (1994) powyżej). Komórki SCC-25 wykazują utratę heterozygotyczności w chromosomie 17 i delecję dwóch par zasad w kodonie 209 na pozostałym allelu; mRNA p53 nie jest wykrywalne w komórkach SCC-25, a w ich jądrach nie wykrywa się immunoreaktywnej proteiny p53 (Caamano (1993) powyżej). Około 1,5 x 10⁴ komórek w pożywce (według opisu w przykładzie 1) dodano do każdego dołka na płytce z 96 dołkami i hodowano przez około 4 godziny w temp. 37°C i atmosferze 5% CO2.

Budowę i reprodukcję ludzkich adenowirusów p53 wild i galaktozydazowego E. coli (beta-gal) opisano uprzednio (Wills [1994] powyżej). Stężenie zakaźnych cząsteczek wirusowych określono poprzez pomiar stężenia komórek 293 wykazujących obecność proteiny hekson po czterdziestoośmiogodzinnym okresie infekcji (Huyghe (1995) powyżej). C.I.U. określono jako komórkowe jednostki zakaźne. Adenowirusy z ekspresją p53 podawano w buforze fosforanowym (20 mM NaH2PO4, pH 8,0, 130 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 2% sacharozy). Lek, adenowirus p53, lub odpowiedni nośnik/bufor dodano do każdego dołka. Do badań in vitro z Ad p53, komórki umieszczono na płytkach z gęstością 1,5 x 10⁴ komórek na dołek na płytce 96 dołkowej i inkubowane przez 4 godziny w temp. 37°C i 5% CO2. Lek, Ad p53, lub odpowiedni nośnik dodano do każdego dołka. Kulturę bakteryjną hodowano przez następne 2 dni.

Śmiertelność komórek oszacowano zgodnie z analizą MTT według opisu Mosmanna (1983) J. Immunol. Meth., 65:55-63. W skrócie: ok. 25 ml z 5 mg/ml barwnika niezbędnego do analizy MTT [bromek 3-(4,5 dimetyltiazol-2yl)-2,5-difenyltetrazolium] dodano do każdego dołka i pozostawiono do inkubacji przez 3-4 godz. w temp. 37°C i 5% CO2.

Następnie do każdego dołka dodano 100 ml 10% detergentu SDS i pozostawiono na noc w temp. 37°C i 5% CO2. Następnie za pomocą czytnika mikropłytek Molecular Devices obliczono sygnał w każdym dołku.

We wszystkich przypadkach stosowania cisplatyny (podsumowanie wyników - patrz tabela 6), doksorubicyny (podsumowanie wyników - patrz tabela 7), 5-FU, metotreksatu i etoposidu, terapia skojarzona była skuteczniejsza, jeśli chodzi o zwalczanie komórek rakowych, niż każdy z czynników osobno.

Połączenie metotreksatu i p53 Ad zbadano w jednej linii komórkowej. Gdy komórki SCC-15 poddano działaniu 0,7 mM metotreksatu 24 godziny przed 5 m.o.i. p53 Ad, połączone działanie hamujące dwóch leków było tylko o 5% większe niż samego p53 Ad, chociaż niniejsza różnica była również znacząca statystycznie (p £ 0,003).

Skojarzenie terapii genowej hamującej rozwój nowotworu i czynników przeciwrakowych nie wykazało skutków przeciwstawnych.

PL 193 767 B1

W drugim eksperymencie efektywność terapii dla prawidłowych komórek (MRC-9) porównano z efektywnością dla komórek guza (rys. 9). W tym eksperymencie rozwój mierzono na zasadzie włączania ³H-tymidyny zamiast próby MTT.

Normalne komórki (diploidalne komórki fibroblastów MRC-9) nie wykazały większych efektów przy zastosowaniu terapii skojarzonej. Jak można było oczekiwać, skutek działania samego supresora nowotworów można pominąć w przypadku normalnych komórek, a jest on znaczący w przypadku komórek rakowych.

Dla porównania, podanie samego chemoterapeutyku przeciwrakowego (np. cisplatyna, doksorubicyna, 5-FU, metotreksat i etoposide) było bardziej skuteczne w przypadku normalnych komórek niż w przypadku komórek rakowych (patrz rys. 9).

Tabela 6. Skutki hamowania wzrostu p53 Ad w połączeniu z cisplatyną

Linia komórek	Proteina p53	Rodzaj tkanki	Najpierw cisplatyna	Najpierw p53 Ad	Równocześnie
SK-OV-3	Zerowa	Jajniki	Tak (p = 0,0001)	Tak (p = 0,0001)	Tak (p = 0,0001)
SCC-9	Zerowa	Głowa i szyja	Tak (p = 0,0001)	Tak (p = 0,0001)	Tak (p = 0,0001)
SCC- 15	Zerowa	Głowa i szyja	Tak (p = 0,0001)	NB	NB
SCC-25	Zerowa	Głowa i szyja	Tak (p = 0,0001)	Tak (p = 0,0001)	Tak (p = 0,0001)
MDA-MB-468	Mutant	Pierś	Tak (p = 0,0001)	NB	Tak (p = 0,0001)
MDA-MB-231	Mutant	Pierś	Tak (p = 0,0002)	Tak (p 0,0001)	Tak (p = 0,0001)

Tabela 7. Skutki hamowania wzrostu p53 Ad w połączeniu z doksorubicyną

Linia komórek	Proteina p53	Rodzaj tkanki	Najpierw doks.	Najpierw p53 Ad	Równocześnie
SK-OV-3	Zerowa	Jajniki	Tak (p = 0,0001)	Tak (p = 0,0001)	Tak (p = 0,0001)
SCC-9	Zerowa	Głowa i szyja	Tak (p = 0,0001)	Tak (p = 0,0001)	Tak (p = 0,0001)
SCC-15	Zerowa	Głowa i szyja	Tak (p = 0,0001)	Tak (p = 0,0001)	Tak (p = 0,0001)
SCC-25	Zerowa	Głowa i szyja	Tak (p = 0,0001)	Tak (p = 0,0001)	Tak (p = 0,0001)
DU-145	Mutant	Prostata	Tak (p = 0,0001)	Tak (p = 0,0001)	Tak (p = 0,0001)
MB-231	Mutant	Pierś	Tak (p= 0,0001)	Tak (p = 0,0001)	Tak (p = 0,0001)

Skutki działania doksorubicyny i p53 na raka wątrobokomórkowego

Następujący przykład opisuje możliwość leczenia nowotworów adenowirusem z ekspresją p53 stanowiącym wynalazek, skojarzonym z doksorubicyną, oraz większą skuteczność terapii skojarzonej, tj. synergii, jeśli chodzi o zwalczanie komórek rakowych, niż każdy z czynników osobno. Wyniki pokazują synergiczne działanie pomiędzy nośnikiem zawierającym p53 stanowiącym wynalazek (ACN53) a doksorubicyną.

Doksorubicyna (adriamycyna) oraz p53 (ACN53, rekombinacyjny konstrukt adenowirusowy z ekpresją ludzkiego transgenu p53 typu wild) podano następującym liniom komórkowym: linii ludzkich komórek raka wątroby (HLE) (Hsu (1993) Carcinogenesis 14:987-992; Farshid (1992) J. Med. Virol. 38:235-239; Dor (1975) Gann. 66:385-392), ze zmutowanym p53; linii ludzkich komórek raka wątroby (HLF) ze zmutowanym p53 (tamże); linii ludzkich komórek raka wątroby (Hep 3B) z zerowym p53 (Hasegawa (1995) In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31:55-61); Hep G2, linii ludzkich komórek raka wątroby z p53 wild (tamże), SK-HEP-1, komórki raka gruczołowego wątroby z p53 wild (Lee (1995) FEBS Lett. 368:348-352). Żywotność komórek mierzona sondą żywych komórek calcien AM (Molecular Probes) (patrz np. Poole (1993) J. CellSci.106:685-691). Substrat calcien AM został rozcięty przez esterazy komórkowe, dając w wyniku substancję fluorescencyjną.

₃

Komórki umieszczono na płytkach o 96 dołkach (5 x 10³ komórek/dołek), pozostawiono je na noc, aby mogły przyrosnąć, następnie zastosowano potrójnie roztwory ACN53 i roztwory doksorubicyny w dniu 0tak, aby utworzyć krzywą odpowiedzi z każdą dawką ACN53 dla terapii doksorubicynowej. Na 3 dzień podłoża aspirowano i dodano do komórek calcien AM.

PL 193 767 B1

Intensywność fluorescencyjną każdego dołka określono za pomocą czytnika fluorescencji. Wartość fluorescencji z dołków bez komórek odjęto, a dane wyrażono jako żywotność procentową (intensywność fluorescencyjna) w porównaniu z dołkami kontrolnymi niepodlegającymi kuracji. Wartości ED50 użyto do utworzenia wykresów izobologramów w celu oszacowania współdziałania ACN53 i doksorubicyny.

Analiza izobologramu dla każdej linii komórkowej wykazała synergiczne działanie pomiędzy nośnikiem zawierającym p53 stanowiącym wynalazek (ACN53) a doksorubicyną; omawiana synergia była niezależna od stanu p53 linii komórkowej. Należy jednak zauważyć, że wartość ED50 dla ACN53 przy nieobecności doksorubicyny jest wyższa w liniach komórkowych z p53 wild, niż w liniach ze zmutowanym p53.

₃

W innym, podobnym eksperymencie, komórki HLE umieszczono na płytkach z 96 dołkami (5 x 10³komórek/dołek); pozostawiono je na noc, aby mogły przyrosnąć; następnie zastosowano potrójnie roztwory ACN53 i roztwory doksorubicyny tak, aby utworzyć krzywą odpowiedzi dla terapii doksorubicynowej z każdą dawką ACN53. Użyto trzech grup do badania skutków kolejności dawkowania we współpracy pomiędzy ACN53, a doksorubicyną.

grupa	dzień 0	dzień 1	dzień 2	dzień 3
jednocześnie	ACN53, doksorubicyna			pobranie
najpierw ACN53	ACN53	doksorubicyna		pobranie
najpierw doksorubicyna	doksorubicyna	ACN53		pobranie

Komórki inkubowano przez 3 dni po pierwszej dawce. Pożywkę aspirowano, a do komórek dodano calcien AM w PBS. Intensywność fluorescencyjną każdego dołka określono za pomocą czytnika fluorescencyjnego płytek. Wartość fluorescencji z dołków bez komórek odjęto, a dane wyrażono jako żywotność procentowa (intensywność fluorescencyjna) w porównaniu z dołkami kontrolnymi niepodlegającymi kuracji. Wartości ED50 użyto do utworzenia wykresów izobologramów w celu oszacowania współdziałania ACN53 i doksorubicyny. Analiza izobologramu dla każdego rodzaju dawkowania wykazała synergiczne współdziałanie pomiędzy ACN53 a doksorubicyną w komórkach HLE, które było niezależne od kolejności dawkowania.

p53 z lekami chemoterapeutycznymi in vivo

Działanie leków przeciwrakowych potwierdzonych klinicznie takich jak cisplatyna, doksorubicyna, 5-fluorouracyl (5-FU), metrotreksat i etoposid wraz z wektorem czynnika hamującego rozwój nowotworów stanowiącym wynalazek (A/C/N/53) było następnie badane in vitro.

Myszy SCID 17/ICR C.B. zakupiono w Taconic Farms (Germantown, NY) lub Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Myszy pozbawione grasicy nu/nu zakupiono z Charles River Laboratories. Wszystkie myszy przetrzymywano w obiekcie z barierą VAF, a wszystkie procedury związane ze zwierzętami wykonywano zgodnie z zasadami ustalonymi w Wytycznych dotyczących opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych Narodowego Instytutu Zdrowia. Objętości guzów u grup podlegających różnym terapiom każdego dnia porównywano za pomocą testu Studenta przy wykorzystaniu oprogramowania Statview II (Abacus Concepts, Berkeley, CA). Utworzono krzywe wzrostu nowotworów, aby wykazać średnią objętość guzów ± standardowe odchylenie błędu. Zwykle występowało dziesięć myszy w grupie.

Model raka jajników SK-OV-3

Rozwinięte nowotwory wewnątrzotrzewnowe SK-OV-3 poddawano działaniu wewnątrzotrzewnowych dawek nośników, adenowirusa p53, cisplatyny lub obu. Myszy otrzymywały sześć zastrzyków p53 Ad w ciągu dwóch tygodni. Łączna dawka wirusa wynosiła 1,5 x 10⁹ C.I.U. (3,1 x 10¹⁰ cząsteczek wirusa).

Skuteczność cisplatyny: Samice myszy SCID otrzymywały 5 x 10⁶ komórek nowotworowych jajników dootrzewnowo w dniu 0. Myszy otrzymywały dawki dootrzewnowo w dniach 6, 8, 10, 13, 15 oraz 17 (tylko p53 Ad w D17). Myszy otrzymywały 0,2 ml całkowitej objętości (0,1 nośnika cisplatyny lub cisplatyna plus 0,1 ml bufora Ad lub p53 Ad). Dawka p53 Ad wynosiła 2,5 x 10⁸ C.I.U./mysz/dzień (5,2 x 10⁹ cząsteczek wirusowych). Dawka cisplatyny wynosiła 2 mg/kg/dzień. Guzy pobrano i zważono w dniu 20.

PL 193 767 B1

Myszy w jednej grupie otrzymywały pięć dawek cisplatyny równocześnie z pięcioma pierwszymi dawkami p53 Ad. Dawka dootrzewnowa p53 Ad zmniejszyła masę guza tylko o 17% do dnia 20 (p £ 0,01). Jednakże podawany łącznie z cisplatyną p53 Ad spowodował 38% zmniejszenie masy guzów w porównaniu z samą cisplatyną (p £ 0,0008). U myszy otrzymujących nośniki leków lub tylko p53 Ad stwierdzono wodobrzusze z domieszką krwi i inwazyjne guzki nowotworowe w mięśniu przepony. Wspomnianych objawów nie wykryto u myszy otrzymujących samą cisplatynę lub cisplatynę z p53 Ad.

Skuteczność leków cisplatyna/paklitaxel: Samice myszy SCID otrzymały zastrzyk 2,5 x 10⁶komórek nowotworowych jajników SK-OV-3, dootrzewowo, w dniu 0. Myszy otrzymywały dawki dootrzewnowe w dniach 7, 9, 11, 16 i 18. Myszy otrzymały 0,3 ml łącznej objętości (0,1 ml nośnika cisplatyny lub cisplatyna plus 0,1 ml nośnika paklitaxelu lub paklitaxel plus 0,1 ml bufora Ad lub p53 Ad). Dawka p53 Ad wynosiła 2,5 x 10⁸ C.I.U./mysz/dziennie (5,2 x 10⁹ cząsteczek wirusowych). Dawka cisplatyny wynosiła 0,5 mg/kg/dzień. Dawka paklitaxelu wynosiła 1 mg/kg/dzień. Guzy pobrano i zważono w dniu 30. n = 7=10 myszy w grupie.

W drugim badaniu nowotwory jajników leczono dootrzewnowymi dawkami nośników, p53 Ad, cisplatyna plus paklitaxel, lub wszystkich trzech leków jednocześnie. Skojarzenie wszystkich trzech leków zmniejszyło masę guzów o 34% więcej niż połączenie cisplatyna plus paklitaxel, co pokazuje zwiększoną skuteczność skojarzenia trzech leków (p = 0,0006).

Model nowotworu prostaty DU-145:

Skuteczność cisplatyny:

Guzy wewnątrzotrzewnowe DU-145 leczono dootrzewnowymi dawkami nośników, p53 Ad, cisplatyny, lub obu leków. Samce myszy SCID otrzymały zastrzyk 2,5 x 10⁶ komórek DU-145, dootrzewnowo, w dniu 0. Myszy otrzymywały dawki dootrzewnowe w dniach 7, 9, 11, 14 oraz 16. Myszy otrzymały łącznie 0,2 ml łącznej objętości (nośnik 0,1 cisplatyna lub cisplatyna plus 0,1 ml bufora Ad lub p53 Ad). Dawka p53 Ad wynosiła 8,3 x 10⁸ C.I.U./mysz/dzień (2,9 x 10¹⁰ PN). Dawka cisplatyny wynosiła 1 mg/kg/dzień. Guzy pobrano i zważono w dniu 22. Połączenie p53 Ad oraz cisplatyny znacznie zwiększyło skuteczność przeciwrakową w porównaniu z działaniem każdego z leków osobno (p £ 0,0004).

Model nowotworu sutka MDA-MB-468:

Skuteczność cisplatyny:

Rozwinięte nowotwory MDA-MB-468 poddano działaniu nośników, p53 Ad, cisplatyny lub obu leków. Samice myszy SCID otrzymały zastrzyk 1x 1 0⁷ komórek MDA-MB-468 w poduszkę tłuszczową sutka, 11 dni przed rozpoczęciem dawkowania w dniu 0. Dootrzewnowa dawka cisplatyny wynosiła 1 mg/kg/dzień. Dawka doguzowa p53 Ad wynosiła 8,3 x 10⁸ C.I.U./mysz/dzień (1,9 x 10¹⁰ cząsteczek wirusowych) podawana równocześnie w dniach 0-4. p53 Ad miał zwiększoną skuteczność w połączeniu z cisplatyną(dni 8-31, p £ 0,0004).

Skuteczność doksorubicyny:

W drugim eksperymencie nowotwory MDA-MB-468 poddano działaniu nośników, p53 Ad, doksorubicyny lub obu leków. Samice myszy bezfuterkowych otrzymały zastrzyk 1x 10⁷ komórek MDA-MB-468 podskórnie, 12 dni przed rozpoczęciem dawkowania w dniu 0. Dootrzewnowa dawka doksorubicyny wynosiła 4 mg/kg/dzień w dniach 0, 2, 7 i 9. Dawka doguzowa p53 Ad wynosiła 5 x 10⁸

C.I.U./mysz/dzień (1,03 x 1 0¹⁰ cząsteczek wirusowych) w dniach 0-4 i 7-11.

p53 Ad miał zwiększoną skuteczność w połączeniu z doksorubicyną (dni 14-24, p £ 0,05).

Model nowotworu głowy i szyi SCC-15

Skuteczność 5-fluorouracylu:

Guzy podskórne SCC-15 poddano działaniu nośników, p53 Ad, 5-fluorouracylu (5FU) lub obu leków. Myszy SCID otrzymały zastrzyk 5 x 10⁶ komórek SCC-15 podskórnie 7 dni przed rozpoczęciem dawkowania w dniu 0. Dawka dootrzewnowa 5-fluorouracylu wynosiła 50 mg/kg/dzień w 40% roztworze hydroksypropylo-beta-cyclodextranu (Cerestar Inc., Hammond, IN) podawane dootrzewnowo w dniach 0, 7, oraz14 (raz na tydzień w ciągu trzech tygodni). Dawka p53 Ad wynosiła 2x10⁸ C.I.U. (4 x 10⁹ cząsteczek wirusowych), w dniach 0,1, 7, 8,14 i 15 (6 iniekcji do guzowych w ciągu 3 tygo46

PL 193 767 B1 dni). Podano dawkę 5-FU 50 mg/kg. Połączenie p53 Ad oraz 5-FU spowodowało większą aktywność przeciwrakową, niż w przypadku stosowania każdego z leków osobno (p £ 0,04).

p53 z inhibitorem FPT

Wpływ inhibitora transferazy farnesylo-proteinowej w połączeniu z opracowanym wektorem supresora nowotworów oznaczonym A/C/N/53 zbadano in vitro. Następujące przykłady omawiają zdolność adenowirusa z ekspresją p53 stanowiącego wynalazek w połączeniu z inhibitorem FPT oznaczonym „FPT39 (opisanym we wniosku International Application WO 97/23478, złożonym 19 grudnia 1996, gdzie FPT39 jest oznaczonym składnikiem „39,0, patrz strona 95 WO 97/23478) do leczenia nowotworów oraz fakt, że przeciwrakowe leczenie skojarzone w przypadku komórek raka prostaty oraz komórek raka sutka było skuteczniejsze, jeśli chodzi o eliminację komórek nowotworowych, niż każdy z wspomnianych czynników osobno.

Skuteczność antyproliferacyjna rAd5/p53 oraz FPT39 w przypadku nowotworu jajników SK-OV-3

Metody: ludzkie komórki nowotworowe jajników SK-OV-3 (p53^nu) rozdzielono równo na płytki z 96 dołkami w gęstości 250 komórek na dołek w MEM Eagle'a z 10% cielęcą surowicą płodową. Komórki następnie inkubowano w temp. 37°C i 5% CO2 przez 4 godziny. Dodano do każdego dołka FPT39 lub nośnik leku, a i kultura komórkowa rozwijała się przez 3 dni. Po trzech dniach policzono komórki niepoddane działaniu leków w celu ustalenia ilości dodawanego rAd5/p53. Następnie do każdego dołka dodano rAd5/p53 lub nośnik leku i kulturę komórkową hodowano przez następne 3 dni. Proliferację komórkową badano za pomocą analizy MTT. Wskrócie: ok. 25 mlz 5 mg/ml barwnika niezbędnego do analizy MTT [bromek 3-(4,5 dimetylotiazolo-2yl)-2,5-difenylotetrazoliny] dodano do każdego dołka i zostawiono do inkubacji przez 3-4 godz. w temp. 37°C i 5% CO2. Następnie do każdego dołka dodano 100 ml 10% detergentu SDS i pozostawiono na noc w temp. 37°C i 5% CO2. Fluorescencję w każdym dołku obliczono za pomocą czytnika mikropłytek Molecular Devices. Dane proliferacji komórek zanalizowano metodą statystyczną Thin Plate Spline O'Connella i Wolfingera (1997) J. Comp. Graph. Stat. 6: 224-241.

Wyniki: rAd5/p53 oraz FPT39 posiadają kumulacyjną skuteczność w hamowaniu wzrostu komórek.

W tym eksperymencie nie wykazano ani synergizmu (p > 0,05) ani antagonizmu (p > 0,05).

Antyproliferacyjna i synergiczna skuteczność rAd5/p53 i FPT39 (inhibitor FPT) w przypadku komórek nowotworowych prostaty DU-145

Metody: Ludzkie komórki nowotworowe prostaty DU-145 ^53™) poddano działaniu FPT39 lub nośnika leku, oraz rAd5/p53, następnie kultury komórek zanalizowano, jak to opisano powyżej dla komórek nowotworowych jajników SK-OV-3. Eksperyment powtórzono dwukrotnie.

Wyniki: Eksperyment 1: rAd5/p53 oraz FPT39 posiadają kumulacyjną skuteczność w hamowaniu wzrostu komórek. Nie wykryto ani synergizmu (p > 0,05), ani antagonizmu (p > 0,05) w tym eksperymencie.

Eksperyment 2: rAd5/p53 oraz FPT39 posiadają synergicznąskuteczność (p = 0,0192). Powyższe wyniki wskazują, że rAd5/p53 i FPT39 mogą współdziałać i posiadać skuteczność synergiczną w zwalczaniu proliferacji komórek nowotworowych prostaty.

Antyproliferacyjna i synergiczna skuteczność rAd5/p53 i FPT39 (inhibitor FPT) w przypadku komórek nowotworowych sutka MDA-MB-231

Metody: Ludzkie komórki raka piersi MDA-MB-231 ^53™) poddano działaniu FPT39 lub nośnika leku oraz rAd5/p53, następnie kultury komórek zanalizowano, jak to opisano powyżej dla komórek nowotworowych jajników SK-OV-3. Eksperyment powtórzono dwukrotnie.

Wyniki: Eksperyment 1: rAd5/p53 oraz FPT39 posiadają kumulacyjną skuteczność. Nie wykryto synergizmu (p > 0,05) w niniejszym eksperymencie.

Eksperyment 2: rAd5/p53 oraz FPT39 posiadają kumulacyjną skuteczność na większości powierzchni reakcji. Jednakże synergizm pojawiał się przy izobolach większych lub równych 70 (tj. mniej niż 30% komórek zginęło, p = 0,0001). Wyniki wskazują, że rAd5/p53 i FPT39 mogą współdziałać i posiadać skuteczność synergiczną w zwalczaniu proliferacji komórek nowotworowych raka piersi u ludzi.

P r z yk ład 7

Profil odpowiedzi immunologicznej u pacjentów z przerzutowym rakiem wątroby leczonych wektorem adenowirusa zawierającym p53

PL 193 767 B1

Wynalazek pozwala na skojarzone stosowanie in vivo kwasu nukleinowego z ekspresją p53 i innych czynników chemoterapeutycznych w leczeniu nowotworów.

Poniższy przykład opisuje zdolność adenowirusa z ekspresją p53 stanowiącego wynalazek do zwiększania poziomu limfocytów zabijających nowotwory w raku wątroby u ludzi.

Celem tego badania było określenie genotypów i fenotypów limfocytów przenikających do guzów (TIL) w przerzutowych rakach wątroby z okrężnicy zawierających mutacje p53 (dyskusja na temat TIL, patrz np. Wang (1997) Mol. Med. 3: 716-731; Marrogi (1997) Int. J. Cancer 74: 492-501).

Łącznie leczono 16 pacjentów ze zwiększającymi się dawkami, 10⁹ - 10¹¹ cząsteczek, poprzez cewnikowanie tętnicy wątrobowej z wektorem adenowirusa przenoszącym gen p53 wild.

Łącznie przeprowadzono cztery biopsje u każdego pacjenta 3 do 7 dni po podaniu wektora adenowirusa. Przeprowadzono analizę immunohistochemiczną na zamrożonych tkankach uzyskanych z normalnej wątroby i miejsc łączności tkanki guza i żywiciela.

Przeprowadzono analizę obrazu wspomaganą komputerowo, aby oszacować immunoreaktywność na następujące przeciwciała monoklonalne: CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD56, HLA-DR, IFN-gamma, TNF-alpha oraz IL-2.

Zaobserwowano zwiększenie populacji limfocytów TIL (CD3⁺ oraz CD4⁺) z maksymalną liczbą cząsteczek 7,5 x 10¹⁰. Przy wyższych dawkach zaobserwowano zmniejszenie populacji CD3⁺ o CD4⁺.

Zaobserwowano odwrotną korelację dla komórek CD8⁺. Przy wyższej dawce (2,5 x 10¹¹) zaobserwowano zwiększenie populacji CD3⁺, CD4⁺ i CD8⁺ w guzie w porównaniu z normą.

Wyniki wskazują, że dostarczanie dużych dawek cząsteczek adenowirusów powoduje zwiększenie populacji limfocytów TIL składającej się z CD4⁺ i CD8⁺.

Zaznacza się, że przykłady i opisy podane w niniejszym opisie służą tylko celom poglądowym, a różne zmiany i modyfikacje w tychże, zaproponowane przez osoby biegłe w przedmiotowej dziedzinie, uwzględni się zgodnie z istotą i literą niniejszego wynalazku i zakresem załączonych dokumentów.

Wszystkie publikacje, patenty i zgłoszenia patentowe wymienione w niniejszym dokumencie są niniejszym włączone jako dokumentacja do wszelkich zastosowań.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie kompozycji farmaceutycznej do leczenia rakowych lub hiperproliferujących komórek ssaków, znamienne tym, że stosuje się kompozycję farmaceutyczną zawierającą białko supresorowe guza zawierające białko p53 typu dzikiego albo kwas nukleinowy supresorowego guza, który koduje białko supresorowe guza zawierające białko p53 typu dzikiego, i paklitaksel albo 4-(2-{4-[(1 1R)-3,10-dibromo-8-chloro-6,1 1-dihydro-5H-benzo[5,6]cyklohepta[1 ,2-b]pirydyno-1 1-yl]piperydyno-1-yl}-2-oksoetyl)piperydyno-1-karboksyamid (FPT39) jako inhibitor transferazy farnezylo-białkowej.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że stosuje się czynnik chemoterapeutyczny w postaci cisplatyny.
3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że jako kwas nukleinowy supresorowego guza stosuje się kwas nukleinowy zawarty w wektorze wybranym z grupy składającej się z nieosłoniętego plazmidu DNA, plazmidu w liposomie, plazmidu złożonego z lipidu, wektora wirusowego, wektora AAV i rekombinowanego wektora adenowirusowego.
4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że jako wektor stosuje się A/C/N/53.
5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wymieniony kwas nukleinowy supresorowego guza jest przygotowywany do wprowadzania w całkowitej dawce rzędu od 1 x 10⁹ do 7,5 10¹⁵ cząstek adenowirusa, w sposobie dawkowania wybranym z grupy składającej się z: całkowitej dawki podanej jednorazowo, całkowitej dawki podzielonej na 5 dni i podawanej codziennie, całkowitej dawki podzielonej na 15 dni i podawanej codziennie i całkowitej dawki podzielonej na 30 dni i podawanej codziennie, jednocześnie wymieniony paklitaksel jest przygotowany do ₂ podawania w całkowitej dawce w zakresie od 75 do 350 mg/m² na 24 godziny sposobem dawkowania wybranym z grupy składającej się z: całkowitej dawki podanej jednorazowo, całkowitej dawki podawanej codziennie 1 i 2 dnia, całkowitej dawki podawanej codziennie 1, 2 i 3 dnia, całkowitej dawki podawanej codziennie przez 15 dni, całkowitej dawki podawanej codziennie przez 30 dni, we wlewie ciągłym podawanym codziennie przez 15 dni, we wlewie ciągłym podawanym codziennie przez 30 dni.

PL 193 767 B1
6. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia rakowych lub hiperproliferujących komórek ssaków, znamienna tym, że zawiera białko supresorowe guza zawierające białko p53 typu dzikiego albo kwas nukleinowy supresorowego guza, który koduje białko supresorowe guza zawierające białko p53 typu dzikiego, i paklitaksel albo 4-(2-{4-[(11R)-3,10-dibromo-8-chloro-6,11-dihydro-5H-benzo[5,6]cyklohepta[1,2-b]pirydyno-11-yl]piperydyno-1-yl}-2-oksoetyl)piperydyno-1-karboksyamid (FPT39) jako inhibitor transferazy farnezylo-białkowej.
7. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 6, znamienna tym, że dalej zawiera czynnik chemoterapeutyczny w postaci cisplatyny.
8. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 6, znamienna tym, że kwas nukleinowy supresorowego guza jest zawarty w wektorze wybranym z grupy składającej się z nieosłoniętego plazmidu DNA, plazmidu w liposomie, plazmidu złożonego z lipidu, wektora wirusowego, wektora AAV i rekombinowanego wektora adenowirusowego.
9. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 8, znamienna tym, że wymieniony wektor stanowi A/C/N/53.