CN101429551B - Hmg-1基因核酸原位杂交检测试剂盒和检测方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种癌症早期的原位杂交检测试剂盒，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物、增效剂，其中所述的杂交探针序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还提供了一种HMG-1基因的原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤：a、将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；b、检测a步骤得到的杂交复合体。本发明另外还提供了试剂盒在制备检测癌症早期疾病药物中的应用。本发明优点在于：本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点；本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

Description

HMG-1基因核酸原位杂交检测试剂盒和检测方法与应用

技术领域

本发明涉及生物检测和疾病诊断领域，更具体地涉及癌症的基因检测技术。

背景技术

根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数170万，死亡人数近160万，患者600万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800万，患者约有8400万人，到2020年以上人数将翻一番，这是一组可怕的数字。

2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等多家单位做了一个年度报告，“认为人类在抗癌大战中是失败”，也就是说癌症死亡率没有降低，其列举出造成抗癌大战失败的几个因素是：1.肿瘤细胞异质性；2.肿瘤细胞耐药性；3.抗癌药物设计思路不完善等。同时，该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌症的措施。前段时间财经杂志的文章报道大标题：中国在抗癌战斗中大溃败。

本发明人在研究中发现，导致癌症死亡率不降的另二个重要原因是：1.不能做到真正的早期诊断；2.转移的病理机制不清楚。依照传统的医学影像及和其它生化(如蛋白标记物)指标来诊断癌症，认为占位性癌块在2公分下是属于早期癌症的诊断(更小些有时无症状体征)，这一概念值得认真讨论。影像医学的2公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度，1公分的肿块约有一亿个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止2亿个肿瘤细胞，从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块，其病理演变过程相当长，可能是一年或两年、甚至三年以上，很难证实的是在这个过程中，肿块是癌症唯一的发生地和单独的病灶。临床上已证实：一旦形成肿块的同时，其他癌细胞通过不同途径迁移到其他部位克隆生长；一旦切除原发灶后，其他器官复发灶或多发癌块灶先后形成或转移。因此，在临床上以2公分以下的肿块大小来界定早期与否，不够严谨，这时已经是晚期了，这是导致癌症死亡率不降的真正原因。美国的健康机构都认为早期诊断是降低死亡率和降到医疗成本的关键。

癌症的发生演变过程和癌基因得能、抑癌基因的失能以及癌症转移基因的得能和癌症转移抑制基因的失能有关，也是多基因疾病。随着分子生物学技术日益完善，功能基因组学，疾病基因组学和癌症基因组学研究的深入开展，至今，有可能在基因水平上做到更科学的早期诊断，特别是在癌变前期或癌细胞形成(单克隆时)、突破血管壁早期转移时，就能做到早期预测诊断。

HMG-1基因是一种致癌基因，它的过度表达引起白血病和人类其它癌症的发生。John Hopkins儿童中心研究人员利用遗传工程小鼠技术发现了HMG-1的过度表达可导致儿童和成人白血病及其它癌症的发生。他们使用七只在淋巴组织和白细胞上过度表达HMG-1基因的遗传工程或转基因小鼠，发现每只小鼠都很快发展为人类白血病和淋巴瘤的病例。七只转基因小鼠携带1至28个HMG-1基因复制，所有小鼠都在1至8个月内出现淋巴瘤并死亡。一只小鼠被成功的繁殖建立了遗传工程鼠系，子系小鼠也都发生了恶性淋巴瘤，多数情况下淋巴瘤发生在动物的胸腺，脾脏，骨髓，淋巴结和外周血与白血病类疾病发展过程一致。这些小鼠百分之百的早期发生恶性病变的事实提供的直接证据，证明过度表达HMG-1基因与癌症之间关系。同时在人类白血病的骨髓标本中该基因表达亦过度，而HMG-1基因过度表达是如何干扰正常细胞生长，导致人类癌症和白血病发生，研究人员推测该基因的蛋白参与转录调节过程有关。过度表达的HMG-1可能与细胞内的信号移动有关，有文章报道严重烧伤和脓毒血症(炎症)，机体细胞的修复生长及炎症时细胞因子迁移时均有HMG-1表达过度的现象。因此，当发生癌症和白血病时，癌细胞和白血病细胞在体内迁移和转移，HMG-1基因会表达过度。同样，肿瘤的病理学程度不同，HMG-1基因的表达量也各不相同，恶性程度高的HMG-1基因的表达水平高：轻度是18.2％；中度是60％；重度的是83.3％。以上的信息提示，HMG-1基因的表达水平与肿瘤的病理演变的程度有关。

已往对HMG-1基因的研究都采用高通量基因芯片技术，而这些方法多用于科研方面，不适应临床应用，特别是个性化的应用在我国现阶段没有报道。

中国专利文献CN1556221公开了“IC53基因及其相关产物诊断和治疗结肠癌的用途及一种诊断结肠癌的试剂盒”。中国专利文献CN1769485公开了“栉孔扇贝病原类立克次氏体的原位杂交检测方法及其试剂盒”。中国专利文献CN1556410公开了“一种鱼类病毒的检测试剂盒及其检测方法”。中国专利文献CN1680597公开了“一种用于定量检测丙型肝炎病毒(HCV)的荧光定量PCR试剂盒”。中国专利文献CN2918435，公开了“一种检测肥胖相关基因SNP的寡核苷酸芯片及试剂盒”。但是，关于HMG-1基因的原位杂交检测试剂盒及其检测技术未见报道。

本发明采用核酸原位杂交技术在单细胞水平上观察HMG-1基因的表达量和表达程度，及对临床各类癌症和白血病患者的血液标本进行检测分析，发现该基因与癌症和白血病患者的病理演变和转移有密切相关，从HMG-1基因表达量的变化，早期从基因水平来检测癌基因的表达情况，对临床癌症和白血病的病理演变和转移的诊断有非常重要的临床意义。

发明内容

为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

本发明首先提供一种HMG-1基因核酸原位杂交检测试剂盒，其包括杂交探针和标记物，其中，所述的杂交探针分别具有序列表SEQ ID NO：1所示序列，其分别为HMG-1基因的DNA或RNA序列。其中，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物，所述的放射性核素选自³H、³⁵S、¹²⁵I或³²P中的一种，所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种，所述的非放射性标记物优选自地高辛。

本发明试剂盒的一个优选方案是还包括增强剂(碱性磷酸酶抗体，购买自罗氏公司)。

本发明的白血病和癌症早期HMG-1基因诊断试剂盒应用价值在于，能在基因水平及早对白血病和癌症的发生做检测，一旦病理演变到癌前变时，就采取治疗，降低癌症的死亡率和发病率。

本发明还提供一种HMG-1基因原位杂交的检测方法，包括以下步骤：

(1)在上面所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和

(2)检测所述杂交复合体。

本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的可形成稳定杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16—24小时。

本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的底物选用人的血液白细胞标本或其他器官组织细胞标本。更优选地是，所述的血液标本或肿瘤组织细胞标本。

本发明所述的检测方法，对象是白血病和癌症病人。

本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结合，以HMG-1基因为检测对象，合成探针是HMG-1基因的DNA或RNA序列，检测的底物是人体血液标本白细胞或肿瘤组织细胞的RNA的表达量。原位杂交技术的显示方法能提供HMG-1基因的半定量或定量表达程度判定。根据杂交后免疫组化显色判定以上基因的表达量，正常人HMG-1基因不表达，即不显色，HMG-1基因在白血病和癌症病人高表达，即深显色，该基因在很多癌症都有高表达，有特异和广谱性，临床意义非常重大。

本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告。

1.仪器操作：

1).将待测标本放入反应槽中；

2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；

3).仪器自动弃去液体，自动后固定；

4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42℃)；

5).仪器自动弃去液体，自动清洗；

6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42℃)；

7).仪器自动弃去液体，自动清洗；

8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；

9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；

10).取出封片镜检。

本核酸原位杂交的流程图是分子生物学业内人士均熟知的杂交探针的制作、标本处理、预杂交、杂交、结果检测分析的全过程。

附图说明

图1是本发明实施例肝癌病人的HMG-1基因表达图。

图2是本发明实施例白血病症病人HMG-1基因表达图片。

图3是本发明实施例中正常人HMG-1基因表达图片。

具体实施方式

下面将根据流程图过程，展开实施的步骤，更具体地说明本发明的内容。应该理解，下面的实施例用于说明而非限定本发明内容，任何形式上的改变或变通将落入本发明的保护范围。

实施例1

按照常规方法制备本实施例的原位杂交试剂盒，该试剂盒包括以HMG-1基因为检测目的基因设计的杂交探针、标记物，其中：

本实施例的探针标记物选用地高辛。

试剂盒组成：

消化液          100μL/管          1管/盒           无色透明液体

保护液          100μL/管          1管/盒           无色透明液体

预杂交液        1300μL/管         2管/盒           无色透明液体

正义杂交液      10μL/管           1管/盒           无色透明液体

反义杂交液      10μL/管           1管/盒           无色透明液体

封闭液          1000μL/管         1管/盒           无色透明液体

碱性磷酸酶抗体  1μL/管            1管/盒           无色透明液体

显色剂A         175μL/管          1管/盒           黄色液体

显色剂B         320μL/管          1管/盒           无色透明液体

缓冲液I10x      90mL/瓶           1瓶/盒           浅黄色或无色透明液体

缓冲液II10x     80mL/瓶           1瓶/盒           浅黄色或无色透明液体

缓冲液III10x    20mL/瓶           3瓶/盒           浅黄色或无色透明液体

缓冲液IV10x     90mL/瓶           1瓶/盒           浅黄色或无色透明液体

固定液          90mL/瓶           1瓶/盒           无色透明液体

阳性对照标本    6片/盒

上述试剂成分说明：(所有试剂购自SIGMA)

1.消化液：20mg/mL蛋白酶K，100mg蛋白酶K，加DEPC-H₂O5mL；

2.保护液：0.2g的glycine加入1mL的1×缓冲液I；

3.预杂交液：1×缓冲液II7.5mL

50×D3mL

10mg/ml yest t-RNA750uL

11mg/ml SALMON TESTES DNA 682uL

0.04M EDTA 3mL

50％ formamide 15mL

4.封闭液：0.03g的bloking(购买自罗氏公司)加入1mL1×缓冲液III；

5.10x缓冲液I：(PH7.1-7.4)

NaCl 80g

Na₂HPO₄.12H2O 360g

KCl 2g

KH₂PO₄2g

加三蒸水至1L，并高压灭菌；

6.10x缓冲液II：(PH7.0)

NaCl 175.3g

柠檬酸钠 88.2g

HCl 几滴

加三蒸水至1L，并高压灭菌；

7.缓冲液III：(PH7.9)

Tris 121.1g

NaCl 87.66g

HCl 60mL左右

加三蒸水至1L，并高压灭菌；

8.缓冲液IV：

1M Tris-HCl(PH9.5)：Tirs121.1g加HCl 3ml左右，加水900mL，调PH至9.5，加水至1L，并高压灭菌；

1M NaCl：NaCl 58.44加水至1L，并高压灭菌；

0.5M MgCl₂：101.65g MgCl₂.6H₂O加水至1L，并高压灭菌；

9.固定液：多聚甲醛40g加1×缓冲液I至1L，稍加热(约50-60度)搅拌至溶解；

10.显色剂A：NBT 1g加70％DMF11.44mL；

11.1显色剂B：BCIP1g加100％DMF30mL。

实施例2

标本处理：

1).用10ml的离心管，装4.5ml淋巴细胞分离液，再将3ml抗凝血缓慢加入含有淋巴细胞分离液(血：淋巴细胞分离液＝1:1.5)的离心管中，2000r/min离心10min

2).吸取中间层白细胞至另一离心管中，再在此管中加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10min

3).弃上清.沉淀加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10min

4).弃上清，并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。再将沉淀制成悬液，滴在玻片上推片，自然干燥。(有条件的医院可以用制片机制片。)3ml血，可以做4张片子。

5).用40ml4％固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用1×缓冲液I洗5min。每缸可以放16片。

6)标本可保存在-20℃，或继续做实验。

实施例3

将试剂盒中试剂配制成使用浓度

1).将10×缓冲液I用三蒸水按1:10稀释成1×缓冲液I；

2).将20×缓冲液II用三蒸水按1:10稀释成2×缓冲液II；

按1:100稀释成0.2×缓冲液II；按1:200稀释成0.1×缓冲液II；

3).将10×缓冲液III用三蒸水按1:10稀释成1×缓冲液III；

4).10×缓冲液IV用三蒸水按1:10稀释成×缓冲液IV(取1#，2#，3#各10mL，加水至100mL既可)。

实施例4

实验步骤：

1).取每位待检者标本两张，(另外两张留作复查用)及阳性对照标本两张(每次实验做一对阳性对照)。

2).在玻璃缸里加消化液(消化液100ul加1×缓冲液199.9ml，即为使用浓度)20ml。37℃水浴预热10分钟。放进16张玻片，37℃处理12min，再用1×缓冲液I洗5min.

3).用0.2％的保护液(保护液1ml加1×缓冲液I99ml即为使用浓度)洗10min，三蒸水洗5min，以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥。

4).将玻片放入保湿盒内，加预杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中3h以上。

5).取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70％，90％，95％的乙醇各洗2min，自然干燥

6).将玻片放入保湿盒内，每位病人标本两张，一张加正义杂交液20ul/片，另一张加反义杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中16-24h。

7).取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内

在42℃恒温水浴箱中用2×缓冲液II洗两次，每次15min

在42℃恒温水浴箱中用0.2×缓冲液II洗一次，每次15min

在42℃恒温水浴箱中用0.1×缓冲液II洗两次，每次15min

8).用1×缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥

9).将玻片放入保湿盒内，加0.5％1封闭液(1ml封闭液加5ml1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min。

10).取出玻片，用1×缓冲液III洗30s，自然干燥

11).将玻片放入保湿盒内，加碱性磷酸酶抗体(加入1.8ml1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒在室温下作用30min

12).取出玻片，用1×缓冲液III洗3次，每次15min

13).1×缓冲液IV洗2min，加显色剂(显色剂A73.3ul，显色剂B157.5ul加到30ml1×缓冲液IV中，混匀)，室温避光12h以上

14).用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10％的1×缓冲液I混匀)封片镜检

实施例5

结果判断：

在光镜下计数100-300个细胞，计算染上紫色细胞的百分比。

阳性对照标本加反义杂交液的应该80％以上染上紫色。

所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。

本发明的一个优选实施例的方案是：以HMG-1基因为目的基因合成的核酸探针用地高辛标记(地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。从而获得癌症的诊断信息。一个试剂盒可以多人份使用或一人份使用。

实施例6

白血病人10名，淋巴瘤癌病人5名，正常对照组10名。抽所有待检人的外周血3-5毫升(分离白细胞)做原位杂交。结果表示，所有癌症患者HMG-1基因有过度表达，细胞染色；正常对照组HMG-1基因不表达，细胞无染色。具体结果请见图1是淋巴瘤癌病人的HMG-1基因表达图，图2是白血病症病人HMG-1基因表达图片，图3是正常人HMG-1基因表达图片。

本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物，以及影像医学检查有显著不同。本发明可以在基因水平上(癌变前期或癌细胞增殖)检测HMG-1基因异常表达，在影像医学检查及其它检查未发现占位性癌块病灶之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿块之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床癌症病患一个真正的早期诊断。这样才有可能实施癌症的早期诊断、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根除癌症恶疾。

此外，本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点，同时，本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>芮屈生物技术(上海)有限公司

<120>HMG-1基因核酸原位杂交检测试剂盒和检测方法与应用

<130>/

<150>200710171733.1

<151>2007-11-30

<160>1

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>648

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

Claims (6)

1.一种HMG-1基因核酸原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其特征在于：所述的杂交探针序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的放射性核素选自³H、³⁵S、¹²⁵I或³²P中的一种。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。

5.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述的非放射性标记物优选自地高辛。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。

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