CN101429554B

CN101429554B - Hccr基因核酸原位杂交检测试剂盒和检测方法和应用

Info

Publication number: CN101429554B
Application number: CN2008101796126A
Authority: CN
Inventors: 裘建英; 张云福
Original assignee: SUZHOU FUYING GENE TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: Li Xueying
Priority date: 2007-11-30
Filing date: 2008-11-25
Publication date: 2011-05-25
Anticipated expiration: 2028-11-25
Also published as: CN101429554A

Abstract

本发明涉及一种HCCR(Human cervical cancer oncogene binding protein)基因癌症早期的原位杂交检测试剂盒，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，其中所述的杂交探针序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还提供了一种HCCR基因的原位杂交检测方法。本发明的检测试剂盒和检测方法能在基因水平检测癌变前期或癌变细胞中HCCR基因的表达量，早于蛋白标记物产生以前、更早于肿瘤形成以前，就能检测HCCR基因变化信息，做到真正意义上肿瘤的早期诊断。本发明优点在于：提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点；检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

Description

HCCR基因核酸原位杂交检测试剂盒和检测方法和应用

技术领域

本发明涉及生物检测和疾病诊断领域，更具体地涉及癌症的基因检测技术。

背景技术

根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数170万，死亡人数近170万，患者600多万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800万，患者约有8400万人，到2020年以上人数将翻一番。男性癌症发病率和发生部位以肺、肝、胃依次排列；女性是乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌依次排列，以上几种癌症已占总癌症病例的一半以上。

2005年美国国立卫生院(NIH)癌症研究院、疾控中心等多家单位对“抗癌大战”进行年度回顾，认为人类在抗癌战役中，没有取得胜利，原因是癌症死亡率没有降低。年度报告中指出几个问题与失败有关：1.动物模型设计有缺陷；2.癌细胞多态性；3.癌细胞的耐药性。中国的财经杂志在今年八月份也发表了中国在癌症战役中大溃败的文章。本发明人在研究中认识到，应该补充二个重要的内容：早期诊断乏力；癌症转移机制的研究不够。

以往早期诊断的概念有待进一步的探讨，传统的生化指标和医学影像的早期诊断，实际不是真正科学的早期诊断，特别是以肿块2公分以下属于早期这一界定，是导致癌症死亡率不降的真实原因。以细胞学的角度，1公分的肿块约有一亿个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加的数目远不止2亿个肿瘤细胞。同样生化检测对早期诊断有时会不敏感，比如AFP对早期肝癌的诊断敏感度不高，超过2公分以下的肝癌阳性率较低。事实上，从单克隆的癌细胞到癌块在2公分左右，已有相当长时间的病理演变过程，可能是一年或两年，甚至更长。这个过程难以证实肿块是唯一的发生地和孤独的癌症病灶。一旦形成肿块的同时，其他癌细胞通过不同途径迁移到其他部位克隆生长或在同一器官有多个发源地，快慢不均的生长。这在临床上已得到了证实，一旦肿块被切除后，其他部位或脏器有转移或复发。因此，临床上以2公分以下的肿块大小来界定早期与否，不够严谨(当然有些病例在发现原发病灶时，也发现转移灶，这种情况不是我们要表述的内容)，这是导致癌症死亡率不降的真正原因。

随着分子生物学和肿瘤分子病理生理学，功能基因组学，疾病基因组学，癌症基因组学的研究深入，以及分子生物技术的日益完善，至今有可能在癌变前期或癌细胞形成(单克隆时)或突破血管壁早期转移时，就能做到早期预测诊断，这一技术的实施可能是肿瘤诊治方法的一次革命。做到更科学的早期诊断、早期预防、早期治疗，希望彻底治愈癌症。

本发明的癌症早期诊断试剂盒的临床价值和创新点在于基因水平，即癌变前期或癌变细胞中检测与肝癌，乳腺癌，卵巢癌，子宫颈癌等有关的癌症密切相关的HCCR基因的表达程度，早于蛋白标记物产生以前，当然更早于肿瘤形成之前，检测HCCR基因的变化信息，做到真正意义上的早期诊断。

HCCR基因被发现与肝癌，子宫颈癌，乳腺癌，卵巢癌等发生密切相关。实验研究表明HCCR基因在细胞培养中促进不同种类癌细胞增长作用。实验研究和临床研究表现HCCR基因在子宫颈癌，乳腺癌，卵巢癌及肝癌等癌症中表达增加。已有学者用HCCR蛋白作为靶标记物来检测宫颈癌，乳腺癌，卵巢癌及肝癌的发生率。在上述癌症患者中，HCCR蛋白表达异常高，可以作癌症检查的生物标志物。

本发明公开的癌症早期基因诊断试剂盒是采用核酸原位杂交技术，以HCCR基因为癌基因为检测对象。HCCR基因的序列全长523bp(Human cervical canceroncogene binding protein)，位于染色体12q的位点上，合成的探针是HCCR基因的DNA序列，探测的底物是人体血液标本的白细胞或组织细胞的mRNA。原位杂交技术的显色能提供HCCR基因半定量表达程度判定，正常人HCCR基因不表达。前述的癌症病患有不同程度的高表达。

发明内容

为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

本发明首先提供一种原位杂交检测试剂盒，其包括杂交探针和标记物，其中，所述的杂交探针分别具有序列表SEQ ID NO：1所示。基因的核苷酸序列长度是523bp，位于染色体12q位点上。其中，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物，所述的放射性核素选自³H、³⁵S、¹²⁵I或³²P中的一种，所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种，所述的非放射性标记物优选自地高辛，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。

本发明的癌症早期诊断、转移复发基因诊断试剂盒应用价值在于，能在基因水平，及早对癌症的发生和转移，以及在治疗后及早检测癌症复发转移的病变情况，因HCCR基因与癌症的发生有特异相关，是致癌基因。

本发明还提供一种HCCR基因原位杂交的检测方法，包括以下步骤：

(1)在上面所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和

(2)检测所述杂交复合体。

本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的可形成稳定杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16—24小时。

本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的底物选用人的血液白细胞标本或其他器官组织细胞标本。更优选地是，所述的血液标本或其他器官组织细胞标本来自癌症和/或伴有转移灶的患者、健康人。

本发明所述的检测方法，其中优选地是肝癌、乳腺癌、子宫癌、肺癌、脑癌。

本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结合，以HCCR基因为检测对象，合成探针是HCCR基因的DNA或RNA序列，检测的底物是人体血液标本白细胞或组织细胞的RNA的表达量。原位杂交技术的显示方法能提供HCCR基因的半定量或定量表达程度判定。根据杂交后免疫组化显色判定以上两基因的表达量，正常人HCCR基因不表达，HCCR基因在癌症病人高表达，和正常人有显著差异。

本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括：

1.仪器操作：

1).将待测标本放入反应槽中；

2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；

3).仪器自动弃去液体，自动后固定；

4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42℃)；

5).仪器自动弃去液体，自动清洗；

6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42℃)；

7).仪器自动弃去液体，自动清洗；

8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；

9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；

10).取出封片镜检。

本核酸原位杂交的流程图是分子生物学业内人士均熟知的杂交探针的制作、标本处理、预杂交、杂交、结果检测分析的全过程。

附图说明

图1是本发明实施例中肝癌病人HCCR基因过量表达图片

图2是本发明实施例中正常人HCCR基因过量表达图片。

具体实施方式

下面将根据流程过程，展开实施的步骤，更具体地说明本发明的内容。应该理解，下面的实施例用于说明而非限定本发明内容，任何形式上的改变或变通将落入本发明的保护范围。

实施例1

按照常规方法制备本实施例的原位杂交试剂盒，该试剂盒包括以DLK1基因为检测目的基因设计的杂交探针、标记物、说明书，其中：

本实施例的探针标记物选用地高辛。

试剂盒组成：

消化液 100μL/管 1管/盒无色透明液体

保护液 100μL/管 1管/盒无色透明液体

预杂交液 1300μL/管 2管/盒无色透明液体

正义杂交液 10μL/管 1管/盒无色透明液体

反义杂交液 10μL/管 1管/盒无色透明液体

封闭液 1000μL/管 1管/盒无色透明液体

碱性磷酸酶抗体 1μL/管 1管/盒无色透明液体

显色剂A 175μL/管 1管/盒黄色液体

显色剂B 320μL/管 1管/盒无色透明液体

缓冲液I10x 90mL/瓶 1瓶/盒浅黄色或无色透明液体

缓冲液II10x 80mL/瓶 1瓶/盒浅黄色或无色透明液体

缓冲液III10x 20mL/瓶 3瓶/盒浅黄色或无色透明液体

缓冲液IV10x 90mL/瓶 1瓶/盒浅黄色或无色透明液体

固定液 90mL/瓶 1瓶/盒无色透明液体

阳性对照标本 6片/盒

上述试剂成分说明：(所有试剂购自SIGMA)

1.消化液：20mg/mL蛋白酶K，100mg蛋白酶K，加DEPC-H₂O5mL；

2.保护液：0.2g的glycine加入1mL的1×缓冲液I；

3.预杂交液：1×缓冲液II7.5mL

50×D3mL

10mg/ml yest t-RNA750uL

11mg/ml SALMON TESTES DNA 682uL

0.04M EDTA 3mL

50％formamide 15mL

4.封闭液：0.03g的bloking(购买自罗氏公司)加入1mL1×缓冲液III；

5.10x缓冲液I：(PH7.1-7.4)

NaCl 80g

Na₂HPO₄.12H2O 360g

KCl 2g

KH₂PO₄ 2g

加三蒸水至1L，并高压灭菌；

6. 10x缓冲液II：(PH7.0)

NaCl 175.3g

柠檬酸钠 88.2g

HCl 几滴

加三蒸水至1L，并高压灭菌；

7.缓冲液III：(PH7.9)

Tris 121.1g

NaCl 87.66g

HCl 60mL左右

加三蒸水至1L，并高压灭菌；

8.缓冲液IV：

1M Tris-HCl(PH9.5)：Tirs121.1g加HCl 3ml左右，加水900mL，调PH至9.5，加水至1L，并高压灭菌；

1M NaCl：NaCl 58.44加水至1L，并高压灭菌；

0.5M MgCl₂：101.65g MgCl₂.6H₂O加水至1L，并高压灭菌；

9.固定液：多聚甲醛40g加1×缓冲液I至1L，稍加热(约50-60度)搅拌至溶解；

10.显色剂A：NBT1g加70％DMF11.44mL；

11. 1显色剂B：BCIP1g加100％DMF30mL。

实施例2

标本处理：

1).用10ml的离心管，装4.5ml淋巴细胞分离液，再将3ml抗凝血缓慢加入含有淋巴细胞分离液(血:淋巴细胞分离液＝1:1.5)的离心管中，2000r/min离心10min

2).吸取中间层白细胞至另一离心管中，再在此管中加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10min

3).弃上清.沉淀加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10min

4).弃上清，并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。再将沉淀制成悬液，滴在玻片上推片，自然干燥。(有条件的医院可以用制片机制片。)3ml血，可以做4张片子。

5).用40ml4％固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用1×缓冲液I洗5min。每缸可以放16片。

6)标本可保存在-20℃，或继续做实验。

实施例3

将试剂盒中试剂配制成使用浓度

1).将10×缓冲液I用三蒸水按1:10稀释成1×缓冲液I；

2).将20×缓冲液II用三蒸水按1:10稀释成2×缓冲液II；

按1:100稀释成0.2×缓冲液II；按1:200稀释成0.1×缓冲液II；

3).将10×缓冲液III用三蒸水按1:10稀释成1×缓冲液III；

4).10×缓冲液IV用三蒸水按1:10稀释成×缓冲液IV(取1#，2#，3#各10mL，加水至100mL既可)。

实施例4

实验步骤：

1).取每位待检者标本两张，(另外两张留作复查用)及阳性对照标本两张(每次实验做一对阳性对照)。

2).在玻璃缸里加消化液(消化液100ul加1×缓冲液199.9ml，即为使用浓度)20ml。37℃水浴预热10分钟。放进16张玻片，37℃处理12min，再用1×缓冲液I洗5min.

3).用0.2％的保护液(保护液1ml加1×缓冲液I99ml即为使用浓度)洗10min，三蒸水洗5min，以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥。

4).将玻片放入保湿盒内，加预杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中3h以上。

5).取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70％，90％，95％的乙醇各洗2min，自然干燥

6).将玻片放入保湿盒内，每位病人标本两张，一张加正义杂交液20ul/片，另一张加反义杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中16-24h。

7).取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内

在42℃恒温水浴箱中用2×缓冲液II洗两次，每次15min

在42℃恒温水浴箱中用0.2×缓冲液II洗一次，每次15min

在42℃恒温水浴箱中用0.1×缓冲液II洗两次，每次15min

8).用1×缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥

9).将玻片放入保湿盒内，加0.5％1封闭液(1ml封闭液加5ml1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min。

10).取出玻片，用1×缓冲液III洗30s，自然干燥

11).将玻片放入保湿盒内，加碱性磷酸酶抗体(加入1.8ml1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒在室温下作用30min

12).取出玻片，用1×缓冲液III洗3次，每次15min

13).1×缓冲液IV洗2min，加显色剂(显色剂A73.3ul，显色剂B157.5ul加到30ml1×缓冲液IV中，混匀)，室温避光12h以上

14).用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10％的1×缓冲液I混匀)封片镜检

实施例5

结果判断

在光镜下计数100-300个细胞，计算染上紫色细胞的百分比。

阳性对照标本加反义杂交液的应该80％以上染上紫色。

所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。

本发明的一个优选实施例的方案是：以HCCR基因为目的基因合成的核酸探针用地高辛标记(地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。

本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的HCCR基因表达量，用来确定癌症是否发生，研究表明HCCR基因是致癌基因，因为HCCR基因在正常人中低表达，如果HCCR基因表达高，说明癌症已经发生，从而获得癌症的诊断信息。一个试剂盒可以多人份使用或一人份使用。

实施例6

肝癌病人5名，正常对照组10名。抽所有待检人的外周血3-5毫升(分离白细胞)做原位杂交。结果表示，所有癌症患者HCCR基因有过度表达，细胞染色；正常对照组HCCR基因不表达，细胞无染色。具体结果请见图1是肝癌病人的HCCR基因表达图，图2是正常人HCCR基因表达图片。

本发明具有如下有益效果：

本发明的临床意义是更早期跟踪检测癌症发生、侵润转移动态过程，同时可检测癌症治疗后的转移复发状况，以及用于癌症预防医学检测。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物，以及影像医学检查有显著不同。本发明可以在基因水平上(癌变前期或癌细胞增殖)检测HCCR基因异常表达，在影像医学检查未发现占位性癌病灶之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿块之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床癌症病患一个真正的早期诊断和转移侵入以及治疗后转移复发及早预测。这样才有可能实施癌症的早期诊断、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治癌症恶疾。

此外，本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点，同时，本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>芮屈生物技术(上海)有限公司

<120>HCCR基因核酸原位杂交检测试剂盒和检测方法和应用

<130>/

<150>200710171738.4

<151>2007-11-30

<160>1

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>336

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

Claims

1.一种HCCR基因核酸原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其特征在于：所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的放射性核素选自³H、³⁵S、¹²⁵I或³²P中的一种。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的非放射性标记物优选自地高辛。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。