CN101988101A - 一种mk基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种MK基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种MK基因原位杂交检测方法。另外，本发明还提供了试剂盒在制备检测大肠癌疾病药物中的应用。本发明优点在于：本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

Description

一种MK基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

【技术领域】

本发明涉及一种试剂盒，具体地说关于一种MK基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

【背景技术】

大肠癌为结肠癌和直肠癌的总称，大肠癌是指大肠粘膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的恶性病变预后不良，死亡率较高。大肠癌是大肠粘膜上皮起源的恶性肿瘤。是最常见的消化道恶性肿瘤之一。大肠癌胃肠道常见的恶性肿瘤，仅次于胃癌、食管癌。

大肠癌从癌前变到形成癌症，需要几年时间，如何做到早期检测、诊断、预后的检测及诊治后的复发、转移早期检出是降低发病率和死亡率的关键。

MK基因序列号NM-001012333 909bp cds：135。。。。。566bp在染色体11p11.2″，MK基因是中期因子，在临床各种类型的肿瘤都有MK中期因子的高表达，它促进肿瘤生长、转移。有人利用实时定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)相对定量大肠癌组织中Midkine(MK)基因的表达，探讨MK基因在大肠癌不同病理状态中的意义。提取34例临床大肠癌组织及其癌旁正常组织中的总RNA，经寡聚脱氧胸腺嘧啶逆转录，RT-PCR扩增，以内标甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的mRNA相对定量MK基因的mRNA表达，比较癌组织与其癌旁正常组织中的MK表达差异。结果34例样本中癌组织较之癌旁正常组织，MK基因表达降低(P＜0.01)；其中在Ducks’分期中C期、女性组、淋巴结转移、管状腺癌和浸润浆膜层组中癌组织较之癌旁正常组织表达降低(P＜0.05)，其余组大肠癌组织较之癌旁正常组织无统计学意义(P＞0.05)。结论在大肠癌病程晚期癌组织中MK基因的表达水平降低。

随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，至今，我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆时)就能做到早期预测诊断。

原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。

【发明内容】

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种MK基因的原位杂交检测试剂盒的用途。

本发明的再一的目的是，提供一种MK基因的原位杂交检测试剂盒。

本发明的另一的目的是，提供一种MK基因的原位杂交检测方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种MK基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测大肠癌疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示的RNA序列。

所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

所述的放射性核素选自³H、³⁵S、¹²⁵I或³²P中的一种。

所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。

所述的非放射性标记物优选自地高辛。

所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种MK基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其中所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

一种MK基因的原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤：

a、将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；

b、检测a步骤得到的杂交复合体。

所述的a步骤中形成杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16-24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。

本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括：

仪器操作：

1).将待测标本放入反应槽中；

2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；

3).仪器自动弃去液体，自动后固定；

4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42℃)；

5).仪器自动弃去液体，自动清洗；

6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42℃)；

7).仪器自动弃去液体，自动清洗；

8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；

9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；

10).取出封片镜检。

本发明优点在于：

1、本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。

2、本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

3、本发明的临床意义是更早期跟踪检测大肠癌发生动态过程，以及用于大肠癌预防医学的检测和筛选工具。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物，以及影像医学检查有显著不同。本发明可以在基因水平上检测MK异常表达，在影像医学检查及其它检查未发现占位性大肠癌病灶之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿块之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床大肠癌病患一个真正的预后早期诊断。这样才有可能实施大肠癌的早期诊断、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治大肠癌恶疾。

【附图说明】

图1是本发明实施例中结肠癌症病人MK过量表达图；

图2是本发明实施例中正常人MK图；

【具体实施方式】

下面结合附图对本发明具体实施方式作详细说明。

实施例1

一种MK基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、增效剂，其中，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。杂交探针用地高辛标记。试剂盒中的其它液体和标本组成如下：

消化液         100μl/管    1管/盒    无色透明液体

保护液         100μl/管    1管/盒    无色透明液体

预杂交液       1300μl/管   2管/盒    无色透明液体

正义杂交液     10μl/管     1管/盒    无色透明液体

反义杂交液     10μl/管     1管/盒    无色透明液体

封闭液         1000μl/管   1管/盒    无色透明液体

碱性磷酸酶抗体 1μl/管      1管/盒    无色透明液体

显色剂A        175μl/管    1管/盒    黄色液体

显色剂B        320μl/管    1管/盒    无色透明液体

缓冲液I 10x    90ml/瓶      1瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

缓冲液II 10x   80ml/瓶      1瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

缓冲液III 10x  20m/瓶       3瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

缓冲液IV 10x   90ml/瓶      1瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

固定液         90ml/瓶      1瓶/盒    无色透明液体

阳性对照标本   6片/盒

上述试剂成分说明：(所有试剂购自SIGMA)

1、消化液：20mg/ml蛋白酶K，100mg蛋白酶K，加DEPC-H₂O 5ml；

2、保护液：0.2g的glycine加入1ml的1×缓冲液I；

3、预杂交液：1×缓冲液II 7.5ml

50×D 3ml

10mg/ml yest t-RNA 750ul

11mg/ml SALMON TESTES DNA 682ul

0.04M EDTA 3ml

50％ formamide 15ml

4、封闭液：0.03g的bloking(购买自罗氏公司)加入1ml 1×缓冲液III；

5、10x缓冲液I：(PH7.1-7.4)

NaCl 80g

Na₂HPO₄.12H₂O  360g

KCl  2g

KH₂PO₄ 2g

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

6、10x缓冲液II：(PH7.0)

NaCl  175.3g

柠檬酸钠 88.2g

HCl 几滴

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

7、缓冲液III：(PH7.9)

Tris  121.1g

NaCl  87.66g

HCl  60ml左右

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

8、缓冲液IV：

1M Tris-HCl(PH9.5)：Tirs 121.1g加HCl 3ml左右，加水900ml，调PH至9.5，加水至1l，并高压灭菌；

1M NaCl：NaCl 58.44加水至1l，并高压灭菌；

0.5M MgCl₂：101.65g MgCl₂.6H₂O加水至1l，并高压灭菌；

9、固定液：多聚甲醛40g加1×缓冲液I至1l，稍加热(约50-60度)搅拌至溶解；

10、显色剂A：NBT 1g加70％DMF11.44ml；

11、显色剂B：BCIP 1g加100％DMF30ml。

本发明的试剂盒可以多人份使用或一人份使用。

实施例2

一种MK基因原位杂交检测方法及其试剂盒应用

一、标本处理

1、用10ml的离心管，装4.5ml淋巴细胞分离液，再将3ml抗凝血缓慢加入含有淋巴细胞分离液(血∶淋巴细胞分离液＝1∶1.5)的离心管中，2000r/min离心10min；

2、吸取中间层白细胞至另一离心管中，再在此管中加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10min；

3、弃上清.沉淀加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10min；

4、弃上清，并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。再将沉淀制成悬液，滴在玻片上推片，自然干燥。(有条件的医院可以用制片机制片。)3ml血，可以做4张片子；

5、用40ml 4％固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用1×缓冲液I洗5min。每缸可以放16片；

6、标本可保存在-20℃，或继续做实验。

二、将试剂盒中试剂配制成使用浓度

1、将10×缓冲液I用三蒸水按1∶10稀释成1×缓冲液I；

2、将20×缓冲液II用三蒸水按1∶10稀释成2×缓冲液II；

按1∶100稀释成0.2×缓冲液II；按1∶200稀释成0.1×缓冲液II；

3、将10×缓冲液III用三蒸水按1∶10稀释成1×缓冲液III；

4、10×缓冲液IV用三蒸水按1∶10稀释成×缓冲液IV(取1#，2#，3#各10ml，加水至100ml既可)。

三、实验步骤：

1、取每位待检者标本两张，(另外两张留作复查用)及阳性对照标本两张(每次实验做一对阳性对照)；

2、在玻璃缸里加消化液(消化液100ul加1×缓冲液199.9ml，即为使用浓度)20ml。37℃水浴预热10分钟。放进16张玻片，37℃处理12min，再用1×缓冲液I洗5min；

3、用0.2％的保护液(保护液1ml加1×缓冲液I99ml即为使用浓度)洗10min，三蒸水洗5min，以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥；

4、将玻片放入保湿盒内，加预杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中3h以上；

5、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70％，90％，95％的乙醇各洗2min，自然干燥；

6、将玻片放入保湿盒内，每位病人标本两张，一张加正义杂交液20ul/片，另一张加反义杂交液20ul/片，盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中16-24h；

7、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内

在42℃恒温水浴箱中用2×缓冲液II洗两次，每次15min

在42℃恒温水浴箱中用0.2×缓冲液II洗一次，每次15min

在42℃恒温水浴箱中用0.1×缓冲液II洗两次，每次15min；

8、用1×缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥；

9、将玻片放入保湿盒内，加0.5％l封闭液(1ml封闭液加5ml 1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min；

10、取出玻片，用1×缓冲液III洗30s，自然干燥；

11、将玻片放入保湿盒内，加碱性磷酸酶抗体(加入1.8ml 1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒在室温下作用30min；

12、取出玻片，用1×缓冲液III洗3次，每次15min；

13、1×缓冲液IV洗2min，加显色剂(显色剂A73.3ul，显色剂B157.5ul加到30ml 1×缓冲液IV中，混匀)，室温避光12h以上；

14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10％的1×缓冲液I混匀)封片镜检。

四、结果判断

在光镜下计数100-300个细胞，计算染上紫色细胞的百分比。

阳性对照标本加反义杂交液的应该80％以上染上紫色。

所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。

地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。

本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的MK基因表达量，用来确定大肠癌是否发生。临床研究表明，MK基因是大肠癌的特异基因，因为MK基因在正常人中不表达，唯独在癌表达，说明大肠癌已经发生，用来确定大肠癌是否发生，或是正常。从而获得大肠癌的诊断信息。

本发明实施例采样为：结肠癌病人10名，正常对照组10名。抽所有待检人的外周血3-5毫升(分离白细胞)做原位杂交。结果表示，所有结肠癌患者MK基因有过度表达，细胞染色；正常对照组MK基因不表达，细胞无染色。具体结果请见图1和图2。

实施例3

用MK基因试剂盒检测结肠癌疾病与用VEGF基因试剂盒检测结肠癌疾病之间平行实验。

为了科学评价上述基因各自在结肠癌疾病的特异性、敏感性、准确性。我们用平行试验的方法，同时检测上述基因的mRNA，检测技术采用核酸原位杂交技术，用同一例结肠癌疾病患者的外周血，同时检测MK基因和VEGF(VEGF基因序列号NM-001025366，6p12”3665bp cds：492。。。。1730bp)基因的mRNA(进行核酸原位杂交、免疫组化染色、镜下记数、结果报告等均采用实施例1和实施例2的原位杂交技术的相同方法和步骤及试剂)。发现MK基因在结肠癌疾病病人中表达量比VE6F基因在同一疾病病人的表达量要高。结果表明，MK基因对结肠癌疾病诊断的特异性、敏感性、准确性比VEGF基因更好，原位杂交基因表达图显示，MK基因的表达量是70％，VEGF基因的表达量是50％。本发明的试剂盒作于结肠癌疾病诊断的指标有非常重要的临床意义。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>芮屈生物技术(上海)有限公司

<120>一种MK基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

<130>/

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>909

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

gagcgagtga gcgcgcggcg gcccctggtc cgcccggccg cggccgatct aggggctggg   60

ggctggaggc gggggtgggg gtctgagctg cgtcctgggc tcgaggcgtc ccccggggag  120

tcgcctctta gcggatgcag caccgaggct tcctcctcct caccctcctc gccctgctgg  180

cgctcacctc cgcggtcgcc aaaaagaaag ataaggtgaa gaagggcggc ccggggagcg  240

agtgcgctga gtgggcctgg gggccctgca cccccagcag caaggattgc ggcgtgggtt  300

tccgcgaggg cacctgcggg gcccagaccc agcgcatccg gtgcagggtg ccctgcaact  360

ggaagaagga gtttggagcc gactgcaagt acaagtttga gaactggggt gcgtgtgatg  420

ggggcacagg caccaaagtc cgccaaggca ccctgaagaa ggcgcgctac aatgctcagt  480

gccaggagac catccgcgtc accaagccct gcacccccaa gaccaaagca aaggccaaag  540

ccaagaaagg gaagggaaag gactagacgc caagcctgga tgccaaggag cccctggtgt  600

cacatggggc ctggcccacg ccctccctct cccaggcccg agatgtgacc caccagtgcc  660

ttctgtctgc tcgttagctt taatcaatca tgccctgcct tgtccctctc actccccagc  720

cccaccccta agtgcccaaa gtggggaggg acaagggatt ctgggaagct tgagcctccc  780

ccaaagcaat gtgagtccca gagcccgctt ttgttcttcc ccacaattcc attactaaga  840

aacacatcaa ataaactgac tttttccccc caataaaagc tcttcttttt taatataaaa  900

aaaaaaaaa                                                          909

Claims (10)

1.一种MK基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测大肠癌疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示的RNA序列。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的放射性核素选自³H、³⁵S、¹²⁵I或³²P中的一种。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的非放射性标记物优选自地高辛。

7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。

8.一种MK基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其特征在于，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

9.一种MK基因的原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

a、将权利要求8所述试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；

b、检测a步骤得到的杂交复合体。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：a步骤中形成杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16-24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。

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