CN101363048A - 一种nkx2-8基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种NKX2－8基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种NKX2－8基因原位杂交检测方法。另外，本发明还提供了试剂盒在制备检测肺癌、肺癌转移疾病药物中的应用。本发明优点在于：本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

Description

一种NKX2-8基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

【技术领域】

本发明涉及一种试剂盒，具体地说关于一种NKX2-8基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用。

【背景技术】

根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数170万，死亡人数近160万，患者600万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800万，患者约有8400万人，到2020年以上人数将翻一番，这是一组可怕的数字。

2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等多家单位做了一个年度报告，“认为人类在抗癌大战中是失败”，也就是说癌症死亡率没有降低，其列举出造成抗癌大战失败的几个因素是：1.肿瘤细胞异质性；2.肿瘤细胞耐药性；3.抗癌药物设计思路不完善等。同时，该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌症的措施。

本发明人在研究中发现，导致癌症死亡率不降的另二个重要原因是：1.不能做到真正的早期诊断；2.转移的病理机制不清楚。依照传统的医学影像及和其它生化(如蛋白标记物)指标来诊断癌症，认为占位性癌块在2公分下是属于早期癌症的诊断(更小些有时无症状体征)，这一概念值得认真讨论。影像医学的2公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度，1公分的肿块约有一亿个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止2亿个肿瘤细胞，从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块，其病理演变过程相当长，可能是一年或两年、甚至三年以上，很难证实的是在这个过程中，肿块是癌症唯一的发生地和单独的病灶。临床上已证实：一旦形成肿块的同时，其他癌细胞通过不同途径迁移到其他部位克隆生长；一旦切除原发灶后，其他器官复发灶或多发癌块灶先后形成或转移。因此，在临床上以2公分以下的肿块大小来界定早期与否，不够严谨(有些病例，在发现原发病灶时，同时发现转移病灶，不在我们表述的内容中)，这时已经是晚期了，这是导致癌症死亡率不降的真正原因。

随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，至今，我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆时)或突破血管壁早期转移时，就能做到早期预测诊断。

NKX2-8基因被认为是致肺癌的协同基因，NKX2-8基因的表达增高，表示病人已患肺癌且多数已转移。美国冷泉港实验室的科学家发现了位于人类第14号染色体上NKX2-8和TTF1、PAX9基因有协同致肺癌发生和导致转移，进一步研究表明NKX2-8和TTF1、PAX9基因能再激活一种早期的胎儿基因表达模式，导致肺癌产生和转移，NKX2-8基因与20％肺癌癌变有关，他们发现这些基因的异常变化在晚期肺癌更常见，有可能是癌症复发的危险因子。

目前对NKX2-8基因的研究都采用高通量基因芯片技术，而这一方法多用于科研方面，不适应临床应用，特别是个性化的应用在我国现阶段条件尚不成熟。根据现有的文献资料及查新报告NKX2-8基因的检测技术未见报道，而用抗原抗体(ELISA)方法检测NKX2.8蛋白也还处于研发阶段。

原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。

中国专利文献CN1556221公开了“IC53基因及其相关产物诊断和治疗结肠癌的用途及一种诊断结肠癌的试剂盒”。中国专利文献CN1769485公开了“栉孔扇贝病原类立克次氏体的原位杂交检测方法及其试剂盒”。中国专利文献CN1556410公开了“一种鱼类病毒的检测试剂盒及其检测方法”。中国专利文献CN1680597公开了“一种用于定量检测丙型肝炎病毒(HCV)的荧光定量PCR试剂盒”。中国专利文献CN2918435，公开了“一种检测肥胖相关基因SNP的寡核苷酸芯片及试剂盒”。但是，关于NKX2-8基因的原位杂交检测试剂盒及其检测技术未见报道。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题是，提供一种NKX2-8基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用，能够检测早期肺癌，或者在治疗后能及早地预测转移复发状况。

为了解决上述问题，本发明提供了一种NKX2-8基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测肺癌、肺癌转移疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，其中所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。NKX2-8基因序列见SEQ ID NO.1，NKX2-8基因核苷酸序列长度是1857bp，CDS是193...912bp位于染色体14q13.”位点上。

作为可选的技术方案，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示的RNA序列。

作为可选的技术方案，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

作为可选的技术方案，所述的放射性核素选自³H、³⁵S、¹²⁵I或³²P中的一种。

作为可选的技术方案，所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。

作为可选的技术方案，所述的非放射性标记物优选自地高辛。

作为可选的技术方案，还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。

本发明还提供了一种NKX2-8基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

本发明还提供了一种NKX2-8基因原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤：

a、将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；

b、检测a步骤得到的杂交复合体。

作为可选的技术方案，所述a步骤中形成杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16—24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。

本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结合，以NKX2-8基因为检测对象，合成探针是NKX2-8基因的DNA或RNA序列，检测的底物是人体血液标本白细胞或组织细胞的RNA的表达量。原位杂交技术的显示方法能提供NKX2-8基因的半定量或定量表达程度判定。根据杂交后免疫组化显色判定以上两基因的表达量，正常人NKX2-8基因在胎儿发育高表达，成年人低表达，NKX2-8基因在肺癌晚期病人超高表达，和正常人有显著差异。

本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括：

仪器操作：

1).将待测标本放入反应槽中；

2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；

3).仪器自动弃去液体，自动后固定；

4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42℃)；

5).仪器自动弃去液体，自动清洗；

6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42℃)；

7).仪器自动弃去液体，自动清洗；

8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；

9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；

10).取出封片镜检。

本发明优点在于：

1、本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。

2、本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。克服了目前对NKX2-8基因的研究都采用高通量基因芯片方法，而这些方法多用于科研方面，不适应临床应用的缺陷。

3、本发明的临床意义是更早期跟踪检测肺癌发生、浸润转移动态过程，同时可检测肺癌治疗后的转移复发状况，以及用于肺癌预防医学检测。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物，以及影像医学检查有显著不同。本发明可以在基因水平上(肺癌变前期或癌细胞增殖)检测NKX2-8基因异常表达，在影像医学检查未发现占位性癌病灶之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿块之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床肺癌病患一个真正的早期诊断和转移侵入以及治疗后转移复发及早预测。这样才有可能实施肺癌的早期诊断、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治肺癌恶疾。

【附图说明】

图1是本发明实施例中肺癌病人NKX2-8基因过量表达图片。

图2是正常人NKX2-8基因表达图片。

【具体实施方式】

下面结合图对本发明提供的一种NKX2-8基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用的具体实施方式做详细说明。

实施例1

一种NKX2-8基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、增效剂，其中，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。杂交探针用地高辛标记。试剂盒中的其它液体和标本组成如下：

消化液     100μl/管      1管/盒           无色透明液体

保护液          100μl/管       1管/盒        无色透明液体

预杂交液        1300μl/管      2管/盒        无色透明液体

正义杂交液      10μl/管        1管/盒        无色透明液体

反义杂交液      10μl/管        1管/盒        无色透明液体

封闭液          1000μl/管      1管/盒        无色透明液体

碱性磷酸酶抗体  1μl/管         1管/盒        无色透明液体

显色剂A         175μl/管       1管/盒        黄色液体

显色剂B         320μl/管       1管/盒        无色透明液体

缓冲液I  10x    90ml/瓶         1瓶/盒        浅黄色或无色透明液体

缓冲液II 10x    80ml/瓶         1瓶/盒        浅黄色或无色透明液体

缓冲液III10x    20m/瓶          3瓶/盒        浅黄色或无色透明液体

缓冲液IV 10x    90ml/瓶         1瓶/盒        浅黄色或无色透明液体

固定液          90ml/瓶         1瓶/盒        无色透明液体

阳性对照标本    6片/盒

上述试剂成分说明：(所有试剂购自SIGMA)

1、消化液：20mg/ml蛋白酶K，100mg蛋白酶K，加DEPC-H₂O 5ml；

2、保护液：0.2g的glycine加入1ml的1×缓冲液I；

3、预杂交液：1×缓冲液II 7.5ml

50×D 3ml

10mg/ml yest t-RNA 750ul

11mg/ml SALMON TESTES DNA 682ul

0.04M EDTA 3ml

50％ formamide 15ml

4、封闭液：0.03g的bloking(购买自罗氏公司)加入1ml 1×缓冲液III；

5、10x缓冲液I：(PH7.1-7.4)

NaCl 80g

Na₂HPO_4·12H₂O 360g

KCl 2g

KH₂PO₄ 2g

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

6、10x缓冲液II：(PH7.0)

NaCl 175.3g

柠檬酸钠 88.2g

HCl 几滴

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

7、缓冲液III：(PH7.9)

Tris  121.1g

NaCl  87.66g

HCl   60ml左右

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

8、缓冲液IV：

1M Tris-HCl(PH9.5)：Tirs 121.1g加HCl 3ml左右，加水900ml，调PH至9.5，加水至1l，并高压灭菌；

1M NaCl：NaCl 58.44加水至1l，并高压灭菌；

0.5M MgCl₂：101.65g MgCl_2·6H₂O加水至1l，并高压灭菌；

9、固定液：多聚甲醛40g加1×缓冲液I至1l，稍加热(约50-60度)搅拌至溶解；

10、显色剂A：NBT 1g加70％DMF11.44ml；

11、显色剂B：BCIP 1g加100％DMF30ml。

本发明的试剂盒可以多人份使用或一人份使用。

实施例2

一种NKX2-8基因原位杂交检测方法及其试剂盒应用

一、标本处理

1、用10ml的离心管，装4.5ml淋巴细胞分离液，再将3ml抗凝血缓慢加入含有淋巴细胞分离液(血:淋巴细胞分离液＝1:1.5)的离心管中，2000r/min离心10min；

2、吸取中间层白细胞至另一离心管中，再在此管中加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10min；

3、弃上清.沉淀加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10min；

4、弃上清，并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。再将沉淀制成悬液，滴在玻片上推片，自然干燥。(有条件的医院可以用制片机制片。)3ml血，可以做4张片子；

5、用40ml 4％固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用1×缓冲液I洗5min。每缸可以放16片；

6、标本可保存在-20℃，或继续做实验。

二、将试剂盒中试剂配制成使用浓度

1、将10×缓冲液I用三蒸水按1:10稀释成1×缓冲液I；

2、将20×缓冲液II用三蒸水按1:10稀释成2×缓冲液II；

按1:100稀释成0.2×缓冲液II；按1:200稀释成0.1×缓冲液II；

3、将10×缓冲液III用三蒸水按1:10稀释成1×缓冲液III；

4、10×缓冲液IV用三蒸水按1:10稀释成×缓冲液IV(取1#，2#，3#各10ml，加水至100ml既可)。

三、实验步骤：

1、取每位待检者标本两张，(另外两张留作复查用)及阳性对照标本两张(每次实验做一对阳性对照)；

2、在玻璃缸里加消化液(消化液100ul加1×缓冲液199.9ml，即为使用浓度)20ml。37℃水浴预热10分钟。放进16张玻片，37℃处理12min，再用1×缓冲液I洗5min；

3、用0.2％的保护液(保护液1ml加1×缓冲液I99ml即为使用浓度)洗10min，三蒸水洗5min，以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥；

4、将玻片放入保湿盒内，加预杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中3h以上；

5、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70％，90％，95％的乙醇各洗2min，自然干燥；

6、将玻片放入保湿盒内，每位病人标本两张，一张加正义杂交液20ul/片，另一张加反义杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中16-24h；

7、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内

在42℃恒温水浴箱中用2×缓冲液II洗两次，每次15min

在42℃恒温水浴箱中用0.2×缓冲液II洗一次，每次15min

在42℃恒温水浴箱中用0.1×缓冲液II洗两次，每次15min；

8、用1×缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥；

9、将玻片放入保湿盒内，加0.5％1封闭液(1ml封闭液加5ml1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min；

10、取出玻片，用1×缓冲液III洗30s，自然干燥；

11、将玻片放入保湿盒内，加碱性磷酸酶抗体(加入1.8ml1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒在室温下作用30min；

12、取出玻片，用1×缓冲液III洗3次，每次15min；

13、1×缓冲液IV洗2min，加显色剂(显色剂A73.3ul，显色剂B157.5ul加到30ml1×缓冲液IV中，混匀)，室温避光12h以上；

14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10％的1×缓冲液I混匀)封片镜检。

四、结果判断

在光镜下计数100-300个细胞，计算染上紫色细胞的百分比。

阳性对照标本加反义杂交液的应该80％以上染上紫色。

所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。

肺癌病人NKX2-8基因过量表达图见图1。正常人NKX2-8基因表达图见图2。

地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。

本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的NKX2-8基因表达量，用来确定肺癌是否发生，临床研究表明，NKX2-8基因是肺癌的协同致癌基因，因为NKX2-8基因在正常人中低表达，如果NKX2-8基因表达高，说明肺癌已经发生，从而获得癌症的诊断信息。

实施例3

用NKX2-8基因试剂盒检测肺癌疾病与用TIG2基因试剂盒检测肺癌疾病之间对比实验。

为了科学评价上述基因各自在肺癌疾病的特异性、敏感性、准确性。我们用平行试验的方法，同时检测上述基因的mRNA，检测技术采用核酸原位杂交技术，用同一例肺癌疾病患者的外周血，同时检测NKX2-8基因和TIG2基因的mRNA(进行核酸原位杂交、免疫组化染色、镜下记数、结果报告等均采用实施例1和实施例2的原位杂交技术的相同方法和步骤及试剂)。发现NKX2-8基因在肺癌疾病病人中表达量比TIG2基因在同一疾病病人的表达量要高。结果表明，NKX2-8基因对肺癌疾病诊断的特异性、敏感性、准确性比TIG2基因更好，原位杂交基因表达图显示，NKX2-8基因的表达量是70％，TIG2基因的表达量是50％。本发明的试剂盒作于肺癌疾病诊断的指标有非常重要的临床意义。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>  芮屈生物技术(上海)有限公司

<120>  一种NKX2-8基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

<130>  /

<160>  1

<170>  PatentIn version 3.1

<210>  1

<211>  1857

<212>  DNA

<213>  智人(Homo sapiens)

<400>  1

Claims (10)

1.一种NKX2-8基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测肺癌、肺癌转移疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示的RNA序列。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的放射性核素选自³H、³⁵S、¹²⁵I或³²P中的一种。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的非放射性标记物优选自地高辛。

7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。

8.一种NKX2-8基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其特征在于，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

9.一种NKX2-8基因原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

a、将权利要求8所述试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；

b、检测a步骤得到的杂交复合体。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：a步骤中形成杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16—24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。

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