CN101134959A - 房间隔缺损的nkx2-5基因突变及其检测方法 - Google Patents
房间隔缺损的nkx2-5基因突变及其检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101134959A CN101134959A CNA2007100444943A CN200710044494A CN101134959A CN 101134959 A CN101134959 A CN 101134959A CN A2007100444943 A CNA2007100444943 A CN A2007100444943A CN 200710044494 A CN200710044494 A CN 200710044494A CN 101134959 A CN101134959 A CN 101134959A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nkx2
- septal defect
- atrial septal
- gene
- seconds
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及房间隔缺损的NKX2－5基因突变及其检测方法，该突变是指内含子+1433C→T突变，它与家族性房间隔缺损并房室传导阻滞(FASDAVB)家系疾病存在遗传共分离，其检测方法，包括步骤：(1)提取外周血DNA；(2)NKX2－5基因的体外PCR扩增；(3)DNA测序分析。该基因突变的发现，进一步明确了FASDAVB的分子遗传学机制。
Description
技术领域
本发明属房间隔缺损的基因突变及其检测方法领域，特别是涉及NKX2-5基因突变及其检测方法。
背景技术
先天性心脏病(CHD)是儿童非感染性疾病的主要死亡原因，新生儿CHD患病率高达1％左右，其中房间隔缺损(ASD)又是常见的CHD之一。传统观点认为，ASD及其它CHD的发生是遗传和环境因素综合作用的结果，但对具体的遗传因素及其作用机制的认识几乎空白。家族性房间隔缺损(FASD)发病中遗传因素起到决定性作用，是ASD遗传机制研究的良好样本。近年来，随着家族性疾病致病基因检测技术日趋成熟，很多学者对FASD家系进行致病基因检测，其结果令人鼓舞。FASD大致可分为Holt-Oram综合征(HOS)、家族性房间隔缺损并房室传导阻滞(FASDAVB)和单纯性家族性房间隔缺损(SFASD)三类。1997年Basson首先在HOS家系中检测到TBX5突变，此后FASDAVB和SFASD家系中也分别检测到NKX2-5、GATA4突变。FASD家系的基因检测初步明确了这三类FASD的致病基因，同时揭示了TBX5、NKX2-5和GATA4与房间隔发育有关。可见，FASD的致病基因检测不仅直接探究特定家系的病因，还可以发现新的心脏发育相关基因或揭示基因新的功能，为散发ASD的致病基因分析指明方向。
NKX2-5是重要的心脏发育相关基因，1998年Schott在FASDAVB家系中检测到NKX2-5突变，首次证实NKX2-5突变可引起人类CHD。NKX2-5突变可出现房间隔缺损和房室传导阻滞等多种心脏表型，说明NKX2-5广泛参与房间隔、房室结形成等心脏发育过程；FASDAVB的NKX2-5突变大部分发生在同源结构域，说明同源结构域在NKX2-5的功能维持上至关重要。目前，对NKX2-5结构和功能、上下游调节以及突变导致心脏畸形的具体机制等诸多方面还知之不多，因此更多的家系调查与NKX2-5突变位点分析，有助于发现NKX2-5在心脏发育中的作用，有助于分析NKX2-5的结构和功能的关系，为NKX2-5研究提供方向。
目前，FASDAVB的致病基因分析国外的研究并不多，且大部分是关于白种人的FASDAVB报道，汉族人的FASDAVB既往无确切报道，更无相关致病基因分析。
发明内容
本发明的目的是提供房间隔缺损的NKX2-5基因突变及其检测方法，明确家族性房间隔缺损并房室传导阻滞(FASDAVB)的分子遗传学机制。
本发明的房间隔缺损的NKX2-5基因突变是指内含子+1433C→T突变，该突变与FASDAVB家系疾病存在遗传共分离。
本发明的房间隔缺损的NKX2-5基因突变的检测方法，包括下列步骤：
(1)提取外周血DNA；
(2)NKX2-5基因的体外PCR扩增；
(3)DNA测序分析。
所述的PCR扩增是指反应液为2μL10×PCR Buffer、0.3μl的20μM引物、0.6μl10mM dNTPmix、1.2μL25mM MgCl2、1U Taq酶，加ddH2O至20μl，20ng/μl DNA模板1μl，反应条件：95℃15分钟；94℃40秒，63℃1分钟，每个循环减0.5℃，72℃延伸，10个循环；然后变性94℃40秒，退火57℃1分钟，延伸72℃，共30个循环；72℃延伸10分钟。
所述的测序反应中的PCR反应体系包括测序引物、PCR纯化产物和荧光测序MIX，反应条件：96℃10秒预变性，96℃10秒，53℃5秒，60℃4分钟，35个循环，60℃延伸4分钟；
所述的NKX2-5基因的PCR和测序引物序列见表1。
表2-1NKX2-5PCR和测序引物序列
| 引物 | 引物序列(5’→3’) | 产物大小(bp) |
| 1F1R2F2R3F3R4F4R5F5R6F6R | CAGAGAAATCCTGGCCTAGCCAGAGAAATCCTGGCCTAGCGAGAATTTGGGTTGGGAGGTGCTACCAGCCACCTTGTTTCACAGGAGCGATGAGCAGTTTCAATCGGAGGTTCAGAGGAACTGAGTTTCTTGGGGACGAAATGCTGAGTGAGACGTGTCGGAAAGTCAGGCTGGCTCAAGACTTGAATGCGGTTCAGAGCTAGGCGGGGTAGGCGTTATAACCTAACCCTTGCTGGAACC | 1196129310601300900947 |
| 7F7R | ACATAAATACGGGTGGGTGCAGGAACCGAGTGCTTCTCAA | 1336 |
本发明对房间隔缺损患者NKX2-5突变位点的分析，有助于发现NKX2-5在心脏发育中的作用，分析NKX2-5的结构和功能的关系，为NKX2-5研究提供方向。
附图说明
图1是家系图谱，方框表示男性，圆圈表示女性，黑色表示患者，白色表示正常人，箭头表示先证者；
图2是Polyphred软件对家族性房间隔缺损并房室传导阻滞的多个序列进行比较，内含子红色表示可能的SNP；
图3是突变测序图，显示家族性房间隔缺损并房室传导阻滞的家系成员NKX2-5内含子部分基因序列，单峰代表纯合子，双峰代表杂合子，突变出现在CAGG(C/T)AGGA中。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
抽取家族性房间隔缺损并房室传导阻滞家系的先证者及家系成员20人外周静脉血4mL，其中患者7人；随机抽取散发ASD患者24人、健康对照300人的外周静脉血4mL，按照血液DNA抽取试剂盒(美国QIAGEN产Flexi Gene DNA Kit)进行操作，提取DNA。对NKX2-5基因外显子的进行体外PCR扩增，反应液为2μL10×PCR Buffer、0.3μ1的20μM引物、0.6μl10mM dNTPmix、1.2μL25mM MgCl2、1U Taq酶，加ddH2O至20μl，20ng/μl DNA模板1μl，反应条件：95℃15分钟；94℃40秒，63℃1分钟，每个循环减0.5℃，72℃延伸，共10个循环；然后变性94℃40秒，退火57℃1分钟，延伸72℃，共30个循环；72℃延伸10分钟。扩增后进行PCR产物电泳和Resin树脂纯化，并进行DNA测序分析，测序反应中的PCR反应体系包括0.8μM测序引物，100ng/μl左右的PCR纯化产物和荧光测序MIX，反应条件：96℃10秒预变性，96℃10秒，53℃5秒，60℃4分钟，35个循环，60℃延伸4分钟。NKX2-5基因PCR和测序引物序列见(表1)，
家系图谱见说明书附图1。
测序结果见说明书附图3。
Claims (6)
1.房间隔缺损的NKX2-5基因突变，其特征在于：该基因内含子+1433 C→T突变。
2.根据权利要求1所述的房间隔缺损的NKX2-5基因突变，其特征在于：该突变与家族性房间隔缺损并房室传导阻滞家系疾病存在遗传共分离。
3.房间隔缺损的NKX2-5基因突变检测方法，包括下列步骤：
(1)提取外周血DNA；
(2)NKX2-5基因的体外PCR扩增；
(3)DNA测序分析。
4.根据权利要求3所述的房间隔缺损的NKX2-5基因突变检测方法，其特征在于：所述的PCR扩增是指反应液为2μL 10×PCRBuffer、0.3μl的20μM引物、0.6μl10mM dNTPmix、1.2μL 25mM MgCl2、1U Taq酶，加ddH2O至20μl，20ng/μl DNA模板1μl，反应条件：95℃15分钟；94℃40秒，63℃1分钟，每个循环减0.5℃，72℃延伸，10个循环；然后变性94℃40秒，退火57℃1分钟，延伸72℃，共30个循环；72℃延伸10分钟。
5.根据权利要求3所述的房间隔缺损的NKX2-5基因突变检测方法，其特征在于：所述的测序反应中的PCR反应体系包括测序引物、PCR纯化产物和荧光测序MIX，反应条件：96℃10秒预变性，96℃10秒，53℃5秒，60℃4分钟，35个循环，60℃延伸4分钟。
6.根据权利要求3所述的房间隔缺损的NKX2-5基因突变检测方法，其特征在于：所述的NKX2-5基因的PCR和测序引物序列见表1。
表2-1 NKX2-5 PCR和测序引物序列
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2007100444943A CN101134959A (zh) | 2007-08-02 | 2007-08-02 | 房间隔缺损的nkx2-5基因突变及其检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2007100444943A CN101134959A (zh) | 2007-08-02 | 2007-08-02 | 房间隔缺损的nkx2-5基因突变及其检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101134959A true CN101134959A (zh) | 2008-03-05 |
Family
ID=39159283
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2007100444943A Pending CN101134959A (zh) | 2007-08-02 | 2007-08-02 | 房间隔缺损的nkx2-5基因突变及其检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101134959A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101363048B (zh) * | 2008-08-29 | 2011-11-23 | 芮屈生物技术（上海）有限公司 | 一种nkx2-8基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用 |
-
2007
- 2007-08-02 CN CNA2007100444943A patent/CN101134959A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101363048B (zh) * | 2008-08-29 | 2011-11-23 | 芮屈生物技术（上海）有限公司 | 一种nkx2-8基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10648037B2 (en) | Method and kit for non-invasively detecting EGFR gene mutations | |
| Lindhurst et al. | A mosaic activating mutation in AKT1 associated with the Proteus syndrome | |
| Zeng et al. | Liquid biopsies: DNA methylation analyses in circulating cell-free DNA | |
| US20140370504A1 (en) | Method for detecting genetic variation | |
| CN102808026B (zh) | 用于检测人mthfr基因多态性的引物、探针、荧光pcr试剂盒和方法 | |
| CN109852689B (zh) | 一组脉管畸形相关的生物标志物及相关检测试剂盒 | |
| CN110541025B (zh) | 杜氏肌营养不良基因缺陷的检测方法、引物组合物及试剂盒 | |
| US9574227B2 (en) | Method for detecting variation of gene for non-diagnostic purpose based on fluorescence quenching and probe thereof | |
| CN107254531B (zh) | 早发性结直肠癌辅助诊断的遗传生物标志物及其应用 | |
| CN101298629B (zh) | Lrrc4基因启动子区甲基化检测在脑胶质瘤诊断中的应用及其检测系统 | |
| CN104293920A (zh) | 一种用于快速检测人类vkorc1和cyp2c9基因多态性的试剂盒及其使用方法 | |
| CN110317880A (zh) | 与猪饲料转化率相关的分子标记、鉴定及其应用 | |
| CN103589785A (zh) | Notch3和jag2基因snp位点的用途 | |
| CN101363054A (zh) | 体外检测遗传性耳聋相关缝隙连接蛋白26基因gjb2突变的方法及检测用试剂盒 | |
| CN105648044B (zh) | 确定胎儿目标区域单体型的方法和装置 | |
| CN104726604B (zh) | 一种腐败检材降解dna的检测方法及其应用 | |
| CN101134959A (zh) | 房间隔缺损的nkx2-5基因突变及其检测方法 | |
| CN108300776A (zh) | 脆性x综合征快速筛查试剂盒 | |
| US11821036B2 (en) | Methods for identifying and monitoring pregnant women at risk of preeclampsia | |
| Siavrienė et al. | A de novo 13q31. 3 microduplication encompassing the miR-17~ 92 cluster results in features mirroring those associated with Feingold syndrome 2 | |
| CN103571959B (zh) | 用于检测基因位点突变的引物、探针、试剂盒 | |
| CN102703440A (zh) | 山羊sh2b1基因单核苷酸多态性位点及其检测方法 | |
| CN102776184B (zh) | 猪 ckm 5’侧翼启动子区 snp 作为猪胴体性状的遗传标记及应用 | |
| CN101906470B (zh) | 一种检测黄牛fto基因单核苷酸多态性的方法 | |
| CN103320510A (zh) | 一种黄牛hgf基因单核苷酸多态性的检测方法及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080305 |