CN1769485A

CN1769485A - 栉孔扇贝病原类立克次氏体的原位杂交检测方法及其试剂盒

Info

Publication number: CN1769485A
Application number: CN 200410052013
Authority: CN
Inventors: 李登峰; 吴信忠
Original assignee: Zhejiang University ZJU; South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: Zhejiang University ZJU; South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2004-11-02
Filing date: 2004-11-02
Publication date: 2006-05-10
Anticipated expiration: 2024-11-02
Also published as: CN100350056C

Abstract

本发明涉及一种栉孔扇贝病原类立克次氏体的原位杂交检测方法及用于该法的试剂盒。该法包括如下步骤：根据栉孔扇贝类立克次氏体在细菌分类学上具有保守功能的16S rDNA序列中的三段特有的DNA序列设计合成了地高辛标记的三条寡核苷酸探针，该特异探针与栉孔扇贝组织切片中类立克次氏体16s rRNA杂交结合后通过免疫学的抗原抗体反应扩大信号，然后经酶反应显色。该检测方法能直观地将病原检测与其病理变化结合起来；在高效、准确检测类立克次氏体的同时可由样本切片上分析感染率和感染强度；由于探针与16s rRNA的杂交是特异的，且信号经过了逐级放大，所以远较常规的染色观察检测灵敏、精确；而且检测结果杂交显色后的切片可长期保存。

Description

栉孔扇贝病原类立克次氏体的原位杂交检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及一种栉孔扇贝病原类立克次氏体的原位杂交检测方法及其用于该法的试剂盒。

背景技术

扇贝(scallop)养殖是主导我国贝类养殖甚或整个海水养殖的重要支柱产业，栉孔扇(Chlamys farrei)又是我国重要的海水养殖扇贝品种，但自1995年以来，栉孔扇贝连续出现大规模死亡，尤其是1997～1999年期间，扇贝的死亡率达90％以上，有的海区100％死亡，1997年北方养殖栉孔扇贝死亡面积达33万亩，造成经济损失15亿元。经查明类立克次氏体(rickettsia-like prokaryote，或称rickettsia-like organism)是引起它发病的病原，目前，最常规的检测方法就是采用组织切片光学显微镜观察和超薄切片电子显微镜观察，但这些传统的方法不仅费时、费力，且最大的缺陷是不能把组织切片中光学显微镜观察到的类立克次氏体的包涵体同超薄切片中电子显微镜观察到的类立克次氏体直观的对应起来，因而缺乏灵敏度、可信度。血清学检测方法需要大量纯的病原以制备足够的血清这对尚无法人工培养的类立克次体而言操作烦琐，而且灵敏度不够高。最近，在国际上有少量文献报道利用PCR方法检测水产养殖动物类立克次氏体感染，这些报道是包括对大扇贝(Pecten maximus)的类立克次氏体和鲍类立克次氏体的PCR检测，PCR方法虽然操作快速简单、灵敏度很高、成本低、特异性强，但PCR方法仍然不能直观的观察和证明类立克次氏体的包涵体，而且易于因操作中的模板污染出现假阳性(参考文献见：1.Kellner-Cousin K，Le Gall G，DespresB，et al.Genomic DNA cloning of rickettsia-like organisms(RLO)of Saint-Jacquesscallop Pecten maximus：Evaluation of prokaryote diagnosis by hybridization with anon-isotopically labeled probe and by polymerase chain reaction.Diseases of AquaticOrganisms，1993，(15)：145-152；2.Andree K B，Friedman C S，Moore J D，et al.A polymerase chain reaction assay for the detection of genomic DNA of arickettsiales-like prokaryote associated with withering syndrome in Californiaabalone.Journal of Shellfish Research，2000，19：213-218.)。原位杂交假阳性率更低，从直观性、准确度和灵敏度综合考虑是一种其它任何方法都无法替代的检测方法，但至今未见栉孔扇贝病原类立克次氏体的原位杂交检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高灵敏度、高可信度同时又非常直观的栉孔扇贝类立克次体病原的早期检测方法，并证明通过PCR，克隆、序列分析获得的16S rDNA序列是来自引起扇贝大规模死亡的细胞内寄生物类立克次氏体；本发明的另一目的是提供用于该检测方法的试剂盒。

利用本发明作者已完成的栉孔扇贝类立克次氏体在细菌分类学上具有保守功能的16SrDNA序列中的三段特有的DNA序列设计合成了三条寡核苷酸特异探针，建立了栉孔扇贝类立克次氏体病原的原位杂交检测方法，能直观地将检测的病原类立克次氏体与其引起的病理变化结合起来，从而确定该病原的感染部位，感染程度与其引起的病理变化，确定其致病力，因而直观性、准确度和灵敏度都优于现有的检测方法，实现了本发明的目的。

本发明提供一种栉孔扇贝病原类立克次氏体的原位杂交检测方法，其技术方案包括如下步骤：

(1)用地高辛标记的特异的探针与栉孔扇贝组织切片中类立克次氏体16s rRNA杂交结合；

(2)进行原位杂交检测：

a.通过进一步的免疫学抗原抗体反应扩大信号：所述的地高辛标记的探针结合生物素化鼠抗地高辛，再结合链霉亲合素-生物素-过氧化物酶复合物，最后再结合生物素化过氧化物酶；

b.经酶反应显色；

所述的特异的探针是根据栉孔扇贝类立克次氏体在细菌分类学上具有保守功能的16SrDNA序列中的三段特有的DNA序列设计合成的三条寡核苷酸探针，合成后于每一探针的3’末段标记地高辛；

所述的三条寡核苷酸探针序列为：

(1)5’-CCAACACCGAATCCGAAGACCCGACGTGGTTTA-3’；

(2)5’-GGTCCTTCTTATCCTGTTACTGTCATCATCC-3’；

(3)5’-ACTAGAATACACCTCCGAAGAAGTGCATCTCGT-3’。

本发明栉孔扇贝组织样品和通常的原位杂交检测一样需要固定、切片、灭活样品内源性的过氧化物酶和消化蛋白以暴露DNA等处理，可以采用通常的方法；用生物素或地高辛标记的探针的原位杂交检测通常采用免疫学的抗原抗体反应扩大反应信号、酶反应显色，本发明原位杂交检测可以采用通常的方法，例如可以采用博士德公司敏感性加强型原位杂交检测试剂盒I和二甲基联苯胺(DAB)显色试剂盒；本发明在采用免疫学的抗原抗体反应扩大反应信号方面有一定改进。

本发明优选的技术方案见实施例。

本发明提供一种用于栉孔扇贝病原类立克次氏体的原位杂交检测方法的试剂盒，该试剂盒包括上述特异探针和原位杂交试剂。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

(1)能直观地将检测的类立克次氏体病原与其引起的病理变化结合起来；

(2)在高效、准确检测类立克次氏体的同时可由样本切片上分析感染率和感染强度，这是其它分子生物学检测方法所不具有的特点；

(3)由于在杂交过程中探针与16s rRNA的杂交是特异的，且信号经过了逐级放大，所以远较常规的染色观察检测灵敏、精确；

(4)本发明的结果杂交显色后的切片可长期保存。

附图说明

图1：发病栉孔扇贝消化腺原位杂交检测结果，箭头示黄褐色包涵体(×1330)。

图2：发病栉孔扇贝外套膜原位杂交检测结果，箭头示黄褐色包涵体(×1330)。

具体实施方式

下列实验及操作实例是进一步对本发明的说明，不应该当作对本发明的限制。

实施例1：

栉孔扇贝样品：

发病栉孔扇贝幼贝于2002年6～8月取自山东青岛和长岛发生严重死亡的养殖场，平均大小为3.2cm×2.8cm×0.7cm(样本量n＝26)。健康栉孔扇贝幼贝于2002年8月取自大连扇贝养殖场，平均大小为3.6cm×3.1cm×0.9cm(样本量n＝16)。

健康扇贝做常规切片光镜观察、电镜观察和PCR检测确定是无类立克次氏体感染的非疫区扇贝做为阴性对照，疫区扇贝经常规切片光镜观察、电镜观察和PCR检测确定是有类立克次氏体感染的扇贝作为阳性对照。

使用的原位杂交主要试剂、材料：

(1)敏感性加强型原位杂交检测试剂盒I，博士德公司(武汉市武珞路650号武汉市博士德生物工程有限公司)；

(2)DAB显色试剂盒，博士德公司；

(3)多聚赖氨酸(poly-L-lysine)，Sigma，美国；

(4)焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)，Sigma，美国；

(5)原位杂交专用盖玻片，Sigma，美国；

(6)含DEPC的多聚甲醛固定液：1000mL蒸馏水中加Na₂HPO₄·12H₂O 36g，多聚甲醛干粉40g，加热搅拌溶解后加NaH₂PO₄·2H₂O 3g，pH 7.0～7.5；趁热加DEPC至终浓度0.1％；

(7)含DEPC的1％的多聚赖氨酸(PLL)：取PLL稀释成1％，加DEPC成终浓度0.1％；

(8)载玻片用前需泡于1％的多聚赖氨酸(PLL)中5分钟后分干，4℃保存备用；

(9)2×SSC：1000mL蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠(C₆H₅O₇Na₃·2H₂O)8.8g；

(10)0.5×SSC：300mL蒸馏水加100mL 2×SSC；

(11)0.2×SSC：270mL蒸馏水加30mL 2×SSC。

栉孔扇贝样品固定及切片制备：

(1)取扇贝易感组织消化腺于含0.1％的DEPC的4％的多聚甲醛固定2小时后用PBS洗涤3次，每次30分钟，然后常规脱水、透明、石蜡包埋、切片(6μm厚)；

(2)切片(必须平行做一个阳性和阴性对照)经常规石蜡脱水后加3％的H₂O₂室温处理10分钟，以灭活样品内源性的过氧化物酶，然后用蒸馏水洗2次。

合成特异探针：

根据本发明作者已完成的栉孔扇贝类立克次氏体在细菌分类学上具有保守功能的16SrDNA序列中的三段特有的DNA序列设计合成的三条寡核苷酸探针，合成后于每一探针的3’末段标记8～12个地高辛，探针序列为：

(1)5’-CCAACACCGAATCCGAAGACCCGACGTGGTTTA-3’

(2)5’-GGTCCTTCTTATCCTGTTACTGTCATCATCC-3’

(3)5’-ACTAGAATACACCTCCGAAGAAGTGCATCTCGT-3’

原位杂交：

(1)切片滴加3％的柠檬酸稀释的胃蛋白酶(1mL 3％的柠檬酸加2滴浓缩的胃蛋白酶，混匀)，37℃消化蛋白10分钟，然后用0.5mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，每次5分钟，再用蒸馏水洗1次；

(2)预杂交：在干的杂交盒底部加20％甘油20mL保持湿度，每张切片加20μL预杂交液，在38℃反应3小时，吸取多余液体，不洗；

(3)杂交：用杂交液稀释地高辛标记的探针，浓度为每条探针0.5μg/mL，每张切片加20μL杂交液，盖上盖玻片，39℃杂交过夜；

(4)杂交后洗涤：揭去盖玻片，30～37℃温水的2×SSC(柠檬酸三钠-NaCl缓冲液)洗涤2次，每次5分钟；0.5×SSC(柠檬酸三钠-NaCl缓冲液)洗涤15分钟；0.2×SSC(柠檬酸三钠-NaCl缓冲液)洗涤15分钟；

(5)滴加封闭液，37℃30分钟，甩去多余液体，不洗；

(6)滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃60分钟，0.5mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗4次，每次5分钟；

(7)滴加SABC-POD(链霉亲合素-生物素-过氧化物酶复合物)，37℃20分钟，0.5mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，每次5分钟；

(8)滴加生物素化过氧化物酶，37℃20分钟，0.5mol/L PBS洗4次，每次5分钟；

(9)显色：使用二甲基联苯胺(DAB)显色试剂盒(博士德公司产)，即1mL蒸馏水加显色试剂A、B、C各一滴，混匀，加至标本片上，镜下控制显色，一般30分钟内显色完毕，充分水洗；

(10)苏木精(安氏)染色30秒后充分水洗，酒精脱水、二甲苯透明，封片。

结果观察：

地高辛标记的寡核苷酸探针与细胞内寄生的类立克次氏体包涵体特异性地结合，包涵体DAB显色后呈黄褐色，宿主细胞核由苏木精染成兰色。

原位杂交探针特异地结合在发病栉孔扇贝的细胞内寄生的类立克次氏体包涵体，表明克隆的16S rDNA片段来源于栉孔扇贝类立克次氏体。原位杂交结果与普通H&E染色一致，所检测的健康扇贝原位杂交结果呈阴性反应无黄褐色包涵体，而所检测的病贝呈阳性反应，且原位杂交信号较H&E染色强。原位杂交较常规H&E染色灵敏度高。由于原位杂交是建立在特异性分子杂交的基础上的，较常规H&E染色准确、特异(见图1和图2)。

Claims

1.一种栉孔扇贝病原类立克次氏体的原位杂交检测方法，其包括如下步骤：

(2)进行原位杂交检测：

b.经酶反应显色；

所述的三条寡核苷酸探针的序列为：

(1)5’-CCAACACCGAATCCGAAGACCCGACGTGGTTTA-3’；

(2)5’-GGTCCTTCTTATCCTGTTACTGTCATCATCC-3’；

(3)5’-ACTAGAATACACCTCCGAAGAAGTGCATCTCGT-3’。

2.根据权利要求1所述的一种栉孔扇贝病原类立克次氏体的原位杂交检测方法，其特征在于，所述的栉孔扇贝组织切片制备方法如下：

(1)取扇贝易感组织消化腺于含0.1％焦碳酸二乙酯的4％的多聚甲醛固定2小时后用磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次30分钟，然后脱水、透明、石蜡包埋、切片，载玻片用前需泡于1％的多聚赖氨酸中5分钟后分干，4℃保存备用；

(2)切片平行做一个阳性和阴性对照，经常规石蜡脱水后加3％的H₂O₂室温处理10分钟，然后用蒸馏水洗2次；

所述的特异探针的3’末段标记8～12个地高辛；

所述的特异的探针与栉孔扇贝组织切片中类立克次氏体16s rRNA杂交结合并通过进一步的免疫学抗原抗体反应扩大信号的方法包括如下步骤：

(1)1mL 3％的柠檬酸加2滴浓缩的胃蛋白酶，混匀，滴加于切片，37℃消化蛋白10分钟，然后用0.5mol/L磷酸盐缓冲液洗3次，每次5分钟，再用蒸馏水洗1次；

(4)杂交后洗涤：揭去盖玻片，30～37℃温水的2×柠檬酸三钠-NaCl缓冲液洗涤2次，每次5分钟；0.5×柠檬酸三钠-NaCl缓冲液洗涤15分钟；0.2×柠檬酸三钠-NaCl缓冲液洗涤15分钟；所述的2×柠檬酸三钠-NaCl缓冲液为1000mL蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠8.8g；所述的0.5×柠檬酸三钠-NaCl缓冲液为300mL蒸馏水加100mL 2×柠檬酸三钠-NaCl缓冲液；所述的0.2×柠檬酸三钠-NaCl缓冲液为270mL蒸馏水加30mL 2×柠檬酸三钠-NaCl缓冲液；

(5)滴加封闭液，37℃ 30分钟，甩去多余液体，不洗；

(6)滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃ 60分钟，0.5mol/L磷酸盐缓冲液洗4次，每次5分钟；

(7)滴加链霉亲合素-生物素-过氧化物酶复合物，37℃ 20分钟，0.5mol/L磷酸盐缓冲液洗3次，每次5分钟；

(8)滴加生物素化过氧化物酶，37℃ 20分钟，0.5mol/L磷酸盐缓冲液洗4次，每次5分钟。

3.一种用于栉孔扇贝病原类立克次氏体的原位杂交检测方法的试剂盒，其包括权利要求1所述的特异探针和原位杂交试剂。