CN104826677B - 一种用于急症腹痛疾病排查的免疫检测微流控芯片及其制备方法和检测方法 - Google Patents

一种用于急症腹痛疾病排查的免疫检测微流控芯片及其制备方法和检测方法 Download PDF

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本发明公开了一种用于急症腹痛疾病排查的免疫检测微流控芯片，所述检测微流控芯片包括进样口、微流体通道、反应池、检测单元和出样口，所述进样口、反应池和出样口由微流体通道串行联接，所述检测单元分布于反应池中。本发明还公开了上述用于急症腹痛疾病排查的免疫检测微流控芯片的制备方法和检测方法。发明基于微流控芯片技术平台，集样品进样、免疫反应和光电检测于一体，极大地简化了操作流程，降低了样品和试剂消耗，并且不需要配备昂贵的仪器，极大地降低了使用成本，使现场即时检测成为可能，具有可预见的巨大的经济价值和社会价值。本发明具有检测便捷、样品消耗少、反应效率高、检测时间短、检测成本低等优点。

Description

一种用于急症腹痛疾病排查的免疫检测微流控芯片及其制备方法和检测方法
技术领域
本发明涉及微流控芯片技术领域，提供了一种用于急症腹痛疾病排查的免疫检测微流控芯片及其制备方法和检测方法。
背景技术
急症腹痛(acuteabdominalpain)是急诊患者最常见的病症之一。其就诊全年均可出现，高峰分别是秋季(9～11月)和夏季(6～8月)，就诊年龄集中在15～44岁之间(占就诊总数的72.7％)。常涉及内、外、儿、妇产甚至神经、精神各科的疾病。其主要病因是腹腔内脏器官发生病变、结构机能失常、腹外邻近器官损伤和/或全身性疾病所致。据统计，非创伤性急症腹痛疾病中急性胰腺炎的发病率最高，其次是急性胃肠炎、急性肠梗阻、急性阑尾炎、急性胆管炎、溃疡急性穿孔等。该类疾病往往具有发病急、变化快、病情复杂且严重等特点，加之，目前医院急诊科临床医生趋于年轻化，在急诊诊断方面经验不足，容易诊断有误或治疗欠妥，这样可能造成不良后果，甚至死亡。因此，对急症腹痛的诊断要求较高，能否及时做出明确的诊断，进行合理的治疗，将直接影响着疾病的治疗与预后。针对此现象，本发明提出将血清中胰蛋白酶原-2(TPSⅡ)、血清淀粉样蛋白A(SSA)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、降钙素原(PCT)与抵抗素进行联合检测的急症腹痛排查方案，研制相应的检测试剂盒，对急症腹痛常见的急性胰腺炎、急性阑尾炎、急性腹膜炎、急性胃肠炎与溃疡性急性穿孔进行排除。
目前，国外在临床急症腹痛的检测方面，主要通过结合患者病史，进行体格检查、实验室辅助检查，根据患者病情选择性地进行血糖、妊娠试验、血电解质、肝肾功能、腹部CT检查、腹腔诊断性穿刺以及腹水分析等检查分析，然后综合考虑，提出相应的治疗方案。此外，还采用对急症腹痛患者尿胰蛋白酶原-2的检测，进行急性胰腺炎的排查，但对于急症腹痛相关的其他疾病的排查尚没有相关生物标记物的报道。在国内，对于急症腹痛的临床检测与国外临床检测相似，但TPSⅡ在国外临床诊断中的应用开展较早，而在国内是近两年陆续才开始在三级甲等医院走入临床应用，它的临床应用价值依旧处于进一步的探索中。本发明通过对急症腹痛患者血清中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT与抵抗素进行联合检测，结合现行的微流控技术，实现对急症腹痛常见疾病的简捷、快速排查，为临床医生做出及时合理的诊断提供辅助工具。
发明内容
发明目的：本发明的第一个目的是提供一种用于急症腹痛疾病排查的免疫检测微流控芯片。通过建立一种多指标联合检测的免疫分析方法，为急症腹痛的相关疾病的排查提供一种灵敏度高、精确性好并且方便快速的微流控分析方法，帮助临床医生对急症腹痛相关疾病做出及时诊断，也为病情评估或预后判断进行辅助判断。
本发明的第二个目的是提供了用于急症腹痛疾病排查的免疫检测微流控芯片的制备方法。
本发明的第三个目的是提供了用于急症腹痛疾病排查的免疫检测微流控芯片的检测方法。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于急症腹痛疾病排查的免疫检测微流控芯片，所述检测微流控芯片包括进样口、微流体通道、反应池、检测单元和出样口，所述进样口、反应池和出样口由微流体通道串行联接，所述检测单元分布于反应池中。
进一步地，所述检测单元包括五个检测单元，依次为胰蛋白酶原-2检测单元、超敏C反应蛋白检测单元、血清淀粉样蛋白A检测单元、降钙素原检测单元及抵抗素检测单元。
进一步地，所述的微流控芯片由玻璃石英、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)或聚酯(PC)材料中的一种或几种加工而成。
进一步地，所述芯片的形状为圆柱状，胰蛋白酶原-2(TPSⅡ)检测单元、超敏C反应蛋白(hs-CRP)检测单元、血清淀粉样蛋白A(SSA)检测单元、降钙素原(PCT)检测单元及抵抗素(resistin)检测单元依次平均分布于该检测芯片的反应池中。
进一步地，所述各个检测单元预先固定有各个检测指标发生免疫反应所需的抗体，固定方式是物理吸附、化学交联、溶胶-凝胶包埋、微珠固定中的一种或几种。
进一步地，所述的反应池其容积大于反应体系所需的各种溶液体积的最大值，以保证能够完全容纳所需添加的试剂。
进一步地，所述的反应池和微流体通道具有避光特性。所述的避光特性是指构成反应池和微流体通道的材料对波长600～800nm的可见光具有全吸收的性质，即该波长特征的光无法通过芯片材料直接照射到样品溶液上。
检测过程中被测样品依次全部通过各个检测单元，保证了检测结果的准确性与可靠性。所述的检测单元中间带有小孔，以保证抗体的固定，防止各个检测指标之间的交叉污染及检测过程中抗原抗体的充分反应。
上述的用于急症腹痛疾病排查的免疫检测微流控芯片的制备方法，该微流控芯片是利用ELISA双抗夹心法，利用连接于固相载体上的抗体和标记抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-标记抗体免疫复合物。
具体包括以下步骤：1)芯片氧化；2)包被抗体；3)封闭；4)加抗原；5)加标记抗体。
上述的用于急症腹痛疾病排查的免疫检测微流控芯片的检测方法，包括以下步骤：待检测血样品溶液借助外接的泵阀系统或其他的控流系统依次经由进样口和微流体通道进入反应池，并在反应池中与各个检测单元内固定的荧光或酶标记的抗体进行抗原抗体特异性反应，产生特定的信号；最后采集反应产物产生的信号强度并进行分析，从而实现待测样品中的抗原含量的检测，然后结合制定的急症腹痛疾病的筛查方案，实现对急症腹痛疾病的排查。
有益效果：本发明基于微流控芯片技术平台，集样品进样、免疫反应和光电检测于一体，极大地简化了操作流程，降低了样品和试剂消耗，并且不需要配备昂贵的仪器，极大地降低了使用成本，使现场即时检测成为可能，具有可预见的巨大的经济价值和社会价值。
附图说明
图1一种用于单样品的急症腹痛疾病排查的免疫检测微流控芯片示意图，(a)为该芯片的侧视平面图，(b)为该芯片的检测单元的俯视图，(c)为该芯片的检测单元侧视图；其中：1为进样口，2为微流体通道，3为反应池，4为出样口，5为检测单元，A为TPSⅡ检测单元，B为SSA检测单元，C为hs-CRP检测单元，D为PCT检测单元，E为抵抗素检测单元；
图2急症腹痛疾病排查的免疫检测微流控芯片检测原理图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
实施例1：
一种检测微流控芯片，依次包括进样口1、微流体通道2、反应池3、检测单元5和出样口4，所述进样口1、反应池3和出样口4由微流体通道2串行联接，所述检测单元5分布于反应池3中。反应池3中包括五个检测单元，依次为胰蛋白酶原-2检测单元、超敏C反应蛋白检测单元、血清淀粉样蛋白A检测单元、降钙素原检测单元及抵抗素检测单元。微流控芯片由玻璃石英、聚二甲基硅氧烷(PDMS)加工而成。
芯片的形状为圆柱状，胰蛋白酶原-2(TPSⅡ)检测单元、超敏C反应蛋白(hs-CRP)检测单元、血清淀粉样蛋白A(SSA)检测单元、降钙素原(PCT)检测单元及抵抗素(resistin)检测单元依次平均分布于该检测芯片的反应池中。
各个检测单元预先固定有各个检测指标发生免疫反应所需的抗体，固定方式是物理吸附、化学交联。
实施例2
与实施例1基本一样，所不同的是，微流控芯片由聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)和聚酯(PC)材料加工而成。
各个检测单元预先固定有各个检测指标发生免疫反应所需的抗体，固定方式是溶胶-凝胶包埋。
实施例3
与实施例1基本一样，所不同的是，微流控芯片由玻璃石英、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)和聚酯(PC)材料加工而成。
各个检测单元预先固定有各个检测指标发生免疫反应所需的抗体，固定方式是微珠固定。
实施例4实施例1～3一种用于急症腹痛疾病排查的免疫检测微流控芯片的制备方法
该微流控芯片是利用ELISA双抗夹心法，利用连接于固相载体上的抗体和标记抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-标记抗体免疫复合物。具体制备过程如下：
(1)芯片氧化
a、移取0.5MNaIO4加在芯片的每个反应区，将芯片放入湿盒中，置于37℃恒温箱内避光反应0.5小时；
b、芯片从湿盒中取出，将反应区内剩余液体用吸水纸从背面吸干，用蒸馏水洗涤纸上未反应的高碘酸钠。
(2)包被抗体
a、在芯片的5个反应区分别加浓度为10μg/mLTPSⅡ、hs-CRP、SSA、PCT及抵抗素单克隆抗体，放入湿盒中，置于37℃恒温箱内反应0.5小时；
b、取出芯片，将反应区内剩余液体用吸水纸从背面吸干，用蒸馏水洗涤纸上未反应的包被抗体。
(3)封闭
在芯片的5个反应区各加质量分数为1％BSA溶液，放入湿盒中，置于37℃恒温箱内反应0.5小时。
(4)加抗原
a、在芯片第一排依次分别依次加入0/10/20/50/100/200ng/ml的TPSⅡ、hs-CRP、SSA、PCT及抵抗素标准品，在下面两排中每三点加入同一血清样品，放入湿盒中，置于37℃恒温箱内反应0.5小时；
b、取出芯片，将反应区内剩余液体用吸水纸从背面吸干，用蒸馏水洗去多余的抗原。(5)加标记抗体
a、在芯片的5个反应区分别加入TPSⅡ、hs-CRP、SSA、PCT及抵抗素的荧光标记抗体，放入湿盒中，置于37℃恒温箱内反应0.5小时；
b、取出芯片，将反应区内剩余液体用吸水纸从背面吸干，用蒸馏水洗涤纸上未反应的标记抗体。
通过以上步骤即可完成该急症腹痛疾病排查的免疫检测微流控芯片的制备。所制得的芯片如图1(a)(b)(c)所示。
实施例5上述制备的微流控芯片的检测方法以及检测结果
检测单元中预先固定相应检测指标检测所需的被荧光或酶标记的抗体；在检测过程中，待检测血样品溶液借助外接的泵阀系统或其他的控流系统依次经由进样口和微流体通道进入反应池，并在反应池中与各个检测单元内固定的荧光或酶标记的抗体进行抗原抗体特异性反应，产生特定的信号；最后通过荧光显微镜或其他光学检测仪器，采集反应产物产生的信号强度并进行分析，从而实现待测样品中的抗原含量的检测。本试验中所用的血量为10微升，所得检测结果如表1。
表1微流控芯片检测结果
hs-CRP TPSⅡ SSA PCT 抵抗素
1 179.83 133.66 167 100 192
2 180.6 132.39 170 102 186
3 174.88 138.87 183 95 196
4 188.92 138.14 168 98 188
5 182.41 136.44 172 172 190
6 180.09 139.29 179 98 195
7 183.34 132.42 172 95 186
8 179.9 131.51 170 94 186
9 180.86 131.51 168 97 193
10 181.02 136.66 171 99 188
AVR 181.19 135.09 172.00 97.70 190.00
SD 3.51 3.12 5.12 2.5 3.80
CV 1.94％ 2.31％ 2.98％ 2.56％ 2.00％
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种用于急症腹痛疾病排查的免疫检测微流控芯片，其特征在于，所述检测微流控芯片包括进样口（1）、微流体通道（2）、反应池（3）、检测单元（5）和出样口（4），所述进样口（1）、反应池（3）和出样口（4）由微流体通道（2）串行联接，所述检测单元（5）分布于反应池（3）中，所述检测单元（5）包括五个检测单元，依次为胰蛋白酶原-2检测单元、超敏C反应蛋白检测单元、血清淀粉样蛋白A检测单元、降钙素原检测单元及抵抗素检测单元。
2.根据权利要求1所述的用于急症腹痛疾病排查的免疫检测微流控芯片，其特征在于，所述的微流控芯片由玻璃石英、聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯中的一种或几种加工而成。
3.根据权利要求1所述的用于急症腹痛疾病排查的免疫检测微流控芯片，其特征在于，所述芯片的形状为圆柱状。
4.根据权利要求1所述的用于急症腹痛疾病排查的免疫检测微流控芯片，其特征在于，所述各个检测单元预先固定有各个检测指标发生免疫反应所需的抗体，固定方式是物理吸附、化学交联、溶胶-凝胶包埋、微珠固定中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的用于急症腹痛疾病排查的免疫检测微流控芯片，其特征在于，所述的反应池（3）其容积大于反应体系所需的各种溶液体积的最大值。
6.权利要求1~5任一项所述的用于急症腹痛疾病排查的免疫检测微流控芯片的制备方法，其特征在于，该微流控芯片是利用ELISA双抗夹心法，利用连接于固相载体上的抗体和标记抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-标记抗体免疫复合物。
7.根据权利要求6所述的用于急症腹痛疾病排查的免疫检测微流控芯片的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：1）芯片氧化；2)包被抗体；3)封闭；4)加抗原；5)加标记抗体。
8.权利要求1~5任一项用于急症腹痛疾病排查的免疫检测微流控芯片的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：待检测血样品溶液借助外接的泵阀系统或其他的控流系统依次经由进样口和微流体通道进入反应池，并在反应池中与各个检测单元内固定的荧光或酶标记的抗体进行抗原抗体特异性反应，产生特定的信号；最后采集反应产物产生的信号强度并进行分析，从而实现待测样品中的抗原含量的检测，然后结合制定的急症腹痛疾病的筛查方案，实现对急症腹痛疾病的排查。
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