CN102500435A - 一种可用于酶联免疫反应的微流芯片 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种廉价、易于制备、可用于酶联免疫反应的微流芯片，包括微流层、控制层以及将微流层和控制层连接起来的连接层，微流层中的微流通道与控制层中的控制通道具有至少一个交叠点，交叠点位置的连接层由弹性体材料构成，当控制通道中的压力增加到一定值时，上述至少一个交叠点位置的弹性体连接层将向微流层方向膨胀并与微流通道内表面接触而形成一定大小的接触面，其中至少一部分交叠点处形成的接触面的宽度小于交叠点处微流通道的宽度，从而保持微流通道处于连通的状态，当控制通道中的压力恢复时，交叠点位置的弹性体连接层恢复原态。通过上述结构可以方便地在芯片中形成ELISA反应区，从而快捷地进行ELISA试验。

Description

一种可用于酶联免疫反应的微流芯片

技术领域

本发明涉及一种微流芯片，特别涉及一种廉价、易于制备、可用于酶联免疫反应的微流芯片。

背景技术

酶联免疫反应(Enzyme-linked immunoassay，简称ELISA)是一种利用抗原抗体之间专一性键合的特性对抗体进行检测的方法。自上世纪60年代以来，这种免疫酶技术被广泛应用于生物学及医学等领域，用于检测动物血清中抗体、病毒、激素以及疾病标记物等重要指标。常规的ELISA反应是在96孔板上实现的，分析中每一步需要清洗和混合的过程。这种技术存在反应时间长、样品操作不均一和试剂消耗量大等缺陷。基于这些问题，研究者引入了微流芯片这一新技术，原理是通过化学分析设备的微型化与集成化，最大限度的把分析实验室的功能转移到便携的分析设备中，甚至集成到方寸大小的芯片上。

常规的微流芯片在免疫检测领域具有显著的优越性，但是也存在缺陷和困难。例如，应当如何控制微流芯片免疫技术中普遍偏高的背景值，如何避免因流体失控而造成组内和组间CV值较大的现象。有研究者将共聚焦显微镜以及内反射荧光显微镜引入微流技术，复杂的设备应用显然不利于实际的应用和推广。尤其是目前的研究方向多集中在设备的革新上，虽然可以实现灵敏度高的ELISA，却无法完全模拟传统模式临床血清检测。由此可见，微流控免疫检测技术仍然有很大的开发空间。

基于以上分析，发明人提出“综合优化，利用最简易装置达到快速高效检测”的思路。目标在最基本设备如荧光显微镜、CCD、阀门等不做改变的情况下，对可变因素如芯片设计，反应条件进行优化，将常规免疫临床检测顺利转移到微流芯片的装置中，达到快捷高效的目的。

发明内容

本发明的目的正是为了解决现有技术中基于微流芯片的ELISA设备复杂、昂贵、背景值高、组内和组间CV值较大等问题，提供一种廉价、易于制备且适合进行高通量、高效、快捷ELISA试验的微流芯片。

本发明中的“芯片”与通常本领域所定义的芯片概念相同，其外观为厚度均一的平整片状物体，最常见的形状为长方形或正方形。

本发明中的“一条微流通道”指的是从入口到出口之间连通的直线型的微流通道。

本发明中的“交叠点”指的是微流通道与控制通道在微流芯片上的投影的相交点。显而易见，由于微流通道和控制通道属于不同的层，它们之间不可能是连通的。

本发明中的“交汇点”指的是同一个微流层的不同微流通道之间交汇连通的点。因此，与同一个交汇点相连的不同微流通道之间通过交汇点连通。

除非特别说明，本发明的“n种以上”、“n种以下”均包括数值n本身。

本发明的设计思路是，首先，制备方法采用多层软光刻技术以降低生产成本、减小制备难度。其次，该芯片部分设计借鉴Stephen R.Quake的研究成果，控制层阀门均为弹性体阀门，除此之外，还在管道交叉处增加圆形下压阀，即反应阀门，利用其控制反应室的面积；和过去简单地将抗体固定于十字管道交叉处的研究不同，此结构增强了微环境下免疫反应区域的可控性。

虽然最近很多研究展现了磁珠法在微流免疫检测中的优势，但是考虑到检测样品多来自于病人血清，含有大量杂质，容易与单位表面积大并且反应强度高的磁珠发生非特异性吸附，另外磁珠法自身的缺点如过柱时间很长，洗脱不完全等缺点，因此发明人放弃磁珠，最终采用环氧基团修饰后的玻片固相基底进行检测。

本发明采用的技术方案如下。

一种可用于酶联免疫反应的微流芯片，所述微流芯片包括微流层、控制层以及将微流层和控制层连接起来的连接层，微流层具有至少一条微流通道，控制层具有至少一条控制通道，所述至少一条微流通道与所述至少一条控制通道具有至少一个交叠点，所述交叠点位置的连接层由弹性体材料构成，当控制通道中的压力增加到一定值时，上述至少一个交叠点位置的弹性体连接层将向微流层方向膨胀并与微流通道内表面接触而形成一定大小的接触面，其中至少一部分交叠点处形成的接触面的宽度小于交叠点处微流通道的宽度，从而保持微流通道处于连通的状态，当控制通道中的压力恢复时，交叠点位置的弹性体连接层恢复原态，上述交叠点处的结构在酶联免疫反应中生成反应区域，称为“反应阀门”；其余交叠点处的弹性体连接层将向微流层方向膨胀并与微流通道内表面接触至完全阻断微流通道，使其处于断开的状态，当控制通道中的压力恢复时，交叠点位置的弹性体连接层恢复原态，微流通道重新连通，上述交叠点处的结构用于控制微流通道的连通状态，称为“控制阀门”。

采用上述技术方案便可以简单而方便地进行ELISA实验。利用上述芯片进行ELISA实验时，先施加一定的压力到反应阀门所在的控制通道上，阀门将膨胀并与微流通道内壁接触从而保护一定面积的微流通道，此时往微流通道中通入封闭液体，将没有被保护的微流通道表面(即非ELISA反应区域)封闭起来；然后，通入包被抗原并撤销施加到反应阀门所在的控制通道的压力，这使得包被抗原流经微流通道的时候，只会在被反应阀门保护的区域大量吸附，区别于周围的非ELISA反应区域；之后再依次通入各种相应的抗原抗体溶液进行反应，最后对圆形阀区域的荧光进行图片采集，便完成了一个ELISA实验。

优选的，微流层具有两条以上的微流通道，所述两条以上的微流通道具有至少一个交汇点，“反应阀门”位于上述交汇点处。多条微流通道形成十字交汇点，便可以通过不同走向的微流通道输入不同的液体，方便操作。将“反应阀门”设于上述交汇点处，不同的液体便都可以流经反应位点了。

优选地，微流通道分为横向和纵向两组，组内的微流通道之间没有交汇点，每一条微流通道均与另一组所有的微流通道交汇。由此，微流通道之间就形成纵横交错的网络，每一个交汇点都具有反应位点，一块微流芯片就可以同时进行多个ELISA实验。例如，横向微流通道数目为m，纵向微流通道数目为n，m、n皆为大于或等于2的整数，则交汇点的数目为m×n，反应位点的数目也有m×n个。

优选地，任意两个相邻的反应阀门之间均设置一个控制阀门。这样，当把反应阀门左右两侧的控制阀门关闭，同时将反应阀门上下两侧的控制阀门打开，则液体只能沿着纵向的微流通道流动；相反，当把反应阀门上下两侧的控制阀门关闭，同时将反应阀门左右两侧的控制阀门打开，则液体只能沿着横向的微流通道流动。这样做的好处是，通过纵向的微流通道输送一种液体，通过横向的微流通道输送另一种液体，两种液体彼此不会混合，而只在反应位点交替流过。另外，当需要对反应位点进行孵育的时候，关闭反应位点周围(也即反应阀门周围)所有的4个控制阀门，则可以在反应应点处封闭一定的液体，进行充分的孵育。

优选地，微流层、控制层和连接层均由弹性体材料构成，控制通道在与微流通道的交叠点处扩大形成空腔。由于许多弹性体材料具有良好的加工成型的性能，例如热塑性、热固性、辐射诱导交联等，无需昂贵的设备以及复杂的方法，采用实验室简单的常用设备便可以方便地制备出各种结构的微流芯片。控制通道在与微流通道的交叠点处扩大形成空腔，由于空腔位置的连接层较薄，因此当控制通道中的压力增加时，空腔位置处的连接层将最先膨胀，控制合适的压力便可以保证只有空腔范围内的连接层膨胀，从而只在与空腔范围对应的微流通道内壁区域形成空白区。

优选地，反应阀门处的空腔在微流通道宽度方向上的尺寸小于微流通道的宽度，控制阀门处的空腔在微流通道宽度方向上的尺寸大于微流通道的宽度，以保证反应阀门下压的时候微流通道还处于连通状态，而控制阀门下压的时候微流通道处于断开状态。

优选地，所述空腔的形状为圆形、长方形或正方形。空腔的形状实际上并不受限制，但为了方便观察比较实验结果的考虑，反应阀门空腔一般都设置成规则的相同形状，例如圆形、长方形或正方形等。控制阀门空腔一般设置为长方形或正方形，保证其在微流通道宽度上的尺寸大于微流通道的宽度即可。

优选地，弹性体材料选自聚二甲基硅氧烷(PDMS)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚氨酯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚氯乙烯(PVC)、环状聚烯烃共聚合物(Cyclic Olefin Copolymers；COC)、聚偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚砜、尼龙、苯乙烯-丙烯酸共聚物、天然橡胶、聚异戊二烯、丁基橡胶、卤化丁基橡胶、聚丁二烯、丁苯橡胶、丁腈橡胶、氯丁二烯橡胶、乙丙橡胶、表氯醇橡胶、聚丙烯酸酯橡胶、硅酮橡胶、氟硅橡胶、含氟弹性体(FKM)、全氟弹性体(FFKM)、乙烯-乙酸乙烯酯、节肢弹性蛋白(resilin)、弹性蛋白(elastin)、聚酰亚胺、酚醛树脂中的一种或者任意两种以上的混合物。实施例中使用聚二甲基硅氧烷制备微流芯片，这是由于PDMS具有许多有利于微浇筑、微模塑和微图案化的材料特性。本领域技术人员能够了解，所有本领域现有的弹性体材料都能应用于本发明的微流芯片中，而并不限于上述优选的实例。

本发明还提供一种使用上述微流芯片进行酶联免疫反应(ELISA)的方法：先施加一定的压力到反应阀门所在的控制通道上，阀门将膨胀并与微流通道内壁接触从而保护一定面积的微流通道，此时往微流通道中通入封闭液体，将没有被保护的微流通道表面-即非ELISA反应区域-封闭起来；然后，通入包被抗原并撤销施加到反应阀门所在的控制通道的压力，包被抗原流经微流通道的时候，只会在被反应阀门保护的区域大量吸附反应，区别于周围的非ELISA反应区域；之后再依次通入各种相应的抗原抗体溶液进行反应，最后对圆形阀区域的荧光进行图片采集，便完成了一个ELISA实验。

使用本发明的微流芯片进行ELISA实验的优点是显而易见的，首先，微流芯片可以通过很简单、廉价的方法制得，而不需要昂贵的大型仪器；其次，不需要共聚焦显微镜以及内反射荧光显微镜等复杂的非常规设备，使用最基本设备如荧光显微镜、CCD、阀门等便可以进行常规免疫临床检测，达到快捷高效的目的。低消耗、高通量等微流控芯片特有的优势使得本微流控芯片使用极少量的样品就可以多个并行检测结果，适用于工业上的应用。

附图说明

图1(a)一种优选结构的ELISA集成微流芯片全图；(b)ELISA集成微流芯片局部放大图，蓝色圆形阀门用来生成反应区域，红色及黄色阀门用来隔离出反应小室；(c)施加压力到反应阀门上，连接层薄膜下压保护住流体层的局部区域；(d)撤销施加到反应阀门上的压力，连接层薄膜恢复原始状态，不再保护流体层的局部区域；(e)用黄色染料来表现封闭液流入流体层管道的过程，圆形阀门下压，保护反应区域；(f)用蓝色染料来表现包被抗原流入流体层管道的过程，圆形阀门释放压力，反应液物理吸附在反应区域；(g)用带FITC绿色荧光标记的BSA溶液验证阀工作的原理，圆形荧光阵列表明反应区域；(h)用直接ELISA反应来验证ELISA集成微流控芯片工作原理，其中，包被抗原的浓度及检测一抗的浓度均为1.5mg/ml。

图2芯片设计平面图(使用AutoCAD2010绘制，LinkCad填充，分辨率为1μm)，绿色表示流体层，黑色表示控制层，中央密布圆形反应室的区域称为反应区。C1，C2，C3，C4阀门分别控制洗涤液体(PBS)，封闭缓冲液(Blocking Buffer)，包被抗体(CapAb)，检测抗体(DetAb)的进样；C5阀门控制八梯度平行通道(待测样本)进样；C6阀门保护整个芯片；C7阀门控制液体沿纵向平行管道流动；C8阀门控制液体沿横向平行管道流动；C9阀门控制废液出口(Layout)；C10阀门(Quake阀)控制反应阀门的形成；C11控制四梯度样本(其他试剂通道)进样。

图3Epoxy玻片吸附能力检测试验。(a)-(h)ELISA反应区域原始结果图；(i)-(p)ELISA反应区域结果经matlab处理后的伪彩图，颜色对应color bar表明荧光的亮度，对应的包被抗原的浓度梯度依次为1mg/ml，200μg/ml，40μg/ml，8μg/ml，1.6μg/ml，0.3μg/ml，0.06μg/ml，control；(q)荧光强度曲线，用Image-J得到不同浓度包被抗原下的反应区域的荧光强度对数值。

图4不同浓度一抗的检测试验。(a)-(h)ELISA反应区域原始结果图；(i)-(p)ELISA反应区域结果经matlab处理后的伪彩图，颜色对应color bar表明荧光的亮度，对应的一抗的浓度梯度依次为1μg/ml，100ng/ml，10ng/ml，1ng/ml，100pg/ml，10pg/ml，1pg/ml，0pg/ml(control)；(q)荧光强度曲线，用Image-J得到不同浓度一抗下的反应区域的荧光强度对数值。

具体实施方式

以下举例说明微流芯片的制备方法，下面的实例中使用较简便的光刻胶SU-8、AZP 4620以及PDMS(Sylgard 184)制备，但并不表示微流芯片只能由这样的方法制备，本领域技术人员可以了解，任何本领域现有的技术都可以用来制备具有本发明结构的微流芯片。

我们首先使用光刻蚀的方法分别制作流体层管道(即微流通道)和控制层管道(即控制通道)的模板。控制层管道用负胶SU8-2010制作。倾倒负胶SU8-2010到干净的硅片上，1000rpm的转速旋转1分钟，65度加热板烘烤5分钟，95度加热板烘烤10分钟，曝光，重复65度加热板烘烤5分钟，95度加热板烘烤10分钟，显影，150度加热板加热3个小时加固图形。从而得到高度为20微米的方形管道。流体层正胶管道用正胶AZP 4620制作。将硅片用六甲基二硅烷(HMDS)熏5分钟，然后倾倒正胶AZP 4620到熏好的干净硅片上，1000rpm的转速旋转1分钟，65度预热1分钟，95度加热1分钟，然后在现有光刻胶上再甩一层光刻胶后，65度预热1分钟，95度加热3分钟，115度加热5分钟，进一步固化各层，曝光，显影，然后在加热板上以每小时增加10度的方法从40度逐步升温到210度以圆化正胶管道，从而得到高度为25微米的半圆形管道。

我们使用软刻蚀的方法制作芯片，所用的材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)。在被用来制作微流控芯片之前，所有的模板都要被三甲基氯硅烷(TMCS)熏10分钟以利于聚合的PDMS和硅片的脱离。我们先将Sylgard 184的A组分和B组分(粘连剂)以5比1的比例混合，倾倒到控制层管道的硅片上，真空抽气除泡，80度烘箱加热30分钟，从硅片上撕下带有控制层管道的PDMS块，切割，打孔。同时将Sylgard 184的A组分和B组分(粘连剂)以23比1的比例混合，倾倒到流体层管道的硅片上，以1300rpm的速度将混合液体均匀甩到硅片上，80度烘箱加热30分钟，然后将已打好孔的控制层管道的PDMS块对准贴合到烘好的流体层硅片上，在80度烘箱中聚合60分钟，撕下后，打孔。另外，我们将Sylgard 184的A组分和B组分(粘连剂)以20比1的比例混合，倾倒到载玻片上，以1300rpm的速度将混合液体均匀甩到载玻片上，80度烘箱加热30分钟，将打好孔的两层聚合PDMS块贴到载玻片上，80度烘箱加热过夜。

实施例1

微流芯片的结构。本实施例详细说明本发明的微流芯片的一个优选结构，该结构如图1所示。该芯片的微流层具有4条横向的微流通道、8条纵向的微流通道，彼此互相交汇形成一个4×8的棋盘矩阵，32个交汇点处的32个反应阀门对应着32个ELISA反应位点，每一个反应阀门周围都有4个控制阀门，控制着与该反应位点相通的四个方向的微流通道，在横向微流通道上，相邻的两个反应阀门之间设置了2个控制阀门，以便在围绕反应位点周边形成较小的封闭反应空间，因此一共有80个这样的控制阀门。微流通道通过若干条管道与外接相通，一部分管道用于往微流通道中注入液体，其余的管道用于从微流通道中排出液体。反应区域局部放大图如图1(b)所示，黄色阀门及红色阀门用来隔离出各个反应小室，而蓝色圆形阀门(即反应阀门)用来生成反应区域。当施加一定的压力到这个反应阀门上时，反应阀门会下压从而保护住微流通道的部分区域面积。在将包被抗原通入微流通道之前，我们会通入封闭液封闭非ELISA反应区域，此时我们施加压力下压反应阀门保护住流体层位于圆形阀下的面积(图1(c)、(e))，这样封闭液体就不会侵入反应区域。当通入包被抗原的时候，我们释放掉圆形保护阀的压力(图1(d)、(f))，这样，包被抗原就会流经反应区域，从而只会在反应区域被大量吸附，区别于周围的封闭区域，之后再依次通入各种相应的抗原抗体溶液进行反应，最后对圆形阀区域的荧光进行图片采集，通过使用Image-J程序分析荧光强度来定量标定待测抗体的浓度。我们用带绿色荧光的BSA-FITC溶液来验证整个芯片的功能。首先我们压下反应阀门，通入1mg/ml的BSA溶液封闭整个芯片10分钟，然后通入1.5mg/ml的BSA-FITC溶液孵育30分钟，待PBS冲洗整个管道后，我们发现BSA-FITC溶液只会吸附在反应阀门下的区域，从而在整个芯片上会产生圆形的荧光阵列(图1(g))。然后我们用该芯片进行了简单的直接ELISA反应，在反应区域物理吸附1.5mg/ml的Hunan IgG孵育10分钟，然后通入1.5mg/ml的Goat-anti-HumanIgG-FITC孵育10分钟，通过抗原抗体的相互反应使一抗连接到抗原上，PBS冲洗后可在圆形阀区域看到明显的荧光阵列表达(图1(h))。

实施例2

具体的试验操作过程。

图2显示了微流芯片的设计图。下面将结合该芯片设计图详细说明ELISA试验的操作过程。

芯片结构如图2所示。在实际微流芯片免疫检测中，利用11个阀门(对应图2的C1-C11)控制不同试剂的进样，以及液体的流动方向。圆形的黑色阀门是反应阀门，长方形的黑色阀门是控制阀门。C1-C11阀门的功能如下：C1，C2，C3，C4阀门分别控制洗涤液体(PBS)，封闭缓冲液(Blocking Buffer)，包被抗体(CapAb)，检测抗体(DetAb)的进样；C5阀门控制八梯度平行通道(待测样本)进样；C6阀门保护整个芯片；C7阀门控制液体沿纵向平行管道流动；C8阀门控制液体沿横向平行管道流动；C9阀门控制废液出口(Layout)；C10阀门(Quake阀)控制反应阀门的形成；C11控制四梯度样本(其他试剂通道)进样。

以直接夹心ELISA(Direct Sandwich ELISA)为例，具体操作如下：

(1)进样前排气：控制层施加压力为0.15MPa左右，流体层压力为控制层1/10。进样前将控制层所有阀门关闭，按照图1中的排序，依次往流体层通入试剂，排去气泡。

(2)封闭反应区：封闭Button(C10)被施加压力保护其正下方的区域(即反应区域)，依次打开阀门C2、C6、C7、C8、C9，封闭液进入微流管道。当封闭液占据绝大部分区域后关闭C9，用封闭液将管道中的气泡排走。之后，关闭以上所有阀门；孵育。

(3)洗涤：孵育完毕后，打开阀门C1、C6、C7、C8、C9，洗涤液进入，洗去残留封闭液，洗涤后关闭所有控制层阀门。

(4)抗体包被：依次打开阀门C3、C6、C7、C8、C9，通入包被抗体；待排去残留洗涤液后，打开阀门C10，保证反应区域的基底第一时间被包被抗体包被(未与封闭液和洗涤液接触)，依次关闭除C10外的以上阀门；孵育时长15分钟。注：C10在此步包被完成后不再关闭。

(5)洗涤：孵育完毕后，打开阀门C1、C6、C7、C8、C9，通入洗涤液，洗去残留包被抗体，洗涤后关闭所有控制层阀门。

(6)再次封闭：依次打开阀门C2、C6、C7、C8、C9，封闭液再次进入微流管道，进一步封闭Button内基底未与包被抗体结合的空白位点；孵育时长10分钟，完毕后充分洗涤。

(7)通入样品：依次打开C5、C8、C9，待测样品以及标准样品从S1-S8入口进入，沿纵向平行管道流过反应区，关闭所有控制阀；孵育时长15分钟，此时抗原与包被抗体结合，完毕后充分洗涤。

(8)通入检测抗体：依次打开C4、C6、C7、C8、C9，通入检测抗体，后关闭以上阀门，孵育时长5分钟，完毕后充分洗涤。

(9)提前10分钟打开汞灯，使用蓝光激发，在荧光显微镜下观察Button内残留信号，并用CCD拍照。

实施例3

用本发明的芯片进行ELISA实验的结果。

经过资料的检索，为了更好的吸附包被抗原，我们使用epoxy玻片来取代简单的PDMS吸附，首先我们检测epoxy玻片的吸附能力。我们将1mg/ml的Human IgG按照5X的梯度稀释，通入以epoxy为基底的芯片中，孵育20分钟，然后通入Goat-anti-Human IgG-FITC的带荧光标记的一抗孵育3分钟，洗涤后采集荧光信号，如图2(a-h)所示，将原始图片用matlab伪彩处理后通过颜色表明荧光强度的强弱，如图2(i-p)所示。图片所示区域的Human IgG的强度依次为1mg/ml，200μg/ml，40μg/ml，8μg/ml，1.6μg/ml，0.3μg/ml，0.06μg/ml，0μg/ml(control)。用Image-J处理图片得到荧光的实际对数数值，描绘成曲线，如图2(q)所示。由图片及曲线结果，我们发现，随着包被浓度的提高，荧光强度随之提高，但当包被浓度过高后，由于非特异性吸附导致除反应区域外的封闭区域也会产生较强的荧光信号。若包被浓度过低，则导致之后的抗原抗体反应信号过低，影响准确性。

经过多次摸索及浓度梯度试验，我们选取500μg/ml作为包被抗原的浓度，125μg/ml作为检测抗体的浓度。在此条件下，我们对1pg/ml至1μg/ml区间以10X的浓度梯度对检测抗体进行检测。我们将500μg/ml的Mouse-anti-Human IgG通入以epoxy为基底的芯片中，孵育15分钟，然后通入不同浓度的Human IgG的一抗孵育10分钟，最后通入125μg/ml的Goat-anti-HumanIgG-FITC的带荧光标记的检测二抗，孵育5分钟，洗涤后采集荧光信号，如图3(a-h)所示，将原始图片用matlab伪彩处理后通过颜色表明荧光强度的强弱，如图3(i-p)所示。图片所示区域的Human IgG的强度依次为1μg/ml，100ng/ml，10ng/ml，1ng/ml，100pg/ml，10pg/ml，1pg/ml，0pg/ml(control)。用Image-J处理图片得到荧光的实际对数数值，描绘成曲线，如图32(q)所示。由图片及曲线结果，我们发现，随着一抗浓度的提高，荧光强度随之提高，荧光强度可以表明待测一抗的浓度。

Claims (10)

1.一种可用于酶联免疫反应的微流芯片，其特征在于所述微流芯片包括微流层、控制层以及将微流层和控制层连接起来的连接层，微流层具有至少一条微流通道，控制层具有至少一条控制通道，所述至少一条微流通道与所述至少一条控制通道具有至少一个交叠点，所述交叠点位置的连接层由弹性体材料构成，当控制通道中的压力增加到一定值时，上述至少一个交叠点位置的弹性体连接层将向微流层方向膨胀并与微流通道内表面接触而形成一定大小的接触面，其中至少一部分交叠点处形成的接触面的宽度小于交叠点处微流通道的宽度，从而保持微流通道处于连通的状态，当控制通道中的压力恢复时，交叠点位置的弹性体连接层恢复原态，上述交叠点处的结构在酶联免疫反应中生成反应区域，称为“反应阀门”；其余交叠点处的弹性体连接层将向微流层方向膨胀并与微流通道内表面接触至完全阻断微流通道，使其处于断开的状态，当控制通道中的压力恢复时，交叠点位置的弹性体连接层恢复原态，微流通道重新连通，上述交叠点处的结构用于控制微流通道的连通状态，称为“控制阀门”。

2.根据权利要求1所述的微流芯片，其特征在于微流层具有两条以上的微流通道，所述两条以上的微流通道具有至少一个交汇点，“反应阀门”位于上述交汇点处。

3.根据权利要求2所述的微流芯片，其特征在于微流通道分为横向和纵向两组，组内的微流通道之间没有交汇点，每一条微流通道均与另一组所有的微流通道交汇。

4.根据权利要求3所述的微流芯片，其特征在于横向微流通道数目为m，纵向微流通道数目为n，m、n皆为大于或等于2的整数，交汇点的数目为m×n。

5.根据权利要求1-4的任一项所述的微流芯片，其特征在于任意两个相邻的反应阀门之间均设置一个控制阀门。

6.根据权利要求1-5的任一项所述的微流芯片，其特征在于微流层、控制层和连接层均由弹性体材料构成，控制通道在与微流通道的交叠点处扩大形成空腔。

7.根据权利要求6所述的微流芯片，其特征在于反应阀门处的空腔在微流通道宽度方向上的尺寸小于微流通道的宽度，控制阀门处的空腔在微流通道宽度方向上的尺寸大于微流通道的宽度。

8.根据权利要求6或7所述的微流芯片，其特征在于所述空腔的形状为圆形、长方形或正方形。

9.根据权利要求1-8的任一项所述的微流芯片，其特征在于所述弹性体材料选自聚二甲基硅氧烷(PDMS)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚氨酯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚氯乙烯(PVC)、环状聚烯烃共聚合物(Cyclic Olefin Copolymers；COC)、聚偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚砜、尼龙、苯乙烯-丙烯酸共聚物、天然橡胶、聚异戊二烯、丁基橡胶、卤化丁基橡胶、聚丁二烯、丁苯橡胶、丁腈橡胶、氯丁二烯橡胶、乙丙橡胶、表氯醇橡胶、聚丙烯酸酯橡胶、硅酮橡胶、氟硅橡胶、含氟弹性体(FKM)、全氟弹性体(FFKM)、乙烯-乙酸乙烯酯、节肢弹性蛋白(resilin)、弹性蛋白(elastin)、聚酰亚胺、酚醛树脂中的一种或者任意两种以上的混合物。

10.使用权利要求1-9的任一项微流芯片进行酶联免疫反应(ELISA)的方法，其特征在于先施加一定的压力到反应阀门所在的控制通道上，阀门将膨胀并与微流通道内壁接触从而保护一定面积的微流通道，此时往微流通道中通入封闭液体，将没有被保护的微流通道表面-即非ELISA反应区域-封闭起来；然后，通入包被抗原并撤销施加到反应阀门所在的控制通道的压力，包被抗原流经微流通道的时候，只会在被反应阀门保护的区域大量吸附，区别于周围的非ELISA反应区域；之后再依次通入各种相应的抗原抗体溶液进行反应，最后对圆形阀区域的荧光进行图片采集，便完成了一个ELISA实验。

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