CN209727963U - 基于微流控芯片的免疫荧光检测系统 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种基于微流控芯片的免疫荧光检测系统，包括芯片本体，其内部形成有一条或多条彼此独立用于测试待测样品的测试流道，测试流道包括反应池以及与反应池连通的第一进液通道、第二进液通道和出液通道。其中，出液通道的高度均小于所述微球的直径。第一进液通道用于通入样品溶液，第二进液通道用于通入捕获抗体修饰的微球溶液及检测抗体。本实用新型中出液通道的高度均小于微球的直径，所以微球只能在第二进液通道中流动，并且停留在反应池中与后续样品及反应试剂反应，而不会从出液通道内吸出，从而消除了微堰或微阀等特殊结构，使芯片结构更加简单，且易于制作，成本更加低。
Description
技术领域
本实用新型属于微流控技术领域，尤其涉及一种基于微流控芯片的免疫荧光检测系统。
背景技术
即时检验(POCT)系统是一种可以在实验室中实现快速检测的分析方法。POCT设备可以为重症患者提供有用的诊断信息，并且POCT设备的已经应用到临床上，如妊娠检测，尿糖和酮检测等。例如，HCG测试卡和HBV测试卡可以实现快速检测。然而，传统的实验室检测需要复杂的设备，复杂的过程和较长的检测时间，不能为患者提供适当和及时的护理。因此，有必要开发一种低成本且便携的装置，以提高生物标志物在生化诊断中的监测效率和准确性。在过去几年中，微全分析系统(μ-TAS)由于其小型化设计而在生命科学领域蓬勃发展。该系统可将基本操作(包括样品制备，反应，分离和检测)整合到几平方厘米的芯片中，以进行自动生化和医学分析，并且许多微流体便携式装置已经开发用于生化检测和医学诊断。其中，免疫分析基于其极高的特异性已成为临床检测和生化研究中最重要的分析方法之一。以ELISA为代表的常规测定方法用作检测各种分析物的标准技术，这种传统的免疫分析通常在96孔板中进行，具有试剂消耗多和检测时间长的缺点。并且传统微流控免疫技术在利用非磁性微球作固相载体时必须使用微堰及微阀等特殊结构。这些问题可能最终阻止免疫分析成为商业应用中的实用技术和即时诊断工具，
实用新型内容
本实用新型所要解决的技术问题在于提供一种结构简单，可以避免使用微堰或微阀等特殊结构的免疫荧光检测系统。
为解决上述技术问题，本实用新型采用如下技术方案：
一种基于微流控芯片的免疫荧光检测系统，包括芯片本体，其内部形成有一条或多条彼此独立用于测试待测样品的测试流道；
所述测试流道包括反应池以及与所述反应池连通的第一进液通道、第二进液通道和出液通道；
所述第一进液通道用于通入样品溶液，所述第二进液通道用于通入捕获抗体修饰的微球溶液及检测抗体，所述出液通道的高度均小于所述微球的直径。
进一步的，所述芯片本体包括依次叠加且密封配合的上基板、中隔板和下基板；其中，
所述上基板与所述中隔板相接触的端面内凹形成有顺次连通的所述第一进液通道、第一腔室和所述出液通道；
所述下基板与所述中隔板相接触的端面内凹形成有顺次连通的所述第二出液通道和第二腔室；
所述第一腔室和第二腔室通过贯通所述中隔板的通孔直接连通进而构成所述反应池。
进一步的，所述反应池的形状为圆形。
进一步的，所述第一进液通道的高度小于所述微球的直径。
进一步的，所述微球为聚苯乙烯微球。
进一步的，还包括动力模块；其中，
所述动力模块用于为所述微球溶液、检测抗体、样品溶液导入以及废液导出所述芯片本体提供动力。
进一步的，所述芯片本体的顶部设有与所述第一进液通道连通的样品进样口、与所述第二进液通道连通的微球进样口以及与所述出液通道连通的废液出口。
进一步的，所述反应池在所述芯片本体内呈矩形阵列分布，每一横排上的各反应池的第二进液通道共用一个微球进样口，每一纵排上的各反应池的第一进液通道共用一个样品进样口，所有反应池的出液通道共用一个废液出口。
进一步的，所述动力模块包括真空泵和压力调节阀，所述真空泵通过管道与所述废液出口连接，所述压力调节阀设置在所述管道上。
进一步的，还包括荧光显微镜，所述微流控芯片设置在所述荧光显微镜的载物台上。
一种使用上述免疫荧光检测系统的免疫荧光检测方法，通过动力模块将样品溶液及捕获抗体修饰的微球溶液分别通过第一进液通道和第二进液通道导入反应池中，捕获抗体修饰了的微球溶液与抗原在反应池交汇孵育，待孵育完成后通过第二进液通道通入检测抗体，荧光显微镜下通过观察微球是否带有荧光来判定样品溶液是否带有抗原，进而完成样品溶液的定性定量分析。
与现有技术相比，本实用新型具有如下优点：
(1)出液通道的高度均小于微球的直径，所以微球只能在第二进液通道中流动，并且停留在反应池中与后续样品及反应试剂反应，完成整个免疫分析，从而消除了在使用非磁性微球作为固相载体时使用的微堰或微阀等特殊结构，因而简化了芯片结构，降低了操作成本。
(2)具有多条独立的测试流道，可以实现对携带有不同抗体的微球的定向投放和多种生物样品的并行进样，达到对多样品的高速同时检测，大大节约了分析时间和成本。
(3)采用微流控芯片和真空泵作为驱动力，具有便携性，易用性等优点；生物样品和试剂添加方法简单，设备密封良好，安全可靠。
附图说明
图1为本实用新型微流控芯片的主视图；
图2为本实用新型微流控芯片的爆炸图；
图3为本实用新型微流控芯片的透视图；
图4为本实用新型微流控芯片系统的结构示意图；
图5为4种样品分别与4种修饰有不同捕获抗体的微球反应后得到的荧光图；
图6微流控芯片中人IgG样品与荧光强度的关系。
具体实施方式
下面将结合本实用新型实施例中的附图，对本实用新型实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本实用新型保护的范围。
参见图1和图3，一种基于微流控芯片的免疫荧光检测系统，包括芯片本体1，其内部形成有一条或多条彼此独立用于测试待测样品的测试流道；测试流道包括反应池2以及与反应池2连通的第一进液通道3、第二进液通道4和出液通道5；第一进液通道3用于通入样品溶液，第二进液通道4用于通入捕获抗体修饰的微球溶液及检测抗体，出液通道5的高度均小于微球的直径。为节约分析时间和成本，测试流道优选设计为多条，从而可以同时对不同的样品进行免疫检测。在芯片本体1的顶部设有与第一进液通道3连通的样品进样口6、与第二进液通道4连通的微球进样口7以及与出液通道连通5的废液出口8。
具体的，微球采用直径为40μtm的聚苯乙烯微球，500μg/ml的捕获抗体固定在微球上，为提高抗体的固定效率使用前对微球表面进行了硅烷化处理并用BSA封闭。
本实施例中，抗体修饰的微球溶液和样品溶液分别通过样品进样口6和微球进样口7导入反应池2中，在反应池2中交汇孵育，待孵育完成后从微球进样口7通入检测抗体，荧光显微镜下通过观察微球是否带有荧光来判定样品溶液是否带有抗原，从而可以完成样品溶液的定性定量分析。因出液通道5的高度均小于微球的直径，所以微球只能在第二进液通道4中流动，并且停留在反应池2中与后续样品及反应试剂反应，完成整个免疫分析，而不会从出液通道内吸出，从而省略了在使用非磁性微球作固相载体时使用的微堰或微阀等特殊结构。因此简化了芯片的制作工艺，降低了操作成本。
为防止微球进入第一进液通道内，第一进液通道的高度设计小于微球的直径。进一步的，为了便于芯片的加工制作，第一进液通道3的截面形状及大小均与所述出液通道相同。
具体的，如图2所示，本实施例中微流控芯片的芯片本体1包括依次叠加且密封配合的上基板101、中隔板102和下基板103。其中，上基板101与中隔板102相接触的端面内凹形成有顺次连通的第一进液通道3、第一腔室9和出液通道5；下基板103与中隔板102相接触的端面内凹形成有顺次连通的第二出液通道4和第二腔室10；第一腔室9和第二腔室10通过贯通中隔板的通孔直接连通进而构成反应池2，第一腔室9、第二腔室10和通孔同轴设置。本实施例中，第二进液通道4用于导入可吸附捕获抗体的微球。第一进液通道3用于导入样品溶液，中隔板102用于阻断溶液的交叉混合，避免污染，芯片本体1采用层状结构，从而可以方便芯片本体1内的微流道的加工。
可以想到的是，在实际设计中，上基板101、中隔板102和下基板103可以使聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚碳酸酯(PC)、环烯烃共聚物(COC)、硅胶、聚四氟乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等高分子材料制作。
芯片本体的具体制作过程如下：本实施例上基板101、中隔板102和下基板103材质均为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，并借助光刻技术制作，而本微流控芯片浇铸所用的阳模则采用湿法掩模光刻加工，该技术具有柔性高、制作成本低及周期短等优点，使用AdobeIllustrator CS5软件设计微通道结构，然后印刷在一张高分辨率的透明薄膜上，得到要求尺寸的掩膜，并使用UV曝光和湿化学蚀刻技术制造。
阳膜制作过程如下：使用ITO薄膜作为微通道复形模具的基片，分别裁剪大小合适的杜邦干膜和ITO薄膜，分别剥离杜邦干膜和ITO薄膜外层的保护膜，于暗室红灯下将干膜缓慢均匀地贴在基片上，保证所贴干膜表面平整、无气泡。将贴好干膜的基片用白纸保护，缓慢通过塑封机3次，使两者紧密贴合。随后，将打印好的有微通道图案的掩膜紧贴于干膜上，放入紫外曝光箱中曝光，曝光时间按照所贴层数设定。在紫外光照射下掩膜图案所透射的光使其下面的干膜变性，得到抗蚀图案。揭掉微通道掩模和杜邦干膜的保护膜，用0.85％Na2CO3进行显影，待将曝光过程中被微通道掩模遮蔽处的部分溶解除去仅留下抗蚀干膜图案后，用超纯水反复清洗残留的Na2CO3水溶液并吹干，于60℃烘箱中加热除去残留的水分，得到微芯片复形模具。
上基板、中隔板和下基板复合过程如下：将5％的PVA均匀涂布在由PDMS制作的底板上并放入60℃的烘箱中蒸发除去水形成PVA薄层，将硅橡胶预聚物Sylgard 184和固化剂以10：1比例充分混匀，浇铸在微通道模具上，用循环水真空泵抽真空脱气30min，待混合物中气泡完全消失后，将涂有PVA的PDMS底板覆盖模具并在PDMS底板上放置重物以便得到厚度均一满足要求的中间层。将其处于60℃烘箱中2h加速PDMS预塑体固化。冷却后，将固化后的PDMS薄层从模板上揭下来，此时PDMS中间层与PVA结合在一起。用打孔器在微通道末端打孔作为溶液的进出口，用电弧枪将PDMS基片带有管道的一面与中间层进行氧等离子体活化，在显微镜辅助定位下完成两片芯片的结合。随后，将结合后的芯片放入蒸馏水中溶解PVA层并烘干，再次对芯片与另一含有微通道结构的芯片进行氧等离子体活化，微通道为25μm的上层PDMS芯片(上基板)，中间层200μm(中隔板)和微通道为100μm的下层PDMS芯片(下基板)在显微辅助定位下精确定位三层微结构PDMS的结合点，然后不可逆的紧密粘贴在一起完成三层结构芯片的制作。
为方便在显微镜下观察，反应池3的形状优选设计为圆形。
参见图4，一种基于微流控芯片的免疫荧光检测系统，还包括动力模块；其中，动力模块用于为所述微流控芯片导入的微球、检测抗体、样品溶液以及导出废液提供动力。
参见图2和图3，可以想到的是，在实际应用中，反应池2在芯片本体1内呈矩形阵列分布，每一横排上的各反应池2的第二进液通道共用一个微球进样口，每一纵排上的各反应池2的第一进液通道共用一个样品进样口，所有反应池的出液通道共用一个废液出口。如本实施例中，反应池的数量为16个，呈四行四列分布，相应的，样品进样口和微球进样口的数量均为四个。
参见图4，动力模块包括真空泵11、压力调节阀12和废液储存器13，真空泵11通过管道14与废液储存器13连通，废液储存器13通过乳胶管与废液出口8连接，压力调节阀12设置在废液储存器13上，通过真空泵11提供负压，可以将微球溶液和样品溶液吸附反应池中，同时反应完成后的废液通过真空泵11提供的负压经乳胶管吸入废液储存器13中，同时通过调节压力调节阀12可以调节吸附压力的大小。
具体的，本实施例微流控芯片系统还包括荧光显微镜15，微流控芯片本体1设置在荧光显微镜15的载物台上，至于荧光显微镜15的具体结构均为现有技术，不是本实用新型改进点，在此不再赘述。
应用实施例
分别向四个微球进样口7通入不同捕获抗体修饰的微球溶液(山羊抗鸡IgG，山羊抗兔IgG，山羊抗人IgG，山羊抗小鼠IgG)，向四个样品进样口6通入不同样品溶液(鸡IgG，兔IgG，人IgG，小鼠IgG)，修饰了捕获抗体的微球溶液与抗原在反应室交汇孵育并通过压力调节阀控制真空泵的压力，待孵育完成后从微球进样口7通入检测抗体，荧光显微镜下通过观察微球是否带有荧光来判定样品溶液是否带有抗原，如图5和图6所示，完成样品溶液的定性定量分析。图5中(a)，(b)，(c)和(d)分别表示浓度为0.1μg/mL的抗原鸡IgG，兔IgG，人IgG，小鼠IgG的荧光图像，1，2，3和4分别代表用捕获抗体山羊抗鸡IgG，山羊抗兔IgG，山羊抗人IgG和山羊抗小鼠IgG修饰的微球。
本实用新型采用0.02MPa的真空度确保微球成功引入到芯片反应室，分别在上基板顶部的4个微球进样口注入修饰了不同捕获抗体的4种微球和和4个样品进样口注入4种抗原溶液，抗原抗体反应后使用缓冲液清洗未反应完全的抗原2min，待孵育完成后注入相应的检测抗体，每种捕获抗体只对相对应的特定的抗原才有反应，三者相遇实现对目标抗原的实时检测。该酶联免疫吸附试验芯片系统可同时对多种生物样品进行快速高效的定性定量分析，一次运行即可确定多生物样本的免疫学反应，其高速并行分析能力可以提供高效便捷的即时检测，而微流控芯片系统的研制技术也将最终用于开发便携式的微流控芯片疾病诊断系统，使诊疗设备进一步的小型化、便携化、易用化。
上述实施例仅仅是清楚地说明本实用新型所作的举例，而非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里也无需也无法对所有的实施例予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本实用新型的保护范围之中。
Claims (9)
1.一种基于微流控芯片的免疫荧光检测系统，包括芯片本体，其内部形成有一条或多条彼此独立用于测试待测样品的测试流道，其特征在于：
所述测试流道包括反应池以及与所述反应池连通的第一进液通道、第二进液通道和出液通道；
所述第一进液通道用于通入样品溶液，所述第二进液通道用于通入捕获抗体修饰的微球溶液及检测抗体，所述出液通道的高度小于所述微球的直径。
2.根据权利要求1所述的免疫荧光检测系统，其特征在于：所述芯片本体包括依次叠加且密封配合的上基板、中隔板和下基板；其中，
所述上基板与所述中隔板相接触的端面内凹形成有顺次连通的所述第一进液通道、第一腔室和所述出液通道；
所述下基板与所述中隔板相接触的端面内凹形成有顺次连通的所述第二进液通道和第二腔室；
所述第一腔室和第二腔室通过贯通所述中隔板的通孔直接连通进而构成所述反应池。
3.根据权利要求1所述的免疫荧光检测系统，其特征在于：所述反应池的形状为圆形。
4.根据权利要求1所述的免疫荧光检测系统，其特征在于：所述第一进液通道的高度小于所述微球的直径。
5.根据权利要求1-4任一项所述的免疫荧光检测系统，其特征在于：还包括动力模块；其中，
所述动力模块用于为所述微球溶液、检测抗体、样品溶液导入以及废液导出所述芯片本体提供动力。
6.根据权利要求5所述的免疫荧光检测系统，其特征在于：所述芯片本体的顶部设有与所述第一进液通道连通的样品进样口、与所述第二进液通道连通的微球进样口以及与所述出液通道连通的废液出口。
7.根据权利要求6所述的免疫荧光检测系统，其特征在于：所述反应池在所述芯片本体内呈矩形阵列分布，每一横排上的各反应池的第二进液通道共用一个微球进样口，每一纵排上的各反应池的第一进液通道共用一个样品进样口，所有反应池的出液通道共用一个废液出口。
8.根据权利要求6或7所述的免疫荧光检测系统，其特征在于：所述动力模块包括真空泵和压力调节阀，所述真空泵通过管道与所述废液出口连接，所述压力调节阀设置在所述管道上。
9.根据权利要求5所述的免疫荧光检测系统，其特征在于：还包括荧光显微镜，所述芯片本体设置在所述荧光显微镜的载物台上。
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