CN112206840A - 一种基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片，其构成如下：上层为样品液路层，下层为氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层，底面为空白玻璃底板；具体设置有下述结构：待测样品进样口、待测样品进样通道区、氧化石墨烯淬灭的核酸适配体进样口、氧化石墨烯淬灭的核酸适配体进样通道区、反应池。一种如上所述基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片，其特征在于：所述基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片的制备方法：制备出通道部分凸起的光刻胶模板；显影，坚膜；用硅烷化试剂处理模板；得到带有结构的聚二甲基硅氧烷芯片；不可逆封接。本发明结构简单，制备操作方便，速度快，效率高，应用范围广泛。

Description

一种基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯 片及其制备方法
技术领域
本发明涉及微流控技术和聚合物芯片的设计、加工、制作和应用技术领域，特别提供了一种基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片及其制备方法。
背景技术
外泌体是细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调整过程而形成的细胞外纳米级囊泡。其在人体内分布广泛，人体的尿液、汗液、血液、乳汁等均含有外泌体。外泌体在人体内主要扮演两个角色，第一种是有免疫活性的外泌体，其主要在抗原呈递和共刺激中发挥作用，具有信息传递功能。第二种为含有数量可观的RNA并介导细胞间的遗传物质交流的外泌体，具有物质传递功能。随着研究的深入，人们发现外泌体在适应性免疫、炎症过程、胚胎形成、肿瘤的发生与发展过程中均发挥了重要的作用。就肿瘤来说，一百多年前，经过解剖人们发现特定的肿瘤细胞总是倾向于转移到特定的组织器官，并由此提出了著名的“种子与土壤”转移假说，认为肿瘤细胞只能在适宜的组织器官环境中才能形成转移灶。随着技术的发展肿瘤的转移机制在不断被完善，人们发现肿瘤可以通过分泌外泌体主动改变转移灶微环境，外泌体可以通过调节免疫功能，促进肿瘤血管新生以及肿瘤转移，或者直接作用于肿瘤细胞影响肿瘤进展。因此，对外泌体进行研究，有望为我们在肿瘤早期诊断和抑制肿瘤的发展等方面提供一个新思路。
微流控芯片技术是21世纪非常重要的一个技术，其核心是利用微流控芯片将样品预处理、生物和化学反应、分离检测等基本操作单元集成在具有微米或纳米微通道网络的芯片上，通过操控流体完成复杂的分析过程，具有样品和试剂消耗量少、分析时间短、高通量、容易实现大规模平行测定等优点。利用微流控分析技术可方便的实现分析系统的小型化、集成化和便携化。目前，该系统被广泛应用在生命科学、疾病诊断与治疗、药物合成与筛选等领域。此外，因其具有的微型、自动、使用试剂微量、高通量、可实现多功能集成等特点使其也成为了进行外泌体研究的潜在平台。目前使用微流控芯片对外泌体进行分离的技术主要有两类，一种是基于尺寸的分离技术，主要包括使用纳米孔膜、纳米阵列、微过滤器等器件结构直接对样品进行作用，分离出外泌体。另一种是基于免疫捕获的分离技术，主要包括平面免疫捕获和微珠免疫捕获。但想要高效的获得高纯度外泌体以及对外泌体进行分析与检测仍是一个难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片及其制备方法，以解决以往外泌体分离与检测过程中存在的操作步骤繁琐复杂、消耗大量试剂等局限。
本发明提供了一种基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片，其特征在于：
所述微流控芯片由上层、下层、底面三层顺序串联贴合布置组成，其中：上层为样品液路层，下层为氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层，底面为空白玻璃底板；
所述样品液路层设置有下述结构：
——样品进样口：位于整个样品液路层的最上游；
——样品进样通道区：布置在样品进样口和反应池之间用于沟通两者；
所述氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层设置有下述结构：
——氧化石墨烯淬灭的核酸适配体进样口：位于整个氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层最上游；
——氧化石墨烯淬灭的核酸适配体进样通道区：布置在氧化石墨烯淬灭的核酸适配体进样口和反应池之间用于沟通两者；
所述反应池布置在氧化石墨烯淬灭的核酸适配体进样通道区和样品进样通道区之间，垂直贯穿整个芯片，用于沟通两者。
所述基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片还满足下述要求：
反应池设置有4n个，与之对应的样品液路层上游样品进样口有2n个，每个样品进样口对应一个样品进样通道区，每个样品进样通道区有2n个出口分别和反应池相连；氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层上游核酸适配体进样口有2n个，每个核酸适配体进样口对应一个核酸适配体进样通道区，每个核酸适配体进样通道区有2n个出口分别与反应池相连，其中n为自然数。
所述基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片还满足下述要求之一或其组合：
其一，所述样品进样通道区每个都对应一个进样口和2n个反应池；
其二，所述氧化石墨烯淬灭的核酸适配体进样通道区每个都对应一个进样口和2n个反应池。
所述基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片还满足下述要求之一或其组合：
其一，所述样品液路层和氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层的材料均为聚二甲基硅氧烷聚合物，样品液路层和氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层厚度相同，均为1-3mm；
其二，所述反应池为底面直径2mm的圆柱状腔室，贯穿上层和下层芯片；
其三，所述样品液路层和氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层高度相同，均为80-200μm；
其四，所述样品液路层和氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层通道宽度相同，均为30-100μm。
所述基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片还满足下述要求：
所述样品液路层是在制作成功的样品液路层模板上浇上一层高于模板1-3mm的聚二甲基硅氧烷，固化后揭下得到；所述氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层是在制作成功的氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层模板上浇上一层高于模板1-3mm的聚二甲基硅氧烷，固化后揭下得到；所述样品液路层有结构的一侧封接到氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层无结构一侧，氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层有结构的一侧通过等离子键合到洁净的玻璃片上。
一种基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片的制备方法相关步骤依次要求如下：
(1)采用光刻和腐蚀方法制备出通道部分凸起的光刻胶模板；
(2)用乳酸乙酯对光刻胶模板进行显影，165℃-180℃坚膜1-3h；
(3)将芯片光刻胶模板用硅烷化试剂处理5-10min，使PDMS容易剥离模板底面；
(4)将聚二甲基硅氧烷与引发剂以体积比5-15：1混合均匀，分别浇注于芯片上、下层结构光刻胶模板，80℃烘箱固化20-40min，将聚二甲基硅氧烷与芯片光刻胶模板剥离，得到带有结构的聚二甲基硅氧烷芯片；
(5)将芯片上层带有结构的一侧与芯片下层无结构一侧进行氧等离子体处理1-3min，70-90℃热烘30-60min，进行不可逆封接，得到封接好的聚二甲基硅氧烷芯片；
(6)使用打孔器在上述封接好的聚二甲基硅氧烷芯片样品进样口及反应池处打孔，将芯片下层有结构一侧与空白玻璃片经过氧等离子体处理1-3min，70-90℃热烘30-60min进行不可逆封接，即得到基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片。
所述基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片的制备方法还满足下述要求：先通过氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路在反应池中加入氧化石墨烯淬灭的核酸适配体，接着通过样品液路在反应池中加入样本，最后对芯片荧光进行检测。
本发明所述基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片的用途说明：该芯片可应用于不同外泌体样本(血液、尿液、唾液等)中多个蛋白标志物的检测。
本发明的优点：
1、本发明选用了蛋白特异的核酸适配体对外泌体进行检测，提高了检测的特异性和可信度。
2、本发明将样品引入、核酸适配体检测集中到一块芯片上，优化了外泌体检测流程。
3、本发明通过注射泵进行试剂引入，简化了人工操作，减少误差，实现了传统方法很难实现的时空分辨率。
4、本发明通过在芯片上的阵列设计，可以一次对多个样本的多个蛋白进行检测，大大提高了检测效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片结构示意简图；
图2为基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片上层结构示意图；
图3为基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片下层结构示意图。
其中：1为样品进样口；2为样品进样通道区；3为反应池；4为氧化石墨烯淬灭的核酸适配体进样口；5为氧化石墨烯淬灭的核酸适配体进样通道区。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片及其制备方法进行具体的说明。
实施例1
一种基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片，如图1所示，所述微流控芯片由上层、下层、底面三层顺序串联贴合布置组成，其中：上层为样品液路层(图2)，下层为氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层(图3)，底面为空白玻璃底板，所述样品液路层设置有下述结构：
——样品进样口1：位于整个样品液路层的最上游；
——样品进样通道区2：布置在待测样品进样口和反应池之间用于沟通两者；
所述氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层设置有下述结构：
——氧化石墨烯淬灭的核酸适配体进样口4：位于整个氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层最上游；
——氧化石墨烯淬灭的核酸适配体进样通道区5：布置在氧化石墨烯淬灭的核酸适配体进样口和反应池之间用于沟通两者；
所述反应池3布置在氧化石墨烯淬灭的核酸适配体进样通道区和样品进样通道区之间，垂直贯穿整个芯片，用于沟通两者。
所述基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片还满足下述要求：
反应池设置有64个，与之对应的样品液路层上游样品进样口有8个，每个样品进样口对应一个样品进样通道区，每个样品进样通道区有8个出口分别和反应池相连；氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层上游核酸适配体进样口有8个，氧化石墨烯淬灭的每个核酸适配体进样口对应一个氧化石墨烯淬灭的核酸适配体进样通道区，每个氧化石墨烯淬灭的核酸适配体进样通道区有8个出口分别与反应池相连。
所述基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片还满足下述要求之一或其组合：
其一，所述样品进样通道区每个都对应一个进样口和8个反应池；
其二，所述氧化石墨烯淬灭的核酸适配体进样通道区每个都对应一个进样口和8个反应池。
所述基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片还满足下述要求之一或其组合：
其一，所述样品液路层和氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层的材料均为聚二甲基硅氧烷聚合物，两层芯片厚度相同，均为2mm；
其二，所述反应池为底面直径2mm的圆柱状腔室，贯穿上层和下层芯片；
其三，所述样品液路层和氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层高度相同，均为100μm；
其四，所述样品液路层和氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层通道宽度相同，均为100μm。
所述基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片还满足下述要求：
所述样品液路层是在制作成功的样品液路层模板上浇上一层高于模板2mm的聚二甲基硅氧烷，固化后揭下得到；所述氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层是在制作成功的氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路模板上浇上一层高于模板2mm的聚二甲基硅氧烷，固化后揭下得到；所述样品液路层有结构的一侧封接到氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层无结构一侧，氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层有结构的一侧通过等离子键合到洁净的玻璃片上。
所述基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片的制备方法相关步骤依次要求如下：
(1)采用光刻和腐蚀方法制备出通道部分凸起的光刻胶模板；
(2)用乳酸乙酯对光刻胶模板进行显影，180℃坚膜2h；
(3)将芯片光刻胶模板用硅烷化试剂处理5min，使PDMS容易剥离模板底面；
(4)将聚二甲基硅氧烷与引发剂以体积比10：1混合均匀，分别浇注于芯片上、下层结构光刻胶模板，80℃烘箱固化30min，将聚二甲基硅氧烷与芯片光刻胶模板剥离，得到带有结构的聚二甲基硅氧烷芯片；
(5)将芯片上层带有结构的一侧与芯片下层无结构一侧进行氧等离子体处理1min，80℃热烘60min，进行不可逆封接；
(6)使用打孔器在上述封接好的聚二甲基硅氧烷芯片样品进样口及反应池处打孔，将芯片下层有结构一侧与空白玻璃片经过氧等离子体处理1min，80℃热烘60min进行不可逆封接，即得到基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片。
所述基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片的制备方法还满足下述要求：先通过氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路在反应池中加入氧化石墨烯淬灭的核酸适配体，接着通过样品液路在反应池中加入待测样本，最后对芯片荧光进行检测。
本实施例所述基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片的用途说明：该芯片可应用于不同外泌体样本(血液、尿液、唾液等)中多个蛋白标志物的检测。
本实施例的优点在于：
1.选用了蛋白特异的核酸适配体对外泌体进行检测，提高了检测的特异性和可信度。
2.将样品引入、核酸适配体检测集中到一块芯片上，优化了外泌体检测流程。
3.通过注射泵进行试剂引入，简化了人工操作，减少误差，实现了传统方法很难实现的时空分辨率。
4.通过在芯片上的阵列设计，可以一次对多个样本的多个蛋白进行检测，大大提高了检测效率。
实施例2
基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片采用光刻和腐蚀方法制备出通道部分突起的SU-8模板，芯片中下层结构分别由两个SU-8模板反模PDMS组成；
所述样本液路层芯片模板制作为：取一块洁净的玻璃片，在甩胶机上甩SU-8胶厚度为100μm，95℃前烘20min，自然降温，将芯片样本液路层结构的掩膜置于SU-8胶平板上面，紫外曝光30s，95℃后烘20min，自然降温；最后，采用乳酸乙酯将上述SU-8胶显影5min，180℃坚膜2h，自然降温，得到芯片模板；
所述氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层芯片模板制作为：取一块洁净的玻璃片，在甩胶机上甩SU-8胶厚度为100μm，95℃前烘20min，自然降温，将芯片氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层结构的掩膜置于SU-8胶平板上面，紫外曝光30s，95℃后烘20min，自然降温；最后，采用乳酸乙酯将上述SU-8胶显影5min，180℃坚膜2h，自然降温，得到芯片模板。
实施例3
将芯片上、下层结构的SU-8模板用硅烷化试剂处理10min，使PDMS容易剥离模板底面；PDMS与引发剂以体积比10：1混合均匀，分别浇注于芯片上、下层结构SU-8模板，80℃烘箱固化40min，将PDMS与芯片SU-8模板剥离，得到带有结构的PDMS芯片；使用打孔器在上层样品液路层样品进样口对应位置一一打孔，打穿；将芯片上层带有结构的一侧与芯片下层无结构的一侧进行氧等离子体处理2min，80℃热烘45min，进行不可逆封接；使用打孔器在下层氧化石墨烯淬灭的核酸适配体进样口及反应池对应位置一一打孔，打穿；将上述封接好的聚二甲基硅氧烷PDMS芯片与一块玻璃经过氧等离子体处理2min，80℃热烘45min进行不可逆封接，即得到基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片。
图2中，1为样品进样口，2为样品进样通道区，3为反应池。
图3中，3为反应池，4为氧化石墨烯淬灭的核酸适配体进样口，5为氧化石墨烯淬灭的核酸适配体进样通道区。
所有进样口均采用注射泵进样，不同的样品和不同的核酸适配体通过不同的进样口进入不同的反应池，图中仅为当n＝3时芯片结构示意图，该芯片最多可同时实现对8个不同样本8个不同标志物的检测。此外n还可为0,1,2,3,4等任意自然数，此时最多可实现2n个不同样品的2n不同标志物的同时检测。

Claims (7)

1.一种基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片，其特征在于：
该基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片由上层、下层、底面三层顺序串联贴合布置组成，其中：上层为样品液路层，下层为氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层，底面为空白玻璃底板；
所述样品液路层设置有下述结构：
——样品进样口：位于整个样品液路层的最上游；
——样品进样通道区：布置在样品进样口和反应池之间用于沟通两者；
所述氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层设置有下述结构：
——氧化石墨烯淬灭的核酸适配体进样口：位于整个氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层最上游；
——氧化石墨烯淬灭的核酸适配体进样通道区：布置在氧化石墨烯淬灭的核酸适配体进样口和反应池之间用于沟通两者；
所述反应池布置在氧化石墨烯淬灭的核酸适配体进样通道区和样品进样通道区之间，垂直贯穿整个芯片，用于沟通两者。
2.按照权利要求1所述基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片，其特征在于：所述基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片还满足下述要求：
反应池设置有4n个，与之对应的样品液路层上游样品进样口有2n个，每个样品进样口对应一个样品进样通道区，每个样品进样通道区有2n个出口分别和反应池相连；氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层上游核酸适配体进样口有2n个，每个核酸适配体进样口对应一个核酸适配体进样通道区，每个核酸适配体进样通道区有2n个出口分别与反应池相连，其中n为自然数。
3.按照权利要求1所述基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片，其特征在于：所述基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片还满足下述要求之一或其组合：
其一，所述样品进样通道区每个都对应一个进样口和2n个反应池；
其二，所述氧化石墨烯淬灭的核酸适配体进样通道区每个都对应一个进样口和2n个反应池。
4.按照权利要求1所述基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片，其特征在于：所述基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片还满足下述要求之一或其组合：
其一，所述样品液路层和氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层的材料均为聚二甲基硅氧烷聚合物，样品液路层和氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层厚度相同，均为1-3mm；
其二，所述反应池为底面直径2mm的圆柱状腔室，贯穿上层和下层芯片；
其三，所述样品液路层和氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层高度相同，均为80-200μm；
其四，所述样品液路层和氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层通道宽度相同，均为30-100μm。
5.按照权利要求1所述基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片，其特征在于：所述基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片还满足下述要求：
所述样品液路层是在制作成功的样品液路层模板上浇上一层高于模板1-3mm的聚二甲基硅氧烷，固化后揭下得到；所述氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层是在制作成功的氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层模板上浇上一层高于模板1-3mm的聚二甲基硅氧烷，固化后揭下得到；所述样品液路层有结构的一侧封接到氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层无结构一侧，氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路层有结构的一侧通过等离子键合到洁净的玻璃片上。
6.一种如权利要求1-5所述基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片的制备方法相关步骤依次要求如下：
(1)采用光刻和腐蚀方法制备出通道部分凸起的光刻胶模板；
(2)用乳酸乙酯对光刻胶模板进行显影，165℃-180℃坚膜1-3h；
(3)将芯片光刻胶模板用硅烷化试剂处理5-10min，使PDMS容易剥离模板底面；
(4)将聚二甲基硅氧烷与引发剂以体积比5-15：1混合均匀，分别浇注于芯片上、下层结构光刻胶模板，80℃烘箱固化20-40min，将聚二甲基硅氧烷与芯片光刻胶模板剥离，得到带有结构的聚二甲基硅氧烷芯片；
(5)将芯片上层带有结构的一侧与芯片下层无结构一侧进行氧等离子体处理1-3min，70-90℃热烘30-60min，进行不可逆封接，得到封接好的聚二甲基硅氧烷芯片；
(6)使用打孔器在上述封接好的聚二甲基硅氧烷芯片样品进样口及反应池处打孔，将芯片下层有结构一侧与空白玻璃片经过氧等离子体处理1-3min，70-90℃热烘30-60min进行不可逆封接，即得到基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片。
7.按照权利要求6所述基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述基于氧化石墨烯淬灭核酸适配体的外泌体检测微流控芯片的制备方法还满足下述要求：先通过氧化石墨烯淬灭的核酸适配体液路在反应池中加入氧化石墨烯淬灭的核酸适配体，接着通过样品液路在反应池中加入样本，最后对芯片荧光进行检测。
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