CN111804352A - 一种集成化外泌体分离与检测微流控芯片及应用 - Google Patents

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Abstract

一种集成化外泌体分离与检测微流控芯片及其应用，其构成如下：上层为试剂池层，中层为液路控制层，底层为反应池层；具体设计有下述结构：外泌体样本池、外泌体进样通道、外泌体染色一抗池、外泌体染色一抗进样通道、外泌体染色二抗池、外泌体染色二抗进样通道、显色液池、显色液进样通道、清洗缓冲液池、缓冲液进样通道、废液池、废液流出通道以及反应池。本发明通过泵阀控制系统对微流控芯片进行操控，将外泌体富集、一抗孵育、辣根过氧化酶标记的二抗孵育以及显色反应集成在同一芯片上。优化了外泌体提取检测流程，极大的提高了外泌体检测的效率，并且简化了人为操作的程序，取得了较好的外泌体分离检测效果。

Description

一种集成化外泌体分离与检测微流控芯片及应用
技术领域
本发明涉及外泌体分离领域，尤其涉及一种集成化外泌体分离与检测微流控芯片及应用方法。
背景技术
现有技术中，微流控芯片是一种在微小通道中操控微小体积流体流动的系统，其中通道的尺度为几十到几百微米，承载流体的量为10-9-10-18L。微流控芯片的各个操作单元通过微通道网络内流体的流动相互联系。微流体控制是微流控芯片实验室的操作核心，所涉及的进样、混合、反应、分离等过程都是在可控流体的运动中完成的。无论是宏观还是微观流体，阀都是流体控制的核心部件。由于其重要性，微型阀的研制早在微流控芯片诞生之前引起人们的广泛关注。理论上讲，凡是能控制微通道闭合和开启状态的部件均可作为微流控芯片中的微阀使用。一个理想的微阀应该具备以下特征：低泄漏、低功耗、响应速度快、线性操作能力和适应面广。微流体和微型阀构成了一套完整的微流控芯片系统。
微流控分析的核心是利用微流控芯片将样品预处理、生物和化学反应、分离检测等基本操作单元集成在具有微米或纳米微通道网络的芯片上，通过操控流体完成复杂的分析过程，具有样品和试剂消耗量少、分析时间短、高通量、容易实现大规模平行测定等优点。利用微流控分析技术可方便的实现分析系统的小型化、集成化和便携化。目前，该系统被广泛应用在生命科学、疾病诊断与治疗、药物合成与筛选等领域。
外泌体是细胞分泌的含有脂质、蛋白、mRNAs等多种物质的纳米级囊泡，其在人体内分布广泛，人体的体液如尿液、血液、乳汁、唾液等大都都含有外泌体。外泌体在人体内主要有物质传递及信息传导两大作用。研究表明，外泌体在炎症过程、适应性免疫、胚胎形成、肿瘤的发生与发展过程中均发挥了重要的作用。但如何有效的将外泌体从体液中分离出来并进行检测仍然是一个很大的挑战，目前常用的超速离心、超滤等分离方式费时费力并且产物的纯度难以保证。
微流控芯片技术以其大大减少样品消耗，节省人工及时间成本，可在厘米见方的空间上实现自动化、高通量的实验等优势，受到了广泛的关注，在外泌体研究领域也占有了一席之地。
人们迫切希望获得一种技术效果优良的集成化外泌体分离与检测微流控芯片。
发明内容
本发明的目的是提供一种技术效果优良的集成化外泌体分离与检测微流控芯片。以解决以往外泌体分离与检测过程中存在的操作步骤繁琐复杂、消耗大量试剂等局限。
本发明提供了一种集成化外泌体分离与检测微流控芯片，该微流控芯片由上层、中层、下层三层顺序串联贴合布置组成，其中：上层为试剂池层，中层为液路控制层，底层为反应池层；
所述液路控制层具体设置有下述结构：
——外泌体进样通道A：前端与外泌体样品池1相连，后端垂直汇入主通道D，用于沟通两者，外泌体进样通道A上设计有气动微阀结构，用于控制该通道的通断；
——外泌体染色一抗进样通道B：前端与外泌体染色一抗池2相连，后端垂直汇入主通道D，用于沟通两者，外泌体染色一抗进样通道B上设计有气动微阀结构，用于控制该通道的通断；
——外泌体染色二抗进样通道C：前端与外泌体染色二抗池3相连，后端垂直汇入主通道D，用于沟通两者，外泌体染色二抗进样通道C上设计有气动微阀结构，用于控制该通道的通断；
——主通道D：设置在试剂池与反应池5之间，用于沟通两者；
——显色液进样通道E：与显色液池4相连并垂直汇入主通道D，用于沟通两者，显色液进样通道E上设计有气动微阀结构，用于控制该通道的通断；
——废液流出通道F：前端与反应池5相连，后端与废液池6相连，用于沟通两者，废液流出通道F上设计有气动微阀结构，用于控制该通道的通断；
——缓冲液进样通道G：与清洗缓冲液池7相连并垂直汇入主通道D，用于沟通两者，缓冲液进样通道G上设计有气动微阀结构，用于控制该通道的通断。
所述试剂池层设计有六个试剂池，分别为外泌体样本池1、外泌体染色一抗池2、外泌体染色二抗池3、显色液池4、废液池6、清洗缓冲液池7；反应池层设计有一个反应池，为反应池5。
所述外泌体样本池1通过外泌体进样孔h1与外泌体进样通道A相连，所述外泌体染色一抗池2通过一抗进样孔h2与外泌体染色一抗进样通道B相连，所述外泌体染色二抗池3通过二抗进样孔h3与外泌体染色二抗进样通道C相连，所述显色液池4通过显色液进样孔h4与显色液进样通道E相连，所述废液池6通过废液出口孔h5与废液流出通道F相连，所述清洗缓冲液池7通过清洗缓冲液进样孔h6与缓冲液进样通道G相连，所述反应池通过反应池进样孔h7与主通道D相连，通过反应池出口孔h8与废液流出通道F相连；每个通道均有单独的微阀控制，所述微控芯片的所有控制用的阀均为常闭阀。
所述集成化外泌体分离与检测微流控芯片还满足下述要求之一或其组合：
其一，所述上层芯片的材料为聚碳酸酯塑料，厚度为0.5-2.5cm；所述上层试剂池层为定制模块；上层试剂池层为公司定制的聚碳酸酯塑料模块。
其二，所述中层芯片和下层芯片的材料均为聚二甲基硅氧烷聚合物，中层芯片厚度为100-500μm，下层芯片厚度为1-2mm；
其三，所述试剂池为底面直径0.2-1cm，高度0.4-2.4cm的圆柱形结构；
其四，所述试剂池底部有一直径为0.2-0.5mm的圆孔，打通上层芯片，使其能够和中层芯片沟通；
其五，所述芯片的中层液路层液路高度与宽度相同，均为80-200μm；
其六，所述芯片的下层反应池层通道高度为0.8-1.6mm，反应池直径为2-8mm，连接通道宽度为80-200μm。
所述中层液路控制层是在制作成功的液路模板上甩一层高于模板100-500μm的聚二甲基硅氧烷膜；
所述反应池层是在制作成功的反应池模板上甩一层高于模板1-2mm的聚二甲基硅氧烷膜；
所述中层液路控制层的聚二甲基硅氧烷膜无结构一侧通过等离子键合到反应池层底部；
所述中层液路控制层的聚二甲基硅氧烷有结构的一侧通过等离子和反应池层有结构的一侧键合。
本发明提供了一种集成化外泌体分离与检测微流控芯片的应用，所述集成化外泌体分离与检测微流控芯片可用于体液(血液、尿液、唾液等)及培养基中外泌体浓度的检测。
集成化外泌体分离与检测微流控芯片的应用方法步骤如下：
(1)取出待测样品25-50μL，与修饰了特异性抗体的免疫捕获磁珠混合，磁珠终浓度达到1×106-5×106颗粒数/mL，室温孵育30-60min，备用；
(2)将孵育好的样品加入外泌体样品池1中，并依次将10-20μL外泌体染色一抗(1-4μg/mL)、10-20μL外泌体染色二抗(1-4μg/mL)、10-20μL显色液、150-300μL清洗缓冲液加入到外泌体染色一抗池2、外泌体染色二抗池3、显色液池4及清洗缓冲液池7中；
(3)将芯片置于泵阀操控系统中，在外泌体样品池1上方施加5-15kPa压力，打开外泌体进样通道A及废液流出通道F上的控制阀门，使外泌体样品进入反应池5并被反应池底部的磁铁吸附，实现外泌体的分离与富集；
(4)在清洗缓冲液池7上方施加5-15kPa压力，打开缓冲液进样通道G及废液流出通道F上的控制阀门，使缓冲液进入反应池5清洗掉多余的样品及杂质；
(5)在外泌体染色一抗池2上方施加5-15kPa压力，打开一抗进样通道B及废液流出通道F上的控制阀门，使外泌体染色一抗进入反应池5，室温孵育20-40min；
(6)重复步骤(4)，清洗掉多余的外泌体染色一抗；
(7)在外泌体染色二抗池3上方施加5-15kPa压力，打开二抗进样通道C及废液流出通道F上的控制阀门，使外泌体染色二抗进入反应池5，室温孵育20-40min；
(8)重复步骤(4)，清洗掉多余的外泌体染色二抗；
(9)在显色液池4上方施加5-15kPa压力，打开显色液进样通道E及废液流出通道F上的控制阀门，使显色液进入反应池5，室温避光孵育10-20min；
(10)使用酶标仪于370nm处检测吸光度。
所述集成化外泌体分离与检测微流控芯片的应用方法还满足下述要求：所述泵阀操控系统在试剂池层上方有六个压力控制装置，可控制各个试剂池压力大小；在各个通道的阀门位置有对应的控制模块，可用于控制阀门的状态；在反应池正下方有一块磁体，可用于吸附捕获了外泌体的免疫磁珠。
本发明利用微流体与微型阀技术，制备了一种集外泌体富集、一抗孵育、辣根过氧化酶标记的二抗孵育、显色、清洗于一体，各个步骤相继进行的微流控芯片。整个芯片平台结构简单，操作方便，集成度高，分析速度快，效率高，无需任何复杂和昂贵的设备，无需大量样品与试剂消耗。综上所述，发明一种方便，快捷，集成度高，应用范围广的集成化外泌体分离与检测微流控芯片具有十分重要意义的。
本发明解决了以往外泌体分离与检测过程中存在的操作步骤繁琐复杂、消耗大量试剂等技术局限。本发明制备过程稳定，操作简单，集成度高。
本发明所述集成化外泌体分离与检测微流控芯片的用途说明：该芯片可用于对表达特定蛋白的外泌体进行捕获与富集，并对捕获后的外泌体使用酶联免疫反应进行鉴定。所述集成化微流控芯片可进行不同样品的外泌体的富集，进行不同特定蛋白表达的外泌体的捕获，可进行不同种类的抗体染色。
本发明的优点在于：1、操作简便、快捷；2、样品与试剂用量少，实验成本低廉；3、不接触有毒有害试剂，环境友好；4、高度集成化、应用范围广泛。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为集成化外泌体分离与检测微流控芯片结构示意简图；
图2为集成化外泌体分离与检测微流控芯片上层试剂池层结构示意图；
图3为集成化外泌体分离与检测微流控芯片中层液路控制层结构示意图；
图4为集成化外泌体分离与检测微流控芯片下层反应池层结构示意图；
图5为乳腺癌病人外泌体检测结果图；
图6为正常人外泌体检测结果图。
其中，外泌体样本池1、外泌体染色一抗池2、外泌体染色二抗池3、显色液池4、反应池5、废液池6、清洗缓冲液池7、外泌体进样通道A、外泌体染色一抗进样通道B、外泌体染色二抗进样通道C、主通道D、显色液进样通道E、废液流出通道F、清洗缓冲液进样通道G；除主通道D外，其余通道均有一气动微阀，控制液路的通断；
h1-h6均为试剂池底部贯穿孔，用以沟通试剂池与中层液路通道，外泌体样品进样孔h1、一抗进样孔h2、二抗进样孔h3、显色液进样孔h4、废液出口孔h5、清洗缓冲液进样孔h6；反应池进样孔h7，反应池出口孔h8。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的集成化外泌体分离与检测微流控芯片及其制备方法进行具体的说明。
本发明提供了一种集成化外泌体分离与检测微流控芯片，如图1所示该微流控芯片由上层、中层、下层三层顺序串联贴合布置组成，其中：上层为试剂池层(图2)，中层为液路控制层(图3)，底层为反应池层(图4)；
所述液路控制层具体设置有下述结构：
——外泌体进样通道A：前端与外泌体样品池1相连，后端垂直汇入主通道D，用于沟通两者，外泌体进样通道A上设计有气动微阀结构，用于控制该通道的通断；
——外泌体染色一抗进样通道B：前端与外泌体染色一抗池2相连，后端垂直汇入主通道D，用于沟通两者，外泌体染色一抗进样通道B上设计有气动微阀结构，用于控制该通道的通断；
——外泌体染色二抗进样通道C：前端与外泌体染色二抗池3相连，后端垂直汇入主通道D，用于沟通两者，外泌体染色二抗进样通道C上设计有气动微阀结构，用于控制该通道的通断；
——主通道D：设置在试剂池与反应池5之间，用于沟通两者；
——显色液进样通道E：与显色液池4相连并垂直汇入主通道D，用于沟通两者，显色液进样通道E上设计有气动微阀结构，用于控制该通道的通断；
——废液流出通道F：前端与反应池5相连，后端与废液池6相连，用于沟通两者，废液流出通道F上设计有气动微阀结构，用于控制该通道的通断；
——缓冲液进样通道G：与清洗缓冲液池7相连并垂直汇入主通道D，用于沟通两者，缓冲液进样通道G上设计有气动微阀结构，用于控制该通道的通断。
所述试剂池层设计有六个试剂池，分别为外泌体样本池1、外泌体染色一抗池2、外泌体染色二抗池3、显色液池4、废液池6、清洗缓冲液池7；反应池层设计有一个反应池，为反应池5。
所述外泌体样本池1通过外泌体进样孔h1与外泌体进样通道A相连，所述外泌体染色一抗池2通过一抗进样孔h2与外泌体染色一抗进样通道B相连，所述外泌体染色二抗池3通过二抗进样孔h3与外泌体染色二抗进样通道C相连，所述显色液池4通过显色液进样孔h4与显色液进样通道E相连，所述废液池6通过废液出口孔h5与废液流出通道F相连，所述清洗缓冲液池7通过清洗缓冲液进样孔h6与缓冲液进样通道G相连，所述反应池通过反应池进样孔h7与主通道D相连，通过反应池出口孔h8与废液流出通道F相连；每个通道均有单独的微阀控制，所述微控芯片的所有控制用的阀均为常闭阀。
所述集成化外泌体分离与检测微流控芯片还满足下述要求之一或其组合：
其一，所述上层芯片的材料为聚碳酸酯塑料，厚度为0.5-2.5cm；所述上层试剂池层为定制模块；上层试剂池层为公司定制的聚碳酸酯塑料模块。
其二，所述中层芯片和下层芯片的材料均为聚二甲基硅氧烷聚合物，中层芯片厚度为100-500μm，下层芯片厚度为1-2mm；
其三，所述试剂池为底面直径0.2-1cm，高度0.4-2.4cm的圆柱形结构；
其四，所述试剂池底部有一直径为0.2-0.5mm的圆孔，打通上层芯片，使其能够和中层芯片沟通；
其五，所述芯片的中层液路层液路高度与宽度相同，均为80-200μm；
其六，所述芯片的下层反应池层通道高度为0.8-1.6mm，反应池直径为2-8mm，连接通道宽度为80-200μm。
所述中层液路控制层是在制作成功的液路模板上甩一层高于模板100-500μm的聚二甲基硅氧烷膜；
所述反应池层是在制作成功的反应池模板上甩一层高于模板1-2mm的聚二甲基硅氧烷膜；
所述中层液路控制层的聚二甲基硅氧烷膜无结构一侧通过等离子键合到反应池层底部；
所述中层液路控制层的聚二甲基硅氧烷有结构的一侧通过等离子和反应池层有结构的一侧键合。
本发明提供了一种集成化外泌体分离与检测微流控芯片的应用，所述集成化外泌体分离与检测微流控芯片可用于体液(血液、尿液、唾液等)及培养基中外泌体浓度的检测。
集成化外泌体分离与检测微流控芯片的应用方法步骤如下：
(1)取出待测样品25-50μL，与修饰了特异性抗体的免疫捕获磁珠混合，磁珠终浓度达到1×106-5×106颗粒数/mL，室温孵育30-60min，备用；
(2)将孵育好的样品加入外泌体样品池1中，并依次将10-20μL外泌体染色一抗(1-4μg/mL)、10-20μL外泌体染色二抗(1-4μg/mL)、10-20μL显色液、150-300μL清洗缓冲液加入到外泌体染色一抗池2、外泌体染色二抗池3、显色液池4及清洗缓冲液池7中；
(3)将芯片置于泵阀操控系统中，在外泌体样品池1上方施加5-15kPa压力，打开外泌体进样通道A及废液流出通道F上的控制阀门，使外泌体样品进入反应池5并被反应池底部的磁铁吸附，实现外泌体的分离与富集；
(4)在清洗缓冲液池7上方施加5-15kPa压力，打开缓冲液进样通道G及废液流出通道F上的控制阀门，使缓冲液进入反应池5清洗掉多余的样品及杂质；
(5)在外泌体染色一抗池2上方施加5-15kPa压力，打开一抗进样通道B及废液流出通道F上的控制阀门，使外泌体染色一抗进入反应池5，室温孵育20-40min；
(6)重复步骤(4)，清洗掉多余的外泌体染色一抗；
(7)在外泌体染色二抗池3上方施加5-15kPa压力，打开二抗进样通道C及废液流出通道F上的控制阀门，使外泌体染色二抗进入反应池5，室温孵育20-40min；
(8)重复步骤(4)，清洗掉多余的外泌体染色二抗；
(9)在显色液池4上方施加5-15kPa压力，打开显色液进样通道E及废液流出通道F上的控制阀门，使显色液进入反应池5，室温避光孵育10-20min；
(10)使用酶标仪于370nm处检测吸光度。
所述集成化外泌体分离与检测微流控芯片的应用方法还满足下述要求：所述泵阀操控系统在试剂池层上方有六个压力控制装置，可控制各个试剂池压力大小；在各个通道的阀门位置有对应的控制模块，可用于控制阀门的状态；在反应池正下方有一块磁体，可用于吸附捕获了外泌体的免疫磁珠。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
集成化外泌体分离与检测微流控芯片采用光刻和腐蚀方法制备出通道部分突起的SU-8模板，芯片中下层结构分别由两个SU-8模板反模PDMS组成；
所述中层液路控制芯片模板制作为：取一块洁净的玻璃片，在甩胶机上甩SU-8胶厚度为100μm，95℃前烘20min，自然降温，将芯片中层结构的掩膜置于SU-8胶平板上面，紫外曝光30s，95℃后烘20min，自然降温；最后，采用乳酸乙酯将上述SU-8胶显影5min，180℃坚膜2h，自然降温，得到芯片模板；
所述下层反应池层芯片模板制作为：取一块洁净的玻璃片，在玻璃片上倒上SU-8胶厚度为1mm，95℃前烘12h，自然降温，将芯片下层结构的掩膜置于SU-8胶平板上面，紫外曝光100s，95℃后烘20min，自然降温；最后，采用乳酸乙酯将上述SU-8胶显影30min，180℃坚膜2h，自然降温，得到芯片模版。
实施例2
将芯片中、下层结构的SU-8模板用硅烷化试剂处理10min，使PDMS容易剥离模板底面；PDMS与引发剂以体积比10：1混合均匀，分别浇注于芯片中、下层结构SU-8模板，80℃烘箱固化40min，将PDMS与芯片SU-8模板剥离，得到带有结构的PDMS芯片；使用打孔器在中层液路控制层和上层试剂池层试剂池底部对应位置一一打孔，打穿；将芯片中层带有结构的一侧与芯片下层带有结构的一侧进行氧等离子体处理2min，80℃热烘45min，进行不可逆封接；将上述封接好的聚二甲基硅氧烷PDMS芯片与上层聚碳酸酯塑料经过氧等离子体处理2min，80℃热烘45min进行不可逆封接，即得到集成化外泌体分离与检测微流控芯片。
实施例3
乳腺癌病人血清样本中外泌体的分离与检测
选用实施例2中制备好的微流控芯片进行分离与检测，具体步骤如下所示：
(1)取出病人血清25μL，与修饰了EpCAM抗体(鼠抗人)的免疫捕获磁珠混合，磁珠终浓度达到5×106颗粒数/mL，室温孵育30min，备用；
(2)将孵育好的样品加入外泌体样品池(1)中，并依次将15μL的EpCAM一抗(兔抗人)(2μg/mL)、15μL辣根过氧化酶标记的二抗(2μg/mL)、15μL显色液、200μL清洗缓冲液加入到外泌体染色一抗池2、外泌体染色二抗池3、显色液池4及清洗缓冲液池7中；
(3)将芯片置于泵阀操控系统中，在外泌体样品池1上方施加10kPa压力，打开外泌体进样通道A及废液流出通道F上的控制阀门，使外泌体样品进入反应池5并被反应池底部的磁铁吸附，实现外泌体的分离与富集；
(4)在清洗缓冲液池7上方施加10kPa压力，打开缓冲液进样通道G及废液流出通道F上的控制阀门，使缓冲液进入反应池5清洗掉多余的样品及杂质；
(5)在一抗池2上方施加10kPa压力，打开一抗进样通道B及废液流出通道F上的控制阀门，使一抗进入反应池5，室温孵育30min；
(6)重复步骤(4)，清洗掉多余的一抗；
(7)在二抗池3上方施加10kPa压力，打开二抗进样通道C及废液流出通道F上的控制阀门，使二抗进入反应池5，室温孵育30min；
(8)重复步骤(4)，清洗掉多余的二抗；
(9)在显色液池4上方施加10kPa压力，打开显色液进样通道E及废液流出通道F上的控制阀门，使显色液进入反应池5，室温避光孵育15min；
(10)使用酶标仪于370nm处检测吸光度。
图5为三例乳腺癌病人血清中外泌体检测结果图，从图中可以看出，乳腺癌病人均能检测出表达EpCAM蛋白的外泌体。
实施例4
健康人血清样本中外泌体的分离与检测
选用实施例2中制备好的微流控芯片进行分离与检测，具体步骤如下所示：
(1)取出健康人血清25μL，与修饰了EpCAM抗体(鼠抗人)的免疫捕获磁珠混合，磁珠终浓度达到5×106颗粒数/mL，室温孵育30min，备用；
(2)将孵育好的样品加入外泌体样品池1中，并依次将15μL的EpCAM一抗(兔抗人)(2μg/mL)、15μL辣根过氧化酶标记的二抗(2μg/mL)、15μL显色液、200μL清洗缓冲液加入到外泌体染色一抗池2、外泌体染色二抗池3、显色液池4及清洗缓冲液池7中；
(3)将芯片置于泵阀操控系统中，在外泌体样品池1上方施加10kPa压力，打开外泌体进样通道A及废液流出通道F上的控制阀门，使外泌体样品进入反应池5并被反应池底部的磁铁吸附，实现外泌体的分离与富集；
(4)在清洗缓冲液池7上方施加10kPa压力，打开缓冲液进样通道G及废液流出通道F上的控制阀门，使缓冲液进入反应池5清洗掉多余的样品及杂质；
(5)在一抗池2上方施加10kPa压力，打开一抗进样通道B及废液流出通道F上的控制阀门，使一抗进入反应池5，室温孵育30min；
(6)重复步骤(4)，清洗掉多余的一抗；
(7)在二抗池3上方施加10kPa压力，打开二抗进样通道C及废液流出通道F上的控制阀门，使二抗进入反应池5，室温孵育30min；
(8)重复步骤(4)，清洗掉多余的二抗；
(9)在显色液池4上方施加10kPa压力，打开显色液进样通道E及废液流出通道F上的控制阀门，使显色液进入反应池5，室温避光孵育15min；
(10)使用酶标仪于370nm处检测吸光度。
图6是三例健康人血清中外泌体检测结果图，从图中可以看出，健康人血清中表达EpCAM的外泌体检出量约为癌症病人的1/20。此集成化外泌体分离与检测微流控芯片可实现乳腺癌和正常人表达EpCAM蛋白外泌体的区分。

Claims (8)

1.一种集成化外泌体分离与检测微流控芯片，其特征在于：
所述微流控芯片由上层、中层、下层三层顺序串联贴合布置组成，其中：上层为试剂池层，中层为液路控制层，底层为反应池层；
所述液路控制层具体设置有下述结构：
——外泌体进样通道(A)：前端与外泌体样品池(1)相连，后端垂直汇入主通道(D)，用于沟通两者，外泌体进样通道(A)上设计有气动微阀结构，用于控制该通道的通断；
——外泌体染色一抗进样通道(B)：前端与外泌体染色一抗池(2)相连，后端垂直汇入主通道(D)，用于沟通两者，外泌体染色一抗进样通道(B)上设计有气动微阀结构，用于控制该通道的通断；
——外泌体染色二抗进样通道(C)：前端与外泌体染色二抗池(3)相连，后端垂直汇入主通道(D)，用于沟通两者，外泌体染色二抗进样通道(C)上设计有气动微阀结构，用于控制该通道的通断；
——主通道(D)：设置在试剂池与反应池(5)之间，用于沟通两者；
——显色液进样通道(E)：与显色液池(4)相连并垂直汇入主通道(D)，用于沟通两者，显色液进样通道(E)上设计有气动微阀结构，用于控制该通道的通断；
——废液流出通道(F)：前端与反应池(5)相连，后端与废液池(6)相连，用于沟通两者，废液流出通道(F)上设计有气动微阀结构，用于控制该通道的通断；
——缓冲液进样通道(G)：与清洗缓冲液池(7)相连并垂直汇入主通道(D)，用于沟通两者，缓冲液进样通道(G)上设计有气动微阀结构，用于控制该通道的通断。
2.按照权利要求1所述集成化外泌体分离与检测微流控芯片，其特征在于：所述试剂池层设计有六个试剂池，分别为外泌体样本池(1)、外泌体染色一抗池(2)、外泌体染色二抗池(3)、显色液池(4)、废液池(6)、清洗缓冲液池(7)；反应池层设计有一个反应池，为反应池(5)。
3.按照权利要求2所述集成化外泌体分离与检测微流控芯片，其特征在于：所述外泌体样本池(1)通过外泌体进样孔(h1)与外泌体进样通道(A)相连，所述外泌体染色一抗池(2)通过一抗进样孔(h2)与外泌体染色一抗进样通道(B)相连，所述外泌体染色二抗池(3)通过二抗进样孔(h3)与外泌体染色二抗进样通道(C)相连，所述显色液池(4)通过显色液进样孔(h4)与显色液进样通道(E)相连，所述废液池(6)通过废液出口孔(h5)与废液流出通道(F)相连，所述清洗缓冲液池(7)通过清洗缓冲液进样孔(h6)与缓冲液进样通道(G)相连，所述反应池通过反应池进样孔(h7)与主通道(D)相连，通过反应池出口孔(h8)与废液流出通道(F)相连；每个通道均有单独的微阀控制，所述微控芯片的所有控制用的阀均为常闭阀。
4.按照权利要求1和2所述集成化外泌体分离与检测微流控芯片，其特征在于：所述集成化外泌体分离与检测微流控芯片还满足下述要求之一或其组合：
其一，所述上层芯片的材料为聚碳酸酯塑料，厚度为0.5-2.5cm；
其二，所述中层芯片和下层芯片的材料均为聚二甲基硅氧烷聚合物，中层芯片厚度为100-500μm，下层芯片厚度为1-2mm；
其三，所述试剂池为底面直径0.2-1cm，高度0.4-2.4cm的圆柱形结构；
其四，所述试剂池底部有一直径为0.2-0.5mm的圆孔，打通上层芯片，使其能够和中层芯片沟通；
其五，所述芯片的中层液路层液路高度与宽度相同，均为80-200μm；
其六，所述芯片的下层反应池层通道高度为0.8-1.6mm，反应池直径为2-8mm，连接通道宽度为80-200μm。
5.按照权利要求4所述集成化外泌体分离与检测微流控芯片，其特征在于：所述上层试剂池层为定制模块；
所述中层液路控制层是在制作成功的液路模板上甩一层高于模板100-500μm的聚二甲基硅氧烷膜；
所述反应池层是在制作成功的反应池模板上甩一层高于模板1-2mm的聚二甲基硅氧烷膜；
所述中层液路控制层的聚二甲基硅氧烷膜无结构一侧通过等离子键合到反应池层底部；
所述中层液路控制层的聚二甲基硅氧烷有结构的一侧通过等离子和反应池层有结构的一侧键合。
6.一种如权利要求1-5所述集成化外泌体分离与检测微流控芯片的应用，其特征在于：所述集成化外泌体分离与检测微流控芯片可用于体液(血液、尿液、唾液等)及培养基中外泌体浓度的检测。
7.按照权利要求6所述集成化外泌体分离与检测微流控芯片的应用，其特征在于：所述集成化外泌体分离与检测微流控芯片的应用方法步骤如下：
(1)取出待测样品25-50μL，与修饰了特异性抗体的免疫捕获磁珠混合，磁珠终浓度达到1×106-5×106颗粒数/mL，室温孵育30-60min，备用；
(2)将孵育好的样品加入外泌体样品池(1)中，并依次将10-20μL外泌体染色一抗(1-4μg/mL)、10-20μL外泌体染色二抗(1-4μg/mL)、10-20μL显色液、150-300μL清洗缓冲液加入到外泌体染色一抗池(2)、外泌体染色二抗池(3)、显色液池(4)及清洗缓冲液池(7)中；
(3)将芯片置于泵阀操控系统中，在外泌体样品池(1)上方施加5-15kPa压力，打开外泌体进样通道(A)及废液流出通道(F)上的控制阀门，使外泌体样品进入反应池(5)并被反应池底部的磁铁吸附，实现外泌体的分离与富集；
(4)在清洗缓冲液池(7)上方施加5-15kPa压力，打开缓冲液进样通道(G)及废液流出通道(F)上的控制阀门，使缓冲液进入反应池(5)清洗掉多余的样品及杂质；
(5)在外泌体染色一抗池(2)上方施加5-15kPa压力，打开一抗进样通道(B)及废液流出通道(F)上的控制阀门，使外泌体染色一抗进入反应池(5)，室温孵育20-40min；
(6)重复步骤(4)，清洗掉多余的外泌体染色一抗；
(7)在外泌体染色二抗池(3)上方施加5-15kPa压力，打开二抗进样通道(C)及废液流出通道(F)上的控制阀门，使外泌体染色二抗进入反应池(5)，室温孵育20-40min；
(8)重复步骤(4)，清洗掉多余的外泌体染色二抗；
(9)在显色液池(4)上方施加5-15kPa压力，打开显色液进样通道(E)及废液流出通道(F)上的控制阀门，使显色液进入反应池(5)，室温避光孵育10-20min；
(10)使用酶标仪于370nm处检测吸光度。
8.按照权利要求7所述集成化外泌体分离与检测微流控芯片的应用，其特征在于：所述集成化外泌体分离与检测微流控芯片的应用方法还满足下述要求：所述泵阀操控系统在试剂池层上方有六个压力控制装置，可控制各个试剂池压力大小；在各个通道的阀门位置有对应的控制模块，可用于控制阀门的状态；在反应池正下方有一块磁体，可用于吸附捕获了外泌体的免疫磁珠。
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