EA003735B1 - Ген, кодирующий новый маркер рака - Google Patents

Abstract

Выделяют молекулу кДНК, кодирующую белок, обозначенный как Labyrinthin (Lab), и определяют ее нуклеотидную последовательность. Упомянутый белок либо пептиды, полученные из упомянутого белка, являются маркерами, пригодными для определения раковых опухолей новых классов. В диагностических пробах для определения упомянутых раковых опухолей используются антитела к Lab либо нуклеотидные зонды, которые гибридизуются с упомянутым lab геном либо его фрагментом. В вакцинах, пригодных для предупреждения рецидива раковых опухолей у субъекта с положительной реакцией на Lab (либо lab) либо для профилактики начального возникновения раковой опухоли, используются белки либо пептиды, полученные из Lab. Экспрессия Lab посредством иммуногенных проб используется для контролирования результатом лечения рака. При лечении используются антисмысловые молекулы против lab. Смысловые молекулы lab используются для восстановления утраченной функции lab в нормальных больных клетках, например, в железистых клетках.

Description

Настоящее изобретение относится к гену, кодирующему белок и составляющие его пептиды, который включает эпитоп, раковый антиген, пригодный для использования в качестве маркера, который не ограничивается ранее определенными гистологическими классами рака. Антигенные пептиды пригодны для использования в качестве вакцины для лечения и профилактики рака, а также для получения новых специфичных моноклональных антител. Антисмысловые молекулы пригодны для использования в фармацевтических композициях и могут применяться для диагностики и лечения.

Предпосылки создания изобретения

Рак (рак представляет собой злокачественную опухоль, где термин опухоль означает аномальную массу ткани, которая не обязательно должна быть злокачественной; термин неоплазма обозначает форму опухоли) является ведущей причиной смертных случаев среди мужчин и женщин во всем мире. Лишь в Соединенных Штатах ежегодно диагностируется свыше 1 млн новых случаев заболевания и ежегодно же сообщается более чем о 0,5 млн смертных случаев (Лендис (Ьап618) и другие, 1998). В историческом плане в основу группирования и лечения опухолей отчасти положены ткани, в которых они возникают, например, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак легких и т.п. Однако, в случае рака легких, например, общепризнанно, что эти опухоли представляют собой крайне разнородную группу новообразований. Это в равной степени относится и к опухолям, возникающим в других тканях. Отчасти вследствие упомянутой разнородности, существуют сложные и противоречивые классификационные схемы, которые применяются для опухолей, обнаруживаемых у человека. Предшествующие попытки лечения рака тормозились: (1) спорной классификацией опухолей, возникающих в определенных тканях, и (2) использованием микроскопических методов, основанных на определении внешнего вида упомянутых опухолей (гистологическая классификация). Несмотря на то, что существующие схемы классификации опухолей различных типов обладают некоторой прогностической ценностью, почти все упомянутые классификации оказываются непригодными для прогнозирования реакции на лечение и вероятного течения лечения либо хода заболевания. Для существенного изменения статистики выживаемости людей, имеющих рак, необходимы усовершенствованные классификационные схемы, основанные на биологическом строении упомянутых неоплазм. Одним из подходов к решению упомянутых проблем является размещение молекул, обладающих специфичностью к опухолям, в предпочтительном варианте антигенов, в молекулах, которые являются маркерами раковых клеток. (Термин маркер в данном случае определяется как любое свойство, которое может использоваться для различения раковых и нормальных тканей, а также других болезненных состояний). Таким образом, присутствие маркера является основанием для классификации.

Моноклональные антитела (МСАв), полученные методами гибридизации соматических клеток, как правило, на мышах, являются пригодными молекулярными зондами для обнаружения и распознавания клеточных антигенов и, следовательно, обладают значительным потенциалом обнаружения раковых антигенов. Упомянутые антитела связываются со специфическими антигенами и упомянутое связывание обнаруживается с помощью хорошо известных способов. В случае выявления связывания делается вывод о присутствии специфического антигена. Упомянутые раковые антигены, находящиеся на поверхности клетки либо обнаруживаемые в массе раковой опухоли, представляют собой молекулярные мишени для иммунных систем хозяина (в том числе и антител хозяина). Результаты недавних исследований позволяют предположить, что раковые пациенты, имеющие антитела против своих опухолей, находятся в лучшем положении по сравнению с пациентами, у которых отсутствует иммунная реакция подобного типа (Ливингстон (Ыущдвйэи) и другие, 1994). Таким образом, естественные, индуцированные либо введенные антитела представляют собой перспективный терапевтический подход.

Следствием гуманизации моноклональных антител не человеческого происхождения (процесс, посредством которого реакционноактивные участки моноклональных антител не человеческого происхождения вводятся в клонируемые человеческие антитела и экспрессируются) является снижение иммуногенности чужеродных антител без потери характерного для них специфического связывания в случаях применения ίη νίνο и ех νίνο. Моноклональные антитела могут использоваться в качестве иммуносцинтиграфических агентов ίη νίνο, в диагностических тестах и для лечения (Радосевич Ша6о5еую11) и другие, 1988, 1990; Розен (Ковеп) и другие, 1988).

Вакцинотерапия представляет собой хорошо разработанный метод, направленный на индуцирование иммунной реакции без воздействия возбудителя заболевания либо состояния. Доступно, например, множество вакцин для стимулирования реакции хозяина на бактериальные и вирусные агенты. Использование раковых антигенов (маркеров) в вакцине могло бы предотвратить возникновение первичных раковых опухолей и могло бы также явиться средством предотвращения рецидива заболевания.

Генотерапия представляет собой средство, с помощью которого процесс генетического конструирования клеток модифицируется для экспрессии гена, представляющего интерес. Существует большое количество разновидностей генотерапии, в том числе генная замести тельная терапия, антисмысловая супрессивная терапия и экспрессия генов-заменителей. Открытие генов, кодирующих раковые, в предпочтительном варианте опухолеспецифические антигены (маркеры), предоставляет возможность генетического вмешательства с целью предотвращения пролиферации раковых клеток. Точное и последовательное использование ракового маркера для дифференциации раковых и нормальных тканей обладает не только диагностическим потенциалом, но и является также желательным для лечения и прогнозирования. Вследствие этого осуществлялся поиск подобных маркеров.

Результаты недавних исследований показали, что в некоторых линиях клеток аденокарциномы человека и в первичных злокачественных гепатомах сверхпродуцируется ген, кодирующий человеческий фермент, аспартил бетагидроксилазу (НААН), который мог бы использоваться в качестве маркера. Упомянутый ген, кодирующий НААН, был клонирован и секвенирован (Гронке (Отопке) и другие, 1989, 1990; Ванг (\Уапд) и другие, 1991; Джа (Ла) и другие, 1992, 1994; Кориот (Копо1й) и другие, 1994; Лавесье (Ьауащыете) и другие, 1996). Немногое, однако, известно об экспрессии НААН в человеческих опухолях в общем (Лавесье (Ьауа1кК1ете) и другие, 1996).

Изучение НААН явилось логическим продолжением изучения аналога этого фермента, встречающегося у крупного рогатого скота (Гронке (Отопке) и другие, 1989, 1990; Ванг (\Уапд) и другие, 1991; Джа (Ла) и другие, 1992). Аспартил бета-гидроксилаза крупного рогатого скота представляет собой внутриклеточный гликозилированный белок, находящийся в зернистой эндоплазматической сети. Сообщалось, что упомянутый белок имеет молекулы трех основных разновидностей: одну массой 85 кДа и две активные формы с молекулярной массой 56 и 52 кДа соответственно (Лавесье (Ьауа1кщете) и другие, 1996).

С помощью стандартных биохимических методов аспартил бета-гидроксилаза крупного рогатого скота (ЬААН) была очищена с определением характеристик (Гронке (Отопке) и другие, 1990; Ванг (^апд) и другие, 1991). Было показано, что активность упомянутого фермента коррелирует с очищенными разновидностями массой 52 и 56 кДа.

В иммунологическом плане наблюдалась также родственная высокомолекулярная форма (85-90 кДа). Как часть процесса очистки ЬААН связывается с Соп А сефарозой, что соответствует выводу о том, что упомянутый фермент гликозилирован. (В последующих сообщениях относительно определения последовательности ДНК было показано три возможных участка гликозилирования, причем один из упомянутых участков расположен очень близко от известной активной области фермента). Упомянутый бе лок является очень кислым по своей природе и для солюбилизации активной фракции детергент не требуется. Упомянутый активный участок зависит от присутствия гистидина в положении 675 у биохимически выделенного белка крупного рогатого скота (ЬААН) (Джа (Ла) и другие, 1994).

Для НААН была определена частичная аминокислотная последовательность. ДНКзонды (ДНК-зонд представляет собой молекулу, имеющую нуклеотидную последовательность, способную связываться с определенной нуклеотидной последовательностью при определенных условиях), выведенные из этой аминокислотной последовательности, использовались для скринирования библиотеки кДНК крупного рогатого скота (Джа (Ла) и другие, 1992). (Библиотека кДНК включает фрагменты ДНК, кодирующие генные продукты, например, пептиды, в отличие от геномной ДНК). В состав нескольких перекрывающихся последовательностей кДНК в упомянутой библиотеке входила последовательность открытой рамки считывания (ОВР), состоящая из 764 аминокислот, которая, как полагают, кодирует белок массой 85 кДа. В состав упомянутой последовательности открытой рамки считывания входили также два других возможных инициирующих кодона, т.е. точки, в которых начинается кодирование. Большинству 3’ инициирующих кодонов предшествовал участок связывания рибосом. Результатом трансляции упомянутого клона, имевшего эту последовательность, является белок, масса которого составляет приблизительно 85 килодальтон. К мембранной фракции клеток МО-63 человека получали антисыворотку, которую использовали для иммуноскринирования библиотеки кДНК, составленной из клеток МО-63. Сообщались данные по одному клону, который может кодировать белок, состоящий из 757 аминокислот, и который, как было показано посредством секвенирования, имеет высокую степень Ν’концевой гомологии с ЬААН (Кориот (КопоШ) и другие, 1994). Когда этот клон был использован в трансляционной системе ш уйто (искусственная смесь нормальной клеточной цитоплазмы, использованная для превращения мРНК в белок), был получен белок массой 56 кДа. Предположили, что это было обусловлено посттрансляционным гидролизом.

Упомянутый фермент НААН несет ответственность за модификацию специфических остатков аспарагиновой кислоты в пределах доменов, подобных домену эпидермального фактора роста белков. Предположили, что упомянутые модифицированные остатки аспарагиновой кислоты обеспечивают превращение доменов, подобных домену эпидермального фактора роста, в области связывания кальция (Гронке (Огопке) и другие, 1989, 1990; Ванг (^апд) и другие, 1991; Джа (Ла) и другие, 1992,

1994; Кориот (Коио1Ь) и другие, 1994; Лавесье (ЛауаюЛете) и другие, 1996).

Фермент, родственный НААН, аспартил бета-гидроксилазу (ААН), вначале подвергли изучению потому, что он своеобразно модифицировал определенные остатки аспарагиновой кислоты либо аспарагина в группе биологически важных белков, в том числе витамин Кзависимых факторов свертывания крови VII, IX и X. Другие белки, например, С, 8 и Ζ, также подвергались упомянутой модификации (Гронке (Стопке) и другие, 1989, 1990; Ванг (^апд) и другие, 1991; Джа (Ла) и другие, 1992, 1994; Кориот (КопоШ) и другие, 1994; Лавесье (ЛауаюЛете) и другие, 1996). Было показано, что остатки аспарагиновой кислоты и аспарагина модифицируются НААН в белки, содержащие домены, подобные домену эпидермального фактора роста. Функция упомянутых остатков бетагидроксиаспарагиновой кислоты и бетагидроксиаспарагина неизвестна, было, однако, выдвинуто предположение, что эта модификация необходима для связывания кальция в доменах, подобных домену эпидермального фактора роста (ЕСБ) определенных белков.

Были получены антитела к клеткам злокачественной гепатомы (ЕОСИ8) человека (Лавесье (ЛауаюЛете) и другие, 1990). Одно моноклональное антитело вступало в реакцию с антигеном, имевшим высокую степень экспрессии в злокачественных гепатомах (Лавесье (ЛауайК1ете) и другие, 1996). Результатом иммуноскринирования с помощью этого антитела и библиотеки лямбда д!11 НерС2 явилось выделение частичной кДНК, которая в последующем была использована для выделения более крупного клона.

Сообщалось, что линия клеток аденокарциномы человека, получившая обозначение А549, имела очень высокие уровни активности НААН (Лавесье (ЛауаюЛете) и другие, 1996). Против линии клеток аденокарциномы человека А549 (Американская коллекция типовых культур, номер доступа ССЬ 185) было получено мышиное моноклональное антитело, получившее обозначение МСА 44-3А6 (патент США № 4,816,402) (Радосевич (Вайокеу1ей) и другие, 1985). Упомянутое антитело распознавало находящийся на поверхности клетки негликозилированный антигенный белок, имеющий расчетную среднюю молекулярную массу 40 кДа.

Упомянутый антиген экспрессировался клетками А549 и, как было установлено, он являлся хорошим аденокарциномным маркером, т.е. он часто экспрессировался раковыми опухолями, которые при гистологическом исследовании выглядели подобно аденокарциномам (Радосевич (Вайокеу1ей) и другие, 1990а; Ли (Лее) и другие, 1985). Уникальность упомянутого антитела МСА 44-3А6 заключается в том, что это первое моноклональное антитело, имеющее упомянутую специфичность связывания. Ре зультаты, полученные Международным Семинаром по раку легких, подтвердили другие родственные опубликованные данные по МСА 443А6 (Стахель (81аЛе1), 1994).

Упомянутое антитело, получившее обозначение МСА 44-3 А6, имеет клиническую пригодность, поскольку оно дифференцирует антигены, связанные с аденокарциномами. Распределение упомянутого антигена в нормальных и эмбриональных тканях ограничивается некоторыми железистыми тканями (Радосевич (Вайокеуюй) и другие, 1991). Обнаружение может осуществляться на фиксированой формалином, залитой парафином ткани (Радосевич (Вайокеуюй) и другие, 1985, 1988, 1990а, 1990Ь; Ли (Лее) и другие, 1985, 1986; Пиль (Р1еЫ) и другие, 1988; Комбс (СошЬк) и другие, 1988Ь, 1988с; Баннер (Ваппег) и другие, 1985). Упомянутое антитело имеет ограниченную картину связывания в легочных опухолях человека (Ли (Лее) и другие, 1985; Баннер (Ваппег) и другие, 1985; Радосевич (Вайокеуюй) и другие, 1990а, 1990Ь).

В процессе исследования более чем двух сотен случаев рака легких было обнаружено, что МСА 44-3А6 реагирует со всеми обследованными аденокарциномами, многими из числа крупноклеточных карцином, а также с субпопуляциями промежуточного нейроэндокринного мелкоклеточного рака легких, четко дифференцированного нейроэндокринного мелкоклеточного рака, карциноидными опухолями, но не реагирует с мезотелиомами. МСА 44-3А6 не реагирует с плоскоклеточными раковыми опухолями, аденоматозом легких либо мелкоклеточными раковыми опухолями (Ли (Лее) и другие, 1985). МСА 44-3А6 пригодно для различения аденокарцином, метастазирующих в плевру, и мезотелиом (Ли (Лее) и другие, 1986). Упомянутое антитело отличается избирательной реактивностью среди аденокарцином и крупноклеточных карцином (Пиль (Р1еЫ) и другие, 1988о; Радосевич (Вайокеуюй) и другие, 1990Ь).

В процессе исследования свыше 40 случаев рака легких со сравнением цитологических и гистологических данных было установлено, что МСА 44-3А6 пригодно для цитологического диагностирования и обеспечивает получение результатов, соответствующих гистологическим данным (Баннер (Ваппег) и другие, 1985). Гистология занимается изучением тканей (состоящих из клеток). Цитология занимается изучением клеток, удаленных из организующего контекста, который обычно называют тканью. Клетки, удаленные из тканей, не всегда ведут себя так, как если бы они оставались в составе ткани, из которой они были получены. К счастью, упомянутый антиген, обнаруженный МСА 44-3А6, экспрессированный аденокарциномными клетками в ткани, ведет себя точно так же, как и аденокарциномные клетки, удаленные из ткани. Это чрезвычайно важная с ди003735 агностической точки зрения характеристика. Были продемонстрированы подобные же корреляции с использованием клеточных блоков легочных карцином, полученных цитологическими методами, а также аденокарциномных клеток, представляющих общую воду организма из других участков тела (Ли (Бее) и другие, 1985; Спаньоло (8радпо1о) и другие, 1991; Комбс (СотЬк) и другие, 1988с). Кроме того, МСА 443А6 связывается с аденокарциномами из других участков, кроме рака легких. Сообщалось об экспрессии упомянутого антигена в первичных и метастатических поражениях (Комбс (СотЬк) и другие, 1988а). Отмечалась также пригодность упомянутого моноклонального антитела для дифференциации рака и доброкачественных поражений в ткани молочной железы человека (Дуда (Эийа) и другие, 1991).

Определяли клеточную локализацию упомянутого антигена, обнаруженного с помощью МСА 44-3А6. С помощью радиоиммуноанализа живых клеток (проба с радиоактивными антителами, направленная на определение связывания упомянутого антитела с живыми клетками), иммунофлуоресценции и анализа с помощью клеточного сортера с возбуждением флуоресценции живых клеток (РАС8), было показано, что упомянутый антиген, обнаруженный с помощью МСА 44-3А6, располагается на внешней поверхности клетки (Радосевич (Кайокеу1ей) и другие, 1985). Дополнительные исследования посредством иммуносорбентной электронной микроскопии и анализа методом РАС8 показали, что упомянутый антиген не модулируется (т.е. не интернализируется раковыми клетками при связывании антителом), экспрессируется на внеклеточной поверхности цитоплазматической мембраны и не является специфичным для цикла деления клетки, т.е. упомянутая клетка образует белок постоянно не только в процессе прохождения цикла деления, но и тогда, когда она не делится (Радосевич (Кайокеу1ей) и другие, 1991). Упомянутый антиген не обнаруживается в сыворотке нормальных либо раковых пациентов и не выделяется в культуральную среду положительными линиями клеток (известно, например, что часть цитоплазматической мембраны раковых клеток вздувается пузырями и отделяется в окружающую жидкость) (Радосевич (Кайокеу1ей) и другие, 1985). Недавно у 3 из 27 произвольно обследованных пациентов с аденокарциномами были обнаружены природные антитела к упомянутому антигену. Наряду с этим, МСА 44-3 А6 с радиоактивной меткой использовали для определения местоположения опухолей А549, возникающих у голых мышей. Доксорубициновый иммуноконъюгат МСА 44-3 А6 обладает избирательной токсичностью ίη уйго (81пки1е (Синкуле) и другие, 1991).

Определение нуклеотидной и аминокислотной последовательности упомянутого антигена, обнаруживаемого с помощью МСА 44

3А6, повысило бы пригодность этого антигена для диагностирования, лечения и профилактики рака.

Краткое изложение сущности изобретения

Упомянутый антиген, обнаруженный с помощью упомянутого антитела МСА 44-3 А6, как описано в разделе Предпосылки создания изобретения, обозначают в настоящее время, как БаЬупЩЫп. Ген (обозначаемый 1аЬупЩ1нп; сокращенно 1аЬ), характеризующийся уникальной нуклеотидной последовательностью, которая кодирует антиген, обнаруженный с помощью МСА 44-3А6, был выделен с определением характеристик. Упомянутое условное обозначение 1аЬ означает нуклеиновые ДНК/РНК формы; обозначение 1аЬ означает белок, кодируемый 1аЬ ДНК/РНК.

В настоящем изобретении, описание которого представлено, упомянутое антитело МСА 44-3 А6 используется как инструмент для клонирования упомянутого гена, кодирующего БаЬ. В дополнение к этому эпитоп (необходимый участок связывания антитела, находящийся на упомянутом антигене) для МСА 44-3 А6 на упомянутом белке БаЬ, экспрессированном упомянутым клоном, был идентифицирован как РТСЕРО (стандартное сокращение для аминокислот). Упомянутый эпитоп представляет собой важную иммунодоминантную последовательность; это значит, что, в случае введения в организм животных, упомянутые животные с готовностью продуцируют антитела к упомянутой последовательности.

Одним из аспектов настоящего изобретения является использование 1аЬ ДНК в режиме смысловой экспрессии (нормальная транскрипция последовательности ДНК в направлении 3'5' для получения нити мРНК из смысловой нити ДНК, причем упомянутая мРНК является комплементарной ДНК) для: (1) маркирования человеческих опухолей с помощью нуклеотидных зондов; (2) обнаружения ДНК и мРНК экспрессии 1аЬ в клетках и тканях; (3) преобразования клеток в клетки железистого типа; (4) продуцирования БаЬ антигена ίη у1уо для иммунизации; (5) ех у1уо экспрессии БаЬ для иммунизации с продуцированием антител; и (6) продуцирования БаЬ ίη νίΙΐΌ. Другим аспектом настоящего изобретения является использование антисмысловой молекулы, например, посредством продуцирования нити мРНК либо ДНК с обратной относительно смысловой молекулы ориентацией, для подавления роста 1аЬупЩ1нпэкспрессируемых (раковых) клеток.

Аспектом настоящего изобретения является вектор, включающий молекулу ДНК с нуклеотидной последовательностью, кодирующей как минимум эпитоп упомянутого БаЬ антигена и соответствующую регуляторную последовательность для обеспечения возможности экспрессирования в клетке-хозяине.

Другим аспектом настоящего изобретения является аминокислотная последовательность, выведенная из участка кодирования белка упомянутого 1аЬ гена. Отдельные участки упомянутой последовательности, что было определено с помощью иммунологических методов, вызывают эффекты, соответствующие эффектам как природных (из раковых клеток), так и химически продуцированных (синтезированных пептидов) и экспрессированных продуктов упомянутого клонированного 1аЬ гена.

Другим аспектом настоящего изобретения является использование упомянутой выведенной аминокислотной последовательности ЬаЬ в целом, пептидов, полученных из ЬаЬ либо химически продуцированных (синтетических) ЬаЬ пептидов, или любой комбинации упомянутых молекул, для использования при получении вакцин для профилактики раковых опухолей человека и/либо лечения раковых больных. Для целей настоящего изобретения упомянутое выражение раковые больные обозначает лиц, в клетках которых обнаружен упомянутый ЬаЬ антиген. Эти препараты могут использоваться также для предотвращения появления у этих пациентов опухолей перед их начальным возникновением.

Моноклональные антитела, направленные на упомянутый ЬаЬ белок либо антигенные компоненты или производные ЬаЬ белков, пригодны для обнаружения ЬаЬ и для других целей. Моноклональные антитела, получаемые в разновидностях, отличающихся от реагирующих с упомянутым ЬаЬ антигеном, могут модифицироваться рядом методов молекулярного клонирования, например, таким образом, что они сохраняют свою способность связывания с упомянутыми ЬаЬупЩ1ип белками, однако не проявляют иммуногенности в организме человека (Састри (8аЧгу) и другие, 1989; Сембрук (8атЬгоок) и другие, 1990). Вкратце, это осуществляется посредством замещения последовательности участка связывания гена клонированного человеческого антитела последовательностью участка связывания представляющего интерес моноклонального антитела не человеческого происхождения. Эти гуманизированные моноклональные антитела используются как терапевтические и диагностические реактивы ίη νίνο, ех νίνο и ίη νίίτο.

Использование упомянутого ЬаЬ белка либо полученных из него антигенных пептидов в диагностических пробах на рак, является способом контролирования пациентов на присутствие и количество антител, которые они имеют в крови либо других общих водах или тканях тела. Подобное обнаружение не ограничивается формами рака, относящимися к ранее определенному классу либо классам, но является пригодным для раковых клеток, имеющих ЬаЬ маркерный антиген. Степень сероконверсии, определяемая методами, известными специалистам в данной области техники [например, твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А) (Ингрелл (Епдга11) и Перлман (Рег1тапп), 1971)], может использоваться для контролирования эффектов лечения.

Лечение с помощью антисмысловых молекул к 1аЬ либо антител к ЬаЬ, входящих в состав фармацевтической композиции, является методом лечения пациентов, имеющих ЬаЬ в либо на своих раковых клетках.

Краткое описание рисунков

Фиг. 1 - нуклеиновокислотная последовательность упомянутого 1аЬ гена (Последовательность № 1).

Фиг. 2 - аминокислотная последовательность ЬаЬ, выведенная из упомянутого 1аЬ гена (Последовательность № 2).

Фиг. 3 - иллюстрация упомянутого 1аЬ гена и его связи с упомянутым НААН ферментом.

Подробное описание изобретения

Молекулярная биология ЬаЬупЩЫп: Для демонстрации того, что эпитоп МСА 44-3А6 кодируется белковой последовательностью, из упомянутой линии клеток А549 была выделена высокомолекулярная ДНК. Полученную ДНК соосаждали (с помощью кальция) с плазмидой (р8Упео) и использовали для трансфекции линии клеток мышей, обозначенной В78Н1 (Альбине (А1Ь1по) и другие, 1985). Упомянутая линия клеток мышей отрицательна по экспрессии эпитопа и, как сообщалось, имеет высокую частоту включения и экспресии любых последовательностей ДНК человека. Если бы упомянутая линия клеток В78Н1 была в состоянии включить ДНК, следовало бы ожидать, что она поглотит как человеческую, так и плазмидную ДНК. Плазмидная ДНК обеспечивает устойчивость упомянутых клеток к С418 (лекарственный препарат, токсичный в нормальных условиях). Таким образом, если клетка, чувствительная в нормальных условиях к ингибитору роста 6418, растет в С418, она должна была бы поглотить упомянутую плазмиду и могла бы также поглотить одну либо несколько последовательностей ДНК А549. После отбора с помощью 0418 (способ отбора только тех клеток, которые обладают устойчивостью для роста в 0418, посредством включения/экспресии Иео гена на р8Упео плазмиде) было обнаружено приблизительно 15 из 1х10⁵ клонов посредством иммуноселекции с помощью МСА 44-3 А6. Этот результат соответствует выводу о том, что линия клеток человека А549 имеет ДНК, кодирующую ЬаЬ, и включает регулирующие последовательности, необходимые для экспрессии ЬаЬ.

Сравнение НААН и ЬаЬупЩЫп: Поскольку последовательность ДНК 1аЬ была определена как аспект настоящего изобретения, можно произвести сравнение НААН и 1аЬ. Нуклеотидные последовательности НААН и 1аЬ имеют некоторое сходство внутренних фрагментов, однако различаются на любой стороне фрагмента и свя заны с различными продуктами. Этот вывод основывается отчасти на результатах анализа и гомологии последовательностей ДНК, сообщенных для двух упомянутых генов. В частности, 1аЬ 5' участок не имеет гомологии с НААН. Участок кодирования белка 1аЬ имеет приблизительно 99,6% гомологию с внутренним фрагментом предложенного для НААН участка кодирования белка. Упомянутый 3' участок не имеет гомологии с последовательностью, сообщенной для НААН. Фактически все другие результаты сравнения НААН и 1аЬупЩ1ип различаются, например: (1) молекулярная масса белков, (2) размещение в клетке, (3) размещение в хромосоме, (4) гистологическое представление в нормальных тканях и опухолях, (5) назернблоттинговая экспрессия, (6) результаты иммунологических исследований.

Несмотря на то, что участок кодирования белка 1аЬ идентичен внутреннему участку последовательности, сообщенной для НААН, упомянутый 5' нетранслированный участок НААН отличается и часть 5' транслированного участка кодирования белка НААН отсутствует на участке, обнаруженном в упомянутом 1аЬ клоне. Следовало бы ожидать, что упомянутый белок как НААН, так и 1аЬ клонов должен быть весьма кислым по своей природе и, вследствие этого, демонстрировать аномальное поведение при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Продукт, клонированный и раскрытый в настоящем изобретении, перемещается идентично нативному белку, обнаруженному в нескольких линиях клеток. Убедительным свидетельством в пользу того, что был клонирован правильный фрагмент гена, кодирующего упомянутый антиген, обнаруженный с помощью МСА 44-3А6 (мРНК), является то, что, в случае получения упомянутого рекомбинантного белка, упомянутый рекомбинантный белок должен действовать (в данном случае, иметь среднюю молекулярную массу) точно так же, как и независимый полученный биологическим путем источник упомянутого белка. ЬаЬ, полученный из клонов, имеет характеристики ЬаЬ из клеток.

Упомянутая выведенная аминокислотная последовательность, закодированная НААН, требует применения открытой рамки считывания, которая позволила бы получить белок массой 85-90 кДа и не учитывает наличия нескольких инициирующих кодонов и других более коротких открытых рамок считывания. Упомянутый выведенный НААН белок (биохимически) гликозилирован и сообщенная последовательность имеет участки гликозилирования (Кориот (Когю!й) и другие, 1994; Лавесье (Ьауа1851сгс) и другие, 1996). В противоположность этому, ЬаЬ не гликозилирован и не имеет предсказанных участков гликозилирования.

Упомянутая выведенная НААН аминокислотная последовательность включает участок, общий с упомянутой ЬаЬ аминокислотной последовательностью, который, согласно предположению, обладает чрезвычайно высокой гидрофобностью. Для растворения ЬаЬ необходимы сильные детергенты; НААН в них не нуждается. Повышенная экспрессия НААН (по результатам определения активности фермента) в той же самой линии клеток (А549), которая была использована для клонирования и экстенсивного исследования 1аЬ, позволяет предположить, что оба упомянутые генные продукты могут быть важны для фенотипа клеток аденокарцином и что, по крайней мере, клетки А549 продуцируют оба функциональные НААН и ЬаЬ. Следствием успешной трансфекции А549 антисмысловыми для 1аЬ молекулами явилось явно выраженное снижение экспресии 1аЬ и скорости роста упомянутых клеток. Следствием экспрессии смысловой 1аЬ генно-инженерной конструкции в клетках ΝΙΗ-3Τ3 (нормальные мышиные фибробласты) явилось явно выраженное изменение фенотипа в фенотип, соответствующий фенотипу клеток аденокарциномы. Таким образом, 1аЬ экспрессия связана с превращением нормальных клеток в раковые клетки. ЬаЬ и НААН имеют общие потенциальные области связывания кальция.

Конструирование и клонирование библиотеки фрагментов кДНК:

Библиотека лямбда д!11 фага кДНК была сконструирована с помощью мРНК, которая была выделена из активно растущих клеток А549 (Сембрук (8ашЬгоок) и другие, 1990). Эту олиго(бТ)-примированную кДНК клонировали на участок Есо ΚΙ с помощью Есо ΒΙ линкеров. Упомянутая библиотека на приблизительно 83% состояла из прозрачных (включающих инсерционный сегмент) пятен гемолиза с титром 1,2х10¹⁰/мл, представляя как минимум 1,46х10⁶ независимых пятен гемолиза, которые, благодаря полимеразно-цепьевой реакции, имеют инсерционные сегменты, размер которых колеблется в пределах от 0,6 тысяч до 5 тысяч пар оснований. Поскольку ЬаЬ представляет собой интегральный белок (белок, внедренный в цитоплазматическую мембрану) массой 40 кДа, теоретическая полномерная мРНК, кодирующая этот белок, включающая потенциальную лидерную последовательность, должна по оценкам состоять приблизительно из 1,1 тысячи пар оснований. Эту библиотеку подвергали иммуноскринингу с помощью упомянутого антитела МСА 44-3А6. Было выделено восемь независимо полученных фаговых изолятов (идентичные фаги из одного и того же пятна гемолиза). Все они относились к числу бляшек, очищеных повторными циклами иммуноскрининга/выделения. После Есо Ш гидролиза восьми упомянутых изолятов были получены инсерционные сегменты длиной приблизительно 2 тысячи пар оснований. Был выделен самый крупный инсерционный сегмент (2А1А1), упомянутый Есо ΒΙ фрагмент клонировали в упомянутой ρΟΕΜ-3Ζ плазмиде.

Секвенирование и анализ методом секвенирования. Было установлено, что упомянутый фрагмент ДНК, обозначенный как 2А1А1, имеет инсерционный сегмент длиной 2442 пары оснований (фиг. 1), включающий 5' нетранслированный участок, участок связывания рибосом и инициирующий кодон, который, предположительно, мог бы кодировать белок, состоящий из 255 аминокислот (фиг. 2). Упомянутый 3' нетранслированный участок примечателен тем, что он включает лишь четыре нестабильные последовательности: АТТТА (Кса (Хи) и другие, 1997). Наряду с этим имеются последовательности, находящиеся в самой 3'-концевой области мРНК, которые вызывают аденилирование мРНК (Сембрук (8ашЬгоок) и другие, 1990). Упомянутая 1аЬ последовательность включает как субоптимальный (АТТААА), так и оптимальный (ААТААА) участок полиаденилирования. Это последовательности, находящиеся в самой 3'-концевой области мРНК, которые вызывают аденилирование мРНК. Упомянутые результаты исследований на молекулярном уровне подтверждают данные цитологических и биохимических исследований, которые приводились ранее. (Упомянутый НААН клон имеет ро1у А сигнал, однако упомянутый 3' участок в полном объеме секвенированию не подвергался).

В упомянутой ЬаЬ аминокислотной последовательности (фиг. 2) наблюдается сочетание, напоминающее участок связывания кальция, однако оно находится за пределами известного необходимого структурного контекста, чтобы быть участком связывания. В этом случае, упомянутая последовательность связывания кальция присутствует, однако она не включена в контекст белковой последовательности, которая, как известно, заставляет ее выполнять роль участка связывания. Была отмечена гомология с 1аЬ и Ε8Τ клоном (обозначенная № 05501), которая представляла лишь часть упомянутого 3' нетранслированного участка и независимо подтвердила эту часть упомянутой последовательности. В случае НААН наблюдалась также некоторая гомология внутренних фрагментов, однако упомянутый 5' нетранслированный и часть упомянутого 5' транслированного участка различны (58 аминокислот); кроме того, основная часть упомянутого 3' кодирующего участка у 1аЬ отсутствует (фиг. 3).

Клонирование и анализ геномной ДНК: Используя ПЦР фрагмент, представляющий участок кодирования белка 1аЬ в качестве зонда, скринировали геномную лямбда ΡΙΧ II библиотеку, полученную из линии клеток ^У1-38 легочных фибробластов человека. Десять первичных бляшек было выделено из приблизительно 1х10⁶ бляшек, которые подвергались скринингу. Используя семь из них в качестве ДНК-мишени, были установлены условия полимеразноцепьевой реакции с праймерами для упомянутого участка кодирования белка, продуцирующего фрагмент длиной 765 пар оснований, т.е. предполагаемый участок кодирования белка для 1аЬ. При анализе 1аЬ методом назерн-блоттинга (метод, использованный для качественной оценки мРНК), обнаруживалась лишь одна ошибка на 2,7 тысячи пар оснований. Рекомбинантный белок, полученный из упомянутого 1аЬ клона, при проверке методом вестерн-блоттинга (метод, использованный для качественного определения белков) с использованием МСА 44-3А6, имел такую же относительную подвижность, что и ЬаЬ белок, полученный из клеток А549.

ЬаЬ и НААН гены дали различные результаты в закодированных ими белках. НААН постоянно давал две полосы при анализе методом назерн-блоттинга (2,6 и 4,3 тысячи пар оснований), что позволяет предположить, что упомянутая полоса из 2,6 тысячи пар оснований обусловлена альтернативным сплайсингом, т. е. клетка делится с разрывом спирали мРНК. Кроме того, если 1аЬ и НААН являются одним и тем же геном, НААН должен обнаруживаться во всех тканях и линиях раковых клеток, в которых обнаруживается ЬаЬ. Однако при анализе методом назерн-блоттинга ЬаЬ не обнаруживается в линиях клеток ЕМТ6 либо ОЬ-ЭВ; у этих клеток также отсутствует иммунореактивность. Это свидетельствует о том, что ЬаЬ мРНК не образуется и что ЬаЬ белок в этих клетках не продуцируется. ЬаЬ белок редко экспрессируется в нормальных клетках, где, как сообщалось, как НААН мРНК, так и НААН белок экспрессируются почти в каждой исследованной ткани.

Анализ мРНК. Посредством анализа фрагмента ДНК линии клеток А549 методом назернблоттинга с использованием 1аЬ кДНК в качестве зонда была идентифицирована одна полоса в приблизительно 2,7 тысячи пар оснований. Подобное ожидалось, исходя из наличия кДНК (2442 пары оснований) и ро1у-А хвоста из приблизительно 300 пар оснований. Результаты анализа линии клеток мышей, ЕМТ6, и линии клеток крупноклеточной карциномы человека, ОЬ-ЭВ. методом назерн-блоттинга подтвердили, что упомянутыми клетками транскрипт для 1аЬ не продуцировался. Это соответствует результатам иммуноанализов, отрицательных по 1аЬ экспрессии на этих клетках.

Антисмысловая и смысловая экспрессия кДНК. Упомянутая плазмида (рВК-СМУ) (Сембрук (8ашЬгоок) и другие, 1990) может нести в клетки А549 и ΝΙΗ 3Т3 смысловую либо антисмысловую молекулу 1аЬ с полномерной кДНК. Антисмысловая молекула может быть, например, комплементарной последовательностью смысловой молекуле, которая гибридизуется с упомянутой смысловой молекулой, предотвращая ее экспрессию. В случае применения МТТ анализа (МТТ=3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5 дифенилтетразолия бромид)) (Сиддик (8|66к|ие) и другие, 1992) для оценки скорости роста клеток А549, экспрессирующих антисмысловую молекулу относительно 1аЬ, было отмечено явно выраженное снижение скорости роста. Клетки А549, трансфецированные антисмысловой молекулой, выглядели имеющими большую степень контактного торможения. В упомянутых клетках, трансфецированных антисмысловой молекулой, снижается обнаружимое количество ЬаЬ. Клетки ΝΙΗ-3Τ3, имеющие фибробластоподобную морфологию (крупные, тонкие веретенообразные), при осуществлении смысловой экспрессии превращаются в крупные клетки, напоминающие аденокарциноматозные клетки (очень круглые, полные).

Хромосомная локализация: Хромосомная локализация 1аЬ, используя полномерную кДНК в качестве зонда при гибридизации ίη κίίι.ι (Сембрук (8атЬгоок) и другие, 1990), предположительно приходится на хромосому 2с.| 12-14, с некоторой возможной долей реактивности на хромосомы 4 и 8. В случае использования того же самого зонда (полномерная кДНК последовательность 1аЬ) и РАС8-отсортированных хромосом (Лебо (ЬеЬо) и другие, 1985), окрашивание отмечалось также на хромосоме 2 со слабым окрашиванием на 4 хромосоме и отсутствием окрашивания на 8 хромосоме. Использование геномных клонов будет иметь особое значение при разрешении этих данных, поскольку могут использоваться более строгие условия гибридизации, нежели допустимые для кДНК, следствием чего будет ослабление фоновых сигналов. Это является еще одним доказательство того, что был клонирован верный ген и что полученные результаты не являются артефактом. В геномной ДНК опухолей могут происходить мутации и для настоящего изобретения ДНК была клонирована из опухолевых клеток (А549). Следовательно, мог быть клонирован мутировавший ген. В данном случае подобное исключено, поскольку геномная ДНК нормальной клетки (ДНК) продуцировала ту же самую последовательность, что и клонированная в соответствии с приведенным описанием. Таким образом, из клеток А549 был клонирован нормальный ген. Слабые сигналы на хромосомах 4 и 8 соответствуют псевдогену либо родственному гену. Например, сообщалось о присутствии НААН на хромосоме 8ц 12 при гибридизации ίη δίΐιι. так что упомянутый результат на хромосоме 8 может отражать гомологию последовательности НААН и 1аЬ.

Определение характеристик белковой молекулы ЬаЬугтШт. Результаты предшествующих исследований с проведением анализа методом вестерн-блоттинга (качественный анализ для оценки антигенов) показали, что ЬаЬ антиген представляет собой белок массой 40 кДа (по относительной подвижности), обнаруживаемый на клетках А549 (Радосевич (Ка6о5е\зе11) и дру гие, 1985). Эпитоп, по всей видимости, не модулируется и не блокируется лектинами, и избирательно экспрессируется на поверхности клетки с основным местонахождением в цитоплазматической мембране (Радосевич (Ка6о5е\зс11) и другие, 1985, 1991). ЬаЬ чувствителен к протеазам, но не к реакциям, вызывающим изменение липидов либо углеводородов (Радосевич (Кабо5е\зе11) и другие, 1985). Биохимические свойства ЬаЬ соответствуют тому, что ЬаЬ представляет собой интегральный белок цитоплазматической мембраны.

Наличие выведенной аминокислотной последовательности упомянутого 1аЬ гена, соответствующего настоящему изобретению, обеспечивает дополнительное определение характеристик упомянутого ЬаЬ белка. Экстенсивный компьютерный анализ ЬаЬ позволил идентифицировать эукариотическую последовательность, подобную лидерной последовательности и теоретический сайт расщепления, 3 сайта миристилирующей последовательности, участок слабого мембраносвязывающего фрагмента (МАО I) и участок сильного мембраносвязывающего фрагмента (МАО II) (фиг. 2). [(В упомянутой последовательности НААН имеется 58 (теоретических) аминокислот, за которыми следует участок, гомологичный последовательности кодирования белка ЬаЬ и 445 аминокислот, дополняющих упомянутую 1аЬ последовательность в направлении 3')].

Когда ЬаЬ экспрессируется как слитый белок в бактериально-глутатионтрансаминазной системе экспрессии слияния (рСЕМЕХ-2Т) (компания АтегсНаш Ркагтааа Вю1ес11. 1пс., Р18са!атау, штат Нью Джерси, 08854, США), и подвергается анализу методом вестернблоттинга с использованием упомянутого антитела МСА 44-3А6, полученные в результате этого блоты демонстрируют, что экспрессированный расщепленный слитый белок имеет такую же относительную подвижность, что и белок, обнаруженный на клетках А549. Установленная молекулярная масса ЬаЬ составляет 28,8 кДа, а при проведении вестерн-блоттинга он имеет относительную подвижность, идентичную подвижности формы, экспрессированной клетками А549 (средняя относительная подвижность=40 кДа). 55 остатков глутаминовой и 27 остатков аспарагиновой кислоты (в общем, 82 остатка) почти равномерно распределены в объеме белка (в общем, 255 аминокислот; 228 без лидерной последовательности), за исключением лидерной последовательности и участка самого сильного мембраносвязывающего фрагмента (МАО II). Эти данные позволяют предположить, что ЬаЬ совершает аномальное перемещение при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. В клетках других линий, кроме А549 (например, в клетках аденокарцином ОИ-145, Американская коллекция типовых культур, № НТВ-81; ΖΚ-75-1, Аме риканская коллекция типовых культур, № СКЬ1504 и т.д.) обнаруживают антиген, имеющий такую же молекулярную массу, как и ЬаЬ. При зондировании вестерн-блотов на наличие ЬаЬ не обнаруживаются ни разновидности с молекулярной массой 85-90 кДа, ни разновидности с молекулярной массой 52 и 56 кДа.

Картирование эпитопа с помощью антитела МСА 44-3А6 и пригодность ЬаЬ для получения вакцин. С помощью полимеразно-цепьевой реакции и системы глутатионтрансаминазыслитого белка были получены субклоны упомянутого участка кодирования белка и произведено картирование эпитопов посредством связывания МСА 44-3А6 с шестью аминокислотами (РТСЕРО). представляющими аминокислоты №№ 117-122 ЬаЬ (Р пептида). Для определения упомянутого эпитопа весь участок кодирования был подразделен на зоны. Для амплификации каждой зоны были разработаны праймеры полимеразно-цепьевой реакции. Продукты полимеразно-цепьевой реакции при последующей экспрессии были клонированы и подвергнуты анализу методом вестерн-блоттинга с использованием антитела МСА 44-3 А6.

В последующем фрагмент ДНК, представляющий собой положительный результат вестерн-блоттинга, был подвергнут дополнительному подразделению. Полученные продукты полимеразно-цепьевой реакции были клонированы, экспрессированы и подвергнуты испытанию посредством вестерн-блоттинга. Подобным образом были получены генно-инженерные конструкции как 5'-концевой, так и 3'-концевой области. При каждом цикле количество аминокислот сокращалось. Вследствие этого, последний цикл отличался от предшествующего одной аминокислотой (в обоих направлениях), благодаря чему можно было установить точный участок связывания МСА 44-3А6. Это показывает, что, по крайней мере, шесть упомянутых аминокислот находятся на наружной поверхности клетки. Для дополнительного подтверждения сказанного клонировали ДНК, кодирующую лишь упомянутые шесть аминокислот, и полученный слитый белок оказался положительным по результатам анализа методом вестернблоттинга. Синтезированный Р пептид может непосредственно обнаруживаться МСА 44-3А6 и упомянутый синтетический пептид оказался иммуногенным у 5 из 5 проверенных мышей. Результаты автоматизированного компьютерного анализа/моделирования (программы ССС, компания Сепебск Стук1а1 Сгоир, Медисон, штат Висконсин 53703) также указывали на то, что этот эпитоп окажется весьма иммуногенным.

Получение вакцин. Вакцина представляет собой антигенный препарат, следствием введения которого хозяину является продуцирование последним антител против упомянутого антигена(ов). Реакция хозяина обеспечивает иммунитет последнего к заболеванию, против которого и была направлена упомянутая вакцина. Таким образом, вакцинирование профилактирует клиническое проявление болезни, причем хозяин не подвергается воздействию возбудителей упомянутой болезни. ЬаЬ обладает всеми свойствами предпочтительной противораковой вакцины. Упомянутый 1аЬ ген часто экспрессируется опухолями, которые выглядят подобно аденокарциномам, экспрессируется на наружной поверхности клеток, экспрессируется всеми клетками в пределах данной раковой опухоли, постоянно экспрессируется упомянутыми раковыми клетками и редко экспрессируется нормальными клетками. ЬаЬ белок (пептиды) может быть получен любым из целого ряда методов с использованием методики молекулярного клонирования, причем он может быть получен в больших количествах, что превращает его в практичный антиген для использования в качестве вакцины. После очистки упомянутого ЬаЬ белка до уровня пригодности для введения человеку, он вводится внутрикожно, подкожно либо иными путями с тем, чтобы заставить иммунную систему продуцировать антитела против этого белка (пептидов).

Использование молекулярного моделирования и автоматизированного компьютерного анализа (программы ССС, компания Сепебск Сгу51а1 Сгоир, Медисон, штат Висконсин 53703) позволяет идентифицировать небольшие участки молекул, по размеру несколько превосходящие эпитоп (от шести до семи аминокислот для белков), которые, как полагают, находятся на поверхности белковой молекулы. Наряду с этим может быть определена степень гидрофобности либо гидрофильности данной последовательности и уровень иммуногенности данной последовательности для животных (компания Сепебск Сгу51а1 Сгоир, Медисон, штат Висконсин 53703). После определения, какая из последовательностей удовлетворяет упомянутым критериям, пептиды синтезируют либо получают посредством ряда стандартных методов. В последующем один либо несколько из этих пептидов включается в состав вакцины и, как описывалось ранее, вводится хозяину в качестве вакцины.

Вакцина включает молекулу, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы последовательностей, кодируемых кДНК, фиг. 1, последовательностей фиг. 2, кодируемых кДНК, пептиды ΑΡΡΕΌΝΡνΕΌ (Последовательность № 6), ΕΕΟΟΕνΡΡΩΤ (Последовательность № 7), ^СΡΤСΕΡ^^Ε (Последовательность № 8) и ΕρΕΝΡΌδδΕΡν (Последовательность № 9) и любые их фрагменты либо комбинации.

Данная вакцина может вводиться хозяину один либо много раз. Для того, чтобы некоторые пациенты распознали данную вакцину, вместе с упомянутыми пептидами должен вводиться также адъювант. Адъюванты являются не специфическими иммунными стимуляторами, которые повышают иммунную готовность и помогают превращению хозяина из не имеющего обнаружимых сывороточных антител в имеющего сывороточные антитела с очень высоким титром. Именно упомянутый высокий уровень (титр) антител, который эффективно защищает упомянутого хозяина от болезни либо состояния, против которого направлены упомянутые антитела.

Функциональные исследования. Исследования, целью которых было выяснение клеточных функций ЬаЬ, являются продолжением исследований по локализации/определению характеристик (Сиддик (8|ббк|ие) и другие, 1992). Определяли изменение уровней ЬаЬ в ответ на воздействие различных концентраций внеклеточных катионов (Са, Мд⁺⁺, Си⁺⁺ и Ре ). Экспрессия ЬаЬ в клетках А549 модулировалась лишь Са⁺⁺. С помощью высокоспецифичного флуоресцентного Еига-2/ЛМ Са⁺⁺ метода определения концентрации Са⁺⁺ в цитозоле (компания Мо1еси1аг РгоЬек 1пс., Еидепе, штат Орегон) было показано, что (1) внутренняя концентрация Са выше в клетках А549, чем в клетках ри-ЭВ; и (2) что упомянутая линия клеток А549 реагирует на различные внешние уровни Са (Сиддик (8|ббк|ие) и другие, 1992). Поскольку рН может модулировать внутренние уровни свободного Са⁸⁸, следствием внешнего манипулирования рН можно добиться изменений уровней экспрессии ЬаЬ. Следствием внеклеточного изменения рН (в присутствии нормальных концентраций Са⁸⁸) явилось: (1) параллельное изменение внутриклеточного рН по результатам измерения с помощью 8ΝΑΚΡ-1 ЛМ/РЛС8 (компания Мо1еси1аг РгоЬек 1пс., Еидепе, штат Орегон 97402); (2) повышение уровней транскрипта для ЬаЬ (при сравнении с экспрессией СЛРЭН посредством назернблоттинга); и (3) повышение уровня ЬаЬ белка (по результатам анализа методом вестернблоттинга/методом гибридизации макромолекул путем диффузии через щелеобразные отверстия в матрице). Внутриклеточные изменения рН (вследствие внешних изменений) для клеток А549 идентичны сообщавшимся для нормальных клеток. Повышенная экспрессия 1аЬ также не являлась следствием гибели клеток (по результатам МТТ анализа) (Сиддик (8|ббк|ие) и другие, 1992). В дополнение к этому, инкубирование рекомбинантного ЬаЬ при различных рН растворов не изменяет иммунореактивности. Предварительные данные позволяют предположить, что в случае проведения упомянутых экспериментов на клетках А549, выращенных при пониженной концентрации Са⁸⁸, индуцированная экспрессия 1аЬ ослабляется.

Методы диагностирования раковых клеток в образце клеток. Биологические образцы, отбираемые у субъекта, используются для определения присутствия раковых клеток у данного субъекта. Примерами пригодных образцов являются пробы крови и биопсийный материал. Одним из способов диагностирования является введение в ДНК клеток образца меченого зонда, способного гибридизоваться с упомянутым 1аЬ геном либо его фрагментом при строго определенных условиях, например, 6 х цитрат

Ν;ι-Ν;·ιϋ; 0,05 х реагент для проведения анализа методом вестерн-блоттинга; 50% формамида; температура 42°С (Сембрук (8атЬгоок) и другие, 1990). Естественно, упомянутые условия гибридизации изменяются для достижения оптимальной чувствительности и специфичности в зависимости от природы биологического образца, типа рака, метода получения зонда и метода получения ткани.

Следующий этап после контактирования образца с зондом заключается в определении, гибридизуется ли упомянутый зонд с нуклеотидными последовательностями ДНК образца, на основании чего делается вывод о присутствии 1аЬ гена. Упомянутое присутствие является диагностическим признаком рака.

Сущность следующего диагностического метода заключается в получении моноклональных антител, в предпочтительном варианте, меченых, либо уже существующих антител, либо новых антител, направленных на упомянутые антигенные пептиды, которые являются аспектами настоящего изобретения, и контактировании образца с упомянутыми антителами для обнаружения ЬаЬ антигена. Упомянутые моноклональные антитела пригодны для разработки высокоспецифичных анализов для обнаружения ЬаЬ антигена и позволяют осуществлять упомянутые анализы во множестве различных форматов, следствием чего является их более широкое использование в науке и медицине.

Настоящее изобретение полезно тем, что оно описывает новый ген, который экспрессируется на поверхности опухолей и о котором ранее не сообщалось. Этот ген не является тканеспецифичным и, следовательно, обеспечит возможность обнаружения опухолей независимо от того, в каком органе они возникают. Подобным же образом, использование этого гена для получения вакцины против упомянутых опухолей будет иметь весьма широкий диапазон применений. В диагностических пробах также будет использована упомянутая возможность применения на различных тканях, вследствие чего обнаружение ЬаЬ/1аЬ превратится в универсальный маркер для раковых опухолей, в частности, для тех, которые упоминались ранее, а именно, аденокарцином.

Документы, упомянутые в описании

Л1Ьто, А.Р., ОгаГ, Ь.Н., Коп1ог. В.В.8., е! а1. ^NΑ-теά^аΐеά 1гаикГег оГ Ьитаи те1апота се11 кигГасе д1усорго!ет др130: ИепЕйсайоп оГ 1гапкГсс1ап1к Ьу егу1Ьгосу!е гокеШпд. Мо1. Се11. Вю1. 5:692-697, 1985.

Ваппег В.Е., 0ои1б У.Е., Вабοзеν^сй кА., еί а1. Арр11са11оп о£ топос1опа1 апбйобу 44-3А6 ш Не су1об1адпоз1з апб с1азз|ПсаРоп о£ ри1топагу сагстотаз. О1ад Су(ораШо1. 1:300-307, 1985.

Вготеп, Ό.Τ. апб Мооге, М. Мопос1опа1 апРйоб1ез адабчз! (тео 1штап 1ипд сагстота се11 йпк. Вг. 1. Сап. 46:794-801, 1980.

СотЬз, 8.0., Н|буедг Ό.Ε., Ма, Υ., еί а1. Р1еотогрЫс Сагстота о£ (1е Рапсгеаз: А гаге сазе героП о£ сотЬтеб 1из1о1одюа1 ГеаРиез о£ р1еотогр1бс абепосагстота апб д1ап( се11 (итог оГ 111е рапсгеаз. 01ад. СуЮрабюк 4:316-322, 1988а.

СотЬз, 8.0., Вабοзеν^сй, кА., Ма, Υ., е( а1. Ехргеззюп оГ 1Не Апбдешс Эе1егт1пап1 Весодшхеб Ьу Не Мопос1опа1 АпйЬобу 44-3А6 оп 8е1ес( Нитап Абепосагстотаз апб Ыогта1 Нитап Т1ззиез. Титог Вю1. 9:116-122, 1988Ь.

СотЬз, 8.0., Вабοзеν^сй, кА., апб 8.Т. Возеп. Су1о1од1са1 ехргеззюп оГ Не абепосагапота апбдеп тагкег т 1штап Ьобу Г1тбз. Титог Вю1. 9:116-122, 1988с.

Эиба. В.В., ЛидизГ ΟΖ.. КабозеуюН. ЬА. апб 8.Т. Возеп. Мопос1опа1 АпбЬобу 44-3А6 аз а Магкег Еог 01ГГегеп(1а11оп оГ Вгеаз( Сапсег. Титог Вю1. 12:254-260, 1992.

Еηдνа11, Е. апб Рег1тапп, Р. Епхуте Йпкеб иптипозогЬегИ аззау (ЕЫ8А): ОиапШаРуе аззау оГ 1д0. 1ттипосйет1зйу. 8:87-874, 1971.

0гопке, В.8., УапОизеп, У.к, 0агзку, У.М., 1асоЬз, кУ., 8агбапа, М.К., 81ет, А.М. апб Р.А. Епебтап. Азраг1у1 Ье(а 1убгоху1азе: 1п νίΡΌ 1убгоху1абоп о Г а зу пНе(1с рерПбе Ьазеб оп Не з1гис1иге о Г Не Гбз1 дготеШ Гас1ог-Нке ботат оГ 1итап 1ас1ог IX. РЫА8. 86:3609-3613, 1989.

0гопке, В.8., Уе1зс1, Ό.Ι, УапЭизеп, У.к, 0агзку, У.М., 8агбапа, М.К., 81ет, А.М., апб Р.А. Епебтап. Раг(1а1 рипПсаРоп апб скагасЮпхабоп о£ Ьоуте буег азраРу1 Ье(а 1убгоху1азе. I. Вю1. С1ет. 265:8558-8565, 1990.

На, 8., УапЭизеп, У.к, О1еЫ, В.Е., Ко11, Ы.Е., О1хоп, В.А.Е., ЕНз1оп, К.О., 81ет, А.М., апб Р.А. Епебтап. сЭХА с1оптд апб ехргеззюп о£ Ьоуте азраг(у1 (азрагадету1) Ье1а-1убгоху1азе.

I. Вю1. С1ет. 267:14322-14327, 1992.

На, 8., Мс01ппз, К., УапЭизеп, У.к, Вигке, Сб., Кио, А., 0б£Гт, Р.В., 8агбапа, М.К., ЕШз(оп К.О., 81егп А.М., апб Р.А. Епебтап. А Ги11у асбге са1а 1у (1с ботат о£ Ьохте азраПу 1 (азрагадВ пу1) Ье1а-11убгоху1азе ехргеззеб т ЕзскепсЫа сой: СбипасЮпхайоп апб е\абепсе £ог Не 1бепбйсабоп о£ ап асруе-збе гедюп т хеПейгаЮ а1рйаке1од1и1ага1е-берепбеп1 бюхудепазез. РЫА8 91:7227-7231,1994.

КобоШ, Е., 01ейегз, С., апб I. Егеу. С1ошпд апб сйа^асίе^^ζаί^οη о£ Не 1штап депе епсобтд азрабу1 Ье1а-1убгоху1азе. 0епе 150:395-399,1994.

Ьапб1з, 8.Н., Мипау, Т., Во1беп 8., апб Р.А. Утдо. Сапсег 81абзРсз, 1998, СА 44:6-9.

Еауа1зз1еге, Ь., На, 8., МзЫуата, М., бе 1а Моп(е 8., 8(геп, А.М., Уапбз, кВ., апб Р.А. Ебебтап. Оуегехргеззюп о£ 1штап азраПу 1 (аз рагадту1) Ье1а-1убгоху1азе т 1ера1осе11и1аг сагапота апб с1ю1апдюсагсб'юта. I. Сйп. ^езк 98:1313-1323, 1996.

ЬеЬо, В.У., То1ап, О.В., Вгисе, В.Э., С1епд, М.С. апб Кап, Υ.ν. 8ро( Ь1о( апа1уз1з о£ зобеб с1готозотез азз1дпз а ГгнсЮзе т(о1егапсе депе 1осиз (о с1готозоте 9. Су(отебу. 6:476483,1985.

Ьее, I., Вабοзеν^сй, кА., Возеп, 8.Т. е( а1. Iттиηοй^зίοсйет^зί^у о£ 1ипд сагстотаз изтд топос1опа1 апбЬобу 44-3А6. Сап. Вез. 45:58135817.1985.

Ьее, I., Вабοзеν^сй, кА., ^еДес, 0., е( а1. Мабдпап! МезоШейотаз: 1тргоуеб 01ГГегеп11а1 О|адпоз1з Егот Ьипд Абепосагстотаз Изтд Мопос1опа1 АпбЬоб1ез 44-3 А6 апб 624А12. Атег. I. РаШ. 123:497-507, 1986.

ЬМпдз(оп, Р.О., Уопд, Ο.Υ.Ο., Аб1иб, 8., Тао, Υ., Рабеνаη, М., Рагеп(е, В., Нап1оп, С., Сакез, М.к, Не1йпд, Е., В1йег, 0., Оейдеп, Н.Е. апб О1б, Ь.к бпргоуеб зигска1 т А1СС з(аде III те1апота раПеп1з 0М2 апбЬоб1ез: А гапбонбхеб 1г1а1 о£ аб)иуап1 уассбчаРоп \νί11ι 0М2 дапдйоз1бе. I. Сйп. Опсо1., 12:1036-1044, 1994.

Р1еЫ, М.В., 0ои1б, У.Е., Вабοзеν^сй, кА., е( а1. Iттиηοй^зίοсйет^са1 [беп(1Пса(1оп о£ Ехосбпе апб Ыеигоепбосбпе 8иЬзе(з о£ Ьагде Се11 Ьипд Сагстотаз. Ра1к Вез. апб Ргас. 183:675-682, 1988.

Вабοзеν^сй, кА., Ма, Υ., Ьее, I., е( а1. Мопос1опа1 апбйобу 44-3А6 аз а ргоЬе £ог а ηονе1 апбдеп Гоипб 1штап 1ипд сагстотаз д1апби1аг б1ГГегеп(1а(1оп. Сап. Вез 45:5805-5812, 1985.

Вабοзеν^сй, кА., Ьее, I., 0ои1б, У.Е., апб 8.Т. Возеп. Мопос1опа1 апббобу аззауз £ог 1ипд сапсег. бт: Ш хНго б1адпоз1з о£ 1штап (итогз изтд топос1опа1 апбЬоб1ез. Кирскк, ΗΖ. апб N. Возе (Ебз.) Магсе1 Эеккег, р101-119, 1988.

Вабοзеν^сй, кА., СотЬз, 8.0., апб 8.Т. Возеп. Iттиηοй^зίοсйет^са1 апа1уз1з о£ 1ипд сапсег б1ГГегеп(1а(1оп тагкегз. Ш: Ьипд Сапсег Э|ГГегепбаРоп. Ьипд Вю1оду т Неа1(1 апб б1зеазе. Ь'Епкапк С., Вета1, 8., апб Вауйп 8. (Ебз.). Магсе1 Цеккег, 1990а.

Вабοзеν^сй, кА., №дисЫ, М., Возеп 8.Т., Υ. 81птоза1о. Iттиηοсуίοсйет^са1 апа1уз1з о£ 1штап абепосагстотаз апб Ьгопс1бо1оакео1аг сагстотаз о£ Не 1ипд изтд Не топос1опа1 ап(1Ьобу 44-3А6. Титог Вю1оду. 11:181-188, 1990Ь.

Вабοзеν^сй, кА., СотЬз, 8.0., апб 8.Т. Возеп. Ехргеззюп о£ МСА 44-3А6 т 1штап Ге(а1 беνе1οртеηί. Титог Вю1оду 12:321-329, 1991.

^боземЫ, кА., 8|бб|цие, Е.8., Возеп, 8.Т. апб Уб. КаЬаР Се11 Сус1е апб ЕМ Еуа1иаРоп о£ Не Абепосагстота Аниден Весодшхеб Ьу Не Мопос1опа1 АпбЬобу 44-3 А6. Вг. I. Сап. 63:8687,1991.

Возеп, 8.Т., Ми1зЫпе, кЬ., СиШба, Е., апб АЬгатз, Р.0. Вю1оду о£ Ьипд Сапсег. Магсе1 Оеккег, Ыс. Υο^к. ΝΥ, Уо1. 37, 1988.

8атЬгоок, ί.. Ргбзсб, Ε.Ρ., апб Т. ΜαηίαΙίδ. Мо1еси1аг с1ошпд: а 1аЬога1огу тапиа1. 2пб Ε6, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬ. Ргезз., 1990.

8аз1гу, Ь., А1бпд-Меез, М., Низе, \У.Э.. 8НогЕ РМ., Нау, Β.Ν., 1апба, Κ.Ό., Вепкоу1з, 8.Р, апб Ьетег. С1ошпд оГ (Не 1ттцпо1од1са1 герег1о1ге ш ЕзсЬепсЫа соб Гог депегабоп оГ топос1опа1 са!а1убс апбЬоб1ез: Сопзбисбоп оГ а беауу сНат уапаЫе гедюп-зресбгс с^NΑ бЬгагу. ΡΝΑ8. 86:5728-5732, 1989.

81бб1С]ие, Р.8., !с|ЬаР Ζ., апб ΡΑ. Рабозеу1сН. СНапдез ш (Не ехргеззюп оГ (Не 1итог-аззос1а1еб Апбдеп гесодшхеб Ьу топос1опа1 апбЬобу 443А6 ш А549 се11з бие 1о са1сшт. Титог Вю1. 13:142-151, 1992.

81пки1е, 1., Возеп, 8.Т., апб РА. Вабозеуюб. МСА 44-3А6 ЭоихогиЫст (Аббату ст) 1ттипосоп)цда1ез: Сотрагабуе 1п Уб го Апб-Титог ЕГПсасу оГ ЭбРегеп! Сопщдабоп Ме(Нобз. Титог Вю1. 12:198-206, 1991.

8радпо1о, Э.У., ^бакег, Ό., Сагге11о, 8., е( а1. ТНе изе оГ топос1опа1 апбЬобу 44-3А6 ш се11 Ь1оскз т (Не б1адпоз1з оГ 1ипд сагстота, сагстотаз те(аз(абс 1о 1ипд апб р1еига, апб р1еига1 табдпап! тезо(НеНота. Ат. 1. Сбп. Ра(Н. 95:322329, 1991.

8(аНе1, В.А. (СНабтап). ТЫгб 1п1етабопа1 1А8ЬС ХУогкзНор оп Ьипд Титог апб Э|ГГегеп(1абоп Апбдепз. 1п1ег. 1. Сапсег 8ирр1 8:6-26, 1994.

^апд, О., УапЭизеп, XV.Р, Ребозкц С.Р, Оагзку, У.М., 81ет, А.М., апб Р.А. Рге1бтап. Воуте буег азраг(у1 Ье(а-Нубгоху1азе. 1. Вю1. СНет. 266:14004-14010, 1991.

Хи, Ν., СНеп, С-Υ. А., 8 Ну и, А-В. Моби1абоп оГ (Не Га1е оГ су(ор1азпйс тВNΑ Ьу Аи-псН е1етеп(з: Кеу зесщепсе Геа(игез сопбоШпд тВNΑ беабепу1абоп апб бесау. Мо1. Се11. Вю1оду. 17:4611-4621, 1997.

Claims (16)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Применение молекулы ДНК с нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 1, либо с последовательностью, имеющей, как минимум, приблизительно 70% гомологию с упомянутой нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 1, для диагностирования рака.
2. 2. Молекула кДНК с нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 1.
3. 3. Молекула кДНК с нуклеотидной последовательностью, имеющей приблизительно 70% гомологию с упомянутой нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 1.
4. 4. Фрагмент молекулы кДНК по п.2, где упомянутый фрагмент расположен между инициирующим кодоном (АТС) и терминирующим кодоном ТАА в упомянутой нуклеотидной последовательности и включает 765 пар оснований.
5. 5. Фрагмент кДНК, достаточный для кодирования эпитопа белка, обозначенного ЬаЬ и обнаруживаемого антителом МСА 44-3 А6.
6. 6. Аминокислотная последовательность, кодируемая кДНК по любому из пп.2, 3, 4 либо

   5.
7. 7. Способ диагностирования раковых клеток в образце клеток, включающий (a) введение упомянутого образца клеток в контакт с меченым зондом, способным гибридизоваться с упомянутой молекулой кДНК, имеющей нуклеотидную последовательность, представленную на фиг. 1, либо ее фрагментом, при строго определенных условиях;

   (b) определение того, прошла ли гибридизация упомянутого зонда с нуклеотидными последовательностями упомянутой пробы; и (c) принятие вывода о присутствии упомянутой последовательности в случае гибридизации упомянутого зонда, причем упомянутое присутствие является диагностическим признаком рака.
8. 8. Применение молекулы, имеющей ами- нокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей последовательности, кодируемые кДНК фиг. 1, последовательности, кодируемые кДНК фиг. 2, пептиды АРΡΕΌΝΡνΕΌ, ΗΕΟΟΕνΕΕΙΡΕ ЭСРРСЕРООЕ и Ε0ΕΝΡΟ88ΕΡΥ и любые их фрагменты либо комбинации, в вакцине.
9. 9. Молекула с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, включающей ΑΡΡΕ^NΡVΕ^, ЕЕООЕУРР1)'Е ЭСР'РСЕРООЕ и ΕΟΕΝΡΌ88ΕΡν.
10. 10. Молекула с аминокислотной последовательностью РТОБРО.
11. 11. Пептид, выбранный из группы, включающей все последовательности длиной от 5 аминокислот до 20 аминокислот, упорядоченно размещенные в соответствии с размещением аминокислот на фиг. 2, где положение первой аминокислоты упомянутой последовательности из п аминокислот выбирают из группы, включающей положение от 1 до п-5... п-20.
12. 12. Антитело, направленное на пептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из последовательности по пп.6, 8, 9, 10 либо 11, за исключением моноклонального антитела 44-3А6.
13. 13. Антитело по п.12, дополнительно определяемое как моноклональное антитело.
14. 14. Антитело, продуцируемое млекопитающими против аминокислотной последовательности, кодируемой молекулой ДНК по пп.2, 3, 4 либо 5, либо ее фрагмента, включающего эпитоп, за исключением моноклонального антитела 44-3А6.
15. 15. Способ ослабления результатов экспрессии молекулы кДНК по пп.2, 3, 4 либо 5, включающий (а) получение антисмысловой молекулы к молекуле кДНК либо продукту ее экспрессии и (Ь) гибридизацию упомянутой антисмысловой молекулы с упомянутой молекулой кДНК либо продуктом ее экспрессии.
16. 16. Способ по п.16, где длина упомянутой антисмысловой молекулы составляет, как минимум, 100 нуклеотидов.