JP2002512005A - ガンについてのマーカーである、ラビリンチンをコードする遺伝子 - Google Patents

ガンについてのマーカーである、ラビリンチンをコードする遺伝子

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Abstract

(57)【要約】 ラビリンチン（Ｌａｂ）と命名されるタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子を単離し、そしてそのヌクレオチド配列を決定する。このタンパク質、またはこのタンパク質に由来するペプチドは、新規なクラスのガンを規定するために有用なマーカーである。これらのガンについての診断アッセイは、Ｌａｂに対する抗体、またはｌａｂ遺伝子もしくはそれからのフラグメントとハイブリダイズするヌクレオチドプローブを用いる。Ｌａｂ（またはｌａｂ）についての試験がポジティブな被験体におけるガンの再発を予防するか、またはガンの初期発生を予防するかのいずれかに有用なワクチンは、Ｌａｂに由来するタンパク質またはペプチドを使用する。免疫原性アッセイを介するＬａｂの発現を用いて、ガン処置の効果をモニタリングする。ｌａｂに対するアンチセンス分子を、処置に用いる。ｌａｂのセンス分子を用いて、罹病正常細胞（例えば、腺細胞）において失われたｌａｂ機能を回復させる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、以前に規定された組織学的クラスのガンに制限されないマーカーと
して有用なエピトープ、ガン関連抗原を含む、タンパク質をコードする遺伝子お
よびそれからのペプチドに関する。抗原性ペプチドは、ガンの処置および予防の
ためのワクチンとして、ならびに新規な特異的モノクローナル抗体の調製のため
に有用である。アンチセンス分子は、薬学的組成物において有用であり、そして
診断および処置のために有用である。
【０００２】 （発明の背景） ガン1は、世界中の男性および女性の死の主な原因である。米国だけで、毎年
１００万を超える新たな症例が診断され、そして５０万を超える死亡が毎年報告
されている（Ｌａｎｄｉｓら，１９９８）。歴史的に、腫瘍は、部分的には、腫
瘍が生じた組織に基づいて分類および処置されている（例えば、乳ガン、結腸ガ
ン、および肺ガンなど）。だが、例えば、肺ガンにおいて、これらの腫瘍が非常
に不均質な群の新生物であることが十分に認識されている。これはまた、他の組
織において生じた腫瘍についても事実である。部分的には、この不均質性のため
に、ヒトの腫瘍について用いられる、複雑かつ矛盾した分類スキームが存在する
。ガンを処置するための以前の試みは、以下によって妨げられている：１）所定
の組織において生じる腫瘍の任意の分類、および２）これらの腫瘍がどのように
見えるか（組織学的分類）に基づく顕微鏡法を用いること。種々の腫瘍型につい
ての既存の分類は、いくらかの予後的価値を有するが、ほぼ全ての分類は、処置
に対する応答性および治癒の可能性または疾患の経過について予測することがで
きない。これらの新生物の生物学的構成に基づく改善された分類スキームは、ガ
ンを有するヒトの生存の統計学を有意に変更することが必要とされる。これらの
問題を解決するための１つのアプローチは、腫瘍に特異的な分子、特にガン細胞
のマーカーである分子における抗原を位置決めすることである。（「マーカー」
は、本明細書中で、ガンを正常組織および他の疾患状態から区別するために用い
られ得る、任意の特性と定義される）。次いで、マーカーの存在は、分類の基礎
である。
【０００３】 （注）1 本明細書中で用いられる用語は以下の通りである：「ガン」は、悪
性の腫瘍であり、ここで「腫瘍」は異常な塊の組織であり、悪性である必要はな
い。「新生物」は、新規の増殖形態である。
【０００４】 通常マウスにおいて、体細胞ハイブリダイゼーション技術によって調製される
モノクローナル抗体（ＭＣＡ）は、細胞抗原の検出および区別のための有用な分
子プローブであり、それゆえ、ガン関連抗原を検出するための大きな可能性を有
する。これらの抗体は、特異的抗原に結合し、そしてこの結合は、周知の方法に
よって検出可能である。結合が生じる場合、特異的抗原が存在すると推論される
。細胞表面に曝露されるか、またはガン塊に見出される、ガン関連抗原は、宿主
の免疫系（宿主の抗体を含む）についての分子標的である。近年の知見は、腫瘍
に対する抗体を有するガン患者が、この型の免疫応答を備えないガン患者よりも
良好であることを示唆する（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら，１９９４）。それゆえ、
天然の、誘導された、または投与された抗体は、有望な治療アプローチである。
【０００５】 非ヒトＭＣＡのヒト化（非ヒトＭＣＡ反応性部位が、クローニングされたヒト
抗体中にシャトルされ、そして発現されるプロセス）は、インビボおよびエキソ
ビボでの適用においてそれらの特異的結合の損失を伴わずに、外来抗体の減少し
た免疫原性をもたらす。ＭＣＡは、インビボ画像化剤、診断試験として、および
治療のために用いられ得る（Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈら １９８８，１９９６；Ｒ
ｅｓｅｎら １９８８）。
【０００６】 ワクチン治療は、疾患または状態の原因因子に曝露することなく、免疫応答を
誘導することが指向された十分に確立されたアプローチである。例えば、細菌因
子およびウイルス因子に対する宿主における応答を刺激する多くのワクチンが利
用可能である。ワクチンにおける腫瘍関連抗原（マーカー）の使用は、原発性ガ
ンの発生を予防し得、そしてまたこの疾患の再発を予防する手段を提供し得る。
【０００７】 遺伝子治療は、細胞の遺伝的構成を目的の遺伝子を発現するように改変する手
段である。以下を含む多くの形態の遺伝子治療が存在する：遺伝子の置換、アン
チセンス抑制治療、および代理遺伝子発現。ガン関連抗原、好ましくはガン特異
的抗原（マーカー）をコードする遺伝子の発見により、ガン細胞増殖に対する遺
伝的介入に門戸を開く。正常組織からガン性組織を区別するためのガンマーカー
の正確かつ一貫した使用は、診断的可能性を有するだけでなく、そしてまた処置
および予後診断のために望ましい。それゆえ、このようなマーカーが求められて
いる。
【０００８】 近年の研究は、ヒトアスパルチルβ−ヒドロキシラーゼ（ＨＡＡＨ）をコード
する酵素が、いくつかのヒト腺ガン細胞株および原発性肝細胞ガンにおいて過剰
発現され、それゆえ、マーカーであり得ることを示した。ＨＡＡＨをコードする
といわれる遺伝子がクローニングされ、そして配列決定された（Ｇｒｏｎｋｅら
，１９８９，１９９０；Ｗａｎｇら，１９９１；Ｊｉａら，１９９２，１９９４
；Ｋｏｒｉｏｔｈら，１９９４；Ｌａｖａｉｓｓｉｅｒｅら，１９９６）。しか
し、一般に、ヒト腫瘍におけるＨＡＡＨ発現についてはほとんど知られていない
（Ｌａｖａｉｓｓｉｅｒｅら，１９９６）。
【０００９】 ＨＡＡＨ酵素の研究は、そのウシの対応物についての研究に起因した（Ｇｒｏ
ｎｋｅら，１９８９，１９９０；Ｗａｎｇら，１９９１；Ｊｉａら，１９９２）
。ウシアスパルチルβヒドロキシラーゼは、細胞内のグリコシル化されたタンパ
ク質であり、粗面小胞体中に位置する。このタンパク質は、以下の３つの主要な
分子種を有することが報告されている：８５キロダルトン形態、およびそれぞれ
５６キロダルトンおよび５２キロダルトンの分子量を有する２つの活性な形態（
Ｌａｖａｉｓｓｉｅｒｅら，１９９６）。
【００１０】 標準的な生化学的方法を用いて、ウシアスパルチルβ−ヒドロキシラーゼ（ｂ
ＡＡＨ）が精製および特徴付けされた（Ｇｒｏｎｋｅら，１９９０；Ｗａｎｇら
，１９９１）。この酵素の活性は、精製された５２キロダルトンおよび５６キロ
ダルトンの種に相関することが示されている。免疫学的に、関連する、より高分
子量の形態（８５〜９０キロダルトン）もまた観察された。精製の一部として、
ｂＡＡＨは、ＣｏｎＡセファロースに結合され、これは、この酵素がグリコシル
化されるという結論と一致している（そのＤＮＡ配列に関するその後の報告は、
３つの可能なグリコシル化部位を示し、１つの部位は、公知の活性な酵素ドメイ
ンに非常に近い）。このタンパク質は性質が非常に酸性であり、そして活性な画
分を可溶性にするために界面活性剤は必要とされない。この活性な酵素部位は、
生化学的に単離されたウシタンパク質（ｂＡＡＨ）由来の６７５位のヒスチジン
の存在に依存する（Ｊｉａら，１９９４）。
【００１１】 ＨＡＡＨについての部分的アミノ酸配列が得られた。このアミノ酸配列から推
定されたＤＮＡプローブ（ＤＮＡプローブは、特定の条件下で特定のヌクレオチ
ド配列に結合し得るヌクレオチド配列を有する分子である）を用いて、ウシｃＤ
ＡＮライブラリーをスクリーニングした（Ｊｉａら，１９９２）。（ｃＤＮＡラ
イブラリーは、ゲノムＤＮＡとは対照的に、遺伝子産物（例えば、ペプチド）を
コードするＤＮＡの切片を含む）。ライブラリーにおけるいくつかの重複するｃ
ＤＮＡ配列は、８５キロダルトンのタンパク質をコードすると期待される、７６
４アミノ酸のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列を含んでいた。こ
のＯＲＦ配列にはまた、２つの他の可能な開始コドン、すなわち、コードが始ま
る位置が存在していた。最も３’側の開始コドンは、リボソーム結合部位の後に
存在していた。この配列を有するクローンの翻訳は、約８５キロダルトンである
タンパク質を生じた。抗血清を、ヒトＭＧ−６３細胞（ｃａｌｌ）の膜画分に対
して惹起し、そしてこの抗血清を用いて、ＭＧ−６３細胞から作製したｃＤＮＡ
ライブラリーを免疫スクリーニングした。７５７アミノ酸のタンパク質をコード
し得る１つのクローンについてデータが報告され、そして配列分析によって、ｂ
ＡＡＨとの強力なＮ末端相同性を有することが見出された（Ｋｏｒｉｏｔｈら，
１９９４）。このクローンを、インビトロ翻訳系（ｍＲＮＡをタンパク質へと変
換するために用いられる正常細胞の細胞質の人工的カクテル）において用いた場
合、５６キロダルトンのタンパク質が生成された。これは、翻訳後切断に起因す
ることが示唆された。
【００１２】 ＨＡＡＨ酵素は、タンパク質の上皮増殖因子様ドメイン内の特異的アスパラギ
ン酸残基の改変を担う。これらの改変されたアスパラギン酸残基が、上皮増殖因
子様ドメインがカルシウム結合ドメインになることを可能にすると仮定された（
Ｇｒｏｎｋｅら，１９８９，１９９０；Ｗａｎｇら，１９９１；Ｊｉａら，１９
９２，１９９４；Ｋｏｒｉｏｔｈら，１９９４；Ｌａｖａｉｓｓｉｅｒｅら，１
９９６）。
【００１３】 ＨＡＡＨに関連する酵素であるアスパルチルβヒドロキシラーゼ（ＡＡＨ）は
、最初に研究された。なぜなら、これは、ビタミンＫ依存性凝固因子である第Ｖ
ＩＩ因子、第ＩＸ因子、および第Ｘ因子を含む、生物学的に重要なタンパク質の
群において、選り抜きのアスパラギン酸残基またはアスパラギン残基を特異的に
改変したからである。Ｃ、Ｓ、およびＺのような他のタンパク質もまたこの改変
を有する（Ｇｒｏｎｋｅら，１９８９，１９９０；Ｗａｎｇら，１９９１；Ｊｉ
ａら，１９９２，１９９４；Ｋｏｒｉｏｔｈら，１９９４；Ｌａｖａｉｓｓｉｅ
ｒｅら，１９９６）。アスパラギン酸残基およびアスパラギン残基は、上皮増殖
因子様ドメインを含むタンパク質において、ＨＡＡＨによって改変されることが
示されている。βヒドロキシアスパラギン酸残基およびβヒドロキシアスパラギ
ン残基の機能は未知であるが、しかし、この改変が、選択されたタンパク質の上
皮増殖因子ＥＧＦ様ドメインにおけるカルシウム結合のために必要とされること
が推定されている。
【００１４】 抗体は、ヒト肝細胞ガンＦＯＣＵＳ細胞に対して惹起された（Ｌａｖａｉｓｓ
ｉｅｒｅら，１９９０）。１つのＭＣＡは、肝細胞ガンにおいて高度に発現され
た抗原と反応した（Ｌａｖａｉｓｓｉｅｒｅら，１９９６）。この抗体およびλ
ｇｔ１１ ＨｅｐＧ２ライブラリーを用いる免疫スクリーニングは、部分的ｃＤ
ＮＡの単離をもたらし、このｃＤＮＡは続いて、より大きなクローンを単離する
ために用いられた。
【００１５】 Ａ５４９と命名されたヒト腺ガン細胞株は、非常に高レベルのＨＡＡＨ活性を
有すると報告された（Ｌａｖａｉｓｓｉｅｒｅら，１９９６）。ＭＣＡ４４−３
Ａ６と命名されたマウスモノクローナル抗体（米国特許第４，８１６，４０２号
）が、ヒト腺ガン細胞株Ａ５４９（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ １８５）に対して
産生された（Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈら，１９８５）。この抗体は、見積もられた
見かけの分子量４０ｋＤａを有する細胞表面の非グリコシル化抗原性タンパク質
を認識した。
【００１６】 この抗原は、Ａ５４９細胞によって発現され、そして良好な腺ガンマーカーで
あることが見出された；すなわち、この抗原は、組織学的に調べた場合に腺ガン
であるように見えたガンによってしばしば発現される（Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈら
，１９９０ａ；Ｌｅｅら，１９８５）。ＭＣＡ ４４−３Ａ６は、この結合特異
性を有する最初のモノクローナル抗体であるという点で独特である。肺ガンに関
する国際ワークショップからの結果により、ＭＣＡ ４４−３Ａ６についての他
の関連する公開された知見が確認された（Ｓｔａｈｅｌ，１９９４）。
【００１７】 ＭＣＡ ４４−３Ａ６と命名された抗体は、臨床的有用性を有する。なぜなら
、これは、腺ガンに関連する抗原を区別するからである。正常組織および胎児組
織におけるこの抗原の分布は、いくつかの腺組織に制限されている（Ｒａｄｏｓ
ｅｖｉｃｈら，１９９１）。ホルマリン固定したパラフィン包埋組織上で検出が
生じ得る（Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈら，１９８５，１９８８，１９９０ａ，１９９
０ｂ；Ｌｅｅら，１９８５，１９８６；Ｐｉｅｈｌら，１９８８；Ｃｏｍｂｓら
，１９８８ｂ，１９８８ｃ；Ｂａｎｎｅｒら，１９８５）。この抗体は、ヒトの
肺腫瘍において制限された結合パターンを有する（Ｌｅｅら，１９８５；Ｂａｎ
ｎｅｒら，１９８５；Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈら，１９９０ａ，１９９０ｂ）。
【００１８】 ２００を超える肺ガンについての研究では、ＭＣＡ ４４−３Ａ６は、試験し
た腺ガンの全て、多くの大細胞ガン、ならびに中間神経内分泌小細胞肺ガンのサ
ブセット、十分に分化した神経内分泌小細胞ガン、カルチノイドと反応するが、
中皮腫とは反応しないことが見出された。ＭＣＡ４４−３Ａ６は、扁平上皮細胞
ガンとも、細気管支ガンとも、小細胞ガンとも反応しない（Ｌｅｅら，１９８５
）。ＭＣＡ ４４−３Ａ６は、中皮腫から胸膜に転移する腺ガンを区別する際に
有用である（Ｌｅｅら，１９８６）。この抗体は、腺ガンの間で、および大細胞
ガンにおいて選択された反応性を有する（Ｐｉｅｈｌら，１９８８；Ｒａｄｏｓ
ｅｖｉｃｈら，１９９０ｂ）。
【００１９】 細胞学的知見と組織学的知見とを比較する、４０症例を超える肺ガンの研究で
は、ＭＣＡ ４４−３Ａ６は、細胞学的診断において有用であることが見出され
、そして組織学的知見と一致した（Ｂａｎｎｅｒら，１９８５）。組織学は、組
織（これは、細胞から構成される）の研究である。細胞学は、組織化された状況
（これは通常、組織と呼ばれる）から取り出された細胞の研究である。組織から
取り出された細胞は、その細胞が由来する組織において存在する細胞と必ずしも
同じに行動するとは限らない。幸いにも、組織中の腺ガン細胞において発現され
るＭＣＡ ４４−３Ａ６によって検出される抗原は、組織から取り出した腺ガン
細胞と同じように行動する。これは、診断的に非常に重要な特徴である。細胞学
的に調製された肺ガンの細胞ブロック、ならびに身体全体の他の部位からの体液
中におけるＡＣ提示を用いる類似の相関が実証された（Ｌｅｅら，１９８５；Ｓ
ｐａｇｎｏｌｏら，１９９１；Ｃｏｍｂｓら，１９８８ｃ）。また、ＭＣＡ ４
４−３Ａ６は、肺ガン以外の部位からの腺ガンに結合する。原発性病巣および転
移病巣におけるこの抗原の発現もまた報告された（Ｃｏｍｂｓら，１９８８ａ）
。ガンをヒト胸部組織における良性の病巣から区別する際のＭＣＡ抗体の利用も
また示された（Ｄｕｄａら，１９９１）。
【００２０】 ＭＣＡ ４４−３Ａ６によって検出される抗原の細胞の局在化が決定された。
生存細胞放射免疫アッセイ（生存細胞に対する抗体の結合を決定することに指向
された放射性抗体試験）、免疫蛍光、および生存細胞蛍光活性化セルソーター（
ＦＡＣＳ）分析を用いることにより、ＭＣＡ ４４−３Ａ６によって検出された
抗原が、この細胞の外側の表面上に存在することが示された（Ｒａｄｏｓｅｖｉ
ｃｈら，１９８５）。免疫金電子顕微鏡法およびＦＡＣＳ分析を用いるさらなる
研究は、この抗原が調節されず（抗体によって結合された場合にガン細胞によっ
て内部移行されない）、原形質膜の細胞外表面上で発現され、そして細胞周期特
異的でない（すなわち、この細胞は、細胞複製のプロセスを通じて常に、そして
また分裂していないときにタンパク質を作製する）ことを実証した（Ｒａｄｏｓ
ｅｖｉｃｈら，１９９１）。この抗原は、正常な患者の血清にも腫瘍を有する患
者の血清にも見出されず、そしてポジティブ細胞株によって培養培地中に流され
ない（すなわち、ガン細胞は、それらの細胞膜の一部を小疱形成（ｂｌｅｄ ｏ
ｆｆ）し、そして周囲の液体中にそれを放出することが公知である）（Ｒａｄｏ
ｓｅｖｉｃｈら，１９８５）。近年、２７人のうち３人のランダムに試験した腺
ガン患者は、この抗原に対する、天然に存在する抗体を有することが見出された
。さらに、放射標識されたＭＣＡ ４４−３Ａ６を用いて、ヌードマウス中で増
殖するＡ５４９腫瘍が位置決定された。ドキソルビシン（ｄｏｕｘｏｒｕｂｉｃ
ｉｎ）免疫結合体ＭＣＡ ４４−３Ａ６は、インビトロで選択的に毒性である（
Ｓｉｎｋｕｌｅら，１９９１）。
【００２１】 ＭＣＡ ４４−３Ａ６によって検出された抗原のヌクレオチド配列およびアミ
ノ酸配列の決定は、ガンの診断、処置、および予防におけるこの抗原の有用性を
増強する。
【００２２】 （発明の簡潔な要旨） 背景において記載された通りの抗体ＭＣＡ ４４−３Ａ６によって検出される
抗原は、現在「ラビリンチン（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｉｎ）」と命名されている。
ＭＣＡ ４４−３Ａ６によって検出される抗原をコードする独特なヌクレオチド
配列によって特徴付けられる遺伝子（ラビリンチンと命名される；ｌａｂと省略
される）を単離および特徴付けした（ｌａｂとの表示は核のＤＮＡ／ＲＮＡ形態
を示す；「Ｌａｂ」との表示は、ｌａｂ ＤＮＡ／ＲＮＡによってコードされる
タンパク質をいう）。
【００２３】 本明細書中に記載される発明は、抗体ＭＣＡ ４４−３Ａ６を、Ｌａｂをコー
ドする遺伝子をクローニングするための道具として用いた。さらに、ＭＣＡ ４
４−３Ａ６についてのエピトープ（この抗原において見出される抗体について必
要な結合部位）を、ＰＴＧＥＰＱ2であるクローンによって発現されるＬａｂタ
ンパク質において同定した。このエピトープは、重要な免疫優勢配列を表す；す
なわち、動物に注射した場合、この動物は、この配列に対する抗体を容易に産生
する。
【００２４】 本発明の１局面は、以下のためのセンス3発現態様におけるｌａｂ ＤＮＡの
使用である：１）ヌクレオチドプローブによるヒト腫瘍を標識するため；２）細
胞および組織におけるｌａｂのＤＮＡおよびｍＲＮＡ発現の検出のため；３）腺
様細胞型への細胞の形質転換のため；４）免疫のためのインビボでのＬａｂ抗原
の産生のため；５）抗体を生成するための免疫のためのＬａｂのエキソビボ発現
のため；ならびにインビトロでのＬａｂの産生のため。ラビリンチン発現（ガン
性）細胞の増殖を抑制するための、例えば、センス分子への逆方向でのｍＲＮＡ
鎖またはＤＮＡ鎖の産生によるアンチセンス分子の使用は、本発明の別の局面で
ある。
【００２５】 （注）2 アミノ酸についての標準的な略号。
【００２６】 3 センス鎖のＤＮＡからのｍＲＮＡ鎖を生成するための３’から５’
末端へ進行するＤＮＡ配列の正常な転写。このｍＲＮＡは、そのＤＮＡに相補的
である。
【００２７】 本発明の１つの局面は、Ｌａｂ抗原の少なくともエピトープをコードするヌク
レオチド配列、および宿主細胞における発現を可能にするための適切な調節配列
を有するＤＮＡ分子を含むベクターである。
【００２８】 本発明の別の局面は、ｌａｂ遺伝子のタンパク質コード領域から推定されるア
ミノ酸配列である。この配列の選択された領域は、天然に存在する産物（ガン細
胞由来）、化学的に生成される産物（合成的に生成されるペプチド）、およびク
ローン化されたｌａｂ遺伝子の発現産物の両方からの効果に対応する効果を生じ
ることが免疫学的方法を介して見出された。
【００２９】 本発明の別の局面は、Ｌａｂの推定アミノ酸配列全体、Ｌａｂ由来のペプチド
、もしくは化学的に生成された（合成）Ｌａｂペプチド、またはこれらの分子の
任意の組合せの、ヒトのガンを予防するためおよび／またはガンを有するヒトの
処置のためのワクチンの調製における使用のための使用である。本発明の目的の
ために、「ガンを有するヒト」は、それらの細胞において検出されたＬａｂ抗原
を有するヒトである。これらの調製物はまた、最初の発生の前に患者がこれらの
腫瘍を絶えず有することを予防するために用いられ得る。
【００３０】 Ｌａｂタンパク質に指向されるモノクローナル抗体、またはＬａｂタンパク質
の抗原性成分もしくは誘導体は、Ｌａｂの検出のため、および他の目的のために
有用である。Ｌａｂ抗原と反応する種以外の種において作製されるモノクローナ
ル抗体は、これらのモノクローナル抗体が、ラビリンチンペプチドとのそれらの
結合を保持するが、依然としてヒトにおいて免疫原性でないように、多数の分子
クローニング方法によって改変され得る（Ｓａｓｔｒｙら，１９８９；Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら，１９９０）。手短には、これは、クローニングしたヒト抗体遺伝子
の結合部位の配列を、目的の非ヒトモノクローナル抗体の結合部位の配列で置換
することによって行われる。これらの「ヒト化」ＭＣＡは、治療試薬および診断
試薬として、インビボ、エキソビボ、およびインビトロで使用される。
【００３１】 ガンについての診断アッセイにおけるＬａｂタンパク質またはそれに由来する
抗原性ペプチドの使用は、患者の血液または他の体液もしくは組織において有す
る抗体の存在および量について患者をモニタリングする方法である。この検出は
、以前に規定されたクラスのガンに限定されないが、Ｌａｂマーカー抗原を有す
るガン細胞について有用である。当業者に公知の技術［例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｅ
ｎｇｒａｌｌおよびＰｅｒｌｍａｎｎ，１９７１）］によって測定される場合の
セロコンバージョンの程度は、処置の効果をモニタリングするために用いられ得
る。
【００３２】 薬学的組成物におけるｌａｂに対するアンチセンス分子またはＬａｂに対する
抗体での処置は、患者のガン細胞中またはガン細胞上にＬａｂを有する患者を処
置するアプローチである。
【００３３】 （発明の詳細な説明） ラビリンチンの分子生物学：エピトープＭＣＡ ４４−３Ａ６が、タンパク質
配列によってコードされることを実証するために、細胞株Ａ５４９からの高分子
量ＤＮＡを単離した。このＤＮＡを、（カルシウムによって）プラスミド（ｐＳ
Ｖｎｅｏ）とともに共沈し、そしてこれを用いてＢ７８Ｈ１細胞と命名されるマ
ウス細胞株をトランスフェクトした（Ａｌｂｉｎｏら，１９８５）。このマウス
細胞株は、このエピトープの発現に関してネガティブであり、そして高い効率の
任意のヒトＤＮＡ配列の取り込みおよび発現を有することが報告された。所定の
Ｂ７８Ｈ１細胞がＤＮＡを取り込む状態にある場合、ヒトＤＮＡおよびプラスミ
ドＤＮＡの両方を取り込むことが期待される。プラスミドＤＮＡは、細胞をＧ４
１８（通常は毒性の薬物）に対して耐性にする。それゆえ、通常、Ｇ４１８増殖
インヒビターに感受性である細胞がＧ４１８において増殖する場合、この細胞は
、このプラスミドを取り込んでいる必要があり、そしてまた、１以上のＡ５４９
ＤＮＡ配列を取り込んでいるかもしれない。Ｇ４１８選択後（ｐＳＶｎｅｏプ
ラスミド上のＮｅｏ遺伝子の取り込み／発現によってＧ４１８における増殖に対
する耐性を有する細胞のみを選択し、それゆえ、同時に他のＤＮＡを取り込んだ
状態にある細胞を表す方法）、約１５の１×１０5クローンを、ＭＣＡ ４４−
３Ａ６での免疫選択を用いて検出した。この知見は、ヒトＡ５４９細胞が、Ｌａ
ｂをコードするＤＮＡを有し、そしてＬａｂの発現のために必要な調節配列を有
するという結論と一致する。
【００３４】 ＨＡＡＨとラビリンチンとの比較：ｌａｂのＤＮＡ配列が本発明の１局面とし
て決定されたので、ＨＡＡＨおよびｌａｂを比較し得る。ＨＡＡＨおよびｌａｂ
のヌクレオチド配列は、いくつかの内部フラグメント類似性を有するが、このフ
ラグメントのいずれの側でも異なり、そして異なる産物に関連する。この結論は
、部分的に、これらの２つの遺伝子について報告されたＤＮＡ配列の分析および
相同性に基づく。詳細には、ｌａｂ ５’領域は、ＨＡＡＨとは相同性を全く有
さない。ｌａｂのタンパク質コード領域は、ＨＡＡＨについて提案されたタンパ
ク質コード領域の内部セグメントとの約９９．６％の相同性を有する。３’領域
は、ＨＡＡＨの報告された配列とは相同性を全く有さない。ＨＡＡＨとラビリン
チンとを比較する実質的に全ての他のデータは、例えば以下のように異なる：１
）これらのタンパク質の分子量、２）細胞局在、３）染色体局在、４）正常組織
および腫瘍における組織学的提示、５）ノーザンブロット発現、６）免疫学的知
見。
【００３５】 ｌａｂのタンパク質コード領域は、ＨＡＡＨについて報告された配列の内部領
域と同一であるが、ＨＡＡＨの５’非翻訳領域は、異なり、そしてＨＡＡＨの５
'翻訳タンパク質コード領域部分は、ｌａｂクローンにおいて見出される５'翻訳
タンパク質コード領域から失われている。ＨＡＡＨクローンおよびｌａｂクロー
ンの両方から、推定タンパク質が、その性質が非常に酸性であると予期され、そ
れゆえ、ＳＤＳゲルにおいて変則的に（ａｎｏｍｏｌｏｕｓｌｙ）泳動する。予
想されたように、Ｌａｂタンパク質は、ＳＤＳゲルにおいて変則的に移動する。
本発明においてクローニングされ、そして開示されたものは、いくつかの細胞株
において見出されたネイティブなタンパク質と同一に泳動した。ＭＣＡ ４４−
３Ａ６によって検出される抗原をコードする正確な遺伝子フラグメントがクロー
ニングされた（ｍＲＮＡ）という確信的証拠は、この組換えタンパク質を作製し
た場合に、その組換えタンパク質が、そのタンパク質の独立した生物学的に誘導
された供給源と同じに作用する（この場合、見かけの分子量を有する）べきこと
である。クローンから提供されたＬａｂは、細胞からのＬａｂの特徴を有する。
【００３６】 ＨＡＡＨによってコードされる推定アミノ酸配列は、８５〜９０キロダルトン
であるタンパク質を生成するオープンリーディングフレームの使用を必要とし、
そしていくつかの開始コドンおよび他のより短いオープンリーディングフレーム
が存在することを考慮しない。推定ＨＡＡＨタンパク質（生化学的）は、グリコ
シル化され、そして報告された配列は、グリコシル化部位を有する（Ｋｏｒｉｏ
ｔｈら，１９９４；Ｌａｖａｉｓｓｌｅｒｅら，１９９６）。対照的に、Ｌａｂ
はグリコシル化されず、推定グリコシル化部位を有しもしない。
【００３７】 推定ＨＡＡＨアミノ酸配列は、非常に疎水性であることが推定されるＬａｂア
ミノ酸配列によって共有される領域を含む。Ｌａｂは、可溶性であるためには、
強力な界面活性剤を必要とする；ＨＡＡＨはそうではない。ｌａｂをクローニン
グおよび十分に研究するために用いた同じ細胞株（Ａ５４９）における（酵素活
性の測定による）ＨＡＡＨの増加した発現は、これらの両方の遺伝子産物が、Ａ
Ｃ表現型に重要であり得ること、および少なくともＡ５４９細胞が機能的なＨＡ
ＡＨおよびＬａｂの両方を作製することを示唆する。Ａ５４９へのｌａｂに対す
るアンチセンスの成功裏のトランスフェクションは、ｌａｂの発現および細胞の
増殖速度の著しい減少をもたらした。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（正常なマウス線維芽
細胞）におけるセンスｌａｂ構築物の発現は、ＡＣの表現型と一致した表現型で
ある、表現型の著しい変化をもたらした。それゆえ、ｌａｂ発現は、ガン細胞へ
の正常細胞の変換と関連する。ＬａｂおよびＨＡＡＨは、共通の潜在的カルシウ
ム結合ドメインを有する。
【００３８】 ｃＤＮＡライブラリーの構築およびクローニング：ｃＤＮＡ λｇｔ１１ファ
ージライブラリーを、活性に増殖するＡ５４９細胞から単離したｍＲＮＡを用い
て構築した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９９０）。このオリゴ（ｄＴ）プライムド
（ｐｒｉｍｅｄ）ｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩリンカーを用いてＥｃｏＲＩ部位へと
クローニングした。このライブラリーは、ポリメラーゼ連鎖反応によって、０．
６キロベース〜５キロベースの範囲のインサートサイズを有する、最少１．４６
×１０6の独立したプラークを示す、１．２×１０10／ｍｌの力価を有する、約
８３％の明瞭な（インサートを含む）プラークを有する。Ｌａｂが４０キロダル
トンの内在性タンパク質（原形質膜中に埋め込まれるタンパク質）であるので、
潜在的リーダー配列を含む、このタンパク質をコードする理論的全長ｍＲＮＡは
、約１．１キロベースであると見積もられる。このライブラリーを、抗体ＭＣＡ
４４−３Ａ６を用いて免疫スクリーニングした。８個の独立して由来されたフ
ァージストック（同じプラークに由来する同一のファージ）が単離された。これ
らは、全て、免疫スクリーニング／単離の反復サイクルによってプラーク精製さ
れた。これらの８つの単離物のＥｃｏＲＩ消化によって、約２ｋｂの挿入物が見
られた。最大の挿入片を単離し（２ＡｌＡｌ）、そしてこのＥｃｏＲＩフラグメ
ントをｐＧＥＭ−３Ｚプラスミド中にクローニングした。
【００３９】 配列決定および配列分析：２ＡｌＡｌと命名されるＤＮＡフラグメントは、２
５５アミノ酸のタンパク質（図２）をコードすると予期される、５’非翻訳領域
、リボソーム結合部位、および開始コドンを含有する、２４４２塩基対長の挿入
片を有する（図１）ことが見出された。３’非翻訳領域は、４つの不安定性配列
ＡＴＴＴＡ（Ｘｕら，１９９７）のみを含むという点で注目すべきである。さら
に、ｍＲＮＡのアデニル化をもたらす、ｍＲＮＡのまさに３’末端において見出
される配列が存在する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９９０）。ｌａｂ配列は、準最
適なポリアデニル化部位（ＡＴＴＡＡＡ）および最適のポリアデニル化部位（Ａ
ＡＴＡＡＡ）の両方を含む。これらは、ｍＲＮＡのアデニル化をもたらす、ｍＲ
ＮＡのまさに３’末端において見出される配列である。この知見は、本明細書中
に概説された、細胞データおよび生化学的データを支持する分子データを提供す
る（ＨＡＡＨクローンは、ポリＡシグナルを有するが、３’領域全体は配列決定
されていない）。
【００４０】 カルシウム結合部位のモチーフが、Ｌａｂアミノ酸配列において示される（図
２）が、しかし、結合部位であるための公知の必要とされる構造の状況の外であ
る。この場合、カルシウム制限配列がそこに存在するが、この配列は、これを結
合部位として作用させることが公知であるタンパク質配列の状況下にはない。ｌ
ａｂクローンと、３’非翻訳領域の一部のみを示し、そしてこの配列のこの部分
が独立して確認されたＥＳＴクローン（番号０５５０１と命名される）との間の
相同性が示された。いくつかの内部フラグメントの相同性はまた、ＨＡＡＨにつ
いて示されるが、５’非翻訳領域および５’翻訳領域の一部が異なり（５８アミ
ノ酸）、ならびに３’コード配列の主な部分がｌａｂにおいて失われている（図
３）。
【００４１】 ゲノムＤＮＡクローニングおよび分析：ｌａｂのタンパク質コード領域を示す
ＰＣＲフラグメントをプローブとして用いて、ヒト肺線維芽細胞株ＷＩ−３８か
ら作製されたゲノムλＦＩＸ ＩＩライブラリーをスクリーニングした。１０個
の一次プラークを、約１×１０6のスクリーニングされたプラークから単離した
。これらの７個を標的ＤＮＡとして用いて、ポリメラーゼ連鎖反応条件が、タン
パク質コード領域についてプライマーを用いて確立され、ｌａｂについての予期
されたタンパク質コード領域である７６５塩基対のフラグメントを生成した。ノ
ーザンブロット（ｍＲＮＡを定性的に評価するために用いられる方法）について
、ｌａｂは、２．７キロベースで示される１つのバンドのみを検出する。ｌａｂ
クローンから作製される組換えタンパク質は、ＭＣＡ ４４−３Ａ６を用いるウ
ェスタンブロット（タンパク質を定性的に規定するために用いられる方法）で試
験した場合、Ａ５４９細胞によって作製される場合のＬａｂタンパク質と同じ相
対移動度を有する。
【００４２】 Ｌａｂ遺伝子およびＨＡＡＨ遺伝子は、これらがコードするタンパク質におい
て異なる結果を与える。ＨＡＡＨは、一貫してノーザンブロット分析（２．６キ
ロベースおよび４．３キロベース）で２つのバンドを与え、２．６キロベースの
バンドが、選択的スプライシングに起因すること、すなわち、この細胞は、ｍＲ
ＮＡを切断し、そしてスプライスすることを示唆する。また、ｌａｂおよびＨＡ
ＡＨは同じ遺伝子である場合、ＨＡＡＨは、Ｌａｂが見出される全ての組織およ
びガン細胞株において検出されるべきである。しかし、Ｌａｂは、細胞株ＥＭＴ
６またはＱＵ−ＤＢのノーザンブロットにおいて見られず、これらの細胞におい
て免疫反応性も存在しない；これらは、Ｌａｂ ｍＲＮＡが作製されないこと、
およびＬａｂタンパク質がこれらの細胞において生成されないことを示す。Ｌａ
ｂタンパク質は、正常細胞において稀にしか発現されないが、ここでＨＡＡＨ
ｍＲＮＡおよびＨＡＡＨタンパク質の両方が、研究されたほぼ全ての組織におい
て発現されると報告されている。
【００４３】 ｍＲＮＡ分析：プローブとしてｌａｂ ｃＤＮＡを用いるＡ５４９細胞株から
のＤＮＡフラグメントのノーザンブロット分析は、約２．７キロベースの単一の
バンドを同定した。これは、ｃＤＮＡ（２４４２塩基対）および約３００塩基対
のポリＡテールに基づくと予期される。マウス細胞株ＥＭＴ６、およびヒト大細
胞ガン細胞株ＱＵ−ＤＢのノーザンブロット分析は、ｌａｂについての転写物が
これらの細胞によって生成されないことを確認する。このことは、これらの細胞
についてのｌａｂ発現についてネガティブである免疫アッセイと一致する。
【００４４】 アンチセンスｃＤＮＡ発現およびセンスｃＤＮＡ発現：プラスミド（ｐＢＫ−
ＣＭＶ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９９０）は、Ａ５４９細胞およびＮＩＨ ３
Ｔ３細胞へのセンスまたはアンチセンスの全長ｃＤＮＡのｌａｂのいずれかを保
有し得る。アンチセンス分子は、例えば、センス分子にハイブリダイズするセン
ス分子に対して相補配列であり得、その発現を防止する。ｌａｂに対してアンチ
センスを発現するＡ５４９細胞の増殖速度を評価するためのＭＴＴアッセイ（Ｓ
ｉｄｄｉｑｕｅら，１９９２）を用いて、増殖速度における著しい減少が示され
た。アンチセンスでトランスフェクトされたＡ５４９細胞は、より大きな程度の
接触阻害を有するようである。検出可能な量のＬａｂは、これらのアンチセンス
でトランスフェクトされた細胞において低減される。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞は、セ
ンスの発現が生じた場合に、線維芽細胞様細胞型形態（大きい、薄い紡錘体状）
から、大きな腺ガン出現細胞（非常に円形で丸い）へと転換する。
【００４５】 染色体の局在：インサイチュハイブリダイゼーション（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，
１９９０）による、全長ｃＤＮＡをプローブとして用いてのｌａｂについての染
色体局在は、第４染色体および第８染色体とおそらくいくらか反応性を有する、
試験的に染色体２ｑ１２−１４上である。同じプローブ（ｌａｂの全長ｃＤＮＡ
配列）およびＦＡＣＳ選別された染色体（Ｌｅｂｏら，１９８５）を用いてまた
、第２染色体上に染色が示され、第４染色体において弱い染色を有し、そして第
８染色体において染色がなかった。ゲノムクローンの使用は、これらのデータを
決定する際に特に価値がある。なぜなら、ｃＤＮＡについて許容され得るよりも
高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が用いられ得、それによ
って、バックグラウンドシグナルを減少させるからである。これは、正確な遺伝
子がクローニングされること、および結果が方法のアーチファクトに起因しない
ことのなお別の証明である。腫瘍のゲノムＤＮＡには変異が存在し得、そして本
発明については、ＤＮＡが腫瘍細胞（Ａ５４９）からクローニングされた。それ
ゆえ、変異遺伝子が、クローニングされ得る。しかし、これは、この場合ではな
い。なぜなら、正常細胞（ＤＮＡ）からのゲノムＤＮＡは、本明細書中に記載さ
れるようにクローニングされた配列と同じ配列を生成したからである。それゆえ
、正常遺伝子を、Ａ５４９細胞からクローニングした。第４染色体および第８染
色体についての弱いシグナルは、偽遺伝子または関連遺伝子と一致する。例えば
、ＨＡＡＨは、インサイチュハイブリダイゼーションによって第８ｑ１２染色体
上であると報告され、それゆえ、第８染色体についてのこの結果は、ＨＡＡＨ配
列およびｌａｂ配列の相同性を反映し得る。
【００４６】 ラビリンチンのタンパク質分子の特徴付け：ウェスタンブロット分析（抗原を
評価するための定性的アッセイ）を用いる以前の研究は、Ｌａｂ抗原は、Ａ５４
９細胞（Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈら，１９８５）において検出可能な４０キロダル
トン（相対移動度による）タンパク質であることを示した。エピトープは、レク
チンによって調節されるまたはブロックされるようではなく、そして主に原形質
膜上に局在する細胞表面上で選択的に発現される（Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈら，１
９８５，１９９１）。Ｌａｂは、プロテアーゼに対して感受性であるが、脂質ま
たは炭水化物改変反応には感受性でない（Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈら，１９８５）
。Ｌａｂの生化学的特性は、内在性膜タンパク質であるＬａｂと一致する。
【００４７】 本発明のｌａｂ遺伝子由来の推定アミノ酸配列を有することは、Ｌａｂタンパ
ク質のさらなる特徴付けを可能にする。Ｌａｂの大量のコンピューター分析は、
真核生物リーダー様配列および理論的切断部位、３’ミリスチル化配列部位、弱
い膜係留ドメイン（ＭＡＤＩ）、および強い膜係留ドメイン（ＭＡＤＩＩ）（図
２）を同定した［（ＨＡＡＨ配列では、５８個の（理論的）アミノ酸、続いてＬ
ａｂタンパク質コード配列における配列相同性、およびｌａｂ配列に対して３’
側のさらなる４４５アミノ酸が存在する）］。
【００４８】 Ｌａｂが、細菌のＧＳＴ融合発現系（ｐＧＥＭＥＸ−２Ｔ）（Ａｍｅｒｅｈａ
ｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，
Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，０８８５４，ＵＳＡ）において融合タンパク質として発
現され、そして抗体ＭＣＡ ４４−３Ａ６を用いるウェスタンブロット分析に供
する場合、得られるブロットは、発現され切断される融合タンパク質が、Ａ５４
９細胞において検出されるタンパク質と同じ相対移動度を有することを実証する
。Ｌａｂについての推定分子量は、２８．８キロダルトンであり、そしてウェス
タンブロットでは、これは、Ａ５４９細胞により発現される形態と同一の相対移
動度（見かけの相対移動度＝４０キロダルトン）を有する。５５個のグルタミン
酸残基および２７個のアスパラギン酸残基（合わせて８２残基）は、リーダー配
列および最強の膜係留ドメイン（ＭＡＤＩＩ）を除いて、タンパク質（計２５５
アミノ酸；リーダー配列なしで２２８）全体にほぼ均一に分布する。これらのデ
ータは、Ｌａｂが、ＳＤＳゲルにおいて変則的に移動することを示唆する。Ａ５
４９以外の細胞株（例えば、腺ガンＤＵ−１４５、ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−８１；Ｚ
Ｒ−７５−１、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５０４など）は、Ｌａｂと同じ分子量の抗
原を用いて検出された抗原を有する。８５〜９０キロダルトンの分子量種も、５
２および５６キロダルトンの分子量種も、Ｌａｂについてウェスタンブロットを
プローブした場合に示されない。
【００４９】 抗体ＭＣＡ ４４−３Ａ６を用いるエピトープマッピングおよびＬａｂのワク
チン実行可能性：ポリメラーゼ連鎖反応およびＧＳＴ融合タンパク質系を用いて
、タンパク質コード領域のサブクローンを作製し、そしてエピトープを、Ｌａｂ
のアミノ酸番号１１７〜１２２を示す６アミノ酸（ＰＴＧＥＰＱ）（「Ｐ」ペプ
チド）に対するＭＣＡ ４４−３Ａ６の結合にマッピングした。このエピトープ
を決定するために、コード領域全体を領域に分け、ポリメラーゼ連鎖反応のプラ
イマーを設計して各領域を増幅し、そしてその後の発現のポリメラーゼ連鎖反応
産物を、クローニングし、そして抗体ＭＣＡ ４４−３Ａ６を用いてウェスタン
ブロット分析によって試験した。
【００５０】 次いで、ポジティブなウェスタンブロットの結果を示すＤＮＡフラグメントを
、さらに細かく分けた。ポリメラーゼ連鎖反応の産物を、生成し、そしてクロー
ニングし、発現させ、そしてウェスタンブロットによって試験した。構築物を、
５’末端および３’末端の両方からこのようにして作製し、そしてアミノ酸数の
間隔を各回において減少させた。このことは、最後の回がその前の回とは（両方
の方向において）１アミノ酸の相違を示すことを生じ、その結果、ＭＣＡ ４４
−３Ａ６の正確な結合部位を推定し得た。このことは、少なくともこれらの６ア
ミノ酸が、外部細胞表面に露出していることを実証する。この点をさらに実証す
るために、これらの６アミノ酸のみをコードするＤＮＡをクローニングし、そし
て融合タンパク質がウェスタンブロット分析によってポジティブである。合成に
よって調製された「Ｐ」ペプチドは、ＭＣＡ４４−３Ａ６によって特異的に検出
され得、そして合成ペプチドは、試験した５匹のマウスのうちの５匹において免
疫原性であった。コンピューター分析／モデリングはまた、このエピトープが、
コンピューター補助分析（ＧＣＧプログラム）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕ
ｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉ ５３７０３）を用いて非常に免疫
原性であることを予測した。
【００５１】 ワクチン調製：ワクチンは、宿主に与えられた場合に、この抗原に対する抗体
を産生する宿主を生じる、抗原の調製物である。宿主応答は、ワクチンが指向さ
れる疾患に対して免疫性である宿主を生じる。それゆえ、ワクチン処置は、宿主
が疾患の原因因子に曝露されることなく、疾患の臨床的提示を予防する。Ｌａｂ
は、好ましいガンワクチンの全ての特徴を有する。ｌａｂ遺伝子は、腺ガンのよ
うに見える腫瘍によって頻繁に発現され、細胞の外側に発現され、所定のガンに
おける全ての細胞によって発現され、これらのガン細胞の全ての時点で発現され
、そして正常細胞によってめったに発現されない。Ｌａｂタンパク質（ペプチド
）は、分子クローニング技術を用いて任意の数の方法によって生成され得、そし
て大量に生成され得、従って、これをワクチンとして用いるために実用的な抗原
にする。ヒトへの注射のために適切であるようにＬａｂタンパク質が精製された
後、Ｌａｂタンパク質は、皮内に、皮下に、または他の経路によって個体に投与
され、その結果、免疫系をチャレンジしてこのタンパク質（ペプチド）に対する
抗体が生成される。
【００５２】 分子モデリングおよびコンピューター補助分析ＧＣＧプログラム（Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７０３）の
使用は、エピトープよりもわずかに大きな（タンパク質については６〜７アミノ
酸）、分子の小さな部分の同定を可能にし、これは、タンパク質分子の表面に存
在すると予期される。さらに、所定の配列の疎水性または親水性の程度、ならび
に動物においてこの配列がどの程度免疫原性であるかが決定され得る（Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７０３）
。どの配列がこれらの基準を満たすかについて規定した後、ペプチドを合成によ
って作製するかまたは多数の標準的な方法によって生成する。次いで、１以上の
これらのペプチドは、ワクチンとして使用されるように処方され得、そして上記
で概説した宿主にワクチンとして投与され得る。
【００５３】 図１のｃＤＮＡによってコードされる配列、このｃＤＮＡによってコードされ
る図２の配列、ペプチドＡＰＰＥＤＮＰＶＥＤ、ＥＥＱＱＥＶＰＰＤＴ、ＤＧＰ
ＴＧＥＰＱＱＥ、およびＥＱＥＮＰＤＳＳＥＰＶ、ならびにそれらの任意のフラ
グメントまたは組合せの群より選択されるアミノ酸配列を有する分子を含むワク
チン。
【００５４】 所定のワクチンは、宿主に１回投与され得るか、または何回も投与され得る。
いくつかの患者が所定のワクチンを認識するように、アジュバントもまたこのペ
プチドとともに投与される必要があるかもしれない。アジュバントは、免疫の容
易さを高め、かつ検出可能な血清抗体を有さない状態から非常に高い力価の血清
抗体を有する状態への宿主の変換を補助する、非特異的な免疫刺激因子である。
宿主を、抗体が指向される疾患または状態から効率的保護するのは、この高レベ
ル（力価）の抗体である。
【００５５】 機能研究：Ｌａｂの細胞機能を理解することに関する研究は、細胞局在／特徴
付け研究（Ｓｉｄｄｉｑｕｅら，１９９２）の延長である。種々の陽イオン（Ｃ
ａ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｃｕ＋＋、およびＦｅ＋＋）への細胞外曝露に応じたＬａｂ
のレベルの変化が起きた。Ａ５４９細胞におけるＬａｂ発現は、Ｃａ＋＋によっ
てのみ調節された。細胞質ゾルのＣａ＋＋を測定する非常に特異的な蛍光Ｆｕｒ
ａ−２／ＡＭ Ｃａ＋＋方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，
Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ ９７４０２）を用いて、以下のことが実証された；１）内
部Ｃａ＋＋濃度がＱＵ−ＤＢ細胞よりもＡ５４９細胞において高い、そして２）
Ａ５４９細胞株は、種々の外部Ｃａ＋＋レベルに対して応答する（Ｓｉｄｄｉｑ
ｕｅら，１９９２）。ｐＨは細胞内の遊離のＣａ＋＋レベルを調節し得るので、
外部ｐＨの操作は、Ｌａｂの発現レベルにおける変化をもたらすはずである。（
正常なＣａ＋＋濃度の存在下での）細胞外ｐＨ変化は、以下をもたらす：１）Ｓ
ＮＡＲＦ−１ ＡＭ／ＦＡＣＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．
，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ ９７４０２）により測定した場合の細胞内ｐＨの並行変
化、２）Ｌａｂについての転写レベルの増加（ノーザンブロットによるＧＡＰＤ
Ｈ発現と比較した場合）；および３）Ｌａｂタンパク質はまた、増加する（ウェ
スタンブロット／スロットブロット分析を用いて）。Ａ５４９細胞についてのｐ
Ｈにおける細胞内変化（外部変化に起因する）は、正常細胞について報告された
細胞内変化と同一である。ｌａｂの増加した発現はまた、細胞死に起因しない（
ＭＴＴアッセイによって測定した場合）（Ｓｉｄｄｉｑｕｅら，１９９２）。さ
らに、種々のｐＨ溶液での組換えＬａｂのインキュベーションは、免疫反応性を
変更しない。予備的なデータは、これらの実験が、減少したＣａ＋＋において増
殖したＡ５４９細胞に対して行われた場合、誘導されたｌａｂ発現は弱まること
を示唆する。
【００５６】 細胞サンプルにおけるガン細胞の診断方法：被験体からの生物学的サンプルは
、ガン細胞がこの被験体において存在するか否かを決定するために用いられる。
適切なサンプルの例としては、血液および生検材料が挙げられる。診断の１方法
は、このサンプル中の細胞由来のＤＮＡを、ｌａｂ遺伝子またはそのフラグメン
トにハイブリダイズし得る標識プローブにストリンジェントな条件（例えば、６
×ｓｓｃ；０．０５×ブロット（ｂｌｏｔｔｏ）；５０％ ホルムアミド；４２
℃（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９９０））下で曝露することである。もちろん、ハ
イブリダイズする条件は、最適な感度および特異性を達成するために、生物学的
サンプルの性質、ガンの型、プローブの調製方法、および組織調製方法に依存し
て変更される。
【００５７】 サンプルをプローブと接触させた後、次の工程は、このプローブが、このサン
プルからのＤＮＡのヌクレオチド配列とハイブリダイズしたか否かを決定するこ
とであり、このことから、ｌａｂ遺伝子の存在が推論され、この存在がガンの診
断である。
【００５８】 別の診断方法は、既に存在する抗体、または本発明の局面である、この抗原性
ペプチドに指向される新規な抗体のいずれかである、好ましくは標識された、モ
ノクローナル抗体を得て、そしてサンプルをこれらの抗体と接触させてＬａｂ抗
原を検出させることである。これらのモノクローナル抗体は、Ｌａｂ抗原の検出
に関する非常に特異的なアッセイの開発において有用であり、そして多くの異な
る形式において実行される試験を可能にし；科学および医学において、より広範
な適用をもたらす。
【００５９】 本発明は、腫瘍の表面上に発現される、以前に報告されていなかった新規な遺
伝子を記載するという点で有用である。この遺伝子は組織特異的でなく、それゆ
え、腫瘍が生じた器官にかかわらず、腫瘍の検出を可能にする。同様に、これら
の腫瘍のためのワクチンを生成するためのこの遺伝子の使用は、非常に広範な適
用を有する。診断試験はまた、この広範な組織的用途を有し、Ｌａｂ／ｌａｂの
検出を、ガンについての、特に以前に腺ガンと指摘されてきたガンについての「
汎マーカー（ｐａｎ−ｍａｒｋｅｒ）」とする。
【００６０】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ｌａｂ遺伝子の核酸配列である。
【図２】 図２は、ｌａｂ遺伝子から推定された、Ｌａｂについてのアミノ酸配列である
。
【図３】 図３は、ｌａｂ遺伝子およびこれがＨＡＡＨ酵素にどのように関連するかの例
示である。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１２月２７日（２０００．１２．２７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５３】 図１のｃＤＮＡによってコードされる配列、このｃＤＮＡによってコードされ
る図２の配列、ペプチドＡＰＰＥＤＮＰＶＥＤ（配列番号６）、ＥＥＱＱＥＶＰ
ＰＤＴ（配列番号７）、ＤＧＰＴＧＥＰＱＱＥ（配列番号８）、およびＥＱＥＮ
ＰＤＳＳＥＰＶ（配列番号９）、ならびにそれらの任意のフラグメントまたは組
合せの群より選択されるアミノ酸配列を有する分子を含むワクチン。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】 図１は、ｌａｂ遺伝子の核酸配列（配列番号１）である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】 図２は、ｌａｂ遺伝子から推定された、Ｌａｂについてのアミノ酸配列（配列 番号２） である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 (Ｃ１２Ｐ 21/08 //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ｗ Ｆターム(参考） 4B024 AA12 BA36 BA54 CA04 CA09 DA02 DA03 EA04 FA10 GA11 HA12 HA17 4B063 QA19 QQ08 QQ43 QR48 QR56 QS33 QS34 4B064 AG27 AG31 CA10 CA19 CA20 CC24 DA01 DA14 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 BA15 CA41 DA75 DA76 DA86 EA31 EA51 FA72 FA74 HA05

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 図１に示す通りのヌクレオチド配列を有する、単離されたｃ
    ＤＮＡ分子。
  2. 【請求項２】 図１のヌクレオチド配列に約７０％の相同性を示すヌクレオ
    チド配列を有する、単離されたｃＤＮＡ分子。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載の単離されたｃＤＮＡ分子のセグメントであ
    って、ここで、該セグメントが、前記ヌクレオチド配列における開始コドン（Ａ
    ＴＧ）から終止コドンＴＡＡにまたがり、そして７６５塩基対を含む、セグメン
    ト。
  4. 【請求項４】 請求項２に記載の単離されたｃＤＮＡ分子のセグメントであ
    って、ここで、該セグメントが、前記ヌクレオチド配列における開始コドン（Ａ
    ＴＧ）から終止コドンＴＡＡにまたがり、そして約７６５塩基対を含む、セグメ
    ント。
  5. 【請求項５】 単離されたｃＤＮＡのセグメントであって、抗体ＭＣＡ４４
    −３Ａ６によって検出可能なＬａｂタンパク質におけるエピトープをコードする
    に十分である、セグメント。
  6. 【請求項６】 請求項１に記載のｃＤＮＡセグメントによってコードされる
    、アミノ酸配列。
  7. 【請求項７】 請求項２に記載のＤＮＡセグメントによってコードされる、
    アミノ酸配列。
  8. 【請求項８】 細胞サンプルにおけるガン細胞を診断するための方法であっ
    て、該方法は、以下の工程： （ａ）該細胞サンプルを、ｌａｂ遺伝子またはそのフラグメントにハイブリダ
    イズし得る標識プローブと、ストリンジェントな条件下で接触させる工程；およ
    び （ｂ）該プローブが、該サンプル中のヌクレオチド配列とハイブリダイズした
    か否かを決定する工程であって、それによって該ｌａｂ遺伝子の存在が推論され
    、該存在がガンの診断である、工程、 を包含する、方法。
  9. 【請求項９】 ＡＰＰＥＤＮＰＶＥＤ、ＥＥＱＱＥＶＰＰＤＴ、ＤＧＰＴＧ
    ＥＰＱＱＥ、およびＥＱＥＮＰＤＳＳＥＰＶからなる群より選択されるアミノ酸
    配列を有する分子。
  10. 【請求項１０】 アミノ酸配列ＰＴＧＥＰＱを有する分子。
  11. 【請求項１１】 図２におけるアミノ酸であるようにアラインメントされる
    、３と２０との間のアミノ配列長である全ての配列からなる群より選択される、
    ペプチドであって、ここで、ｎアミノ酸の配列の最初のアミノ酸の位置が、１位
    〜ｎ−３位からｎ−２０位からなる群より選択される、ペプチド。
  12. 【請求項１２】 抗体であって、請求項６、８、９、１０、または１１に記
    載の配列から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドに対する、抗体。
  13. 【請求項１３】 モノクローナル抗体であるとさらに規定される、請求項１
    ２に記載の抗体。
  14. 【請求項１４】 抗体であって、請求項２、３、４、もしくは５に記載のＤ
    ＮＡ分子によってコードされるアミノ酸配列、またはエピトープを含むそのフラ
    グメントに対する、哺乳動物において産生された、抗体。
  15. 【請求項１５】 細胞サンプルにおける、請求項２、３、４、または５に記
    載ののｃＤＮＡ分子を検出するための方法であって、該方法が、以下の工程： （ａ）該細胞サンプルを、該ｃＤＮＡまたはそのフラグメントにハイブリダイ
    ズし得る標識プローブと、ストリンジェントな条件下で接触させる工程； （ｂ）該プローブが、該サンプル中のヌクレオチド配列とハイブリダイズした
    か否かを決定する工程；および （ｃ）該プローブがハイブリダイズした場合に該ｃＤＮＡの存在を推論する工
    程、 を包含する、方法。
  16. 【請求項１６】 請求項２、３、４、または５に記載のｃＤＮＡ分子の発現
    の効果を弱める方法であって、該方法が、以下の工程： （ａ）該ｃＤＮＡ分子またはその発現産物に対するアンチセンス分子を得る工
    程、および （ｂ）該アンチセンス分子を該ｃＤＡＮ分子またはその発現産物にハイブリダ
    イズする工程、 を包含する、方法。
  17. 【請求項１７】 前記アンチセンス分子が、少なくとも１００ヌクレオチド
    長である、請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 請求項２または３に記載のｃＤＮＡが誘導される、単離さ
    れたゲノムＤＮＡ分子。
  19. 【請求項１９】 請求項２、３、４、または５に記載の単離されたｃＤＮＡ
    分子を含む、ベクター。
  20. 【請求項２０】 請求項６、８、９、１０、または１１に記載のアミノ酸配
    列を有する分子をコードするｃＤＮＡ分子を含む、ベクター。
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