KR102067487B1

KR102067487B1 - 베타-디펜신 이합체를 포함하는 신규 세포투과성 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102067487B1
Application number: KR1020180068030A
Authority: KR
Inventors: 안대로; 김효영
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2018-06-14
Filing date: 2018-06-14
Publication date: 2020-01-17
Also published as: KR20190141368A

Abstract

본 발명은 베타-디펜신(β-defensin) 이합체를 포함하는 세포투과성 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP)에 관한 것으로, 상기 인간베타-디펜신의 이합체는 핵산과 함께 거대한 복합체를 형성하며, 이러한 복합체는 DNA-transfection 및 RNA-transfection을 중재하고, 세포 투과성이 우수하다.

Description

베타-디펜신 이합체를 포함하는 신규 세포투과성 펩타이드 및 이의 용도{Novel cell penetrating peptide comprising beta-defensin dimer and uses thereof}

본 발명은 신규 세포투과성 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 베타-디펜신(β-defensin) 이합체를 포함하는 세포투과성 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

질병의 발생 및 진행에 중요한 역할을 하는 주요단백질의 기능이 밝혀지면서 세포 내 질환 관련 단백질을 조절할 수 있는 물질로 저분자 화합물이 주요 약물로 이용되고 있으나, 넓은 면적의 단백질 간 상호작용 부위는 저분자 약물이 결합하여 표적단백질의 활성을 조절하기에는 한계가 있음이 알려져 있었다. 이를 극복하기 위하여, 단백질과 단백질간의 상호작용을 조절하기에 적합한 펩타이드나 단백질 기반의 약물 개발이 시도되고 있다. 세포 내 존재하는 표적단백질의 활성 조절을 목적으로 하는 단백질 약물의 성공적인 개발을 위해서는 단백질(핵산화물)의 세포 내 전달 및 수송이 필수적으로 요구되는데, 일반적으로 단백질(핵산화물)의 세포 내 수송은 어려운 것으로 알려져 있었다.

상기와 같은 핵산화물 운송을 위해 자연적으로 발견 된 운송 수단은 바이러스 벡터였다. 바이러스 벡터들은 특히 트랜스펙션을 위한 플라스미드 DNA 전달에 최적화되어 있다. 아데노 관련 바이러스 (AAV)와 같은 바이러스 벡터의 일부가 현재 유전자 요법에 사용되고 있지만, 잠재적인 안전 문제와 바이러스 기반 비히틀의 도입 유전자 크기의 제한이 있다. 바이러스 벡터의 안전성 문제를 해결하기 위해 비 바이러스 성 유전자 전달 비히클이 수십 년 동안 연구되어 왔다. 비 바이러스 벡터 중 가장 널리 사용되는 시스템 중 양이온성 지질기반 리포좀으로 Lipofectamine (LF)이 있다. 그러나 리포펙타민은 종종 많은 생물 의학 분야에서 받아 들일 수 없는 상당한 세포 독성과 면역 원성을 보이는 문제가 있다. 또한, 종래에는 DNA 및 RNA 나노 입자가 siRNA 전달 수단으로 사용되었다. DNA 및 RNA 물질은 생체 적합성이 높지만 작은 핵산화물 운송에는 제한적이다. 최근 세포에서 방출 된 세포외소포 (extracellular vesicle)가 유전자 전달 매개체로 제시되고 있다. EVs는 광범위한 핵산화물의 전달을 위한 다재 다능한 매개체로 간주 될 수 있지만, EV의 준비는 매우 비용이 많이 들고 EV의 견고한 대규모 생산이 어려운 문제점이 있다.

이러한 단점을 보완하기 위한 신규하고 새로운 단백질의 세포 전달 물질의 연구가 필요한 실정이다.

한국등록특허 10-1647804호 한국공개특허 10-2015-0145132호

본 발명자들은 목적 카르고(cargo of interest)를 세포 내로 전달할 수 있는 보다 효율적인 펩타이드 및 이를 이용한 약물전달체(drug delivery system)를 개발하고자 노력한 결과, 인간 베타 디펜신으로부터 유래된 신규한 세포투과 펩타이드를 동정하였고, 상기 펩타이드가 소수성 아미노산 및 양이온성 아미노산으로 구성하며 목적 운반 카르고(예컨대, siRNA 같은 약물)의 세포 내 전달에 효율적으로 적용될 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 세포투과 펩타이드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상술한 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상술한 세포투과 펩타이드를 포함하는 약물전달체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 목적 카르고의 세포 내 전달 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 목적 카르고 운반용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 목적 카르고의 트랜스펙션 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

상기 목적을 해결하기 위하여 본 발명은 하기와 같은 수단을 제공한다.

본 발명의 일측면은, 베타-디펜신(β-defensin) 이합체를 포함하는 세포투과성 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP)를 제공한다.

본 발명의 일측면에서, 상기 베타-디펜신 이합체는 인간베타-디펜신 3(hBD3)의 이합체 및 인간베타-디펜신 2(hBD2)의 이합체 중 어느 하나 이상을 포함하는, 세포투과성 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 일측면에서, 상기 베타-디펜신 이합체는 다이 설파이드 결합을 통해 이합된 것인, 세포투과성 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 일측면에서, 상기 베타-디펜신 이합체는 인간베타-디펜신 3(hBD3)의 이합체인, 세포투과성 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 일측면에서, 상기 펩타이드는 세포질로 투과되는 것인, 세포투과성 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 일측면에서, 상기 펩타이드는 세포독성을 나타내지 않는 것인, 세포투과성 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 일측면에서, 상기 펩타이드는 공유결합으로 연결된 목적 카르고를 세포 또는 조직 내로 전달시키는 것인, 세포투과성 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 다른 측면은, (a) 상기 중 어느 하나의 세포투과성 펩타이드; 및 (b) 상기 펩타이드에 결합된 목적 카르고;를 포함하는 약물전달체(drug delivery system)을 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 카르고는 화학물질, 나노입자, 펩타이드, 폴리펩타이드, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, mRNA 또는 pDNA인 것인, 약물전달체를 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 약물전달체는 상기 (a)와 상기 (b)가 복합체(complex)형태인, 약물전달체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 세포투과성 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은, 인간베타-디펜신 3(hBD3)의 이합체를 포함하는 세포투과성 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.

본 발명의 또 하나의 다른 측면은, 상기 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 중 어느 하나의 약물전달체를 세포에 접촉시키거나 또는 혈액 내로 주입시키는 단계를 포함하는 목적 카르고의 세포 내 전달방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 중 어느 하나의 약물전달체를 포함하는 목적 카르고 운반용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 중 어느 하나의 약물전달체를 포함하는 트랜스팩션 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 약물전달체 내 카르고는 핵산 분자인, 트랜스팩션 키트를 제공한다.

본 발명은 신규한 세포투과 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 펩타이드는 우수한 세포투과성을 가진다.

본 발명의 펩타이드의 양 말단, 특히 C-말단에 목적 카르고와 결합되어 상기 목적 카르고(예컨대,siRNA)를 안정적이고 효과적으로 세포 내(세포질)로 전달할 수 있다.

본 발명의 펩타이드를 포함하는 약물전달체, 그리고 이를 이용하는 목적 카르고의 전달방법 및 조성물은 질병 또는 질환의 치료, 특정 세포의 검출, 질병(예컨대, 암)의 진단, 특정 세포의 위치 추적 및 인 비보 이미징, 등에 이용될 수 있다.

도 1은 핵산화물과의 자기 집합체 DhBD3 및 그 복합체의 도식적 표현이다. 3 개의 디설파이드 결합 (적색선)에 의해 유도된 hBD 구조는 3 개의 β- 가닥 (녹색 화살표)를 제공한다. hBD의 β 가닥 중 하나는 다른 hBD의 β 가닥과 상호 작용하여 이량체 DhBD3를 형성한다. DhBD3는 자기 응집되어 나노 입자를 형성 할 수 있다. 핵산의 존재 하에서, DhBD3는 펩티드의 다중 양이온성 잔기로 인해 핵산과 복합체를 형성 할 수 있다.
도 2는 DhBD3의 특성에 관한 것이다. (A)는 DTT의 존재 및 부재하에 DhBD3의 Tricine-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동결과이다. (B) DLS로 측정 한 hBD3 및 DhBD3 (50 M)의 수력학적 직경이며, 삽입된 그림은 자기 집합 DhBD3의 TEM 이미지이다. (C)는 DLS를 사용하여 결정된 DhBD3의 임계 응집체 농도 (CAC)이다.
도 3은 DhBD3의 셀룰러 속성이다. (A) HeLa 세포에 hBD3 및 DhBD3 (10mM)의 흡수 효율이다. (B) DhBD3 (10mM)으로 처리 된 HeLa 세포의 형광 현미경 이미지이며, 스케일 바는 10μm이다. (C) 다양한 농도의 DhBD3로 처리 된 HeLa 세포의 생존력이다. (D) DhBD3 (10mM)로 처리 한 RAW264.7 세포에서 방출된 인터루킨 -6 (IL-6)의 수준으로, LPS (10 ㎍ / mL)로 처리 된 세포로부터 IL-6 수준을 양성 대조군으로 나타내었다.
도 4는 DhBD3을 형질 감염제로 사용하여 DNA 플라스미드로 세포를 형질 감염시킨 결과이다. (A) EGFP를 발현하는 플라스미드 (pEGFP, 10ng)를 다양한 농도의 DhBD3와 복합체로 만든 후, 착물형성 수준을 아가로스 겔 전기 영동으로 분석한 결과이다 (도 9A). (B)는 DLS로 측정한 pEGFP @ DhBD3 복합체 (2 μM DhBD3와 복합체를 형성 한 10 ng pEGFP)의 유체 역학적 크기이며, 삽입 된 그림은 pEGFP @ DhBD3 복합체의 TEM 이미지이다. (C) pEGFP와 transfection 후 EGFP를 표현 HeLa 세포의 흐름 cytometric 분석결과이다. (D) pEGFP로 형질 감염된 세포에서 발현된 EGFP의 웨스턴 블랏결과이며, DhBD3에 의한 플라스미드 DNA 전달 효율을 양성 대조군으로서 LF (pEGFP @ LF)에 의한 효율과 비교 하였다.
도 5는 DhBD3를 매개체로 사용하는 mRNA의 세포 내 전달결과이다. (A) EGFP 발현 mRNA (mEGFP, 2 μg)는 다양한 농도의 DhBD3와 복합체를 형성하였다. 착물형성 수준은 아가로 오스겔 전기 영동으로 분석 하였다 (도 9B). (B) DLS로 측정한 mEGFP @ DhBD3 복합체 (2 μg DhBD3와 복합체를 형성 한 2 μg mEGFP)의 유체 역학적 크기이며, 삽입된 그림은 mEGFP @ DhBD3 복합체의 TEM 이미지이다. (C) mEGFP의 세포 내 전달 후 EGFP를 표현 HeLa 세포의 흐름 cytometric 분석결과이다. (D) mEGFP @ DhBD3로 처리된 세포에서 발현된 EGFP의 웨스턴 블랏결과이며, DhBD3에 의한 mRNA 전달 효율은 양성 대조군으로서 LF (mEGFP @ LF)에 의한 mRNA 전달 효율과 비교되었다.
도 6은 DhBD3를 매개체로 사용하는 siRNA의 세포 내 전달결과이다.
도 7은 DhBD3와 DhBD2의 비교결과이다. (A) DLS를 사용하여 결정된 DhBD2의 임계 응집체 농도 (CAC)이다. (B) HeLa 세포로 hBDs 및 DhBDs (10mM)의 흡수 효율결과이다. (C) pEGFP @ DhBD, mEGFP @ DhBD 및 siBcl2 @ DhBD의 복합체 비율이다. (D-E) (D) pEGFP @ DhBDs 및 (E) mEGFP @ DhBDs의 세포 내 전달 후 EGFP를 발현하는 HeLa 세포의 유동 세포 계측 분석. (F) siBcl2 @ DhBD의 세포 내 전달 후 HeLa 세포의 생존 가능성. hBD2의 아미노산 서열은 GIGDPVTCLKSGAICHPVFCPRRYKQIGTCGLPGTKCCKKP이다.
도 8은 DhBD3의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼이다. 이량체화된 hBD3는 단량체 -hBD3 (m / z, 5150)을 함유하고 DhBD3의 스펙트럼 영역은 m/z 10302를 갖는다.
도 9는 (A) pEGFP (10ng), (B) mEGFP (2mg) 및 (C) siBcl2 (200nM)와 복합체를 형성한 DhBD3의 1 % 아가로오스겔 분석결과이다.
도 10은 전달 매개체로서 DhBD3 또는 LF를 사용하여 (A) pEGFP 및 (B) mEGFP로 처리 된 HeLa 세포의 유동 세포 계측 프로필이다.
도 11은 pEGFP-N1 벡터 맵이다.

달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 성분, 반응 조건, 성분의 함량을 표현하는 모든 숫자, 값 및/또는 표현은, 이러한 숫자들이 본질적으로 다른 것들 중에서 이러한 값을 얻는 데 발생하는 측정의 다양한 불확실성이 반영된 근사치들이므로, 모든 경우 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 기재에서 수치범위가 개시되는 경우, 이러한 범위는 연속적이며, 달리 지적되지 않는 한 이러한 범 위의 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지의 모든 값을 포함한다. 더 나아가, 이러한 범위가 정수를 지칭하는 경우, 달리 지적되지 않는 한 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지를 포함하는 모든 정수가 포함된다.

본 명세서에 있어서, 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들뿐만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

siRNA, mRNA 및 플라스미드 DNA 등을 포함하는 핵산 시약은 포유동물 세포의 연구등에 있어 중요한 연구 수단이 되고 있으며, 새로운 치료제의 개발에 중요한 역할을 하고 있다. 따라서, 제조하기에 편하고, 세포 투과 효율이 우수하며, 세포독성이 없는 핵산 전달 시약이 요구되고 있다.

본 발명의 발명자들은 베타-디펜신 단백질의 이황하 결합을 통한 이합체가 핵산과의 복합체 형성을 향상시킬 수 있음을 확인하였다. 구체적으로, 인간베타-디펜신의 이합체는 핵산과 함께 거대한 복합체를 형성하며, 이러한 복합체는 DNA-transfection 및 RNA-transfection을 중재하고, 세포를 투과할 수 있음을 확인하였다. 이 중 바람직하게, 인간베타-디펜신 3(hBD3)의 이합체가 세포투과성 펩타이드로 가장 우수함을 확인하였다.

핵산은 표적 특이성과 작은 분자 조절 인자가 결코 제공 할 수 없는 증폭 가능한 활성을 지니고 있지만, 치료용 분자를 위한 기능성 핵산을 이용하는 것은 세포의 불투과성으로 인해 방해 받고 있다. 핵산의 세포 내 전달용 비히클은 다양한 핵산화물에 대한 보편적 적용 가능성, 높은 생체 적합성 및 견고한 생산 방식과 같은 실용적인 용도에 대한 중요한 요구 사항이 있다. 본 발명에서는 핵산 전달에 이상적인 매개체인 이량체 β-defensin 의 가능성을 연구하였다. 인간 β-defensin 3 (hBD3)은 인체에서 본질적으로 발현되는 45-mer 양이온성 항균 펩타이드이며 분자간 β-가닥 상호 작용을 기반으로 이량체화 될 수 있다. 본 발명의 발명자들은 DhBD은 높은 세포 투과 효율과 낮은 세포 독성을 나타냄을 확인하였다. 또한, DhBD3의 다중 양이온 성 잔기는 다양한 핵산과의 복합체 형성 및 복합체화물의 세포 내 전달에 매우 효과적임을 확인하였다. DhBD3에 의한 전달 효율은 상업적으로 이용 가능한 양이온성 지질 기반 형질 감염제인 Lipofectamine에 필적하였다. 임상에서 DhBD3은 높은 생체 적합성을 가진 인간 유래 물질로서 저렴한 방법으로 견고하게 준비 할 수 있으므로 DhBD는 현재의 유전자 전달 시스템의 단점을 극복하고 궁극적으로 치료 핵산을 생존 가능하게 만드는 유망한 유전자 전달 시스템이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford,111(1984)).

본 명세서에서 언급되는 용어 “뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다

이하에서는 본 발명의 다양한 측면을 설명한다.

통상적으로, 세포투과성 펩타이드는 목적 카르고와 비공유결합 또는 공유결합을 통해 연결되어 구성될 수 있다. 특히, 세포투과성 펩타이드와 목적 카르고가 화학적 교차-연결(cross-linking)을 통해 공유결합 컨쥬게이트를 형성하는 것이 바람직하다(Zatsepin, TS, et al., Curr. Pharm. Des., 11: 3639-3654(2005)). 따라서, 본 발명의 펩타이드는 목적 카르고와 공유결합 또는 비공유결합적으로 연결되어 세포 또는 조직 내로 전달시키는 기능을 할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “목적 카르고(cargo of interest)”는 공유결합 또는 비공유결합을 통해 본 발명의 펩타이드와 컨쥬게이트를 이루어 세포 내로 운반되고자 하는 물질을 의미하며, 예를 들어, 화학물질, 나노입자, 펩타이드, 폴리펩타이드, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 및 PNA(peptide-nucleic acid)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 목적 카르고가 폴리펩타이드인 경우, 본 발명의 약물전달체는 본 발명의 펩타이드와 목적 카르고 사이에 링커를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명에서 이용되는 링커로는 당업계에 공지된 다양한 링커를 이용할 수 있다. 상기 링커는 본 발명 펩타이드의 활성, 즉 세포투과 활성을 최대화하기 위하여 특별하게 선택된 길이 및 /또는 서열을 가질 수 있다. 구체적으로는, 상기 링커는 복수의 아미노산 잔기로 이루어진 링커이다.

본 발명의 약물전달체는 다양한 목적으로 이용될 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 약물전달체는 화학물질, 핵산, 나노입자, 등의 물질의 운반에 이용될 수 있으며, 상기 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 및 PNA를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 약물전달체는 운반 대상의 카르고에 따라, 질병 또는 질환의 치료, 특정 세포의 검출, 질병(예컨대, 암)의 진단, 특정 세포의 위치 추적 및 인 비보 이미징 등에 이용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연 의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함할 수 있다

또한, 본 발명의 약물전달체를 구성하는 펩타이드 및 목적 카르고에 대해 다양한 표지 물질이 이용될 수 있으며, 예를 들어 형광물질[예컨대, 플루오레신, FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민 6G(rhodamine6G), 로다민 B(rhodamine B), TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, Texas Red, AlexaFluor, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole) 및 Coumarin], 형광 단백질(fluorescence protein; GFP, RFP, CFP, YFP, BFP, 루시퍼라제 또는 이의 변이체), 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵), 화학물질(예컨대, 바이오틴), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함한다. 본 발명의 약물전달체가 방사능동위원소를 포함하여 구성되는 경우(예컨대, 본 발명의 펩타이드 및 나노입자 구성), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT, Single Photon Emission Computed Tomography) 또는 양전자 방출 단층촬영(PET, Positron Emission Tomography)에 적용되어 조직의 이미징에 이용될 수도 있다.

또한, 본 발명은 상술한 세포투과성 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현벡터를 제공할 수 있다. 보다 상세하게는, 본 발명의 재조합 발현벡터는 (a) 프로모터; 및 (b) 상기 프로모터에 작동적으로 연결된(operatively linked) 서열번호 3 내지 서열번호 4로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이러한 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “프로모터”는 인코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “작동적으로 결합된(operatively linked)”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독(translation)을 조절하게 된다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미 네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 조성물은 비경구 방식으로 투여되는 것이 바람직하다. 비경구 투여를 하는 경우, 정맥내 주입, 피내주입, 병변내(intralesional) 주입, 근육내 주입, 복강내 주입 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 결정될 수 있으며 일반적으로 0.0001-100 mg/kg의 범위일 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 포유동물, 보다 구체적으로는 인간, 마우스, 래트, 기니어 피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개 및 고양이에 적용될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 트랜스펙션 키트(transfection kit)는 외부의 DNA/RNA를 포유동물의 세포 내로 도입이 용이하도록 최적화된 시스템이다. 현재까지 주로 의 트랜스펙션 키트는 칼슘포스페이트법, 지질결합체를 이용하는 방법, 덱스트란 복합체를 이용하는 방법 등이 있으나 이들의 효율성은 1/10⁶ 내지 1/10² 정도이고 세포의 종류에 의존성이 있는 한계가 있다. 이를 극복하기 위해 세포투과성 펩타이드/단백질을 이용한 트랜스펙션 키트를 이용할 수 있다.

본 발명의 트랜스펙션 키트는 추가로 상기 펩타이드와 목적 카르고 간의 링커/결합인자를 추가로 포함할 수 있다. 상기 결합인자는 전사인자 또는 바이러스 단백질을 포함하는 특정 DNA/RNA 서열 또는 단백질 등의 목적 카르고와 결합할 수 있는 단백질 전체 또는 일부를 포함한다. 예를 들어, Gal4는 DNA 결합인자로, 진핵세포생물, 원핵세포 생물, 바이러스에서 널리 사용되는 전사인자이다. DNA/RNA 결합인자는 인 비보 및 인 비트로에서 PTD와 융합단백질을 제조할 수 있는 단백질 발현벡터를 적용하여 이용가능하다. 또한, DNA/RNA 결합인자와 PTD 간의 융합은 화학적 결합, 물리적 공유결합, 또는 비공유 결합에 의해서도 가능하다.

본 발명의 세포투과성 펩타이드와 DNA/RNA과의 융합 컨스트럭트를 만들어 이를 세포 외부에 처리해 주면 효율성과 세포 종류에 의존적인 한계를 극복할 수 있게 된다. 본 발명의 펩타이드와 DNA/RNA 결합인자를 이용하여 인 비보 및 인 비트로에서 다양한 세포의 세포질로 DNA/RNA를 효율적으로 도입할 수 있게 된다. 예를 들어, 전달 방법은 근육내, 복강내, 정맥, 경구, 피하, 피내, 비강내, 흡입을 포함하는 다양한 방법을 통해서 가능할 수 있다. 따라서, 본 발명의 트렌스펙션 키트는 본 발명의 방법에 의해서 유전자 치료와 DNA/RNA 백신에 대한 새로운 방법을 제공할 수 있으며, 일시적 또는 영구적으로 발현이 가능하며 DNA/RNA 백신과 유전자치료와 같은 의학 임상 적용에서 뿐만 아니라 기초 연구의 활용에서도 다양하게 사용될 수 있다.

이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

[반응 시약 및 항체]

본 발명에서는 하기와 같은 항체들이 사용되었다

anti-poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) (# 9542, CST)

anti-caspase-3 (# 9662, CST)

anti-Bcl-2 (# 2872, CST )

anti-β-actin (# 4970, CST, Danvers, MA, USA)

상기 siBcl2 센스 서열은 AGUACAUCCAUUAUAAGCUUU이고, 안티센스 서열은 AGCUUAUAAUGGAUGUACUUU (Bioneer, 한국)이였다.

EGFP mRNA는 TriLink (# L-7601, TriLink, USA)에서 구입하였다.

Lipofectamine (DNA의 경우 lipofectamine 3000, siRNA와 mRNA의 경우 lipofectamineRNAiMAX)는 Invitrogen (Lipofectamine 3000; # L3000-015, LipfectamineRNAiMAX; # 13778-075, Waltham, USA)에서 구입하였다.

pEGFP-N1 벡터는 KIST에서 제공된 벡터를 사용하였으며, 서열은 서열번호 5와 같다.

실시예 1. DhBD3의 특성 확인

본 발명에 있어서, hBD2 펩티드 및 hBD3 펩티드는 고체상 펩타이드 합성에 의해 제조되었다. 상기 베타-디펜신 펩타이드는 Peptron(한국)사에 의해 합성하였다.

PAGE analysis

hBD2 및 hBD3의 구조를 환원 조건 및 비환원 조건하에서 네이티브 PAGE로 분석 하였다.

전기영동을 환원 및 비환원 조건에서 수행하였다. 각 시료에는 25 μM (1 μg)의 펩타이드와 10 μL of 2× 샘플 버퍼가 포함되었다. 또한 환원 조건의 샘플은 2 μL 의 500 mM DTT (50 mM 최종 농도)를 함유하였다. 모든 샘플은 총 부피가 20 μL 로, 0.02% 아세트산으로 희석되었고, 100 °C 에서 5 분 동안 가열되었다. 전체 샘플을 로딩하고 16.5% Tricine gel (#4563065, Bio-Rad, 한국)에서 전기영동을 실행하였다. 상기 겔은 Coomassie 염색약으로 염색되었다.

DhBD3는 tricin-폴리 아크릴 아미드겔에서 이량체의 예상 분자량 (10.3 kDa의) 관련된 이동성을 켰을 때, 그것은 자연 산화 후에 형성 결과 세 분자 내 이황화 결합에 의해 단량체 β-가닥 사이의 상호 작용을 통해 이량화시켰다. DTT와 같은 환원제를 사용하여 디설파이드 결합을 파괴함으로써 DhBD3을 hBD3 (5.15 kDa)로 다시 형질 전환시킬 수 있다 (도 2A).

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry

이량체화는 MALDI-TOF질량 분석에 의해 도 9와 같이 그 특징을 관찰하였다.

Dynamic light scattering (DLS)

DLS에 의해 측정된 DhBD3의 유체 역학적 크기는 615-712 nm로 단량체인 hBD3의 크기보다 훨씬 크기 때문에 DhBD3가 자기 응집 입자를 형성 할 수 있음을 나타낸다(도 2B).

Transmission electron microscopy (TEM)

건조 상태에서 응집체의 크기는 투과 전자 현미경 (TEM)에 의해 대략 200 nm로 확인되었다(도 2B 삽입).

양친매성 단량체 hBD3에서 소수성 잔기를 가진 β-가닥은 다른 β-가닥 펩티드 응집과 유사한 자기 응집을 촉진 할 가능성이 있지만, 단량체의 분자간 소수성 상호 작용은 이량체보다 상대적으로 약하다. 단량체에 비해 이량체는 비교적 높은 응집전위값을 가진다. 이는 HBD3 (> 120 μM) (도 2C)보다 훨씬 높은 DhBD3의 임계 응집 농도 (CAC) (20 μM)에 의해 입증하였다.

실시예 2. DhBD3의 세포 투과특성

본 발명에서는 DhBD3의 세포 투과 특성을 조사하기 위해 HeLa 세포에 Cy5로 표지된 이량체를 처리 하고 유동 세포 계측법을 사용하여 흡수 효율을 분석하였다.

Flow cytometry and cell imaging

hBDs의 세포 흡수를 평가하기 위해, HeLa 세포를 6-well plates (1.0 × 10⁶ cells/well) 상에 시딩하였다. 4시간 후, 세포를 serum-free DMEM 배지에 2회 세척하고 37 ℃에서 지시된 용량 (1, 10 μM)의 혈청 함유 DMEM 배지에서 시료와 함께 항온 배양 하였다. 그런 다음 세포를 인산염 완충 식염수 (PBS)로 2 회 세척하고 37 ℃에서 10 분간 트립신-EDTA 용액 (0.01 % 트립신)에서 배양하여 세포 외 단백질을 소화시키고, ice-cold PBS로 2회 세척한 다음, flow cytometry assays (Guava, USA)를 위해 500 μL 의 ice-cold PBS에 재현탁 하였다.

세포 이미징을 위해 세포를 Cy5-DhBDs로 4 시간 동안 처리하였다. 이어서, 배지를 10 % 소 태아 혈청을 함유하는 배지로 대체하고, 세포를 필터 넘버 4 (Cy5)를 사용하여 Nikon ECLIPSE Ti 현미경으로 라이브 이미지화하였다.

실험 결과, 이량화된 hBD3의 세포 흡수 효율을 크게 향상시켰음을 확인하였다. 단량체인 hBD3와 비교하여, DhBD3은 25 배 더 높은 세포 흡수 효율을 보였다(도 3A). DhBD3으로 처리된 세포의 형광 현미경 이미지에 의해 향상된 흡수 수준이 나타남을 확인하였다(도 3B).

Cell viability assay

Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, 일본)을 사용하여 세포 생존력을 평가 하였다. HeLa 세포 (ATCC)를 96-웰 플레이트에 접종하고, 80 % 컨플루언트까지 배양하고, 10 % 혈청을 함유하는 DMEM에서 24 시간 동안 시료(0-100μM)를 처리 하였다. 그런 다음 WST-1 시약 (10 μL)을 각 웰에 넣고 2 시간 동안 배양했다. 각 웰의 흡광도는 마이크로 플레이트 판독기 시스템 (Molecular Devices, CA, USA)을 사용하여 450-650 nm에서 측정하였다. 세포 생존력은 처리되지 않은 HeLa 세포의 상대 백분율 값으로 나타내었다. 3 회의 실험 결과를 프리즘 소프트웨어 (GraphPad, La Jolla, CA, USA)로 분석 하였다. 데이터는 평균 ± 표준 편차 (SD)로 나타내었다.

실험결과, 세포생존력은 DhBD3의 고농도에 의해 크게 영향을 받지 않았으며, 자기 응집 펩타이드의 낮은 세포 독성을 나타내었음을 확인하였다(도 3C).

Immunogenicity assay

Raw 264.7 세포를 24-웰 플레이트에 접종하고 24 시간 동안 배양하였다. 세포를 80 % 컨플루언트로 성장시키고 양성 대조군으로서 lipopolysaccharides (LPS, 10㎍ / mL)를 처리하였다. 24 시간 동안 세포와 시료 (10 μm)의 인큐베이팅 후, 상등액은 1.5 ML 튜브로 전송하고 4 ℃에서 10 분동안 10,000 × g에서 원심 분리하였다. IL-6의 검출을 위해 마우스 IL-6 ELISA 키트 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하였다. 3 회의 실험 결과를 프리즘 소프트웨어 (GraphPad, La Jolla, CA, USA)로 분석 하였다. 데이터는 평균 ± 표준 편차 (SD)로 나타내었다.

실험결과, 세포내 면역 자극을 확인하기 위해 DhBD3를 대식세포 (RAW264.7)를 처리했을 때, IL-6 수준에 의해 면역 반응을 평가한 경우, DhBD3에 의해 유도된 사이토카인 수준은 매우 낮은 수준으로, DhBD3의 낮은 면역원성을 나타내었음을 확인하였다(도 3D).

이러한 결과는 인간으로부터 유래된 DhBD3가 임상 목적의 전달 수단으로서 잠재적으로 사용될 수 있는 고도의 생체 적합성 물질이라는 것을 보여준다.

실시예 3. DhBD3와 플라스미드 DNA의 복합체 형성

본 발명의 일 측면은 배달 시스템으로 사용가능한 DhBD3의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 발명자들은 특정 세포로의 플라스미드 DNA의 전달을 위한 transfection의 배달 시스템으로 DhBD3가 사용될 수 있는지를 연구하였다.

DhBD3-based transfections and western blot

DhBD3 기반 형질 감염의 웨스턴 블랏 분석을 위해 12-웰 배양 플레이트 (8.0 × 104 세포 / 웰)에 도말된 HeLa 세포를 DhBD3 복합체로 처리하였다. DhBD3 복합체를 serum-free DMEM 배지의 세포에 첨가하고 37 ℃에서 48 시간 동안 배양하였다. 동일한 부피의 serum-free DMEM 배지를 음성 대조군으로서 하나의 플레이트에 첨가 하였다. 배지를 제거하고 세포를 PBS로 2 회 세척 하였다. 세포를 짧게 트립신 처리하고 수집하여 4 ℃에서 1,000 rpm으로 회전시켰다. 생성 된 펠릿을 PBS로 1 회 세정하고, 용해 완충액 (150 mMNaCl, 1% Nonidet P-40, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS, 50 mMTris-HCl, pH 7.4, 10 mM sodium pyrophosphate, 100 mM sodium fluoride, 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 및 1 mM DTT)에 4 ℃에서 10 분 동안 교반하면서 세포를 가용화하여 세포 용해물을 제조하였다. 4 ℃에서 10 분 동안 미세 원심 분리하여 세포 파편을 제거한 후 상층 액 (30 μg / well)을 15 % 및 10 % SDS-PAGE 겔에서 전기 영동으로 분리 한 다음 니트로 셀룰로오스 막으로 옮겼다. 막은 GFP antibody, polyclonal caspase-3 antibody, polyclonal bcl-2 antibody 및 PARP antibody followed by a horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit secondary antibody 로 탐침되었다. 검출 된 단백질은 강화된 화학 발광 및 이미징 시스템 ChemiDoc (Bio-Rad, USA)을 사용하여 시각화 하였다.

확인 결과, DhBD3은 여러 양이온 잔류물을 활용하여 pDNA와 polyanionic DNA복합체를 형성함을 확인하였다. DhBD3에 녹색 형광 단백질을 발현하는 (pEGFP)를 플라스미드 DNA와 복합체를 형성하였다. pEGFP (10 ng)과 DhBD3의 복합체를 형성시켜 (pEGFP @ DhBD3) 아가로스겔 전기영동을 확인한 결과(도 9A)에서 DNA의 이동성이 현저히 저하됨을 확인하였다.

이에, pEGFP @ DhBD3은 추가 실험을 위해 10 μM DhBD3에서 제조되었다(도 4A). DLS에 의해 측정된 pEGFP @ DhBD3 복합체의 유체 역학적 크기는 용액에서 1.99-2.69 μm (도 4b)이었고, TEM 확인 결과 건조 상태의 크기는 약 600 nm이었다 (도 4b, 삽입). HeLa 세포에 pEGFP @ DhBD3으로 처리 한 후, 유동 세포계측법 (flow cytometry)에 의해 형광 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 형질 감염 효율을 확인하였다(도 3A). 처리되지 않은 대조군 세포와 비교하여, pEGFP @ DhBD3로 처리 된 세포는 플라스미드의 성공적인 형질 감염을 나타내는 높은 형광 강도를 나타내었다(도 4C). DhBD3에 의한 형질 전환 효율은 Lipofectamine (pEGFP @ LF)에 의한 효율과 유사 하였다. 대조적으로, naked pEGFP의 형질 감염 효율은 실질적으로 낮았다. 세포에서 EGFP 발현을 western blotting으로 분석했을 때, pEGFP @ DhBD3로 처리 한 세포의 EGFP 수준은 LF (pEGFP @ LF)를 사용한 plasmid로 transfection 한 세포보다 약간 낮았다(그림 4D). 배달시스템이 도입되지 않은 EGFP로 처리된 세포에서의 EGFP 발현은 western blotting에서 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 DhBD3가 플라스미드 DNA를 세포 내로 효율적으로 전달하는 형질 감염 제로 사용될 수 있음을 보여준다.

실시예 4. DhBD3와 mRNA의 복합체 형성

DhBD3가 트랜스펙션을 위해 플라스미드 DNA를 세포에 전달할 수 있다는 것을 발견 한 다음, DhBD3가 전령 RNA (mRNA)의 세포내 전달을 위한 매개체로 사용될 수 있는지 여부를 실험하였다.

EGFP (mEGFP)의 발현을 위한 mRNA는 DhBD3와 복합체를 형성 하였다. pEGFP @ DhBD3 복합체와 유사하게, 겔 전기영동에서 RNA의 실질적으로 감소된 이동성에 의해 mEGFP (2 ㎍)와 DhBD3 (mEGFP @ DhBD3)의 복합체가 입증되었다 (도 9B). DLS로 측정한 mEGFP @ DhBD3의 입자 크기는 2.30 - 2.66 μm이었다(도 5B). TEM 에서, 복합체의 크기는 약 600 nm이었다 (도 5B, 삽입). HeLa 세포를 mEGFP @ DhBD3으로 처리했을 때, EGFP- 양성 세포는 유동 세포 계측법에 의해 분석 될 때 유의하게 증가 하였다(도 3B). mEGFP @ DhBD3에 의해 유도된 EGFP- 양성 세포의 수는 LF (mEGFP @ LF)와 복합된 mEGFP에 의한 것에 비견 될 수 있었다 (도 5C). 그러나, naked mEGFP로 세포를 처리 한 결과 EGFP 양성 세포 수가 적었다. EGFP 발현 수준은 또한 웨스턴 블랏팅에 의해 추정되었다 (도 5D). 유세포 분석 데이터와 일치하여, EGFP 발현은 mEGFP @ DhBD3 및 mEGFP @ LF로 처리 된 세포에서만 관찰되었다. mEGFP @ DhBD3 처리 된 세포의 단백질 수준은 mEGFP @ LF 처리 된 세포의 단백질 수준보다 약간 낮았다.

실시예 5. DhBD3와 siRNA의 복합체 형성

관찰된 mRNA가 DhBD3에 의해 DNA뿐만 아니라 전달 될 수 있다는 것을 관찰함으로써, siRNA와 같은 상대적으로 작은 핵산화물이 DhBD3에 의해 전달 될 수 있는지를 최종적으로 조사했다. Bcl-2의 siRNA 표적 mRNA (siBcl-2)는 DhBD3와 복합체를 형성 하였다. 겔 - 시프트 분석은 siBcl2 (200 nM)가 2 μM의 DhBD3와 완전하게 복합 될 수 있음을 보여 주었다 (도 9C 및 도 6A). DLS로 측정한 DhBD3 (siBcl2 @ DhBD3)와 복합체를 이루는 siBcl2의 입자 크기는 0.95 - 1.10 μm이었다(도 6B). TEM 하에서, 복합체의 크기는 약 200 nm이었다 (도 6B, 삽입).

DhBD3에 의한 siRNA 전달 효율을 시험하기 위해, 우리는 siBcl2 @ DhBD3 복합체로 HeLa 세포를 처리 하였다. Bcl-2 단백질은 미토콘드리아 손상에 의해 유도 된 세포 사멸에 대한 저항성을 직접적으로 제공하기 때문에 siBcl2에 의한 Bcl-2 단백질의 하향 조절은 세포사멸을 일으킨다. siBcl2 @ DhBD3 처리 된 세포는 처리되지 않은 세포와 비교하여 30-40 %의 생존률을 보였다 (도 6C). 유사하게, Bcl-2의 발현 수준 저하 또한 웨스턴 블랏팅에서 관찰되었다 (도 6D). 감소된 Bcl-2는이어서 프로 caspase-3을 세포 사멸 세포 사멸을 마스터 한 절단 caspase-3 활성화시켰다. LF (siBcl2 @ LF)와 복합된 siBcl2에 의해 유도 된 효능과 비교할 때, siBcl2 @ DhBD3 복합체는 유사한 하향 조절 효과를 나타내었다 (도 6C 및 6D). 이러한 결과는 DhBD3가 플라스미드 DNA 및 mRNA뿐만 아니라 siRNA 전달 수단으로 사용될 수 있음을 나타낸다.

이상, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징으로 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Korea Institute of Science Technology <120> Novel cell penetrating peptide comprising beta-defensin dimer and uses thereof <130> K09491_DP-2018-00119 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hBD2 <400> 1 Gly Ile Gly Asp Pro Val Thr Cys Leu Lys Ser Gly Ala Ile Cys His 1 5 10 15 Pro Val Phe Cys Pro Arg Arg Tyr Lys Gln Ile Gly Thr Cys Gly Leu 20 25 30 Pro Gly Thr Lys Cys Cys Lys Lys Pro 35 40 <210> 2 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hBD3 <400> 2 Gly Ile Ile Asn Thr Leu Gln Lys Tyr Tyr Cys Arg Val Arg Gly Gly 1 5 10 15 Arg Cys Ala Val Leu Ser Cys Leu Pro Lys Glu Glu Gln Ile Gly Lys 20 25 30 Cys Ser Thr Arg Gly Arg Lys Cys Cys Arg Arg Lys Lys 35 40 45 <210> 3 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hBD2 <400> 3 ggtataggcg atcctgttac ctgccttaag agtggagcca tatgtcatcc agtcttttgc 60 cctagaaggt ataaacaaat tggcacctgt ggtctccctg gaacaaaatg ctgcaaaaag 120 cca 123 <210> 4 <211> 135 <212> DNA <213> 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Claims

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(a) 인간베타-디펜신 3(hBD3)의 이합체로 이루어진 세포투과성 펩타이드; 및
(b) 상기 펩타이드에 결합된 목적 카르고로서 상기 카르고는 siRNA, mRNA 또는 pDNA인 목적 카르고;를 포함하며,
상기 인간베타-디펜신 3의 이합체는 다이 설파이드 결합을 통해 이합된 것이며,
상기 (a)와 상기 (b)가 공유결합으로 연결된 복합체(complex)형태인, 세포투과성 약물전달체(drug delivery system).
제 9항에 있어서,
상기 약물전달체는 세포질로 투과되는 것인, 약물전달체.
제 9항에 있어서,
상기 약물전달체는 세포독성을 나타내지 않는 것인, 약물전달체.
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제 9항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 약물전달체를 세포에 접촉시키거나 또는 혈액 내로 주입시키는 단계를 포함하는 목적 카르고의 세포 내 전달방법.
제 9항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 약물전달체를 포함하는 목적 카르고 운반용 조성물.
제 9항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 약물전달체를 포함하는 트랜스팩션 키트.
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