CN109456991B - 原儿茶酸调控的开关系统及其调控方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了绿茶代谢物原儿茶酸调控的多功能基因表达平台。所述平台涉及原儿茶酸调控的开关系统,即由原儿茶酸精确调控基因的启动表达或表达关闭,所述开关系统包括原儿茶酸调控的“开”系统和原儿茶酸调控的“关”系统。本发明还提供了包含所述开关系统的真核表达载体、哺乳动物细胞系以及微胶囊。此外,本发明还公开了所述多功能平台可调控胰岛素或胰高血糖素样肽精准表达释放用于糖尿病治疗;该基因表达调控平台可用于构建复杂的生物计算机以及调控CRISPR/Cas9或CRISPR/dCas9系统介导的基因编辑和基因表达激活或抑制。本发明为基因治疗和细胞治疗提供了有力的新型基因表达调控工具。
Description
技术领域
本发明涉及合成生物学,基因、细胞治疗领域,是将哺乳动物合成生物学与疾病治疗、生物计算机以及基因编辑技术相结合,具体涉及绿茶代谢物原儿茶酸调控的多功能基因表达平台和在糖尿病治疗、生物计算机以及调控CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑和基因转录的应用研究。
背景技术
合成生物学作为新兴的研究领域,致力于将自然界存在的基本生物学元件,如核酸、多肽、蛋白质等,通过人工手段对其进行有目的地设计、改造以及组建,形成具有特定功能的生物模块,从而实现对细胞、生物体的功能改造。在过去的几十年里,合成生物学经历了快速的发展阶段,从单基因、单蛋白的活性调控到多基因、多蛋白的活性调控,从简单线路的合成到复杂基因网络的合成,从对原核生物的改造到真核生物的改造,从概念式的基因网络设计到应用式的基因环路开发等。总的来说,合成生物学正以更为精确的、安全的、可预测的方式调控复杂的细胞行为,并将其应用于能源、医药开发以及疾病治疗等各个领域。
本发明公开的原儿茶酸调控的开关系统是以原儿茶酸(PCA)为诱导物,其优势在于PCA分布广泛,存在于广枣、丹参等中草药中,同时也是花青素和茶多酚的主要代谢产物;其次据研究表明PCA具有抗癌、抗氧化、抗炎症、降血糖等多种功效,是一种健康安全的有益小分子物质。因此,本发明开发了原儿茶酸调控的多功能基因表达平台,并将其应用于糖尿病治疗,生物计算机以及调控CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑和基因转录。
糖尿病是一种常见的代谢类疾病,现已成为威胁全球人类健康的慢性流行性疾病之一。目前主要的治疗方法主要包括外科治疗如胃的改造,药物治疗如注射胰岛素、口服降糖药,运动治疗和控制饮食治疗等,但这些治疗方法存在疗效差,增加病人痛苦等问题,因此亟需开发一些新的方法改善糖尿病治疗所面临的困境。此外,生物计算机和基因编辑技术是近几年兴起的基于基因和细胞水平的治疗方式。研究表明相较于传统的治疗手段,这些新的治疗方式尤其在治疗复杂的免疫相关疾病、难治愈的癌症和遗传性疾病方面具有更大的应用潜力。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷,本发明利用哺乳动物合成生物学的手段,提供了一种治疗糖尿病的新方法,即利用原儿茶酸调控的治疗基因环路表达降血糖肽来控制血糖稳态,从而达到治疗糖尿病的目的。本发明在哺乳动物细胞中开发了一套以原儿茶酸和香草酸为双输入端的逻辑门,同时利用CRIRPR/Cas9基因编辑技术合成了原儿茶酸调控的基因编辑和基因转录表达装置,用于调控内、外源基因激活、抑制和编辑。
本发明提供了一种绿茶代谢物原儿茶酸调控的多功能基因表达平台,其中所述平台是以原儿茶酸调控的开关系统(原儿茶酸诱导基因表达系统)为核心,即由原儿茶酸精确调控基因的启动表达或表达关闭,并将其应用于糖尿病治疗,生物计算机以及调控CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑和基因转录。
其中,本发明所述的原儿茶酸调控的开关系统,即由原儿茶酸精确调控基因的启动表达或关闭表达,所述系统包括:a):原儿茶酸调控的“开”系统;和/或,b):原儿茶酸调控的“关”系统。其中,所述原儿茶酸调控的“开”系统是由重组转录抑制子,原儿茶酸诱导型强启动子和待转录序列三部分组成;所述原儿茶酸调控的“关”系统是由重组转录激活子,原儿茶酸诱导型弱启动子和待转录序列三部分组成。
其中,“开”系统中所述的重组转录抑制子为重组转录抑制子KRAB-PcaV,是由转录抑制蛋白KRAB(Krueppe1-associated box protein)(氨基酸序列Genebank登录号:CAA36558)融合至DNA结合域上获得,并由强启动子持续表达。所述转录抑制蛋白KRAB可以为人源的;所述DNA结合域是来源于原儿茶酸操纵子系统的阻遏蛋白PcaV(氨基酸序列Genebank登录号:4G9Y_A);其中,PcaV是来源于天蓝色链霉菌原儿茶酸操纵子系统的阻遏蛋白。
优选地,所述的重组转录抑制子KRAB-PcaV可由不同种类的强启动子启动表达,主要包括PSV40(其核苷酸序列Genebank登录号:KY053832)、PhCMV(其核苷酸序列Genebank登录号:KY199427)、PhEF1α(其核苷酸序列Genebank登录号:AY043301)、PCAG(其核苷酸序列Genebank登录号:HQ456319)等。
其中,“开”系统中所述的原儿茶酸诱导型强启动子是通过强启动子3’端紧接着PcaV操纵子结合位点构成;所述PcaV操纵子结合位点是来源于原儿茶酸操纵子系统的操纵子元件OPcaV,所述的融合型强启动子可驱动下游基因的表达。所述操纵子系统是由阻遏蛋白PcaV和操纵子元件OpcaV组成,其最初是从天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor中分离得到,并受到原儿茶酸的严格调控。
优选地,所述的原儿茶酸诱导型强启动子根据强启动子的种类和操纵子OpcaV的不同拷贝数可组成不同类型的融合型强启动子,包括:a)SEQ ID NO.1所示的原儿茶酸诱导型强启动子PPcaR1核苷酸序列PPcaR1(PSV40-OPcaV);b)SEQ ID NO.2所示的原儿茶酸诱导型强启动子PPcaR2核苷酸序列PPcaR2(PSV40-(OPcaV)2);c)SEQ ID NO.3所示的原儿茶酸诱导型强启动子PPcaR3核苷酸序列PPcaR3(PSV40-(OPcaV)3);d)SEQ ID NO.4所示的原儿茶酸诱导型强启动子PPcaR4核苷酸序列PPcaR4(PSV40-(OPcaV)4);e)SEQ ID NO.5所示的原儿茶酸诱导型强启动子PPcaR5核苷酸序列PPcaR5(PSV40-(OPcaV)5);f)SEQ ID NO.6所示的原儿茶酸诱导型强启动子PPcaR6核苷酸序列PPcaR6(PhCMV-OPcaV);g)SEQ ID NO.7所示的原儿茶酸诱导型强启动子PPcaR7核苷酸序列PPcaR7(PhCMV-(OPcaV)2)h);SEQ ID NO.8所示的原儿茶酸诱导型强启动子PPcaR8核苷酸序列PPcaR8(PhCMV-(OPcaV)3);i)SEQ ID NO.9所示的原儿茶酸诱导型强启动子PPcaR9核苷酸序列PPcaR9(PhCMV-(OPcaV)4);以及j)SEQ ID NO.10所示的原儿茶酸诱导型强启动子PPcaR10核苷酸序列PPcaR10(PhCMV-(OPcaV)5)等。
其中,“开”系统中所述的待转录序列可以是单一编码表达报告蛋白如SEAP(氨基酸序列Genebank登录号:AIR09509)、EGFP(氨基酸序列Genebank登录号:AFA52654)、d2EYFP(氨基酸序列Genebank登录号:AGJ84357)或功能型蛋白如SEQ ID NO.11所示的胰高血糖素样肽GLP-1-Fc氨基酸序列、SEQ ID NO.12所示的胰岛素的氨基酸序列(鼠源)的氨基酸序列等,也可以是编码同时表达报告基因和功能蛋白的基因序列如SEAP-P2A-mINS、GLP-1-Fc-P2A-SEAP、EGFP-P2A-mINS、GLP-1-Fc-P2A-EGFP等。
其中,“开”系统可精确调控胰高血糖素样肽和胰岛素的表达,所述表达降血糖肽和胰岛素的构建方式有:GLP-1-Fc-P2A-SEAP、GLP-1-Fc-P2A-EGFP、SEAP-P2A-mINS、EGFP-P2A-mINS等。
其中,在所述的原儿茶酸调控的开关系统中,所述的原儿茶酸调控的“开”系统分别由人工设计、合成的双质粒系统装载,所述双质粒系统中涉及的序列详见附表1。
其中,“关”系统中所述的重组转录激活子是由PcaV蛋白融合到转录激活蛋白上获得。优选地,所述转录激活蛋白包括单纯疱疹病毒颗粒蛋白VP16转录激活结构域(氨基酸序列Genebank登录号:AEX37895)、NF-KB p65亚基转录激活结构域(氨基酸序列Genebank登录号:ABK40095)、热休克转录因子HSF1转录激活域(氨基酸序列Genebank登录号:BAM10893)等。
优选地,所述的重组转录激活子可由不同种类的强启动子启动持续表达,包括PSV40、PhCMV、PhEF1α、PCAG等。
其中,“关”系统中所述的原儿茶酸诱导型弱启动子是由弱启动子PhCMVmin 5’端紧接着PcaV操纵子结合位点OPcaV构成。在无转录激活子的作用下,所述的原儿茶酸诱导型弱启动子(融合型弱启动子)不表达或几乎不表达下游的待转录核酸序列。
优选地,“关”系统中所述的诱导型弱启动子根据操纵子OpcaV的不同拷贝数可组成不同类型的融合启动子包括:a)SEQ ID NO.13所示的原儿茶酸诱导型弱启动子PPcaA1核苷酸序列PPcaA1(OPcaV-PhCMVmin);b)SEQ ID NO.14所示的原儿茶酸诱导型弱启动子PPcaA2核苷酸序列PPcaA2((OPcaV)2-PhCMVmin);c)SEQ ID NO.15所示的原儿茶酸诱导型弱启动子PPcaA3核苷酸序列PPcaA3((OPcaV)3-PhCMVmin);d)SEQ ID NO.16所示的原儿茶酸诱导型弱启动子PPcaA4核苷酸序列PPcaA4((OPcaV)4-PhCMVmin);e)SEQ ID NO.17所示的原儿茶酸诱导型弱启动子PPcaA5核苷酸序列PPcaA5((OPcaV)5-PhCMVmin)等。
其中,在所述原儿茶酸调控的开关系统中,所述的原儿茶酸“关”系统分别由人工设计、合成的双质粒系统装载,所述质粒系统中涉及的序列详见附表1。
本发明中,所述原儿茶酸调控的开关系统在体内的调控方式可通过注射或口服摄入原儿茶酸来实现,主要包括:a)注射原儿茶酸纯品;b)饮用绿茶。
本发明还提供了一种原儿茶酸调控的“开”系统,所述“开”系统是由重组转录抑制子,原儿茶酸诱导型强启动子和待转录序列三部分组成。
本发明还提供了一种所述原儿茶酸调控的“开”系统在诱导基因表达中的应用。
本发明还提供了一种原儿茶酸诱导基因表达的调控方法,所述方法是由原儿茶酸调控的“开”系统进行调控。其中,所述原儿茶酸“开”系统诱导基因表达的调控方式如图1所示。当原儿茶酸诱导物不存在时,所述重组转录抑制子可结合至所述原儿茶酸诱导型强启动子上,进而阻遏下游待转录序列的表达;而当原儿茶酸诱导物存在时,原儿茶酸阻断其结合,使所述重组转录抑制子从所述原儿茶酸诱导型强启动子上解离下来,启动下游待转录序列的表达。
本发明还提供了一种原儿茶酸调控的“关”系统,所述“关”系统是由重组转录激活子,原儿茶酸诱导型弱启动子和待转录序列三部分组成。
本发明还提供了一种所述原儿茶酸调控的“关”系统在关闭基因表达中的应用。
本发明还提出了一种原儿茶酸关闭基因表达的调控方法,所述方法是由原儿茶酸调控的“关”系统进行调控。其中,所述原儿茶酸调控的“关”系统关闭基因表达的调控方式如图10所示。当原儿茶酸诱导物不存在时,所述的重组转录激活子可结合至所述的原儿茶酸诱导型弱启动子上,进而激活下游待转录序列的表达;而当原儿茶酸诱导物存在时,原儿茶酸解除其结合,使重组转录激活子从诱导型弱启动子上解离下来,关闭下游待转录序列的表达。
本发明还提供了含有原儿茶酸调控的“开”和/或“关”系统的真核表达载体。
本发明还提供了含有原儿茶酸调控的“开”和/或“关”系统的工程化细胞;其中,所述工程化细胞为动物细胞系(优选哺乳动物细胞系);优选地,所述哺乳动物细胞系主要包括HEK-293T、hMSC-hTERT、Hana3A、HeLa等。
本发明还提供了一种微胶囊,所述微胶囊包裹所述原儿茶酸调控的“开”系统、原儿茶酸调控的“关”系统、或所述工程化细胞,其含有所述原儿茶酸调控的“开”和/或“关”系统的工程化细胞。其中,所述微胶囊是由海藻酸-多聚赖氨酸-海藻酸(Alginate-Polylysine-Alginate-membrane)形成的一种半透膜,它能允许小分子物质的自由通透,如细胞生长所需的营养物质、诱导物原儿茶酸等,同时能拦截大于75kD的大蛋白如免疫球蛋白、白蛋白等自由通透。所述微胶囊的特性既能保证胶囊内细胞的正常生长,又能巧妙地避开体内免疫系统的攻击。并且,所述胶囊还能保证细胞产生的效应分子或蛋白可分泌至胶囊外,行使其功能。
本发明中,所述含有原儿茶酸调控的“开”和/或“关”系统的工程化细胞均可进行包裹形成微胶囊,再将其移植至小鼠腹腔内,当通过注射原儿茶酸纯品或饮用绿茶均能剂量依赖性地调控报告基因的启动表达或关闭表达。
本发明还提供了原儿茶酸调控的多功能基因表达平台、所述原儿茶酸调控的“开”系统、所述真核表达载体、所述工程化细胞或所述微胶囊在糖尿病治疗上的应用,所述糖尿病治疗的应用是通过注射原儿茶酸诱导原儿茶酸调控的开关系统表达降血糖肽的方法实现(通过改造原儿茶酸调控的“开”系统,使其通过注射原儿茶酸诱导产生降血糖肽的方法实现,即,所述治疗方法是利用原儿茶酸调控的“开”系统精确调控胰岛素和GLP-1-Fc的表达来分别治疗I和II型糖尿病),所述多功能平台可调控胰岛素或胰高血糖素样肽精准表达释放用于糖尿病治疗。
本发明还提供了一种所述原儿茶酸调控的多功能基因表达平台在小鼠体内调控血糖的方法,所述方法包括以下步骤:
a)人工构建含有原儿茶酸诱导GLP-1-Fc或胰岛素表达调控系统的哺乳动物细胞表达载体;
b)制备含有原儿茶酸诱导GLP-1-Fc或胰岛素表达调控系统的工程化细胞;
c)制备微胶囊,其内部包裹原儿茶酸诱导GLP-1-Fc或胰岛素表达调控系统的工程化细胞;
d)所述微胶囊以腹腔注射的形式移植至糖尿病模型鼠体内;
e)小鼠体内通过注射原儿茶酸纯品诱导其工程化细胞表达GLP-1-Fc或胰岛素,并释放至血液中以达到降血糖的目的。
本发明还提供了一种治疗糖尿病的新方法,通过所述原儿茶酸调控的多功能基因表达平台、所述原儿茶酸调控的“开”系统、所述真核表达载体、所述工程化细胞或所述微胶囊,采用注射或口服摄入原儿茶酸(或其纯品)的方式便可达到降血糖的效果。
本发明所述的原儿茶酸调控的多功能基因表达平台、所述原儿茶酸调控的“开”系统、所述真核表达载体、所述工程化细胞或所述微胶囊也可用于其它疾病的治疗,即通过表达不同治疗功能的药物蛋白来实现不同疾病的治疗。
本发明还提供了原儿茶酸调控的多功能基因表达平台、所述原儿茶酸调控的“开”系统、所述原儿茶酸调控的“关”系统、所述真核表达载体、所述工程化细胞或所述微胶囊在生物计算上的应用,可用于构建复杂的生物计算机;所述生物计算机的应用是通过合成一套双输入信号为原儿茶酸和香草酸的逻辑门实现的;其中所述的逻辑运算包括:A不包括B(A NIMPLY B),B不包括A(B NIMPLY A),与门(AND),或门(OR)以及或非门(NOR)。
其中,所述A不包括B(A NIMPLY B)的逻辑运算中,只有当A信号原儿茶酸输入而B信号香草酸不输入时才有信号d2EYFP的输出;所述B不包括A(B NIMPLY A)的逻辑运算中,只有当A信号原儿茶酸不输入而B信号香草酸输入时才有信号d2EYFP的输出;所述与门的逻辑运算中,只有当A信号原儿茶酸和B信号香草酸同时输入时才有信号d2EYFP的输出;所述或门的逻辑运算中,当其中一个A信号原儿茶酸或B信号香草酸输入时就会有信号d2EYFP的输出;所述或非门的逻辑运算中,只有当A信号原儿茶酸和B信号香草酸都不输入时才有信号d2EYFP的输出。
本发明还提供了原儿茶酸调控的多功能基因表达平台、所述原儿茶酸调控的“开”系统、所述原儿茶酸调控的“关”系统、所述真核表达载体、所述工程化细胞或所述微胶囊在基因编辑及基因转录调控上的应用,所述基因编辑及基因转录调控的应用是通过合成原儿茶酸调控CRISPR/Cas9或CRISPR/dCas9系统介导的基因编辑和基因表达激活或抑制的装置实现的;其中所述的调控装置包括:原儿茶酸调控基因的抑制表达装置(pCRISPRi),原儿茶酸调控基因的激活表达装置(pCRISPRa)以及原儿茶酸调控基因的删除装置(pCRISPRd)。
其中,所述原儿茶酸调控基因的抑制表达装置是通过原儿茶酸诱导dCas9-KRAB(dCas9氨基酸序列Genebank登录号:BAV54120)和gRNA的表达来调控外源基因SEAP和内源基因CXCR4、TP53的表达;所述原儿茶酸调控基因的激活表达装置是通过原儿茶酸诱导gRNA(MS2)和MS2-p65-HSF(MS2氨基酸序列Genebank登录号:NP_040648)的表达来调控外源基因SEAP和内源基因ASCL1、PDX1的表达;所述原儿茶酸调控基因的删除装置是通过诱导gRNA的表达来调控内源基因CCR5、EMX1的删除或纠正外源报告基因的移码突变。
本发明所述的原儿茶酸调控的“开”和“关”系统均具有微调性、可逆性的表达动力学特征。其中,所述的微调性是指下游的基因表达均受原儿茶酸的精准调控,并呈现出剂量依赖性的关系;所述的可逆性是指原儿茶酸调控基因表达的整个过程是可逆的,可以通过控制原儿茶酸的存在与否实现基因表达的开启或关闭。
本发明的有益效果在于,(1)本发明首次人工设计合成原儿茶酸调控的“开”和“关”的基因表达系统,所述系统均可被上载到哺乳动物细胞中并执行相应指令,并通过调节原儿茶酸来实现时空可控的转基因表达。(2)本发明所使用的基因表达调控开关的诱导物原儿茶酸是一种具有抗氧化、抗炎症、降血糖等多种功效的小分子物质,相较于现有的基因开关诱导分子抗生素或防腐剂更健康安全;且原儿茶酸是绿茶中的茶多酚在体内主要代谢产物,因而可通过饮用绿茶的方式调控体内的基因表达。(3)本发明合成了原儿茶酸调控的多功能基因表达平台,所述调控平台可用于疾病治疗,生物计算机以及调控CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑和基因转录;通过注射原儿茶酸调控降血糖肽表达用于糖尿病治疗的新方法;利用微胶囊技术,将含有原儿茶酸诱导GLP-1-Fc或胰岛素表达系统的工程化细胞移植至糖尿病模型鼠中,当小鼠直接腹腔注射原儿茶酸后,即可激活基因开关表达GLP-1-Fc或胰岛素,从而达到降血糖治疗糖尿病的目的。(4)本发明的多功能表达平台应用于糖尿病治疗上,在治疗后的第一天就有明显的降血糖效果,因此可以确定原儿茶酸调控系统的降血糖效果不是由单纯注射PCA所引起的。
附图说明
图1是原儿茶酸调控的“开”系统及调控方法的原理示意图。
图2是原儿茶酸调控的“开”系统的优化研究,即由PSV40启动表达KRAB-PcaV的表达载体分别和10种不同的响应元件进行组合的实验结果。
图3是原儿茶酸调控的“开”系统的优化研究,即由PhEF1α启动表达KRAB-PcaV的表达载体分别和10种不同的响应元件进行组合的实验结果。
图4是原儿茶酸调控的“开”系统的优化研究,即由PCAG启动表达KRAB-PcaV的表达载体分别和10种不同的响应元件进行组合的实验结果。
图5是原儿茶酸调控的“开”系统在不同哺乳动物细胞系中调控表达的实验结果。
图6是原儿茶酸调控的“开”系统具有微调性的表达动力学特征的实验结果。
图7是原儿茶酸调控的“开”系统具有可逆性的表达动力学特征的实验结果。
图8是在原儿茶酸调控的“开”系统中,不同的原儿茶酸孵育时间对其基因表达影响的实验结果。
图9是原儿茶酸调控的“开”系统在野生型鼠体内调控报告基因SEAP表达的实验结果。
图10是原儿茶酸调控的“关”系统及调控方法的原理示意图。
图11是原儿茶酸调控的“关”系统的优化研究,即由PSV40启动表达KRAB-PcaV的表达载体分别和5种不同的响应元件进行组合的实验结果。
图12是原儿茶酸调控的“关”系统在不同哺乳动物细胞系中调控表达的实验结果。
图13是原儿茶酸调控的“关”系统具有微调性的表达动力学特征的实验结果。
图14是原儿茶酸调控的“关”系统具有可逆性的表达动力学特征的实验结果。
图15是原儿茶酸调控的“关”系统在野生型鼠体内调控报告基因SEAP表达的实验结果。
图16是原儿茶酸诱导胰岛素表达系统在1型糖尿病鼠体内调控胰岛素表达的实验结果。
图17是原儿茶酸诱导胰岛素表达系统在1型糖尿病鼠中糖耐受的实验结果。
图18是原儿茶酸诱导胰高血糖素表达系统在2型糖尿病鼠体内调控胰高血糖素表达的实验结果。
图19是原儿茶酸诱导胰高血糖素表达系统在2型糖尿病鼠中糖耐受的实验结果。
图20是原儿茶酸诱导胰高血糖素表达系统在2型糖尿病鼠中胰岛素耐受的实验结果。
图21是原儿茶酸和香草酸为双输入信号的五种逻辑门在哺乳动物细胞中的运算结果。
图22是原儿茶酸调控基因的抑制表达装置(pCRISPRi)在HEK-293T细胞中调控外源基因SEAP抑制表达的实验结果。
图23是原儿茶酸调控基因的抑制表达装置(pCRISPRi)在HEK-293T细胞中调控内源基因TP53抑制表达的实验结果。
图24是原儿茶酸调控基因的抑制表达装置(pCRISPRi)在HEK-293T细胞中调控内源基因CXCR4抑制表达的实验结果。
图25是原儿茶酸调控基因的激活表达装置(pCRISPRa)在HEK-293T细胞中调控外源基因SEAP抑制表达的实验结果。
图26是原儿茶酸调控基因的激活表达装置(pCRISPRa)在HEK-293T细胞中调控内源基因ASCL1抑制表达的实验结果。
图27是原儿茶酸调控基因的激活表达装置(pCRISPRa)在HEK-293T细胞中调控内源基因PDX1抑制表达的实验结果。
图28是原儿茶酸调控基因的删除装置(pCRISPRd)在HEK-293T细胞中调控移码突变的EGFP矫正得以重新表达的实验结果。
图29是原儿茶酸调控基因的删除装置(pCRISPRd)在HEK-293T细胞中调控内源基因EMX1删除的实验结果。
图30是原儿茶酸调控基因的删除装置(pCRISPRd)在HEK-293T细胞中调控内源基因CCR5删除的实验结果。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图,对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等,除以下专门提及的内容之外,均为本领域的普遍知识和公知常识,本发明没有特别限制内容。
实施例1,原儿茶酸调控的开关系统的构建
本实施例中包含了原儿茶酸调控的开关系统所涉及质粒载体的构建方法,但不对本发明的保护范围有所界定。详细设计方案及步骤见附表1。
实施例2,原儿茶酸调控的“开”系统在HEK-293T细胞中的优化研究,即利用PSV40启动表达KRAB-PcaV的表达载体分别和10种不同的响应元件进行组合优化。
第一步,质粒构建。本实例中的质粒构建详见附表1。
第二步,细胞接种。转染前一天将HEK-293T细胞以每孔5×10^4个的细胞量接种于24孔板中,每孔加入500μl含10%FBS的DMEM培养基。
第三步,质粒转染。本实施例的转染体系可分为10组,包括pJY18和pJY1,pJY18和pJY2,pJY18和pJY3,pJY18和pJY4,pJY18和pJY5,pJY18和pJY13,pJY18和pJY14,pJY18和pJY15,pJY18和pJY16,pJY18和pJY17。将上述每组质粒按总量为200ng,1:1的比例与转染试剂PEI(质粒与PEI质量比1:3)进行预混,溶于50ul无血清无抗生素的DMEM中。静止15分钟后,将DNA-PEI预混液滴加至每孔细胞中。
第四步,加入诱导剂。转染6h后,撤去原来的培养基,加入含有500μM原儿茶酸和10%FBS的新鲜培养基DMEM。
第五步,检测报告基因SEAP的表达量。48h后,收集细胞上清液,并置于65℃烘箱内加热30分钟以除去内源性的碱性磷酸酶。然后,按照每孔100μl 2xbuffer液和20μl pNPP底物的比例预混检测工作液并置于37℃培养箱中进行预热。细胞上清液加热30min后,吸取80μl的上清液至96孔板中,并加入120μl预混的检测工作液,然后将板快速置于酶标仪上,在405nM处检测样品的吸光值(连续检测10次,每次间隔1分钟)。最后,以检测时间为横坐标,对应吸光值为纵坐标绘制并计算出曲线斜率。计算酶活的公式为:酶活=曲线的斜率x256.8(单位:U/L)。
实验结果(见图2)显示上述原儿茶酸调控的“开”系统的不同优化组合均能激活报告基因SEAP的表达,但系统所产生的诱导效果各不相同,其中,pJY18和pJY3的组合诱导倍数最佳。
实施例3,原儿茶酸调控的“开”系统在HEK-293T细胞中的优化研究,即利用PhEF1α启动表达KRAB-PcaV的表达载体分别和10种不同的响应元件进行组合优化。
第一步,质粒构建。本实例中的质粒构建详见附表1。
第二步,细胞接种(具体步骤同实施例2)。
第三步,质粒转染。本实施例的转染体系可分为10组,包括pJY29和pJY1,pJY29和pJY2,pJY29和pJY3,pJY29和pJY4,pJY29和pJY5,pJY29和pJY13,pJY29和pJY14,pJY29和pJY15,pJY29和pJY16,pJY29和pJY17。将上述每组质粒按总量为200ng,1:1的比例与转染试剂PEI(质粒与PEI质量比1:3)进行预混,溶于50ul无血清无抗生素的DMEM中。静止15分钟后,将DNA-PEI预混液滴加至每孔细胞中。
第四步,加入诱导剂(具体步骤同实施例2)。
第五步,检测报告基因SEAP的表达量(具体步骤同实施例2)。
实验结果(见图3)显示上述原儿茶酸调控的“开”系统的不同优化组合均能激活报告基因SEAP的表达,但系统所产生的诱导效果各不相同,其中,pJY29和pJY17的组合诱导倍数最佳。
实施例4,原儿茶酸调控的“开”系统在HEK-293T细胞中的优化研究,即利用PCAG启动表达KRAB-PcaV的表达载体分别和10种不同的响应元件进行组合优化。
第一步,质粒构建。本实例中的质粒构建详见附表1。
第二步,细胞接种(具体步骤同实施例2)。
第三步,质粒转染。本实施例的转染体系可分为10组,包括pJY19和pJY1,pJY19和pJY2,pJY19和pJY3,pJY19和pJY4,pJY19和pJY5,pJY19和pJY13,pJY19和pJY14,pJY19和pJY15,pJY19和pJY16,pJY19和pJY17。将上述每组质粒按总量为200ng,1:1的比例与转染试剂PEI(质粒与PEI质量比1:3)进行预混,溶于50ul无血清无抗生素的DMEM中。静止15分钟后,将DNA-PEI预混液滴加至每孔细胞中。
第四步,加入诱导剂(具体步骤同实施例2)。
第五步,检测报告基因SEAP的表达量(具体步骤同实施例2)。
实验结果(见图4)显示上述原儿茶酸调控的“开”系统的不同优化组合均能激活报告基因SEAP的表达,但系统所产生的诱导效果各不相同,其中,pJY19和pJY4的组合诱导倍数最佳。
实施例5,原儿茶酸调控的“开”系统在不同哺乳动物细胞系中的工作情况研究。
第一步,质粒构建。本实例中的质粒构建详见附表1。
第二步,细胞接种(具体步骤同实施例2)。本实例中所涉及的哺乳动物细胞系包括:HEK-293T、hMSC-hTERT、Hana3A、HeLa细胞系。
第三步,质粒转染。将质粒pJY29和pJY14按总量为200ng,1:1的比例与转染试剂PEI(质粒与PEI质量比1:3)进行预混,溶于50ul无血清无抗生素的DMEM中。静止15分钟后,将DNA-PEI预混液滴加至每孔细胞中。
第四步,加入诱导剂(具体步骤同实施例2)。
第五步,检测报告基因SEAP的表达量(具体步骤同实施例2)。
实验结果(见图5)表明原儿茶酸调控的“开”系统在上述哺乳动物细胞系中均能诱导基因表达,但不同细胞系其系统工作情况不同,其中在HEK-293T中,其系统诱导效果最佳。
实施例6,筛选并测定含有原儿茶酸调控的“开”系统的稳定细胞系。
第一步,质粒构建。本实例中的质粒构建详见附表1。
第二步,HEK-293T细胞接种(具体步骤同实施例2)。
第三步,质粒转染。将质粒pJY29、pJY14、pJY60按总量为200ng,10:10:1的比例与转染试剂PEI(质粒与PEI质量比1:3)进行预混,溶于50ul无血清无抗生素的DMEM中。静止15分钟后,将DNA-PEI预混液滴加至每孔细胞中。
第四步,重新接种细胞并加入抗生素进行筛选。转染6h后,将每孔细胞通过胰酶消化重新接种于10cm2皿中,并加入1ug/ml的嘌呤霉素进行筛选。2周之后,挑选单克隆细胞系于24孔板中进行扩增。
第五步,鉴定单克隆细胞系的正确性。将扩增好的各个单克隆细胞系接种于24孔板中,其中实验组加入500uM的原儿茶酸诱导剂。加药48小时后检测报告基因SEAP的表达量(具体步骤同实施例2)。最后,将测试效果佳的稳定细胞系进行扩增、保存。
实施例7,原儿茶酸调控的“开”系统的稳定细胞系具有微调性的表达动力学特征研究。
第一步,将实例6筛选获得调控最佳的稳定细胞系HEKON29按每孔5×10^4个的细胞量接种于24孔板中,每孔加入500ul含有不同浓度原儿茶酸诱导剂和10%FBS的新鲜培养基DMEM。
第二步,检测报告基因SEAP的表达量(具体步骤同实施例2)。
实验结果(见图6)显示原儿茶酸调控的“开”系统的稳定细胞系受原儿茶酸的精确调控,即剂量依赖性地诱导基因表达,进而表明其稳系具有微调性的表达动力学特征。
实施例8,原儿茶酸调控的“开”系统稳定细胞系具有可逆性的表达动力学特征研究。
第一步,将实例6筛选获得调控最佳的稳定细胞系HEKON29按每孔5×10^4个的细胞量接种于24孔板中。
第二步,在第0天,“ON-OFF-ON”实验组加入500uM的原儿茶酸;第2天,撤去原有的培养基,加入不含诱导剂的DMEM;第4天,重新将培养基更换为含有500uM原儿茶酸的DMEM。与此同时,每隔12h吸取细胞上清液检测报告基因SEAP的表达量。而“OFF-ON-OFF”实验组则在第0天加入不含诱导剂的DMEM;第2天,加入500uM的原儿茶酸;第4天,重新将培养基更换为不含诱导剂的DMEM。同样地,每隔12h吸取细胞上清液检测报告基因SEAP的表达量(具体步骤同实施例2)。
实验结果(见图7)表明通过控制原儿茶酸的存在与否可以实现其系统基因表达的开启或关闭,说明原儿茶酸调控的“开”系统的稳定细胞系具有良好的可逆性。
实施例9,在原儿茶酸调控的“开”系统中,原儿茶酸的不同诱导时间控制其基因表达的研究。
第一步,质粒构建。本实例中的质粒构建详见附表1。
第二步,HEK-293T细胞接种(具体步骤同实施例2)。
第三步,质粒转染(具体步骤同实施例5)。
第四步,转染6h后,撤去原来的培养基,实验组加入含有500uM原儿茶酸和10%FBS的新鲜培养基DMEM。严格控制原儿茶酸的不同孵育时间分别为(0h、1h、4h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h),同时在6h、12h、24h、36h、48h、72h的时间点收集细胞上清检测报告基因SEAP的表达量(具体步骤同实施例2)。
实验结果(见图8)表明系统的基因表达量受到原儿茶酸孵育时间的调控,即说明原儿茶酸调控的“开”系统具有良好的可控性。
实施例10,原儿茶酸调控的“开”系统在野生型鼠体内调控报告基因SEAP的表达研究。
第一步,准备细胞。将生长状态良好的原儿茶酸调控的“开”系统稳定细胞系HEKON29培养在含1ug/ml嘌呤霉素、10%FBS的DMEM培养基。
第二步,微胶囊制备。收集细胞,利用微胶囊造粒仪对其包裹,形成含有原儿茶酸调控的“开”系统稳定细胞系的胶囊微球。每个微胶囊含有200个细胞,直径大小为200μm。
第三步,微胶囊体内移植。将微胶囊通过腹腔注射的方式移植至野生型小鼠体内,每只小鼠体内平均移植2x10^6个细胞。
第四步,给药。给药方式分为两种:通过腹腔注射的形式注射不同浓度的原儿茶酸,每天注射3次;通过灌胃的方式饮用绿茶浸出液,每天灌胃3次。
第五步,检测小鼠体内SEAP的表达量。给药48h后,通过眼眶取血的方式收集小鼠血清,采用罗氏的SEAP报告基因化学发光检测试剂盒(Roche Diagnostics;Cat.no.11779842001)。
实验结果(见图9)显示原儿茶酸调控的“开”系统在野生型鼠体内能精准调控基因表达,除直接注射原儿茶酸纯品之外,通过饮用绿茶即利用绿茶中茶多酚产生的原儿茶酸代谢物也可激活系统的表达。
实施例11,原儿茶酸调控的“关”系统在HeLa细胞中的优化研究,即利用PSV40启动表达PcaV-VP16的表达载体分别和5种不同的响应元件进行组合优化。
第一步,质粒构建。本实例中的质粒构建详见附表1。
第二步,细胞接种。转染前一天将HeLa细胞以每孔5×10^4个的细胞量接种于24孔板中,每孔加入500μl含10%FBS的DMEM培养基。
第三步,质粒转染。本实施例的转染体系可分为5组,包括pJY12和pJY6,pJY12和pJY7,pJY12和pJY8,pJY12和pJY9,pJY12和pJY10。将上述每组质粒按总量为200ng,1:1的比例与转染试剂PEI(质粒与PEI质量比1:5)进行预混,溶于50ul无血清无抗生素的DMEM中。静止15分钟后,将DNA-PEI预混液滴加至每孔细胞中。
第四步,加入诱导剂(具体步骤同实施例2)。
第五步,检测报告基因SEAP的表达量(具体步骤同实施例2)。
实验结果(见图11)显示原儿茶酸调控的“关”系统的不同优化组合均能关闭报告基因SEAP的表达,但系统所产生的关闭效果各不相同,其中,pJY12和pJY10的组合抑制效果最佳。
实施例12,原儿茶酸调控的“关”系统在不同哺乳动物细胞系中的工作情况研究。
第一步,质粒构建。本实例中的质粒构建详见附表1。
第二步,细胞接种(具体步骤同实施例2)。本实例中所涉及的哺乳动物细胞系包括:HEK-293T、hMSC-hTERT、Hana3A、HeLa细胞系。
第三步,质粒转染(具体步骤同实施例11)。
第四步,加入诱导剂(具体步骤同实施例11)。
第五步,检测报告基因SEAP的表达量(具体步骤同实施例2)。
实验结果(见图12)表明原儿茶酸调控的“关”系统在上述哺乳动物细胞系中均能关闭报告基因表达,但不同细胞系其系统工作情况不同,其中在HeLa细胞中,其系统抑制效果最佳。
实施例13,筛选并测定含有原儿茶酸调控的“关”系统的稳定细胞系。
第一步,质粒构建。本实例中的质粒构建详见附表1。
第二步,HeLa细胞接种(具体步骤同实施例2)。
第三步,质粒转染。将质粒pJY12、pJY10、pJY60按总量为200ng,10:10:1的比例与转染试剂PEI(质粒与PEI质量比1:5)进行预混,溶于50ul无血清无抗生素的DMEM中。静止15分钟后,将DNA-PEI预混液滴加至每孔细胞中。
第四步,重新接种细胞并加入抗生素进行筛选(具体步骤同实施例6)。
第五步,鉴定单克隆细胞系的正确性。将扩增好的各个单克隆细胞系接种于24孔板中,其中实验组加入500uM原儿茶酸。加药48小时后检测报告基因SEAP的表达量(具体步骤同实施例2)。最后,将抑制效果佳的稳定细胞系进行扩增、保存。
实施例14,原儿茶酸调控的“关”系统的稳定细胞系具有微调性的表达动力学特征研究。
第一步,将实例13筛选获得调控最佳的稳定细胞系HeLaOFF3按每孔5×10^4个的细胞量接种于24孔板中,每孔加入500ul含有不同浓度原儿茶酸诱导剂和10%FBS的新鲜培养基DMEM。
第二步,检测报告基因SEAP的表达量(具体步骤同实施例2)。
实验结果(见图13)显示原儿茶酸调控的“关”系统的稳定细胞系受原儿茶酸的精确调控,即剂量依赖性地关闭基因的表达,进而表明其稳系具有微调性的表达动力学特征。
实施例15,原儿茶酸调控的“关”系统稳定细胞系具有可逆性的表达动力学特征研究。
第一步,将实例13筛选获得调控最佳的稳定细胞系HeLaOFF3按每孔5×10^4个的细胞量接种于24孔板中。
第二步,在第0天,“OFF-ON-OFF”实验组加入500uM的原儿茶酸;第2天,撤去原有的培养基,加入不含诱导剂的DMEM;第4天,重新将培养基更换为含有500uM原儿茶酸的DMEM。同时,每隔12h吸取细胞上清液检测报告基因SEAP的表达量。而“ON-OFF-ON”实验组则在第0天加入不含诱导剂的DMEM;第2天,加入500uM的原儿茶酸;第4天,重新将培养基更换为不含诱导剂的DMEM。同样地,每隔12h吸取细胞上清液检测报告基因SEAP的表达量(具体步骤同实施例2)。
实验结果(见图14)表明通过控制原儿茶酸的存在与否可以实现其系统基因表达的开启或关闭,说明原儿茶酸调控的“关”系统的稳定细胞系也具有良好的可逆性。
实施例16,原儿茶酸调控的“关”系统在野生型鼠体内调控报告基因SEAP的表达研究。
第一步,准备细胞。将生长状态良好的原儿茶酸调控的“关”系统稳定细胞系HeLaOFF3培养在含1ug/ml嘌呤霉素、10%FBS的DMEM培养基。
第二步,微胶囊制备(具体步骤同实施例10)。
第三步,微胶囊体内移植(具体步骤同实施例10)。
第四步,给药(具体步骤同实施例10)。
第五步,检测小鼠体内SEAP的表达量(具体步骤同实施例10)。
实验结果(见图15)显示原儿茶酸调控的“关”系统在野生型鼠体内能精准调控基因表达,其中,除直接注射原儿茶酸纯品之外,通过饮用绿茶即利用绿茶中茶多酚产生的原儿茶酸代谢物也可关闭系统的表达。
实施例17,利用链脲霉素(STZ)造模法构建1型糖尿病模型鼠。
第一步,禁食。给药前,选择40只体重为25g左右,雄性的C57BL/6J小鼠进行长达16h的禁食。
第二步,给药。将STZ溶解于柠檬酸缓冲液(0.1mol/L,pH 4.5)中,然后以40-50mg/kg的给药剂量进行小鼠腹腔注射,并连续注射5天。由于STZ易降解,因此整个过程需要保证药品处于低温避光的状态,且注射过程需快速。
第三步,测定血糖值。第9天,在小鼠饥饿4小时后检测血糖水平,血糖值高于18mM的小鼠可视为造模成功。
实施例18,筛选并测定含有原儿茶酸诱导胰岛素表达系统的稳定细胞系。
第一步,质粒构建。本实例中的质粒构建详见附表1。
第二步,HEK-293T细胞接种(具体步骤同实施例2)。
第三步,质粒转染。将质粒pJY39、pJY40、pCMV-T7-SB100按总量为200ng,9:9:1的比例与转染试剂PEI(质粒与PEI质量比1:3)预混,溶于50ul无血清无抗生素的DMEM中。静止15分钟后,将DNA-PEI预混液滴加至细胞中。
第四步,转染6h后,将每孔细胞通过胰酶消化重新接种于10cm2皿中,并加入1ug/ml的嘌呤霉素和100ug/ml博莱霉素进行筛选。2周之后,挑选单克隆细胞系于24孔板中进行扩增。
第五步,鉴定单克隆细胞系的正确性。将扩增好的各个单克隆细胞系接种于24孔板中,其中实验组加入500uM原儿茶酸。加药48小时后检测报告基因SEAP的表达量(具体步骤同实施例2),并利用胰岛素ELISA试剂盒(Mercodia AB;Cat.no.10-1247-01)测定胰岛素的表达量。最后,将诱导效果佳的稳定细胞系进行扩增、保存。
实施例19,在1型糖尿病的治疗过程中,原儿茶酸诱导胰岛素表达系统调控胰岛素的表达研究。
第一步,准备细胞。将实例18筛选获得调控最佳的稳定细胞系HEKSEAP-P2A-mINS11培养在含1ug/ml嘌呤霉素和100ug/ml博莱霉素、10%FBS的DMEM培养基。
第二步,微胶囊制备(具体步骤同实施例10)。
第三步,微胶囊体内移植(具体步骤同实施例10)。
第四步,给药。对照组小鼠腹腔注射0mg/kg/d的DMEM,实验组腹腔注射含有500mg/kg/d的原儿茶酸DMEM。每天注射3次。
第五步,检测小鼠体内胰岛素的表达量。给药72h后,通过眼眶取血的方式收集小鼠血清,采用胰岛素ELISA试剂盒检测小鼠体内的胰岛素表达量。
实验结果(见图16)显示在1型糖尿病鼠中,原儿茶酸能精准调控胰岛素的表达。
实施例20,原儿茶酸诱导胰岛素表达系统在1型糖尿病的治疗过程中糖耐受研究。
本实例是在1型糖尿病模型鼠进行实例19的治疗后展开的,其糖耐受的具体实验方法如下:
第一步,模型鼠进行16小时的禁食。
第二步,配制125mg/ml的葡萄糖溶液。
第三步,测量小鼠的0点血糖,并按照1.25g/kg的葡萄糖剂量进行腹腔注射。然后,依次测量小鼠在30,60,90,120min的血糖值。
实验结果(见图17)显示相比于对照组,治疗组的高血糖症得到了良好的改善和控制,即说明原儿茶酸所调控表达的胰岛素在1型糖尿病治疗上有显著的效果。
实施例21,筛选并测定含有原儿茶酸诱导胰高血糖素表达系统的稳定细胞系。
第一步,质粒构建。本实例中的质粒构建详见附表1。
第二步,HEK-293T细胞接种(具体步骤同实施例2)。
第三步,质粒转染。将质粒pJY39、pJY41、pCMV-T7-SB100按总量为200ng,9:9:1的比例与转染试剂PEI(质粒与PEI质量比1:3)预混,溶于50ul无血清无抗生素的DMEM中。静止15分钟后,将DNA-PEI预混液滴加至细胞中。
第四步,重新接种细胞并加入抗生素进行筛选(具体步骤同实施例18)。
第五步,鉴定单克隆细胞系的正确性。鉴定单克隆细胞系的正确性。将扩增好的各个单克隆细胞系接种于24孔板中,其中实验组加入500uM原儿茶酸。加药48小时后检测报告基因SEAP的表达量(具体步骤同实施例2),并利用GLP-1ELISA试剂盒(Merck MilliporeCorporation;Cat.no.EGLP-35K)测定GLP-1-Fc的表达量。最后,将诱导效果佳的稳定细胞系进行扩增和保存。
实施例22,在2型糖尿病(db/db)的治疗过程中,原儿茶酸诱导胰高血糖素表达系统调控GLP-1-Fc的表达研究。
第一步,准备细胞。将实例21筛选获得调控最佳的稳定细胞系HEKGLP-1-Fc-P2A-SEAP11培养在含1ug/ml嘌呤霉素和100ug/ml博莱霉素、10%FBS的DMEM培养基。
第二步,微胶囊制备(具体步骤同实施例10)。
第三步,微胶囊体内移植(具体步骤同实施例10)。
第四步,给药(具体步骤同实施例19)。
第五步,检测db/db小鼠体内GLP-1-Fc的表达量。给药72h后,通过眼眶取血的方式收集小鼠血清,采用GLP-1ELISA试剂盒检测小鼠体内的GLP-1-Fc表达量。
实验结果(见图18)显示在2型糖尿病鼠中,原儿茶酸能精确调控GLP-1-Fc的表达。
实施例23,原儿茶酸诱导胰高血糖素表达系统在2型糖尿病的治疗过程中糖耐受研究。
本实例是在2型糖尿病模型鼠进行实例22的治疗后展开的,其糖耐受的具体实验方法同实施例20中所述。
实验结果(见图19)显示相比于对照组,治疗组的高血糖症得到了良好的改善和控制,即说明原儿茶酸所调控表达的GLP-1-Fc在2型糖尿病治疗上有显著的效果。
实施例24,原儿茶酸诱导胰高血糖素表达系统在2型糖尿病的治疗过程中胰岛素耐受研究。
本实例是在2型糖尿病模型鼠进行实例22的治疗后展开的,其糖耐受的具体实验方法如下:
第一步,db/db模型鼠进行4小时的进食。
第二步,配制0.1U/ml胰岛素溶液。
第三步,测量小鼠的0点血糖,并按1.1U/kg的胰岛素剂量进行小鼠腹腔注射。然后依次测量小鼠在30,60,90,120min的血糖值。
实验结果(见图20)显示相比于对照组,治疗组的胰岛素抵抗症状得到了良好的改善和控制,即说明原儿茶酸所调控表达的GLP-1-Fc在2型糖尿病治疗上有显著的效果。
实施例25,以原儿茶酸和香草酸为双输入信号的五种逻辑运算在哺乳动物细胞中的工作情况研究。
第一步,质粒构建。本实施例中的质粒构建详情见附表1。
第二步,细胞接种(具体步骤同实施例2)。
第三步,质粒转染。本实施例中的转染体系可分为5组,第1组为A不包括B的转染体系,具体质粒体系包括pJY12,pCK189,pDL59,第2组为B不包括A的转染体系,具体质粒体系包括pJY19,pJY179,pDL62,第3组为和门的转染体系,具体质粒体系包括pJY19,pCK189,pDL65,第4组为或门的转染体系,具体质粒体系包括pJY19,pDL24,pCK189,pDL30,pDL63,第5组为或非门的转染体系,具体质粒体系包括pJY12,pJY200,pJY179,pJY201,pDL64。将各组逻辑门的转染质粒体系与转染试剂PEI(质粒与PEI质量比1:3)进行预混,溶于50ul无血清无抗生素的DMEM中。静止15分钟后,将DNA-PEI预混液滴加至每孔细胞中。
第四步,加入诱导剂。转染6小时后,更换新鲜的培养基同时加入不同组合的诱导物。其中每个逻辑门所涉及的诱导物组合分为4种,包括(1)不加任何诱导物,(2)只加500μM的原儿茶酸诱导物,(3)只加300μM的香草酸诱导物,(4)同时加入500μM的原儿茶酸和300μM的香草酸两种诱导物。
第五步,拍摄荧光图,同时用流式细胞仪定量分析荧光表达情况。
荧光图和流式数据分析(见图21)表明在上述逻辑门中,d2EYFP的不同输出结果都符合相应的输入组合,即表明上述逻辑门在哺乳动物HEK-293T中都可以进行正确的逻辑运算。
实施例26,原儿茶酸调控基因的抑制表达装置(pCRISPRi)调控内、外源基因的抑制表达研究。
第一步,质粒构建。本实例中的质粒构建详见附表1。
第二步,细胞接种(具体步骤同实施例2)。
第三步,质粒转染。本实施例的转染体系可分为3组,第1组是研究原儿茶酸调控外源基因SEAP的抑制表达的转染体系,具体质粒体系包括pJY19,pJY131,pJY109和pJY53;第2组是研究原儿茶酸调控内源基因TP53的抑制表达的转染体系,具体质粒体系包括pJY19,pJY131,pWL66;第3组是研究原儿茶酸调控内源基因CXCR4的抑制表达的转染体系,具体质粒体系包括pJY19,pJY131,pWL67。将每组质粒体系与转染试剂PEI(质粒与PEI质量比1:3)进行预混,溶于50ul无血清无抗生素的DMEM中。静止15分钟后,将DNA-PEI预混液滴加至每孔细胞中。
第四步,加入诱导剂。每孔加入500ul含有不同浓度原儿茶酸诱导剂和10%FBS的新鲜培养基DMEM。
第五步,检测外源基因报告基因SEAP的表达量(具体步骤同实施例10)。利用RT-qPCR法检测内源基因TP53、CXCR4的mRNA水平,具体步骤包括:(1)采用Trizol的方法提取总的RNA;(2)利用反转试剂盒将RNA反转成cDNA;(3)基因的定量分析。将定量体系置于实时PCR仪器进行PCR反应,内参基因选择人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因。(4)分析并计算基因的相对定量值。
实验结果表明原儿茶酸调控基因的抑制表达装置不仅能精确调控外源基因SEAP的抑制表达(见图22),还能剂量依赖性地抑制内源基因TP53、CXCR4的表达(见图23、24)。
实施例27,原儿茶酸调控基因的激活表达装置(pCRISPRa)调控内、外源基因的激活表达研究。
第一步,质粒构建。本实例中的质粒构建详见附表1。
第二步,细胞接种(具体步骤同实施例2)。
第三步,质粒转染。本实施例的转染体系可分为3组,第1组是研究原儿茶酸调控外源基因SEAP的激活表达的转染体系,具体质粒体系包括pJY19,pSZ69,pJY137,pJY110和pJY54;第2组是研究原儿茶酸调控内源基因ASCL1的激活表达的转染体系,具体质粒体系包括pJY19,pSZ69,pJY137和pJY54;第3组是研究原儿茶酸调控内源基因PDX1的抑制表达的转染体系,具体质粒体系包括pJY19,pSZ69,pJY137和pJY55。将每组质粒体系与转染试剂PEI(质粒与PEI质量比1:3)进行预混,溶于50ul无血清无抗生素的DMEM中。静止15分钟后,将DNA-PEI预混液滴加至每孔细胞中。
第四步,加入诱导剂(具体步骤同实施例26)。
第五步,检测外源基因报告基因SEAP的表达量(具体步骤同实施例10)。利用RT-PCR法检测内源基因ASCL1、PDX1的mRNA水平(具体步骤同实施例26)。
实验结果表明原儿茶酸调控基因的激活表达装置不仅能精确调控外源基因SEAP的激活表达(见图25),还能剂量依赖性地激活内源基因ASCL1、PDX1的表达(见图26、27)。
实施例28,原儿茶酸调控基因的删除装置(pCRISPRd)调控内、外源基因的删除研究。
第一步,质粒构建。本实例中的质粒构建详见附表1。
第二步,细胞接种(具体步骤同实施例2)。
第三步,质粒转染。本实施例的转染体系可分为3组,第1组是研究原儿茶酸调控修复移码突变外源基因EGFP的转染体系,具体质粒体系包括pJY19,pJY53,pYW54和pJY221;第2组是研究原儿茶酸调控内源基因CCR5的删除的转染体系,具体质粒体系包括pJY19,pYW54和pJY57;第3组是研究原儿茶酸调控内源基因EMX1的抑制表达的转染体系,具体质粒体系包括pJY19,pJY19,pYW54和pJY58。将每组质粒体系与转染试剂PEI(质粒与PEI质量比1:3)进行预混,溶于50ul无血清无抗生素的DMEM中。静止15分钟后,将DNA-PEI预混液滴加至每孔细胞中。
第四步,加入诱导剂(具体步骤同实施例26)。
第五步,流式细胞仪分析外源基因报告基因EGFP的表达量。利用T7核酸内切酶I检测试剂盒定量分析内源基因的靶向切割效率,具体步骤如下:(1)收集转染后的细胞,提取基因组;(2)扩增内源基因的靶向序列,并将所得到的扩增产物退火生成杂交DNA双链产物;(3)退火产物通过T7核酸内切酶I进行酶切;(4)酶切产物通过电泳条带分析并计算内源基因的靶向切割效率。
实验结果表明原儿茶酸调控基因的删除装置不仅能纠正外源基因的移码突变,使EGFP得以重新表达(见图28),并且能调控内源基因EMX1、CCR5的删除(见图29、30)。
附表1
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下,本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中,并且以所附的权利要求书为保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东师范大学
<120> 原儿茶酸调控的开关系统及其调控方法和应用
<160> 103
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 234
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gatctgcgat ctgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat 60
cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catcgctgac taattttttt 120
tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg 180
cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttatactc agtgccctga ctat 234
<210> 2
<211> 254
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gatctgcgat ctgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat 60
cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catcgctgac taattttttt 120
tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg 180
cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttatactc agtgccctga ctatatactc 240
agtgccctga ctat 254
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gatctgcgat ctgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat 60
cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catcgctgac taattttttt 120
tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg 180
cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttatactc agtgccctga ctatatactc 240
agtgccctga ctatatactc agtgccctga ctat 274
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gatctgcgat ctgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat 60
cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catcgctgac taattttttt 120
tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg 180
cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttatactc agtgccctga ctatatactc 240
agtgccctga ctatatactc agtgccctga ctatatactc agtgccctga ctat 294
<210> 5
<211> 314
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gatctgcgat ctgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat 60
cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catcgctgac taattttttt 120
tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg 180
cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttatactc agtgccctga ctatatactc 240
agtgccctga ctatatactc agtgccctga ctatatactc agtgccctga ctatatactc 300
agtgccctga ctat 314
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa 60
cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata 120
atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 180
tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc 240
cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta 300
tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg 360
cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt 420
ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca 480
aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag 540
gtctatataa gcaagcttat actcagtgcc ctgactat 578
<210> 7
<211> 598
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa 60
cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata 120
atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 180
tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc 240
cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta 300
tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg 360
cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt 420
ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca 480
aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag 540
gtctatataa gcaagcttat actcagtgcc ctgactatat actcagtgcc ctgactat 598
<210> 8
<211> 618
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa 60
cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata 120
atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 180
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cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta 300
tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg 360
cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt 420
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actcagtgcc ctgactat 618
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<212> DNA
<213> 人工序列
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atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 180
tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc 240
cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta 300
tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg 360
cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt 420
ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca 480
aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag 540
gtctatataa gcaagcttat actcagtgcc ctgactatat actcagtgcc ctgactatat 600
actcagtgcc ctgactatat actcagtgcc ctgactat 638
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa 60
cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata 120
atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 180
tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc 240
cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta 300
tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg 360
cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt 420
ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca 480
aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag 540
gtctatataa gcaagcttat actcagtgcc ctgactatat actcagtgcc ctgactatat 600
actcagtgcc ctgactatat actcagtgcc ctgactatat actcagtgcc ctgactat 658
<210> 11
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Met Lys Ile Ile Leu Trp Leu Cys Val Phe Gly Leu Phe Leu Ala Thr
1 5 10 15
Leu Phe Pro Ile Ser Trp Gln Met Pro Val Glu Ser Gly Leu Ser Ser
20 25 30
Glu Asp Ser Ala Ser Ser Glu Ser Phe Ala Lys Arg Ile Lys Arg His
35 40 45
Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln
50 55 60
Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg Ser
65 70 75 80
Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe
85 90 95
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro
100 105 110
Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val
115 120 125
Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr
130 135 140
Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu
145 150 155 160
Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys
165 170 175
Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
180 185 190
Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro
195 200 205
Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile
210 215 220
Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly
225 230 235 240
Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp
245 250 255
Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp
260 265 270
Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His
275 280 285
Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
290 295 300
<210> 12
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Met Ala Leu Trp Met Arg Phe Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Trp Glu Pro Lys Pro Ala Gln Ala Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly
20 25 30
Pro His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe
35 40 45
Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Arg Arg Lys Arg Glu Asp Pro Gln Val Pro
50 55 60
Gln Leu Glu Leu Gly Gly Gly Pro Glu Ala Gly Asp Leu Gln Thr Leu
65 70 75 80
Ala Leu Glu Val Ala Arg Gln Lys Arg Gly Ile Val Asp Gln Cys Cys
85 90 95
Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
100 105 110
<210> 13
<211> 176
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
atactcagtg ccctgactat cctgcaggtc gagctcggta cccgggtcga gtaggcgtgt 60
acggtgggag gcctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg 120
ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac cgatccagcc tccgcg 176
<210> 14
<211> 196
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
atactcagtg ccctgactat atactcagtg ccctgactat cctgcaggtc gagctcggta 60
cccgggtcga gtaggcgtgt acggtgggag gcctatataa gcagagctcg tttagtgaac 120
cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac 180
cgatccagcc tccgcg 196
<210> 15
<211> 216
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
atactcagtg ccctgactat atactcagtg ccctgactat atactcagtg ccctgactat 60
cctgcaggtc gagctcggta cccgggtcga gtaggcgtgt acggtgggag gcctatataa 120
gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc 180
tccatagaag acaccgggac cgatccagcc tccgcg 216
<210> 16
<211> 236
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
atactcagtg ccctgactat atactcagtg ccctgactat atactcagtg ccctgactat 60
atactcagtg ccctgactat cctgcaggtc gagctcggta cccgggtcga gtaggcgtgt 120
acggtgggag gcctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg 180
ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac cgatccagcc tccgcg 236
<210> 17
<211> 256
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
atactcagtg ccctgactat atactcagtg ccctgactat atactcagtg ccctgactat 60
atactcagtg ccctgactat atactcagtg ccctgactat cctgcaggtc gagctcggta 120
cccgggtcga gtaggcgtgt acggtgggag gcctatataa gcagagctcg tttagtgaac 180
cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac 240
cgatccagcc tccgcg 256
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
agcttatact cagtgccctg actatg 26
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
aattcatagt cagggcactg agtata 26
<210> 20
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
agcttatact cagtgccctg actatatact cagtgccctg actatg 46
<210> 21
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
aattcatagt cagggcactg agtatatagt cagggcactg agtata 46
<210> 22
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
agcttatact cagtgccctg actatatact cagtgccctg actatatact cagtgccctg 60
actatg 66
<210> 23
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
aattcatagt cagggcactg agtatatagt cagggcactg agtatatagt cagggcactg 60
agtata 66
<210> 24
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
agcttatact cagtgccctg actatatact cagtgccctg actatatact cagtgccctg 60
actatatact cagtgccctg actatg 86
<210> 25
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
aattcatagt cagggcactg agtatatagt cagggcactg agtatatagt cagggcactg 60
agtatatagt cagggcactg agtata 86
<210> 26
<211> 106
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
agcttatact cagtgccctg actatatact cagtgccctg actatatact cagtgccctg 60
actatatact cagtgccctg actatatact cagtgccctg actatg 106
<210> 27
<211> 106
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
aattcatagt cagggcactg agtatatagt cagggcactg agtatatagt cagggcactg 60
agtatatagt cagggcactg agtatatagt cagggcactg agtata 106
<210> 28
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ggccctgcag gtcgagctcg gtacccgggt cg 32
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
ccgcgacgtc aggtggcact tttcggggaa 30
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
catactcagt gccctgacta tcctgca 27
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
ggatagtcag ggcactgagt atgacgt 27
<210> 32
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
catactcagt gccctgacta tatactcagt gccctgacta tcctgca 47
<210> 33
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
ggatagtcag ggcactgagt atatagtcag ggcactgagt atgacgt 47
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<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
catactcagt gccctgacta tatactcagt gccctgacta tatactcagt gccctgacta 60
tcctgca 67
<210> 35
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
ggatagtcag ggcactgagt atatagtcag ggcactgagt atatagtcag ggcactgagt 60
atgacgt 67
<210> 36
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
catactcagt gccctgacta tatactcagt gccctgacta tatactcagt gccctgacta 60
tatactcagt gccctgacta tcctgca 87
<210> 37
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
ggatagtcag ggcactgagt atatagtcag ggcactgagt atatagtcag ggcactgagt 60
atatagtcag ggcactgagt atgacgt 87
<210> 38
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
catactcagt gccctgacta tatactcagt gccctgacta tatactcagt gccctgacta 60
tatactcagt gccctgacta tatactcagt gccctgacta tcctgca 107
<210> 39
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
ggatagtcag ggcactgagt atatagtcag ggcactgagt atatagtcag ggcactgagt 60
atatagtcag ggcactgagt atatagtcag ggcactgagt atgacgt 107
<210> 40
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
cacgcgacgt cgcagcggtc gatctggcca cccaccc 37
<210> 41
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
tgctctagat cagcccggtg ccaccgccgg ctc 33
<210> 42
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
cgacgcgttc atgtccaaca ttaccgccat g 31
<210> 43
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
cccaagcttg aattctttgc caaaatgatg ag 32
<210> 44
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
ggggtaccgg gaaagtgatg tcgtgtactg gctc 34
<210> 45
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
cggaattctc acgacacctg aaatggaag 29
<210> 46
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
gctagcttcg atccagacat gataag 26
<210> 47
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
ctagatagcg gaccccttac cgaaac 26
<210> 48
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
ggtaaggggt ccgctatcta gggtaccgag ctcttacgcg tgctag 46
<210> 49
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
catgtctgga tcgaagctag cgccggccgc cccgactcta gatcagc 47
<210> 50
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
gcttcgatcc agacatgata agatac 26
<210> 51
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
ctagatagcg gaccccttac cgaaac 26
<210> 52
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
gtttcggtaa ggggtccgct atctagggta ccgagctctt acgcgtgcta g 51
<210> 53
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
gtatcttatc atgtctggat cgaagcttag ttgcagtagt tctccagttg g 51
<210> 54
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
gcttcgatcc agacatgata agatac 26
<210> 55
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
ctagatagcg gaccccttac cgaaac 26
<210> 56
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
gtttcggtaa ggggtccgct atctagggta ccgagctctt acgcgtgcta g 51
<210> 57
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
gtatcttatc atgtctggat cgaagcttac gggtgcgcgg cgtcggtggt g 51
<210> 58
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
gtgccctgac tatcctgcag ggagggccta tttcccatga ttccttc 47
<210> 59
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
ggtggaattc gatagtcagg gcactgagta taagcttgat atataaagcc aagaaatcg 59
<210> 60
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
atactcagtg ccctgactat cgaattccac cgcagccgct cgctgcagca ggttttag 58
<210> 61
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
gccggccgcc ccgactctag agtgaaatac cgcacagatg cgtaaggag 49
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
cagtgccctg actatgaatt ccaccggcct ggctggccgc actaag 46
<210> 63
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
agggcatcgg tcgacggatc cgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggag 49
<210> 64
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
ccggaattcc accgtgacat caattattat acatg 35
<210> 65
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
tgctctagag cttgtctgca gaattggcgc acgcg 35
<210> 66
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
ccggaattcc accgagtccg agcagaagaa gaag 34
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
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tgctctagag cttgtctgca gaattggcgc acgcg 35
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
ctagctagcg ccaccatgac cgagtacaag cccacggtg 39
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<210> 71
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
aattcccgct gctgcagcga gcggctgcgg tga 33
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
ccaccgcagc cgctcgctgc agcagcggcc tgca 34
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 73
ggccgctgct gcagcgagcg gctgcggtgg acgt 34
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 74
cagtgccctg actatgaatt cgccaccatg gcttcaaact ttactcag 48
<210> 75
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 75
ggagacagtg gggtccttgg ctttgg 26
<210> 76
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 76
ccaaagccaa ggaccccact gtctccggaa gcggagctac taacttcagc ctgc 54
<210> 77
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 77
gccggccgcc ccgactctag attacttgta cagctcgtcc atgccgagag 50
<210> 78
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 78
aaagcttcga atcgcgaatt cgccaccatg gacatgccgc gc 42
<210> 79
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 79
ccagcgcgtc ggcgcgcccg gatccgtcgg cgcgaatgct ccacgccgcg c 51
<210> 80
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 80
gcgcggcgtg gagcattcgc gccgacggat ccgggcgcgc cgacgcgctg g 51
<210> 81
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 81
gccggccgcc ccgactctag attaaaacag agatgtgtcg aagatg 46
<210> 82
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 82
agcttgccac catgcctgac atcaattatt atacatcggc 40
<210> 83
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 83
tcgagccgat gtataataat tgatgtcagg catggtggca 40
<210> 84
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 84
ccggaattcc accgccagtc ttgagcacat ggg 33
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<211> 35
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tgctctagag cttgtctgca gaattggcgc acgcg 35
<210> 86
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 86
ccggaattcc accgacttac actgatcccc tcca 34
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 87
tgctctagag cttgtctgca gaattggcgc acgcg 35
<210> 88
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 88
cagtgccctg actatgaatt cgccaccatg tgcggccgca agctgctgag 50
<210> 89
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 89
cgacggcgtg tctgtgcatc cattccgcta ggtccgggat tctcctccac atctccagc 59
<210> 90
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 90
gaatcccgga cctagcggaa tggatgcaca gacacgccgt cgggaacgcc gtgc 54
<210> 91
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 91
cttgtccaaa ctcatcaatg tatcctagac tcgagcggcc gccactgtgc tg 52
<210> 92
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 92
ctaggataca ttgatgagtt tggacaagtt taaaccc 37
<210> 93
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 93
gaatgcaatt gttgttgtta accatgcatc tcaattagtc agcaaccata g 51
<210> 94
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 94
tcgattggat ccaatgaatt cgccaccatg tgcggccgca agctg 45
<210> 95
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 95
gaatgcaatt gttgttgtta accatgcatc tcaattagtc agcaaccata g 51
<210> 96
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 96
gcggccgctt aagctagctt cgatccag 28
<210> 97
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 97
cacattgatc ctagcagaag cacaggctg 29
<210> 98
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 98
gtgcttctgc taggatcaat gtgggaagcg gagctactaa cttcagcc 48
<210> 99
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 99
cgaagctagc ttaagcggcc gcttacgggt gcgcggcgtc ggtggtgc 48
<210> 100
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 100
cagacatgat aagatacatt gatgag 26
<210> 101
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 101
ctcatcaatg tatcttatca tgtctgttac gggtgcgcgg cgtcggtggt gc 52
<210> 102
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 102
cccaagcttc cggtgccacc atggactata aggacc 36
<210> 103
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 103
ccgctcgagg tcgaggctga tcagcgagct ctaggaattc 40
Claims (9)
1.一种原儿茶酸调控的开关系统,其特征在于,所述系统包括:
a):原儿茶酸调控的“开”系统;
和/或,
b):原儿茶酸调控的“关”系统;
其中,
所述原儿茶酸调控的“开”系统是由重组转录抑制子,原儿茶酸诱导型强启动子和待转录序列三部分组成;所述重组转录抑制子为重组转录抑制子KRAB-PcaV,是由转录抑制蛋白KRAB融合至DNA结合域上获得;所述DNA结合域是来源于原儿茶酸操纵子系统的阻遏蛋白PcaV;所述的原儿茶酸诱导型强启动子根据强启动子的种类和操纵子OpcaV 的不同拷贝数可组成不同类型的融合型强启动子,如SEQ ID NO.1~10所述的核苷酸序列;
所述原儿茶酸调控的“关”系统是由重组转录激活子,原儿茶酸诱导型弱启动子和待转录序列三部分组成;所述重组转录激活子是由PcaV蛋白融合到转录激活蛋白上获得;所述转录激活蛋白包括单纯疱疹病毒颗粒蛋白VP16转录激活结构域、NF-ΚB p65亚基转录激活结构域、热休克转录因子HSF1转录激活域;所述的诱导型弱启动子根据操纵子OpcaV的不同拷贝数可组成不同类型的融合启动子,如 SEQ ID NO.13~17所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的开关系统,其特征在于,所述的重组转录抑制子由不同种类的强启动子启动表达,包括PSV40,其核苷酸序列Genbank登录号:KY053832;PhCMV ,其核苷酸序列Genbank登录号:KY199427;PhEF1α,其核苷酸序列Genbank登录号:AY043301;和PCAG ,其核苷酸序列Genbank登录号:HQ456319。
3.如权利要求1所述的开关系统,其特征在于, 所述的重组转录激活子包括单纯疱疹病毒颗粒蛋白VP16转录激活结构域,氨基酸序列Genbank登录号:AEX37895;NF-ΚB p65亚基转录激活结构域,氨基酸序列Genbank登录号:ABK40095;热休克转录因子HSF1转录激活域,氨基酸序列Genbank登录号:BAM10893。
4.一种原儿茶酸诱导基因表达的调控方法,其特征在于,所述方法是由权利要求1中所述的原儿茶酸调控的“开”系统进行调控;其中,当原儿茶酸诱导物不存在时,所述重组转录抑制子可结合至所述原儿茶酸诱导型强启动子上,进而阻遏下游待转录序列的表达;而当原儿茶酸诱导物存在时,原儿茶酸阻断其结合,使所述重组转录抑制子从所述原儿茶酸诱导型强启动子上解离下来,启动下游待转录序列的表达。
5.一种原儿茶酸关闭基因表达的调控方法,其特征在于,所述方法是由权利要求1中所述的原儿茶酸调控的“关”系统进行调控;当原儿茶酸诱导物不存在时,所述的重组转录激活子可结合至所述的原儿茶酸诱导型弱启动子上,进而激活下游待转录序列的表达;而当原儿茶酸诱导物存在时,原儿茶酸解除其结合,使重组转录激活子从诱导型弱启动子上解离下来,关闭下游待转录序列的表达。
6.一种真核表达载体,其特征在于,其包括如权利要求1中所述的原儿茶酸调控的“开”系统和/或 原儿茶酸调控的“关”系统。
7.一种工程化细胞,其特征在于,其包括如权利要求1中所述的原儿茶酸调控的“开”系统和/或 原儿茶酸调控的“关”系统。
8.一种微胶囊,其特征在于,其包括如权利要求1中所述的原儿茶酸调控的“开” 系统和/或 原儿茶酸调控的“关”系统。
9.如权利要求1所述的原儿茶酸调控的开关系统在生物计算机上的应用。
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设计、构建原儿茶酸调控的基因表达平台及其应用研究;尹剑丽;《中国博士学位论文全文数据库 基础科技辑》;20210415(第4期);A006-34页 * |
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