CN116926095A

CN116926095A - 葡萄糖调控基因表达环路控制系统及其调控血糖的应用

Info

Publication number: CN116926095A
Application number: CN202210326236.9A
Authority: CN
Inventors: 叶海峰; 管宁子; 高纤云
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2022-03-30
Filing date: 2022-03-30
Publication date: 2023-10-24
Also published as: WO2023185442A1

Abstract

本发明公开了葡萄糖调控基因表达环路控制系统及其在调控血糖中的应用，其包括转录抑制子HexR，葡萄糖诱导型强启动子和待转录序列。本发明葡萄糖调控基因表达环路控制系统具有微调性、可逆性的表达动力学特征。本发明还公开了智能可控的微生物药物工厂及其在皮肤伤口愈合中的应用，其包括基因表达环路控制系统和底盘益生菌。本发明还公开了原核表达载体、工程化细胞及其在治疗糖尿病、促进皮肤伤口愈合、预防和/治疗代谢疾病的药物中的应用。本发明涉及合成生物学及细胞治疗领域，将微生物合成生物学与疾病治疗相结合，具广泛应用前景。

Description

葡萄糖调控基因表达环路控制系统及其调控血糖的应用

技术领域

本发明涉及合成生物学、细胞治疗领域，是将微生物合成生物学与疾病治疗相结合，具体涉及葡萄糖调控基因表达环路控制系统及其调控血糖的应用。

背景技术

生物传感器可以直接使用完整的微生物细胞或细胞碎片作为敏感材料，利用其体内的酶及代谢系统来识别与检测各类物质。近年来合成生物学的发展极大促进了生物传感器功能的开发，在生物医学中，可以很好地检测各种生理指标或者疾病信号，包括其宿主环境中的刺激和外部信号。益生菌能特异性靶向肠道作为肠道定向给药载体，满足作为生物治疗剂的几乎所有要求，利用益生菌开发生物传感器实现诊疗一体化是实现精准医学的重要手段。

目前糖尿病的治疗方式主要包括注射胰岛素，服用药物和控制饮食等，但目前的医疗水平仍不能将糖尿病彻底治愈，糖尿病患者需每天口服降血糖药物或注射胰岛素来维持血糖稳定。采用口服或注射给药，当前应用的大多数临床药物的有效成分会失活，只有很少一部分能够作用到预期的靶点部位。如果因为药物作用效率不够甚至过低，而导致需要的药物剂量激增，通常损害患者健康甚至出现众多副作用。且注射胰岛素无法达到可控地释放胰岛素，极易造成低血糖风险。能够实时自动监控体内血糖浓度并且能够准确的对血糖浓度及时进行调整对于治疗糖尿病非常重要。因此，亟需开发新的治疗方式来提高治疗效果，降低治疗风险，提高治疗的便捷性。

另一方面，伤口愈合过程受损是一个与代谢性疾病和衰老密切相关的日益严重的医学问题。皮肤上的开放性伤口会引起严重的不适，并为细菌的入侵提供了入口。在伤口愈合炎症阶段，免疫细胞在受伤或激活的细胞释放的警报信号、细胞因子和趋化因子的作用下积累，从而对伤口的愈合起到至关重要的作用。巨噬细胞和中性粒细胞是创伤部位的主要免疫细胞群，它们在阻止微生物入侵的同时也可以通过分泌额外的趋化因子、生长因子和基质消化酶等来促进愈合过程。

慢性创伤通常与潜在的能提高伤口易感性或降低愈合能力的病理过程有关，如动/静脉功能不足、糖尿病或正在接受全身类固醇治疗等。以糖尿病足溃疡为例，作为糖尿病的常见并发症之一，会导致长期疼痛、活力下降，甚至可能需要截肢。对于糖尿病足溃疡等慢性创伤的标准治疗包括手术或化学清除坏死组织、反复更换敷料、使用抗生素进行感染控制等，结果不稳定，并伴有不良副作用。此外，临床上也通过局部应用生长因子或与不同生物材料联合应用对不同类型的慢性创伤进行治疗，但效果并不显著。其中，伤口的蛋白水解特性限制了药物的利用度，是慢性伤口药物治疗的主要障碍。因此，亟需开发新的治疗方式对难以愈合的慢性皮肤伤口进行稳定、安全的治疗，提高治疗效果和治疗的便捷性。

发明内容

本发明提出了一种葡萄糖调控基因表达环路控制系统，其包括转录抑制子 HexR，葡萄糖诱导型强启动子和待转录序列。其中，所述转录抑制子HexR可同源二聚化并与特异的DNA序列相结合，所述特异的DNA序列选自序列SEQ ID NO.78～80。其中，所述葡萄糖诱导型强启动子是由组成型强启动子与所述特异的DNA序列组合而成；其包括但不限于如SEQID NO.1-10之任一种核苷酸序列。

其中，所述转录抑制子为可结合至所述葡萄糖诱导型强启动子上并进而阻遏下游待转录序列的表达。所述待转录序列包括单一编码表达报告蛋白或功能型蛋白，或串联表达多种蛋白。所述转录抑制子、葡萄糖诱导型强启动子和待转录序列可构建在一个或两个质粒载体上。

本发明还提出了一种葡萄糖诱导基因表达调控方法，由所述葡萄糖调控基因表达环路控制系统进行调控。在具体实施方案中，当葡萄糖不存在时，所述转录抑制子可结合至所述葡萄糖诱导型强启动子上，进而阻遏下游待转录序列的表达；当葡萄糖存在时，葡萄糖经Entner-Doudoroff途径代谢生成代谢中间物 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate(KDPG)，KDPG阻断其结合，使所述转录抑制子从所述葡萄糖诱导型强启动子上解离下来，启动下游待转录序列的表达。在具体实施方案中，其诱导基因表达的调控方式如图1所示。

本发明中，所述葡萄糖调控基因表达环路控制系统即由葡萄糖精确调控基因的启动表达和分泌，由转录抑制子HexR，葡萄糖诱导型强启动子和待转录序列三部分组成。

其中，所述转录抑制子HexR为来源于恶臭假单胞菌Pseudomonas putida的 HexR操纵子系统的阻遏蛋白HexR(其氨基酸序列Genbank登录号：AE015451)，由强启动子持续表达。

优选地，所述的转录抑制子HexR可由不同种类的强启动子启动表达，所述的强启动子包括但不限于P_BBA23100(其核苷酸序列Genbank登录号：MG649435)、P_Lac(其核苷酸序列Genebank登录号：LC652750)、P_Tac(其核苷酸序列Genebank 登录号：MN913428)等。

其中，所述葡萄糖诱导型强启动子是通过强启动子与RBS位点之间插入不同拷贝数的HexR操纵子结合位点构成；所述HexR操纵子结合位点来源于HexR 操纵子系统的操纵子元件HexO。所述的葡萄糖诱导型强启动子可驱动下游基因的表达。所述HexR操纵子系统是由阻遏蛋白HexR和操纵子元件HexO组成，其最初是从恶臭假单胞菌Pseudomonas putida中分离得到，并受到葡萄糖的代谢产物2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate(KDPG)的严格调控。

优选地，所述的葡萄糖诱导型强启动子根据强启动子的种类和操纵子HexO 的不同拷贝数可组成不同类型的融合型强启动子，包括：a)如SEQ ID NO.1所示的葡萄糖诱导型强启动子P_HexR1核苷酸序列P_HexR1(P_Tac-HexO)；b)如SEQ ID NO.2所示的葡萄糖诱导型强启动子P_HexR2核苷酸序列P_HexR2(P_Tac-2×HexO)；c)如 SEQ ID NO.3所示的葡萄糖诱导型强启动子P_HexR3核苷酸序列 P_HexR3(P_Tac-3×HexO)；d)如SEQ ID NO.4所示的葡萄糖诱导型强启动子P_HexR4核苷酸序列P_HexR4(P_Tac-4×HexO)；e)如SEQ ID NO.5所示的葡萄糖诱导型强启动子P_HexR5核苷酸序列P_HexR5(P_Tac-5×HexO)；f)如SEQ ID NO.6所示的葡萄糖诱导型强启动子P_HexR6核苷酸序列P_HexR6(P_Lac-HexO)；g)如SEQ ID NO.7所示的葡萄糖诱导型强启动子P_HexR7核苷酸序列P_HexR7(P_Lac-2×HexO)；h)如SEQ ID NO.8 所示的葡萄糖诱导型强启动子P_HexR8核苷酸序列P_HexR8(P_Lac-3×HexO)；i)如SEQ ID NO.9所示的葡萄糖诱导型强启动子P_HexR9核苷酸序列P_HexR9(P_Lac-4×HexO)；j)如SEQ ID NO.10所示的葡萄糖诱导型强启动子P_HexR10核苷酸序列P_HexR10(P_Lac-5×HexO)以及任意组成型启动子与任意拷贝数的HexO组成的葡萄糖诱导型启动子P_HexRn。

其中，所述待转录序列可以是单一编码表达报告蛋白如sfGFP(氨基酸序列Genbank登录号：AB971579)、LuxCDABE(氨基酸序列Genbank登录号： EF173694)或功能型蛋白如SEQ ID NO.11所示的胰高血糖素样肽GLP-1氨基酸序列、如SEQ ID NO.12所示的胰高血糖素样肽EK-GLP-1氨基酸序列、如SEQ ID NO.13所示的胰高血糖素样肽GLP-1-Fc氨基酸序列、如SEQ ID NO.61所示的鼠源胰岛十二指肠同源盒-1(mPDX-1)氨基酸序列、如SEQ IDNO.66所示的人源胰岛十二指肠同源盒-1(hPDX-1)氨基酸序列等。

其中，所述的葡萄糖调控基因表达环路控制系统可精确调控一种或通过多顺反子的形式串联多种报告蛋白及功能蛋白的表达。

其中，所述的葡萄糖调控基因表达环路控制系统分别由人工设计、合成的双质粒系统装载，所述双质粒系统中涉及的序列详见表1。

本发明还提出一种表达载体、工程化细胞、传感器或重组益生菌，其含有所述的葡萄糖调控基因表达环路控制系统。在具体实施方案中，所述葡萄糖调控基因表达环路控制系统位于所述工程化细胞、传感器或重组益生菌的染色体或质粒中的任意一种。

本发明还提出一种应用，即所述葡萄糖调控基因表达环路控制系统，所述表达载体、工程化细胞、传感器或重组益生菌在制备治疗和/或预防糖尿病的药物、制备调控血糖的药物或产品中的应用。

在具体实施方案中，所述药物或产品包括但不限于口服剂、涂抹剂、注射剂等各种剂型。优选，采用口服剂的方式。在具体实施方案中，通过口服含有所述葡萄糖调控基因表达环路控制系统的重组益生菌(即，智能可控的微生物药物工厂)，通过葡萄糖诱导基因表达调控，表达降血糖肽，实现调控血糖。也就是说，通过口服所述重组益生菌(经改造的智能可控的益生菌药物工厂)，使其通过血糖诱导产生胰高血糖素样肽的方法实现，可以精确调控GLP-1或/和PDX-1的表达，实现治疗糖尿病的效果。具体地，所述应用及治疗方法中，通过调控释放胰高血糖素样肽、胰岛十二指肠同源盒-1降糖蛋白来调控血糖，调控血糖水平。

本发明还提出了一种调控血糖的方法，即利用所述葡萄糖调控基因表达环路控制系统，和/或利用所述表达载体、工程化细胞、传感器或重组益生菌等来调控血糖。具体实施方案中，所述方法通过调控GLP-1、PDX-1降糖蛋白的表达来实现调控血糖的效果。具体地，所述调控血糖的方法包括以下步骤：

a)人工构建原核表达载体或用于染色体整合的功能模块；所述原核表达载体或用于染色体整合的功能模块含有葡萄糖诱导GLP-1/PDX-1表达调控系统；

b)将步骤a)构建的表达载体或用于染色体整合的功能模块转化至微生物细胞中或整合至微生物细胞染色体上，制备含有葡萄糖诱导GLP-1/PDX-1表达调控系统的工程化细胞；

c)将步骤b)制备的所述工程化细胞以灌胃形式移植至糖尿病模型鼠体内；

d)小鼠体内葡萄糖闭环诱导所述工程化细胞表达并分泌GLP-1/PDX-1，吸收至血液中以降血糖。

在具体实施方案中，所述调控血糖方法可以口服益生菌的方式。

本发明还提供了一种治疗糖尿病的新方法，通过所述智能可控的益生菌药物工厂、葡萄糖诱导GLP-1或/和PDX-1表达调控系统，采用口服益生菌的方式便可达到降血糖的效果。本发明提供了安全、可靠、可精确调控释放胰高血糖素样肽或/和胰岛十二指肠同源盒-1治疗糖尿病的新策略。本发明提供了治疗糖尿病的新方法、新策略。所述系统可调控胰高血糖素样肽GLP-1、胰岛十二指肠同源盒-1PDX-1的表达。所述胰高血糖素样肽GLP-1的表达包括EK-GLP-1、GLP-1-Fc 等。所述胰岛十二指肠同源盒-1PDX-1的表达包括mPDX-1、hPDX-1等。本发明所述葡萄糖调控基因表达环路控制系统可以快速通过葡萄糖代谢物调控基因表达，具有精准控制基因表达量、调控基因表达倍数高等特点。

本发明所述葡萄糖调控基因表达环路控制系统具有微调性、可逆性的表达动力学特征。所述微调性是指下游的基因表达受葡萄糖的精准调控，并呈现出剂量依赖性的关系；所述可逆性是指葡萄糖调控基因表达的整个过程是可逆的，可以通过控制葡萄糖的存在与否实现基因表达的开启或关闭。且，具有微调性、可逆性的表达动力学特征同样体现在所述葡萄糖诱导基因表达调控方法，调控血糖方法，以及所述表达载体、工程化细胞、传感器或重组益生菌等。

本发明还提出了一种质粒，选自质粒pGN11、pGN69、pGN89、pGN90、 pGN227、pGN12、pGN228、pGN229、pGN220、pGN221、pGN222、pGN223、 pGN224、pGN231、pGN232、pGN233、pGN65、pGN237、pGN238、pGN239、 pGN241、pGN242、pGN243、pGN288、pGN308、pGN306、pGN307、pXG58之一种或几种。所述质粒，详见表1。

本发明还提出了一种核苷酸序列，其为葡萄糖诱导型强启动子P_HexR1、P_HexR2、P_HexR3、P_HexR4、P_HexR5、P_HexR6、P_HexR7、P_HexR8、P_HexR9、P_HexR10之一种，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1～10之一所示。

本发明还提出了一种引物，其序列如SEQ ID NO.16-60、62-65、67-74、76-77 所示的其中一种或几种。本发明还提出了一种引物对，其序列如编号1-30所示引物对之一种或几种。如表1、表2所示。

本发明还提出一种智能可控的微生物药物工厂，其包括底盘微生物，以及上载至所述底盘微生物中的基因表达环路控制系统。在具体实施方案要中，所述基因表达环路控制系统位于所述底盘微生物的染色体或质粒中的任意一种。

本发明所述智能可控的微生物药物工厂，优选地为葡萄糖调控的益生菌药物工厂，为含有葡萄糖调控基因表达环路控制系统的工程化细胞。还可以是其他调控方式的微生物药物工厂，即含有其他调控方式的基因表达环路控制系统的工程化细胞。在具体实施方案中，所述工程化细胞可以为任意益生菌，如Escherichia coli Nissle 1917(EcN)等。

其中，所述基因表达环路控制系统包括但不限于葡萄糖调控基因表达环路控制系统、以及其他调控方式的基因表达环路控制系统，如木糖诱导的基因表达系统、阿拉伯糖诱导的基因表达系统、尿酸诱导的基因表达系统等。

本发明中，所述葡萄糖调控基因表达环路控制系统包括转录抑制子HexR，葡萄糖诱导型强启动子和待转录序列三部分。在一具体实施方案中，所述转录抑制子HexR可结合至所述葡萄糖诱导型强启动子上并进而阻遏下游待转录序列的表达；所述葡萄糖诱导型强启动子是由组成型强启动子与HexR特异结合的DNA序列组合而成；所述待转录序列包括单一编码表达报告蛋白如LuxCDABE(氨基酸序列Genbank登录号：EF173694)或功能型蛋白如SEQ ID NO.14所示的人酸性成纤维生长因子rhaFGF135氨基酸序列、如SEQ ID NO.15所示的趋化因子 CXCL12氨基酸序列、如SEQ ID NO.75所示的人源白介素4因子(hIL4)氨基酸序列等，或串联表达多种蛋白。具体实施方案中，调控方式为，当葡萄糖不存在时，所述转录抑制子可结合至所述葡萄糖诱导型强启动子上，进而阻遏下游待转录序列的表达；当葡萄糖存在时，葡萄糖经Entner-Doudoroff途径代谢生成代谢中间物2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate(KDPG)，KDPG阻断其结合，使所述转录抑制子从所述葡萄糖诱导型强启动子上解离下来，启动下游待转录序列的表达。

本发明中，所述基因表达环路控制系统包括转录抑制子，诱导型强启动子和待转录序列。在具体实施方案中，所述转录抑制子、诱导型强启动子和待转录序列可构建在一个或两个质粒载体上。

本发明中，所述智能可控的微生物药物工厂可以在一种诱导物的存在下表达目的基因。在具体实施方案中，所述诱导物通过外源添加或由体内产生。

优选地，所述底盘微生菌包括益生菌。优选地，所述益生菌包括但不限大肠杆菌Nissle 1917、乳酸乳球菌、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌等。在具体实施方案中，所述智能可控的微生物药物工厂即重组益生菌。

本发明所述智能可控的微生物药物工厂包括但不限于可以处于液体中，或是经冷冻干燥、喷雾干燥的。

本发明还提出了一种所述智能可控的微生物药物工厂的构建方法，包括以下步骤：

a)将转录抑制蛋白特异性识别的DNA操纵子序列与组成型强启动子组合，构建诱导型强启动子；

b)将表达药物蛋白的编码基因以单一或串联的方式构建至诱导型启动子下游，构建报告模块；其中药物蛋白的种类和数量可根据实际需求进行相应的替换改变；

c)构建组成型表达转录抑制蛋白的功能模块。

本发明提出的智能可控的微生物药物工厂的构建方法，将包含所述步骤b)和步骤c)构建的功能模块与报告模块的质粒转化至益生菌感受态细胞中，或将所述步骤b)和步骤c)构建的功能模块与报告模块通过RED重组酶系统或CRISPR系统整合至益生菌染色体上，制备得到可诱导的工程化细胞，即制备得到所述智能可控的微生物药物工厂。

本发明还提出了表达载体、工程化细胞，其含有所述智能可控的微生物药物工厂。具体实施中，一种含有葡萄糖调控基因表达环路控制系统的原核表达载体。

本发明还提出了所述智能可控的微生物药物工厂在在制备预防和/或治疗疾病的药物或产品中的应用。所述药物或产品包括但不限于促进皮肤伤口愈合的药物、预防和/或治疗代谢性疾病的药物、预防和/或治疗其他疾病的药物等。

在具体实施方案中，所述皮肤伤口包括但不限于慢性皮肤伤口、糖尿病患皮肤伤口、糖尿病足溃疡等。

本发明还提出了智能可控的微生物(优选为益生菌)药物工厂在促进糖尿病皮肤伤口愈合中的应用。所述促进糖尿病皮肤伤口愈合的应用是通过伤口原位滴涂智能可控的益生菌药物工厂的方法实现，即通过构建智能可控的益生菌药物工厂，使其通过血糖诱导产生生长因子、细胞因子和趋化因子的方法实现，即，所述治疗方法是利用智能可控的益生菌药物工厂精确调控生长因子、细胞因子和趋化因子的表达与分泌来促进伤口愈合。

本发明还提出一种利用所述智能可控的微生物(益生菌)药物工厂从而促进皮肤伤口愈合的方法。所述方法包括以下步骤：

a)人工构建含有葡萄糖诱导生长因子、巨噬细胞M2极化细胞因子和趋化因子的表达调控系统的原核表达载体或用于染色体整合的功能模块；

b)制备含有葡萄糖诱导生长因子、巨噬细胞M2极化细胞因子和趋化因子表达调控系统的工程化细胞；

c)所述步骤b)制备的工程化细胞以伤口原位滴涂的形式移植至糖尿病模型鼠皮肤伤口处；

d)小鼠皮肤伤口处葡萄糖闭环诱导工程化细胞表达并分泌生长因子、巨噬细胞M2极化细胞因子和趋化因子，以实现促进伤口愈合的效果。

其中，所述生长因子为rhaFGF135、FGF2、FGF7、TGF-α、TGF-β、PDGF、 EGF、VEGF、IGF-1、IGF-2、PDGF、HGF；所述巨噬细胞M2极化细胞因子为 IL4、IL-10、IL-13、CSF1、IL34；所述趋化因子为CXCL12、CXCL13、CXCL8、 CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL11、CXCL10。

本发明还提出了一种质粒，所述质粒为质粒pGN233、pGN65、pGN299、 pGN300、pGN314之一种或几种，详见表1。

本发明还提出了一种核苷酸序列，其为葡萄糖诱导型强启动子P_HexR4、P_HexR9之一种，其序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.9所示。

本发明有益效果包括，本发明提供了一种促进慢性皮肤伤口愈合的新方法，通过所述智能可控的益生菌药物工厂、葡萄糖诱导生长因子、细胞因子和趋化因子表达调控系统，采用伤口原位滴涂益生菌的方式便可达到加速伤口愈合的效果。本发明提供了一种安全、可靠、可精确调控释放治疗因子加速慢性皮肤伤口、糖尿病足溃疡等慢性皮肤伤口愈合的新策略。所述系统可调控生长因子、巨噬细胞M2极化细胞因子和趋化因子的表达与分泌。本发明创新开发了一种将生长因子、巨噬细胞M2极化细胞因子和趋化因子直接传递到受伤皮肤的优化技术，以益生菌用作载体，用质粒或染色体基因组编码生长因子、巨噬细胞M2极化细胞因子和趋化因子。

本发明有益效果包括，提供一种智能可控的益生菌药物工厂，包括基因表达环路控制系统和底盘益生菌。本发明所述葡萄糖调控基因表达环路控制系统具有微调性、可逆性的表达动力学特征。本发明还提供所述智能可控的益生菌药物工厂或含有葡萄糖调控基因表达环路控制系统的原核表达载体或含有葡萄糖调控基因表达环路控制系统的工程化细胞在治疗糖尿病、促进慢性皮肤伤口愈合、促进糖尿病足溃疡等慢性皮肤伤口愈合、预防和/或治疗代谢疾病的药物中的应用。

附图说明

图1是本发明葡萄糖调控基因表达环路控制系统及调控方法的原理示意图。

图2是本发明葡萄糖调控基因表达环路控制系统的优化研究，即利用不同启动子启动表达HexR的表达载体分别和葡萄糖诱导型强启动子P_HexR1进行组合的实验结果。

图3是本发明葡萄糖调控基因表达环路控制系统的优化研究，即利用P_Tac启动表达HexR的表达载体分别和5种不同的响应元件进行组合的实验结果。

图4是本发明葡萄糖调控基因表达环路控制系统的优化研究，即利用RBS 调控HexR的表达载体分别和葡萄糖诱导型强启动子P_HexR4进行组合的实验结果。

图5是本发明葡萄糖调控基因表达环路控制系统具有微调性的表达动力学特征的实验结果。

图6是本发明葡萄糖调控基因表达环路控制系统具有可逆性的表达动力学特征的实验结果。

图7是在本发明葡萄糖调控基因表达环路控制系统中，不同的葡萄糖诱导时间对其基因表达影响的实验结果。

图8是本发明葡萄糖调控基因表达环路控制系统在野生型小鼠和1型糖尿病小鼠体内调控报告基因luxCDABE表达的实验结果。

图9是本发明调控胰高血糖素样肽表达分泌的益生菌药物工厂治疗1型糖尿病小鼠的实验结果。

图10是本发明调控胰高血糖素样肽表达分泌的益生菌药物工厂长期控制1 型糖尿病小鼠血糖的实验结果。

图11是本发明葡萄糖调控的益生菌药物工厂在1型糖尿病的治疗过程中糖耐受的实验结果。

图12是本发明葡萄糖调控基因表达环路控制系统在糖尿病小鼠皮肤伤口处调控报告基因luxCDABE表达的实验结果。

图13是本发明益生菌药物工厂受葡萄糖调控诱导人酸性成纤维生长因子rhaFGF135表达分泌的实验结果。

图14是本发明益生菌药物工厂受葡萄糖调控诱导趋化因子CXCL12表达分泌的实验结果。

图15是本发明糖尿病小鼠伤口处激活益生菌药物工厂表达和分泌人酸性成纤维生长因子rhaFGF135和趋化因子CXCL12的实验结果。

图16是本发明葡萄糖调控的益生菌药物工厂促进糖尿病小鼠皮肤伤口愈合的实验结果。

图17是本发明伤口原位滴涂益生菌药物工厂后小鼠的血液指标。

图18是本发明伤口原位滴涂益生菌药物工厂后重组益生菌在小鼠各脏器及血液中的残留。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。这些实施例仅用于举例说明发明，而不对本发明的范围构成任何限制。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。以下实施例中所用的试剂、仪器等，以及未注明具体条件的实验方法，按照常规或商品供货商所建议的条件进行。

分子克隆

分子克隆技术构建本发明所有表达质粒，步骤为业内常识。

所有用于PCR的引物均由金唯智生物科技有限公司合成。本发明实施例中构建的表达质粒都经过序列测定，序列测定由金唯智生物科技有限公司完成。本发明实施例中所用的Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司。核酸内切酶、T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司。同源重组酶购自和元生物技术(上海)股份有限公司。Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶购买时附带有相应的聚合酶缓冲液和dNTP。核酸内切酶、T4 DNA连接酶、同源重组酶购买时附带有相应的缓冲液。酵母提取物(YeastExtract)、胰蛋白胨(Trypton)、琼脂粉、M9培养基、葡萄糖、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)购自上海生工生物工程技术有限公司。DNA Marker DL5000、DNA Marker DL2000(宝生物工程有限公司)；核酸染料EB(广东国奥生物技术公司)；质粒小抽提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)；DNA胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒均购自康为世纪生物科技有限公司；实施例中提及的无水乙醇、 NaCl等其余试剂均为国产分析纯产品。DNA片段的胶回收、纯化回收，其步骤根据DNA胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)的操作说明书；质粒提取步骤根据质粒小抽(天根生化科技(北京)有限公司)提取试剂盒说明书。

细菌培养与转化

本发明实施例中用以下细菌底盘细胞和电转化为例说明葡萄糖调控基因表达环路控制系统在原核细胞及动物体内的工作情况，但不限制本发明保护范围。

细菌培养：大肠杆菌EcN培养于LB培养基中，培养基中加入100μg/ml的氨苄青霉素和50μg/ml的卡那霉素溶液；细菌培养于37℃、210rpm的摇床中。

大肠杆菌EcN感受态细胞的制备：所有用于感受态细胞制备的溶液和耗材均经过高温高压灭菌处理。将大肠杆菌EcN菌种划线于不含抗生素的平板上， 37℃倒置培养12～16h；挑取一个单菌落于2mL不含抗生素的LB摇菌管中， 37℃、210rpm振荡培养过夜。吸取1mL菌液转入100mL新鲜LB培养基中， 37℃、210rpm摇床振荡培养至OD₆₀₀在0.4～0.6之间。将培养液转入离心管中，冰上放置15min，然后于4℃、3500rpm离心10min，弃上清，依次用50mL和25mL预冷的ddH₂O重悬，4℃、3500rpm离心10min，用25mL预冷的10％甘油重悬，4℃、3500rpm离心10min。弃上清，用预冷的10％甘油重悬，分装(100μl/管)，-80℃保存。

转化：EcN的转化使用优化后的电转化法。简单的说，即将预冷的质粒(300-500ng)和感受态(100μl)混合物加进电转杯底部，电转参数设置为2mm， 2500V，电击一次。电击结束后，将培养基900μl加进电转杯，混匀后吸出置于灭菌的EP管中，37℃、210rpm孵育1h，将菌体涂布抗性平板(100μg/ml的 Amp和50μg/ml的Kan)，37℃培养16-20h。

报告基因绿色荧光蛋白(sfGFP)的检测

绿色荧光蛋白sfGFP在蓝光下具有肉眼可见的荧光，且其荧光强度可用酶标仪Synergy H1测定。吸取100μl细菌悬液于黑色96孔酶标板中，放在酶标仪中，在波长为480nm的激发光作用下，检测菌悬液在520nm的发射光读数，即为绿色荧光强度。同时吸取100μl细菌悬液于透明96孔酶标板中，使用酶标仪检测细菌培养液在600nm处的吸光值，即为菌体细胞密度。用荧光强度/菌体细胞密度来表征报告基因的表达效率。

分泌蛋白提取

在2ml细菌培养液上清中分别加入8ml甲醇、2ml氯仿和8ml水，混匀后 12000g离心10min，移除上层液体，加入8ml甲醇,混匀后12000g离心15min，弃尽上清，风干后加入30μlPBS缓冲液重悬沉淀。

蛋白免疫印记(Western Bloting)

将蛋白样品中加入10μl 4×蛋白上样缓冲液，进行SDS-PAGE电泳。使用湿式电印迹法进行转膜(250mA，1-1.5h)，使用TBST+5％的脱脂奶粉封闭1.5 h，TBST清洗3次后加入一抗，于4℃孵育过夜，TBST清洗3次后加入二抗，于室温孵育2h，使用凝胶成像系统进行显影检测。

实施例1，葡萄糖调控基因表达环路控制系统的构建

本实施例中包含了葡萄糖调控基因表达环路控制系统所涉及质粒载体的构建方法。详细设计方案及步骤见表1。

表1质粒构建表

引物对(编号1-30)，如表2所示：

实施例2，葡萄糖调控基因表达环路控制系统在EcN中的优化研究，即利用不同启动子启动表达HexR的表达载体分别和葡萄糖诱导型强启动子P_HexR1进行组合优化。

第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。

第二步，转化。本实施例的转化体系可分为4组，包括pGN11，pGN11和 pGN69，pGN11和pGN89，pGN11和pGN90。将上述每组质粒电转化EcN电转感受态。

第三步，培养。挑取阳性单克隆转接液体LB培养基，37℃、210rpm培养 12h。

第四步，检测报告基因sfGFP的表达量。吸取100μL细菌悬液于黑色96孔酶标板中和透明96孔酶标板中，使用酶标仪检测荧光强度和菌体细胞密度。用荧光强度/菌体细胞密度来表征报告基因的表达效率。

实验结果(见图2)显示外源表达HexR阻遏蛋白后，均可抑制报告基因sfgfp 的表达，其中Tac启动子启动表达HexR(pGN89)后报告基因的表达阻遏最强。

实施例3，葡萄糖调控基因表达环路控制系统在EcN中的优化研究，即利用 P_Tac启动表达HexR的表达载体分别和5种不同的响应元件进行组合优化。

第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。

第二步，转化。本实施例的转化体系可分为5组，包括pGN89和pGN11, pGN89和pGN227，pGN89和pGN12，pGN89和pGN228，pGN89和pGN229。将上述每组质粒电转化EcN电转感受态。

第三步，培养(具体步骤同实施例2)。

第四步，诱导。5000rpm离心5min，以等量M9培养基用枪头吹打均匀，按500μL的培养体积分装至48孔板。不同实验组添加相应浓度的无菌葡萄糖溶液诱导，37℃、150rpm振荡培养12h。

第五步，检测报告基因sfGFP的表达量(具体步骤同本发明实施例2)。

实验结果(见图3)显示葡萄糖调控基因表达环路控制系统的不同优化组合均能激活报告基因sfGFP的表达，但系统所产生的诱导效果各不相同，其中， pGN89和pGN228的组合诱导倍数最佳。

实施例4，葡萄糖调控基因表达环路控制系统在EcN中的优化研究，即利用 RBS调控HexR的表达载体分别和葡萄糖诱导型强启动子P_HexR4进行组合优化。

第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。

第二步，转化。本实施例的转化体系可分为4组，包括pGN89和pGN228， pGN231和pGN228，pGN232和pGN228，pGN233和pGN228。将上述每组质粒电转化EcN电转感受态。

第三步，培养(具体步骤同本发明实施例2)。

第四步，诱导(具体步骤同本发明实施例3)。

实验结果(见图4)显示葡萄糖调控基因表达环路控制系统的不同优化组合均能激活报告基因sfGFP的表达，但系统所产生的诱导效果各不相同，其中， pGN233和pGN228的组合诱导倍数最佳。

实施例5，葡萄糖调控基因表达环路控制系统具有微调性的表达动力学特征研究。

第一步，将本发明实施例4获得的诱导倍数最佳的工程菌接种、培养，5000 rpm离心5min，以等量M9培养基用枪头吹打均匀，按500μL的培养体积分装至48孔板。不同实验组添加不同终浓度的无菌葡萄糖溶液诱导，37℃、150rpm 振荡培养12h。

第二步，检测报告基因sfGFP的表达量(具体步骤同本发明实施例2)。

实验结果(见图5)显示葡萄糖调控基因表达环路控制系统的工程菌受葡萄糖的精确调控，即剂量依赖性地诱导基因表达，进而表明其具有微调性的表达动力学特征。

实施例6，葡萄糖调控基因表达环路控制系统具有可逆性的表达动力学特征研究。

第一步，将本发明实施例4获得的诱导倍数最佳的工程菌接种、培养，5000 rpm离心5min，以等量M9培养基用枪头吹打均匀，按500μL的培养体积分装至48孔板。

第二步，“ON-OFF-ON”实验组在0h加入终浓度20mM的无菌葡萄糖溶液诱导；第2h，离心洗去原有的培养基，加入不含葡萄糖的M9培养基重悬培养；第7h，离心洗去培养基，加入含终浓度20mM葡萄糖的M9培养基重悬培养。而“OFF-ON-OFF”实验组则在0h加入不加葡萄糖诱导；第2h，加入终浓度20mM的无菌葡萄糖溶液诱导；第7h，离心洗去原有的培养基，加入不含葡萄糖的M9培养基重悬培养。两实验组均每隔1h吸取菌液检测报告基因sfGFP 的表达量(具体步骤同本发明实施例2)。

实验结果(见图6)表明通过控制葡萄糖的存在与否可以实现其系统基因表达的开启或关闭，说明葡萄糖调控基因表达环路控制系统具有良好的可逆性。

实施例7，在葡萄糖调控基因表达环路控制系统中，葡萄糖的不同诱导时间控制其基因表达的研究。

第一步，将本发明实施例4获得的诱导倍数最佳的工程菌接种、培养，5000 rpm离心5min，以等量M9培养基用枪头吹打均匀，按500μL的培养体积分装至48孔板。不同实验组添加终浓度20mM的无菌葡萄糖溶液，37℃、150rpm 振荡培养不同时间(0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h)。

实验结果(见图7)显示系统的基因表达量受到葡萄糖诱导时间的调控，即说明葡萄糖调控基因表达环路控制系统具有良好的可控性。

实施例8，利用链脲霉素(STZ)造模法构建1型糖尿病模型鼠。

第一步，禁食。给药前，选择40只体重为25g左右，雄性的C57BL/6J小鼠进行长达16h的禁食。

第二步，给药。将STZ溶解于柠檬酸缓冲液(0.1mol/L，pH 4.5)中，然后以40-50mg/kg的给药剂量进行小鼠腹腔注射，并连续注射5天。由于STZ 易降解，因此整个过程需要保证药品处于低温避光的状态，且注射过程需快速。

第三步，测定血糖值。第9天，在小鼠饥饿4小时后检测血糖水平，血糖值高于16.7mM的小鼠可视为造模成功。

实施例9，葡萄糖调控基因表达环路控制系统在1型糖尿病小鼠体内调控报告基因luxCDABE的表达研究。

第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。

第二步，转化。将pGN65和pGN233电转化EcN电转感受态。

第三步，培养(具体步骤同本发明实施例2)。

第四步，细胞收集。5000rpm离心5min，用无菌的PBS洗涤3次后重悬(10⁹ CFU/100μl)。

第五步，灌胃。将细菌悬浮液分别灌胃至野生型小鼠和1型糖尿病小鼠体内(禁食4h)，每只小鼠100μl(10⁹CFU工程菌)。

第六步，检测小鼠体内luxCDABE的表达量。灌胃6h后，通过小动物活体成像仪检测生物发光信号。

实验结果(见图8)显示葡萄糖调控基因表达环路控制系统在1型糖尿病小鼠体内能激活基因表达，而在野生型小鼠体内不能激活基因表达。

实施例10，构建并测定葡萄糖调控胰高血糖素样肽表达和分泌的工程菌。

第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。

第二步，转化(具体步骤同本发明实施例2)。本实施例的转化体系可分为 8组，包括pGN237和pGN233,pGN238和pGN233，pGN239和pGN233，pGN241 和pGN233，pGN242和pGN233，pGN243和pGN233，pGN288和pGN233，pGN308 和pGN233。将上述每组质粒电转化EcN电转感受态。

第三步，鉴定胰高血糖素样肽的表达和分泌。将扩增好的工程菌接种后加入 20mM葡萄糖诱导。12h后检测胞内外胰高血糖素样肽的含量。将诱导分泌效果佳的工程菌进行扩增、保存。

实施例11，调控胰高血糖素样肽表达分泌的益生菌治疗2型糖尿病(dbdb)小鼠的研究。

本实施例以2型糖尿病小鼠为例，举例证明益生菌葡萄糖传感器对于糖尿病的闭环治疗功能，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：

第一步，细胞收集。将实施例10筛选获得的诱导胰高血糖素样肽分泌效果佳的工程菌和本发明实施例9中筛选获得的调控报告基因luxCDABE表达的工程菌扩增培养，5000rpm离心5min，用无菌的PBS洗涤3次后重悬(10⁹CFU/100 μl)。

第二步，灌胃。分别将PBS和步骤一扩增后的两种工程菌悬浮液灌胃至2 型糖尿病小鼠体内(禁食4h)，每只小鼠100μl(10⁹CFU工程菌)。

第三步，检测小鼠血糖。灌胃24h后，使用血糖试纸条检测小鼠血糖(小鼠禁食4h)。同时检测野生型小鼠血糖作为对照。

实验结果(见图9)显示口服调控胰高血糖素样肽表达与分泌的益生菌可降低2型糖尿病鼠的血糖水平。

实施例12，调控胰高血糖素样肽表达分泌的益生菌治疗2型糖尿病小鼠的长期性的效果研究。

第一步，细胞收集(具体步骤同本发明实施例11)。

第二步，灌胃。连续15天每24h按照本发明实施例11的步骤进行灌胃。

第三步，检测小鼠血糖(具体步骤同本发明实施例11)。

实验结果(见图10)显示口服调控胰高血糖素样肽表达与分泌的益生菌可长期维持2型糖尿病鼠的血糖稳态。

实施例13，葡萄糖调控的益生菌药物工厂在2型糖尿病的治疗过程中糖耐受研究。

本实施例是在2型糖尿病模型鼠进行本发明实施例12的治疗后展开的，其糖耐受的具体实验方法如下：

第一步，模型鼠进行16小时的禁食。

第二步，配制125mg/ml的葡萄糖溶液。

第三步，测量小鼠的0点血糖，并按照1.25g/kg的葡萄糖剂量进行腹腔注射。然后，依次测量小鼠在30，60，90，120min的血糖值。

实验结果(见图11)显示相比于对照组，治疗组的高血糖症得到了良好的改善和控制，即说明调控胰高血糖素样肽表达分泌的益生菌在2型糖尿病治疗上有显著的效果。

实施例14，糖尿病小鼠皮肤伤口造模。

第一步，麻醉。选择40只1型糖尿病模型鼠，使用吸入式麻醉法以气体麻醉剂异氟烷麻醉。

第二步，脱毛。用小动物电推剪和脱毛膏脱去小鼠背部毛发，并用酒精棉擦拭干净。

第三步，全层皮肤损失。于小鼠背部脊椎两侧脱毛处标记两个相同的圆形区域(面积约30mm²)，沿标记剪去皮肤及皮下组织深至筋膜层，两个切除部分由完整的皮肤分开。采用随机分组法对小鼠背部伤口进行分组。

实施例15，葡萄糖调控的益生菌药物工厂在1型糖尿病小鼠皮肤伤口处调控报告基因luxCDABE的表达研究。

第一步，转化。将pGN65和pGN233电转化EcN电转感受态。

第二步，培养。挑取阳性单克隆转接液体LB培养基，37℃、210rpm培养 12h。

第三步，细胞收集。5000rpm离心5min，用无菌的PBS洗涤3次后重悬(10⁹ CFU/10μl)。

第四步，皮肤原位滴涂。将细菌悬浮液分别滴涂至1型糖尿病小鼠皮肤伤口处，每只小鼠10μl(10⁹CFU工程菌)。

第五步，检测小鼠皮肤伤口处luxCDABE的表达量。工程菌滴涂后，通过小动物活体成像仪检测生物发光信号。

实验结果(见图12)显示葡萄糖调控基因表达环路控制系统在糖尿病小鼠皮肤伤口处能持续激活基因表达，激活约可维持24小时。

实施例16，构建并测定葡萄糖调控人酸性成纤维生长因子rhaFGF135表达和分泌的益生菌药物工厂。

第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。

第二步，转化。将pGN299和pGN233电转化EcN电转感受态。

第三步，鉴定rhaFGF135的表达和分泌。将扩增好的工程菌接种后加入20 mM葡萄糖诱导。12h后离心取上清，提取上清中的蛋白，通过western bloting 检测rhaFGF135的含量。将诱导分泌效果佳的工程菌进行扩增、保存。

实验结果(见图13)显示葡萄糖可调控rhaFGF135的表达和分泌。

实施例17，构建并测定葡萄糖调控趋化因子CXCL12表达和分泌的益生菌药物工厂。

第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。

第二步，转化。将pXG22和pGN233电转化EcN电转感受态。

第三步，鉴定CXCL12的表达和分泌。将扩增好的工程菌接种后加入20mM 葡萄糖诱导。12h后离心取上清，提取上清中的蛋白，通过western bloting检测 CXCL12的含量。将诱导分泌效果佳的工程菌进行扩增、保存。

实验结果(见图14)显示葡萄糖可调控CXCL12的表达和分泌。

实施例18，验证糖尿病小鼠伤口处激活益生菌药物工厂表达和分泌人酸性成纤维生长因子rhaFGF135和趋化因子CXCL12。

第一步，细菌培养。将葡萄糖调控人酸性成纤维生长因子rhaFGF135和趋化因子CXCL12表达和分泌的益生菌及野生型EcN接种液体LB培养基，37℃、 210rpm培养12h。

第二步，细胞收集(具体步骤同本发明实施例4)。

第三步，皮肤原位滴涂(具体步骤同本发明实施例4)。

第四步，皮肤组织取样。6小时后，处死小鼠，剪取小鼠伤口处皮肤。

第五步，组织切片。将皮肤组织置于4％多聚甲醛中固定24小时，流水过夜冲洗，将皮肤依次经过30％、50％、75％、85％、95％、100％的乙醇、50％乙醇和50％的二甲苯混合液中各浸泡1小时，再依次经过100％二甲苯和新的100％二甲苯中各通透5分钟。随后于50％二甲苯和50％的石蜡中浸蜡1小时，于100％石蜡中浸泡过夜，第二天转移至新的100％石蜡中浸泡1小时。使用包埋机进行包埋后于-20℃冷冻过夜。使用石蜡切片机进行组织切片。

第六步，免疫荧光染色。依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85％酒精5min-75％酒精5min-蒸馏水洗。组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(pH 8.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火8min至沸，停火8min，再转中低火7min。自然冷却后将玻片置于PBS(pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走)，甩干PBS，滴加BSA，封闭30min。轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。玻片置于PBS(pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次 5min。切片稍甩干后在圈内滴加二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。玻片置于PBS(pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。玻片置于PBS(pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。切片于荧光显微镜下观察并采集图像(DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发红光)。

实验结果(见图15)显示糖尿病小鼠伤口处可激活葡萄糖调控的益生菌药物工厂表达和分泌人酸性成纤维生长因子rhaFGF135和趋化因子CXCL12。

实施例19，调控人酸性成纤维生长因子rhaFGF135和趋化因子CXCL12表达分泌的益生菌药物工厂促进糖尿病小鼠皮肤伤口愈合的研究。

本实施例以1型糖尿病小鼠皮肤伤口为例，举例证明葡萄糖调控的益生菌药物工厂对于小鼠皮肤伤口愈合的促进，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：

第一步，细菌培养(具体步骤同本发明实施例8)。

第二步，细胞收集。将实例5-7筛选获得的诱导人酸性成纤维生长因子 rhaFGF135和趋化因子CXCL12分泌效果佳的重组益生菌和野生型的EcN扩增培养，5000rpm离心5min，用无菌的PBS(pH 6.35)洗涤3次后重悬(10⁹CFU/10 μl)。

第三步，原位滴涂细菌。分别将PBS、人酸性成纤维生长因子rhaFGF135、野生型EcN、调控人酸性成纤维生长因子rhaFGF135表达分泌的益生菌、调控趋化因子CXCL12表达分泌的益生菌悬浮液原位滴涂至糖尿病小鼠皮肤伤口处，每只小鼠每24小时10μl(10⁹CFU工程菌)。

第四步，检测小鼠皮肤伤口大小。每24h对小鼠皮肤伤口进行拍照，使用 Image J软件统计伤口面积。

实验结果(见图16)显示原位滴涂调控rhaFGF135和CXCL12表达与分泌的益生菌可显著促进糖尿病小鼠皮肤伤口的愈合。

实施例20，益生菌药物工厂促进皮肤伤口愈合的安全性验证。

第一步，细菌培养(具体步骤同本发明实施例7)。

第二步，细胞收集(具体步骤同本发明实施例4)。

第三步，原位滴涂细菌(具体步骤同本发明实施例4)。

第四步，取样。涂菌24小时后取小鼠血液，随后处死小鼠，分别取心、肝、脾、肺、肾，加入PBS缓冲液后进行研磨。

第五步，安全验证。对小鼠血液进行血常规分析；吸取组织研磨液涂布LB 平板，37℃静置培养12小时后进行菌落计数。

实验结果(见图17、图18)显示原位滴涂益生菌不影响小鼠的血液指标，且细菌不会侵染小鼠的脏器，24小时后血液中也没有残留。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东师范大学

<120> 葡萄糖调控基因表达环路控制系统及其调控血糖的应用

<160> 80

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 64

<212> DNA

<213> 葡萄糖诱导型强启动子PHexR1

<400> 1

ttgacatccc acctcacgta tgctataatg tgtgcagtct gacgcggcgt tgttggaatt 60

acaa 64

<210> 2

<211> 79

<212> DNA

<213> 葡萄糖诱导型强启动子PHexR2

<400> 2

ttgacatccc acctcacgta tgctataatg tgtgcagtct gacgcggcgt tgttggaatt 60

acaattgttg gaattacaa 79

<210> 3

<211> 94

<212> DNA

<213> 葡萄糖诱导型强启动子PHexR3

<400> 3

ttgacatccc acctcacgta tgctataatg tgtgcagtct gacgcggcgt tgttggaatt 60

acaattgttg gaattacaat tgttggaatt acaa 94

<210> 4

<211> 109

<212> DNA

<213> 葡萄糖诱导型强启动子PHexR4

<400> 4

ttgacatccc acctcacgta tgctataatg tgtgcagtct gacgcggcgt tgttggaatt 60

acaattgttg gaattacaat tgttggaatt acaattgttg gaattacaa 109

<210> 5

<211> 124

<212> DNA

<213> 葡萄糖诱导型强启动子PHexR5

<400> 5

ttgacatccc acctcacgta tgctataatg tgtgcagtct gacgcggcgt tgttggaatt 60

acaattgttg gaattacaat tgttggaatt acaattgttg gaattacaat tgttggaatt 120

acaa 124

<210> 6

<211> 91

<212> DNA

<213> 葡萄糖诱导型强启动子PHexR6

<400> 6

tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gttgttggaa ttacaattgt tggaattaca 60

attgttggaa ttacaattgt tggaattaca a 91

<210> 7

<211> 81

<212> DNA

<213> 葡萄糖诱导型强启动子PHexR7

<400> 7

tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt ggtgtgcagt ctgacgcggc gttgttggaa 60

ttacaattgt tggaattaca a 81

<210> 8

<211> 96

<212> DNA

<213> 葡萄糖诱导型强启动子PHexR8

<400> 8

tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt ggtgtgcagt ctgacgcggc gttgttggaa 60

ttacaattgt tggaattaca attgttggaa ttacaa 96

<210> 9

<211> 111

<212> DNA

<213> 葡萄糖诱导型强启动子PHexR9

<400> 9

tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt ggtgtgcagt ctgacgcggc gttgttggaa 60

ttacaattgt tggaattaca attgttggaa ttacaattgt tggaattaca a 111

<210> 10

<211> 126

<212> DNA

<213> 葡萄糖诱导型强启动子PHexR10

<400> 10

tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt ggtgtgcagt ctgacgcggc gttgttggaa 60

ttacaattgt tggaattaca attgttggaa ttacaattgt tggaattaca attgttggaa 120

ttacaa 126

<210> 11

<211> 31

<212> PRT

<213> 胰高血糖素样肽（GLP-1）

<400> 11

His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Gln Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Asn Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 12

<211> 36

<212> PRT

<213> 胰高血糖素样肽EK-GLP-1

<400> 12

Asp Asp Asp Asp Lys His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser

1 5 10 15

Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Gln Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val

20 25 30

Asn Gly Arg Gly

35

<210> 13

<211> 270

<212> PRT

<213> 胰高血糖素样肽GLP-1-Fc

<400> 13

His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Gln Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Asn Gly Arg Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Gly Ser Ile Ser Ala Met Val Arg Ser Asp Lys Thr His Thr

35 40 45

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

50 55 60

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

65 70 75 80

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

85 90 95

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

100 105 110

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

115 120 125

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

130 135 140

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

145 150 155 160

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

165 170 175

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

180 185 190

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

195 200 205

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

210 215 220

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

225 230 235 240

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

245 250 255

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260 265 270

<210> 14

<211> 136

<212> PRT

<213> 人酸性成纤维细胞因子（rhaFGF135）

<400> 14

Met Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly

1 5 10 15

His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp

20 25 30

Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly

35 40 45

Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln Tyr Leu Ala Met Asp

50 55 60

Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu

65 70 75 80

Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys

85 90 95

Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser

100 105 110

Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe

115 120 125

Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp

130 135

<210> 15

<211> 69

<212> PRT

<213> 趋化因子（CXCL12）

<400> 15

Met Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu

1 5 10 15

Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr

20 25 30

Pro Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg

35 40 45

Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu

50 55 60

Lys Ala Leu Asn Lys

65

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ttgttggaat tacaacccct ctagaaataa ttttg 35

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ttgtaattcc aacaacgccg cgtcagactg cacac 35

<210> 18

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ggagaaatac tagatggcag atcttgtgcg aaacctcctg gaacagat 48

<210> 19

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tttctttacc agactcgagg gtacctcagt tgaggtcgtc gtcctc 46

<210> 20

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ttgtaattcc aacaattgta attccaacaa cgccgcgtca gactgcacac 50

<210> 21

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ttgttggaat tacaattgtt ggaattacaa cccctctaga aataattttg 50

<210> 22

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ttgtaattcc aacaattgta attccaacaa ttgtaattcc aacaattgta attccaacaa 60

cgccgcgtca gactgcacac 80

<210> 23

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ttgtaattcc aacaattgta attccaacaa ttgttggaat tacaacccct ctagaaataa 60

ttttg 65

<210> 24

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt ggtgtgcagt ctgacgcggc gttg 54

<210> 25

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

cggaagcata aagtgtaaac ttaagcatat ggtgcactct cagtacaatc 50

<210> 26

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

tttgtttaac tttaagaagg agatataccg tgcgaaacct cctggaac 48

<210> 27

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

tctccttctt aaagttaaac aaaattattt ctagacatta tacgagccga tgattaa 57

<210> 28

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gactcgtctt ataaggaaag ttaacggtgc gaaacctcct ggaac 45

<210> 29

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

gttaactttc cttataagac gagtctattc attatacgag ccgatgatta att 53

<210> 30

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

acaacaaagc aaaaataggg ggttcggtgc gaaacctcct ggaac 45

<210> 31

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

aaccccctat ttttgctttg ttgtgctcat tatacgagcc gatgattaat t 51

<210> 32

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

ttaagaagga gatataccat gggcagcagc atgactaaaa aaatttcatt cattattaac 60

<210> 33

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

agcttgtcga cggagctcga attctcaact attaaatgct tggtttaagc 50

<210> 34

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

tgctctggct ctgctgccgc tgctgtttac cccggtaacc aaggcacatt ccgaaggcac 60

ctttacct 68

<210> 35

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

agaaggagat ataccatgat gaaacagtcc accattgctc tggctctgct gc 52

<210> 36

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

tgctcgagtg cggccgctca cttgtcatcg tcatccttgt 40

<210> 37

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

tgcactggct ggtttcgcga ccgtggcaca ggctcattcc gaaggcacct ttacct 56

<210> 38

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

agaaggagat ataccatgat gaaaaaaacc gctatcgcaa tcgccgttgc actggctggt 60

ttcgc 65

<210> 39

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

atagtactaa cgaccccgat tgcgattagc tcttttgcgc atagcgaagg caccttcacc 60

t 61

<210> 40

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

agaaggagat ataccatgag ggctaaatta ttgggaatag tactaacgac cccgattgc 59

<210> 41

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

tagcggtggc tgtggcggcg ggtgttatga gcgcacaggc acatagcgag ggcacct 57

<210> 42

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

agaaggagat ataccatgat gataacattg aggaaattac ccctagcggt ggctgtggcg 60

<210> 43

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

tgcgggcctg ttgttgctgg ctgcgcagcc ggcaatggcg catagcgagg gcacct 56

<210> 44

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

agaaggagat ataccatgaa atatttacta cccacagcag ctgcgggcct gttgttgc 58

<210> 45

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

aagctttata tctacaagtt tgccgctgcc gacccatagc gaaggtacgt ttacct 56

<210> 46

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

agaaggagat ataccatgaa aatttcaagc tttatatcta caagtttgcc g 51

<210> 47

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

ccgaccgacg acgacgacaa gcatagcgaa ggtacgttta cc 42

<210> 48

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

cgctatgctt gtcgtcgtcg tcggtcggca gcggcaaac 39

<210> 49

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

ccgaccgacg acgacgacaa gcatagcgaa ggtacgttta cc 42

<210> 50

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

tggtggtgct cgagtttacc cggagacagg gagagg 36

<210> 51

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

taaactcgag caccaccacc accac 25

<210> 52

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

cgctatgctt gtcgtcgtcg tcggtcggca gcggcaaac 39

<210> 53

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

agcagcttta ttagtaccag tctgccgctg ccgaccgcta actataaaaa accgaaactg 60

ctgt 64

<210> 54

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

ttaagaagga gatataccat gaagatcagc agctttatta gtaccagtct gc 52

<210> 55

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

gtcgacggag ctcgaattct taagcgtaat ctggaacatc gtatgggtag tccgacgaca 60

ccggc 65

<210> 56

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

atagcgattg ctgtagcgct ggcgggtttt gctaccgttg ctcaggcgaa accggtgagt 60

ctgagttatc gttgcc 76

<210> 57

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

taactttaag aaggagatat accatgaaaa agacagcaat agcgattgct gtagcgct 58

<210> 58

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

gtcgacggag ctcgaattct taagcgtaat ctggaacatc gtatgggtat ttattcagtg 60

ctttttccag atattcctg 79

<210> 59

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

attacgctta agaattcaat agactcgtct tataaggaaa gttaacgatg aaaaagacag 60

caatagcgat tgct 74

<210> 60

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

tggtggtggt ggtgctcgag tttattcagt gctttttcca gatattc 47

<210> 61

<211> 284

<212> PRT

<213> 鼠源胰岛十二指肠同源盒-1(mPDX-1)

<400> 61

Met Asn Ser Glu Glu Gln Tyr Tyr Ala Ala Thr Gln Leu Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Pro Cys Ala Phe Gln Arg Gly Pro Val Pro Glu Phe Ser Ala Asn Pro

20 25 30

Pro Ala Cys Leu Tyr Met Gly Arg Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro

35 40 45

Gln Phe Thr Ser Ser Leu Gly Ser Leu Glu Gln Gly Ser Pro Pro Asp

50 55 60

Ile Ser Pro Tyr Glu Val Pro Pro Leu Ala Ser Asp Asp Pro Ala Gly

65 70 75 80

Ala His Leu His His His Leu Pro Ala Gln Leu Gly Leu Ala His Pro

85 90 95

Pro Pro Gly Pro Phe Pro Asn Gly Thr Glu Pro Gly Gly Leu Glu Glu

100 105 110

Pro Asn Arg Val Gln Leu Pro Phe Pro Trp Met Lys Ser Thr Lys Ala

115 120 125

His Ala Trp Lys Gly Gln Trp Ala Gly Gly Ala Tyr Thr Ala Glu Pro

130 135 140

Glu Glu Asn Lys Arg Thr Arg Thr Ala Tyr Thr Arg Ala Gln Leu Leu

145 150 155 160

Glu Leu Glu Lys Glu Phe Leu Phe Asn Lys Tyr Ile Ser Arg Pro Arg

165 170 175

Arg Val Glu Leu Ala Val Met Leu Asn Leu Thr Glu Arg His Ile Lys

180 185 190

Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Glu Glu Asp Lys

195 200 205

Lys Arg Ser Ser Gly Thr Pro Ser Gly Gly Gly Gly Gly Glu Glu Pro

210 215 220

Glu Gln Asp Cys Ala Val Thr Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ala Val Pro

225 230 235 240

Pro Leu Pro Pro Pro Gly Gly Ala Val Pro Pro Gly Val Pro Ala Ala

245 250 255

Val Arg Glu Gly Leu Leu Pro Ser Gly Leu Ser Val Ser Pro Gln Pro

260 265 270

Ser Ser Ile Ala Pro Leu Arg Pro Gln Glu Pro Arg

275 280

<210> 62

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

caccaccacc accaccacat gaacagtgag gagcagtac 39

<210> 63

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

ttaacgacga cgctggcggc gttttttacg gccgtaaccg ccaccccggg gttcctgcgg 60

t 61

<210> 64

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

gccagcgtcg tcgttaatga gatccggctg ctaacaaa 38

<210> 65

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

tggtggtggt ggtggtgggt cggcagcggc aaac 34

<210> 66

<211> 283

<212> PRT

<213> 人源胰岛十二指肠同源盒-1(hPDX-1)

<400> 66

Met Asn Gly Glu Glu Gln Tyr Tyr Ala Ala Thr Gln Leu Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Pro Cys Ala Phe Gln Arg Gly Pro Ala Pro Glu Phe Ser Ala Ser Pro

20 25 30

Pro Ala Cys Leu Tyr Met Gly Arg Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro His

35 40 45

Pro Phe Pro Gly Ala Leu Gly Ala Leu Glu Gln Gly Ser Pro Pro Asp

50 55 60

Ile Ser Pro Tyr Glu Val Pro Pro Leu Ala Asp Asp Pro Ala Val Ala

65 70 75 80

His Leu His His His Leu Pro Ala Gln Leu Ala Leu Pro His Pro Pro

85 90 95

Ala Gly Pro Phe Pro Glu Gly Ala Glu Pro Gly Val Leu Glu Glu Pro

100 105 110

Asn Arg Val Gln Leu Pro Phe Pro Trp Met Lys Ser Thr Lys Ala His

115 120 125

Ala Trp Lys Gly Gln Trp Ala Gly Gly Ala Tyr Ala Ala Glu Pro Glu

130 135 140

Glu Asn Lys Arg Thr Arg Thr Ala Tyr Thr Arg Ala Gln Leu Leu Glu

145 150 155 160

Leu Glu Lys Glu Phe Leu Phe Asn Lys Tyr Ile Ser Arg Pro Arg Arg

165 170 175

Val Glu Leu Ala Val Met Leu Asn Leu Thr Glu Arg His Ile Lys Ile

180 185 190

Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Glu Glu Asp Lys Lys

195 200 205

Arg Gly Gly Gly Thr Ala Val Gly Gly Gly Gly Val Ala Glu Pro Glu

210 215 220

Gln Asp Cys Ala Val Thr Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ala Leu Pro Pro

225 230 235 240

Pro Pro Pro Pro Gly Gly Ala Val Pro Pro Ala Ala Pro Val Ala Ala

245 250 255

Arg Glu Gly Arg Leu Pro Pro Gly Leu Ser Ala Ser Pro Gln Pro Ser

260 265 270

Ser Val Ala Pro Arg Arg Pro Gln Glu Pro Arg

275 280

<210> 67

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

caccaccacc accaccacat gaacggcgag gagcagt 37

<210> 68

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

ttaacgacga cgctggcggc gttttttacg gccgtaaccg ccacctcgtg gttcctgcgg 60

cc 62

<210> 69

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

gccagcgtcg tcgttaatga gatccggctg ctaacaaa 38

<210> 70

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

tggtggtggt ggtggtgggt cggcagcggc aaac 34

<210> 71

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

atccggctgc taacaaagga aataattttg tttaacttta agaaggagat ataccatgaa 60

aatttcaagc 70

<210> 72

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

caactcagct tcctttcggg ttaacgacga cgctggcgg 39

<210> 73

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

aaggaagctg agttggctgc tg 22

<210> 74

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

tcctttgtta gcagccggat ctca 24

<210> 75

<211> 129

<212> PRT

<213> 人源白介素4因子（hIL4）

<400> 75

His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser

1 5 10 15

Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile

20 25 30

Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala

35 40 45

Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg

50 55 60

Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile

65 70 75 80

Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu

85 90 95

Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe

100 105 110

Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser

115 120 125

Ser

<210> 76

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

ggaagatctt ccaaagagga gaaatactag atgaaaatct cctctttca 49

<210> 77

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 77

cggggtaccc cgccggatct cagtggtggt ggt 33

<210> 78

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 78

ttgtggtttt tacta 15

<210> 79

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 79

ttgtaattcc aacaa 15

<210> 80

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 80

ttgtttaaat atacaa 16

Claims

1.一种葡萄糖调控基因表达环路控制系统，其特征在于，其包括转录抑制子HexR，葡萄糖诱导型强启动子和待转录序列。

2.如权利要求1所述的葡萄糖调控基因表达环路控制系统，其特征在于，所述转录抑制子HexR可同源二聚化并与特异的DNA序列相结合，所述特异的DNA序列选自序列SEQ IDNO.78～80。

3.如权利要求2所述的葡萄糖调控基因表达环路控制系统，其特征在于，所述葡萄糖诱导型强启动子是由组成型强启动子与所述特异的DNA序列组合而成；所述葡萄糖诱导型强启动子包括如SEQ ID NO.1-10之任一种核苷酸序列。

4.如权利要求1所述的葡萄糖调控基因表达环路控制系统，其特征在于，所述转录抑制子为可结合至所述葡萄糖诱导型强启动子上并进而阻遏下游待转录序列的表达。

5.如权利要求1所述的葡萄糖调控基因表达环路控制系统，其特征在于，所述待转录序列包括单一编码表达报告蛋白或功能型蛋白，或串联表达多种蛋白。

6.如权利要求1所述的葡萄糖调控基因表达环路控制系统，其特征在于，所述转录抑制子、葡萄糖诱导型强启动子和待转录序列可构建在一个或两个质粒载体上。

7.一种葡萄糖诱导基因表达调控方法，其特征在于，所述方法是由如权利要求1所述的葡萄糖调控基因表达环路控制系统进行调控。

8.如权利要求7所述的葡萄糖诱导基因表达调控方法，其特征在于，

当葡萄糖不存在时，所述转录抑制子可结合至所述葡萄糖诱导型强启动子上，进而阻遏下游待转录序列的表达；

当葡萄糖存在时，葡萄糖经Entner-Doudoroff途径代谢生成代谢中间物2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate(KDPG)，KDPG阻断其结合，使所述转录抑制子从所述葡萄糖诱导型强启动子上解离下来，启动下游待转录序列的表达。

9.一种表达载体、工程化细胞、传感器或重组益生菌，其特征在于，其含有如权利要求1所述的葡萄糖调控基因表达环路控制系统。

10.如权利要求9所述的表达载体、工程化细胞、传感器或重组益生菌，其特征在于，所述葡萄糖调控基因表达环路控制系统位于所述工程化细胞、传感器或重组益生菌的染色体或质粒中的任意一种。

11.如权利要求1所述的葡萄糖调控基因表达环路控制系统，如权利要求9所述的表达载体、工程化细胞、传感器或重组益生菌在制备治疗和/或预防糖尿病的药物、制备调控血糖的药物中的应用。

12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述应用包括口服药物。

13.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述应用包括通过调控释放胰高血糖素样肽、胰岛十二指肠同源盒-1降糖蛋白来调控血糖。

14.一种调控血糖的方法，其特征在于，所述方法利用如权利要求1所述的葡萄糖调控基因表达环路控制系统，和/或，利用如权利要求9所述的表达载体、工程化细胞、传感器或重组益生菌来调控血糖。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法调控GLP-1、PDX-1降糖蛋白的表达。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

c)将步骤b)制备的所述工程化细胞以灌胃的形式移植至糖尿病模型鼠体内；

17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法包括采用口服益生菌的方式。

18.如权利要求1所述的的葡萄糖调控基因表达环路控制系统，如权利要求7所述的葡萄糖诱导基因表达调控方法，如权利要求9所述的表达载体、工程化细胞、传感器或重组益生菌，如权利要求14所述的调控血糖的方法，其特征在于，所述葡萄糖调控基因表达环路控制系统具有微调性、可逆性的表达动力学特征；所述微调性是指下游的基因表达受葡萄糖的精准调控，并呈现出剂量依赖性的关系；所述可逆性是指葡萄糖调控基因表达的整个过程是可逆的，可以通过控制葡萄糖的存在与否实现基因表达的开启或关闭。

19.一种质粒，其特征在于，所述质粒为选自质粒pGN11、pGN69、pGN89、pGN90、pGN227、pGN12、pGN228、pGN229、pGN220、pGN221、pGN222、pGN223、pGN224、pGN231、pGN232、pGN233、pGN65、pGN237、pGN238、pGN239、pGN241、pGN242、pGN243、pGN288、pGN308、pGN306、pGN307、pXG58之一种或几种。

20.一种核苷酸序列，其特征在于，其为葡萄糖诱导型强启动子P_HexR1、P_HexR2、P_HexR3、P_HexR4、P_HexR5、P_HexR6、P_HexR7、P_HexR8、P_HexR9、P_HexR10之一种，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～10所示。

21.一种引物/引物对，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.16-60、62-65、67-74、76-77所示的其中一种或几种；所述引物对的序列如编号1-30所示引物对之一种或几种。