CN113817042B

CN113817042B - 一种人脂肪干细胞分泌多肽adscp2及其应用

Info

Publication number: CN113817042B
Application number: CN202110930522.1A
Authority: CN
Inventors: 李景云; 马洁桦; 文娟; 龙伟; 祝丽珺
Original assignee: Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Current assignee: Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Priority date: 2021-08-13
Filing date: 2021-08-13
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2041-08-13
Also published as: CN113817042A

Abstract

本发明公开了一种人脂肪干细胞分泌多肽ADSCP2及其应用。一种人脂肪干细胞分泌多肽ADSCP2，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。多肽ADSCP2能够抑制人瘢痕真皮成纤维细胞中胶原基因COL1A1、COL1A2、COL3A1的mRNA表达量，显著降低了人瘢痕真皮成纤维细胞中肌成纤维细胞主要标志物ACTA2的mRNA表达量。所述的人脂肪干细胞分泌多肽ADSCP2可用于制备降低瘢痕真皮成纤维胶原含量、降低肌成纤维细胞量的药物或试剂，为抑制瘢痕增生提供了新的靶点。

Description

一种人脂肪干细胞分泌多肽ADSCP2及其应用

技术领域

本发明涉及创面愈合与瘢痕领域，具体地说涉及一种人脂肪干细胞分泌多肽ADSCP2及其应用。

背景技术

增生性瘢痕是一类皮肤纤维化疾病，主要以胶原等细胞外基质局部过度沉积为特征，是烧伤、整形外科界面临的巨大挑战。其不仅影响美观，还会引起瘙痒、疼痛、挛缩等症状甚至残疾，严重降低患者的生活质量，给患者的身体和心灵带来巨大的痛苦。皮肤损伤及外科手术后的患者，增生性瘢痕的发生率为39％-68％，烧伤患者的发生率则高达91％。目前，多采用局部加压、激光干预、药物注射、手术切除等方法治疗增生性瘢痕，然而均存在局限性及不良并发症。因此，深入研究增生性瘢痕的形成与调控机制、寻找有效的瘢痕防治手段，具有重要的临床意义。增生性瘢痕是皮肤真皮层受损后愈合过程中发生的异常修复，与炎症反应、血管生成、细胞增殖、结构成熟、组织重塑等密切相关。成纤维细胞是主要的效应细胞，其异常的增殖、分化、合成与降解胶原，是增生性瘢痕形成的重要原因。近年来临床与基础研究均发现脂肪来源干细胞(Adipose-derived stem cells，ADSC，简称脂肪干细胞)可抑制瘢痕增生，而其作用机制未完全阐明，可能是通过抗炎、免疫调节、抗氧化以及抑制纤维化等，调控正常皮肤创伤的修复、发挥抑制瘢痕增生的功能。近期研究报道，其培养上清可降低成纤维细胞中的胶原合成量从而抑制瘢痕增生；其分泌的肝细胞生长因子HGF，可抑制瘢痕来源成纤维细胞中TGF-β及胶原表达水平。这些研究提示，进一步从脂肪干细胞的分泌成分切入，探讨其对成纤维细胞生物学功能的影响，有可能找到瘢痕防治的新线索。

随着质谱技术的发展，多肽组学极大拓宽了研究视野。多肽是一类由3-50个氨基酸残基组成的生物活性物质，具有分子量小、容易合成、高效低毒等特点，在多个领域的药物研发中受到重视。目前，全球上市的多肽药物有100多个，涵盖肥胖、糖尿病、抗肿瘤等多个领域。在皮肤相关领域，多肽药物已经展现出良好的应用前景，如用于改善卟啉病患者日光耐受性的阿法诺肽(Afamelanotide，13肽)，用于治疗皮肤感染的杆菌肽(Bacitracin)、短杆菌素(Tyrothricin，环肽)等。目前尚没有用于治疗增生性瘢痕的多肽药物。查阅文献发现，间充质干细胞可分泌有功能的抗菌肽LL-37、hepcidin、β-defensin-2等，在抗细菌感染、促进创伤修复中发挥作用。因此，进一步从多肽角度探索脂肪干细胞分泌成分中调控成纤维细胞生物学功能的新成分，有可能为瘢痕的防治提供新手段。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种人脂肪干细胞分泌多肽ADSCP2。

本发明的另一目的是提供该多肽的应用。本发明的又一目的是提供一种含有该多肽的细胞培养液。

技术方案：本发明所述的一种人脂肪干细胞分泌多肽ADSCP2，氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

本发明所述的人脂肪干细胞分泌多肽ADSCP2在制备降低瘢痕真皮成纤维细胞胶原含量的药物或试剂。

本发明所述的人脂肪干细胞分泌多肽ADSCP2在制备降低肌成纤维细胞量的药物或试剂。

一种细胞培养液，其特征在于含有权利要求1所述的人脂肪干细胞分泌多肽ADSCP2。

所述多肽的获得可按照氨基酸序列通过固相合成方法获得；或者通过宿主微生物或细胞内克隆并表达携带编码所述多肽之一的核苷酸序列的DNA片段，通过现有的重组DNA技术制备获得。所使用的表达载体和宿主细胞均为重组技术为公众所知的。表达载体例如pET载体、pGEX载体；宿主细胞例如大肠杆菌(E.coli)，放线菌(Actinomycetes)，芽孢杠菌(Bacillus)，链霉菌(Streptomyces)，本发明所述的多肽可用常规的酶切方法将其从宿主细胞中分离，也可以通过常规的液相色谱法进行分离和纯化，上述的分离纯化方法都是本领域技术人员公知的技术。

本发明还提供编码前述多肽的核苷酸序列，其为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明还提供含有前述多肽的组合物。

本发明所述的多肽可以单独应用，除此之外，本发明多肽还可以与其他多肽联合使用。多肽组合物中包含序列为SEQ ID NO.1的多肽。

所述的药用组合物的剂型选自胶囊、片剂、锭剂、丸剂、滴丸、栓剂、喷雾、乳膏、贴剂中的任意一种。

所述的药用组合物包含将权利要求1所述人脂肪干细胞分泌多肽ADSCP2制备成所述的剂型的药用辅料。

有益效果：

人脂肪干细胞分泌多肽ADSCP2(DENREKVNDQAKL)，为CD166来源肽，由13个氨基酸组成，目前尚无其相关功能报道。生物信息学分析及实验结果显示：①ADSCP2来源于CD166蛋白C端的2090-2110位氨基酸；②ProtParam在线分析发现，ADSCP2的不稳定系数(Instability index)为-3.83，属于稳定型多肽，可稳定存在；脂肪系数(Aliphaticindex)为60，平均亲疏水性(Grand average of hydropathicity)为-2.077；③细胞培养液中加入ADSCP2，定量PCR实验证实ADSCP2可降低瘢痕真皮成纤维细胞中胶原基因COL1A1、COL1A2、COL3A1的mRNA表达量；定量PCR实验证实ADSCP2可降低肌成纤维细胞主要标志物ACTA2的mRNA表达量。因此，ADSCP2可以在制备降低瘢痕真皮成纤维细胞胶原含量、降低肌成纤维细胞量的药物或试剂中应用。

附图说明

图1为试验例1中ADSCP2抑制瘢痕真皮成纤维细胞中胶原基因COL1A1、COL1A2、COL3A1以及肌成纤维细胞主要标志物ACTA2的mRNA表达量的图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

委托上海科肽生物科技有限公司通过固相法合成如下SEQ ID NO.1所示序列：

Asp Glu Asn Arg Glu Lys Val Asn Asp Gln Ala Lys Leu

这是十三个氨基酸组成的多肽，通过在线工具获取前述多肽序列的主要生物学参数如下：

等电点(PI)为4.78，分子质量(Mw)1558.67Da。

上述序列为来源于人脂肪干细胞培养上清中的天然序列，除了通过化学固相合成法获得，还可以通过对长链多肽通过生物酶切技术获得，亦可通过宿主微生物或细胞内克隆并表达携带编码所述多肽之一的核苷酸序列的DNA片段，通过现有的重组DNA技术制备获得。编码上述多肽的核苷酸序列为：gatgaaaacagagaaaaggtgaatgaccaggcaaaacta(SEQ IDNO.2)。

所使用的表达载体和宿主细胞均为重组技术为公众所知的。表达载体例如pET载体、pGEX载体；宿主细胞例如大肠杆菌(E.coli)，放线菌(Actinomycetes)，芽孢杠菌(Bacillus)，链霉菌(Streptomyces)，本发明所述的多肽可用常规的酶切方法将其从宿主细胞中分离，也可以通过常规的液相色谱法进行分离和纯化，上述的分离纯化方法都是本领域技术人员公知的技术。

实施例2

一、试验材料

RNA逆转录试剂盒和RNA检测试剂盒等购自南京诺唯赞公司，成纤维细胞培养基购自美国Sciencell公司。

二、ADSCP2多肽的合成与稀释

本实验实施例1中固相合成获得的多肽ADSCP2为例。取10mg多肽，用无菌双蒸水稀释成50mM-40℃储存备用。

三、实时定量PCR(RT-PCR)检测多肽ADSCP2对人瘢痕真皮成纤维细胞中胶原基因COL1A1、COL1A2、COL3A1以及肌成纤维细胞主要标志物ACTA2的mRNA表达的影响

在37℃、5％CO₂孵箱中，培养人瘢痕真皮成纤维细胞，按10⁵/mL密度接种于6孔板中，待细胞融合度达60％左右时，将多肽(终浓度为1、10、25、50μM)加入人瘢痕真皮成纤维细胞，24h后，细胞长满，弃去培养基，尽量吸净培养基，分别直接加入Trizol 1mL；室温裂解5分钟，加入200μL氯仿，充分涡旋震荡混匀15s，室温静置2min，12000rpm，4℃离心15min；轻轻吸取上层水相450μL至无RNA酶的EP管，加入450μL异丙醇，-20℃放置过夜，12000rpm，4℃离心15min，管底可见细小片状沉淀；用75％乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀，12000rpm，4℃离心5min，小心弃去上清；再次12000rpm，4℃离心2min，用黄枪头小心吸掉上清；放入超净台或通风橱干燥10-15min；使用DEPC水30μL溶解RNA。

提取好的RNA，采用南京诺唯赞公司的逆转录试剂盒进行逆转录，按照说明书的具体步骤实施如下：①去除可能的基因组DNA，反应体系总体积为16μL，具体如下：

将上述试剂加入在一个EP管中之后，移液器轻轻吹打使其混匀，放入42℃水浴锅2min。②配制逆转录反应体系，总体积为20μL，即在上一步的EP管中加入4μL的含有逆转录酶的逆转录反应溶液(5×HiScript III qRT SuperMix)，用移液器轻轻吹打使其混匀。③进行逆转录反应，37℃15min，85℃5s。产物可立即用于qPCR反应，或者-20℃保存，并在半年内使用。

使用到的引物由上海生工公司合成。引物序列如下：

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)使用南京诺唯赞公司的ChamQ Universal SYBR qPCRMaster Mix试剂盒进行。

①在qPCR管中配制如下混合液：

按照PCR仪默认的两步法PCR扩增的标准程序设定：预变性95℃10s；PCR反应95℃5s，60℃31s，共40个循环；融解曲线获取程序即默认的Dissociation Stage。反应结束后确认qRT-PCR的扩增曲线和引物的融解曲线正常，用2-△△Ct法分析所得数据。

试验结果：如图1所示，通过实时定量PCR实验发现，高浓度ADSCP2多肽处理组(25、50μM)的瘢痕真皮成纤维细胞中胶原基因COL1A1、COL1A2、COL3A1以及肌成纤维细胞主要标志物ACTA2的mRNA表达量均显著降低，表明多肽ADSCP2可显著抑制瘢痕真皮成纤维细胞中胶原基因COL1A1、COL1A2、COL3A1以及肌成纤维细胞主要标志物ACTA2的mRNA表达量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京市妇幼保健院

<120> 一种人脂肪干细胞分泌多肽ADSCP2及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Glu Asn Arg Glu Lys Val Asn Asp Gln Ala Lys Leu

1 5 10

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gatgaaaaca gagaaaaggt gaatgaccag gcaaaacta 39

Claims

1.一种人脂肪干细胞分泌多肽ADSCP2，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的人脂肪干细胞分泌多肽ADSCP2的基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求2所述基因的重组表达载体。

4.权利要求1所述的人脂肪干细胞分泌多肽ADSCP2在制备降低瘢痕真皮成纤维细胞胶原含量的药物或试剂中的应用。

5.权利要求1所述的人脂肪干细胞分泌多肽ADSCP2在制备降低肌成纤维细胞量的药物或试剂中的应用。

6.一种细胞培养液，其特征在于含有权利要求1所述的人脂肪干细胞分泌多肽ADSCP2。

7.含有权利要求1所述人脂肪干细胞分泌多肽ADSCP2的药用组合物。

8.根据权利要求7所述的药用组合物，其特征在于所述的药用组合物的剂型选自胶囊、片剂、锭剂、丸剂、滴丸、栓剂、喷雾、乳膏、贴剂中的任意一种。

9.根据权利要求7所述的药用组合物，其特征在于所述的药用组合物包含将权利要求1所述人脂肪干细胞分泌多肽ADSCP2制备成权利要求8所述的剂型的药用辅料。