CN113444746B - 白藜芦醇调控转基因表达的控制系统及其构建和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种由植物天然活性成分白藜芦醇(RES)调控转基因表达的控制系统及其构建方法，所述系统可以精准调控外源基因的表达或关闭，即白藜芦醇调控外源基因表达的抑制系统和诱导系统。本发明还公开了该抑制系统和诱导系统用于精确调控嵌合抗原受体(CAR)的表达，实现在体外及体内调控工程化T细胞识别并杀伤肿瘤细胞的功能，并调控细胞因子的释放，提高CAR‑T细胞治疗的安全性和可控性。本发明还公开了所述调控系统的真核表达载体、工程化细胞载体及体内移植载体。本发明具有精准调控转基因表达、诱导倍数高、灵敏度高等特点，为精准可控的基因治疗和细胞治疗提供了新的工具和方法。
Description
技术领域
本发明涉及合成生物学，基因治疗、过继性细胞免疫治疗领域，具体涉及白藜芦醇调控转基因表达的控制系统及其构建方法和应用。
背景技术
合成生物学是以工程学理论思路为指导，将不同生物的功能元件进行有效设计、优化及组装，对细胞进行定向改造，使其具有某些特定的功能以满足特定需求。经过近几十年的快速发展，已经设计出多种基因环路并应用于能源、环境、医药开发及疾病治疗等多个领域(Courbet et al.,2016；Lienert et al.,2014)。
恶性肿瘤是威胁人类健康的重要疾病之一，肿瘤的预防及治疗研究也是全世界范围内的研究热点。现传统治疗肿瘤的方法包括手术、化学疗法及放射性疗法，但这些方法都有一些缺陷，难以完全治愈，同时也会影响正常细胞，产生很大的副作用。现逐渐发展起来的免疫疗法给肿瘤治疗带来了很大的希望，其中针对血液瘤的嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法已经上市且有多个成功治愈的案例，给肿瘤治疗带来了曙光——CAR-T疗法(Maude etal.,2018；Neelapu et al.,2017)。通过对病人的T细胞在体外进行扩增、工程化基因改造，再重新回输至病人体内，工程化的T细胞可以特异性靶向肿瘤标志性受体并杀伤肿瘤细胞(Brenner et al.,2018；Wuet al.,2019)。该治疗方法可以降低对正常细胞的影响，但在治疗过程中由于CAR-T细胞会迅速靶向肿瘤细胞并释放细胞因子杀伤肿瘤细胞，会产生细胞因子风暴、肿瘤溶释综合征等可能致死的副作用，所以CAR-T细胞治疗具有一定的安全隐患，也大大限制了其治疗潜力(Shah andFry,2019)。因此，亟需开发安全可靠、可调控CAR-T细胞治疗策略以缓解副作用，提高CAR-T细胞治疗的安全性。
现已有多种基于理性设计的合成生物学装置用于提高CAR-T细胞治疗的安全性和可控型，包括通过诱导物关闭T细胞功能(function-OFF)或者激活T细胞功能(function-ON)的方式(Brenner et al.,2018；Wu et al.,2019)。“function-OFF”的调控装置通过加入诱导物的方式抑制CAR-T细胞的功能或者诱导T细胞凋亡以降低副作用对病人的影响，比如通过雷帕霉素等抗生素诱导T细胞凋亡的装置(Sato et al.,2007；Di Stasi et al.,2011)、由抗体介导的消除装置(Philip et al.,2014；Rafiq et al.,2020；Wang et al.,2011)、小分子调控的STOP-CAR装置(Giordano-Attianese et al.,2020)或者光控CAR装置(Zhang et al.,2021)。“function-ON”的调控装置则是通过诱导物的添加诱导CAR-T细胞的激活，以达到诱导物剂量依赖性地调控T细胞对肿瘤细胞的识别与杀伤，如小分子调控CAR受体的控制系统(Jan et al.,2021；Li et al.,2020；Sakemura et al.,2016；Weberet al.,2020；Wu et al.,2015)、抗体或蛋白介导的CAR受体调控系统(Cho et al.,2018；Rodgers et al.,2016；Viaud et al.,2018)以及光或磁场响应的调控系统(Huang etal.,2020；Pan et al.,2018)。
然而，这些诱导系统仍存在一定的问题，如雷帕霉素、四环素等抗生素的安全性问题，光、磁场的穿透性问题。因此，仍需开发更加安全的调控系统以提高CAR-T细胞治疗的安全性和可控型。
发明内容
为了克服现有技术存在的问题，本发明提出了一种新的可调控的CAR-T细胞(嵌合抗原受体修饰的T细胞)疗法，即利用白藜芦醇调控的基因开关系统调控CAR表达以减缓CAR-T治疗过程中产生的副作用。本发明开发的白藜芦醇调控转基因表达的控制系统可实现对目的基因表达的多样性调控，将该系统用于调控肿瘤免疫治疗的过程，可为临床治疗提供更加安全的调控工具。
本发明提出的白藜芦醇调控转基因表达的控制系统是以白藜芦醇为诱导剂，白藜芦醇作为一种具有生物活性的天然酚类化合物，广泛存在于葡萄、花生、蓝莓、虎杖等植物中，已有多篇研究报道其具有抗肿瘤、抗炎、降血糖等多种功效，是一种安全的小分子化合物(Baur et al.,2006；Oryza Oil&Fat Chemical Co.,2008；Xia et al.,2017；Zordokyet al.,2014)。本发明构建的白藜芦醇调控转基因表达的控制系统具有更好的安全性，在疾病治疗方面的应用也具有更大的潜力和前景。
本发明提出的白藜芦醇调控转基因表达的控制系统，包括白藜芦醇调控转基因表达的抑制或激活，所述系统包括：a)白藜芦醇调控转基因表达的抑制系统RESOFF；和/或，b)白藜芦醇调控转基因表达的诱导系统RESON。
其中，所述白藜芦醇调控的抑制系统RESOFF包括重组转录激活子，白藜芦醇诱导型弱启动子和待转录序列三部分；所述白藜芦醇调控的诱导系统RESON包括重组转录抑制子，白藜芦醇诱导型强启动子和待转录序列三部分。
其中，诱导系统RESON中所述的重组转录抑制子为重组转录抑制子TtgR-KRAB，是由转录抑制蛋白KRAB(Krueppe1-associated box protein)(氨基酸序列Genbank登录号：CAA36558)融合至DNA结合域C端上获得，并由强启动子持续表达。所述转录抑制蛋白KRAB可以为人源的；所述DNA结合域是来源于白藜芦醇操纵子系统的阻遏蛋白TtgR(氨基酸序列Genbank登录号NP_743546)；其中，TtgR是来源于恶臭假单胞菌抗菌素排出泵操纵子系统的阻遏蛋白。
优选地，所述的重组转录抑制子TtgR-KRAB可由不同种类的强启动子启动表达，主要包括PSV40(其核苷酸序列Genbank登录号：KY053832)、PhCMV(其核苷酸序列Genbank登录号：KY199427)、PhEF1α(其核苷酸序列Genbank登录号：AY043301)、PmPGK(其核苷酸序列Genbank登录号：MH325104.1)等。
其中，诱导系统RESON中所述的白藜芦醇诱导型强启动子是通过在强启动子两端添加TtgR操纵子蛋白结合序列构成；所述TtgR操纵子蛋白结合序列是来源于抗菌素排出泵操纵子系统的蛋白结合序列OTtgR，所述的融合型强启动子可驱动下游基因的表达。所述操纵子系统是由阻遏蛋白TtgR和蛋白结合序列OTtgR组成，该系统是从恶臭假单胞菌Pseudomonas putida中发现的，并受到白藜芦醇的严格调控。
其中，所述蛋白结合序列根据不同的优化及突变方式包括：a)原始的蛋白结合序列OTtgR(SEQ ID NO.7)；b)TtgR蛋白结合序列OTtgR的反向互补序列OTRC0(SEQ ID NO.8)；c)TtgR蛋白结合序列OTtgR反向互补序列OTRC的1号突变序列OTRC1(SEQ ID NO.9)；d)TtgR蛋白结合序列OTtgR反向互补序列OTRC的2号突变序列OTRC2(SEQ ID NO.10)；e)TtgR蛋白结合序列OTtgR反向互补序列OTRC的3号突变序列OTRC3(SEQ ID NO.11)；f)TtgR蛋白结合序列OTtgR反向互补序列OTRC的4号突变序列OTRC4(SEQ ID NO.12)。
优选地，所述的白藜芦醇诱导型强启动子根据强启动子的种类和操纵子OTtgR的不同拷贝数可组成不同类型的融合型强启动子，包括：a)如SEQ ID NO.13所示的白藜芦醇诱导型强启动子PResR1核苷酸序列PSV40-OTtgR；b)如SEQ ID NO.14所示的白藜芦醇诱导型强启动子PResR2核苷酸序列PSV40-OTRC0；c)如SEQ ID NO.15所示的白藜芦醇诱导型强启动子PResR3核苷酸序列PSV40-OTRC1；d)如SEQ ID NO.16所示的白藜芦醇诱导型强启动子PResR4核苷酸序列PSV40-OTRC2；e)如SEQ ID NO.17所示的白藜芦醇诱导型强启动子PResR5核苷酸序列PSV40-OTRC3；f)如SEQ ID NO18所示的白藜芦醇诱导型强启动子PResR6核苷酸序列PSV40-OTRC4；g)如SEQ ID NO.19所示的白藜芦醇诱导型强启动子PResR7核苷酸序列OTRC1-PSV40-OTRC1；h)如SEQID NO.20所示的白藜芦醇诱导型强启动子PResR8核苷酸序列OTRC1-PSV40-(OTRC1)2；i)如SEQ IDNO.21所示的白藜芦醇诱导型强启动子PResR9核苷酸序列(OTRC1)2-PSV40-(OTRC1)2；j)如SEQ IDNO.22所示的白藜芦醇诱导型强启动子PResR10核苷酸序列OTRC1-PmPGK-(OTRC1)2；k)如SEQ IDNO.23所示的白藜芦醇诱导型强启动子PResR11核苷酸序列OTRC1-PhEF1a-(OTRC1)2；l)如SEQ IDNO.24所示的白藜芦醇诱导型强启动子PResR12核苷酸序列OTRC1-PhCMV-(OTRC1)2。
其中，诱导系统中所述的待转录序列可以是单一编码表达报告蛋白如SEAP(氨基酸序列Genbank登录号：AIR09509)、EGFP(氨基酸序列Genbank登录号：AFA52654)、d2EYFP(氨基酸序列Genbank登录号：AGJ84357)或功能型蛋白如SEQ ID NO.25所示的抗人CD19抗原的嵌合抗原受体(antiCD19 CAR)的氨基酸序列等，也可以是编码同时表达报告基因和功能蛋白的基因序列如antiCD19 CAR-P2A-EGFP等。
其中，在所述的白藜芦醇调控的控制系统中，所述的白藜芦醇调控的诱导系统RESON分别由人工设计、合成的双质粒系统装载，所述双质粒系统中涉及的序列详见附表1。
其中，抑制系统RESOFF中所述的重组转录激活子是由TtgR蛋白融合到具有转录激活功能的转录激活蛋白上获得。优选地，所述转录激活蛋白包括单纯疱疹病毒颗粒蛋白VP16转录激活结构域(氨基酸序列Genbank登录号：AEX37895)、VP16的4拷贝转录激活结构域VP64(氨基酸序列Genbank登录号：AAZ80416.1)、NF-KB p65亚基转录激活结构域(氨基酸序列Genbank登录号：ABK40095)、Rta人类疱疹病毒转录激活域(氨基酸序列Genbank登录号：AAA66528.1)、热休克转录因子HSF1转录激活域(氨基酸序列Genbank登录号：BAM10893)等。
优选地，所述的重组转录激活子可由不同种类的强启动子启动持续表达，包括PSV40、PhCMV、PhEF1α、PmPGK等。
其中，抑制系统RESOFF中所述的白藜芦醇诱导型启动子是由弱启动子PhCMVmin 5’端紧接着TtgR操纵子结合位点OTRC1构成。在无转录激活子的作用下，所述的白藜芦醇诱导型启动子(融合型弱启动子)不表达或几乎不表达下游的待转录核酸序列。
优选地，抑制系统RESOFF中所述的诱导型弱启动子根据操纵子OTRC的不同拷贝数可组成不同类型的融合启动子包括：a)SEQ ID NO.26所示的白藜芦醇诱导型弱启动子PResA1核苷酸序列PResA1(OTRC1-PhCMVmin)；b)SEQ ID NO.27所示的白藜芦醇诱导型弱启动子PResA2核苷酸序列PResA2((OTRC1)2-PhCMVmin)；c)SEQ ID NO.28所示的白藜芦醇诱导型弱启动子PResA3核苷酸序列PResA3((OTRC1)3-PhCMVmin)；d)SEQ ID NO.29所示的白藜芦醇诱导型弱启动子PResA4核苷酸序列PResA4((OTRC1)4-PhCMVmin)；e)SEQ ID NO.30所示的白藜芦醇诱导型弱启动子PResA5核苷酸序列PResA5((ORC1)5-PhCMVmin)等。
其中，在所述白藜芦醇调控的控制系统中，所述的白藜芦醇抑制系统RESOFF分别由人工设计、合成的双质粒系统装载，所述质粒系统中涉及的序列详见附表1。
本发明，所述待转录序列包括作为报告检测的蛋白基因序列和可作为疾病治疗的蛋白或小肽的基因序列；其中，所述报告基因序列包括分泌性碱性磷酸酶、增强型荧光蛋白；所述可作为疾病治疗的基因序列包括嵌合抗原受体。
本发明还提供了白藜芦醇调控转基因表达的控制系统在调控CAR-T细胞治疗中、在肿瘤免疫诊疗中的应用。
所述肿瘤包括血液肿瘤及实体瘤。
本发明还提供了白藜芦醇调控转基因表达的控制系统的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
a)制备含有所述白藜芦醇调控转基因表达的控制系统的真核质粒表达载体；
b)制备含有所述白藜芦醇调控转基因表达的控制系统的工程化细胞；
c)制备含有所述白藜芦醇调控转基因表达的控制系统的工程化细胞移植载体；
d)通过控制白藜芦醇给药剂量对工程化细胞移植载体进行诱导表达。
步骤a)中，所述真核质粒表达载体如表1所示。
步骤b)中，所述工程化细胞为动物细胞系(优选哺乳动物细胞系)；优选地，所述哺乳动物细胞系主要包括HEK-293T、hMSC-hTERT、Hana3A、HeLa、HEK293FT等。
本发明还提供了含有白藜芦醇调控转基因表达的抑制或诱导系统的工程化细胞；其中，所述工程化细胞为动物细胞系(优选哺乳动物细胞系)；优选地，所述哺乳动物细胞系主要包括HEK-293T、hMSC-hTERT、Hana3A、HeLa、HEK293FT等。
本发明还提供了一种微胶囊，所述微胶囊包裹所述白藜芦醇调控转基因表达的控制系统，包括白藜芦醇调控转基因表达的抑制系统和/或诱导系统、或所述工程化细胞，其含有所述白藜芦醇调控转基因表达的控制系统、抑制或诱导系统的工程化细胞。
其中，所述微胶囊是由海藻酸-多聚赖氨酸-海藻酸(Alginate-Polylysine-Alginate-membrane)形成的一种半透膜，它能允许小分子物质的自由通透，如细胞生长所需的营养物质、诱导物白藜芦醇等，同时能拦截大于75kD的大蛋白如免疫球蛋白、白蛋白等自由通透。所述微胶囊的特性既能保证胶囊内细胞的正常生长，又能巧妙地避开体内免疫系统的攻击。并且，所述胶囊还能保证细胞产生的效应分子或蛋白可分泌至胶囊外，行使其功能。
本发明中，所述含有白藜芦醇调控的抑制系统或诱导系统的工程化细胞均可进行包裹形成微胶囊，再将其移植至小鼠腹腔内，当通过注射或者口服白藜芦醇纯品均能剂量依赖性地调控报告基因的启动表达或关闭表达。
本发明还提供了一种白藜芦醇调控嵌合型抗原受体(CAR)的表达系统，所述表达系统包括如上所述的白藜芦醇调控转基因表达的控制系统，所述表达系统调控表达的转基因为嵌合抗原受体CAR。
其中，所述表达系统的转导载体为慢病毒载体。
所述表达系统的转导细胞包括人急性T细胞白血病细胞系Jurkat T和人的原代T细胞。
本发明还提供了所述的白藜芦醇调控嵌合抗原受体的表达系统在用于肿瘤免疫治疗中的应用、在减缓工程化T细胞在杀伤肿瘤过程中产生的副作用中的应用。
优选地，所述肿瘤免疫治疗的应用是通过注射或口服白藜芦醇的方式抑制或者诱导白藜芦醇控制系统调控CAR受体的表达并调控T细胞的功能，从而精准调控CAR-T细胞在体内的激活，降低CAR-T细胞治疗过程中细胞因子等副作用发生的可能性。
所述肿瘤包括血液肿瘤及实体瘤。
本发明中，所述白藜芦醇调控转基因表达的控制系统在体内的调控方式可通过注射或口服摄入白藜芦醇的方式来实现，主要包括：a)注射白藜芦醇纯品；b)口服白藜芦醇自微乳溶剂。
本发明所述的白藜芦醇调控转基因表达的控制系统均具有微调性、可逆性的表达动力学特征。其中，所述微调性是指下游的基因表达均受白藜芦醇的精准调控，并呈现出剂量依赖性的关系；所述可逆性是指白藜芦醇调控基因表达的整个过程是可逆的，可以通过控制白藜芦醇的存在与否实现基因表达的开启或关闭。
本发明由植物天然活性成分白藜芦醇(RES)调控基因表达的控制系统。系统可以精准调控外源基因的表达或关闭，包括白藜芦醇调控外源基因表达的抑制系统(OFF)和诱导系统(ON)。本发明中该抑制系统和诱导系统用于精确调控嵌合抗原受体(CAR)的表达，实现了在体外及体内调控工程化T细胞识别并杀伤肿瘤细胞的功能，并调控细胞因子的释放，提高CAR-T细胞治疗的安全性和可控性。本发明具有精准调控转基因表达、诱导倍数高、灵敏度高等特点，为精准可控的基因治疗和细胞治疗提供了新的工具和方法。
本发明中，所述诱导小分子白藜芦醇可以被其结构类似物白皮杉醇替代，既可以通过白皮杉醇调控本发明的控制系统。
附图说明
图1为白藜芦醇抑制转基因表达的控制系统的原理图。
图2为本发明对白藜芦醇抑制型控制系统的优化研究，即对白藜芦醇诱导型启动子、转录激活子及其强启动子进行优化的实验结果，其中，图A为由PSV40启动子启动表达不同激活子的优化方案示意图，图B-D为由PSV40启动子启动表达不同激活子的测试结果，图E为由PhCMV启动子启动表达不同激活子的优化方案示意图，图F-H为由PhCMV启动子启动表达不同激活子的测试结果，图I为白藜芦醇诱导型弱启动子中结合序列拷贝数的优化方案示意图，图J-N为含有不同拷贝结合序列弱启动子的测试结果。
图3为白藜芦醇抑制型控制系统在不同哺乳动物细胞系中调控转基因表达的实验结果。
图4为本发明对白藜芦醇抑制型的控制系统调控转基因表达的动力学特征研究，即白藜芦醇抑制转基因表达的时间剂量依赖性、可逆性及长期性的实验结果，其中，图A为时间剂量依赖性的表征结果，图B为可逆性的表征结果，图C为长期性的表征结果。
图5为白藜芦醇抑制型控制系统在野生型鼠体内调控报告基因表达的实验结果，其中，图A为抑制系统在小鼠体内调控转基因表达的剂量依赖性表征结果，图B为抑制系统在小鼠体内调控转基因表达的长期性表征结果。
图6为白藜芦醇诱导转基因表达控制系统的原理图。
图7为本发明对白藜芦醇诱导型控制系统的优化研究，即对白藜芦醇诱导型强启动子以及转录抑制元件的强启动子进行优化的实验结果，其中，图A为诱导型强启动子结合序列插入形式的优化方案示意图，图B-E为诱导型强启动子结合序列插入形式的优化结果，图F为诱导型强启动子中强启动子的优化方案示意图，图G-J为不同强启动子的测试结果，图K为抑制子元件中启动子表达强度的优化方案示意图，图L-O为不同强启动子的测试结果。
图8为本发明对白藜芦醇诱导型控制系统的优化研究，即对白藜芦醇特异性结合的TtgR蛋白进行定点突变的实验结果，其中，图A为ResR蛋白点突变的优化方案示意图，图B为不同ResR蛋白突变对白藜芦醇诱导报告基因表达倍数的实验结果。
图9为白藜芦醇诱导型控制系统在不同哺乳动物细胞系中调控转基因表达的实验结果。
图10为本发明对白藜芦醇诱导型控制系统调控转基因表达的动力学特征研究，即白藜芦醇抑制转基因表达的时间剂量依赖性、可逆性及长期性的实验结果，其中，图A为时间剂量依赖性的表征结果，图B为可逆性的表征结果，图C为长期性的表征结果。
图11为白藜芦醇诱导型控制系统在野生型鼠体内调控报告基因表达的实验结果，其中，图A为诱导系统在小鼠体内调控转基因表达的剂量依赖性表征结果，图B为诱导系统在小鼠体内调控转基因表达的长期性表征结果。
图12为本发明在野生型小鼠体内通过口服微乳化白藜芦醇调控报告基因表达的实验结果。
图13为白藜芦醇抑制嵌合抗原受体CAR表达控制系统的原理图，其中，图A为白藜芦醇抑制系统调控CAR表达设计原理图，图B为白藜芦醇抑制CAR表达系统在T细胞中调控免疫治疗的示意图。
图14为本发明白藜芦醇抑制CAR表达控制系统在Jurkat T细胞中抑制CAR的表达及细胞激活的剂量依赖性的实验结果，其中，图A为白藜芦醇抑制CAR表达的实验结果，图B为白藜芦醇抑制T细胞激活表征受体CD69的实验结果，图C为白藜芦醇抑制T细胞分泌白介素-2的实验结果。
图15为本发明白藜芦醇抑制CAR表达控制系统在人的原代T细胞中抑制CAR的表达及细胞激活的剂量依赖性的实验结果，其中，图A为白藜芦醇抑制CAR表达的实验结果，图B为白藜芦醇抑制T细胞分泌白介素-2的实验结果，图C为白藜芦醇抑制T细胞分泌干扰素-γ的实验结果，图D为白藜芦醇抑制T细胞杀伤肿瘤细胞功能的实验结果。
图16为本发明白藜芦醇抑制CAR表达控制系统在快速白血病小鼠模型中抑制T细胞功能的实验结果，其中，图A为白藜芦醇在白血病异体移植小鼠模型中抑制T细胞激活的实验流程图，图B为白藜芦醇抑制CAR表达控制系统在T细胞中抑制肿瘤细胞杀伤的标志性流式细胞数据，图C为为白藜芦醇抑制CAR表达控制系统在T细胞中抑制肿瘤细胞杀伤的标志性流式细胞数据统计图，图D和E为白藜芦醇在24小时时调控T细胞释放细胞因子hIL-2和hTNF的实验结果，图F和G为白藜芦醇在48小时时调控T细胞释放细胞因子hIL-2和hTNF的实验结果。
图17为白藜芦醇诱导嵌合抗原受体CAR表达控制系统的原理图，其中，图A为白藜芦醇诱导系统调控CAR表达设计原理图，图B为白藜芦醇诱导CAR表达系统在T细胞中调控免疫治疗的示意图。
图18为本发明白藜芦醇诱导CAR表达控制系统在Jurkat T细胞中诱导CAR表达及剂量依赖性、长期可控型及可逆性的实验结果，其中，图A为白藜芦醇诱导CAR表达的实验结果，图B为白藜芦醇诱导系统在Jurkat T细胞中诱导报告基因表达的实验结果，图C和D为白藜芦醇诱导系统在Jurkat T细胞中诱导报告基因表达的可逆性表征结果。
图19为本发明白藜芦醇诱导CAR表达控制系统在Jurkat T细胞中诱导细胞激活的剂量依赖性的实验结果，其中，图A为白藜芦醇诱导T细胞激活表征受体CD69的实验结果，图B为白藜芦醇诱导T细胞分泌白介素-2的实验结果。
图20为本发明白藜芦醇诱导CAR表达控制系统在人的原代T细胞中对白藜芦醇诱导型强启动子进行优化的实验结果，其中，图A为诱导型启动子的优化方案示意图，图B为不同诱导型启动子诱导CAR表达的实验结果。
图21为本发明白藜芦醇诱导CAR表达控制系统在人的原代T细胞中对白藜芦醇诱导型抑制子进行优化的实验结果，其中，图A为ResR蛋白点突变的优化方案示意图，图B-D为不同抑制子对白藜芦醇诱导CAR表达影响的实验结果。
图22为本发明白藜芦醇诱导CAR表达控制系统在人的原代T细胞中诱导CAR的表达及细胞激活的剂量依赖性的实验结果，其中，图A为白藜芦醇诱导CAR表达的实验结果，图B为白藜芦醇诱导T细胞分泌白介素-2的实验结果，图C为白藜芦醇诱导T细胞分泌干扰素-γ的实验结果，图D为白藜芦醇诱导T细胞杀伤肿瘤细胞功能的实验结果。
图23为本发明白藜芦醇诱导CAR表达控制系统在快速白血病小鼠模型中诱导T细胞功能的实验结果，其中，图A为白藜芦醇在白血病异体移植小鼠模型中诱导T细胞激活的实验流程图，图B为白藜芦醇诱导CAR表达控制系统在T细胞中抑制肿瘤细胞杀伤的标志性流式细胞数据，图C为为白藜芦醇诱导CAR表达控制系统在T细胞中抑制肿瘤细胞杀伤的标志性流式细胞数据统计图，图D和E为白藜芦醇在24小时时调控T细胞释放细胞因子hIL-2和hTNF的实验结果，图F和G为白藜芦醇在48小时时调控T细胞释放细胞因子hIL-2和hTNF的实验结果。
图24为本发明白藜芦醇诱导CAR表达控制系统在白血病小鼠模型中诱导T细胞功能的实验结果，其中，图A为白藜芦醇诱导CAR表达控制系统在白血病小鼠模型中调控T细胞功能的实验流程图，图B为第3天白藜芦醇诱导T细胞分泌白介素-2的实验结果，图C为第3天白藜芦醇诱导T细胞分泌肿瘤坏死因子(hTNF)的实验结果，图D为活体成像检测小鼠体内腔肠素酶活的实验结果，图E为第28天小鼠活体成像荧光值的统计结果，图F为42天中小鼠活体成像荧光值的统计结果，图G为小鼠生存率的统计结果。
图25为本发明白藜芦醇抑制及诱导转基因表达控制系统对白藜芦醇类似物白皮杉醇响应的实验结果，其中，图A为白皮杉醇抑制白藜芦醇抑制系统表达目的蛋白的实验结果，图B为白皮杉醇诱导白藜芦醇诱导系统表达目的蛋白的实验结果。
具体实施方式
以下用实施例和附图对本发明作进一步阐述。这些实施例仅用于举例说明发明，而不对本发明的范围构成任何限制。本发明的实施过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公认常识，本发明没有特别限制内容。以下实施例中所用的试剂、仪器等，以及未注明具体条件的实验方法，按照常规或商品供货商所建议的条件进行。
实施例1白藜芦醇调控转基因表达的控制系统的构建
本实施例中提出的白藜芦醇调控转基因表达的控制系统所涉及质粒载体的构建方法。详细设计方案及步骤见附表1。但这不是对本发明保护范围的限制或缩小。
实施例2白藜芦醇调控转基因表达抑制系统在HEK-293细胞中的优化研究，即分别通过PSV40或PhCMV启动表达不同的转录激活子(ResA)，并优化不同的白藜芦醇诱导型启动子，即对11种不同的元件组合进行优化。
第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见附表1。
第二步，细胞接种。转染前一天将HEK-293细胞以每孔5×10^4个的细胞量接种于24孔板中，每孔加入500μl含10％FBS的DMEM培养基。
第三步，质粒转染。本实施例的转染体系可分为11组，包括pLF31(PResA1-SEAP-pA；PResA1,OTRC1-PhCMVmin)和pLF4(PSV40-ResA1-pA；ResA2,TtgR-VP16)，pLF32(PSV40-ResA2-pA；ResA2,TtgR-VP64)和pLF33(PSV40-ResA3-pA；ResA3,TtgR-VPR)，pLF31和pLF34(PhCMV-ResA1-pA)(F)，pLF31和pLF35(PhCMV-ResA2-pA)，pLF31和pLF36(PhCMV-ResA3-pA)，pLF36(PhCMV-ResA3-pA；ResA3,TtgR-VPR)和pLF31(PResA1-SEAP-pA；PResA1,OTRC1-PhCMVmin)，pLF36和pLF37[PResA2-SEAP-pA；PResA2,(OTRC1)2-PhCMVmin]，pLF36和pLF38[PResA3-SEAP-pA；PResA3,(OTRC1)3-PhCMVmin]，pLF36和pLF39[PResA4-SEAP-pA；PResA4,(OTRC1)4-PhCMVmin]，pLF36和pLF40[PResA5-SEAP-pA；PResA5,(OTRC1)5-PhCMVmin]。将上述每组质粒按总量为200ng,1:1的比例与转染试剂PEI(质粒与PEI质量比1:3)进行预混，溶于50ul无血清无抗生素的DMEM中。静止15分钟后，将DNA-PEI预混液滴加至每孔细胞中。
第四步，加入诱导剂。转染6h后，撤去原来的培养基，加入含有不同浓度白藜芦醇和10％FBS的新鲜培养基DMEM。
第五步，检测报告基因SEAP的表达量。48h后，收集细胞上清液，并置于65℃烘箱内加热30分钟以除去内源性的碱性磷酸酶。然后，按照每孔100μl2xbuffer液和20μl pNPP底物的比例预混检测工作液并置于37℃培养箱中进行预热。细胞上清液加热30min后，吸取80μl的上清液至96孔板中，并加入120μl预混的检测工作液，然后将板快速置于酶标仪上，在405nM处检测样品的吸光值(连续检测10次，每次间隔1分钟)。最后，以检测时间为横坐标，对应吸光值为纵坐标绘制并计算出曲线斜率。计算酶活的公式为：酶活＝曲线的斜率x256.8(单位：U/L)。
实验结果(见图2)显示上述白藜芦醇调控的抑制系统的不同优化组合均能抑制报告基因SEAP的表达，但系统所产生的诱导效果各不相同，其中，pLF36和pLF31的组合诱导倍数最佳。
实施例3白藜芦醇调控转基因表达的抑制系统在不同哺乳动物细胞系中的工作情况研究。
第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见附表1。
第二步，细胞接种(具体步骤同本发明实施例2)。本实例中所涉及的哺乳动物细胞系包括：HEK-293、hMSC-hTERT、HEK293FT、HeLa、Hana3A细胞系。
第三步，质粒转染。将质粒pLF36和pLF31按总量为200ng,1:1的比例与转染试剂PEI(质粒与PEI质量比1:3)进行预混，溶于50ul无血清无抗生素的DMEM中。静止15分钟后，将DNA-PEI预混液滴加至每孔细胞中。
第四步，加入诱导剂(具体步骤同本发明实施例2)。
第五步，检测报告基因SEAP的表达量(具体步骤同本发明实施例2)。
实验结果(见图3)表明白藜芦醇调控的抑制系统在上述哺乳动物细胞系中均能诱导基因表达，但不同细胞系其系统工作情况不同，其中在HEK-293FT细胞中的诱导效果最佳。
实施例4筛选并测定含有白藜芦醇抑制转基因表达控制系统的稳定细胞系。
第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见附表1。
第二步，HEK-293T细胞接种(具体步骤同本发明实施例2)。
第三步，质粒转染。将200ng pLF51(ITR-OTRC1-PhCMVmin-SEAP-pA::PhCMV-TtgR-VPR-P2A-PuroR-pA-ITR)与转染试剂PEI(质粒与PEI质量比1:3)进行预混，溶于50ul无血清无抗生素的DMEM中。静止15分钟后，将DNA-PEI预混液滴加至每孔细胞中。
第四步，重新接种细胞并加入抗生素进行筛选。转染6h后，将每孔细胞通过胰酶消化重新接种于10cm2皿中，并加入1ug/ml的嘌呤霉素进行筛选。2周之后，挑选单克隆细胞系于24孔板中进行扩增。
第五步，鉴定单克隆细胞系的正确性。将扩增好的各个单克隆细胞系接种于24孔板中，其中实验组加入30uM的白藜芦醇诱导剂。加药48小时后检测报告基因SEAP的表达量(具体步骤同本发明实施例2)。最后，将测试效果佳的稳定细胞系HEKRES-rep-SEAP进行扩增、保存。
实施例5白藜芦醇抑制转基因表达控制系统的稳定细胞系具有微调性的表达动力学特征研究。
第一步，将本发明实施例4筛选获得调控最佳的稳定细胞系HEKRES-rep-SEAP按每孔5×10^4个的细胞量接种于24孔板中，每孔加入500ul含有不同浓度白藜芦醇诱导剂和10％FBS的新鲜培养基DMEM。
第二步，检测报告基因SEAP的表达量(具体步骤同本发明实施例2)。
实验结果(见图4A)显示白藜芦醇调控抑制转基因表达控制系统的稳定细胞系受白藜芦醇的精确调控，即剂量依赖性地诱导基因表达，进而表明其稳定细胞系具有微调性的表达动力学特征。
实施例6白藜芦醇抑制转基因表达控制系统稳定细胞系具有可逆性的表达动力学特征研究。
第一步，将本发明实施例5筛选获得调控最佳的稳定细胞系HEKRES-rep-SEAP按每孔5×10^4个的细胞量接种于24孔板中。
第二步，在第0天，“ON-OFF-ON”实验组加入20uM的白藜芦醇；第2天，撤去原有的培养基，加入不含诱导剂的DMEM；第4天，重新将培养基更换为含有20uM白藜芦醇的DMEM。与此同时，每隔12h吸取细胞上清液检测报告基因SEAP的表达量。而“OFF-ON-OFF”实验组则在第0天加入不含诱导剂的DMEM；第2天，加入20uM的白藜芦醇；第4天，重新将培养基更换为不含诱导剂的DMEM。同样地，每隔12h吸取细胞上清液检测报告基因SEAP的表达量(具体步骤同本发明实施例2)。
实验结果(见图4B)表明通过控制白藜芦醇的存在与否可以实现其系统基因表达的开启或关闭，说明白藜芦醇调控抑制转基因表达控制系统的稳定细胞系具有良好的可逆性。
实施例7在转导白藜芦醇调控抑制转基因表达控制系统的稳定细胞系中，白藜芦醇对转基因表达的调控具有长期可控型。
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见附表1。
第二步，HEKRES-rep-SEAP细胞接种(具体步骤同本发明实施例2)。
第三步，质粒转染(具体步骤同本发明实施例2)。
第四步，转染6h后，撤去原来的培养基，实验组加入含有30uM白藜芦醇和10％FBS的新鲜培养基DMEM.每天收集细胞上清检测报告基因SEAP的表达量(具体步骤同本发明实施例2)。
实验结果(见图4C)表明系统的基因表达量受到白藜芦醇孵育时间的调控，即说明白藜芦醇调控抑制系统具有良好的可控性。
实施例8白藜芦醇调控抑制转基因表达控制系统在野生型鼠体内调控报告基因SEAP的表达研究。
第一步，准备细胞。将生长状态良好的HEKRES-rep-SEAP细胞培养在含1ug/ml嘌呤霉素、10％FBS的DMEM培养基。
第二步，微胶囊制备。收集细胞，利用微胶囊造粒仪对其包裹，形成含有白藜芦醇调控的“开”系统稳定细胞系的胶囊微球。每个微胶囊含有200个细胞，直径大小为200μm。
第三步，微胶囊体内移植。将微胶囊通过腹腔注射的方式移植至野生型小鼠体内，每只小鼠体内平均移植2×10^6个细胞。
第四步，给药。通过腹腔注射的形式注射不同浓度的白藜芦醇，每天给药1次。
第五步，检测小鼠体内SEAP的表达量。给药48h后，通过眼眶取血的方式收集小鼠血清，采用罗氏的SEAP报告基因化学发光检测试剂盒(Roche Diagnostics；Cat.no.11779842001)。
第六步，对照组和250mg/kg/day的给药组继续给药，分别在第4天、第6天以及第15天收集小鼠血液，检测血清中SEAP的表达量。
实验结果(见图5)显示白藜芦醇抑制转基因表达控制系统在野生型鼠体内能够精准调控基因表达，并且具有一定的剂量依赖性和长期调控效果。
实施例9白藜芦醇诱导转基因表达控制系统在HEK-293FT细胞中的优化研究，即分别通过对白藜芦醇诱导型强启动子及白藜芦醇特异性转录抑制子(ResR)的启动子进行优化，共有12种不同的元件组合方式。
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见附表1。
第二步，细胞接种(具体步骤同本发明实施例2)。
第三步，质粒转染。本实施例的转染体系可分为12组，包括pLF6(PSV40-ResR1-pA)分别与pLF9(PResR3-SEAP-pA；PResR3,PSV40-OTRC1)、pLF13(PResR7-SEAP-pA；PResR7,OTRC1-PSV40-OTRC1)、pLF14[PResR8-SEAP-pA；PResR8,OTRC1-PSV40-(OTRC1)2]、pLF15[PResR9-SEAP-pA；PResR9,(OTRC1)2-PSV40-(OTRC1)2]的组合，pLF6分别与pLF14[PResR8-SEAP-pA；PResR8,OTRC1-PSV40-(OTRC1)2]、pLF16[PResR10-SEAP-pA；PResR10,OTRC1-PmPGK-(OTRC1)2]、pLF17[PResR11-SEAP-pA；PResR11,OTRC1-PhEF1a-(OTRC1)2]、pLF18[PResR12-SEAP-pA；PResR12,OTRC1-PhCMV-(OTRC1)2]的组合，pLF18分别与pLF6(PSV40-ResR1-pA)、pLF23(PmPGK-ResR1-pA)、pLF24(PhEF1α-ResR1-pA)、pLF25(PhCMV-ResR1-pA)的组合。将上述每组质粒按总量为200ng,1:1的比例与转染试剂PEI(质粒与PEI质量比1:3)进行转染(具体步骤同本发明实施例2)。
第四步，加入诱导剂。转染6h后，撤去原来的培养基，加入含有不同浓度白藜芦醇和10％FBS的新鲜培养基DMEM。
第五步，检测报告基因SEAP的表达量(具体步骤同本发明实施例2)。
实验结果(见图7)显示上述白藜芦醇调控的抑制系统的不同优化组合均能诱导报告基因SEAP的表达，但系统所产生的诱导效果各不相同，其中，pLF25和pLF18的组合诱导倍数最佳。
实施例10白藜芦醇诱导转基因表达控制系统在HEK-293FT细胞中对白藜芦醇特异性抑制子的优化研究，分别对TtgR蛋白进行了定点突变，共5种突变形式。
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见附表1。
第二步，细胞接种(具体步骤同本发明实施例2)。
第三步，质粒转染。将pLF18[PResR12-SEAP-pA；PResR12,OTRC1-PCMV-(OTRC1)2]分别与质粒pLF63(PmPGK-ResR1)、pLF359(PmPGK-ResR2)、pLF360(PmPGK-ResR3)、pLF361(PmPGK-ResR4)、pLF362(PmPGK-ResR5)以1:1(w/w)的比例转染至HEK293细胞中(具体步骤同本发明实施例2)。
第四步，加入诱导剂。转染6h后，撤去原来的培养基，加入含有不同浓度白藜芦醇和10％FBS的新鲜培养基DMEM。
第五步，检测报告基因SEAP的表达量(具体步骤同本发明实施例2)。
实验结果(见图8)显示上述白藜芦醇诱导转基因表达诱导系统的优化方案并没有显著提高系统的灵敏度。
实施例11白藜芦醇诱导转基因表达控制系统在不同哺乳动物细胞系中的工作情况研究。
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见附表1。
第二步，细胞接种(具体步骤同本发明实施例2)。本实例中所涉及的哺乳动物细胞系包括：HEK-293、hMSC-hTERT、HEK293FT、HeLa、Hana3A细胞系。
第三步，质粒转染。将质粒pLF25和pLF18按总量为200ng,1:1的比例与转染试剂PEI(质粒与PEI质量比1:3)进行预混，溶于50ul无血清无抗生素的DMEM中。静止15分钟后，将DNA-PEI预混液滴加至每孔细胞中。
第四步，加入诱导剂(具体步骤同本发明实施例2)。
第五步，检测报告基因SEAP的表达量(具体步骤同本发明实施例2)。
实验结果(见图9)表明白藜芦醇调控的抑制系统在上述哺乳动物细胞系中均能诱导基因表达，但不同细胞系其系统工作情况不同，其中在HEK293FT细胞中的诱导效果最佳。
实施例12筛选并测定含有白藜芦醇诱导转基因表达控制系统的稳定细胞系。
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见附表1。
第二步，HEK-293T细胞接种(具体步骤同本发明实施例2)。
第三步，质粒转染。将200ng pLF50[ITR OTRC1-PhCMV-(OTRC1)2-SEAP-pA::PhCMV-TtgR-KRAB-P2A-PuroR-pA-ITR]与转染试剂PEI(质粒与PEI质量比1:3)进行预混，溶于50ul无血清无抗生素的DMEM中。静止15分钟后，将DNA-PEI预混液滴加至每孔细胞中。
第四步，单克隆挑选(具体步骤同本发明实施例4)。
第五步，鉴定单克隆细胞系的正确性(具体步骤同本发明实施例4)。
实施例13白藜芦醇诱导转基因表达控制系统的稳定细胞系具有微调性的表达动力学特征研究。
第一步，将本发明实施例12筛选获得调控最佳的稳定细胞系HEKRES-ind-SEAP按每孔5×10^4个的细胞量接种于24孔板中，每孔加入500ul含有不同浓度白藜芦醇诱导剂和10％FBS的新鲜培养基DMEM。
第二步，检测报告基因SEAP的表达量(具体步骤同本发明实施例2)。
实验结果(见图10A)显示白藜芦醇调控抑制转基因表达控制系统的稳定细胞系受白藜芦醇的精确调控，即剂量依赖性地诱导基因表达，进而表明其稳系具有微调性的表达动力学特征。
实施例14白藜芦醇诱导转基因表达控制系统稳定细胞系具有可逆性的表达动力学特征研究。
第一步，将本发明实施例12筛选获得调控最佳的稳定细胞系HEKRES-ind-SEAP按每孔5×10^4个的细胞量接种于24孔板中。
第二步，在第0天，“ON-OFF-ON”实验组加入20uM的白藜芦醇；第2天，撤去原有的培养基，加入不含诱导剂的DMEM；第4天，重新将培养基更换为含有20uM白藜芦醇的DMEM。与此同时，每隔12h吸取细胞上清液检测报告基因SEAP的表达量。而“OFF-ON-OFF”实验组则在第0天加入不含诱导剂的DMEM；第2天，加入20uM的白藜芦醇；第4天，重新将培养基更换为不含诱导剂的DMEM。同样地，每隔12h吸取细胞上清液检测报告基因SEAP的表达量(具体步骤同本发明实施例2)。
实验结果(见图10B)表明通过控制白藜芦醇的存在与否可以实现其系统基因表达的开启或关闭，说明白藜芦醇调控抑制转基因表达控制系统的稳定细胞系具有良好的可逆性。
实施例15在转导白藜芦醇诱导转基因表达控制系统的稳定细胞系中，白藜芦醇对转基因表达的调控具有长期可控型。
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见附表1。
第二步，HEKRES-ind-SEAP细胞接种(具体步骤同本发明实施例2)。
第三步，质粒转染(具体步骤同本发明实施例5)。
第四步，转染6h后，撤去原来的培养基，实验组加入含有30uM白藜芦醇和10％FBS的新鲜培养基DMEM.每天收集细胞上清检测报告基因SEAP的表达量(具体步骤同本发明实施例2)。
实验结果(见图10C)表明系统的基因表达量受到白藜芦醇孵育时间的调控，即说明白藜芦醇调控的诱导系统具有良好的可控性。
实施例16白藜芦醇诱导转基因表达控制系统在野生型鼠体内调控报告基因SEAP的表达研究。
第一步，准备细胞。将生长状态良好的HEKRES-ind-SEAP细胞培养在含1ug/ml嘌呤霉素、10％FBS的DMEM培养基。
第二步，微胶囊制备(具体步骤同本发明实施例8)。
第三步，微胶囊体内移植(具体步骤同本发明实施例8)。
第四步，给药。通过腹腔注射的形式注射不同浓度的白藜芦醇，每天给药1次。
第五步，检测小鼠体内SEAP的表达量(具体步骤同本发明实施例8)。
第六步，对照组和250mg/kg/day的给药组继续给药，分别在第4天、第6天以及第15天收集小鼠血液，检测血清中SEAP的表达量。
实验结果(见图11)显示白藜芦醇诱导转基因表达控制系统在野生型鼠体内能够精准调控基因表达，并且具有一定的剂量依赖性和长期调控效果。
实施例17通过口服白藜芦醇自微乳制剂在小鼠体内调控报告基因SEAP表达的研究。
第一步，准备细胞。将生长状态良好的HEKRES-ind-SEAP细胞培养在含1ug/ml嘌呤霉素、10％FBS的DMEM培养基。
第二步，微胶囊制备(具体步骤同本发明实施例8)。
第三步，微胶囊体内移植(具体步骤同本发明实施例8)。
第四步，给药。小鼠每天口服不同浓度的自微乳制剂，每天给药2次。
第五步，分别在第2天、第4天以及第6天收集小鼠血液，检测血清中SEAP的表达量(具体步骤同实施例8)。
实验结果(见图12)显示通过口服白藜芦醇自微乳制剂的形式可以有效诱导报告基因的表达，并且具有一定的剂量依赖性和长期调控效果。
实施例18白藜芦醇抑制嵌合抗原受体CAR表达控制系统的构建。
本发明设计通过白藜芦醇抑制转基因表达控制系统调控CAR受体的表达，从而调控CAR-T细胞对抗原的识别及杀伤过程，可以通过白藜芦醇的添加关闭CAR-T细胞对抗原细胞的响应(图13)。
实施例19慢病毒的生产。
第一步，细胞传代接板及转染。HEK293细胞扩增后接板于15cm培养皿，每皿的接种细胞量为6×106，16小时后进行转染。质粒包装体系包括包装质粒psPAX2、pMD2G和载体质粒，三者比例为2：1：2，每皿的总质粒量为30μg，转染6小时后换液，病毒生产中所使用的质粒皆为大抽无内毒素抽提试剂盒抽提。
第二步，慢病毒的收集。换液48小时后，收集包含病毒的上清至50ml离心管，800×g离心10分钟去除细胞碎片，离心后用0.45μm的滤器过滤。
第三步，慢病毒的浓缩。将病毒收集至超速离心管中，4℃，25000×g,离心2.5小时。去除上清，用PBS重悬病毒沉淀，分装置于-80℃保存。
第四步，慢病毒的感染及滴度的检测。Jurkat T细胞接板于24孔板，每孔细胞量为5万，浓缩病毒进行梯度稀释(梯度为0.01、0.1、1、10μl)并加入24孔板，每个梯度设置2个重复孔，感染24小时后更换新鲜培养基，48小时后收集细胞，进行特异性抗体染色，流式细胞技术检测感染效率，计算病毒滴度。
实施例20白藜芦醇抑制CAR表达控制系统在Jurkat T细胞中对CAR受体表达的调控效果研究。
第一步，准备细胞。将生长状态良好的JurkatT细胞以每孔5×10^4个的细胞量接种于24孔板中，每孔加入500μl含10％FBS的1640培养基。
第二步，病毒感染。Jurkat T细胞接板于24孔板，每孔细胞量为1×105，加入病毒pLF78(PmPGK-ResA3)和pLF100(PResA1-CAR)，以1:1的比例感染至Jurkat T细胞中，MOI＝1，同时加入6-8μg/ml Polybrene增加感染效率，置于平板离心机，250g离心2h。
第三步，诱导剂添加。感染24h后离心去除病毒，加入不含白藜芦醇或含有不同浓度白藜芦醇的完全培养基继续培养，48小时后收集细胞，用PBS清洗2次。
第四步，抗体染色。清洗后的细胞加入可与CAR胞外单链抗体结合的兔抗(BiotinRabbit Anti-mouse FMC63 scFv antibody)，4℃避光孵育30min后去除上清，加入二抗PE-Streptavidin，4℃避光孵育30min后离心，吸走上清，并用缓冲液重悬细胞，在1小时内通过流式细胞仪进行分析。
第五步，通过流式细胞仪对处理后的细胞进行分析并统计荧光强度。本发明中所用流式细胞数据处理软件为FlowJo(Tree Star)，阳性细胞的比例、平均荧光强度(Medianfluorescence,MFI)等数据皆由该软件分析导出，本发明中统计的CAR表达荧光强度(Weighted fluorescence)由阳性细胞百分比乘以平均荧光强度(Mean FluorescenceIntensity,MFI)计算得出。
实验结果(见图14A)显示白藜芦醇可有效抑制CAR受体的表达，并具有白藜芦醇药物剂量的依赖性。
实施例21白藜芦醇抑制CAR表达控制系统在Jurkat T细胞中抑制细胞因子表达调控效果研究。
第一步，准备细胞(具体步骤同本发明实施例20)。
第二步，病毒感染(具体步骤同本发明实施例20)。
第三步，诱导剂添加(具体步骤同本发明实施例20)。
第四步，与肿瘤细胞共孵育。白藜芦醇诱导后的工程化细胞分别与CD19阴性或者CD19阳性K562细胞进行共同孵育，Jurkat T细胞与K562细胞的细胞量比例为1(E:T＝1)，18小时后收集细胞及细胞培养上清。
第五步，Jurkat T细胞表面活性受体CD69的表达检测。将收集并清洗后的细胞用PE/Cy7染料标记的CD69特异性抗体(PE/Cy7 Anti-human CD69 antibody)进行染色，清洗后通过流式细胞仪进行分析，计算CD69受体表达的阳性率。
第六步，细胞因子分泌的检测。细胞培养后的上清，通过相应的检测试剂盒进行检测，具体实验方法如说明书。
实验结果(见图14B和14C)显示白藜芦醇能够很好地抑制工程化Jurkat T细胞表达CD69及hIL-2的功能。
实施例22人原代T细胞的分离及激活。
第一步，密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)。将用PBS等体积稀释后的外周血加入至装有密度梯度分离液的离心管中，离心后，小心吸取淋巴细胞层至新的离心管中，加入3倍体积的PBS清洗，400g，离心10分钟后去除上清。
第二步，CD4+和CD8+ T细胞的分选与培养。通过美天旎的T细胞分选试剂盒对PBMC中的CD4+和CD8+ T细胞进行正向分选，获得的细胞培养于含100IU/ml hIL-2的X-Vivo无血清培养基或者直接冻存。
第三步，原代T细胞的激活。细胞复苏后，在培养体系中加入400ng/ml的抗人CD3和CD28的单克隆抗体进行特异性激活，激活48小时后进行病毒感染。
第四步，原代T细胞的慢病毒感染。调整激活后的原代T细胞浓度为1×10^6个细胞每毫升，加入终浓度为8μg/μl的polybrene，加入适量病毒(感染MOI为10)，进行半体积病毒感染(如24孔板，则加入250μl细胞悬液)，然后进行平板离心(250×g，32℃，离心2小时)。离心结束后放至培养箱继续培养4小时，4小时后添加250μl含有8μg/μl polybrene的X-Vivo培养基以补全培养体系，继续感染24小时。24小时后离心去除病毒，继续加入含有hIL-2的X-Vivo培养基扩增T细胞进行后期实验。
实施例23白藜芦醇抑制CAR表达控制系统在原代T细胞中调控CAR受体表达的研究。
第一步，准备细胞(具体步骤同本发明实施例22)。
第二步，病毒感染，在原代T细胞中系统最佳元件病毒组合为：pLF363(LTR-PmPGK-ResA4-LTR)和pLF100(LTR-PResA1-CAR-LTR)，具体病毒感染步骤同实施例21。
第三步，诱导剂添加(具体步骤同本发明实施例20)。
第四步，抗体染色(具体步骤同本发明实施例20)。
第五步，通过流式细胞仪对处理后的细胞进行分析并统计荧光强度(具体步骤同本发明实施例19)。
实验结果(见图15A)显示，在人原代T细胞中，白藜芦醇可有效抑制CAR受体的表达，并具有白藜芦醇药物剂量的依赖性。
实施例24白藜芦醇抑制CAR表达控制系统在原代T细胞中抑制细胞因子表达调控效果研究。
第一步，准备细胞(具体步骤同本发明实施例22)。
第二步，病毒感染(具体步骤同本发明实施例23)。
第三步，诱导剂添加(具体步骤同本发明实施例20)。
第四步，与肿瘤细胞共孵育(具体步骤同本发明实施例21)。
第五步，原代T细胞表面活性受体CD69的表达检测(具体步骤同本发明实施例20)。
第六步，细胞因子分泌的检测。细胞培养后的上清，通过相应的检测试剂盒进行检测，具体实验方法如说明书。
实验结果(见图15B和15C)显示，在原代T细胞中，白藜芦醇能够剂量依赖性地调控T细胞释放细胞因子的激活功能。
实施例25白藜芦醇抑制CAR表达控制系统在原代T细胞中调控T细胞肿瘤杀伤效果的研究。
第一步，准备效应细胞(具体步骤同本发明实施例22)。
第二步，病毒感染(具体步骤同本发明实施例23)。
第三步，诱导剂添加(具体步骤同本发明实施例20)。
第四步，准备肿瘤细胞。将CD19-K562EGFP细胞和CD19+K562mCherry细胞进行1：1混合，并通过流式确认两群细胞占比为50％左右。
第五步，细胞孵育。将效应细胞与靶细胞进行混合孵育，两种细胞比例为5：1，孵育18小时后收集细胞。
第六步，流式细胞分析。收集后的细胞用死活染料(Fixable viability dyeeFluor 660)染色，然后用4％多聚甲醛固定后，通过流式分析仪收集数据分析。本发明中需要先通过死活染色收集活细胞，再通过K562靶细胞表达的荧光蛋白标签反选去除细胞群中的T细胞，分析K562细胞群中CD19-K562EGFP细胞与CD19+ K562mCherry细胞的比例，计算细胞杀伤效率，细胞杀伤效率的计算公式为：
实验结果(见图15D)显示白藜芦醇能够有效抑制工程化T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应，并具有药物剂量依赖性。
实施例26白藜芦醇抑制系统在小鼠体内抑制肿瘤杀伤的调控效果的研究。
为了评估白藜芦醇调控系统在小鼠体内调控CAR-T细胞功能的效果，本发明构建了基于白血病快速异体移植小鼠模型的实验方案，具体的实验流程如下：
第一步，肿瘤细胞移植。首先将3×107个混合靶细胞(包括1.5×107个CD19+-K562mCherry细胞和1.5×107个CD19--K562EGFP细胞)通过腹腔注射移植至重度免疫缺陷型小鼠(NOD-Prkdcscid Il2rgem26/NjuCrl,NCG)体内。
第二步，T细胞移植。10小时后，腹腔移植未转染CAR或者包含白藜芦醇调控系统的原代T细胞。
第三步，给药。T细胞移植后48小时内，每隔12个小时腹腔注射一次白藜芦醇。
第四步，血液样品采集。分别在24及48小时收集血液，分离上清，通过流式细胞微球技术(Cytometric bead array,CBA,BD Biosciences#558270&560112)检测血液中细胞因子的表达量。
第五步，腹腔细胞的收集及分析。T细胞移植48小时后，通过腹腔灌洗的方法收集小鼠腹腔中的细胞，细胞收集后400×g离心15min，然后加入红细胞裂解液去除红细胞，用流式细胞清洗液(Cell staining buffer)清洗2遍后进行死活细胞染色并通过流式细胞检测T细胞杀伤CD19阳性肿瘤细胞的杀伤效率，具体步骤同本发明实施例24。
肿瘤杀伤的实验结果(见图16B和16C)显示，在小鼠模型中，白藜芦醇同样能够有效抑制工程化T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应，并具有药物剂量依赖性。细胞因子释放的实验结果(见图16D-G)显示白藜芦醇能够有效抑制T细胞释放细胞因子。
实施例27白藜芦醇诱导嵌合抗原受体CAR表达控制系统的构建。
本发明设计通过白藜芦醇诱导转基因表达控制系统调控CAR受体的表达，从而调控CAR-T细胞对抗原的识别及杀伤过程，可以通过白藜芦醇的添加诱导CAR-T细胞对抗原细胞的响应(图17)。
实施例28白藜芦醇抑制CAR表达控制系统在Jurkat T细胞中对CAR受体表达的调控效果研究。
第一步，准备细胞(具体步骤同本发明实施例20)。
第二步，病毒感染。Jurkat T细胞接板于24孔板，每孔细胞量为1×105，加入病毒pLF63(LTR-PmPGK-ResR1-LTR)与pLF64(LTR-PResR11-CAR-P2A-EGFP-LTR)，以1:1的比例感染至Jurkat T细胞中，MOI＝1，同时加入6-8μg/ml Polybrene增加感染效率，置于平板离心机，250g离心2h。
第三步，诱导剂添加(具体步骤同本发明实施例20)。
第四步，抗体染色(具体步骤同本发明实施例20)。
第五步，通过流式细胞仪对处理后的细胞进行分析并统计荧光强度(具体步骤同本发明实施例19)。
实验结果(见图18A)显示白藜芦醇可有效诱导CAR受体的表达，并具有白藜芦醇药物剂量的依赖性。
实施例29白藜芦醇诱导CAR表达控制系统在Jurkat T细胞中长期调控CAR及EGFP表达的特征研究。
第一步，准备细胞(具体步骤同本发明实施例20)。
第二步，病毒感染(具体步骤同本发明实施例27)。
第三步，诱导剂添加。病毒感染24h后，撤去原来的培养基，实验组加入含有30uM白藜芦醇和10％FBS的新鲜培养基，每天收集细胞，通过流式细胞仪检测EGFP的表达量。
实验结果(见图18B)显示白藜芦醇可长期性地诱导CAR受体的表达，调控系统能够稳定有效地在Jurkat T细胞中调控转基因地表达。
实施例30白藜芦醇诱导CAR表达控制系统在Jurkat T细胞中调控CAR及EGFP表达的可逆性特征研究。
第一步，准备细胞(具体步骤同本发明实施例20)。
第二步，病毒感染(具体步骤同本发明实施例28)。
第三步，诱导剂添加。“ON-OFF-ON”实验组加入20uM的白藜芦醇；第2天，撤去原有的培养基，加入不含诱导剂的1640培养基；第4天，重新将培养基更换为含有20uM白藜芦醇的1640培养基。与此同时，每隔12h吸取细胞上清液检测报告基因SEAP的表达量。而“OFF-ON-OFF”实验组则在第0天加入不含诱导剂的1640培养基；第2天，加入20uM的白藜芦醇；第4天，重新将培养基更换为不含诱导剂的1640培养基。每隔12h收集细胞，通过流式细胞仪检测EGFP的表达量。
实验结果(见图18C和18D)显示白藜芦醇诱导CAR受体的表达过程具有可逆性。
实施例31白藜芦醇诱导CAR表达控制系统在Jurkat T细胞中抑制细胞因子表达调控效果研究。
第一步，准备细胞(具体步骤同本发明实施例20)。
第二步，病毒感染(具体步骤同本发明实施例29)。
第三步，诱导剂添加(具体步骤同本发明实施例20)。
第四步，与肿瘤细胞共孵育(具体步骤同本发明实施例21)。
第五步，Jurkat T细胞表面活性受体CD69的表达检测(具体步骤同实施例21)。
第六步，细胞因子分泌的检测。细胞培养后的上清，通过相应的检测试剂盒进行检测，具体实验方法如说明书。
实验结果(见图19)显示白藜芦醇能够很好地诱导工程化Jurkat T细胞的激活，诱导激活标志蛋白CD69及细胞因子hIL-2的分泌表达。
实施例32白藜芦醇诱导CAR表达控制系统在原代T细胞中的优化研究。
本发明针对白藜芦醇诱导系统中的诱导型启动子(见图20)及白藜芦醇特异性抑制子(见图21)进行了优化，最终获得了在原代T细胞中灵敏度更高、诱导效率更高的系统。
实施例33白藜芦醇诱导CAR表达控制系统在原代T细胞中调控CAR受体表达的研究。
第一步，准备细胞(具体步骤同本发明实施例22)。
第二步，病毒感染，在原代T细胞中系统最佳元件病毒组合为：pLF355(PResR15-CAR)与pLF361(PmPGK-ResR4)，具体病毒感染步骤同本发明实施例22。
第三步，诱导剂添加(具体步骤同本发明实施例20)。
第四步，抗体染色(具体步骤同本发明实施例20)。
第五步，通过流式细胞仪对处理后的细胞进行分析并统计荧光强度(具体步骤同本发明实施例20)。
实验结果(见图22A)显示，在人原代T细胞中，白藜芦醇可有效诱导CAR受体的表达，并具有白藜芦醇药物剂量的依赖性。
实施例34白藜芦醇诱导CAR表达控制系统在原代T细胞中诱导细胞因子表达调控效果研究。
第一步，准备细胞(具体步骤同本发明实施例21)。
第二步，病毒感染(具体步骤同本发明实施例33)。
第三步，诱导剂添加(具体步骤同本发明实施例20)。
第四步，与肿瘤细胞共孵育(具体步骤同本发明实施例21)。
第五步，原代T细胞表面活性受体CD69的表达检测(具体步骤同本发明实施例21)。
第六步，细胞因子分泌的检测。细胞培养后的上清，通过相应的检测试剂盒进行检测，具体实验方法如说明书。
实验结果(见图22B和22C)显示，在原代T细胞中，白藜芦醇能够剂量依赖性地调控T细胞释放细胞因子的激活功能。
实施例35白藜芦醇诱导CAR表达控制系统在原代T细胞中调控T细胞肿瘤杀伤效果的研究。
第一步，准备效应细胞(具体步骤同本发明实施例21)。
第二步，病毒感染(具体步骤同本发明实施例33)。
第三步，诱导剂添加(具体步骤同本发明实施例20)。
第四步，准备肿瘤细胞。将CD19- K562EGFP细胞和CD19+ K562mCherry细胞进行1：1混合，并通过流式确认两群细胞占比为50％左右。
第五步，细胞孵育。将效应细胞与靶细胞进行混合孵育，两种细胞比例为5：1，孵育18小时后收集细胞。
第六步，流式细胞分析(具体步骤同本发明实施例25)。
实验结果(见图22D)显示白藜芦醇能够有效诱导工程化T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应，并具有药物剂量依赖性。
实施例36白藜芦醇诱导CAR表达系统在快速白血病小鼠模型中调控T细胞功能的研究。
为了评估白藜芦醇调控系统在小鼠体内调控CAR-T细胞功能的效果，本发明构建了基于白血病快速异体移植小鼠模型的实验方案，具体的实验流程如下：
第一步，肿瘤细胞移植(具体步骤同本发明实施例26)。
第二步，T细胞移植。10小时后，腹腔移植未转染CAR或者包含白藜芦醇诱导系统的原代T细胞。
第三步，给药。T细胞移植后48小时内，每隔12个小时腹腔注射一次白藜芦醇。
第四步，血液样品采集(具体步骤同本发明实施例26)。
第五步，腹腔细胞的收集及分析(具体步骤同本发明实施例26)。
肿瘤杀伤的实验结果(见图23B和23C)显示，在小鼠模型中，白藜芦醇同样能够有效诱导工程化T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应，并具有药物剂量依赖性。细胞因子释放的实验结果(见图23D-G)显示白藜芦醇能够有效诱导T细胞释放细胞因子。
实施例37白藜芦醇诱导CAR表达系统在尾静脉造模的白血病小鼠模型中调控T细胞功能的研究。
为了评估白藜芦醇调控系统在通过尾静脉造模的白血病小鼠模型中调控CAR-T细胞功能的效果，本发明构建了基于白血病异体移植小鼠模型的实验方案，具体的实验流程如下：
第一步，肿瘤细胞移植。首先将1×106个表达腔肠素酶的CD19阳性K562细胞通过尾静脉注射的方式移植至重度免疫缺陷型小鼠(NOD-Prkdcscid Il2rgem26/NjuCrl,NCG)体内。
第二步，T细胞移植。5天后，尾静脉移植1×107个未转染CAR、持续性表达CAR或者包含白藜芦醇调控系统的原代T细胞。
第三步，给药。T细胞移植后，每天腹腔注射不含白藜芦醇的对照组溶剂或者含有50mg/kg白藜芦醇的制剂，或者每天口服250mg/kg的白藜芦醇自微乳制剂。
第四步，血液样品采集。在给药3天后收集血液，分离上清，通过流式细胞微球技术(Cytometric bead array,CBA,BD Biosciences#558270&560112)检测血液中细胞因子的表达量。
第五步，小鼠活体成像分析。T细胞移植前以及移植后每周进行小鼠活体成像检测，检测前腹腔注射6mg/kg腔肠素底物并立即进行活体成像拍照，统计小鼠体内的发光强度。
第六步，小鼠存活率统计。每天记录小鼠的生存情况直至小鼠全部死亡，统计每组小鼠的生存率。
血液中细胞因子检测的实验结果(见图24B和24C)显示，在白血病小鼠模型中，通过口服或者腹腔注射的方式均能显著地诱导T细胞释放细胞因子。活体成像的数据(见图24B-F)显示，通过口服或者注射白藜芦醇的方式，可以显著诱导T细胞杀伤肿瘤细胞。细胞存活率的统计数据(见图24G)显示，在小鼠模型中，白藜芦醇可以有效调控白藜芦醇诱导系统在小鼠体内的功能，减缓白血病小鼠的死亡。
实施例38多羟基酚化合物白皮杉醇调控白藜芦醇控制系统的效果研究。
为了评估同为多羟基酚化合物的白皮杉醇对调控系统的抑制或诱导效果，本发明在HEK293细胞中进行了实验，具体实验流程如下：
第一步，HEK293细胞接板(具体步骤同本发明实施例2)。
第三步，质粒转染。本实施例的转染体系可分为2组，包括pLF31(PResA1-SEAP-pA；PResA1,OTRC1-PhCMVmin)和pLF36(PhCMV-ResA3-pA)，以及pLF18[PResR12-SEAP-pA；PResR12,OTRC1-PhCMV-(OTRC1)2]和pLF25(PhCMV-ResR1-pA)的组合，具体转染步骤同本发明实施例2。
第四步，加入诱导剂。转染6h后，撤去原来的培养基，加入含有不同浓度白皮杉醇和10％FBS的新鲜培养基DMEM。
第五步，检测报告基因SEAP的表达量(具体步骤同本发明实施例2)。
实验结果(见图25)显示上述白皮杉醇可显著抑制或者诱导白藜芦醇控制系统表达报告基因。
表1.质粒构建表
缩写：PhCMV，人类巨细胞病毒启动子；PSV40，猿猴空泡病毒启动子；PhEF1α，人类扩展因子α基因启动子；PmPGK，小鼠磷酸甘油酸激酶基因启动子；PhCMVmin3G，巨细胞病毒CMV最小启动子突变体；EGFP，增强型绿色荧光蛋白；SEAP,人类外分泌碱性磷酸酶；VP16，单纯疱疹病毒颗粒蛋白；VP64，疱疹病毒转录激活结构域四聚体；VPR，VP64-P65-Rta串联激活域；CAR，嵌合抗原受体；P2A，碳端含有一个D(V/I)EXNPGP结构域的独立寡肽；KRAB，人源转录抑制蛋白。
本发明保护内容保护范围不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东师范大学
<120> 白藜芦醇调控转基因表达的控制系统及其构建和应用
<160> 30
<170> PatentIn version 3.3
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Gln Arg Gln Ser Ala Val Leu Asp Cys His Lys Gly Ile Thr Leu Ala
130 135 140
Leu Ala Asn Ala Val Arg Arg Gly Gln Leu Pro Gly Glu Leu Asp Ala
145 150 155 160
Glu Arg Ala Ala Val Ala Met Phe Ala Tyr Val Asp Gly Leu Ile Arg
165 170 175
Arg Trp Leu Leu Leu Pro Asp Ser Val Asp Leu Leu Gly Asp Val Glu
180 185 190
Lys Trp Val Asp Thr Gly Leu Asp Met Leu Arg Leu Ser Pro Ala Leu
195 200 205
Arg Lys Ser Ala Tyr Ser Arg Ala Pro Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys
210 215 220
Val Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys
225 230 235 240
Val Met Asp Ala Lys Ser Leu Thr Ala Trp Ser Arg Thr Leu Val Thr
245 250 255
Phe Lys Asp Val Phe Val Asp Phe Thr Arg Glu Glu Trp Lys Leu Leu
260 265 270
Asp Thr Ala Gln Gln Ile Val Tyr Arg Asn Val Met Leu Glu Asn Tyr
275 280 285
Lys Asn Leu Val Ser Leu Gly Tyr Gln Leu Thr Lys Pro Asp Val Ile
290 295 300
Leu Arg Leu Glu Lys Gly Glu Glu Pro Trp Leu Val Glu Arg Glu Ile
305 310 315 320
His Gln Glu Thr His Pro Asp Ser Glu Thr Ala Phe Glu Ile Lys Ser
325 330 335
Ser Val Ser Ser Arg Ser Ile Phe Lys Asp Lys Gln Ser Cys Asp Ile
340 345 350
Lys Met Glu Gly Met Ala Arg Asn Asp Leu Trp
355 360
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> TtgR蛋白结合序列OTtgR的核苷酸序列
<400> 7
cagtatttac aaacaaccat gaatgtaagt atattc 36
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> TtgR蛋白结合序列OTtgR的反向互补序列OTRC0的核苷酸序列
<400> 8
gaatatactt acattcatgg ttgtttgtaa atactg 36
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> TtgR蛋白结合序列OTtgR反向互补序列OTRC的1号突变序列OTRC1的核苷酸序列
<400> 9
gaatatactt acattcaagg ttgtttgtaa atactg 36
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> TtgR蛋白结合序列OTtgR反向互补序列OTRC的2号突变序列OTRC2的核苷酸序列
<400> 10
gaatatactt acattcttgg ttgtttgtaa atactg 36
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> TtgR蛋白结合序列OTtgR反向互补序列OTRC的3号突变序列OTRC3的核苷酸序列
<400> 11
gaatatactt acattctagg ttgtttgtaa atactg 36
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> TtgR蛋白结合序列OTtgR反向互补序列OTRC的4号突变序列OTRC4的核苷酸序列
<400> 12
gaatatactt acattcatcg ttgtttgtaa atactg 36
<210> 13
<211> 250
<212> DNA
<213> 白藜芦醇诱导型强启动子PResR1的核苷酸序列
<400> 13
gatctgcgat ctgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat 60
cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catcgctgac taattttttt 120
tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg 180
cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttcagtat ttacaaacaa ccatgaatgt 240
aagtatattc 250
<210> 14
<211> 250
<212> DNA
<213> 白藜芦醇诱导型强启动子PResR2的核苷酸序列
<400> 14
gatctgcgat ctgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat 60
cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catcgctgac taattttttt 120
tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg 180
cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttgaatat acttacattc atggttgttt 240
gtaaatactg 250
<210> 15
<211> 250
<212> DNA
<213> 白藜芦醇诱导型强启动子PResR3的核苷酸序列
<400> 15
gatctgcgat ctgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat 60
cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catcgctgac taattttttt 120
tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg 180
cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttgaatat acttacattc aaggttgttt 240
gtaaatactg 250
<210> 16
<211> 250
<212> DNA
<213> 白藜芦醇诱导型强启动子PResR4的核苷酸序列
<400> 16
gatctgcgat ctgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat 60
cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catcgctgac taattttttt 120
tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg 180
cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttgaatat acttacattc ttggttgttt 240
gtaaatactg 250
<210> 17
<211> 250
<212> DNA
<213> 白藜芦醇诱导型强启动子PResR5的核苷酸序列
<400> 17
gatctgcgat ctgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat 60
cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catcgctgac taattttttt 120
tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg 180
cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttgaatat acttacattc taggttgttt 240
gtaaatactg 250
<210> 18
<211> 250
<212> DNA
<213> 白藜芦醇诱导型强启动子PResR6的核苷酸序列
<400> 18
gatctgcgat ctgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat 60
cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catcgctgac taattttttt 120
tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg 180
cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttgaatat acttacattc atcgttgttt 240
gtaaatactg 250
<210> 19
<211> 308
<212> DNA
<213> 白藜芦醇诱导型强启动子PResR7的核苷酸序列
<400> 19
gaatatactt acattcatgg ttgtttgtaa atactgacgc gtgctagccc gggctcgaga 60
tctgcgatct gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc 120
cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tcgctgacta atttttttta 180
tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct 240
tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc ttgaatatac ttacattcat ggttgtttgt 300
aaatactg 308
<210> 20
<211> 343
<212> DNA
<213> 白藜芦醇诱导型强启动子PResR8的核苷酸序列
<400> 20
gaatatactt acattcatgg ttgtttgtaa atactgacgc gtgctagccc gggctcgaga 60
tctgcgatct gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc 120
cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tcgctgacta atttttttta 180
tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct 240
tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc ttgaatatac ttacattcaa ggttgtttgt 300
aaatactgga atatacttac attcaaggtt gtttgtaaat act 343
<210> 21
<211> 379
<212> DNA
<213> 白藜芦醇诱导型强启动子PResR9的核苷酸序列
<400> 21
gaatatactt acattcaagg ttgtttgtaa atactggaat atacttacat tcaaggttgt 60
ttgtaaatac tgacgcgtgc tagcccgggc tcgagatctg cgatctgcat ctcaattagt 120
cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg 180
cccattctcc gccccatcgc tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct 240
cggcctctga gctattccag aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca 300
aaaagcttga atatacttac attcaaggtt gtttgtaaat actggaatat acttacattc 360
aaggttgttt gtaaatact 379
<210> 22
<211> 669
<212> DNA
<213> 白藜芦醇诱导型强启动子PResR10的核苷酸序列
<400> 22
gaatatactt acattcaagg ttgtttgtaa atactggaat atacttacat tcaaggttgt 60
ttgtaaatac tgacgcgtcc gggtagggga ggcgcttttc ccaaggcagt ctggagcatg 120
cgctttagca gccccgctgg gcacttggcg ctacacaagt ggcctctggc ctcgcacaca 180
ttccacatcc accggtaggc gccaaccggc tccgttcttt ggtggcccct tcgcgccacc 240
ttctactcct cccctagtca ggaagttccc ccccgccccg cagctcgcgt cgtgcaggac 300
gtgacaaatg gaagtagcac gtctcactag tctcgtgcag atggacagca ccgctgagca 360
atggaagcgg gtaggccttt ggggcagcgg ccaatagcag ctttgctcct tcgctttctg 420
ggctcagagg ctgggaaggg gtgggtccgg gggcgggctc aggggcgggc tcaggggcgg 480
ggcgggcgcc cgaaggtcct ccggaggccc ggcattctgc acgcttcaaa agcgcacgtc 540
tgccgcgctg ttctcctctt cctcatctcc gggcctttcg acctgcagcc caagcttgaa 600
tatacttaca ttcaaggttg tttgtaaata ctggaatata cttacattca aggttgtttg 660
taaatactg 669
<210> 23
<211> 1234
<212> DNA
<213> 白藜芦醇诱导型强启动子PResR11的核苷酸序列
<400> 23
gaatatactt acattcaagg ttgtttgtaa atactggaat atacttacat tcaaggttgt 60
ttgtaaatac tgacgcgtgc tagctagggg aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt 120
ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc 180
gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc 240
tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt gaattacttc cacctggctg cagtacgtga 300
ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag 360
gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc 420
gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa 480
atttttgatg acctgctgcg acgctttttt tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc 540
aagatctgca cactggtatt tcggtttttg gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt 600
cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg 660
ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc 720
cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc 780
ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg 840
gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact 900
ccacggagta ccgggcgccg tccaggcacc tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt 960
cgtctttagg ttggggggag gggttttatg cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg 1020
agactgaagt taggccagct tggcacttga tgtaattctc cttggaattt gccctttttg 1080
agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat 1140
ttcaggtgtc gtgacccaag cttgaatata cttacattca aggttgtttg taaatactgg 1200
aatatactta cattcaaggt tgtttgtaaa tact 1234
<210> 24
<211> 743
<212> DNA
<213> 白藜芦醇诱导型强启动子PResR12的核苷酸序列
<400> 24
gaatatactt acattcaagg ttgtttgtaa atactggaat atacttacat tcaaggttgt 60
ttgtaaatac tgacgcgtgt tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta 120
cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg 180
gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc 240
ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa 300
ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca 360
atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta 420
cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt 480
acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg 540
acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca 600
actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca 660
gagctcaagc ttgaatatac ttacattcaa ggttgtttgt aaatactgga atatacttac 720
attcaaggtt gtttgtaaat act 743
<210> 25
<211> 553
<212> PRT
<213> 嵌合抗原受体的氨基酸序列
<400> 25
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
145 150 155 160
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
165 170 175
Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
195 200 205
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
210 215 220
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Phe Val
260 265 270
Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
275 280 285
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
290 295 300
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
305 310 315 320
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
325 330 335
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg
340 345 350
Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
355 360 365
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
370 375 380
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Phe Ser Val Val Lys
385 390 395 400
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
405 410 415
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
420 425 430
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
435 440 445
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
450 455 460
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
465 470 475 480
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
485 490 495
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
500 505 510
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
515 520 525
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
530 535 540
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
545 550
<210> 26
<211> 192
<212> DNA
<213> 白藜芦醇诱导型弱启动子PResA1的核苷酸序列
<400> 26
cagtatttac aaacaaccat gaatgtaagt atattccctg caggtcgagc tcggtacccg 60
ggtcgagtag gcgtgtacgg tgggaggcct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc 120
agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat 180
ccagcctccg cg 192
<210> 27
<211> 192
<212> DNA
<213> 白藜芦醇诱导型弱启动子PResA2的核苷酸序列
<400> 27
gaatatactt acattcaagg ttgtttgtaa atactgcctg caggtcgagc tcggtacccg 60
ggtcgagtag gcgtgtacgg tgggaggcct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc 120
agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat 180
ccagcctccg cg 192
<210> 28
<211> 230
<212> DNA
<213> 白藜芦醇诱导型弱启动子PResA3的核苷酸序列
<400> 28
gaatatactt acattcaagg ttgtttgtaa atactgccga atatacttac attcaaggtt 60
gtttgtaaat actgcctgca ggtcgagctc ggtacccggg tcgagtaggc gtgtacggtg 120
ggaggcctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga gacgccatcc 180
acgctgtttt gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc agcctccgcg 230
<210> 29
<211> 268
<212> DNA
<213> 白藜芦醇诱导型弱启动子PResA4的核苷酸序列
<400> 29
gaatatactt acattcaagg ttgtttgtaa atactgccga atatacttac attcaaggtt 60
gtttgtaaat actgccgaat atacttacat tcaaggttgt ttgtaaatac tgcctgcagg 120
tcgagctcgg tacccgggtc gagtaggcgt gtacggtggg aggcctatat aagcagagct 180
cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga 240
agacaccggg accgatccag cctccgcg 268
<210> 30
<211> 306
<212> DNA
<213> 白藜芦醇诱导型弱启动子PResA5的核苷酸序列
<400> 30
gaatatactt acattcaagg ttgtttgtaa atactgccga atatacttac attcaaggtt 60
gtttgtaaat actgccgaat atacttacat tcaaggttgt ttgtaaatac tgccgaatat 120
acttacattc aaggttgttt gtaaatactg cctgcaggtc gagctcggta cccgggtcga 180
gtaggcgtgt acggtgggag gcctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg 240
cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac cgatccagcc 300
tccgcg 306
Claims (6)
1.一种白藜芦醇调控转基因表达的控制系统，其特征在于，所述系统包括白藜芦醇调控转基因表达的抑制系统RESOFF，和/或白藜芦醇调控转基因表达的诱导系统RESON；其中，
所述白藜芦醇调控转基因表达的抑制系统RESOFF包括重组转录激活子、白藜芦醇诱导型弱启动子和待转录序列；
所述重组转录激活子由具有转录激活功能的激活蛋白融合至DNA结合蛋白TtgR的C端上获得；其中，所述具有转录激活功能的激活蛋白选自单纯疱疹病毒颗粒蛋白VP16转录激活结构域、VP16的4拷贝转录激活结构域VP64、NF-ΚB p65亚基转录激活结构域、Rta人类疱疹病毒转录激活域或热休克转录因子HSF1转录激活域；所述白藜芦醇诱导型弱启动子由弱启动子PhCMVmin 5’端紧接着TtgR蛋白特异结合的DNA序列组成，所述白藜芦醇诱导型弱启动子的序列选自序列SEQ ID NO.26-30；
所述诱导系统RESON包括重组转录抑制子、白藜芦醇诱导型强启动子和待转录序列；所述重组转录抑制子是由转录抑制蛋白KRAB融合至DNA结合蛋白TtgR的C端上获得的重组转录抑制子TtgR-KRAB；所述白藜芦醇诱导型强启动子由强启动子两端添加TtgR蛋白特异结合的DNA序列组成，所述白藜芦醇诱导型强启动子的序列选自序列SEQ ID NO.13-24；
所述DNA结合蛋白TtgR是来源于白藜芦醇操纵子系统的阻遏蛋白TtgR及其突变蛋白；所述TtgR蛋白及其突变蛋白序列选自SEQ ID NO.1-2；所述TtgR蛋白特异结合的DNA序列来源于白藜芦醇操纵子系统的操纵序列OTtgR及其相关突变序列；所述OTtgR及其突变序列选自序列SEQ ID NO.7-12。
2.如权利要求1所述的白藜芦醇调控转基因表达的控制系统，其特征在于，所述白藜芦醇诱导型弱启动子根据所述TtgR蛋白特异结合的DNA序列的不同拷贝数组成不同类型的融合启动子。
3.如权利要求1所述的白藜芦醇调控转基因表达的控制系统，其特征在于，所述待转录序列选自作为报告检测的蛋白基因序列和作为疾病治疗的蛋白或小肽的基因序列；其中，所述报告检测的蛋白选自分泌性碱性磷酸酶、增强型荧光蛋白；所述作为疾病治疗的蛋白选自嵌合抗原受体。
4.如权利要求1~3之任何一项所述的白藜芦醇调控转基因表达的控制系统，其特征在于，诱导小分子白藜芦醇可以被其结构类似物白皮杉醇替代。
5.如权利要求1所述的白藜芦醇调控转基因表达的控制系统的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
a）制备含有如权利要求1-3之任何一项所述白藜芦醇调控转基因表达的控制系统的真核质粒表达载体；
b）制备含有如权利要求1-3之任何一项所述白藜芦醇调控转基因表达的控制系统的工程化细胞；
c）制备含有如权利要求1-3之任何一项所述白藜芦醇调控转基因表达的控制系统的工程化细胞移植载体；
d）通过控制白藜芦醇给药剂量对工程化细胞移植载体进行诱导表达。
6.一种白藜芦醇调控嵌合抗原受体的表达系统，其特征在于，所述表达系统包括如权利要求1所述的白藜芦醇调控转基因表达的控制系统，所述表达系统调控表达的转基因为嵌合抗原受体CAR；其中，所述表达系统的转导载体为慢病毒载体；所述表达系统的转导细胞选自人急性T细胞白血病细胞系Jurkat T或人的原代T细胞。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202110671259.9A CN113444746B (zh) | 2021-06-17 | 2021-06-17 | 白藜芦醇调控转基因表达的控制系统及其构建和应用 |
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|---|---|---|---|
| CN202110671259.9A CN113444746B (zh) | 2021-06-17 | 2021-06-17 | 白藜芦醇调控转基因表达的控制系统及其构建和应用 |
Publications (2)
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