CN101260408B - 一种双色荧光报告载体的构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双色荧光报告载体的构建方法和应用，一种双色荧光报告载体，其序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其构建方法步骤为：A.衍生质粒pEGFP-N1-Ampicillin的构建；B.衍生质粒pMD18-EGFP的构建；C.衍生质粒pMD18-EGFP-polyA的构建；D.衍生质粒pEGFP/EGFP的构建；E.目的质粒pEGFP/DsRed的最终构建；F.双色荧光报告载体pEGFP/DsRed的一种衍生双色荧光载体pEGFP/DsRed-HBx的制备。本发明方法易行，操作方便，该载体在高通量筛选且定量siRNA效率中的应用。

Description

一种双色荧光报告载体的构建方法和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和抗病毒研究领域，可以高通量地筛选出抗病毒的siRNA药物。更具体地讲，本发明涉及一种双色荧光报告载体，同时涉及到双色荧光报告载体的构建方法，以及该发明在高通量且精确评估siRNA效率中的应用。背景技术

RNA干扰(RNAi)是一种从酵母到人都保守的分子机制：双链的小干扰RNA(siRNA)中的一条链被整合到RISC(RNA-Induced Silencing Complex)中去，当此条链找到与之配对的靶标mRNA时，靶标mRNA随之将被RISC序列特异性的切割然后降解掉(Fire A，Xu SQ，Montgomery MK，Kostas SA，Driver SE，Mello CC 1998 Potent andspecific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature391：806-811.)。现在RNAi被越来越多的应用到在单个基因或者是基因组水平来研究基因的功能(Hannon GJ，Rossi JJ 2004 Unlocking the potential of the human genomewith RNA interference.Nature 431：371-378.；Dorsett Y，Tuschl T 2004 siRNAs：applications in functional genomics and potential therapeutics.Nature Rev.Drug Discov，3：318-329.)，同时对于那些基于基因沉默的治疗方法而言RNAi更代表着一种有应用价值的新手段(Dorsett Y，Tuschl T 2004 siRNAs：applications in functional genomicsand potential therapeutics.Nature Rev.Drug Discov.3：318-329.；Shuey DJ，McCallusDE，Giordano T 2002 RNAi：gene-silencing in therapeutic intervention.Drug Discov.Today 7：1040-1046.；Sioud M 2004 Therapeutic siRNAs.Trends Pharmacol.Sci.25：22-8.)。siRNA的应用所面临的一个最主要的挑战就是设计出有效的siRNA来沉默基因的表达。平均而言，被挑选出来的siRNA中，仅有五分之一能够引起有效的基因沉 默(Kumar R，Conklin DS，Mittal V 2003 High-Throughput Selection of Effective RNAiProbes for Gene Silencing.Genome Res.13：2333-2340.；McManus MT，Sharp PA 2002Gene silencing in mammals by siRNAs.Nat.Rev.Genet.3：737-747.；Kapadia SB，Brideau-Andersen A，Chisari FV 2003 Interference of hepatitis C virus RNA replicationby short interfering RNAs.Proc.Natl.Acad.Sci.100：2014-2018.)。siRNA不能引起有效的基因沉默的可能原因可以归结为：siRNA在体内的不稳定性；siRNA同RISC的组分不可相互作用性；或者由于靶标mRNA的本地二级结构的束缚所导致的靶标的不可进入性等等。最近由于深刻理解了RNAi介导的基因沉默的生化机制和大规模地分析靶向同一个基因的各不相同的siRNA，很多关键地影响siRNA效果的规则都被揭示出来。这些规则明显优化了设计出合理siRNA的方案(Mittal V 2004 Improving theefficiency of RNA interference in mammals.Nat.Rev.Genet.5：355-365.；Reynolds A，Leake D，Boese Q，Scaringe S，Marshall WS，Khvorova，A 2004 Rational siRNA designfor RNA interference.Nat.Biotechnol.22：326-330.；Ui-Tei K，Naito Y，Takahashi F，Haraguchi T，Ohki-Hamazaki H，Juni A，Ueda R，Saigo K 2004 Guidelines for theselection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNAinterference.Nucleic Acids Res.32：936-948.；Khvorova A，Reynolds A，Jayasena SD2003 Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias.Cell 115：209-216.；SchwarzDS，Hutvagner G.，Du T，Xu Z，Aronin N，Zamore PD 2003 Asymmetry in the assemblyof the RNAi enzyme complex.Cell 115：199-208.；Holen T，Amarzguioui M，Wiiger MT，Babaie E，Prydz H 2002 Positional effects of short interfering RNAs targeting the humancoagulation trigger Tissue Factor.Nucleic Acids Res.30：1757-1766.；Ameres SL，Martinez J，Schroeder R 2007 Molecular basis for target RNA recognition and cleavageby human RISC.Cell 130：101-112.)。即使这种经过改进之后的方案增加了设计出有效的siRNA的机率，但是它既不能确保单个预测的siRNA的有效性更不能确保所预测出的就是现实中最有效的siRNA。因此，现在人们花费大量的人力物力投入到从一大群siRNA中筛选出有效siRNA序列这一工作中去。(Vickers TA，Koo S，Bennett C F，Crooke ST，Dean NM，Baker BF 2003 Efficient reduction of target RNAs by smallinterfering RNA and RNase H-dependent antisense agents.J.Biol.Chem.278：7108-7118.；Kumar R，Conklin DS，Mittal V 2003 High-Throughput Selection ofEffective RNAi Probes for Gene Silencing.Genome Res.13：2333-2340.；Kasim V，Taira K，Miyagishi M 2006 Screening of siRNA target sequences by using fragmentized DNA.J.Gene Med.8：782-791.；Hung CF，Lu KC，Cheng TL，Wu RH，Huang LY，Teng CF，Chang WT 2006 A novel siRNA validation system for functional screening andidentification of effective RNAi probes in mammalian cells.Biochem.Biophys.Res.Commun.346：707-720.；Echeverril CJ，Perrimon N 2006 High-throughput RNAiscreening in cultured cells：a user′s guide.Nat.Rev.Genet.7：373-384.)。

如果是出于治疗的目的，那么对一个siRNA探针的效率进行定量变得特别重要。对一大群siRNA进行精确的定量可以筛选出最有效的siRNA探针以进行动物实验和临床实验。许多定量分析的方法已经被发展出来以报告siRNA的效率，这些方法大体可以归结为两类：第一类是利用细胞群体破碎后不同荧光素酶表达水平来量化siRNA的沉默效果(Vickers TA，Koo S，Bennett C F，Crooke ST，Dean NM，Baker BF2003 Efficient reduction of target RNAs by small interfering RNA and RNaseH-dependent antisense agents.J.Biol.Chem.278：7108-7118.；Smart N，Scambler PJ，Riley PR 2005 A rapid and sensitive assay for quantification of siRNA efficiency andspecificity.Biol.Proced.Online 7：1-7.)。例如Du等人设计了一种名为siQuant的质粒，此种质粒将作为siRNA靶标的寡核苷酸序列通过Bgl II和Apa I双酶切克隆到萤火虫荧光素酶之后，使得被克隆的序列紧随萤火虫荧光素酶的起始密码子，这样有活性的siRNA就会下调萤火虫荧光素酶的表达。为了评估siRNA的抑制效率，Du等人借助Promega公司的双荧光素酶报告基因系统进行分析。在实验时，将siRNA同siQuant质粒和另外一个能表达海肾荧光素酶的质粒这三者一起共转染入细胞中。此系统中，一个报告基因(萤火虫荧光素酶)活力的改变，直接相关于siRNA的抑制活性，而第二个报告基因(海肾荧光素酶)的组成性活力则提供了内参，使实验值可以规一化，这样也就达到了定量的目的。在结果检测时，此方法需要破解细胞并在细胞裂解液中加入萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶各自对应的荧光素底物，Du等人随后使用荧光素酶检测仪进行检测得到了较好的实验结果(Du Q，Thonberg H，Zhang HY，Wahlestedt C，Liang ZC 2004 Validating siRNA using a reportermade from synthetic DNA oligonucleotides.Biochem.Biophys.Res.Commun.325：243-249.)。

第二类定量分析siRNA效率的方法就是用不同的质粒表达两个荧光蛋白，一个 荧光蛋白基因作为内参放在一个载体上，另一荧光蛋白基因放在另一个载体被靶标所融合，它们同siRNA/shRNA(小发夹RNA)共转染之后，利用仪器在不破碎细胞的前提下测出两种荧光的强度以其比值来表征siRNA的活性(Hirano T，Yamauchi N，Sato F，Soh T，Hattori MA 2004 Evaluation of RNA interference in developing porcinegranulosa cells using fluorescence reporter genes.J.Reprod Dev.50：599-603.；Sipa K，Sochacka E，Kazmierczak-Baranska J，Maszewska M，Janicka M，Nowak G，Nawrot B2007 Effect of base modifications on structure，thermodynamic stability，and genesilencing activity of short interfering.RNA.13：1301-16.)。例如Kumar等人设计出了一种RNAi微阵列(microarray)的方法以达到高通量地筛选出有效的siRNA/shRNA。为了能够达到在基因芯片上进行高通量筛选的目的，作者们构建了一个能表达绿色荧光蛋白的质粒，在此质粒中EGFP和靶标基因前后融合在一起，与此同时还利用了一个能表达红色荧光蛋白的质粒pDsRed2-N1作为内参以规一化试验结果达到定量RNAi效率的目的。在实验中，此两种质粒与各自不同的siRNA/shRNA以液体的形式混匀在一起，随后将得到的各自不同的混和液分装于384孔板中。利用阵列仪(arrayer)将此液体印刻到一种特殊的载玻片表面。为了达到转染的目的，转染溶液被吸入到一个特殊的孔槽中，随后将上面载玻片被印刻的那一面向下盖在这个孔槽上。45分钟后，移去装有转染溶液的孔槽，将处理过的载玻片面朝上放入一个特殊的培养瓶中与一定数目的细胞进行共转染。24小时后，将生长在载玻片上的细胞固定包装好，用激光扫描仪扫描载玻片，随后用相应的软件分析获得绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白各自的荧光强度。这样得到载玻片上每个点的绿/红荧光强度之后，利用绿色荧光强度除以红色荧光强度的数值进行规一化之后，就能定量地计算出各个样品中RNAi的效率(Kumar R，Conklin DS，Mittal V 2003 High-ThroughputSelection of Effective RNAi Probes for Gene Silencing.Genome Res.13：2333-2340.)。

上面的两类定量分析RNAi效率的方法各有优缺点。第一类方法优点是比较简便，容易实施，第二类方法优点是能进行高通量筛选。但是这两大方法都存在一个主要的缺点：就是在进行定量的时候，不能够精确地放映出siRNA的抑制效率。例如这两大方法需要将三种物质(两个荧光载体和siRNA)共转染进细胞，所以它们都避免不了进行共转染所导致的两个荧光报告基因间转染效率的差异这一共同挑 战(Echeverril CJ，Perrimon N 2006 High-throughput RNAi screening in cultured cells：auser′s guide.Nat.Rev.Genet.7：373-384.)。当这些荧光物质的基因被转染进细胞后会出现如下情况：有的细胞无荧光信号；有的细胞只能检测到其中一种荧光信号；有的则两种荧光信号兼而有之。因此上述两类方法中用整个细胞群而不是挑选出符合要求的细胞进行定量分析的方法显然是不精确的。而且在第一类方法中细胞不是在生理条件下实施检测的，所以检测细胞必须被裂解掉，这无疑也影响到定量的精确性。在药物治疗和功能基因组学方面，我们尤其需要建立一个精确的定量系统以在单体活细胞水平高通量地评估出siRNA/shRNA的效率。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种双色荧光报告载体，该载体pEGFP/DsRed及其衍生载体pEGFP/DsRed-HBx是在同一个载体上利用两套不同的顺式作用元件同时独立地能在真核细胞中表达出绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的载体。该载体明显克服了先前将两个荧光报告基因分别放在两个不同的载体中进行共转染所导致的两个荧光报告基因间转染效率的差异这一共同难题，此发明为在单体活细胞水平精确定量siRNA的效率奠定了坚实的物质基础。

本发明的另一个目的是在于提供了一种双色荧光报告载体pEGFP/DsRed及其衍生质粒pEGFP/DsRed-HBx的构建方法，方法简便易行，试验操作方便。

本发明的再一个目的是在于提供了双色荧光报告载体pEGFP/DsRed-HBx在高通量筛选且精确定量siRNA效率中的应用。基于本发明中的双色荧光报告载体pEGFP/DsRed-HBx而提出的定量荧光流式细胞术的方法大大提升了评估siRNA效率的精确性。定量荧光流式细胞术是一种灵敏高效且简单易行的方法，数据可以被连续的收集并且细胞能够根据需要马上被分成多个亚区(subpopulation)以进行分析；同时其每次可以测量大量的细胞以提供进行统计学分析的需要。更为重要的是，此种方法可以在单体活细胞水平进行检测，而且计算出的结果具有高度的可信性和可重复性。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

本发明所述的双色荧光报告载体pEGFP/DsRed及其衍生载体pEGFP/DsRed-HBx 是可在同一个载体上分别表达出绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的真核表达载体。其首次由发明人提出并构建成功。本发明中的双色荧光报告载体pEGFP/DsRed和pEGFP/DsRed-HBx中的红色荧光蛋白基因(DsRed-Monomer)克隆自BD BiosciencesClontech公司生产的pDsRed-Monomer-N1质粒，其由CMV立即早期启动子(P_CMV IE)来表达，绿色荧光蛋白基因(EGFP)克隆自BD Biosciences Clontech公司生产的pEGFP-N1质粒，其由SV40早期启动子(P_SV40e)来表达。乙肝病毒(HBV)的X蛋白(HBx)基因作为靶标经过Not I和Xba I酶切被融合到双色荧光报告载体pEGFP/DsRed中的红色荧光蛋白基因DsRed-Monomer的终止密码子之后，因此HBx就成为了DsRed-Monomer的3’UTR而不被翻译出来。此衍生质粒在本发明中被命名为pEGFP/DsRed-HBx。这样此衍生质粒pEGFP/DsRed-HBx就可以仅仅表达出完整的红色荧光蛋白而避免了红色荧光蛋白遭融合后的影响。在本发明的这个双色荧光报告系统pEGFP/DsRed-HBx中，EGFP发出的绿色荧光被用来筛选出那些被转染进了双色荧光报告载体的细胞，同时其发出的绿色荧光强度也能反映出被转染的双色荧光报告载体上类似基因的表达水平；另一方面由于靶定HBx的siRNA的干扰作用导致了DsRed-Monomer红色荧光蛋白表达水平发生了改变，也就是导致了红色荧光强度发生了变化。红色荧光强度的这种变化就关联于siRNA的抑制效果。将红/绿荧光蛋白基因设计在同一个载体中且用不同的顺式作用元件进行表达有着明显的好处。这种方法明显克服了先前将两个荧光报告基因分别放在两个不同的载体中进行共转染所导致的两个荧光报告基因间转染效率的差异这一共同难题(Echeverril CJ，Perrimon N 2006 High-throughput RNAi screening in cultured cells：a user′s guide.Nat.Rev.Genet.7：373-384.)。本发明中的pEGFP/DsRed-HBx双色荧光报告系统确保了同样拷贝的EGFP和DsRed-Monomer基因被转染进同一个单体活细胞中。因此EGFP的表达应当与DsRed-Monomer的表达成线形关系，并且此相关性在细胞状态一致的前提下不会受转染效率变化之影响。

本发明中的pEGFP/DsRed-HBx双色荧光报告载体上红/绿荧光蛋白间的相关性，依据流式细胞术通过测量单个细胞内发射的红/绿荧光强度最后计算出目的细胞群的平均红/绿荧光强度来进行确定。基于各自对应的平均荧光强度(MFI)，在多次验中中请人都模拟出了平均红/绿荧光强度间关联度很好的直线。此结果证明了在 同一批次的实验中，双色荧光报告系统pEGFP/DsRed-HBx中的红绿荧光蛋白间确实存在着不受转染效率变化影响的直线关系，具体直线关系请见图11(C)，图13(A)、(B)、(C)。这条直线申请人称之为校准曲线。当能引起干扰作用的siRNA与本发明中的pEGFP/DsRed-HBx一起被共转染进细胞时，目的细胞群的平均红色荧光强度将会发生明显的改变；与此同时其对应的平均绿色荧光强度(MFI of EGFP)的整体水平在干扰发生前后不会改变(见图12)。因此目的细胞群的平均绿色荧光强度可以作为内参以衡量siRNA起作用之后平均红色荧光强度的变化。基于上面的校准曲线，通过平均绿色荧光强度这一内参，可以计算出siRNA在还没有起作用时的理论平均红色荧光强度(tMFI of DsRed-Monomer)。当siRNA发挥生物学功能之后，利用流式细胞仪测出目的细胞群此时的平均红色荧光强度(MFI ofDsRed-Monomer)。那么siRNA的抑制效率就可以用公式表示为：siRNA抑制效率＝(tMFI-MFI)_{DsRed-Monomer}/tMFI_{DsRed-Monomer}×100％。基于此，申请人将本发明中的pEGFP/DsRed-HBx同siRNA共转染进Linx细胞系(其来源见：Tong WP，Zhou Y，WangX，Yang F，Wu KL，Wu J，Zhang Y 2008 An accurate quantitative method forscreening effective siRNA probes targeting a Hepatitis B virus transcriptin single living cells.Biochem Biophys Res Commun.367：866-73。)中去，利用定量流式细胞术快速高效的筛选并计算出了有效的siRNA的抑制效率(见图13)。此种方法计算出的结果同在荧光显微镜下检测的实验结果非常一致(见图12)。本发明提供了一种在单体活细胞水平精确快速定量siRNA效率的方法。

构建一种双色荧光报告载体pEGFP/DsRed及其衍生质粒pEGFP/DsRed-HBx的具体试验技术可以参考Joe Sambrook，David Russell等编写的Molecular Cloning：A Laboratry Manual，Cold Spring Harbor Lab(CSHL)Press，2001。本发明中转化大肠杆菌DH5α(Gibco BRL公司产品)和ER2925(New England Biolabs公司产品)采取的都是氯化钙转化法，所用限制性内切核酸酶购买自New England Biolabs公司、Fermentas或者是Takara公司，并且对所有以PCR扩增方式做出的克隆都进行了测序。本发明通过以质粒pEGFP-N1和pDsRed-Monomer-N1(均购买自BDBiosciences Clontech公司)为基本平台，构建双色荧光报告载体所采取的设计 思路和技术措施如下：

1、衍生质粒pEGFP-N1-Ampicillin的构建。将带有启动子和转录终止信号的氨苄基因插入到pEGFP-N1载体中，由此衍生出的质粒被命名为pEGFP-N1-Ampicillin(见图1)。带有启动子和转录终止信号的氨苄抗性基因序列是以pUC18(Takara公司产品)为模板利用KOD DNA聚合酶(TOYOBO公司产品)扩增出pUC18中从1566到2617的一段DNA序列。所用5’引物P1为：CCTAGATCTTAAGAAATTAAAAATGAAGTTT(下划线为引入的Bgl II酶切位点)；3’引物P2为：TAATAATGGTTTCACGTAGTGCAGGTGGC(下划线为引入的Dra III酶切位点)。质粒pEGFP-N1被Afl II单酶切后通过KOD DNA聚合酶补成平末端。随后用Cycle-Pure Kit(E.Z.N.A公司产品)纯化被补成平末端的pEGFP-N1质粒。为了提高克隆成功的概率，减少载体自连，接着对被补成平末端的pEGFP-N1质粒进行了去磷酸化操作，同时对上述扩增出带有启动子和转录终止信号的氨苄抗性基因序列进行磷酸化操作。然后用Cycle-Pure Kit(E.Z.N.A公司产品)分别纯化已经去磷酸化的和磷酸化的上述体系。将纯化后得到的被磷酸化的1086bp长度的带有启动子和转录终止信号的氨苄抗性基因序列(KOD DNA聚合酶的产物本身就是平末端)与被纯化后的平滑化的被去磷酸化的pEGFP-N1进行连接反应。连接后的产物转化完大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞之后，直接将被转化的细菌放入含60μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中于37℃摇床中过夜培养。24小时后收集生长起来的细菌，用碱法抽提出质粒，将所得质粒再次转化DH5α感受态细胞，将被转化细胞铺板于含60μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的双抗平板上，于37℃培养箱中培养过夜。挑选单克隆，酶切证明有插入；测序结果表明了带有启动子和转录终止信号的氨苄抗性基因序列的插入方向。故得到了具有氨苄抗性的质粒。此衍生质粒被命名为pEGFP-N1-Ampicillin，并转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，用于基因的增殖和保藏。

2、衍生质粒pMD18-EGFP的构建。首先，利用PCR扩增出在EGFP基因5’端含有Stu I-Sal I酶切位点的中间产物。5’引物P3为： 

(下划标记为引入的Stu I和Sal I酶切位点)；3’引物P4为：TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC。然后此中间产物被连接到 pMD18-T vector(Takara公司产品)。此克隆命名为pMD18-EGFP，克隆示意过程见图2。

3、衍生质粒pMD18-EGFP-polyA的构建。利用PCR扩增出pEGFP-N1(BDBioscienees Clontech公司产品)中从3424到3860间的一段序列(此序列为单纯疱疹病毒胸苷激酶的转录终止信号——HSV TK poly A)，使得该序列的两边分别含有Pst I和Hind III酶切位点。所用5’引物P5：TTGCTGCAGGCGGGACTCTGGGGT(下划标记为引入的Pst I酶切位点)；3’引物P6： (下划线为引入的Hind III酶切位点；虚线为模板序列中本身含有的Dra II酶切位点)。此PCR产物经Pst I和HindIII双酶切后连接到上述衍生质粒pMD18-EGFP相应位点。由此生成的质粒命名为pMD18-EGFP-polyA，克隆示意过程见图3。

4、衍生质粒pEGFP/EGFP的构建。用Dra II(Eco0109 I)和Stu I双酶切上述衍生质粒pMD18-EGFP-polyA，回收其中被切出的大小为1,188bp的片断(此片断包含EGFP和HSV TK poly A的DNA序列)。将此片段亚克隆进上述已经制备好的衍生质粒pEGFP-N1-Ampicillin相应位置处。由此衍生出的质粒被命名为pEGFP/EGFP，克隆示意过程见图4。

5、目的质粒pEGFP/DsRed的最终构建。用Nhe I和Not I切下质粒pDsRed-Monomer-N1上从多克隆位点到DsRed-Monomer基因(BD BiosciencesClontech公司产品)末尾处的一段775bp的片断。将此片段亚克隆进上述已经构建好的衍生质粒pEGFP/EGFP的相应位点。由此得到所述的双色荧光报告载体pEGFP/DsRed，克隆示意过程见图5。用此载体转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，用于其增殖和保藏。

6、基于目的质粒pEGFP/DsRed，一种衍生质粒pEGFP/DsRed-HBx的克隆示意过程见图6。衍生质粒pEGFP/DsRed-HBx的制备方法如下：

a、HBx基因片断的PCR扩增制备

含有HBx基因的质粒(来源见：Wu KL，Zhang X，Zhang J，Yang Y，MuYX，Liu M，Lu L，Li Y，Zhu Y，Wu J 2005 Inhibition of Hepatitis B virusgene expression by single and dual small interfering RNA treatment.Virus Res.112：100-7.)为模板，利用PCR扩增出在HBx基因两边分别含有Not I和Xba I酶切位点的片断，所用5’引物P7：ATAGCGGCCGCATGGCTGCTGCTAGGCTGTGCT(下划线为引入的Not I酶切位点)；3’引物P8：ATATCTAGAGGCAGAGGTGAAAAAG(下划线为引入的Xba I酶切位点)。

b、可被Xba I酶切的双色荧光报告载体pEGFP/DsRed的获得

因为本发明中的载体pEGFP/DsRed在大肠杆菌E.coli DH5α内增殖时所抽提出的pEGFP/DsRed质粒上的Xba I酶切位点被甲基化了，这样使得pEGFP/DsRed不可被Xba I消化。为了获得可被Xba I消化的pEGFP/DsRed，pEGFP/DsRed质粒被转化到了ER2925菌株中，然后从ER2925菌株中抽提出pEGFP/DsRed质粒，这样就避免了甲基化对Xba I酶切活性的影响。

c、pEGFP/DsRed-HBx克隆的获得

用Not I和Xba I分别双酶切HBx基因的PCR产物和从ER2925菌株中抽提出来的pEGFP/DsRed质粒，将HBx基因产物连接到pEGFP/DsRed的相应位置，转化ER2925菌株。测序结果证实了克隆的准确性。所得克隆就是pEGFP/DsRed-HBx。

本发明提供了双色荧光报告载体pEGFP/DsRed的全部DNA序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。这些序列是基于亚克隆操作过程中和克隆载体的母本pEGFP-N1上的核苷酸序列没有突变这一假设而提出的。本发明中的pEGFP/DsRed只被我们部分测序，其中多克隆位点和DsRed-Monomer基因是亚克隆自pDsRed-Monomer-N1；β-内酰胺酶(氨苄抗性基因)部分测序；绿色荧光蛋白基因EGFP和单纯疱疹病毒胸苷激酶的转录终止信号(HSV TK poly A)完全测序。

本发明提供了双色荧光报告载体pEGFP/DsRed和pEGFP/DsRed-HBx的图谱，分别见图5和图6。pEGFP/DsRed全长5686bp，具体位置信息描述如下：

·CMV立即早期启动子(P_CMV IE)：1-589

·多克隆位点(MCS)：591-671

·红色荧光蛋白基因DsRed-Monomer

Kozak保守的翻译起始位点：672-682

起始密码子(ATG)：679-681；终止密码子：1354-1356

·SV40早期mRNA聚腺苷酸化信号

聚腺苷酸化信号：1510-1515&1539-1544；mRNA 3’末端：1548&1560

·β-内酰胺酶基因(氨苄抗性基因)

β-内酰胺酶：起始密码子(ATG)：1755-1757；终止密码子：2615-2617

β-内酰胺酶启动子：1624-1754；-35区：1685-1690；-10区：1708-1713

β-内酰胺酶转录终止信号：2618-2675

β-内酰胺酶转录本核糖体结合位点：1743-1747

·f1单链DNA origin：2699-3154

·SV40早期启动子(P_SV40e)：3328-3596

·SV40 Origin：3495-3630

·绿色荧光蛋白基因EGFP

Kozak保守的翻译起始位点：3638-3648

起始密码子(ATG)：3645-3647；终止密码子：4362-4364

PCR扩增时发生了突变使得：酪氨酸-183突变为天冬酰胺(T→A)：4191

·单纯疱疹病毒胸苷激酶的转录终止信号(HSV TK poly A)

聚腺苷酸化信号：4612-4617&4625-4630

·pUC质粒复制的origin：4961-5604

一种双色荧光报告载体pEGFP/DsRed-HBx在高通量筛选且精确定量siRNA效率中的应用。为了验证pEGFP/DsRed-HBx表达的红/绿荧光蛋白间的相关性，12个不同浓度的pEGFP/DsRed-HBx分别同一个无关的siRNA(siNC，具体信息参见表1)进行共转染Linx细胞。转染后48小时，用倒置荧光显微镜观察(见图10)。结果表明在相同质量浓度下，本发明中的pEGFP/DsRed-HBx所表达出的红色荧光信号和绿色荧光信号，其强度大致相等(见图10)。从图10的试验结果中我们可以观察到，在不同的pEGFP/DsRed-HBx的质量下，当绿色荧光增强时，此时对应质量下样品的红色荧光也必定同时增强。例如当样品的质量从100ng上升到160ng的时候，160ng时的绿色荧光信号明显强于100ng时的绿色荧光信号；于此同时160ng时的红色荧光信号也明显强于100ng时的红色荧光信号。而当所用pEGFP/DsRed-HBx的质量增加而绿色荧光减弱时，对应样品的红色荧光也必定同时减弱。例如当样品的质量从 400ng上升到500ng的时候，500ng时的绿色荧光信号明显弱于400ng时的绿色荧光信号；于此同时500ng时的红色荧光信号也明显弱于400ng时的红色荧光信号。在同一个样品中，当绿光减弱时，红光必定也减弱；反之依然。图10结果可以定性说明本发明中的pEGFP/DsRed-HBx载体所表达的红/绿荧光蛋白间存在着一种直线关系，这就为后面的用绿色信号作为内参来精确定量红色荧光信号的变化打下了坚实的基础。

红/绿荧光信号间的相关性用激发波长为488nm的流式细胞术进行分析，分析结果见图11。从图11(A)上，可以看到没有经过转染操作的细胞绝大部分都分布在B3区，从图11(B)中，可以看出那些转染了双色荧光报告载体和4nM的siNC的细胞有相当一部份分布在B1，B3和B4区。我们知道，流式细胞仪给出的结果中，分布在B1区的是那些只发红光的细胞；分布在B2区的是那些既发红光又发绿光的细胞；分布在B4区的是那些只发绿光的细胞。同时每个区的细胞数目以及各自区域内细胞的平均绿色荧光强度数值(X-mean)和平均红色荧光强度数值(Y-mean)流式细胞仪都能测出，具体参数见图11(A)和(B)。因为流式细胞仪的488nm的激发波长更适用于EGFP被激发而不利于DsRed-Monomer的被激发，所以在图11(B)的B4区中，被转染的细胞仅仅检测到中等表达水平的EGFP而检测不到红色信号是可以理解的；但是，在B1区中存在着表达相当水平的红色信号而没有检测到绿色信号则令人吃惊。此结果表明，位于图11(B)的B4区中的这些细胞EGFP的表达被部分抑制了。因为没有荧光信号的细胞以及那些仅仅只有红色荧光而没有绿色荧光的细胞都被筛选出局，而那些能够发出作为内参的绿色荧光的单体活细胞才被确定下来作为分析的对象以提高分析的精确性；所以B1和B2区的细胞在随后的定量分析中不予考虑。

红/绿荧光信号的相关性是基于各自对应的平均荧光强度(MFI)来计算的，其数值分别对应于Y-mean和X-mean。而绿/红荧光信号的MFI又经由下面的两个公式计算得来：

MFI(EGFP)＝[X-mean_(B2)×N_(B2)+X-mean_(B4)×N_(B4)]/[N_(B2)+N_(B4)]

                                                           ---方程(1)

MFI(DsRed-Monomer)＝[Y-mean_(B2)×N_(B2)+Y-mean_(B4)×N_(B4)]/[N_(B2)+N_(B4)]

                                                    ---方程(2)

基于上面的公式我们可以计算出不同质粒浓度的pEGFP/DsRed-HBx同4nM的siNC共转染后各自对应的红/绿平均荧光强度(MFI)，这样依据不同浓度下的MFI，我们可以用DsRed-Monomer的MFI对相应的EGFP的MFI来做图。由此我们拟合出了一条相关性非常好的直线。Y(平均红色荧光强度)＝0.5194*X(平均绿色荧光强度)-19.31，请见图11(C)。此结果证明了双色荧光报告载体中红/绿荧光蛋白间的表达确实存在着一种内源性的直线关系。

为了抑制乙肝病毒的表达，申请人向广州市锐博生物科技有限公司订购了10个靶定HBx mRNA的siRNA和一个作为参照的无关siRNA(siNC)，并挑选出了其中5个有效siRNA在单体活细胞水平来进行高通量和精确定量分析。具体信息如表1所示：

表1.本研究中靶定HBx的siRNA序列信息

为了方便高效地评估出这些siRNA的效率，基于流式细胞术我们提出了一种新的评估方法。申请人选取5个siRNA(si9，si12，si19-1，si22，和si25)做浓度梯度实验。250ng的pEGFP/DsRed-HBx分别同浓度递减的siRNA和siNC(25nM，50nM and 100nM)一起共转染Linx细胞(来源见：Tong WP，Zhou Y，Wang X，Yang F，Wu KL，Wu J，Zhang Y 2008 An accurate quantitative method for screening effective siRNA probestargeting a Hepatitis B virus transcript in single living cells.Biochem Biophys ResCommun.367：866-73.)。细胞被吹撒上样到流式细胞仪器中进行测量。这种基于单体活细胞的siRNA的抑制作用通过如下的方程(3)来计算：

抑制百分率＝(tMFI-MFI)_DsRed/tMFI_DsRed×100％。tMFI表示的是理论MFI。

                                                          ---方程(3)

为了计算出DsRed-Monomer的理论MFI(tMFI)，一条对应的校准曲线根据pEGFP/DsRed-HBx和不同浓度的siNC共转染时的结果通过方程(1)和方程(2)依据上面所述的方法被拟合出来(见图13)。在共转染了报告质粒和有活性作用的siRNA的细胞中，基于方程1我们可以计算出细胞中表达的EGFP的MFI，另一方面在此校准曲线上与EGFP的MFI相对应处就有一个红色荧光蛋白的MFI，我们把此从校准曲线上推导出来的理论上的红色荧光蛋白的MFI定义为tMFI。tMFI表示的是当RNAi没有发生时细胞中红色荧光蛋白的MFI。当RNAi发生后，利用方程(2)可以计算出此时观测到的红色荧光蛋白的MFI。那么siRNA的抑制效率就可以用DsRed-Monomer的tMFI和MFI间的差值推导出来，也就是方程(3)所表示的意义。

基于此种定量方法，我们一次性地计算出了此5种siRNA分别在25nM、50nM和100nM这三个不同的浓度下的抑制效率，快速高效地得到了15个样品的抑制结果，见表2。

                    表2.不同浓度下siRNA抑制效果表

从表2中，可以看出所有挑选出来的siRNA在三种不同浓度下都取得了80％以上的抑制效率，而且每个siRNA的抑制效率在三种不同浓度时都几乎相同。这表明5个siRNA在25nM的时候全都达到了饱和抑制。在25nM、50nM和100nM这三个不同的浓度下，很有意思的是，每个siRNA都产生出了高度一致的抑制效率：si12的抑制效率在86-88％之间；si9在83-84％之间；si22都是81％；si19-1和si25都在80-82％ 之间。具体siRNA的抑制效率请见图13。抑制效率高度一致性表明本发明的方法是极其可靠的。

综上所述本发明中的双色荧光报告载体pEGFP/DsRed和pEGFP/DsRed-HBx的主要优点特征总结如下：

1、具有pUC质粒的复制子，是松弛型质粒。依据常规培养大肠杆菌和抽提质粒的方法，4ml大肠杆菌DH5α可以抽提出4.4到8.6微克的质粒量(见图7)，因此本发明中的pEGFP/DsRed和pEGFP/DsRed-HBx两种质粒经过常规的抽提方法可以很方便地得到微克级的量以满足常规生物试验的需要。

2、pEGFP/DsRed转染24小时后在荧光显微镜下可同时观察到两种荧光蛋白各自清晰明亮的荧光信号，表明载体上的红/绿荧光蛋白基因可同时被正常有效地表达(见图8)。

3、分别在转染pEGFP/DsRed-HBx后24小时、48小时、72小时用荧光显微镜观察，可同时观察到两种荧光蛋白各自清晰明亮的荧光信号，并且对应荧光信号随着时间的推移有越来越强的趋势，表明载体在一定时间范围内能稳定地表达出红/绿荧光蛋白(见图9)。

4、荧光蛋白EGFP和DsRed-Monomer适合在流式细胞细胞仪平台上进行双标检测(Orengo JP，Bundman D，Cooper TA.2006 A bichromatic fluorescent reporterfor cell-based screens of alternative splicing.Nucleic AcidsRes.34：e148.)。EGFP和DsRed-Monomer在被488nm的激光激发时，会产生各自的发射波谱。检测时我们选择了PMT2(FL1)通道和PMT4(FL3)通道分别来收集波长范围为[515nm，535nm]的绿色荧光信号和波长范围为[610，630]的红色荧光信号。因此将荧光间的干扰降低到了最低限度，这为精确定量提供了物质基础。

5、在EGFP基因的两端分别存在一个Sal I位点(见图谱5和6)，用Sal I单酶切就可以将EGFP基因切下来，这为以后载体的升级改进提供了很好的条件。

6、靶标基因可以融合在DsRed-Monomer的终止密码子之后，因此靶标基因就成为了DsRed-Monomer的3’UTR而不被翻译出来(见图谱6)。这样就可以仅仅表达出完整的红色荧光蛋白而避免了红色荧光蛋白遭融合后的影响。这为精确定量系统的稳定性提供了保证。

7、载体表达出的红/绿荧光蛋白各自所发出的荧光强度间存在着相关性，利用定量荧光流式细胞术，可以绘制出相关性很好的校准曲线(见图11和13)。这为精确定量提供了方法上的支持。

综上所述，本发明中所述的定量分析siRNA效率的方法与现有技术相比具有以下优点：

1、仅只需要对双色荧光报告质粒和siRNA进行共转染即可；

2、整个操作过程中，细胞在活体的状态下被分析，不需要打破细胞更不需要从细胞中抽提出蛋白和RNA；

3、没有荧光信号的细胞以及那些仅仅只有红色荧光而没有绿色荧光的细胞都被筛选出局，而那些能够发出作为内参的绿色荧光的单体活细胞才被确定下来作为分析的对象以提高分析的精确性；

4、在不同批次的实验甚至在同一批次所用不同浓度的siRNA实验中，我们都用无关的负对照siRNA作为参照计算出了双色荧光报告载体中红绿荧光蛋白之间的校准曲线以此来提高我们定量的精确性；

5、目的细胞群中的每一个细胞的红/绿荧光强度都被利用来计算各个siRNA抑制靶标的效率，因此基于校准曲线的定量结果具有高度的可信性和可重复性(见图13)。

附图说明

本发明的上述和其他目的，特点和优势可显而易见地从下面对本发明优选实施例的详细描述和附图示出的内容得到，不同视图中相同的参考符号代表相同的部分。附图并不一定是按比例示出，其重点在于说明本发明的实施和效果。

图1为衍生质粒pEGFP-N1-Ampicillin的构建示意图；

图2为衍生质粒pMD18-EGFP的构建示意图；

图3为衍生质粒pMD18-EGFP-polyA的构建示意图；

图4为衍生质粒pEGFP/EGFP的构建示意图；

图5为双色荧光报告载体pEGFP/DsRed的构建及其图谱示意图；

图6为双色荧光报告载体pEGFP/DsRed-HBx的构建及其图谱示意图；

图7为依据常规的抽提超纯质粒的方法，所得的超纯双色荧光报告载体pEGFP/DsRed和pEGFP/DsRed-HBx对其定量的电泳图片。最左边的条带为maker：1kb plus；泳道1为本发明中的超纯质粒pEGFP/DsRed.；泳道2为本发明中的超纯质粒pEGFP/DsRed-HB；依据常规的定量算法对其进行定量，定量结果证明用4ml DH5α可以抽提出8.6微克本发明中的双色荧光报告载体pEGFP/DsRed和4.4微克本发明中的双色荧光报告载体pEGFP/DsRed-HBx；

图8为Hela细胞被转染了250ng本发明中的pEGFP/DsRed，24小时之后在荧光显微镜下观察到的结果示意图。EGFP表示用蓝光激发在荧光显微镜下观察到的绿色荧光信号，DsRed-Monomer表示在EGFP信号观察完之后在同一个视野下用绿光激发后所观察到的红色荧光信号。结果显示本发明中的pEGFP/DsRed能够同时检测到绿色荧光信号和红色荧光信号，表明本发明中的pEGFP/DsRed载体能够在真核细胞中同时顺利表达出绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白；

图9为Linx细胞被转染了250ng本发明中的双色荧光报告载体pEGFP/DsRed-HBx之后，在转染24小时，48小时，72小时在荧光显微镜下观察到的结果示意图。EGFP和DsRed-Monomer表示在24小时、48小时、72小时等时间段时分别检测到的绿色荧光和红色荧光信号。从图上我们可以观察到，本发明中的双色荧光报告载体pEGFP/DsRed-HBx能在真核细胞中顺利表达出绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白。而且随着时间的推移，荧光信号有增强的趋势，此结果表明本发明中的pEGFP/DsRed-HBx载体有很好的稳定性，适合于长时间的荧光信号检测；

图10为用不同质量本发明中的pEGFP/DsRed-HBx载体和4nM siNC(无关siRNA)共转染Linx细胞，48小时之后在荧光显微镜下观察到绿色荧光信号和红色荧光信号的结果。具体转染所用质粒的质量如图所示为：100ng、120ng、140ng、160ng、180ng、200ng、220ng、250ng、300ng、350ng、400ng、500ng。在同一个样品中，当绿光减弱时，红光必定也减弱；反之依然。图10结果可以定性说明本发明中的pEGFP/DsRed-HBx载体所表达的红/绿荧光蛋白间存在着一种直线关系，这就为后面的用绿色信号作为内参来精确定量红色荧光信号的变化打下了坚实的基础。

图11为图10中用不同质量(分别为100ng、120ng、140ng、160ng、180ng、200ng、220ng、250ng、300ng、350ng、400ng、500ng)的pEGFP/DsRed-HBx和4nM siNC(无关siRNA)共转染Linx细胞在荧光显微镜下观察之后，全部样品都用流式细胞仪检测完毕后所给出的部分流式分析结果。流式结果中的Y轴(PMT4Log)表征的是DsRed-Monomer的红色荧光强度；X轴(PMT2Log)表征的是EGFP的绿色荧光强度。图11(A)为未进行转染操作的细胞作为流式分析的空白对照所显示的结果。空白样品的流式结果表明在未转染本发明的细胞中既没有红色信号也没有绿色信号。图11(B)为用100ng pEGFP/DsRed-HBx同4nM siNC共转染后用流式细胞仪检测到的结果。图11(B)的上部分显示的是流式细胞仪基于所分析细胞的荧光信号特征，将细胞分成了4个区域，分别为B1、B2、B3、B4区。当转染了本发明中的pEGFP/DsRed-HBx之后，那些检测到荧光信号的细胞大部分位于B2区，另有一小部分位于B1和B4区。流式细胞仪同时将不同区域内的细胞参数都在图B的下部分分别显示出来。例如位于该区中细胞的数目(Number)、区内每个细胞的平均绿色荧光强度(X-mean)、区内每个细胞的平均红色荧光强度(Y-mean)等等。图11(C)为基于流式细胞仪分析的数据，依据方程(1)(2)计算出每个质量下样品各自的平均红/绿荧光强度，由此决定橙色点的坐标，橙色点的坐标表示细胞在转染siNC后细胞表达荧光的情况。每个橙色点所用的载体质量都在对应点下进行了标明。然后用平均红色荧光强度对平均绿色荧光强度进行作图，用软件R package(http://www.r-project.org)于是模拟出了一条如图11(C)所示的直线。直线的方程及其相关特性在图C的左上角标出。

图12为荧光显微镜下观察到的在100nM，50nM和25nM不同浓度的siRNA的抑制效果图。将250ng本发明中的pEGFP/DsRed-HBx同挑选出的有效的5个siRNA(si9，si12，si19-1，si22，和si25)分别在不同的浓度下(100nM，50nM和25nM)共转染Linx细胞系。同时将siNC也在逐渐降低浓度(100nM，50nM和25nM)下与250ng本发明中的pEGFP/DsRed-HBx共转染Linx细胞系并在每个浓度下都做了10个样品以绘制出校准曲线。EGFP表示荧光显微镜下所检测到的绿色荧光蛋白所发出的信号，DsRed-Monomer表示荧光显微镜下检测到的红色荧光蛋白所发出的信号。从转染SiNC的试验结果可以发现，在100nM，50nM和25nM 浓度下，同一个siNC自身所发出的红/绿荧光信号强度都彼此相当；但是当转染进了5个有效的siRNA(si9，si12，si19-1，si22，和si25)之后，与同浓度下的siNC的转染结果对比我们可以发现，绿色荧光信号没有什么变化，但是红色荧光信号却大大地降低了。表明挑选出的有功能的siRNA很有效地抑制了DsRed-Monomer的表达。

图13为基于不同浓度下的校准曲线所计算出的不同浓度下siRNA的抑制效果图。当用实验证实了本发明所表达的红(绿)荧光蛋白的平均荧光强度间的确存在着直线关系之后，我们就开始运用本发明进行高通量筛选有效siRNA。将图12中的试验样品在荧光显微镜下观察之后，随即将其上样到流式细胞仪中进行定量分析。所用本发明中的pEGFP/DsRed-HBx载体都为250ng，siNC的浓度和有效siRNA的浓度都分别为100nM，50nM，25nM。不同浓度下的效果图分别对应于图13(A)，(B)，(C)。橙色点的坐标表示细胞在转染siNC后细胞表达荧光的情况，不同siNC浓度下，橙色点的坐标数值计算以及校准曲线的确立都同图11，校准曲线的特征都在其左上角标出。绿色点的坐标表示细胞在转染有效siRNA后细胞表达荧光的情况，绿色点的坐标数值的确定也是依据方程(1)(2)计算出每个有效siRNA样品各自的平均红/绿荧光强度来决定的。siRNA抑制效率依据方程(3)计算得出。si9的抑制效率计算如下：例如在图13(A)中，当转染了100nM的si9之后，利用方程(1)(2)可以确定其绿色点的坐标，因为与此同时转染了100nM的siNC的样品可以确定橙色点的坐标及在此浓度下的校准曲线，那么当si9的平均绿色荧光被测出来之后，就可以在校准曲线上找到对应此点时的理论平均红色荧光强度(tMFI)，水平直线指向的就是tMFI。最后依据方程(3)方便地算出si9在100nM下可以达到83％的抑制效果，基于此可以轻易算出其他浓度下si9的抑制效果。100nM，50nM，25nM下对应的具体抑制结果分别在图13(A)，(B)，(C)的右边被标记出来。对图13(A)，(B)，(C)结果分析对比，我们发现在不同浓度下，每个siRNA自身的抑制效率都极其一致，表明本发明在25nM的时候这5个siRNA都达到了饱和抑制。此结果也证明了基于本发明的定量流式细胞术具有高度的可重复性和可信赖性。

具体实施方式

实施例1 PCR扩增带有启动子和转录终止信号的氨苄抗性基因序列

扩增引物合成：引物根据氨苄抗性基因的ORF及载体设计，用primerpremier 5.0软件(加拿大的Premier公司产品)检测。所用5’引物P1为：CCTAGATCTTAAGAAATTAAAAATGAAGTTT(下划线为引入的Bgl II酶切位点)；3’引物P2为：TAATAATGGTTTCACGTAGTGCAGGTGGC(下划线为引入的Dra III酶切位点)。本发明中所用引物均由武汉赛百盛公司合成。以pUC18(Takara公司产品)为模板，用上游引物和下游引物，利用PCR仪扩增出pUC18中从1566到2617的一段DNA序列。

PCR体系组分：5μl 10×1^#buffer，5μl dNTP(2mM)，1μl引物P1(10μM)，1μl引物P2(10μM)，0.1μl模板pUC18，2μl Mgcl 2(25mM)，0.3μl TOYOBO KOD酶(2.5U/μl)，补无菌ddH₂O至50μl。用移液枪抽吸混匀，向无菌PCR管中加上述组分的操作在冰上进行。1000rpm离心10sec后，将PCR管置于PCR仪上。

PCR反应条件：94℃，3min；94℃，30s；40℃，30s；74℃，30s，5次；94℃，30s；55℃，30s；74℃，30s，25次；74℃，5min。

取5uL PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶上电泳，EB染色后紫外灯下观察扩增结果。PCR扩增带有启动子和转录终止信号的氨苄抗性基因，PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶上电泳，EB染色后紫外灯下观察，有与目的基因大小相符的目的条带，大小为1086bp左右。此步得到了带有启动子和转录终止信号的氨苄抗性基因序列。

实施例2带有启动子和转录终止信号的氨苄抗性基因PCR产物的回收与纯化

(1)将实施例1中的PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳(1×TAE)，用紫外灯观察电泳情况，当要回收的DNA带与其他带完全分离时，停止电泳，在紫外灯下用刀片切下欲回收带，用PCR产物纯化试剂盒纯化。(2)在Eppendorf管中将胶捣碎，加入等体积的溶胶液Binding Buffer，65℃水浴7min，其间每2min轻摇Eppendorf管一次直至胶完全融解。(3)将融解的 样品加入层析柱中，12000rpm离心1min，弃去液体。(4)加300μl BindingBuffer，离心弃去液体。(5)加750μl Washing Buffer，离心弃去液体。(6)重复步骤(5)一次。(7)空柱子12000rpm离心1min以甩干液体。(8)将柱子放于1.5ml Eppendorf管，加入30μl Elution buffer，37℃保温2min，12000rpm离心1min，将得到的PCR产物取2μl电泳检测定量，其余的贮于-20℃备用。此步得到了纯化过的带有启动子和转录终止信号的氨苄抗性基因序列。

实施例3质粒pEGFP-N1被Afl II单酶切

反应体系：5μl 10×0buffer；pEGFP-N1 plasmid 15μl；5μl Afl II酶；补无菌水ddH₂O至50μl。

反应过程：将反应体系组分在冰上混合并混匀，5000rpm瞬时离心10s，置于37℃水浴锅中保温反应2-4h，用1％的琼脂糖凝胶电泳紫外灯下切下目的条带，用胶回收试剂盒进行回收纯化。最后用30μl无菌水洗脱。取2μl样品1％琼脂糖电泳检测，其余贮于-20℃备用。此步得到了被被Afl II单酶切过的pEGFP-N1。

实施例4质粒pEGFP-N1被Afl II单酶切后通过KOD DNA聚合酶补成平末端

反应体系：5μl被Afl II单酶切的pEGFP-N1；1μl MgCl₂(25mM)；2μl dNTP(2.5mM)；1μl 10×1^#buffer；1μl TOYOBO KOD酶(2.5U/μl)。

反应过程：将反应体系组分在冰上混合并混匀，5000rpm瞬时离心10s，放入PCR仪中于70℃反应30分钟。此步得到了通过KOD DNA聚合酶被补成平末端的pEGFP-N1。

实施例5用Cycle-Pure Kit(E.Z.N.A公司产品)纯化被补平的质粒pEGFP-N1

具体过程如下：

(1)将实施例4中被Afl II单酶切的质粒pEGFP-N1酶切体系转移到一个干净的1.5ml的离心管中，加入4-5倍体积的Buffer CP。(2)完全振荡混和，对离心管进行简短离心，将溶液集中于管底。(3)将HiBind DNA柱子置入一个试剂盒中提供的2ml的收集管中。(4)将步骤(2)中的样品加入到HiBindDNA柱子中，在室温(20-25℃)10,000×g离心1分钟。(5)倒掉管底离 心下来的液体，将HiBind DNA柱子放回上述的收集管中。(6)用700μl被无水乙醇稀释过的DNA wash溶液冲洗HiBind DNA柱子。在室温10,000×g离心1分钟。(7)倒掉管底离心下来的液体，重复步骤(6)一次。(8)倒掉管底离心下来的液体，以最大转速空转HiBind DNA柱子2分钟以甩干柱子中的基质。(9)将HiBind DNA柱子放入到一干净的1.5ml离心管中，直接滴加15-30μl无菌水到柱子的基质上，在室温静置1-2分钟。以最大转速离心1分钟将DNA洗脱下来。此步得到了被纯化过的补平的质粒pEGFP-N1。

实施例6对被补平的pEGFP-N1质粒进行去磷酸化操作，以及对扩增出的氨苄抗性基因进行磷酸化操作

去磷酸化反应体系：1～20pmol被补成平末端的pEGFP-N1质粒；5μl 10×碱性磷酸酶buffer；2μl TaKaRa碱性磷酸酶(10U/μl)；补无菌水ddH₂O至50μl。

磷酸化扩增出的氨苄抗性基因反应体系：1～50pmol利用KOD扩增出的氨苄抗性基因；5μl 10×T4多核苷酸激酶buffer；2.5μl ATP(10mM)；2.5μl T4多核苷酸激酶；补无菌水ddH₂O至50μl。

反应过程：分别将去磷酸化和磷酸化体系组分在冰上混合并混匀，5000rpm瞬时离心10s，随后于37℃反应30分钟，在70℃变性15分钟失活蛋白，最后分别用Cycle-Pure Kit(E.Z.N.A公司产品)进行纯化。此步分别得到了被去磷酸化和被补平的pEGFP-N1质粒和被磷酸化的氨苄抗性基因。

实施例7将被去磷酸化的pEGFP-N1质粒和被磷酸化的氨苄抗性基因进行连接反应

将以上被去磷酸化的pEGFP-N1质粒和被磷酸化的氨苄抗性基因进行连接反应，其连接体系为：3μl(10ng/μl)被去磷酸化的pEGFP-N1质粒；3μl(28ng/μl)被磷酸化的氨苄抗性基因；6μl Solution I(Takara)。在冰上混合上述液体，将12μl混合液放在250μl的无菌离心管中，用移液枪轻轻抽吸几下混匀，5000rpm瞬时离心，将混合液集中在管底，然后4℃连接过夜。

实施例8大肠杆菌的转化和带有氨苄霉素和卡那霉素抗性质粒 pEGFP-N1-Ampicillin的筛选

(1)采用冷氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞：(a)以无菌牙签挑取平板上的大肠杆菌DH5α单菌落，接种到5mL LB培养基中，37℃，220rpm活化过夜。(b)取10～20μl上述活化大肠杆菌，接种到5mL新鲜的LB培养基中，37℃，220rpm培养2～3h，至OD600值为0.4～0.6。(c)取1.5mL步骤(b)中的菌液加入无菌的Eppendorf离心管中，4,000rpm离心10min，抽干上清。(d)加入800μl冰预冷的0.1M氯化钙，轻轻振荡重悬菌体沉淀，冰浴30min。4,000rpm离心10min，抽干上清。(e)加入100μl冰预冷的0.1M氯化钙重悬沉淀，得到制备好的感受态细胞。4℃保存，7～10天内使用。

(2)质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞：(a)取12μl连接反应液，加入到100μl上述制备的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。(b)42℃水浴中热激90s，迅速移至冰中冰浴2-3min。(c)加入390μl新鲜LB液体培养基，37℃，150rpm轻摇，50min。(d)4,000rpm离心5min，吸弃400μl上清，将剩余的菌液用移液枪轻轻混匀。(e)将剩余的菌液接种到5mL含有60μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃摇床中220rpm过夜培养。(f)24小时后，观察结果。

(3)质粒pEGFP-N1-Ampicillin的筛选：24小时后收集生长起来的细菌，用碱法抽提出质粒，将所得质粒再次转化DH5α感受态细胞，将被转化细胞铺板于含60μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的双抗平板上，于37℃培养箱中培养过夜。挑选单克隆，酶切证明有插入。同时将重组质粒pEGFP-N1-Ampicillin送往上海联合基因研究院测序。所能测出的部分证明氨苄抗性基因以顺时针方向插入。最终得到了有氨苄抗性的载体pEGFP-N1-Ampicillin。具体克隆过程及图谱见图1。

实施例9衍生质粒pMD18-EGFP的构建(具体图谱见图2)

(1)扩增引物合成设计和合成方法以及操作过程同实施例1。所用5’引物P3为： 

(下划标记为引入的Stu I和SalI酶切位点)；3’引物P4为：TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC。以pEGFP-N1 (BD Biosciences Clontech公司产品)为模板，用上游引物和下游引物，利用PCR仪扩增出绿色荧光蛋白基因EGFP。PCR体系组分：25μl 2×GC buffer I，5μl dNTP(2mM)，1μl引物P3(10μM)，1μl引物P4(10μM)，1μl模板pEGFP-N1，0.4μl Takara LA Taq酶(5U/μl)，补无菌ddH₂O至50μl。

PCR反应条件：94℃，3min；94℃，30s；50℃，60s；72℃，90s，30次；74℃，5min。

(2)PCR产物的回收与纯化过程同实施例2。将回收和纯化过的EGFP基因PCR产物与pMD18-T vector(Takara公司产品)进行连接反应。其连接体系为：4μl EGFP PCR产物；0.5μl pMD18-T vector；5μl Solution I；0.5μl T4DNA连接酶。具体连接操作过程同实施例7。

(3)大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备同实施例8，质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞过程如下：(a)取10uL连接反应液，加入到100uL上述制备的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。(b)42℃水浴中热激90秒，迅速移至冰中冰浴2-3min。(c)加入390uL新鲜LB液体培养基，37℃，150rpm轻摇，50min。(d)4,000rpm离心5min，吸弃400uL上清，将剩余的菌液用移液枪轻轻混匀。(e)取100uL细菌悬液，用无菌三角玻璃涂棒涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，正向放置1-2小时，直至液体被充分吸收，倒置平板，于37℃培养箱中培养过夜。(f)12-16小时后，观察结果。

(4)阳性重组子pMD18-EGFP的鉴定。(a)双酶切鉴定，反应体系：1μl10×K buffer；7μl plasmid；1μl Hind III酶；1μl BamH I酶；补无菌水ddH₂O至10μl。反应过程：将反应体系组分在冰上混合并混匀，5000rpm瞬时离心10s，置于水浴锅中37℃保温反应2-4h，加反应量0.1倍体积的10×loading Buffer终止反应，取8μl酶切产物，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。根据双酶切后是否有大小正确的带来判断该质粒是否为阳性重组子pMD18-EGFP。(b)EGFP序列测定：将经过双酶切鉴定的pMD18-EGFP重组质粒送往上海联合基因研究院测序。序列测定结果表明EGFP在PCR扩增时发生了一个碱基的突变使得：酪氨酸-183突变为天冬酰胺，即从起始密码子开始的第547位的T突变为A。

实施例10衍生质粒pMD18-EGFP-polyA的构建(具体图谱见图3)

(1)以pEGFP-N1(BD Biosciences Clontech公司产品)为模板，扩增出pEGFP-N1(BD Biosciences Clontech公司产品)中从3424到3860间的一段序列(此序列为单纯疱疹病毒胸苷激酶的转录终止信号——HSV TK poly A)，使得该序列的两边分别含有Pst I和Hind III酶切位点。扩增引物合成设计和合成方法以及操作过程同实施例1。所用5’引物P5：TTGCTGCAGGCGGGACTCTGGGGT(下划标记为引入的Pst I酶切位点)；3’引物P6： 

(下划线为引入的Hind III酶切位点；虚线为模板序列中本身含有的Dra II酶切位点)。PCR体系组分：5μl10×buffer I，5μl dNTP(2mM)，1μl引物P5(10μM)，1μl引物P6(10μM)，1μl模板pEGFP-N1，2μl Mgcl₂(25mM)，1μl TOYOBO KOD酶(2.5U/μl)，补无菌ddH₂O至50μl。

PCR反应条件：94℃，30s；58℃，30s；74℃，60s，30次；74℃，5min。

(2)PCR产物的回收与纯化过程同实施例2。将回收和纯化过的PCR产物与pMD18-EGFP(衍生质粒)进行双酶切后连接反应。其双酶切体系为：11.5μlpMD18-EGFP或者PCR产物；1.5μl 10×M buffer；1μl Hind III酶；1μl PstI酶；补无菌水ddH₂O至15μl。酶切后纯化回收，具体操作同实施例2。随后进行连接反应，其连接体系为：2μl pMD18-EGFP质粒；6μl PCR回收产物；1μl 10×buffer；1μl T4DNA连接酶。具体连接操作过程同实施例7。

(3)大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备和转化同实施例8。

(4)阳性重组子pMD18-EGFP-polyA的鉴定。(a)双酶切鉴定大体上同实施例9中的(4a)，所用限制性内切酶为Pst I和Hind III。(b)polyA信号的序列测定，同实施例9中的(4b)，测序结果正确。

实施例11衍生质粒pEGFP/EGFP的构建(具体图谱见图4)

(1)用Fermentas公司生产的Dra II(Eco0109 I)和Stu I双酶切上述衍生质粒pMD18-EGFP-polyA，回收其中被切出的大小为1,188bp的片断(此片断包含EGFP和HSV TK poly A的DNA序列)，同时也用Dra II(Eco0109 I)和Stu I双酶切 pEGFP-N1-Ampicillin。具体双酶切实施过程如下：(a)首先Stu I单酶切pMD18-EGFP-polyA和pEGFP-N1-Ampicillin，体系如下：2μl 10×B buffer；16.5μl plasmid；1.5μl Stu I酶；补无菌水ddH₂O至20μl。(b)分别回收纯化被Stu I切动的质粒，具体操作过程同实施例2。(c)然后用Dra II单酶切被纯化回收的质粒，体系如下：2μl 10×Tango buffer；16.5μl plasmid；1.5μl Dra II酶；补无菌水ddH₂O至20μl。(d)分别回收纯化被切出的大小约1.2Kb的和4.5Kb的条带，具体操作过程同实施例2。

(2)将此1,188bp的片断亚克隆进上述已经制备好的衍生质粒pEGFP-N1-Ampicillin相应位置处。具体连接体系如下：4μl 1,188bp的EGFP-polyA片断；1μl pEGFP-N1-Ampicillin vector；5μl Solution I；0.5μl T4DNA连接酶。具体连接操作过程同实施例7。

(3)大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备和连接产物的转化同实施例8。

(4)阳性重组子pEGFP/EGFP的鉴定。因为在载体的设计中，申请人在EGFP基因的两端都带上了Sal I酶切位点，当用Sal I单酶切时如果能切出大约为750bp的条带，则说明构建的质粒成功。具体Sal I(Takara公司产品)单酶切体系如下：1μl 10×H buffer；4μl plasmid；0.5μl Sal I酶；0.5μl RnaseA(降解质粒中的RNA)；补无菌水ddH₂O至10μl。最后有目的条带被切出，证明亚克隆构建成功。

实施例12目的质粒pEGFP/DsRed的最终构建(具体图谱见图5)

(1)用Nhe I和Not I切下质粒pDsRed-Monomer-N1(BD Biosciences Clontech公司产品)从多克隆位点到DsRed-Monomer基因(BD Biosciences Clontech公司产品)末尾处的一段775bp的片断。将此片段亚克隆进上述已经构建好的衍生质粒pEGFP/EGFP的相应位点。具体双酶切方法和克隆过程同实施例11，只是过程中使用的限制性内切酶分别为Nhe I和Not I，并且从pDsRed-Monomer-N1上回收的插入片断大小为768bp，从pEGFP/EGFP上回收的载体片断大小为5000bp。

(2)阳性重组子pEGFP/DsRed的鉴定。对DsRed-Monomer基因序列的测序，具体实施方式同实施例9中的(4b)，测序结果正确。

实施例13目的质粒pEGFP/DsRed-HBx的最终构建(具体图谱见图6)

(1)以含有HBx基因的质粒为模板，利用PCR扩增出在HBx基因两边分别含有Not I和Xba I酶切位点的片断，所用5’引物P7：ATAGCGGCCGCATGGCTGCTGCTAGGCTGTGCT(下划线为引入的Not I酶切位点)；3’引物P8：ATATCTAGAGGCAGAGGTGAAAAAG(下划线为引入的Xba I酶切位点)。扩增引物合成设计和合成方法以及操作过程同实施例1。

PCR体系组分：5μl 10×buffer，5μl dNTP(2mM)，1μl引物P7(10μM)，1μl引物P8(10μM)，1μl模板pCMV-flag2a-HBx，0.4μl Pfu酶(2.5U/μl)，补无菌ddH₂O至50μl。

PCR反应条件：94℃，3min；94℃，30s；58℃，60s；72℃，90s，30次；74℃，5min。

(2)可被Xba I酶切的双色荧光报告载体pEGFP/DsRed的获得

因为本发明中的载体pEGFP/DsRed在大肠杆菌E.coli DH5α内增殖时所抽提出的pEGFP/DsRed质粒上的Xba I酶切位点被甲基化了，这样使得pEGFP/DsRed不可被Xba I消化。为了获得可被Xba I消化的pEGFP/DsRed，pEGFP/DsRed质粒被转化到了ER2925菌株(New England Biolabs公司产品)中，然后从ER2925菌株(New England Biolabs公司产品)中抽提出pEGFP/DsRed质粒，这样就避免了甲基化对Xba I酶切活性的影响。大肠杆菌ER2925感受态细胞的制备和载体pEGFP/DsRed的转化同实施例8。

(3)HBx基因的PCR产物的回收与纯化过程同实施例2。将回收和纯化过的HBx基因PCR产物与pEGFP/DsRed(衍生质粒)分别进行双酶切反应以便将HBx插入到pEGFP/DsRed的相应位置处。具体双酶切方法和克隆过程同实施例11。只是过程中使用的限制性内切酶分别为Xba I和Not I，并且回收的HBx基因的PCR片断大小约为465bp，回收的载体pEGFP/DsRed片断大小约为5600bp。具体连接体系和操作过程同实施例11。

(4)阳性重组子pEGFP/DsRed-HBx的鉴定。HBx基因的序列测定，同实施例9中的(4b)，测序结果正确。

实施例14载体pEGFP/DsRed在真核细胞内表达荧光蛋白功能的鉴定(具体试验结果见图8)

因为本发明pEGFP/DsRed理论上可以在真核细胞中既表达出绿色荧光蛋白也可以表达出红色荧光蛋白，如果将质粒转染入真核细胞内，在显微镜下既可以观察到绿色荧光信号而且也可以观察到红色荧光信号的话，那么可以表明pEGFP/DsRed所克隆进入的EGFP基因和DsRed-Monomer基因具有生物学功能。具体细胞的相关操作技术如下：

(1)本发明中所用Hela细胞的培养。Hela细胞系从中国典型培养物保藏中心购买，保藏编号：CCTCC GDC009，为普通细胞株。Hela细胞系培养于含10％热失活小牛血清FCS(FCS；Gibco)、1mM L-谷氨酸的DMEM(DMEM；Invitrogen，Gibco)培养基中于37℃、5％CO₂中培养。(a)细胞的传代培养。待细胞长到80％丰度时，吸去培养瓶内的陈旧培养液。(b)用无菌PBS缓冲液(0.2g KCl，0.2g KH2PO4，8.0g NaCl，1.56g Na2HPO4.7H2O，融解在1L双蒸水中)漂洗细胞单层两次，吸去漂洗液，以除去少数老化或死去的细胞。(c)用无菌吸管吸取1ml0.25％的胰酶加入培养瓶中，置于37℃培养箱消化至细胞变圆(胰酶约2-5分钟)。(d)加入10ml新鲜DMEM完全培养基，迅速吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。(e)把细胞悬液分成等份，分装入两个无菌的细胞培养瓶内，置培养箱中培养。

(2)本发明中所用Hela细胞进行的转染操作。本发明中的细胞转染都是在24孔板中进行。转染全过程必须严格无菌操作。具体过程如下：(a)在转染前一天将待转染细胞接种于24孔板中，37℃培养。转染前的细胞密度以60-70％为准。(b)准备以下溶液：①稀释250ng pEGFP/DsRed于50μl无血清、无抗菌素的DMEM培养基中。混匀后室温(20-25℃，以下相同)静置10分钟。②稀释1μl Lipofectamine2000(Invitrogen公司产品)试剂于50μl无血清、无抗菌素的DMEM培养基中。混匀后室温静置5分钟。(c)混合①、②两种溶液，室温静置15-20分钟。(溶液可能会呈雾状浑浊，但不影响转染)。(d)弃掉培养板中的旧培养基，用0.5ml无血清、无抗菌素的DMEM培养基清洗细胞2次，最后每孔加入400μl无血清、无抗菌素的DMEM培养基。(e)将以上Lipofectamine 2000-DNA混合物加入到此24孔板中，前后左右振荡24孔板使溶液均匀。(f)37℃温育6小时。(g)吸出转染液，加入正常生长培养基，37℃培养。(h)转染24-72小时后检测。

(3)细胞转染24小时后在荧光显微镜下的观察。24小时后，细胞用倒置荧光显微镜(Leica DMIRB)进行观察。本发明表达的DsRed-Monomer用绿光激发；而本发明表达的EGF用蓝光激发。一旦找到合适的视野之后，那么当分别用绿光和蓝光进行激发时必须保证所观察结果是在同一个视野下观察的结果，而这可以通过仅仅只改变激发光源而达到。

(4)在荧光显微镜下观察到的结果如图8所示，表明pEGFP/DsRed能够表达出有生物活性的EGFP和DsRed-Monomer的荧光蛋白。

实施例15分别在转染Linx细胞24小时，48小时，72小时后在荧光显微镜下检测pEGFP/DsRed-HBx中荧光蛋白的表达(具体试验结果见图9)

(1)本发明中所用的Linx细胞系来源请见Tong WP，Zhou Y，Wang X，Yang F，Wu KL，Wu J，Zhang Y 2008 An accurate quantitative method forscreening effective siRNA probes targeting a Hepatitis B virus transcriptin single living cells.Biochem Biophys Res Commun.367：866-73。Linx细胞系具体的培养、转染和荧光显微镜相关操作技术同实施例14。

(2)在荧光显微镜下观察到的结果如图9所示。表明本发明在一定时间范围内能稳定地表达出红/绿荧光蛋白。

实施例16定量荧光流式细胞术对pEGFP/DsRed-HBx表达出的红/绿荧光蛋白各自所发出的荧光强度之间相关性的检测(具体试验结果见图10和11)

(1)将4nM的siNC与不同浓度的pEGFP/DsRed-HBx进行共转染Linx细胞系。转染质粒的质量分别如下：100ng，120ng，140ng，160ng，180ng，200ng，220ng，250ng，300ng，350ng，400ng，500ng。Linx细胞系具体的培养、转染相关操作技术同实施例14。

(2)在荧光显微镜下观察到的结果如图10所示。荧光观察完之后准备对细胞进行流式细胞术分析。

(3)流式细胞术分析之前对细胞的处理。(a)弃掉24孔培养板中的培养基，用冰冷的1×PBS清洗两次；(b)在每个孔中加入1ml冰冷的1×PBS，所后用移液管滴入数滴0.25％胰酶，前后左右振荡平板混匀溶液，将24孔板置于37℃培养约10分钟；(c)用100μl移液器反复吹打约50次以吹散Linx细胞；(d)将打散的 Linx细胞悬液吸入到2mlEP管中于冰上放置；(e)于4℃在转速为600×g的冷冻离心机下以加速度为6进行离心；(f)弃掉上层液体，在此加入1ml冰冷的1×PBS，重悬细胞，重复5中操作；(g)最后加入500μl冰冷的1×PBS于冰上放置以进行流式细胞仪分析。

(4)分析细胞之前对流式细胞仪的设置。选用EPICS ALTRA II(Beckman Coulter公司产品)此款流式细胞仪来分析已经处理好的细胞。(a)选取流式细胞仪的PMT2和PMT4通道来收集对应的绿色和红色荧光。其中PMT2对应的波长范围为[515，535]收集EGFP发出的绿色荧光信号，PMT4对应的波长范围为[610，630]收集DsRed-Monomer发出的红色荧光信号；(b)用空白样品作为流式分析的对照；(c)样品的流式结果用软件Expo32 V1.2B(Beckman Coulter公司产品)统一分析；

(5)为了更进一步地研究本发明所表达的红绿荧光间确实存在着一种曲线关系，将图10中的细胞用流式细胞仪进行了分析。对流式细胞仪的参数进行设置之后，上样分析的细胞被分成了4个区域：仅仅只发红色荧光的细胞位于B1区；既发红光也发绿光的细胞位于B2区；既不发红光也不发绿光的细胞位于B3区；仅仅只发绿光的细胞位于B4区。流式结果中的Y轴(PMT4Log)表征的是DsRed-Monomer的红色荧光强度；X轴(PMT2Log)表征的是EGFP的绿色荧光强度。没有经过转染处理过的细胞(空白样品)作为进行流式分析时的内参。空白样品的流式结果表明在未转染本发明的细胞中既没有红色信号也没有绿色信号，见图11(A)。当转染了本发明之后，那些检测到荧光信号的细胞大部分位于B2区，另有一小部分位于B1和B4区，见图11(B)。流式细胞仪同时将不同区域内的细胞参数都具体地显示出来。例如位于该区中细胞的数目(Number)、区内每个细胞的平均绿色荧光强度(X-mean)、区内每个细胞的平均红色荧光强度(Y-mean)等等。将图11(A)和(B)中的流式结果按照发明内容中提到的方程(1)和(2)计算得到不同质粒浓度下的平均红/绿荧光强度，然后用平均红色荧光强度(MFI of DsRed-Monomer)对与之相应的平均绿色荧光强度(MFI of EGFP)作图拟合而成曲线关系图。方程如下所示：

MFI(EGFP)＝[X-mean_(B2)×N_(B2)+X-mean_(B4)×N_(B4)]/[N_(B2)+N_(B4)]

                                                     ---方程(1)

MFI(DsRed-Monomer)＝[Y-mean_(B2)×N_(B2)+Y-mean_(B4)×N_(B4)]/[N_(B2)+N_(B4)]

                                                          ---方程(2)

图11(C)的结果证明了本发明所表达的红/绿荧光蛋白的平均荧光强度间的确存在着直线关系。将此曲线称之为校准曲线。方程用R package软件(http://www.r-project.org)拟合而成。

实施例17pEGFP/DsRed-HBx在高通量筛选和精确定量siRNA效率中的应用(具体试验结果见图12和13)

(1)本发明中使用的siRNA的合成。本发明中所用的5个靶向HBx的siRNA和一个靶向无关序列的siRNA(siNC)(详细信息见发明内容中的表1)均由广州市锐博生物科技有限公司合成。所有siRNA干粉溶于无核酸酶的水中以达到25μM的储存浓度。

(2)选取5个siRNA(si9，si12，si19-1，si22，和si25)做浓度梯度实验。250ng的pEGFP/DsRed-HBx分别同浓度递减的siRNA和siNC(25nM，50nM和100nM)一起共转染Linx细胞。Linx细胞系具体的培养、转染和荧光显微镜相关操作技术同实施例14。转染之后48小时，荧光显微镜下观察到的结果如图12所示。在每个浓度下，siNC与250ng pEGFP/DsRed-HBx共转染10次，以拟合出在此浓度下的校准曲线。

(3)每个浓度下的校准曲线都根据各自浓度下的siNC与250ngpEGFP/DsRed-HBx共转染的10个样品的流式数据拟合而成。流式细胞术分析及各自浓度下校准曲线的绘制同实施例16。

(4)依据方程式(3)，直接计算出siRNA的效率(图3b)。方程如下所示：

抑制百分率＝(tMFI-MFI)_DsRed/tMFI_DsRed×100％。tMFI表示的是理论MFI。

                                                         ---方程(3)

tMFI表示的是DsRed-Monomer的理论MFI。为了计算出DsRed-Monomer的理论MFI(tMFI)，根据实施例16中所述的方法，在25nM，50nM和100nM下依据siNC的转染结果，3条不同浓度下各自对应的校准曲线通过方程(1)和方程(2)被拟合出来(见图13)。基于校准曲线，可以轻易地计算出siRNA的效率。基于方程 (1)可以计算出待求样品中细胞表达的EGFP的MFI，另一方面在此校准曲线上与此EGFP的MFI相对应处就有一个红色荧光蛋白的MFI，把此从校准曲线上推导出来的理论上的红色荧光蛋白的MFI定义为tMFI。tMFI表示的是当RNAi没有发生时细胞中红色荧光蛋白的MFI。当RNAi发生后，利用方程(2)可以计算出此时观测到的红色荧光蛋白的MFI。那么siRNA的抑制效率就可以用DsRed-Monomer的tMFI和MFI间的差值推导出来，这也就是方程(3)所表示的意义。基于此中方法，一次性地计算出了此5种siRNA分别在25nM、50nM和100nM这三个不同的浓度下的抑制效率，快速高效地得到了15个样品的抑制结果(见图13)。

SEQUENCE LISTING

<110>武汉大学

<120>一种双色荧光报告载体构建方法和应用

<130>一种双色荧光报告载体构建方法和应用

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>5686

<212>DNA

<213>人工构建的重组DNA序列

<400>1

tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg    60

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt    120

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca    180

atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc    240

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta    300

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac    360

catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg    420

atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg    480

ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt    540

acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta    600

ccggactcag atctcgagct caagcttcga attctgcagt cgacggtacc gcgggcccgg    660

gatccaccgg tcgccaccat ggacaacacc gaggacgtca tcaaggagtt catgcagttc    720

aaggtgcgca tggagggctc cgtgaacggc cactacttcg agatcgaggg cgagggcgag    780

ggcaagccct acgagggcac ccagaccgcc aagctgcagg tgaccaaggg cggccccctg    840

cccttcgcct gggacatcct gtccccccag ttccagtacg gctccaaggc ctacgtgaag    900

caccccgccg acatccccga ctacatgaag ctgtccttcc ccgagggctt cacctgggag    960

cgctccatga acttcgagga cggcggcgtg gtggaggtgc agcaggactc ctccctgcag    1020

gacggcacct tcatctacaa ggtgaagttc aagggcgtga acttccccgc cgacggcccc    1080

gtaatgcaga agaagactgc cggctgggag ccctccaccg agaagctgta cccccaggac    1140

ggcgtgctga agggcgagat ctcccacgcc ctgaagctga aggacggcgg ccactacacc    1200

tgcgacttca agaccgtgta caaggccaag aagcccgtgc agctgcccgg caaccactac    1260

gtggactcca agctggacat caccaaccac aacgaggact acaccgtggt ggagcagtac    1320

gagcacgccg aggcccgcca ctccggctcc cagtagagcg gccgcgactc tagatcataa    1380

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tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata    1500

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tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt    1740

gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg    1800

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caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtcctga ggcggaaaga    3300

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cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca    3900

agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca    3960

actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc    4020

tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact    4080

acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact    4140

tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac aaccagcaga    4200

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ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtaagtcgac ctgcaggcgg    4380

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ctggcactct gtcgataccc caccgagacc ccattggggc caatacgccc gcgtttcttc    4740

cttttcccca ccccaccccc caagttcggg tgaaggccca gggctcgcag ccaacgtcgg    4800

ggcggcaggc cctgccatag cctcaggtta ctcatatata ctttagattg atttaaaact    4860

tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat    4920

cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc    4980

ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct    5040

accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg    5100

cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca    5160

cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc    5220

tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga    5280

taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac    5340

gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga    5400

agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag    5460

ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg    5520

acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag    5580

caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc    5640

tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc atgcat                   5686

Claims (3)

1.一种双色荧光报告载体，其序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列； 

2.一种用于制备权利要求1所述的双色荧光报告载体的方法，它包括下列步骤： 

A.衍生质粒pEGFP-N1-Ampicillin的构建：PCR扩增出带有启动子和转录终止信号的氨苄基因，此序列是以pUC18为模板利用KOD DNA聚合酶扩增出的pUC18中从1566到2617的一段DNA序列，将此序列以平末端的方式插入到pEGFP-N1载体的Afl II酶切位点，由此衍生出的质粒为pEGFP-N1-Ampicillin； 

B.衍生质粒pMD18-EGFP的构建：PCR扩增出在EGFP基因5’端含有Stu I-SalI酶切位点的产物，然后将此产物连接到pMD18-T vector中，为pMD18-EGFP； 

C.衍生质粒pMD18-EGFP-polyA的构建：利用PCR扩增出pEGFP-N1中从3424到3860间的一段序列，该序列的两边分别含有Pst I和Hind III酶切位点，此PCR产物经Pst I和Hind III双酶切后连接到上述衍生质粒pMD18-EGFP相应位点，由此生成的质粒为pMD18-EGFP-polyA； 

D.衍生质粒pEGFP/EGFP的构建：用Dra II和Stu I双酶切上述衍生质粒pMD18-EGFP-polyA，回收其中被切出的大小为1,188bp的片断，将此片段亚克隆进上述已经制备好的衍生质粒pEGFP-N1-Ampicillin相应位置处，由此衍生出的质粒为pEGFP/EGFP； 

E.目的质粒pEGFP/DsRed的最终构建：用Nhe I和Not I切下质粒pDsRed-Monomer-N1从多克隆位点到DsRed-Monomer基因末尾处的一段775bp的片断，将此片段亚克隆进上述已经构建好的衍生质粒pEGFP/EGFP的相应位点，由此得到双色荧光报告载体pEGFP/DsRed，用此载体转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，用于其增殖和保藏； 

F.双色荧光报告载体pEGFP/DsRed的一种衍生双色荧光载体pEGFP/DsRed-HBx的制备方法，步骤如下： 

a.HBx基因片断的PCR扩增制备：利用PCR扩增出在HBx基因两边分别含有Not I和Xba I酶切位点的片断； 

b.Xba I酶切的双色荧光报告载体pEGFP/DsRed的获得：为了获得Xba I消化的双色荧光报告载体pEGFP/DsRed，将双色荧光报告载体pEGFP/DsRed转化到ER2925菌株中，然后从ER2925菌株中抽提出pEGFP/DsRed质粒； 

c.pEGFP/DsRed-HBx克隆的构建：用Not I和Xba I分别双酶切HBx基因的PCR产物和从ER2925菌株中抽提出来的双色荧光报告载体pEGFP/DsRed，将HBx基因产物连接到pEGFP/DsRed的相应位置，转化ER2925菌株，得到双色荧光报告载体pEGFP/DsRed-HBx。 

3.权利要求1所述的一种双色荧光报告载体在高通量筛选且定量siRNA效率中的应用。 

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