CN106220721B - Prame衍生的肽以及包括该肽的免疫原组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药和免疫学领域，涉及一种PRAME衍生的肽以及包括该肽的免疫原组合物，该肽的长度不多于35个氨基酸且包括源自人PRAME蛋白的氨基酸序列的至少27个连续的氨基酸，其中，所述肽包括源自人PRAME蛋白的氨基酸序列的至少一个II类HLA表位和至少一个I类HLA表位；本发明还涉及所述肽本身以及以组合物的形式用作治疗和/或预防癌症的药物的应用。本发明的肽能够有效地治疗或预防人类肿瘤性疾病或癌症。

Description

PRAME衍生的肽以及包括该肽的免疫原组合物
本申请为申请日为2008年3月26日、申请号为200880009876.5、名称为“PRAME衍生的肽以及包括该肽的免疫原组合物”的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及医药和免疫学领域。特别涉及到肽、疫苗以及用于制备在给药至患者时能够在体内引发抗肿瘤细胞的免疫应答的疫苗组合物的制备方法。
背景技术
肿瘤相关的抗原PRAME(黑素瘤细胞中优先表达的抗原)最初被鉴定为能够被具有溶解黑素瘤细胞能力的细胞毒性T淋巴细胞识别的抗原(Ikeda等，Immunity.1997；6：199-208)。虽然，已知肿瘤抗原PRAME在多种人类癌症中过表达，但目前还不了解它的分子功能。PRAME最近被鉴定为RAR(视黄酸受体)信号的显性阻抑物。在存在RA时PRAME结合在RAR上，通过募集Polycomb蛋白阻止了配体诱导的受体激活作用以及靶基因的转录。PRAME存在于RAR靶的启动子上，并抑制了RA诱导的分化、生长阻滞、以及凋亡。相反，在RA抗性的人黑素瘤中通过RNA干扰抑制PRAME的表达，恢复了的RAR信号并恢复了体内和体外对RA的抗增殖作用的敏感性(Epping等，Cell.2005；122(6)：835-47)。时常在人恶性肿瘤中观察到的PRAME的过表达可以通过拮抗RAR信号为肿瘤细胞提供生长和存活方面的优势。
事实上发现PRAME在很多种固体肿瘤中以及30％的急性白血病中具有过表达，而表达PRAME的正常组织仅限于睾丸、子宫内膜，并且在卵巢和肾上腺中的表达水平很低。PRAME为已建立的肿瘤抗原，其作为免疫疗法的标靶的潜在应用在现有技术中已有证据，如US 5,830,753、US 6,297,050、US 6,339,149、EP 0783511 B1、WO 01/52612和US 2005/0221440 A1中公开的。虽然有很多出版物指出了PRAME作为肿瘤抗原以及引发抗肿瘤细胞免疫应答和制备抗肿瘤疫苗的候选标靶的潜能，但几乎没有证实了PRAME衍生的肽和表位能够天然保存的有用数据，也没有显示了在建立有效的抗肿瘤T细胞应答时所需的这些表位的免疫原性的有用数据。本发明着眼于这些问题并提供了改进的PRAME衍生的肽，该衍生的肽包括新鉴定的MHC I类和II类表位，本发明还提供了包括这些肽的组合物。
发明内容
US 6,297,050、WO01/52612和US 2005/0221440A1提供了编码表位(epitopes)的PRAME衍生的核苷酸分子，以及包括这些表位的肽。包括现有技术中公开的肽的PRAME衍生和/或PRAME表位可以用作接种组合物的活性组分。这些肽基于I类HLA呈递的(presented)表位，该表位的确定是通过结合预定的算法和蛋白酶体剪切的检测来进行的，而不考虑为了最佳地诱导CD8+ CTL应答，所选序列需要包括由I类HLA分子和II类HLA分子呈递的序列。此外，没有数据证明是否这些表位和肽确实在人体内具有引发免疫应答的能力。
本发明提供了能够引发CD4+ T辅助淋巴细胞(Th cells)和CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的应答的肽和组合物。本发明的主要目的在于提供含有新型抗肿瘤PRAME表位的肽以及用于接种目的的包括所述肽的组合物，由于存在确定的CD4+Th和CD8+CTL表位，因此这些组合物的效果更好。含有这些肽的本发明组合物可以合成制备并因此是完全确定的，这对制造、质量控制以及确保安全的目的来说是有益的。本发明的肽最佳地被设计用作疫苗，以诱导强烈的治疗性和/或保护性的免疫应答，并通过同时引发CD4+ Th和CD8+ CTL的应答而对抗表达PRAME的恶性肿瘤，并且本发明的肽适用于较高百分比的患者，因为这些肽中含有的HLA I类和HLA II类表位覆盖了很宽的HLA单体型(haplotype)。
本发明提供了一种改进的衍生自PRAME蛋白的肽，其中，该肽包括新鉴定的表位。根据本发明的PRAME衍生的肽的序列符合许多严格的要求：序列足够小以能够有效地合成同时还得足够大以能够被专门的抗原呈递细胞捕获。根据本发明的肽可以容易地被20S蛋白酶体降解，释放出I类HLA可呈递的片段或表位。根据本发明的肽优选包括至少一个I类HLA表位和至少一个II类HLA表位。所述II类HLA可呈递的表位通过不依赖蛋白酶体的途径从本发明的肽中分离出来。实质上，这些II类HLA表位被呈递以形成最适的CD8+效应T细胞和CD8+记忆T细胞，因为CD4+ Th细胞能够为树突状细胞(DC)提供必要的信号从而使这些树突状细胞(DC)诱导最佳的强CD8+效应物以及记忆T细胞的应答。存在于本发明的肽中的表位可以被广范围的MHC单体型的广范围的I类HLA和II类HLA分子所展示，特别是涵盖了患者体内多数HLA单体型的最主要的这些人HLA分子。本发明的肽包括HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24、HLA-A68、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B35、HLA-B60、HLA-B61和HLA-B62呈递的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位，其中，已实验性的建立了所述CTL表位的结合I类HLA的能力和由蛋白酶体产生的C-末端。最优选含有结合HLA-A2的CTL表位的肽，因为HLA-A2为人类最主要的I类HLA分子。
此外，根据本发明的肽优选具有经过健康的对照组和/或癌症患者的体外分析证明了的CD4+Th细胞反应性，从而确保了不仅产生改进的CD8+效应物T细胞，还产生了适当的CTL记忆。此外，本发明的肽中存在的结合I类HLA分子的CTL表位优选具有经过在健康的供体和/或癌症患者中在体外和/或体内诱生CTL的能力而确认的CD8+CTL细胞刺激活性。
特别地，本发明公开了一组20个PRAME衍生的肽，该肽具有源自PRAME氨基酸序列的33-35个连续的氨基酸(aa)，这些肽满足的上述大部分的或者全部的要求并且可以分别使用，或者2、3、4、5、10甚至所有20个肽任意结合使用，以用于治疗或预防恶性肿瘤或癌症，以及用于治疗和/或预防(过)表达PRAME的恶性肿瘤(特别是肿瘤)的接种组合物。因此，本发明公开了免疫原组合物，该组合物包括选自由20个PRAME衍生的肽所组成的组中的至少一种(优选两种或两种以上)肽。优选情况下，所述免疫原组合物还包括免疫调节剂和佐剂(更优选合成的佐剂)，选择所述佐剂以极大地增强并优化本发明的肽和表位的免疫原活性，从而在体内和/或体外显示出抗肿瘤活性。
抗肿瘤疫苗可以应用在多种治疗领域(从抗癌症治疗至恶性肿瘤如病毒诱导的恶性肿瘤的治疗或预防)，包括人乳头状病毒(HPV)、柯氏肉瘤疱疹病毒(Kaposi sarcomaherpes virus，KSHV)、EB(Epstein Bar)病毒诱导的淋巴瘤(EBV)、以及展示肿瘤抗原(例如，MAGE、BAGE、RAGE、GAGE、SSX-2、NY-ESO-1、CT-抗原、CEA、PSA、p53或PRAME)的偶发性的恶性肿瘤。由任意的抗肿瘤肽疫苗获得的最优选的免疫应答为由所述肽中的T细胞表位引发的T细胞应答。成功的抗肿瘤T细胞应答应当包括I类HLA限制性CTL应答和同时发生的II类HLA限制性Th应答，并且可以伴随有B-细胞应答。多篇出版物已经证实了CD4+T-细胞与呈递II类表位的树突状细胞(DC)的相互作用使CD40配体上调。
CD4+ Th细胞通过其CD40配体与位于DC上CD40分子的相互作用导致了DC的激活。激活的DCs展示上调的协同刺激分子并分泌促进CTL的细胞因子。这不仅获得了由该激活的DC(呈递I类MHC限制性表位)诱导的更强烈的CD8+ CTL应答，而且还获得了更强烈的CTL记忆应答(Ridge等.1998，Nature 393：474；Schoenberger等.1998，Nature 393：480；Sun等2004，Nat.Immunol.5：927)。Zwaveling等公开了在接种长链的(35个氨基酸)肽以后，对于强烈的抗肿瘤CD8+ CTL应答来说需要CD40在DC上的表达(2002，J.Immunol.169：350)。近来发现，当在所述长链的肽中含有的II类MHC表位未诱导CD4+Th应答时，诱导的CD8+CTL应答较弱且短暂，并且完全缺失CD8+ CTL记忆。
通过连续的确定的细胞内机制，从全长的PRAME蛋白分子或者从编码有缺陷的核糖体产物的较短的PRAME，在细胞内产生呈递由PRAME编码的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位的I类HLA分子(DRIPS；Yewdell等，2002，Mol.Immunol 39：139)。
首先，能够确定CTL表位的主要因素是所述表位(或表位前体)通过细胞溶质肽酶的酶消化作用而从它的旁侧蛋白区域释放出来。多种催化性的蛋白酶体作为初级酶复合物对于绝大多数的CTL表位的正确的C-末端的产生是需要的(Rock等，2004，Nat.Immunol.5：670)。另一方面，CTL表位的氨基末端的生成则更为灵活，因为在细胞溶质和内质网(ER)上存在多种氨基末端外肽酶(例如，ERAP1、嘌呤霉素敏感性的氨基肽酶、争光霉素水解酶以及其他的外肽酶)，并且这些修整酶具有使延长的表位前体的N-末端缩短至表位的精确长度的能力。相反，没有C-末端修整的报道。因此，PRAME蛋白上的蛋白酶体剪切位点的实验性检测鉴定了能够结合I类HLA分子的内源产生的PRAME肽片段的C-末端。在具体的例子中，关于大部分的具有碱性C-末端残基的CTL表位，非蛋白酶体酶活性对表位的C-末端的生成是需要的(见Tenzer等，2005；Cell.Mol.Life Sci 62：1025和Seifert等，2003，Nat.Immunol.4：375)。本发明还公开了一种新型的呈递CTL表位的HLA-A3，该HLA-A3经过鉴定通过N-精氨酸二元转化酶(Nardilysin)(EC 3.4.24.61)和甲拌磷寡肽酶(TOP)(EC 3.4.24.15)的非蛋白酶体的二元反应生成了C-末端。
其次，酶法产生的长度为9-11个氨基酸的肽片段应该具有结合细胞中可用的I类HLA分子的能力，该I类HLA分子是在所述细胞中产生的。所述肽与I类HLA分子的结合限制于那些在所谓的锚定位点具有所需氨基酸残基的肽。由于HLA分子的高度多态性，每种I类分子均具有不同的优选结合基序，该结合基序包括优选的锚定残基。
可以实验性地检测多数由蛋白酶体消化的酶消化现象以及I类HLA肽的结合，并且这种检测结果的结合实现了对呈递CTL表位的I类HLA分子进行可靠且精确的筛选(Kessler等，2001，J.Exp.Med.173：73)。此外，为了确认来自PRAME的经过鉴定的假定的I类HLA分子呈递的CTL表位的有效性，可以对合成的表位肽进行体外诱导CTL应答的免疫原能力的检测。一旦产生具有对抗经鉴定的表位的反应性的CTL细胞系，则该CTL细胞系(或源自该细胞系的克隆)可以用于通过功能性的CTL识别分析来确认肿瘤细胞上CTL表位在细胞表面的表达(Kessler等，2001，J.Exp.Med.173：73)。
本发明提供了源自完整的PRAME蛋白抗原的仔细筛选的肽序列。这种肽在广范围的患有PRAME阳性癌症的患者中给药后，产生了改进的、增强的以及延长的CD8+ CTL效应物以及记忆细胞应答。位于PRAME中的新鉴定的CD4+Th细胞和CD8+ CTL细胞表位、以及PRAME衍生的合成肽和含有它们的免疫原组合物也是本发明的一部分。
因为本发明的肽优选单独或组合用作疫苗或者作为免疫原组合物的一部分，所以所述肽优选称作疫苗肽以及疫苗组合物。
在医疗目的的应用中优选使用相对短的肽，因为它们可以在体外有效地被合成，使用大于约100个氨基酸的天然蛋白是不可能的并且也是不经济的。肽的化学合成可以通过常规的方法以及各种本领域技术人员公知的合适的方法进行。肽的化学合成还可以克服与完整的蛋白质的重组产生有关的问题，即，难于标准化并且需要大量的纯化以及质量控制措施。长度超过I类和II类HLA表位(例如，具有下文所指定的长度)长度的肽对用作疫苗组分来说是特别有益的，因为它们足够大从而能够被专门的抗原呈递细胞(特别是DC)所捕获，如在WO02/070006中所描述的；并且它们在含有的I类和II类HLA表位发生细胞表面呈递(presentation)之前在DC中被加工。因此，具有下文所述长度的本发明的肽的应用，防止了由非抗原呈递细胞(见Toes等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 93：7855和Toes等，1996，J.Immunol.156∶3911)上的少量的I类HLA表位的系统性呈递所产生的T细胞耐受性的不利诱导作用(参见Zwaveling等，2002，J.Immunol.169：350)。
被呈递到CTL细胞和/或Th细胞的T细胞受体处的包括表位的肽优选满足许多要求。所述肽优选具有足够的长度以包括I类HLA和II类HLA表位。此外，所述肽优选包括位于它们的I类HLA和II类HLA结合部分的锚定残基，以能够分别与I类和II类分子结合。肽与MHC呈递分子之间的相互作用应该具有足够的稳定性，以产生显著有效的免疫应答。在本发明的内容中，如果所述肽具有中度到高度的亲和结合力，则肽与MHC呈递分子之间的相互作用在此方面被认为具有足够的稳定性，其中，IC50≤约5μM被认为是高度亲和结合力，约5μM＜IC50≤约15μM被认为是中度亲和结合力，约15μM＜IC50≤100μM被认为是低度亲和结合力，IC50＞约100μM被认为是不结合。
产生所述表位的C-末端的特定的蛋白酶体切割位点优选存在于表位的氨基酸序列之后，以使表位从更大的肽上解离下来并被呈递给I类HLA分子。II类HLA分子呈递的表位对序列长度的要求并不严格，因此对结合II类分子的肽的精确的酶法生成的要求并不绝对。这些要求在本发明中用于在全长的PRAME蛋白序列中定位和设计肽，使该肽包括优选的CTL和Th细胞表位的组合，并因此该肽可以作为极为适合于接种目的的肽。
此外，优选使用体外(in vitro)和先体外后体内(ex vivo)的T细胞实验来证实根据本发明的肽诱导基本的CD4+ Th和CD8+ CTL应答的能力。因此，本发明的肽在能够化学合成的相对较短的肽的筛选中具有显著的进步，所述相对较短的肽包括最有效且最广泛适用的源自于PRAME肿瘤抗原的I类HLA和II类HLA分子呈递的T细胞表位。通过它们的蛋白酶体切割来优化这些肽，所述肽优选含有I类HLA和II类HLA表位。包含在本发明的肽中的CTL表位的C-末端通过20S蛋白酶体的剪切出来，提供了具有CD8+ CTL刺激能力的结合I类HLA的片段。
在本发明的第一个方面，提供了一种肽，该肽包括选自人PRAME蛋白(SEQ IDNo.21)的509个氨基酸序列的连续的氨基酸序列，其中，所述肽优选包括至少一个II类HLATh细胞表位，并且优选还包括至少一个I类HLA细胞毒性T细胞表位。优选情况下，所述肽的长度不多于100个氨基酸，并且包括选自人PRAME蛋白(即，SEQ ID No.21)的氨基酸序列的至少19个连续的氨基酸，其中，所述肽优选包括至少一个II类HLA表位并且优选还包括至少一个I类HLA表位，优选情况下(并不必须)，上述两类表位都来源于人PRAME蛋白的氨基酸序列。更优选地，在所述肽中，至少一个II类HLA表位和至少一个I类HLA表位存在于来源于人PRAME蛋白的氨基酸序列的连续氨基酸序列中。
为了清楚，本发明的肽优选包括至少一个I类HLA分子呈递的表位，并优选还包括至少一个II类HLA分子呈递的表位。这些表位中的每一种都是可呈递的(presentable)，并且在经此处所描述的加工后能够与存在于细胞上的相应的特异性HLA分子结合。因此，每种HLA表位还可以称为HLA结合的和/或可呈递的表位。
所述肽中含有的源自人PRAME蛋白的连续氨基酸序列的长度优选为至少19、20、21、22、25、27、30、33或35个氨基酸，且优选不多于100、80、60、50、45、40、35、33或30个氨基酸，并且所述肽中含有的源白人PRAME蛋白的连续氨基酸序列的长度更优选为19-45个氨基酸，甚至更优选为30-40个氨基酸，甚至更优选为30-35个氨基酸，和最优选为33-35个氨基酸。在另一个优选的实施方式中，本发明的肽包括本文所定义的源自人PRAME蛋白的任意的连续的氨基酸序列。本发明的肽可以容易地合成，并且足够大以能够被专门的抗原呈递细胞所捕获以及被蛋白酶体所加工，并且具有足够的体积和长度以含有至少一个I类HLA表位和至少一个II类HLA表位。选择性地，所述肽可以包括N-末端延伸或C-末端延伸，其可以是能够增强生物可用性、细胞吸收、加工能力和/或溶解性的氨基酸、修饰的氨基酸、或其它功能基团。
优选地，包含在本发明的肽中的II类CD4+Th细胞表位具有激活人类癌症患者和/或健康对照组中的CD4+Th细胞的能力。优选在先体外后体内(ex vivo)或体内(in vivo)对激活作用进行评估，更优选在肿瘤细胞表达PRAME抗原的人类癌症患者中进行评估。最优选地，II类HLA表位具有激活CD4+Th记忆应答的能力，即激活CD45RO-阳性CD4+ Th细胞。由于通过DC的CD40-触发(Lanzavecchia，1998，Nature 393：413)的“杀细胞许可(licence tokill)”信号，将导致更强烈的CD8+效应物和记忆CTL应答。
本发明的肽还包括I类HLA表位。所述I类HLA表位优选通过蛋白酶体切割进行了C-末端的加工。此外，所述I类HLA表位优选能够激活CD8+ CTL应答。最优选地，在人类健康对照个体或者甚至更优选在人类癌症患者中，在先体外后体内和/或体内证实了所述CTL的激活能力。优选地，在人类癌症患者中，肿瘤表达PRAME抗原。由于产生和维持有效的CTL细胞应答中的协同作用，观察到在一个肽中同时存在I类HLA抗原和II级抗原是特别有利的(参见Zwaveling等，2002，J.Immunol.169：350)。
本发明的PRAME肽中的I类HLA表位优选能够在待治疗的患者中呈显性的HLA等位基因上被呈递。优选本发明的PRAME衍生的肽中的I类HLA表位为能够结合HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24、HLA-A68、HLA-B7、HLA-B8、HLA-A35、HLA-B60、HLA-B61和HLA-B62的表位。最优选的I类HLA CTL表位为结合HLA-A2的PRAME表位，因为HLA-A2在所有的高加索人、黑人、印地安人和东方人中呈高度显性，如表1所示。I类HLA表位优选具有高度肽结合能力(IC50＜约5μM的肽)或者中度亲和力(5μM＜IC50＜约15μM的肽)。
根据更优选的实施方式，本发明的肽的长度不多于100个氨基酸，包括源自人PRAME蛋白的连续的氨基酸序列，该连续的氨基酸序列选自由SEQ ID NOs1-20所示的氨基酸序列所组成的组中，或者选择由SEQ ID NO 6、5、7、8、9、10、11、12、14、15、16、18、1、2、3、4、13、17、19和SEQ ID NO：20所组成的组中，人PRAME蛋白的1-33位氨基酸表示为SEQ IDNO.1，19-53位氨基酸(SEQ ID NO.2)，47-79位氨基酸(SEQ ID NO.3)，69-101位氨基酸(SEQID NO.4)，80-114位氨基酸(SEQ ID NO.5)，94-126位氨基酸(SEQ ID NO.6)，112-144位氨基酸(SEQ ID NO.7)，133-166位氨基酸(SEQ ID NO.8)，173-207位氨基酸(SEQ ID NO.9)，190-223位氨基酸(SEQ ID NO.10)，234-268位氨基酸(SEQ ID NO.11)，247-279位氨基酸(SEQ ID NO.12)，262-294位氨基酸(SEQ ID NO.13)，284-316位氨基酸(SEQ ID NO.14)，295-327位氨基酸(SEQ ID NO.15)，353-387位氨基酸(SEQ ID NO.16)，399-431位氨基酸(SEQ ID NO.17)，4l7-450位氨基酸(SEQ ID NO.18)，447-480位氨基酸(SEQ ID NO.19)，477-509位氨基酸(SEQ ID NO.20)。人PRAME蛋白的全长氨基酸序列如SEQ ID No.21所示。
这一组中更优选的肽包括SEQ ID NOs.6、5、7、8、9、10、11、12、14、15、16和18，这些肽包含HLA-A2或其它显性的I类HLA表位。这一亚组中的最优选的肽包括SEQ ID NOs.6、5、8、14、15、16和18，这些肽都包含结合HLA-A2的表位，当从PRAME肿瘤抗原中经过内源加工时证实了所述结合HLA-A2的表位能够诱导识别天然存在的表位的CTL应答。
本发明的PRAME衍生的肽可以通过删除或替换一个或多个氨基酸而被修饰，通过在N-末端和/或C-末端添加氨基酸或功能性基团的延伸而被修饰，这些修饰可以改善生物可用性、对T细胞的靶向，或者包括或释放能够提供佐剂或共激功能的免疫调节物质。可任选的N-末端和/或C-末端的添加氨基酸优选不存在于PRAME的氨基酸序列中的相应位置上，更优选地，N-末端和/或C-末端的添加氨基酸不来源于PRAME的氨基酸序列(SEQ IDNO.21)。本领域的技术人员应该理解的是，天然存在的人类PRAME等位基因变体的PRAME氨基酸序列也包括在本发明的范围内。
本发明的PRAME衍生的肽可以通过化学合成以及随后的纯化而获得(例如，见实施例1)。本发明的PRAME衍生的肽优选溶于在生理上可接受的水性溶液(例如PBS)，所述水性溶液含有不超过35、20、10、5或0％的DMSO。在这种溶液中，所述肽优选以至少0.5、1、2、4或8毫克肽/毫升的浓度溶解。更优选地，多于一种的不同的本发明的PRAME衍生的肽的混合物在这种溶液中以至少0.5、1、2、4或8毫克肽/毫升的浓度溶解。
根据本发明的肽的优选应用是它们用作药物的应用，其中，更优选地，所述肽用作疫苗或疫苗的活性组分。在治疗和/或预防癌症、在制备药物中(优选用于治疗或预防人类癌症或形成肿瘤的疾病的疫苗)，每种肽可以单独使用或者优选将至少一种或两种或三种或四种或多于四种的本发明的肽结合使用。这些疾病优选包括血液恶性肿瘤和固体肿瘤，其中，癌细胞表达PRAME肿瘤抗原。根据本发明的这种药物和/或抗肿瘤疫苗可以用于治疗患有以下非广泛列表的表达PRAME的人类肿瘤性疾病或者具有发展成为这些疾病的危险的患者：黑素瘤、淋巴瘤、乳头状瘤、乳腺癌或宫颈癌、急性和慢性白血病、成神经管细胞瘤、非小细胞肺癌、头颈癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、多发性骨髓瘤、肉瘤以及包括慢性髓细胞性白血病和急性髓细胞性白血病在内的血液恶性肿瘤。
另一方面，本发明还涉及可以用于治疗和/或接种受试者的组合物，该组合物包括至少一种、至少两种、至少三种、至少四种如上所述的根据本发明的肽，并且选择性地含有一种或多种药学上可接收的赋形剂，特别是佐料和免疫调节剂。优选地，所述组合物为药物组合物和/或用作药剂。所述药物组合物优选用于接种。所述药物组合物优选用于治疗和/或预防癌症，用于制备药物(优选用于治疗或预防人类肿瘤性疾病或癌症的疫苗)。肿瘤性疾病(癌症)的不完全列表已经在本文中给出。所述组合物优选包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15以及直到20个不同的肽。替换性地或者与前述的优选实施方式相结合，存在于本发明的组合物中的肽的长度不超过100个氨基酸，并且包括源自人类PRAME蛋白的连续的氨基酸序列，该连续的氨基酸序列选自由SEQ ID NOs.1-20所示的(如表6所示)氨基酸序列所组成的组中。更优选地，所述组合物中存在的肽选自以下亚组：SEQ ID NOs.6、5、7、8、9、10、11、12、14、15、16以及18。它们均包括HLA-A2或其它显性的I类HLA表位。存在于本发明的组合物中的最优选的肽选自以下亚组中：SEQ ID Nos.6、5、8、14、15、16和18。选择性地，可以选择两个或两个以上的肽来匹配受试者或者待治疗的人群的HLA等位基因。
药物的剂型、给药途径以及所用的药学上可接受的赋形剂是常规的为本领域所公知的，例如在Remington的“The Science and Practice of Pharmacy，21stEdition 2005，University of Sciences in Philadelphia”中所描述的。本发明的药物组合物和药物优选制成适于静脉或皮下、或者肌肉给药的剂型，虽然其它的给药途径也是可以的，例如，粘膜给药或真皮和/或皮内给药(如通过注射)。
此外，本发明还包括单次给药本发明的至少一种肽和/或至少一种组合物。选择性地，如果需要可以重复给药至少一种肽和/或至少一种组合物和/或可以依次给药本发明的不同的肽和/或组合物。
根据本发明的药学上可接受的组合物可以包括至少一种能够刺激免疫应答的化合物或佐剂。本发明的药物组合物还可以包括一种或多种的合成佐剂。这些佐剂可以混合在本发明的药物组合物中或者分别地向需要治疗的哺乳动物或人类给药。特别优选那些通过Toll样受体起作用的佐剂。能够激活天然免疫系统的免疫修饰化合物可以特别地通过Toll样受体(TLR’s，包括TLR’s 1-10)而被激活。能够激活TLR受体的化合物以及它们的修饰物和衍生物在现有技术中有记载。TLR1可以通过细菌脂蛋白和它的乙酰化形式而被激活，此外，TLR2可以被革兰氏阳性细菌的糖脂、LPS、LPA、LTA、菌毛、外膜蛋白、源自细菌或宿主的热休克蛋白、以及分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖而被激活。TLR3可以通过dsDNA(特别是来源于病毒的dsDNA)而被激活，或者通过化学合成的化合物多聚(I：C)而被激活。TLR4可以被革兰氏阴性的LPS、LTA、源自宿主或细菌的热休克蛋白、病毒包衣或外膜蛋白质、紫杉醇或它的衍生物、含有透明质烷的低聚糖和纤维结合蛋白而被激活。TLR5可以被鞭毛或鞭毛蛋白激活。TLR6可以通过分枝杆菌脂蛋白质以及B链球菌热不稳定的可溶性因子(GBS-F)或葡萄球菌调控蛋白而被激活。TLR7可以被咪唑并喹啉激活。TLR9可以通过未甲基化的CpGDNA或染色质-IgG复合物而被激活。特别地，TLR3、TLR7和TLR9在介导抗病毒感染的天然免疫应答中起到重要的作用，在治疗方法中以及根据本发明的组合物或药物中优选使用能够激活这些受体的化合物。特别优选的佐剂包括但不限制于合成产生的化合物，包括dsRNA、多聚(I：C)、启动TLR3和TLR9受体的未甲基化的CpG DNA、IC31、IMSAVAC、Montanide ISA-51(法国Seppic 7生产的佐剂)。在另一个优选的实施方式中，合成的佐剂化合物物理连接于本发明的肽。佐剂和共激化合物或功能基团与含有I类HLA表位和II类HLA表位的肽的物理连接，通过同时刺激抗原呈递细胞(特别是纳入、代谢并展示抗原的树突状细胞)而提供了增强的免疫应答。
此外，优选结合使用如WO99/61065和WO03/084999中记载的抗原呈递细胞(共)刺激分子以及本发明的肽和组合物。特别地，优选使用4-1-BB和/或CD40配体、竞争性抗体(agonistic antibodies)或功能片段和它们的衍生物，以及具有相似的竞争活性的合成的化合物，向待治疗的患者进行分别的给药或者与本发明的肽结合给药，以进一步地刺激生成患者体内最佳的免疫应答。
在另一个优选实施方式中，包括使用或不使用额外的免疫刺激物(例如，TLR配体和/或抗CD40/抗-4-1BB的抗体)，在缓慢释放的载体如矿物油中(例如，Montanide ISA 51)或PGLA中递送所述肽。
在本发明的说明书和权利要求中，动词“包括”以及它的变化形式是非限制性的意思，意味着包括下列事项但并不排除未特定给出的事项。此外，由非限定性的冠词“一个”或“一种”限定的元素(element)不排除存在多于一个元素的情况，除非文中明确地写明是一种以及仅仅是一种元素。因此，非限定性的冠词“一个”或“一种”通常表示“至少一种”。
通过以下实施例对本发明进行更加详细的说明，但并不限制本发明的范围。
附图说明
图1.1-1.2：通过使用纯化的蛋白酶体的体外消化确定的源于人PRAME蛋白的合成肽中的蛋白酶体的切割位点。通过粗箭头和细箭头分别指示出了主要的和少量的切割位点(分别以多于或少于5％的消化材料来表示)。
图2：通过使用细胞溶质提取物和纯化的酶的体外酶消化分析确定的PRA190-198的酶切释放的N-末端和C-末端。
图3a-3b：在51Cr-释放细胞毒性测定中检测的通过抗PRAME衍生的CTL表位的CTL对肽和肿瘤细胞的特定识别。图3a，HLA-A2呈递的表位的识别，图3b，其它I类HLA分子呈递的表位的识别。
图4：通过蛋白酶体消化的长链PRAME肽的片段中的假定的完整的表位的例子。
a在竞争性结合测定中被确定结合I类HLA的肽(见表3)
占用免疫-蛋白酶体消化以后获得的片段根据它们的C-末端进行排列。列出了起始氨基酸和终止氨基酸。
c强度表示为在1小时的孵育时间内消化27个氨基酸的总质量峰线(mass-peak)强度的％。
具体实施方式
实施例
在本发明中，将诱导能够有效的和成功的抗患者体内表达PRAME的癌细胞的疫苗诱导的T细胞应答所需要的不同方面结合起来，以设计和筛选最佳的PRAME衍生的疫苗肽。优选的PRAME疫苗肽应该包括至少一种(但优选多种)能够在患者体内诱导CTL应答的I类HLA呈递的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位，以及至少一种证明了具有引发CD4+ Th淋巴细胞应答能力的PRAME衍生的肽。实验部分以序列以及长度/大小的形式提供了用于接种的PRAEME衍生的肽进行优化发计和筛选所需要的参数。实验部分公开了在体外和体内I类HLA呈递的CTL表位和诱导CD4+ Th淋巴细胞反应性的肽的鉴定和确认，它们存在于全长PRAME蛋白中并且可以混合在长度优选为19-45个氨基酸的肽中。
实施例1：源自PRAME的肽的I类HLA呈递的肽的鉴定
肽的合成生成
本研究所用的所有的肽均通过固相法在自动多肽合成仪(Abimed AMS422)上使用标准的Fmoc化学法进行合成。将用于CTL诱导的短肽溶解在20μl DMSO中，在0.9％的NaCl中稀释至肽浓度为1mg/ml，在-20℃下储存直至使用。I类HLA肽结合测定中使用的荧光标记的参比肽为合成的半胱氨酸衍生物。使用5-(碘代乙酰胺基)荧光素(Fluka Chemie AG，Buchs，Switzerland)在pH 7.5(磷酸钠水/乙腈1∶1V/V溶液)下进行标记。通过葡聚糖凝胶G-10使标记的肽除去盐分，并通过C18 RP-HPLC进一步纯化。通过质谱分析标记的肽。用于体外蛋白酶体消化分析和CD4+ Th淋巴细胞反应性分析的27个氨基酸和22个氨基酸多肽通过如上所述的方法合成，并在乙腈-水梯度溶液中通过反相HPLC纯化，并在乙腈-水中过夜进行低压冻干。通过质谱法确定纯度。
用于I类HLA结合检测的PRAME的预筛选
使用肽结合预测算法BIMAS(http∶//bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)(Parker，等，1994，J.Immunol.152：163)和SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/)，筛选具有潜在结合于最显性的I类HLA分子的能力的长度为8、9、10或11个氨基酸的PRAME肽。这些计算机算法搜寻存在于全长PRAME蛋白中的与目的I类HLA分子的结合基序相匹配的肽。选择人群中患病率较高的或至少适中的I类HLA分子，例如，HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24、HLA-A68、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B35、HLA-B60、HLA-B61和HLA-B62。这些I类HLA分子的人群患病率如表1所示。
使用这种算法，在全长PRAME蛋白中筛选出了对所选的I类HLA分子具有预测的(有效的)结合能力的肽。合成具有高度预测的结合能力的PRAME肽(长度为9、10或11个氨基酸)，以在基于竞争的I类HLA结合测定中在实际上实验性地确定它们的结合能力。由于结合确定的I类HLA分子的高度预测性得分对于实际的高度亲和结合力来说不存必然联系(如Kessler等在“2003，Hum Immunol.64：245”中所描述)，因此，这种结合检测是结合能力的评估所需要的。
表1：HLA抗原的频率分布
以在主要人种中的百分比来表示a
Figure GDA0002246777630000171
I类HLA肽结合能力的检测
为了实验性地检测结合I类HLA的能力，使用了基于I类HLA分子竞争的细胞结合测定法，开发了HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24、HLA-A68、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B35、HLA-B60、HLA-B61和HLA-B62(Kessler等，2003，Hum Immunol.64：245)。使用了经EBV转化的人类B细胞(B-LCL)，该细胞通过弱酸处理从它们天然呈递的I类HLA肽中“分离”。收集B-LCL并在磷酸盐缓冲液(PBS)中洗涤，将沉淀物(2-15x106个细胞)置于冰上5分钟。通过在冰冷的柠檬酸缓冲液(0.263M的柠檬酸与0.123M Na2HPO4的1∶1混合物，如表2所示调整pH值)中孵育细胞90秒来进行洗脱。然后，立即将细胞在冰冷的含有2％FCS的IMDM中进行缓冲，在相同的培养基中洗涤一次以上，以4x105个细胞的浓度重悬于IMDM培养基中(含有2％FCS和2μg/ml人β2-微球蛋白(β2M))(Sigma，St.Louis，MO，USA)。
在PBS/BSA0.5％中对每种竞争的测试肽进行8组两倍的稀释(最高浓度600μM，6倍的测定浓度)。在测定中，从100μM至0.8μM的量对测试肽进行检测。在不同的I类HLA竞争测定中使用荧光素(F1)标记的参比肽，它们的来源如表2所示。以6倍的最终测定浓度，将通过研究建立的对I类HLA分子具有高度亲和力的这些肽溶解在PBS/BSA0.5％中。在96孔的V型底培养板中将25μl的竞争(测试)肽与25μl的F1标记的参比肽混合。随后，在100μl/孔中以4x104/孔的量加入分离的B-LCL。在4℃下孵育24小时，细胞用含有1％BSA的PBS洗涤3次，用0.5％多聚甲醛固定，并通过FACScan流式细胞计数仪(Becton Dickinson)进行分析以检测平均荧光值(MF)。通过以下公式计算F1-标记的参比肽结合的百分比抑制率：
(1-(MF参比+竞争肽-MF背景)/(MF参比肽-MF背景))x100％。竞争肽的结合亲和力以能够抑制50％的F1-标记的参比肽的结合的浓度来表示(IC50)。通过非线性回归分析来计算IC50。IC50≤5μM被认为是高度亲和结合力，5蛋M＜IC50≤约15μM被认为是中度亲和结合力，约15μM＜IC50≤100μM被认为是低度亲和结合力，IC50＞100μM被认为是未结合。
表2：不同I类HLA结合测定的特征
Figure GDA0002246777630000191
I类HLA结合测定的结果
实际的结合检测显示49个PRAME肽(长度为9或10个氨基酸)显示出对HLA-A2的高度的或中度的亲和力(表3a)，并且如表3b所示，93个肽(长度为8、9、10、11个氨基酸)对于其它的I类HLA分子(HLA-A1、HLA-A3、HLA-A24、HLA-A68、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B35、HLA-B60、HLA-B61和HLA-B62)具有高度的或中度的结合力。使用蛋白酶体消化分析的结果，进一步分析了这些已证实了具有结合I类HLA能力的肽从它们的旁侧蛋白序列中通过蛋白酶体切割的酶切释放能力(图1.1-1.2)。如表4所列出的，这种分析能够筛选具有以下性质的肽：(1)具有较高的结合I类HLA的能力，(2)通过蛋白酶体切割产生C-末端，和(3)在蛋白酶体的消化分析中发现是完整的。
表3A：源自PRAME的高度和中度结合HLA-A2(*0201)的肽
Figure GDA0002246777630000201
Figure GDA0002246777630000211
表3B：源自PRAME的高度和中度结合I类HLA的肽(非HLA-A2)
Figure GDA0002246777630000212
Figure GDA0002246777630000221
Figure GDA0002246777630000231
实施例2：全长PRAME中的蛋白酶体切割位点的检测
在体外由蛋白酶体介导的切割分析中的材料和方法
通过Groettrup等(J.Biol.Chem.270：23808-23815.；1995)描述的方法，从B-LCL细胞系中纯化出20S蛋白酶体。这种细胞型已知含有免疫蛋白酶体。通过2维免疫印迹确定出LMP2和LMP7的含量较高。为了评价反应动力学，以不同的孵育时间进行消化。在300μl的如上所述的蛋白酶体酰化缓冲液中，使用1μg纯化的蛋白酶体在37℃下与所述肽(27个氨基酸，20μg)一同孵育1小时、4小时和24小时(Eggers，等1995.J.Exp.Med.182：1865)。加入三氟乙酸以停止消化，在-20℃下储存样品直至进行质谱分析。
在设置有流速大约为250nL/min的在线钠米电喷射界面的串连四极杆飞行时间质谱仪(Q-TOF(Micromass))上进行电喷射离子化质谱分析。使用专用的微米/纳米HPLC自动采样器FAMOS(LC Packings)进行注入。在水-甲醇-乙酸(95∶5∶1，v/v/v)中将消化溶液稀释5倍，并装载在水-甲醇-乙酸(95∶5∶1，v/v/v)中的前置柱(MCA-300-05-C8；LC Packings)上。清洗前置柱3次，以去除存在于消化液中的缓冲液。随后，以250nl/min的流速，使用70％至90％梯度的B溶液在10分钟内对截留(trapped)的分析物进行洗脱；(A：水-甲醇-乙酸(95∶5∶1，v/v/v)；B：水-甲醇-乙酸(10∶90∶1，v/v/v)。如果需要，这种较低的洗脱率允许在同样的洗脱过程中设置额外的MS/MS实验。每秒记录50-2000Da的质谱。这种分辨率能够从多种带电离子中直接检测出单一同位素质量。使用Biolynx/蛋白质软件(Micromass)在消化的前体肽中搜索质谱中的峰。使用质谱中的峰的强度来确定由蛋白酶体消化产生的肽的相对量。
在体外由蛋白酶介导的切割分析的结果
使用纯化的20S蛋白酶体，在体外对覆盖了几乎整个PRAME的氨基酸序列的29个有重叠的PRAME肽(最多27个氨基酸)进行消化。消化的间隔为1小时、4小时和24小时。消化片段的质谱分析显示了经消化的PRAME肽中的大量的和少量的蛋白酶体的切割位点。
图1.1-1.2显示了较多的(表示为大于5％的消化材料)和少量的切割位点(表示为小于5％的消化材料)，这些酶切位点是在使用纯化的蛋白酶体与指定的合成肽一同孵育1小时后发现的。这些时间点反应了最可靠的生理学酶活性。
使用对通过体外的蛋白酶体切割产生的肽片段的鉴定，一方面来评价具有高度和中度亲和结合力的I类HLA肽的C-末端的生成，另一方面来评价在经过蛋白酶体切割后作为完整片段存在的表位。图4显示了一种结合肽的例子，发现这种肽在蛋白酶体切割后是完整的，代表非常可能出现在体内的表位；还显示了一种结合肽的例子，发现这种肽在蛋白酶体切割后是不完整的，因此在体内被发现的可能性较低。在表4中列出了显示出高度或中度结合I类HLA能力的PRAME肽，以及在体外经过蛋白酶体切割后是具有正确的C-末端的完整的片段的PRAME肽。这种对肽的筛选可能是在细胞内进行的，也是由I类HLA分子天然呈递到肿瘤细胞表面的，因此优选使用它们在患者体内诱导CTL应答。
表4：经过蛋白酶体切割后源自PRAME的结合I类HLA的肽是具有正确的C-末端完整的片段
Figure GDA0002246777630000251
Figure GDA0002246777630000261
实施例3：不依赖蛋白酶体的HLA-A3呈递的CTL表位PRAME190-198的C-末端的产生 需要非蛋白酶体切割
一些不常见的CTL表位(多数在它们的C-末端具有碱性氨基酸残基)需要使用另外的酶进行非蛋白酶体切割，以释放它们的C-末端(Tenzer等，2005；Cell.Mol.Life Sci 62：1025和Seifert等，2003，Nat.Immunol.4：375)。本发明包括一个这样的CTL表位(位于PRAME的190-198位)，氨基酸序列为ELFSYLIEK，其中，它的C-末端是通过N-精氨酸二元转化酶(Nardilysin；EC 3.4.24.61)和甲拌磷寡肽酶(TOP；EC 3.4.24.15)两次连续的酶切但不依赖于蛋白酶体而产生的。
除了涉及ELFSYLIEK表位的产生以外，可以预测N-精氨酸二元转化酶(Nardilysin)可以通过直接切割而有效地产生下述肽的C-末端：结合HLA-A3的肽PRA16-24(SMSVWTSPR)、结合HLA-A68的肽PRA150-158和PRA150-159(EAAQPMTKK和EAAQPMTKKR)、结合HLA-A24的肽PRA254-262和结合HLA-B*3501的肽PRA253-262。后两个肽(PRA254-262和PRA253-262)还可以通过蛋白酶体切割(如表4所示)而产生C-末端。
酶法生成PRAME190-198的N-末端和C-末端的检测中的材料和方法及结果
使用浓度为20nM的纯化的蛋白酶体制剂、N-精氨酸二元转化酶(Nardilysin)和甲拌磷寡肽酶(TOP)，以在无细胞体系中消化合成的27个氨基酸(PRA182-208)、19个氨基酸(PRA190-208)、13个氨基酸(PRA190-202)、12个氨基酸(PRA190-201)和11-个氨基酸(PRA190-200)的肽(浓度为20μM)，在这些肽的天然旁侧区域(flanking regions)包含HLA-A3呈递的CTL表位ELFSYLIEK(PRA190-198)。如图2所描述的，全面的消化分析揭示了通过蛋白酶体的切割位点有效地释放了PRA190-198的N-末端。然而，与众多主要的CTL表位相比，释放C-末端需要先以N-精氨酸二元转化酶(Nardilysin)切割，产生了11个氨基酸、12个氨基酸和13个氨基酸的前体表位肽PRA190-200；190-201；190-202，随后以甲拌磷寡肽酶(TOP)介导的降解使所述11个氨基酸、12个氨基酸和13个氨基酸的前体肽降解为最小9个氨基酸的ELFSYLIEK表位。
此外，使用CTL克隆识别具有抑制的N-精氨酸二元转化酶(Nardilysin)或甲拌磷寡肽酶(TOP)水平(通过RNA干扰方法)的靶细胞(PRAME和HLA-A3阳性的)中的ELFSYLIEK表位(见图3a-3b)的功能性识别实验，证实了这两种酶对活体细胞中产生9个氨基酸的ELFSYLIEK PRA190-198CTL表位来说是确切需要的(数据未示出)。
由于HLA-A3的结合基序临近HLA-A11的结合基序，这种新型的表位还被认为是新型的HLA-A11呈递的表位。表达HLA-A11和PRAME的靶细胞被CTL抗-ELFSYLIEK特异性的识别(数据未示出)。
实施例4：对经鉴定的CTL表位淋巴细胞的免疫原性和内源产生的检测
对经鉴定的假定I类HLA呈递的CTL表位的亚型进行免疫原性分析。通过在体外诱导抗合成产生的CTL表位的CTL来确定免疫原性。此外，检测了产生的CTL(克隆)识别共表达有PRAME和正确的I类HLA分子的肿瘤的能力。
对抗以下选择到的结合I类HLA分子的PRAME衍生的CTL表位诱导CTL的大批培养。选择肽PRA100-108(VLDGLDVLL)、PRA142-151(SLYSFPEPEA)、PRA300-309(ALYVDSLFFL)、PRA371-380(ALLERASATL)和PRA425-433(SLLQHLIGL)，因为这些肽是预测HLA-A2呈递的CTL表位。此外，诱导抗以下表位的CTL：PRA190-198(ELFSYLIEK)(一种HLA-A3呈递的CTL表位)，PRA113-122(RPRRWKLQVL)(一种HLA-B7呈递的表位)，PRA258-267(QMINLRRLLL)(一种预测表达HLA-B8的CTL表位)。
CTL克隆的体外生成过程和功能性的CTL分析
通过菲科帕克(Ficoll-Paque)法从健康的供体的血液中得到用于诱导CTL的外周血单核细胞(PBMC)。为了优化地使用存在于PBMC中的所有APC，我们开发了能够产生激活的B细胞与成熟DC细胞的混合物的培养系统，所述混合物在最初的诱导步骤中用作APC。外周血单核细胞(PBMC)是通过绵羊红细胞-玫瑰花结形成法(SRBC-rosetting)从T细胞部分和含有B细胞和单核细胞的部分中分离的。冷冻保藏T细胞部分。以1x106个细胞/孔的浓度，在24孔板中在含有800U/ml GM-CSF、500U/ml IL-4(PeproTech Inc.)和500ng/ml CD40 mAb(克隆B-B20；Serotec)的完全培养基中培养单核细胞和B细胞的混合物6天。这种培养体系具有以下三种作用：i)GM-CSF和IL-4诱导单核细胞分化为未成熟的树突状细胞；ii)IL4和CD40 mAb引发B细胞的激活和增殖(Schultze，等1997，J Clin.Invest.100∶2757)，以及iii)CD40 mAb介导未成熟的树突状细胞的成熟(Cella，等1996.J Exp Med 184：747)。在第三天，补充细胞因子和CD40 mAb。为了进一步促进CTL诱导能力，将APC-混合物用0.4ng/mlLPS(Difco Labs)、500U/ml IFN(Boehringer Mannheim)和500ng/ml CD40 mAb再培养2天。在第8天，对APC-混合物与50μg/ml的肽(每种肽分别地)在室温、辐射(30Gy)下进行脉冲处理，并进行清洗以除去游离的肽。解冻冷冻保藏的自体的T细胞部分，并使用磁性珠(Dynal)从CD4+ T细胞中分离出来。在96孔U型底平板中进行初次诱导。APC以10,000个细胞/孔的浓度与50,000个CD8+ T细胞/孔在含有10％的人混合血清(HPS)、5ng/ml的IL-7(PeproTech)和0.1ng/ml IL-12(Sigma)的培养基中进行共培养。在起始诱导CTL的微培养的第7天进行收集，清洗，并以40,000个应答细胞/孔的浓度在96孔的U型底平板中在含有10％HPS、5ng/ml的IL-7和0.1ng/ml的IL-12的培养基中进行再刺激(restimulated)。在弱酸洗脱以从I类MHC分子中除去天然呈递的肽之后(见MHC结合测定的材料和方法)，通过Schultze等(1997，J Clin.Invest.100∶2757)描述的方法在含有2％FCS和3μg/ml的β2-微球蛋白(Sigma)的培养基中在室温下经过辐射(75Gy)和肽脉冲(50μg/m1)4小时产生的自体激活的B细胞，以10,000个细胞/孔的浓度用作再刺激物APC。除了IL-7被20IU/ml的IL-2(Chiron Corp.)替换以外，在第14天和第21天以相同的方式重复进行再刺激。在第29天，通过标准的限制稀释方法克隆CTL的大批培养物。每7-12天使用含有异源PBMC和B-LCL的供给混合物通过无特异性的刺激在含有10％FCS、1.5％白细胞凝集素(Sigma)和240IU/ml IL-2的培养基中维持CTL克隆。
为了功能性的分析CTL杀死具有肽的靶细胞或肿瘤靶细胞的能力，使用了标准的铬释放测定法。标记51Cr后(1小时)，将靶细胞(2000个细胞/孔)加入到96孔板中的终体积为100μl的完全培养基中的不同数量的效应细胞中，在37℃培养4小时后，收获悬浮物。根据以下公式计算三个重复孔的特异性裂解的平均％：(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)x100％.。
CTL的免疫原性和功能性识别肿瘤细胞的分析结果
选择了8个肽用于体外CTL诱导，它们是PRA100-108(HLA-A2)、PRA142-151(HLA-A2)、PRA300-309(HLA-A2)、PRA371-380(HLA-A2)、PRA425-433(HLA-A2)、PRA190-198(HLA-A3)、PRA113-122(HLA-B7)和PRA258-267(HLA-B8)，当负载于表达在B-LCL靶细胞上的正确的I类HLA分子中时，它们具有诱导大批的CTL培养物的能力，所述CTL培养物高度特异性地识别诱导肽(数据未示出)随后，通过限制性稀释法克隆这些CTL大批培养物，并产生CTL克隆。
所述CTL克隆能够有效地识别CTL表位，这些CTL克隆是对抗所述CTL表位而产生，所述CTL表位可以为外源负载的合成肽(图3a和3b，图上部)或者为存在于肿瘤细胞上的内源产生的和天然表达的CTL表位(图3a和3b，图下部)。因此，HLA-A2呈递的肽(图3a)和HLA-A3、HLA-B7和HLA-B8呈递的肽(图3b)都是真正的CTL表位。这些数据确认了此8个CTL表位的免疫原性，证明了它们的细胞表面表达，并且显示了我们关于CTL表位的预测的准确性。这表明所有经鉴定的预测CTL表位(在表4中列出)均可能是肿瘤细胞表达的标靶，适合用于患有PRAME阳性并表达正确的I类HLA分子的癌症的患者体内诱导CTL应答，。
实施例5：CD4+ T辅助细胞抗PRAME中结合II类HLA的肽反应性的检测
为了优化疫苗诱导的抗肿瘤CD8+ CTL细胞的应答(能够消灭表达PRAME的肿瘤细胞)的诱导和维持，需要诱导同时发生的CD4+ Th细胞的应答(例如，Bourgeois，等，2002.Eur.J.Immunol.32：2199；Kumaraguru，等，2004.J.Immunol.172：3719；Janssen，等，2003.Nature 421：852；Hamilton，等，2004.Nat.Immunol.5：873)。这种现象的主要机制是CD4+辅助T细胞群通过CD40-配体和CD40的相互作用在专门的抗体呈递细胞(主要是树突状细胞(DCs))的成熟过程中提供辅助作用(称为“许可模式”)(Schoenberger，等，1998.Nature 393：480；Lanzavecchia.1998.Nature 393：413)。多方面的证据显示出，没有这种CD4+Th应答，不能诱导CD8+应答或仅诱导不理想的CD8+应答，记忆细胞CD8+ T细胞应答的维持和恢复是无力的(Belz，等，2002.J.Virol.76：12388)。因此，在能够诱导CD4+ Th细胞的PRAME蛋白中鉴别结合II类HLA的肽是十分重要的。使用两种不同的筛选测定法来鉴别这些PRAME肽。使用CD4+ Th细胞的增殖和由Th细胞产生的IFNγ，来评价抗一组51个有重叠的PRAME肽的反应活性，所述PRAME肽具有结合II类HLA分子所需要的长度(22个氨基酸或27个氨基酸的肽)。首先，对预测具有结合这些有重叠的PRAME肽的能力的II类HLA分子进行鉴别。
源自PRAME的有重叠的多肽(27个氨基酸或22个氨基酸)的II类HLA结合谱的硅检测
II类HLA与肽的结合没有I类HLA的结合严格。结合在II类HLA分子中的肽至少为13个氨基酸并且可以更长，因为II类HLA分子的结合槽的开放末端允许肽结合于II类分子上并在两个末端延伸到槽外。因此，结合II类HLA分子的肽的长度要求比结合I类HLA分子的肽的要求更灵活。此外，与此一致的是，结合在II类HLA分子上的肽比结合在I类HLA分子上的肽更杂乱。通常长度为13-25个氨基酸的多肽具有结合多种II类HLA分子的能力。这些可变的肽结合II类HLA分子的特征的优点在于，很少需要实际的实验结合测定来确认预测的肽结合。
为了预测II类HLA的结合，使用了互联网上免费使用的一种算法。这种算法是“ProPred”(http：//www.imtech.res.in/raghava/propred/)(见Singh等，2001，Bioinformatics 17：1236)。使用这种算法，在51个有重叠的肽中筛选了用于结合不同的II类HLA分子的结合基序的存在，并对结果进行了分析。如表5A所示，用于检测CD4+ T细胞的反应性的所有有重叠的肽都具有预测的对多种II类HLA分子的有效结合能力(所用的终止点(cutoff)：对于各个II类等位基因，从全长PRAME中选出5个预测的最优结合的肽)。
表5A：51个有重叠的PRAME肽结合II类HLA分子的能力
Figure GDA0002246777630000321
Figure GDA0002246777630000331
CD4+ T细胞增殖测定和CD4+ T细胞IFNγ ELISPOT测定的步骤
为了进行CD4+ T细胞增殖测定，将获得自健康供体或患有PRAME阳性癌症的患者中的总PBMC(1.5x105个细胞/孔)接种在U型底的96孔板的8个孔中的RPMI培养基中，该培养基补充有10％的自体血清和10μg/ml的51个有重叠的27个氨基酸或22个氨基酸的PRAME肽。在第6天，加入50μl的3H-胸腺嘧啶(1mCi/50ml)，在第7天检测3H-胸腺嘧啶的掺入状况。
为了IFNγ ELISPOT测定，使用购自Miltenyi Biotec的CD45RO磁性珠从PBMC中分离出CD45RO+细胞。随后，将CD45RO+(和CD45RO-阴性)细胞与自体受辐射的PBMC以4∶1的比例，接种在24孔板(2-3x 106个细胞/孔)的10个孔的IMDM培养基中，该培养基含有10％的人混合血清并补充有5种不同的肽的10个肽的混合物，所述不同的肽中的每一种均来自于51个有重叠的长度为27个氨基酸或22个氨基酸的PRAME肽的组中。每种肽的肽浓度为5μg/ml，并在第2天加入IL-2(150IU/ml)。在第10天，对肽刺激的CD45RO培养物进行计数，并与自体辐射的PBMC以1∶1的比例，在缺少肽或者存在5μg/ml的单独的肽(1-51号)的情况下，共同接种于IFNγ ELISPOT平板，每种情况进行三次重复。
CD4+ T细胞抗一组51个PRAME肽(27个氨基酸/22个氨基酸)的反应性的结果
在8个健康受体和7个PRAME阳性癌症患者的外周血中，CD4+ Th细胞抗51个有重叠的PRAME肽的反应性分析显示，51个肽中的28个肽通过CD4+ Th细胞诱导了IFNγ的生成，36个肽诱导了CD4+ Th细胞的增殖(表5B)。
表5B：结合II类HLA分子的51个有重叠的PRAME肽的反应性
Figure GDA0002246777630000341
Figure GDA0002246777630000351
Figure GDA0002246777630000361
实施例6：筛选能够满足主要的疫苗要求的疫苗肽
包括一种或多种PRAME衍生的肽的最优的和确定的诱导T细胞的组合物能够诱导抗PRAME阳性肿瘤的免疫应答，且一定能够诱导I类HLA限制性CD8+CTL应答，并同时诱导II类HLA限制性CD4+ T辅助细胞应答。需要Th细胞应答，以增强诱导和维持CTL应答。
此外，由于HLA分子的广泛多态现象，需要设计一种最佳的疫苗以具有较广的HLA单体型范围，允许在众多的潜在患者人群中使用这种疫苗。此外，所述疫苗应该适用于高百分比的患有PRAME阳性癌症的个体患者。因此，根据本发明的疫苗组合物含有多种PRAMECTL表位，这些表位通过在人群中广泛存在的不同的I类HLA分子来呈递。由于在II类HLA分子中的杂乱结合的程度较高，这种要求对于诱导CD4+ T辅助细胞的肽来说并不严格。如表4所示的CTL表位以及如上表5A和5B所列的CD4+ T辅助细胞表位的鉴定，使能够将疫苗肽设计为包含在用于PRAME阳性癌症的确定疫苗中。
所述疫苗组合物含有长度为30-35个氨基酸的PRAME衍生的肽，因为这种长度的肽具有多种优点。如上所述，原则上这种肽易于合成。此外，它们具有足够的长度以容纳I类HLA呈递的CTL表位和II类HLA呈递的T辅助细胞表位。最后，最重要的是所述表位(CTL表位和T辅助细胞表位)在通过抗原递呈细胞呈递之前，这种长度的肽需要被专门的抗原呈递细胞(特别是树突状细胞)加工(Zwaveling，等，2002.J.Immunol.169：350)。结果，不会发生非专门的抗原呈递细胞的呈递和通过生物体的系统性扩散，因此，不会发生在以最小量的I类HLA呈递的CTL表位接种后观察到的耐受性的诱导(Toes，等，1996.J.Immunol.156：3911；Toes，等，1996.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 93：7855.)。因此，这种长度的疫苗肽优于短小的I类HLA表位或全长蛋白。
使用经鉴别的CD8+ CTL表位和CD4+ T辅助细胞反应性PRAME衍生的肽的信息，设计了符合以下三个主要规则的20个PRAME疫苗肽：1)含有至少一个CTL表位，优选多于一个CTL表位，最优选还含有免疫原性经过CTL诱导确认的CTL表位和更优选可被HLA-A2呈递的CTL表位；2)含有至少一种CD4+ T辅助细胞反应性肽，优选为在患有PRAME阳性的恶性肿瘤的患者体内和健康受体内都具有反应性；3)长度为19-45个氨基酸，优选为30-35个氨基酸。
根据本发明设计的PRAME衍生的肽在表6中列出，并且满足这些要求。与现有技术中描述的PRAME片段和组合物相比，表6中的PRAME衍生的肽在人类患者体内对抗表达PRAME的恶性肿瘤和肿瘤而引发有效的、增强的和延长的在体内的免疫应答的能力更为优异。
表6中列出的每一个本发明的肽均被实际地合成并通过如本文上述实施例1中所描述的方法进行了纯化。然而，对于最初使用与表6中的肽相同的标准设计的一种肽(SEQID NO.22：SEQ ID NO.21的222-256位氨基酸)，我们发现实际上它不能够以能够被接受的纯度合成(小于2％的正确序列)。我们还注意到，每一种本发明的肽以0.5-8mg/ml的浓度溶解在生理上可接受的盐溶液(包括大约35％的DMSO)中。
Figure GDA0002246777630000381
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Figure GDA0002246777630000401
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Claims (15)

1.一种长度不多于35个氨基酸的肽，该肽包括源自人PRAME蛋白的氨基酸序列的至少33个连续的氨基酸，其中，所述肽包括源自人PRAME蛋白的氨基酸序列的至少一个II类HLA表位和至少一个I类HLA表位，其中，所述II类HLA表位如含有SEQ ID NO：21的第247-273位氨基酸的氨基酸序列所示，其中，所述肽包括源自人PRAME蛋白的连续的氨基酸序列，该连续的氨基酸序列由SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的肽，其中，所述II类HLA表位具有激活人类癌症患者和/或健康对照体内的CD4+ Th细胞的能力。
3.根据权利要求2所述的肽，其中，所述II类HLA表位具有激活CD45RO阳性CD4+ Th细胞的能力。
4.根据权利要求1所述的肽，其中，所述I类HLA表位通过蛋白酶体切割进行了C-末端加工。
5.根据权利要求4所述的肽，其中，所述I类HLA表位具有激活人类癌症患者和/或健康对照体内的CD8+ CTL的能力。
6.根据权利要求5所述的肽，其中，所述I类HLA表位为HLA-A2表位。
7.根据权利要求1所述的肽，其中，该肽由源自人PRAME蛋白的连续的氨基酸序列组成，该连续的氨基酸序列为如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。
8.一种接种组合物，该组合物含有至少一种如权利要求1-7中的任意一项所述的肽。
9.根据权利要求8所述的组合物，该组合物还含有至少一种额外的肽，该额外的肽具有33-35个氨基酸的长度，其中，所述额外的肽包括源自人PRAME蛋白的氨基酸序列的至少一个II类HLA表位和至少一个I类HLA表位，并且其中，所述额外的肽包括源自人PRAME蛋白的连续的氨基酸序列，该连续的氨基酸序列选自由SEQ ID NOs：1-20所示的氨基酸序列所组成的组中。
10.根据权利要求8所述的组合物，其中，该组合物含有至少一种佐剂。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中，所述佐剂通过Toll样受体起作用。
12.根据权利要求1-7中的任意一项所述的肽或根据权利要求8-11中的任意一项所述的组合物，所述肽或组合物用作疫苗。
13.权利要求1-7中的任意一项所述的肽或权利要求8-11中的任意一项所述的组合物在制备用于治疗或预防表达PRAME的癌症的疫苗中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其中，所述癌症选自由以下癌症所组成的组中：黑素瘤、淋巴瘤、乳头状瘤、乳腺癌、宫颈癌、急性白血病、慢性白血病、成神经管细胞瘤、非小细胞肺癌、头颈癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、多发性骨髓瘤和肉瘤。
15.根据权利要求14所述的应用，其中，所述癌症选自慢性髓细胞性白血病和急性髓细胞性白血病。
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