CN114269357A - 新抗原组合物及其用途 - Google Patents

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CN114269357A CN202080057540.7A CN202080057540A CN114269357A CN 114269357 A CN114269357 A CN 114269357A CN 202080057540 A CN202080057540 A CN 202080057540A CN 114269357 A CN114269357 A CN 114269357A
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nucleic acid
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董正鑫
罗宾·杰西卡·艾泽特
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Abstract

本文公开内容涉及包含新表位的免疫治疗性多肽、包含免疫治疗性多肽的抗原呈递细胞和包含免疫治疗性多肽的药物组合物。本文还公开了免疫治疗性多肽在治疗疾病或病况中的用途。

Description

新抗原组合物及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年6月12日提交的美国临时申请号62/860,493的权益，其通过引用整体并入本文。本申请涉及于2020年5月7日提交的国际申请号PCT/US2020/031898，其通过引用整体并入本文。
背景技术
癌症免疫疗法利用免疫系统来治疗癌症。免疫疗法利用以下事实：癌细胞通常在其表面上具有可被免疫系统检测到的分子，称为肿瘤抗原，该分子通常是蛋白质或其他大分子(例如碳水化合物)。主动免疫疗法通过靶向肿瘤抗原来指导免疫系统攻击肿瘤细胞。被动免疫疗法增强现有的抗肿瘤应答，包括使用单克隆抗体、淋巴细胞和细胞因子。肿瘤疫苗一般由肿瘤抗原和免疫刺激分子(例如佐剂、细胞因子或Toll样受体(TLR)配体)组成，它们共同作用以诱导能识别并裂解肿瘤细胞的抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)。由恶性细胞内的遗传改变(例如，倒位、易位、缺失、错义突变、剪接位点突变等)引起的肿瘤新抗原代表最具肿瘤特异性的一类抗原，并且可以是患者特异性的或共有的。肿瘤新抗原是肿瘤细胞特有的，因为突变及其相应的蛋白质仅存在于肿瘤中。它们还避免了中枢耐受，因此更可能是免疫原性的。因此，肿瘤新抗原为免疫识别提供了极好的靶标，包括通过体液免疫和细胞免疫。
为了从疫苗接种中引发T细胞应答，抗原呈递细胞(APC)必须处理含有表位的肽，并在主要组织相容性复合体(MHC)I或MHC II上呈递表位。发展治愈性和肿瘤特异性免疫疗法的关键障碍之一是用于抗原呈递以产生足够免疫应答的最小表位的处理和释放不足。因此，需要开发另外的癌症治疗疫苗以确保有效和充分的表位处理和呈递。
援引并入
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度犹如具体地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。
发明内容
在一些方面，本文提供了一种多肽，其包含由抗原呈递细胞(APC)的I类MHC或II类MHC呈递的表位，所述多肽具有下述式(I)的结构：
Yn-Bt-Ar-Xm-As-Cu-Zp
式(I)，
或其药学上可接受的盐，
(i)其中Xm是所述表位，其中每个X独立地代表由受试者基因组的核酸序列编码的连续氨基酸序列的氨基酸，
并且其中(a)所述MHC是I类MHC并且m是8至12的整数，或
(b)所述MHC是II类MHC并且m是9-25的整数；
(ii)其中每个Y独立地为氨基酸、其类似物或衍生物，并且其中：
(A)当式(I)中Ar的变量r为0时，Yn不由紧靠所述受试者基因组中编码Br-Ar-Xm的核酸序列上游的核酸序列编码，
(B)当式(I)中Ar的变量r为1且式(I)中Bt的变量t为0时，Yn不由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的核酸序列编码，或者
(C)当式(I)中Ar的变量r为1且式(I)中Bt的变量t为1或更大时，Yn不由紧靠所述受试者基因组中编码Bt的核酸序列上游的核酸序列编码；并且
进一步地，其中n是0至1000的整数；
(iii)其中每个Z独立地为氨基酸、其类似物或衍生物，并且其中：
(A)当式(I)中As的变量s为0时，Zp不由紧靠所述受试者基因组中编码Xm-As-Cu的核酸序列下游的核酸序列编码，
(B)当式(I)中As的变量s为1且式(I)中Cu的变量u为0时，Zp不由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的核酸序列编码，或者
(C)当式(I)中As的变量s为1且式(I)中Cu的变量u为1或更大时，Zp不由紧靠所述受试者基因组中编码Cu的核酸序列下游的核酸序列编码；并且
进一步地，其中p是0至1000的整数；
并且进一步地其中，
当n为0时，p是1至1000的整数；并且
当p为0时，n是1至1000的整数；
(iv)其中Ar是接头，并且r是0或1；
(v)其中As是接头，并且s是0或1；
(vi)其中每个B独立地代表由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的所述受试者基因组中的核酸序列编码的氨基酸，
并且其中t是0至1000的整数；
(vii)其中每个C独立地代表由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的所述受试者基因组中的核酸序列编码的氨基酸，
并且其中u是0-1000的整数；
并且进一步地其中，
(a)所述多肽不是由通过I类MHC呈递的四个不同表位组成；
(b)所述多肽包含至少两个不同的多肽分子；
(c)所述表位包含至少一个突变氨基酸；并且/或者
(d)当所述多肽被所述APC处理时，Yn和/或Zp从所述表位裂解。
在一些实施方案中，所述表位通过II类MHC呈递。在一些实施方案中，m是9至25的整数。在一些实施方案中，t是1、2、3、4或5或更大，并且r是0。在一些实施方案中，u是1、2、3、4或5或更大，并且s是0。在一些实施方案中，t是1或更大，r是0，并且n是1-1000。在一些实施方案中，u是1或更大，s是0，并且p是1-1000。在一些实施方案中，t为0。在一些实施方案中，u为0。在一些实施方案中，t为至少1，Bt包含赖氨酸。在一些实施方案中，u为至少1，Cu包含赖氨酸。在一些实施方案中，当多肽被APC处理时，Bt从表位裂解。在一些实施方案中，当多肽被APC处理时，Cu从表位裂解。在一些实施方案中，n是1至5或7至1000的整数。在一些实施方案中，p是1至4或6至1000的整数。
在一些实施方案中，所述多肽不是由通过I类MHC呈递的四个不同表位组成。在一些实施方案中，所述多肽不包含由I类MHC呈递的四个不同表位。在一些实施方案中，所述多肽包含至少两个不同的多肽分子。在一些实施方案中，所述表位包含至少一个突变氨基酸。在一些实施方案中，所述至少一个突变氨基酸由所述受试者基因组中的核酸序列中的插入、缺失、移码、neoORF或点突变编码。在一些实施方案中，当所述多肽被APC处理时，Yn和/或Zp从表位裂解。在一些实施方案中，Xm中的m为至少8，且Xm为AA1AA2AA3AA4AA5AA6AA7AA8AA9AA10AA11AA12AA13AA14AA15AA16AA17AA18AA19AA20AA21AA22AA23AA24AA25，其中每个AA是氨基酸，并且其中AA9、AA10、AA11、AA12、AA13、AA14、AA15、AA16、AA17、AA18、AA19、AA20、AA21、AA22、AA23、AA24和AA25中的一个或多个任选地存在，并且其中至少一个AA是突变氨基酸。在一些实施方案中，r为1。在一些实施方案中，s为1。在一些实施方案中，r为1并且s为1。在一些实施方案中，r为0。在一些实施方案中，s为0。在一些实施方案中，r为0，并且s为0。
在一些实施方案中，Ar和/或As是非多肽接头。在一些实施方案中，Ar和/或As是化学接头。在一些实施方案中，Ar和/或As包含非天然氨基酸。在一些实施方案中，Ar和/或As不包含氨基酸。在一些实施方案中，Ar和/或As不包含天然氨基酸。在一些实施方案中，Ar和/或As包含除了肽键以外的键。在一些实施方案中，Ar和/或As包含二硫键。在一些实施方案中，Ar和As是不同的。在一些实施方案中，Ar和As是相同的。
在一些实施方案中，所述多肽包含亲水尾。在一些实施方案中，与不含Yn-Bt-Ar和/或As-Zp的相应肽相比，Yn-Br-Ar和/或As-Cu-Zp增强所述多肽的溶解性。在一些实施方案中，Xm的每个X都是天然氨基酸。
在一些实施方案中，当所述多肽被APC处理时，所述表位从Yn-Bt-Ar和/或As-Cu-Zp释放。在一些实施方案中，所述多肽在Ar和/或As处裂解。在一些实施方案中，当n是1至1000的整数时，与裂解包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽相比，所述多肽以更高的速率裂解，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的核酸序列编码；并且/或者当p是1至1000的整数时，与裂解包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽相比，所述多肽以更高的速率裂解，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的核酸序列编码。
在一些实施方案中，当n是1至1000的整数时，与裂解包含Bt-Xm的相同长度的相应多肽相比，所述多肽以更高的速率裂解，其中t为至少1且式(I)中变量Ar的r为0；并且/或者其中当p是1至1000的整数时，与裂解包含Xm-Cu的相同长度的相应多肽相比，所述多肽以更高的速率裂解，其中u为至少1且式(I)中变量As的s为0。
在一些实施方案中，当n是1至1000的整数时，与裂解包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽相比，所述多肽在Ar处以更高的速率裂解，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的核酸序列编码；并且/或者当p是1至1000的整数时，与裂解包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽相比，所述多肽在As处以更高的速率裂解，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的核酸序列编码。
在一些实施方案中，当n是1至1000的整数时，与包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽的表位呈递相比，所述APC的表位呈递增强，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的核酸序列编码；并且/或者当p是1至1000的整数时，与包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽的表位呈递相比，所述APC的表位呈递增强，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的核酸序列编码。
在一些实施方案中，当n是1至1000的整数时，与包含Bt-Xm的相同长度的相应多肽的表位呈递相比，所述APC的表位呈递增强，其中t为至少1且式(I)中变量Ar的r为0；并且/或者当p是1至1000的整数时，与包含Xm-Cu的相同长度的相应多肽的表位呈递相比，所述APC的表位呈递增强，其中u为至少1且式(I)中变量As的s为0。
在一些实施方案中，所述APC将所述表位呈递给免疫细胞。在一些实施方案中，所述APC将所述表位呈递给吞噬细胞。在一些实施方案中，所述APC将所述表位呈递给树突细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞。在一些实施方案中，所述APC优先或特异性地将所述表位呈递给免疫细胞、吞噬细胞、树突细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞。
在一些实施方案中，当n是1至1000的整数时，与包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽的免疫原性相比，免疫原性增强，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的核酸序列编码；并且/或者当p是1至1000的整数时，与包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽的免疫原性相比，免疫原性增强，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的核酸序列编码。
在一些实施方案中，当n是1到1000的整数时，与包含Bt-Xm的相同长度的相应多肽的免疫原性相比，免疫原性增强，其中t为至少1且式(I)中的变量Ar的r为0；并且/或者其中当p是1-1000的整数时，与包含Xm-Cu的相同长度的相应多肽的免疫原性相比，免疫原性增强，其中u为至少1且式(I)中的变量As的s为0。
在一些实施方案中，当n是1至1000的整数时，与包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽的抗肿瘤活性相比，抗肿瘤活性增强，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的核酸序列编码；并且/或者当p是1至1000的整数时，与包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽的抗肿瘤活性相比，抗肿瘤活性增强，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的核酸序列编码。
在一些实施方案中，当n是1至1000的整数时，与包含Bt-Xm的相同长度的相应多肽的抗肿瘤活性相比，抗肿瘤活性增强，其中t为至少1且式(I)中的变量Ar的r为0；并且/或者其中当p是1至1000的整数时，与包含Xm-Cu的相同长度的相应多肽的抗肿瘤活性相比，抗肿瘤活性增强，其中u为至少1且式(I)中的变量As的s为0。
在一些实施方案中，Yn和/或Zp包含选自聚赖氨酸(polyK)和聚精氨酸(polyR)的序列。在一些实施方案中，Yn和/或Zp包含选自polyK-AA-AA和polyR-AA-AA的序列，其中每个AA是氨基酸或其类似物或衍生物。在一些实施方案中，polyK包含聚-L-赖氨酸。在一些实施方案中，polyR包含聚-L-精氨酸。在一些实施方案中，polyK或polyR分别包含至少三个或四个连续的赖氨酸残基或至少三个或四个连续的精氨酸残基。在一些实施方案中，Ar和/或As选自二硫化物、对氨基苄氧羰基(PABC)和AA-AA-PABC，其中每个AA是氨基酸或其类似物或衍生物。在一些实施方案中，AA-AA-PABC选自Ala-Lys-PABC、Val-Cit-PABC和Phe-Lys-PABC。
在一些实施方案中，Ar和/或As是
Figure BDA0003504116290000071
在一些实施方案中，Ar和/或As是
Figure BDA0003504116290000072
Figure BDA0003504116290000081
其中，
R1和R2独立地为H或(C1-C6)烷基；j是1或2；G1为H或COOH；并且i是1、2、3、4或5。
在一些实施方案中，所述多肽是泛素化的。在一些实施方案中，所述多肽在裂解之前被泛素化。在一些实施方案中，所述多肽在赖氨酸残基上被泛素化。在一些实施方案中，所述多肽在受试者中被APC处理之前或被APC内化之前未裂解。在一些实施方案中，所述多肽在受试者中被APC处理之前或被APC内化之前在血液中未裂解。在一些实施方案中，所述多肽不被血液中的蛋白酶裂解。在一些实施方案中，所述多肽不被纤溶酶、血浆激肽释放酶、组织激肽释放酶、凝血酶或凝血因子裂解。在一些实施方案中，所述多肽在人血浆中是稳定的。在一些实施方案中，所述多肽在人血浆中具有1小时至5天的半衰期。在一些实施方案中，所述多肽在溶酶体、内溶酶体、内体或内质网(ER)中裂解。在一些实施方案中，所述多肽被氨肽酶裂解。在一些实施方案中，所述氨肽酶是胰岛素调节的氨肽酶(IRAP)或内质网氨肽酶(ERAP)。在一些实施方案中，所述多肽由蛋白酶体和/或免疫蛋白酶体的胰蛋白酶样结构域处理。在一些实施方案中，所述胰蛋白酶样结构域包含胰蛋白酶样活性、胰凝乳蛋白酶样活性或肽基谷氨酰肽水解酶(PGPH)活性。在一些实施方案中，所述多肽被蛋白酶裂解。在一些实施方案中，所述蛋白酶是胰蛋白酶样蛋白酶、胰凝乳蛋白酶样蛋白酶或肽基谷氨酰肽水解酶(PGPH)。在一些实施方案中，所述蛋白酶选自天冬酰胺肽裂合酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和苏氨酸蛋白酶。在一些实施方案中，所述蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶，选自钙蛋白酶、胱天蛋白酶、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶F、组织蛋白酶H、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L1、组织蛋白酶L2、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶W和组织蛋白酶Z。
在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，所述受试者是人。
在一些实施方案中，所述表位结合至MHC I类HLA。在一些实施方案中，所述表位以10分钟至24小时的稳定性结合至MHC I类HLA。在一些实施方案中，所述表位以0.1nM至2000nM的亲和力结合至MHC I类HLA。在一些实施方案中，所述表位结合至MHC II类HLA。在一些实施方案中，所述表位以10分钟至24小时的稳定性结合至MHC II类HLA。在一些实施方案中，所述表位以0.1nM至2000nM、1nM至1000nM、10nM至500nM或小于1000nM的亲和力结合至MHC II类HLA。在一些实施方案中，n是1至20或5至12的整数。在一些实施方案中，p是1至20或5至12的整数。在一些实施方案中，所述表位包含肿瘤特异性表位。
在一些实施方案中，所述多肽包含至少两个多肽，其中所述至少两个多肽中的两个或更多个具有相同的式Yn-Bt-Ar-Xm-As-Cu-Zp。在一些实施方案中，所述多肽包含至少两个多肽分子。在一些实施方案中，所述至少两个多肽或多肽分子中的两个或更多个的Xm是相同的。在一些实施方案中，所述至少两个多肽或多肽分子中的两个或更多个的Yn是相同的。在一些实施方案中，所述至少两个多肽或多肽分子中的两个或更多个的Zp是相同的。在一些实施方案中，所述至少两个多肽或多肽分子中的两个或更多个的Ar和/或As是不同的。在一些实施方案中，对于所述至少两个多肽或多肽分子的第一个，r＝0，并且对于所述至少两个多肽或多肽分子的第二个，r＝1。在一些实施方案中，对于所述至少两个多肽或多肽分子的第一个，s＝0，并且对于所述至少两个多肽或多肽分子的第二个，s＝1。在一些实施方案中，所述多肽包含至少3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个多肽或多肽分子。
在一些实施方案中，所述表位是RAS表位。在一些实施方案中，所述表位包含突变RAS肽序列，所述RAS肽序列包含突变RAS蛋白的至少8个连续的氨基酸，所述突变RAS蛋白包含在G12、G13或Q61处的突变和在G12、G13或Q61处的突变。在一些实施方案中，包含在G12、G13或Q61处的突变的突变RAS蛋白的至少8个连续氨基酸包含G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61H、Q61L、Q61K或Q61R突变。在一些实施方案中，G12、G13或Q61处的突变包含G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61H、Q61L、Q61K或Q61R突变。在一些实施方案中，Yn和/或Zp包含巨细胞病毒(CMV)的蛋白质如pp65的氨基酸序列、人免疫缺陷病毒(HIV)的蛋白质的氨基酸序列或MART-1的蛋白质的氨基酸序列。在一些实施方案中，n和/或p为1、2、3或大于3的整数。在一些实施方案中，Yn和/或Zp包含赖氨酸或聚赖氨酸。在一些实施方案中，Yn和/或Zp包含K、KK、KKK、KKKK或KKKKK。
在一些实施方案中，所述表位以小于10μM、小于1μM、小于500nM、小于400nM、小于300nM、小于250nM、小于200nM、小于150nM、小于100nM或小于50nM的亲和力结合至由HLA等位基因编码的蛋白质。在一些实施方案中，所述表位以大于24小时、大于12小时、大于9小时、大于6小时、大于5小时、大于4小时、大于3小时、大于2小时、大于1小时、大于45分钟、大于30分钟、大于15分钟或大于10分钟的稳定性结合至由HLA等位基因编码的蛋白质。在一些实施方案中，所述HLA等位基因选自HLA-A02:01等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-A11:01等位基因、HLA-A03:02等位基因、HLA-A30:01等位基因、HLA-A31:01等位基因、HLA-A33:01等位基因、HLA-A33:03等位基因、HLA-A68:01等位基因、HLA-A74:01等位基因和/或HLA-C08:02等位基因及其任何组合。
在一些实施方案中，所述表位包含GADGVGKSAL、GACGVGKSAL、GAVGVGKSAL、GADGVGKSA、GACGVGKSA、GAVGVGKSA、KLVVVGACGV、FLVVVGACGL、FMVVVGACGI、FLVVVGACGI、FMVVVGACGV、FLVVVGACGV、MLVVVGACGV、FMVVVGACGL、YLVVVGACGV、KMVVVGACGV、YMVVVGACGV、MMVVVGACGV、DTAGHEEY、TAGHEEYSAM、DILDTAGHE、DILDTAGH、ILDTAGHEE、ILDTAGHE、DILDTAGHEEY、DTAGHEEYS、LLDILDTAGH、DILDTAGRE、DILDTAGR、ILDTAGREE、ILDTAGRE、CLLDILDTAGR、TAGREEYSAM、REEYSAMRD、DTAGKEEYSAM、CLLDILDTAGK、DTAGKEEY、LLDILDTAGK、ILDTAGKE、ILDTAGKEE、DTAGLEEY、ILDTAGLE、DILDTAGL、ILDTAGLEE、GLEEYSAMRDQY、LLDILDTAGLE、LDILDTAGL、DILDTAGLE、DILDTAGLEEY(、AGVGKSAL、GAAGVGKSAL、AAGVGKSAL、CGVGKSAL、ACGVGKSAL、DGVGKSAL、ADGVGKSAL、DGVGKSALTI、GARGVGKSA、KLVVVGARGV、VVVGARGV、SGVGKSAL、VVVGASGVGK、GASGVGKSAL、VGVGKSAL、VVVGAGCVGK、KLVVVGAGC、GDVGKSAL、DVGKSALTI、VVVGAGDVGK、TAGKEEYSAM、DTAGHEEYSAM、TAGHEEYSA、DTAGREEYSAM、TAGKEEYSA、AAGVGKSA、AGCVGKSAL、AGDVGKSAL、AGKEEYSAMR、AGVGKSALTI、ARGVGKSAL、ASGVGKSA、ASGVGKSAL、AVGVGKSA、CVGKSALTI、DILDTAGK、DILDTAGREEY、DTAGHEEYSAMR、DTAGKEEYS、DTAGKEEYSAMR、DTAGLEEYS、DTAGLEEYSA、DTAGLEEYSAMR、DTAGREEYS、DTAGREEYSAMR、GAAGVGKSA、GACGVGKSA、GACGVGKSAL、GADGVGKS、GAGDVGKSA、GAGDVGKSAL、GASGVGKSA、GCVGKSAL、GCVGKSALTI、GHEEYSAM、GKEEYSAM、GLEEYSAMR、GREEYSAM、GREEYSAMR、HEEYSAMRD、KEEYSAMRD、KLVVVGASG、LDILDTAGR、LEEYSAMRD、LVVVGARGV、LVVVGASGV、REEYSAMRDQY、RGVGKSAL、TAGLEEYSA、TEYKLVVVGAA、VGAAGVGKSA、VGADGVGK、VGASGVGKSA、VGVGKSALTI、VVVGAAGV、VVVGAVGV、YKLVVVGAC、YKLVVVGAD、YKLVVVGAR或DILDTAGKE的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Yn包含IDIIMKIRNA、FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFIIFFIFFWMC、FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFAAFWFW、IFFIFFIIFFFFFFFFFFFFIIIIIIIWEC、FIFFFIIFFFFFIFFFFFIFIIIIIIFWEC、TEY、TEYKLV、WQAGILAR、HSYTTAE、PLTEEKIK、GALHFKPGSR、RRANKDATAE、KAFISHEEKR、TDLSSRFSKS、FDLGGGTFDV、CLLLHYSVSK、KKKKIIMKIRNA或MTEYKLVVV的氨基酸序列。在一些实施方案中，Zp包含KKNKKDDI、KKNKKDDIKD、AGNDDDDDDDDDDDDDDDDDKKDKDDDDDD、AGNKKKKKKKNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN、AGRDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD、SALTI、SALTIQL、GKSALTIQL、GKSALTI、QGQNLKYQ、ILGVLLLI、EKEGKISK、AASDFIFLVT、KELKQVASPF、KKKLINEKKE、KKCDISLQFF、KSTAGDTHLG、ATFYVAVTVP、LTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDG或TIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGE的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述表位不是RAS表位。在一些实施方案中，所述多肽不是KKKKKPKRDGYMFLKAESKIMFAT、KKKKYMFLKAESKIMFATLQRSS、KKKKKAESKIMFATLQRSSLWCL、KKKKKIMFATLQRSSLWCLCSNH或KKKKMFATLQRSSLWCLCSNH。
在一些实施方案中，所述表位是GATA3表位。在一些实施方案中，所述GATA3表位包含MLTGPPARV、SMLTGPPARV、VLPEPHLAL、KPKRDGYMF、KPKRDGYMFL、ESKIMFATL、KRDGYMFL、PAVPFDLHF、AESKIMFATL、FATLQRSSL、ARVPAVPFD、IMKPKRDGY、DGYMFLKA、MFLKAESKIMF、LTGPPARV、ARVPAVPF、SMLTGPPAR、RVPAVPFDL或LTGPPARVP的氨基酸序列。
在一些方面，本文提供了包含如本文所述的多肽的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是抗原呈递细胞。在一些实施方案中，所述细胞是树突细胞。在一些实施方案中，所述细胞是成熟抗原呈递细胞。
在一些方面，本文提供了裂解多肽的方法，包括使本文所述的多肽与抗原呈递细胞(APC)接触。在一些实施方案中，所述方法在体内进行。在一些实施方案中，所述方法离体进行。
在一些方面，本文提供了一种制备多肽的方法，包括将Yn-Ar和/或As-Zp连接到包含表位序列的序列，其中所述表位序列由抗原呈递细胞(APC)的I类MHC或II类MHC呈递；其中(i)每个Y独立地是氨基酸、其类似物或衍生物，并且其中Yn不是由紧靠所述受试者基因组中编码所述表位的核酸序列上游的核酸序列编码，并且n是0至1000的整数；(ii)每个Z独立地是氨基酸、其类似物或衍生物，并且其中Zp不是由紧靠所述受试者基因组中编码所述表位的核酸序列下游的核酸序列编码，并且p是0至1000的整数；和(iii)Ar是接头且As是接头，其中r和s中至少一个是1；并且进一步地，其中(a)所述多肽不是由通过I类MHC呈递的四个不同表位组成；(b)所述多肽包含至少两个不同的多肽分子；(c)所述表位包含至少一个突变氨基酸；并且/或者(d)当所述多肽被APC处理时，Yn和/或Zp从所述表位裂解。
在一些方面，本文提供了一种制备多肽的方法，包括将Yn连接到Bt-Xm和/或将Zp连接到Xm-Cu，其中Xm是由抗原呈递细胞(APC)的I类MHC或II类MHC呈递的表位序列；并且其中(i)每个B独立地代表由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的受试者基因组核酸序列编码的氨基酸，并且其中t是0至1000的整数；(ii)其中每个C独立地代表由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的受试者基因组核酸序列编码的氨基酸，并且其中u是0-1000的整数；(iii)每个Y独立地是氨基酸、其类似物或衍生物，并且其中Yn不是由紧靠所述受试者基因组中编码Bt-Xm的核酸序列上游的核酸序列编码，并且其中n是0-1000的整数；和(iv)每个Z独立地是氨基酸、其类似物或衍生物，并且其中Zp不是由紧靠所述受试者基因组中编码Xm-Cu的核酸序列下游的核酸序列编码，并且其中p是0-1000的整数；并且进一步地，其中(a)所述多肽不是由通过I类MHC呈递的四个不同表位组成；(b)所述多肽包含至少两个不同的多肽分子；(c)所述表位包含至少一个突变氨基酸；并且/或者(d)当所述多肽被APC处理时，Yn-Bt和/或Cu-Zp从所述表位裂解。
在一些实施方案中，当n为0时，p是1至1000的整数，并且当p为0时，n是1至1000的整数。在一些实施方案中，每个X独立地代表肽序列的氨基酸，所述肽序列包含任何由受试者基因组中的核酸序列编码的连续氨基酸序列，并且(a)MHC是I类MHC，并且m是8至12的整数，或(b)MHC是II类MHC，并且m是9至25的整数。
在一些方面，本文提供了包含本文所述的多肽和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物还包含免疫调节剂或佐剂。在一些实施方案中，所述免疫调节剂或佐剂选自聚-ICLC、1018ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、ARNAX、STING激动剂、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFactIMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、Juvlmmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂A、Montanide IMS1312、Montanide ISA 206、MonISA IDE 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、
Figure BDA0003504116290000141
载体系统、PLGA微粒、瑞喹莫德、SRL172、病毒体和其他病毒样颗粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam2Cys、Pam3Cys、Pam3CSK4和Aquila的QS21刺激子。在一些实施方案中，所述免疫调节剂或佐剂包含聚-ICLC。在一些实施方案中，所述药物组合物是疫苗组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物是水性的或是液体。
在一些实施方案中，所述表位以1ng至10mg或5μg至1.5mg的量存在于所述药物组合物中。在一些实施方案中，所述药物组合物还包含DMSO。在一些实施方案中，所述药学上可接受的赋形剂包含水。在一些实施方案中，所述药物组合物包含以小于1mM或大于1mM的浓度存在的pH调节剂。在一些实施方案中，所述pH调节剂是二羧酸盐或三羧酸盐。在一些实施方案中，所述pH调节剂是琥珀酸的二羧酸盐或二琥珀酸盐。在一些实施方案中，所述pH调节剂是柠檬酸的三羧酸盐或三柠檬酸盐。在一些实施方案中，所述pH调节剂是琥珀酸二钠。在一些实施方案中，所述琥珀酸的二羧酸盐或所述二琥珀酸盐以0.1mM-1mM的浓度存在于所述药物组合物中。在一些实施方案中，所述琥珀酸的二羧酸盐或所述二琥珀酸盐以1mM-5mM的浓度存在于所述药物组合物中。在一些实施方案中，当给受试者施用时，针对所述表位的免疫应答增强。
在一些方面，本文提供了一种治疗疾病或病况的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，所述疾病或病况是癌症。在一些实施方案中，所述癌症选自肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、子宫癌和肝癌。在一些实施方案中，施用包括皮内注射、鼻内喷雾应用、肌内注射、腹膜内注射、静脉内注射、口服施用或皮下注射。
在一些方面，本文提供了受试者预防的方法，包括使所述受试者的细胞与本文所述的多肽、细胞或药物组合物接触。
在一些方面，本文提供了一种方法，包括识别由受试者的肿瘤细胞表达的表位，以及产生包含所述表位的多肽，其中所述多肽具有式(I)的结构，
Yn-Bt-Ar-Xm-As-Cu-Zp
式(I)，
或其药学上可接受的盐，
(i)其中Xm是所述表位，其中每个X独立地代表由受试者基因组的核酸序列编码的连续氨基酸序列的氨基酸，
并且其中(a)所述MHC是I类MHC并且m是8至12的整数，或
(b)所述MHC是II类MHC并且m是9-25的整数；
(ii)其中每个Y独立地为氨基酸、其类似物或衍生物，并且其中：
(A)当式(I)中Ar的变量r为0时，Yn不由紧靠所述受试者基因组中编码Br-Ar-Xm的核酸序列上游的核酸序列编码，
(B)当式(I)中Ar的变量r为1且式(I)中Bt的变量t为0时，Yn不由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的核酸序列编码，或者
(C)当式(I)中Ar的变量r为1且式(I)中Bt的变量t为1或更大时，Yn不由紧靠所述受试者基因组中编码Bt的核酸序列上游的核酸序列编码；并且
进一步地，其中n是0至1000的整数；
(iii)其中每个Z独立地为氨基酸、其类似物或衍生物，并且其中：
(A)当式(I)中As的变量s为0时，Zp不由紧靠所述受试者基因组中编码Xm-As-Cu的核酸序列下游的核酸序列编码，
(B)当式(I)中As的变量s为1且式(I)中Cu的变量u为0时，Zp不由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的核酸序列编码，或者
(C)当式(I)中As的变量s为1且式(I)中Cu的变量u为1或更大时，Zp不由紧靠所述受试者基因组中编码Cu的核酸序列下游的核酸序列编码；并且
进一步地，其中p是0至1000的整数；
并且进一步地其中，
当n为0时，p是1至1000的整数；并且
当p为0时，n是1至1000的整数；
(iv)其中Ar是接头，并且r是0或1；
(v)其中As是接头，并且s是0或1；
(vi)其中每个B独立地代表由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的所述受试者基因组中的核酸序列编码的氨基酸，
并且其中t是0至1000的整数；
(vii)其中每个C独立地代表由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的所述受试者基因组中的核酸序列编码的氨基酸，
并且其中u是0-1000的整数；
并且进一步地其中，
(a)所述多肽不是由通过I类MHC呈递的四个不同表位组成；
(b)所述多肽包含至少两个不同的多肽分子；
(c)所述表位包含至少一个突变氨基酸；并且/或者
(d)当所述多肽被所述APC处理时，Yn和/或Zp从所述表位裂解。
在一些实施方案中，识别包括从自所述受试者的肿瘤细胞测序得到的核酸序列池中选择多个核酸序列，所述多个核酸序列编码多个候选肽序列，所述多个候选肽序列包含不存在于自所述受试者的非肿瘤细胞测序得到的核酸序列池中的一个或多个不同突变，其中自所述受试者的肿瘤细胞测序得到的核酸序列池和自所述受试者的非肿瘤细胞测序得到的核酸序列池通过全基因组测序或全外显子组测序来测序。在一些实施方案中，识别还包括通过HLA肽结合分析来预测或测量所述多个候选肽序列中的哪些候选肽序列与由同一受试者的HLA等位基因编码的蛋白质形成复合物。在一些实施方案中，识别还包括基于所述HLA肽结合分析从所述候选肽序列中选择多个选定的肿瘤特异性肽或编码所述多个选定的肿瘤特异性肽的一个或多个多核苷酸。
在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用所述多肽。在一些实施方案中，施用包括皮内注射、鼻内喷雾应用、肌内注射、腹膜内注射、静脉内注射、口服施用或皮下注射。在一些实施方案中，在所述受试者中引起免疫应答。在一些实施方案中，由所述受试者的肿瘤细胞表达的表位是新抗原、肿瘤相关抗原、突变的肿瘤相关抗原，并且/或者其中与所述受试者的正常细胞中所述表位的表达相比，所述受试者的肿瘤细胞中所述表位的表达更高。
本文提供了一种多肽，其包含由抗原呈递细胞(APC)的I类MHC或II类MHC呈递的表位，所述多肽具有下述式(I)的结构：
Yn-Bt-Ar-Xm-As-Cu-Zp
式(I)，
或其药学上可接受的盐，其中Xm是所述表位，其中每个X独立地代表由受试者基因组的核酸序列编码的连续氨基酸序列的氨基酸，并且其中所述MHC是I类MHC并且m是8至12的整数，或所述MHC是II类MHC并且m是9-25的整数；其中每个Y独立地为氨基酸、其类似物或衍生物，并且其中：当式(I)中Ar的变量r为0时，Yn不由紧靠所述受试者基因组中编码Br-Ar-Xm的核酸序列上游的核酸序列编码，当式(I)中Ar的变量r为1且式(I)中Bt的变量t为0时，Yn不由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的核酸序列编码，或者当式(I)中Ar的变量r为1且式(I)中Bt的变量t为1或更大时，Yn不由紧靠所述受试者基因组中编码Bt的核酸序列上游的核酸序列编码；并且进一步地，其中n是0至1000的整数；其中每个Z独立地为氨基酸、其类似物或衍生物，并且其中：当式(I)中As的变量s为0时，Zp不由紧靠所述受试者基因组中编码Xm-As-Cu的核酸序列下游的核酸序列编码，当式(I)中As的变量s为1且式(I)中Cu的变量u为0时，Zp不由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的核酸序列编码，或者当式(I)中As的变量s为1且式(I)中Cu的变量u为1或更大时，Zp不由紧靠所述受试者基因组中编码Cu的核酸序列下游的核酸序列编码；并且进一步地，其中p是0至1000的整数；并且进一步地其中，当n为0时，p是1至1000的整数；并且当p为0时，n是1至1000的整数；其中Ar是接头，并且r是0或1；其中As是接头，并且s是0或1；其中每个B独立地代表由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的所述受试者基因组中的核酸序列编码的氨基酸，并且其中t是0至1000的整数；其中每个C独立地代表由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的所述受试者基因组中的核酸序列编码的氨基酸，并且其中u是0-1000的整数；并且进一步地其中，所述多肽不是由通过I类MHC呈递的四个不同表位组成；所述多肽包含至少两个不同的多肽分子；所述表位包含至少一个突变氨基酸；并且/或者当所述多肽被所述APC处理时，Yn和/或Zp从所述表位裂解。
在一些实施方案中，所述表位通过II类MHC呈递，并且m是9至25的整数。
在一些实施方案中，与不含Yn-Bt-Ar和/或As-Cu-Zp的相应肽相比，Yn-Br-Ar和/或As-Cu-Zp增强所述多肽的溶解性。在一些实施方案中，当所述多肽被所述APC处理时，所述表位从Yn-Bt-Ar和/或As-Cu-Zp释放。在一些实施方案中，当n是1至1000的整数时，与裂解包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽相比，所述多肽以更高的速率裂解，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的核酸序列编码；并且/或者当p是1至1000的整数时，与裂解包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽相比，所述多肽以更高的速率裂解，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的核酸序列编码。在一些实施方案中，当n是1至1000的整数时，与包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽的表位呈递相比，所述APC的表位呈递增强，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的核酸序列编码；并且/或者当p是1至1000的整数时，与包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽的表位呈递相比，所述APC的表位呈递增强，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的核酸序列编码。在一些实施方案中，所述APC将所述表位呈递给免疫细胞。
在一些实施方案中，当n是1至1000的整数时，与包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽的免疫原性相比，免疫原性增强，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的核酸序列编码；并且/或者当p是1至1000的整数时，与包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽的免疫原性相比，免疫原性增强，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的核酸序列编码。
在一些实施方案中，当n是1至1000的整数时，与包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽的抗肿瘤活性相比，抗肿瘤活性增强，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的核酸序列编码；并且/或者当p是1至1000的整数时，与包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽的抗肿瘤活性相比，抗肿瘤活性增强，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的核酸序列编码。
在一些实施方案中，Yn和/或Zp包含选自赖氨酸(Lys)、聚赖氨酸(polyK)和聚精氨酸(polyR)的序列。在一些实施方案中，所述polyK包含聚-L-赖氨酸。在一些实施方案中，所述polyR包含聚-L-精氨酸。在一些实施方案中，所述polyK或polyR分别包含至少两个、三个或四个连续的赖氨酸残基或至少两个、三个或四个连续的精氨酸残基。
在一些实施方案中，所述表位结合至MHC II类HLA。在一些实施方案中，所述表位以10分钟至24小时的稳定性结合至MHC II类HLA。在一些实施方案中，所述表位以0.1nM至2000nM、1nM至1000nM、10nM至500nM或小于1000nM的亲和力结合至MHC II类HLA。
在一些实施方案中，所述多肽在受试者中被APC处理之前或被APC内化之前未裂解。在一些实施方案中，所述多肽在人血浆中是稳定的。在一些实施方案中，所述多肽在人血浆中具有1小时至5天的半衰期。在一些实施方案中，所述受试者是人。
在一些实施方案中，所述表位以小于10μM、小于1μM、小于500nM、小于400nM、小于300nM、小于250nM、小于200nM、小于150nM、小于100nM或小于50nM的亲和力结合至由HLA等位基因编码的蛋白质。在一些实施方案中，所述表位以大于24小时、大于12小时、大于9小时、大于6小时、大于5小时、大于4小时、大于3小时、大于2小时、大于1小时、大于45分钟、大于30分钟、大于15分钟或大于10分钟的稳定性结合至由HLA等位基因编码的蛋白质。在一些实施方案中，所述HLA等位基因选自HLA-A02:01等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-A11:01等位基因、HLA-A03:02等位基因、HLA-A30:01等位基因、HLA-A31:01等位基因、HLA-A33:01等位基因、HLA-A33:03等位基因、HLA-A68:01等位基因、HLA-A74:01等位基因和/或HLA-C08:02等位基因及其任何组合。在一些实施方案中，所述表位包含肿瘤特异性表位。在一些实施方案中，所述表位包含至少一个突变氨基酸。在一些实施方案中，所述至少一个突变氨基酸由所述受试者基因组中的核酸序列中的插入、缺失、移码、neoORF或点突变编码。
在一些实施方案中，所述表位是RAS表位。在一些实施方案中，所述表位包含突变RAS肽序列，所述RAS肽序列包含突变RAS蛋白的至少8个连续的氨基酸，所述突变RAS蛋白包含在G12、G13或Q61处的突变和在G12、G13或Q61处的突变。在一些实施方案中，包含在G12、G13或Q61处的突变的突变RAS蛋白的至少8个连续氨基酸包含G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61H、Q61L、Q61K或Q61R突变。在一些实施方案中，G12、G13或Q61处的突变包含G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61H、Q61L、Q61K或Q61R突变。在一些实施方案中，所述RAS表位包含VVVGAAGVGK、VVVGAAGVG、VVVGAAGV、VVGAAGVGK、VVGAAGVG、VGAAGVGK、VVVGACGVGK、VVVGACGVG、VVVGACGV、VVGACGVGK、VVGACGVG、VGACGVGK、VVVGADGVGK、VVVGADGVG、VVVGADGV、VVGADGVGK、VVGADGVG、VGADGVGK、VVVGARGVGK、VVVGARGVG、VVVGARGV、VVGARGVGK、VVGARGVG、VGARGVGK、VVVGASGVGK、VVVGASGVG、VVVGASGV、VVGASGVGK、VVGASGVG、VGASGVGK、VVVGAVGVGK、VVVGAVGVG、VVVGAVGV、VVGAVGVGK、VVGAVGVG或VGAVGVGK的氨基酸序列。在一些实施方案中，Yn包含K、KK、KKK、KKKK、KKKKK、KKKKKKK、KKKKKKKK、KTEY、KTEYK、KTEYKL、KTEYKLV、KTEYKLVV、KTEYKLVVV、KKTEY、KKTEYK、KKTEYKL、KKTEYKLV、KKTEYKLVV、KKTEYKLVVV、KKKTEY、KKKTEYK、KKKTEYKL、KKKTEYKLV、KKKTEYKLVV、KKKTEYKLVVV、KKKKTEY、KKKKTEYK、KKKKTEYKL、KKKKTEYKLV、KKKKTEYKLVV、KKKKTEYKLVVV、IDIIMKIRNA、FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFIIFFIFFWMC、FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFAAFWFW、IFFIFFIIFFFFFFFFFFFFIIIIIIIWEC、FIFFFIIFFFFFIFFFFFIFIIIIIIFWEC、TEY、TEYK、TEYKL、TEYKLV、TEYKLVV、TEYKLVVV、WQAGILAR、HSYTTAE、PLTEEKIK、GALHFKPGSR、RRANKDATAE、KAFISHEEKR、TDLSSRFSKS、FDLGGGTFDV、CLLLHYSVSK、KKKKIIMKIRNA或MTEYKLVVV的氨基酸序列。在一些实施方案中，Zp包含K、KK、KKK、KKKK、KKKKK、KKKKKKK、KKKKKKKK、KKNKKDDI、KKNKKDDIKD、AGNDDDDDDDDDDDDDDDDDKKDKDDDDDD、AGNKKKKKKKNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN、AGRDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD、SALTI、SALTIQL、GKSALTIQL、GKSALTI、SALTIK、SALTIQLK、GKSALTIQLK、GKSALTIK、SALTIKK、SALTIQLKK、GKSALTIQLKK、GKSALTIKK、SALTIKKK、SALTIQLKKK、GKSALTIQLKKK、GKSALTIKKK、SALTIKKKK、SALTIQLKKKK、GKSALTIQLKKKK、GKSALTI、KKKK、QGQNLKYQ、ILGVLLLI、EKEGKISK、AASDFIFLVT、KELKQVASPF、KKKLINEKKE、KKCDISLQFF、KSTAGDTHLG、ATFYVAVTVP、LTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDG或TIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGE的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含KTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL、KTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL、KTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL、KTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL、KKKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL、KKKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL、KKKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL、KKKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL、KKKKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL、KKKKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL、KKKKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL、KKKKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKK、KKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKK、KKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKK、KKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLK、TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLK、TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLK、TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLK、TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKKK、TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKKK、TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKKK、TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKKK、TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKKKK、TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKKKK、TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKKKK或TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKKKK的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述表位不是RAS表位。在一些实施方案中，所述多肽不是KKKKKPKRDGYMFLKAESKIMFAT、KKKKYMFLKAESKIMFATLQRSS、KKKKKAESKIMFATLQRSSLWCL、KKKKKIMFATLQRSSLWCLCSNH或KKKKMFATLQRSSLWCLCSNH。
在一些实施方案中，Yn和/或Zp包含与所述表位所来源的蛋白质不同的蛋白质的氨基酸序列。在一些实施方案中，Yn和/或Zp包含CMV的蛋白质如pp65的氨基酸序列、HIV的蛋白质的氨基酸序列或MART-1的蛋白质的氨基酸序列。在一些实施方案中，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或大于20的整数。在一些实施方案中，p是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或大于20的整数。
在一些实施方案中，所述表位是TMPRSS2:ERG表位。在一些实施方案中，所述TMPRSS2:ERG表位包含ALNSEALSV的氨基酸序列。
本文还提供了一种包含编码本文所述的多肽的序列的多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸是mRNA。
本文还提供了一种药物组合物，包含本文所述的多肽或本文所述的多核苷酸；和药学上可接受的赋形剂。
本文还提供了一种治疗疾病或病况的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，所述疾病或病况是选自肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、子宫癌、前列腺癌、肝癌、胆道恶性肿瘤、子宫内膜癌、宫颈癌、膀胱癌、肝癌、骨髓性白血病和乳腺癌的癌症。在一些实施方案中，施用包括皮内注射、鼻内喷雾应用、肌内注射、腹膜内注射、静脉内注射、口服施用或皮下注射。
本文还提供了一种制备抗原特异性T细胞的方法，包括用包含本文所述的多肽或编码本文所述多肽的多核苷酸的抗原呈递细胞刺激T细胞。在一些实施方案中，所述方法离体进行。
附图说明
在所附权利要求书中具体阐述了本公开的特征。通过参考以下对利用本公开的原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会对本公开的特征和优点获得更好的理解，在这些附图中：
图1示出了抗原呈递细胞(APC)对HLA等位基因X上的表位X的简化的示例性表位处理和呈递。在天然背景下，肽包含天然位于表位序列侧翼的氨基酸或氨基酸序列。在合理的情况下，肽在表位序列的N-和/或C-端包含不是由编码表位序列的基因组编码的氨基酸或氨基酸序列，和/或接头。
图2示出了含有组织蛋白酶B可裂解接头的多肽的示例性组织蛋白酶B裂解。
图3示出了使用T细胞受体(TCR)转导的细胞体外筛选多肽的表位处理和呈递的实验设计图(结果见图4和5)。
图4示出了说明在与等量的外周血单核细胞(PBMC)共培养48小时后的KRAS特异性Jurkat细胞分泌的IL-2水平(pg/mL)的图，该PBMC负载了仅含有KRAS-G12V表位的肽，或者负载了含有KRAS-G12V表位以及在N-端和C-端的天然位于KRAS-G12V表位侧翼的额外氨基酸序列的肽。
图5示出了说明在与等量的外周血单核细胞(PBMC)共培养48小时后的KRAS特异性Jurkat细胞分泌的IL-2水平(pg/mL)的图，该PBMC负载了仅含有KRAS-G12V表位的肽、含有KRAS-G12V表位以及在N-端和C-端的天然位于KRAS-G12V表位侧翼的额外氨基酸序列的肽、或者含有KRAS-G12V表位和在N-端和C-端的合理设计的天然不位于KRAS-G12V侧翼的额外氨基酸序列(合理情况)的肽。
图6示出了免疫原性研究的实验设计图。小鼠在第0、7和14天用各种多肽设计进行免疫接种，并在第7、14和21天采血样以评估抗原特异性CD8+T细胞应答(结果见图7-9)。
图7示出了说明总体免疫应答的图(7A：H-2Kb，7B：H-2Db，7C：总体)。
图8示出了说明用K4-表位免疫接种能增强对H-2Kb-呈递表位的免疫应答的图(8A：Alg8，8B：Lama4)。
图9示出了说明用K4-表位免疫接种能增加对H-2Db-呈递表位的免疫应答的图(9A：Reps1，9B：Adpgk，9C：Irgq，9D：Obsl1)。
图10示出了说明在与293T细胞共培养24小时后Jurkat细胞分泌的IL-2水平(pg/mL)的图(Jurkat细胞与293T细胞的比例为5:1)，该293T细胞负载了仅含有TMPRSS2::ERG表位的肽或用以下质粒转导：编码在天然情况下的含有TMPRSS2::ERG表位的肽(即，肽另外包含在N-和/或C-端的天然位于表位序列侧翼的氨基酸或氨基酸序列)的质粒、编码在非天然情况下的含有TMPRSS2::ERG表位的肽(即，肽另外包含不天然位于表位序列侧翼的氨基酸或氨基酸序列)的质粒、或者编码在非天然情况下的不相关表位的质粒(作为对照)。
图11示出了经FLT3L处理的PBMC中IL-2浓度(pg/mL)与肽浓度(nM)的图，该PBMC在与用TCR转导的Jurkat细胞共培养后与增加量的指定的RAS-G12V突变肽接触，该TCR结合到与由HLA-A11:01等位基因编码的MHC结合的加下划线的RAS-G12V表位。
图12示出了说明在体外使用来自健康供体的PBMC(上图)和在体内使用经肽免疫接种的HLA-A11:01转基因小鼠(下图)的情况下，来自图11的指定RAS-G12V突变肽的免疫原性的数据。
图13A示出了使用用于在细胞中表达的短聚体(9-10个氨基酸，上图)和长聚体(25个氨基酸，下图)的mRNA构建体的示例性示意图。
图13B示出了作为占总CD8+细胞百分比的多聚体特异性CD8+细胞的示例性图。显示了用于多聚体测定的抗原。
图13C示出了检测多聚体阳性CD8+T细胞的示例性流式细胞术分析，比较了经短聚体(9-10个氨基酸)和长聚体(25个氨基酸)肽刺激的APC和含有编码相同短聚体(9-10个氨基酸)和长聚体(25个氨基酸)肽的RNA的APC。
具体实施方式
基于发现用于增强表位处理和呈递以刺激免疫应答的方法，本文描述了新的免疫治疗组合物及其用途，该免疫治疗组合物包含个体的肿瘤特异性抗原或新表位。因此，本文所述的本公开提供了可用于例如刺激针对肿瘤相关抗原或新表位的免疫应答的肽，以产生用于治疗癌症、疾病或病况的免疫原性组合物或癌症疫苗。
以下描述和示例详细阐明了本公开的实施方案。应当理解，本公开不限于本文所述的特定实施方案，因此可以变化。本领域技术人员将会认识到，本公开存在许多变化和修改，这些均涵盖在本公开内容的范围内。
所有术语均应按照它们将被本领域技术人员所理解的那样来理解。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
本文所用的章节标题仅用于组织编排的目的，而不应解释为限制所描述的主题。
尽管本公开的各个特征可以在单个实施方案的语境中描述，但是这些特征也可以单独提供或以任何合适的组合提供。相反，尽管为了清楚起见，本文可以在单独的实施方案的语境中描述本公开，但是本公开也可以在单个实施方案中实现。
以下定义补充了本领域中的定义，并且针对本申请，而不应归于任何相关或不相关的情况，例如任何共同拥有的专利或申请。本文描述了优选的材料和方法，但是与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料可以在测试本公开内容的实践中使用。因此，本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而并非旨在限制。
1.定义
本文使用的术语仅用于描述特定情况的目的，而非旨在限制。在本申请中，除非另有特别说明，否则单数形式的使用包括复数形式。除非上下文另有明确规定，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”也意欲包括复数形式。
在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。如本文所用的术语“和/或”和“其任意组合”及其语法等同语可互换使用。这些术语可表达，具体涉及任何组合。仅为了说明目的，下列短语“A、B和/或C”或“A、B、C或其任意组合”可指“单独A；单独B；单独C；A和B；B和C；A和C；以及A、B和C”。术语“或”可以合取性使用或析取性使用，除非上下文具体指出为析取性使用。
术语“约”或“大约”可意指在本领域普通技术人员测定的特定值的可接受误差范围内，该可接受误差范围将部分取决于该值如何测量或测定，即，测量系统的局限性。例如，根据本领域中的实践，“约”可指在1个或大于1个标准偏差内。或者，“约”可指给定值的最多20％、最多10％、最多5％或最多1％的范围。或者，特别是对于生物系统或过程，该术语可指在数值的数量级内，在5倍以内，更优选在2倍以内。在本申请和权利要求书中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则应推定术语“约”意指在该特定值的可接受误差范围内。
如在本说明书和权利要求书中所用的，词语“包含”(和任何形式的包含)、“具有”(和任何形式的具有)、“包括”(和任何形式的包括)或“含有”(和任何形式的含有)是包含性的或开放式的，并不排除其他未列举的要素或方法步骤。可以想到，本说明书中讨论的任何实施方案可以采用本公开的任何方法或组合物来实施，反之亦然。此外，本公开的组合物可以用来实现本公开的方法。
本说明书中提及“一些实施方案”、“实施方案”、“一个实施方案”或“其他实施方案”意指与该实施方案相关描述的特定特征、结构或特性包含在本公开的至少一些实施方案中，但不一定包含在所有实施方案中。为了便于理解本公开，下面定义了许多术语和短语。
用于描述肽或蛋白质的命名法遵循常规实践，其中氨基基团呈现于每个氨基酸残基的左侧(氨基端或N端)且羧基基团呈现于右侧(羧基端或C端)。当在肽表位中提及氨基酸残基位置时，在氨基至羧基方向上对氨基酸残基进行编号，其中1位是位于表位或该表位可能是其一部分的肽或蛋白质的氨基端的残基。在代表本公开所选择的具体实施方案的通式中，除非另有说明，否则氨基端和羧基端基团(尽管没有具体显示)是它们在生理pH值下呈现的形式。在氨基酸结构式中，每个残基通常用标准的三字母或单字母命名表示。氨基酸残基的L-形式由大写单字母或首字母大写的三字母符号表示，而具有D-形式的那些氨基酸残基的D-形式由小写单字母或小写三字母符号表示。然而，当使用没有大写字母的三字母符号或全名时，它们也可以指L氨基酸残基。甘氨酸没有不对称碳原子，并简称为“Gly”或“G”。本文所述的肽的氨基酸序列通常使用标准单字母符号表示。(A，丙氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，组氨酸；I，异亮氨酸；K，赖氨酸；L，亮氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，缬氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸)。
术语“残基”是指通过酰胺键或酰胺键模拟物并入肽或蛋白质中的氨基酸残基或氨基酸模拟残基，或编码该氨基酸或氨基酸模拟物的核酸(DNA或RNA)。
如本文所用的“多肽”、“肽”及其语法等同语是指氨基酸残基的聚合物。“成熟蛋白质”是全长的并且任选地包含在给定细胞环境中对蛋白质而言典型的糖基化或其他修饰的蛋白质。本文公开的多肽和蛋白质(包括其功能部分和功能变体)可包含合成氨基酸来代替一种或多种天然存在的氨基酸。这类合成氨基酸是本领域已知的，并且包括，例如，氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰基氨基甲基-半胱氨酸、反式-3-和反式-4-羟基脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、吲哚啉-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N’-苄基-N’-甲基-赖氨酸、N’,N’-二苄基-赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。本公开进一步预期，本文所述多肽在工程化细胞中的表达可与多肽构建体的一种或多种氨基酸的翻译后修饰相关。翻译后修饰的非限制性实例包括磷酸化、酰化(包括乙酰化和甲酰化)、糖基化(包括N-连接的和O-连接的)、酰胺化、羟基化、烷基化(包括甲基化和乙基化)、泛素化、加入吡咯烷酮羧酸、形成二硫键、硫酸化、豆蔻酰化、棕榈酰化、异戊二烯化、法尼基化、牻牛儿基化(geranylation)、糖基磷脂酰肌醇化(glypiation)、脂化(lipoylation)和碘化。
术语“肽”是指一系列通常通过相邻氨基酸残基的α-氨基与羧基之间的肽键彼此连接的氨基酸残基。
“合成肽”是指从非天然来源中获得的肽，例如是人造的。可以使用诸如化学合成或重组DNA技术等方法产生这类肽。“合成肽”包括“融合蛋白”。
“表位”是分子的特征集合，诸如一起形成被例如免疫球蛋白、T细胞受体、HLA分子或嵌合抗原受体识别的位点的一级、二级和三级肽结构和电荷。或者，表位可以被定义为参与被特定免疫球蛋白识别的一组氨基酸残基，或者在T细胞的情况下，对于被T细胞受体蛋白、嵌合抗原受体和/或主要组织相容性复合物(MHC)受体识别所必需的那些残基。“T细胞表位”应被理解为意指肽序列，其可以以呈递肽的MHC分子或MHC复合物的形式被MHC I类或II类分子结合，然后以这种形式被T细胞如T淋巴细胞或T辅助细胞识别并结合。表位可以通过从天然来源分离来制备，或者它们可以根据本领域的标准方案进行合成。合成表位可以包含人工氨基酸残基“氨基酸模拟物”，如天然存在的L氨基酸残基的D异构体或诸如环己基丙氨酸的非天然存在的氨基酸残基。在整个公开内容中，表位在一些情况下可以被称为肽或肽表位。应当理解，包含本文所述的表位或类似物以及另外的氨基酸的蛋白质或肽仍在本公开的范围内。在某些实施方案中，该肽包含抗原的片段。在某些实施方案中，对本公开的肽的长度具有限制。当包含本文所述表位的蛋白质或肽包含与天然序列具有100％同一性的区域(即，连续的一系列氨基酸残基)时，发生长度受限的实施方案。为了避免表位的定义例如在整个天然分子上读取，对与天然肽序列具有100％同一性的任何区域的长度具有限制。因此，对于包含本文所述表位及与天然肽序列具有100％同一性的区域的肽，与天然序列具有100％同一性的区域通常具有以下长度：少于或等于600个氨基酸残基、少于或等于500个氨基酸残基、少于或等于400个氨基酸残基、少于或等于250个氨基酸残基、少于或等于100个氨基酸残基、少于或等于85个氨基酸残基、少于或等于75个氨基酸残基、少于或等于65个氨基酸残基以及少于或等于50个氨基酸残基。在某些实施方案中，本文所述的“表位”被包含在具有以低至5个氨基酸残基的任一增量少于51个氨基酸残基的区域的肽中，该区域与天然肽序列具有100％的同一性；具有例如50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基。
术语“衍生的”及其语法等同语当用于论述表位时是“制备的”及其语法等同语的同义词。衍生的表位可以从天然来源分离，或者可以根据本领域的标准方案合成。合成表位可包含人工氨基酸残基“氨基酸模拟物”，例如天然存在的L氨基酸残基的D异构体或非天然氨基酸残基如环己基丙氨酸。衍生或制备的表位可以是天然表位的类似物。
“免疫原性”肽或“免疫原性”表位或“肽表位”是包含等位基因特异性基序的肽，这使得该肽将结合HLA分子并且诱导细胞介导的应答或体液应答，例如，细胞毒性T淋巴细胞(CTL(例如CD8+))、辅助性T淋巴细胞(Th(例如CD4+))和/或B淋巴细胞应答。因此，本文所述的免疫原性肽能够与适当的HLA分子结合，之后诱导针对肽的CTL(细胞毒性)应答或HTL(和体液)应答。
“新抗原”是指由蛋白质的肿瘤特异性改变产生的一类肿瘤抗原。新抗原包括但不限于由例如蛋白质序列的置换、移码突变、融合多肽、框内缺失、插入、内源性逆转录病毒多肽的表达以及多肽的肿瘤特异性过表达所产生的肿瘤抗原。
在本说明书中与“肽”可互换使用的术语“突变肽”、“肿瘤特异性肽”、“新抗原肽”和“新抗原的肽”是指通常通过相邻氨基酸的α-氨基与羧基之间的肽键彼此连接的一系列残基，通常是L-氨基酸。同样地，术语“多肽”在本说明书中与“突变多肽”、“新抗原多肽”和“新抗原的多肽”可互换使用，以指定通常通过相邻氨基酸的α-氨基与羧基之间的肽键彼此连接的一系列残基，例如L-氨基酸。多肽或肽可以是各种长度，或为中性(不带电荷)形式或盐的形式，且没有如糖基化、侧链氧化或磷酸化的修饰，或含有这些修饰，但该修饰不能破坏本文所述多肽的生物活性。本文所用的肽或多肽包含至少一个侧翼序列。如本文所用的术语“侧翼序列”是指不是新表位的一部分的新抗原肽的片段或区域。
“新表位”、“肿瘤特异性新表位”、“肿瘤特异性表位”或“肿瘤抗原”是指不存在于诸如非病变细胞，例如非癌细胞或种系细胞等参考中，但在病变细胞，例如癌细胞中发现的表位或抗原决定簇区域。这包括以下情况：在正常的非病变细胞或种系细胞中发现相应的表位，但是由于在病变细胞，例如癌细胞中的一个或多个突变，该表位的序列被改变，从而产生新表位。如本文所用的术语“新表位”是指在肽或新抗原性肽内的抗原决定簇区域。新表位可包含至少一个“锚定残基”和至少一个“锚定残基侧翼区”。新表位可以进一步包含“分隔区”。术语“锚定残基”是指与HLA上的特定口袋结合，从而导致与HLA相互作用的特异性的氨基酸残基。在一些情况下，锚定残基可位于规范锚定位置。在其他情况下，锚定残基可位于非规范锚定位置。新表位可以通过突出到肽结合沟中的口袋中的一级和二级锚定残基与HLA分子结合。在肽结合沟中，特定氨基酸组成了容纳所呈递的新表位的锚定残基的相应侧链的口袋。在HLA I和HLA II分子两者的不同等位基因之间存在肽结合偏好。HLA I类分子结合短的新表位，后者的N和C端锚定在位于新表位结合沟端的口袋中。虽然大多数HLAI类结合新表位约为9个氨基酸，但更长的新表位可通过其中心部分的凸起来容纳，从而产生约8至12个氨基酸的结合新表位。与HLA II类蛋白质结合的新表位在大小上不受限制，可以在约16至25个氨基酸之间变化。HLA II类分子中的新表位结合沟在两端均打开，从而允许长度相对较长的肽的结合。虽然长度为9个氨基酸残基的核心区段对新表位的识别贡献最大，但锚定残基侧翼区对于肽对HLA II类等位基因的特异性也很重要。在一些情况下，锚定残基侧翼区是N端残基。在另一种情况下，锚定残基侧翼区是C端残基。在又一种情况下，锚定残基侧翼区是N端残基和C端残基两者。在一些情况下，锚定残基侧翼区的侧翼为至少两个锚定残基。侧翼为锚定残基的锚定残基侧翼区是“分隔区”。
“主要组织相容性复合物”或“MHC”是在控制导致生理免疫应答的细胞相互作用中起作用的基因簇。在人类中，MHC复合物也被称为人白细胞抗原(HLA)复合物。关于MHC和HLA复合物的详细描述，参见Paul,Fundamental Immunology,第3版,Raven Press,New York(1993)。“主要组织相容性复合物(MHC)的蛋白质或分子”、“MHC分子”、“MHC蛋白”或“HLA蛋白”应被理解为意指这样的蛋白质，其能够结合由蛋白质抗原的蛋白质水解裂解所产生的肽并且代表潜在的淋巴细胞表位(例如，T细胞表位和B细胞表位)，从而将其转运到细胞表面并在那里将其呈递给特定细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞或B细胞。基因组中的主要组织相容性复合物包含遗传区域，其在细胞表面上表达的基因产物对于结合和呈递内源性和/或外源性抗原至关重要，并且因此用于调节免疫过程。主要组织相容性复合物被分为编码不同蛋白质的两个基因分组，即MHC I类分子和MHC II类分子。这两种MHC类别的细胞生物学和表达模式适应于这些不同的作用。
“人白细胞抗原”或“HLA”是人I类或II类主要组织相容性复合物(MHC)蛋白(参见，例如，Stites等人,Immunology,第8版.,Lange Publishing,Los Altos,Calif.(1994))。
“肽-MHC(pMHC)稳定性”是指在生化测定中半数的特异性肽从同源HLA解离所花费的时长。
“抗原呈递细胞”(APC)是在其细胞表面上呈递与MHC分子缔合的蛋白质抗原的肽片段的细胞。一些APC可激活抗原特异性T细胞。成熟的专职抗原呈递细胞通过吞噬作用或受体介导的胞吞作用非常有效地内化抗原，随后在其膜上展示与II类MHC分子结合的抗原片段。T细胞识别抗原呈递细胞膜上的抗原-II类MHC分子复合物并与其相互作用。随后由抗原呈递细胞产生其他共刺激信号，从而导致T细胞的活化。共刺激分子的表达是专职抗原呈递细胞的定义性特征。专职抗原呈递细胞的主要类型是树突细胞，其具有最广泛的抗原呈递范围，并且可能是最重要的抗原呈递细胞，还有巨噬细胞、B细胞和某些活化的上皮细胞。“树突细胞(DC)”是经由MHC II类和I类抗原呈递途径将外周组织中捕获的抗原呈递给T细胞的白细胞群体。众所周知，树突细胞是免疫应答的有效诱导物，并且这些细胞的活化是诱导抗肿瘤免疫的关键步骤。树突细胞方便地分类为“未成熟的”和“成熟的”细胞，其可以用作区分两种充分表征的表型的简单方法。然而，这种命名法不应被解释为排除所有可能的中间分化阶段。未成熟的树突细胞被表征为具有高抗原摄取和加工能力的抗原呈递细胞，其与Fc受体(FcR)和甘露糖受体的高表达相关。成熟表型的特征通常是这些标志物的较低表达以及负责T细胞活化的细胞表面分子如I类和II类MHC、粘附分子(例如，CD54和CD11)以及共刺激分子(例如，CD40、CD80、CD86和4-1BB)的高表达。
术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”、“多核酸”或“寡核苷酸”及其语法等同语在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA如mRNA。因此，这些术语包括双链和单链DNA、三链DNA以及双链和单链RNA。它还包括修饰形式(例如通过甲基化和/或通过加帽)和未修饰形式的多核苷酸。该术语还意在包括包含非天然存在的核苷酸或合成核苷酸以及核苷酸类似物的分子。可以通过例如转染、转化或转导将本文公开或考虑的核酸序列和载体引入细胞中。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶掺入聚合物中的任何底物。在一些实施方案中，多核苷酸和核酸可以是体外转录的mRNA。在一些实施方案中，使用本公开的方法施用的多核苷酸是mRNA。
“参考”可以用来将本公开的方法中获得的结果与肿瘤标本相关联并且进行比较。通常，“参考”可以基于一个或多个正常标本获得，特别是不受癌症疾病影响的标本，其获自患者或一个或多个不同的个体，例如健康个体，特别是同一物种的个体。“参考”可以通过检测足够大量的正常标本来凭经验确定。
术语“突变”或“突变的”是指与参考相比核酸序列的变化或差异(核苷酸置换、添加、插入或缺失)。“体细胞突变”可发生在除生殖细胞(精子和卵子)之外的身体的任何细胞中，因此不会传递给孩子。这些改变可以(但不总是)导致癌症或其他疾病。在一些实施方案中，突变是非同义突变。术语“非同义突变”是指导致翻译产物中的氨基酸改变如氨基酸置换的突变，例如，核苷酸置换。当突变破坏基因密码子周期性的正常相(也称为“阅读框”)时，发生“移码”，从而导致非天然蛋白质序列的翻译。基因中的不同突变可以实现相同的改变的阅读框。当通过基因组中的各种突变事件(例如错义突变、融合转录物、移码和/或终止密码子丢失)改变开放阅读框(ORF)时，可以创建“neoORF”。neoORF可以编码正常基因组中不存在的新氨基酸序列。
“保守氨基酸置换”是其中一个氨基酸残基被另一个具有相似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸置换。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，用苯丙氨酸置换酪氨酸是保守置换。识别不消除肽功能的核苷酸和氨基酸保守置换的方法是本领域公知的。
“天然”或“野生型”序列是指在自然界中发现的序列。这样的序列本质上可以包含更长的序列。
如本文所用的术语“亲和力”是指结合对的两个成员(例如，HLA结合肽和I类或II类HLA)之间的结合强度的量度。KD是解离常数并且具有摩尔浓度的单位。亲和常数是解离常数的倒数。亲和常数有时用作描述该化学实体的通用术语。它是结合能量的直接量度。亲和力可以通过实验确定，例如使用市售Biacore SPR单元通过表面等离子体共振(SPR)确定。亲和力也可以被表示为抑制浓度50(IC50)，即50％的肽被替代时的浓度。同样，ln(IC50)是指IC50的自然对数。Koff是指解离速率常数，例如，关于HLA结合肽和I类或II类HLA的解离。在整个公开内容中，“结合数据”或“结合分析”结果可以用“IC50”表示。IC50是结合测定中观察到标记的参考肽结合的50％抑制时测试肽的浓度。考虑到运行测定的条件(即，限制HLA蛋白和标记的参考肽浓度)，这些值接近KD值。用于确定结合的测定是本领域公知的，并且详细描述于例如PCT公开WO 94/20127和WO 94/03205以及其他出版物如Sidney等人,Current Protocols in Immunology 18.3.1(1998)；Sidney等人,J.Immunol.154:247(1995)；和Sette等人,Mol.Immunol.31:813(1994)中。或者，结合可以相对于参考标准肽的结合来表示。例如，可以基于其相对于参考标准肽的IC50的IC50。结合也可以使用其他测定系统来确定，包括使用以下系统的测定系统：活细胞(例如，Ceppellini等人,Nature 339:392(1989)；Christnick等人,Nature 352:67(1991)；Busch等人,Int.Immunol.2:443(1990)；Hill等人,J.Immunol.147:189(1991)；del Guercio等人,J.Immunol.154:685(1995))、使用去污剂裂解物的无细胞系统(例如，Cerundolo等人,J.Immunol.21:2069(1991))、固定化纯化的MHC(例如，Hill等人,J.Immunol.152,2890(1994)；Marshall等人,J.Immunol.152:4946(1994))、ELISA系统(例如，Reay等人,EMBO J.11:2829(1992))、表面等离子体共振(例如，Khilko等人,J.Biol.Chem.268:15425(1993))；高通量可溶相测定(Hammer等人,J.Exp.Med.180:2353(1994))以及I类MHC稳定化或组装的测量(例如，Ljunggren等人,Nature 346:476(1990)；Schumacher等人,Cell 62:563(1990)；Townsend等人,Cell 62:285(1990)；Parker等人,J.Immunol.149:1896(1992))。“交叉反应性结合”指示肽被多于一个HLA分子结合；同义词是简并结合。
如本文所用的术语“天然存在的”及其语法等同语是指物体可以在自然界中找到的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可以从天然来源分离并且未在实验室中被人有意修饰的肽或核酸是天然存在的。
“抗原处理”或“处理”及其语法等同语是指多肽或抗原降解为处理产物，该产物为所述多肽或抗原的片段(例如，多肽降解为肽)，以及这些片段中的一个或多个与MHC分子缔合(例如，通过结合)，用于由细胞(例如抗原呈递细胞)呈递至特异性T细胞。
术语“受试者”是指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人类、非人灵长类、犬科动物、猫科动物、啮齿类等，其将是特定治疗的受体。通常，提及人类受试者，术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。
“细胞”及其语法等同语是指人或非人动物来源的细胞。
“T细胞”包括CD4+T细胞和CD8+T细胞。术语T细胞还包括T辅助1型T细胞和T辅助2型T细胞。
根据本公开内容，术语“疫苗”涉及在施用后诱导识别并攻击病原体或病变细胞(如癌细胞)的免疫应答(如细胞或体液免疫应答)的药物制剂(药物组合物)或产品。疫苗可用于预防或治疗疾病。术语“个体化癌症疫苗”或“个人化癌症疫苗”涉及特定癌症患者，并且意指癌症疫苗适应个体癌症患者的需要或特殊情况。
术语“有效量”或“治疗有效量”或“治疗效果”是指对于“治疗”受试者或哺乳动物的疾病或病症有效的治疗剂的量。治疗有效量的药物具有治疗效果，因此可以预防疾病或病症的发展；减缓疾病或病症的发展；减缓疾病或病症的进展；在一定程度上缓解与疾病或病症相关的一种或多种症状；降低发病率和死亡率；提高生活质量；或这些效果的组合。
术语“治疗”或“缓解”是指：(1)治愈、减缓、减轻经诊断的病理状况或病症的症状，和/或中止该病理状况或病症的进展的治疗措施；和(2)预防或减缓目标病理状况或病症的发展的预防性或防范性措施。因此，需要治疗的受试者包括已经患有该病症的受试者；易于患该病症的受试者；以及要预防该病症的受试者。
“药学上可接受的”是指通常无毒、惰性和/或生理学相容的组合物或组合物组分。
“药用赋形剂”或“赋形剂”包括诸如佐剂、载体、pH调节剂和缓冲剂、张度调节剂、润湿剂、防腐剂等材料。“药用赋形剂”为药学上可接受的赋形剂。
如本文所用的“免疫调节剂”或其语法等同语可以指能够刺激或抑制免疫系统并可以帮助个体的身体对抗例如感染、癌症等疾病的物质。影响免疫系统特定部分的特异性免疫调节剂的实例包括但不限于单克隆抗体、细胞因子和疫苗。非特异性免疫调节剂以一般方式影响免疫系统，非限制性实例包括卡介苗(BCG)和左旋咪唑。
如本文所用的术语“癌症”及其语法等同语可以指细胞的过度增殖，其独特性状即正常控制的丧失会导致生长失调、分化缺乏、局部组织侵袭和转移。关于本发明的组合物和方法，癌症可以是任何癌症，包括急性淋巴细胞癌、急性骨髓性白血病、肺泡横纹肌肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、肛管癌、直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓癌、结肠癌、食道癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠类癌瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、白血病、液体肿瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、恶性间皮瘤、肥大细胞瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌和肠系膜癌、舌咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、输尿管癌和/或膀胱癌中的任何一种。如本文所用的术语“肿瘤”是指例如恶性或良性类型的细胞或组织的异常生长。
术语“外显子组”是指编码功能性蛋白的基因组的部分，或指包含基因组中蛋白质编码基因的所有外显子或编码区的序列。其根据物种占全基因组的约1-2％。
“稀释剂”包括无菌液，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的水和油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水也是药物组合物的稀释剂。盐溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可如在可注射溶液中用作稀释剂。
“受体”应被理解为是指能够结合配体的生物分子或分子分组。受体可以用来在细胞、细胞形成或生物体中传递信息。受体包含至少一个受体单元，例如，其中每个受体单元可以由蛋白质分子组成。受体具有与配体的结构互补的结构，并且可以作为结合配偶体与配体复合。具体通过配体在细胞表面上复合后受体的构象变化来传递信息。在一些实施方案中，受体应被理解为尤其是指能够与配体(特别是合适长度的肽或肽片段)形成受体/配体复合物的MHC I类和II类的蛋白质。
“配体”应被理解为意指具有与受体的结构互补的结构并且能够与该受体形成复合物的分子。在一些实施方案中，配体应被理解为意指在其氨基酸序列中具有合适长度和合适结合基序的肽或肽片段，以使得肽或肽片段能够与MHC I类或MHC II类的蛋白质形成复合物。
在一些实施方案中，“受体/配体复合物”还应被理解为意指“受体/肽复合物”或“受体/肽片段复合物”，其包括呈递肽或肽片段的MHC I类或II类分子。
术语“基序”是指所限定长度的氨基酸序列中的残基模式，例如，长度小于约15个氨基酸残基或长度小于约13个氨基酸残基的肽，例如，对于I类HLA基序，具有约8至约13个(例如，8、9、10、11、12或13个)氨基酸残基，而对于II类HLA基序，具有约6至约25个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个)氨基酸残基，其被特定的HLA分子所识别。对于由给定的人HLA等位基因编码的每种HLA蛋白，基序通常是不同的。这些基序的一级和二级锚定残基的模式不同。在一些实施方案中，MHC I类基序标识长度为9、10或11个氨基酸残基的肽。
在两个核酸序列或多肽的氨基酸序列的语境中，如本文所用的术语“相同的”及其语法等同语或“序列同一性”，是指在指定的比较窗口上，两个序列中的残基在为了获得最大对应性而对齐时相同。如本文所用的“比较窗口”是指至少约20个连续位置，通常约50至约200、更通常约100至约150个连续位置的区段，其中可在两个序列经过最佳比对后将一个序列与具有相同数目的连续位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法在本领域中是公知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过以下方法进行：Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.,2:482(1981)的局部同源性算法；Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443(1970)的比对算法；Pearson和Lipman,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,85:2444(1988)的相似性搜索方法；这些算法的计算机化实现(包括但不限于Intelligentics,MountainView Calif.的PC/Gene程序中的CLUSTAL，Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,Wis.,U.S.A.)；CLUSTAL程序在以下文献中充分描述：Higgins和Sharp,Gene,73:237-244(1988)以及Higgins和Sharp,CABIOS,5:151-153(1989)；Corpet等人,NucleicAcids Res.,16:10881-10890(1988)；Huang等人,Computer Applications in theBiosciences,8:155-165(1992)；及Pearson等人,Methods in MoleCular Biology,24:307-331(1994)。比对通常还通过检查和手动比对来进行。在一类实施方案中，本文的多肽与参考多肽或其片段具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，例如，如通过BLASTP(或CLUSTAL或其他任何可用的比对软件)使用默认参数来测定的。类似地，核酸也可以参考起始核酸来描述，例如，它们可以与参考核酸或其片段具有50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、98％、99％或100％的序列同一性，例如，如通过BLASTN(或CLUSTAL，或其他任何可用的比对软件)使用默认参数来测定的。当描述一个分子与较大分子具有一定百分比的序列同一性时，这意味着当两个分子最佳比对时，根据两个分子最佳比对的顺序，较小分子中所述百分比的残基在较大分子中找到匹配残基。
应用于核酸或氨基酸序列的术语“基本上相同的”及其语法等同语是指使用标准程序，与使用上述程序(例如BLAST)的参考序列相比，核酸或氨基酸序列包含具有至少90％或更高、至少95％、至少98％和至少99％的序列同一性的序列。例如，BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)为11，期望(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长(W)为3，期望(E)为10和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1992))。通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定序列同一性百分比，其中与用于两个序列最佳比对的参考序列(其不包括添加或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸序列的部分可包括添加或缺失(即空位)。通过以下方法来计算百分比：确定在两个序列中均出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数，并将所得结果乘以100以得到序列同一性百分比。在实施方案中，在长度至少约50个残基的序列的区域上，在至少约100个残基的区域上存在基本同一性，并且在实施方案中，序列在至少约150个残基上基本相同。在实施方案中，序列在编码区的整个长度上基本相同。
如本文所用的术语“载体”意指构建体，其能够在宿主细胞中递送并通常表达一种或多种目的基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体，以及包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体。
“分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是未在自然界中发现的形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已经纯化至其不再是在自然界中发现的形式的程度的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。在一些实施方案中，分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本上纯的。在一些实施方案中，“分离的多核苷酸”涵盖包含在PCR或定量PCR反应中扩增的多核苷酸的PCR或定量PCR反应。
术语“分离的”、“生物学纯的”或其语法等同语是指这样的材料，其实质上或基本上不含在其天然状态下被发现时通常伴随该材料的组分。因此，本文所述的分离的肽不含有在其原位环境中通常与该肽关联的一些或全部物质。“分离的”表位是指不包括衍生出该表位的抗原的全序列的表位。通常，“分离的”表位不会在其上附接有导致序列在天然序列的整个长度上具有100％同一性的其他氨基酸残基。天然序列可以是诸如衍生出表位的肿瘤相关抗原的序列。因此，术语“分离的”意指将材料从其原始环境(例如，如果其为天然存在的，则为天然环境)中移出。“分离的”核酸是从其天然环境中移取的核酸。例如，存在于活动物中的天然存在的多核苷酸或肽不是分离的，但从天然系统中的一些或全部共存物质中分离出的相同的多核苷酸或肽是分离的。这样的多核苷酸可以是载体的一部分，并且/或者这样的多核苷酸或肽可以是组合物的一部分，并且仍然是“分离的”，因为这样的载体或组合物不是其天然环境的一部分。分离的RNA分子包括本文所述的DNA分子的体内或体外RNA转录物，并且还包括以合成方式产生的这类分子。
如本文所用的术语“基本上纯的”是指至少50％纯(即，不含污染物)、至少90％纯、至少95％纯、至少98％纯或至少99％纯的物质。
如本文所用的“转染”、“转化”或“转导”是指通过使用物理或化学方法将一种或多种外源多核苷酸引入宿主细胞中。许多转染技术是本领域已知的，并且包括例如磷酸钙DNA共沉淀(参见，例如，Murray E.J.(编著),Methods in MoleCular Biology,Vol.7,GeneTransfer and Expression Protocols,Humana Press(1991))；DEAE-葡聚糖；电穿孔；阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；以及磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。在合适的包装细胞中生长感染性颗粒后，可将噬菌体或病毒载体引入宿主细胞中，其中许多包装细胞可商购获得。
2.增强的裂解及其用途
发展治愈性和肿瘤特异性免疫疗法的关键障碍之一是用于抗原呈递以产生足够免疫应答的最小表位的处理和释放不足。抗原处理和呈递是指在细胞内发生的过程，其导致蛋白片段化或蛋白水解、蛋白质片段或肽与主要组织相容性复合物(MHC)分子的缔合、以及肽-MHC(pMHC)分子在细胞表面上的表达以便被T细胞上的T细胞受体(TCR)识别。抗原呈递是由抗原呈递细胞(APC)和某些其他细胞表面上发现的MHC I类分子和MHC II类分子介导的。MHC I类和MHC II类分子将短肽递送至细胞表面，使得这些肽分别由细胞毒性(CD8+)和辅助(CD4+)T细胞进行识别。TCR仅能识别以结合至细胞表面上的MHC分子的肽形式的抗原，且T细胞所识别的抗原为由大分子结构的断裂、个体蛋白质的解折叠、及其经由抗原处理而裂解成短片段所产生的肽。
细胞表面上的抗原呈递需要肽的正确处理以通过蛋白酶体、胞质和内质网(ER)氨肽酶释放最小表位；与抗原处理(TAP)转运相关的有效转运体；和与MHC I类分子的充分结合。表位产生的效率不仅取决于表位本身，而且取决于其侧翼区或表位氨基酸序列侧翼的氨基酸序列。从包含表位序列和表位序列侧翼的氨基酸序列的肽中处理最小表位的效率尚未完全了解，但已知受到多种因素的影响，包括肽中的裂解位点两侧的特定氨基酸残基和附近的其他竞争性裂解位点。
解决最小表位问题的处理和释放不足的一种方法是研究和设计可以添加到表位序列的N和/或C端以增强肽的裂解和处理以及表位呈递的特定氨基酸残基或序列。例如，可以将已知被有效处理的来自其他表位的氨基酸残基或序列加入到表位序列。另一实例是使用已知在表位周围通常观察到的氨基酸残基(Abelin等人，2017,Immunity 46,315-326)。该方法可赋予额外的益处，包括促进肽的制造(例如，合成、纯化和/或配制)或更容易的下游修饰(例如与其他分子缀合)。
解决目前对有效处理和释放最小表位的障碍的另一种方法是使用被蛋白酶裂解的接头来靶向含表位的肽，以供位点特异性蛋白酶处理以释放表位。例如，在树突细胞(DC)内能够容易地裂解以释放最小表位序列的特异性接头可以用于增强疫苗接种后的CD8依赖性免疫应答。另外，这些肽将不会与非专职APC表面上的MHC I类分子非选择性地结合，而是会通过特异性(例如胞吞)途径被适当地处理并呈递到T细胞。另外，促进充分的表位处理和呈递的另一实例是结合两种策略，即特异性氨基酸残基和特异性接头。
本文提供了一种多肽，其包含由受试者基因组编码的表位序列、由或不由紧靠编码受试者基因组中的表位序列的核酸序列上游或下游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列、氨基酸或氨基酸序列，和/或接头。向表位序列添加氨基酸、氨基酸序列和/或接头可以增强APC对表位的处理和呈递，从而产生免疫应答。一方面，氨基酸或氨基酸序列是氨基酸序列或肽序列。在实施方案中，氨基酸序列或肽序列不是由紧靠受试者基因组中编码表位序列的核酸序列上游或下游的核酸序列编码。在另一个实施方案中，氨基酸或氨基酸序列与表位序列邻接，并且由编码表位序列的受试者基因组进行编码。例如，与表位序列邻接的氨基酸或氨基酸序列可以包含一个或多个增强多肽(例如赖氨酸)裂解的氨基酸残基。在这样的实施方案中，多肽可以包含与表位序列邻接的氨基酸或氨基酸序列，并且可以进一步包含不是由紧靠受试者基因组中编码表位序列的核酸序列上游或下游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列。
在一些实施方案中，表位由APC的I类MHC呈递。在一些实施方案中，表位由APC的II类MHC呈递。在一些实施方案中，表位的每个氨基酸呈递肽序列的氨基酸，该肽序列包含任何由受试者基因组中的核酸序列编码的连续氨基酸序列。在一些实施方案中，表位包含8至12个连续的氨基酸残基，并由APC的I类MHC呈递。在一些实施方案中，表位包含8、9、10、11或12个连续的氨基酸残基，并由APC的I类MHC呈递。在一些实施方案中，表位包含9至25个连续的氨基酸残基，并由APC的II类MHC呈递。在一些实施方案中，表位包含9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续的氨基酸残基，并由APC的II类MHC呈递。在一些实施方案中，表位序列包含8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续氨基酸残基，其中第13至第25个氨基酸中的一个或多个任选地存在，并且至少一个氨基酸是突变氨基酸。在一些实施方案中，表位序列包含AA1AA2AA3AA4AA5AA6AA7AA8AA9AA10AA11AA12AA13AA14AA15AA16AA17AA18AA19AA20AA21AA22AA23AA24AA25，其中每个AA是氨基酸，并且AA9、AA10、AA11、AA12、AA13、AA14、AA15、AA16、AA17、AA18、AA19、AA20、AA21、AA22、AA23、AA24和AA25中的一个或多个任选地存在，并且至少一个AA是突变氨基酸。
在一些实施方案中，包含表位序列和氨基酸或氨基酸序列，且该氨基酸或氨基酸序列与表位序列邻接并且由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游或下游的核酸序列编码，的多肽可以不包含接头。在一些实施方案中，包含表位序列和氨基酸或氨基酸序列，且该氨基酸或氨基酸序列与表位序列邻接并且由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游或下游的核酸序列编码，的多肽可包含接头。在一些实施方案中，包含表位序列和氨基酸或氨基酸序列，且该氨基酸或氨基酸序列不是由紧靠受试者基因组中编码表位序列的核酸序列上游或下游的核酸序列编码，的多肽可进一步包含接头。在一些实施方案中，包含表位序列和氨基酸或氨基酸序列，且该氨基酸或氨基酸序列不是由紧靠受试者基因组中编码表位序列的核酸序列上游或下游的核酸序列编码，的多肽可以不包含接头。
在一些实施方案中，氨基酸或氨基酸序列包含0至1000个氨基酸残基的长度。在一些实施方案中，由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列包含0至1000个氨基酸残基的长度。在一些实施方案中，由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列下游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列包含0至1000个氨基酸残基的长度。在一些实施方案中，氨基酸或氨基酸序列包含大于0、大于1、大于2、大于3、大于4、大于5、大于6、大于7、大于8、大于9、大于10、大于15、大于20、大于25、大于30、大于35、大于40、大于45、大于50、大于55、大于60、大于65、大于70、大于75、大于80、大于85、大于90、大于95、大于100、大于150、大于200、大于250、大于300、大于350、大于400、大于450、大于500、大于550、大于600、大于650、大于700、大于750、大于800、大于850、大于900或大于950个氨基酸残基的长度。在一些实施方案中，由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列包含大于0、大于1、大于2、大于3、大于4、大于5、大于6、大于7、大于8、大于9、大于10、大于15、大于20、大于25、大于30、大于35、大于40、大于45、大于50、大于55、大于60、大于65、大于70、大于75、大于80、大于85、大于90、大于95、大于100、大于150、大于200、大于250、大于300、大于350、大于400、大于450、大于500、大于550、大于600、大于650、大于700、大于750、大于800、大于850、大于900或大于950个氨基酸残基的长度。在一些实施方案中，由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列下游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列包含大于0、大于1、大于2、大于3、大于4、大于5、大于6、大于7、大于8、大于9、大于10、大于15、大于20、大于25、大于30、大于35、大于40、大于45、大于50、大于55、大于60、大于65、大于70、大于75、大于80、大于85、大于90、大于95、大于100、大于150、大于200、大于250、大于300、大于350、大于400、大于450、大于500、大于550、大于600、大于650、大于700、大于750、大于800、大于850、大于900或大于950个氨基酸残基的长度。
在一些实施方案中，氨基酸或氨基酸序列包含1至5或7至1000个氨基酸残基的长度。在一些实施方案中，氨基酸或氨基酸序列不包含6个氨基酸残基的长度。在一些实施方案中，由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游的核酸序列编码的肽序列的氨基酸或氨基酸序列包含1至5或7至1000个氨基酸残基的长度。在一些实施方案中，由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游的核酸序列编码的肽序列的氨基酸或氨基酸序列不包含6个氨基酸残基的长度。在一些实施方案中，由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列下游的核酸序列编码的肽序列的氨基酸或氨基酸序列包含1至4或6至1000个氨基酸残基的长度。在一些实施方案中，由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列下游的核酸序列编码的肽序列的氨基酸或氨基酸序列不包含5个氨基酸残基的长度。
在一些实施方案中，多肽还包含接头。在一些实施方案中，多肽不是由通过I类MHC呈递的四个不同表位组成。在一些实施方案中，多肽不包含由I类MHC呈递的四个不同表位。在一些实施方案中，多肽包含至少两个由I类MHC呈递的不同表位。在一些实施方案中，多肽包含至少三个、至少五个或至少六个由I类MHC呈递的不同表位。在一些实施方案中，表位包含至少一个突变氨基酸。在一些实施方案中，至少一个突变氨基酸由受试者基因组中的核酸序列中的插入、缺失、移码、neoORF或点突变编码。在一些实施方案中，当多肽由APC处理时，不是由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游或下游的核酸序列编码的肽序列的氨基酸或氨基酸序列从表位裂解。在一些实施方案中，多肽包含至少两个不同的多肽分子。在一些实施方案中，多肽包含至少三种、至少四种或至少五种不同的多肽分子。
在一些实施方案中，本公开包括一种多肽，其包含不是由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游或下游的核酸序列编码的肽序列的氨基酸或氨基酸序列；和/或接头。氨基酸或氨基酸序列和/或接头可提供多肽所需的性质，例如增加的溶解性、稳定性、免疫原性、抗原处理或抗原呈递。在一些实施方案中，多肽可以包含增强APC对表位的处理和呈递以便例如产生免疫应答的氨基酸或氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽可以包含在表位序列的N-和/或C-端上的氨基酸或氨基酸序列。在一些实施方案中，氨基酸或氨基酸序列可以包含聚赖氨酸(poly-Lys或polyK)或聚精氨酸(poly-Lys或polyR)。在一些实施方案中，氨基酸或氨基酸序列可以是在表达表位的受试者中不表达的蛋白质的多肽序列的氨基酸或氨基酸序列(例如，不由编码表位序列的受试者的基因组编码)。在另一个实施方案中，多肽可包含可被蛋白酶裂解的接头。在一些实施方案中，多肽可包含被蛋白酶裂解的接头和氨基酸或氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供了式(I)、(II)、(III)和/或(IV)的多肽，或式(I)、(II)、(III)和/或(IV)的多肽的药学上可接受的盐，其中立体化学是不确定的，例如，外消旋物或非对映异构体的混合物或单独的非对映异构体。本领域技术人员将认识到，在制备式(I)、(II)、(III)和/或(IV)化合物的任何阶段，可以使用对应于式(I)、(II)、(III)和/或(IV)中的任何一个的化合物的异构体混合物(例如外消旋物)。在制备的任何阶段，单一立体异构体可以通过使用例如手性色谱分离将其从异构体混合物(例如外消旋物)中分离而获得。
在一些实施方案中，接头包含非多肽接头。在一些实施方例中，接头包含化学接头。在一些实施方案中，接头包含非天然氨基酸。在一些实施方案中，非天然氨基酸包含β-γ-δ-氨基酸。在一些实施方案中，非天然氨基酸包含L-α-氨基酸的衍生物。在一些实施方案中，接头不包含氨基酸。在一些实施方案中，接头不包含天然氨基酸。在一些实施方案中，接头包含除了肽键以外的键。在一些实施方案中，接头包含二硫键。在一些实施方案中，本文所述的多肽包含多于一个接头。在一些实施方案中，本文所述的多肽包含第一接头和第二接头，其中第一接头在表位的N端，第二接头在表位的C端。在一些实施方案中，第一接头和第二接头是不同的。在一些实施方案中，第一接头和第二接头是相同的。
在一些实施方案中，多肽包含亲水尾。在一些实施方案中，包含表位序列、不是由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游或下游的核酸序列编码的肽序列的氨基酸或氨基序列、和/或接头的多肽，与包含相同表位序列且不含该氨基酸或氨基酸序列和/或接头的多肽相比，增强了溶解性。在一些实施方案中，包含表位序列、和与由受试者基因组中的核酸序列编码的表位序列邻接的氨基酸或氨基序列的多肽，与包含相同表位序列而不含该氨基酸或氨基酸序列的多肽相比，增强了溶解性。例如，与表位序列邻接的氨基酸或氨基酸序列可以包含一个或多个增强多肽溶解性的氨基酸残基(例如赖氨酸)。在这样的实施方案中，多肽可以包含与表位序列邻接的氨基酸或氨基酸序列，并且可以进一步包含不是由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游或下游的核酸序列编码的肽序列的氨基酸或氨基酸序列。
在一些实施方案中，当多肽被APC处理时，表位从包含表位序列的多肽释放。在一些实施方案中，当多肽进一步包括不包含由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游的核酸序列编码的至少一个额外氨基酸的氨基酸或氨基酸序列、和/或接头时，与包括相同表位但不含不包含由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游的核酸序列编码的至少一个额外氨基酸的氨基酸或氨基酸序列和/或接头的多肽相比，表位以更高的速率释放。在一些实施方案中，当多肽进一步包括不包含由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列下游的核酸序列编码的至少一个额外氨基酸的氨基酸或氨基酸序列、和/或接头时，与包括相同表位但不含不包含由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列下游的核酸序列编码的至少一个额外氨基酸的氨基酸或氨基酸序列和/或接头的多肽相比，表位以更高的速率释放。在一些实施方案中，当氨基酸或氨基酸序列不是受试者中表达的蛋白质的肽序列的氨基酸或氨基酸序列时，表位以更高的速率释放。在一些实施方案中，当多肽包含接头时，与包含相同表位但不包含接头的多肽相比，表位以更高的速率释放。在一些实施方案中，当多肽包含可被蛋白酶裂解的接头时，与包含相同表位但不包含可被蛋白酶裂解的接头的多肽相比，表位以更高的速率释放。
在一些实施方案中，当包括表位和包含由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游或下游的核酸序列编码的至少一个额外氨基酸的氨基酸或氨基酸序列的多肽进一步包括不由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游或下游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列和/或接头时，与包括相同表位和包含由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游或下游的核酸序列编码的至少一个额外氨基酸的氨基酸或氨基酸序列，但不包括不由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游或下游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列和/或接头的相应多肽相比，表位以更高的速率释放。
在一些实施方案中，当多肽包括不包含由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游的核酸序列编码的至少一个额外氨基酸的氨基酸或氨基酸序列、和/或接头时，与具有表位和由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列的相同长度的相应多肽相比，多肽以更高的速率裂解。在一些实施方案中，当多肽包括不包含由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列下游的核酸序列编码的至少一个额外氨基酸的氨基酸或氨基酸序列、和/或接头时，与具有表位和由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列下游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列的相同长度的相应多肽相比，多肽以更高的速率裂解。在一些实施方案中，当氨基酸或氨基酸序列不是受试者中表达的蛋白质的肽序列的氨基酸或氨基酸序列时，多肽以更高的速率裂解。在一些实施方案中，当多肽包含接头时，与包含相同表位但不包含接头的多肽相比，所述多肽以更高的速率裂解。在一些实施方案中，当多肽包含可被蛋白酶裂解的接头时，与包含相同表位但不包含可被蛋白酶裂解的接头的多肽相比，所述多肽以更高的速率裂解。
在一些实施方案中，当多肽进一步包括不包含由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游的核酸序列编码的至少一个额外氨基酸的氨基酸或氨基酸序列时，与包含表位序列和与表位序列邻接的由核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列但不包含接头的相同长度的相应多肽的裂解相比，多肽以更高的速率裂解。在一些实施方案中，当多肽进一步包括不包含由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列下游的核酸序列编码的至少一个额外氨基酸的氨基酸或氨基酸序列时，与包含表位序列和与表位序列邻接的由核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列但不包含接头的相同长度的相应多肽的裂解相比，多肽以更高的速率裂解。
在一些实施方案中，当多肽包含(i)由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游或下游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列，(ii)不由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游或下游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列，和/或(iii)接头时，与具有表位和由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游或下游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列的相同长度的相应多肽相比，多肽以更高的速率裂解。
在一些实施方案中，当多肽被APC处理时，多肽在接头区域裂解。在一些实施方案中，当多肽进一步包括不包含由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游的核酸序列编码的至少一个额外氨基酸的氨基酸或氨基酸序列、和接头时，与具有表位和由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列的相同长度的相应多肽相比，多肽在接头区域以更高的速率裂解。在一些实施方案中，当多肽进一步包括不包含由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列下游的核酸序列编码的至少一个额外氨基酸的氨基酸或氨基酸序列、和接头时，与包含表位和由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列下游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列的相同长度的相应多肽相比，多肽在接头区域以更高的速率裂解。在一些实施方案中，当氨基酸或氨基酸序列不是受试者中表达的蛋白质的肽序列的氨基酸或氨基酸序列时，多肽在接头区域以更高的速率裂解。
在一些实施方案中，当多肽被APC处理时，APC的表位呈递增强。在一些实施方案中，当包含表位的多肽进一步包括不包含由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游的核酸序列编码的至少一个额外氨基酸的氨基酸或氨基酸序列、和/或接头时，与具有表位和由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列的相同长度的相应多肽相比，APC的表位呈递增强。在一些实施方案中，当包含表位的多肽进一步包括不包含由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列下游的核酸序列编码的至少一个额外氨基酸的氨基酸或氨基酸序列、和/或接头时，与具有表位和由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列下游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列的相同长度的相应多肽相比，APC的表位呈递增强。在一些实施方案中，当氨基酸或氨基酸序列不是受试者中表达的蛋白质的肽序列的氨基酸或氨基酸序列时，APC的表位呈递增强。在一些实施方案中，当多肽包含接头时，与包含相同表位但不包含接头的多肽相比，APC的表位呈递增强。在一些实施方式中，当多肽包含可被蛋白酶裂解割的接头时，与包含相同表位但不包含可被蛋白酶解割的接头的多肽相比，APC的表位呈递增强。
在一些实施方案中，当多肽进一步包括不包含由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游的核酸序列编码的至少一个额外氨基酸的氨基酸或氨基酸序列时，与包含表位序列和与表位序列邻接的由核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列但不包含接头的相同长度的相应多肽相比，APC的表位呈递增强。在一些实施方案中，当多肽进一步包括不包含由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列下游的核酸序列编码的至少一个额外氨基酸的氨基酸或氨基酸序列时，与包含表位序列和与表位序列邻接的由核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列但不包含接头的相同长度的相应多肽相比，APC的表位呈递增强。
在一些实施方案中，当多肽包含(i)由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游或下游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列，(ii)不由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游或下游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列，和/或(iii)接头时，与具有表位和由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游或下游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列的相同长度的相应多肽相比，APC的表位呈递增强。
在一些实施方案中，当多肽被APC处理时，免疫原性增强。在一些实施方案中，当包含表位的多肽进一步包括不包含由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游的核酸序列编码的至少一个额外氨基酸的氨基酸或氨基酸序列、和/或接头时，与具有表位和由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列的相同长度的相应多肽相比，免疫原性增强。在一些实施方案中，当包含表位的多肽进一步包括不包含由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列下游的核酸序列编码的至少一个额外氨基酸的氨基酸或氨基酸序列、和/或接头时，与具有表位和由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列下游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列的相同长度的相应多肽相比，免疫原性增强。在一些实施方案中，当氨基酸或氨基酸序列不是受试者中表达的蛋白质的肽序列的氨基酸或氨基酸序列时，免疫原性增强。在一些实施方案中，当多肽包含接头时，与包含相同表位但不包含接头的多肽相比，免疫原性增强。在一些实施方案中，当多肽包含可被蛋白酶裂解的接头时，与包含相同表位但不包含可被蛋白酶裂解的接头的多肽相比，免疫原性增强。
在一些实施方案中，当多肽进一步包括不包含由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游的核酸序列编码的至少一个额外氨基酸的氨基酸或氨基酸序列时，与包含表位序列和与表位序列邻接的由核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列但不包含接头的相同长度的相应多肽相比，免疫原性增强。在一些实施方案中，当多肽进一步包括不包含由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列下游的核酸序列编码的至少一个额外氨基酸的氨基酸或氨基酸序列时，与包含表位序列和与表位序列邻接的由核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列但不包含接头的相同长度的相应多肽相比，免疫原性增强。
在一些实施方案中，当多肽包含(i)由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游或下游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列，(ii)不由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游或下游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列，和/或(iii)接头时，与具有表位和由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游或下游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列的相同长度的相应多肽相比，免疫原性增强。
在一些实施方案中，当多肽被APC处理时，抗肿瘤活性增强。在一些实施方案中，当包含表位的多肽进一步包括不包含由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游的核酸序列编码的至少一个额外氨基酸的氨基酸或氨基酸序列、和/或接头时，与具有表位和由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列的相同长度的相应多肽相比，APC的抗肿瘤活性增强。在一些实施方案中，当包含表位的多肽进一步包括不包含由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列下游的核酸序列编码的至少一个额外氨基酸的氨基酸或氨基酸序列。和/或接头时，与具有表位和由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列下游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列的相同长度的相应多肽相比，抗肿瘤活性增强。在一些实施方案中，当氨基酸或氨基酸序列不是受试者中表达的蛋白质的肽序列的氨基酸或氨基酸序列时，抗肿瘤活性增强。在一些实施方案中，当多肽包含接头时，与包含相同表位但不包含接头的多肽相比，抗肿瘤活性增强。在一些实施方案中，当多肽包含可被蛋白酶裂解的接头时，与包含相同表位但不包含可被蛋白酶裂解的接头的多肽相比，抗肿瘤活性增强。
在一些实施方案中，当多肽进一步包括不包含由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游的核酸序列编码的至少一个额外氨基酸的氨基酸或氨基酸序列时，与包含表位序列和与表位序列邻接的由核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列但不包含接头的相同长度的相应多肽相比，抗肿瘤活性增强。在一些实施方案中，当多肽进一步包括不包含由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列下游的核酸序列编码的至少一个额外氨基酸的氨基酸或氨基酸序列时，与包含表位序列和与表位序列邻接的由核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列但不包含接头的相同长度的相应多肽相比，抗肿瘤活性增强。
在一些实施方案中，当多肽包含(i)由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游或下游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列，(ii)不由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游或下游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列，和/或(iii)接头时，与具有表位和由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游或下游的核酸序列编码的氨基酸或氨基酸序列的相同长度的相应多肽相比，抗肿瘤活性增强。
在一些实施方案中，当多肽被APC处理时，APC将表位呈递到免疫细胞。在一些实施方案中，当多肽被APC处理时，APC优先或特异性地将表位呈递到免疫细胞。在一些实施方案中，当多肽被APC处理时，APC将表位呈递到吞噬细胞。在一些实施方案中，当多肽被APC处理时，APC优先或特异性地将表位呈递到吞噬细胞。在一些实施方案中，当多肽被APC处理时，APC将表位呈递到树突细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞。在一些实施方案中，APC优先或特异性地将表位呈递到树突细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞。
在一些实施方案中，多肽包含选自聚赖氨酸(polyK)和聚精氨酸(polyR)的氨基酸序列。在优选的实施方案中，多肽包含polyK序列。在一些实施方案中，多肽包含选自polyK-AA-AA和polyR-AA-AA的序列，其中每个AA是氨基酸或其类似物或衍生物。在优选的实施方案中，多肽包含polyK-AA-AA。在一些实施方案中，polyK包含聚-L-赖氨酸。在一些实施方案中，polyK包含至少两个连续的赖氨酸残基。在一些实施方案中，polyK包含至少三个连续的赖氨酸残基，例如Lys-Lys-Lys。在优选的实施方案中，polyK包含至少四个连续的赖氨酸残基，例如Lys-Lys-Lys-Lys，也称为K4。在一些实施方案中，polyK包含至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少10个连续的赖氨酸残基。在一些实施方案中，polyR包含聚-L-精氨酸。在一些实施方案中，polyR包含至少两个连续的精氨酸残基。在一些实施方案中，polyR包含至少三个连续的精氨酸残基，例如Arg-Arg-Arg。在一些实施方案中，polyR包含至少四个、至少五个、至少六个或至少七个连续的精氨酸残基。在一些实施方案中，polyR包含至少八个连续的精氨酸残基，例如Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg，也称为R8。在一些实施方案中，polyR包含至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少10个连续精氨酸残基。在一些实施方案中，polyK中的赖氨酸单元和/或polyR中的精氨酸单元各自可具有(L)立体化学构型、(D)立体化学构型、或(L)和(D)立体化学构型的任何混合物。
在一些实施方案中，多肽包含选自二硫化物、对氨基苄氧羰基(PABC)和AA-AA-PABC的接头，其中AA是氨基酸或其类似物或衍生物。在一些实施方案中，AA-AA-PABC选自丙氨酸-赖氨酸-PABC(Ala-Lys-PABC)、缬氨酸-瓜氨酸-PABC(Val-Cit-PABC)和苯丙氨酸-赖氨酸-PABC(Phe-Lys-PABC)。在一些实施方案中，AA-AA-PABC是Ala-Lys-PABC。在一些实施方案中，AA-AA-PABC是Val-Cit-PABC。在一些实施方案中，AA-AA-PABC是Phe-Lys-PABC。在一些实施方案中，Val-Cit-PABC中的缬氨酸和瓜氨酸单元各自具有(L)立体化学构型。在一些实施方案中，Phe-Lys-PABC中的苯丙氨酸和赖氨酸单元各自具有(L)立体化学构型。在一些实施方案中，Val-Cit-PABC中的缬氨酸和瓜氨酸单元各自具有(D)立体化学构型。在一些实施方案中，Phe-Lys-PABC中的苯丙氨酸和赖氨酸单元各自具有(D)立体化学构型。在一些实施方案中，Val-Cit-PABC中的缬氨酸和瓜氨酸单元具有(L)和(D)立体化学构型的混合物。在一些实施方案中，Phe-Lys-PABC中的苯丙氨酸和赖氨酸单元具有(L)和(D)立体化学构型的混合物。
在一些实施方案中，多肽包含具有以下结构的接头：
Figure BDA0003504116290000561
在一些实施方案中，多肽包含接头，接头是
Figure BDA0003504116290000562
其中R1和R2独立地为H或(C1-C6)烷基；j是1或2；G1为H或COOH；且i是1、2、3、4或5。
在一些实施方案中，Ar和/或As是式(III)或式(IV)，其中R1和R2独立为H或(C1-C6)烷基；j是1或2；G1为H或COOH；且i是1、2、3、4或5。
在一些实施方案中，多肽包含式(III)或式(IV)的接头。
式(IV)的二硫化物接头可以根据Zhang,Donglu,等人,ACS Med.Chem.Lett.2016,7,988-993以及Pillow,Thomas H.,等人,Chem.Sci.,2017,8,366–370进行合成。含PABC的肽可根据Laurent Ducry(ed.),Antibody-Drug Conju gates,Methods in MolecularBiology,vol.1045,DOI 10.1007/978-1-62703-541-5_5,Springer Science+BusinessMedia,LLC 2013进行合成。在一些实施方案中，可以使用任何用于固相肽合成的树脂。
抗原处理途径
本文所述的多肽可以通过不同的途径处理以释放表位用于表位呈递。为了产生最佳肽抗原，在抗原处理和呈递途径中存在两个关键处理事件。胞质蛋白主要由蛋白酶体处理。然后，短肽通过与抗原处理相关的转运蛋白(TAP)转运到内质网(ER)中，用于随后与MHCI类分子的组装。外源蛋白主要由MHC II类分子呈递。抗原通过包括吞噬作用、大胞饮和内吞作用的几种途径被内化，并最终运输至成熟或晚期内体区室，在该区室中其被处理并负载到MHC II类分子上。细胞质/核抗原也可以通过自噬运输到内体网络中，用于随后的MHCII类分子的处理和呈递。
最初的肽蛋白水解作用发生在细胞的胞质溶胶内，并通过蛋白酶体或免疫蛋白酶体将较大的蛋白片段降解成较小的肽。该处理事件通常负责产生与I类MHC结合的肽的最终C-端残基。蛋白酶体是一种含有多个亚基的大蛋白水解复合物，包含两个亚基——多功能大蛋白酶(LMP)2和LMP7。结合用于降解的蛋白质通过与泛素共价连接而靶向到蛋白酶体。LMP2和LMP7诱导蛋白水解复合物以产生结合I类MHC I的肽。然后，在胞质溶胶中产生的肽通过TAP转运到ER中。由于TAP优先转运11-14个氨基酸的肽，肽通常太长而不能稳定地结合I类MHC，并且在进入ER后需要进一步处理。该处理包括通过内质网氨肽酶(ERAP)1和ERAP2修剪抗原肽的N-端区域。该过程产生对I类MHC缔合具有高亲和力的肽的集合。
在正常细胞环境中，典型的II类MHC分子仅在如树突细胞(DC)或巨噬细胞的专门的APC上表达。通过吞噬作用、内吞作用或胞饮作用内化的外源性或胞外抗原主要在II类MHC上呈递至CD4+T细胞上。然而，一小部分胞质抗原也由于自体吞噬而在II类MHC上表达。简言之，内吞抗原在由逐渐酸性更强的蛋白水解活性区室组成的囊泡途径中进行处理，这些区室通常描述为早期内体(pH 6.0-pH 6.5)、晚期内体或内溶酶体(pH 5.0-pH 6.0)和溶酶体(pH 4.5-pH 5.0)。通过吞噬作用内化的抗原遵循类似的途径，终止于通过吞噬体和溶酶体融合形成的吞噬溶酶体。溶酶体和吞噬溶酶体(pH 4.0-pH 4.5)含有多个酸性pH最佳的蛋白酶，通常称为组织蛋白酶。在高度降解性的细胞如巨噬细胞中，通过这些酶的连续裂解产生非常短的肽和游离氨基酸，它们被转运到胞质溶胶中以补充用于新蛋白质合成的tRNA。在蛋白水解活性较低的APC中，较大的中间体形成了用于II类MHC结合的肽的主要来源，这些肽通常由13-18个氨基酸组成。
I类和II类MHC均可以接近由内源和外源抗原处理的肽。例如，II类MHC能结合来源于在溶酶体中被降解的内源膜蛋白的肽。同样地，I类MHC可以结合来源于通过胞吞作用或吞噬作用内化的外源蛋白质的肽(一种被称为交叉呈递的现象)。DC的特异性亚群特别擅长介导该过程，这对于引发幼稚CD8+T细胞的初次应答是至关重要的。
一方面，本文提供了一种多肽裂解的方法，包括将本文所述的多肽与APC接触。在一些实施方案中，所述方法可在体内进行。在一些实施方案中，所述方法可在体外进行。
在一些实施方案中，多肽被泛素化。在一些实施方案中，多肽在裂解之前被泛素化。在一些实施方案中，多肽在蛋白酶体和/或免疫蛋白酶体处理之前被泛素化。在一些实施方案中，多肽在赖氨酸残基上被泛素化。在一些实施方案中，多肽在不在表位序列上的赖氨酸残基上被泛素化。在一些实施方案中，多肽在polyK上的赖氨酸残基上被泛素化。在一些实施方案中，多肽在polyK上的第一个赖氨酸上被泛素化。在一些实施方案中，多肽在polyK上的第二个赖氨酸上被泛素化。在一些实施方案中，多肽在polyK上的第三个赖氨酸上被泛素化。在一些实施方案中，多肽在polyK上的第四个赖氨酸上被泛素化。在一些实施方案中，多肽在polyK上的第五、第六、第七、第八、第九或第十个赖氨酸上被泛素化。在一些实施方案中，多肽在至少一个赖氨酸残基上被泛素化。在一些实施方案中，多肽在多于一个赖氨酸残基上被泛素化。在一些实施方案中，多肽在polyK上的多于一个赖氨酸残基上被泛素化。在一些实施方案中，多肽在每个赖氨酸残基上被泛素化。在一些实施方案中，多肽在polyK的每个赖氨酸残基上被泛素化。在一些实施方案中，多肽在polyK上的两个赖氨酸残基上被泛素化。在一些实施方案中，多肽在polyK上的三个赖氨酸残基上被泛素化。在一些实施方案中，多肽在polyK上的四个赖氨酸残基上被泛素化。在一些实施方案中，多肽在polyK上的五个、六个、七个、八个、九个或十个赖氨酸残基上被泛素化。在一些实施方案中，多肽在polyK的每个赖氨酸残基上是顺序泛素化的。在一些实施方案中，多肽在polyK的每个赖氨酸残基上不是顺序泛素化的。
在一些实施方案中，多肽在Ala-Lys-PABC的赖氨酸残基上被泛素化。在一些实施方案中，多肽在Phe-Lys-PABC的赖氨酸残基上被泛素化。在一些实施方案中，多肽包含polyK和AA-AA-PABC，其中每个AA是氨基酸或其类似物或衍生物。在一些实施方案中，多肽在polyK和AA-AA-PABC的至少一个赖氨酸残基上被泛素化。在一些实施方案中，多肽在polyK和AA-AA-PABC上的一个或多个赖氨酸残基上被泛素化。在一些实施方案中，多肽在polyK和Ala-Lys-PABC上的一个或多个赖氨酸残基上被泛素化。在一些实施方案中，多肽在polyK和Phe-Lys-PABC上的一个或多个赖氨酸残基上被泛素化。
在一些实施方案中，多肽被APC内化。在一些实施方案中，多肽通过内吞作用被APC内化。在一些实施方案中，多肽通过吞噬作用被APC内化。在一些实施方案中，多肽通过胞饮作用被APC内化。在一些实施方案中，多肽在细胞质中裂解。在一些实施方案中，多肽在胞内体中裂解。在一些实施方案中，多肽在内溶酶体中裂解。在一些实施方案中，多肽在溶酶体中裂解。在一些实施方案中，多肽在ER中裂解。在一些实施方案中，多肽被氨肽酶裂解。在一些实施方案中，氨肽酶是胰岛素调节的氨肽酶(IRAP)。在一些实施方案中，氨肽酶是内质网氨肽酶(ERAP)。在一些实施方案中，多肽由蛋白酶体和/或免疫蛋白酶体的胰蛋白酶样结构域处理。在一些实施方案中，胰蛋白酶样结构域具有胰蛋白酶样活性。在一些实施方案中，胰蛋白酶样结构域具有胰凝乳蛋白酶样活性。在一些实施方案中，胰蛋白酶样活性具有肽基谷氨酰基-肽水解酶(PGPH)活性。在一些实施方案中，多肽被蛋白酶裂解。在一些实施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶样蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶是胰凝乳蛋白酶样蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶是肽基谷氨酰基-肽水解酶(PGPH)。在一些实施方案中，蛋白酶选自天冬酰胺肽裂合酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和苏氨酸蛋白酶。在优选的实施方案中，蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶。在一些实施方案中，半胱氨酸蛋白酶选自钙蛋白酶、胱天蛋白酶、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶F、组织蛋白酶H、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L1、组织蛋白酶L2、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶W和组织蛋白酶Z。在一些实施方案中，蛋白酶是组织蛋白酶B。在一些实施方案中，蛋白酶是组织蛋白酶C。在一些实施方案中，蛋白酶是组织蛋白酶F。在一些实施方案中，蛋白酶是组织蛋白酶Z。
在一些实施方案中，多肽在赖氨酸残基处裂解。在一些实施方案中，多肽在polyK上的赖氨酸残基处裂解。在一些实施方案中，多肽在polyK上的第一个赖氨酸残基处裂解。在一些实施方案中，多肽在polyK上的第二个赖氨酸残基处裂解。在一些实施方案中，多肽在polyK上的第三个赖氨酸残基处裂解。在一些实施方案中，多肽在polyK上的第四个赖氨酸残基处裂解。在一些实施方案中，多肽在polyK上的第五个、第六个、第七个、第八个、第九个或第十个赖氨酸残基上裂解。在一些实施方案中，多肽在polyK上的一个以上赖氨酸残基处裂解。在一些实施方案中，多肽在polyK上的每个赖氨酸残基处被裂解。在一些实施方案中，多肽在polyK上的每个赖氨酸残基处是顺序裂解的。在一些实施方案中，多肽在polyK上的每个赖氨酸残基处不是顺序裂解的。
在一些实施方案中，多肽在AA-AA-PABC处被裂解，其中每个AA是氨基酸或其类似物或衍生物。在一些实施方案中，多肽在Ala-Lys-PABC处裂解。在一些实施方案中，多肽在Ala-Lys-PABC中的赖氨酸残基处裂解。在一些实施方案中，多肽在Phe-Lys-PABC处裂解。在一些实施方案中，多肽在Phe-Lys-PABC中的赖氨酸残基处裂解。在一些实施方案中，多肽在Val-Cit-PABC处裂解。在一些实施方案中，多肽在Val-Cit-PABC中的瓜氨酸(Cit)残基处裂解。在一些实施方案中，当多肽裂解时，表位被释放。
限制基于肽的药物的全身治疗应用的一个主要弱点是肽的蛋白水解降解。通过注射途径施用的肽到达血液，血液中含有在止血、纤溶和组织转化(即受伤情况下的重要过程)中起作用的蛋白酶。因此，使肽对血液、血清或血浆中存在的蛋白酶稳定是重要的。一方面，本文所述的多肽在血浆、血液和/或血清中是稳定的。在一些实施方案中，多肽在受试者中被APC内化之前不裂解。在一些实施方案中，多肽在受试者中被APC处理之前不裂解。在一些实施方案中，多肽在被APC内化之前不在受试者的血液中裂解。在一些实施方案中，多肽在被APC处理之前不在受试者的血液中裂解。在一些实施方案中，多肽不被血液中的蛋白酶裂解。在一些实施方案中，多肽不通过纤溶酶裂解。在一些实施方案中，多肽不通过血浆激肽释放酶裂解。在一些实施方案中，多肽不通过组织激肽释放酶裂解。在一些实施方案中，多肽不通过凝血酶裂解。在一些实施方案中，多肽不通过凝血因子裂解。在一些实施方案中，多肽不通过凝血因子XII裂解。在一些实施方案中，多肽在人血浆中是稳定的。在一些实施方案中，多肽在人血液中是稳定的。在一些实施方案中，多肽在人血清中是稳定的。
在一些实施方案中，多肽在人血浆中具有1小时至5天的半衰期。在一些实施方案中，多肽具有约1小时至约120小时的半衰期。在一些实施方案中，多肽具有约1小时至约5小时、约1小时至约10小时、约1小时至约12小时、约1小时至约24小时、约1小时至约36小时、约1小时至约48小时、约1小时至约60小时、约1小时至约72小时、约1小时至约84小时、约1小时至约96小时、约1小时至约120小时、约5小时至约10小时、约5小时至约12小时、约5小时至约24小时、约5小时至约36小时、约5小时至约48小时、约5小时至约60小时、约5小时至约72小时、约5小时至约84小时、约5小时至约96小时、约5小时至约120小时、约10小时至约12小时、约10小时至约24小时、约10小时至约36小时、约10小时至约48小时、约10小时至约60小时、约10小时至约72小时、约10小时至约84小时、约10小时至约96小时、约10小时至约120小时、约12小时至约24小时、约12小时至约36小时、约12小时至约48小时、约12小时至约60小时、约12小时至约72小时、约12小时至约84小时、约12小时至约96小时、约12小时至约120小时、约24小时至约36小时、约24小时至约48小时、约24小时至约60小时、约24小时至约72小时、约24小时至约84小时、约24小时至约96小时、约24小时至约120小时、约36小时至约48小时、约36小时至约60小时、约36小时至约72小时、约36小时至约84小时、约36小时至约96小时、约36小时至约120小时、约48小时至约60小时、约48小时至约72小时、约48小时至约84小时、约48小时至约96小时、约48小时至约120小时、约60小时至约72小时、约60小时至约84小时、约60小时至约96小时、约60小时至约120小时、约72小时至约84小时、约72小时至约96小时、约72小时至约120小时、约84小时至约96小时、约84小时至约120小时或约96小时至约120小时的半衰期。在一些实施方案中，多肽具有约1小时、约5小时、约10小时、约12小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时、约72小时、约84小时、约96小时或约120小时的半衰期。在一些实施方案中，多肽具有至少约1小时、约5小时、约10小时、约12小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时、约72小时、约84小时或约96小时的半衰期。在一些实施方案中，多肽具有至多约5小时、约10小时、约12小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时、约72小时、约84小时、约96小时或约120小时的半衰期。
3.新抗原及其用途
开发治愈性且肿瘤特异性免疫疗法的关键障碍之一是识别和选择用以避免自身免疫的高度特异性且受限制的肿瘤抗原。由恶性细胞内的遗传改变(例如，倒位、易位、缺失、错义突变、剪接位点突变等)引起的肿瘤新抗原代表最具肿瘤特异性的一类抗原。由于识别新抗原、选择优化的抗原和产生用于疫苗或免疫原性组合物的新抗原的技术困难，新抗原很少用于癌症疫苗或免疫原性组合物。这些问题可以通过以下方法解决：识别肿瘤中以DNA水平存在但不存于来自高比例癌症受试者的匹配种系样品中的瘤形成/肿瘤中的突变；用一种或多种肽-MHC结合预测算法分析所识别的突变，以生成在瘤形成/肿瘤内表达以及与高比例的患者HLA等位基因结合的多种新抗原T细胞表位；以及合成多种选自所有新抗原肽和预测的结合肽的组的新抗原肽，以用于适用于治疗高比例的癌症受试者的癌症疫苗或免疫原性组合物。
例如，将肽测序信息翻译成治疗性疫苗可以包括预测可以结合高比例个体的HLA分子的突变肽。有效地选择使用哪些特定突变作为免疫原需要具有预测哪些突变肽将有效地结合高比例的患者的HLA等位基因的能力。最近，采用经验证的结合和非结合肽的基于神经网络的学习方法提高了主要HLA-A和HLA-B等位基因的预测算法的准确性。然而，即使使用先进的基于神经网络的算法来编码HLA-肽结合规则，若干因素仍然限制了预测HLA等位基因上呈现的肽的能力。
将肽测序信息翻译成治疗性疫苗的另一个实例可包括将药物配制为长肽的多表位疫苗。靶向实际上尽可能多的突变表位利用了免疫系统的巨大能力，通过下调免疫靶向基因产物来防止免疫逃逸的机会，并补偿表位预测方法的已知不准确性。合成肽提供了有效制备多种免疫原以及快速地将突变表位的识别转化为有效的疫苗的有用方法。肽可轻松化学合成且易于使用不含污染细菌或动物物质的试剂进行纯化。小尺寸允许清楚地聚焦蛋白质的突变区域并且还减少了与其他组分(未突变的蛋白质或病毒载体抗原)的不相关的抗原竞争。
将肽测序信息翻译成治疗性疫苗的又一个实例可包括与强疫苗佐剂的组合。有效的疫苗可能需要强佐剂来引发免疫应答。例如，聚-ICLC——TLR3以及MDA5和RIG3的RNA解旋酶结构域的激动剂，已显示出疫苗佐剂的几种理想的性质。这些性质包括诱导体内免疫细胞的局部和全身活化、产生刺激性趋化因子和细胞因子以及通过树突细胞(DC)刺激抗原呈递。此外，聚-ICLC可以在人体中诱导持久的CD4+和CD8+应答。重要的是，在接种聚-ICLC的受试者和接受过高效、具有复制能力的黄热病疫苗的志愿者中观察到转录和信号转导途径上调的惊人相似性。此外，在最近的1期研究中，>90％的(除Montanide外还)使用聚-ICLC联合NYESO-1肽疫苗免疫的卵巢癌患者显示出CD4+和CD8+T细胞的诱导以及对肽的抗体应答。同时，聚-ICLC迄今已在超过25项临床试验中进行了广泛测试，并表现出相对良好的毒性概况。
肽
在一些方面，本公开提供了包含肿瘤特异性突变的分离的肽。这些肽和多肽在本文中被称为“新抗原肽”或“新抗原多肽”。在本说明书中，术语“肽”可与“突变肽”、“新抗原肽”和“新抗原的肽”互换使用，以指定通常通过相邻氨基酸的α-氨基与羧基之间的肽键彼此连接的一系列残基，通常为L-氨基酸。同样地，术语“多肽”在本说明书中与“突变多肽”、“新抗原多肽”和“新抗原的多肽”可互换使用，以指定通常通过相邻氨基酸的α-氨基与羧基之间的肽键彼此连接的一系列残基，例如L-氨基酸。多肽或肽可以是各种长度，或为中性(不带电荷)形式或盐的形式，且没有如糖基化、侧链氧化或磷酸化的修饰，或含有这些修饰，但该修饰不能破坏本文所述多肽的生物活性。
在一些实施方案中，使用基因组或外显子组测序方法来识别肿瘤特异性突变。根据本公开可以使用任何合适的测序方法，例如，下一代测序(NGS)技术。第三代测序方法可能在未来取代NGS技术以加速该方法的测序步骤。为了阐明的目的：在本公开上下文中的术语“下一代测序”或“NGS”意指所有新型高通量测序技术，与被称为Sanger化学法的“常规”测序方法相比，其通过将整个基因组分成小块，沿整个基因组平行随机读取核酸模板。这类NGS技术(也称为大规模平行测序技术)能够在非常短的时间内，例如1-2周内，例如1-7天内或少于24个小时内，提供全基因组、外显子组、转录组(基因组的所有转录序列)或甲基化组(基因组的所有甲基化序列)的核酸序列信息，并且原则上允许单细胞测序方法。可商购获得的或文献中提到的多个NGS平台可以在本公开的背景中使用，例如，在WO 2012/159643中详细描述的那些NGS平台。
在某些实施方案中，本文所述的肽可包含但不限于约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约150、约200、约300、约350、约400、约450、约500、约600、约700、约800、约900、约1,000、约1,500、约2,000、约2,500、约3,000、约4,000、约5,000、约7,500、约10,000个氨基酸或更多个氨基酸残基，以及其中可得出的任何范围。在具体的实施方案中，新抗原肽分子等于或少于100个氨基酸。
在一些实施方案中，多肽的长度可以是约8至约50个氨基酸残基，或约8至约30、约8至约20、约8至约18、约8至约15或约8至约12个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度可以是约8至约500个氨基酸残基，或约8至约450、约8至约400、约8至约350、约8至约300、约8至约250、约8至约200、约8至约150、约8至约100、约8至约50或约8至约30个氨基酸残基。
在一些实施方案中，多肽的长度可以是至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个氨基酸残基。在一些实施方案中，多肽的长度可以是至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500个或更多个氨基酸残基。在一些实施方案中，多肽的长度可以是至多8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更少个氨基酸残基。在一些实施方案中，多肽的长度可以是至多8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500个或更少个氨基酸残基。
在一个实施方案中，多肽的总长度为至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少1000或至少1500个氨基酸。
在一些实施方案中，多肽的总长度为至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14、至多15、至多16、至多17、至多18、至多19、至多20、至多21、至多22、至多23、至多24、至多25、至多26、至多27、至多28、至多29、至多30、至多40、至多50、至多60、至多70、至多80、至多90、至多100、至多150、至多200、至多250、至多300、至多350、至多400、至多450、至多500、至多1000或至多1500个氨基酸。
在一些实施方案中，本文所述的多肽可以包含表位。在一些实施方案中，表位可以包含但不限于约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约150、约200、约300、约350、约400、约450、约500、约600、约700、约800、约900、约1,000、约1,500、约2,000、约2,500、约3,000、约4,000、约5,000、约7,500、约10,000个氨基酸或更多个氨基酸残基以及其中可得出的任何范围。
在一些实施方案中，表位的长度可以是约8至约50个氨基酸残基长度，或约8至约30、约8至约20、约8至约18、约8至约15、或约8至约12个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽的长度可以是约8至约500个氨基酸残基长度，或约8至约450、约8至约400、约8至约350、约8至约300、约8至约250、约8至约200、约8至约150、约8至约100、约8至约50或约8至约30个氨基酸残基。
在一些实施方案中，表位长度可以是至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多个氨基酸残基。在一些实施方案中，表位长度可以是至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500个或更多个氨基酸残基。在一些实施方案中，表位长度可以是至多8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更少个氨基酸残基。在一些实施方案中，表位长度可以是至多8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500个或更少个氨基酸残基。
可以以几种方式设计更长的肽。在一些实施方案中，当HLA结合肽被预测或已知时，较长的肽包含：(1)向每个相应基因产物的N端及C端延伸2-5个氨基酸的单个结合肽；或(2)一些或所有结合肽与每个结合肽的延伸序列的串接。在其他实施方案中，当测序揭示肿瘤中存在长(>10个残基)新表位序列时(例如，由于导致新的肽序列的移码、通读或内含子包含)，较长的肽可由作为单个较长的肽或几个重叠的较长肽的整个新肿瘤特异性氨基酸段组成。在一些实施方案中，推测使用较长的肽允许患者细胞进行内源性加工，并且可以导致更有效的抗原呈递和T细胞应答诱导。在一些实施方案中，可以使用两种或更多种肽，其中肽重叠并铺在长的新抗原肽上。
在一些实施方案中，针对MHC I类的免疫原性抗原、新抗原肽或其表位的长度为12个氨基酸残基或更少，并且通常由约8个至约12个氨基酸残基组成。在一些实施方案中，针对MHC I类的免疫原性抗原、新抗原肽或其表位为约8、约9、约10、约11或约12个氨基酸残基。在一些实施方案中，针对MHC II类的免疫原性抗原、新抗原肽或其表位的长度为25个氨基酸残基或更少，并且通常由约9个至约25个氨基酸残基组成。在一些实施方案中，针对MHCII类的免疫原性抗原、新抗原肽或其表位为约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24或约25个氨基酸残基。
在一些实施方案中，抗原、新抗原肽或表位结合HLA蛋白(例如，MHC I类HLA或MHCII类HLA)。在具体实施方案中，抗原、新抗原肽或表位以比相应的野生型肽更大的亲和力结合HLA蛋白。在特定的实施方案中，抗原、新抗原肽或表位具有至少小于5000nM、至少小于500nM、至少小于100nM、至少小于50nM或更低的IC50或KD。在一些实施方案中，抗原、新抗原肽或表位结合至MHC I类HLA。在一些实施方案中，抗原、新抗原肽或表位以0.1nM至2000nM的亲和力结合至MHC I类HLA。在一些实施方案中，抗原、新抗原肽或表位以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000nM的亲和力结合至MHC I类HLA。在一些实施方案中，抗原、新抗原肽或表位结合至MHC II类HLA。在一些实施方案中，抗原、新抗原肽或表位以0.1nM至2000nM、1nM至1000nM、10nM至500nM或小于1000nM的亲和力结合至MHC II类HLA。在一些实施方案中，抗原、新抗原肽或表位以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000nM的亲和力结合至MHC II类HLA。
在一些实施方案中，抗原、新抗原肽或表位以10分钟至24小时的稳定性结合至MHCI类HLA。在一些实施方案中，抗原、新抗原肽或表位以10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟的稳定性结合至MHC I类HLA。在一些实施方案中，抗原、新抗原肽或表位以1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时的稳定性结合至MHC I类HLA。在一些实施方案中，抗原、新抗原肽或表位以10分钟至24小时的稳定性结合至MHC II类HLA。在一些实施方案中，抗原、新抗原肽或表位以10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟的稳定性结合至MHC II类HLA。在一些实施方案中，抗原、新抗原肽或表位以1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时的稳定性结合至MHC II类HLA。
在一些实施方案中，多肽可具有约0.5至约12、约2至约10或约4至约8的pI值。在一些实施方案中，肽可具有至少4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或更高的pI值。在一些实施方案中，多肽可具有至多4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或更低的pI值。
在一些实施方案中，本文所述的多肽包含不是由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游的核酸序列编码的肽序列的氨基酸或氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的多肽包含不是由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列下游的核酸序列编码的肽序列的氨基酸或氨基酸序列。在一些实施方案中，氨基酸或氨基酸序列包含0-1000、1-900、5-800、10-700、20-600、30-500、40-400、50-300、60-200或70-100个氨基酸残基。在优选的实施方案中，氨基酸或氨基酸序列包含1至20个氨基酸残基。在另一个优选的实施方案中，氨基酸或氨基酸序列包含5至12个氨基酸残基。在一些实施方案中，氨基酸或氨基酸序列包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少1000或至少1500个氨基酸残基。在一些实施方案中，氨基酸或氨基酸序列包含约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约1000或约1500个氨基酸残基。
一方面，本文提供了一种制备多肽的方法，其包括将氨基酸或氨基酸序列和/或接头连接到包含表位序列的序列的N-和/或C-端。在一些实施方案中，本文所述的多肽可以在溶液中、被冻干或者可以是结晶形式。在一些实施方案中，本文所述的多肽可以通过重组DNA技术或化学合成经由合成而制备，或者可以从诸如原始肿瘤或病原生物体的天然来源中分离。表位或新表位可以单独合成或直接或间接地连接在多肽中。尽管本文所述的多肽可能基本上不含其他天然存在的宿主细胞蛋白质及其片段，但在一些实施方案中，该多肽可以通过合成进行缀合以与天然片段或颗粒连接。
在一些实施方案中，本文所述的多肽可以用很多种方式制备。在一些实施方案中，可以根据常规技术在溶液中或在固体支持体上合成多肽。各种自动合成器可商购获得，并可根据已知方案进行使用。参见，例如，Stewart&Young,olid Phase Peptide Synthesis,第2版,Pierce Chemical Co.,1984。此外，可以使用化学连接将各个多肽进行连接，以产生仍然在本公开范围内的较大的多肽。
或者，可以使用重组DNA技术，其中将编码多肽或多肽部分的核苷酸序列插入表达载体中、转化或转染到合适的宿主细胞中，并在适于表达的条件下培养。这些方法通常是本领域已知的，如在Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)中所概述的。因此，包含一种或多种本文所述的新抗原肽的重组肽可以用于呈递合适的T细胞表位。
在一些实施方案中，多肽包含至少一个突变氨基酸。在一些实施方案中，至少一个突变氨基酸由受试者基因组中的核酸序列中的一个或多个核苷酸的插入进行编码。在一些实施方案中，至少一个突变氨基酸由受试者基因组中的核酸序列中的一个或多个核苷酸的缺失进行编码。在一些实施方案中，至少一个突变氨基酸由受试者基因组中的核酸序列中的移码进行编码。当突变破坏基因密码子周期性的正常相(也称为“阅读框”)时，发生移码，从而导致非天然蛋白质序列的翻译。基因中的不同突变可以实现相同的改变的阅读框。在一些实施方案中，至少一个突变氨基酸由受体者基因组中的核酸序列中的neoORF进行编码。在一些实施方案中，至少一个突变氨基酸由受试者基因组中的核酸序列中的点突变进行编码。在一些实施方案中，至少一个突变氨基酸由具有突变的基因编码，该突变可导致融合多肽、内源逆转录病毒多肽的框内缺失、插入和表达以及多肽的肿瘤特异性过表达。在一些实施方案中，至少一个突变氨基酸由受试者基因组中的第一基因与第二基因的融合物编码。在一些实施方案中，至少一个突变氨基酸由受试者基因组中的第一基因与第二基因的框内融合物编码。在一些实施方案中，至少一个突变氨基酸由受试者基因组中的第一基因与第一基因的剪接变体的外显子的融合物编码。在一些实施方案中，至少一个突变氨基酸由受试者基因组中的第一基因与第一基因的隐蔽外显子的融合物编码。
在一些方面，本公开提供了包含至少两个多肽分子的多肽。在一些实施方案中，至少两个多肽或多肽分子中的两个或更多个包含表位。在一些实施方案中，至少两个多肽或多肽分子中的两个或更多个包含相同表位。在一些实施方案中，至少两个多肽或多肽分子中的两个或更多个包含相同长度的相同表位。在一些实施方案中，至少两个多肽或多肽分子中的两个或更多个包含氨基酸或氨基酸序列，该氨基酸或氨基酸序列是不由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游或下游的核酸序列编码的肽序列的氨基酸或氨基酸序列。在一些实施方案中，不由紧靠受试者基因组中编码至少两个多肽或多肽分子中的两个或更多个的表位的核酸序列上游的核酸序列编码的肽序列的氨基酸或氨基酸序列是相同的。在一些实施方案中，不由紧靠受试者基因组中编码至少两个多肽或多肽分子中的两个或更多个的表位的核酸序列下游的核酸序列编码的肽序列的氨基酸或氨基酸序列是相同的。
在一些实施方案中，至少两个多肽或多肽分子中的两个或更多个包含接头。在一些实施方案中，至少两个多肽或多肽分子中的两个或更多个在表位的N和/或C端包含接头。在一些实施方案中，至少两个多肽或多肽分子中的两个或更多个包含不同的接头。在一些实施方案中，至少两个多肽或多肽分子的第一多肽或多肽分子不包含接头，并且至少两个多肽或多肽分子的第二多肽或多肽分子包含接头。在一些实施方案中，至少两个多肽或多肽分子的第一多肽或多肽分子在表位的N端上不包含接头，并且至少两个多肽或多肽分子的第二多肽或多肽分子在表位的N端上包含接头。在一些实施方案中，至少两个多肽或多肽分子的第一多肽或多肽分子在表位的C端上不包含接头，并且至少两个多肽或多肽分子的第二多肽或多肽分子在表位的C端上包含接头。在一些实施方案中，至少两个多肽或多肽分子的第一多肽或多肽分子包含接头，并且至少两个多肽或多肽分子的第二多肽或多肽分子不包含接头。在一些实施方案中，至少两个多肽或多肽分子的第一多肽或多肽分子在表位的N端上包含接头，并且至少两个多肽或多肽分子的第二多肽或多肽分子在表位的N端上不包含接头。在一些实施方案中，至少两个多肽或多肽分子的第一多肽或多肽分子在表位的C端上包含接头，并且至少两个多肽或多肽分子的第二多肽或多肽分子在表位的C端上不包含接头。
二硫化物接头可以使用本领域熟知的方法合成。例如，二硫化物接头可根据Zhang,Donglu,等人,ACS Med.Chem.Lett.2016,7,988-993和Pillow,Thomas H.,等人,Chem.Sci.,2017,8,366–370合成。二硫化物接头合成和含二硫化物的肽的合成的实例见实施例3和4。含PABC的肽可以使用本领域公知的方法合成。例如，含PABC的肽可根据LaurentDucry(ed.),Antibody-Drug Conju gates,Methods in Molecular Biology,vol.1045,DOI 10.1007/978-1-62703-541-5_5,Springer Science+Business Media,LLC 2013进行合成。含PABC的肽的合成实例见实施例5。在一些实施方案中，可以使用任何用于固相肽合成的树脂。
在一些实施方案中，多肽包含至少3种、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或更多的多肽或多肽分子。例如，多肽可以包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个或更多个多肽或多肽分子。
在一些实施方案中，包含抗原、新抗原肽或表位的多肽包含RAS表位。在一些实施方案中，肽可衍生自具有置换突变的蛋白质，该突变例如是KRAS G12C、G12D、G12V、Q61H或Q61L突变，或NRAS Q61K或Q61R突变。该置换可位于肽长度上的任何位置。例如，它可以位于该肽的N端三分之一、该肽的中央三分之一或该肽的C端三分之一。在另一个实施方案中，置换的残基位于离N-端2-5个残基或离C-端2-5个残基。肽可以类似地衍生自肿瘤特异性插入突变，该突变中肽包含一个或多个或所有插入残基。在一些实施方案中，表位包含突变RAS肽序列，RAS肽序列包含突变RAS蛋白的至少8个连续的氨基酸，突变RAS蛋白包含G12、G13或Q61处的突变和在G12、G13或Q61处的突变。在一些实施方案中，包含G12、G13或Q61处的突变的突变RAS蛋白的至少8个连续氨基酸包含G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61H、Q61L、Q61K或Q61R突变。在一些实施方案中，G12、G13或Q61处的突变包含G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61H、Q61L、Q61K或Q61R突变。
在一些实施方案中，包含RAS表位的多肽进一步包含氨基酸序列。在一些实施方案中，氨基酸序列是巨细胞病毒(CMV)蛋白如pp65的氨基酸序列。在一些实施方案中，氨基酸序列是人免疫缺陷病毒(HIV)蛋白的氨基酸序列。在一些实施方案中，氨基酸序列是MART-1蛋白的氨基酸序列。在一些实施方案中，CMV蛋白(例如pp65)的氨基酸序列包含1、2、3或3个以上氨基酸残基。在一些实施方案中，CMV蛋白(例如pp65)的氨基酸序列包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸残基。在一些实施方案中，HIV蛋白的氨基酸序列包含1、2、3或3个以上氨基酸残基。在一些实施方案中，HIV蛋白的氨基酸序列包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸残基。在一些实施方案中，MART-1蛋白的氨基酸序列包含1、2、3或3个以上氨基酸残基。在一些实施方案中，MART-1的蛋白质的氨基酸序列包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸残基。
在一些实施方案中，RAS表位结合至由HLA等位基因编码的蛋白质。在一些实施方案中，RAS表位以小于10μM、小于9μM、小于8μM、小于7μM、小于6μM、小于5μM、小于4μM、小于3μM、小于2μM、小于1μM、小于950nM、小于900nM、小于850nM、小于800nM、小于750nM、小于600nM、小于550nM、小于500nM、小于450nM、小于400nM、小于350nM、小于300nM、小于250nM、小于200nM、小于150nM、小于100nM、小于90nM、小于80nM、小于70nM、小于60nM、小于50nM、小于40nM、小于30nM、小于20nM或小于10nM的亲和力结合至由HLA等位基因编码的蛋白质。在一些实施方案中，RAS表位以大于24小时、大于23小时、大于22小时、大于21小时、大于20小时、大于19小时、大于18小时、大于17小时、大于16小时、大于15小时、大于14小时、大于13小时、大于12小时、大于11小时、大于10小时、大于9小时、大于8小时、大于7小时、大于6小时、大于5小时、大于4小时、大于3小时、大于2小时、大于1小时、大于55分钟、大于50分钟、大于45分钟、大于40分钟、大于35分钟、大于30分钟、大于25分钟、大于20分钟、大于15分钟、大于10分钟、大于9分钟、大于8分钟、大于7分钟、大于6分钟、大于5分钟、大于4分钟、大于3分钟、大于2分钟或大于1分钟的稳定性结合至由HLA等位基因编码的蛋白质。
在一些实施方案中，HLA等位基因选自HLA-A02:01等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-A11:01等位基因、HLA-A03:02等位基因、HLA-A30:01等位基因、HLA-A31:01等位基因、HLA-A33:01等位基因、HLA-A33:03等位基因、HLA-A68:01等位基因、HLA-A74:01等位基因和/或HLA-C08:02等位基因及其任何组合。在一些实施方案中，HLA等位基因是HLA-A02:01。在一些实施方案中，HLA等位基因是HLA-A03:01等位基因。在一些实施方案中，所HLA等位基因是HLA-A11:01等位基因。在一些实施方案中，所HLA等位基因是HLA-A03:02等位基因。在一些实施方案中，所HLA等位基因是HLA-A30:01等位基因。在一些实施方案中，所HLA等位基因是HLA-A31:01等位基因。在一些实施方案中，HLA等位基因是HLA-A33:01等位基因。在一些实施方案中，HLA等位基因是HLA-A33:03等位基因。在一些实施方案中，HLA等位基因是HLA-A68:01等位基因。在一些实施方案中，HLA等位基因是HLA-A74:01等位基因。在一些实施方案中，HLA等位基因是HLA-C08:02。
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其含有包含第一肽和第二肽的单个多肽，或者编码第一肽和第二肽的单个多核苷酸。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含一种或多种另外的肽，其中所述一种或多种另外的肽包含第三新表位。在一些实施方案中，第一肽和第二肽由从相同转录起始位点转录的序列编码。在一些实施方案中，第一肽由从第一转录起始位点转录的序列编码，而第二肽由从第二转录起始位点转录的序列编码。在一些实施方案中，其中多肽的长度为至少26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500或10,000个氨基酸。在一些实施方案中，多肽包含与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一序列；和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二序列。在一些实施方案中，多肽包含与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的至少8或9个连续氨基酸的第一序列；和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的至少16或17个连续氨基酸的第二序列。
在一些实施方案中，第二肽长于第一肽。在一些实施方案中，第一肽长于第二肽。在一些实施方案中，第一肽的长度为至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500或10,000个氨基酸。在一些实施方案中，第二肽的长度为至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500或10,000个氨基酸。在一些实施方案中，第一肽包含与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少9个连续氨基酸的序列。在一些实施方案中，第二肽包含与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的至少17个连续氨基酸的序列。
在一些实施方案中，第一肽、第二肽或两者包含至少一个侧翼序列，其中至少一个侧翼序列在新表位的上游或下游。在一些实施方案中，至少一个侧翼序列与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，至少一个侧翼序列包含非野生型序列。在一些实施方案中，至少一个侧翼序列是N端侧翼序列。在一些实施方案中，至少一个侧翼序列是C端侧翼序列。在一些实施方案中，第一肽的至少一个侧翼序列与第二肽的至少一个侧翼序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，第一肽的至少一个侧翼区域不同于第二肽的至少一个侧翼区域。在一些实施方案中，至少一个侧翼残基包含突变。
在一些实施方案中，肽包含新表位序列，该新表位序列包含至少一个突变氨基酸。在一些实施方案中，肽包含新表位序列，该新表位序列包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个突变氨基酸。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个非突变氨基酸。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个在至少一个突变氨基酸上游的非突变氨基酸。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个在至少一个突变氨基酸下游的非突变氨基酸。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸；至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个在至少一个突变氨基酸上游的非突变氨基酸；和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个在至少一个突变氨基酸下游的非突变氨基酸。
在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在至少一个突变氨基酸上游的序列。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在至少一个突变氨基酸下游的序列。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸、与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在至少一个突变氨基酸上游的序列、和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在至少一个突变氨基酸下游的序列。
在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在至少一个突变氨基酸上游的序列，该序列包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在至少一个突变氨基酸下游的序列，该序列包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸；与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在至少一个突变氨基酸上游的序列，该序列包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸；和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在至少一个突变氨基酸下游的序列，该序列包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸。
在一些实施方案中，表位是TMPRSS2:ERG表位。在一些实施方案中，TMPRSS2:ERG表位包含ALNSEALSV的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含RAS表位的多肽包含GADGVGKSAL、GACGVGKSAL、GAVGVGKSAL、GADGVGKSA、GACGVGKSA、GAVGVGKSA、KLVVVGACGV、FLVVVGACGL、FMVVVGACGI、FLVVVGACGI、FMVVVGACGV、FLVVVGACGV、MLVVVGACGV、FMVVVGACGL、YLVVVGACGV、KMVVVGACGV、YMVVVGACGV、MMVVVGACGV、DTAGHEEY、TAGHEEYSAM、DILDTAGHE、DILDTAGH、ILDTAGHEE、ILDTAGHE、DILDTAGHEEY、DTAGHEEYS、LLDILDTAGH、DILDTAGRE、DILDTAGR、ILDTAGREE、ILDTAGRE、CLLDILDTAGR、TAGREEYSAM、REEYSAMRD、DTAGKEEYSAM、CLLDILDTAGK、DTAGKEEY、LLDILDTAGK、ILDTAGKE、ILDTAGKEE、DTAGLEEY、ILDTAGLE、DILDTAGL、ILDTAGLEE、GLEEYSAMRDQY、LLDILDTAGLE、LDILDTAGL、DILDTAGLE、DILDTAGLEEY(、AGVGKSAL、GAAGVGKSAL、AAGVGKSAL、CGVGKSAL、ACGVGKSAL、DGVGKSAL、ADGVGKSAL、DGVGKSALTI、GARGVGKSA、KLVVVGARGV、VVVGARGV、SGVGKSAL、VVVGASGVGK、GASGVGKSAL、VGVGKSAL、VVVGAGCVGK、KLVVVGAGC、GDVGKSAL、DVGKSALTI、VVVGAGDVGK、TAGKEEYSAM、DTAGHEEYSAM、TAGHEEYSA、DTAGREEYSAM、TAGKEEYSA、AAGVGKSA、AGCVGKSAL、AGDVGKSAL、AGKEEYSAMR、AGVGKSALTI、ARGVGKSAL、ASGVGKSA、ASGVGKSAL、AVGVGKSA、CVGKSALTI、DILDTAGK、DILDTAGREEY、DTAGHEEYSAMR、DTAGKEEYS、DTAGKEEYSAMR、DTAGLEEYS、DTAGLEEYSA、DTAGLEEYSAMR、DTAGREEYS、DTAGREEYSAMR、GAAGVGKSA、GACGVGKSA、GACGVGKSAL、GADGVGKS、GAGDVGKSA、GAGDVGKSAL、GASGVGKSA、GCVGKSAL、GCVGKSALTI、GHEEYSAM、GKEEYSAM、GLEEYSAMR、GREEYSAM、GREEYSAMR、HEEYSAMRD、KEEYSAMRD、KLVVVGASG、LDILDTAGR、LEEYSAMRD、LVVVGARGV、LVVVGASGV、REEYSAMRDQY、RGVGKSAL、TAGLEEYSA、TEYKLVVVGAA、VGAAGVGKSA、VGADGVGK、VGASGVGKSA、VGVGKSALTI、VVVGAAGV、VVVGAVGV、YKLVVVGAC、YKLVVVGAD、YKLVVVGAR或DILDTAGKE的氨基酸序列。
在一些实施方案中，包含RAS表位的多肽如在N-端上进一步包含K、KK、KKK、KKKK、KKKKK、KKKKKKK、KKKKKKKK、KTEY、KTEYK、KTEYKL、KTEYKLV、KTEYKLVV、KTEYKLVVV、KKTEY、KKTEYK、KKTEYKL、KKTEYKLV、KKTEYKLVV、KKTEYKLVVV、KKKTEY、KKKTEYK、KKKTEYKL、KKKTEYKLV、KKKTEYKLVV、KKKTEYKLVVV、KKKKTEY、KKKKTEYK、KKKKTEYKL、KKKKTEYKLV、KKKKTEYKLVV、KKKKTEYKLVVV、IDIIMKIRNA、FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFIIFFIFFWMC、FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFAAFWFW、IFFIFFIIFFFFFFFFFFFFIIIIIIIWEC、FIFFFIIFFFFFIFFFFFIFIIIIIIFWEC、TEY、TEYK、TEYKL、TEYKLV、TEYKLVV、TEYKLVVV、WQAGILAR、HSYTTAE、PLTEEKIK、GALHFKPGSR、RRANKDATAE、KAFISHEEKR、TDLSSRFSKS、FDLGGGTFDV、CLLLHYSVSK、KKKKIIMKIRNA或MTEYKLVVV的氨基酸序列。
在一些实施方案中，包含RAS表位的多肽如在C-端上进一步包含K、KK、KKK、KKKK、KKKKK、KKKKKKK、KKKKKKKK、KKNKKDDI、KKNKKDDIKD、AGNDDDDDDDDDDDDDDDDDKKDKDDDDDD、AGNKKKKKKKNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN、AGRDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD、SALTI、SALTIQL、GKSALTIQL、GKSALTI、SALTIK、SALTIQLK、GKSALTIQLK、GKSALTIK、SALTIKK、SALTIQLKK、GKSALTIQLKK、GKSALTIKK、SALTIKKK、SALTIQLKKK、GKSALTIQLKKK、GKSALTIKKK、SALTIKKKK、SALTIQLKKKK、GKSALTIQLKKKK、GKSALTI、KKKK、QGQNLKYQ、ILGVLLLI、EKEGKISK、AASDFIFLVT、KELKQVASPF、KKKLINEKKE、KKCDISLQFF、KSTAGDTHLG、ATFYVAVTVP、LTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDG或TIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGE的氨基酸序列。
在一些实施方案中，包含RAS表位的多肽选自KTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL、KTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL、KTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL、KTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL、KKKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL、KKKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL、KKKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL、KKKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL、KKKKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL、KKKKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL、KKKKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL、KKKKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKK、KKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKK、KKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKK、KKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLK、TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLK、TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLK、TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLK、TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKKK、TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKKK、TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKKK、TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKKK、TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKKKK、TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKKKK、TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKKKK或TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKKKK。在一些实施方案中，包含RAS表位的多肽选自KKKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL、KKKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL、KKKKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL和KKKKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL。在一些实施方案中，包含RAS表位的多肽是KKKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL。在一些实施方案中，包含RAS表位的多肽是KKKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL。在一些实施方案中，包含RAS表位的多肽是KKKKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL。在一些实施方案中，包含RAS表位的多肽是KKKKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL。
在一些实施方案中，包含KRAS G12C突变的肽包含MTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETC LLDILDTAGQE的序列。在一些实施方案中，包含KRAS G12C突变的肽包含KLVVVGACGV的新表位序列。在一些实施方案中，包含KRAS G12C突变的肽包含LVVVGACGV的新表位序列。在一些实施方案中，包含KRAS G12C突变的肽包含VVGACGVGK的新表位序列。在一些实施方案中，包含KRAS G12C突变的肽包含VVVGACGVGK的新表位序列。
在一些实施方案中，包含KRAS G12D突变的肽包含MTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQE的序列。在一些实施方案中，包含KRAS G12D突变的肽包含VVGADGVGK的新表位序列。在一些实施方案中，包含KRAS G12D突变的肽包含VVVGADGVGK的新表位序列。在一些实施方案中，包含KRAS G12D突变的肽包含KLVVVGADGV的新表位序列。在一些实施方案中，包含KRAS G12D突变的肽包含LVVVGADGV的新表位序列。
在一些实施方案中，包含KRAS G12V突变的肽包含MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQE的序列。在一些实施方案中，包含KRAS G12V突变的肽包含KLVVVGAVGV的新表位序列。在一些实施方案中，包含KRAS G12V突变的肽包含LVVVGAVGV的新表位序列。在一些实施方案中，包含KRAS G12V突变的肽包含VVGAVGVGK的新表位序列。在一些实施方案中，包含KRAS G12V突变的肽包含VVVGAVGVGK的新表位序列。
在一些实施方案中，包含KRAS Q61H突变的肽包含AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGHEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPM的序列。在一些实施方案中，包含KRAS Q61H突变的肽包含ILDTAGHEEY的新表位序列。
在一些实施方案中，包含KRAS Q61L突变的肽包含AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGLEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPM的序列。在一些实施方案中，包含KRAS Q61L突变的肽包含ILDTAGLEEY的新表位序列。在一些实施方案中，包含KRAS Q61L突变的肽包含LLDILDTAGL的新表位序列。
在一些实施方案中，包含NRAS Q61K突变的肽包含AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGKEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNSKSFADINLYREQIKRVKDSDDVPM的序列。在一些实施方案中，包含NRAS Q61K突变的肽包含ILDTAGKEEY的新表位序列。
在一些实施方案中，包含NRAS Q61R突变的肽包含AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGREEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNSKSFADINLYREQIKRVKDSDDVPM的序列。在一些实施方案中，包含NRAS Q61R突变的肽包含ILDTAGREEY的新表位序列。
在一些实施方案中，包含RAS Q61H突变的肽包含TCLLDILDTAGHEEYSAMRDQYM的序列。在一些实施方案中，包含RAS Q61H突变的肽包含表1中提供的序列。在一些实施方案中，表1中提供的肽序列结合至或预计结合至由HLA等位基因编码的蛋白质，该等位基因在表1中与肽序列相邻的相应列中提供。
表1.包含RAS Q61H突变的肽序列、相应的HLA等位基因和结合潜力排名
Figure BDA0003504116290000871
Figure BDA0003504116290000881
在一些实施方案中，包含RAS Q61R突变的肽包含TCLLDILDTAGREEYSAMRDQYM的序列。在一些实施方案中，包含RAS Q61R突变的肽包含表2中提供的序列。在一些实施方案中，表2中提供的肽序列结合至或预计结合至由HLA等位基因编码的蛋白质，该等位基因在表2中与肽序列相邻的相应列中提供。
表2.包含RAS Q61R突变的肽序列、相应的HLA等位基因和结合潜力排名
Figure BDA0003504116290000891
Figure BDA0003504116290000901
Figure BDA0003504116290000911
在一些实施方案中，包含RAS Q61K突变的肽包含TCLLDILDTAGKEEYSAMRDQYM的序列。在一些实施方案中，包含RAS Q61K突变的肽包含表3中提供的序列。在一些实施方案中，表3中提供的肽序列结合至或预计结合至由HLA等位基因编码的蛋白质，该等位基因在表3中与肽序列相邻的相应列中提供。
表3.包含RAS Q61K突变的肽序列、相应的HLA等位基因和结合潜力排名
Figure BDA0003504116290000912
Figure BDA0003504116290000921
在一些实施方案中，包含RAS Q61L突变的肽包含TCLLDILDTAGLEEYSAMRDQYM的序列。在一些实施方案中，包含RAS Q61L突变的肽包含表4中提供的序列。在一些实施方案中，表4中提供的肽序列结合至或预计结合至由HLA等位基因编码的蛋白质，该等位基因在表4中与肽序列相邻的相应列中提供。
表4.包含RAS Q61L突变的肽序列、相应的HLA等位基因和结合潜力排名
Figure BDA0003504116290000931
Figure BDA0003504116290000941
Figure BDA0003504116290000951
在一些实施方案中，包含RAS G12A突变的肽包含MTEYKLVVVGAAGVGKSALTIQL的序列。在一些实施方案中，包含RAS G12A突变的肽包含表5中提供的序列。在一些实施方案中，表5中提供的肽序列结合至或预计结合至由HLA等位基因编码的蛋白质，该等位基因在表5中与肽序列相邻的相应列中提供。
表5.包含RAS G12A突变的肽序列、相应的HLA等位基因和结合潜力排名
Figure BDA0003504116290000961
Figure BDA0003504116290000971
Figure BDA0003504116290000981
在一些实施方案中，包含RAS G12C突变的肽包含MTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL的序列。在一些实施方案中，包含RAS G12C突变的肽包含表6中提供的序列。在一些实施方案中，表6中提供的肽序列结合至或预计结合至由HLA等位基因编码的蛋白质，该等位基因在表6中与肽序列相邻的相应列中提供。
表6.包含RAS G12C突变的肽序列、相应的HLA等位基因和结合潜力排名
Figure BDA0003504116290000982
Figure BDA0003504116290000991
在一些实施方案中，包含RAS G12D突变的肽包含MTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL的序列。在一些实施方案中，包含RAS G12D突变的肽包含表7中提供的序列。在一些实施方案中，表7中提供的肽序列结合至或预计结合至由HLA等位基因编码的蛋白质，该等位基因在表7中与肽序列相邻的相应列中提供。
表7.包含RAS G12D突变的肽序列、相应的HLA等位基因和结合潜力排名
Figure BDA0003504116290001001
Figure BDA0003504116290001011
在一些实施方案中，包含RAS G12R突变的肽包含MTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL的序列。在一些实施方案中，包含RAS G12R突变的肽包含表8中提供的序列。在一些实施方案中，表8中提供的肽序列结合至或预计结合至由HLA等位基因编码的蛋白质，该等位基因在表8中与肽序列相邻的相应列中提供。
表8.包含RAS G12R突变的肽序列、相应的HLA等位基因和结合潜力排名
Figure BDA0003504116290001012
Figure BDA0003504116290001021
Figure BDA0003504116290001031
在一些实施方案中，包含RAS G12S突变的肽包含MTEYKLVVVGASGVGKSALTIQL的序列。在一些实施方案中，包含RAS G12S突变的肽包含表9中提供的序列。在一些实施方案中，表9中提供的肽序列结合至或预计结合至由HLA等位基因编码的蛋白质，该等位基因在表9中与肽序列相邻的相应列中提供。
表9.包含RAS G12S突变的肽序列、相应的HLA等位基因和结合潜力排名
Figure BDA0003504116290001032
Figure BDA0003504116290001041
在一些实施方案中，包含RAS G12V突变的肽包含MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL的序列。在一些实施方案中，包含RAS G12V突变的肽包含表10中提供的序列。在一些实施方案中，表10中提供的肽序列结合至或预计结合至由HLA等位基因编码的蛋白质，该等位基因在表10中与肽序列相邻的相应列中提供。
表10.包含RAS G12V突变的肽序列、相应的HLA等位基因和结合潜力排名
Figure BDA0003504116290001051
Figure BDA0003504116290001061
Figure BDA0003504116290001071
在一些实施方案中，包含RAS G13C突变的肽包含MTEYKLVVVGAGCVGKSALTIQL的序列。在一些实施方案中，包含RAS G13C突变的肽包含表11中提供的序列。在一些实施方案中，表11中提供的肽序列结合至或预计结合至由HLA等位基因编码的蛋白质，该等位基因在表11中与肽序列相邻的相应列中提供。
表11.包含RAS G13C突变的肽序列、相应的HLA等位基因和结合潜力排名
Figure BDA0003504116290001072
Figure BDA0003504116290001081
在一些实施方案中，包含RAS G13D突变的肽包含MTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQL的序列。在一些实施方案中，包含RAS G13D突变的肽包含表12中提供的序列。在一些实施方案中，表12中提供的肽序列结合至或预计结合至由HLA等位基因编码的蛋白质，该等位基因在表12中与肽序列相邻的相应列中提供。
表12.包含RAS G13D突变的肽序列、相应的HLA等位基因和结合潜力排名
Figure BDA0003504116290001082
Figure BDA0003504116290001091
在一些实施方案中，本文所述的多肽不包含RAS表位。在一些实施方案中，表位不是RAS表位。在一些实施方案中，多肽不包含KKKKKPKRDGYMFLKAESKIMFAT、KKKKYMFLKAESKIMFATLQRSS、KKKKKAESKIMFATLQRSSLWCL、KKKKKIMFATLQRSSLWCLCSNH或KKKKMFATLQRSSLWCLCSNH。
在一些实施方案中，包含抗原、新抗原肽或表位的多肽包含GATA3表位。在一些实施方案中，GATA3表位包含MLTGPPARV、SMLTGPPARV、VLPEPHLAL、KPKRDGYMF、KPKRDGYMFL、ESKIMFATL、KRDGYMFL、PAVPFDLHF、AESKIMFATL、FATLQRSSL、ARVPAVPFD、IMKPKRDGY、DGYMFLKA、MFLKAESKIMF、LTGPPARV、ARVPAVPF、SMLTGPPAR、RVPAVPFDL或LTGPPARVP的氨基酸序列。
肽的修饰
在一些实施方案中，本公开包括修饰的肽。修饰可以包括不改变抗原肽本身的一级氨基酸序列的共价化学修饰。修饰可以产生具有所需性质(例如，延长体内半衰期、增加稳定性、降低清除率、改变免疫原性或变应原性、能够产生特定抗体、细胞靶向、抗原摄取、抗原加工、HLA亲和力、HLA稳定性或抗原呈递)的肽。在一些实施方案中，肽可包含一个或多个序列，所述序列增强APC对表位的加工和呈递，例如用于产生免疫应答。
在一些实施方案中，可以修饰多肽以提供所需属性。例如，可以通过与含有至少一个能够诱导T辅助细胞应答的表位的序列连接来增强肽诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性的能力。在一些实施方案中，免疫原性肽/T辅助缀合物通过间隔体分子来连接。在一些实施方案中，间隔体包含在生理条件下基本上不带电荷的相对较小的中性分子，如氨基酸或氨基酸模拟物。间隔体可以选自例如Ala、Gly或非极性氨基酸或中性极性氨基酸的其他中性间隔体。应当理解，任选存在的间隔体不必包含相同的残基，因此可以是异源寡聚体或同源寡聚体。新抗原肽可以直接或经由肽的氨基或羧基端的间隔体连接至T辅助肽。新抗原肽或T辅助肽的氨基末端可以被酰化。T辅助肽的实例包括破伤风类毒素残基830-843、流感残基307-319以及疟疾环子孢子残基382-398和残基378-389。
本公开的肽序列可任选地通过DNA水平的改变而改变，特别是通过在预选的碱基处突变编码该肽的DNA，从而生成将转化为所需氨基酸的密码子。
在一些实施方案中，本文所述的肽可包含置换以改变所得肽的物理性质(例如，稳定性或溶解性)。例如，可以通过用α-氨基丁酸(“B”)置换半胱氨酸(C)来修饰该肽。由于其化学性质，半胱氨酸具有形成二硫键的倾向，并且在结构上充分改变肽以降低结合能力。用α-氨基丁酸置换C不仅可以缓解这个问题，而且在某些情况下实际上改善了结合和交叉结合能力。用α-氨基丁酸置换半胱氨酸可以发生在新抗原肽的任何残基上，例如在肽内表位或类似物的锚定或非锚定位置或肽的其他位置上。
还可以通过延长或减少化合物的氨基酸序列(例如通过氨基酸的添加或缺失)来修饰所述肽。还可以通过改变某些残基的顺序或组成来修饰所述肽或类似物。技术人员将会理解，对于生物活性必需的某些氨基酸残基，例如在关键接触位点的残基或保守残基，通常可在不对生物活性产生不利影响的情况下进行改变。非关键氨基酸不必限于蛋白质中天然存在的那些氨基酸，如L-α-氨基酸，而是也可以包括非天然氨基酸，如D-异构体、β-γ-δ-氨基酸，以及L-α-氨基酸的许多衍生物。
在一些实施方案中，可以使用具有单氨基酸置换的一系列肽来优化所述肽，以确定静电荷、疏水性等对HLA结合的影响。例如，可以沿肽的长度进行一系列带正电荷(例如Lys或Arg)或带负电荷(例如Glu)的氨基酸置换，从而揭示对各种HLA分子和T细胞受体的不同敏感模式。另外，可以采用使用小的相对中性的部分如Ala、Gly、Pro或类似残基的多重置换。该置换可以是同源寡聚体或异源寡聚体。置换或添加的残基的数目和类型取决于必需接触点与所寻求的某些功能属性(例如，疏水性与亲水性)之间必需的间隔。与亲本肽的亲和力相比，通过这样的置换也可以实现对HLA分子或T细胞受体的结合亲和力增加。在任何情况下，这样的置换应该采用选择的氨基酸残基或其他分子片段以避免例如可能破坏结合的空间干扰和电荷干扰。氨基酸置换通常是单残基的。可以将置换、缺失、插入或其任意组合进行组合，以得到最终的肽。
在一些实施方案中，本文所述的肽可包含氨基酸模拟物或非天然氨基酸残基，例如D-或L-萘丙氨酸；D-或L-苯基甘氨酸；D-或L-2-噻吩基丙氨酸；D-或L-1、-2、3-或4-芘基丙氨酸；D-或L-3噻吩基丙氨酸；D-或L-(2-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(3-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(2-吡嗪基)-丙氨酸；D-或L-(4-异丙基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸；D-(三氟-甲基)-苯丙氨酸；D-ρ-氟苯丙氨酸；D-或L-ρ-联苯基-苯丙氨酸；D-或L-ρ-甲氧基联苯基苯丙氨酸；D-或L-2-吲哚(烯丙基)丙氨酸；以及D-或L-烷基丙氨酸，其中烷基可以是取代或未取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、仲丁基(sec-isotyl)、异戊基或非酸性氨基酸残基。非天然氨基酸的芳环包括例如噻唑基、噻吩基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基和吡啶基芳环。具有各种氨基酸模拟物或非天然氨基酸残基的修饰肽可具有增加的体内稳定性。这样的肽还可具有改善的保质期或制备性质。
在一些实施方案中，本文所述的肽可以通过末端-NH2酰化(例如通过烷酰基(C1-C20)或硫代羟乙酰基乙酰化)、末端羧基酰胺化(例如氨、甲胺等)进行修饰。在一些实施方案中，这些修饰可以提供用于与支持体或其他分子连接的位点。在一些实施方案中，本文所述的肽可包含修饰，诸如但不限于糖基化、侧链氧化、生物素化、磷酸化、添加表面活性物质(例如脂质)，或可以进行化学修饰，例如乙酰化等。此外，肽中的键可以是除了肽键之外的键，例如共价键、酯键或醚键、二硫键、氢键、离子键等。
在一些实施方案中，本文所述的肽可包括诸如本领域公知的那些载体，例如甲状腺球蛋白、诸如人血清白蛋白的白蛋白、破伤风类毒素、诸如聚L-赖氨酸和聚L-谷氨酸的聚氨基酸残基、流感病毒蛋白、乙型肝炎病毒核心蛋白等。
可以进一步修饰所述肽，以使之含有通常不是蛋白质的一部分的其他化学部分。那些衍生化的部分可以改善溶解性、生物半衰期、蛋白质的吸收或结合亲和力。该部分还可以减少或消除肽等的任何不期望的副作用。这些部分的概述可见于Remington'sPharmaceutical Sciences,第20版，Mack Publishing Co.,Easton,PA(2000)。例如，可以在必要时修饰具有所需活性的新抗原肽，以提供某些期望的属性，例如改善的药理学特性，同时增加或至少保留未修饰肽的基本上所有生物活性以结合期望的HLA分子并激活适当的T细胞。例如，该肽可以经受各种改变，如保守或非保守置换，其中这样的改变可以在其使用中提供某些优点，如改善的HLA结合。这样的保守置换可包括将氨基酸残基替换为生物学和/或化学上相似的另一个氨基酸残基，例如，用一个疏水残基替代另一个疏水残基，或用一个极性残基替代另一个极性残基。还可以使用D-氨基酸探测单氨基酸置换的影响。这样的修饰可以使用公知的肽合成程序进行，如在例如Merrifield,Science 232:341-347(1986),Barany&Merrifield,The Peptides,Gross&Meienhofer编著(N.Y.,AcademicPress),第1至284页(1979)；以及Stewart&Young,Solid Phase Peptide Synthesis,(Rockford,III.,Pierce)第2版(1984)中所描述的。
在一些实施方案中，本文所述的肽可以缀合至大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质；多糖，如琼脂糖凝胶、琼脂糖、纤维素、纤维素珠；聚氨基酸，如聚谷氨酸、聚赖氨酸；氨基酸共聚物；灭活的病毒颗粒；灭活的细菌毒素，如来自白喉、破伤风、霍乱、白细胞毒素分子的类毒素；灭活的细菌；和树突细胞。
可以进行的肽的改变包括但不限于与载体蛋白缀合、与配体缀合、与抗体缀合、PEG化、聚唾液酸化、HES化、重组PEG模拟物、Fc融合、白蛋白融合、纳米颗粒附着、纳米颗粒包封、胆固醇融合、铁融合、酰化、酰胺化、糖基化、侧链氧化、磷酸化、生物素化、添加表面活性物质、添加氨基酸模拟物或添加非天然氨基酸。
糖基化可影响蛋白质的物理性质，并且在蛋白质稳定性、分泌和亚细胞定位中也至关重要。适当的糖基化对于生物活性可能是重要的。事实上，来自真核生物的一些基因，当在缺乏对蛋白质进行糖基化的细胞过程的细菌(例如，大肠杆菌)中表达时，回收到由于缺乏糖基化而没有或几乎没有活性的蛋白质。可以通过改变氨基酸序列来实现糖基化位点的添加。肽或蛋白质的改变可以例如通过添加或置换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(用于O-连接的糖基化位点)或天冬酰胺残基(用于N-连接的糖基化位点)来进行。在每种类型中发现的N-连接和O-连接的寡糖和糖残基的结构可以是不同的。通常在两者上均发现的一种类型的糖是N-乙酰神经氨酸(下文称为唾液酸)。唾液酸通常是N-连接和O-连接的寡糖的末端残基，并且由于其负电荷，可赋予糖蛋白酸性。本公开的实施方案包括N-糖基化变体的生成和使用。可以通过化学或酶促方式或通过置换编码糖基化的氨基酸残基的密码子来完成碳水化合物的去除。化学去糖基化技术是已知的，并且可以通过使用各种内切糖苷酶和外切糖苷酶来实现多肽上碳水化合物部分的酶促切割。
用于缀合的其他合适的组分和分子包括，例如，用于靶向淋巴系统的分子，甲状腺球蛋白；诸如人血清白蛋白(HAS)的白蛋白；破伤风类毒素；白喉类毒素；诸如聚(D-赖氨酸：D-谷氨酸)的聚氨基酸；轮状病毒的VP6多肽；流感病毒血凝素，流感病毒核蛋白；匙孔戚血蓝蛋白(KLH)；以及B型肝炎病毒核心蛋白和表面抗原；或者前述的任何组合。
另一种类型的修饰是在多肽序列的N端和/或C端缀合(例如，连接)一个或多个另外的组分或分子，诸如另一种蛋白质(例如，具有与主题蛋白质异源的氨基酸序列的蛋白质)或载体分子。因此，示例性多肽序列可以作为与另一种组分或分子的缀合物提供。在一些实施方案中，白蛋白与本公开的肽或蛋白质的融合可以例如通过遗传操作实现，以使得编码HSA的DNA或其片段与编码一种或多种多肽序列的DNA连接。之后，可以用例如合适的质粒形式的融合核苷酸序列转化或转染合适的宿主，以便表达融合多肽。表达可以在体外从例如原核或真核细胞实现，或在体内从例如转基因生物体实现。在本公开的一些实施方案中，融合蛋白的表达在哺乳动物细胞系例如CHO细胞系中进行。此外，可以修饰白蛋白本身以延长其循环半衰期。通过上述遗传操作技术或通过化学缀合可以实现修饰的白蛋白与一种或多种多肽的融合；得到的融合分子具有超过未修饰白蛋白的融合体的半衰期(参见，例如，WO2011/051489)。已经开发了几种白蛋白结合策略作为直接融合的替代，包括通过缀合的脂肪酸链结合白蛋白(酰化)。由于血清白蛋白是脂肪酸的转运蛋白，这些具有白蛋白结合活性的天然配体已被用于小蛋白质治疗的半衰期延长。
用于缀合的其他候选组分和分子包括适用于分离或纯化的那些。非限制性实例包括结合分子，如生物素(生物素-亲和素特异性结合对)、抗体、受体、配体、凝集素或包含固体支持物的分子，包括例如塑料或聚苯乙烯珠子、板或珠子、磁珠、测试条和膜。诸如阳离子交换色谱法的纯化方法可以用来通过电荷差异分离缀合物，其有效地将缀合物分离成各种分子量。通过阳离子交换色谱法获得的级分的含量可以使用常规方法通过分子量来识别，例如，质谱法、SDS-PAGE或用于通过分子量分离分子实体的其他已知方法。
在一些实施方案中，本公开的肽或蛋白质序列的氨基或羧基末端可以与免疫球蛋白Fc区(例如，人Fc)融合以形成融合缀合物(或融合分子)。已经表明Fc融合缀合物增加生物药物的系统半衰期，因此生物制药产品可能需要较低频率的施用。Fc与内衬于血管的内皮细胞中的新生Fc受体(FcRn)结合，并且在结合后，保护Fc融合分子免于降解并重新释放到循环中，使分子在循环中保持更长时间。这种Fc结合被认为是内源IgG保持其长血浆半衰期的机制。与传统的Fc-融合缀合物相比，最近的Fc-融合技术将生物药物的单拷贝与抗体的Fc区连接，以优化生物药物的药代动力学和药效学性质。
本公开设想使用肽的当前已知或正在开发的其他修饰来改善一种或多种性质。这种延长本公开的肽的循环半衰期、增加稳定性、降低清除率或改变免疫原性或变应原性的方法包括通过羟乙基淀粉化(hesylation)修饰肽序列，其利用与其他分子连接的羟乙基淀粉衍生物来修饰分子的特性。例如，在申请号为2007/0134197及2006/0258607的美国专利申请中描述了羟乙基淀粉化的各个方面。
可以用多种方式测定肽稳定性。例如，肽酶和各种生物介质如人血浆和血清已经用于测定稳定性。参见，例如，Verhoef等人,Eur.J.Drug Metab.Pharmacokinetics 11:291(1986)。使用25％人血清(v/v)测定方便地测定本文所述肽的半衰期。方案如下：将合并的人血清(AB型，非热灭活的)在使用前通过离心进行破坏。然后用RPMI-1640或另一种合适的组织培养基将血清稀释至25％。以预定的时间间隔，将少量反应溶液取出并添加至6％三氯乙酸(TCA)水溶液或乙醇中。将混浊的反应样品冷却(4℃)15分钟，然后进行旋转以使沉淀的血清蛋白成团。然后使用稳定性特异性色谱条件，通过反相HPLC确定肽的存在。
可以通过各种修饰来克服与短血浆半衰期或对蛋白酶降解的易感性相关的问题，包括将肽或蛋白质序列与多种非蛋白质聚合物(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯)中的任何一种进行缀合或连接(参见，例如，通常经由与蛋白质和非蛋白质聚合物例如PEG共价结合的连接部分)。这类PEG缀合的生物分子已经显示出具有临床上有用的性质，包括更好的物理和热稳定性、防止对酶促降解的易感性、增加的溶解性、更长的体内循环半衰期和降低的清除率、降低的免疫原性和抗原性以及降低的毒性。
适合与多肽或蛋白质序列缀合的PEG通常在室温下可溶于水，并且具有通式R-(O-CH2-CH2)n-O-R，其中R为氢或保护基如烷基或烷醇基团，并且其中n为1至1000的整数。当R为保护基时，其通常具有1至8个碳。与多肽序列缀合的PEG可以是直链的或支链的。本公开设想了支链PEG衍生物、“星形-PEG”和多臂PEG。本公开还设想了缀合物的组合物，其中PEG具有不同的n值，因此各种不同的PEG以一定比例存在。例如，一些组合物包含缀合物的混合物，其中n＝1、2、3和4。在一些组合物中，n＝1的缀合物的百分比为18％-25％，n＝2的缀合物的百分比为50％-66％，n＝3的缀合物的百分比为12％-16％，n＝4的缀合物的百分比可达5％。这类组合物可以通过本领域已知的反应条件和纯化方法产生。例如，可以使用阳离子交换色谱法分离缀合物，然后识别含有附接有例如所需数目的PEG的缀合物的级分，纯化为不含未修饰的蛋白质序列且不含附接有其他数目的PEG的缀合物。
PEG可以经由末端反应性基团(“间隔体”)与本公开的肽或蛋白质结合。该间隔体是，例如，介导一个或多个多肽序列的游离氨基或羧基与PEG之间的键的末端反应性基团。具有可与游离氨基结合的间隔体的PEG包括可通过用N-羟基琥珀酰亚胺活化PEG的琥珀酸酯而制备的N-羟基琥珀酰亚胺PEG。可以与游离氨基结合的另一种活化的PEG是可以通过使PEG单甲醚与氰尿酰氯反应而制备的2,4-双(O-甲氧基聚乙二醇)-6-氯-s-三嗪。与游离羧基结合的活化的PEG包括聚氧乙烯二胺。
本公开的一个或多个肽或蛋白质序列与具有间隔体的PEG的缀合可以通过各种常规方法进行。例如，该缀合反应可以在pH为5至10的溶液中、在4℃至室温的温度下、利用4:1至30:1的试剂与肽/蛋白质的摩尔比进行30分钟至20小时。可以选择反应条件以引导反应主要产生所需的置换度。通常，低温、低pH(例如，pH＝5)和短反应时间往往减少附接的PEG的数目，而高温、中性至高pH(例如，pH>7)和更长的反应时间往往增加附接的PEG的数目。可以使用本领域已知的各种手段终止反应。在一些实施方案中，通过酸化反应混合物并在例如-20℃下冷冻来终止反应。
新表位
新表位包含被免疫系统识别的新抗原肽或新抗原多肽的新抗原决定簇部分。新表位是指不存在于诸如非病变细胞，例如非癌细胞或种系细胞等参考中，但在病变细胞，例如癌细胞中发现的表位。这包括以下情况：在正常的非病变细胞或种系细胞中发现相应的表位，但是由于在病变细胞，例如癌细胞中的一个或多个突变，该表位的序列被改变，从而产生新表位。术语“新表位”与“肿瘤特异性表位”或“肿瘤特异性新表位”在本说明书中可互换使用，用来表示通常通过相邻氨基酸的α-氨基与羧基之间的肽键彼此连接的一系列残基，通常为L-氨基酸。新表位可以是多种长度，其呈中性(不带电荷)形式或盐形式，并且不含诸如糖基化、侧链氧化或磷酸化等修饰，或者含有这些修饰，条件是该修饰不会破坏本文所述的多肽的生物活性。本公开提供了分离的新表位，其包含来自表1-12的肿瘤特异性突变。
在一些实施方案中，本文所述的用于MHC I类HLA的新表位的长度为12个氨基酸残基或更少，并且通常由约8个至约12个氨基酸残基组成。在一些实施方案中，本文所述的用于MHC I类HLA的新表位为约8、约9、约10、约11或约12个氨基酸残基。在一些实施方案中，本文所述的用于MHC II类HLA的新表位的长度为25个氨基酸残基或更少，并且通常由约9个至约25个氨基酸残基组成。在一些实施方案中，本文所述的用于MHC II类HLA的新表位为约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24或约25个氨基酸残基。
在一些实施方案中，本文所述的组合物含有包含蛋白质的第一新表位的第一肽和包含相同蛋白质的第二新表位的第二肽，其中第一肽与第二肽不同，并且其中第一新表位包含突变，且第二新表位包含相同的突变。在一些实施方案中，本文所述的组合物含有包含蛋白质的第一区域的第一新表位的第一肽和包含相同蛋白质的第二区域的第二新表位的第二肽，其中第一区域包含第二区域的至少一个氨基酸，其中第一肽与第二肽不同，并且其中第一新表位包含第一突变，且第二新表位包含第二突变。在一些实施方案中，第一突变和第二突变是相同的。在一些实施方案中，突变选自点突变、剪接位点突变、移码突变、通读突变、基因融合突变及其任意组合。
在一些实施方案中，第一新表位与I类HLA蛋白结合，以形成I类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第二新表位与II类HLA蛋白结合，以形成II类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第二新表位与I类HLA蛋白结合，以形成I类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第一新表位与II类HLA蛋白结合，以形成II类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第一新表位激活CD8+T细胞。在一些实施方案中，第一新表位激活CD4+T细胞。在一些实施方案中，第二新表位激活CD4+T细胞。在一些实施方案中，第二新表位激活CD8+T细胞。在一些实施方案中，CD4+T细胞的TCR与II类HLA-肽复合物结合。在一些实施方案中，CD8+T细胞的TCR与II类HLA-肽复合物结合。在一些实施方案中，CD8+T细胞的TCR与I类HLA-肽复合物结合。在一些实施方案中，CD4+T细胞的TCR与I类HLA-肽复合物结合。
在一些实施方案中，第二新表位长于第一新表位。在一些实施方案中，第一新表位的长度为至少8个氨基酸。在一些实施方案中，第一新表位的长度为8至12个氨基酸。在一些实施方案中，第一新表位包含至少8个连续氨基酸的序列，其中所述8个连续氨基酸中的至少1个在野生型序列的相应位置处不同。在一些实施方案中，第一新表位包含至少8个连续氨基酸的序列，其中所述8个连续氨基酸中的至少2个在野生型序列的相应位置处不同。在一些实施方案中，第二新表位的长度为至少16个氨基酸。在一些实施方案中，第二新表位的长度为16至25个氨基酸。在一些实施方案中，第二新表位包含至少16个连续氨基酸的序列，其中所述16个连续氨基酸中的至少1个在野生型序列的相应位置处不同。在一些实施方案中，第二新表位包含至少16个连续氨基酸的序列，其中所述16个连续氨基酸中的至少2个在野生型序列的相应位置处不同。
在一些实施方案中，新表位包含至少一个锚定残基。在一些实施方案中，第一新表位、第二新表位或两者包含至少一个锚定残基。在一个实施方案中，第一新表位的至少一个锚定残基在规范锚定位置或非规范锚定位置处。在另一个实施方案中，第二新表位的至少一个锚定残基在规范锚定位置或非规范锚定位置处。在又一个实施方案中，第一新表位的至少一个锚定残基不同于第二新表位的至少一个锚定残基。
在一些实施方案中，所述至少一个锚定残基是野生型残基。在一些实施方案中，所述至少一个锚定残基是置换。在一些实施方案中，至少一个锚定残基不包含该突变。
在一些实施方案中，第一或第二新表位或两者包含至少一个锚定残基侧翼区。在一些实施方案中，新表位包含至少一个锚定残基。在一些实施方案中，所述至少一个锚定残基包括至少两个锚定残基。在一些实施方案中，所述至少两个锚定残基被包含至少1个氨基酸的分隔区隔开。在一些实施方案中，所述至少一个锚定残基侧翼区不在该分隔区内。在一些实施方案中，所述至少一个锚定残基侧翼区在(a)所述至少两个锚定残基的N端锚定残基的上游；(b)所述至少两个锚定残基的C端锚定残基的下游；或(a)和(b)兼具。
在一些实施方案中，新表位结合HLA蛋白(例如，MHC I类HLA或MHC II类HLA)。在一些实施方案中，新表位以比相应的野生型肽更高的亲和力结合HLA蛋白。在一些实施方案中，新表位的IC50低于5,000nM、低于1,000nM、低于500nM、低于100nM、低于50nM或更低。在一些实施方案中，新表位可以具有约1pM至约1mM、约100pM至约500μM、约500pM至约10μM、约1nM至约1μM或约10nM至约1μM的HLA结合亲和力。在一些实施方案中，新表位可以具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1,000、1,500或2,000nM或更高的HLA结合亲和力。在一些实施方案中，新表位可以具有至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1,000、1,500或2,000nM的HLA结合亲和力。
在一些实施方案中，第一和/或第二新表位与相应野生型新表位相比以更大的亲和力与HLA蛋白结合。在一些实施方案中，第一和/或第二新表位以小于1,000nM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、250nM、150nM、100nM、50nM、25nM或10nM的KD或IC50与HLA蛋白结合。在一些实施方案中，第一和/或第二新表位以小于1,000nM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、250nM、150nM、100nM、50nM、25nM或10nM的KD或IC50与HLA I类蛋白结合。在一些实施方案中，第一和/或第二新表位以小于2,000nM、1,500nM、1,000nM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、250nM、150nM、100nM、50nM、25nM或10nM的KD或IC50与HLA II类蛋白结合。
在一些实施方案中，新表位结合至MHC I类HLA。在一些实施方案中，新表位以0.1nM至2000nM的亲和力结合至MHC I类HLA。在一些实施方案中，新表位以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000nM的亲和力结合至MHC I类HLA。在一些实施方案中，新表位结合至MHC II类HLA。在一些实施方案中，表位以0.1nM至2000nM、1nM至1000nM、10nM至500nM或小于1000nM的亲和力结合至MHCII类HLA。在一些实施方案中，新表位以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000nM的亲和力结合至MHC II类HLA。
在一些实施方案中，新表位以10分钟至24小时的稳定性结合至MHC I类HLA。在一些实施方案中，新表位以10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟的稳定性结合至MHC I类HLA。在一些实施方案中，新表位以1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时的稳定性结合至MHC I类HLA。在一些实施方案中，新表位以10分钟至24小时的稳定性结合至MHC II类HLA。在一些实施方案中，新表位以10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟的稳定性结合至MHC II类HLA。在一些实施方案中，新表位以1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时的稳定性结合至MHC II类HLA。
在一个方面，第一和/或第二新表位与由受试者表达的HLA等位基因所编码的蛋白质结合。在另一方面，在受试者的非癌细胞中不存在所述突变。在又一方面，第一和/或第二新表位由受试者的癌细胞的基因或表达基因编码。在一些实施方案中，第一新表位包含如表1至12的第1列中所描绘的突变。在一些实施方案中，第二新表位包含如表1至12的第1列中所描绘的突变。例如，第一新表位和第二新表位可以包含序列ALNSEALSVV。例如，第一新表位和第二新表位可以包含序列MALNSEALSV。
在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位来源于KRAS蛋白。在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位来源于RAS蛋白。在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位来源于包含G12C、G12D、G12V、Q61H或Q61L置换突变的KRAS蛋白。在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位源自包含Q61K或Q61R置换突变的NRAS蛋白。在一些实施方案中，新表位包含置换突变，例如KRAS G12C、G12D、G12V、Q61H或Q61L突变，或NRAS Q61K或Q61R突变。在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位源自MTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQE的KRAS或NRAS蛋白序列。例如，第一新表位和第二新表位可以包含序列KLVVVGACGV。例如，第一新表位和第二新表位可以包含序列LVVVGACGV。例如，第一新表位和第二新表位可以包含序列VVGACGVGK。例如，第一新表位和第二新表位可以包含序列VVVGACGVGK。在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位源自MTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEVVGADGVGK的KRAS或NRAS蛋白序列。例如，第一新表位和第二新表位可以包含序列VVVGADGVGK。例如，第一新表位和第二新表位可以包含序列KLVVVGADGV。例如，第一新表位和第二新表位可以包含序列LVVVGADGV。
在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位源自MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQE的KRAS或NRAS蛋白序列。例如，第一新表位和第二新表位可以包含序列KLVVVGAVGV。例如，第一新表位和第二新表位可以包含序列LVVVGAVGV。例如，第一新表位和第二新表位可以包含序列VVGAVGVGK。例如，第一新表位和第二新表位可以包含序列VVVGAVGVGK。
在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位源自AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGHEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPM的KRAS或NRAS蛋白序列。例如，第一新表位和第二新表位可以包含序列ILDTAGHEEY。
在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位源自AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGLEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPM的KRAS或NRAS蛋白序列。例如，第一新表位和第二新表位可包含序列ILDTAGLEEY。例如，第一新表位和第二新表位可以包含序列LLDILDTAGL。
在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位源自AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGKEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNSKSFADINLYREQIKRVKDSDDVPM的KRAS或NRAS蛋白序列。例如，第一新表位和第二新表位可以包含序列ILDTAGKEEY。
在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位源自AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGREEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNSKSFADINLYREQIKRVKDSDDVPM的KRAS或NRAS蛋白序列。例如，第一新表位和第二新表位可以包含序列ILDTAGREEY。
在一些实施方案中，新表位包含选自以下序列的序列：DTAGHEEY、TAGHEEYSAM、DILDTAGHE、DILDTAGH、ILDTAGHEE、ILDTAGHE、DILDTAGHEEY、DTAGHEEYS、LLDILDTAGH、DILDTAGRE、DILDTAGR、ILDTAGREE、ILDTAGRE、CLLDILDTAGR、TAGREEYSAM、REEYSAMRD、DTAGKEEYSAM、CLLDILDTAGK、DTAGKEEY、LLDILDTAGK、ILDTAGKE、ILDTAGKEE、DTAGLEEY、ILDTAGLE、DILDTAGL、ILDTAGLEE、GLEEYSAMRDQY、LLDILDTAGLE、LDILDTAGL、DILDTAGLE、DILDTAGLEEY(、AGVGKSAL、GAAGVGKSAL、AAGVGKSAL、CGVGKSAL、ACGVGKSAL、DGVGKSAL、ADGVGKSAL、DGVGKSALTI、GARGVGKSA、KLVVVGARGV、VVVGARGV、SGVGKSAL、VVVGASGVGK、GASGVGKSAL、VGVGKSAL、VVVGAGCVGK、KLVVVGAGC、GDVGKSAL、DVGKSALTI、VVVGAGDVGK、TAGKEEYSAM、DTAGHEEYSAM、TAGHEEYSA、DTAGREEYSAM、TAGKEEYSA、AAGVGKSA、AGCVGKSAL、AGDVGKSAL、AGKEEYSAMR、AGVGKSALTI、ARGVGKSAL、ASGVGKSA、ASGVGKSAL、AVGVGKSA、CVGKSALTI、DILDTAGK、DILDTAGREEY、DTAGHEEYSAMR、DTAGKEEYS、DTAGKEEYSAMR、DTAGLEEYS、DTAGLEEYSA、DTAGLEEYSAMR、DTAGREEYS、DTAGREEYSAMR、GAAGVGKSA、GACGVGKSA、GACGVGKSAL、GADGVGKS、GAGDVGKSA、GAGDVGKSAL、GASGVGKSA、GCVGKSAL、GCVGKSALTI、GHEEYSAM、GKEEYSAM、GLEEYSAMR、GREEYSAM、GREEYSAMR、HEEYSAMRD、KEEYSAMRD、KLVVVGASG、LDILDTAGR、LEEYSAMRD、LVVVGARGV、LVVVGASGV、REEYSAMRDQY、RGVGKSAL、TAGLEEYSA、TEYKLVVVGAA、VGAAGVGKSA、VGADGVGK、VGASGVGKSA、VGVGKSALTI、VVVGAAGV、VVVGAVGV、YKLVVVGAC、YKLVVVGAD、YKLVVVGAR和DILDTAGKE。
在一些实施方案中，新表位包含RAS表位。在一些实施方案中，新表位包含突变RAS肽序列，RAS肽序列包含突变RAS蛋白的至少8个连续的氨基酸，突变RAS蛋白包含在G12、G13或Q61处的突变和在G12、G13或Q61处的突变。在一些实施方案中，包含在G12、G13或Q61处突变的突变RAS蛋白的至少8个连续氨基酸包含G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61H、Q61L、Q61K或Q61R突变。在一些实施方案中，G12、G13或Q61处的突变包含G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61H、Q61L、Q61K或Q61R突变。
在一些实施方案中，包含突变RAS序列的新表位包含GADGVGKSAL、GACGVGKSAL、GAVGVGKSAL、GADGVGKSA、GACGVGKSA、GAVGVGKSA、KLVVVGACGV、FLVVVGACGL、FMVVVGACGI、FLVVVGACGI、FMVVVGACGV、FLVVVGACGV、MLVVVGACGV、FMVVVGACGL、YLVVVGACGV、KMVVVGACGV、YMVVVGACGV、MMVVVGACGV、DTAGHEEY、TAGHEEYSAM、DILDTAGHE、DILDTAGH、ILDTAGHEE、ILDTAGHE、DILDTAGHEEY、DTAGHEEYS、LLDILDTAGH、DILDTAGRE、DILDTAGR、ILDTAGREE、ILDTAGRE、CLLDILDTAGR、TAGREEYSAM、REEYSAMRD、DTAGKEEYSAM、CLLDILDTAGK、DTAGKEEY、LLDILDTAGK、ILDTAGKE、ILDTAGKEE、DTAGLEEY、ILDTAGLE、DILDTAGL、ILDTAGLEE、GLEEYSAMRDQY、LLDILDTAGLE、LDILDTAGL、DILDTAGLE、DILDTAGLEEY(、AGVGKSAL、GAAGVGKSAL、AAGVGKSAL、CGVGKSAL、ACGVGKSAL、DGVGKSAL、ADGVGKSAL、DGVGKSALTI、GARGVGKSA、KLVVVGARGV、VVVGARGV、SGVGKSAL、VVVGASGVGK、GASGVGKSAL、VGVGKSAL、VVVGAGCVGK、KLVVVGAGC、GDVGKSAL、DVGKSALTI、VVVGAGDVGK、TAGKEEYSAM、DTAGHEEYSAM、TAGHEEYSA、DTAGREEYSAM、TAGKEEYSA、AAGVGKSA、AGCVGKSAL、AGDVGKSAL、AGKEEYSAMR、AGVGKSALTI、ARGVGKSAL、ASGVGKSA、ASGVGKSAL、AVGVGKSA、CVGKSALTI、DILDTAGK、DILDTAGREEY、DTAGHEEYSAMR、DTAGKEEYS、DTAGKEEYSAMR、DTAGLEEYS、DTAGLEEYSA、DTAGLEEYSAMR、DTAGREEYS、DTAGREEYSAMR、GAAGVGKSA、GACGVGKSA、GACGVGKSAL、GADGVGKS、GAGDVGKSA、GAGDVGKSAL、GASGVGKSA、GCVGKSAL、GCVGKSALTI、GHEEYSAM、GKEEYSAM、GLEEYSAMR、GREEYSAM、GREEYSAMR、HEEYSAMRD、KEEYSAMRD、KLVVVGASG、LDILDTAGR、LEEYSAMRD、LVVVGARGV、LVVVGASGV、REEYSAMRDQY、RGVGKSAL、TAGLEEYSA、TEYKLVVVGAA、VGAAGVGKSA、VGADGVGK、VGASGVGKSA、VGVGKSALTI、VVVGAAGV、VVVGAVGV、YKLVVVGAC、YKLVVVGAD、YKLVVVGAR或DILDTAGKE的氨基酸序列。
在一些实施方案中，包含突变RAS序列的新表位结合至由HLA等位基因编码的蛋白质。在一些实施方案中，包含突变RAS序列的新表位以小于10μM、小于9μM、小于8μM、小于7μM、小于6μM、小于5μM、小于4μM、小于3μM、小于2μM、小于1μM、小于950nM、小于900nM、小于850nM、小于800nM、小于750nM、小于600nM、小于550nM、小于500nM、小于450nM、小于400nM、小于350nM、小于300nM、小于250nM、小于200nM、小于150nM、小于100nM、小于90nM、小于80nM、小于70nM、小于60nM、小于50nM、小于40nM、小于30nM、小于20nM或小于10nM的亲和力结合由HLA等位基因编码的蛋白质。在一些实施方案中，包含突变RAS序列的新表位以大于24小时、大于23小时、大于22小时、大于21小时、大于20小时、大于19小时、大于18小时、大于17小时、大于16小时、大于15小时、大于14小时、大于13小时、大于12小时、大于11小时、大于10小时、大于9小时、大于8小时、大于7小时、大于6小时、大于5小时、大于4小时、大于3小时、大于2小时、大于1小时、大于55分钟、大于50分钟、大于45分钟、大于40分钟、大于35分钟、大于30分钟、大于25分钟、大于20分钟、大于15分钟、大于10分钟、大于9分钟、大于8分钟、大于7分钟、大于6分钟、大于5分钟、大于4分钟、大于3分钟、大于2分钟或大于1分钟的稳定性结合至由HLA等位基因编码的蛋白质。
置换可位于新表位长度上的任何位置。例如，它可以位于该肽的N端三分之一、该肽的中央三分之一或该肽的C端三分之一。在另一个实施方案中，置换的残基位于距N端2-5个残基处，或距C端2-5个残基处。所述肽可类似地衍生自肿瘤特异性插入突变，其中所述肽包含一个或多个或所有插入的残基。
在一些实施方案中，本文所述的肽可以使用不含污染细菌或动物物质的试剂轻松化学合成(Merrifield RB:Solid phase peptide synthesis.I.The synthesis of atetrapeptide.J.Am.Chem.Soc.85:2149-54,1963)。在一些实施方案中，通过以下步骤制备肽：(1)使用均匀合成和切割条件在多通道仪器上平行固相合成；(2)采用柱洗出在RP-HPLC柱上纯化；以及在肽之间重新洗涤，但不替代；随后(3)使用有限的一组最具信息性的试验进行分析。良好生产规范(GMP)足迹可以针对个体患者的一组肽来定义，因此仅在针对不同患者的肽的合成之间需要适当的转换程序。在一些实施方案中，可以使用任何用于固相肽合成的树脂。
多核苷酸
或者，编码本公开的肽的核酸(例如，多核苷酸)可以用来在体外产生新抗原多肽。该多核苷酸可以是，例如，单链和/或双链的DNA、cDNA、RNA，或天然或稳定化形式的多核苷酸，例如具有硫代磷酸骨架的多核苷酸，或其组合，并且它可以含有或者可以不含内含子，只要它编码该肽即可。在一些实施方案中，利用体外翻译来产生肽。
本文提供了编码本公开中描述的每种新抗原多肽的新抗原多核苷酸。术语“多核苷酸”、“核苷酸”或“核酸”与“突变多核苷酸”、“突变核苷酸”、“突变核酸”、“新抗原多核苷酸”、“新抗原核苷酸”或“新抗原突变核酸”在本公开中可互换使用。由于遗传密码的冗余性，各种核酸序列可以编码相同的肽。这些核酸中的每一种都落入本公开的范围内。编码肽的核酸可以是DNA或RNA，例如mRNA，或DNA和RNA的组合。在一些实施方案中，编码肽的核酸序列是自扩增mRNA(Brito等人,Adv.Genet.2015；89:179-233)。编码本文所述肽的任何合适的多核苷酸都落入本公开的范围内。
在一些实施方案中，两个连续抗原肽的编码序列被间隔体或接头分开。在一些实施方案中，两个连续抗原肽的编码序列彼此相邻。在一些实施方案中，两个连续抗原肽的编码序列不被间隔体或接头分开。
在一些实施方案中，间隔体或接头包含至多5000个核苷酸残基。示例性间隔体序列为GGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGC。
另一个示例性间隔体序列为GGCGGCAGCCTGGGCGGCGGCGGCAGCGGC。另一个示例性间隔体序列为GGCGTCGGCACC。另一个示例性间隔体序列为CAGCTGGGCCTG。另一个示例性间隔体是一编码赖氨酸的序列，例如AAA或AAG。另一个示例性间隔体序列为CAACTGGGATTG。
在一些实施方案中，mRNA包含一种或多种额外的结构以增强APC的抗原表位处理和呈递。
在一些实施方案中，接头或间隔体可以含有裂解位点。裂解位点确保将包含表位序列串的蛋白质产物裂解成用于呈递的单独的表位序列。优选的裂解位点位于某些表位附近，以避免序列内表位的无意裂解。在一些实施方案中，表位和编码表位串的mRNA上的裂解区域的设计是非随机的。
术语“RNA”包括并且在一些实施方案中涉及“mRNA”。术语“mRNA”意指“信使RNA”，并且涉及通过使用DNA模板而产生的并编码肽或多肽的“转录物”。通常，mRNA包含5’-UTR、蛋白质编码区和3’-UTR。mRNA在细胞中和在体外仅具有有限的半衰期。在一些实施方案中，该mRNA是自扩增mRNA。在本公开的上下文中，mRNA可以通过DNA模板的体外转录生成。体外转录方法是技术人员已知的。例如，多种体外转录试剂盒可商购获得。
可以根据需要改变RNA的稳定性和翻译效率。例如，RNA可以被稳定化，并且其翻译通过一种或多种具有稳定作用和/或提高RNA翻译效率的修饰而增加。例如，在PCT/EP2006/009448中描述了这样的修饰，该文献通过引用并入本文。为了增加根据本公开使用的RNA的表达，可以在编码区(即编码表达的肽或蛋白质的序列)内修饰该RNA，而不改变表达的肽或蛋白质的序列，从而增加GC含量以增加mRNA稳定性并进行密码子优化，从而增强在细胞中的翻译。
在本公开中使用的RNA语境中的术语“修饰”包括对RNA的任何修饰，该修饰在所述RNA中不是天然存在的。在一些实施方案中，该RNA不具有未加帽的5’-三磷酸。通过用磷酸酶处理RNA可以除去这样的未加帽的5’-三磷酸。在其他实施方案中，该RNA可以具有修饰的核糖核苷酸，以增加其稳定性和/或降低细胞毒性。在一些实施方案中，5-甲基胞苷可以在RNA中部分或完全置换，例如胞苷。任选地，假尿苷部分或完全置换，例如尿苷。
在一些实施方案中，术语“修饰”涉及提供具有5’-帽或5’-帽类似物的RNA。术语“5’-帽”是指在mRNA分子的5’端上发现的帽结构，并且通常由经由不寻常的5’至5’三磷酸键与mRNA连接的鸟苷核苷酸组成。在一些实施方案中，这种鸟苷在7位上被甲基化。术语“常规5’-帽”是指天然存在的RNA 5’-帽、7-甲基鸟苷帽(m G)。在本公开的上下文中，术语“5’-帽”包括类似于RNA帽结构的5’-帽类似物，并且被修饰为具有稳定RNA和/或增强体内和/或细胞内的RNA翻译(如果与RNA附接)的能力。
在某些实施方案中，将编码本公开的新抗原肽的mRNA施用于有需要的受试者。在一些实施方案中，本公开提供了包含修饰的核苷的RNA、寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸分子，包含修饰的核苷的基因治疗载体，包含修饰的基因治疗方法和核苷的基因转录沉默方法。在一些实施方案中，待施用的mRNA包含至少一个修饰的核苷。
编码本文所述的肽的多核苷酸可以通过化学技术合成，例如，Matteucci等人,J.Am.Chem.Soc.103:3185(1981)的磷酸三酯方法。编码包含类似物或由类似物组成的肽的多核苷酸可以简单地通过用合适的和期望的核酸碱基置换编码天然表位的那些碱基来制备。
在一些实施方案中，所述多核苷酸可包含肽或蛋白质的编码序列，该编码序列在相同阅读框中融合至有助于例如从宿主细胞表达和/或分泌该肽或蛋白质的多核苷酸(例如，起到控制多肽从细胞转运的分泌序列的作用的前导序列)。具有前导序列的多肽是前蛋白，并且可以具有被宿主细胞切割以形成多肽的成熟形式的前导序列。
在一些实施方案中，所述多核苷酸可包含肽或蛋白质的编码序列，该编码序列在相同的阅读框中融合至允许例如纯化编码的肽的标志物序列，然后可以将其并入个性化的疾病疫苗或免疫原性组合物中。例如，在细菌宿主的情况下，该标记序列可以是由pQE-9载体提供的六组氨酸标签，以提供与标志物融合的成熟多肽的纯化，或者当使用哺乳动物宿主(例如，COS-7细胞)时，该标志物序列可以是来源于流感血凝素蛋白的血凝素(HA)标签。其他标签包括但不限于钙调蛋白标签、FLAG标签、Myc标签、S标签、SBP标签、Softag 1、Softag 3、V5标签、Xpress标签、Isopeptag、SpyTag、生物素羧基载体蛋白(BCCP)标签、GST标签、荧光蛋白标签(例如，绿色荧光蛋白标签)、麦芽糖结合蛋白标签、Nus标签、Strep-标签、硫氧还蛋白标签、TC标签、Ty标签等。
在一些实施方案中，所述多核苷酸可包含在相同阅读框中融合的一种或多种当前描述的肽或蛋白质的编码序列，以创建能够产生多种新抗原肽的单个多联新抗原肽构建体。
在一些实施方案中，使用重组技术通过分离或合成编码目的野生型蛋白质的DNA序列来构建DNA序列。任选地，可以通过位点特异性诱变来诱变序列，以提供其功能类似物。参见，例如，Zoeller等人,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 81:5662-5066(1984)和美国专利4,588,585。在另一实施方案中，使用寡核苷酸合成仪通过化学合成构建编码目的肽或蛋白质的DNA序列。可以基于所需肽的氨基酸序列设计这样的寡核苷酸，并选择在产生目的重组多肽的宿主细胞中有利的那些密码子。可以应用标准方法合成编码分离的目的多肽的分离的多核苷酸序列。例如，完整的氨基酸序列可以用来构建反向翻译的基因。此外，可以合成含有编码特定分离多肽的核苷酸序列的DNA寡聚体。例如，可以合成编码所需多肽的部分的几种小寡核苷酸，然后将其连接。单个寡核苷酸通常含有用于互补装配的5'或3'突出端。
一旦装配(例如，通过合成、定点诱变或另一种方法)，将编码特定分离的目的多肽的多核苷酸序列插入表达载体中，并任选地将其可操作地连接至适合于在所需宿主中表达蛋白质的表达控制序列。可以通过核苷酸测序、限制酶切作图和生物活性多肽在合适宿主中的表达来证实正确的装配。如本领域公知的，为了在宿主中获得转染基因的高表达水平，该基因可以可操作地连接至在所选表达宿主中起作用的转录和翻译表达控制序列。因此，本公开还涉及可用于产生和施用本文所述的新抗原多肽和新表位的载体和表达载体，以及包含这类载体的宿主细胞。
在一些实施方案中，还可以制备能够表达如本文所述的肽或蛋白质的表达载体。用于不同细胞类型的表达载体是本领域公知的，并且可以在无需过多试验的情况下进行选择。通常，将DNA以适当的方向和正确的阅读框插入表达载体如质粒中以供表达。如有必要，DNA可以连接至被期望的宿主(例如细菌)识别的适当的转录和翻译调节控制核苷酸序列，尽管这样的控制通常可在表达载体中获得。然后使用标准技术将载体引入宿主细菌中以供克隆(参见，例如，Sambrook等人(1989)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)。
适合于产生和施用本文所述的新抗原多肽的大量载体和宿主系统是本领域技术人员已知的，并且是可商购获得的。举例来说，提供以下载体。细菌：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；pCR(Invitrogen)。真核生物：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)；p75.6(Valentis)；pCEP(Invitrogen)；pCEI(Epimmune)。然而，可以使用其他任何质粒或载体，只要它在宿主中是可复制且可存活的。
编码本文所述的新抗原肽的多核苷酸还可以包含泛素化信号序列，和/或靶向序列，如内质网(ER)信号序列，以促进所得肽向内质网中的移动。
在一些实施方案中，本文所述的新抗原肽还可以通过病毒或细菌载体进行施用/表达。表达载体的实例包括减毒病毒宿主，如牛痘或禽痘。可用于免疫方案的痘苗病毒载体和方法在美国专利4,722,848中描述。另一种载体是BCG(卡介苗)。Stover等人,Nature351:456-460(1991)描述了BCG载体。根据本文的描述，可用于本文所述新抗原多肽的治疗性施用或免疫的多种其他载体，例如腺病毒和腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌载体、解毒炭疽毒素载体、仙台病毒载体、痘病毒载体、金丝雀痘载体等，对本领域技术人员来说将是显而易见的。在一些实施方案中，该载体是修饰的安卡拉牛痘(VacciniaAnkara(VA))(例如，Bavarian Noridic(MVA-BN))。
也有利地采用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达重组蛋白。可以进行重组蛋白在哺乳动物细胞中的表达，因为这类蛋白质通常被正确折叠、适当修饰并且是完全功能性的。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括由Gluzman(Cell 23:175,1981)描述的猴肾细胞的COS-7系，以及能够表达适当载体的其他细胞系，包括，例如，L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、293、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可包含非转录的元件，如复制起点，与待表达的基因连接的合适的启动子和增强子，以及其他5'或3'侧翼非转录序列，以及5'或3'非翻译序列，如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和接受体位点以及转录终止序列。Luckow和Summers,Bio/Technology 6:47(1988)综述了用于在昆虫细胞中产生异源蛋白质的杆状病毒系统。
用载体对宿主细胞进行遗传工程化(转导或转化或转染)，所述载体可以是例如克隆载体或表达载体。该载体可以是，例如，质粒、病毒小体、噬菌体等形式。工程化宿主细胞可以在适当改变的常规营养培养基中培养以用于激活启动子、选择转化子或扩增多核苷酸。诸如温度、pH等培养条件是先前与被选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于普通技术人员是显而易见的。
作为适当宿主的代表性实例，可以提及：细菌细胞，如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)内的各个种；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，如果蝇和Sf9；动物细胞，如在Gluzman,Cell23:175(1981)中描述的COS-7猴肾成纤维细胞系，以及能够表达相容性载体的其他细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系或鲍斯黑素瘤(Bowes melanoma)；植物细胞等。根据本文的教导，适当宿主的选择被认为在本领域技术人员的能力范围内。
本文所述的多核苷酸可以在人类细胞(例如，免疫细胞，包括树突细胞)中施用和表达。可以使用人密码子使用表来指导每种氨基酸的密码子选择。这样的多核苷酸包含表位和/或类似物之间的间隔氨基酸残基，诸如上述那些，或者可以包含与表位和/或类似物(和/或CTL(例如CD8+)、Th(例如CD4+)和B细胞表位)相邻的天然存在的侧翼序列。
载体中可以包含本领域技术人员熟知的标准调节序列以确保在人靶细胞中表达。需要几种载体元件：具有多核苷酸的下游克隆位点的启动子，例如小基因插入；用于有效转录终止的聚腺苷酸化信号；大肠杆菌复制起点；以及大肠杆菌选择性标记(例如氨苄青霉素或卡那霉素抗性)。许多启动子可以用于此目的，例如人巨细胞病毒(hCMV)启动子。关于其他合适的启动子序列，参见，例如，美国专利5,580,859和5,589,466。在一些实施方案中，该启动子是CMV-IE启动子。
可以通过许多不同的方法将载体引入动物组织中。两种最常用的方法是使用标准皮下注射针在盐水中注射DNA以及基因枪递送。在Scientific American(Weiner等人(1999)Scientific American 281(1):34–41)中说明了DNA疫苗质粒构建及其随后通过这两种方法递送到宿主中的示意性概述。盐水中的注射通常在骨骼肌中肌肉内(IM)或皮内(ID)进行，或将DNA递送至细胞外空间。这可以由电穿孔通过肌肉毒素如布比卡因暂时损伤肌肉纤维来辅助；或者通过使用盐水或蔗糖的高渗溶液来辅助(Alarcon等人(1999).Adv.Parasitol.Advances in Parasitology42:343–410)。对这种递送方法的免疫应答可能受许多因素的影响，包括针类型、针排列、注射速度、注射量、肌肉类型以及所注射动物的年龄、性别和生理状况(Alarcon等人(1999).Adv.Parasitol.Advances in Parasitology42:343–410)。
另一种常用的递送方法——基因枪递送，使用压缩氦气作为促进剂，以弹道学方式加速已经吸附到金或钨微粒上的质粒DNA(pDNA)进入靶细胞(Alarcon等人(1999).Adv.Parasitol.Advances in Parasitology42:343–410；Lewis等人(1999).Advances inVirus Research(Academic Press)54:129–88)。
替代的递送方法可包括在粘膜表面如鼻粘膜和肺粘膜上气雾剂滴注裸DNA(Lewis等人(1999).Advances in Virus Research(Academic Press)54:129–88)以及将pDNA局部施用到眼睛粘膜和阴道粘膜(Lewis等人(1999)Advances in Virus Research(AcademicPress)54:129–88)。使用阳离子脂质体-DNA制剂、可生物降解的微球、用于口服施用至肠粘膜的减毒志贺氏杆菌或李斯特杆菌载体以及重组腺病毒载体也已实现了粘膜表面递送。在轻微机械破坏细胞膜，暂时使细胞透化后，DNA或RNA也可以被递送至细胞。膜的这种温和的机械破坏可以通过轻微地迫使细胞通过小孔来完成(Sharei等人,Ex Vivo CytosolicDelivery of Functional Macromolecules to Immune Cells,PLOS ONE(2015))。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人造膜囊泡)。在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。“脂质体”是通用术语，其包括通过生成封闭的脂质双层或聚集体而形成的多种单层和多层脂质媒介物。脂质体的特征可以在于具有囊泡结构，该囊泡结构具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有由水性介质隔开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，多层脂质体自发形成。脂质组分在形成闭合结构之前经历自重排，并在脂质双层之间捕获水和溶解的溶质(Ghosh等人,Glycobiology 5:505-10(1991))。然而，还包括在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了脂质转染胺-核酸复合物。
考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(在体外、离体或体内)。在另一方面，核酸可以与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可以包封在脂质体的水性内部中、散布在脂质体的脂质双层内、经由与脂质体和寡核苷酸二者缔合的连接分子附接于脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质结合、作为悬浮液包含在脂质中、包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物不限于在溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、胶束或“坍缩”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪小液滴，以及含有长链脂族烃及其衍生物的一类化合物，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。适合使用的脂质可以从商业来源获得。在氯仿或氯仿/甲醇中的脂质储备溶液可以在约-20℃储存。由于氯仿比甲醇更容易蒸发，氯仿用作唯一溶剂。
4.抗原呈递细胞(APC)
抗原呈递细胞(APC)将与MHC分子缔合的蛋白质抗原的肽片段呈递到其的细胞表面上。呈递的肽与MHC分子以肽-MHC复合物(pMHC)的形式在APC的细胞表面缔合。肽-MHC复合物的处理和呈递可包括一系列连续的阶段，包括：蛋白酶介导的蛋白质消化；由与抗原处理相关的转运蛋白(TAP)介导的肽向内质网(ER)的转运；使用新合成的MHC分子形成肽-MHCI分子；以及肽-MHC分子向细胞表面的转运。
一些APC可以激活抗原特异性T细胞。例如，包含与pMHC相互作用的T细胞受体(TCR)的T细胞可以在TCR-pMHC形成后被激活、刺激、诱导或扩增。在一些实施方案中，APC的MHC(例如，I类MHC或II类MHC)可以负载肽，并通过将编码包含待呈递的肽序列的抗原肽或多肽的核酸(例如，RNA)引入APC而由APC呈递。
从生物学的角度来看，为了使体细胞突变产生免疫应答，需要满足几个标准：含有突变的等位基因应由细胞表达，突变应在蛋白质编码区和非同义区，翻译的蛋白质应由蛋白酶体或其他细胞蛋白质降解途径裂解并且含有突变的表位应由MHC复合物呈递，所呈递的表位应由TCR识别，最后，TCR-pMHC复合物应启动激活T细胞的信号级联放大。
单核细胞可以在血流中循环，然后移动到组织中，在组织中其可以分化成巨噬细胞和树突细胞。通常典型单核细胞的特征在于CD14细胞表面受体的高水平表达。单核细胞和B细胞可以是感受态APC，尽管它们的抗原呈递能力似乎限于之前的致敏的T细胞的再活化。这些细胞类型可能不能直接激活功能上幼稚或未致敏的T细胞群。专职抗原呈递细胞通过吞噬作用或受体介导的内吞作用非常有效地内化抗原，然后在其膜上展示结合至MHC分子的抗原片段。T细胞识别APC膜上的抗原-MHC分子复合物并与其相互作用。然后另外的共刺激信号通过APC产生，导致T细胞活化。共刺激分子的表达是专职APC的典型特征。
专职APC通过吞噬作用或受体介导的内吞作用非常有效地内化抗原，然后在其膜上展示结合至MHC分子的抗原片段。T细胞识别APC膜上的抗原-MHC分子复合物并与其相互作用。然后另外的共刺激信号可通过APC产生，导致T细胞活化。共刺激分子的表达可以是专职专职抗原呈递细胞的典型特征。专职APC的实例可包括但不限于树突细胞(DC)、巨噬细胞和B细胞。专职APC可表达高水平的MHC II类、ICAM-1和B7-2。
专职APC的主要类型之一是DC，其具有最广泛的抗原呈递范围。专职APC的其他主要类型包括巨噬细胞、B细胞和某些激活的上皮细胞。DC是白细胞群，其通过MHC II类和I类抗原呈递途径将抗原(例如外周组织中捕获的抗原)呈递至T细胞。DC能够激活幼稚和之前致敏的T细胞(例如记忆T细胞)。DC可以是白细胞群，其通过MHC I类和II类抗原呈递途径将外周组织中捕获的抗原呈递至T细胞。DC可以是免疫应答的有效诱导剂，并且这些细胞的激活可以是诱导抗肿瘤免疫的关键步骤。
DC可以被分类为“未成熟”和“成熟”细胞，这可以用作区分两种充分表征的表型的简单方法。然而，该命名法不应被解释为排除分化的所有可能的中间阶段。未成熟DC的特征可以是具有高抗原摄入和处理能力的APC，这与Fcγ受体和甘露糖受体的高表达相关。成熟表型的特征通常可在于这些标记物的表达较低，但高表达负责T细胞活化的细胞表面分子如I类和II类MHC、粘附分子(例如CD54和CD11)和共刺激分子(例如CD40、CD80、CD86和4-1BB)。成熟DC可以是CD11b+、CD11c+、HLA-DR+、CD80+、CD86+、CD54+、CD3-、CD19-、CD14-、CD141+(BDCA-3)和/或CD1a+。DC成熟可以被称为DC活化状态，在该状态下，此类抗原呈递DC导致T细胞引发，而未成熟DC的呈递则导致耐受。DC成熟可由以下项引起：具有由先天受体检测的微生物学特征的生物分子(例如细菌DNA、病毒RNA、内毒素等)、促炎细胞因子(例如TNF、白介素和干扰素)、通过CD40L将CD40与DC表面的连接，以及经历细胞死亡的细胞释放的物质。可诱导DC成熟的细胞因子的其他非限制性实例包括IL-4、GM-CSF、TNF-α、IL-1β、PGE1和IL-6。例如，DC可以通过在体外将骨髓细胞与细胞因子如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)一起培养而衍生。例如，DC可以源自分离自PBMC的CD14+单核细胞。可用于将单核细胞衍生为DC的细胞因子或生长因子包括但不限于GM-CSF、IL-4、FLT3L、TNF-α、IL-1β、PGE1、IL-6、IL-7、IFN-α、R848、LPS、ss-RNA40和polyI:C。
通常，非专职抗原呈递细胞不会结构性地表达MHC II类蛋白。MHC II类蛋白通常仅在通过某些如IFN-γ的细胞因子刺激非专职APC时进行表达。
APC的来源通常可以是包含能够在体外表达和呈递抗原肽的APC或APC前体的组织来源。在一些实施方案中，当负载靶RNA和/或用必需的细胞因子或因子处理时，APC能够增殖并成为专职APC。
一方面，所述抗原多肽或蛋白可以作为含有本文所述的此类多肽、肽、蛋白质或多核苷酸的细胞提供。在一些实施方案中，细胞是抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，细胞是树突细胞(DC)。在一些实施方案中，细胞是成熟抗原呈递细胞。在一些实施方案中，新抗原肽或蛋白质可以作为包含如本文所述的此类多肽、肽、蛋白质或多核苷酸的APC(例如树突细胞)提供。在其他实施方案中，此类APC被用于刺激供患者使用的T细胞。因此，本公开的一个实施方案是一种组合物，其含有用一种或多种本文所述新抗原肽或多核苷酸脉冲或负载的至少一种APC(例如树突细胞)。在一些实施方案中，这样的APC是自体的(例如，自体树突细胞)。或者，从患者中分离的外周血单核细胞(PBMC)可以离体负载新抗原肽或多核苷酸。在相关实施方案中，将这样的APC或PBMC注射回患者体内。在一些实施方案中，APC是树突细胞。在相关实施方案中，该树突细胞是用新抗原肽或核酸脉冲的自体树突细胞。该新抗原肽可以是产生适当T细胞应答的任何合适的肽。使用以来自肿瘤相关抗原的肽脉冲的自体树突细胞的T细胞治疗在Murphy等人(1996)The Prostate 29,371-380和Tjua等人(1997)The Prostate 32,272-278中公开。在一些实施方案中，该T细胞是CTL(例如CD8+)。在一些实施方案中，该T细胞是辅助L淋巴细胞(Th(例如CD4+))。
在一些实施方案中，本公开提供了一种组合物，其包含也可以施用于受试者的基于细胞的免疫原性药物组合物。例如，基于APC的免疫原性药物组合物可以使用如本领域所理解的任何已知的技术、载体和赋形剂配制。APC包括单核细胞、单核细胞衍生的细胞、巨噬细胞和树突细胞。有时，基于APC的免疫原性药物组合物可以是基于树突细胞的免疫原性药物组合物。
基于树突细胞的免疫原性药物组合物可通过本领域已知的任何方法制备。在一些情况下，可以通过离体或体内方法制备基于树突细胞的免疫原性药物组合物。该离体方法可包括使用以本文所述的多肽离体脉冲的自体DC，以在施用于患者之前激活或负载DC。该体内方法可包括使用与本文所述的多肽相偶联的抗体靶向特异性DC受体。基于DC的免疫原性药物组合物可以进一步包含DC激活剂，如TLR3、TLR-7-8和CD40激动剂。基于DC的免疫原性药物组合物可以进一步包含佐剂和药学上可接受的载体。
抗原呈递细胞(APC)可以从多种来源制备，包括人和非人灵长类动物、其他哺乳动物和脊椎动物。在某些实施方案中，APC可以从人或非人类脊椎动物的血液制备。也可以从富集的白细胞群体中分离APC。白细胞群体可以通过本领域技术人员已知的方法制备。这样的方法通常包括收集肝素化血液、单采血液分离术或白细胞去除术、血沉棕黄层的制备、玫瑰花结、离心、密度梯度离心(例如，使用Ficoll、硅胶和蔗糖)、差异裂解非白细胞的细胞和过滤。也可以通过从受试者收集血液、除纤以去除血小板并溶解红细胞来制备白细胞群体。白细胞群体可任选地富集单核树突细胞前体。
根据白细胞富集群体的所需用途，可以从多种受试者中获得血细胞群体。该受试者可以是健康受试者。或者，可以从需要免疫刺激的受试者(例如，癌症患者或其他免疫刺激对其有益的患者)获得血细胞。同样，可从需要免疫抑制的受试者，例如患有自身免疫性疾病(例如类风湿性关节炎、糖尿病、狼疮、多发性硬化等)的患者获得血细胞。也可以从HLA匹配的健康个体获得白细胞群体。
当使用血液作为APC的来源时，可以使用维持其活力的常规方法获得血液白细胞。根据本公开的一个方面，可以将血液稀释到可以含有或可以不含肝素或其他合适的抗凝剂的介质中。血液与介质的体积可以约为1比1。可以通过在4℃下以大约1,000rpm(150g)在介质中离心血液来浓缩细胞。可以通过将细胞重悬于本领域已知的任何会溶解红细胞的溶液例如氯化铵中，而消除血小板和红细胞。例如，混合物可以是体积比约为1:1的介质和氯化铵。可以通过离心浓缩细胞，并在所需溶液中洗涤，直到获得基本不含血小板和红细胞的白细胞群体。组织培养中常用的任何等渗溶液都可以用作从血小板和红细胞中分离白细胞的介质。这样的等渗溶液的实例可以是磷酸盐缓冲盐水、Hanks平衡盐溶液和完全生长培养基。APC和/或APC前体细胞也可以通过淘洗来纯化。
在一个实施方案中，APC可以是炎性或其他激活条件下的非标称APC。例如，非标称APC可包括用干扰素-γ刺激的上皮细胞、T细胞、B细胞和/或被诱导APC活性的因子或条件激活的单核细胞。可以根据本领域已知的方法来制备这类非标称APC。
根据APC的类型，可以根据需要对APC进行培养、扩充、分化和/或成熟。可以在任何合适的培养容器，例如培养板、烧瓶、培养袋和生物反应器中培养APC。
在某些实施方案中，可以在合适的培养基或生长培养基中培养APC，以维持和/或扩大制品中APC的数目。可以根据分离的APC的类型选择培养基。例如，成熟的APC，如成熟的树突细胞，可以在适合其维持和扩充的生长培养基中培养。培养基可以补充有氨基酸、维生素、抗生素、二价阳离子等。另外，细胞因子、生长因子和/或激素可包含在生长培养基中。例如，为了维持和/或扩充成熟的树突细胞，可以添加细胞因子，如粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和/或白介素4(IL-4)。在其他实施方案中，可以培养和/或扩充未成熟的APC。未成熟的树突细胞可以保留摄取靶mRNA和加工新抗原的能力。在一些实施方案中，未成熟的树突细胞可以在适于其维持和培养的培养基中培养。培养基可以补充有氨基酸、维生素、抗生素、二价阳离子等。另外，细胞因子、生长因子和/或激素可包含在生长培养基中。
其他未成熟的APC可以类似地进行培养或扩充。未成熟的APC的制品可以被成熟以形成成熟的APC。APC的成熟可以在暴露于新抗原肽期间或之后发生。在某些实施方案中，未成熟树突细胞的制品可以成熟。合适的成熟因子包括，例如，细胞因子TNF-α、细菌产物(例如，BCG)等。在另一个方面，分离的APC前体可用来制备未成熟APC的制品。APC前体可以进行培养、分化和/或成熟。在某些实施方案中，单核树突细胞前体可在补充有氨基酸、维生素、细胞因子和/或二价阳离子的合适培养基的存在下培养，以促进单核树突细胞前体向未成熟树突细胞的分化。在一些实施方案中，APC前体是从PBMC分离的。PBMC可以获自供体，例如人类供体，并且可以新鲜使用或冷冻以备将来使用。在一些实施方案中，APC由一种或多种APC制品制备。在一些实施方案中，APC包括负载有包含第一和第二新表位的第一和第二新抗原肽或编码包含第一和第二新表位的第一和第二新抗原肽的多核苷酸的APC。在一些实施方案中，APC是自体APC、同种异体APC或人工APC。
5.佐剂
佐剂可用来增强在接受本文提供的组合物的患者中引发的免疫应答(体液和/或细胞应答)。有时，佐剂可引发Th1型应答。其他时候，佐剂可引发Th2型应答。Th1型应答的特征可在于产生诸如IFN-γ等细胞因子，相反，Th2型应答的特征可在于产生诸如IL-4、IL-5和IL-10等细胞因子。
在一些方面，基于脂质的佐剂，如MPLA和MDP，可以与本文公开的免疫原性药物组合物一起使用。例如，单磷酰脂质A(MPLA)是引起脂质体抗原向特异性T淋巴细胞的呈递增加的佐剂。另外，胞壁酰二肽(MDP)也可以作为合适的佐剂与本文所述的免疫原性药物制剂一起使用。
合适的佐剂是本领域已知的(参见WO2015/095811)，并且包括但不限于聚(I:C)、聚-ICLC、Hiltonol、STING激动剂、1018ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂质A、Montanide IMS 1312、MontanideISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、
Figure BDA0003504116290001421
载体系统、PLG微粒、瑞喹莫德、SRL172、病毒小体和其他病毒样颗粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam2Cys、Pam3Cys、Pam3CSK4、衍生自皂苷的Aquila的QS21刺激子(Aquila Biotech,Worcester,Mass.,USA)、分枝杆菌提取物和合成细菌细胞壁模拟物以及其他专有佐剂，如Ribi的Detox.Quil或Superfos。佐剂还包括不完全弗氏佐剂或GM-CSF。先前已经描述了几种对树突细胞特异性的免疫佐剂(Dupuis M等人,Cell Immunol.1998；186(1):18-27；Allison A C；Dev Biol Stand.1998；92:3-11)(Mosca等人,Frontiers inBioscience,2007；12:4050-4060)(Gamvrellis等人,Immunol&Cell Biol.2004；82:506-516)。也可以使用细胞因子。几种细胞因子与影响树突细胞向淋巴组织迁移(例如TNF-α)、加速树突细胞成熟为T淋巴细胞的有效抗原呈递细胞(例如，GM-CSF、PGE1、PGE2、IL-1、IL-1b、IL-4、IL-6和CD40L)(美国专利5,849,589，其通过引用整体并入本文)以及充当免疫佐剂(例如，IL-12)(Gabrilovich D I等人,J Immunother Emphasis Tumor Immunol.1996(6):414-418)直接相关。
佐剂还可包含刺激分子，如细胞因子。细胞因子的非限制性实例包括：CCL20、a-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ(淋巴毒素α(LTα))、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、表皮胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮细胞趋化因子(MEC)IL-12、IL-15,、IL-28、MHC、CD80、CD86、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1、MIP-la、MIP-1-、IL-8、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-18的突变体形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DRS、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IκB、无活性NIK、SAP K、SAP-I、JNK、干扰素应答基因、NFκB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40 LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI和TAP2。
其他佐剂包括：MCP-1、MIP-la、MIP-lp、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变体形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维生长因子、IL-7、IL-22、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IκB、无活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFκB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40 LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段。
在一些方面，佐剂可以是toll样受体(TLR)的调节剂。TLR调节剂的实例包括TLR-9激动剂，并且不限于TLR的小分子调节剂，如咪喹莫特。与本文所述的免疫原性药物组合物组合使用的佐剂的其他实例可包括但不限于皂苷、CpG ODN等。有时，佐剂选自细菌类毒素、聚氧丙烯-聚乙二醇嵌段聚合物、铝盐、脂质体、CpG聚合物、水包油乳液或其组合。有时，佐剂是水包油乳液。水包油乳液可包含至少一种油和至少一种表面活性剂，其中油和表面活性剂是可生物降解的(可代谢的)且生物相容的。乳液中的油滴直径可小于5μm，甚至可具有亚微米级直径，这些小尺寸通过微流化器实现以提供稳定的乳液。尺寸小于220nm的小液滴可以进行过滤除菌。
6.治疗方法和药物组合物
本文所述的新抗原治疗剂(例如，多肽或多核苷酸、APC或含有多肽或多核苷酸的树突细胞)可用于多种应用，包括但不限于治疗性处置方法，如癌症的治疗。在一些实施方案中，治疗性处置方法包括免疫疗法。在某些实施方案中，新抗原肽可用于激活、促进、增加和/或增强免疫应答、将现有免疫应答重定向至新靶标、增加肿瘤的免疫原性、抑制肿瘤生长、减小肿瘤体积、增加肿瘤细胞凋亡和/或降低肿瘤的致瘤性。所述使用方法可以是体外、离体或体内方法。
在一些方面，本公开提供了用于使用包含本文所述新抗原肽或蛋白的多肽、细胞或药物组合物激活受试者中的免疫应答的方法。在一些实施方案中，本公开提供了受试者预防的方法，其包括使受试者的细胞与包含本文所述新抗原肽或蛋白的多肽、细胞或药物组合物进行接触。在一些实施方案中，本公开提供了用于使用包含本文所述新抗原肽或蛋白的多肽、细胞或药物组合物促进受试者中的免疫应答的方法。在一些实施方案中，本公开提供了用于使用包含本文所述新抗原肽或蛋白的多肽、细胞或药物组合物增加受试者中的免疫应答的方法。在一些实施方案中，本公开提供了用于使用包含本文所述新抗原肽或蛋白的多肽、细胞或药物组合物增强免疫应答的方法。
在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加T细胞活性或体液免疫。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或辅助T淋巴细胞(Th)活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加天然杀伤(NK)细胞活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加T细胞活性和增加NK细胞活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加CTL活性和增加NK细胞活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括抑制或降低T调节(Treg)细胞的抑制活性。在一些实施方案中，激活、促进、增加和/或增强免疫应答包括增加抗肿瘤活性。在一些实施方案中，激活、促进、增加和/或增强免疫应答包括增加免疫原性。在一些实施方案中，该免疫应答是抗原刺激的结果。在一些实施方案中，该抗原刺激是肿瘤细胞。在一些实施方案中，该抗原刺激是癌症。
在一些实施方案中，本公开提供了使用包含本文所述新抗原肽或蛋白的多肽、细胞或药物组合物激活、促进、增加和/或增强免疫应答的方法。在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的多肽，该多肽将新抗原肽或多核苷酸递送至肿瘤细胞。在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的被肿瘤细胞内化的新抗原多肽。在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的被肿瘤细胞内化的新抗原多肽，并且该新抗原肽被细胞处理。在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的被肿瘤细胞内化的新抗原多肽，并且新表位被呈递在该肿瘤细胞的表面上。在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的被肿瘤细胞内化并被细胞处理的新抗原多肽，并且抗原肽被呈递在该肿瘤细胞的表面上。
在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的新抗原多肽或多核苷酸，该新抗原肽或多核苷酸将包含至少一种新抗原肽的外源多肽递送至肿瘤细胞，其中衍生自该新抗原肽的至少一个新表位呈递于该肿瘤细胞的表面上。在一些实施方案中，该抗原肽与MHC I类分子复合地呈递于肿瘤细胞的表面上。在一些实施方案中，该抗原肽与MHC II类分子复合地呈递于肿瘤细胞的表面上。
在一些实施方案中，方法包括使肿瘤细胞与本文所述的新抗原多肽或多核苷酸接触，该新抗原多肽或多核苷酸将包含至少一种新抗原多肽的外源多肽递送至该肿瘤细胞，其中衍生自该至少一种新抗原多肽的至少一个新表位呈递于该肿瘤细胞的表面上。在一些实施方案中，该新表位与MHC I类分子复合地呈递于肿瘤细胞的表面上。在一些实施方案中，该新表位与MHC II类分子复合地呈递于肿瘤细胞的表面上。
在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的新抗原多肽或多核苷酸，该新抗原多肽或多核苷酸将包含至少一种抗原肽的外源多肽递送至肿瘤细胞，其中表位或新表位呈递于该肿瘤细胞的表面上，并且诱导针对该肿瘤细胞的免疫应答。在一些实施方案中，针对表位或新表位的免疫应答得到增加。在一些实施方案中，针对肿瘤细胞的免疫应答得到增加。在一些实施方案中，该新抗原多肽或多核苷酸将包含至少一种新抗原肽的外源多肽递送至肿瘤细胞，其中表位或新表位呈递于该肿瘤细胞的表面上，并且抑制肿瘤生长。
在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的新抗原多肽或多核苷酸，该新抗原多肽或多核苷酸将包含至少一种新抗原肽的外源多肽递送至肿瘤细胞，其中衍生自该至少一种新抗原肽的新表位呈递于该肿瘤细胞的表面上，并且诱导针对该肿瘤细胞的T细胞杀伤。在一些实施方案中，针对肿瘤细胞的T细胞杀伤得到增强。在一些实施方案中，针对肿瘤细胞的T细胞杀伤得到增加。
在一些实施方案中，增加受试者的免疫应答的方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的新抗原治疗剂，其中该治疗剂是特异性结合本文所述的新抗原的抗体。在一些实施方案中，增加受试者的免疫应答的方法包括向受试者施用治疗有效量的抗体。
本公开提供了将现有免疫应答重定向至肿瘤的方法。在一些实施方案中，将现有免疫应答重定向至肿瘤的方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的新抗原治疗剂。在一些实施方案中，现有免疫应答针对病毒。在一些实施方案中，该病毒选自：麻疹病毒、水痘-带状疱疹病毒(VZV；水痘病毒)、流感病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、风疹病毒、轮状病毒、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、EB病毒(EBV)和巨细胞病毒(CMV)。在一些实施方案中，该病毒是水痘-带状疱疹病毒。在一些实施方案中，该病毒是巨细胞病毒。在一些实施方案中，该病毒是麻疹病毒。在一些实施方案中，现有免疫应答在自然病毒感染之后获得。在一些实施方案中，现有免疫应答在针对病毒的疫苗接种之后获得。在一些实施方案中，现有免疫应答是细胞介导的应答。在一些实施方案中，现有免疫应答包括CTL或Th细胞。
在一些实施方案中，将现有免疫应答重定向至受试者的肿瘤的方法包括施用融合蛋白，该融合蛋白包含(i)特异性结合新抗原的抗体和(ii)至少一种本文所述的新抗原肽，其中(a)该融合蛋白在与肿瘤相关抗原或新表位结合后被肿瘤细胞内化；(b)将所述新抗原肽加工并与MHC I类分子相缔合地呈递于该肿瘤细胞的表面上；并且(c)所述新抗原肽/MHCI类复合物被CTL识别。在一些实施方案中，CTL是记忆T细胞。在一些实施方案中，该记忆T细胞是用新抗原肽进行接种的结果。
本公开提供了增加肿瘤免疫原性的方法。在一些实施方案中，增加肿瘤免疫原性的方法包括使肿瘤或肿瘤细胞与有效量的本文所述的新抗原治疗剂接触。在一些实施方案中，增加肿瘤免疫原性的方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的新抗原治疗剂。
本公开还提供了使用本文所述的新抗原治疗剂抑制肿瘤生长的方法。在某些实施方案中，抑制肿瘤生长的方法包括在体外使细胞混合物与新抗原治疗剂接触。例如，与免疫细胞(例如，T细胞)混合的无限增殖化细胞系或癌细胞系在添加新抗原肽的培养基中培养。在一些实施方案中，从诸如组织活检物、胸腔积液或血液样品等患者样品中分离肿瘤细胞，与免疫细胞(例如，T细胞)混合，并在添加新抗原治疗剂的培养基中培养。在一些实施方案中，新抗原治疗剂增加、促进和/或增强免疫细胞的活性。在一些实施方案中，新抗原治疗剂抑制肿瘤细胞生长。在一些实施方案中，新抗原治疗剂激活肿瘤细胞的杀伤。
在一些实施方案中，该受试者是哺乳动物。在某些实施方案中，该受试者是人。在某些实施方案中，该受试者具有肿瘤或者该受试者具有至少部分去除的肿瘤。
在一些实施方案中，抑制肿瘤生长的方法包括将现有免疫应答重定向至新靶标，其包括向受试者施用治疗有效量的新抗原治疗剂，其中该现有免疫应答针对由所述新抗原肽递送至肿瘤细胞的抗原肽。
在某些实施方案中，所述肿瘤包含癌症干细胞。在某些实施方案中，通过施用新抗原治疗剂来降低肿瘤中癌症干细胞的频率。在一些实施方案中，提供了降低肿瘤中癌症干细胞的频率的方法，包括向受试者施用治疗有效量的新抗原治疗剂。
另外，在一些方面，本公开提供了降低受试者的肿瘤致肿瘤性的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的新抗原治疗剂。在某些实施方案中，所述肿瘤包含癌症干细胞。在一些实施方案中，通过降低肿瘤中癌症干细胞的频率来降低肿瘤的致瘤性。在一些实施方案中，所述方法包括使用本文所述的新抗原治疗剂。在某些实施方案中，通过施用本文所述的新抗原治疗剂来降低肿瘤中癌症干细胞的频率。
在一些实施方案中，所述肿瘤是实体瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤是选自下组的肿瘤：结直肠肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤、卵巢肿瘤、肝肿瘤、乳腺肿瘤、肾肿瘤、前列腺肿瘤、神经内分泌肿瘤、胃肠肿瘤、黑素瘤、宫颈肿瘤、膀胱肿瘤、胶质母细胞瘤和头颈肿瘤。在某些实施方案中，该肿瘤是结直肠肿瘤。在某些实施方案中，该肿瘤是卵巢肿瘤。在一些实施方案中，该肿瘤是乳腺肿瘤。在一些实施方案中，该肿瘤是肺肿瘤。在某些实施方案中，该肿瘤是胰腺肿瘤。在某些实施方案中，该肿瘤是黑素瘤肿瘤。在一些实施方案中，该肿瘤是实体瘤。
本公开进一步提供了治疗受试者的癌症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的新抗原治疗剂。在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括将现有免疫应答重定向至新靶标，该方法包括向受试者施用治疗有效量的新抗原治疗剂，其中该现有免疫应答针对由所述新抗原肽递送至癌细胞的抗原肽。
本公开提供了治疗癌症的方法，包括向受试者(例如，需要治疗的受试者)施用治疗有效量的本文所述的新抗原治疗剂。在一些实施方案中，该受试者是哺乳动物。在某些实施方案中，该受试者是人。在某些实施方案中，该受试者具有癌性肿瘤。在某些实施方案中，该受试者具有至少部分去除的肿瘤。
受试者可以是，例如，哺乳动物、人、孕妇、老年人、成年人、青少年、青春期前儿童、儿童、幼儿、婴儿、新生儿或新生婴儿。受试者可以是患者。在一些情况下，受试者可以是人。在一些情况下，受试者可以是儿童(即青春期以下的年轻人)。在一些情况下，受试者可以是婴儿。在一些情况下，受试者可以是配方奶粉喂养的婴儿。在一些情况下，受试者可以是加入临床研究的个体。在一些情况下，受试者可以是实验室动物，例如哺乳动物或啮齿动物。在一些情况下，受试者可以是小鼠。在一些情况下，该受试者可以是肥胖的或超重的受试者。
在一些实施方案中，受试者先前已经用一种或多种不同的癌症治疗方式进行了治疗。在一些实施方案中，受试者先前已经用放射疗法、化学疗法或免疫疗法中的一种或多种进行了治疗。在一些实施方案中，受试者已经用一、二、三、四或五线先前疗法进行了治疗。在一些实施方案中，先前的疗法是细胞毒性疗法。
在某些实施方案中，所述癌症是选自结直肠癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、胃肠癌、黑素瘤、宫颈癌、神经内分泌癌、膀胱癌、子宫癌、胶质母细胞瘤和头颈癌的癌症。在某些实施方案中，该癌症是胰腺癌。在某些实施方案中，该癌症是卵巢癌。在某些实施方案中，该癌症是结直肠癌。在某些实施方案中，该癌症是乳腺癌。在某些实施方案中，该癌症是前列腺癌。在某些实施方案中，该癌症是肺癌。在某些实施方案中，该癌症是非小细胞肺癌。在某些实施方案中，该癌症是子宫癌。在某些实施方案中，该癌症是肝癌。在某些实施方案中，该癌症是黑素瘤。在一些实施方案中，该癌症是实体癌。在一些实施方案中，该癌症包括实体瘤。
在一些实施方案中，所述癌症是血液系统癌症。在一些实施方案中，该癌症选自：急性髓性白血病(AML)、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、T细胞急性淋巴母细胞白血病(T-ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病、慢性髓性白血病(CML)、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)和皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)。
在一些实施方案中，所述新抗原治疗剂作为联合治疗施用。具有两种或更多种治疗剂的联合治疗使用通过不同作用机制起作用的药剂，尽管这不是必需的。使用具有不同作用机制的药剂的联合治疗可引起累加或协同效应。联合治疗可以允许每种药剂的剂量低于单一疗法中所使用的剂量，从而降低毒性副作用和/或增加药剂的治疗指数。联合治疗可以降低耐药性癌细胞发展的可能性。在一些实施方案中，联合治疗包含影响免疫应答(例如，增强或激活该应答)的治疗剂和影响(例如，抑制或杀死)肿瘤/癌细胞的治疗剂。
在一些情况下，免疫原性药物组合物可与附加药剂一起施用。在一些实施方案中，新抗原治疗剂可与免疫疗法一起施用。该免疫疗法可以是，例如，针对免疫检查点的抗体。在一些实施方案中，该抗体是双特异性抗体。附加药剂的选择可以至少部分地取决于所治疗的病况。附加药剂可包括，例如，检查点抑制剂，如抗PD1、抗CTLA4、抗PD-L1、抗CD40或抗TIM3剂(例如，抗PD1、抗CTLA4、抗PD-L1、抗CD40或抗TIM3抗体)；或对病原体感染(例如病毒感染)具有治疗效果的任何药剂，包括，例如，用来治疗炎性状况的药物，如NSAID，例如，布洛芬、萘普生、对乙酰氨基酚、酮洛芬或阿司匹林。例如，检查点抑制剂可以是PD-1/PD-L1激动剂，其选自：纳武单抗(ONO-4538/BMS-936558，MDX1 106，OPDIVO)、派姆单抗(MK-3475，KEYTRUDA)、pidilizumab(CT-011)和MPDL328OA(ROCHE)。作为另一个实例，制剂可以另外含有一种或多种补充剂，如维生素C、E或其他抗氧化剂。
本公开的方法可以用来治疗本领域已知的任何类型的癌症。通过本公开的方法治疗的癌症的非限制性实例可包括黑素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如，透明细胞癌)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤和其他肿瘤性恶性肿瘤。
另外，本文提供的疾病或病况包括使用本发明的治疗方法可抑制其生长的难治性或复发性恶性肿瘤。在一些实施方案中，通过本公开的治疗方法治疗的癌症选自癌、鳞状癌、腺癌、肉瘤、子宫内膜癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、结肠癌、结直肠癌、生殖器区域的鳞状细胞癌、黑素瘤、肾细胞癌、肺癌、非小细胞肺癌、肺鳞状细胞癌、胃癌、膀胱癌、胆囊癌、肝癌、甲状腺癌、喉癌、唾液腺癌、食管癌、头颈癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、胰腺癌、间皮瘤、肉瘤、血液系统癌症、白血病、淋巴瘤、神经瘤及其组合。在一些实施方案中，通过本公开的方法治疗的癌症包括，例如，癌、鳞状癌(例如子宫颈管、眼睑、结膜、阴道、肺、口腔、皮肤、膀胱、舌头、喉和食道的癌症)和腺癌(例如，前列腺、小肠、子宫内膜、子宫颈管、大肠、肺、胰腺、食道、直肠、子宫、胃、乳腺和卵巢的癌症)。在一些实施方案中，将通过本公开的方法治疗的癌症进一步包括肉瘤(例如，肌原性肉瘤)、白血病、神经瘤、黑素瘤和淋巴瘤。在一些实施方案中，将通过本公开的方法治疗的癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，将通过本公开的治疗方法治疗的癌症是三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些实施方案中，将通过本公开的治疗方法治疗的癌症是卵巢癌。在一些实施方案中，将通过本公开的治疗方法治疗的癌症是结直肠癌。
在一些实施方案中，将用本公开的药物组合物治疗的患者或患者群体患有实体瘤。在一些实施方案中，该实体瘤是黑素瘤、肾细胞癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、胆囊癌、喉癌、肝癌、甲状腺癌、胃癌、唾液腺癌、前列腺癌、胰腺癌或Merkel细胞癌。在一些实施方案中，将用本公开的药物组合物治疗的患者或患者群体患有血液系统癌症。在一些实施方案中，患者患有血液系统癌症，如弥漫性大B细胞淋巴瘤(“DLBCL”)、霍奇金淋巴瘤(“HL”)、非霍奇金淋巴瘤(“NHL”)、滤泡性淋巴瘤(“FL”)、急性骨髓性白血病(“AML”)或多发性骨髓瘤(“MM”)。在一些实施方案中，待治疗的患者或患者群体的癌症选自卵巢癌、肺癌和黑素瘤。
根据本公开可以预防和/或治疗的癌症的具体实例包括但不限于以下：肾癌、肾脏癌、多形性胶质母细胞瘤、转移性乳腺癌；乳腺癌；乳腺肉瘤；神经纤维瘤；神经纤维瘤病；小儿肿瘤；神经母细胞瘤；恶性黑素瘤；表皮癌；白血病，例如但不限于急性白血病，急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞性白血病，如成髓细胞性、早幼粒细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病，以及骨髓增生异常综合征；慢性白血病，例如但不限于慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病；真性红细胞增多症；淋巴瘤，例如但不限于霍奇金病、非霍奇金病；多发性骨髓瘤，例如但不限于郁积型多发性骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、浆细胞白血病、孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；意义不明的单克隆丙种球蛋白病；良性单克隆丙种球蛋白病；重链病；骨癌和结缔组织肉瘤，例如但不限于骨骼肉瘤、骨髓瘤骨病、多发性骨髓瘤、胆脂瘤诱发的骨肉瘤、佩吉特骨病、骨肉瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性巨细胞瘤、骨纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤(血管内皮瘤)、纤维肉瘤、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神经鞘瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤；脑瘤，例如但不限于神经胶质瘤、星形细胞瘤、脑干神经胶质瘤、室管膜瘤、少突神经胶质瘤、非神经胶质瘤、听神经鞘瘤、颅咽管瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、松果体细胞瘤、松果体母细胞瘤和原发性脑淋巴瘤；乳腺癌，包括但不限于腺癌、小叶(小细胞)癌、导管内癌、髓样乳腺癌、粘液性乳腺癌、小管性乳腺癌、乳头状乳腺癌、佩吉特病(包括青少年佩吉特病)和炎性乳腺癌；肾上腺癌，例如但不限于嗜铬细胞瘤和肾上腺皮质癌；甲状腺癌，例如但不限于乳头状或滤泡状甲状腺癌、髓样甲状腺癌和间变性甲状腺癌；胰腺癌，例如但不限于胰岛素瘤、胃泌素瘤、胰高血糖素瘤、VIP瘤、分泌促生长素抑制素的肿瘤以及类癌或胰岛细胞瘤；垂体癌，例如但不限于库欣病、分泌催乳素的肿瘤、肢端肥大症和尿崩症；眼癌，例如但不限于眼黑素瘤，如虹膜黑素瘤、脉络膜黑素瘤和睫状体黑素瘤，以及视网膜母细胞瘤；阴道癌，如鳞状细胞癌、腺癌和黑素瘤；外阴癌，如鳞状细胞癌、黑素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤和佩吉特病；宫颈癌，例如但不限于鳞状细胞癌和腺癌；子宫癌，例如但不限于子宫内膜癌和子宫肉瘤；卵巢癌，例如但不限于卵巢上皮癌、交界瘤、胚细胞瘤和基质肿瘤；食管癌，例如但不限于鳞状癌、腺癌、腺样囊性癌、粘液表皮样癌、腺鳞癌、肉瘤、黑素瘤、浆细胞瘤、疣状癌和燕麦细胞(小细胞)癌；胃癌，例如但不限于腺癌、蕈状(息肉样)、溃疡性、浅表扩散、弥散性扩散、恶性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和癌肉瘤；结肠癌；结直肠癌；KRAS突变结直肠癌；结肠癌；直肠癌；肝癌，例如但不限于肝细胞癌和肝母细胞瘤；胆囊癌，如腺癌；胆管癌，例如但不限于乳头状、结节状和弥漫性；肺癌，如KRAS突变的非小细胞肺癌、非小细胞肺癌、鳞状细胞癌(表皮样癌)、腺癌、大细胞癌和小细胞肺癌；肺癌；睾丸癌，例如但不限于生殖细胞瘤、精原细胞瘤、间变性、经典(典型)、精细胞癌、非精原细胞瘤、胚胎性癌、畸胎瘤、绒毛膜癌(卵黄囊瘤)，前列腺癌，例如但不限于雄激素非依赖性前列腺癌、雄激素依赖性前列腺癌、腺癌、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤；松果体癌；口腔癌，例如但不限于鳞状细胞癌；基底癌；唾液腺癌，例如但不限于腺癌、粘液表皮样癌和腺样囊性癌；咽癌，例如但不限于鳞状细胞癌和疣状；皮肤癌，例如但不限于基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑素瘤，浅表扩散性黑素瘤、结节性黑素瘤、痣样恶性黑素瘤、肢端着色斑性黑素瘤；肾癌，例如但不限于肾细胞癌、腺癌、肾上腺样瘤、纤维肉瘤、移行细胞癌(肾盂和/或子宫)；肾癌；维尔姆斯瘤；膀胱癌，例如但不限于移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、癌肉瘤。另外，癌症包括粘液肉瘤、骨原性肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、间皮瘤、滑膜瘤、血管母细胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支气管癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌和乳头状腺癌。
癌症包括但不限于B细胞癌症，例如，多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病(例如α链疾病、γ链疾病及μ链疾病)、良性单克隆丙种球蛋白病和免疫细胞淀粉样变性、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、支气管癌、结直肠癌、前列腺癌(例如，转移性、激素难治性前列腺癌)、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌症、周围神经系统癌、食管癌、宫颈癌、子宫癌或子宫内膜癌、口腔或咽部的癌症、肝癌、肾癌、睪丸癌、胆道癌、小肠或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、血液组织的癌症等。适用于本公开所涵盖的方法的癌症类型的其他非限制性实例包括人类肉瘤和癌，例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、肝癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、骨癌、脑瘤、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤；白血病，例如，急性淋巴细胞白血病及急性髓细胞性白血病(成髓细胞性、早幼粒细胞性、粒单核细胞性、单核细胞性和红白血病)；慢性白血病(慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病及慢性淋巴细胞白血病)；以及真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金病及非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和重链病。在一些实施方案中，通过本公开的方法确定其表型的癌症是上皮癌，例如但不限于膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、妇科癌症、肾癌、喉癌、肺癌、口腔癌、头颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或皮肤癌。在其他实施方案中，该癌症是乳腺癌、前列腺癌、肺癌或结肠癌。在另外其他的实施方案中，该上皮癌是非小细胞肺癌、非乳头状肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌(例如，浆液性卵巢癌)或乳腺癌。上皮癌可以用各种其他方式表征，包括但不限于浆液性、子宫内膜样、粘液性、透明细胞、布伦纳型(brenner)或未分化的。在一些实施方案中，本公开用于淋巴瘤或其亚型(包括但不限于套细胞淋巴瘤)的治疗、诊断和/或预后。淋巴组织增生性病症也被认为是增殖性疾病。
在一些实施方案中，本文所述药剂与至少一种附加治疗剂的组合产生累加或协同结果。在一些实施方案中，联合治疗导致药剂的治疗指数增加。在一些实施方案中，联合治疗导致附加治疗剂的治疗指数增加。在一些实施方案中，联合治疗导致药剂的毒性和/或副作用降低。在一些实施方案中，联合治疗导致附加治疗剂的毒性和/或副作用降低。
在某些实施方案中，除了施用本文所述的新抗原治疗剂外，所述方法或治疗进一步包括施用至少一种附加治疗剂。附加治疗剂可在药剂施用之前、同时和/或之后施用。在一些实施方案中，所述至少一种附加治疗剂包含1、2、3种或更多种附加治疗剂。
可与本文所述的新抗原治疗剂联合施用的治疗剂包括化疗剂。因此，在一些实施方案中，所述方法或治疗涉及将本文所述的药剂与化疗剂联合或与化疗剂的混合物联合施用。使用药剂的治疗可以在施用化学疗法之前、同时或之后进行。联合施用可包括以单一药物制剂或使用分开的制剂进行共同施用，或以任一顺序连续施用，但通常在一段时间内进行，以使得所有活性剂可同时发挥其生物活性。这类化疗剂的制备和给药方案可根据制造商的说明书使用或由技术人员凭经验确定。这类化学疗法的制备和给药方案也描述于TheChemotherapy Source Book,第4版,2008,M.C.Perry编,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA中。
有用的化疗剂类别包括，例如，抗微管蛋白剂、奥利斯他汀(auristatin)、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷化剂(例如，铂络合物，例如顺铂、单(铂)、双(铂)和三核铂络合物以及卡铂)、蒽环类、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化疗增敏剂、多卡米星(duocarmycin)、依托泊苷、氟化嘧啶、离子载体、来西托辛(lexitropsin)、亚硝基脲、普拉汀诺(platinol)、嘌呤抗代谢物、嘌呤霉素(puromycin)、辐射增敏剂、类固醇、紫杉烷、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱(vinca alkaloid)等。在某些实施方案中，第二治疗剂是烷化剂、抗代谢物、抗有丝分裂剂、拓扑异构酶抑制剂或血管生成抑制剂。
可用于本公开中的化疗剂包括但不限于烷化剂，例如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(CYTOXAN)；烷基磺酸盐，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；次乙亚胺及甲基蜜胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙烯三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；氮芥，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌二醇氮芥(estramustine)、异环磷酰胺、甲基二氯乙基胺、盐酸氧氮芥(mechiorethamine oxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、胆甾醇对苯乙酸氮芥(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素(bleomycin)、放线菌素c、卡奇霉素(calicheamicin)、卡柔比星(carabicin)、卡波霉素(carnomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，例如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷、5-FU；雄激素，例如卡鲁睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯；抗肾上腺，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶(amsacrine)；贝拉布昔(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多醣；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；硝氨丙吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；甲基苄肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofuran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2,2’,2”-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加赛特辛(gacytosine)；阿糖胞苷(Ara-C)；紫杉烷，例如紫杉醇(TAXOL)和多西他赛(TAXOTERE))；苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱；长春瑞滨；诺维本(navelbine)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；柔红霉素；氨蝶呤；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸；埃斯培拉霉素(esperamicin)；卡培他滨(XELODA)；以及上述任何药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。化疗剂还包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，例如抗雌激素，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香化酶抑制性4(5)-咪唑、4羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、可昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(FARESTON)；和抗雄激素，例如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及上述任何药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，附加治疗剂是顺铂。在某些实施方案中，附加治疗剂是卡铂。
在某些实施方案中，所述化疗剂是拓扑异构酶抑制剂。扑异构酶抑制剂是干扰拓扑异构酶(例如，拓扑异构酶I或II)的作用的化疗剂。拓扑异构酶抑制剂包括但不限于盐酸多柔比星、柠檬酸柔红霉素、盐酸米托蒽醌、放线菌素D、依托泊苷、盐酸拓扑替康、替尼泊苷(VM-26)和伊立替康(irinotecan)以及任何这些药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方案中，附加治疗剂是伊立替康。
在某些实施方案中，所述化疗剂是抗代谢物。抗代谢物是这样的化学物质：其结构类似于正常生化反应所需的代谢物，但其差异足以干扰细胞的一种或多种正常功能，如细胞分裂。抗代谢物包括但不限于吉西他滨、氟尿嘧啶、卡培他滨、氨甲蝶呤钠、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲塞(pemetrexed)、替加氟(tegafur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、硫鸟嘌呤、5-氮胞苷、6巯嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫鸟嘌呤、喷司他丁、磷酸氟达拉滨和克拉屈滨(cladribine)以及任何这些药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，附加治疗剂是吉西他滨。
在某些实施方案中，所述化疗剂是抗有丝分裂剂，包括但不限于结合微管蛋白的药剂。在一些实施方案中，该药剂是紫杉烷。在某些实施方案中，该药剂是紫杉醇或多西他赛，或者是紫杉醇或多西他赛的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，该药剂是紫杉醇(TAXOL)、多西他赛(TAXOTERE)、白蛋白结合型紫杉醇(ABRAXANE)、DHA-紫杉醇或PG-紫杉醇。在某些替代实施方案中，所述抗有丝分裂剂包含长春花生物碱，如长春新碱、长春碱、长春瑞滨或长春地辛，或其药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方案中，所述抗有丝分裂剂是驱动蛋白Eg5的抑制剂或有丝分裂激酶的抑制剂，如Aurora A或Plk1。在某些实施方案中，附加治疗剂是紫杉醇。在一些实施方案中，附加治疗剂是白蛋白结合型紫杉醇。
在一些实施方案中，附加治疗剂包含诸如小分子的药剂。例如，治疗可涉及将本公开的药剂与充当针对肿瘤相关抗原(包括但不限于EGFR、HER2(ErbB2)和/或VEGF)的抑制剂的小分子联合施用。在一些实施方案中，本公开的药剂与选自下组的蛋白激酶抑制剂联合施用：吉非替尼(IRESSA)、厄洛替尼(TARCEVA)、舒尼替尼(SUTENT)、拉帕替尼(lapatanib)、凡德他尼(ZACTIMA)、AEE788、CI-1033、西地尼布(RECENTIN)、索拉菲尼(NEXAVAR)和帕唑帕尼(GW786034B)。在一些实施方案中，附加治疗剂包含mTOR抑制剂。在另一个实施方案中，附加治疗剂是减少Treg细胞数的化学疗法或其他抑制剂。在某些实施方案中，所述治疗剂是环磷酰胺或抗CTLA4抗体。在另一个实施方案中，附加治疗剂减少骨髓来源的抑制细胞的存在。在进一步的实施方案中，附加治疗剂是卡铂紫杉醇(carbotaxol)。在另一个实施方案中，附加治疗剂将细胞转移至1型T辅助细胞应答。在进一步的实施方案中，附加治疗剂是依鲁替尼。
在一些实施方案中，附加治疗剂包含生物分子，如抗体。例如，治疗可涉及将本公开的药剂与针对肿瘤相关抗原的抗体(包括但不限于结合EGFR、HER2/ErbB2和/或VEGF的抗体)联合施用。在某些实施方案中，附加治疗剂是对癌症干细胞标志物具有特异性的抗体。在某些实施方案中，附加治疗剂是作为血管生成抑制剂的抗体(例如，抗VEGF或VEGF受体抗体)。在某些实施方案中，附加治疗剂是贝伐珠单抗(AVASTIN)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、曲妥珠单抗(HERCEPTIN)、帕妥珠单抗(OMNITARG)、帕尼单抗(VECTIBIX)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)或西妥昔单抗(ERBITUX)。
本文提供的药剂和组合物可单独使用或与常规治疗方案如手术、放射、化学疗法和/或骨髓移植(自体、同基因、同种异体或无关)联合使用。例如，一组肿瘤抗原可用于例如大部分癌症患者中。
在一些实施方案中，除包含免疫原性疫苗的组合物外，还可以施用至少一种或多种化疗剂。在一些实施方案中，所述一种或多种化疗剂可属于不同类别的化疗剂。
化疗剂的实例包括但不限于烷化剂，如氮芥类(例如甲基二氯乙基胺(氮芥)、苯丁酸氮芥、环磷酰胺
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异环磷酰胺和美法仑)；亚硝基脲类(例如N-亚硝基-N-甲基脲、链脲菌素、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀和司莫司汀)；烷基磺酸酯类(例如白消安)；四嗪类(例如达卡巴嗪(DTIC)、米托唑胺(mitozolomide)和替莫唑胺
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)；氮丙啶类(例如噻替派、丝裂霉素和地吖醌)；和铂类药物(例如顺铂、卡铂和奥沙利铂)；非经典烷化剂，如丙卡巴肼和六甲蜜胺(六甲蜜胺)；抗代谢剂，如5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯嘌呤(6-MP)、卡培他滨
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克拉屈滨、氯法拉滨(clofarabine)、阿糖胞苷
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地西他滨、氟尿苷、氟达拉滨、奈拉滨(nelarabine)、吉西他滨
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羟基脲、氨甲蝶呤、培美曲塞
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喷司他丁、硫鸟嘌呤、Vidaza；抗微管剂，如长春花生物碱(例如长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛和长春氟宁(vinflunine))；紫杉烷类(例如紫杉醇
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多西他赛
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鬼臼毒素(例如依托泊苷和替尼泊苷)；埃博霉素类(epothilones)(例如伊沙匹隆
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)；雌莫司汀
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抗肿瘤抗生素，如蒽环类(例如柔红霉素、多柔比星
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表柔比星、伊达比星)；放线菌素-D；和博莱霉素；拓扑异构酶I抑制剂，如托泊替康和伊立替康(CPT-11)；拓扑异构酶II抑制剂，如依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷、米托蒽醌、新生霉素(novobiocin)、美巴龙(merbarone)和阿柔比星(aclarubicin)；皮质类固醇，如泼尼松(prednisone)、甲泼尼龙
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和地塞米松
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L-天冬酰胺酶；硼替佐米
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免疫治疗剂，如利妥昔单抗
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阿仑珠单抗
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沙利度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)
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BCG、白介素-2、干扰素-α和癌症疫苗如
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；激素治疗剂，如氟维司群
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他莫昔芬、托瑞米芬
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阿那曲唑
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依西美坦
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来曲唑
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醋酸甲地孕酮
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雌激素、比卡鲁胺
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氟他胺
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尼鲁米特
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亮丙瑞林
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和戈舍瑞林
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分化剂，如类视黄醇类、维甲酸(ATRA或
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)、贝沙罗汀
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和三氧化二砷
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以及靶向治疗剂，如伊马替尼
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吉非替尼
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和舒尼替尼
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在一些实施方案中，该化学疗法是鸡尾酒疗法。鸡尾酒疗法的实例包括但不限于CHOP/R-CHOP(美罗华(rituxan)、环磷酰胺、羟基多柔比星、长春新碱和泼尼松)、EPOCH(依托泊苷、泼尼松、长春新碱、环磷酰胺、羟基多柔比星)、Hyper-CVAD(环磷酰胺、长春新碱、羟基多柔比星、地塞米松)、FOLFOX(氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸、奥沙利铂)、ICE(异环磷酰胺、卡铂、依托泊苷)、DHAP(高剂量阿糖胞苷[ara-C]、地塞米松、顺铂)、ESHAP(依托泊苷、甲泼尼龙、阿糖胞苷[ara-C]、顺铂)和CMF(环磷酰胺、氨甲蝶呤、氟尿嘧啶)。
在某些实施方案中，附加治疗剂包含第二免疫治疗剂。在一些实施方案中，附加免疫治疗剂包括但不限于集落刺激因子、白介素、阻断免疫抑制功能的抗体(例如，抗CTLA-4抗体、抗CD28抗体、抗CD3抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIGIT抗体)、增强免疫细胞功能的抗体(例如，抗GITR抗体、抗OX-40抗体、抗CD40抗体或抗4-1BB抗体)、toll样受体(例如，TLR4、TLR7、TLR9)、可溶性配体(例如，GITRL、GITRL-Fc、OX-40L、OX-40L-Fc、CD40L、CD40L-Fc、4-1BB配体或4-1BB配体-Fc)或B7家族成员(例如，CD80、CD86)。在一些实施方案中，附加免疫治疗剂靶向CTLA-4、CD28、CD3、PD-1、PD-L1、TIGIT、GITR、OX-40、CD-40或4-1BB。
在一些实施方案中，附加治疗剂是免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，该免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗CD28抗体、抗TIGIT抗体、抗LAG3抗体、抗TIM3抗体、抗GITR抗体、抗4-1BB抗体或抗OX-40抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是抗TIGIT抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是选自纳武单抗(OPDIVO)、派姆单抗(KEYTRUDA)、匹地珠单抗(pidilzumab)、MEDI0680、REGN2810、BGB-A317和PDR001的抗PD-1抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是选自BMS935559(MDX-1105)、阿特利珠单抗(atexolizumab)(MPDL3280A)、德瓦鲁单抗(MEDI4736)和阿维鲁单抗(MSB0010718C)的抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是选自伊匹木单抗(YERVOY)和曲美木单抗的抗CTLA-4抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是选自BMS-986016和LAG525的抗LAG-3抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是选自MEDI6469、MEDI0562和MOXR0916的抗OX-40抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是选自PF-05082566的抗4-1BB抗体。
在一些实施方案中，所述新抗原治疗剂可与选自下组的生物分子联合施用：肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang)、BMP、BDNF、EGF、促红细胞生成素(EPO)、FGF、GDNF、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、干细胞因子(SCF)、GDF9、HGF、HDGF、IGF、迁移刺激因子、肌肉生长抑制素(GDF-8)、NGF、神经营养蛋白、PDGF、促血小板生成素、TGF-α、TGF-β、TNF-α、VEGF、PlGF、γ-IFN、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15和IL-18。
在一些实施方案中，采用本文所述的新抗原治疗剂的治疗可以伴随着手术切除肿瘤、去除癌细胞或治疗医师认为必需的其他任何手术疗法。
在某些实施方案中，治疗涉及与放射疗法联合施用本文所述的新抗原治疗剂。用药剂治疗可以在施用放射疗法之前、同时或之后进行。这类放射疗法的给药方案可由熟练的执业医师确定。
联合施用可包括以单一药物制剂或使用分开的制剂进行共同施用，或以任一顺序连续施用，但通常在一段时间内进行，以使得所有活性剂可同时发挥其生物活性。
应当理解，本文所述的新抗原治疗剂与至少一种附加治疗剂的组合可以以任何顺序或同时施用。在一些实施方案中，将所述药剂施用于先前已经接受第二治疗剂治疗的患者。在某些其他实施方案中，新抗原治疗剂和第二治疗剂基本上同时或并行施用。例如，可以在进行采用第二治疗剂(例如，化学疗法)的疗程的同时给予受试者药剂。在某些实施方案中，在用第二治疗剂治疗的1年内施用新抗原治疗剂。应进一步理解，可在几小时或几分钟内(即，基本上同时)将两种(或更多种)药剂或治疗施用于受试者。
对于疾病的治疗，本文所述的新抗原治疗剂的适当剂量取决于待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和病程、疾病的反应性、施用药剂是用于治疗还是预防目的、既往治疗、患者的临床病史等，所有均由治疗医师决定。新抗原治疗剂可以一次性施用或在持续数天至数月的一系列治疗期间施用，或施用直至实现治愈或达到疾病况态减轻(例如，肿瘤大小减小)。最佳给药方案可以根据患者体内药物累积的测量来计算，并且将根据单独药剂的相对效力而不同。用药医师可以确定最佳剂量、给药方法和重复频率。
在一些实施方案中，新抗原治疗剂可以以初始较高的“负荷”剂量施用，随后以一个或多个较低剂量施用。在一些实施方案中，施用频率也可以改变。在一些实施方案中，给药方案可包括施用初始剂量，然后每周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次施用额外的剂量(或“维持”剂量)。例如，给药方案可包括施用初始负荷剂量，然后每周施用例如初始剂量的一半的维持剂量，或者给药方案可包括施用初始负荷剂量，然后每隔一周施用例如初始剂量的一半的维持剂量，或者给药方案可包括施用三个初始剂量3周，然后每隔一周施用例如相同量的维持剂量。
如本领域技术人员已知的，任何治疗剂的施用可导致副作用和/或毒性。在一些情况下，副作用和/或毒性非常严重，以至于阻止以治疗有效剂量施用特定药剂。在一些情况下，必须停止治疗，而可以尝试其他药剂。然而，同一治疗类别中的许多药剂显示出相似的副作用和/或毒性，这意味着患者必须停止治疗，或者如果可能的话，遭受与治疗剂相关的令人不愉快的副作用。
在一些实施方案中，给药方案可以限于特定次数的施用或“周期”。在一些实施方案中，所述药剂施用3、4、5、6、7、8个或更多个周期。例如，所述药剂每2周施用，持续6个周期，所述药剂每3周施用，持续6个循环，所述药剂每2周施用，持续4个周期，所述药剂每3周施用，持续4个周期，等等。给药方案可以由本领域技术人员决定并随后进行修改。
本公开提供了向受试者施用本文所述的新抗原治疗剂的方法，包括使用间歇给药策略施用一种或多种药剂，这可以减少与药剂、化疗剂等的施用相关的副作用和/或毒性。在一些实施方案中，用于治疗人类受试者的癌症的方法包括向受试者施用治疗有效剂量的新抗原治疗剂联合治疗有效剂量的化疗剂，其中一种或两种所述药剂根据间歇给药策略施用。在一些实施方案中，用于治疗人类受试者的癌症的方法包括向受试者施用治疗有效剂量的新抗原治疗剂联合治疗有效剂量的第二免疫治疗剂，其中一种或两种所述药剂根据间歇给药策略施用。在一些实施方案中，该间歇给药策略包括向受试者施用初始剂量的新抗原治疗剂，并且大约每2周一次施用后续剂量的药剂。在一些实施方案中，该间歇给药策略包括向受试者施用初始剂量的新抗原治疗剂，并且大约每3周一次施用后续剂量的药剂。在一些实施方案中，该间歇给药策略包括向受试者施用初始剂量的新抗原治疗剂，并且大约每4周一次施用后续剂量的药剂。在一些实施方案中，使用间歇给药策略施用所述药剂，并且每周施用附加治疗剂。
本公开提供了包含本文所述的新抗原治疗剂的组合物。本公开还提供了包含本文所述的新抗原治疗剂和药学上可接受的媒介物的药物组合物。在一些实施方案中，该药物组合物可用于免疫治疗。在一些实施方案中，该组合物可用于抑制肿瘤生长。在一些实施方案中，该药物组合物可用于抑制受试者(例如，人类患者)中的肿瘤生长。在一些实施方案中，该组合物可用于治疗癌症。在一些实施方案中，该药物组合物可用于治疗受试者(例如，人类患者)中的癌症。
通过将本公开的新抗原治疗剂与药学上可接受的媒介物(例如，载体或赋形剂)组合，制备制剂以供储存和使用。本领域技术人员通常认为药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂是制剂或药物组合物的非活性成分。示例性制剂在WO 2015/095811中列出。
合适的药学上可接受的媒介物包括但不限于无毒性缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；盐，例如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂，例如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六烃季铵、苯扎氯铵、苄索氯铵(benzethonium chloride)、苯酚、丁醇或苯甲醇、对羟苯甲酸烷基酯(如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯)、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚；低分子量多肽(例如，少于约10个氨基酸残基)；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物，例如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，例如钠；金属络合物，例如Zn-蛋白质络合物；以及非离子表面活性剂，例如吐温(TWEEN)或聚乙二醇(PEG)。(Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第22版,2012,Pharmaceutical Press,London)。在一些实施方案中，所述媒介物是5％右旋糖水溶液。
一方面，本文提供了药学上可接受的或生理学上可接受的组合物，包括与药物施用相容的溶剂(水性或非水性)、溶液、乳剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收促进剂或延迟剂。因此，药物组合物或药物制剂是指适用于在受试者中的药物用途的组合物。组合物可以配制成与特定的施用途径(即全身或局部)相容。因此，组合物包括适于通过各种途径施用的载体、稀释剂或赋形剂。
在一些实施方案中，组合物可进一步包含可接受的添加剂以改善组合物中免疫细胞的稳定性。可接受的添加剂可能不改变免疫细胞的比活性。可接受的添加剂的实例包括但不限于糖类，例如甘露醇、山梨醇、葡萄糖、木糖醇、海藻糖、山梨糖、蔗糖、半乳糖、葡聚糖、右旋糖、果糖、乳糖及其混合物。可接受的添加剂可以与可接受的载体和/或赋形剂(如右旋糖)组合。或者，可接受的添加剂的实例包括但不限于如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80的表面活性剂，以增加肽的稳定性并降低溶液的胶凝作用。表面活性剂可以以溶液的0.01％至5％的量加入到组合物中。加入此类可接受的添加剂会增加组合物在储存中的稳定性和半衰期。
本文所述的药物组合物可以以任何数量的用于局部或全身治疗的方式施用。施用可以是通过表皮或透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末的局部施用；通过吸入或吹入粉末或气雾剂(包括通过雾化器、气管内和鼻内)的肺部施用；口服；或胃肠外施用，包括静脉内、动脉内、肿瘤内、皮下、腹膜内、肌肉内(例如，注射或输注)或颅内(例如，鞘内或脑室内)。
药物组合物可以通过例如注射来施用。施用可以为皮内注射、鼻内喷雾应用、肌内注射、腹膜内注射、静脉内注射、口服施用或皮下注射。用于注射的组合物包括水溶液(在水溶性的情况下)或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，通过使用如卵磷脂的包衣，通过在分散体的情况下保持所需的粒径，以及通过使用表面活性剂，可以保持流动性。抗细菌剂和抗真菌剂包括例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸和硫柳汞。等渗剂，例如糖类、多元醇如甘露醇、山梨醇以及氯化钠可以包括在组合物中。所得溶液可以包装直接使用，或冻干；冻干制剂可随后在施用之前与无菌溶液组合。对于静脉内注射或在病痛部位注射，活性成分将是肠胃外可接受的水溶液形式，其是无热原的并且具有合适的pH、等张性和稳定性。本领域相关技术人员能够使用例如等张媒介物制备合适的溶液，所述等张媒介物是例如氯化钠注射液、林格注射液和乳酸钠林格注射液。根据需要可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。无菌注射溶液可以根据需要通过将活性成分以所需量与上述列举的成分之一或组合一起掺入适当溶剂中，随后过滤灭菌来进行制备。通常，通过将活性成分掺入到包含基本分散介质和来自以上列举的所需其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用无菌粉制备无菌可注射溶液的情况下，优选的制备方法可以是真空干燥和冷冻干燥，其从其之前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何另外的所需成分的粉末。
组合物可以如通过注射单位剂量进行常规地静脉内施用。对于注射，活性成分可以是胃肠外可接受的水溶液形式，其基本上无热原并且具有合适的pH、等张性和稳定性。可以使用例如等张媒介物制备合适的溶液，所述等张媒介物是例如氯化钠注射液、林格注射液和乳酸钠林格注射液。根据需要可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。另外，组合物可以通过雾化施用。
当考虑将组合物用于药物或本文提供的任何方法时，预计组合物可基本上不含热原，使得当施用于人类患者时，组合物将不会引起炎性反应或不安全的过敏反应。测试组合物中的热原和制备基本上不含热原的组合物是本领域普通技术人员熟知的，并且可以使用市售试剂盒完成。
可接受的载体可以含有稳定吸收、增加或延迟吸收或增加或延迟清除的化合物。此类化合物包括，例如，碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；低分子量蛋白；减少肽的清除或水解的组合物；或赋形剂或其他稳定剂和/或缓冲剂。延迟吸收的试剂包括例如单硬脂酸铝和明胶。去污剂也可用于稳定或增加或减少药物组合物的吸收，包括脂质体载体。为了防止消化，可以将化合物与组合物复合，使其对酸水解和酶水解具有抗性，或者可以将化合物复合在如脂质体的适当抗性载体中。保护化合物免受消化的方法是本领域已知的(例如，Fix(1996)Pharm Res.13:1760 1764；Samanen(1996)J.Pharm.Pharmacol.48:119 135；和美国专利5,391,377)。
所述组合物可以与剂型相容的方式以治疗有效量施用。施用量取决于待治疗的受试者、受试者免疫系统利用活性成分的能力和所需的结合能力程度。所需施用的活性成分的精确量取决于从业人员的判断，并且对于每个个体是独特的。用于初始施用和加强注射的合适方案也是可变的，但通常是先进行初始施用，随后通过后续注射或其他施用以一个或多个的小时间隔进行重复给药。或者，考虑足以维持血液中的浓度的连续静脉输注。
在一些情况下，包含一种或多种试剂的药物组合物在局部施用或在特定感染部位处或附近注射时发挥局部和区域性效应。例如粘性液体、溶液、悬浮液、基于二甲亚砜(DMSO)的溶液、脂质体制剂、凝胶、胶冻、乳膏、洗剂、软膏、栓剂、泡沫或气溶胶喷雾剂的直接局部施用可以用于局部施用，以产生例如局部和区域性效果。用于此类制剂的药学上合适的媒介物包括例如低级脂族醇、聚乙二醇类(例如甘油或聚乙二醇)、脂肪酸酯、油、脂肪、硅氧烷等。此类制剂还可以包括防腐剂(例如对羟基苯甲酸酯)和/或抗氧化剂(例如抗坏血酸和生育酚)。还可参见Dermatological Formulations:Percutaneous absorption,Barry(Ed.),Marcel Dekker Incl,1983。在另一个实施方案中，包含转运蛋白、载体或离子通道抑制剂的局部制剂用于治疗表皮或粘膜病毒感染。
在一些情况下，免疫原性药物组合物可以包括载体和赋形剂(包括但不限于缓冲剂、碳水化合物、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂)、水、油(包括石油、动物油、植物油或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)、盐水溶液、葡萄糖水溶液和甘油溶液、芳香剂、着色剂、防粘剂和其他可接受的添加剂、佐剂或粘合剂、其他接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，如pH缓冲剂、张力调节剂、乳化剂、润湿剂等。赋形剂的实例包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。在另一种情况中，药物制剂基本上不含防腐剂。在其他情况下，药物制剂可以含有至少一种防腐剂。应认识到，虽然本领域普通技术人员已知的任何合适的载体均可用于施用本文所述的药物组合物，但载体的类型将根据施用模式而变化。
免疫原性药物组合物可以包括防腐剂，例如硫柳汞或2-苯氧基乙醇。在一些情况下，免疫原性药物组合物基本上不含(例如，＜10μg/mL)汞材料，例如不含硫柳汞。α-生育酚琥珀酸酯可用作汞化合物的替代物。
为了控制张力，免疫原性药物组合物中可以包括生理盐，例如钠盐。其他盐可包括氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和/或氯化镁等。
免疫原性药物组合物可具有介于200mOsm/kg和400mOsm/kg之间、240mOsm/kg至360mOsm/kg之间或290-310mOsm/kg范围内的重量摩尔渗透压浓度。
免疫原性药物组合物可包含一种或多种缓冲剂，例如Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(特别是与氢氧化铝佐剂一起)；或柠檬酸盐缓冲剂。在一些情况下，缓冲剂的浓度在5-20或10-50mM范围内。
免疫原性药物组合物可包含pH调节剂。在一些实施方案中，pH调节剂以小于1mM或大于1mM的浓度存在。在一些实施方案中，pH调节剂以小于10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900nM或1mM的浓度存在。在一些实施方案中，pH调节剂以大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800或900mM的浓度存在。在一些实施方案中，pH调节剂是二羧酸盐。在一些实施方案中，pH调节剂是三羧酸盐。在一些实施方案中，pH调节剂是琥珀酸的二羧酸盐。在一些实施方案中，pH调节剂是二琥珀酸盐。在一些实施方案中，pH调节剂是柠檬酸的三羧酸盐。在一些实施方案中，pH调节剂是三柠檬酸盐。在一些实施方案中，pH调节剂是琥珀酸二钠。在一些实施方案中，琥珀酸的二羧酸盐以0.1mM-1mM的浓度存在于药物组合物中。在一些实施方案中，二琥珀酸盐以0.1mM-1mM的浓度存在于药物组合物中。在一些实施方案中，琥珀酸的二羧酸盐以1mM-5mM的浓度存在于药物组合物中。在一些实施方案中，二琥珀酸盐以1mM-5mM的浓度存在于药物组合物中。免疫原性药物组合物的pH可在约5.0与约8.5之间、约6.0与约8.0之间、约6.5与约7.5之间或约7.0与约7.8之间。
免疫原性药物组合物可以是无菌的。免疫原性药物组合物可以是无热原的，例如每剂含有＜1EU(内毒素单位，标准量度)，并且每剂可以＜0.1EU。组合物可以不含谷蛋白。
免疫原性药物组合物可以包括去污剂，例如聚氧乙烯山梨醇酯表面活性剂(称为“吐温”)，或辛苯聚醇(例如辛苯聚醇-9(Triton X-100)或叔辛基苯氧基聚乙烯乙氧基乙醇)。去污剂可以仅以痕量存在。免疫原性药物组合物可包含各自少于1mg/mL的辛苯聚醇-10和聚山梨醇酯80。痕量的其他残留组分可以是抗生素(例如新霉素、卡那霉素和多粘菌素B)。
免疫原性药物组合物可以配制为本领域公知的在合适载体中的无菌溶液或悬浮液。药物组合物可以通过常规的、公知的灭菌技术灭菌，或者可以无菌过滤。所得水溶液可以包装直接使用，或被冻干，冻干制剂可随后在施用之前与无菌溶液组合。
包含例如如本文公开的免疫细胞的活性剂与一种或多种佐剂的药物组合物可以配制成包含一定的摩尔比。例如，可以使用约99:1至约1:99的摩尔比的活性剂(如本文所述的免疫细胞)与一种或多种佐剂。在一些情况下，活性剂(如本文所述的免疫细胞)与一种或多种佐剂的摩尔比范围可以选自约80:20至约20:80、约75:25至约25:75、约70:30至约30:70、约66:33至约33:66、约60:40至约40:60、约50:50、以及约90:10至约10:90。活性剂(如本文所述的免疫细胞)与一种或多种佐剂的摩尔比可以是约1:9，并且在一些情况下可以是约1:1。活性剂(如本文所述的免疫细胞)与一种或多种佐剂可以一起配制在同一剂量单位中，例如，在一个小瓶、栓剂、片剂、胶囊、气雾剂喷雾中；或者每种药剂、形式和/或化合物可以配制成单独的单位，例如两个小瓶、栓剂、片剂、两个胶囊、一个片剂和一个小瓶、气雾剂等。
治疗制剂可以是单位剂型。这类制剂包括片剂、丸剂、胶囊、粉末、颗粒、水或非水性介质中的溶液或悬浮物或栓剂。
本文所述的新抗原肽还可以包埋在微胶囊中。这类微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合来制备，例如分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒及纳米胶囊)或粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第22版,2012,Pharmaceutical Press,London中所述。
在某些实施方案中，药物制剂包括与脂质体复合的本文所述的新抗原治疗剂。产生脂质体的方法是本领域技术人员已知的。例如，一些脂质体可以用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发产生。通过具有确定孔径的过滤器可挤出脂质体，以产生具有所需直径的脂质体。
在某些实施方案中，可以产生包含本文所述的新抗原肽的持续释放制品。持续释放制品的合适的实例包括含有药剂的固体疏水性聚合物的半透性基质，其中该基质是成型物品(例如，膜或微胶囊)的形式。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶如聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚(乙烯醇)、聚乳酸、L-谷氨酸与L-谷氨酸7-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)、乙酸异丁酸蔗糖酯和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
本公开提供了包括免疫原性疫苗的治疗方法。提供了治疗疾病(如癌症或病毒感染)的方法。方法可包括向受试者施用有效量的包含免疫原性抗原的组合物。在一些实施方案中，该抗原包括病毒抗原。在一些实施方案中，该抗原包括肿瘤抗原。
可以制备的疫苗的非限制性实例包括基于肽的疫苗、基于核酸的疫苗、基于抗体的疫苗和基于抗原呈递细胞的疫苗。
可以使用一种或多种生理学上可接受的载体来配制疫苗组合物，所述载体包括赋形剂和助剂，其有助于将活性剂加工成可药用的制品。合适的制剂可取决于选定的给药途径。任何公知的技术、载体和赋形剂均可作为如本领域所理解的合适的技术、载体和赋形剂。
在一些情况下，疫苗组合物被配制为基于肽的疫苗、基于核酸的疫苗、基于抗体的疫苗或基于细胞的疫苗。例如，疫苗组合物可包括阳离子脂质制剂中的裸cDNA；脂肽(例如，Vitiello,A.等人,J.Clin.Invest.95:341,1995)、包封在例如聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)(“PLG”)微球中的裸cDNA或肽(参见，例如，Eldridge等人,Molec.Immunol.28:287-294,1991；Alonso等人,Vaccine 12:299-306,1994；Jones等人,Vaccine 13:675-681,1995)；免疫刺激复合物(ISCOMS)中含有的肽组合物(例如，Takahashi等人,Nature 344:873-875,1990；Hu等人,Clin Exp Immunol.113:235-243,1998)；或多抗原肽系统(MAP)(参见例如，Tam,J.P.,Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.85:5409-5413,1988；Tarn,J.P.,J.Immunol.Methods 196:17-32,1996)。有时，疫苗被配制为基于肽的疫苗或基于核酸的疫苗，其中该核酸编码多肽。有时，疫苗被配制为基于抗体的疫苗。有时，疫苗被配制为基于细胞的疫苗。
可以使用经识别的疾病特异性免疫原性新抗原肽的氨基酸序列来开发药学上可接受的组合物。抗原的来源可以是但不限于天然或合成蛋白质，包括糖蛋白、肽和超抗原；抗体/抗原复合物；脂蛋白；RNA或其翻译产物；以及DNA或由DNA编码的多肽。抗原的来源也可以包含未转化、转化、转染或转导的细胞或细胞系。可以使用本领域普通技术人员已知的可用于表达重组抗原的任何多种表达或逆转录病毒载体来转化、转染或转导细胞。还可以在用含有编码重组抗原的DNA分子的表达或逆转录病毒载体转化、转染或转导的任何合适的宿主细胞中实现表达。可以使用本领域技术人员已知的任何数量的转染、转化和转导方案。重组痘苗载体和用痘苗载体感染的细胞可用作抗原的来源。
药物组合物可包含合成的疾病特异性免疫原性新抗原肽。药物组合物可包含两种或更多种疾病特异性免疫原性新抗原肽。药物组合物可包含疾病特异性免疫原性肽的前体(如蛋白质、肽、DNA和RNA)。疾病特异性免疫原性肽的前体可以生成经识别的疾病特异性免疫原性新抗原肽或根据所述新抗原肽生成。在一些实施方案中，治疗组合物包含免疫原性肽的前体。疾病特异性免疫原性肽的前体可以是前药。在一些实施方案中，包含疾病特异性免疫原性新抗原肽的药物组合物可进一步包含佐剂。例如，新抗原肽可用作疫苗。在一些实施方案中，免疫原性疫苗可包含药学上可接受的免疫原性新抗原肽。在一些实施方案中，免疫原性疫苗可包含免疫原性新抗原肽的药学上可接受的前体(如蛋白质、肽、DNA和RNA)。在一些实施方案中，治疗方法包括向受试者施用有效量的特异性识别免疫原性新抗原肽的抗体。
本文描述的方法在个性化医学环境中有用，其中使用免疫原性新抗原肽为同一个体开发治疗剂(如疫苗或治疗性抗体)。因此，治疗受试者疾病的方法可包括根据本文所述的方法识别受试者中的免疫原性新抗原肽；合成该肽(或其前体)；以及向受试者施用该肽或特异性识别该肽的抗体。
在一些实施方案中，识别由受试者的肿瘤细胞或免疫原性新抗原肽表达的表位包括从自受试者的肿瘤细胞测序得到的核酸序列池中选择多个核酸序列，所述多个核酸序列编码多个候选肽序列，所述多个候选肽序列包含不存在于从受试者的非肿瘤细胞测序得到的核酸序列池中的一个或多个不同突变，其中从受试者的肿瘤细胞测序得到的核酸序列池和从受试者的非肿瘤细胞测序得到的核酸序列池通过全基因组测序或全外显子组测序来测序。在一些实施方案中，识别由受试者的肿瘤细胞表达的表位或免疫原性新抗原肽进一步包括通过HLA肽结合分析来预测或测量所述多个候选肽序列中的哪些候选肽序列与由同一受试者的HLA等位基因编码的蛋白质形成复合物。在一些实施方案中，识别由受试者的肿瘤细胞表达的表位或免疫原性新抗原肽进一步包括基于HLA肽结合分析从所述候选肽序列中选择多个选定的肿瘤特异性肽或编码所述多个选定的肿瘤特异性肽的一个或多个多核苷酸。在一些实施方案中，由受试者的肿瘤细胞表达的表位是新抗原、肿瘤相关抗原、突变的肿瘤相关抗原，并且/或者其中与所述受试者的正常细胞中所述表位的表达相比，受试者的肿瘤细胞中所述表位的表达更高。
在一些实施方案中，免疫原性新抗原的表达模式可以作为产生患者特异性疫苗的必要基础。在一些实施方案中，免疫原性新抗原的表达模式可以作为产生针对患有特定疾病的一组患者的疫苗的必要基础。因此，可在患者组中选择性地治疗特定疾病，例如，特定类型的肿瘤。
在一些实施方案中，本文所述的肽是结构上正常的抗原，其可以在大的患者组中被自体抗疾病T细胞识别。在一些实施方案中，测定其疾病表达结构上正常的新抗原的一组患病受试者的抗原表达模式。
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物包含至少两个多肽或至少两个多肽分子。在一些实施方案中，所述至少两个多肽或多肽分子中的两个或更多个包含相同长度的相同表位。在一些实施方案中，所述至少两个多肽或多肽分子中的两个或更多个包含不由紧靠受试者基因组中编码表位的核酸序列上游或下游的核酸序列编码的肽序列的相同氨基酸或氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少两个多肽或多肽分子中的两个或更多个包含不同的接头。在一些实施方案中，所述至少两个多肽或多肽分子的第一多肽不包含接头，并且所述至少两个多肽或多肽分子的第二多肽包含接头。在一些实施方案中，所述至少两个多肽或多肽分子的第一多肽在表位的N端上不包含接头，并且所述至少两个多肽或多肽分子的第二多肽在表位的N端上包含接头。在一些实施方案中，所述至少两个多肽或多肽分子的第一多肽在表位的C端不包含接头，并且所述至少两个多肽或多肽分子的第二多肽在表位的C端包含接头。在一些实施方案中，所述至少两个多肽或多肽分子的第一多肽包含接头，并且所述至少两个多肽或多肽分子的第二多肽不包含接头。在一些实施方案中，所述至少两个多肽或多肽分子的第一多肽在表位的N端包含接头，并且所述至少两个多肽或多肽分子的第二多肽在表位的N端不包含接头。在一些实施方案中，所述至少两个多肽或多肽分子的第一多肽在表位的C端包含接头，并且所述至少两个多肽或多肽分子的第二多肽在表位的C端不包含接头。
在一些实施方案中，表位以1ng至10mg或5μg至1.5mg的量存在于药物组合物中。在一些实施方案中，表位以1ng至10mg的量存在。在一些实施方案中，表位以1ng至100ng、10ng至200ng、20ng至300ng、30ng至400ng、40ng至500ng、50ng至600ng、60ng至700ng、70ng至800ng、80ng至900ng、90ng至1μg、100ng至2μg、200ng至3μg、300ng至4μg、400ng至5μg、500ng至6μg、600ng至7μg、700ng至8μg、800ng至9μg、900ng至10μg、1μg至100μg、20μg至200μg、30μg至300μg、40μg至400μg、50μg至500μg、60μg至600μg、70μg至700μg、80μg至800μg、90μg至900μg、100μg至1mg、100μg至1.1mg、300μg至1.2mg、400μg至1.3mg、500μg至1.4mg、600μg至1.5mg、700μg至2mg、800μg至3mg、900μg至4mg、1mg至5mg、1.3mg至6mg、1.5mg至7mg、2mg至8mg、3mg至9mg或4mg至10mg的量存在。在一些实施方案中，表位以约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900或950ng的量存在。在一些实施方案中，表位以约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、或950μg的量存在。在一些实施方案中，表位以约1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9或10mg的量存在。
有多种方法可以产生免疫原性新抗原。蛋白质或肽可以通过本领域技术人员已知的任何技术制备，包括通过标准分子生物学技术表达蛋白质、多肽或肽、从天然来源分离蛋白质或肽、体外翻译或化学合成蛋白质或肽。通常，这类疾病特异性新抗原可以在体外或体内产生。免疫原性新抗原可以在体外作为肽或多肽产生，然后可以将其配制成个性化疫苗或免疫原性组合物并施用于受试者。免疫原性新抗原的体外产生可包括肽合成或在任何多种细菌、真核或病毒重组表达系统中从DNA或RNA分子表达肽/多肽，随后纯化所表达的肽/多肽。或者，可以通过将编码免疫原性新抗原的分子(例如DNA、RNA和病毒表达系统)引入受试者中，由此表达所编码的免疫原性新抗原，从而在体内产生免疫原性新抗原。在一些实施方案中，编码免疫原性新抗原肽的多核苷酸可用于在体外产生新抗原肽。
在一些实施方案中，多核苷酸包含与编码免疫原性新抗原的多核苷酸具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。该多核苷酸可以是，例如，单链和/或双链的DNA、cDNA、多核苷酸的天然或稳定化形式，或其组合。编码免疫原性新抗原肽的核酸序列可以含有或可以不含内含子，只要该核酸序列编码所述肽即可。在一些实施方案中，利用体外翻译来产生肽。
还设想了包含编码新抗原的序列的表达载体，以及含有该表达载体的宿主细胞。适用于本公开的表达载体可包含至少一个与核酸序列可操作地连接的表达控制元件。将表达控制元件插入载体中以控制并调节核酸序列的表达。表达控制元件的实例是本领域公知的，并且包括例如lac系统、λ噬菌体的操纵子和启动子区、酵母启动子以及来源于多瘤、腺病毒、逆转录病毒或SV40的启动子。其他操纵元件包括但不限于前导序列、终止密码子、聚腺苷酸化信号以及核酸序列在宿主系统中适当转录和后续翻译所必需或优选的其他任何序列。本领域技术人员应当理解，表达控制元件的正确组合将取决于所选择的宿主系统。应进一步理解，所述表达载体应含有在宿主系统中转移和后续复制含有核酸序列的表达载体所必需的其他元件。这类元件的实例包括但不限于复制起点和选择性标记。
新抗原肽可以以编码所需新抗原肽的RNA或cDNA分子的形式提供。本公开的一种或多种新抗原肽可以由单一表达载体编码。通常，将DNA以适当的取向和正确的阅读框插入表达载体如质粒中用于表达，如有必要，DNA可以与由所需宿主(例如，细菌)识别的适当的转录和翻译调节控制核苷酸序列连接，尽管这样的控制通常可在表达载体中获得。然后将载体引入宿主细菌中以使用标准技术进行克隆。用于真核宿主，尤其是哺乳动物或人的有用的表达载体包括，例如，包含来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。用于细菌宿主的有用的表达载体包括已知的细菌质粒，诸如来自大肠杆菌的质粒(包括pCR 1、pBR322、pMB9及其衍生物)、更宽的宿主范围的质粒，如M13和丝状单链DNA噬菌体。用于表达多肽的合适宿主细胞在多核苷酸部分[0250]中进行论述。适用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的克隆和表达载体是本领域公知的。
可以根据任何合适的方法纯化由转化的宿主产生的蛋白质。这类标准方法包括色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法和大小分级柱色谱法等)，离心、差异溶解性或通过用于蛋白质纯化的其他任何标准技术。诸如六组氨酸、麦芽糖结合域、流感病毒外壳序列、谷胱甘肽-S-转移酶等亲和标签可以附接至该蛋白质上，以允许通过合适的亲和柱轻松纯化。分离的蛋白质还可以使用诸如蛋白水解、核磁共振和X射线晶体学等技术进行物理表征。
疫苗可包含结合本文所述的多肽序列的实体。该实体可以是抗体。基于抗体的疫苗可以使用如本领域所理解的任何公知的技术、载体和赋形剂配制。在一些实施方案中，本文所述的肽可用于制备新抗原特异性治疗剂，如抗体治疗剂。例如，新抗原可用来产生和/或识别特异性识别新抗原的抗体。这些抗体可用作治疗剂。该抗体可以是自然抗体、嵌合抗体、人源化抗体，或者可以是抗体片段。该抗体可以识别一种或多种本文所述的多肽。在一些实施方案中，该抗体可以识别具有以下序列的多肽，该序列与本文所述的多肽具有至多40％、50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，该抗体可以识别具有以下序列的多肽，该序列与本文所述的多肽具有至少40％、50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，该抗体可以识别这样的多肽序列，该多肽序列是本文所述多肽的长度的至少30％、40％、50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，该抗体可以识别这样的多肽序列，该多肽序列是本文所述多肽的长度的至多30％、40％、50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
本公开还设想使用核酸分子作为媒介物，以供在体内以例如DNA疫苗的形式将新抗原肽/多肽递送至有需要的受试者。
在一些实施方案中，所述疫苗是核酸疫苗。在一些实施方案中，所述核酸编码免疫原性肽或肽前体。在一些实施方案中，所述核酸疫苗包含在编码免疫原性肽或肽前体的序列侧翼的序列。在一些实施方案中，该核酸疫苗包含超过一个免疫原性表位。在一些实施方案中，该核酸疫苗是基于DNA的疫苗。递送方法在多核苷酸部分[0250]中进行论述。
多核苷酸可以是基本上纯的，或包含在合适的载体或递送系统中。合适的载体和递送系统包括病毒，如基于腺病毒、痘苗病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、腺相关病毒或含有超过一种病毒的元件的杂合体的系统。非病毒递送系统包括阳离子脂质和阳离子聚合物(例如，阳离子脂质体)。
可以使用基于病毒的系统在体内编码并表达一种或多种新抗原肽。在本公开中可使用病毒载体作为重组载体，其中删除病毒基因组的一部分以引入新基因而不破坏病毒的感染性。本公开的病毒载体是非致病性病毒。在一些实施方案中，该病毒载体对哺乳动物中的特定细胞类型具有趋向性。在另一个实施方案中，本公开的病毒载体能够感染专职抗原呈递细胞，如树突细胞和巨噬细胞。在本公开的又一个实施方案中，该病毒载体能够感染哺乳动物中的任何细胞。该病毒载体还可以感染肿瘤细胞。在本公开中使用的病毒载体包括但不限于痘病毒如痘苗病毒、禽痘病毒、鸡痘病毒和高度减毒的痘苗病毒(Ankara或MVA)、逆转录病毒、腺病毒、杆状病毒等。
疫苗可以通过多种途径递送。递送途径可包括经口(包括经颊和舌下)、直肠、经鼻、局部、透皮贴剂、经肺、阴道、栓剂或胃肠外(包括肌肉内、动脉内、鞘内、皮内、腹膜内、皮下和静脉内)施用，或者以适于通过雾化、吸入或吹入施用的形式施用。关于药物递送系统的一般信息可见Ansel等人,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(Lippencott Williams&Wilkins,Baltimore Md.(1999)。本文所述的疫苗可以施用于肌肉，或者可以通过皮内或皮下注射或以透皮方式(例如通过离子电渗)施用。可以使用疫苗的表皮施用。本文所述的疫苗可以通过皮内注射、鼻内喷雾应用、肌内注射、腹膜内注射、静脉内注射、口服施用或皮下注射进行施用。
在一些情况下，疫苗还可以被配制用于通过鼻道施用。其中载体是固体的适合经鼻施用的制剂可包括粒径例如在约10至约500微米范围内的粗粉末，其以鼻吸的方式施用，即，通过鼻道从靠近鼻子的粉末容器中快速吸入。该制剂可以是鼻喷雾剂、滴鼻剂或通过雾化器进行气雾剂施用。该制剂可包括疫苗的水性或油性溶液。
疫苗可以是液体制品，如悬浮液、糖浆或酏剂。疫苗还可以是用于胃肠外、皮下、皮内、肌肉内或静脉内施用(例如，可注射施用)的制品，如无菌悬浮液或乳液。
疫苗可包括用于单次免疫的材料，或者可包括用于多次免疫的材料(即“多剂量”试剂盒)。在多剂量设置中优选包含防腐剂。作为在多剂量组合物中包含防腐剂的替代(或除此之外)，所述组合物可被包含在具有用于去除材料的无菌适配器的容器中。
疫苗可以以约0.5mL的剂量体积施用，但半剂量(即约0.25mL)可施用于儿童。有时，疫苗可以以更高的剂量施用，例如约1ml。
疫苗可以以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个剂量疗程方案来施用。有时，疫苗以1、2、3或4个剂量疗程方案来施用。有时，疫苗以1个剂量疗程方案来施用。有时，疫苗以2个剂量疗程方案来施用。
第一剂量和第二剂量的施用可以间隔约0天、1天、2天、5天、7天、14天、21天、30天、2个月、4个月、6个月、9个月、1年、1.5年、2年、3年、4年或更多年。
本文所述的疫苗可以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年施用。有时，本文所述的疫苗可以每2、3、4、5、6、7年或更多年施用。有时，本文所述的疫苗可以每4、5、6、7年或更多年施用。有时，本文所述的疫苗施用一次。
所述剂量实例并非限制性的，并且仅用来举例说明用于施用本文所述疫苗的特定给药方案。可以从动物模型确定用于人类的有效量。例如，可以配制用于人类的剂量以达到已发现对动物有效的循环、肝脏、局部和/或胃肠道浓度。基于动物数据和其他类型的相似数据，本领域技术人员可以确定适合人类的疫苗组合物的有效量。
在提及药剂或药剂组合时，有效量通常意指已由医学或制药领域的任何各种管理或咨询组织(例如，FDA、AMA)或者由制造商或供应商推荐或批准的剂量范围、给药方式、制剂等。
在一些方面，本文所述的疫苗和试剂盒可以在2℃至8℃之间储存。在一些情况下，疫苗不冷冻储存。在一些情况下，将疫苗储存在如-20℃或-80℃的温度下。在一些情况下，将疫苗避光储存。
7.试剂盒
本文所述的新抗原治疗剂可以与给药说明书一起以试剂盒形式提供。通常，该试剂盒包括在容器中的单位剂型形式的所需新抗原治疗剂和给药说明书。该试剂盒中还可包括附加治疗剂，例如细胞因子、淋巴因子、检查点抑制剂、抗体。其他可能需要的试剂盒组分包括，例如，无菌注射器、加强剂量和其他所需的赋形剂。
本文还提供了与本文所述的一种或多种方法一起使用的试剂盒和制品。该试剂盒可含有一种或多种包含一个或多个新表位的新抗原多肽。该试剂盒还可含有编码一种或多种本文所述的肽或蛋白质的核酸，识别一种或多种本文所述肽的抗体，或用一种或多种本文所述肽激活的基于APC的细胞。该试剂盒可以进一步含有组成和递送该疫苗所必需的佐剂、试剂和缓冲液。
该试剂盒还可包括载具、包装或容器，该容器被区室化为容纳一个或多个容器如小瓶、管等，每个容器包含将在本文描述的方法中使用的一种单独元素，如肽和佐剂。合适的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器和试管。该容器可由多种材料如玻璃或塑料形成。
本文提供的制品含有包装材料。药物包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶子、管、袋、容器、瓶子，和任何适于选定制剂和预期给药和治疗模式的包装材料。试剂盒一般包括列出了内容物的标签和/或使用说明书，以及带有使用说明的包装插页。一般也包括一套说明书。
将通过具体实施方案更详细地描述本公开内容。提供以下实施方案是为了说明的目的，并非旨在以任何方式限制本公开内容。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改以产生本公开的替代实施方案的多种非关键参数。本文列出的所有专利、专利申请和印刷出版物均通过引用整体并入本文。
实施例
提供这些实施方案仅仅是为了说明性目的，而并非限制本文提供的权利要求书的范围。
实施例1-对多肽的增强裂解和处理的评估
T细胞受体(TCR)转导的细胞用于在体外筛选多肽以进行表位处理和呈递。将表达CD8的工程化Jurkat细胞与经验证的TCR一起制备为效应细胞。对于靶细胞，具有特异性HLA等位基因的外周血单核细胞(PBMC)采用FLT3-配体刺激过夜，负载在不同环境中含有感兴趣表位的多肽一小时，并用细胞因子使其成熟。将工程化Jurkat细胞和PBMC共培养48小时，并测量由工程化Jurkat细胞分泌的IL-2水平作为TCR识别肽的读出。实验设计示于图3中，结果示于图4和5中。
实施例2-新抗原多肽的免疫原性
研究了围绕特异性表位设计的多种多肽的免疫原性，以及对这些多肽的T细胞应答的质量。在到达时，将八十四只8-12周龄雌性C57BL/6小鼠(Taconic Biosciences)随机地和前瞻性地分配到治疗组。在研究开始前使动物适应三天。动物食用LabDietTM 5053无菌啮齿动物食料，并且无菌水任意取用。组1中的12只动物作为未接种疫苗的对照。组2-7的每组中的12只动物接受50μg polyIC:LC和10μg每种多肽(表13中定义；粗体序列代表最小表位)或替代肽设计的摩尔匹配等价物(表14中定义)。Kif18b用作CD4辅助肽，并在组2-7的所有小鼠中使用未修饰的Kif18b。在第7、14和21天通过眶后放血收集血液。每天称重并监测动物的一般健康。如果动物与其在第0天的体重相比损失＞30％的体重，或者如果发现动物濒死，则在研究完成的第21天通过过量CO2使动物安乐死。
表13.用于研究的肽
Figure BDA0003504116290001831
表14.实验设计(也参见图6)
Figure BDA0003504116290001832
MHC四聚体在现场制备并用于测量免疫原性测定中的肽特异性T细胞扩增。为了评估，将四聚体加入到在含有1％FCS和0.1％叠氮化钠(FACS缓冲液)的PBS中的1×105个细胞中。细胞在黑暗中37℃孵育15分钟。然后将对T细胞标记物(如CD8)特异的抗体和对不相关细胞类型(如CD4/CD11b/CD11c/CD19)特异的抗体添加至制造商建议的终浓度，并将细胞在黑暗中于4℃孵育20分钟。用冷FACS缓冲液洗涤细胞，然后立即在LSR2(Becton Dickinson)仪器上进行分析，并通过使用FacsDiva软件(Becton Dickinson)进行分析。为了分析四聚体阳性细胞，从前向和侧向散射图上选取淋巴细胞门(gate)。数据报道为CD4-CD11b-CD11c-CD19-CD8+/四聚体+细胞的百分比。
用K4-表位的免疫接种显著增加了对6个评估表位中5个的免疫应答。对Alg8、Lama4、Reps1、Adpgk和Obsl1的免疫应答显著增加。用K4-表位的免疫接种增加了免疫原性差的表位(例如Obsl1)的免疫原性。K4-Val-Cit-PABC-表位免疫接种增加了Alg8特异性免疫应答。结果如图7-9所示。
实施例3-二硫键接头(化合物5)的合成
步骤1
Figure BDA0003504116290001841
将2,2’-双(5-硝基吡啶基)二硫化物2(2mmol)悬浮于10mL二氯甲烷中，并将二氯甲烷(4mL)中的相应的巯基醇1(1mmol，其中R1和R2如本文所定义)加入悬浮液中。将所得悬浮液在室温下搅拌16小时。减压移除溶剂。将所得的残余物再溶解在5mL二甲基甲酰胺中，并用乙腈和含0.05％TFA的水的梯度使用C18反相柱进行纯化。合并并冻干所需级分以得到(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基烷基醇3(约65-82％产率，＞90％纯度，在220nm处进行UPLC-MS/UV分析)。
步骤2
Figure BDA0003504116290001851
向(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基烷基醇3(0.5mmol，其中R1和R2如本文所定义)在二甲基甲酰胺(2mL)中的溶液中加入N,N'-二异丙基乙胺(1.5mmol)，随后加入4-氯甲酸硝基苯酯4(0.55mmol)。将该溶液在室温下搅拌16小时，然后用乙腈和含0.05％TFA的水的梯度使用C18反相柱进行纯化。合并并冻干所需级分以得到4-硝基苯基-(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基烷基碳酸酯5(约90-98％产率，＞90％纯度，在220nm处进行UPLC-MS/UV分析)。
实施例4-含二硫化物的肽的合成
步骤1：4-硝基-2-吡啶基巯基活化的二硫化物肽8的形成
Figure BDA0003504116290001852
根据上述方案，肽结合树脂6(可使用任何制备用于固相肽合成的树脂)的N-端用接头5(其中R1和R2如本文所定义)手动酰化，或在自动肽合成仪上相应地程序化。更具体地，将树脂6(0.05mmol)在二甲基甲酰胺中溶胀5分钟，并排干。将相应的4-硝基苯基-(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基烷基碳酸酯5(0.2mmol)和Oxyma Pure
Figure BDA0003504116290001853
(也称为Oxyma Pure，0.3mmol)溶解在1mL二甲基甲酰胺中，加入到溶胀的树脂6中，然后加入N,N’-二异丙基乙胺(0.3mmol)。将所得的树脂悬浮液搅拌3小时，排干，然后用二甲基甲酰胺(5x，5mL)、二氯甲烷(5x，5mL)和甲醇(2x，5mL)冲洗所得的肽结合树脂7。将肽结合树脂7减压干燥1小时，并使用3mL 95％三氟乙酸(TFA)、2.5％水、2.5％三异丙基硅烷(TIPS)在室温下裂解3小时，以形成含有未结合的肽8和来自7的裂解树脂的裂解溶液(“A”)。然后过滤该裂解溶液A并在50mL锥形管中排干，来自7的裂解树脂用95:5的TFA:水溶液(1mL)洗涤、过滤、排干并合并以得到经过滤的肽溶液(“B”)。通过用冰冷的二乙醚进行沉淀，将未结合的肽8从经过滤的肽溶液B中分离，并在3600rpm离心5分钟，并且倾析出二乙醚。然后用20mL冰冷的二乙醚冲洗所得肽沉淀，以得到悬浮液，然后将悬浮液涡旋并再次以3600rpm离心3分钟。重复该操作总共3次洗涤，以彻底冲洗沉淀，从而得到4-硝基苯基-(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基烷基氨基甲酸酯肽8，其无需进一步纯化即可用于下一合成步骤。
步骤2：进行二硫化物交换反应以形成含二硫化物的肽10
Figure BDA0003504116290001861
如以上方案中所述，粗4-硝基苯基-(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基烷基氨基甲酸酯肽8(其中R1和R2如本文所定义)与所需的含硫醇分子9(其中G1和j如本文所定义)进行二硫化物交换。更具体地，将4-硝基苯基-(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基烷基氨基甲酸酯肽8(0.05mmol)溶解在二甲基甲酰胺(1mL)中，然后加入在1:1二甲基甲酰胺-1M Tris缓冲液中的含所需硫醇的化合物9(0.05mmol)。将所得的黄色溶液搅拌2小时，并用乙腈和含0.05％TFA的水的梯度使用C18反相柱进行纯化。合并并冻干所需级分以得到含有二硫化物的肽10(约10-30％产率，＞95％纯度，在220nm处进行UPLC-MS/UV分析，从固相肽合成开始)。
实施例5-含PABC的肽(13)的合成
Figure BDA0003504116290001871
如上方案所述，将肽结合的树脂6的N-端用Fmoc-AA-AA-PAB-PNP 11手动酰化，或在自动肽合成仪上相应地程序化。更具体地，将树脂6(0.05mmol)在二甲基甲酰胺中溶胀5分钟，并排干。将相应的Fmoc-AA-AA-PAB-PNP 11(0.2mmol)和Oxyma Pure
Figure BDA0003504116290001872
(也称为Oxyma Pure，0.3mmol)溶解在1mL二甲基甲酰胺中，加入到树脂6中，然后添加N,N’-二异丙基乙胺(0.3mmol)。将所得树脂悬浮液搅拌3小时并排干，然后用二甲基甲酰胺(5x，5mL)冲洗所得的Fmoc保护的树脂12。用在二甲基甲酰胺中的20％哌啶(2x，5分钟)除去最后的N-端α-Fmoc。此时，脱保护的中间体12可以任选地使用标准Fmoc固相肽合成法在12的N-端处与另外的氨基酸残基反应，接着使用如上文刚刚描述的类似程序进行N-端α-Fmoc脱保护。在完成所需的Fmoc脱保护后，用二甲基甲酰胺(5x，5mL)、二氯甲烷(5x，5mL)和随后的甲醇(2x，5mL)冲洗树脂12(或具有延伸氨基酸的类似物)。将肽结合的树脂12减压干燥1小时，并用3mL 70％三氟乙酸(TFA)、10％苯酚、10％三异丙基硅烷(TIPS)和10％茴香硫醚在室温下裂解30分钟，以形成含有未结合的肽13和来自12的裂解树脂的裂解溶液(“A”)。然后过滤并排干该裂解溶液A，以得到在50mL锥形管中的经过滤的肽溶液(“B”)。将来自12的裂解树脂用95:5TFA:水溶液(1mL)洗涤、过滤、排干并与经过滤的肽溶液B合并。通过用冰冷的二乙醚进行沉淀，将未结合的肽13从经过滤的肽溶液B中分离，并在3600rpm离心5分钟，并且倾析出二乙醚。然后用20mL冰冷的二乙醚冲洗所得的肽沉淀，以得到悬浮液，然后将悬浮液涡旋并再次以3600rpm离心3分钟。重复该操作总共3次洗涤，以彻底冲洗沉淀，从而得到化合物13(约10-30％产率，＞95％纯度，在220nm出进行从UPLC-MS/UV分析，固相肽合成开始)。
实施例6-TMPRSS2::ERG表位处理的评估
将T细胞受体(TCR)转导的细胞用于在HLA-A02:01上体外评估TMPRSS2::ERG表位处理和呈递。将表达CD8的工程化Jurkat细胞与经验证的TCR一起制备为效应细胞。对于靶细胞，将天然表达HLA-A02:01的293T细胞：i)负载含有TMPRSS2::ERG表位的肽仅24小时，或ii)用编码含有不同环境中的TMPRS2::ERG表位(天然环境中的表位，即肽还包含在N-和/或C-端上天然侧接表位序列的氨基酸或氨基酸序列；非天然环境中的表位，即肽还包含非天然侧接表位序列的氨基酸或氨基酸序列，例如CMVpp65序列)的肽的质粒稳定转导，或用编码含有在非天然环境中的不相关表位的肽的质粒(作为对照)稳定转导。将工程化Jurkat细胞和293T细胞共培养24小时，并测量工程化Jurkat细胞分泌的IL-2水平作为TCR肽识别的读出。结果如图10所示。
实施例7-多肽的增强的裂解和处理以及免疫原性的比较
针对表位处理和呈递，将T细胞受体(TCR)转导的细胞用于体外比较来自含有以下项的肽的RAS-G12V-HLA-A11:01表位的处理：仅RAS-G12V表位、RAS-G12V表位和仅在N-端的侧接表位的额外氨基酸序列、或RAS-G12V表位和在N-和C-端的侧接表位的额外氨基酸序列。将表达CD8的工程化Jurkat细胞与经验证的TCR一起制备为效应细胞。对于靶细胞，具有特异性HLA等位基因的外周血单核细胞(PBMC)采用FLT3-配体刺激过夜，负载在不同环境中含有RAS-G12V表位的多肽一小时，并用细胞因子使其成熟。将工程化Jurkat细胞和PBMC共培养48小时，并测量工程化Jurkat细胞分泌的IL-2水平作为TCR识别肽的读出。结果示于图11。
实施例8-表位周围具有不同环境的RAS突变肽的免疫原性评估
材料：
AIM V培养基(Invitrogen)
人FLT3L，临床前CellGenix#1415-050储液50ng/μL
TNF-α，临床前CellGenix#1406-050储液10ng/μL
IL-1β，临床前CellGenix#1411-050储液10ng/μL
PGE1或Alprostadil—来自捷克共和国Cayman储液0.5μg/μL
R10培养基-RPMI 1640谷氨酰胺+10％人血清+1％PenStrep
20/80培养基-18％AIM V+72％RPMI 1640谷氨酰胺+10％人血清+1％
PenStrep
IL7储液5ng/μL
IL15储液5ng/μL
程序：
步骤1：将5百万个PBMC(或感兴趣细胞)铺板在24孔板的每个孔中，孔中具有在2mLAIM V培养基中的FLT3L
步骤2：在AIMV中的肽负载和成熟
1.将感兴趣的肽库(除了没有肽的条件)与PBMC(或感兴趣细胞)在各自的孔中混合。
2.孵育1小时。
3.孵育后，将成熟混合物(包括TNF-α、IL-1β、PGE1和IL-7)混合到每个孔中。
步骤3：以10％体积的终浓度将人血清加入到每个孔中并混合。
步骤4：用补充有IL7+IL15的新鲜RPMI+10％HS培养基替换培养基。
步骤5：在孵育期间，每1-6天用补充有IL7+IL15的新鲜20/80培养基替换培养基。
步骤6：将5百万个PBMC(或感兴趣细胞)铺板在新的6孔板的每个孔中，孔中具有在2mL AIM V培养基中的FLT3L
步骤7：进行肽负载和成熟以进行再刺激(新板)
1.将感兴趣的肽库(除了没有肽的条件)与PBMC(或感兴趣细胞)在各自的孔中混合。
2.孵育1小时。
3.孵育后，将成熟混合物混合到每个孔中。
步骤8：再刺激：
1.对第一刺激FLT3L培养物进行计数，并将5百万个培养的细胞加入新的再刺激板中。
2.将培养物体积调至5mL(AIM V)，并且加入500μl人血清(10％体积)
步骤9：移除3ml培养基，并加入6ml补充有IL7+IL15的RPMI+10％HS培养基。
步骤10：用补充有IL7+IL15的新鲜20/80培养基替换75％的培养基。
步骤11：如果需要，重复再刺激。
抗原特异性诱导的分析
MHC四聚体是购买的或原地制备的，并且用来在免疫原性测定中测量肽特异性T细胞扩充。为了进行评估，根据制造商的说明书，将四聚体加入到含有1％FCS和0.1％叠氮化钠(FACS缓冲液)的PBS中的1x105个细胞中。将细胞在室温下在黑暗中孵育20分钟。然后添加对T细胞标志物如CD8具有特异性的抗体至制造商建议的终浓度，并将细胞在4℃下在黑暗中孵育20分钟。用冷的FACS缓冲液洗涤细胞，并将其重悬浮于含有1％甲醛的缓冲液中。在LSR Fortessa(Becton Dickinson)仪器上获得细胞，并通过使用FlowJo软件(BectonDickinson)进行分析。为了分析四聚体阳性细胞，从前向和侧向散射图上选取淋巴细胞门。数据被报告为CD8+/四聚体+细胞的百分比
将肽免疫原性工作流程(即T细胞诱导和四聚体分析)用于评估图11中所述的三种肽设计的相对免疫原性。图12顶部示出了示例性数据，显示基于跨3个供体的命中率，具有在C-端的表位的肽相对于具有在中间的表位的肽的免疫原。还使用如实施例2中所述的体内小鼠疫苗接种策略评估了相同的三种肽设计。图12底部示出了示例性数据，显示具有在C-端的表位的肽相对于具有在中间的表位的肽的免疫原性增加。
实施例9-当用编码肽的mRNA刺激APC时的高CD8命中率
如图13A图示，以串联新抗原串的形式构建了短聚体(9-10个氨基酸)或长聚体(25个氨基酸)。抗原的序列由彩色框表示。如NetChop(预测人类蛋白质组裂解的算法)所预测的，在抗原序列之间添加了接头序列(K、QLGL或GVGT-表示为蓝色圆圈)。如果预测序列在抗原序列内裂解，则添加裂解位点以促进抗原序列之间的裂解。然后用前述编码多抗原的mRNA构建体对PBMC进行核转染，并将其用来刺激T细胞。用一致的肽库进行并排比较，其长度和序列与RNA串内编码的肽相同。短和长RNA序列使得产生了对多聚体应答的类似CD8+T细胞(表15)。值得注意，使用编码长聚体和短聚体的mRNA观察到强CD8应答。
表15-肽与RNA长聚体和短聚体介导的激活的比较
Figure BDA0003504116290001911
如图13B所示，Gli3表位被肽以及mRNA良好地呈现和呈递，然而，mRNA编码的Gli3短聚体表位负载的PBMC导致更高的Gli3特异性CD8+T细胞(如通过多聚体测定检测的)。多聚体测定的代表性流式细胞术结果示于图13C中。在该串中，Gli3序列之前的序列来自非天然环境。这可能增强了来自多肽串的Gli3的处理和呈递，并且与肽相比增加了应答。另外，该mRNA短聚体串引起ME-1T细胞应答，该应答不存在于一致的短肽库中。在这些串中，ME-1在表位序列之前和之后具有裂解位点，这种增强的表位处理和呈递可导致更好的T细胞应答。
实施方案的段落
一种多肽，包含由抗原呈递细胞(APC)的I类MHC或II类MHC呈递的表位，所述多肽具有式(I)的结构：
Yn-Bt-Ar-Xm-As-Cu-Zp
式(I)，
或其药学上可接受的盐，
(i)其中Xm是所述表位，其中每个X独立地代表由受试者基因组的核酸序列编码的连续氨基酸序列的氨基酸，
并且其中(a)所述MHC是I类MHC并且m是8至12的整数，或
(b)所述MHC是II类MHC并且m是9-25的整数；
(ii)其中每个Y独立地为氨基酸、其类似物或衍生物，并且其中：
(A)当式(I)中Ar的变量r为0时，Yn不由紧靠所述受试者基因组中编码Br-Ar-Xm的核酸序列上游的核酸序列编码，
(B)当式(I)中Ar的变量r为1且式(I)中Bt的变量t为0时，Yn不由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的核酸序列编码，或者
(C)当式(I)中Ar的变量r为1且式(I)中Bt的变量t为1或更大时，Yn不由紧靠所述受试者基因组中编码Bt的核酸序列上游的核酸序列编码；并且
进一步地，其中n是0至1000的整数；
(iii)其中每个Z独立地为氨基酸、其类似物或衍生物，并且其中：
(A)当式(I)中As的变量s为0时，Zp不由紧靠所述受试者基因组中编码Xm-As-Cu的核酸序列下游的核酸序列编码，
(B)当式(I)中As的变量s为1且式(I)中Cu的变量u为0时，Zp不由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的核酸序列编码，或者
(C)当式(I)中As的变量s为1且式(I)中Cu的变量u为1或更大时，Zp不由紧靠所述受试者基因组中编码Cu的核酸序列下游的核酸序列编码；并且
进一步地，其中p是0至1000的整数；
并且进一步地其中，
当n为0时，p是1至1000的整数；并且
当p为0时，n是1至1000的整数；
(iv)其中Ar是接头，并且r是0或1；
(v)其中As是接头，并且s是0或1；
(vi)其中每个B独立地代表由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的所述受试者基因组中的核酸序列编码的氨基酸，
并且其中t是0至1000的整数；
(vii)其中每个C独立地代表由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的所述受试者基因组中的核酸序列编码的氨基酸，
并且其中u是0-1000的整数；
并且进一步地其中，
(a)所述多肽不是由通过I类MHC呈递的四个不同表位组成；
(b)所述多肽包含至少两个不同的多肽分子；
(c)所述表位包含至少一个突变氨基酸；并且/或者
(d)当所述多肽被所述APC处理时，Yn和/或Zp从所述表位裂解。
段[0492]所述的多肽，其中所述表位由II类MHC呈递。
段[0492]或[0493]所述的多肽，其中m是9-25的整数。
段[0492]-[0494]中任一项所述的多肽，其中t是1、2、3、4或5或更大，且r是0。
段[0492]-[0495]中任一项所述的多肽，其中u是1、2、3、4或5或更大，且s是0。
段[0492]-[0496]中任一项所述的多肽，其中t是1或更大，r是0，且n是1-1000。
段[0492]-[0497]中任一项所述的多肽，其中u是1或更大，s是0，且p是1-1000。
段[0492]-[0498]中任一项所述的多肽，其中t是0。
段[0492]-[0499]中任一项所述的多肽，其中u是0。
段[0492]-[0500]中任一项所述的多肽，其中t是至少1，且Bt包含赖氨酸。
段[0492]-[0501]中任一项所述的多肽，其中u为至少1，且Cu包含赖氨酸。
段[0492]-[0502]中任一项所述的多肽，其中当所述多肽被APC处理时，Bt从所述表位裂解。
段[0492]-[0503]中任一项所述的多肽，其中当所述多肽被APC处理时，Cu从所述表位裂解。
段[0492]-[0504]中任一项的单独多肽，其中n是1至5或7至1000的整数。
段[0492]-[0505]中任一项所述的多肽，其中p是1至4或6至1000的整数。
段[0492]-[0506]中任一项所述的多肽，其中所述多肽不是由通过I类MHC呈递的四个不同表位组成。
段[0492]-[0507]中任一项所述的多肽，其中所述多肽不包含由I类MHC呈递的四个不同表位。
段[0492]-[0508]中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含至少两个不同的多肽分子。
段[0492]-[0509]中任一项所述的多肽，其中所述表位包含至少一个突变氨基酸。
段[0510]所述的多肽，其中所述至少一个突变氨基酸由所述受试者基因组中的核酸序列中的插入、缺失、移码、neoORF或点突变编码。
段[0492]-[0511]中任一项所述的多肽，其中当所述多肽被APC处理时，Yn和/或Zp从所述表位裂解。
段[0492]-[0512]中任一项所述的多肽，其中Xm中的m为至少8，且其中Xm为AA1AA2AA3AA4AA5AA6AA7AA8AA9AA10AA11AA12AA13AA14AA15AA16AA17AA18AA19AA20AA21AA22AA23AA24AA25，其中每个AA为氨基酸，且其中AA9、AA10、AA11、AA12、AA13、AA14、AA15、AA16、AA17、AA18、AA19、AA20、AA21、AA22、AA23、AA24和AA25中的一个或多个任选地存在，且进一步地其中至少一个AA为突变氨基酸。
段[0492]-[0513]中任一项所述的多肽，其中r是1。
段[0492]-[0514]中任一项所述的多肽，其中s是1。
段[0492]-[0515]中任一项所述的多肽，其中r是1，且s是1。
段[0492]-[0516]中任一项所述的多肽，其中r是0。
段[0492]-[0517]中任一项所述的多肽，其中s是0。
段[0492]-[0518]中任一项所述的多肽，其中r是0，且s是0。
段[0492]-[0519]中任一项所述的多肽，其中Ar和/或As是非多肽接头。
段[0492]-[0520]中任一项所述的多肽，其中Ar和/或As是化学接头。
段[0492]-[0521]中任一项所述的多肽，其中Ar和/或As包含非天然氨基酸。
段[0492]-[0522]中任一项所述的多肽，其中Ar和/或As不包含氨基酸。
段[0492]-[0523]中任一项所述的多肽，其中Ar和/或As不包含天然氨基酸。
段[0492]-[0524]中任一项所述的多肽，其中Ar和/或As包含不同于肽键的键。
段[0492]-[0525]中任一项所述的多肽，其中Ar和/或As包含二硫键。
段[0492]-[0526]中任一项所述的多肽，其中Ar和As不同。
段[0492]-[0527]中任一项所述的多肽，其中Ar和As相同。
段[0492]-[0528]中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含亲水尾。
段[0492]-[0529]中任一项所述的多肽，其中与不含Yn-Bt-Ar和/或As-Cu-Zp的相应肽相比，Yn-Br-Ar和/或As-Cu-Zp增强所述多肽的溶解性。
段[0492]-[0530]中任一项所述的多肽，其中Xm的每个X是天然氨基酸。
段[0492]-[0531]中任一项所述的多肽，其中当所述多肽被APC处理时，所述表位从Yn-Bt-Ar和/或As-Cu-Zp释放。
段[0492]-[0532]中任一项所述的多肽，其中所述多肽在Ar和/或As处裂解。
段[0492]-[0533]中任一项所述的多肽，其中当n是1至1000的整数时，与裂解包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽相比，所述多肽以更高的速率裂解，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的核酸序列编码；并且/或者其中当p是1至1000的整数时，与裂解包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽相比，所述多肽以更高的速率裂解，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的核酸序列编码。
段[0492]-[0533]中任一项所述的多肽，其中当n是1至1000的整数时，与裂解包含Bt-Xm的相同长度的相应多肽相比，所述多肽以更高的速率裂解，其中t为至少1且式(I)中变量Ar的r为0；并且/或者其中当p是1至1000的整数时，与裂解包含Xm-Cu的相同长度的相应多肽相比，所述多肽以更高的速率裂解，其中u为至少1且式(I)中变量As的s为0。
段[0492]-[0535]中任一项所述的多肽，其中当n是1至1000的整数时，与裂解包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽相比，所述多肽在Ar处以更高的速率裂解，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的核酸序列编码；并且/或者其中当p是1至1000的整数时，与裂解包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽相比，所述多肽在As处以更高的速率裂解，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的核酸序列编码。
段[0492]-[0536]中任一项所述的多肽，其中当n是1至1000的整数时，与包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽的表位呈递相比，所述APC的表位呈递增强，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的核酸序列编码；并且/或者其中当p是1至1000的整数时，与包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽的表位呈递相比，所述APC的表位呈递增强，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的核酸序列编码。
段[0492]-[0536]中任一项所述的多肽，其中当n是1至1000的整数时，与包含Bt-Xm的相同长度的相应多肽的表位呈递相比，所述APC的表位呈递增强，其中t为至少1且式(I)中变量Ar的r为0；并且/或者其中当p是1至1000的整数时，与包含Xm-Cu的相同长度的相应多肽的表位呈递相比，所述APC的表位呈递增强，其中u为至少1且式(I)中变量As的s为0。
段[0492]-[0538]中任一项所述的多肽，其中所述APC将所述表位呈递至免疫细胞。
段[0492]-[0539]中任一项所述的多肽，其中所述APC将所述表位呈递至吞噬细胞。
段[0492]-[0540]中任一项所述的多肽，其中所述APC将所述表位呈递至树突细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞。
段[0492]-[0541]中任一项所述的多肽，其中所述APC优先或特异性地将所述表位呈递至免疫细胞、吞噬细胞、树突细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞。
段[0492]-[0542]中任一项所述的多肽，其中当n是1至1000的整数时，与包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽的免疫原性相比，免疫原性增强，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的核酸序列编码；并且/或者其中当p是1至1000的整数时，与包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽的免疫原性相比，免疫原性增强，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的核酸序列编码。
段[0492]-[0542]中任一项所述的多肽，其中当n是1到1000的整数时，与包含Bt-Xm的相同长度的相应多肽的免疫原性相比，免疫原性增强，其中t为至少1且式(I)中的变量Ar的r为0；并且/或者其中当p是1-1000的整数时，与包含Xm-Cu的相同长度的相应多肽的免疫原性相比，免疫原性增强，其中u为至少1且式(I)中的变量As的s为0。
段[0492]-[0544]中任一项所述的多肽，其中当n是1至1000的整数时，与包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽的抗肿瘤活性相比，抗肿瘤活性增强，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的核酸序列编码；并且/或者其中当p是1至1000的整数时，与包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽的抗肿瘤活性相比，抗肿瘤活性增强，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的核酸序列编码。
段[0492]-[0544]中任一项所述的多肽，其中当n是1至1000的整数时，与包含Bt-Xm的相同长度的相应多肽的抗肿瘤活性相比，抗肿瘤活性增强，其中t为至少1且式(I)中的变量Ar的r为0；并且/或者其中当p是1至1000的整数时，与包含Xm-Cu的相同长度的相应多肽的抗肿瘤活性相比，抗肿瘤活性增强，其中u为至少1且式(I)中的变量As的s为0。
段[0492]-[0546]中任一项所述的多肽，其中Yn和/或Zp包含选自聚赖氨酸(polyK)和聚精氨酸(polyR)的序列。
段[0547]所述的多肽，其中Yn和/或Zp包含选自polyK-AA-AA和polyR-AA-AA的序列，且其中每个AA是氨基酸或其类似物或衍生物。
段[0547]或[0548]所述的多肽，其中所述polyK包含poly-L-Lys。
段[0547]或[0548]所述的多肽，其中所述polyR包含poly-L-Arg。
段[0547]-[0550]中任一项所述的多肽，其中所述polyK或polyR分别包含至少三个或四个连续的赖氨酸残基或至少三个或四个连续的精氨酸残基。
段[0492]-[0551]中任一项所述的多肽，其中Ar和/或As选自二硫化物、对氨基苄氧羰基(PABC)和AA-AA-PABC，其中每个AA是氨基酸或其类似物或衍生物。
段[0552]所述的多肽，其中AA-AA-PABC选自Ala-Lys-PABC、Val-Cit-PABC和Phe-Lys-PABC。
段[0492]-[0551]中任一项所述的多肽，其中Ar和/或As是
Figure BDA0003504116290001991
段[0492]-[0551]中任一项所述的多肽，其中Ar和/或As是
Figure BDA0003504116290001992
其中，
R1和R2独立地为H或(C1-C6)烷基；
j是1或2；
G1为H或COOH；并且
i是1、2、3、4或5。
段[0492]-[0555]中任一项的单独多肽，其中所述多肽是泛素化的。
段[0556]所述的多肽，其中所述多肽在裂解前被泛素化。
段[0556]或[0557]所述的多肽，其中所述多肽在赖氨酸残基上被泛素化。
段[0492]-[0558]中任一项所述的多肽，其中所述多肽在受试者中在被APC处理之前或在被APC内化之前未裂解。
段[0492]-[0559]中任一项所述的多肽，其中所述多肽在被APC处理之前或在被APC内化之前在受试者的血液中未裂解。
段[0492]-[0560]中任一项所述的多肽，其中所述多肽不由血液中的蛋白酶裂解。
段[0492]-[0561]中任一项所述的多肽，其中所述多肽不由纤溶酶、血浆激肽释放酶、组织激肽释放酶、凝血酶或凝血因子裂解。
段[0492]-[0562]中任一项所述的多肽，其中所述多肽在人血浆中是稳定的。
段[0492]-[0563]中任一项所述的多肽，其中所述多肽在人血浆中具有1小时至5天的半衰期。
段[0492]-[0564]中任一项所述的多肽，其中所述多肽在溶酶体、内溶酶体、内体或内质网(ER)中裂解。
段[0492]-[0565]中任一项所述的多肽，其中所述多肽由氨肽酶裂解。
段[0566]所述的多肽，其中所述氨肽酶是胰岛素调节的氨肽酶(IRAP)或内质网氨肽酶(ERAP)。
段[0492]-[0565]中任一项所述的多肽，其中所述多肽由蛋白酶体和/或免疫蛋白酶体的胰蛋白酶样结构域处理。
段[0568]所述的多肽，其中所述胰蛋白酶样结构域具有胰蛋白酶样活性、胰凝乳蛋白酶样活性或肽基谷氨酰基-肽水解酶(PGPH)活性。
段[0492]-[0565]中任一项所述的多肽，其中所述多肽由蛋白酶裂解。
段[0570]所述的多肽，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶样蛋白酶、胰凝乳蛋白酶样蛋白酶或肽基谷氨酰基-肽水解酶(PGPH)。
段[0570]所述的多肽，其中所述蛋白酶选自天冬酰胺肽裂合酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和苏氨酸蛋白酶。
段[0572]所述的多肽，其中所述蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶，选自钙蛋白酶、胱天蛋白酶、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶F、组织蛋白酶H、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L1、组织蛋白酶L2、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶W和组织蛋白酶Z。
段[0492]-[0573]中任一项所述的多肽，其中所述受试者是哺乳动物。
段[0492]-[0574]中任一项所述的多肽，其中所述受试者是人。
段[0492]-[0575]中任一项所述的多肽，其中所述表位与MHC I类HLA结合。
段[0576]所述的多肽，其中所述表位以10分钟至24小时的稳定性结合至所述MHCI类HLA。
段[0576]所述的多肽，其中所述表位以0.1nM至2000nM的亲和力结合至所述MHC I类HLA。
段[0492]-[0575]中任一项所述的多肽，其中所述表位结合至MHC II类HLA。
段[0579]所述的多肽，其中所述表位以10分钟至24小时的稳定性结合至所述MHCII类HLA。
段[0579]所述的多肽，其中所述表位以0.1nM至2000nM、1nM至1000nM、10nM至500nM或小于1000nM的亲和力结合至所述MHC II类HLA。
段[0492]-[0581]中任一项所述的多肽，其中n是1至20或5至12的整数。
段[0492]-[0582]中任一项所述的多肽，其中p是1至20或5至12的整数。
段[0492]-[0583]中任一项所述的多肽，其中所述表位包含肿瘤特异性表位。
段[0492]-[0584]中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含至少两个多肽，其中所述至少两个多肽中的两个或更多个具有相同的式Yn-Bt-Ar-Xm-As-Cu-Zp。
段[0585]所述的多肽，其中所述多肽包含至少两个多肽分子。
段[0585]或[0586]所述的多肽，其中所述至少两个多肽或多肽分子中的两个或更多个的Xm是相同的。
段[0585]-[0587]中任一项所述的多肽，其中所述至少两个多肽或多肽分子中的两个或更多个的Yn是相同的。
段[0585]-[0588]中任一项所述的多肽，其中所述至少两个多肽或多肽分子中的两个或更多个的ZP是相同的。
段[0585]-[0589]中任一项所述的多肽，其中所述至少两个多肽或多肽分子中的两个或更多个的Ar和/或As是不同的。
段[0585]-[0590]中任一项所述的多肽，其中对于所述至少两个多肽或多肽分子的第一个，r＝0，且对于所述至少两个多肽或多肽分子的第二个，r＝1。
段[0585]-[0591]中任一项所述的多肽，其中对于所述至少两个多肽或多肽分子的第一个，s＝0，且对于所述至少两个多肽或多肽分子的第二个，s＝1。
段[0492]-[0592]中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含至少3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个多肽或多肽分子。
段[0492]-[0593]中任一项所述的多肽，其中所述表位为RAS表位。
段[0594]所述的多肽，其中所述表位包含突变RAS肽序列，所述RAS肽序列包含突变RAS蛋白的至少8个连续的氨基酸，所述突变RAS蛋白包含在G12、G13或Q61处的突变和在G12、G13或Q61处的所述突变。
段[0595]所述的多肽，其中包含G12、G13或Q61处突变的突变RAS蛋白的所述至少8个连续氨基酸包含G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61H、Q61L、Q61K或Q61R突变。
段[0595]或[0596]所述的多肽，其中G12、G13或Q61处的所述突变包含G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61H、Q61L、Q61K或Q61R突变。
段[0492]-[0597]中任一项所述的多肽，其中Yn和/或Zp包含CMV的蛋白质如pp65的氨基酸序列、HIV的蛋白质的氨基酸序列或MART-1的蛋白质的氨基酸序列。
段[0492]-[0598]中任一项所述的多肽，其中n和/或p是1、2、3或大于3的整数。
段[0492]-[0599]中任一项所述的多肽，其中所述表位以小于10μM、小于1μM、小于500nM、小于400nM、小于300nM、小于250nM、小于200nM、小于150nM、小于100nM或小于50nM的亲和力结合至由HLA等位基因编码的蛋白质。
段[0492]-[0600]中任一项所述的多肽，其中所述表位以大于24小时、大于12小时、大于9小时、大于6小时、大于5小时、大于4小时、大于3小时、大于2小时、大于1小时、大于45分钟、大于30分钟、大于15分钟或大于10分钟的稳定性结合至由HLA等位基因编码的蛋白质。
段[0600]或[0601]所述的多肽，其中所述HLA等位基因选自HLA-A02:01等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-A11:01等位基因、HLA-A03:02等位基因、HLA-A30:01等位基因、HLA-A31:01等位基因、HLA-A33:01等位基因、HLA-A33:03等位基因、HLA-A68:01等位基因、HLA-A74:01等位基因和/或HLA-C08:02等位基因及其任何组合。
段[0492]-[0602]中任一项所述的多肽，其中所述表位包含GADGVGKSAL、GACGVGKSAL、GAVGVGKSAL、GADGVGKSA、GACGVGKSA、GAVGVGKSA、KLVVVGACGV、FLVVVGACGL、FMVVVGACGI、FLVVVGACGI、FMVVVGACGV、FLVVVGACGV、MLVVVGACGV、FMVVVGACGL、YLVVVGACGV、KMVVVGACGV、YMVVVGACGV、MMVVVGACGV、DTAGHEEY、TAGHEEYSAM、DILDTAGHE、DILDTAGH、ILDTAGHEE、ILDTAGHE、DILDTAGHEEY、DTAGHEEYS、LLDILDTAGH、DILDTAGRE、DILDTAGR、ILDTAGREE、ILDTAGRE、CLLDILDTAGR、TAGREEYSAM、REEYSAMRD、DTAGKEEYSAM、CLLDILDTAGK、DTAGKEEY、LLDILDTAGK、ILDTAGKE、ILDTAGKEE、DTAGLEEY、ILDTAGLE、DILDTAGL、ILDTAGLEE、GLEEYSAMRDQY、LLDILDTAGLE、LDILDTAGL、DILDTAGLE、DILDTAGLEEY(、AGVGKSAL、GAAGVGKSAL、AAGVGKSAL、CGVGKSAL、ACGVGKSAL、DGVGKSAL、ADGVGKSAL、DGVGKSALTI、GARGVGKSA、KLVVVGARGV、VVVGARGV、SGVGKSAL、VVVGASGVGK、GASGVGKSAL、VGVGKSAL、VVVGAGCVGK、KLVVVGAGC、GDVGKSAL、DVGKSALTI、VVVGAGDVGK、TAGKEEYSAM、DTAGHEEYSAM、TAGHEEYSA、DTAGREEYSAM、TAGKEEYSA、AAGVGKSA、AGCVGKSAL、AGDVGKSAL、AGKEEYSAMR、AGVGKSALTI、ARGVGKSAL、ASGVGKSA、ASGVGKSAL、AVGVGKSA、CVGKSALTI、DILDTAGK、DILDTAGREEY、DTAGHEEYSAMR、DTAGKEEYS、DTAGKEEYSAMR、DTAGLEEYS、DTAGLEEYSA、DTAGLEEYSAMR、DTAGREEYS、DTAGREEYSAMR、GAAGVGKSA、GACGVGKSA、GACGVGKSAL、GADGVGKS、GAGDVGKSA、GAGDVGKSAL、GASGVGKSA、GCVGKSAL、GCVGKSALTI、GHEEYSAM、GKEEYSAM、GLEEYSAMR、GREEYSAM、GREEYSAMR、HEEYSAMRD、KEEYSAMRD、KLVVVGASG、LDILDTAGR、LEEYSAMRD、LVVVGARGV、LVVVGASGV、REEYSAMRDQY、RGVGKSAL、TAGLEEYSA、TEYKLVVVGAA、VGAAGVGKSA、VGADGVGK、VGASGVGKSA、VGVGKSALTI、VVVGAAGV、VVVGAVGV、YKLVVVGAC、YKLVVVGAD、YKLVVVGAR或DILDTAGKE的氨基酸序列。
段[0492]-[0603]中任一项所述的多肽，其中Yn包含IDIIMKIRNA、FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFIIFFIFFWMC、FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFAAFWFW、IFFIFFIIFFFFFFFFFFFFIIIIIIIWEC、FIFFFIIFFFFFIFFFFFIFIIIIIIFWEC、TEY、TEYKLV、WQAGILAR、HSYTTAE、PLTEEKIK、GALHFKPGSR、RRANKDATAE、KAFISHEEKR、TDLSSRFSKS、FDLGGGTFDV、CLLLHYSVSK、KKKKIIMKIRNA或MTEYKLVVV的氨基酸序列。
段[0492]-[0604]中任一项所述的多肽，其中Zp包含KKNKKDDI、KKNKKDDIKD、AGNDDDDDDDDDDDDDDDDDKKDKDDDDDD、AGNKKKKKKKNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN、AGRDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD、SALTI、SALTIQL、GKSALTIQL、GKSALTI、QGQNLKYQ、ILGVLLLI、EKEGKISK、AASDFIFLVT、KELKQVASPF、KKKLINEKKE、KKCDISLQFF、KSTAGDTHLG、ATFYVAVTVP、LTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDG或TIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGE的氨基酸序列。
段[0492]-[0593]中任一项所述的多肽，其中所述表位不是RAS表位。
段[0492]-[0606]中任一项所述的多肽，其中所述多肽不是KKKKKPKRDGYMFLKAESKIMFAT、KKKKYMFLKAESKIMFATLQRSS、KKKKKAESKIMFATLQRSSLWCL、KKKKKIMFATLQRSSLWCLCSNH或KKKKMFATLQRSSLWCLCSNH。
段[0492]-[0593]中任一项所述的多肽，其中所述表位是GATA3表位。
段[0608]所述的多肽，其中所述GATA3表位包含MLTGPPARV、SMLTGPPARV、VLPEPHLAL、KPKRDGYMF、KPKRDGYMFL、ESKIMFATL、KRDGYMFL、PAVPFDLHF、AESKIMFATL、FATLQRSSL、ARVPAVPFD、IMKPKRDGY、DGYMFLKA、MFLKAESKIMF、LTGPPARV、ARVPAVPF、SMLTGPPAR、RVPAVPFDL或LTGPPARVP的氨基酸序列。
一种细胞，包含段[0492]-[0609]中任一项所述的多肽。
段[0610]所述的细胞，其中所述细胞为抗原呈递细胞。
段[0611]所述的细胞，其中所述细胞为树突细胞。
段[0610]所述的细胞，其中所述细胞为成熟抗原呈递细胞。
一种裂解多肽的方法，包括使段[0492]-[0609]中任一项所述的多肽与APC接触。
段[0614]的所述方法，其中所述方法在体内进行。
段[0614]的所述方法，其中所述方法离体进行。
一种制备多肽的方法，包括将Yn-Ar和/或As-Zp连接到包含表位序列的序列，其中所述表位序列由抗原呈递细胞(APC)的I类MHC或II类MHC呈递；并且其中
(i)每个Y独立地是氨基酸、其类似物或衍生物，并且其中Yn不是由紧靠所述受试者基因组中编码所述表位的核酸序列上游的核酸序列编码，
并且其中u是0-1000的整数；
(ii)每个Z独立地是氨基酸、其类似物或衍生物，并且其中Zp不是由紧靠所述受试者基因组中编码所述表位的核酸序列下游的核酸序列编码，
并且其中p是0-1000的整数；并且
(iii)Ar是接头并且As是连接团，其中r和s中至少一个是1；
并且进一步地其中，
(a)所述多肽不是由通过I类MHC呈递的四个不同表位组成；
(b)所述多肽包含至少两个不同的多肽分子；
(c)所述表位包含至少一个突变氨基酸；并且/或者(d)当所述多肽被APC处理时，Yn和/或Zp从所述表位裂解。
一种制备多肽的方法，包括将Yn连接到Bt-Xm和/或将Zp连接到Xm-Cu，其中Xm是由抗原呈递细胞(APC)的I类MHC或II类MHC呈递的表位序列；并且其中
(i)每个B独立地代表由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的受试者基因组核酸序列编码的氨基酸，
并且其中t是0至1000的整数；
(ii)每个C独立地代表由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的受试者基因组核酸序列编码的氨基酸，
并且其中u是0-1000的整数；
(iii)每个Y独立地是氨基酸、其类似物或衍生物，并且其中Yn不是由紧靠所述受试者基因组中编码Bt-Xm的核酸序列上游的核酸序列编码，
并且其中n是0-1000的整数；并且
(iv)每个Z独立地是氨基酸、其类似物或衍生物，并且其中Zp不是由紧靠所述受试者基因组中编码Xm-Cu的核酸序列下游的核酸序列编码，
并且其中p是0-1000的整数；
并且进一步地其中，
(a)所述多肽不是由通过I类MHC呈递的四个不同表位组成；
(b)所述多肽包含至少两个不同的多肽分子；
(c)所述表位包含至少一个突变氨基酸；并且/或者
(d)当所述多肽被APC处理时，Yn-Bt和/或Cu-Zp从所述表位裂解。
段[0617]或[0618]所述的方法，其中当n是0时，p是1到1000的整数；当p为0时，n为1-1000的整数。
段[0617]-[0619]所述的方法，其中每个X独立地代表肽序列的氨基酸，所述肽序列包含任何由受试者基因组中的核酸序列编码的连续氨基酸序列，并且其中(a)MHC是I类MHC，并且m是8至12的整数，或(b)MHC是II类MHC，并且m是9至25的整数。
一种药物组合物，包含段[0492]-[0609]中任一项所述的多肽和药学上可接受的赋形剂。
段[0621]所述的药物组合物，进一步包含免疫调节剂或佐剂。
段[0622]所述的药物组合物，其中所述免疫调节剂或佐剂选自聚-ICLC、1018ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、ARNAX、STING激动剂、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、Juvlmmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、MonISA IDE 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、
Figure BDA0003504116290002081
载体系统、PLGA微粒、瑞喹莫德、SRL172、病毒体和其他病毒样颗粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam2Cys、Pam3Cys、Pam3-CSK4和Aquila的QS21刺激子。
段[0622]或[0623]所述的药物组合物，其中所述免疫调节剂或佐剂包括聚-ICLC。
段[0621]-[0624]中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物是疫苗组合物。
段[0621]-[0625]中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物是水性的或是液体。
段[0621]-[0626]中任一项所述的药物组合物，其中所述表位以1ng至10mg或5μg至1.5mg的量存在于所述药物组合物中。
段[0621]-[0627]中任一项所述的药物组合物，其进一步包含DMSO。
段[0621]-[0628]中任一项所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂包含水。
段[0621]-[0629]中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含以小于1mM或大于1mM的浓度存在的pH调节剂。
段[0630]所述的药物组合物，其中所述pH调节剂为二羧酸盐或三羧酸盐。
段[0630]所述的药物组合物，其中所述pH调节剂是琥珀酸的二羧酸盐，或二琥珀酸盐。
段[0630]所述的药物组合物，其中所述pH调节剂是柠檬酸的三羧酸盐，或三柠檬酸盐。
段[0630]所述的药物组合物，其中所述pH调节剂是琥珀酸二钠。
段[0632]所述的药物组合物，其中所述琥珀酸的二羧酸盐或二琥珀酸盐以0.1mM-1mM的浓度存在于所述药物组合物中。
段[0632]所述的药物组合物，其中所述琥珀酸的二羧酸盐或二琥珀酸盐以1mM-5mM的浓度存在于所述药物组合物中。
段[0621]-[0636]中任一项所述的药物组合物，其中当施用于受试者时，对所述表位的免疫应答增加。
一种治疗疾病或病况的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的段[0621]-[0637]中任一项所述的药物组合物。
段[0638]所述的方法，其中所述疾病或病况是癌症。
段[0639]所述的方法，其中所述癌症选自肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、子宫癌和肝癌。
段[0638]-[0640]中任一项所述的方法，其中施用包括皮内注射、鼻内喷雾应用、肌内注射、腹膜内注射、静脉内注射、口服施用或皮下注射。
一种受试者预防的方法，包括使所述受试者的细胞与段[0492]-[0613]或[0621]-[0637]中任一项所述的多肽、细胞或药物组合物接触。
一种方法，包括识别由受试者的肿瘤细胞表达的表位，以及产生包含所述表位的多肽，其中所述多肽具有式(I)的结构：
Yn-Bt-Ar-Xm-As-Cu-Zp
式(I)，
或其药学上可接受的盐，
(i)其中Xm是所述表位，其中每个X独立地代表由受试者基因组的核酸序列编码的连续氨基酸序列的氨基酸，
并且其中(a)所述MHC是I类MHC并且m是8至12的整数，或
(b)所述MHC是II类MHC并且m是9-25的整数；
(ii)其中每个Y独立地为氨基酸、其类似物或衍生物，并且其中：
(A)当式(I)中Ar的变量r为0时，Yn不由紧靠所述受试者基因组中编码Br-Ar-Xm的核酸序列上游的核酸序列编码，
(B)当式(I)中Ar的变量r为1且式(I)中Bt的变量t为0时，Yn不由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的核酸序列编码，或者
(C)当式(I)中Ar的变量r为1且式(I)中Bt的变量t为1或更大时，Yn不由紧靠所述受试者基因组中编码Bt的核酸序列上游的核酸序列编码；并且
进一步地，其中n是0至1000的整数；
(iii)其中每个Z独立地为氨基酸、其类似物或衍生物，并且其中：
(A)当式(I)中As的变量s为0时，Zp不由紧靠所述受试者基因组中编码Xm-As-Cu的核酸序列下游的核酸序列编码，
(B)当式(I)中As的变量s为1且式(I)中Cu的变量u为0时，Zp不由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的核酸序列编码，或者
(C)当式(I)中As的变量s为1且式(I)中Cu的变量u为1或更大时，Zp不由紧靠所述受试者基因组中编码Cu的核酸序列下游的核酸序列编码；并且
进一步地，其中p是0至1000的整数；
并且进一步地其中，
当n为0时，p是1至1000的整数；并且
当p为0时，n是1至1000的整数；
(iv)其中Ar是接头，并且r是0或1；
(v)其中As是接头，并且s是0或1；
(vi)其中每个B独立地代表由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的所述受试者基因组中的核酸序列编码的氨基酸，
并且其中t是0至1000的整数；
(vii)其中每个C独立地代表由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的所述受试者基因组中的核酸序列编码的氨基酸，
并且其中u是0-1000的整数；
并且进一步地其中，
(a)所述多肽不是由通过I类MHC呈递的四个不同表位组成；
(b)所述多肽包含至少两个不同的多肽分子；
(c)所述表位包含至少一个突变氨基酸；并且/或者
(d)当所述多肽被所述APC处理时，Yn和/或Zp从所述表位裂解。
段[0643]所述的方法，其中识别包括从自所述受试者的肿瘤细胞测序得到的核酸序列池中选择多个核酸序列，所述多个核酸序列编码多个候选肽序列，所述多个候选肽序列包含不存在于自所述受试者的非肿瘤细胞测序得到的核酸序列池中的一个或多个不同突变，其中自所述受试者的肿瘤细胞测序得到的核酸序列池和自所述受试者的非肿瘤细胞测序得到的核酸序列池通过全基因组测序或全外显子组测序来测序。
段[0643]或[0644]所述的方法，其中识别还包括通过HLA肽结合分析来预测或测量所述多个候选肽序列中的哪些候选肽序列与由同一受试者的HLA等位基因编码的蛋白质形成复合物。
段[0643]-[0645]中任一项所述的方法，其中识别还包括基于所述HLA肽结合分析从所述候选肽序列中选择多个选定的肿瘤特异性肽或编码所述多个选定的肿瘤特异性肽的一个或多个多核苷酸。
段[0643]-[0646]中任一项所述的方法，还包括向所述受试者施用所述多肽。
段[0647]所述的方法，其中施用包括皮内注射、鼻内喷雾应用、肌内注射、腹膜内注射、静脉内注射、口服施用或皮下注射。
段[0643]-[0648]中任一项所述的方法，其中在所述受试者中引发免疫应答。
段[0643]-[0649]中任一项所述的方法，其中由所述受试者的肿瘤细胞表达的表位是新抗原、肿瘤相关抗原、突变的肿瘤相关抗原，并且/或者其中与所述受试者的正常细胞中所述表位的表达相比，所述受试者的肿瘤细胞中所述表位的表达更高。

Claims (48)

1.一种多肽，包含由抗原呈递细胞(APC)的I类MHC或II类MHC呈递的表位，所述多肽具有式(I)的结构：
Yn-Bt-Ar-Xm-As-Cu-Zp
式(I)，
或其药学上可接受的盐，
(i)其中Xm是所述表位，其中每个X独立地代表由受试者基因组的核酸序列编码的连续氨基酸序列的氨基酸，
并且其中(a)所述MHC是I类MHC并且m是8至12的整数，或
(b)所述MHC是II类MHC并且m是9-25的整数；
(ii)其中每个Y独立地为氨基酸、其类似物或衍生物，并且其中：
(A)当式(I)中Ar的变量r为0时，Yn不由紧靠所述受试者基因组中编码Br-Ar-Xm的核酸序列上游的核酸序列编码，
(B)当式(I)中Ar的变量r为1且式(I)中Bt的变量t为0时，Yn不由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的核酸序列编码，或者
(C)当式(I)中Ar的变量r为1且式(I)中Bt的变量t为1或更大时，Yn不由紧靠所述受试者基因组中编码Bt的核酸序列上游的核酸序列编码；并且
进一步地，其中n是0至1000的整数；
(iii)其中每个Z独立地为氨基酸、其类似物或衍生物，并且其中：
(A)当式(I)中As的变量s为0时，Zp不由紧靠所述受试者基因组中编码Xm-As-Cu的核酸序列下游的核酸序列编码，
(B)当式(I)中As的变量s为1且式(I)中Cu的变量u为0时，Zp不由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的核酸序列编码，或者
(C)当式(I)中As的变量s为1且式(I)中Cu的变量u为1或更大时，Zp不由紧靠所述受试者基因组中编码Cu的核酸序列下游的核酸序列编码；并且
进一步地，其中p是0至1000的整数；
并且进一步地其中，
当n为0时，p是1至1000的整数；并且
当p为0时，n是1至1000的整数；
(iv)其中Ar是接头，并且r是0或1；
(v)其中As是接头，并且s是0或1；
(vi)其中每个B独立地代表由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的所述受试者基因组中的核酸序列编码的氨基酸，
并且其中t是0至1000的整数；
(vii)其中每个C独立地代表由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的所述受试者基因组中的核酸序列编码的氨基酸，
并且其中u是0-1000的整数；
并且进一步地其中，
(a)所述多肽不是由通过I类MHC呈递的四个不同表位组成；
(b)所述多肽包含至少两个不同的多肽分子；
(c)所述表位包含至少一个突变氨基酸；并且/或者
(d)当所述多肽被所述APC处理时，Yn和/或Zp从所述表位裂解。
2.如权利要求1所述的多肽，其中所述表位通过II类MHC呈递，并且m是9至25的整数。
3.如权利要求1或2所述的多肽，其中与不含Yn-Bt-Ar和/或As-Cu-Zp的相应肽相比，Yn-Br-Ar和/或As-Cu-Zp增强所述多肽的溶解性。
4.如权利要求1-3中任一项所述的多肽，其中当所述多肽被所述APC处理时，所述表位从Yn-Bt-Ar和/或As-Cu-Zp释放。
5.如权利要求1-4中任一项所述的多肽，其中当n是1至1000的整数时，与裂解包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽相比，所述多肽以更高的速率裂解，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的核酸序列编码；并且/或者
其中当p是1至1000的整数时，与裂解包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽相比，所述多肽以更高的速率裂解，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的核酸序列编码。
6.如权利要求1-5中任一项所述的多肽，其中当n是1至1000的整数时，与包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽的表位呈递相比，所述APC的表位呈递增强，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的核酸序列编码；并且/或者
其中当p是1至1000的整数时，与包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽的表位呈递相比，所述APC的表位呈递增强，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的核酸序列编码。
7.如权利要求1-6中任一项所述的多肽，其中所述APC将所述表位呈递给免疫细胞。
8.如权利要求1-7中任一项所述的多肽，其中当n是1至1000的整数时，与包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽的免疫原性相比，免疫原性增强，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的核酸序列编码；并且/或者
其中当p是1至1000的整数时，与包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽的免疫原性相比，免疫原性增强，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的核酸序列编码。
9.如权利要求1-8中任一项所述的多肽，其中当n是1至1000的整数时，与包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽的抗肿瘤活性相比，抗肿瘤活性增强，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列上游的核酸序列编码；并且/或者
其中当p是1至1000的整数时，与包含Xm和至少一个额外氨基酸的相同长度的相应多肽的抗肿瘤活性相比，抗肿瘤活性增强，所述额外氨基酸由紧靠所述受试者基因组中编码Xm的核酸序列下游的核酸序列编码。
10.如权利要求1-9中任一项所述的多肽，其中Yn和/或Zp包含选自赖氨酸(Lys)、聚赖氨酸(polyK)和聚精氨酸(polyR)的序列。
11.如权利要求10所述的多肽，其中所述polyK包含聚-L-赖氨酸。
12.如权利要求10所述的多肽，其中所述polyR包含聚-L-精氨酸。
13.如权利要求10-12中任一项所述的多肽，其中所述polyK或polyR分别包含至少两个、三个或四个连续的赖氨酸残基或至少两个、三个或四个连续的精氨酸残基。
14.如权利要求1-13中任一项所述的多肽，其中所述表位结合至MHC II类HLA。
15.如权利要求14所述的多肽，其中所述表位以10分钟至24小时的稳定性结合至所述MHC II类HLA。
16.如权利要求14所述的多肽，其中所述表位以0.1nM至2000nM、1nM至1000nM、10nM至500nM或小于1000nM的亲和力结合至所述MHC II类HLA。
17.如权利要求1-16中任一项所述的多肽，其中所述多肽在受试者中被APC处理之前或被APC内化之前未裂解。
18.如权利要求1-17中任一项所述的多肽，其中所述多肽在人血浆中是稳定的。
19.如权利要求1-18中任一项所述的多肽，其中所述多肽在人血浆中具有1小时至5天的半衰期。
20.如权利要求1-19中任一项所述的多肽，其中所述受试者是人。
21.如权利要求1-20中任一项所述的多肽，其中所述表位以小于10μM、小于1μM、小于500nM、小于400nM、小于300nM、小于250nM、小于200nM、小于150nM、小于100nM或小于50nM的亲和力结合至由HLA等位基因编码的蛋白质。
22.如权利要求1-21中任一项所述的多肽，其中所述表位以大于24小时、大于12小时、大于9小时、大于6小时、大于5小时、大于4小时、大于3小时、大于2小时、大于1小时、大于45分钟、大于30分钟、大于15分钟或大于10分钟的稳定性结合至由HLA等位基因编码的蛋白质。
23.如权利要求21或22所述的多肽，其中所述HLA等位基因选自HLA-A02:01等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-A11:01等位基因、HLA-A03:02等位基因、HLA-A30:01等位基因、HLA-A31:01等位基因、HLA-A33:01等位基因、HLA-A33:03等位基因、HLA-A68:01等位基因、HLA-A74:01等位基因和/或HLA-C08:02等位基因及其任何组合。
24.如权利要求1-23中任一项所述的多肽，其中所述表位包含肿瘤特异性表位。
25.如权利要求1-24中任一项所述的多肽，其中所述表位包含至少一个突变氨基酸。
26.如权利要求25所述的多肽，其中所述至少一个突变氨基酸由所述受试者基因组中的核酸序列中的插入、缺失、移码、neoORF或点突变编码。
27.如权利要求1-26中任一项所述的多肽，其中所述表位是RAS表位。
28.如权利要求27所述的多肽，其中所述表位包含突变RAS肽序列，所述RAS肽序列包含突变RAS蛋白的至少8个连续的氨基酸，所述突变RAS蛋白包含在G12、G13或Q61处的突变和在G12、G13或Q61处的突变。
29.如权利要求28所述的多肽，其中包含在G12、G13或Q61处的突变的突变RAS蛋白的所述至少8个连续氨基酸包含G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61H、Q61L、Q61K或Q61R突变。
30.如权利要求28或29所述的多肽，其中在G12、G13或Q61处的所述突变包含G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61H、Q61L、Q61K或Q61R突变。
31.如权利要求27-30中任一项所述的多肽，其中所述RAS表位包含VVVGAAGVGK、VVVGAAGVG、VVVGAAGV、VVGAAGVGK、VVGAAGVG、VGAAGVGK、VVVGACGVGK、VVVGACGVG、VVVGACGV、VVGACGVGK、VVGACGVG、VGACGVGK、VVVGADGVGK、VVVGADGVG、VVVGADGV、VVGADGVGK、VVGADGVG、VGADGVGK、VVVGARGVGK、VVVGARGVG、VVVGARGV、VVGARGVGK、VVGARGVG、VGARGVGK、VVVGASGVGK、VVVGASGVG、VVVGASGV、VVGASGVGK、VVGASGVG、VGASGVGK、VVVGAVGVGK、VVVGAVGVG、VVVGAVGV、VVGAVGVGK、VVGAVGVG或VGAVGVGK的氨基酸序列。
32.如权利要求1-31中任一项所述的多肽，其中Yn包含K、KK、KKK、KKKK、KKKKK、KKKKKKK、KKKKKKKK、KTEY、KTEYK、KTEYKL、KTEYKLV、KTEYKLVV、KTEYKLVVV、KKTEY、KKTEYK、KKTEYKL、KKTEYKLV、KKTEYKLVV、KKTEYKLVVV、KKKTEY、KKKTEYK、KKKTEYKL、KKKTEYKLV、KKKTEYKLVV、KKKTEYKLVVV、KKKKTEY、KKKKTEYK、KKKKTEYKL、KKKKTEYKLV、KKKKTEYKLVV、KKKKTEYKLVVV、IDIIMKIRNA、FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFIIFFIFFWMC、FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFAAFWFW、IFFIFFIIFFFFFFFFFFFFIIIIIIIWEC、FIFFFIIFFFFFIFFFFFIFIIIIIIFWEC、TEY、TEYK、TEYKL、TEYKLV、TEYKLVV、TEYKLVVV、WQAGILAR、HSYTTAE、PLTEEKIK、GALHFKPGSR、RRANKDATAE、KAFISHEEKR、TDLSSRFSKS、FDLGGGTFDV、CLLLHYSVSK、KKKKIIMKIRNA或MTEYKLVVV的氨基酸序列。
33.如权利要求1-32中任一项所述的多肽，其中Zp包含K、KK、KKK、KKKK、KKKKK、KKKKKKK、KKKKKKKK、KKNKKDDI、KKNKKDDIKD、AGNDDDDDDDDDDDDDDDDDKKDKDDDDDD、AGNKKKKKKKNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN、AGRDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD、SALTI、SALTIQL、GKSALTIQL、GKSALTI、SALTIK、SALTIQLK、GKSALTIQLK、GKSALTIK、SALTIKK、SALTIQLKK、GKSALTIQLKK、GKSALTIKK、SALTIKKK、SALTIQLKKK、GKSALTIQLKKK、GKSALTIKKK、SALTIKKKK、SALTIQLKKKK、GKSALTIQLKKKK、GKSALTI、KKKK、QGQNLKYQ、ILGVLLLI、EKEGKISK、AASDFIFLVT、KELKQVASPF、KKKLINEKKE、KKCDISLQFF、KSTAGDTHLG、ATFYVAVTVP、LTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDG或TIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGE的氨基酸序列。
34.如权利要求1-33中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含KTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL、KTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL、KTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL、KTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL、KKKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL、KKKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL、KKKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL、KKKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL、KKKKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL、KKKKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL、KKKKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL、KKKKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL、KKTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKK、KKTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKK、KKTEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKK、KKTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLK、TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLK、TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLK、TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLK、TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKK、TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKKK、TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKKK、TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKKK、TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKKK、TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLKKKK、TEYKLVVVGADGVGKSALTIQLKKKK、TEYKLVVVGARGVGKSALTIQLKKKK或TEYKLVVVGACGVGKSALTIQLKKKK的氨基酸序列。
35.如权利要求1-26中任一项所述的多肽，其中所述表位不是RAS表位。
36.如权利要求1-35中任一项所述的多肽，其中所述多肽不是KKKKKPKRDGYMFLKAESKIMFAT、KKKKYMFLKAESKIMFATLQRSS、KKKKKAESKIMFATLQRSSLWCL、KKKKKIMFATLQRSSLWCLCSNH或KKKKMFATLQRSSLWCLCSNH。
37.如权利要求1-36中任一项所述的多肽，其中Yn和/或Zp包含与所述表位所来源的蛋白质不同的蛋白质的氨基酸序列。
38.如权利要求1-37中任一项所述的多肽，其中Yn和/或Zp包含CMV的蛋白质如pp65的氨基酸序列、HIV的蛋白质的氨基酸序列或MART-1的蛋白质的氨基酸序列。
39.如权利要求1-38中任一项所述的多肽，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或大于20的整数。
40.如权利要求1-39中任一项所述的多肽，其中p是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或大于20的整数。
41.一种多核苷酸，包含编码如权利要求1-40中任一项所述的多肽的序列。
42.如权利要求41所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是mRNA。
43.一种药物组合物，包含如权利要求1-40中任一项所述的多肽或如权利要求41或42所述的多核苷酸，和药学上可接受的赋形剂。
44.一种治疗疾病或病况的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如权利要求43所述的药物组合物。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述疾病或病况是选自肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、子宫癌、前列腺癌、肝癌、胆道恶性肿瘤、子宫内膜癌、宫颈癌、膀胱癌、肝癌、骨髓性白血病和乳腺癌的癌症。
46.如权利要求44或45所述的方法，其中施用包括皮内注射、鼻内喷雾应用、肌内注射、腹膜内注射、静脉内注射、口服施用或皮下注射。
47.一种制备抗原特异性T细胞的方法，包括用抗原呈递细胞刺激T细胞，所述抗原呈递细胞包含如权利要求1-40中任一项所述的多肽或如权利要求41或42所述的多核苷酸。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述方法离体进行。
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