KR20220062488A - 신생항원 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
신생에피토프를 포함하는 면역치료 폴리펩티드, 면역치료 폴리펩티드를 포함하는 항원 제시 세포, 및 면역치료 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 개시된다. 또한, 질환 또는 병태의 치료에서 면역치료 폴리펩티드의 용도가 본원에 개시된다.
Description
본 발명은 신생항원 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 6월 12일에 출원된 미국 가출원 번호 62/860,493의 이익을 주장하며, 이는 전체가 참조로 본원에 포함된다. 본 출원은 2020년 5월 7일에 출원된 국제 출원 번호 PCT/US2020/031898에 관한 것으로, 이는 전체가 참조로 본원에 포함된다.
배경
암 면역요법은 암을 치료하기 위해 면역계를 사용하는 것이다. 면역요법은 암세포가 종종 단백질 또는 다른 마크로분자(예컨대, 탄수화물)인 종양 항원으로 공지된, 면역계에 의해 검출될 수 있는 분자를 표면에 갖는다는 사실을 이용한다. 능동 면역요법은 종양 항원을 표적화함으로써 면역계가 종양 세포를 공격하도록 지시한다. 수동 면역요법은 기존의 항-종양 반응을 향상시키며, 모노클로날 항체, 림프구 및 시토카인의 사용을 포함한다. 종양 백신은 전형적으로 종양 항원 및 종양 세포를 인식하고 용해하는 항원 특이적 세포독성 T 세포(CTL)를 유도하기 위해 함께 작동하는 면역자극 분자(예컨대, 애주번트, 시토카인 또는 톨-유사 수용체(TLR) 리간드)로 구성된다. 악성 세포 내 유전적 변화(예컨대, 역위, 전위, 결실, 미스센스 돌연변이, 스플라이스 부위 돌연변이 등)의 결과로 발생하는 종양 신생항원은 가장 종양 특이적 부류의 항원을 나타내며, 환자 특이적이거나 공유될 수 있다. 종양 신생항원은 돌연변이 및 이의 상응하는 단백질이 종양에만 존재하기 때문에 종양 세포에 고유하다. 그들은 또한 중추 관용을 피하므로 면역원성일 가능성이 더 크다. 따라서, 종양 신생항원은 체액성 및 세포성 면역 모두를 포함하는 면역 인식을 위한 우수한 표적을 제공한다.
백신접종으로부터 T 세포 반응을 유도하기 위해, 항원 제시 세포(APC)는 에피토프 함유 펩티드를 프로세싱하고 주요 조직적합성 복합체(MHC) I 또는 MHC II에 에피토프를 제시해야 한다. 치료 및 종양 특이적 면역요법을 개발하는 데 있어 중요한 장애물 중 하나는 적절한 면역 반응을 생성하기 위한 항원 제시를 위한 최소 에피토프의 불충분한 프로세싱 및 방출이다. 따라서, 효율적이고 충분한 에피토프 프로세싱 및 제시를 보장하기 위한 추가적인 암 치료 백신의 개발이 필요하다.
참조에 의한 인용
본 명세서에서 언급되는 모든 공개문, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 공개문, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
일부 측면에서, 항원 제시 세포(APC)의 클래스 I MHC 또는 클래스 II MHC에 의해 제시되는 에피토프를 포함하고, 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는 폴리펩티드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 본원에 제공된다:
Yn-Bt-Ar-Xm-As-Cu-Zp
화학식 (I)
상기 식에서,
(i) Xm은 에피토프이고, 각각의 X는 독립적으로 대상체의 게놈 내 핵산 서열에 의해 코딩되는 인접 아미노산 서열의 아미노산을 나타내고,
(a) MHC는 클래스 I MHC이고 m은 8 내지 12의 정수이거나,
(b) MHC는 클래스 II MHC이고 m은 9 내지 25의 정수이고;
(ii) 각각의 Y는 독립적으로 아미노산, 또는 이의 유사체 또는 유도체이고,
(A) 화학식 (I)에서 Ar의 변수 r이 0인 경우, Yn은 Bt-Ar-Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않거나,
(B) 화학식 (I)에서 Ar의 변수 r이 1이고 화학식 (I)에서 Bt의 변수 t가 0인 경우, Yn은 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않거나,
(C) 화학식 (I)에서 Ar의 변수 r이 1이고 화학식 (I)에서 Bt의 변수 t가 1 이상인 경우, Yn은 Bt를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산에 의해 코딩되지 않고;
추가로 n은 0 내지 1000의 정수이고;
(iii) 각각의 Z는 독립적으로 아미노산, 또는 이의 유사체 또는 유도체이고,
(A) 화학식 (I)에서 As의 변수 s가 0인 경우, Zp는 Xm-As-Cu를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않거나,
(B) 화학식 (I)에서 As의 변수 s가 1이고 화학식 (I)에서 Cu의 변수 u가 0인 경우, Zp는 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않거나,
(C) 화학식 (I)에서 As의 변수 s가 1이고 화학식 (I)에서 Cu의 변수 u가 1 이상인 경우, Zp는 Cu를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산에 의해 코딩되지 않고;
추가로 p는 0 내지 1000의 정수이고;
추가로
n이 0인 경우, p는 1 내지 1000의 정수이고;
p가 0인 경우, n은 1 내지 1000의 정수이고;
(iv) Ar은 링커이고, r은 0 또는 1이고;
(v) As는 링커이고, s는 0 또는 1이고;
(vi) 각각의 B는 독립적으로 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 대상체의 게놈 내 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산을 나타내고,
t는 0 내지 1000의 정수이고;
(vii) 각각의 C는 독립적으로 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 대상체의 게놈 내 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산을 나타내고,
u는 0 내지 1000의 정수이고;
추가로
(a) 폴리펩티드는 클래스 I MHC에 의해 제시되는 4개의 상이한 에피토프로 이루어지지 않고/않거나;
(b) 폴리펩티드는 적어도 2개의 상이한 폴리펩티드 분자를 포함하고/하거나;
(c) 에피토프는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산을 포함하고/하거나;
(d) Yn 및/또는 Zp는 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때 에피토프로부터 절단된다.
일부 실시양태에서, 에피토프는 클래스 II MHC에 의해 제시된다. 일부 실시양태에서, m은 9 내지 25의 정수이다. 일부 실시양태에서, t는 1, 2, 3, 4 또는 5 또는 그 초과이고 r은 0이다. 일부 실시양태에서, u는 1, 2, 3, 4, 또는 5 또는 그 초과이고 s는 0이다. 일부 실시양태에서, t는 1 이상이고, r은 0이고, n은 1-1000이다. 일부 실시양태에서, u는 1 이상이고, s는 0이고, p는 1-1000이다. 일부 실시양태에서, t는 0이다. 일부 실시양태에서, u는 0이다. 일부 실시양태에서, t는 적어도 1이고 Bt는 리신을 포함한다. 일부 실시양태에서, u는 적어도 1이고 Cu는 리신을 포함한다. 일부 실시양태에서, Bt는 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때 에피토프로부터 절단된다. 일부 실시양태에서, Cu는 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때 에피토프로부터 절단된다. 일부 실시양태에서, n은 1 내지 5 또는 7-1000의 정수이다. 일부 실시양태에서, p는 1 내지 4 또는 6-1000의 정수이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 클래스 I MHC에 의해 제시되는 4개의 상이한 에피토프로 이루어지지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 클래스 I MHC에 의해 제시되는 4개의 상이한 에피토프를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 2개의 상이한 폴리펩티드 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 돌연변이 아미노산은 대상체의 게놈 내 핵산 서열에서 삽입, 결실, 프레임쉬프트, neoORF, 또는 포인트 돌연변이에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, Yn 및/또는 Zp는 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때 에피토프로부터 절단된다. 일부 실시양태에서, Xm의 m은 적어도 8이고 Xm은 AA1AA2AA3AA4AA5AA6AA7AA8AA9AA10AA11AA12AA13AA14AA15AA16AA17AA18AA19AA20AA21AA22AA23AA24AA25이고, 각각의 AA는 아미노산이고, AA9, AA10, AA11, AA12, AA13, AA14, AA15, AA16, AA17, AA18, AA19, AA20, AA21, AA22, AA23, AA24, 및 AA25 중 하나 이상은 임의적으로 존재하고, 추가로 적어도 하나의 AA는 돌연변이 아미노산이다. 일부 실시양태에서, r은 1이다. 일부 실시양태에서, s는 1이다. 일부 실시양태에서, r은 1이고 s는 1이다. 일부 실시양태에서 r은 0이다. 일부 실시양태에서 s는 0이다. 일부 실시양태에서 r은 0이고 s는 0이다.
일부 실시양태에서, Ar 및/또는 As는 비-폴리펩티드 링커이다. 일부 실시양태에서, Ar 및/또는 As는 화학적 링커이다. 일부 실시양태에서, Ar 및/또는 As는 비-천연 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, Ar 및/또는 As는 아미노산을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, Ar 및/또는 As는 천연 아미노산을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, Ar 및/또는 As는 펩티드 결합 이외의 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, Ar 및/또는 As는 디설파이드 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, Ar 및 As는 상이하다. 일부 실시양태에서, Ar 및 As는 동일하다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 친수성 테일을 포함한다. 일부 실시양태에서, Yn-Bt-Ar 및/또는 As-Cu-Zp는 Yn-Bt-Ar 및/또는 As-Zp를 함유하지 않는 상응하는 펩티드와 비교하여 폴리펩티드의 용해도를 향상시킨다. 일부 실시양태에서, Xm의 각각의 X는 천연 아미노산이다.
일부 실시양태에서, 에피토프는 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때 Yn-Bt-Ar 및/또는 As-Cu-Zp로부터 방출된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 Ar 및/또는 As에서 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는, n이 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 절단과 비교하여 더 높은 속도로 절단되고/되거나; 폴리펩티드는, p이 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 절단과 비교하여 더 높은 속도로 절단된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는, n이 1 내지 1000의 정수인 경우, t가 적어도 1이고 화학식 (I)의 Ar의 변수 r이 0인 Bt-Xm을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 절단과 비교하여 더 높은 속도로 절단되고/되거나; 폴리펩티드는, p이 1 내지 1000의 정수인 경우, u가 적어도 1이고 화학식 (I)의 As의 변수 s가 0인 Xm-Cu을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 절단과 비교하여 더 높은 속도로 절단된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는, n이 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 절단과 비교하여 더 높은 속도로 Ar에서 절단되고/되거나; 폴리펩티드는 p이 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 절단과 비교하여 더 높은 속도로 As에서 절단된다.
일부 실시양태에서, APC에 의한 에피토프 제시는, n이 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 제시와 비교하여 향상되고/되거나; APC에 의한 에피토프 제시는, p가 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 에피토프 제시와 비교하여 향상된다.
일부 실시양태에서, APC에 의한 에피토프 제시는, n이 1 내지 1000의 정수인 경우, t가 적어도 1이고 화학식 (I)의 Ar의 변수 r이 0인 Bt-Xm을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 에피토프 제시와 비교하여 향상되고/되거나; APC에 의한 에피토프 제시는, p이 1 내지 1000의 정수인 경우, u가 적어도 1이고 화학식 (I)의 As의 변수 s가 0인 Xm-Cu을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 에피토프 제시와 비교하여 향상된다.
일부 실시양태에서, APC는 에피토프를 면역 세포에 제시한다. 일부 실시양태에서, APC는 에피토프를 포식 세포에 제공한다. 일부 실시양태에서, APC는 에피토프를 수지상 세포, 대식구, 비만 세포, 호중구 또는 단핵구에 제시한다. 일부 실시양태에서, APC는 에피토프를 면역 세포, 포식 세포, 수지상 세포, 대식구, 비만 세포, 호중구 또는 단핵구에 우선적으로 또는 특이적으로 제시한다.
일부 실시양태에서, 면역원성은, n이 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 면역원성과 비교하여 향상되고/되거나; 면역원성은, p가 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 면역원성과 비교하여 향상된다.
일부 실시양태에서, 면역원성은, n이 1 내지 1000의 정수인 경우, t가 적어도 1이고 화학식 (I)의 Ar의 변수 r이 0인 Bt-Xm을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 면역원성과 비교하여 향상되고/되거나; 면역원성은, p이 1 내지 1000의 정수인 경우, u가 적어도 1이고 화학식 (I)의 As의 변수 s가 0인 Xm-Cu을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 면역원성과 비교하여 향상된다.
일부 실시양태에서, 항-종양 활성은, n이 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 항-종양 활성과 비교하여 향상되고/되거나; 항-종양 활성은, p가 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 항-종양 활성과 비교하여 향상된다.
일부 실시양태에서, 항-종양 활성은, n이 1 내지 1000의 정수인 경우, t가 적어도 1이고 화학식 (I)의 Ar의 변수 r이 0인 Bt-Xm을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 항-종양 활성과 비교하여 향상되고/되거나; 항-종양 활성은, p이 1 내지 1000의 정수인 경우, u가 적어도 1이고 화학식 (I)의 As의 변수 s가 0인 Xm-Cu을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 항-종양 활성과 비교하여 향상된다.
일부 실시양태에서, Yn 및/또는 Zp는 poly-Lys(polyK) 및 poly-Arg(polyR)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Yn 및/또는 Zp는 polyK-AA-AA 및 polyR-AA-AA로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하고, 각각의 AA는 아미노산 또는 이의 유사체 또는 유도체이다. 일부 실시양태에서, polyK는 poly-L-Lys를 포함한다. 일부 실시양태에서, polyR은 poly-L-Arg를 포함한다. 일부 실시양태에서, polyK 또는 polyR은 각각 적어도 3개 또는 4개의 인접 리신 또는 아르기닌 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, Ar 및/또는 As는 디설파이드; p-아미노벤질옥시카르보닐(PABC); 및 AA-AA-PABC로 이루어진 군으로부터 선택되고, 각각의 AA는 아미노산 또는 이의 유사체 또는 유도체이다. 일부 실시양태에서, AA-AA-PABC는 Ala-Lys-PABC, Val-Cit-PABC, 및 Phe-Lys-PABC로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, Ar 및/또는 As는 하기 화학식 (II)이다:
화학식 (II).
일부 실시양태에서, Ar 및/또는 As는 하기 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)이다:
화학식 (III)
화학식 (IV)
상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 (C1-C6) 알킬이고; j는 1 또는 2이고; G1은 H 또는 COOH이고; i는 1, 2, 3, 4, 또는 5이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 절단 전에 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 리신 잔기에서 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 대상체에서 APC에 의한 내재화 전에 또는 APC에 의한 프로세싱 전에 절단되지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 APC에 의한 프로세싱 전에 또는 APC에 의한 내재화 전에 대상체의 혈액에서 절단되지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 혈액 내 프로테아제에 의해 절단되지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 플라스민, 혈장 칼리크레인, 조직 칼리크레인, 트롬빈, 또는 응고 인자에 의해 절단되지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 혈장에서 안정하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 혈장에서 1시간 내지 5일의 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 리소좀, 엔도리소좀, 엔도좀, 또는 세포질세망(ER)에서 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 아미노펩티다제에 의해 절단된다. 일부 실시양태에서, 아미노펩티다제는 인슐린 조절된 아미노펩티다제(IRAP) 또는 세포질세망 아미노펩티다제(ERAP)이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 프로테아좀 및/또는 면역프로테아좀의 트립신-유사 도메인에 의해 프로세싱된다. 일부 실시양태에서, 트립신-유사 도메인은 트립신-유사 활성, 키모트립신-유사 활성, 또는 펩티딜글루타밀-펩티드 히드롤라제(PGPH) 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 프로테아제에 의해 절단된다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 트립신-유사 프로테아제, 키모트립신-유사 프로테아제, 또는 펩티딜글루타밀-펩티드 히드롤라제(PGPH)이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 아스파라긴 펩티드 리아제, 아스파르트산 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 메탈로프로테아제, 세린 프로테아제, 및 트레오닌 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 칼파인, 카스파제, 카텝신 B, 카텝신 C, 카텝신 F, 카텝신 H, 카텝신 K, 카텝신 L1, 카텝신 L2, 카텝신 O, 카텝신 S, 카텝신 W, 및 카텝신 Z로 이루어진 군으로부터 선택되는 시스테인 프로테아제이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
일부 실시양태에서, 에피토프는 MHC 클래스 I HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 10분 내지 24시간의 안정성으로 MHC 클래스 I HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 0.1 nM 내지 2000 nM의 친화도로 MHC 클래스 I HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 MHC 클래스 II HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 10분 내지 24시간의 안정성으로 MHC 클래스 II HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 0.1 nM 내지 2000 nM, 1 nM 내지 1000 nM, 10 nM 내지 500 nM, 또는 1000 nM nM 미만의 친화도로 MHC 클래스 II HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, n은 1 내지 20 또는 5 내지 12의 정수이다. 일부 실시양태에서, p는 1 내지 20 또는 5 내지 12의 정수이다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 종양 특이적 에피토프를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 2개의 폴리펩티드를 포함하고, 적어도 2개의 폴리펩티드 중 2개 이상은 동일한 화학식 Yn-Bt-Ar-Xm-As-Cu-Zp를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 2개의 폴리펩티드 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자 중 2개 이상의 Xm은 동일하다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자 중 2개 이상의 Yn은 동일하다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자 중 2개 이상의 Zp는 동일하다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자 중 2개 이상의 Ar 및/또는 As는 상이하다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제1의 것에 대해 r=0이고, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제2의 것에 대해 r=1이다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자 중 제1의 것에 대해 s=0이고, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자 중 제2의 것에 대해 s=1이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 초과의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 에피토프는 RAS 에피토프이다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 G12, G13 또는 Q61에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 RAS 단백질의 적어도 8개의 인접 아미노산 및 G12, G13 또는 Q61에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 RAS 펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, G12, G13, 또는 Q61에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 RAS 단백질의 적어도 8개의 인접 아미노산은 G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V, Q61H, Q61L, Q61K, 또는 Q61R 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, G12, G13, 또는 Q61에서의 돌연변이는 G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V, Q61H, Q61L, Q61K, 또는 Q61R 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, Yn 및/또는 Zp는 거대세포바이러스(CMV), 예컨대 pp65, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 MART-1의 단백질의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, n 및/또는 p는 1, 2, 3, 또는 3 초과의 정수이다. 일부 실시양태에서, Yn 및/또는 Zp는 리신 또는 폴리-리신을 포함한다. 일부 실시양태에서, Yn 및/또는 Zp는 K, KK, KKK, KKKK 또는 KKKKK를 포함한다.
일부 실시양태에서, 에피토프는 10 μM 미만, 1 μM 미만, 500 nM 미만, 400 nM 미만, 300 nM 미만, 250 nM 미만, 200 nM 미만, 150 nM 미만, 100 nM, 또는 50 nM 미만의 친화도로 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 24시간 초과, 12시간 초과, 9시간 초과, 6시간 초과, 5시간 초과, 4시간 초과, 3시간 초과, 2시간 초과, 1시간 초과, 45분 초과, 30분 초과, 15분, 또는 10분 초과의 안정성으로 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, HLA 대립유전자는 HLA-A02:01 대립유전자, HLA-A03:01 대립유전자, HLA-A11:01 대립유전자, HLA-A03:02 대립유전자, HLA-A30:01 대립유전자, HLA-A31:01 대립유전자, HLA-A33:01 대립유전자, HLA-A33:03 대립유전자, HLA-A68:01 대립유전자, HLA-A74:01 대립유전자, 및/또는 HLA-C08:02 대립유전자 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 에피토프는 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 
일부 실시양태에서, Yn은 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 
. 일부 실시양태에서, Zp는 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 
.
일부 실시양태에서, 에피토프는 RAS 에피토프가 아니다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 하기가 아니다: 
.
일부 실시양태에서, 에피토프는 GATA3 에피토프이다. 일부 실시양태에서, GATA3 에피토프는 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 
.
일부 측면에서, 본원에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 세포가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포는 항원 제시 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 수지상 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 성숙한 항원 제시 세포이다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 폴리펩티드를 항원 제시 세포(APC)에 접촉시키는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 절단하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 생체내에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 방법은 생체외에서 수행된다.
일부 측면에서, Yn-Ar 및/또는 As-Zp를 에피토프 서열을 포함하는 서열에 연결하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 에피토프 서열은 클래스 I MHC 또는 클래스 II에 의해 제시되고; (i) 각각의 Y는 독립적으로 아미노산, 또는 이의 유사체 또는 유도체이고, Yn은 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않고, n은 0 내지 1000의 정수이고; (ii) 각각의 Z는 독립적으로 아미노산, 또는 이의 유사체 또는 유도체이고, Zp는 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않고, p는 0 내지 1000의 정수이고; (iii) Ar은 링커이고 As는 링커이고, r 및 s 중 적어도 하나는 1이고; 추가로 (a) 폴리펩티드는 클래스 I MHC에 의해 제시되는 4개의 상이한 에피토프로 이루어지지 않고/않거나; (b) 폴리펩티드는 적어도 2개의 상이한 폴리펩티드 분자를 포함하고/하거나; (c) 에피토프는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산을 포함하고/하거나; (d) Yn 및/또는 Zp는 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때 에피토프로부터 절단된다.
일부 측면에서, Yn을 Bt-Xm 및/또는 Zp를 Xm-Cu에 연결하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, Xm은 항원 제시 세포(APC)의 클래스 I MHC 또는 클래스 II MHC에 의해 제시되는 에피토프이고; (i) 각각의 B는 독립적으로 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 대상체의 게놈 내 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산을 나타내고, t는 0 내지 1000의 정수이고; (ii) 각각의 C는 독립적으로 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 대상체의 게놈 내 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산을 나타내고, u는 0 내지 1000의 정수이고; (iii) 각각의 Y는 독립적으로 아미노산, 또는 이의 유사체 또는 유도체이고, Yn은 Bt-Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않고, n은 0 내지 1000의 정수이고; (iv) 각각의 Z는 독립적으로 아미노산, 또는 이의 유사체 또는 유도체이고, Zp는 Xm-Cu를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않고, p는 0 내지 1000의 정수이고; 추가로 (a) 폴리펩티드는 클래스 I MHC에 의해 제시되는 4개의 상이한 에피토프로 이루어지지 않고/않거나; (b) 폴리펩티드는 적어도 2개의 상이한 폴리펩티드 분자를 포함하고/하거나; (c) 에피토프는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산을 포함하고/하거나; (d) Yn-Bt 및/또는 Cu-Zp는 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때 에피토프로부터 절단된다.
일부 실시양태에서, n이 0인 경우, p는 1 내지 1000의 정수이고, p가 0인 경우, n은 1 내지 1000의 정수이다. 일부 실시양태에서, 각각의 X는 독립적으로 대상체의 게놈 내 핵산 서열에 의해 코딩되는 임의의 인접 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 서열의 아미노산을 나타내고, (a) MHC는 클래스 I MHC이고 m은 8 내지 12의 정수이거나 (b) MHC는 클래스 II MHC이고 m은 9 내지 25의 정수이다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 면역조절제 또는 애주번트를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역조절제 또는 애주번트는 poly-ICLC, 1018 ISS, 알루미늄 염, 암플리박스, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, ARNAX, STING 효능제, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, 이미퀴모드, ImuFact IMP321, IS 패치, ISS, ISCOMATRIX, 주브이뮨(JuvImmune), LipoVac, MF59, 모노포스포릴지질 A, 몬타니드 IMS 1312, 몬타니드 ISA 206, 몬타니드 ISA 50V, 몬타니드 ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PepTel®, 벡터 시스템, PLGA 마이크로입자, 레시퀴모드, SRL172, 비로좀 및 다른 바이러스-유사 입자, YF-17D, VEGF 트랩, R848, 베타-글루칸, Pam2Cys, Pam3Cys, Pam3CSK4, 및 어퀼러(Aquila) QS21 스티물론으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 면역조절제 또는 애주번트는 poly-ICLC를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 백신 조성물이다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 수성 또는 액체이다.
일부 실시양태에서, 에피토프는 1 ng 내지 10 mg 또는 5 μg 내지 1.5 mg의 양으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 DMSO를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 약제학적으로 허용되는 부형제는 물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 1 mM 미만 또는 1 mM 초과의 농도로 존재하는 pH 조절제를 포함한다. 일부 실시양태에서, pH 조절제는 디카르복실레이트 염 또는 트리카르복실레이트 염이다. 일부 실시양태에서, pH 조절제는 숙신산의 디카르복실레이트 염, 또는 디숙시네이트 염이다. 일부 실시양태에서, pH 조절제는 시트르산의 트리카르복실레이트 염, 또는 트리시트레이트 염이다. 일부 실시양태에서, pH 조절제는 이나트륨 숙시네이트이다. 일부 실시양태에서, 숙신산의 디카르복실레이트 염, 또는 디숙시네이트 염은 0.1 mM - 1 mM의 농도로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시양태에서, 숙신산의 디카르복실레이트 염, 또는 디숙시네이트 염은 1 mM - 5 mM의 농도로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시양태에서, 에피토프에 대한 면역 반응은 대상체에게 투여될 때 증가된다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 병태는 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 폐암, 비-소세포 폐암, 췌장암, 결장직장암, 자궁암, 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 투여는 피내 주사, 비강내 스프레이 적용, 근육내 주사, 복강내 주사, 정맥내 주사, 경구 투여, 또는 피하 주사를 포함한다.
일부 측면에서, 대상체의 세포를 본원에 기재된 폴리펩티드, 세포 또는 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 대상체를 예방하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 측면에서, 대상체의 종양 세포에 의해 발현되는 에피토프를 확인하는 단계 및 에피토프를 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 생성하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공되며, 폴리펩티드는 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는다:
Yn-Bt-Ar-Xm-As-Cu-Zp
화학식 (I)
상기 식에서,
(i) Xm은 에피토프이고, 각각의 X는 독립적으로 대상체의 게놈 내 핵산 서열에 의해 코딩되는 인접 아미노산 서열의 아미노산을 나타내고,
(a) MHC는 클래스 I MHC이고 m은 8 내지 12의 정수이거나,
(b) MHC는 클래스 II MHC이고 m은 9 내지 25의 정수이고;
(ii) 각각의 Y는 독립적으로 아미노산, 또는 이의 유사체 또는 유도체이고,
(A) 화학식 (I)에서 Ar의 변수 r이 0인 경우, Yn은 Bt-Ar-Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않거나,
(B) 화학식 (I)에서 Ar의 변수 r이 1이고 화학식 (I)에서 Bt의 변수 t가 0인 경우, Yn은 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않거나,
(C) 화학식 (I)에서 Ar의 변수 r이 1이고 화학식 (I)에서 Bt의 변수 t가 1 이상인 경우, Yn은 Bt를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산에 의해 코딩되지 않고;
추가로 n은 0 내지 1000의 정수이고;
(iii) 각각의 Z는 독립적으로 아미노산, 또는 이의 유사체 또는 유도체이고,
(A) 화학식 (I)에서 As의 변수 s가 0인 경우, Zp는 Xm-As-Cu를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않거나,
(B) 화학식 (I)에서 As의 변수 s가 1이고 화학식 (I)에서 Cu의 변수 u가 0인 경우, Zp는 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않거나,
(C) 화학식 (I)에서 As의 변수 s가 1이고 화학식 (I)에서 Cu의 변수 u가 1 이상인 경우, Zp는 Cu를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산에 의해 코딩되지 않고;
추가로 p는 0 내지 1000의 정수이고;
추가로
n이 0인 경우, p는 1 내지 1000의 정수이고;
p가 0인 경우, n은 1 내지 1000의 정수이고;
(iv) Ar은 링커이고 r은 0 또는 1이고;
(v) As는 링커이고, s는 0 또는 1이고;
(vi) 각각의 B는 독립적으로 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 대상체의 게놈 내 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산을 나타내고,
t는 0 내지 1000의 정수이고;
(vii) 각각의 C는 독립적으로 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 대상체의 게놈 내 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산을 나타내고,
u는 0 내지 1000의 정수이고;
추가로
(a) 폴리펩티드는 클래스 I MHC에 의해 제시되는 4개의 상이한 에피토프로 이루어지지 않고/않거나;
(b) 폴리펩티드는 적어도 2개의 상이한 폴리펩티드 분자를 포함하고/하거나;
(c) 에피토프는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산을 포함하고/하거나;
(d) Yn 및/또는 Zp는 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때 에피토프로부터 절단된다.
일부 실시양태에서, 확인은 대상체의 비-종양 세포로부터 시퀀싱된 핵산 서열의 풀에 존재하지 않는 하나 이상의 상이한 돌연변이를 포함하는 복수의 후보 펩티드 서열을 코딩하는 대상체의 종양 세포로부터 시퀀싱된 핵산 서열의 풀로부터 복수의 핵산 서열을 선택하는 것을 포함하며, 대상체의 종양 세포로부터 시퀀싱된 핵산 서열의 풀 및 대상체의 비-종양 세포로부터 시퀀싱된 핵산 서열의 풀은 전체 게놈 시퀀싱 또는 전체 엑솜 시퀀싱에 의해 시퀀싱된다. 일부 실시양태에서, 확인은 복수의 후보 펩티드 서열의 후보 펩티드 서열이 HLA 펩티드 결합 분석에 의해 동일한 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질과 복합체를 형성하는지를 예측 또는 측정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 확인은 HLA 펩티드 결합 분석에 기초하여 후보 펩티드 서열로부터 복수의 선택된 종양 특이적 펩티드 또는 복수의 선택된 종양 특이적 펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 선택하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 폴리펩티드를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여는 피내 주사, 비강내 스프레이 적용, 근육내 주사, 복강내 주사, 정맥내 주사, 경구 투여, 또는 피하 주사를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 대상체에서 유도된다. 일부 실시양태에서, 대상체의 종양 세포에 의해 발현되는 에피토프는 신생항원, 종양 관련된 항원, 돌연변이된 종양 관련된 항원이고/이거나 에피토프의 발현은 대상체의 정상 세포에서의 에피토프의 발현과 비교하여 대상체의 종양 세포에서 더 높다.
항원 제시 세포(APC)의 클래스 I MHC 또는 클래스 II MHC에 의해 제시되는 에피토프를 포함하고, 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는 폴리펩티드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 본원에 제공된다:
Yn-Bt-Ar-Xm-As-Cu-Zp
화학식 (I)
상기 식에서, Xm은 에피토프이고, 각각의 X는 독립적으로 대상체의 게놈 내 핵산 서열에 의해 코딩되는 인접 아미노산 서열의 아미노산을 나타내고, (a) MHC는 클래스 I MHC이고 m은 8 내지 12의 정수이거나, (b) MHC는 클래스 II MHC이고 m은 9 내지 25의 정수이고; 각각의 Y는 독립적으로 아미노산, 또는 이의 유사체 또는 유도체이고, 화학식 (I)에서 Ar의 변수 r이 0인 경우, Yn은 Bt-Ar-Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않거나, 화학식 (I)에서 Ar의 변수 r이 1이고 화학식 (I)에서 Bt의 변수 t가 0인 경우, Yn은 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않거나, 화학식 (I)에서 Ar의 변수 r이 1이고 화학식 (I)에서 Bt의 변수 t가 1 이상인 경우, Yn은 Bt를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산에 의해 코딩되지 않고; 추가로 n은 0 내지 1000의 정수이고; 각각의 Z는 독립적으로 아미노산, 또는 이의 유사체 또는 유도체이고, 화학식 (I)에서 As의 변수 s가 0인 경우, Zp는 Xm-As-Cu를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않거나, 화학식 (I)에서 As의 변수 s가 1이고 화학식 (I)에서 Cu의 변수 u가 0인 경우, Zp는 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않거나, 화학식 (I)에서 As의 변수 s가 1이고 화학식 (I)에서 Cu의 변수 u가 1 이상인 경우, Zp는 Cu를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산에 의해 코딩되지 않고; 추가로 p는 0 내지 1000의 정수이고; 추가로 n이 0인 경우, p는 1 내지 1000의 정수이고; p가 0인 경우, n은 1 내지 1000의 정수이고; Ar은 링커이고, r은 0 또는 1이고; As는 링커이고, s는 0 또는 1이고; 각각의 B는 독립적으로 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 대상체의 게놈 내 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산을 나타내고, t는 0 내지 1000의 정수이고; 각각의 C는 독립적으로 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 대상체의 게놈 내 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산을 나타내고, u는 0 내지 1000의 정수이고; 추가로 폴리펩티드는 클래스 I MHC에 의해 제시되는 4개의 상이한 에피토프로 이루어지지 않고/않거나; 폴리펩티드는 적어도 2개의 상이한 폴리펩티드 분자를 포함하고/하거나; 에피토프는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산을 포함하고/하거나; Yn 및/또는 Zp는 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때 에피토프로부터 절단된다.
일부 실시양태에서, 에피토프는 클래스 II MHC에 의해 제시되고 m은 9 내지 25의 정수이다.
일부 실시양태에서, Yn-Bt-Ar 및/또는 As-Cu-Zp는 Yn-Bt-Ar 및/또는 As-Cu-Zp를 함유하지 않는 상응하는 펩티드와 비교하여 폴리펩티드의 용해도를 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때 Yn-Bt-Ar 및/또는 As-Cu-Zp로부터 방출된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는, n이 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 절단과 비교하여 더 높은 속도로 절단되고/되거나; 폴리펩티드는, p이 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 절단과 비교하여 더 높은 속도로 절단된다. 일부 실시양태에서, APC에 의한 에피토프 제시는, n이 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 제시와 비교하여 향상되고/되거나; APC에 의한 에피토프 제시는, p가 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 에피토프 제시와 비교하여 향상된다. 일부 실시양태에서, APC는 에피토프를 면역 세포에 제시한다.
일부 실시양태에서, 면역원성은, n이 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 면역원성과 비교하여 향상되고/되거나; 면역원성은, p가 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 면역원성과 비교하여 향상된다.
일부 실시양태에서, 항-종양 활성은, n이 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 항-종양 활성과 비교하여 향상되고/되거나; 항-종양 활성은, p가 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 항-종양 활성과 비교하여 향상된다.
일부 실시양태에서, Yn 및/또는 Zp는 리신(Lys), poly-Lys(polyK) 및 poly-Arg(polyR)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, polyK는 poly-L-Lys를 포함한다. 일부 실시양태에서, polyR은 poly-L-Arg를 포함한다. 일부 실시양태에서, polyK 또는 polyR은 각각 적어도 2, 3 또는 4개의 인접 리신 또는 아르기닌 잔기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 에피토프는 MHC II 클래스 HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 10분 내지 24시간의 안정성으로 MHC II 클래스 HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 0.1 nM 내지 2000 nM, 1 nM 내지 1000 nM, 10 nM 내지 500 nM, 또는 1000 nM 미만의 친화도로 MHC II 부류 HLA에 결합한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 APC에 의한 프로세싱 전에 또는 대상체에서 APC에 의한 내재화 전에 절단되지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 혈장에서 안정하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 혈장에서 1시간 내지 5일의 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
일부 실시양태에서, 에피토프는 10 μM 미만, 1 μM 미만, 500 nM 미만, 400 nM 미만, 300 nM 미만, 250 nM 미만, 200 nM 미만, 150 nM 미만, 100 nM, 또는 50 nM 미만의 친화도로 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 24시간 초과, 12시간 초과, 9시간 초과, 6시간 초과, 5시간 초과, 4시간 초과, 3시간 초과, 2시간 초과, 1시간 초과, 45분 초과, 30분 초과, 15분, 또는 10분 초과의 안정성으로 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, HLA 대립유전자는 HLA-A02:01 대립유전자, HLA-A03:01 대립유전자, HLA-A11:01 대립유전자, HLA-A03:02 대립유전자, HLA-A30:01 대립유전자, HLA-A31:01 대립유전자, HLA-A33:01 대립유전자, HLA-A33:03 대립유전자, HLA-A68:01 대립유전자, HLA-A74:01 대립유전자, 및/또는 HLA-C08:02 대립유전자 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 종양 특이적 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 돌연변이 아미노산은 대상체의 게놈 내 핵산 서열에서 삽입, 결실, 프레임쉬프트, neoORF, 또는 포인트 돌연변이에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, 에피토프는 RAS 에피토프이다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 G12, G13 또는 Q61에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 RAS 단백질의 적어도 8개의 인접 아미노산 및 G12, G13 또는 Q61에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 RAS 펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, G12, G13, 또는 Q61에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 RAS 단백질의 적어도 8개의 인접 아미노산은 G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V, Q61H, Q61L, Q61K, 또는 Q61R 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, G12, G13, 또는 Q61에서의 돌연변이는 G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V, Q61H, Q61L, Q61K, 또는 Q61R 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, RAS 에피토프는 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 
. 일부 실시양태에서, Yn은 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 
. 일부 실시양태에서, Zp는 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 
. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 
. 일부 실시양태에서, 에피토프는 RAS 에피토프가 아니다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 하기가 아니다: 
.
일부 실시양태에서, Yn 및/또는 Zp는 에피토프가 유래된 단백질과 상이한 단백질의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Yn 및/또는 Zp는 CMV, 예컨대 pp65, HIV, 또는 MART-1의 단백질의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 20 초과의 정수이다. 20. 일부 실시양태에서, p는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 20 초과의 정수이다.
일부 실시양태에서, 에피토프는 TMPRSS2:ERG 에피토프이다. 일부 실시양태에서, TMPRSS2:ERG 에피토프는 ALNSEALSV의 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 본원에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 mRNA이다.
또한, 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드; 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다.
또한, 본원에 기재된 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 병태는 폐암, 비-소세포 폐암, 췌장암, 결장직장암, 자궁암, 전립선암, 간암, 담도 악성종양, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 간암, 골수성 백혈병 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암이다. 일부 실시양태에서, 투여는 피내 주사, 비강내 스프레이 적용, 근육내 주사, 복강내 주사, 정맥내 주사, 경구 투여, 또는 피하 주사를 포함한다.
또한, T 세포를 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 본원에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항원 제시 세포로 자극하는 단계를 포함하는, 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 생체외에서 수행된다
본 개시내용의 특징은 첨부된 청구범위에서 구체적으로 설명된다. 본 발명의 특징 및 이점에 대한 더 나은 이해는 본 개시내용의 원리가 활용되는 예시적인 실시양태를 설명하는 하기의 상세한 설명 및 첨부 도면을 참조하여 얻어질 것이다.
도 1은 항원 제시 세포(APC)에 의한 HLA 대립유전자 X 상의 에피토프 X의 단순화된 예시적인 에피토프 프로세싱 및 제시를 도시한다. 자연적인 맥락에서, 펩티드는 에피토프 서열의 측면에 자연적으로 배치된 아미노산 또는 아미노산 서열을 포함한다. 합리적인 맥락에서, 펩티드는, 에피토프 서열의 N- 및/또는 C-말단에, 에피토프 서열을 코딩하는 게놈에 의해 코딩되지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열, 및/또는 링커를 포함한다.
도 2는 카텝신 B-절단 가능한 링커를 함유하는 폴리펩티드의 예시적인 카텝신 B 절단을 도시한다.
도 3은 T 세포 수용체(TCR)-형질도입된 세포를 사용하여 에피토프 프로세싱 및 제시를 위해 시험관내에서 폴리펩티드를 스크리닝하기 위한 실험 설계의 다이어그램을 도시한다(결과는 도 4 및 5에 나타냄).
도 4는 KRAS-G12V 에피토프만을 함유하는 펩티드 또는 KRAS-G12V 에피토프 및 N- 및 C-말단에서 KRAS-G12V 에피토프의 측면에 자연적으로 배치된 추가 아미노산 서열을 함유하는 펩티드가 로딩된 동량의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 48시간 공동 배양 후 KRAS 특이적 저캇(Jurkat) 세포에 의해 분비되는 IL-2의 수준(pg/mL)을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 5는 KRAS-G12V 에피토프만을 함유하는 펩티드, KRAS-G12V 에피토프 및 N- 및 C-말단에서 KRAS-G12V 에피토프의 측면에 자연적으로 배치된 추가 아미노산 서열을 함유하는 펩티드, 또는 KRAS-G12V 에피토프 및 N- 및 C-말단에서 KRAS-G12V 에피토프의 측면에 자연적으로는 배치되지 않는 합리적으로 설계된 추가 아미노산 서열을 함유하는 펩티드가 로딩된 동량의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 48시간 공동 배양 후 KRAS 특이적 저캇 세포에 의해 분비되는 IL-2의 수준(pg/mL)을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 6은 면역원성 연구의 실험 설계의 다이어그램을 도시한다. 마우스를 다양한 폴리펩티드 설계로 제0일, 제7일 및 제14일에 면역화시키고, 제7일, 제14일 및 제21일에 채혈하여 항원 특이적 CD8+ T 세포 반응을 평가하였다(결과는 도 7-9에 나타냄).
도 7은 총 면역 반응(7a: H-2Kb, 7b: H-2Db, 7c: 전체)을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 8은 K4-에피토프로의 면역화가 H-2Kb-제시된 에피토프에 대한 면역 반응을 향상시킨다는 것을 입증하는 그래프를 도시한다(8a: Alg8, 8b: Lama4).
도 9는 K4-에피토프로의 면역화가 H-2Db-제시된 에피토프에 대한 면역 반응을 증가시킨다는 것을 입증하는 그래프를 도시한다(9a: Reps1, 9b: Adpgk, 9c: Irgq, 9d: Obsl1).
도 10은 TMPRSS2::ERG 에피토프만을 함유하는 펩티드로 로딩되거나, 자연적인 맥락으로 TMPRSS2::ERG 에피토프를 함유하는 펩티드(즉, N- 및/또는 C-말단에서 에피토프 서열의 측면에 자연적으로 배치된 아미노산 또는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 펩티드)를 코딩하는 플라스미드, 비-자연적인 맥락으로 TMPRSS2::ERG 에피토프를 함유하는 펩티드(즉, 에피토프 서열의 측면에 자연적으로는 배치되지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 펩티드)를 코딩하는 플라스미드, 또는 비-자연적인 맥락으로 (대조군으로) 관련 없는 에피토프를 코딩하는 플라스미드로 형질도입된 293T 세포와 24시간 공동 배양 후(저캇 대 293T 세포의 5:1 비율), 저캇 세포에 의해 분비되는 IL-2(pg/mL)의 수준을 나타내는 그래프를 도시한다
도 11은 HLA-A11:01 대립유전자에 의해 코딩되는 MHC에 결합되는 밑줄 친 RAS-G12V 에피토프에 결합하는 TCR로 형질도입된 저캇 세포와 공동 배양 후 증가하는 양의 표시된 RAS-G12V 돌연변이 펩티드와 접촉된 FLT3L-처리된 PBMC에서 IL-2 농도(pg/mL) 대 펩티드 농도(nM)의 그래프를 도시한다.
도 12는 건강한 도너로부터의 PBMC를 사용한 시험관내(상단) 및 펩티드로 면역화된 HLA-A11:01 트랜스제닉 마우스를 사용한 생체내(하단) 둘 다에서 도 11로부터의 표시된 RAS-G12V 돌연변이 펩티드의 면역원성을 예시하는 데이터를 도시한다.
도 13a는 세포에서의 발현을 위해 사용되는 쇼트머(shortmer) (9-10개 아미노산, 상단) 및 롱머(longmer) (25개 아미노산, 하단)를 사용하는 mRNA 구축물의 예시적인 개략도를 도시한다.
도 13b는 총 CD8+ 세포의 백분율로서 멀티머 특이적 CD8+ 세포의 예시적인 그래프를 도시한다. 멀티머 검정에 사용된 항원이 표시된다.
도 13c는 쇼트머(9-10개 아미노산) 및 롱머(2 아미노산) 펩티드 자극된 APC 및 동일한 쇼트머(9-10개 아미노산) 및 롱머(25개 아미노산)를 코딩하는 RNA를 함유하는 APC를 비교하는, 멀티머 양성 CD8+ T 세포의 검출에 대한 예시적인 유동 세포측정 분석을 도시한다.
도 1은 항원 제시 세포(APC)에 의한 HLA 대립유전자 X 상의 에피토프 X의 단순화된 예시적인 에피토프 프로세싱 및 제시를 도시한다. 자연적인 맥락에서, 펩티드는 에피토프 서열의 측면에 자연적으로 배치된 아미노산 또는 아미노산 서열을 포함한다. 합리적인 맥락에서, 펩티드는, 에피토프 서열의 N- 및/또는 C-말단에, 에피토프 서열을 코딩하는 게놈에 의해 코딩되지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열, 및/또는 링커를 포함한다.
도 2는 카텝신 B-절단 가능한 링커를 함유하는 폴리펩티드의 예시적인 카텝신 B 절단을 도시한다.
도 3은 T 세포 수용체(TCR)-형질도입된 세포를 사용하여 에피토프 프로세싱 및 제시를 위해 시험관내에서 폴리펩티드를 스크리닝하기 위한 실험 설계의 다이어그램을 도시한다(결과는 도 4 및 5에 나타냄).
도 4는 KRAS-G12V 에피토프만을 함유하는 펩티드 또는 KRAS-G12V 에피토프 및 N- 및 C-말단에서 KRAS-G12V 에피토프의 측면에 자연적으로 배치된 추가 아미노산 서열을 함유하는 펩티드가 로딩된 동량의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 48시간 공동 배양 후 KRAS 특이적 저캇(Jurkat) 세포에 의해 분비되는 IL-2의 수준(pg/mL)을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 5는 KRAS-G12V 에피토프만을 함유하는 펩티드, KRAS-G12V 에피토프 및 N- 및 C-말단에서 KRAS-G12V 에피토프의 측면에 자연적으로 배치된 추가 아미노산 서열을 함유하는 펩티드, 또는 KRAS-G12V 에피토프 및 N- 및 C-말단에서 KRAS-G12V 에피토프의 측면에 자연적으로는 배치되지 않는 합리적으로 설계된 추가 아미노산 서열을 함유하는 펩티드가 로딩된 동량의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 48시간 공동 배양 후 KRAS 특이적 저캇 세포에 의해 분비되는 IL-2의 수준(pg/mL)을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 6은 면역원성 연구의 실험 설계의 다이어그램을 도시한다. 마우스를 다양한 폴리펩티드 설계로 제0일, 제7일 및 제14일에 면역화시키고, 제7일, 제14일 및 제21일에 채혈하여 항원 특이적 CD8+ T 세포 반응을 평가하였다(결과는 도 7-9에 나타냄).
도 7은 총 면역 반응(7a: H-2Kb, 7b: H-2Db, 7c: 전체)을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 8은 K4-에피토프로의 면역화가 H-2Kb-제시된 에피토프에 대한 면역 반응을 향상시킨다는 것을 입증하는 그래프를 도시한다(8a: Alg8, 8b: Lama4).
도 9는 K4-에피토프로의 면역화가 H-2Db-제시된 에피토프에 대한 면역 반응을 증가시킨다는 것을 입증하는 그래프를 도시한다(9a: Reps1, 9b: Adpgk, 9c: Irgq, 9d: Obsl1).
도 10은 TMPRSS2::ERG 에피토프만을 함유하는 펩티드로 로딩되거나, 자연적인 맥락으로 TMPRSS2::ERG 에피토프를 함유하는 펩티드(즉, N- 및/또는 C-말단에서 에피토프 서열의 측면에 자연적으로 배치된 아미노산 또는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 펩티드)를 코딩하는 플라스미드, 비-자연적인 맥락으로 TMPRSS2::ERG 에피토프를 함유하는 펩티드(즉, 에피토프 서열의 측면에 자연적으로는 배치되지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 펩티드)를 코딩하는 플라스미드, 또는 비-자연적인 맥락으로 (대조군으로) 관련 없는 에피토프를 코딩하는 플라스미드로 형질도입된 293T 세포와 24시간 공동 배양 후(저캇 대 293T 세포의 5:1 비율), 저캇 세포에 의해 분비되는 IL-2(pg/mL)의 수준을 나타내는 그래프를 도시한다
도 11은 HLA-A11:01 대립유전자에 의해 코딩되는 MHC에 결합되는 밑줄 친 RAS-G12V 에피토프에 결합하는 TCR로 형질도입된 저캇 세포와 공동 배양 후 증가하는 양의 표시된 RAS-G12V 돌연변이 펩티드와 접촉된 FLT3L-처리된 PBMC에서 IL-2 농도(pg/mL) 대 펩티드 농도(nM)의 그래프를 도시한다.
도 12는 건강한 도너로부터의 PBMC를 사용한 시험관내(상단) 및 펩티드로 면역화된 HLA-A11:01 트랜스제닉 마우스를 사용한 생체내(하단) 둘 다에서 도 11로부터의 표시된 RAS-G12V 돌연변이 펩티드의 면역원성을 예시하는 데이터를 도시한다.
도 13a는 세포에서의 발현을 위해 사용되는 쇼트머(shortmer) (9-10개 아미노산, 상단) 및 롱머(longmer) (25개 아미노산, 하단)를 사용하는 mRNA 구축물의 예시적인 개략도를 도시한다.
도 13b는 총 CD8+ 세포의 백분율로서 멀티머 특이적 CD8+ 세포의 예시적인 그래프를 도시한다. 멀티머 검정에 사용된 항원이 표시된다.
도 13c는 쇼트머(9-10개 아미노산) 및 롱머(2 아미노산) 펩티드 자극된 APC 및 동일한 쇼트머(9-10개 아미노산) 및 롱머(25개 아미노산)를 코딩하는 RNA를 함유하는 APC를 비교하는, 멀티머 양성 CD8+ T 세포의 검출에 대한 예시적인 유동 세포측정 분석을 도시한다.
에피토프 프로세싱 및 제시를 향상시켜 면역 반응을 자극하는 방법의 발견을 기반으로 하는 개체의 종양 특이적 항원 또는 신생에피토프를 포함하는 새로운 면역치료 조성물 및 이의 용도가 본원에 기재된다. 따라서, 본원에 기재된 본 개시내용은, 예컨대 종양 관련된 항원 또는 신생에피토프에 대한 면역 반응을 자극하고, 암, 질환 또는 병태를 치료하는 데 사용하기 위한 면역원성 조성물 또는 암 백신을 생성하기 위해 사용될 수 있는 펩티드를 제공한다.
하기 설명 및 예는 본 개시내용의 실시양태를 상세히 예시한다. 본 개시 내용은 본원에 기재된 특정 실시양태에 제한되지 않고 변경될 수 있음을 이해해야 한다. 당업자는 본 발명의 범위 내에 포괄되는 본 개시내용의 많은 변화 및 변형이 있음을 인식할 것이다.
모든 용어는 당업자가 이해하는 바와 같이 이해되도록 의도된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에 사용된 섹션 제목은 조직화 목적만을 위한 것이며 설명된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 개시내용의 다양한 특징들이 단일 실시양태의 맥락에서 설명될 수 있지만, 특징들은 또한 개별적으로 또는 임의의 적절한 조합으로 제공될 수 있다. 역으로, 본 개시내용은 명료함을 위해 별도의 실시양태의 맥락에서 본원에서 설명될 수 있지만, 본 개시내용은 또한 단일 실시양태로 구현될 수 있다.
하기 정의는 당업계의 정의를 보완하고 본 출원에 대한 것이며 임의의 관련되거나 관련되지 않은 사례, 예컨대 임의의 공동 소유의 특허 또는 출원에 귀속되어서는 안된다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 개시내용의 시험을 위한 실시에 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에 기재된다. 따라서, 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 설명하기 위해 사용된 것으로, 한정하려는 의도가 아니다.
1. 정의
본원에 사용된 용어는 단지 특정한 사례를 설명하기 위해 사용된 것으로, 한정하려는 의도가 아니다. 본 출원에서 단수의 사용은 특별히 달리 언급되지 않는 한 복수를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도된다.
본 출원에서 "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 용어 "및/또는" 및 "이들의 임의의 조합" 및 본원에 사용된 이들의 문법적 등가물은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이러한 용어는 임의의 조합이 구체적으로 고려된다는 것을 전달할 수 있다. 단지 설명을 위한 목적으로, 하기 어구 "A, B, 및/또는 C" 또는 "A, B, C, 또는 이들의 임의의 조합"은 "A 개별적으로; B 개별적으로; C 개별적으로; A 및 B; B 및 C; A 및 C; 및 A, B, 및 C"를 의미할 수 있다. 용어 "또는"은 문맥이 구체적으로 분리 사용을 언급하지 않는 한 결합적으로 또는 분리적으로 사용될 수 있다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내를 의미할 수 있으며, 이는 값이 측정되거나 결정되는 방식, 즉 측정 시스템의 한계에 부분적으로 의존할 것이다. 예컨대, "약"은 당업계의 관행에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 최대 10%, 최대 5%, 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 이 용어는 값의 10배 이내, 5배 이내, 보다 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원 및 청구범위에 기재되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "약"은 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하는 것으로 가정되어야 한다.
본 명세서 및 청구범위(들)에서 사용되는 단어 "포함하는" (및 "포함하다"와 같은 포함하는의 임의의 형태), "갖는" (및 "갖다"와 같은 임의의 형태), 또는 "함유하는" (및 "함유하다"와 같은 임의의 형태)은 포괄적이거나 개방형이며, 추가의 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본 명세서에서 논의되는 임의의 실시양태는 본 개시내용의 임의의 방법 또는 조성물과 관련하여 구현될 수 있으며, 그 반대도 마찬가지인 것으로 고려된다. 또한, 본 개시내용의 조성물은 본 개시내용의 방법을 달성하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에서 "일부 실시양태", "일 실시양태", "한 실시양태" 또는 "다른 실시양태"에 대한 언급은 실시양태와 관련하여 설명되는 특색 , 구조 또는 특징이 적어도 일부 실시양태에 포함된다는 것을 의미하나, 본 개시내용의 모든 실시양태가 반드시 그런 것은 아니다. 본 개시내용의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어 및 어구가 하기에 정의된다.
펩티드 또는 단백질을 설명하는 데 사용되는 명명법은 아미노기가 각각의 아미노산 잔기의 왼쪽에 표시되고(아미노- 또는 N-말단), 카르복실기가 각각의 아미노산의 오른쪽에 표시되는(카르복시- 또는 C-말단) 통상적인 관행을 따른다. 아미노산 잔기 위치가 펩티드 에피토프에서 언급될 때, 위치는 아미노에서 카르복실 방향으로 번호가 매겨지고, 위치 1은 에피토프, 또는 에피토프가 일부일 수 있는 펩티드 또는 단백질의 아미노 말단 끝에 위치된 잔기이다. 본 개시내용의 선택된 특정 실시양태를 나타내는 화학식에서, 아미노- 및 카르복실-말단기는 구체적으로 나타내지는 않았지만 달리 명시되지 않는 한 생리학적 pH 값에서 가정하는 형태이다. 아미노산 구조식에서, 각각의 잔기는 일반적으로 표준 3문자 또는 단문자로 표시된다. 아미노산 잔기의 L-형은 대문자 단문자 또는 3문자 기호의 대문자 첫 문자로 표시되고, D형을 갖는 아미노산 잔기에 대한 D-형은 소문자 단문자 또는 소문자 3문자 기호로 표시된다. 그러나, 3문자 기호 또는 전체 명칭을 대문자 없이 사용하는 경우에는, L 아미노산 잔기를 지칭할 수 있다. 글리신은 비대칭 탄소 원자가 없으며, 단순히 "Gly" 또는 "G"로 지칭된다. 본원에 제시된 펩티드의 아미노산 서열은 일반적으로 표준 단문자 기호를 사용하여 지정된다. (A, 알라닌; C, 시스테인; D, 아스파르트산; E, 글루탐산; F, 페닐알라닌; G, 글리신; H, 히스티딘; I, 이소류신; K, 리신; L, 류신; M, 메티오닌; N, 아스파라긴; P, 프롤린; Q, 글루타민; R, 아르기닌; S, 세린; T, 트레오닌; V, 발린; W, 트립토판; 및 Y, 티로신).
용어 "잔기"는 아미드 결합 또는 아미드 결합 모방체에 의해 펩티드 또는 단백질에 포함되는 아미노산 잔기 또는 아미노산 모방체 잔기, 또는 아미노산 또는 아미노산 모방체를 코딩하는 핵산(DNA 또는 RNA)을 지칭한다.
본원에 사용된 "폴리펩티드", "펩티드" 및 이들의 문법적 등가물은 아미노산 잔기의 폴리머를 지칭한다. "성숙한 단백질"은 전장인 단백질이며, 임의적으로 주어진 세포 환경에서 단백질에 대해 전형적인 글리코실화 또는 다른 변형을 포함한다. 본원에 개시된 폴리펩티드 및 단백질(이의 기능적 부분 및 기능적 변이체 포함)은 하나 이상의 자연 발생 아미노산 대신 합성 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 합성 아미노산은 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 아미노사이클로헥산 카르복실산, 노르류신, α-아미노 n-데카노산, 호모세린, S-아세틸아미노메틸-시스테인, 트랜스-3- 및 트랜스-4-히드록시프롤린, 4-아미노페닐알라닌, 4-니트로페닐알라닌, 4-클로로페닐알라닌, 4-카르복시페닐알라닌, β-페닐세린 β-히드록시페닐알라닌, 페닐글리신, α-나프틸알라닌, 사이클로헥실알라닌, 사이클로헥실글리신, 인돌린-2-카르복실산, 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산, 아미노말론산, 아미노말론산 모노아미드, N'-벤질-N'-메틸-리신, N',N'-디벤질-리신, 6-히드록시리신, 오르니틴, α-아미노사이클로펜탄 카르복실산, α-아미노사이클로헥산 카르복실산, α-아미노사이클로헵탄 카르복실산, α-(2-아미노-2-노르보르난)-카르복실산, α,γ-디아미노부티르산, α,β-디아미노프로피온산, 호모페닐알라닌, 및 α-tert-부틸글리신을 포함한다. 본 개시내용은 조작된 세포에서 본원에 기재된 폴리펩티드의 발현이 폴리펩티드 구축물의 하나 이상의 아미노산의 번역 후 변형과 관련될 수 있음을 추가로 고려한다. 번역 후 변형의 비제한적인 예는 인산화, 아세틸화 및 포르밀화를 포함하는 아실화, 글리코실화(N-연결 및 O-연결 포함), 아미드화, 히드록실화, 메틸화 및 에틸화를 포함하는 알킬화, 유비퀴틴화, 피롤리돈 카르복실산의 첨가, 디설파이드 브릿지, 황산화, 미리스토일화, 팔미토일화, 이소프레닐화, 파르네실화, 게라닐화, 글리피에이션(glypiation), 리포일화 및 요오드화를 포함한다.
용어 "펩티드"는 전형적으로 α-아미노와 인접한 아미노산 잔기의 카르복실기 사이의 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 일련의 아미노산 잔기를 지칭한다.
"합성 펩티드"는 비-천연 공급원, 예컨대 인공으로부터 수득되는 펩티드를 지칭한다. 이러한 펩티드는 화학적 합성 또는 재조합 DNA 기술과 같은 방법을 이용하여 생성될 수 있다. "합성 펩티드"는 "융합 단백질"을 포함한다.
"에피토프"는, 예컨대 면역글로불린, T 세포 수용체, HLA 분자, 또는 키메라 항원 수용체에 의해 인식되는 부위를 함께 형성하는 1차, 2차, 및 3차 펩티드 구조 및 전하와 같은 분자의 집합적 특징이다. 대안적으로, 에피토프는 특정 면역글로불린에 의한 인식에 관여하는 아미노산 잔기의 세트, 또는 T 세포의 맥락에서 T 세포 수용체 단백질, 키메라 항원 수용체, 및/또는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 수용체에 의한 인식에 필요한 잔기로 정의될 수 있다. "T 세포 에피토프"는 펩티드-제시 MHC 분자 또는 MHC 복합체의 형태로 클래스 I 또는 II의 MHC 분자에 의해 결합될 수 있고 이어서 이 형태로 T-림프구 또는 T-헬퍼 세포와 같은 T 세포에 의해 인식 및 결합될 수 있는 펩티드 서열을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 에피토프는 천연 공급원으로부터 단리하여 제조될 수 있거나, 당업계의 표준 프로토콜에 따라 합성될 수 있다. 합성 에피토프는 인공 아미노산 잔기, "아미노산 모방체", 예컨대 자연 발생 L 아미노산 잔기의 D 이성질체 또는 사이클로헥실알라닌과 같은 비자연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 본 개시내용 전반에 걸쳐, 에피토프는 일부 경우에 펩티드 또는 펩티드 에피토프로 지칭될 수 있다. 본원에 기재된 에피토프 또는 유사체 뿐만 아니라 추가의 아미노산(들)을 포함하는 단백질 또는 펩티드가 여전히 본 개시내용의 범위 내에 있음을 이해해야 한다. 특정 실시양태에서, 펩티드는 항원의 단편을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 펩티드의 길이에는 제한이 있다. 길이가 제한된 실시양태는 본원에 기재된 에피토프를 포함하는 단백질 또는 펩티드가 천연 서열과 100% 동일성을 갖는 영역(즉, 아미노산 잔기의 인접 시리즈)을 포함할 때 발생한다. 에피토프가, 예컨대 전체 천연 분자에 대한 판독으로부터 정의되는 것을 피하기 위해, 천연 펩티드 서열과 100% 동일성을 갖는 임의의 영역의 길이에 제한이 있다. 따라서, 본원에 기재된 에피토프 및 천연 펩티드 서열과 100% 동일성을 갖는 영역을 포함하는 펩티드의 경우, 천연 서열에 대해 100% 동일성을 갖는 영역은 일반적으로 600개 이하의 아미노산 잔기, 500개 이하의 아미노산 잔기, 400개 이하의 아미노산 잔기, 250개 이하의 아미노산 잔기, 100개 이하의 아미노산 잔기, 85개 이하의 아미노산 잔기, 75개 이하의 아미노산 잔기, 65개 이하의 아미노산 잔기, 및 50개 이하의 아미노산 잔기의 길이를 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 "에피토프"는 5개의 아미노산 잔기까지의 임의의 증분으로 천연 펩티드 서열에 대해 100% 동일성을 갖는 51개 미만의 아미노산 잔기 , 예컨대 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산 잔기를 갖는 영역을 갖는 펩티드로 구성된다.
에피토프를 논의하기 위해 사용될 때 용어 "유도된" 및 이의 문법적 등가물은 "제조된" 및 이의 문법적 등가물과 동의어이다. 유도된 에피토프는 천연 공급원으로부터 단리될 수 있거나, 당업계의 표준 프로토콜에 따라 합성될 수 있다. 합성 에피토프는 인공 아미노산 잔기 "아미노산 모방체", 예컨대 자연 발생 L 아미노산 잔기의 D 이성질체 또는 비-천연 아미노산 잔기, 예컨대 사이클로헥실알라닌을 포함할 수 있다. 유도되거나 제조된 에피토프는 천연 에피토프의 유사체일 수 있다.
"면역원성" 펩티드 또는 "면역원성" 에피토프 또는 "펩티드 에피토프"는 펩티드가 HLA 분자에 결합하고 세포 매개된 반응 또는 체액 반응, 예컨대 세포독성 T 림프구(CTL(예컨대, CD8+)), 헬퍼 T 림프구(Th(예컨대, CD4+)) 및/또는 B 림프구 반응을 유도하도록 대립유전자 특이적 모티프를 포함하는 펩티드이다. 따라서, 본원에 기재된 면역원성 펩티드는 적절한 HLA 분자에 결합하고, 그 후 펩티드에 대한 CTL(세포독성) 반응 또는 HTL (및 체액성) 반응을 유도할 수 있다.
"신생항원"은 단백질의 종양 특이적 변화로부터 발생하는 종양 항원 부류를 의미한다. 신생항원은, 예컨대 단백질 서열의 치환, 프레임 쉬프트 돌연변이, 융합 폴리펩티드, 프레임내 결실, 삽입, 내인성 레트로바이러스 폴리펩티드의 발현 및 폴리펩티드의 종양 특이적 과발현으로부터 발생하는 종양 항원을 포괄하지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 "펩티드"와 상호교환적으로 사용되는 용어 "돌연변이 펩티드", "종양 특이적 펩티드", "신생항원 펩티드" 및 "신생항원성 펩티드"는 전형적으로 인접한 아미노산의 α-아미노기와 카르복실기 사이의 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 일련의 잔기, 통상적으로 L-아미노산을 지칭한다. 유사하게, 용어 "폴리펩티드"는 전형적으로 인접한 아미노산의 α-아미노기와 카르복실기 사이의 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 일련의 잔기, 예컨대 L-아미노산을 지정하기 위해 본 명세서에서 "돌연변이 폴리펩티드", "신생항원 폴리펩티드" 및 "신생항원성 폴리펩티드"와 상호교환적으로 사용된다. 폴리펩티드 또는 펩티드는, 중성(비하전된) 형태 또는 염 형태이고, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드의 생물학적 활성을 파괴하지 않는 조건에 따라 글리코실화, 측쇄 산화 또는 인산화와 같은 변형이 없거나 이러한 변형을 함유하는, 다양한 길이일 수 있다. 본원에 사용된 펩티드 또는 폴리펩티드는 적어도 하나의 플랭킹 서열을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "플랭킹 서열"은 신생에피토프의 일부가 아닌 신생항원 펩티드의 단편 또는 영역을 지칭한다.
"신생에피토프", "종양 특이적 신생에피토프", "종양 특이적 에피토프", 또는 "종양 항원"은 병들지 않은 세포, 예컨대 비-암성 세포 또는 배선 세포와 같은 참조물에서는 존재하지 않지만, 병든 세포, 예컨대 암세포에서 발견되는 에피토프 또는 항원 결정인자 영역을 지칭한다. 이는 상응하는 에피토프가 정상의 병들지 않은 세포 또는 배선 세포에서는 발견되지 않지만, 병든 세포, 예컨대 암세포에서의 하나 이상의 돌연변이로 인해 에피토프의 서열이 변경되어 신생에피토프를 생성하는 상황을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "신생에피토프"는 펩티드 또는 신생항원 펩티드 내의 항원 결정인자 영역을 지칭한다. 신생에피토프는 적어도 하나의 "앵커 잔기" 및 적어도 하나의 "앵커 잔기 플랭킹 영역"을 포함할 수 있다. 신생에피토프는 "분리 영역"을 추가로 포함할 수 있다. 용어 "앵커 잔기"는 HLA 상의 특정 포켓에 결합하여 HLA와의 상호작용의 특이성을 초래하는 아미노산 잔기를 지칭한다. 일부 경우에서, 앵커 잔기는 표준 앵커 위치에 있을 수 있다. 다른 경우에서, 앵커 잔기는 비-표준 앵커 위치에 있을 수 있다. 신생에피토프는 펩티드 결합 홈의 포켓으로 돌출된 1차 및 2차 앵커 잔기를 통해 HLA 분자에 결합할 수 있다. 펩티드 결합 홈에서, 특정 아미노산은 제시된 신생에피토프의 앵커 잔기의 상응하는 측쇄를 수용하는 포켓을 구성한다. 펩티드 결합 선호도는 HLA I 및 HLA II 분자 모두의 상이한 대립유전자 사이에 존재한다. HLA 클래스 I 분자는 N- 및 C-말단 끝이 신생에피토프 결합 홈의 끝에 위치된 포켓에 고정되어 있는 짧은 신생에피토프에 결합한다. HLA 클래스 I 결합 신생에피토프의 대부분은 약 9개의 아미노산이지만, 더 긴 신생에피토프는 중앙 부분의 팽창에 의해 수용될 수 있어 약 8 내지 12개의 아미노산의 결합 신생에피토프가 생성된다. HLA 클래스 II 단백질에 결합하는 신생에피토프는 크기가 제한되지 않으며 약 16 내지 25개의 아미노산으로 다양할 수 있다. HLA 클래스 II 분자의 신생에피토프 결합 홈은 양쪽 끝이 열려 있어 비교적 긴 길이의 펩티드가 결합할 수 있다. 코어 9개 아미노산 잔기 길이의 긴 세그먼트가 신생에피토프의 인식에 가장 크게 기여하지만, 앵커 잔기 플랭킹 영역도 HLA 클래스 II 대립유전자에 대한 펩티드의 특이성에 중요하다. 일부 경우에서, 앵커 잔기 플랭킹 영역은 N-말단 잔기이다. 또 다른 경우에서, 앵커 잔기 플랭킹 영역은 C-말단 잔기이다. 또 다른 경우에서, 앵커 잔기 플랭킹 영역은 N-말단 잔기 및 C-말단 잔기 모두이다. 일부 경우에서, 앵커 잔기 플랭킹 영역은 적어도 2개의 앵커 잔기가 측면에 배치된다. 앵커 잔기가 측면에 배치된 앵커 잔기 플랭킹 영역은 "분리 영역"이다.
"주요 조직적합성 복합체" 또는 "MHC"는 생리학적 면역 반응을 담당하는 세포 상호작용의 제어에서 역할을 하는 유전자 클러스터이다. 인간에서, MHC 복합체는 인간 백혈구 항원(HLA) 복합체로도 공지되어 있다. MHC 및 HLA 복합체에 대한 자세한 설명은 문헌(Paul, Fundamental Immunology, 3rd Ed., Raven Press, New York (1993))을 참조한다. "주요 조직적합성 복합체(MHC)의 단백질 또는 분자", "MHC 분자", "MHC 단백질" 또는 "HLA 단백질"은 단백질 항원의 단백질분해 절단으로부터 생성되고 잠재적인 림프구 에피토프(예컨대, T 세포 에피토프 및 B 세포 에피토프)를 나타내는 펩티드에 결합하고, 이들을 세포 표면으로 수송하고, 여기에서 이들을 특정 세포, 특히 세포독성 T-림프구, T-헬퍼 세포, 또는 B 세포에 제시할 수 있는 단백질을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 게놈의 주요 조직적합성 복합체는 세포 표면에 발현된 유전자 생성물이 내인성 및/또는 외래 항원을 결합하고 제시하여 면역학적 과정을 조절하는 데 중요한 유전자 영역을 포함한다. 주요 조직적합성 복합체는 상이한 단백질을 코딩하는 2개의 유전자 그룹, 즉 MHC 클래스 I 분자 및 MHC 클래스 II 분자로 분류된다. 2개의 MHC 클래스의 세포 생물학 및 발현 패턴은 이러한 상이한 역할에 맞게 조정된다.
"인간 백혈구 항원" 또는 "HLA"는 인간 클래스 I 또는 클래스 II 주요 조직적합성 복합체(MHC) 단백질이다(예컨대, 문헌(Stites, et al., Immunology, 8th Ed., Lange Publishing, Los Altos, Calif. (1994)) 참조).
"펩티드-MHC(pMHC) 안정성"은 생화학적 검정에서 특정 펩티드 양의 절반이 동족 HLA로부터 해리되는 데 걸리는 시간의 길이를 지칭한다.
"항원 제시 세포"(APC)는 세포 표면 상의 MHC 분자와 회합하여 단백질 항원의 펩티드 단편을 제시하는 세포이다. 일부 APC는 항원 특이적 T 세포를 활성화할 수 있다. 성숙한 전문 항원 제시 세포는 포식작용 또는 수용체 매개된 세포내이입에 의해 항원을 내재화한 후 클래스 II MHC 분자에 결합된 항원 단편을 막 상에 디스플레이하는 데 매우 효율적이다. T 세포는 항원 제시 세포의 막 상의 항원-클래스 II MHC 분자 복합체를 인식하고 상호작용한다. 이어서, 추가의 공동 자극 신호가 항원 제시 세포에 의해 생성되어 T 세포의 활성화를 유도한다. 공동 자극 분자의 발현은 전문 항원 제시 세포의 결정적인 특징이다. 전문 항원 제시 세포의 주요 유형은 가장 광범위한 항원 제시 범위를 갖고 아마도 가장 중요한 항원 제시 세포인 수지상 세포, 대식구, B 세포, 및 특정한 활성화된 상피 세포일 것이다. "수지상 세포(DC)"는 MHC 클래스 II 및 I 항원 제시 경로 둘 다를 통해 말초 조직에서 포획된 항원을 T 세포에 제시하는 백혈구 집단이다. 수지상 세포는 면역 반응의 강력한 유도자이며 이들 세포의 활성화는 항종양 면역의 유도를 위한 중요한 단계라는 것은 널리 공지되어 있다. 수지상 세포는 "미성숙" 및 "성숙" 세포로 편리하게 분류되며, 이는 2개의 잘 특성화된 표현형을 구별하는 간단한 방법으로 사용될 수 있다. 그러나, 이 명명법은 분화의 가능한 모든 중간 단계를 배제하는 것으로 해석되어서는 안된다. 미성숙한 수지상 세포는 Fc 수용체(FcR) 및 만노스 수용체의 높은 발현과 상관관계가 있는 높은 항원 흡수 및 프로세싱 능력을 갖는 항원 제시 세포로 특징지어진다. 성숙한 표현형은 전형적으로 이러한 마커의 발현은 낮지만 클래스 I 및 클래스 II MHC, 접착 분자(예컨대, CD54 및 CD11) 및 공동자극 분자(예컨대, CD40, CD80, CD86 및 4-1BB)와 같은 T 세포 활성화를 담당하는 세포 표면 분자의 높은 발현으로 특징지어진다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드", "핵산", "다핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드" 및 이들의 문법적 등가물은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머를 지칭하며, DNA 및 RNA, 예컨대 mRNA를 포함한다. 따라서, 이러한 용어는 이중 및 단일 가닥 DNA, 삼중 DNA 뿐만 아니라, 이중 및 단일 가닥 RNA도 포함한다. 이는 또한, 예컨대 메틸화 및/또는 캡핑에 의한 변형 및 폴리뉴클레오티드의 변형되지 않은 형태를 포함한다. 이 용어는 또한 비-자연 발생 또는 합성 뉴클레오티드 뿐만 아니라 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 분자를 포함하는 것을 의미한다. 본원에 개시되거나 고려되는 핵산 서열 및 벡터는, 예컨대 형질감염, 형질전환 또는 형질도입에 의해 세포에 도입될 수 있다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 폴리머에 편입될 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 및 핵산은 시험관내 전사된 mRNA일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법을 이용하여 투여되는 폴리뉴클레오티드는 mRNA이다.
"참조"는 종양 표본으로부터 본 개시내용의 방법에서 수득된 결과를 서로 관련시키고 비교하기 위해 사용될 수 있다. 전형적으로 "참조"는, 환자 또는 하나 이상의 상이한 개체, 예컨대 건강한 개체, 특히 동일한 종의 개체로부터 수득된, 하나 이상의 정상 표본, 특히 암 질환의 영향을 받지 않는 표본을 기반으로 얻을 수 있다, "참조"는 충분히 큰 수의 정상 표본을 시험하여 경험적으로 결정될 수 있다.
용어 "돌연변이" 또는 "돌연변이체"는 참조와 비교하여 핵산 서열의 변화 또는 차이(뉴클레오티드 치환, 부가, 삽입 또는 결실)를 지칭한다. "체세포 돌연변이"는 배세포(정자 및 난자)를 제외한 신체의 임의의 세포에서 발생할 수 있으므로 어린이에게 전달되지 않는다. 이러한 변화는 암 또는 다른 질환을 유발할 수 있다(그러나 항상 그런 것은 아니다). 일부 실시양태에서, 돌연변이는 비-동의적(non-synonymous) 돌연변이이다. 용어 "비-동의적 돌연변이"는 번역 생성물에서 아미노산 치환과 같은 아미노산 변화를 초래하는 돌연변이, 예컨대 뉴클레오티드 치환을 지칭한다. "프레임쉬프트"는 돌연변이가 유전자의 코돈 주기성("리딩 프레임"으로도 공지됨)의 정상 단계를 방해하여 비-천연 단백질 서열의 번역을 초래할 때 발생한다. 유전자의 상이한 돌연변이가 동일한 변경된 리딩 프레임을 달성하는 것이 가능하다. "neoORF"는 미스센스 돌연변이, 융합 전사체, 프레임쉬프트 및/또는 정지 코돈 상실과 같은 게놈의 다양한 돌연변이 이벤트를 통해 오픈 리딩 프레임(ORF)이 변경될 때 생성될 수 있다. neoORF는 정상 게놈에 존재하지 않는 새로운 아미노산 서열을 코딩할 수 있다.
"보존적 아미노산 치환"은 하나의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 염기성 측쇄(예컨대, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄(예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함하여 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열이 당업계에서 정의되었다. 예컨대, 티로신에 대한 페닐알라닌의 치환은 보존적 치환이다. 펩티드 기능을 제거하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산의 보존적 치환을 확인하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
"천연" 또는 "야생형" 서열은 자연에서 발견되는 서열을 지칭한다. 이러한 서열은 본질적으로 더 긴 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "친화도"는 결합 쌍의 2개의 구성원, 예컨대 HLA 결합 펩티드 및 클래스 I 또는 II HLA 사이의 결합 세기의 척도를 지칭한다. KD는 해리 상수이며, 몰농도 단위를 갖는다. 친화도 상수는 해리 상수의 역수이다. 친화도 상수는 때때로 이 화학 물질을 설명하는 일반적인 용어로 사용된다. 이는 결합 에너지의 직접적인 척도이다. 친화도는 실험적으로, 예컨대 시판되는 Biacore SPR 유닛을 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 결정될 수 있다. 친화도는 또한 펩티드의 50%가 대체되는 억제 농도 50(IC50)으로 표현될 수 있다. 유사하게, ln(IC50)은 IC50의 자연 로그를 지칭한다. Koff는, 예컨대 HLA 결합 펩티드 및 클래스 I 또는 II HLA의 해리를 위한 오프-속도 상수를 나타낸다. 본 개시내용의 전반에 걸쳐, "결합 데이터" 또는 "결합 분석" 결과는 "IC50"으로 표현될 수 있다. IC50은 표지된 참조 펩티드의 50% 결합 억제가 관찰되는 결합 검정에서 시험된 펩티드의 농도이다. 검정이 실행되는 조건(즉, HLA 단백질 및 표지된 참조 펩티드 농도 제한)이 주어지면, 이러한 값은 KD 값에 가깝다. 결합을 결정하기 위한 검정은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예컨대 PCT 공개문 WO 94/20127 및 WO 94/03205, 및 문헌(Sidney et al., Current Protocols in Immunology 18.3.1 (1998); Sidney, et al., J. Immunol. 154:247 (1995); 및 Sette, et al., Mol. Immunol. 31:813 (1994))과 같은 다른 공개문에 상세히 설명되어 있다. 대안적으로, 결합은 참조 표준 펩티드에 의한 결합과 비교하여 표현될 수 있다. 예컨대, 참조 표준 펩티드의 IC50과 비교하여 이의 IC50을 기반으로 할 수 있다. 결합은 또한 살아 있는 세포(예컨대, Ceppellini et al., Nature 339:392 (1989); Christnick et al., Nature 352:67 (1991); Busch et al., Int. Immunol. 2:443 (1990); Hill et al., J. Immunol. 147:189 (1991); del Guercio et al., J. Immunol. 154:685 (1995)), 세제 용해물을 사용하는 무세포 시스템(예컨대, Cerundolo et al., J. Immunol. 21:2069 (1991)), 고정화된 정제된 MHC(예컨대, Hill et al., J. Immunol. 152, 2890 (1994); Marshall et al., J. Immunol. 152:4946 (1994)), ELISA 시스템(예컨대, Reay et al., EMBO J. 11:2829 (1992)), 표면 플라스몬 공명(예컨대, Khilko et al., J. Biol. Chem. 268:15425 (1993)); 고플럭스 용해성 상 검정(Hammer et al., J. Exp. Med. 180:2353 (1994)), 및 클래스 I MHC 안정화 또는 어셈블리의 측정(예컨대, Ljunggren et al., Nature 346:476 (1990); Schumacher et al., Cell 62:563 (1990); Townsend et al., Cell 62:285 (1990); Parker et al., J. Immunol. 149:1896 (1992))을 사용하는 것을 포함하여 다른 검정 시스템을 사용하여 결정될 수 있다. "교차 반응성 결합"은 펩티드가 하나 초과의 HLA 분자에 의해 결합된다는 것을 나타내며; 동의어는 축퇴 결합이다.
본원에 사용된 용어 "자연적으로 발생하는" 및 이의 문법적 등가물은 물체가 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예컨대, 유기체(바이러스 포함)에 존재하고 자연에서 공급원으로부터 단리될 수 있고 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 펩티드 또는 핵산은 자연적으로 발생한다.
"항원 프로세싱" 또는 "프로세싱" 및 이의 문법적 등가물은 폴리펩티드 또는 항원이 상기 폴리펩티드 또는 항원의 단편인 진행 생성물로 분해되고(예컨대, 폴리펩티드의 펩티드로의 분해) 이들 단편 중 하나 이상이 특정 T 세포에 대해 세포, 예컨대 항원 제시 세포에 의한 제시를 위해(예컨대, 결합을 통해) MHC 분자와 회합하는 것을 지칭한다.
용어 "대상체"는 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 설치류 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 동물(예컨대, 포유동물)을 지칭하며, 특정 치료의 수혜자이다. 전형적으로, 용어 "대상체" 및 "환자"는 인간 대상체와 관련하여 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
"세포" 및 이의 문법적 등가물은 인간 또는 비-인간 동물 기원의 세포를 지칭한다.
"T 세포"는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함한다. 용어 T 세포는 또한 T 헬퍼 1형 T 세포 및 T 헬퍼 2형 T 세포를 모두 포함한다.
본 개시내용에 따라, 용어 "백신"은 투여 시 병원체 또는 암세포와 같은 병든 세포를 인식하는 면역 반응, 예컨대 세포 또는 체액성 면역 반응을 유도하는 약제학적 제제(약제학적 조성물) 또는 생성물에 관한 것이다. 백신은 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 용어 "개별화된 암 백신" 또는 "맞춤형 암 백신"은 특정 암 환자에 관한 것으로 암 백신이 개별 암 환자의 필요 또는 특수한 상황에 맞게 조정되는 것을 의미한다.
용어 "유효량" 또는 "치료학적 유효량" 또는 "치료 효과"는 대상체 또는 포유동물의 질환 또는 장애를 "치료"하는 데 효과적인 치료제의 양을 지칭한다. 약물의 치료학적 유효량은 치료 효과를 가지며, 그 자체로 질환 또는 장애의 발병 예방; 질환 또는 장애의 발병 지연; 질환 또는 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 어느 정도의 완화; 이환율 및 사망률 감소; 삶의 질 향상; 또는 이러한 효과의 조합을 가질 수 있다.
용어 "치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하기 위해" 또는 "경감시키는" 또는 "경감시키기 위해"는 (1) 진단된 병리학적 병태 또는 장애의 증상을 치료, 둔화, 완화 및/또는 진행을 중단시키는 치료적 조치; 및 (2) 표적화된 병리학적 상태 또는 장애의 발병을 예방 또는 지연시키는 예방적 또는 방지적 조치 둘 다를 지칭한다. 따라서, 치료가 필요한 대상체는 이미 장애를 갖는 대상체; 장애를 가질 경향이 있는 대상체; 장애를 예방해야 하는 대상체를 포함한다.
"약제학적으로 허용되는"은 일반적으로 무독성, 불활성 및/또는 생리학적으로 적합한 조성물 또는 조성물의 성분을 지칭한다.
"약제학적 부형제" 또는 "부형제"는 애주번트, 담체, pH 조절제 및 완충제, 장성 조절제, 습윤제, 보존제 등과 같은 물질을 포함한다. "약제학적 부형제"는 약제학적으로 허용되는 부형제이다.
본원에 사용된 "면역조절제" 또는 이의 문법적 등가물은 면역계를 자극하거나 억제할 수 있고 개체의 신체가 질환, 예컨대 감염, 암 등과 싸우도록 도울 수 있는 물질을 지칭할 수 있다. 면역계의 특정 부분에 영향을 미치는 특정 면역조절제는 모노클로날 항체, 시토카인 및 백신을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 비특이적 면역조절제는 일반적인 방식으로 면역계에 영향을 미치고 비제한적인 예는 칼메트-게랑 간균(Bacillus Calmette-Guerin: BCG) 및 레바미졸을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "암" 및 이의 문법적 등가물은 세포의 과증식을 지칭할 수 있으며 이의 고유한 특성 - 정상적 제어의 상실 -으로 인해 조절되지 않은 성장, 분화 결여, 국소 조직 침윤 및 전이를 초래한다. 본 발명의 조성물 및 방법과 관련하여, 암은 급성 림프구성 암, 급성 골수성 백혈병, 폐포 횡문근육종, 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 항문암, 항문관암, 직장암, 눈의 암, 간내 담관의 암, 관절의 암, 목암, 담낭암, 흉막암,비암, 비강암, 중이암, 구강암, 음문암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수암, 결장암, 식도암, 자궁경부암, 섬유육종, 위장관 카르시노이드 종양, 호지킨 림프종, 하인두암, 신장암, 후두암, 백혈병, 액상 종양, 간암, 폐암, 림프종, 악성 중피종, 비만세포종, 흑색종, 다발성 골수종, 비인두암, 비-호지킨 림프종, 난소암, 췌장암, 복막암, 장막암, 장간막암, 인두암, 전립선암, 직장암, 콩팥암, 피부암, 소장암, 연조직암, 고형 종양, 위암, 고환암, 갑상선암, 요광암, 및/또는 비뇨기 방광암을 포함하는 임의의 암일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "종양"은, 예컨대 악성 유형 또는 양성 유형의 세포 또는 조직의 비정상적 성장을 지칭한다.
용어 "엑솜"은 기능적 단백질을 코딩하는 게놈의 부분, 또는 게놈 내 단백질 코딩 유전자의 모든 엑손 또는 코딩 영역을 포괄하는 서열을 지칭한다. 이는 종에 따라 전체 게놈의 약 1-2%이다.
"희석제"는 멸균 액체, 예컨대 물 및 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 오일을 포함한 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등을 포함한다. 물도 약제학적 조성물의 희석제이다. 식염수 용액, 수성 덱스트스 및 글리세롤 수용액도, 예컨대 주사용 용액에서 희석제로 사용될 수 있다.
"수용체"는 리간드에 결합할 수 있는 생물학적 분자 또는 분자 그룹을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 수용체는 세포, 세포 형성 또는 유기체에서 정보를 전달하는 역할을 할 수 있다. 수용체는, 예컨대 각각의 수용체 단위가 단백질 분자로 구성될 수 있는 적어도 하나의 수용체 단위를 포함한다. 수용체는 리간드의 구조를 보완하는 구조를 가지며 리간드를 결합 파트너로 복합시킬 수 있다. 정보는 특히 세포 표면 상의 리간드의 복합체화에 따른 수용체의 입체구조적 변화에 의해 전달된다. 일부 실시양태에서, 수용체는 특히 리간드, 특히 적합한 길이의 펩티드 또는 펩티드 단편과 수용체/리간드 복합체를 형성할 수 있는 MHC 클래스 I 및 II의 단백질을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
"리간드"는 수용체의 구조에 상보적인 구조를 갖고 이 수용체와 복합체를 형성할 수 있는 분자를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 실시양태에서, 리간드는 펩티드 또는 펩티드 단편이 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II의 단백질과 복합체를 형성할 수 있도록 이의 아미노산 서열에 적절한 길이 및 적절한 결합 모티프를 갖는 펩티드 또는 펩티드 단편을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
일부 실시양태에서, "수용체/리간드 복합체"는 또한 펩티드- 또는 펩티드 단편-제시 클래스 I 또는 클래스 II의 MHC 분자를 포함하는 "수용체/펩티드 복합체" 또는 "수용체/펩티드 단편 복합체"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "모티프"는 정의된 길이의 아미노산 서열에서 잔기의 패턴, 예컨대 특정 HLA 분자에 의해 인식되는 클래스 I HLA 모티프의 경우, 약 15개 미만의 아미노산 잔기 길이 또는 약 13개 미만의 아미노산 잔기 길이, 예컨대 약 8 내지 약 13개의 아미노산 잔기(예컨대, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13) 및 클래스 II HLA 모티프의 경우, 약 6 내지 약 25개의 아미노산 잔기(예컨대, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25)를 지칭한다. 모티프는 전형적으로 주어진 인간 HLA 대립유전자에 의해 코딩된 각각의 HLA 단백질에 대해 상이하다. 이러한 모티프는 1차 및 2차 앵커 잔기의 패턴이 상이하다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 모티프는 9, 10, 또는 11개 아미노산 잔기 길이의 펩티드를 확인한다.
2개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열과 관련하여 본원에 사용된 용어 "동일한" 및 이의 문법적 등가물 또는 "서열 동일성"은 지정된 비교창에 걸쳐 최대 대응으로 정렬될 때 동일한 2개 서열의 잔기를 지칭한다. 본원에 사용된 "비교 창"은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 수의 인접 위치의 참조 서열과 비교될 수 있는 적어도 약 20개 인접 위치, 일반적으로 약 50 내지 200, 보다 일반적으로 약 100 내지 약 150개의 인접 위치의 세그먼트를 지칭한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 최적의 서열 정렬은 문헌(Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981))의 국소 상동성 알고리즘; 문헌(Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970))의 정렬 알고리즘; 문헌(Pearson and Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444 (1988))의 유사성 검색 방법; 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 구현(하기를 포함하고 이에 제한되지 않음: CLUSTAL(PC/Gene program, Intelligentics, Mountain View Calif.), GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 TFASTA(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis., U.S.A.))에 의해 수행될 수 있고; CLUSTAL 프로그램은 문헌(Higgins and Sharp, Gene, 73:237-244 (1988) and Higgins and Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989); Corpet et al., Nucleic Acids Res., 16:10881-10890 (1988); Huang et al., Computer Applications in the Biosciences, 8:155-165 (1992); 및 Pearson et al., Methods in Molecular Biology, 24:307-331 (1994))에 잘 기술되어 있다. 정렬은 또한 종종 검사 및 수동 정렬에 의해 수행된다. 한 부류의 실시양태에서, 본원의 폴리펩티드는, 예컨대 디폴트 파라미터를 사용하여 BLASTP (또는 CLUSTAL, 또는 임의의 다른 이용 가능한 정렬 소프트웨어)에 의해 측정 시, 참조 폴리펩티드, 또는 이의 단편에 대해 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 유사하게, 핵산은 또한 출발 핵산을 참조하여 기술될 수 있으며, 예컨대 핵산은, 예컨대 디폴트 파라미터를 사용하여 BLASTP (또는 CLUSTAL, 또는 임의의 다른 이용 가능한 정렬 소프트웨어)에 의해 측정 시, 참조 핵산, 또는 이의 단편에 대해 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있다. 하나의 분자가 더 큰 분자와 특정한 백분율의 서열 동일성을 갖는다고 말할 때, 이는, 2개의 분자가 최적으로 정렬될 때, 더 작은 분자에서의 상기 잔기 백분율이 2개의 분자가 최적으로 정렬되는 순서에 따라 더 큰 분자에서 일치하는 잔기를 찾는 것을 의미한다.
핵산 또는 아미노산 서열에 적용되는 용어 "실질적으로 동일한" 및 이의 문법적 등가물은 핵산 또는 아미노산 서열이 표준 파라미터를 사용하여 상기 기재된 프로그램, 예컨대 BLAST를 사용하여 참조 서열과 비교 시 적어도 90% 서열 동일성 또는 더욱 많게는 적어도 95%, 적어도 98%, 및 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것을 의미한다. 예컨대, (뉴클레오티드 서열의 경우) BLASTN 프로그램은 디폴트로서 단어 길이(W) 11, 기대값(E) 10, M=5, N=-4 및 두 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 단어 길이(W) 3, 기대값(E) 10, BLOSUM62 스코어링 매트릭스를 사용한다(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)). 서열 동일성의 백분율은 비교 창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되며, 비교 창에서 폴리뉴클레오티드 서열의 부분은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 (부가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열과 비교하여 부가 또는 결실(즉 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 일치된 위치의 수를 산출하기 위해 두 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하고, 일치된 위치의 수를 비교 창의 총 위치 수로 나누고, 서열 동일성의 백분율을 산출하기 위해 결과에 100을 곱하여 계산된다. 실시양태에서, 실질적 동일성은 적어도 약 100개 잔기의 영역에 걸쳐 적어도 약 50개 잔기 길이인 서열의 영역에 존재하고, 실시양태에서, 서열은 적어도 약 150개 잔기에 걸쳐 실질적으로 동일하다. 실시양태에서, 서열은 코딩 영역의 전체 길이에 걸쳐 실질적으로 동일하다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 하나 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달 및 일반적으로 발현할 수 있는 구축물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 리포좀에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"단리된" 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 자연에서 발견되지 않는 형태의 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물이다. 단리된 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 더 이상 자연에서 발견되는 형태가 아닌 정도로 정제된 것들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 실질적으로 순수하다. 일부 실시양태에서, "단리된 폴리뉴클레오티드"는 PCR 또는 정량적 PCR 반응에서 증폭된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 PCR 또는 정량적 PCR 반응물을 포함한다.
용어 "단리된", "생물학적으로 순수한" 또는 이들의 문법적 등가물은 천연 상태에서 발견되는 물질에 일반적으로 수반되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 지칭한다. 따라서, 본원에 기재된 단리된 펩티드는 원 위치의 환경에서 펩티드와 일반적으로 회합된 물질의 일부 또는 전부를 함유하지 않는다. "단리된" 에피토프는 에피토프가 유래된 항원의 전체 서열을 포함하지 않는 에피토프를 지칭한다. 전형적으로 "단리된" 에피토프는 천연 서열의 전체 길이에 걸쳐 100% 동일성을 갖는 서열을 생성하는 추가 아미노산 잔기가 이에 부착되지 않는다. 천연 서열은 에피토프가 유래된 종양 관련된 항원과 같은 서열일 수 있다. 따라서, 용어 "단리된"은 물질이 원래 환경(예컨대, 자연적으로 발생하는 경우 천연 환경)으로부터 이동되었다는 것을 의미한다. "단리된" 핵산은 천연 환경으로부터 이동된 핵산이다. 예컨대, 살아있는 동물에 존재하는 자연 발생 폴리뉴클레오티드 또는 펩티드는 단리되지 않으나, 자연계에 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 펩티드는 단리된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부일 수 있고/있거나 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 펩티드는 조성물의 일부일 수 있으며, 이러한 벡터 또는 조성물이 천연 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 "단리"될 수 있다. 단리된 RNA 분자는 본원에 기재된 DNA 분자의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체를 포함하고, 합성적으로 생성된 이러한 분자를 추가로 포함한다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 순수한"은 적어도 50% 순수한(즉, 오염물이 없음), 적어도 90% 순수한, 적어도 95% 순수한, 적어도 98% 순수한, 또는 적어도 99% 순수한 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 "형질감염", "형질전환" 또는 "형질도입"은 물리적 또는 화학적 방법을 이용하여 숙주 세포에 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 지칭한다. 많은 형질감염 기술이 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 인산칼슘 DNA 공동 침전(예컨대, 문헌(Murray E. J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991)) 참조); DEAE-덱스트란; 전기천공; 양이온성 리포좀 매개된 형질감염; 텅스텐 입자 촉진된 마이크로입자 충격(Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); 및 인산스트론튬 DNA 공동 침전(Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987))을 포함한다. 파지 또는 바이러스 벡터는 많은 것이 시판되는 적절한 패키징 세포에서 감염성 입자의 성장 후 숙주 세포에 도입될 수 있다.
2.
향상된 절단 및 이의 용도
치료 및 종양 특이적 면역요법을 개발하는 데 있어 중요한 장애물 중 하나는 적절한 면역 반응을 생성하기 위한 항원 제시를 위한 최소 에피토프의 불충분한 프로세싱 및 방출이다. 항원 프로세싱 및 제시는 단백질의 단편화 또는 단백질분해, 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자와 단백질 단편 또는 펩티드의 회합, 및 T 세포 상의 T 세포 수용체(TCR)에 의한 인식을 위해 세포 표면 상에 펩티드-MHC(pMHC) 분자의 발현을 초래하는 세포 내에서 발생하는 과정을 지칭한다. 항원 제시는 항원 제시 세포(APC) 및 다른 특정 세포의 표면에서 발견되는 MHC 클래스 I 분자 및 MHC 클래스 II 분자에 의해 매개된다. MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자는 짧은 펩티드를 세포 표면에 전달하여 이러한 펩티드가 각각 세포독성(CD8+) 및 헬퍼(CD4+) T 세포에 의해 인식되도록 한다. TCR은 세포 표면 상의 MHC 분자에 결합된 펩티드 형태의 항원만을 인식할 수 있으며, T 세포에 의해 인식되는 항원은 마크로분자 구조의 붕괴, 개별 단백질의 풀림 및 항원 프로세싱을 통한 짧은 단편으로의 절단으로 인해 발생하는 펩티드이다.
세포 표면 상의 항원 제시는 프로테아좀, 시토졸 및 세포질세망(ER) 아미노펩티다제, 항원 프로세싱(TAP) 수송과 관련된 효율적인 수송체, 및 MHC 클래스 I 분자에 대한 충분한 결합에 의해 최소 에피토프를 방출하기 위한 펩티드의 정확한 프로세싱을 필요로 한다. 에피토프 생성의 효율은 에피토프 자체 뿐만 아니라 이 플랭킹 영역 또는 에피토프의 아미노산 서열의 측면에 배치된 아미노산 서열에 의존한다. 에피토프 서열 및 에피토프 서열의 측면에 배치된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드로부터 최소 에피토프를 프로세싱하는 효율은 완전히 이해되지는 않았지만 펩티드의 절단 부위 양쪽에 있는 특정 아미노산 잔기 및 인근의 다른 경쟁 절단 부위를 포함한 여러 요인에 의해 영향을 받는 것으로 공지되어 있다.
최소 에피토프 문제의 불충분한 프로세싱 및 방출을 해결하는 한 가지 방법은 에피토프 서열의 N- 및/또는 C-말단에 추가될 수 있는 특정 아미노산 잔기 또는 서열을 연구하고 설계하여 펩티드의 절단 및 프로세싱 및 에피토프의 제시를 향상시키는 것이다. 예컨대, 효율적으로 프로세싱되는 것으로 공지된 다른 에피토프로부터의 아미노산 잔기 또는 서열을 에피토프 서열에 추가할 수 있다. 또 다른 예는 에피토프 주변에서 일반적으로 관찰되는 것으로 공지된 아미노산 잔기를 사용하는 것이다(Abelin, et al., 2017, Immunity 46, 315-326). 이 접근 방식은 펩티드의 제조(예컨대, 합성, 정제 및/또는 제형화) 또는 더 쉬운 다운스트림 변형(예컨대, 다른 분자에 대한 접합)을 용이하게 하는 것을 포함하여 추가 이점을 제공할 수 있다.
최소 에피토프의 효율적인 프로세싱 및 방출에 대한 현재의 장애물을 해결하는 또 다른 방법은 에피토프의 방출을 위한 부위 특이적 프로테아제 프로세싱을 위한 에피토프 함유 펩티드를 표적화하기 위해 프로테아제-절단 가능한 링커를 사용하는 것이다. 예컨대, 최소 에피토프 서열을 방출하기 위해 수지상 세포(DC) 내부에서 쉽게 절단될 수 있는 특정 링커를 사용하여 백신접종 후 CD8 의존적 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 또한 이러한 펩티드는 비-전문 APC의 표면 상의 MHC 클래스 I 분자에 대해 비-선택적 결합을 갖지 않으며, 대신 특정(예컨대, 세포내이입) 경로를 통해 적절하게 프로세싱되고 T 세포에 제시된다. 충분한 에피토프 프로세싱 및 제시를 촉진하는 또 다른 예는 2가지 전략, 즉 특정 아미노산 잔기와 특정 링커를 조합하는 것이다.
대상체의 게놈에 의해 코딩되는 에피토프 서열, 대상체의 게놈 내 에피토프 서열을 코딩하는 핵산 서열의 바로 상류 또는 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있거나 코딩되지 않을 수 있는 아미노산 또는 아미노산 서열, 아미노산 또는 아미노산 서열, 및/또는 링커를 포함하는 폴리펩티드가 본원에 제공된다. 에피토프 서열에 대한 아미노산, 아미노산 서열, 및/또는 링커의 추가는 면역 반응의 생성을 위한 APC에 의한 에피토프 프로세싱 및 제시를 향상시킬 수 있다. 한 측면에서, 아미노산 또는 아미노산 서열은 아미노산 서열 또는 펩티드 서열의 것이다. 한 실시양태에서, 아미노산 서열 또는 펩티드 서열은 에피토프 서열을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류 또는 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 아미노산 또는 아미노산 서열은 에피토프 서열과 인접하고 에피토프 서열을 코딩하는 대상체의 게놈에 의해 코딩된다. 예컨대, 에피토프 서열과 인접한 아미노산 또는 아미노산 서열은 폴리펩티드(예컨대, 리신)의 절단을 향상시키는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 폴리펩티드는 에피토프 서열과 인접한 아미노산 또는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 대상체의 게놈 내 에피토프 서열을 코딩하는 핵산 서열의 바로 상류 또는 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 에피토프는 APC의 클래스 I MHC에 의해 제시된다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 APC의 클래스 II MHC에 의해 제시된다. 일부 실시양태에서, 에피토프의 각각의 아미노산은 대상체의 게놈 내 핵산 서열에 의해 코딩되는 임의의 인접 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 서열의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 8 내지 12개의 인접 아미노산 잔기를 포함하고 APC의 클래스 I MHC에 의해 제시된다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 인접 아미노 잔기를 포함하고, APC의 클래스 I MHC에 의해 제시된다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 9 내지 25개의 인접 아미노산 잔기를 포함하고, APC의 클래스 II MHC에 의해 제시된다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 인접 아미노산 잔기를 포함하고, APC의 클래스 II MHC에 의해 제시된다. 일부 실시양태에서, 에피토프 서열은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 인접 아미노산 잔기를 포함하고, 13번째 내지 25번째 아미노산 중 하나 이상은 임의적으로 존재하고, 적어도 하나의 아미노산은 돌연변이 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 에피토프 서열은 AA1AA2AA3AA4AA5AA6AA7AA8AA9AA10AA11AA12AA13AA14AA15AA16AA17AA18AA19AA20AA21AA22AA23AA24AA25를 포함하고, 각각의 AA는 아미노산이고, AA9, AA10, AA11, AA12, AA13, AA14, AA15, AA16, AA17, AA18, AA19, AA20, AA21, AA22, AA23, AA24, 및 AA25 중 하나 이상은 임의적으로 존재하고, 적어도 하나의 AA는 돌연변이 아미노산이다.
일부 실시양태에서, 에피토프 서열 및 에피토프 서열과 인접하고 대상체의 게놈 내 에피토프를 코딩하는 핵산 서열의 바로 상류 또는 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 또는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 링커를 포함하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 에피토프 서열 및 에피토프 서열과 인접하고 대상체의 게놈 내 에피토프를 코딩하는 핵산 서열의 바로 상류 또는 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 또는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 링커를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 에피토프 서열 및 에피토프 서열을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류 또는 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 추가로 링커를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 에피토프 서열 및 에피토프 서열을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류 또는 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 링커를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 아미노산 또는 아미노산 서열은 0 내지 1000개의 아미노산 잔기 길이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 또는 아미노산 서열은 0 내지 1000개의 아미노산 잔기 길이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 또는 아미노산 서열은 0 내지 1000개의 아미노산 잔기 길이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 또는 아미노산 서열은 0개 초과, 1개 초과, 2개 초과, 3개 초과, 4개 초과, 5개 초과, 6개 초과, 7개 초과, 8개 초과, 9개 초과, 10개 초과, 15개 초과, 20개 초과, 25개 초과, 30개 초과, 35개 초과, 40개 초과, 45개 초과, 50개 초과, 55개 초과, 60개 초과, 65개 초과, 70개 초과, 75개 초과, 80개 초과, 85개 초과, 90개 초과, 95개 초과, 100개 초과, 150개 초과, 200개 초과, 250개 초과, 300개 초과, 350개 초과, 400개 초과, 450개 초과, 500개 초과, 550개 초과, 600개 초과, 650개 초과, 700개 초과, 750개 초과, 800개 초과, 850개 초과, 900개 초과, 또는 950개 초과의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류의 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 또는 아미노산 서열은 0개 초과, 1개 초과, 2개 초과, 3개 초과, 4개 초과, 5개 초과, 6개 초과, 7개 초과, 8개 초과, 9개 초과, 10개 초과, 15개 초과, 20개 초과, 25개 초과, 30개 초과, 35개 초과, 40개 초과, 45개 초과, 50개 초과, 55개 초과, 60개 초과, 65개 초과, 70개 초과, 75개 초과, 80개 초과, 85개 초과, 90개 초과, 95개 초과, 100개 초과, 150개 초과, 200개 초과, 250개 초과, 300개 초과, 350개 초과, 400개 초과, 450개 초과, 500개 초과, 550개 초과, 600개 초과, 650개 초과, 700개 초과, 750개 초과, 800개 초과, 850개 초과, 900개 초과, 또는 950개 초과의 아미노산 잔기 길이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류의 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 또는 아미노산 서열은 0개 초과, 1개 초과, 2개 초과, 3개 초과, 4개 초과, 5개 초과, 6개 초과, 7개 초과, 8개 초과, 9개 초과, 10개 초과, 15개 초과, 20개 초과, 25개 초과, 30개 초과, 35개 초과, 40개 초과, 45개 초과, 50개 초과, 55개 초과, 60개 초과, 65개 초과, 70개 초과, 75개 초과, 80개 초과, 85개 초과, 90개 초과, 95개 초과, 100개 초과, 150개 초과, 200개 초과, 250개 초과, 300개 초과, 350개 초과, 400개 초과, 450개 초과, 500개 초과, 550개 초과, 600개 초과, 650개 초과, 700개 초과, 750개 초과, 800개 초과, 850개 초과, 900 초과, 또는 950개 초과의 아미노산 잔기 길이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아미노산 또는 아미노산 서열은 1-5 또는 7-1000개의 아미노산 잔기 길이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 또는 아미노산 서열은 6개의 아미노산 잔기 길이를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 펩티드 서열의 아미노산 또는 아미노산 서열은 1-5 또는 7-1000개의 아미노산 잔기 길이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 펩티드 서열의 아미노산 또는 아미노산 서열은 6개의 아미노산 잔기 길이를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 펩티드 서열의 아미노산 또는 아미노산 서열은 1-4 또는 6-1000개의 아미노산 잔기 길이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 펩티드 서열의 아미노산 또는 아미노산 서열은 5개의 아미노산 잔기 길이를 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 링커를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 클래스 I MHC에 의해 제시되는 4개의 상이한 에피토프로 이루어지지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 클래스 I MHC에 의해 제시되는 4개의 상이한 에피토프를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 클래스 I MHC에 의해 제시되는 적어도 2개의 상이한 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 클래스 I MHC에 의해 제시되는 적어도 3개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개의 상이한 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 하나 이상의 돌연변이 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 돌연변이 아미노산은 대상체의 게놈 내 핵산 서열에서 삽입, 결실, 프레임쉬프트, neoORF, 또는 포인트 돌연변이에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류 또는 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않는 펩티드 서열의 아미노산 또는 아미노산 서열은 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 2개의 상이한 폴리펩티드 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개의 상이한 폴리펩티드 분자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류 또는 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않는 펩티드 서열의 아미노산 또는 아미노산 서열, 및/또는 링커를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 아미노산 또는 아미노산 서열 및/또는 링커는 증가된 용해도, 안정성, 면역원성, 항원 프로세싱 또는 항원 제시와 같은 원하는 특성을 갖는 폴리펩티드를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는, 예컨대 면역 반응의 생성을 위해 APC에 의한 에피토프의 프로세싱 및 제시를 향상시키는 아미노산 또는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 에피토프 서열의 N- 및/또는 C-말단에 아미노산 또는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 또는 아미노산 서열은 폴리-리신(poly-Lys 또는 polyK) 또는 폴리-아르기닌 (poly-Arg 또는 polyR)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 또는 아미노산 서열은 에피토프를 발현하는 대상체에서 발현되지 않는(예컨대, 에피토프 서열을 코딩하는 대상체의 게놈에 의해 코딩되지 않는) 단백질의 폴리펩티드 서열일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 폴리펩티드는 프로테아제에 의해 절단 가능한 링커를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 프로테아제-절단성 링커 및 아미노산 또는 아미노산 서열 둘 다를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I), (II), (III), 및/또는 (IV)의 폴리펩티드, 또는 화학식 (I), (II), (III), 및/또는 (IV)의 폴리펩티드의 약제학적으로 허용되는 염이 본원에 제공되며, 여기서 입체화학은 정의되지 않고, 예컨대 라세미체 또는 부분입체이성질체의 혼합물 또는 개별 부분입체이성질체이다. 당업자는 화학식 (I), (II), (III), 및/또는 (IV)의 화합물의 제조의 임의의 단계에서, 임의의 화학식 (I), (II), (III)에 상응하는 화합물의 이성질체의 혼합물(예컨대, 라세미체)이 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 제조의 모든 단계에서, 단일 입체이성질체는, 예컨대 키랄 크로마토그래피 분리를 이용하여 이성질체의 혼합물(예컨대, 라세미체)로부터 단리함으로써 수득될 수 있다.
일부 실시양태에서, 링커는 비-폴리펩티드 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 화학적 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 비-천연 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 β-γ-α 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 L-α-아미노산의 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 링커는 천연 아미노산을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 링커는 펩티드 결합 이외의 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 디설파이드 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 하나 초과의 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 제1 링커 및 제2 링커를 포함하며, 제1 링커는 에피토프의 N-말단에 있고 제2 링커는 에피토프의 C-말단에 있다. 일부 실시양태에서, 제1 링커 및 제2 링커는 상이하다. 일부 실시양태에서, 제1 링커 및 제2 링커는 동일하다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 친수성 테일을 포함한다. 일부 실시양태에서, 에피토프 서열, 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류 또는 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않는 펩티드 서열의 아미노산 또는 아미노산 서열 및/또는 링커을 포함하는 폴리펩티드는 아미노산 또는 아미노산 서열 및/또는 링커 없이 동일한 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 향상된 용해도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 에피토프 서열 및 대상체의 게놈 내 핵산 서열에 의해 코딩되는 에피토프 서열과 인접한 아미노산 또는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 아미노산 또는 아미노산 서열 없이 동일한 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 향상된 용해도를 갖는다. 예컨대, 에피토프 서열과 인접한 아미노산 또는 아미노산 서열은 폴리펩티드의 용해도를 향상시키는 하나 이상의 아미노산 잔기(예컨대, 리신)를 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 폴리펩티드는 에피토프 서열과 인접한 아미노산 또는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류 또는 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않는 펩티드 서열의 아미노산 또는 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 에피토프는 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드로부터 방출된다. 일부 실시양태에서, 에피토프는, 폴리펩티드가 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열 및/또는 링커를 추가로 포함하는 경우, 동일한 에피토프를 포함하지만, 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열 및/또는 링커를 포함하지 않는 폴리펩티드와 비교하여, 더 높은 속도로 방출된다. 일부 실시양태에서, 에피토프는, 폴리펩티드가 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열 및/또는 링커를 추가로 포함하는 경우, 동일한 에피토프를 포함하지만, 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열 및/또는 링커를 포함하지 않는 폴리펩티드와 비교하여, 더 높은 속도로 방출된다. 일부 실시양태에서, 에피토프는, 아미노산 또는 아미노산 서열이 대상체에서 발현되는 단백질의 펩티드 서열이 아닌 경우, 더 높은 속도로 방출된다. 일부 실시양태에서, 에피토프는, 폴리펩티드가 링커를 포함하는 경우, 동일한 에피토프를 포함하지만 링커를 포함하지 않는 폴리펩티드와 비교하여, 더 높은 속도로 방출된다. 일부 실시양태에서, 에피토프는, 폴리펩티드가 프로테아제에 의해 절단 가능한 링커를 포함하는 경우, 동일한 에피토프를 포함하지만 프로테아제에 의해 절단 가능한 링커를 포함하지 않는 폴리펩티드와 비교하여, 더 높은 속도로 방출된다.
일부 실시양태에서, 에피토프는, 에피토프 및 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류 또는 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 아미노산 또는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류 또는 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열 및/또는 링커를 추가로 포함하는 경우, 동일한 에피토프 및 에피토를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류 또는 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 아미노산 또는 아미노산 서열은 포함하지만, 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류 또는 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열 및/또는 링커를 포함하지 않는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여, 더 높은 속도로 방출된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는, 폴리펩티드가 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산 서열을 포함하지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열, 및/또는 링커를 포함하는 경우, 동일한 길이이고 에피토프 및 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 또는 아미노산 서열을 갖는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여, 더 높은 속도로 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는, 폴리펩티드가 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산 서열을 포함하지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열, 및/또는 링커를 포함하는 경우, 동일한 길이이고 에피토프 및 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 또는 아미노산 서열을 갖는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여, 더 높은 속도로 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는, 아미노산 또는 아미노산 서열이 대상체에서 발현되는 단백질의 펩티드 서열이 아닌 경우, 더 높은 속도로 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는, 폴리펩티드가 링커를 포함하는 경우, 동일한 에피토프를 포함하지만 링커를 포함하지 않는 폴리펩티드와 비교하여, 더 높은 속도로 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는, 폴리펩티드가 프로테아제에 의해 절단 가능한 링커를 포함하는 경우, 프로테아제에 의해 절단 가능한 링커를 포함하지 않는 동일한 에피토프를 포함하는 폴리펩티드와 비교하여, 더 높은 속도로 절단된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는, 폴리펩티드가 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산 서열을 포함하지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열을 포함하는 경우, 에피토프 서열 및 핵산 서열에 의해 코딩되는 에피토프 서열에 인접한 아미노산 또는 아미노산 서열은 포함하지만 링커는 포함하지 않는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 절단과 비교하여, 더 높은 속도로 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는, 폴리펩티드가 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산 서열을 포함하지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열을 포함하는 경우, 에피토프 서열 및 핵산 서열에 의해 코딩되는 에피토프 서열에 인접한 아미노산 또는 아미노산 서열은 포함하지만 링커는 포함하지 않는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 절단과 비교하여, 더 높은 속도로 절단된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는, 폴리펩티드가 (i) 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류 또는 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 또는 아미노산 서열, 및 (ii) 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류 또는 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열, 및/또는 (iii) 링커를 포함하는 경우, 동일한 길이이고 에피토프 및 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류 또는 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 또는 아미노산 서열을 갖는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여, 더 높은 속도로 절단된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때 링커 영역에서 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는, 폴리펩티드가 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산 서열을 포함하지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열, 및 링커를 추가로 포함하는 경우, 동일한 길이이고 에피토프 및 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 또는 아미노산 서열을 갖는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여, 더 높은 속도로 링커 영역에서 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는, 폴리펩티드가 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산 서열을 포함하지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열, 및 링커를 추가로 포함하는 경우, 동일한 길이이고 에피토프 및 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 또는 아미노산 서열을 갖는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여, 더 높은 속도로 링커 영역에서 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는, 아미노산 또는 아미노산 서열이 대상체에서 발현되는 단백질의 펩티드 서열이 아닌 경우, 더 높은 속도로 링커 영역에서 절단된다.
일부 실시양태에서, APC에 의한 에피토프 제시는 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때 향상된다. 일부 실시양태에서, APC에 의한 에피토프 제시는, 폴리펩티드가 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산 서열을 포함하지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열, 및/또는 링커를 포함하는 경우, 동일한 길이이고 에피토프 및 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 또는 아미노산 서열을 갖는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여, 향상된다. 일부 실시양태에서, APC에 의한 에피토프 제시는, 폴리펩티드가 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산 서열을 포함하지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열, 및/또는 링커를 포함하는 경우, 동일한 길이이고 에피토프 및 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 또는 아미노산 서열을 갖는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여, 향상된다. 일부 실시양태에서, APC에 의한 에피토프 제시는, 아미노산 또는 아미노산 서열이 대상체에서 발현되는 단백질의 펩티드 서열이 아닌 경우, 향상된다. 일부 실시양태에서, APC에 의한 에피토프 제시는, 폴리펩티드가 링커를 포함하는 경우, 동일한 에피토프를 포함하지만 링커를 포함하지 않는 폴리펩티드와 비교하여, 향상된다. 일부 실시양태에서, APC에 의한 에피토프 제시는, 폴리펩티드가 프로테아제에 의해 절단 가능한 링커를 포함하는 경우, 프로테아제에 의해 절단 가능한 링커를 포함하지 않는 동일한 에피토프를 포함하는 폴리펩티드와 비교하여, 향상된다.
일부 실시양태에서, APC에 의한 에피토프 제시는, 폴리펩티드가 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산 서열을 포함하지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 경우, 에피토프 서열 및 핵산 서열에 의해 코딩되는 에피토프 서열에 인접한 아미노산 또는 아미노산 서열은 포함하지만 링커는 포함하지 않는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 절단과 비교하여, 향상된다. 일부 실시양태에서, APC에 의한 에피토프 제시는, 폴리펩티드가 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산 서열을 포함하지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 경우, 에피토프 서열 및 핵산 서열에 의해 코딩되는 에피토프 서열에 인접한 아미노산 또는 아미노산 서열은 포함하지만 링커는 포함하지 않는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 절단과 비교하여, 향상된다.
일부 실시양태에서, APC에 의한 에피토프 제시는, 폴리펩티드가 (i) 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류 또는 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 또는 아미노산 서열, 및 (ii) 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류 또는 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열, 및/또는 (iii) 링커를 포함하는 경우, 동일한 길이이고 에피토프 및 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류 또는 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 또는 아미노산 서열을 갖는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여, 향상된다.
일부 실시양태에서, 면역원성은 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때 향상된다. 일부 실시양태에서, 면역원성은, 폴리펩티드가 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산 서열을 포함하지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열, 및/또는 링커를 추가로 포함하는 경우, 동일한 길이이고 에피토프 및 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 또는 아미노산 서열을 갖는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여, 향상된다. 일부 실시양태에서, 면역원성은, 폴리펩티드가 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산 서열을 포함하지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열, 및/또는 링커를 추가로 포함하는 경우, 동일한 길이이고 에피토프 및 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 또는 아미노산 서열을 갖는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여, 향상된다. 일부 실시양태에서, 면역원성은, 아미노산 또는 아미노산 서열이 대상체에서 발현되는 단백질의 펩티드 서열이 아닌 경우, 향상된다. 일부 실시양태에서, 면역원성은, 폴리펩티드가 링커를 포함하는 경우, 동일한 에피토프를 포함하지만 링커를 포함하지 않는 폴리펩티드와 비교하여, 향상된다. 일부 실시양태에서, 면역원성은, 폴리펩티드가 프로테아제에 의해 절단 가능한 링커를 포함하는 경우, 프로테아제에 의해 절단 가능한 링커를 포함하지 않는 동일한 에피토프를 포함하는 폴리펩티드와 비교하여, 향상된다.
일부 실시양태에서, 면역원성은, 폴리펩티드가 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산 서열을 포함하지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 경우, 에피토프 서열 및 핵산 서열에 의해 코딩되는 에피토프 서열에 인접한 아미노산 또는 아미노산 서열은 포함하지만 링커는 포함하지 않는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 절단과 비교하여, 향상된다. 일부 실시양태에서, 면역원성은, 폴리펩티드가 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산 서열을 포함하지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 경우, 에피토프 서열 및 핵산 서열에 의해 코딩되는 에피토프 서열에 인접한 아미노산 또는 아미노산 서열은 포함하지만 링커는 포함하지 않는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 절단과 비교하여, 향상된다.
일부 실시양태에서, 면역원성은, 폴리펩티드가 (i) 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류 또는 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 또는 아미노산 서열, 및 (ii) 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류 또는 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열, 및/또는 (iii) 링커를 포함하는 경우, 동일한 길이이고 에피토프 및 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류 또는 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 또는 아미노산 서열을 갖는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여, 향상된다.
일부 실시양태에서, 항-종양 활성은 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때 향상된다. 일부 실시양태에서, 항-종양 활성은, 폴리펩티드가 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산 서열을 포함하지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열, 및/또는 링커를 추가로 포함하는 경우, 동일한 길이이고 에피토프 및 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 또는 아미노산 서열을 갖는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여, 향상된다. 일부 실시양태에서, 항-종양 활성은, 폴리펩티드가 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산 서열을 포함하지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열, 및/또는 링커를 추가로 포함하는 경우, 동일한 길이이고 에피토프 및 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 또는 아미노산 서열을 갖는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여, 향상된다. 일부 실시양태에서, 항-종양 활성은, 아미노산 또는 아미노산 서열이 대상체에서 발현되는 단백질의 펩티드 서열이 아닌 경우, 향상된다. 일부 실시양태에서, 항-종양 활성은, 폴리펩티드가 링커를 포함하는 경우, 동일한 에피토프를 포함하지만 링커를 포함하지 않는 폴리펩티드와 비교하여, 향상된다. 일부 실시양태에서, 항-종양 활성은, 폴리펩티드가 프로테아제에 의해 절단 가능한 링커를 포함하는 경우, 프로테아제에 의해 절단 가능한 링커를 포함하지 않는 동일한 에피토프를 포함하는 폴리펩티드와 비교하여, 향상된다.
일부 실시양태에서, 항-종양 활성은, 폴리펩티드가 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산 서열을 포함하지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 경우, 에피토프 서열 및 핵산 서열에 의해 코딩되는 에피토프 서열에 인접한 아미노산 또는 아미노산 서열은 포함하지만 링커는 포함하지 않는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 절단과 비교하여, 향상된다. 일부 실시양태에서, 항-종양 활성은, 폴리펩티드가 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산 서열을 포함하지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 경우, 에피토프 서열 및 핵산 서열에 의해 코딩되는 에피토프 서열에 인접한 아미노산 또는 아미노산 서열은 포함하지만 링커는 포함하지 않는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 절단과 비교하여, 향상된다.
일부 실시양태에서, 항-종양 활성은, 폴리펩티드가 (i) 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류 또는 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 또는 아미노산 서열, 및 (ii) 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류 또는 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열, 및/또는 (iii) 링커를 포함하는 경우, 동일한 길이이고 에피토프 및 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류 또는 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 또는 아미노산 서열을 갖는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여, 향상된다.
일부 실시양태에서, APC는 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때 에피토프를 면역 세포에 제시한다. 일부 실시양태에서, APC는 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때 에피토프를 면역 세포에 우선적으로 또는 특이적으로 제시한다. 일부 실시양태에서, APC는 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때 에피토프를 포식 세포에 제시한다. 일부 실시양태에서, APC는 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때 에피토프를 포식 세포에 우선적으로 또는 특이적으로 제시한다. 일부 실시양태에서, APC는 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때 에피토프를 수지상 세포, 대식구, 비만 세포, 호중구, 또는 단핵구에 제시한다. 일부 실시양태에서, APC는 에피토프를 수지상 세포, 대식구, 비만 세포, 호중구 또는 단핵구에 우선적으로 또는 구체적으로 제시한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 poly-Lys(polyK) 및 poly-Arg(polyR)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK-AA-AA 및 polyR-AA-AA로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하고, 각각의 AA는 아미노산 또는 이의 유사체 또는 유도체이다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK-AA-AA를 포함한다. 일부 실시양태에서, polyK는 poly-L-Lys를 포함한다. 일부 실시양태에서, polyK는 적어도 2개의 인접 리신 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, polyK는 적어도 3개의 인접 리신 잔기, 예컨대 Lys-Lys-Lys를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, polyK는 적어도 4개의 인접 리신 잔기, 예컨대 K4로도 공지된 Lys-Lys-Lys-Lys를 포함한다. 일부 실시양태에서, polyK는 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개의 인접 리신 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, polyR은 poly-L-Arg를 포함한다. 일부 실시양태에서, polyR은 적어도 2개의 인접 아르기닌 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, polyR은 적어도 3개의 인접 아르기닌 잔기, 예컨대 Arg-Arg-Arg를 포함한다. 일부 실시양태에서, polyR은 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 또는 적어도 7개의 인접 아르기닌 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, polyR은 적어도 8개의 인접 아르기닌 잔기, 예컨대 R8로도 공지된 Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg를 포함한다. 일부 실시양태에서, polyR은 적어도 5, 적어도 6 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10개의 인접 아르기닌 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, polyK의 리신 단위 및/또는 polyR의 아르기닌 단위는 각각 (L) 입체화학적 배열, (D) 입체화학적 배열, 또는 (L) 및 (D) 입체화학적 배열의 임의의 혼합물을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 디설파이드, p-아미노벤질옥시카르보닐(PABC), 및 AA-AA-PABC로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커를 포함하며, AA는 아미노산 또는 이의 유사체 또는 유도체이다. 일부 실시양태에서, AA-AA-PABC는 알라닌-리신-PABC(Ala-Lys-PABC), 발린-시트룰린-PABC(Val-Cit-PABC), 및 페닐알라닌-리신-PABC(Phe-Lys-PABC)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, AA-AA-PABC는 Ala-Lys-PABC이다. 일부 실시양태에서, AA-AA-PABC는 Val-Cit-PABC이다. 일부 실시양태에서, AA-AA-PABC는 Phe-Lys-PABC이다. 일부 실시양태에서, Val-Cit-PABC의 발린 및 시트룰린 단위는 각각 (L) 입체화학적 배열을 갖는다. 일부 실시양태에서, Phe-Lys-PABC의 페닐알라닌 및 리신 단위는 각각 (L) 입체화학적 배열을 갖는다. 일부 실시양태에서, Val-Cit-PABC의 발린 및 시트룰린 단위는 각각 (D) 입체화학적 배열을 갖는다. 일부 실시양태에서, Phe-Lys-PABC의 페닐알라닌 및 리신 단위는 각각 (D) 입체화학적 배열을 갖는다. 일부 실시양태에서, Val-Cit-PABC의 발린 및 시트룰린 단위는 (L) 및 (D) 입체화학적 배열의 혼합물을 갖는다. 일부 실시양태에서, Phe-Lys-PABC의 페닐알라닌 및 리신 단위는 (L) 및 (D) 입체화학적 배열의 혼합물을 갖는다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 하기 화학식 (II)의 구조를 갖는 링커를 포함한다:
화학식 (II).
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 하기 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)인 링커를 포함한다:
화학식 (III)
화학식 (IV)
상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 (C1-C6) 알킬이고; j는 1 또는 2이고; G1은 H 또는 COOH이고; i는 1, 2, 3, 4, 또는 5이다.
일부 실시양태에서, Ar 및/또는 As는 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)이고, R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 (C1-C6) 알킬이고; j는 1 또는 2이고; G1은 H 또는 COOH이고; i는 1, 2, 3, 4, 또는 5이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)인 링커를 포함한다.
화학식 (IV)의 디설파이드 링커는 문헌(Zhang, Donglu, et al., ACS Med. Chem. Lett. 2016, 7, 988-993; 및 Pillow, Thomas H., et al., Chem. Sci., 2017, 8, 366-370)에 따라 합성될 수 있다. PABC 함유 펩티드는 문헌(Laurent Ducry (ed.), Antibody-Drug Conju gates, Methods in Molecular Biology, vol. 1045, DOI 10.1007/978-1-62703-541-5_5, Springer Science+Business Media, LLC 2013)에 따라 합성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 고체상 펩티드 합성을 위해 제조된 임의의 수지가 사용될 수 있다.
항원 프로세싱 경로
본원에 기재된 폴리펩티드는 에피토프 제시를 위한 에피토프를 방출하기 위해 상이한 경로에 의해 프로세싱될 수 있다. 최적의 펩티드 항원을 생성하기 위해 항원 프로세싱 및 제시 경로 내에 2가지 주요 프로세싱 이벤트가 존재한다. 시토졸 단백질은 주로 프로테아좀에 의해 프로세싱된다. 이어서, 짧은 펩티드는 MHC 클래스 I 분자와의 후속 조립을 위해 항원 프로세싱(TAP)와 관련된 수송체에 의해 세포질세망(ER)으로 수송된다. 외인성 단백질은 주로 MHC 클래스 II 분자에 의해 제시된다. 항원은 포식작용, 거대음세포작용 및 세포내이입을 포함한 여러 경로에 의해 내재화되고, 결국 성숙 또는 후기 엔도좀 구획으로 수송되어 여기서 프로세싱되고 MHC 클래스 II 분자에 로딩된다. 세포질/핵 항원은 또한 MHC 클래스 II 분자를 사용한 후속 프로세싱 및 제시를 위해 자가포식을 통해 엔도좀 네트워크로 수송될 수 있다.
초기 펩티드 단백질분해는 세포의 시토졸 내에서 일어나고 프로테아좀 또는 면역프로테아좀에 의해 더 큰 단백질 단편을 더 작은 펩티드로 분해한다. 이 프로세싱 이벤트는 종종 클래스 I MHC에 결합하는 펩티드의 최종 C-말단 잔기의 생성을 담당한다. 프로테아좀은 2개의 아단위인 큰 다기능성 프로테아제(LMP) 2 및 LMP7을 포함한 다수의 아단위를 함유하는 큰 단백질분해 복합체이다. 분해를 위해 결합된 단백질은 유비퀴틴과의 공유 결합에 의해 프로테아좀으로 표적화된다. LMP2 및 LMP7은 단백질분해 복합체를 유도하여 클래스 I MHC I에 결합하는 펩티드를 생성한다. 시토졸에서 생성된 펩티드는 TAP를 통해 ER로 수송된다. TAP는 11-14개 아미노산의 펩티드를 우선적으로 수송하기 때문에, 펩티드는 종종 안정한 클래스 I MHC 결합에 너무 길며 ER에 들어갈 때 추가 프로세싱이 필요하다. 이 프로세싱은 세포질세망 아미노펩티다제(ERAP) 1 및 ERAP2에 의한 항원성 펩티드의 N-말단 영역 트리밍을 포함한다. 이 과정은 클래스 I MHC 회합에 대해 높은 친화도를 갖는 펩티드 풀을 생성한다.
정상적인 세포 환경에서, 고전적인 클래스 II MHC 분자는 수지상 세포(DC) 또는 대식구와 같은 전문 APC에서만 발현된다. 포식작용, 세포내이입 또는 음세포작용에 의해 내재화된 외인성 또는 세포외 항원은 주로 클래스 II MHC에서 CD4+ T 세포로 제시된다. 그러나, 시토졸 항원의 작은 서브세트는 자가포식의 결과로 클래스 II MHC에서도 발현된다. 간단히 말해서, 세포내이입된 항원은 관행적으로 초기 엔도좀(pH 6.0 - pH 6.5), 후기 엔도좀 또는 엔도리소좀(pH 5.0 - pH 6.0), 및 리소좀(pH 4.5 - pH 5.0)으로 기술되는 점차적으로 더 산성화되고 단백질분해적으로 활성인 구획으로 이루어진 소포 경로에서 프로세싱된다. 포식작용에 의해 내재화된 항원은 파고좀 및 리소좀의 융합에 의해 형성된 파고리소좀에서 종결되는 유사한 경로를 따른다. 리소좀 및 파고리소좀(pH 4.0 - pH 4.5)은 일반적으로 카텝신으로 불리는 다수의 산성 pH-최적 프로테아제를 함유한다. 대식구와 같은 고도의 분해적 세포에서, 이러한 효소에 의한 연속적인 절단은 매우 짧은 펩티드 및 유리 아미노산을 생성하여 새로운 단백질 합성을 위한 tRNA를 보충하기 위해 시토졸로 전위된다. 단백질분해적으로 활성이 덜한 APC에서는, 더 큰 중간체가 클래스 II MHC 결합을 위한 펩티드의 지배적인 공급원을 형성하고, 이러한 펩티드는 일반적으로 13-18개의 아미노산으로 이루어진다.
클래스 I 및 클래스 II MHC는 모두 내인성 및 외인성 항원으로부터 프로세싱된 펩티드에 접근할 수 있다. 예컨대, 클래스 II MHC는 리소좀에서 분해되는 내인성 막 단백질로부터 유래된 펩티드에 결합한다. 유사하게, 클래스 I MHC는 교차-제시로 불리는 현상인 세포내이입 또는 포식작용에 의해 내재화된 외인성 단백질에서 유래된 펩티드에 결합할 수 있다. DC의 특정 서브세트는 이 과정을 매개하는 데 특히 능숙하며, 이는 나이브 CD8+ T 세포에 의한 1차 반응의 개시에 매우 중요하다.
한 측면에서, 본원에 기재된 폴리펩티드를 APC에 접촉시키는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 절단하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 생체내에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 시험관내에서 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 절단 전에 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 프로테아좀 및/또는 면역프로테아좀 프로세싱 전에 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 리신 잔기에서 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 에피토프 서열 상에 없는 리신 잔기에서 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 상의 리신 잔기에서 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 상의 제1 리신 상에서 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 상의 제2 리신 상에서 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 상의 제3 리신 상에서 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 상의 제4 리신 상에서 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 상의 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 도는 제10 리신 상에서 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 하나의 리신 잔기에서 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 하나 초과의 리신 잔기에서 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 상의 하나 초과의 리신 잔기에서 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 각각의 리신 잔기에서 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 상의 각각의 리신 잔기에서 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 상의 2개의 리신 잔기에서 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 상의 3개의 리신 잔기에서 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 상의 4개의 리신 잔기에서 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 상의 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 또는 제10 리신 잔기에서 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 상의 각각의 리신 잔기에서 순차적으로 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 상의 각각의 리신 잔기에서 순차적으로 유비퀴틴화되지 않는다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 Ala-Lys-PABC 상의 리신 잔기에서 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 Phe-Lys-PABC 상의 리신 잔기에서 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 및 AA-AA-PABC를 포함하며, 각각의 AA는 아미노산 또는 이의 유사체 또는 유도체이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 및 AA-AA-PABC 상의 적어도 하나의 리신 잔기에서 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 및 AA-AA-PABC 상의 하나 이상의 리신 잔기에서 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 및 Ala-Lys-PABC 상의 하나 이상의 리신 잔기에서 유비퀴틴화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 및 Phe-Lys-PABC 상의 하나 이상의 리신 잔기에서 유비퀴틴화된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 APC에 의해 내재화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 세포내이입을 통해 APC에 의해 내재화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 포식작용을 통해 APC에 의해 내재화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 음세포작용을 통해 APC에 의해 내재화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 세포질에서 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 엔도좀에서 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 엔도리소좀에서 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 리소좀에서 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 ER에서 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 아미노펩티다제에 의해 절단된다. 일부 실시양태에서, 아미노펩티다제는 인슐린 조절된 아미노펩티다제(IRAP)이다. 일부 실시양태에서, 아미노펩티다제는 세포질세망 아미노펩티다제(ERAP)이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 프로테아좀 및/또는 면역프로테아좀의 트립신-유사 도메인에 의해 프로세싱된다. 일부 실시양태에서, 트립신-유사 도메인은 트립신-유사 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 트립신-유사 도메인은 키모트립신-유사 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 트립신-유사 활성은 펩티딜글루타밀-펩티드 히드롤라제(PGPH) 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 프로테아제에 의해 절단된다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 트립신-유사 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 키모트립신-유사 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 펩티딜글루타밀-펩티드 히드롤라제(PGPH)이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 아스파라긴 펩티드 리아제, 아스파르트산 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 메탈로프로테아제, 세린 프로테아제, 및 트레오닌 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 프로테아제는 시스테인 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, 시스테인 프로테아제는 칼파인, 카스파제, 카텝신 B, 카텝신 C, 카텝신 F, 카텝신 H, 카텝신 K, 카텝신 L1, 카텝신 L2, 카텝신 O, 카텝신 S, 카텝신 W, 및 카텝신 Z로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 카텝신 B이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 카텝신 C이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 카텝신 F이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 카텝신 Z이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 리신 잔기에서 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 상의 리신 잔기에서 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 상의 제1 리신 잔기에서 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 상의 제2 리신 잔기에서 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 상의 제3 리신 잔기에서 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 상의 제4 리신 잔기에서 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 상의 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 또는 제10 리신 잔기에서 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 상의 하나 초과의 리신 잔기에서 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 상의 각각의 리신 잔기에서 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 상의 각각의 리신 잔기에서 순차적으로 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 polyK 상의 각각의 리신 잔기에서 순차적으로 절단되지 않는다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 AA-AA-PABC에서 절단되고, 각각의 AA는 아미노산 또는 이의 유사체 또는 유도체이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 Ala-Lys-PABC에서 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 Ala-Lys-PABC의 리신 잔기에서 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 Phe-Lys-PABC에서 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 Phe-Lys-PABC의 리신 잔기에서 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 Val-Cit-PABC에서 절단된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 Val-Cit-PABC의 시트룰린(Cit) 잔기에서 절단된다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 폴리펩티드가 절단될 때 방출된다.
전신 치료 적용을 제한하는 펩티드 기반 약물의 하나의 주요 약점은 펩티드의 단백질분해적 분해이다. 주사 경로에 의해 투여되는 펩티드는 지혈, 섬유소 용해 및 조직 전환, 즉 부상의 경우 중요한 과정에서 기능하는 프로테아제를 함유하는 혈류에 도달한다. 따라서, 혈액, 혈청 또는 혈장에 존재하는 프로테아제에 대해 펩티드를 안정화시키는 것이 중요하다. 한 측면에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 혈장, 혈액 및/또는 혈청에서 안정하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 대상체에서 APC에 의한 내재화 전에 절단되지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 대상체에서 APC에 의해 프로세싱되기 전에 절단되지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 APC에 의한 내재화 전에 대상체의 혈액에서 절단되지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 APC에 의한 프로세싱 전에 대상체의 혈액에서 절단되지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 혈액 내 프로테아제에 의해 절단되지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 플라스민에 의해 절단되지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 혈장 칼리크레인에 의해 절단되지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 조직 칼리크레인에 의해 절단되지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 트롬빈에 의해 절단되지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 응고 인자에 의해 절단되지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 응고 인자 XII에 의해 절단되지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 혈장에서 안정하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 혈액에서 안정하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 혈청에서 안정하다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 혈장에서 1시간 내지 5일의 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 1시간 내지 약 120시간의 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 1시간 내지 약 5시간, 약 1시간 내지 약 10시간, 약 1시간 내지 약 12시간, 약 1시간 내지 약 24시간, 약 1시간 내지 약 36시간, 약 1시간 내지 약 48시간, 약 1시간 내지 약 60시간, 약 1시간 내지 약 72시간, 약 1시간 내지 약 84시간, 약 1시간 내지 약 96시간, 약 1시간 내지 약 120시간, 약 5시간 내지 약 10시간, 약 5시간 내지 약 12시간, 약 5시간 내지 약 24시간, 약 5시간 내지 약 36시간, 약 5시간 내지 약 48시간, 약 5시간 내지 약 60시간, 약 5시간 내지 약 72시간, 약 5시간 내지 약 84시간, 약 5시간 내지 약 96시간, 약 5시간 내지 약 120시간, 약 10시간 내지 약 12시간, 약 10시간 내지 약 24시간, 약 10시간 내지 약 36시간, 약 10시간 내지 약 48시간, 약 10시간 내지 약 60시간, 약 10시간 내지 약 72시간, 약 10시간 내지 약 84시간, 약 10시간 내지 약 96시간, 약 10시간 내지 약 120시간, 약 12시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 36시간, 약 12시간 내지 약 48시간, 약 12시간 내지 약 60시간, 약 12시간 내지 약 72시간, 약 12시간 내지 약 84시간, 약 12시간 내지 약 96시간, 약 12시간 내지 약 120시간, 약 24시간 내지 약 36시간, 약 24시간 내지 약 48시간, 약 24시간 내지 약 60시간, 약 24시간 내지 약 72시간, 약 24시간 내지 약 84시간, 약 24시간 내지 약 96시간, 약 24시간 내지 약 120시간, 약 36시간 내지 약 48시간, 약 36시간 내지 약 60시간, 약 36시간 내지 약 72시간, 약 36시간 내지 약 84시간, 약 36시간 내지 약 96시간, 약 36시간 내지 약 120시간, 약 48시간 내지 약 60시간, 약 48시간 내지 약 72시간, 약 48시간 내지 약 84시간, 약 48시간 내지 약 96시간, 약 48시간 내지 약 120시간, 약 60시간 내지 약 72시간, 약 60시간 내지 약 84시간, 약 60시간 내지 약 96시간, 약 60시간 내지 약 120시간, 약 72시간 내지 약 84시간, 약 72시간 내지 약 96시간, 약 72시간 내지 약 120시간, 약 84시간 내지 약 96시간, 약 84시간 내지 약 120시간, 또는 약 96시간 내지 약 120시간의 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 1시간, 약 5시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 24시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 72시간, 약 84시간, 약 96시간, 또는 약 120시간의 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 약 1시간, 약 5시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 24시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 72시간, 약 84시간, 또는 약 96시간의 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 최대 약 5시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 24시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 72시간, 약 84시간, 약 96시간, 또는 약 120시간의 반감기를 갖는다.
3.
신생항원 및 이의 용도
치료 및 종양 특이적 면역요법을 개발하는 데 있어 중요한 장애물 중 하나는 자가면역을 피하기 위해 고도로 특이적이고 제한된 종양 항원을 확인하고 선택하는 것이다. 악성 세포 내 유전적 변화(예컨대, 역위, 전위, 결실, 미스센스 돌연변이, 스플라이스 부위 돌연변이 등)의 결과로 발생하는 종양 신생항원은 가장 종양 특이적인 부류의 항원을 나타낸다. 신생항원은 이를 확인하고, 최적화된 항원을 선택하고, 백신 또는 면역원성 조성물에 사용하기 위한 신생항원을 생성하는 기술적인 어려움으로 인해 암 백신 또는 면역원성 조성물에 거의 사용되지 않았다. 이러한 문제는, 종양의 DNA 수준에서는 존재하지만 암을 갖는 높은 비율의 대상체로부터의 일치하는 배선 샘플에는 존재하지 않는 신생물/종양의 돌연변이를 확인하고; 신생물/종양 내에서 발현되고 높은 비율의 환자 HLA 대립유전자에 결합하는 복수의 신생항원 T 세포 에피토프를 생성하기 위해 하나 이상의 펩티드-MHC 결합 예측 알고리즘으로 확인된 돌연변이를 분석하고; 암을 갖는 높은 비율의 대상체를 치료하기에 적합한 암 백신 또는 면역원성 조성물에 사용하기 위한 모든 신생항원 펩티드 및 예측된 결합 펩티드의 세트로부터 선택되는 복수의 신생항원 펩티드를 합성함으로써 해결될 수 있다.
예컨대, 펩티드 시퀀싱 정보를 치료 백신으로 번역하는 것은 높은 비율의 개체의 HLA 분자에 결합할 수 있는 돌연변이된 펩티드의 예측을 포함할 수 있다. 면역원으로 활용될 특정 돌연변이를 효율적으로 선택하려면 돌연변이된 펩티드가 높은 비율의 환자의 HLA 대립유전자에 효율적으로 결합할 것인지 예측하는 능력이 필요하다. 최근, 검증된 결합 및 비-결합 펩티드를 사용한 신경망 기반 학습 접근 방식은 주요 HLA-A 및 -B 대립유전자에 대한 예측 알고리즘의 정확도를 향상시켰다. 그러나, HLA-펩티드 결합 규칙을 코딩하기 위해 고급 신경망 기반 알고리즘을 사용하더라도 여러 요인이 HLA 대립유전자에 제시된 펩티드를 예측하는 능력을 제한한다.
펩티드 시퀀싱 정보를 치료 백신으로 번역하는 또 다른 예는 약물을 긴 펩티드의 다중 에피토프 백신으로 제형화하는 것을 포함할 수 있다. 실제로 가능한 한 많은 돌연변이된 에피토프를 표적화하는 것은 면역계의 엄청난 능력을 이용하고, 면역 표적화된 유전자 생성물의 하향 조절에 의한 면역학적 이탈의 기회를 방지하고, 에피토프 예측 접근법의 알려진 부정확성을 보상한다. 합성 펩티드는 다중 면역원을 효율적으로 제조하고 돌연변이 에피토프의 확인을 효과적인 백신으로 신속하게 번역하는 유용한 수단을 제공한다. 펩티드는 화학적으로 쉽게 합성될 수 있으며, 오염 박테리아 또는 동물성 물질이 없는 시약을 활용하여 쉽게 정제될 수 있다. 작은 크기는 단백질의 돌연변이 영역에 명확한 초점을 허용하고, 또한 다른 성분(비-돌연변이된 단백질 또는 바이러스 벡터 항원)으로부터 관련 없는 항원 경쟁을 감소시킨다.
펩티드 시퀀싱 정보를 치료 백신으로 번역하는 또 다른 예는 강력한 백신 애주번트와의 조합을 포함할 수 있다. 효과적인 백신은 면역 반응을 개시하기 위해 강력한 애주번트가 필요할 수 있다. 예컨대, TLR3의 효능제 및 MDA5 및 RIG3의 RNA 헬리카제 도메인인 poly-ICLC는 백신 애주번트에 대해 여러 바람직한 특성을 나타내었다. 이러한 특성은 생체내 면역 세포의 국소 및 전신 활성화 유도, 자극성 케모카인 및 시토카인 생성, 수지상 세포(DC)에 의한 항원 제시 자극을 포함한다. 또한, poly-ICLC는 인간에서 지속적인 CD4+ 및 CD8+ 반응을 유도할 수 있다. 중요하게는, 전사 및 신호 전달 경로의 상향 조절에서 현저한 유사성이 poly-ICLC으로 백신접종된 대상체 및 고도로 효과적이고 복제 적격 황열 백신이 접종된 지원자에서 관찰되었다. 또한, (몬타니드 외에) NYESO-1 펩티드 백신과 함께 poly-ICLC로 면역화된 난소 암종 환자의 >90%는 최근 1상 연구에서 펩티드에 대한 항체 반응 뿐만 아니라 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 유도를 나타내었다. 동시에, poly-ICLC는 현재까지 25개 초과의 임상 시험에서 광범위하게 시험되었으며, 비교적 유리한 독성 프로파일을 나타내었다.
펩티드
일부 측면에서, 본 개시내용은 종양 특이적 돌연변이를 포함하는 단리된 펩티드를 제공한다. 이들 펩티드 및 폴리펩티드는 본원에서 "신생항원 펩티드" 또는 "신생항원 폴리펩티드"로 지칭된다. 용어 "펩티드"는 전형적으로 인접한 아미노산의 α-아미노기와 카르복실기 사이의 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 일련의 잔기, 전형적으로 L-아미노산을 지칭하도록 본 명세서에서 "돌연변이 펩티드", "신생항원 펩티드" 및 "신생항원성 펩티드"와 상호교환적으로 사용된다. 유사하게, 용어 "폴리펩티드"는 전형적으로 인접한 아미노산의 α-아미노기와 카르복실기 사이의 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 일련의 잔기, 전형적으로 L-아미노산을 지칭하도록 본 명세서에서 "돌연변이 폴리펩티드", "신생항원 폴리펩티드" 및 "신생항원성 폴리펩티드"와 상호교환적으로 사용된다. 폴리펩티드 또는 펩티드는, 중성(비하전된) 형태 또는 염 형태이고, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드의 생물학적 활성을 파괴하지 않는 조건에 따라 글리코실화, 측쇄 산화 또는 인산화와 같은 변형이 없거나 이러한 변형을 함유하는, 다양한 길이일 수 있다.
일부 실시양태에서, 게놈 또는 엑솜 시퀀싱 방법을 이용하여 종양 특이적 돌연변이를 확인한다. 임의의 적합한 시퀀싱 방법, 예컨대 차세대 시퀀싱(NGS) 기술이 본 개시내용에 따라 이용될 수 있다. 3세대 시퀀싱 방법은 향후 NGS 기술을 대체하여 이 방법의 시퀀싱 단계를 가속화할 수 있다. 설명을 위해: 본 개시내용의 맥락에서 용어 "차세대 시퀀싱" 또는 "NGS"는 생어(Sanger) 화학으로 공지된 "통상의" 시퀀싱 방법론과 대조적으로 전체 게놈을 작은 조각으로 쪼갬으로써 핵산 템플릿을 전체 게놈을 따라 병렬로 무작위로 판독하는 모든 새로운 고처리량 시퀀싱 기술을 의미한다. 이러한 NGS 기술(대규모 병렬 시퀀싱 기술이라고도 함)은 전체 게놈, 엑솜, 전사체(게놈의 모든 전사된 서열) 또는 메틸롬(게놈의 모든 메틸화된 서열)의 핵산 서열 정보를 매우 짧은 기간에, 예컨내 1-2주 이내, 예컨대 1-7일 이내 또는 24시간 이내에 전달할 수 있고, 원칙적으로 단일 세포 시퀀싱 접근법을 허용한다. 시판되거나 문헌에 언급된 다수의 NGS 플랫폼, 예컨대 WO 2012/159643에 상세히 기술된 것들이 본 개시내용의 맥락에서 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 약 5개, 약 6개, 약 7개, 약 8개, 약 9개, 약 10개, 약 11개, 약 12개, 약 13개, 약 14개, 약 15개, 약 16개, 약 17개, 약 18개, 약 19개, 약 20개, 약 21개, 약 22개, 약 23개, 약 24개, 약 25개, 약 26개, 약 27개, 약 28개, 약 29개, 약 30개, 약 31개, 약 32개, 약 33개, 약 34개, 약 35개, 약 36개, 약 37개, 약 38개, 약 39개, 약 40개, 약 41개, 약 42개, 약 43개, 약 44개, 약 45개, 약 46개, 약 47개, 약 48개, 약 49개, 약 50개, 약 60개, 약 70개, 약 80개, 약 90개, 약 100개, 약 110개, 약 120개, 약 150개, 약 200개, 약 300개, 약 350개, 약 400개, 약 450개, 약 500개, 약 600개, 약 700개, 약 800개, 약 900개, 약 1,000개, 약 1,500개, 약 2,000개, 약 2,500개, 약 3,000개, 약 4,000개, 약 5,000개, 약 7,500개, 약 10,000개 아미노산 또는 그 초과의 아미노산 잔기, 및 그 안에서 유도 가능한 임의의 범위를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 신생항원 펩티드 분자는 100개 이하의 아미노산이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 8 내지 약 50개의 아미노산 잔기 길이, 또는 약 8 내지 약 30개, 약 8 내지 약 20개, 약 8 내지 약 18개, 약 8 내지 약 18개. 약 8 내지 15개, 또는 약 8개 내지 약 12개 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 약 8 내지 약 500개의 아미노산 잔기 길이, 또는 약 8 내지 약 450개, 약 8 내지 약 400개, 약 8 내지 약 350개, 약 8 내지 약 300개, 약 8 내지 약 250, 약 8 내지 약 200개, 약 8 내지 약 150개, 약 8 내지 약 100개, 약 8 내지 약 50개, 또는 약 8 내지 약 30개의 아미노산 잔기 길이일 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개, 또는 그 초과의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500개, 또는 그 초과의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 최대 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개, 또는 그 미만의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 최대 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500개, 또는 그 미만의 아미노산 잔기 길이일 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 1000, 또는 적어도 1500개 아미노산의 총 길이를 갖는다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 최대 8, 최대 9, 최대 10, 최대 11, 최대 12, 최대 13, 최대 14, 최대 15, 최대 16, 최대 17, 최대 18, 최대 19, 최대 20, 최대 21, 최대 22, 최대 23, 최대 24, 최대 25, 최대 26, 최대 27, 최대 28, 최대 29, 최대 30, 최대 40, 최대 50, 최대 60, 최대 70, 최대 80, 최대 90, 최대 100, 최대 150, 최대 200, 최대 250, 최대 300, 최대 350, 최대 400, 최대 450, 최대 500, 최대 1000, 또는 최대 1500개 아미노산의 총 길이를 갖는다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 에피토프를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 에피토프는 약 5개, 약 6개, 약 7개, 약 8개, 약 9개, 약 10개, 약 11개, 약 12개, 약 13개, 약 14개, 약 15개, 약 16개, 약 17개, 약 18개, 약 19개, 약 20개, 약 21개, 약 22개, 약 23개, 약 24개, 약 25개, 약 26개, 약 27개, 약 28개, 약 29개, 약 30개, 약 31개, 약 32개, 약 33개, 약 34개, 약 35개, 약 36개, 약 37개, 약 38개, 약 39개, 약 40개, 약 41개, 약 42개, 약 43개, 약 44개, 약 45개, 약 46개, 약 47개, 약 48개, 약 49개, 약 50개, 약 60개, 약 70개, 약 80개, 약 90개, 약 100개, 약 110개, 약 120개, 약 150개, 약 200개, 약 300개, 약 350개, 약 400개, 약 450개, 약 500개, 약 600개, 약 700개, 약 800개, 약 900개, 약 1,000개, 약 1,500개, 약 2,000개, 약 2,500개, 약 3,000개, 약 4,000개, 약 5,000개, 약 7,500개, 약 10,000개 아미노산 또는 그 초과의 아미노산 잔기, 및 그 안에서 유도 가능한 임의의 범위를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 에피토프는 약 8 내지 약 50개의 아미노산 잔기 길이, 또는 약 8 내지 약 30개, 약 8 내지 약 20개, 약 8 내지 약 18개, 약 8 내지 약 15개, 또는 약 8개 내지 약 12개의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 약 8 내지 약 500개의 아미노산 잔기 길이, 또는 약 8 내지 약 450개, 약 8 내지 약 400개, 약 8 내지 약 350개, 약 8 내지 약 300개, 약 8 내지 약 250, 약 8 내지 약 200개, 약 8 내지 약 150개, 약 8 내지 약 100개, 약 8 내지 약 50개, 또는 약 8 내지 약 30개의 아미노산 잔기 길이일 수 있다.
특정 실시양태에서, 에피토프는 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개, 또는 그 초과의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500개, 또는 그 초과의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 최대 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개, 또는 그 미만의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 최대 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500개, 또는 그 미만의 아미노산 잔기일 수 있다.
더 긴 펩티드는 여러 방식으로 설계될 수 있다. 일부 실시양태에서, HLA-결합 펩티드가 예측되거나 공지된 경우, 더 긴 펩티드는 (1) 각각의 상응하는 유전자 생성물의 N- 및 C-말단을 향해 2-5개 아미노산의 확장을 갖는 개별 결합 펩티드; 또는 (2) 각각에 대해 확장된 서열을 갖는 결합 펩티드의 일부 또는 전부의 연결을 포함한다. 다른 실시양태에서, (예컨대, 새로운 펩티드 서열을 유도하는 프레임쉬프트, 리드-쓰루(read-through) 또는 인트론 포함으로 인해) 시퀀싱이 종양에 존재하는 긴(>10개 잔기) 신생에피토프 서열을 나타내는 경우, 더 긴 펩티드는 하나의 더 긴 펩티드 또는 여러개의 겹치는 더 긴 펩티드로서 새로운 종양 특이적 아미노산의 전체 스트레치로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 보다 긴 펩티드의 사용은 환자 세포에 의한 내인성 프로세싱을 허용하는 것으로 추정되고, 보다 효과적인 항원 제시 및 T 세포 반응의 유도를 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드가 겹치고 긴 신생항원 펩티드 위에 타일링되는 경우, 2개 이상의 펩티드가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, MHC 클래스 I에 대한 면역원성 항원, 신생항원 펩티드 또는 이의 에피토프는 12개 이하의 아미노산 잔기 길이이고, 일반적으로 약 8 내지 약 12개의 아미노산 잔기로 이루어진다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I에 대한 면역원성 항원, 신생항원 펩티드, 또는 이의 에피토프는 약 8개, 약 9개, 약 10개, 약 11개, 또는 약 12개의 아미노산 잔기이다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 II에 대한 면역원성 항원, 신생항원 펩티드 또는 이의 에피토프는 25개 이하의 아미노산 잔기 길이이고, 일반적으로 약 9개 내지 약 25개의 아미노산 잔기로 이루어진다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 II에 대한 면역원성 항원, 신생항원 펩티드 또는 이의 에피토프는 약 15개, 약 16개, 약 17개, 약 18개, 약 19개, 약 20개, 약 21개, 약 22개, 약 23개, 약 24개, 또는 약 25개 아미노산 잔기이다.
일부 실시양태에서, 항원, 신생항원 펩티드, 또는 에피토프는 HLA 단백질(예컨대, MHC 클래스 I HLA 또는 MHC 클래스 II HLA)에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항원, 신생항원 펩티드, 또는 에피토프는 상응하는 야생형 펩티드보다 더 큰 친화도로 HLA 단백질에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항원, 신생항원 펩티드, 또는 에피토프는 적어도 5000 nM 미만, 적어도 500 nM 미만, 적어도 100 nM 미만, 적어도 50 nM 미만 또는 그 미만의 IC50 또는 KD를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항원, 신생항원 펩티드, 또는 에피토프는 MHC 클래스 I HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항원, 신생항원 펩티드, 또는 에피토프는 0.1 nM 내지 2000 nM의 친화도로 MHC 클래스 I HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항원, 신생항원 펩티드, 또는 에피토프는 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 nM의 친화도로 MHC 클래스 I HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항원, 신생항원 펩티드, 또는 에피토프는 MHC 클래스 II HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항원, 신생항원 펩티드, 또는 에피토프는 0.1 nM 내지 2000 nM, 1 nM 내지 1000 nM, 10 nM 내지 500 nM, 또는 1000 nM 미만의 친화도로 MHC 클래스 II HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항원, 신생항원 펩티드, 또는 에피토프는 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 nM의 친화도로 MHC 클래스 II HLA에 결합한다.
일부 실시양태에서, 항원, 신생항원 펩티드, 또는 에피토프는 10분 내지 24시간의 안정성으로 MHC 클래스 I HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항원, 신생항원 펩티드, 또는 에피토프는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60분의 안정성으로 MHC 클래스 I HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항원, 신생항원 펩티드, 또는 에피토프는 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24시간의 안정성으로 MHC 클래스 I HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항원, 신생항원 펩티드, 또는 에피토프는 10분 내지 24시간의 안정성으로 MHC 클래스 II HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항원, 신생항원 펩티드, 또는 에피토프는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60분의 안정성으로 MHC 클래스 II HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항원, 신생항원 펩티드, 또는 에피토프는 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24시간의 안정성으로 MHC 클래스 II HLA에 결합한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 0.5 내지 약 12, 약 2 내지 약 10, 또는 약 4 내지 약 8의 pI 값을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 적어도 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 또는 그 초과의 pI 값을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 최대 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 또는 그 미만의 pI 값을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않는 펩티드 서열의 아미노산 또는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않는 펩티드 서열의 아미노산 또는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 또는 아미노산 서열은 0-1000, 1-900, 5-800, 10-700, 20-600, 30-500, 40-400, 50-300, 60-200, 또는 70-100개의 아미노산 잔기를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 아미노산 또는 아미노산 서열은 1 내지 20개의 아미노산 잔기를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 아미노산 또는 아미노산 서열은 5 내지 12개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 또는 아미노산 서열은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개, 적어도 25개, 적어도 26개, 적어도 27개, 적어도 28개, 적어도 29개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 350개, 적어도 400개, 적어도 450개, 적어도 500개, 적어도 1000, 또는 적어도 1500개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 또는 아미노산 서열은 약 1개, 약 2개, 약 3개, 약 4개, 약 5개, 약 6개, 약 7개, 약 8개, 약 9개, 약 10개, 약 11개, 약 12개, 약 13개, 약 14개, 약 15개, 약 16개, 약 17개, 약 18개, 약 19개, 약 20개, 약 21개, 약 22개, 약 23개, 약 24개, 약 25개, 약 26개, 약 27개, 약 28개, 약 29개, 약 30개, 약 40개, 약 50개, 약 60개, 약 70개, 약 80개, 약 90개, 약 100개, 약 150개, 약 200개, 약 250개, 약 300개, 약 350개, 약 400개, 약 450개, 약 500개, 약 1000, 또는 약 1500개의 아미노산 잔기를 포함한다.
한 측면에서, 아미노산 또는 아미노산 서열 및/또는 링커를 에피토프 서열을 포함하는 서열의 N- 및/또는 C-말단에 연결하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 용액, 동결건조 또는 결정 형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 재조합 DNA 기술 또는 화학적 합성에 의해 합성적으로 제조될 수 있거나, 천연 종양 또는 병원성 유기체와 같은 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 에피토프 또는 신생에피토프는 개별적으로 합성되거나 폴리펩티드에서 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 본원에 기재된 폴리펩티드는 다른 자연 발생 숙주 세포 단백질 및 이의 단편이 실질적으로 없을 수 있지만, 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 천연 단편 또는 입자에 연결되도록 합성적으로 접합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 매우 다양한 방식으로 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 통상적인 기술에 따라 용액에서 또는 고체 지지체 상에서 합성될 수 있다. 다양한 자동 합성기가 시판되고 있으며, 공지된 프로토콜에 따라 사용될 수 있다. 예컨대, 문헌(Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. Ed., Pierce Chemical Co., 1984)을 참조한다. 또한, 개별 폴리펩티드는 화학적 리게이션을 이용하여 연결되어 여전히 본 개시내용의 범위 내에 있는 더 큰 폴리펩티드를 생성할 수 있다.
대안적으로, 발현 벡터에 삽입된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 적절한 숙주 세포로 형질전환되거나 형질감염되고 발현에 적합한 조건 하에 배양되는 재조합 DNA 기술이 이용될 수 있다. 이러한 절차는 일반적으로 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))에 기재된 바와 같이 당업계에 일반적으로 공지되어 있다. 따라서, 본원에 기재된 하나 이상의 신생항원 펩티드를 포함하는 재조합 펩티드를 사용하여 적절한 T 세포 에피토프를 제시할 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 돌연변이 아미노산은 대상체의 게놈 내 핵산 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 돌연변이 아미노산은 대상체의 게놈 내 핵산 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 돌연변이 아미노산은 대상체의 게놈 내 핵산 서열에서 프레임쉬프트에 의해 코딩된다. 프레임 시프트는 돌연변이가 유전자 코돈 주기성("리딩 프레임"이라고도 함)의 정상 단계를 방해하여 비-천연 단백질 서열의 번역을 초래할 때 발생한다. 유전자의 상이한 돌연변이가 동일한 변경된 리딩 프레임을 달성하는 것이 가능하다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 돌연변이 아미노산은 대상체의 게놈 내 핵산 서열에서 neoORF에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 돌연변이 아미노산은 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 포인트 돌연변이에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 돌연변이 아미노산은 융합 폴리펩티드, 프레임내 결실, 삽입, 내인성 레트로바이러스 폴리펩티드의 발현, 및 폴리펩티드의 종양 특이적 과발현을 초래하는 돌연변이를 갖는 유전자에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 돌연변이 아미노산은 대상체의 게놈에서 제1 유전자와 제2 유전자의 융합에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 돌연변이 아미노산은 대상체의 게놈에서 제1 유전자와 제2 유전자의 프레임내 융합에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 돌연변이 아미노산은 대상체의 게놈 내 제1 유전자의 스플라이스 변이체의 엑손과 제1 유전자의 융합에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 돌연변이 아미노산은 대상체의 게놈 내 제1 유전자의 잠재 엑손과 제1 유전자의 융합에 의해 코딩된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 적어도 2개의 폴리펩티드 분자를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자 중 2개 이상은 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자 중 2개 이상은 동일한 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자 중 2개 이상은 동일한 길이의 동일한 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자 중 2개 이상은 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류 또는 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않는 펩티드 서열의 아미노산 또는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않는 펩티드 서열의 아미노산 또는 아미노산 서열은 동일하다. 일부 실시양태에서, 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않는 펩티드 서열의 아미노산 또는 아미노산 서열은 동일하다.
일부 실시양태에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자 중 2개 이상은 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자 중 2개 이상은 에피토프의 N- 및/또는 C-말단에 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자 중 2개 이상은 상이한 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제1 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자는 링커를 포함하지 않고, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제2 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자는 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제1 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자는 에피토프의 N-말단에 링커를 포함하지 않고, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제2 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자는 에피토프의 N-말단에 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제1 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자는 에피토프의 C-말단에 링커를 포함하지 않고, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제2 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자는 에피토프의 C-말단에 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제1 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자는 링커를 포함하고, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제2 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자는 링커를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제1 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자는 에피토프의 N-말단에 링커를 포함하고, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제2 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자는 에피토프의 N-말단에 링커를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제1 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자는 에피토프의 C-말단에 링커를 포함하고, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제2 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자는 에피토프의 C-말단에 링커를 포함하지 않는다.
디설파이드 링커는 당업계에 널리 공지된 방법을 이용하여 합성될 수 있다. 예컨대, 디설파이드 링커는 문헌(Zhang, Donglu, et al., ACS Med. Chem. Lett. 2016, 7, 988-993; 및 Pillow, Thomas H., et al., Chem. Sci., 2017, 8, 366-370)에 따라 합성될 수 있다. 디설파이드 링커 합성 및 디설파이드 함유 펩티드 합성의 예는 실시예 3 및 4에 나타나 있다. PABC 함유 펩티드는 당업계에 널리 공지된 방법을 이용하여 합성될 수 있다. 예컨대, PABC 함유 펩티드는 문헌(Laurent Ducry (ed.), Antibody-Drug Conju gates, Methods in Molecular Biology, vol. 1045, DOI 10.1007/978-1-62703-541-5_5, Springer Science+Business Media, LLC 2013)에 따라 합성될 수 있다. PABC 함유 펩티드 합성의 예는 실시예 5에 나타나 있다. 일부 실시양태에서, 고체상 펩티드 합성을 위해 제조된 임의의 수지를 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 또는 그 초과의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자를 포함한다. 예컨대, 폴리펩티드는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개 또는 그 초과의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항원, 신생항원 펩티드, 또는 에피토프를 포함하는 폴리펩티드는 RAS 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 치환 돌연변이, 예컨대 KRAS G12C, G12D, G12V, Q61H, 또는 Q61L 돌연변이, 또는 NRAS Q61K 또는 Q61R 돌연변이를 갖는 단백질로부터 유래될 수 있다. 치환은 펩티드의 길이를 따라 어디든지 위치될 수 있다. 예컨대, 펩티드의 N-말단 1/3, 펩티드의 중앙 1/3 또는 펩티드의 C-말단 1/3에 위치될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 치환된 잔기는 N-말단 끝으로부터 2-5개 잔기 떨어져 위치되거나 C-말단 끝으로부터 2-5개 잔기 떨어져 위치된다. 펩티드는 펩티드가 삽입된 잔기의 하나 이상 또는 모두를 포함하는 종양 특이적 삽입 돌연변이로부터 유사하게 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 G12, G13 또는 Q61에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 RAS 단백질의 적어도 8개의 인접 아미노산 및 G12, G13 또는 Q61에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 RAS 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, G12, G13, 또는 Q61에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 RAS 단백질의 적어도 8개의 인접 아미노산은 G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V, Q61H, Q61L, Q61K, 또는 Q61R 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, G12, G13, 또는 Q61에서의 돌연변이는 G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V, Q61H, Q61L, Q61K, 또는 Q61R 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, RAS 에피토프를 포함하는 폴리펩티드는 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 pp65와 같은 거대세포바이러스(CMV) 단백질의 것이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 인간 면역결핍 바이러스(HIV)의 단백질이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 MART-1의 단백질의 것이다. 일부 실시양태에서, pp65와 같은 CMV의 단백질의 아미노산 서열은 1, 2, 3개, 또는 3개 초과의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, pp65와 같은 CMV의 단백질의 아미노산 서열은 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, HIV의 단백질의 아미노산 서열은 1, 2, 3개, 또는 3개 초과의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, HIV 단백질의 아미노산 서열은 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, MART-1의 단백질의 아미노산 서열은 1, 2, 3개, 또는 3개 초과의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, MART-1의 단백질의 아미노산 서열은 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개의 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 실시양태에서, RAS 에피토프는 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, RAS 에피토프는 10 μM 미만, 9 μM 미만, 8 μM 미만, 7 μM 미만, 6 μM 미만, 5 μM 미만, 4 μM 미만, 3 μM 미만, 2 μM 미만, 1 μM 미만, 950 nM 미만, 900 nM 미만, 850 nM 미만, 800 nM 미만, 750 nM 미만, 600 nM 미만, 550 nM 미만, 500 nM 미만, 450 nM 미만, 400 nM 미만, 350 nM 미만, 300 nM 미만, 250 nM 미만, 200 nM 미만, 150 nM 미만, 100 nM 미만, 90 nM 미만, 80 nM 미만, 70 nM 미만, 60 nM 미만, 50 nM 미만, 40 nM 미만, 30 nM 미만, 20 nM, 또는 10 nM 미만의 친화도로 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, RAS 에피토프는 24시간 초과, 23시간 초과, 22시간 초과, 21시간 초과, 20시간 초과, 19시간 초과, 18시간 초과, 17시간 초과, 16시간 초과, 15시간 초과, 14시간 초과, 13시간 초과, 12시간 초과, 11시간 초과, 10시간 초과, 9시간 초과, 8시간 초과, 7시간 초과, 6시간 초과, 5시간 초과, 4시간 초과, 3시간 초과, 2시간 초과, 1시간 초과, 55분 초과, 50분 초과, 45분 초과, 40분 초과, 35분 초과, 30분 초과, 25분 초과, 20분 초과, 15분 초과, 10분 초과, 9분 초과, 8분 초과, 7분 초과, 6분 초과, 5분 초과, 4분 초과, 3분 초과, 2분, 또는 1분 초과의 안정성으로 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합한다.
일부 실시양태에서, HLA 대립유전자는 HLA-A02:01 대립유전자, HLA-A03:01 대립유전자, HLA-A11:01 대립유전자, HLA-A03:02 대립유전자, HLA-A30:01 대립유전자, HLA-A31:01 대립유전자, HLA-A33:01 대립유전자, HLA-A33:03 대립유전자, HLA-A68:01 대립유전자, HLA-A74:01 대립유전자 및/또는 HLA-C08:02 대립유전자 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, HLA 대립유전자는 HLA-A02:01이다. 일부 실시양태에서, HLA 대립유전자는 HLA-A03:01 대립유전자이다. 일부 실시양태에서, HLA 대립유전자는 HLA-A11:01 대립유전자이다. 일부 실시양태에서, HLA 대립유전자는 HLA-A03:02 대립유전자이다. 일부 실시양태에서, HLA 대립유전자는 HLA-A30:01 대립유전자이다. 일부 실시양태에서, HLA 대립유전자는 HLA-A31:01 대립유전자이다. 일부 실시양태에서, HLA 대립유전자는 HLA-A33:01 대립유전자이다. 일부 실시양태에서, HLA 대립유전자는 HLA-A33:03 대립유전자이다. 일부 실시양태에서, HLA 대립유전자는 HLA-A68:01 대립유전자이다. 일부 실시양태에서, HLA 대립유전자는 HLA-A74:01 대립유전자이다. 일부 실시양태에서, HLA 대립유전자는 HLA-C08:02이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 제1 펩티드 및 제2 펩티드를 포함하는 단일 폴리펩티드, 또는 제1 펩티드 및 제2 펩티드를 코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물은 하나 이상의 추가의 펩티드를 포함하고, 하나 이상의 추가의 펩티드는 제3 신생에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 펩티드 및 제2 펩티드는 동일한 전사 개시 부위로부터 전사된 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 제1 펩티드는 제1 전사 개시 부위로부터 전사된 서열에 의해 코딩되고, 제2 펩티드는 제2 전사 개시 부위로부터 전사된 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 7,500, 또는 10,000개의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 상응하는 야생형 서열에 대해 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 제1 서열; 및 상응하는 야생형 서열에 대해 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 제2 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 상응하는 야생형에 대해 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 적어도 8개 또는 9개의 인접 아미노산의 제1 서열; 및 상응하는 야생형에 대해 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 16개 또는 17개의 인접 아미노산의 제2 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 펩티드는 제1 펩티드보다 더 길다. 일부 실시양태에서, 제1 펩티드는 제2 펩티드보다 더 길다. 일부 실시양태에서, 제1 펩티드는 적어도 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 7,500, 또는 10,000개의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제2 펩티드는 적어도 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 7,500, 또는 10,000개의 아미노산 길이를 갖는다. 아미노산 일부 실시양태에서, 제1 펩티드는 상응하는 야생형 서열에 대해 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 적어도 9개의 인접 아미노산의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 펩티드는 상응하는 야생형 서열에 대해 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 적어도 17개의 인접 아미노산의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 펩티드, 제2 펩티드, 또는 둘 모두는 적어도 하나의 플랭킹 서열을 포함하고, 적어도 하나의 플랭킹 서열은 신생에피토프의 상류 또는 하류에 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 플랭킹 서열은 상응하는 야생형 서열에 대해 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 플랭킹 서열은 비-야생형 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 플랭킹 서열은 N-말단 플랭킹 서열이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 플랭킹 서열은 C-말단 플랭킹 서열이다. 일부 실시양태에서, 제1 펩티드의 적어도 하나의 플랭킹 서열은 제2 펩티드의 적어도 하나의 플랭킹 서열에 대해 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 펩티드의 적어도 하나의 플랭킹 영역은 제2 펩티드의 적어도 하나의 플랭킹 영역과 상이하다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 플랭킹 잔기는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 펩티드는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산을 포함하는 신생에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 또는 그 초과의 돌연변이 아미노산를 포함하는 신생에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산 및 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 초과의 비-돌연변이 아미노산을 포함하는 단백질로부터 유래되는 신생에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산 및 적어도 하나의 돌연변이 아미노산의 상류에 있는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 초과의 비-돌연변이 아미노산을 포함하는 단백질로부터 유래되는 신생에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산 및 적어도 하나의 돌연변이 아미노산의 하류에 있는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 초과의 비-돌연변이 아미노산을 포함하는 단백질로부터 유래되는 신생에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산; 적어도 하나의 돌연변이 아미노산의 상류에 있는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 초과의 비-돌연변이 아미노산; 및 적어도 하나의 돌연변이 아미노산의 하류에 있는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 초과의 비-돌연변이 아미노산을 포함하는 단백질로부터 유래되는 신생에피토프 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 펩티드는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산 및 상응하는 야생형 서열에 대해 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산의 상류에 있는 서열을 포함하는 단백질로부터 유래되는 신생에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산 및 상응하는 야생형 서열에 대해 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산의 하류에 있는 서열을 포함하는 단백질로부터 유래되는 신생에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산, 상응하는 야생형 서열에 대해 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산의 상류에 있는 서열, 및 상응하는 야생형 서열에 대해 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산의 하류에 있는 서열을 포함하는 단백질로부터 유래되는 신생에피토프 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 펩티드는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산 및 상응하는 야생형 서열에 대해 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 초과의 인접 아미노산을 포함하는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산의 상류에 있는 서열을 포함하는 단백질로부터 유래되는 신생에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산 및 상응하는 야생형 서열에 대해 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 초과의 인접 아미노산을 포함하는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산의 하류에 있는 서열을 포함하는 단백질로부터 유래되는 신생에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산, 및 상응하는 야생형 서열에 대해 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 초과의 인접 아미노산을 포함하는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산의 상류에 있는 서열, 및 상응하는 야생형 서열에 대해 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 초과의 인접 아미노산을 포함하는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산의 상류에 있는 서열을 포함하는 단백질로부터 유래되는 신생에피토프 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 에피토프는 TMPRSS2:ERG 에피토프이다. 일부 실시양태에서, TMPRSS2:ERG 에피토프는 ALNSEALSV의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, RAS 에피토프를 포함하는 폴리펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 
.
일부 실시양태에서, RAS 에피토프를 포함하는 폴리펩티드는, 예컨대 N-말단에 하기의 아미노산 서열을 추가로 포함한다: 
.
일부 실시양태에서, RAS 에피토프를 포함하는 폴리펩티드는, 예컨대 C-말단에 하기의 아미노산 서열을 추가로 포함한다: 
. 일부 실시양태에서, RAS 에피토프를 포함하는 폴리펩티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 
. 일부 실시양태에서, RAS 에피토프를 포함하는 폴리펩티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 
. 일부 실시양태에서, RAS 에피토프를 포함하는 폴리펩티드는 
이다. 일부 실시양태에서, RAS 에피토프를 포함하는 폴리펩티드는 
이다. 일부 실시양태에서, RAS 에피토프를 포함하는 폴리펩티드는 
이다. 일부 실시양태에서, RAS 에피토프를 포함하는 폴리펩티드는 
이다.
일부 실시양태에서, KRAS G12C 돌연변이를 포함하는 펩티드는 하기 서열을 포함한다: 
. 일부 실시양태에서, KRAS G12 C 돌연변이를 포함하는 펩티드는 KLVVVGACGV의 신생에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, KRAS G12 C 돌연변이를 포함하는 펩티드는 LVVVGACGV의 신생에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, KRAS G12 C 돌연변이를 포함하는 펩티드는 VVGACGVGK의 신생에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, KRAS G12 C 돌연변이를 포함하는 펩티드는 VVVGACGVGK의 신생에피토프 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, KRAS G12D 돌연변이를 포함하는 펩티드는 하기 서열을 포함한다: 
. 일부 실시양태에서, KRAS G12D 돌연변이를 포함하는 펩티드는 VVGADGVGK의 신생에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, KRAS G12D 돌연변이를 포함하는 펩티드는 VVVGADGVGK의 신생에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, KRAS G12D 돌연변이를 포함하는 펩티드는 KLVVVGADGV의 신생에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, KRAS G12D 돌연변이를 포함하는 펩티드는 LVVVGADGV의 신생에피토프 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, KRAS G12V 돌연변이를 포함하는 펩티드는 하기 서열을 포함한다: 
. 일부 실시양태에서, KRAS G12V 돌연변이를 포함하는 펩티드는 KLVVVGAVGV의 신생에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, KRAS G12V 돌연변이를 포함하는 펩티드는 LVVVGAVGV의 신생에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, KRAS G12V 돌연변이를 포함하는 펩티드는 VVGAVGVGK의 신생에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, KRAS G12V 돌연변이를 포함하는 펩티드는 VVVGAVGVGK의 신생에피토프 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, KRAS Q61H 돌연변이를 포함하는 펩티드는 하기 서열을 포함한다: 
. 일부 실시양태에서, KRAS Q61H 돌연변이를 포함하는 펩티드는 ILDTAGHEEY의 신생에피토프 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, KRAS Q61L 돌연변이를 포함하는 펩티드는 하기 서열을 포함한다: 
. 일부 실시양태에서, KRAS Q61L 돌연변이를 포함하는 펩티드는 ILDTAGLEEY의 신생에피토프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, KRAS Q61L 돌연변이를 포함하는 펩티드는 LLDILDTAGL의 신생에피토프 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, NRAS Q61K 돌연변이를 포함하는 펩티드는 하기 서열을 포함한다: 
. 일부 실시양태에서, NRAS Q61K 돌연변이를 포함하는 펩티드는 ILDTAGKEEY의 신생에피토프 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, NRAS Q61R 돌연변이를 포함하는 펩티드는 하기 서열을 포함한다: 
.일부 실시양태에서, NRAS Q61R 돌연변이를 포함하는 펩티드는 ILDTAGREEY의 신생에피토프 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, RAS Q61H 돌연변이를 포함하는 펩티드는 하기 서열을 포함한다: 
. 일부 실시양태에서, RAS Q61H 돌연변이를 포함하는 펩티드는 표 1에 제공된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표 1에 제공된 펩티드 서열은 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합하거나 이에 결합할 것으로 예측되고, 대립유전자는 펩티드 서열 옆에 있는 표 1의 상응하는 컬럼에 제공된다.
일부 실시양태에서, RAS Q61R 돌연변이를 포함하는 펩티드는 하기 서열을 포함한다: TCLLDILDTAGREEYSAMRDQYM. 일부 실시양태에서, RAS Q61R 돌연변이를 포함하는 펩티드는 표 2에 제공된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표 2에 제공된 펩티드 서열은 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합하거나 이에 결합할 것으로 예측되고, 대립유전자는 펩티드 서열 옆에 있는 표 2의 상응하는 컬럼에 제공된다.
일부 실시양태에서, RAS Q61K 돌연변이를 포함하는 펩티드는 하기 서열을 포함한다: TCLLDILDTAGKEEYSAMRDQYM. 일부 실시양태에서, RAS Q61K 돌연변이를 포함하는 펩티드는 표 3에 제공된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표 3에 제공된 펩티드 서열은 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합하거나 이에 결합할 것으로 예측되고, 대립유전자는 펩티드 서열 옆에 있는 표 3의 상응하는 컬럼에 제공된다.
일부 실시양태에서, RAS Q61L 돌연변이를 포함하는 펩티드는 하기 서열을 포함한다: TCLLDILDTAGLEEYSAMRDQYM. 일부 실시양태에서, RAS Q61L 돌연변이를 포함하는 펩티드는 표 4에 제공된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표 4에 제공된 펩티드 서열은 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합하거나 이에 결합할 것으로 예측되고, 대립유전자는 펩티드 서열 옆에 있는 표 4의 상응하는 컬럼에 제공된다.
일부 실시양태에서, RAS G12A 돌연변이를 포함하는 펩티드는 하기 서열을 포함한다: MTEYKLVVVGAAGVGKSALTIQL. 일부 실시양태에서, RAS G12A 돌연변이를 포함하는 펩티드는 표 5에 제공된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표 5에 제공된 펩티드 서열은 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합하거나 이에 결합할 것으로 예측되고, 대립유전자는 펩티드 서열 옆에 있는 표 5의 상응하는 컬럼에 제공된다.
일부 실시양태에서, RAS G12C 돌연변이를 포함하는 펩티드는 하기 서열을 포함한다: MTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL. 일부 실시양태에서, RAS G12C 돌연변이를 포함하는 펩티드는 표 6에 제공된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표 6에 제공된 펩티드 서열은 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합하거나 이에 결합할 것으로 예측되고, 대립유전자는 펩티드 서열 옆에 있는 표 6의 상응하는 컬럼에 제공된다.
일부 실시양태에서, RAS G12D 돌연변이를 포함하는 펩티드는 하기 서열을 포함한다: MTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL. 일부 실시양태에서, RAS G12D 돌연변이를 포함하는 펩티드는 표 7에 제공된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표 7에 제공된 펩티드 서열은 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합하거나 이에 결합할 것으로 예측되고, 대립유전자는 펩티드 서열 옆에 있는 표 7의 상응하는 컬럼에 제공된다.
일부 실시양태에서, RAS G12R 돌연변이를 포함하는 펩티드는 하기 서열을 포함한다: MTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL. 일부 실시양태에서, RAS G12R 돌연변이를 포함하는 펩티드는 표 8에 제공된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표 8에 제공된 펩티드 서열은 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합하거나 이에 결합할 것으로 예측되고, 대립유전자는 펩티드 서열 옆에 있는 표 8의 상응하는 컬럼에 제공된다.
일부 실시양태에서, RAS G12S 돌연변이를 포함하는 펩티드는 하기 서열을 포함한다: MTEYKLVVVGASGVGKSALTIQL. 일부 실시양태에서, RAS G12S 돌연변이를 포함하는 펩티드는 표 9에 제공된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표 9에 제공된 펩티드 서열은 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합하거나 이에 결합할 것으로 예측되고, 대립유전자는 펩티드 서열 옆에 있는 표 9의 상응하는 컬럼에 제공된다.
일부 실시양태에서, RAS G12V 돌연변이를 포함하는 펩티드는 하기 서열을 포함한다: MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL. 일부 실시양태에서, RAS G12V 돌연변이를 포함하는 펩티드는 표 10에 제공된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표 10에 제공된 펩티드 서열은 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합하거나 이에 결합할 것으로 예측되고, 대립유전자는 펩티드 서열 옆에 있는 표 10의 상응하는 컬럼에 제공된다.
일부 실시양태에서, RAS G13C 돌연변이를 포함하는 펩티드는 하기 서열을 포함한다: MTEYKLVVVGAGCVGKSALTIQL. 일부 실시양태에서, RAS G13C 돌연변이를 포함하는 펩티드는 표 11에 제공된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표 11에 제공된 펩티드 서열은 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합하거나 이에 결합할 것으로 예측되고, 대립유전자는 펩티드 서열 옆에 있는 표 11의 상응하는 컬럼에 제공된다.
일부 실시양태에서, RAS G13D 돌연변이를 포함하는 펩티드는 하기 서열을 포함한다: MTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQL. 일부 실시양태에서, RAS G13D 돌연변이를 포함하는 펩티드는 표 12에 제공된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표 12에 제공된 펩티드 서열은 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합하거나 이에 결합할 것으로 예측되고, 대립유전자는 펩티드 서열 옆에 있는 표 12의 상응하는 컬럼에 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 RAS 에피토프를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 RAS 에피토프가 아니다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 하기를 포함하지 않는다: 
.
일부 실시양태에서, 항원, 신생항원 펩티드, 또는 에피토프를 포함하는 폴리펩티드는 GATA3 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, GATA3 에피토프는 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 
.
펩티드 변형
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 변형된 펩티드를 포함한다. 변형은 항원성 펩티드 자체의 1차 아미노산 서열을 변경하지 않는 공유 화학적 변형을 포함할 수 있다. 변형은 원하는 특성, 예컨대 생체내 반감기 연장, 안정성 증가, 제거 감소, 면역원성 또는 알레르기 유발성 변경, 특정 항체 증가, 세포 표적화, 항원 흡수, 항원 프로세싱, HLA 친화성, HLA 안정성 또는 항원 제시를 갖는 펩티드를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드는, 예컨대 면역 반응의 생성을 위해 APC에 의한 에피토프의 프로세싱 및 제시를 향상시키는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 원하는 속성을 제공하도록 변형될 수 있다. 예컨대, 세포독성 T 림프구(CTL) 활성을 유도하는 펩티드의 능력은 T 헬퍼 세포 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 에피토프를 함유하는 서열에 대한 연결에 의해 향상될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역원성 펩티드/T 헬퍼 접합체는 스페이서 분자에 의해 연결된다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 생리학적 조건 하에 실질적으로 비하전된 아미노산 또는 아미노산 모방체와 같은 비교적 작은 중성 분자를 포함한다. 스페이서는, 예컨대 Ala, Gly, 또는 비극성 아미노산 또는 중성 극성 아미노산의 다른 중성 스페이서로부터 선택될 수 있다. 임의로 존재하는 스페이서는 동일한 잔기로 구성될 필요가 없고 따라서 헤테로- 또는 호모-올리고머일 수 있다는 것이 이해될 것이다. 신생항원 펩티드는 펩티드의 아미노 또는 카르복시 말단에서 직접적으로 또는 스페이서를 통해 T 헬퍼 펩티드에 연결될 수 있다. 신생항원 펩티드 또는 T 헬퍼 펩티드의 아미노 말단은 아실화될 수 있다. T 헬퍼 펩티드의 예는 파상풍 톡소이드 잔기 830-843, 인플루엔자 잔기 307-319, 및 말라리아 포자소체 잔기 382-398 및 잔기 378-389를 포함한다.
본 개시내용의 펩티드 서열은 특히 원하는 아미노산으로 번역될 코돈이 생성되도록 미리 선택된 염기에서 펩티드를 코딩하는 DNA를 돌연변이시킴으로써 DNA 수준에서의 변화를 통해 임의로 변경될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드는 생성된 펩티드의 물리적 특성(예컨대, 안정성 또는 용해도)을 변형시키는 치환을 함유할 수 있다. 예컨대, 펩티드는 시스테인(C)을 α-아미노 부티르산("B")으로 치환함으로써 변형될 수 있다. 화학적 특성으로 인해, 시스테인은 디설파이드 브릿지를 형성하고, 펩티드를 구조적으로 충분히 변형시켜 결합 능력을 감소시키는 경향이 있다. C를 α-아미노 부티르산으로 대체하면 이 문제가 완화될 뿐만 아니라 일부 경우에서 실제로 결합 및 교차 결합 능력이 개선된다. 시스테인의 α-아미노 부티르산으로의 치환은 신생항원 펩티드의 임의의 잔기, 예컨대 펩티드 내의 에피토프 또는 유사체의 앵커 또는 비-앵커 위치, 또는 펩티드의 다른 위치에서 발생할 수 있다.
펩티드는 또한, 예컨대 아미노산의 추가 또는 결실에 의해 화합물의 아미노산 서열을 연장 또는 감소시킴으로써 변형될 수 있다. 펩티드 또는 유사체는 또한 특정 잔기의 순서 또는 조성을 변경함으로써 변형될 수 있다. 생물학적 활성에 필수적인 특정 아미노산 잔기, 예컨대 중요한 접촉 부위에서의 잔기 또는 보존된 잔기는 일반적으로 생물학적 활성에 대한 역효과 없이 변경되지 않을 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 비-중요 아미노산은 L-α-아미노산 또는 D-이성질체와 같이 단백질에서 자연적으로 발생하는 것으로 제한될 필요는 없지만, 비-천연 아미노산, 예컨대 β-γ-α 아미노산 뿐만 아니라 L-α-아미노산의 많은 유도체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 펩티드는 HLA 결합에 대한 정전기 전하, 소수성 등의 효과를 결정하기 위해 단일 아미노산 치환을 갖는 일련의 펩티드를 사용하여 변형될 수 있다. 예컨대, 일련의 양으로 하전된(예컨대, Lys 또는 Arg) 또는 음으로 하전된(예컨대, Glu) 아미노산 치환이 펩티드의 길이를 따라 만들어질 수 있으며, 이는 다양한 HLA 분자 및 T 세포 수용체에 대한 민감성의 상이한 패턴을 드러낸다. 또한, Ala, Gly, Pro 또는 유사한 잔기와 같은 작고 비교적 중성인 모이어티를 사용하는 다수의 치환이 사용될 수 있다. 치환은 호모-올리고머 또는 헤테로-올리고머일 수 있다. 치환되거나 추가되는 잔기의 수 및 유형은 필수 접촉 포인트와 특정 기능적 속성(예컨대, 소수성 대 친수성) 사이에 필요한 간격에 따라 다르다. HLA 분자 또는 T 세포 수용체에 대한 증가된 결합 친화도는 또한 모 펩티드의 친화도와 비교하여 이러한 치환에 의해 달성될 수 있다. 여하튼, 이러한 치환은, 예컨대 결합을 방해할 수 있는 입체 및 전하 간섭을 피하기 위해 선택되는 아미노산 잔기 또는 다른 분자 단편을 사용해야 한다. 아미노산 치환은 전형적으로 단일 잔기의 것이다. 치환, 결실, 삽입, 또는 이들의 임의의 조합은 최종 펩티드에 도달하도록 조합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드는 아미노산 모방체 또는 비-천연 아미노산 잔기, 예컨대 D- 또는 L-나프틸알라닌; D- 또는 L-페닐글리신; D- 또는 L-2-티에닐알라닌; D- 또는 L-1, -2, 3-, 또는 4-피레네일알라닌; D- 또는 L-3 티에닐알라닌; D- 또는 L-(2-피리디닐)-알라닌; D- 또는 L-(3-피리디닐)-알라닌; D- 또는 L-(2-피라지닐)-알라닌; D- 또는 L-(4-이소프로필)-페닐글리신; D-(트리플루오로메틸)-페닐글리신; D-(트리플루오로-메틸)-페닐알라닌; D-ρ-플루오로페닐알라닌; D- 또는 L-ρ-비페닐-페닐알라닌; D- 또는 L-ρ-메톡시비페닐페닐알라닌; D- 또는 L-2-인돌(알릴)알라닌; 및 D- 또는 L-알킬알라닌을 포함할 수 있고, 알킬기는 치환 또는 비치환된 메틸, 에틸, 프로필, 헥실, 부틸, 펜틸, 이소프로필, 이소-부틸, sec-이소틸, 이소-펜틸, 또는 비-산성 아미노산 잔기일 수 있다. 비-천연 아미노산의 방향족 고리는, 예컨대 티아졸릴, 티오페닐, 피라졸릴, 벤즈이미다졸릴, 나프틸, 푸라닐, 피롤릴, 및 피리딜 방향족 고리를 포함한다. 다양한 아미노산 모방체 또는 비-천연 아미노산 잔기를 갖는 변형된 펩티드는 생체내에서 증가된 안정성을 가질 수 있다. 이러한 펩티드는 또한 개선된 저장 수명 또는 제조 특성을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드는 말단-NH2 아실화, 예컨대 알카노일(C1-C20) 또는 티오글리콜릴 아세틸화, 말단-카르복실 아미드화, 예컨대 암모니아, 메틸아민 등에 의해 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들 변형은 지지체 또는 다른 분자에 연결하기 위한 부위를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드는 글리코실화, 측쇄 산화, 비오티닐화, 인산화, 표면 활성 물질, 예컨대 지질의 첨가와 같은 변형을 함유할 수 있지만 이에 제한되지는 않거나, 예컨대 아세틸화 등과 같이 화학적으로 변형될 수 있다. 또한, 펩티드의 결합은 펩티드 결합 이외의 것일 수 있으며, 예컨대 공유 결합, 에스테르 또는 에테르 결합, 디설파이드 결합, 수소 결합, 이온 결합 등이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드는 당업계에 널리 공지된 것과 같은 캐리어, 예컨대 티로글로불린, 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민, 파상풍 톡소이드, 폴리아미노산 잔기, 예컨대 폴리 L-리신 및 폴리 L-글루탐산, 인플루엔자 바이러스 단백질, B형 간염 바이러스 코어 단백질 등을 포함할 수 있다.
펩티드는 일반적으로 단백질의 일부가 아닌 추가적인 화학적 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 이러한 유도체화된 모이어티는 용해도, 생물학적 반감기, 단백질의 흡수 또는 결합 친화도를 개선할 수 있다. 모이어티는 또한 펩티드 등의 임의의 바람직한 부작용을 감소 또는 제거할 수 있다. 이들 모이어티에 대한 개요는 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000))에서 찾을 수 있다. 예컨대, 원하는 활성을 갖는 신생항원 펩티드는 특정한 원하는 속성, 예컨대 개선된 약리학적 특성을 제공하기 위해 필요에 따라 변형될 수 있으며, 동시에 원하는 HLA 분자에 결합하고 적절한 T 세포를 활성화시키기 위해 비변형된 펩티드의 모든 생물학적 활성을 실질질적으로 증가시키거나 적어도 보유한다. 예컨대, 펩티드는 보존적 또는 비-보존적 치환과 같은 다양한 변화를 받을 수 있으며, 이러한 변화는 개선된 HLA 결합과 같은 사용상의 특정 이점을 제공할 수 있다. 이러한 보존적 치환은 아미노산 잔기를 생물학적 및/또는 화학적으로 유사한 또 다른 아미노산 잔기, 예컨대 소수성 잔기를 또 다른 것으로, 극성 잔기를 또 다른 것으로 대체하는 것을 포괄할 수 있다. 단일 아미노산 치환의 효과는 또한 D-아미노산을 사용하여 조사될 수 있다. 이러한 변형은, 예컨대 문헌(Merrifield, Science 232:341-347 (1986), Barany & Merrifield, The Peptides, Gross & Meienhofer, eds. (N.Y., Academic Press), pp. 1-284 (1979); 및 Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, III., Pierce), 2d Ed. (1984))에 기재된 바와 같이 널리 공지된 펩티드 합성 절차를 이용하여 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드는 크고 느리게 대사되는 마크로분자, 예컨대 단백질; 세파로스, 아가로스, 셀룰로스, 셀룰로스 비드와 같은 다당류; 폴리글루탐산, 폴리리신과 같은 폴리머 아미노산; 아미노산 코폴리머; 불활성화된 바이러스 입자; 디프테리아, 파상풍, 콜레라, 류코톡신 분자로부터의 톡소이드와 같은 불활성화된 박테리아 독소; 불활성화된 박테리아; 및 수지상 세포에 접합될 수 있다.
펩티드에 대한 변화는 캐리어 단백질에 대한 접합, 리간드에 대한 접합, 항체에 대한 접합, PEG화, 폴리시알릴화 HES화(HESylation), 재조합 PEG 모방체, Fc 융합, 알부민 융합, 나노입자 부착, 나노미립자 캡슐화, 콜레스테롤 융합, 철 융합, 아실화, 아미드화, 글리코실화, 측쇄 산화, 인산화, 비오틴화, 표면 활성 물질의 첨가, 아미노산 모방체의 첨가, 또는 비-천연 아미노산의 첨가를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
글리코실화는 단백질의 물리적 특성에 영향을 미칠 수 있으며, 또한 단백질 안정성, 분비 및 세포하 국소화에 중요할 수 있다. 적절한 글리코실화는 생물학적 활성에 중요할 수 있다. 사실, 진핵 생물로부터의 일부 유전자는 단백질을 글리코실화하는 세포 과정이 없는 박테리아(예컨대, 이. 콜라이(E. coli))에서 발현될 때 글리코실화가 없기 때문에 활성이 거의 또는 전혀 없이 회수되는 단백질을 산출한다. 글리코실화 부위의 추가는 아미노산 서열을 변경함으로써 달성될 수 있다. 펩티드 또는 단백질에 대한 변경은, 예컨대 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기(O-연결된 글리코실화 부위의 경우) 또는 아스파라긴 잔기(N-연결된 글리코실화 부위의 경우)의 추가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다. N--연결 및 O-연결 올리고당류의 구조 및 각각의 유형에서 발견되는 슈가 잔기는 상이할 수 있다. 둘 다에서 일반적으로 발견되는 슈가의 하나의 유형은 O-아세틸뉴라민산(이하 시알산으로 지칭됨)이다. 시알산은 일반적으로 N--연결 및 O-연결 올리고당류의 말단 잔기이며, 음전하로 인해 당단백질에 산성 특성을 부여할 수 있다. 본 개시내용의 실시양태는 O-글리코실화 변이체의 생성 및 사용을 포함한다. 탄수화물의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로, 또는 글리코실화된 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 치환에 의해 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 공지되어 있고, 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제를 사용하여 달성될 수 있다.
접합을 위한 추가의 적합한 성분 및 분자는, 예컨대 림프계로의 표적화를 위한 분자, 티로글로불린; 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민(HAS); 파상풍 톡소이드; 디프테리아 톡소이드; 폴리아미노산, 예컨대 폴리(D-리신:D-글루탐산); 로타바이러스의 VP6 폴리펩티드; 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌, 인플루엔자 바이러스 핵단백질; 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH); 및 B형 간염 바이러스 코어 단백질 및 표면 항원; 또는 전술된 것의 임의의 조합을 포함한다.
또 다른 유형의 변형은 폴리펩티드 서열의 N- 및/또는 C-말단에 하나 이상의 추가의 성분, 예컨대 또 다른 단백질(예컨대, 해당 단백질에 이종성인 아미노산 서열을 갖는 단백질), 또는 담체 분자를 접합(예컨대, 연결)하는 것이다. 따라서, 예시적인 폴리펩티드 서열은 또 다른 성분 또는 분자와의 접합체로서 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 펩티드 또는 단백질에 대한 알부민의 융합은, 예컨대 HSA를 코딩하는 DNA 또는 이의 단편이 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA에 연결되도록 유전자 조작에 의해 달성될 수 있다. 그 후, 적합한 숙주는 융합 폴리펩티드를 발현하기 위해, 예컨대 적합한 플라스미드 형태의 융합 뉴클레오티드 서열로 형질전환 또는 형질감염될 수 있다. 발현은, 예컨대 원핵 또는 진핵 세포로부터 시험관내에서, 또는 예컨대 트랜스제닉 유기체로부터 생체내에서 수행될 수 있다. 본 개시내용의 일부 실시양태에서, 융합 단백질의 발현은 포유동물 세포주, 예컨대 CHO 세포주에서 수행된다. 또한, 알부민 자체가 순환 반감기를 연장하도록 변형될 수 있다. 변형된 알부민과 하나 이상의 폴리펩티드의 융합은 상기 기재된 유전자 조작 기술 또는 화학적 접합에 의해 달성될 수 있으며; 생성된 융합 분자는 비-변형된 알부민과의 융합의 반감기를 초과하는 반감기를 갖는다(예컨대, WO2011/051489 참조). 접합된 지방산 쇄(아실화)를 통한 알부민 결합을 포함하여 직접 융합을 위한 대안으로 여러 알부민 결합 전략이 개발되었다. 혈청 알부민은 지방산에 대한 수송 단백질이기 때문에, 알부민 결합 활성을 갖는 이러한 천연 리간드는 작은 단백질 치료제의 반감기 연장에 사용되어 왔다.
접합을 위한 추가의 후보 성분 및 분자는 단리 또는 정제에 적합한 것들을 포함한다. 비제한적 예는 결합 분자, 예컨대 비오틴(비오틴-아비딘 특이적 결합 쌍), 항체, 수용체, 리간드, 렉틴, 또는 예컨대 플라스틱 또는 폴리스티렌 비드, 플레이트 또는 비드, 자기 비드, 시험 스트립 및 막를 포함하는 고체 지지체를 포함하는 분자를 포함한다. 양이온 교환 크로마토그래피와 같은 정제 방법은 접합체를 다양한 분자량으로 효과적으로 분리하는 전하 차이에 의해 접합체를 분리하는 데 이용될 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 수득되는 분획의 함량은 통상적인 방법, 예컨대 질량 분광법, SDS-PAGE 또는 분자량에 의해 분자를 분리하는 다른 공지된 방법을 이용하여 분자량에 의해 확인될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 펩티드 또는 단백질 서열의 아미노- 또는 카르복실-말단은 면역글로불린 Fc 영역(예컨대, 인간 Fc)과 융합되어 융합 접합체 (또는 융합 분자)를 형성할 수 있다. Fc 융합 접합체는 바이오의약품의 전신 반감기를 증가시키는 것으로 나타났으며, 따라서 바이오의약품은 덜 빈번한 투여를 요구할 수 있다. Fc는 혈관을 따라 늘어선 내피세포의 신생 Fc 수용체(FcRn)에 결합하고, 결합 시, Fc 융합 분자는 분해로부터 보호되어 순환계로 재방출되어 분자를 더 오랫동안 순환 상태로 유지한다. 이 Fc 결합은 내인성 IgG가 긴 혈장 반감기를 유지하는 메카니즘으로 여겨진다. 보다 최근의 Fc-융합 기술은 바이오의약품의 단일 카피를 항체의 Fc 영역에 연결하여 기존의 Fc-융합 접합체와 비교하여 바이오의약품의 약동학 및 약력학 특성을 최적화한다.
본 개시내용은 하나 이상의 특성을 개선하기 위해 현재 공지되어 있거나 개발 중인 펩티드의 다른 변형의 사용을 고려한다. 순환 반감기를 연장하거나, 안정성을 증가시키거나, 제거를 감소시키거나, 본 개시내용의 펩티드의 면역원성 또는 알레르기성을 변경하기 위한 이러한 방법 중 하나는 분자의 특성을 변형하기 위해 다른 분자에 연결된 히드록시에틸 전분 유도체를 사용하는 헤실화(hesylation)에 의한 펩티드 서열의 변형을 수반한다. 헤실화의 다양한 측면은, 예컨대 미국 특허 출원 번호 2007/0134197 및 2006/0258607에 기재되어 있다.
펩티드 안정성은 다양한 방식으로 검정될 수 있다. 예컨대, 펩티다제 및 인간 혈장 및 혈청과 같은 다양한 생물학적 배지를 사용하여 안정성을 시험하였다. 예컨대, 문헌(Verhoef, et al., Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinetics 11:291 (1986))을 참조한다. 본원에 기재된 펩티드의 반감기는 25% 인간 혈청(v/v) 검정을 이용하여 편리하게 결정된다. 프로토콜은 하기와 같다: 풀링된 인간 혈청(AB형, 비-열 불활성화)을 사용 전에 원심분리에 의해 황폐화시킨다. 이어서, 혈청을 RPMI-1640 또는 또 다른 적절한 조직 배양 배지로 25%로 희석한다. 미리 결정된 시간 간격으로, 소량의 반응 용액을 꺼내고, 6% 수성 트리클로로아세트산(TCA) 또는 에탄올에 첨가한다. 탁한 반응 샘플을 15분 동안 냉각시킨 다음(4℃), 회전시켜 침전된 혈청 단백질을 펠릿화한다. 이어서, 펩티드의 존재를 안정성 특이적 크로마토그래피 조건을 이용하여 역상 HPLC에 의해 결정한다.
짧은 혈장 반감기 또는 프로테아제 분해에 대한 감수성과 관련된 문제는(예컨대, 전형적으로 단백질 및 비-단백질성 폴리머 둘 다에 공유 결합된 연결 모이어티, 예컨대 PEG를 통해) 펩티드 또는 단백질 서열을 다양한 비-단백질성 폴리머, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌에 접합 또는 연결하는 것을 포함하는 다양한 변형에 의해 극복될 수 있다. 이러한 PEG 접합된 생체분자는 더 나은 물리적 및 열적 안정성, 효소 분해에 대한 감수성에 대한 보호, 증가된 용해도, 더 긴 생체내 순환 반감기 및 감소된 제거율, 감소된 면역원성 및 항원성, 감소된 독성을 포함하는 임상적으로 유용한 특성을 갖는 것으로 나타났다.
폴리펩티드 또는 단백질 서열에 접합하기에 적합한 PEG는 일반적으로 실온에서 물에 용해되며, 일반식 R-(O-CH2-CH2)n-O-을 가지며, R은 수소 또는 알킬 또는 알칸올과 같은 보호기이고, n은 1 내지 1000의 정수이다. R이 보호기인 경우, 이는 일반적으로 1 내지 8개의 탄소를 갖는다. 폴리펩티드 서열에 접합된 PEG는 선형 또는 분지형일 수 있다. 분지형 PEG 유도체, "star-PEG" 및 다중-아암 PEG가 본 개시내용에 의해 고려된다. 본 개시내용은 또한 PEG가 상이한 n 값을 갖고 이에 따라 다양한 상이한 PEG가 특정 비율로 존재하는 접합체의 조성물을 고려한다. 예컨대, 일부 조성물은 n = 1, 2, 3 및 4인 접합체의 혼합물을 포함한다. 일부 조성물에서, n=1인 접합체의 백분율은 18-25%이고, n=2인 경우 접합체의 백분율은 50-66%이고, n=3인 접합체의 백분율은 12-16%이고, n=4인 접합체의 백분율은 최대 5%이다. 이러한 조성물은 당업계에 공지된 반응 조건 및 정제 방법에 의해 생성될 수 있다. 예컨대, 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 접합체를 분리한 다음, 예컨대 원하는 수의 PEG가 부착되고, 변형되지 않은 단백질 서열 및 다른 수의 PEG가 부착된 접합체가 없는 정제된 접합체를 함유하는 분획을 확인한다.
PEG는 말단 반응기("스페이서")를 통해 본 개시내용의 펩티드 또는 단백질에 결합될 수 있다. 스페이서는, 예컨대 하나 이상의 폴리펩티드 서열의 유리 아미노 또는 카르복실기와 PEG 사이의 결합을 매개하는 말단 반응기이다. 유리 아미노기에 결합될 수 있는 스페이서를 갖는 PEG는 PEG의 숙신산 에스테르를 N-히드록시숙신이미드로 활성화시켜 제조될 수 있는 N-히드록시숙신이미드 PEG를 포함한다. 유리 아미노기에 결합될 수 있는 또 다른 활성화된 PEG는 PEG 모노메틸 에테르를 염화시아누르와 반응시켜 제조될 수 있는 2,4-비스(O-메톡시폴리에틸렌글리콜)-6-클로로-s-트리아진이다. 유리 카르복실기에 결합된 활성화된 PEG는 폴리옥시에틸렌디아민을 포함한다.
스페이서를 갖는 PEG에 본 개시내용의 펩티드 또는 단백질 서열 중 하나 이상을 접합하는 것은 다양한 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 예컨대, 접합 반응은 pH 5 내지 10, 온도 4℃ 내지 실온에서 30분 내지 20시간 동안 용액에서 4:1 내지 30:1의 시약 대 펩티드/단백질의 몰비를 이용하여 수행될 수 있다. 반응 조건은 원하는 치환도를 우세하게 생성하도록 반응을 지시하도록 선택될 수 있다. 일반적으로 저온, 낮은 pH(예컨대, pH=5) 및 짧은 반응 시간은 부착된 PEG의 수를 감소시키는 경향이 있는 반면, 고온, 중성 내지 높은 pH(예컨대, pH>7) 및 긴 반응 시간은 부착된 PEG의 수를 증가시키는 경향이 있다. 당업계에 공지된 다양한 수단을 사용하여 반응을 종결시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 반응은 반응 혼합물을 산성화하고, 예컨대 -20℃에서 동결함으로써 종결된다.
신생에피토프
신생에피토프는 면역계에 의해 인식되는 신생항원 펩티드 또는 신생항원 폴리펩티드의 신생항원 결정인자 부분을 포함한다. 신생에피토프는 병들지 않은 세포, 예컨대 비-암성 세포 또는 배선 세포와 같은 참조에는 존재하지 않지만, 병든 세포, 예컨대 암세포에서 발견되는 에피토프를 지칭한다. 이는 상응하는 에피토프가 정상의 병들지 않은 세포 또는 배선 세포에서는 발견되지만, 암세포와 같은 병든 세포에서는 하나 이상의 돌연변이로 인해 에피토프의 서열이 신생에피토프를 초래하도록 변경되는 상황을 포함한다. 용어 "신생에피토프"는 본 명세서에서 "종양 특이적 에피토프" 또는 "종양 특이적 신생에피토프"와 상호교환적으로 사용되어 전형적으로 인접한 아미노산의 α-아미노기와 카르복실기 사이의 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 일련의 잔기, 전형적으로 L-아미노산을 지정한다. 신생에피토프는, 중성(비하전된) 형태 또는 염 형태이고, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드의 생물학적 활성을 파괴하지 않는 조건에 따라 글리코실화, 측쇄 산화 또는 인산화와 같은 변형이 없거나 이러한 변형을 함유하는, 다양한 길이일 수 있다. 본 개시내용은 표 1 내지 12로부터의 종양 특이적 돌연변이를 포함하는 단리된 신생에피토프를 제공한다.
일부 실시양태에서, MHC 클래스 I HLA에 대해 본원에 기재된 신생에피토프는 12개 이하의 아미노산 잔기 길이이고, 일반적으로 약 8 내지 약 12개의 아미노산 잔기로 이루어진다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I HLA에 대해 본원에 기재된 신생에피토프는 약 8개, 약 9개, 약 10개, 약 11개, 또는 약 12개의 아미노산 잔기이다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 II HLA에 대해 본원에 기재된 신생에피토프는 25개 이하의 아미노산 잔기 길이이고, 일반적으로 약 9 내지 약 25개의 아미노산 잔기로 이루어진다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 II HLA에 대해 본원에 기재된 신생에피토프는 약 15, 약 16개, 약 17개, 약 18개, 약 19개, 약 20개, 약 21개, 약 22개, 약 23개, 약 24개, 또는 약 25개의 아미노산 잔기이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 단백질의 제1 신생에피토프를 포함하는 제1 펩티드 및 동일한 단백질의 제2 신생에피토프를 포함하는 제2 펩티드를 포함하고, 제1 펩티드는 제2 펩티드와 상이하고, 제1 펩티드는 신생에피토프는 돌연변이를 포함하고 제2 신생에피토프는 동일한 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 단백질의 제1 영역의 제1 신생에피토프를 포함하는 제1 펩티드 및 동일한 단백질의 제2 영역의 제2 신생에피토프를 포함하는 제2 펩티드를 포함하고, 제1 영역은 제2 영역의 적어도 하나의 아미노산을 포함하고, 제1 펩티드는 제2 펩티드와 상이하고, 제1 신생에피토프는 제1 돌연변이를 포함하고 제2 신생에피토프는 제2 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 돌연변이 및 제2 돌연변이는 동일하다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 포인트 돌연변이, 스플라이스 부위 돌연변이, 프레임쉬프트 돌연변이, 리드-쓰루 돌연변이, 유전자 융합 돌연변이, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 제1 신생에피토프는 클래스 I HLA 단백질에 결합하여 클래스 I HLA-펩티드 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 제2 신생에피토프는 클래스 II HLA a 단백질에 결합하여 클래스 II HLA-펩티드 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 제2 신생에피토프는 클래스 I HLA 단백질에 결합하여 클래스 I HLA-펩티드 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 제1 신생에피토프는 클래스 II HLA 단백질에 결합하여 클래스 II HLA-펩티드 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 제1 신생에피토프는 CD8+ T 세포를 활성화시킨다. 일부 실시양태에서, 제1 신생에피토프는 CD4+ T 세포를 활성화시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 신생에피토프는 CD4+ T 세포를 활성화시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 신생에피토프는 CD8+ T 세포를 활성화시킨다. 일부 실시양태에서, CD4+ T 세포의 TCR은 클래스 II HLA-펩티드 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8+ T 세포의 TCR은 클래스 II HLA-펩티드 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, CD8+ T 세포의 TCR은 클래스 I HLA-펩티드 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, CD4+ T 세포의 TCR은 클래스 I HLA-펩티드 복합체에 결합한다.
일부 실시양태에서, 제2 신생에피토프는 제1 신생에피토프보다 더 길다. 일부 실시양태에서, 제1 신생에피토프는 적어도 8개의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 신생에피토프는 8 내지 12개의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 신생에피토프는 적어도 8개의 인접 아미노산의 서열을 포함하고, 8개의 인접 아미노산 중 적어도 1개는 야생형 서열의 상응하는 위치에서 상이하다. 일부 실시양태에서, 제1 신생에피토프는 적어도 8개의 인접 아미노산의 서열을 포함하고, 8개의 인접 아미노산 중 적어도 2개는 야생형 서열의 상응하는 위치에서 상이하다. 일부 실시양태에서, 제2 신생에피토프는 적어도 16개의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제2 신생에피토프는 16 내지 25개의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제2 신생에피토프는 적어도 16개의 인접 아미노산의 서열을 포함하고, 16개의 인접 아미노산 중 적어도 1개는 야생형 서열의 상응하는 위치에서 상이하다. 일부 실시양태에서, 제2 신생에피토프는 적어도 16개의 인접 아미노산의 서열을 포함하고, 16개 인접 아미노산 중 적어도 2개는 야생형 서열의 상응하는 위치에서 상이하다.
일부 실시양태에서, 신생에피토프는 적어도 하나의 앵커 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 신생에피토프, 제2 신생에피토프 또는 둘 모두는 적어도 하나의 앵커 잔기를 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 신생에피토프의 적어도 하나의 앵커 잔기는 표준 앵커 위치 또는 비-표준 앵커 위치에 있다. 또 다른 실시양태에서, 제2 신생에피토프의 적어도 하나의 앵커 잔기는 표준 앵커 위치 또는 비-표준 앵커 위치에 있다. 또 다른 실시양태에서, 제1 신생에피토프의 적어도 하나의 앵커 잔기는 제2 신생에피토프의 적어도 하나의 앵커 잔기와 상이하다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 앵커 잔기는 야생형 잔기이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 앵커 잔기는 치환이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 앵커 잔기는 돌연변이를 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 제2 신생에피토프 또는 둘 모두는 적어도 하나의 앵커 잔기 플랭킹 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 신생에피토프는 적어도 하나의 앵커 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 앵커 잔기는 적어도 2개의 앵커 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 앵커 잔기는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 분리 영역에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 앵커 잔기 플랭킹 영역은 분리 영역 내에 있지 않다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 앵커 잔기 플랭킹 영역은 (a) 적어도 2개의 앵커 잔기의 N-말단 앵커 잔기의 상류; (b) 적어도 2개의 앵커 잔기의 C-말단 앵커 잔기의 하류; 또는 (a)와 (b) 모두에 있다.
일부 실시양태에서, 신생에피토프는 HLA 단백질(예컨대, MHC 클래스 I HLA 또는 MHC 클래스 II HLA)에 결합한다. 일부 실시양태에서, 신생에피토프는 상응하는 야생형 펩티드보다 더 큰 친화도로 HLA 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 신생에피토프는 5,000 nM 미만, 1,000 nM 미만, 500 nM 미만, 100 nM 미만, 50 nM 미만, 또는 그 미만의 IC50을 갖는다. 일부 실시양태에서, 신생에피토프는 약 1 pM 내지 약 1 mM, 약 100 pM 내지 약 500 μM, 약 500 pM 내지 약 10 μM, 약 1 nM 내지 약 1 μM, 또는 약 10 nM 내지 약 1 μM의 HLA 결합 친화도를 가질 수 있다. 신생에피토프는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,500, 또는 2,000 nM, 또는 그 초과의 HLA 결합 친화도를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 신생에피토프는 최대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,500, 또는 2,000 nM의 HLA 결합 친화도를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 신생에피토프는 상응하는 야생형 신생에피토프보다 더 큰 친화도로 HLA 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 신생에피토프는 1,000 nM, 900 nM, 800 nM, 700 nM, 600 nM, 500 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 또는 10 nM 미만의 KD 또는 IC50으로 HLA 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 신생에피토프는 1,000 nM, 900 nM, 800 nM, 700 nM, 600 nM, 500 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 또는 10 nM 미만의 KD 또는 IC50으로 HLA 클래스 I 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 신생에피토프는 2,000 nM, 1,500 nM, 1,000 nM, 900 nM, 800 nM, 700 nM, 600 nM, 500 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 또는 10 nM 미만의 KD 또는 IC50으로 HLA 클래스 II 단백질에 결합한다.
일부 실시양태에서, 신생에피토프는 MHC 클래스 I HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 신생에피토프는 0.1 nM 내지 2000 nM의 친화도로 MHC 클래스 I HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 신생에피토프는 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 nM의 친화도로 MHC 클래스 I HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 신생에피토프는 MHC 클래스 II HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 신생에피토프는 0.1 nM 내지 2000 nM, 1 nM 내지 1000 nM, 10 nM 내지 500 nM, 또는 1000 nM 미만의 친화도로 MHC 클래스 II HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 신생에피토프는 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 nM의 친화도로 MHC 클래스 II HLA에 결합한다.
일부 실시양태에서, 신생에피토프는 10분 내지 24시간의 안정성으로 MHC 클래스 I HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 신생에피토프는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60분의 안정성으로 MHC 클래스 I HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 신생에피토프는 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24시간의 안정성으로 MHC 클래스 I HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 신생에피토프는 10분 내지 24시간의 안정성으로 MHC 클래스 II HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 신생에피토프는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60분의 안정성으로 MHC 클래스 II HLA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 신생에피토프는 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24시간의 안정성으로 MHC 클래스 II HLA에 결합한다.
한 측면에서, 제1 및/또는 제2 신생에피토프는 대상체에 의해 발현되는 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합한다. 또 다른 측면에서, 돌연변이는 대상체의 비-암세포에 존재하지 않는다. 또 다른 측면에서, 제1 및/또는 제2 신생에피토프는 대상체의 암세포의 유전자 또는 발현된 유전자에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 제1 신생에피토프는 표 1 내지 12의 컬럼 1에 나타낸 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 신생에피토프는 표 1 내지 12의 컬럼 1에 나타낸 돌연변이를 포함한다. 예컨대, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 서열 ALNSEALSVV를 포함할 수 있다. 예컨대, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 MALNSEALSV 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 KRAS 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 NRAS 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 G12C, G12D, G12V, Q61H, 또는 Q61L 치환의 돌연변이를 포함하는 KRAS 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 Q61K 또는 Q61R 치환의 돌연변이를 포함하는 NRAS 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 신생에피토프는 치환 돌연변이, 예컨대 KRAS G12C, G12D, G12V, Q61H, 또는 Q61L 돌연변이, 또는 NRAS Q61K 또는 Q61R 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 
의 KRAS 또는 NRAS 단백질 서열로부터 유래된다. 예컨대, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 서열 KLVVVGACGV를 포함할 수 있다. 예컨대, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 서열 LVVVGACGV를 포함할 수 있다. 예컨대, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 서열 VVGACGVGK를 포함할 수 있다. 예컨대, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 서열 VVVGACGVGK를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 
의 KRAS 또는 NRAS 단백질 서열로부터 유래된다. 예컨대, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 서열 VVVGADGVGK를 포함할 수 있다. 예컨대, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 서열 KLVVVGADGV를 포함할 수 있다. 예컨대, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 서열 LVVVGADGV를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는
의 KRAS 또는 NRAS 단백질 서열로부터 유래된다. 예컨대, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 서열 KLVVVGAVGV를 포함할 수 있다. 예컨대, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 서열 LVVVGAVGV를 포함할 수 있다. 예컨대, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 서열 VVGAVGVGK를 포함할 수 있다. 예컨대, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 서열 VVVGAVGVGK를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 
의 KRAS 또는 NRAS 단백질 서열로부터 유래된다. 예컨대, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 서열 ILDTAGHEEY를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 
의 KRAS 또는 NRAS 단백질 서열로부터 유래된다. 예컨대, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 서열 ILDTAGLEEY를 포함할 수 있다. 예컨대, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 서열 LLDILDTAGL을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 
의 KRAS 또는 NRAS 단백질 서열로부터 유래된다. 예컨대, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 서열 ILDTAGKEEY를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 
의 KRAS 또는 NRAS 단백질 서열로부터 유래된다. 예컨대, 제1 신생에피토프 및 제2 신생에피토프는 서열 ILDTAGREEY를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 신생에피토프는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다: 
.
일부 실시양태에서, 신생에피토프는 RAS 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 신생에피토프는 G12, G13 또는 Q61에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 RAS 단백질의 적어도 8개의 인접 아미노산 및 G12, G13 또는 Q61에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 RAS 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, G12, G13, 또는 Q61에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 RAS 단백질의 적어도 8개의 인접 아미노산은 G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V, Q61H, Q61L, Q61K, 또는 Q61R 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, G12, G13, 또는 Q61에서의 돌연변이는 G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V, Q61H, Q61L, Q61K, 또는 Q61R 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 돌연변이 RAS 서열을 포함하는 신생에피토프는 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 
.
일부 실시양태에서, 돌연변이 RAS 서열을 포함하는 신생에피토프는 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이 RAS 서열을 포함하는 신생에피토프는 10 μM 미만, 9 μM 미만, 8 μM 미만, 7 μM 미만, 6 μM 미만, 5 μM 미만, 4 μM 미만, 3 μM 미만, 2 μM 미만, 1 μM 미만, 950 nM 미만, 900 nM 미만, 850 nM 미만, 800 nM 미만, 750 nM 미만, 600 nM 미만, 550 nM 미만, 500 nM 미만, 450 nM 미만, 400 nM 미만, 350 nM 미만, 300 nM 미만, 250 nM 미만, 200 nM 미만, 150 nM 미만, 100 nM 미만, 90 nM 미만, 80 nM 미만, 70 nM 미만, 60 nM 미만, 50 nM 미만, 40 nM 미만, 30 nM 미만, 20 nM, 또는 10 nM 미만의 친화도로 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이 RAS 서열을 포함하는 신생에피토프는 24시간 초과, 23시간 초과, 22시간 초과, 21시간 초과, 20시간 초과, 19시간 초과, 18시간 초과, 17시간 초과, 16시간 초과, 15시간 초과, 14시간 초과, 13시간 초과, 12시간 초과, 11시간 초과, 10시간 초과, 9시간 초과, 8시간 초과, 7시간 초과, 6시간 초과, 5시간 초과, 4시간 초과, 3시간 초과, 2시간 초과, 1시간 초과, 55분 초과, 50분 초과, 45분 초과, 40분 초과, 35분 초과, 30분 초과, 25분 초과, 20분 초과, 15분 초과, 10분 초과, 9분 초과, 8분 초과, 7분 초과, 6분 초과, 5분 초과, 4분 초과, 3분 초과, 2분, 또는 1분 초과의 안정성으로 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합한다.
치환은 신생에피토프의 길이를 따라 어디든지 위치될 수 있다. 예컨대, 펩티드의 N-말단 1/3, 펩티드의 중앙 1/3 또는 펩티드의 C-말단 1/3에 위치될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 치환된 잔기는 N-말단 끝으로부터 2-5개 잔기가 떨어져 위치되거나 C-말단 끝으로부터 2-5개 잔기가 떨어져 위치된다. 펩티드는 펩티드가 삽입된 잔기의 하나 이상 또는 모두를 포함하는 종양 특이적 삽입 돌연변이로부터 유사하게 유래될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드는 오염 박테리아 또는 동물 물질이 없는 시약을 활용하여 화학적으로 용이하게 합성될 수 있다(Merrifield RB: Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc.85:2149-54, 1963). 일부 실시양태에서, 펩티드는 (1) 균일한 합성 및 절단 조건을 사용하여 다중 채널 기기에서 병렬 고체상 합성; (2) 컬럼 스트리핑을 갖는 RP-HPLC 컬럼을 통한 정제; 및 펩티드 간의 재세척(교체는 아님); 이어서 (3) 가장 유익한 검정의 제한된 세트를 사용한 분석에 의해 제조된다. 우수 제조 관리기준(GMP) 풋프린트는 개별 환자에 대한 펩티드 세트를 중심으로 정의될 수 있으므로 상이한 환자에 대한 펩티드 합성 간에만 스위트(suite_ 전환 절차가 필요하다. 일부 실시양태에서, 고체상 펩티드 합성을 위해 제조된 임의의 수지가 사용될 수 있다.
폴리뉴클레오티드
대안적으로, 본 개시내용의 펩티드를 코딩하는 핵산(예컨대, 폴리뉴클레오티드)은 시험관내에서 신생항원 펩티드를 생성하는 데 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 DNA, cDNA, RNA, 단일- 및/또는 이중-가닥, 또는 천연 또는 안정화된 형태의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 포스포로티에이트 백본을 갖는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합일 수 있으며, 이는 펩티드를 코딩하는 한 인트론을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서 시험관내 번역을 이용하여 펩티드를 생성한다.
본 개시내용에 기재된 각각의 신생항원 폴리펩티드를 코딩하는 신생항원 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다. 용어 "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 본 교시내용에서 "돌연변이 폴리뉴클레오티드", "돌연변이 뉴클레오티드", "돌연변이 핵산", "신생항원 폴리뉴클레오티드", "신생항원 뉴클레오티드" 또는 "신생항원 돌연변이 핵산"과 상호교환적으로 사용된다. 다양한 핵산 서열은 유전자 코드의 중복성으로 인해 동일한 펩티드를 코딩할 수 있다. 이들 핵산 각각은 본 개시내용의 범위에 속한다. 펩티드를 코딩하는 핵산은 DNA 또는 RNA, 예컨대 mRNA, 또는 DNA와 RNA의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드를 코딩하는 핵산은 자가 증폭 mRNA이다(Brito et al., Adv. Genet. 2015; 89:179-233). 본원에 기재된 펩티드를 코딩하는 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드는 본 개시내용의 범위 내에 속한다.
일부 실시양태에서, 2개의 연속적인 항원성 펩티드에 대한 코딩 서열은 스페이서 또는 링커에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, 2개의 연속적인 항원성 펩티드에 대한 코딩 서열은 서로 인접한다. 일부 실시양태에서, 2개의 연속적인 항원성 펩티드에 대한 코딩 서열은 스페이서 또는 링커에 의해 분리되지 않는다.
일부 실시양태에서, 스페이서 또는 링커는 최대 5000개의 뉴클레오티드 잔기를 포함한다. 예시적인 스페이서 서열은 
이다. 또 다른 예시적인 스페이서 서열은 
이다. 또 다른 예시적인 스페이서 서열은 
이다. 다른 예시적인 스페이서 서열은 
이다. 또 다른 예시적인 스페이서는 AAA 또는 AAG와 같은 리신을 코딩하는 서열이다. 다른 예시적인 스페이서 서열은 
이다.
일부 실시양태에서, mRNA는 APC에 의한 항원 에피토프 프로세싱 및 제시를 향상시키기 위한 하나 이상의 추가의 구조를 포함한다.
일부 실시양태에서, 링커 또는 스페이서 영역은 절단 부위를 함유할 수 있다. 절단 부위는 에피토프 서열의 스트링을 포함하는 단백질 생성물을 제시를 위한 개별적인 에피토프 서열로 절단하는 것을 보장한다. 바람직한 절단 부위는 서열 내 에피토프의 우발적 절단을 피하기 위해 특정 에피토프에 인접하게 배치된다. 일부 실시양태에서, 에피토프의 스트링을 코딩하는 mRNA 상의 에피토프 및 절단 영역의 설계는 계획적이다.
용어 "RNA"는 일부 실시양태에서 "mRNA"를 포함하고 이에 관한 것이다. 용어 "mRNA"는 "메신저-RNA"를 의미하며, DNA 템플릿을 사용하여 생성되고 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 "전사체"에 관한 것이다. 전형적으로, mRNA는 5'-UTR, 단백질 코딩 영역, 및 3'-UTR을 포함한다. mRNA는 세포에서 및 시험관내에서 단지 제한된 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, mRNA는 자가 증폭 mRNA이다. 본 개시내용의 맥락에서, mRNA는 DNA 템플릿으로부터 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있다. 시험관내 전사 방법론은 당업자에게 공지되어 있다. 예컨대, 시판되는 다양한 시험관내 전사 키트가 있다.
RNA의 안정성 및 번역 효율은 필요에 따라 변형될 수 있다. 예컨대, RNA는 안정화 효과 및/또는 RNA의 번역 효율 증가를 갖는 하나 이상의 변형에 의해 안정화되고 이의 번역이 증가될 수 있다. 이러한 변형은, 예컨대 참조로 본원에 포함된 PCT/EP2006/009448에 기재되어 있다. 본 개시내용에 따라 사용되는 RNA의 발현을 증가시키기 위해, 발현되는 펩티드 또는 단백질의 서열을 변경하지 않으면서 코딩 영역, 즉 발현되는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 서열 내에서 변형되어 GC 함량을 증가시켜 mRNA 안정성을 증가시키고 코돈 최적화를 수행하여 세포에서 번역을 향상시킬 수 있다.
본 개시내용에서 사용된 RNA의 맥락에서 용어 "변형"은 상기 RNA에 자연적으로는 존재하지 않는 RNA의 임의의 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, RNA는 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트를 갖지 않는다. 이러한 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트의 제거는 RNA를 포스파타제로 처리함으로써 달성될 수 있다. 다른 실시양태에서, RNA는 이의 안정성을 증가시키고/시키거나 세포독성을 감소시키기 위해 변형된 리보뉴클레오티드를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 5-메틸시티딘은, 예컨대 시티딘에 대해 RNA에서 부분적으로 또는 완전히 치환될 수 있다. 대안적으로, 슈도우리딘은, 예컨대 우리딘에 대해 부분적으로 또는 완전히 치환된다.
일부 실시양태에서, 용어 "변형"은 RNA에 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 제공하는 것과 관련된다. 용어 5'-캡"은 mRNA 분자의 5'-말단에서 발견되는 캡 구조를 지칭하며, 일반적으로 특이한 5'에서 5' 트리포스페이트 연결을 통해 mRNA에 연결된 구아노신 뉴클레오티드로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 이 구아노신은 7-위치에서 메틸화된다. 용어 "통상적인 5'-캡"은 자연 발생 RNA 5'-캡, 7-메틸구아노신 캡(m G)을 지칭한다. 본 개시내용의 맥락에서, 용어 "5'-캡"은 RNA 캡 구조와 유사한 5'-캡 유사체를 포함하고, 생체내 및/또는 세포에서 RNA를 안정화하고/하거나 이에 부착되는 경우 RNA의 번역을 향상시키는 능력을 갖도록 변형된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 신생항원 펩티드를 코딩하는 mRNA는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 RNA, 올리고리보뉴클레오티드, 및 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 폴리리보뉴클레오티드 분자, 이를 포함하는 유전자 요법 벡터, 이를 포함하는 유전자 요법 방법 및 유전자 전사 침묵 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 투여될 mRNA는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오시드를 포함한다.
본원에 기재된 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 화학적 기술, 예컨대 문헌(Matteucci, et al., J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981))의 포스포트리에스테르 방법에 의해 합성될 수 있다. 유사체를 포함하거나 이로 이루어진 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 천연 에피토프를 코딩하는 염기를 적절하고 원하는 핵산 염기(들)로 대체함으로써 간단하게 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 숙주 세포로부터 펩티드 또는 단백질의 발현 및/또는 분비를 돕는 폴리뉴클레오티드에 동일한 리딩 프레임에서 융합된 펩티드 또는 단백질에 대한 코딩 서열(예컨대, 세포로부터 폴리펩티드의 수송을 제어하기 위한 분비 서열로서 기능하는 리더 서열)을 포함할 수 있다. 리더 서열을 갖는 폴리펩티드는 프리-단백질(pre-protein)이고, 폴리펩티드의 성숙한 형태를 형성하도록 숙주 세포에 의해 절단되는 리더 서열을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 코딩된 펩티드의 정제를 허용하는 마커 서열에 동일한 리딩 프레임에서 융합된 펩티드 또는 단백질에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있으며, 이는 이어서 맞춤형 질환 백신 또는 면역원성 조성물에 통합될 수 있다. 예컨대, 마커 서열은 박테리아 숙주의 경우 마커에 융합된 성숙한 폴리펩티드의 정제를 제공하기 위해 pQE-9 벡터에 의해 공급되는 헥사-히스티딘 태그일 수 있거나, 마커 서열은 포유동물 숙주(예컨대, COS-7 세포)가 사용되는 경우, 인풀루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래되는 헤마글루티닌(HA) 태그일 수 있다. 추가 태그는 칼로둘린 태그, FLAG 태그, Myc 태그, S 태그, SBP 태그, Softag 1, Softag 3, V5 태그, Xpress 태그, Isopeptag, SpyTag, 비오틴 카르복실 캐리어 단백질(BCCP) 태그, GST 태그, 형광 단백질 태그(예컨대, 녹색 형광 단백질 태그), 말토스 결합 단백질 태그, Nus 태그, Strep-태그, 티오레독신 태그, TC 태그, Ty 태그 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 다수의 신생항원 펩티드를 생성할 수 있는 단일 연쇄체화된 신생항원 펩티드 구축물을 생성하기 위해 동일한 리딩 프레임에 융합된 현재 기재된 펩티드 또는 단백질 중 하나 이상에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, DNA 서열은 관심 야생형 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 단리 또는 합성함으로써 재조합 기술을 이용하여 구축된다. 임의적으로, 서열은 이의 기능적 유사체를 제공하기 위해 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 돌연변이화될 수 있다. 예컨대, 문헌(Zoeller et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984), 및 미국 특허 번호 4,588,585)을 참조한다. 또 다른 실시양태에서, 관심 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 화학적 합성에 의해 구축될 것이다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 원하는 펩티드의 아미노산 서열에 기초하여 관심 재조합 폴리펩티드가 생성되는 숙주 세포에서 선호되는 코돈을 선택하여 설계될 수 있다. 표준 방법을 적용하여 관심의 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 합성할 수 있다. 예컨대, 완전한 아미노산 서열을 사용하여 역번역된 유전자를 구축할 수 있다. 또한, 특정한 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머가 합성될 수 있다. 예컨대, 원하는 폴리펩티드의 일부를 코딩하는 여러 개의 작은 올리고뉴클레오티드를 합성한 다음 리게이션할 수 있다. 개별 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 상보적 조립을 위한 5' 또는 3' 돌출부를 함유한다.
(예컨대, 합성, 부위 지정된 돌연변이유발, 또는 또 다른 방법에 의해) 일단 조립되면, 괸심의 특정한 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 벡터에 삽입되고, 임의적으로 원하는 숙주에서 단백질의 발현에 적합한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 적절한 조립은 뉴클레오티드 시퀀싱, 제한 매핑 및 적절한 숙주에서 생물학적으로 활성인 폴리펩티드의 발현에 의해 확인될 수 있다. 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 숙주에서 형질감염된 유전자의 높은 발현 수준을 얻기 위해, 유전자는 선택되는 발현 숙주에서 기능하는 전사 및 번역 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 또한 본원에 기재된 신생항원 폴리펩티드 및 신생에피토프의 생성 및 투여에 유용한 벡터, 및 발현 벡터, 및 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 펩티드 또는 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터가 또한 제조될 수 있다. 상이한 세포 유형에 대한 발현 벡터는 당업계에 널리 공지되어 있고, 과도한 실험 없이 선택될 수 있다. 일반적으로, DNA는 플라스미드와 같은 발현 벡터에 적절한 배향 및 발현을 위한 정확한 리딩 프레임으로 삽입된다. 필요한 경우, DNA는 원하는 숙주(예컨대, 박테리아)에 의해 인식되는 적절한 전사 및 번역 조절 제어 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있지만, 이러한 제어는 일반적으로 발현 벡터에서 이용 가능하다. 이어서, 벡터는 표준 기술을 이용하여 클로닝을 위해 숙주 박테리아에 도입된다(예컨대, 문헌(Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) 참조).
본원에 기재된 신생항원 폴리펩티드를 생성 및 투여하기에 적합한 다수의 벡터 및 숙주 시스템은 당업자에게 공지되어 있고 시판된다. 하기 벡터는 예시로 제공된다. 박테리아: pQE70, pQE60, pQE-9(Qiagen), pBS, pD10, phagescript, psiX174, pBluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A(Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(Pharmacia); pCR(Invitrogen). Eukaryotic: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG(Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL(Pharmacia); p75.6(Valentis); pCEP(Invitrogen); pCEI(Epimmune). 그러나, 숙주에서 복제 가능하고 생존할 수 있는 한, 임의의 다른 플라스미드 또는 벡터를 사용할 수 있다.
본원에 기재된 신생항원 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 유비퀴틴화 신호 서열, 및/또는 생성된 펩티드의 세포질세망으로의 이동을 용이하게 하는 세포질세망(ER) 신호 서열과 같은 표적화 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 신생항원 펩티드는 또한 바이러스 또는 박테리아 벡터에 의해 투여 및/또는 발현될 수 있다. 발현 벡터의 예는 백시니아 또는 조류폭스와 같은 약독화된 바이러스 숙주를 포함한다. 면역화 프로토콜에 유용한 백시니아 벡터 및 방법은, 예컨대 미국 특허 번호 4,722,848에 기재되어 있다. 또 다른 벡터는 BCG(Bacille Calmette Guerin)이다. BCG 벡터는 문헌(Stover et al., Nature 351:456-460 (1991))에 기재되어 있다. 본원에 기재된 신생항원 폴리펩티드의 치료적 투여 또는 면역화에 유용한 매우 다양한 다른 벡터, 예컨대 아데노 및 아데노 관련된 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 벡터, 해독된 탄저독소 벡터, 센다이 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 카나리폭스 벡터 등은 본원의 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 변형된 백시니아 앙카라(VA)(예컨대, 바바리안 노리딕(Bavarian Noridic) (MVA-BN))이다.
다양한 포유동물 또는 곤충 세포 배양 시스템이 또한 재조합 단백질을 발현시키기 위해 유리하게 사용된다. 포유동물 세포에서 재조합 단백질의 발현은 이러한 단백질이 일반적으로 올바르게 접히고 적절하게 변형되고 완전히 기능하기 때문에 수행될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예는 문헌(Gluzman, Cell 23:175, 1981)에 기재된 원숭이 신장 세포의 COS-7 세포주, 및 예컨대 L 세포, C127, 3T3, 차이니즈 햄스터 난소(CHO), 293, HeLa 및 BHK 세포주를 포함한 적합한 벡터를 발현할 수 있는 다른 세포주를 포함한다. 포유동물 발현 벡터는 비전사 요소, 예컨대 복제 기점, 발현될 유전자에 연결된 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 다른 5' 또는 3' 플랭킹 비전사 서열, 및 5' 또는 3' 비번역 서열, 예컨대 필요한 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 도너 및 억셉터 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수있다. 곤충 세포에서 이종 단백질의 생성을 위한 배큘로바이러스 시스템은 문헌(Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988))에 의해 검토된다.
숙주 세포는, 예컨대 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 벡터로 유전자 조작(형질도입 또는 형질전환 또는 형질감염)된다. 벡터는, 예컨대 플라스미드, 바이러스 입자, 파지 등의 형태일 수 있다. 조작된 숙주 세포는 프로모터 활성화, 형질전환체 선택 또는 폴리뉴클레오티드 증폭에 적합하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택되는 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 조건이며, 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
적절한 숙주의 대표적인 예로서, 이. 콜라이, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리움 및 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 속의 다양한 종과 같은 박테리아 세포; 효모와 같은 진균 세포; 드로소필라 및 Sf9와 같은 곤충 세포; 문헌( Gluzman, Cell 23:175 (1981))에 의해 기재된 원숭이 신장 섬유모세포의 COS-7 세포주와 같은 동물 세포, 및 적합한 벡터를 발현할 수 있는 다른 세포주, 예컨대 C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주 또는 Bowes 흑색종; 식물 세포 등을 언급할 수 있다. 적절한 숙주의 선택은 본원의 교시로부터 당업자의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 인간 세포(예컨대, 수지상 세포를 포함하는 면역 세포)에 투여되고 발현될 수 있다. 인간 코돈 사용 표는 각각의 아미노산에 대한 코돈 선택을 안내하는 데 사용할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 에피토프 및/또는 유사체 사이에 스페이서 아미노산 잔기, 예컨대 상기 기재된 것을 같거나, 에피토프 및/또는 유사체 (및/또는 CTL(예컨대, CD8+), Th(예컨대, CD4+) 및 B 세포 에피토프)에 인접한 자연 발생 플랭킹 서열을 포함할 수 있다.
당업자에게 널리 공지된 표준 조절 서열은 인간 표적 세포에서의 발현을 보장하기 위해 벡터에 포함될 수 있다. 여러 벡터 요소가 바람직하다: 폴리뉴클레오티드에 대한 다운스트림 클로닝 부위, 예컨대 미니유전자 삽입을 갖는 프로모터; 효율적인 전사 종결을 위한 폴리아데닐화 신호; 이. 콜라이 복제 기점; 및 이. 콜라이 선별 마커(예컨대, 암피실린 또는 카나마이신 내성). 많은 프로모터, 예컨대 인간 거대세포바이러스(hCMV) 프로모터가 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 예컨대, 다른 적합한 프로모터 서열에 대해 미국 특허 번호 5,580,859 및 5,589,466을 참조한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 CMV-IE 프로모터이다.
벡터는 다수의 상이한 방법에 의해 동물 조직에 도입될 수 있다. 가장 일반적인 2가지 접근법은 표준 피하 주사 바늘을 사용한 식염수 중의 DNA의 주사 및 유전자 총 전달이다. DNA 백신 플라스미드의 구축 및 이러한 2가지 방법에 의한 숙주로의 후속 전달에 대한 개략적인 개요는 문헌(Scientific American (Weiner et al., (1999) Scientific American 281 (1): 34-41))에 기재되어 있다. 식염수 중에서의 주사는 일반적으로 골격근에서 근육내(IM) 또는 피내(ID)로 수행되며, DNA는 세포외 공간으로 전달된다. 이는 부피바카인과 같은 미오톡신으로 일시적으로 근육 섬유를 손상시켜 전기천공에 의해 또는 식염수 또는 수크로스의 고장성 용액을 사용함으로써 지원될 수 있다(Alarcon et al., (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410). 이 전달 방법에 대한 면역 반응은 바늘 유형, 바늘 정렬, 주사 속도, 주사 부피, 근육 유형, 주사되는 동물의 연령, 성별 및 생리적 상태를 포함한 많은 요인에 의해 영향을 받을 수 있다(Alarcon et al., (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410).
다른 일반적으로 이용되는 전달 방법인 유전자 총 전달은 압축된 헬륨을 촉진제로 사용하여 금 또는 텅스텐 마이크로입자에 흡착된 플라스미드 DNA(pDNA)를 탄도적으로 가속한다(Alarcon et al., (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410; Lewis et al., (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88).
대안적인 전달 방법은 비강 및 폐 점막과 같은 점막 표면에 노출된(naked) DNA의 에어로졸 점적주입(Lewis et al., (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88) 및 눈 및 질 점막에 대한 pDNA의 국부 투여(Lewis et al., (1999) Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88)를 포함할 수 있다. 점막 표면 전달은 또한 양이온성 리포좀-DNA 제제, 생분해성 마이크로스피어, 장 점막에 경구 투여하기 위한 약독화된 시겔라 또는 리스테리아 벡터, 및 재조합 아데노바이러스 벡터를 사용하여 달성되었다. DNA 또는 RNA는 또한 세포막의 약한 기계적 파괴 후에 세포에 전달되어 일시적으로 세포를 투과할 수 있다. 막의 이러한 약한 기계적 파괴는 세포가 약하게 작은 구멍을 통과하도록 함으로써 작은 구멍을 통해 세포를 부드럽게 밀어넣음으로써 달성될 수 있다(Sharei et al., Ex Vivo Cytosolic Delivery of Functional Macromolecules to Immune Cells, PLOS ONE (2015)).
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드 분산 시스템, 예컨대 마크로분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포좀을 포함하는 지질 기반 시스템을 포함한다. 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드성 시스템은 리포좀(예컨대, 인공 막 소포)이다. 비-바이러스 전달 시스템이 사용되는 경우, 예시적인 전달 비히클은 리포좀이다. "리포좀"은 봉입된 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중층 지질 비히클을 포괄하는 일반적인 용어이다. 리포좀은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 갖는 소포 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 다중층 리포좀은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질 층을 갖는다. 이들은 인지질이 과량의 수용액에 현탁되면 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 닫힌 구조가 형성되기 전에 자가 재배열을 거쳐 지질 이중층 사이에 물 및 용해된 용질을 가둔다(Ghosh et al., Glycobiology 5: 505-10 (1991)). 그러나, 용액에서 정상적인 소포 구조와 상이한 구조를 갖는 조성물도 포함된다. 예컨대, 지질은 미셀 구조를 취하거나 단순히 지질 분자의 불균일한 응집체로 존재할 수 있다. 또한 리포펙타민-핵산 복합체가 고려된다.
지질 제형의 사용이 핵산을 숙주 세포로 도입하기 위해 고려된다(시험관내, 생체외 또는 생체내). 또 다른 측면에서, 핵산은 지질과 회합될 수 있다. 지질과 회합된 핵산은 리포좀의 수성 내부에 캡슐화되거나, 리포좀의 지질 이중층 내에 산재되거나, 리포좀 및 올리고뉴클레오티드 둘 다와 관련된 연결 분자를 통해 리포좀에 부착되거나, 리포좀에 포획되거나, 리포좀과 복합체화되거나, 지질을 함유하는 용액에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질 중에 현탁액으로 함유되거나, 미셀과 함께 함유되거나 이와 복합체화되거나, 달리 지질과 회합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 관련된 조성물은 용액에서 임의의 특정 구조로 제한되지 않는다. 예컨대, 이중층 구조에 미셀로서, 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 또한, 용액에 단순히 산재되어 크기 또는 모양이 균일하지 않은 응집체를 형성할 수도 있다. 지질은 자연 발생 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예컨대, 지질은 세포질에서 자연적으로 발생하는 지방 액적 뿐만 아니라 장쇄 지방족 탄화수소 및 이들의 유도체, 예컨대 지방산, 알콜, 아민, 아미노 알콜 및 알데하이드를 함유하는 화합물 부류를 포함한다. 사용에 적합한 지질은 시판 공급원에서 얻을 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올 중의 지질 스톡 용액은 약 -20℃에서 저장될 수 있다. 클로로포름은 메탄올보다 쉽게 증발하기 때문에 유일한 용매로 사용된다.
4.
항원 제시 세포(APC)
항원 제시 세포(APC)는 세포 표면 상의 MHC 분자와 회합하여 단백질 항원의 펩티드 단편을 제시한다. 제시된 펩티드는 APC의 세포 표면 상에서 펩티드-MHC 복합체(pMHC)로서 MHC 분자와 회합된다. 펩티드-MHC 복합체의 프로세싱 및 제시는 하기를 포함하는 일련의 순차적 단계를 수반할 수 있다: 단백질의 프로테아제 매개된 분해; 항원 프로세싱과 관련된 수송체(TAP)에 의해 매개되는 세포질세망(ER)으로의 펩티드 수송; 새로 합성된 MHC 분자를 사용한 펩티드-MHC I 분자의 형성; 및 세포 표면으로의 펩티드-MHC 분자의 수송.
일부 APC는 항원 특이적 T 세포를 활성화시킬 수 있다. 예컨대, pMHC와 상호작용하는 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 T 세포는 TCR-pMHC의 형성 시 활성화되거나, 자극되거나, 유도되거나, 확장될 수 있다. 일부 실시양태에서, APC의 MHC(예컨대, 클래스 I MHC 또는 클래스 II MHC)는 펩티드로 로딩되고 APC에 제시될 펩티드 서열을 포함하는 항원 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산(예컨대, RNA)을 도입함으로써 APC에 의해 제시될 수 있다.
생물학적 관점에서, 체세포 돌연변이가 면역 반응을 일으키기 위해서는 몇 가지 기준이 충족되어야 한다: 돌연변이를 함유하는 대립유전자는 세포에 의해 발현되어야 하고, 돌연변이는 단백질 코딩 영역에 있어야 하고 비동의적이어야 하고, 번역된 단백질은 프로테아좀 또는 다른 세포 단백질 분해 경로에 의해 절단되어야 하고, 돌연변이를 함유하는 에피토프는 MHC 복합체에 의해 제시되어야 하고, 제시된 에피토프는 TCR에 의해 인식되어야 하고, 마지막으로 TCR-pMHC 복합체는 T 세포를 활성화시키는 신호전달 캐스케이드를 개시해야 한다.
단핵구는 혈류를 순환한 다음 대식구 및 수지상 세포로 분화할 수 있는 조직으로 이동할 수 있다. 고전적 단핵구는 전형적으로 CD14 세포 표면 수용체의 높은 발현 수준을 특징으로 한다. 단핵구 및 B 세포의 항원 제시 능력은 이전에 감작된 T 세포의 재활성화로 제한되는 것으로 보이지만, 이들은 적격 APC일 수 있다. 이러한 세포 유형은 기능적으로 나이브하거나 프라이밍되지 않은 T 세포 집단을 직접적으로 활성화시킬 수 없다. 전문 항원 제시 세포는 포식작용 또는 수용체 매개된 세포내이입에 의해 항원을 내재화하는 데 매우 효율적이며, MHC 분자에 결합된 항원 단편을 막에 디스플레이한다. T 세포는 APC 막 상의 항원-MHC 분자 복합체를 인식하고 상호작용한다. 이어서, 추가의 공동 자극 신호가 APC에 의해 생성되어 T 세포가 활성화된다. 공동 자극 분자의 발현은 전문 APC의 전형적인 특징이다.
전문 APC는 포식작용 또는 수용체 매개된 세포내이입에 의해 항원을 내재화한 다음, MHC 분자에 결합된 항원 단편을 막에 디스플레이하는 데 매우 효율적일 수 있다. T 세포는 APC 막 상의 항원-MHC 분자 복합체를 인식하고 상호작용할 수 있다. 이어서, 추가의 공동 자극 신호가 APC에 의해 생성되어 T 세포가 활성화될 수 있다. 공동 자극 분자의 발현은 전문 항원 제시 세포의 특징을 정의할 수 있다. 전문 APC의 예는 수지상 세포(DC), 대식구 및 B 세포을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 전문 APC는 높은 수준의 MHC 클래스 II, ICAM-1 및 B7-2를 발현할 수 있다.
전문 APC의 주요 유형 중 하나는 가장 광범위한 항원 제시 범위를 갖는 DC이다. 다른 주요 유형의 전문 APC는 대식구, B 세포 및 특정한 활성화된 상피 세포를 포함한다. DC는 MHC 클래스 II 및 I 항원 제시 경로를 통해 T 세포에 항원(예컨대, 말초 조직에 포획된 항원)을 제시하는 백혈구 집단이다. DC는 나이브 T 세포 및 이전에 프라이밍된 T 세포(예컨대, 메모리 T 세포)를 모두 활성화시킬 수 있다. DC는 MHC 클래스 I 및 II 항원 제시 경로를 통해 말초 조직에서 포획된 항원을 T 세포에 제시하는 백혈구 집단일 수 있다. DC는 면역 반응의 강력한 유도자가 될 수 있으며, 이러한 세포의 활성화는 항종양 면역의 유도를 위한 중요한 단계일 수 있다.
DC는 "미성숙" 및 "성숙" 세포로 분류될 수 있으며, 이는 2가지의 잘 특성화된 표현형을 구별하는 간단한 방법으로 사용될 수 있다. 그러나, 이 명명법이 분화의 가능한 모든 중간 단계를 배제하는 것으로 해석되어서는 안된다. 미성숙한 DC는 항원 흡수 및 프로세싱 능력이 높은 APC로 특징지어질 수 있으며, 이는 Fcγ 수용체 및 만노스 수용체의 높은 발현과 관련이 있다. 성숙한 표현형은 전형적으로 이러한 마커의 낮은 발현 및 클래스 I 및 클래스 II MHC, 접착 분자(예컨대, CD54 및 CD11) 및 공동자극 분자(예컨대, CD40, CD80, CD86 및 4-1BB)와 같은 T 세포 활성화를 담당하는 세포 표면 분자의 높은 발현으로 특징지어질 수 있다. 성숙한 DC는 CD11b+, CD11c+, HLA-DR+, CD80+, CD86+, CD54+, CD3-, CD19-, CD14-, CD141+(BDCA-3), 및/또는 CD1a+일 수 있다. DC 성숙은 이러한 항원 제시 DC가 T 세포 프라이밍을 유도하는 반면 미성숙한 DC에 의한 제시는 관용을 초래하는 DC 활성화 상태로 지칭될 수 있다. DC 성숙은 선천적 수용체에 의해 검출되는 미생물 특징을 갖는 생체분자(예컨대, 박테리아 DNA, 바이러스 RNA, 내독소 등), 전염증성 시토카인(예컨대, TNF, 인터루킨 및 인터페론), CD40L에 의한 DC 표면 상의 CD40 리게이션, 및 세포 사멸을 겪는 세포로부터 방출되는 물질에 의해 야기될 수 있다. DC 성숙을 유도할 수 있는 시토카인의 추가의 비제한적인 예는 IL-4, GM-CSF, TNF-α, IL-1β, PGE1, 및 IL-6을 포함한다. 예컨대, DC는 과립구-대식구 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)와 같은 시토카인으로 시험관내에서 골수 세포를 배양함으로써 유도될 수 있다. 예컨대, DC는 PBMC로부터 단리된 CD14+ 단핵구에서 유래될수 있다. 단핵구를 DC로 유도하는 데 사용될 수 있는 시토카인 또는 성장 인자는 GM-CSF, IL-4, FLT3L, TNF-α, IL-1β, PGE1, IL-6, IL-7, IFN-α, R848, LPS, ss-rna40, 및 polyI:C을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
전형적으로, 비-전문 항원 제시 세포는 MHC 클래스 II 단백질을 구성적으로 발현하지 않는다. MHC 클래스 II 단백질은 전형적으로 IFN-α와 같은 특정 시토카인에 의한 비-전문 APC의 자극 시에만 발현된다.
APC의 공급원은 전형적으로 시험관내에서 항원 펩티드를 발현 및 제시할 수 있는 APC 또는 APC 전구체를 포함하는 조직 공급원일 수 있다. 일부 실시양태에서, APC는 표적 RNA로 로딩되고/되거나 필요한 시토카인 또는 인자로 처리될 때 증식하고 전문 APC가 될 수 있다.
한 측면에서, 항원성 폴리펩티드 또는 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 이러한 폴리펩티드, 펩티드, 단백질, 또는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포로서 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 항원 제시 세포(APC)이다. 일부 실시양태에서, 세포는 수지상 세포(DC)이다. 일부 실시양태에서, 세포는 성숙한 항원 제시 세포이다. 일부 실시양태에서, 신생항원 펩티드 또는 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 이러한 폴리펩티드, 펩티드, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 APC(예컨대, 수지상 세포)로서 제공될 수 있다. 다른 실시양태에서, 이러한 APC는 환자에게 사용하기 위해 T 세포를 자극하는 데 사용된다. 따라서, 본 개시내용의 한 실시양태는 본원에 기재된 하나 이상의 신생항원 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드로 펄스 처리되거나 로딩된 적어도 하나의 APC(예컨대, 수지상 세포)를 함유하는 조성물이다. 일부 실시양태에서, 이러한 APC는 자가(예컨대, 자가 수지상 세포)이다. 대안적으로, 환자로부터 단리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 생체외에서 신생항원 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드로 로딩될 수 있다. 관련된 실시양태에서, 이러한 APC 또는 PBMC는 환자에게 다시 주사된다. 일부 실시양태에서, APC는 수지상 세포이다. 관련된 실시양태에서, 수지상 세포는 신생항원 펩티드 또는 핵산으로 펄스 처리된 자가 수지상 세포이다. 신생항원 펩티드는 적절한 T 세포 반응을 일으키는 임의의 적절한 펩티드일 수 있다. 종양 관련된 항원으로부터의 펩티드로 펄스 처리된 자가 수지상 세포를 사용한 T 세포 요법은 문헌(Murphy et al. (1996) The Prostate 29, 371-380 및 Tjua et al. (1997) The Prostate 32, 272-278)에 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CTL(예컨대, CD8+)이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 헬퍼 T 림프구(Th(예컨대, CD4+))이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 대상체에게 투여될 수 있는 세포 기반 면역원성 약제학적 조성물을 포함하는 조성물을 제공한다. 예컨대, APC 기반 면역원성 약제학적 조성물은 널리 공지된 기술, 담체 및 부형제를 적절하고 당업계에서 이해되는 대로 사용하여 제형화될 수 있다. APC는 단핵구, 단핵구 유래된 세포, 대식구 및 수지상 세포를 포함한다. 때때로, APC 기반 면역원성 약제학적 조성물은 수지상 세포 기반 면역원성 약제학적 조성물일 수 있다.
수지상 세포 기반 면역원성 약제학적 조성물은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 경우에서, 수지상 세포 기반 면역원성 약제학적 조성물은 생체외 또는 생체내 방법을 통해 제조될 수 있다. 생체외 방법은 환자에게 투여하기 전에 DC를 활성화시키거나 로딩하기 위해 본원에 기재된 폴리펩티드와 생체외에서 펄스 처리된 자가 DC의 사용을 포함할 수 있다. 생체내 방법은 본원에 기재된 폴리펩티드와 커플링된 항체를 사용하여 특이적 DC 수용체를 표적화하는 것을 포함할 수 있다. DC 기반 면역원성 약제학적 조성물은 TLR3, TLR-7-8, 및 CD40 효능제와 같은 DC 활성화제를 추가로 포함할 수 있다. DC 기반 면역원성 약제학적 조성물은 애주번트, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다.
항원 제시 세포(APC)는 인간 및 비-인간 영장류, 다른 포유동물 및 척추동물을 포함한 다양한 공급원으로부터 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, APC는 인간 또는 비-인간 척추동물의 혈액으로부터 제조될 수 있다. APC는 농축된 백혈구 집단으로부터도 단리될 수 있다. 백혈구 집단은 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 전형적으로 헤파린 처리된 혈액 수집, 성분채집 또는 백혈구 성분채집, 버피 코트 제조, 로제팅, 원심분리, 밀도 구배 원심분리(예컨대, 피콜, 콜로이드 실리카 입자 및 수크로스 사용), 차별적 용해 비-백혈구 세포 및 여과를 포함한다. 백혈구 집단은 또한 대상체로부터 혈액을 수집하고, 섬유소를 제거하여 혈소판을 제거하고, 적혈구를 용해하여 제조될 수 있다. 백혈구 집단은 임의적으로 단구성 수지상 세포 전구체에 대해 농축될 수 있다.
혈액 세포 집단은 농축된 백혈구 집단의 원하는 용도에 따라 다양한 대상체로부터 수득될 수 있다. 대상체는 건강한 대상체일 수 있다. 대안적으로, 혈액 세포는 면역자극을 필요로 하는 대상체, 예컨대 암 환자 또는 면역자극이 유익할 다른 환자로부터 수득될 수 있다. 유사하게, 혈액 세포는 면역 억제가 필요한 대상체, 예컨대 자가면역 장애(예컨대, 류마티스 관절염, 당뇨병, 루푸스, 다발성 경화증 등)를 갖는 환자로부터 수득될 수 있다. HLA가 일치하는 건강한 개체로부터도 백혈구 집단을 수득할 수 있다.
혈액이 APC의 공급원으로 사용되는 경우, 혈액 백혈구는 생존력을 유지하는 통상적인 방법을 이용하여 수득될 수 있다. 본 개시내용의 한 측면에 따라, 혈액은 헤파린 또는 다른 적합한 항응고제를 함유하거나 함유하지 않을 수 있는 배지로 희석될 수 있다. 혈액 대 배지의 부피는 약 1 대 1일 수 있다. 세포는 4℃에서 약 1,000 rpm(150 g)으로 배지에서 혈액을 원심분리함으로써 농축될 수 있다. 혈소판 및 적혈구는 적혈구를 용해시키는 당업계에 공지된 임의의 수의 용액, 예컨대 염화암모늄에 세포를 재현탁함으로써 고갈될 수 있다. 예컨대, 혼합물은 약 1:1 부피의 배지 및 염화암모늄일 수 있다. 세포는 원심분리에 의해 농축되고, 혈소판 및 적혈구가 실질적으로 없는 백혈구 집단이 얻어질 때까지 원하는 용액에서 세척될 수 있다. 혈소판 및 적혈구로부터 혈액 백혈구를 분리하기 위한 배지로는 조직 배양에 일반적으로 사용되는 임의의 등장액이 사용될 수 있다. 이러한 등장성 용액의 예는 포스페이트 완충된 식염수, 행크스(Hanks) 균형 염 용액 및 완전 성장 배지일 수 있다. APC 및/또는 APC 전구체 세포는 또한 일루트리에이션(elutriation)에 의해 정제될 수 있다.
한 실시양태에서, APC는 염증성 또는 달리 활성화된 조건 하에서 비-공칭 APC일 수 있다. 예컨대, 비-공칭 APC는 인터페론-감마로 자극된 상피 세포, APC 활성을 유도하는 인자 또는 조건에 의해 활성화된 T 세포, B 세포 및/또는 단핵구를 포함할 수 있다. 이러한 비-공칭 APC는 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
APC는 APC의 유형에 따라 원하는 대로 배양, 확장, 분화 및/또는 성숙될 수 있다. APC는, 예컨대 배양 플레이트, 플라스크, 배양 백 및 생물반응기와 같은 임의의 적합한 배양 용기에서 배양될 수 있다.
특정 실시양태에서, APC는 제제에서 APC의 수를 유지 및/또는 확장하기 위해 적합한 배양물 또는 성장 배지에서 배양될 수 있다. 배양 배지는 단리된 APC의 유형에 따라 선택될수 있다. 예컨대, 성숙한 수지상 세포와 같은 성숙한 APC는 유지 및 확장에 적합한 성장 배지에서 배양될 수 있다. 배양 배지는 아미노산, 비타민, 항생제, 2가 양이온 등으로 보충될 수 있다. 또한, 시토카인, 성장 인자 및/또는 호르몬이 성장 배지에 포함될 수 있다. 예컨대, 성숙한 수지상 세포의 유지 및/또는 확장을 위해 과립구/대식구 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및/또는 인터루킨 4(IL-4)와 같은 시토카인을 첨가할 수 있다. 다른 실시양태에서, 미성숙한 APC는 배양 및/또는 확장될 수 있다. 미성숙한 수지상 세포는 표적 mRNA를 흡수하고 새로운 항원을 프로세싱하는 능력을 유지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 미성숙한 수지상 세포는 유지 및 배양에 적합한 배지에서 배양될 수 있다. 배양 배지는 아미노산, 비타민, 항생제, 2가 양이온 등으로 보충될 수 있다. 또한, 시토카인, 성장 인자 및/또는 호르몬이 성장 배지에 포함될 수 있다.
다른 미성숙한 APC가 유사하게 배양되거나 확장될 수 있다. 미성숙한 APC의 제제는 성숙되어 성숙한 APC를 형성할 수 있다. APC의 성숙은 신생항원 펩티드에 노출되는 동안 또는 노출된 후에 발생할 수 있다. 특정 실시양태에서, 미성숙한 수지상 세포의 제제가 성숙될 수 있다. 적합한 성숙 인자는, 예컨대 시토카인 TNF-α, 박테리아 생성물(예컨대, BCG) 등을 포함한다. 또 다른 측면에서, 단리된 APC 전구체를 사용하여 미성숙한 APC의 제제를 제조할 수 있다. APC 전구체는 배양, 분화 및/또는 성숙될 수 있다. 특정 실시양태에서, 단구성 수지상 세포 전구체는 미성숙한 수지상 세포로의 단구성 수지상 세포 전구체의 분화를 촉진하기 위해 아미노산, 비타민, 시토카인 및/또는 2가 양이온이 보충된 적합한 배양 배지의 존재 하에 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, APC 전구체는 PBMC로부터 단리된다. PBMC는 도너, 예컨대 인간 도너로부터 수득될 수 있으며, 신선하게 사용하거나 향후 사용을 위해 냉동될 수 있다. 일부 실시양태에서, APC는 하나 이상의 APC 제제로부터 제조된다. 일부 실시양태에서, APC는 제1 및 제2 신생에피토프를 포함하는 제1 및 제2 신생항원 펩티드 또는 제1 및 제2 신생에피토프를 포함하는 제1 및 제2 신생항원 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 로딩된 APC를 포함한다. 일부 실시양태에서, APC는 자가 APC, 동종이계 APC, 또는 인공 APC이다.
5.
애주번트
애주번트는 본원에 제공된 바와 같은 조성물을 투여받는 환자에서 유도된 면역 반응(체액 및/또는 세포)을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 때때로, 애주번트는 Th1 유형 반응을 유도할 수 있다. 다른 경우, 애주번트는 Th2 유형 반응을 유도할 수 있다. Th1 유형 반응은 IL-4, IL-5 및 IL-10과 같은 시토카인의 생성을 특징으로 할 수 있는 Th2 유형 반응과 대조적으로 IFN-γ와 같은 시토카인의 생성을 특징으로 할 수 있다.
일부 측면에서, MPLA 및 MDP와 같은 지질 기반 애주번트는 본원에 개시된 면역원성 약제학적 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예컨대, 모노포스포릴 지질 A(MPLA)는 특정 T 림프구에 대한 리포좀 항원의 증가된 제시를 유발하는 애주번트이다. 또한, 무라밀 디펩티드(MDP)는 또한 본원에 기재된 면역원성 약제학적 제형과 함께 적합한 애주번트로서 사용될 수 있다.
적합한 애주번트는 당업계에 공지되어 있으며(WO 2015/095811 참조), poly(I:C), poly-ICLC, 힐토놀, STING 효능제, 1018 ISS, 알루미늄 염, 암플리박스, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, 이미퀴모드, ImuFact IMP321, IS 패치, ISS, ISCOMATRIX, 주브이뮨, LipoVac, MF59, 모노포스포릴 지질 A, 몬타니드 IMS 1312, 몬타니드 ISA 206, 몬타니드 ISA 50V, 몬타니드 ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PepTel® 벡터 시스템, PLG 마이크로입자, 레시퀴모드, SRL172, 비로좀 및 다른 바이러스-유사 입자, YF-17D, VEGF 트랩, R848, 베타-글루칸, Pam2Cys, Pam3Cys, Pam3CSK4, 어퀼러 QS21 스티물론(Aquila Biotech, Worcester, Mass., USA) (사포닌, 미코박테리아 추출물 및 합성 박테리아 세포벽 모방체로부터 유래됨), 및 다른 독점적인 애주번트, 예컨대 리비 디톡스(Ribi's Detox). 퀼(Quil) 또는 수퍼포스(Superfos)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 애주번트는 또한 불완전 프로인트 또는 GM-CSF를 포함한다. 수지상 세포 및 이의 제조에 특이적인 여러 면역학적 애주번트(예컨대, MF59)는 이전에 기술되었다(Dupuis M, et al., Cell Immunol. 1998; 186(1):18-27; Allison A C; Dev. Biol. Stand. 1998; 92:3-11; Mosca et al. Frontiers in Bioscience, 2007; 12:4050-4060; Gamvrellis et al. Immunol & Cell Biol. 2004; 82: 506-516)). 또한, 시토카인을 사용할 수 있다. 여러 시토카인은 림프 조직으로의 수지상 세포 이동에 영향을 미치고(예컨대, TNF-알파), 수지상 세포의 T-림프구에 대한 효율적인 항원 제시 세포로의 성숙을 가속화하고(예컨대, GM-CSF, PGE1, PGE2, IL-1, IL-1b, IL-4, IL-6 및 CD40L) (미국 특허 번호 5,849,589, 전체가 참조로 본원에 포함됨) 면역애주번트로 작용하는 것(예컨대, IL-12)과 직접적으로 연관되었다(Gabrilovich D I, et al., J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418).
애주번트는 또한 시토카인과 같은 자극 분자를 포함할 수 있다. 시토카인의 비제한적인 예는 하기를 포함한다: CCL20, a-인터페론(IFN-a), β-인터페론(IFN-β), γ-인터페론, 혈소판 유래된 성장 인자(PDGF), TNFα, TNFβ(림포톡신 알파(LTα)), GM-CSF, 표피 성장 인자(EGF), 피부 T 세포 유인 케모카인(CTACK), 상피 흉선 발현된 케모카인(TECK), 점막 관련된 상피 케모카인(MEC), IL-12, IL-15,, IL-28, MHC, CD80, CD86, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, MCP-1, MIP-la, MIP-1-, IL-8, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-18의 돌연변이 형태, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DRS, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IκB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-I, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFκB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAPI, 및 TAP2.
추가 애주번트는 하기를 포함한다: MCP-1, MIP-la, MIP-lp, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18의 돌연변이 형태, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, IL-7, IL-22, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IκB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFκB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 및 이들의 기능적 단편.
일부 측면에서, 애주번트는 톨-유사 수용체(TLR)의 조절제일 수 있다. TLR의 조절제의 예는 TLR-9 효능제를 포함하고, 이미퀴모드와 같은 TLR의 소분자 조절제로 제한되지 않는다. 본원에 기재된 면역원성 약제학적 조성물과 조합하여 사용되는 애주번트의 다른 예는 사포닌, CpG ODN 등을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 때때로, 애주번트는 박테리아 톡소이드, 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 폴리머, 알루미늄 염, 리포좀, CpG 폴리머, 수중유 에멀젼, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 때로는, 애주번트는 수중유 에멀젼이다. 수중유 에멀젼은 적어도 하나의 오일 및 적어도 하나의 계면활성제를 포함할 수 있으며, 오일(들) 및 계면활성제(들)는 생분해성(대사성) 및 생체적합성이다. 에멀젼 중 오일 액적은 직경이 5μm 미만일 수 있으며, 심지어 서브 마이크론 직경을 가질 수 있으며, 이러한 작은 크기는 안정적인 에멀젼을 제공하기 위해 미세유동화기로 달성된다. 크기가 220 nm 미만인 액적은 필터 멸균될 수 있다.
6.
치료 방법 및 약제학적 조성물
본원에 기재된 신생항원 치료제(예컨대, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드, APC 또는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 수지상 세포)는 암 치료와 같은 치료적 처치 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 적용에 유용하다. 일부 실시양태에서, 치료적 처치 방법은 면역요법을 포함한다. 특정 실시양태에서, 신생항원 펩티드는 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상, 기존 면역 반응을 새로운 표적으로 재지정, 종양의 면역원성을 증가, 종양 성장을 억제, 종양 부피를 감소, 종양 세포 아폽토시스를 증가, 및/또는 종양의 종양원성을 감소시키는 데 유용하다. 사용 방법은 시험관내, 생체외 또는 생체내 방법일 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 신생항원 펩티드 또는 단백질을 포함하는 폴리펩티드, 세포, 또는 약제학적 조성물을 사용하여 대상체에서 면역 반응을 활성화시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체의 세포를 본원에 기재된 신생항원 펩티드 또는 단백질을 포함하는 폴리펩티드, 세포, 또는 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 대상체를 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 신생항원 펩티드 또는 단백질을 포함하는 폴리펩티드, 세포, 또는 약제학적 조성물을 사용하여 대상체에서 면역 반응을 촉진하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 신생항원 펩티드 또는 단백질을 포함하는 폴리펩티드, 세포, 또는 약제학적 조성물을 사용하여 대상체에서 면역 반응을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 신생항원 펩티드 또는 단백질을 포함하는 폴리펩티드, 세포, 또는 약제학적 조성물을 사용하여 면역 반응을 향상시키는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 세포 매개된 면역의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 T 세포 활성 또는 체액성 면역의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 세포독성 T 림프구(CTL) 또는 헬퍼 T 림프구(Th) 활성의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 천연 킬러(NK) 세포 활성의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 T 세포 활성의 증가 및 NK 세포 활성의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 CTL 활성의 증가 및 NK 세포 활성의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 T 조절(Treg) 세포의 억제 활성의 억제 또는 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 항-종양 활성의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 면역원성의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 항원 자극의 결과이다. 일부 실시양태에서, 항원 자극은 종양 세포이다. 일부 실시양태에서, 항원 자극은 암이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 신생항원 펩티드 또는 단백질을 포함하는 폴리펩티드, 세포, 또는 약제학적 조성물을 사용하여 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 신생항원 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 종양 세포에 전달하는 치료학적 유효량의 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 종양 세포에 의해 내재화된 신생항원 폴리펩티드의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 종양 세포에 의해 내재화된 신생항원 폴리펩티드의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 신생항원 펩티드는 세포에 의해 프로세싱된다. 일부 실시양태에서, 방법은 종양 세포에 의해 내재화되고 신생항원 폴리펩티드의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 신생에피토프은 종양 세포의 표면 상에 제시된다. 일부 실시양태에서, 방법은 종양 세포에 의해 내재화되고, 세포에 의해 프로세싱되는 신생항원 폴리펩티드의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 항원성 펩티드는 종양 세포의 표면 상에 제시된다.
일부 실시양태에서, 방법은 적어도 하나의 신생항원 펩티드를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 종양 세포에 전달하는 본원에 기재된 신생항원 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 신생항원 펩티드에서 유래되는 적어도 하나의 신생에피토프는 종양 세포의 표면 상에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항원성 펩티드는 MHC 클래스 I 분자와 복합체로 종양 세포의 표면 상에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항원성 펩티드는 MHC 클래스 II 분자와 복합체로 종양 세포의 표면 상에 제시된다.
일부 실시양태에서, 방법은 적어도 하나의 신생항원 폴리펩티드를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 종양 세포에 전달하는 본원에 기재된 신생항원 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 종양 세포를 접촉시키는 단계를 포함하고, 적어도 하나의 신생항원으로부터 유래되는 적어도 하나의 신생에피토프는 종양 세포의 표면 상에 제시된다. 일부 실시양태에서, 신생에피토프는 MHC 클래스 I 분자와 복합체로 종양 세포의 표면 상에 제시된다. 일부 실시양태에서, 신생에피토프는 MHC 클래스 II 분자와 복합체로 종양 세포의 표면 상에 제시된다.
일부 실시양태에서, 방법은 적어도 하나의 항원성 펩티드를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 종양 세포에 전달하는 본원에 기재된 신생항원 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 에피토프 또는 신생에피토프는 종양 세포의 표면 상에 제시되고, 종양 세포에 대한 면역 반응을 유도한다. 일부 실시양태에서, 에피토프 또는 신생에피토프에 대한 면역 반응이 증가된다. 일부 실시양태에서, 종양 세포에 대한 면역 반응이 증가된다. 일부 실시양태에서, 신생항원 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 신생항원 펩티드를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 종양 세포에 전달하고, 에피토프 또는 신생에피토프는 종양 세포의 표면 상에 제시되고, 종양 성장은 억제된다.
일부 실시양태에서, 방법은 적어도 하나의 신생항원 펩티드를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 종양 세포에 전달하는 본원에 기재된 신생항원 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 적어도 하나의 신생항원 펩티드로부터 유래되는 신생에피토프가 종양 세포의 표면 상에 제시되고, 종양 세포에 대해 지시되는 T 세포 사멸이 유도된다. 일부 실시양태에서, 종양 세포에 대해 지시되는 T 세포 사멸이 향상된다. 일부 실시양태에서, 종양 세포에 대해 지시되는 T 세포 사멸이 증가된다.
일부 실시양태에서, 대상체에서 면역 반응을 증가시키는 방법은 대상체에게 치료학적 유효량의 본원에 기재된 신생항원 치료제를 투여하는 단계를 포함하고, 작용제는 본원에 기재된 신생항원에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 면역 반응을 증가시키는 방법은 대상체에게 치료학적 유효량의 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 기존 면역 반응을 종양으로 재지정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 기존 면역 반응을 종양으로 재지정하는 방법은 본원에 기재된 신생항원 치료제의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 기존 면역 반응은 바이러스에 대한 것이다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 홍역 바이러스, 수두-대상포진 바이러스(VZV; 수두 바이러스), 인플루엔자 바이러스, 볼거리 바이러스, 폴리오바이러스, 풍진 바이러스, 로타바이러스, A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), 엡스타인 바르 바이러스(EBV) 및 거대세포바이러스(CMV)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 수두-대상포진 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 거대세포바이러스이다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 홍역 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 기존의 면역 반응은 천연 바이러스 감염 후에 획득되었다. 일부 실시양태에서, 기존 면역 반응은 바이러스에 대한 백신접종 후에 획득되었다. 일부 실시양태에서, 기존 면역 반응은 세포 매개된 반응이다. 일부 실시양태에서, 기존 면역 반응은 CTL 또는 Th 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체에서 기존 면역 반응을 종양으로 재지정하는 방법은 (i) 신생항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 (ii) 본원에 기재된 적어도 하나의 신생항원 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함하고, (a) 융합 단백질은 종양 관련된 항원 또는 신생에피토프에 결합한 후 종양 세포에 의해 내재화되고; (b) 신생항원 펩티드는 프로세싱되어 MHC 클래스 I 분자와 관련된 종양 세포의 표면 상에 제시되고; (c) 신생항원 펩티드/MHC 클래스 I 복합체는 CTL에 의해 인식된다. 일부 실시양태에서, CTL은 메모리 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 메모리 T 세포는 신생항원 펩티드를 사용한 백신접종의 결과이다.
본 개시내용은 종양의 면역원성을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 종양의 면역원성을 증가시키는 방법은 종양 또는 종양 세포를 유효량의 본원에 기재된 신생항원 치료제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양의 면역원성을 증가시키는 방법은 본원에 기재된 신생항원 치료제의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 신생항원 치료제를 사용하여 종양의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 종양의 성장을 억제하는 방법은 시험관내에서 세포 혼합물을 신생항원 치료제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 예컨대, 면역 세포(예컨대, T 세포)와 혼합된 불멸화된 세포주 또는 암 세포주는 신생항원 펩티드가 첨가된 배지에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 종양 세포는 환자 샘플, 예컨대 조직 생검, 흉막 삼출액 또는 혈액 샘플로부터 단리되고, 면역 세포(예컨대, T 세포)와 혼합되고, 신생항원 치료제가 첨가된 배지에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 신생항원 치료제는 면역 세포의 활성을 증가, 촉진 및/또는 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 신생항원 치료제는 종양 세포 성장을 억제한다. 일부 실시양태에서, 신생항원 치료제는 종양 세포의 사멸을 활성화시킨다.
일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 종양을 갖고 있거나 대상체는 적어도 부분적으로 제거된 종양을 가졌다.
일부 실시양태에서, 종양의 성장을 억제하는 방법은 대상체에게 치료학적 유효량의 신생항원 치료제를 투여하여 기존의 면역 반응을 새로운 표적으로 재지정하는 단계를 포함하고, 기존의 면역 반응은 신생항원 펩티드에 의해 종양 세포에 전달되는 항원성 펩티드에 대한 것이다.
특정 실시양태에서, 종양은 암 줄기 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양에서 암 줄기 세포의 빈도는 신생항원 치료제의 투여에 의해 감소된다. 일부 실시양태에서, 치료학적 유효량의 신생항원 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 종양에서 암 줄기 세포의 빈도를 감소시키는 방법이 제공된다.
또한, 일부 측면에서, 본 개시내용은 대상체에게 치료학적 유효량의 본원에 기재된 신생항원 치료제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양의 종양원성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 종양은 암 줄기 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양의 종양원성은 종양에서 암 줄기 세포의 빈도를 감소시킴으로써 감소된다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 신생항원 치료제를 사용하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양에서 암 줄기 세포의 빈도는 본원에 기재된 신생항원 치료제의 투여에 의해 감소된다.
일부 실시양태에서, 종양은 고형 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 결장직장 종양, 췌장 종양, 폐 종양, 난소 종양, 간종양, 유방 종양, 신장 종양, 전립선 종양, 신경내분비 종양, 위장관 종양, 흑색종, 자궁경부 종양, 방광 종양, 교모세포종, 및 두경부 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 결장직장 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 난소 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 유방 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 폐 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 췌장 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 흑색종 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 고형 종양이다.
본 개시내용은 본원에 기재된 신생항원 치료제의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 기존의 면역 반응을 새로운 표적으로 재지정하는 단계를 포함하고, 방법은 대상체에게 치료학적 유효량의 신생항원 치료제를 투여하는 단계를 포함하고, 기존의 면역 반응은 신생항원 펩티드에 의해 암세포에 전달되는 항원성 펩티드에 대한 것이다.
본 개시내용은 본원에 기재된 신생항원 치료제의 치료학적 유효량을 대상체(예컨대, 치료를 필요로 하는 대상체)에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 암성 종양을 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 적어도 부분적으로 제거된 종양을 갖는다.
대상체는, 예컨대 포유동물, 인간, 임산부, 노인, 성인, 청소년, 프리-청소년전(pre-adolescent), 어린이, 유아(toddler), 유아(infant), 신생아(newborn) 또는 신생아(neonate)일 수 있다. 대상체는 환자일 수 있다. 일부 경우에서, 대상체는 인간일 수 있다. 일부 경우에서, 대상체는 어린이일 수 있다(즉, 사춘기 미만의 젊은 인간). 일부 경우에서, 대상체는 유아(infant)일 수 있다. 일부 경우에서, 대상체는 분유를 먹는 유아(infant)일 수 있다. 일부 경우에서, 대상체는 임상 연구에 등록된 개체일 수 있다. 일부 경우에서, 대상체는 실험 동물, 예컨대 포유동물 또는 설치류일 수 있다. 일부 경우에서, 대상체는 마우스일 수 있다. 일부 경우에서, 대상체는 비만 또는 과체중 대상체일 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체는 이전에 하나 이상의 상이한 암 치료 방식으로 치료를 받은 적이 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 이전에 방사선요법, 화학요법 또는 면역요법 중 하나 이상으로 치료받은 적이 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 1, 2, 3, 4, 또는 5개 라인의 선행 요법으로 치료를 받았다. 일부 실시양태에서, 선행 요법은 세포독성 요법이다.
특정 실시양태에서, 암은 결장직장암, 췌장암, 폐암, 난소암, 간암, 유방암, 신장암, 전립선암, 위장관암, 흑색종, 자궁경부암, 신경내분비암, 방광암, 자궁암, 교모세포종 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암이다. 특정 실시양태에서, 암은 췌장암이다. 특정 실시양태에서, 암은 난소암이다. 특정 실시양태에서, 암은 결장직장암이다. 특정 실시양태에서, 암은 유방암이다. 특정 실시양태에서, 암은 전립선암이다. 특정 실시양태에서, 암은 폐암이다. 특정 실시양태에서, 암은 비-소세포 폐암이다. 특정 실시양태에서, 암은 자궁암이다. 특정 실시양태에서, 암은 간암이다. 특정 실시양태에서, 암은 흑색종이다. 일부 실시양태에서, 암은 고형암이다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양을 포함한다.
일부 실시양태에서, 암은 혈액암이다. 일부 실시양태에서, 암은 급성 골수성 백혈병(AML), 호지킨 림프종, 다발성 골수종, T 세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 털세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병(CML), 비-호지킨 림프종, 미만성 큰 B 세포 림프종(DLBCL), 맨틀 세포 림프종(MCL) 및 피부 T 세포 림프종(CTCL)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 신생항원 치료제는 조합 요법으로서 투여된다. 2개 이상의 치료제를 사용한 조합 요법은 반드시 필요한 것은 아니지만 상이한 작용 메카니즘에 의해 작용하는 작용제를 사용한다. 작용 메카니즘이 상이한 작용제를 사용하는 조합 요법은 부가적 또는 상승적 효과를 초래할 수 있다. 조합 요법은 단일 요법에서 사용되는 것보다 더 낮은 용량의 각각의 제제를 허용할 수 있으므로 독성 부작용을 감소시키고 작용제(들)의 치료 지수를 증가시킬 수 있다. 조합 요법은 내성 암세포가 발생할 가능성을 줄일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 면역 반응에 영향을 미치는(예컨대, 반응을 향상시키거나 활성화시키는) 치료제 및 종양/암 세포에 영향을 미치는(예컨대, 억제 또는 사멸시키는) 치료제를 포함한다.
일부 경우에서, 면역원성 약제학적 조성물은 추가 작용제와 함께 투여될 수 있다. 추가 작용제의 선택은 적어도 부분적으로 치료되는 병태에 따라 달라질 수 있다. 추가 작용제는, 예컨대 항-PD1, 항-CTLA4, 항-PD-L1, 항-CD40 또는 항-TIM3 작용제와 같은 체크포인트 억제제(예컨대, 항-PD1, 항-CTLA4, 항-PD-L1, 항 CD40 또는 항-TIM3 항체); 또는 예컨대 NSAID, 예컨대 이부프로펜, 나프록센, 아세트아미노펜, 케토프로펜 또는 아스피린과 같은 염증 상태를 치료하는 데 사용되는 약물을 포함하는 병원체 감염(예컨대, 바이러스 감염)에 대한 치료 효과를 갖는 임의의 작용제를 포함할 수 있다. 예컨대, 체크포인트 억제제는 니볼루맙(ONO-4538/BMS-936558, MDX1 106, OPDIVO), 펨브롤리주맙(MK-3475, KEYTRUDA), 피딜리주맙(CT-011), 및 MPDL328OA(ROCHE)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 PD-1/PD-L1 길항제일 수 있다. 다른 예로서, 제형은 비타민 C, E 또는 다른 항산화제와 같은 하나 이상의 보충제를 추가로 함유할 수 있다.
본 개시내용의 방법은 당업계에 공지된 임의의 유형의 암을 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 개시내용의 방법에 의해 치료될 암의 비제한적 예는 흑색종(예컨대, 전이성 악성 흑색종), 콩팥암(예컨대, 투명 세포 암종), 전립선암(예컨대, 호르몬 불응성 전립선 선암종), 췌장 선암종, 유방암, 결장암, 폐암(예컨대, 비-소세포 폐암), 식도암, 두경부의 편평세포 암종, 간암, 난소암, 자궁경부암, 갑상선암, 교모세포종, 신경교종, 백혈병, 림프종, 및 다른 신생물성 악성 종양을 포함할 수 있다.
추가로, 본원에서 제공되는 질환 또는 병태는 성장이 본 개시내용의 치료 방법을 이용하여 억제될 수 있는 난치성 또는 재발성 악성종양을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 치료 방법에 의해 치료될 암은 암종, 편평세포 암종, 선암종, 육종, 자궁내막암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 자궁관암, 원발성 복막암, 결장암, 결장직장암, 항문생식기 부위의 편평세포 암종, 흑색종, 신장 세포 암종, 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 편평세포 암종, 위암, 방광암, 담낭암, 간암, 갑상선암, 후두암, 침샘암, 식도암, 두경부암, 교모세포종, 신경교종, 두경부의 편평세포 암종, 전립선암, 췌장암, 중피종, 육종, 혈액암, 백혈병, 림프종, 신경종, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 치료 방법에 의해 치료될 암은, 예컨대 암종, 편평세포 암종(예컨대, 자궁경관, 눈꺼풀, 결막, 질, 폐, 구강, 피부, 방광, 혀, 후두, 및 식도), 및 선암종(예컨대, 전립선, 소장, 자궁내막, 자궁경관, 대장, 폐, 췌장, 식도, 직장, 자궁, 위, 유선, 및 난소)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법에 의해 치료될 암은 육종(예컨대, 근육성 육종), 백혈병, 신경종, 흑색종 및 림프종을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법에 의해 치료될 암은 유방암이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 치료 방법에 의해 치료될 암은 삼중 음성 유방암(TNBC)이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 치료 방법에 의해 치료될 암은 난소암이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 치료 방법에 의해 치료될 암은 결장직장암이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물로 치료될 환자 또는 환자 집단은 고형 종양을 갖는다. 일부 실시양태에서, 고형 종양은 흑색종, 신장 세포 암종, 폐암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 담낭암, 후두암, 간암, 갑상선암, 위암, 침샘암, 전립선암, 췌장암, 또는 메르켈 세포 암종이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물로 치료될 환자 또는 환자 집단은 혈액암을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 혈액암, 예컨대 미만성 큰 B 세포 림프종("DLBCL"), 호지킨 림프종("HL"), 비-호지킨 림프종("NHL"), 소포 림프종("FL"), 급성 골수성 백혈병("AML") 또는 다발성 골수종("MM")을 갖는다. 일부 실시양태에서, 치료될 환자 또는 환자의 집단은 난소암, 폐암 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암을 갖는다.
본 개시내용에 따라 예방 및/또는 치료될 수 있는 암의 구체적인 예는 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 콩팥암, 신장암, 다형성 교모세포종, 전이성 유방암; 유방 암종; 유방 육종; 신경섬유종; 신경 섬유종증; 소아 종양; 신경모세포종; 악성 흑색종; 표피의 암종; 백혈병, 예컨대, 제한 없이, 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 예컨대 골수모구성, 전골수구성, 골수단핵구성, 단구성, 적백혈병 백혈병 및 미클로이형성(myclodysplastic) 증후군, 만성 백혈병, 예컨대, 제한 없이, 만성 골수구성(과립구) 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 털세포 백혈병; 진성 적혈구증가증; 림프종, 예컨대, 제한 없이, 호지킨 질환, 비-호지킨 질환; 다발성 골수종, 예컨대, 제한 없이, 무증상(smoldering) 다발성 골수종, 비분비성 골수종, 골경화증 골수종, 형질세포 백혈병, 고립성 형질세포종 및 골수외 형질세포종; 발덴스트롬 마이크로글로불린혈증; 미확정의 모노클로날 감마글로불린병증; 양성 모노클로날 감마글로불린병증; 중쇄 질환; 골암 및 결합 조직 육종, 예컨대, 제한 없이, 골 육종, 골수종 골 질환, 다발성 골수종, 진주종 유도된 골육종, 골의 파제트 질환, 골육종, 연골육종, 유윙 육종, 악성 거대 세포 종양, 골의 섬유육종, 척색종, 골막 육종, 연조직 육종, 맥관육종(혈관육종), 섬유육종, 카포시 육종, 평활근육종, 지방육종, 림프관 육종, 신경초종, 횡문근육종, 및 윤활막 육종; 뇌 종양, 예컨대, 제한 없이, 신경교종, 성상세포종, 뇌 줄기 신경교종, 뇌실막종, 핍돌기신경교종, 비신경교 종양, 속귀 신경집종, 두개인두종, 속질모세포종, 수막종, 송과체종, 송과체모세포종, 및 원발성 뇌 림프종; 유방암, 예컨대, 제한 없이, 선암종, 소엽(소세포) 암종, 관내 암종, 수질 유방암, 점액 유방암, 관 유방암, 유두 유방암, 파제트 질환(소아 파제트 질환 포함) 및 염증성 유방암; 부신암, 예컨대, 제한 없이, 크롬친화세포종 및 부신피질 암종; 갑상선암, 예컨대, 제한 없이, 유두 또는 소포 갑상선암, 수질 갑상선암 및 역형성 갑상선암; 췌장암, 예컨대, 제한 없이, 인슐린종, 가스트린종, 글루카곤종, 비포마, 소마토스타틴-분비 종양, 및 카르시노이드 또는 섬세포 종양; 뇌하수체암, 예컨대, 제한 없이, 쿠싱 질환, 프롤락틴-분비 종양, 말단거대증, 및 요붕증(diabetes insipius); 안암, 예컨대, 제한 없이, 안구 흑색종, 예컨대 홍채 흑색종, 맥락막 흑색종, 및 섬모체 흑색종, 및 망막아종; 질암, 예컨대 편평세포 암종, 선암종, 및 흑색종; 외음부암, 예컨대 편평세포 암종, 흑색종, 선암종, 기저세포 암종, 육종, 및 파제트 질환; 자궁경부암, 예컨대, 제한 없이, 편평세포 암종, 및 선암종; 자궁암, 예컨대, 제한 없이, 자궁내막 암종 및 자궁 육종; 난소암, 예컨대, 제한 없이, 난소 상피 암종, 경계성 종양, 배세포 종양, 및 기질 종양; 자궁경부 암종; 식도암, 예컨대, 제한 없이, 편평세포암, 선암종, 샘낭 암종, 점막표피양 암종, 선편평세포 암종, 육종, 흑색종, 형질세포종, 사마귀양 암종, 및 귀리 세포(소세포) 암종; 위암, 예컨대, 제한 없이, 선암종, 버섯모양(폴립모양), 궤양화, 표재 확산, 분산 확산, 악성 림프종, 지방육종, 섬유육종, 및 암육종; 결장암; 결장직장암, KRAS 돌연변이된 결장직장암; 결장 암종; 직장암; 간암, 예컨대, 제한 없이, 간세포 암종 및 간모세포종, 담낭암, 예컨대 선암종; 담관암종, 예컨대, 제한 없이, 유두, 결절, 및 미만성; 폐암, 예컨대 KRAS-돌연변이된 비-소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 편평세포 암종(표피모양 암종), 선암종, 대세포 암종 및 소세포 폐암; 폐 암종; 고환암, 예컨대, 제한 없이, 배아 종양, 정상피종, 역형성, 고전적(전형적), 정모세포성, 비정상피종, 배아 암종, 기형종 암종, 융모막암종(난황난 종양), 전립선암, 예컨대, 제한 없이, 안드로겐-독립적 전립선암, 안드로겐-의존적 전립선암, 선암종, 평활근육종, 및 횡문근육종; 페날암(penal cancer); 구강암, 예컨대, 제한 없이, 편평세포 암종; 기저암; 침샘암, 예컨대, 제한 없이, 선암종, 점막표피양 암종, 및 샘낭 암종; 인두암, 예컨대, 제한 없이, 편평세포암, 및 사마귀양; 피부암, 예컨대, 제한 없이, 기저세포 암종, 편평세포 암종 및 흑색종, 표재확산 흑색종, 결절 흑색종, 검은사마귀 악성 흑색종, 말단흑자 흑색종; 신장암, 예컨대, 제한 없이, 신장세포암, 선암종, 콩팥세포암종, 섬유육종, 이행세포암(신우 및/또는 우테러(uterer)); 신장 암종; 윌름 종양; 방광암, 예컨대, 제한 없이, 이행세포 암종, 편평세포암, 선암종, 암육종. 또한, 암은 점액육종, 골원성 육종, 내피육종, 림프관내피육종, 중피종, 윤활막종, 혈관모세포종, 상피 암종, 낭선암종, 기관지 암종, 땀샘 암종, 피지샘 암종, 유두 암종, 및 유두 선암종.
암은 B 세포암, 예컨대 다발성 골수종, 발덴스트롬 마이크로글로불린혈증, 중쇄 질환, 예컨대 예컨대 알파 쇄 질환, 감마 쇄 질환, 및 뮤 쇄 질환, 양성 모노클로날 감마글로불린병증, 및 면역구성 아밀로이드증, 흑색종, 유방암, 폐암, 기관지암, 결장직장암, 전립선암(예컨대, 전이성, 호르몬 불응성 전립선암), 췌장암, 위암, 난소암, 비뇨기 방광암, 뇌 또는 중추신경계암, 말초 신경계암, 식도암, 자궁경부암, 자궁 또는 자궁내막암, 구강암 또는 인두, 간암, 신장암, 고환암, 담도암, 소장 또는 충수암, 침샘암, 갑상선암, 부신암, 골육종, 연골육종, 혈액 조직의 암 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 개시내용에 의해 포괄되는 방법에 적용할 수 있는 암 유형의 다른 비제한적 예는 인간 육종 및 암종, 예컨대 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척색종, 맥관육종, 내피육종, 림프맥관육종, 림프관내피육종, 윤활막종, 중피종, 유윙 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 결장직장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 편평세포 암종, 기저세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지샘 암종, 유두 암종, 유두 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지 암종, 신장 세포 암종, 간종양, 담관 암종, 간암, 융모막암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름 종양, 자궁경부암, 골암, 뇌 종양, 고환암, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 속질모세포종, 두개인두종, 뇌실막종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍돌기신경교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막아종; 백혈병, 예컨대 급성 림프구성 백혈병 및 급성 골수구성 백혈병(골수모구성, 전골수구성, 골수단핵구성, 단구성 및 적백혈병); 만성 백혈병(만성 골수구성(과립구) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병); 및 진성 적혈구증가증, 림프종(호지킨 질환 및 비-호지킨 질환), 다발성 골수종, 발덴스트롬 마이크로글로불린혈증, 및 중쇄 질환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표현형이 본 개시내용의 방법에 의해 결정되는 암은 상피암, 예컨대, 제한 없이, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 부인암, 콩팥암, 후두암, 폐암, 구강암, 두경부암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 또는 피부암이다. 다른 실시양태에서, 암은 유방암, 전립선암, 폐암, 또는 결장암이다. 또 다른 실시양태에서, 상피암은 비-소세포 폐암, 비-유두 신장 세포 암종, 자궁경부 암종, 난소 암종(예컨대, 장액성 난소 암종), 또는 유방 암종이다. 상피암은 장액성, 자궁내막양, 점액성, 투명 세포, 브레너(brenner), 또는 미분화를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 다른 방식으로 특징지어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 림프종 또는 맨틀 세포 림프종을 포함하지만 이에 제한되지 않는 이의 아유형의 치료, 진단, 및/또는 예후에서 사용된다. 림프증식 질환은 또한 증식성 질환으로 간주된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 작용제와 적어도 하나의 추가의 치료제의 조합은 부가적 또는 상승적 결과를 초래한다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 작용제의 치료 지수의 증가를 초래한다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 추가의 치료제(들)의 치료 지수의 증가를 초래한다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 작용제의 독성 및/또는 부작용의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 추가 치료제(들)의 독성 및/또는 부작용의 감소를 초래한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 신생항원 치료제를 투여하는 것 외에, 방법 또는 치료는 적어도 하나의 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가 치료제는 작용제의 투여 전, 투여와 동시에 및/또는 투여 후에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 추가 치료제는 1, 2, 3개, 또는 그 추가의 추가 치료제를 포함한다.
본원에 기재된 신생항원 치료제와 조합하여 투여될 수 있는 치료제는 화학요법제를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법 또는 치료는 화학요법제와 조합하여 또는 화학요법제의 칵테일과 조합하여 본원에 기재된 작용제의 투여를 포함한다. 약제를 사용한 치료는 화학요법의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 발생할 수 있다. 조합 투여는 단일 약제학적 제형으로 또는 별도의 제형을 사용하는 공동 투여, 또는 일반적으로 모든 활성제가 생물학적 활성을 동시에 발휘할 수 있도록 하는 시간 기간 내에 어느 한 순서로 연속 투여를 포함할 수 있다. 이러한 화학요법제의 제조 및 투여 일정은 제조자의 지침에 따라 또는 숙련된 의사에 의해 경험적으로 결정되는 바와 같이 사용될 수 있다. 이러한 화학요법에 대한 제조 및 투여 일정은 또한 문헌(The Chemotherapy Source Book, 4th Edition, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA)에 기재되어 있다.
유용한 부류의 화학요법제는, 예컨대 항-투불린제, 아우리스타틴, DNA 마이너 그루브 결합제, DNA 복제 억제제, 알킬화제(예컨대, 백금 복합체, 예컨대 시스플라틴, 모노(백금), 비스(백금) 및 삼핵 백금 복합체 및 카르보플라틴), 안트라사이클린, 항생제, 항-폴레이트, 항-대사물질, 화학요법 증감제, 두오카르마이신, 에토포시드, 플루오르화 피리미딘, 이오노포어, 렉시트로프신, 니트로소우레아, 플라티놀, 스테로이드, 퓨린 항대사산물, 푸로마이신, 방사선 감작제, 스테로이드, 탁산, 토포이소머라제 억제제, 빈카 알카로이드 등을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 치료제는 알킬화제, 항-대사물질, 항유사분열, 토포이소머라제 억제제, 또는 혈관신생 억제제이다.
본 개시내용에서 유용한 화학요법제는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 사이클로포스파미드(CYTOXAN); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예컨대 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스파오라미드 및 트리메틸올로멜라민; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비신, 펜네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드 니트로스우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대 아클라시노미신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사산물, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시토신 아라비노시드, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항-부신, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 틸로스탄; 엽산 보충물, 예컨대 폴린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘프로미틴; 엘립티늄 아세테이트 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 미피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK; 라족산; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드(Ara-C); 탁소이드, 예컨대 파클리탁셀(TAXOL) 및 도세탁셀(TAXOTERE); 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; CPT11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노산; 에스페라미신; 카페시타빈(XELODA); 및 상기의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 화학요법제는 또한, 예컨대 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(FARESTON)을 포함하는 항-에스트로겐; 및 항-안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류플로라이드, 및 고세렐린; 및 상기의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체와 같은 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하도록 작용하는 항-호르몬제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 시스플라틴이다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 카르보플라틴이다.
특정 실시양태에서, 화학요법제는 토포이소머라제 억제제이다. 토포이소머라제 억제제는 토포이소머라제 효소(예컨대, 토포이소머라제 I 또는 II)의 작용을 방해하는 화학요법제이다. 토포이소머라제 억제제는 독소루비신 HCl, 다우노루비신 시트레이트, 미톡산트론 HCl, 악티노마이신 D, 에토포시드, 토포테칸 HCl, 테니포시드(VM-26), 및 이리노테칸 뿐만 아니라 이들 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산, 또는 유도체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들의. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 이리노테칸이다.
특정 실시양태에서, 화학요법제는 항-대사물질이다. 항-대사물질은 정상적인 생화학 반응에 필요한 대사산물과 유사한 구조를 갖는 화학 물질이지만 세포 분열과 같은 세포의 하나 이상의 정상적인 기능을 방해할 만큼 충분히 상이하다. 항-대사물질은 젬시타빈, 플루오로우라실, 카페시타빈, 메토트렉세이트 나트륨, 랄리트렉세드, 페메트렉세드, 테가푸르, 시토신 아라비노시드, 티오구아닌, 5-아자시티딘, 6 메르캅토퓨린, 아자티오프린, 6-티오구아닌, 펜토스타틴, 플루다라빈 포스페이트, 및 클라드리빈 뿐만 아니라 이들 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산, 또는 유도체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 젬시타빈이다.
특정 실시양태에서, 화학요법제는 투불린에 결합하는 작용제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 항유사분열제이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 탁산이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 파클리탁셀 또는 도세탁셀, 또는 파클리탁셀 또는 도세탁셀의 약제학적으로 허용되는 염, 산, 또는 유도체이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 파클리탁셀(TAXOL), 도세탁셀(TAXOTERE), 알부민 결합된 파클리탁셀(ABRAXANE), DHA-파클리탁셀, 또는 PG-파클리탁셀이다. 특정한 대안적 실시양태에서, 항유사분열제는 빈카 알칼로이드, 예컨대 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 또는 빈데신, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 산, 또는 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항유사분열제는 키네신 Eg5의 억제제 또는 유사분열 키나제의 억제제, 예컨대 오로라 A(Aurora A) 또는 Plk1이다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 파클리탁셀이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 알부민 결합된 파클리탁셀이다.
일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 소분자와 같은 작용제를 포함한다. 예컨대, 치료는 EGFR, HER2(ErbB2), 및/또는 VEGF를 포함하지만 이에 제한되지 않는 종양 관련된 항원에 대한 억제제로서 작용하는 소분자와 본 개시내용의 작용제의 조합 투여를 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 작용제는 게피티닙(IRESSA), 에를로티닙(TARCEVA), 수니티닙(SUTENT), 라파타닙, 반데타닙(ZACTIMA), AEE788, CI-1033, 세디라닙(RECENTIN), 소라페닙(NEXAVAR) 및 파조파닙(GW786034B)으로 이루어진 군으로부터 선태되는 단백질 키나제 억제제와 조합하여 투여된다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 mTOR 억제제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 추가의 치료제는 Treg 세포의 수를 감소시키는 화학요법 또는 다른 억제제이다. 특정 실시양태에서, 치료제는 사이클로포스파미드 또는 항-CTLA4 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 추가의 치료제는 골수 유래된 억제 세포의 존재를 감소시킨다. 추가 실시양태에서, 추가의 치료제는 카르보탁솔이다. 또 다른 실시양태에서, 추가의료제는 세포를 T 헬퍼 1 반응으로 이동시킨다. 추가 실시양태에서, 추가의 치료제는 이브루티닙이다.
일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 항체와 같은 생물학적 분자를 포함한다. 예컨대, 치료는 EGFR, HER2/ErbB2 및/또는 VEGF에 결합하는 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 종양 관련 항원에 대한 항체와 본 개시내용의 작용제의 조합 투여를 수반할 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 암 줄기 세포 마커에 특이적인 항체이다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 혈관신생 억제제인 항체(예컨대, 항-VEGF 또는 VEGF 수용체 항체)이다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 베바시주맙(AVASTIN), 라무시루맙, 트라스투주맙(HERCEPTIN), 페르투주맙(OMNITARG), 파니투무맙(VECTIBIX), 니모투주맙, 잘루투무맙 또는 세툭시맙(ERBITUX)이다.
본원에 제공된 작용제 및 조성물은 단독으로 또는 수술, 방사선 조사, 화학요법 및/또는 골수 이식(자가, 동계, 동종이계 또는 비관련)과 같은 통상적인 치료 요법과 조합하여 사용될 수 있다. 종양 항원 세트는, 예컨대 암 환자의 많은 부분에서 유용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역원성 백신을 포함하는 조성물에 추가하여 적어도 하나의 화학요법제가 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 화학요법제는 상이한 부류의 화학요법제에 속할 수 있다.
화학요법제의 예는 알킬화제, 예컨대 질소 머스타드(예컨대, 메클로레타민(질소 머스타드), 클로람부실, 사이클로포스파미드(Cytoxan®), 이포스파미드, 및 멜팔란); 니트로소우레아(예컨대, N-니트로소-N-메틸우레아, 스트렙토조신, 카르무스틴(BCNU), 로무스틴, 및 세무스틴); 알킬 술포네이트(예컨대, 부술판); 테트라진(예컨대, 다카르바진(DTIC), 미토졸로미드 및 테모졸로미드(Temodar®)); 아지리딘(예컨대, 티오테파, 미토마이신 및 디아지쿠온); 및 백금 약물(예컨대, 시스플라틴, 카르보플라틴, 및 옥살리플라틴); 비-고전적 알킬화제, 예컨대 프로카르바진 및 알트레타민(헥사메틸멜라민); 항-대사산물제, 예컨대 5-플루오로우라실(5-FU), 6-메르캅토퓨린(6-MP), 카페시타빈(Xeloda®), 클라드리빈, 클로파라빈, 시타라빈(Ara-C®), 데시타빈, 플록수리딘, 플루다라빈, 넬라라빈, 젬시타빈(Gemzar®), 히드록시우레아, 메토트렉세이트, 페메트렉세드(Alimta®), 펜토스타틴, 티오구아닌, 비다자; 항-미세소관제, 예컨대 빈카 알카로이드(예컨대, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신 및 빈플루닌); 탁산(예컨대, 파클리탁셀(Taxol®), 도세탁셀(Taxotere®)); 포도필로톡신(예컨대, 에토포시드 및 테니포시드); 에포틸론(예컨대, 익사베필론(Ixempra®)); 에스트라무스틴(Emcyt®); 항-종양 항생제, 예컨대 안트라사이클린(예컨대, 다우노루비신, 독소루비신(Adriamycin®, 에피루비신, 이다루비신); 악티노마이신-D; 및 블레오마이신; 토포이소머라제 I 억제제, 예컨대 토포테칸 및 이리노테칸(CPT-11); 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대 에토포시드(VP-16), 테니포시드, 미톡산트론, 노보비오신, 메르바론 및 아클라루비신; 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니손, 메틸프레드니솔론(Solumedrol®), 및 덱사메타손(Decadron®); L-아스파라기나제; 보르테조밉(Velcade®); 면역치료제, 예컨대 리툭시맙(Rituxan®), 알렘투주맙(Campath®), 탈리도미드, 레날리도미드(Revlimid®), BCG, 인터루킨-2, 인터페론-알파 및 암 백신, 예컨대 Provenge®; 호르몬 치료제, 예컨대 풀베스트란트(Faslodex®), 타목시펜, 토레미펜(Fareston®), 아나스트로졸(Arimidex®), 엑세메스탄(Aromasin®), 레트로졸(Femara®), 메게스트롤 아세테이트(Megace®), 에스트로겐, 비칼루타미드(Casodex®), 플루타미드(Eulexin®), 닐루타미드(Nilandron®), 류플로라이드(Lupron®) 및 고세렐린(Zoladex®); 분화제, 예컨대 레티노이드, 트레티노인(ATRA 또는 Atralin®), 벡사로텐(Targretin®) 및 아르세닉 트리옥사이드(Arsenox®); 및 표적화된 호르몬 치료제, 예컨대 이마티닙(Gleevec®), 게피티닙(Iressa®) 및 수니티닙(Sutent®)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 화학요법은 칵테일 요법이다. 칵테일 요법의 예는 CHOP/R-CHOP(리툭산, 사이클로포스파미드, 히드록시독소루비신, 빈크리스틴, 및 프레드니손), EPOCH(에토포시드, 프레드니손, 빈크리스틴, 사이클로포스파미드, 히드록시독소루비신), 하이퍼-CVAD(사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 히드록시독소루비신, 덱사메타손), FOLFOX(플루오로우라실(5-FU), 류코보린, 옥살리플라틴), ICE(이포스파미드, 카르보플라틴, 에토포시드), DHAP(고용량 시타라빈 [ara-C], 덱사메타손, 시스플라틴), ESHAP(에토포시드, 메틸프레드니솔론, 시타라빈 [ara-C], 시스플라틴) 및 CMF(사이클로포스파미드, 메토트렉세이트, 플루오우라실)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 제2 면역치료제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가의 면역치료제는 콜로니 자극 인자, 인터루킨, 면역억제 기능을 차단하는 항체(예컨대, 항-CTLA-4 항체, 항-CD28 항체, 항-CD3 항체 , 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-TIGIT 항체), 면역 세포 기능을 향상시키는 항체(예컨대, 항-GITR 항체, 항-OX-40 항체, 항-CD40 항체) 또는 항-4-1BB 항체), 톨-유사 수용체(예컨대, TLR4, TLR7, TLR9), 가용성 리간드(예컨대, GITRL, GITRL-Fc, OX-40L, OX-40L-Fc, CD40L, CD40L-Fc, 4-1BB 리간드, 또는 4-1BB 리간드-Fc), 또는 B7 계열의 구성원(예컨대, CD80, CD86)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 추가의 면역치료제는 CTLA-4, CD28, CD3, PD-1, PD-L1, TIGIT, GITR, OX-40, CD-40, 또는 4-1BB를 표적화한다.
일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 면역 체크포인트 억제제이다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-CD28 항체, 항-TIGIT 항체, 항-LAG3 항체, 항-TIM3 항체, 항-GITR 항체, 항-4-1BB 항체, 또는 항-OX-40 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 항-TIGIT 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 니볼루맙(OPDIVO), 펨브롤리주맙(KEYTRUDA), 피딜주맙, MEDI0680, REGN2810, BGB-A317, 및 PDR001로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-PD-1 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 BMS935559(MDX-1105), 아텍솔리주맙(MPDL3280A), 두르발루맙(MEDI4736), 및 아벨루맙(MSB0010718C)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-PD-L1 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 이필리무맙(YERVOY) 및 트레멜리무맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-CTLA-4 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 BMS-986016 및 LAG525로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-LAG-3 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 MEDI6469, MEDI0562, 및 MOXR0916으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-OX-40 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 PF-05082566으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-4-1BB 항체이다.
일부 실시양태에서, 신생항원 치료제는 아드레노메둘린(AM), 안기오포이에틴(Ang), BMPs, BDNF, EGF, 에리트로포이에틴(EPO), FGF, GDNF, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구-대식구 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 대식구 콜로니 자극 인자(M-CSF), 줄기 세포 인자(SCF), GDF9, HGF, HDGF, IGF, 이동-자극 인자, 미오스타틴(GDF-8), NGF, 뉴트로핀, PDGF, 트롬보포이에틴, TGF-α, TGF-β, TNF-α, VEGF, PlGF, 감마-IFN, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, 및 IL-18로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 분자와 조합하여 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 신생항원 치료제를 사용한 치료는 종양의 외과적 제거, 암세포의 제거, 또는 치료 의사에 의해 필요하다고 간주되는 임의의 다른 외과적 요법을 수반할 수 있다.
특정 실시양태에서, 치료는 방사선 요법과 조합하여 본원에 기재된 신생항원 치료제의 투여를 수반한다. 작용제를 사용한 치료는 방사선 요법의 투여 전, 투여와 동시에, 또는 투여 후에 발생할 수 있다. 이러한 방사선 요법에 대한 투여 일정은 숙련된 의사에 의해 결정될 수 있다.
조합 투여는 단일 약제학적 제형으로 또는 별도의 제형을 사용하여 공동 투여하거나, 모든 활성제가 생물학적 활성을 동시에 발휘할 수 있도록 하는 어느 한 순서로 그러나 일반적으로 일정한 기간 내에 연속 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 신생항원 치료제와 적어도 하나의 추가의 치료제의 조합이 임의의 순서로 또는 공동으로 투여될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 이전에 제2 치료제로 치료를 받은 환자에게 투여될 것이다. 특정한 다른 실시양태에서, 신생항원 치료제 및 제2 치료제는 실질적으로 동시에 또는 공동으로 투여될 것이다. 예컨대, 대상체는 제2 치료제(예컨대, 화학요법)로 치료 과정을 거치는 동안 작용제를 받을 수 있다. 특정 실시양태에서, 신생항원 치료제는 제2 치료제로 치료한 지 1년 이내에 투여될 것이다. 2개 (또는 그 초과)의 작용제 또는 치료제가 몇 시간 또는 몇 분 이내에(즉, 실질적으로 동시에) 대상체에게 투여될 수 있다는 것이 추가로 이해될 것이다.
질환의 치료를 위해, 본원에 기재된 신생항원 치료제의 적절한 용량은 치료될 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 질환의 반응성, 작용제가 치료 또는 예방용으로 투여되는지 여부, 이전 요법, 환자의 임상 병력 등에 따라 모두 담당 의사의 재량에 따라 결정된다. 신생항원 치료제는 1회 또는 수일 내지 수개월 동안 지속되는 일련의 치료에 걸쳐, 또는 치유가 이루어지거나 질환 상태의 감소(예컨대, 종양 크기의 감소)가 달성될 때까지 투여될 수 있다. 최적의 투여 일정은 환자 신체내 약물 축적 측정값으로부터 계산될 수 있으며, 개별 작용제의 상대적 효능에 따라 달라질 것이다. 담당 의사는 최적의 용량, 투여 방법 및 반복률을 결정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 신생항원 치료제는 초기에 더 높은 "로딩" 용량으로 투여된 후, 하나 이상의 더 낮은 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 빈도도 변경될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 요법은 초기 용량을 투여한 후 추가 용량 (또는 "유지" 용량)을 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 또는 매월 1회 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예컨대, 투여 요법은 초기 로딩 용량을 투여한 후, 예컨대 초기 용량의 1/2의 주간 유지 용량을 투여하는 것을 포함할 수 있고; 투여 요법은 초기 로딩 용량을 투여한 후, 예컨대 격주로 초기 용량의 1/2의 유지 용량을 투여하는 것을 포함할 수 있고; 또는 투여 요법은 3주 동안 3회의 초기 용량을 투여한 후, 예컨대 격주로 동일한 양의 유지 용량을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 임의의 치료제의 투여는 부작용 및/또는 독성을 유발할 수 있다. 일부 경우에서, 부작용 및/또는 독성이 너무 심하여 특정 작용제를 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 방해할 수 있다. 일부 경우에서, 요법을 중단해야 하며 다른 작용제가 시도될 수 있다. 그러나, 동일한 치료제 부류의 많은 작용제는 유사한 부작용 및/도는 독성을 나타내며, 이는 환자가 요법을 중단해야 하거나, 가능한 경우, 치료제와 관련된 불쾌한 부작용을 겪는다는 것을 의미한다.
일부 실시양태에서, 투여 일정은 특정 횟수의 투여 또는 "주기"로 제한될 수 있다. 일부 실시양태에서, 작용제는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 그 초과의 주기 동안 투여된다. 예컨대, 작용제는 6주기 동안 2주마다 투여되고, 6주기 동안 작용제는 3주마다 투여되고, 4주기 동안 작용제는 2주마다 투여되고, 4주기 동안 작용제는 3주마다 투여된다. 투여 일정은 당업자에 의해 결정되고 후속적으로 변형될 수 있다.
본 개시내용은 작용제, 화학요법제 등의 투여와 관련된 부작용 및/또는 독성을 감소시킬 수 있는, 하나 이상의 작용제를 투여하기 위한 간헐적 투여 전략을 이용하는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 신생항원 치료제를 대상체에게 투여하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법은 치료학적 유효량의 신생항원 치료제를 치료학적 유효량의 화학요법제와 조합하여 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 작용제 중 하나 또는 둘 모두는 간헐적 투여 전략에 따라 투여된다. 일부 실시양태에서, 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법은 대상체에게 치료학적 유효량의 신생항원 치료제를 치료학적 유효량의 제2 면역치료제와 조합하여 투여하는 단계를 포함하고, 작용제 중 하나 또는 둘 모두는 간헐적 투여 전략에 따라 투여된다. 일부 실시양태에서, 간헐적 투여 전략은 대상체에게 신생항원 치료제의 초기 용량을 투여하고, 약 2주마다 약 1회 작용제의 후속 용량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 간헐적 투여 전략은 대상체에게 신생항원 치료제의 초기 용량을 투여하고, 약 3주마다 약 1회 작용제의 후속 용량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 간헐적 투여 전략은 신생항원 치료제의 초기 용량을 대상체에게 투여하고, 약 4주마다 약 1회 작용제의 후속 용량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 작용제는 간헐적 투여 전략을 이용하여 투여되고 추가의 치료제는 매주 투여된다.
본 개시내용은 본원에 기재된 신생항원 치료제를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 또한 본원에 기재된 신생항원 치료제 및 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 면역요법에 사용된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 종양 성장을 억제하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 대상체(예컨대, 인간 환자)에서 종양 성장을 억제하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 암 치료에 사용된다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 대상체(예컨대, 인간 환자)에서 암을 치료하는 데 사용된다.
제형은 본 개시내용의 신생항원 치료제를 약제학적으로 허용되는 비히클(예컨대, 담체 또는 부형제)과 조합함으로써 저장 및 사용을 위해 제조된다. 당업자는 일반적으로 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 안정화제를 제형 또는 약제학적 조성물의 불활성 성분으로 간주한다. 예시적인 제형은 WO 2015/095811에 열거되어 있다.
적합한 약제학적으로 허용되는 비히클은 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않은다: 무독성 버퍼, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 염, 예컨대 염화나트륨; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제, 예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥산올, 3-펜탄올, 및 m-크레졸; 저분자량 폴리펩티드(예컨대, 약 10개 미만의 아미노산 잔기); 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 친수성 폴리머, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 탄수화물, 예컨대 단당류, 이당류, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 슈가, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 카운터 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물, 예컨대 Zn-단백질 착물; 및 비-이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG. (Remington: Science and Practice of Pharmacy, 22st Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London.). 일부 실시양태에서, 비히클은 물 중의 5% 덱스트스이다.
한 측면에서, 약제학적 투여에 적합한 용매(수성 또는 비-수성), 용액, 에멀젼, 분산 매질, 코팅제, 등장제, 흡수 촉진제 또는 지연제를 포함하는 약제학적으로 허용되거나 생리학적으로 허용되는 조성물이 본원에 제공된다. 따라서, 약제학적 조성물 또는 약제학적 제형은 대상체에서 약제학적 사용에 적합한 조성물을 지칭한다. 조성물은 특정 투여 경로(즉, 전신 또는 국소)에 적합하게 제형화될 수 있다. 따라서, 조성물은 다양한 경로에 의한 투여에 적합한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 조성물 내 면역 세포의 안정성을 개선하기 위해 허용되는 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 허용되는 첨가제는 면역 세포의 특정 활성을 변경하지 않을 수 있다. 허용되는 첨가제의 예는 만니톨, 소르비톨, 글루코스, 자일리톨, 트레할로스, 소르보스, 수크로스, 갈락토스, 덱스트란, 덱스트스, 프룩토스, 락토스, 및 이들의 혼합물과 같은 슈가를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 허용되는 첨가제는 허용되는 담체 및/또는 부형제, 예컨대 덱스트스와 조합될 수 있다. 대안적으로, 허용되는 첨가제의 예는 펩티드의 안정성을 증가시키고 용액의 겔화를 감소시키기 위한 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80과 같은 계면활성제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 계면활성제는 용액의 0.01% 내지 5%의 양으로 조성물에 추가될 수 있다. 이러한 허용가능한 첨가제의 첨가는 저장 시 조성물의 안정성 및 반감기를 증가시킨다.
본원에 기재된 약제학적 조성물은 국소 또는 전신 치료를 위해 임의의 수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 표피 또는 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 젤, 점적제, 좌제, 스프레이, 액체 및 분말에 의한 국부적; 분무기에 의하는 것을 포함하는 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기, 기관내, 및 비강내에 의한 폐; 경구; 또는 정맥내, 동맥내, 종양내, 피하, 복강내, 근육내(예컨대, 주사 또는 주입), 또는 두개내(예컨대, 경막내 또는 뇌실내)를 포함하는 비경구일 수 있다.
약제학적 조성물은, 예컨대 주사에 의해 투여될 수 있다. 투여는 피내 주사, 비강내 스프레이 적용, 근육내 주사, 복강내 주사, 정맥내 주사, 경구 투여 또는 피하 주사일 수 있다. 주사용 조성물은 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리식염수, 정균수 또는 포스페이트 완충된 식염수(PBS)를 포함한다. 담체는, 예컨대 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 유동성은, 예컨대 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우, 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 항세균제 및 항진균제는, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산 및 티메로살을 포함한다. 등장화제, 예컨대 슈가, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 및 염화나트륨이 조성물에 포함될 수 있다. 생성된 용액은 그대로 사용하기 위해 포장되거나 동결건조될 수 있고; 동결건조된 제제는 나중에 투여 전에 멸균 용액과 조합될 수 있다. 정맥 주사, 또는 병든 부위에 주사하는 경우, 활성 성분은 발열원이 없고 적절한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태일 것이다. 당업자는, 예컨대 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 락테이트화된 링거 주사액과 같은 등장성 비히클을 사용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다. 필요에 따라, 보존제, 안정화제, 버퍼, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 포함될 수 있다. 멸균 주사 용액은 필요에 따라 상기에 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 성분을 혼입한 후 여과 멸균하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 성분을 기본 분산 매질 및 상기에 열거된 것들로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조일 수 있으며, 이는 활성 성분의 분말 + 사전에 멸균 여과된 이의 용액으로부터 임의의 추가의 원하는 성분을 생성한다.
조성물은, 예컨대 단위 용량의 주사와 같이 통상적으로 정맥내 투여될 수 있다. 주사를 위해, 활성 성분은 실질적으로 발열원이 없고 적절한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태일 수 있다. 예컨대, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 락테이트화된 링거 주사액과 같은 등장성 비히클을 사용하여 적합한 용액을 제조할 수 있다. 필요에 따라 보존제, 안정화제, 버퍼, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 포함될 수 있다. 추가로, 조성물은 에어로졸화를 통해 투여될 수 있다.
조성물이 의약 또는 본원에 제공된 임의의 방법에 사용하기 위해 고려될 때, 조성물이 인간 환자에게 투여될 때 염증 반응 또는 불안전한 알레르기 반응을 일으키지 않도록 조성물은 발열원이 실질적으로 없을 수 있는 것으로 고려된다. 발열원에 대해 조성물을 시험하고 발열원이 실질적으로 없는 조성물을 제조하는 것은 당업자에게 잘 이해되고 있으며 시판되는 키트를 사용하여 달성될 수 있다.
허용되는 담체는 흡수를 안정화, 증가 또는 지연시키거나 제거를 증가 또는 지연시키는 화합물을 함유할 수 있다. 이러한 화합물은 탄수화물, 예컨대 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란; 저분자량 단백질; 펩티드의 제거 또는 가수분해를 감소시키는 조성물; 또는 부형제 또는 다른 안정화제 및/또는 버퍼를 포함한다. 흡수를 지연시키는 제제는, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함한다. 세제는 또한 리포좀 캐리어를 포함하는 약제학적 조성물의 흡수를 안정화시키거나 증가 또는 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 분해로부터 보호하기 위해, 화합물은 산성 및 효소 가수분해에 내성이 되도록 하는 조성물과 복합체를 형성할 수 있거나, 화합물은 리포좀과 같은 적절한 내성 담체에서 복합체를 형성할 수 있다. 분해로부터 화합물을 보호하는 수단은 당업계에 공지되어 있다(예컨대, Fix (1996) Pharm Res. 13:1760 1764; Samanen (1996) J. Pharm. Pharmacol. 48:119 135; 미국 특허 번호 5,391,377).
조성물은 투여 제형에 적합한 방식으로, 치료학적 유효량으로 투여될 수 있다. 투여될 양은 치료될 대상체, 활성 성분을 이용하는 대상체의 면역계의 능력, 및 원하는 결합 능력의 정도에 의존한다. 투여에 필요한 활성 성분의 정확한 양은 의사의 판단에 따라 다르며 개인마다 다르다. 초기 투여 및 부스터 샷에 적합한 요법도 가변적이지만, 초기 투여 후 후속 주사 또는 다른 투여에 의해 1시간 이상의 간격으로 반복 투여되는 것이 대표적이다. 대안적으로, 혈액 내 농도를 유지하기에 충분한 지속적인 정맥내 주입이 고려된다.
일부 경우에서, 하나 이상의 작용제를 포함하는 약제학적 조성물은 국부 투여되거나 특정 감염 부위 또는 그 부근에서 주사될 때 국소 및 부위 효과를 발휘한다. 예컨대, 국소 및/또는 부위 효과를 생성하기 위해, 점성 액체, 용액, 현탁액, 디메틸술폭사이드(DMSO) 기반 용액, 리포좀 제형, 젤, 젤리, 크림, 로션, 연고, 좌제, 포음 또는 에어로졸 스프레이와 같은 직접적 국부 적용이 국소 투여에 사용될 수 있다. 이러한 제형을 위한 약제학적으로 적절한 비히클은, 예컨대 저급 지방족 알콜, 폴리글리콜(예컨대, 글리세롤 또는 폴리에틸렌 글리콜), 지방산의 에스테르, 오일, 지방, 실리콘 등을 포함한다. 이러한 제제는 또한 보존제(예컨대, p-하이드록시벤조산 에스테르) 및/또는 항산화제(예컨대, 아스코르브산 및 토코페롤)를 포함할 수 있다. 또한, 문헌(Dermatological Formulations: Percutaneous absorption, Barry (Ed.), Marcel Dekker Incl, 1983)을 참조한다. 또 다른 실시양태에서, 수송체, 캐리어 또는 이온 채널 억제제를 포함하는 국소/국부 제형은 표피 또는 점막 바이러스 감염을 치료하는 데 사용된다.
일부 경우에서, 면역원성 약제학적 조성물은 담체 및 부형제(버퍼, 탄수화물, 만니톨, 단백질, 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대 글리신, 항산화제, 정균제, 킬레이트제, 현탁제, 증점제, 및/또는 보존제를 포함하지만 이에 제한되지 않음), 물, 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 오일을 포함하는 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등, 식염수 용액, 덱스트스 및 글리세롤 수용액, 향미제, 착색제, 점착 제거제 및 다른 허용되는 첨가제, 애주번트 또는 결합제, 생리학적 조건을 근사화하는 데 필요한 다른 약제학적으로 허용되는 보조 물질, 예컨대 pH 완충제, 장성 조절제, 유화제, 습윤제 등을 포함할 수 있다. 부형제의 예는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유 건조, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 또 다른 경우에서, 약제학적 제제는 보존제가 실질적으로 없다. 다른 경우에서, 약제학적 제제는 적어도 하나의 보존제를 함유할 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 적합한 담체를 사용하여 본원에 기재된 약제학적 조성물을 투여할 수 있지만, 담체의 유형은 투여 방식에 따라 변할 것이라는 것이 인식될 것이다.
면역원성 약제학적 조성물은 티오메르살 또는 2-페녹시에탄올과 같은 보존제를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 면역원성 약제학적 조성물은, 예컨대 수은 물질이 실질적으로 없으며(예컨대, <10 μg/mL), 예컨대 티오메르살이 없다. α-토코페롤 숙시네이트는 수은 화합물의 대안으로 사용될 수 있다.
장성을 제어하기 위해, 나트륨염과 같은 생리학적 염이 면역원성 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 다른 염은 염화칼륨, 인산이수소칼륨, 인산이나트륨, 및/또는 염화마그네슘 등을 포함할 수 있다.
면역원성 약제학적 조성물은 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 240-360 mOsm/kg, 또는 290-310 mOsm/kg 범위의 삼투질농도를 가질 수 있다.
면역원성 약제학적 조성물은 하나 이상의 버퍼, 예컨대 트리스 버퍼; 보레이트 버퍼; 숙시네이트 버퍼; 히스티딘 버퍼(특히 수산화알루미늄 애주번트를 갖는 버퍼); 또는 시트레이트 버퍼를 포함할 수 있다. 버퍼는, 일부 경우에서, 5-20 또는 10-50 mM 범위로 포함된다.
면역원성 약제학적 조성물은 pH 조절제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, pH 조절제는 1 mM 미만 또는 1 mM 초과의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, pH 조절제는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 nM, 또는 1 mM 미만의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, pH 조절제는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900 mM 초과의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, pH 조절제는 디카르복실레이트 염이다. 일부 실시양태에서, pH 조절제는 트리카르복실레이트 염이다. 일부 실시양태에서, pH 조절제는 숙신산의 디카르복실레이트 염이다. 일부 실시양태에서, pH 조절제는 디숙시네이트 염이다. 일부 실시양태에서, pH 조절제는 시트르산의 트리카르복실레이트 염이다. 일부 실시양태에서, pH 조절제는 트리시트레이트 염이다. 일부 실시양태에서, pH 조절제는 이나트륨 숙시네이트이다. 일부 실시양태에서, 숙신산의 디카르복실레이트 염은 0.1 mM - 1 mM의 농도로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시양태에서, 디숙시네이트 염은 0.1 mM - 1 mM의 농도로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시양태에서, 숙신산의 디카르복실레이트 염은 1 mM - 5 mM의 농도로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시양태에서, 디숙시네이트 염은 1 mM - 5 mM의 농도로 약제학적 조성물에 존재한다. 면역원성 약제학적 조성물의 pH는 약 5.0 내지 약 8.5, 약 6.0 내지 약 8.0, 약 6.5 내지 약 7.5, 또는 약 7.0 내지 약 7.8일 수 있다.
면역원성 약제학적 조성물은 멸균될 수 있다. 면역원성 약제학적 조성물은 비-발열성으로, 예컨대 용량당 <1 EU(내독소 단위, 표준 측정치)를 함유할 수 있고, 용량당 <0.1 EU일 수 있다. 조성물은 글루텐이 없을 수 있다.
면역원성 약제학적 조성물은 세제, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제('트윈'으로 공지됨), 또는 옥톡시놀(예컨대, 옥톡시놀-9(트리톤 X-100) 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올)을 포함할 수 있다. 세제는 미량으로만 존재할 수 있다. 면역원성 약제학적 조성물은 옥톡시놀-10 및 폴리소르베이트 80 각각을 1 mg/mL 미만으로 포함할 수 있다. 미량의 다른 잔류 성분은 항생제(예컨대, 네오마이신, 카나마이신, 폴리믹신 B)일 수 있다.
면역원성 약제학적 조성물은 당업계에 널리 공지된 적절한 비히클에서 멸균 용액 또는 현탁액으로 제형화될 수 있다. 약제학적 조성물은 통상적이고 널리 공지된 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있거나 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 그대로 사용하기 위해 포장되거나 동결건조될 수 있으며, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 용액과 조합된다.
예컨대, 본원에 개시된 면역 세포와 같은 활성제를 하나 이상의 애주번트와 조합하여 포함하는 약제학적 조성물은 특정 몰비를 포함하도록 제형화될 수 있다. 예컨대, 약 99:1 내지 약 1:99의 활성제, 예컨대 본원에 기재된 면역 세포가 하나 이상의 애주번트와 조합되어 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 본원에 기재된 면역 세포와 같은 활성제의 몰비 범위는 하나 이상의 애주번트와 조합하여 약 80:20 내지 약 20:80; 약 75:25 내지 약 25:75, 약 70:30 내지 약 30:70, 약 66:33 내지 약 33:66, 약 60:40 내지 약 40:60; 약 50:50; 및 약 90:10 내지 약 10:90로부터 선택될 수 있다. 본원에 기재된 면역 세포와 같은 활성제의 몰비는 하나 이상의 애주번트와 조합하여 약 1:9일 수 있고, 일부 경우에는 약 1:1일 수 있다. 본원에 기재된 면역 세포와 같은 활성제는 하나 이상의 애주번트와 조합하여 동일한 투여 단위, 예컨대 하나의 바이알, 좌제, 정제, 캡슐, 에어로졸 스프레이에 함께 제형화될 수 있거나; 각각의 작용제, 형태 및/또는 화합물은 별도의 단위, 예컨대 2개의 바이알, 좌제, 정제, 2개의 캡슐, 정제 및 바이알, 에어로졸 스프레이 등으로 제형화될 수 있다.
치료 제형은 단위 투여 형태일 수 있다. 이러한 제형은 정제, 환제, 캡슐, 분말, 과립, 용액, 또는 물 또는 비-수성 매질 중의 현탁액, 또는 좌제를 포함한다.
본원에 기재된 신생항원 펩티드는 또한 마이크로캡슐에 포획될 수 있다. 이러한 마이크로캡슐은, 예컨대 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해, 예컨대 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐 각각에서, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예컨대, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 문헌(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22st Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London)에 기재된 바와 같은 마크로에멀젼에서 제조된다.
특정 실시양태에서, 약제학적 제형은 리포좀과 복합체화된 본원에 기재된 신생항원 치료제를 포함한다. 리포좀을 생성하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예컨대, 일부 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발에 의해 생성될 수 있다. 리포좀은 정의된 기공 크기의 필터를 통해 압출하여 원하는 직경을 갖는 리포좀을 생성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 신생항원 펩티드를 포함하는 서방성 제제가 생성될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 작용제를 함유하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 매트릭스는 성형품(예컨대, 필름 또는 마이크로캡슐) 형태이다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔, 예컨대 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐 알콜), 폴리락티드, L-글루탐산과 7 에틸-L-글루타메이트의 코폴리머, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 코폴리머, 예컨대 LUPRON DEPOTTM(락트산-글리콜산 코폴리머 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사 가능한 마이크로스피어), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
본 개시내용은 면역원성 백신을 포함하는 치료 방법을 제공한다. 질환(예컨대, 암 또는 바이러스 감염)에 대한 치료 방법이 제공된다. 방법은 면역원성 항원을 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 바이러스 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 종양 항원을 포함한다.
제조될 수 있는 백신의 비제한적인 예는 펩티드 기반 백신, 핵산 기반 백신, 항체 기반 백신 및 항원 제시 세포 기반 백신을 포함한다.
백신 조성물은 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로 활성제의 가공을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체를 사용하여 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 임의의 널리 공지된 기술, 담체 및 부형제가 적절하고 당업계에서 이해되는 바와 같이 사용될 수 있다.
일부 경우에서, 백신 조성물은 펩티드 기반 백신, 핵산 기반 백신, 항체 기반 백신 또는 세포 기반 백신으로 제형화된다. 예컨대, 백신 조성물은 양이온성 지질 제형에 네이키드 cDNA; 리포펩티드(예컨대, 문헌(Vitiello, A. et al., J. Clin. Invest. 95:341, 1995) 참조), 예컨대 폴리(DL-락티드-코-글르콜리드)("PLG") 마이크로스피어에 캡슐화된 노출된 cDNA 또는 펩티드(예컨대, 문헌(Eldridge, et al., Molec. Immunol. 28:287-294, 1991: Alonso et al, Vaccine 12:299-306, 1994; Jones et al, Vaccine 13:675-681, 1995) 참조); 면역 자극 복합체(ISCOMS)에 함유된 펩티드 조성물(예컨대, 문헌(Takahashi et al, Nature 344:873-875, 1990; Hu et al, Clin. Exp. Immunol. 113:235-243, 1998) 참조); 또는 다중 항원 펩티드 시스템(MAP) (예컨대, 문헌 (Tam, J. P., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 85:5409-5413, 1988; Tarn, J.P., J. Immunol. Methods 196:17-32, 1996) 참조)를 포함할 수 있다. 때때로, 백신은 펩티드 기반 백신 또는 핵산이 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 기반 백신으로 제형화된다. 때때로, 백신은 항체 기반 백신으로 제형화된다. 때때로 백신은 세포 기반 백신으로 제형화된다.
확인된 질환 특이적 면역원성 신생항원 펩티드의 아미노산 서열은 약제학적으로 허용되는 조성물을 개발하는 데 사용될 수 있다. 항원의 공급원은 당단백질, 펩티드 및 슈퍼항원을 포함하는 천연 또는 합성 단백질; 항체/항원 복합체; 지단백질; RNA 또는 이의 번역 생성물; 및 DNA 또는 DNA에 의해 코딩되는 폴리펩티드일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 항원의 공급원은 또한 형질전환되지 않은, 형질전환된, 형질감염된 또는 형질도입된 세포 또는 세포주를 포함할 수 있다. 세포는 재조합 항원을 발현하는 데 사용될 수 있는 당업자에게 공지된 임의의 다양한 발현 또는 레트로바이러스 벡터를 사용하여 형질전환, 형질감염 또는 형질도입될 수 있다. 발현은 또한 재조합 항원(들)을 코딩하는 DNA 분자를 함유하는 발현 또는 레트로바이러스 벡터로 형질전환, 형질감염 또는 형질도입된 임의의 적절한 숙주 세포에서 달성될 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 수의 형질감염, 형질전환 및 형질도입 프로토콜이 사용될 수 있다. 재조합 백시니아 벡터 및 백시니아 벡터로 감염된 세포는 항원의 공급원으로 사용될 수 있다.
약제학적 조성물은 합성 질환 특이적 면역원성 신생항원 펩티드를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 2개 이상의 질환 특이적 면역원성 신생항원 펩티드를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 질환 특이적 면역원성 펩티드(예컨대, 단백질, 펩티드, DNA 및 RNA)에 대한 전구체를 포함할 수 있다. 질환 특이적 면역원성 펩티드에 대한 전구체는 확인된 질환 특이적 면역원성 신생항원 펩티드를 생성하거나 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료 조성물은 면역원성 펩티드의 전구체를 포함한다. 질환 특이적 면역원성 펩티드의 전구체는 전구약물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 질환 특이적 면역원성 신생항원 펩티드를 포함하는 약제학적 조성물은 애주번트를 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 신생항원 펩티드는 백신으로 활용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역원성 백신은 약제학적으로 허용되는 면역원성 신생항원 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역원성 백신은 면역원성 신생항원 펩티드(예컨대, 단백질, 펩티드, DNA 및 RNA)에 대한 약제학적으로 허용되는 전구체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료 방법은 면역원성 신생항원 펩티드를 특이적으로 인식하는 항체의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 방법은 면역원성 신생항원 펩티드가 동일한 개체에 대한 치료제(예컨대, 백신 또는 치료 항체)를 개발하는 데 사용되는 맞춤형 의학 맥락에서 유용하다. 따라서, 대상체에서 질환을 치료하는 방법은 본원에 기재된 방법에 따라 대상체에서 면역원성 신생항원 펩티드를 확인하는 단계; 및 펩티드 (또는 이의 전구체)를 합성하는 단계; 및 펩티드 또는 펩티드를 특이적으로 인식하는 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체의 종양 세포 또는 면역원성 신생항원 펩티드에 의해 발현되는 에피토프를 확인하는 것은 대상체의 비-종양 세포로부터 시퀀싱된 핵산 서열의 풀에 존재하지 않는 하나 이상의 상이한 돌연변이를 포함하는 다수의 후보 펩티드 서열을 코딩하는 대상체의 종양 세포로부터 시퀀싱된 핵산 서열의 풀로부터 복수의 핵산 서열을 선택하는 것을 포함하고, 대상체의 종양 세포로부터 시퀀싱된 핵산 서열의 풀 및 대상체의 비-종양 세포로부터 시퀀싱된 핵산 서열의 풀은 전체 게놈 시퀀싱 또는 전체 엑솜 시퀀싱에 의해 시퀀싱된다. 일부 실시양태에서, 대상체의 종양 세포에 의해 발현되는 에피토프 또는 면역원성 신생항원 펩티드를 확인하는 것은 HLA 펩티드 결합 분석에 의해 복수의 후보 펩티드 서열 중 어느 후보 펩티드 서열이 동일한 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질과 복합체를 형성하는지 예측하거나 측정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체의 종양 세포에 의해 발현되는 에피토프 또는 면역원성 신생항원 펩티드를 확인하는 단계는 HLA 펩티드 결합 분석에 기반하여 후보 펩티드 서열로부터 복수의 선택된 종양 특이적 펩티드 또는 복수의 선택된 종양 특이적 펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 선택하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체의 종양 세포에 의해 발현되는 에피토프는 신생항원, 종양 관련된 항원, 돌연변이된 종양 관련된 항원이고/이거나 에피토프의 발현은 대상체의 정상 세포에서의 에피토프의 발현과 비교하여 대상체의 종양 세포에서 더 높다.
일부 실시양태에서, 면역원성 신생항원의 발현 패턴은 환자 특이적 백신의 생성을 위한 필수 기초로서 작용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역원성 신생항원의 발현 패턴은 특정 질환을 갖는 환자 그룹에 대한 백신 생성을 위한 필수 기초로서 작용할 수 있다. 따라서, 특정 질환, 예컨대 특정 유형의 종양은 환자 그룹에서 선택적으로 치료될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드는 대규모 환자 그룹에서 자가 항-질환 T 세포에 의해 인식될 수 있는 구조적으로 정상적인 항원이다. 일부 실시양태에서, 질환이 구조적으로 정상적인 신생항원을 발현하는 질환 대상체의 그룹의 항원-발현 패턴이 결정된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 적어도 2개의 폴리펩티드 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자 중 2개 이상은 동일한 길이의 동일한 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자 중 2개 이상은 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈에서 핵산 서열의 바로 상류 또는 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않는 펩티드 서열의 동일한 아미노산 또는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자 중 2개 이상은 상이한 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제1 폴리펩티드는 링커를 포함하지 않고, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제2 폴리펩티드는 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제1 폴리펩티드는 에피토프의 N-말단에 링커를 포함하지 않고, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제2 폴리펩티드는 에피토프의 N-말단에 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제1 폴리펩티드는 에피토프의 C-말단에 링커를 포함하지 않고, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제2 폴리펩티드는 에피토프의 C-말단에 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제1 폴리펩티드는 링커를 포함하고, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제2 폴리펩티드는 링커를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제1 폴리펩티드는 에피토프의 N-말단에 링커를 포함하고, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제2 폴리펩티드는 N-말단에 링커를 포함하지 않는다 에피토프의. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제1 폴리펩티드는 에피토프의 C-말단에 링커를 포함하고, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제2 폴리펩티드는 에피토프의 C-말단에 링커를 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 에피토프는 1 ng 내지 10 mg 또는 5 μg 내지 1.5 mg의 양으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 1 ng 내지 10 mg의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 1 ng 내지 100 ng, 10 ng 내지 200 ng, 20 ng 내지 300 ng, 30 ng 내지 400 ng, 40 ng 내지 500 ng, 50 ng 내지 600 ng, 60 ng 내지 700 ng, 70 ng 내지 800 ng, 80 ng 내지 900 ng, 90 ng 내지 1 μg, 100 ng 내지 2 μg, 200 ng 내지 3 μg, 300 ng 내지 4 μg, 400 ng 내지 5 μg, 500 ng 내지 6 μg, 600 ng 내지 7 μg, 700 ng 내지 8 μg, 800 ng 내지 9 μg, 900 ng 내지 10 μg, 1 μg 내지 100 μg, 20 μg 내지 200 μg, 30 μg 내지 300 μg, 40 μg 내지 400 μg, 50 μg 내지 500 μg, 60 μg 내지 600 μg, 70 μg 내지 700 μg, 80 μg 내지 800 μg, 90 μg 내지 900 μg, 100 μg 내지 1 mg, 200 μg 내지 1.1 mg, 300 μg 내지 1.2 mg, 400 μg 내지 1.3 mg, 500 μg 내지 1.4 mg, 600 μg 내지 1.5 mg, 700 μg 내지 2 mg, 800 μg 내지 3 mg, 900 μg 내지 4 mg, 1 mg 내지 5 mg, 1.3 mg 내지 6 mg, 1.5 mg 내지 7 mg, 2 mg 내지 8 mg, 3 mg 내지 9 mg, 또는 4 mg 내지 10 mg의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 또는 950 ng의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 μg의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 약 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 mg의 양으로 존재한다.
면역원성 신생항원을 생성하는 다양한 방법이 있다. 단백질 또는 펩티드는 표준 분자 생물학적 기술을 통한 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 발현, 천연 공급원으로부터 단백질 또는 펩티드의 단리, 시험관내 번역, 또는 단백질 또는 펩티드의 화학적 합성을 포함하는 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 질환 특이적 신생항원은 시험관내 또는 생체내에서 생성될 수 있다. 면역원성 신생항원은 펩티드 또는 폴리펩티드로 시험관내에서 생성될 수 있으며, 이후 맞춤형 백신 또는 면역원성 조성물로 제형화되어 대상체에게 투여될 수 있다. 면역원성 신생항원의 시험관내 생성은 펩티드 합성 또는 임의의 다양한 박테리아, 진핵 또는 바이러스 재조합 발현 시스템에서 DNA 또는 RNA 분자로부터 펩티드/폴리펩티드의 발현 후 발현된 펩티드/폴리펩티드의 정제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 면역원성 신생항원은 면역원성 신생항원을 코딩하는 분자(예컨대, DNA, RNA, 및 바이러스 발현 시스템)를 대상체에 도입함으로써 생체내에서 생성될 수 있으며, 그 결과 코딩된 면역원성 신생항원이 발현된다. 일부 실시양태에서, 면역원성 신생항원 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 시험관내에서 신생항원 펩티드를 생성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 면역원성 신생항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대해 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 DNA, cDNA, 단일 가닥 및/또는 이중 가닥, 천연 또는 안정화된 형태의 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합일 수 있다. 면역원성 신생항원 펩티드를 코딩하는 핵산은 펩티드를 코딩하는 한 인트론을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 시험관내 번역을 이용하여 펩티드를 생성한다.
신생항원을 코딩하는 서열을 포함하는 발현 벡터 뿐만 아니라 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포도 고려된다. 본 개시내용에서 사용하기에 적합한 발현 벡터는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 발현 제어 요소를 포함할 수 있다. 발현 제어 요소는 핵산 서열의 발현을 제어하고 조절하기 위해 벡터에 삽입된다. 발현 제어 요소의 예는 당업계에 널리 공지되어 있고, 예컨대 lac 시스템, 파지 람다의 오퍼레이터 및 프로모터 영역, 효모 프로모터, 및 폴리오마, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 또는 SV40으로부터 유래된 프로모터를 포함한다. 추가적인 작동 요소는 리더 서열, 종결 코돈, 폴리아데닐화 신호 및 숙주 시스템에서 핵산 서열의 적절한 전사 및 후속 번역에 필요하거나 선호되는 임의의 다른 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 발현 제어 요소의 정확한 조합은 선택되는 숙주 시스템에 의존할 것이라는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 발현 벡터는 숙주 시스템에서 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터의 전달 및 후속 복제에 필요한 추가 요소를 함유해야 한다는 것을 추가로 이해할 것이다. 이러한 요소의 예는 복제 기점 및 선별 가능한 마커를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
신생항원 펩티드는 원하는 신생항원 펩티드를 코딩하는 RNA 또는 cDNA 분자의 형태로 제공될 수 있다. 본 개시내용의 하나 이상의 신생항원 펩티드는 단일 발현 벡터에 의해 코딩될 수 있다. 일반적으로, DNA는 플라스미드와 같은 발현 벡터에 적절한 배향 및 발현을 위한 정확한 리딩 프레임으로 삽입되며, 필요한 경우, DNA는 원하는 숙주(예컨대, 박테리아)에 의해 인식되는 적절한 전사 및 번역 조절 제어 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있으며, 이러한 제어는 일반적으로 발현 벡터에서 이용가능하다. 이어서, 벡터는 표준 기술을 이용하여 클로닝을 위해 숙주 박테리아에 도입된다. 진핵 숙주, 특히 포유동물 또는 인간에 유용한 발현 벡터는, 예컨대 SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 및 거대세포바이러스로부터의 발현 제어 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 박테리아 숙주에 유용한 발현 벡터는 공지된 박테리아 플라스미드, 예컨대 pCR 1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체를 포함하는 이. 콜라이로부터의 플라스미드, 더 넓은 숙주 범위 플라스미드, 예컨대 M13 및 사상 단일 가닥 DNA 파지를 포함한다. 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 폴리뉴클레오티드 섹션[0250]에서 논의된다. 박테리아, 진균, 효모, 및 포유동물 세포 숙주와 함께 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 당업계에 널리 공지되어 있다.
형질전환된 숙주에 의해 생성되는 단백질은 임의의 적합한 방법에 따라 정제될 수 있다. 이러한 표준 방법은 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환, 친화성 및 사이징 컬럼 크로마토그래피 등), 원심분리, 차등 용해도, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술을 포함한다. 헥사히스티딘, 말토스 결합 도메인, 인플루엔자 코트 서열, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 등과 같은 친화성 태그를 단백질에 부착하여 적절한 친화성 컬럼을 통과하여 쉽게 정제할 수 있다. 단리된 단백질은 또한 단백질분해, 핵 자기 공명 및 x-선 결정학과 같은 기술을 이용하여 물리적으로 특성화될 수 있다.
백신은 본원에 기재된 폴리펩티드 서열에 결합하는 개체를 포함할 수 있다. 개체는 항체일 수 있다. 항체 기반 백신은 적절하고 당업계에서 이해되는 바와 같이 널리 공지된 기술, 담체 및 부형제 중 임의의 것을 사용하여 제형화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드는 항체 치료제와 같은 신생항원 특이적 치료제를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 예컨대, 신생항원을 사용하여 신생항원을 특이적으로 인식하는 항체를 생성 및/또는 확인할 수 있다. 이러한 항체는 치료제로 사용될 수 있다. 항체는 천연 항체, 키메라 항체, 인간화 항체일 수 있거나, 항체 단편일 수 있다. 항체는 본원에 기재된 폴리펩티드 중 하나 이상을 인식할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 본원에 기재된 폴리펩티드에 대해 최대 40%, 50%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 폴리펩티드를 인식할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 본원에 기재된 폴리펩티드에 대해 적어도 40%, 50%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 폴리펩티드를 인식할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 본원에 기재된 폴리펩티드의 길이의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 폴리펩티드 서열을 인식할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 본원에 기재된 폴리펩티드의 길이의 최대 30%, 40%, 50%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 폴리펩티드 서열을 인식할 수 있다.
본 개시내용은 또한 예컨대 DNA 백신의 형태로 생체내에서 이를 필요로 하는 대상체에게 신생항원 펩티드/폴리펩티드를 전달하기 위한 비히클로서 핵산 분자의 용도를 고려한다.
일부 실시양태에서, 백신은 핵산 백신이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 면역원성 펩티드 또는 펩티드 전구체를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산 백신은 면역원성 펩티드 또는 펩티드 전구체를 코딩하는 서열의 측면에 배치된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 백신은 하나 초과의 면역원성 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 백신은 DNA 기반 백신이다. 전달 방법은 폴리뉴클레오티드 섹션[0250]에서 논의된다.
폴리뉴클레오티드는 실질적으로 순수하거나 적합한 벡터 또는 전달 시스템에 함유될 수 있다. 적합한 벡터 및 전달 시스템은 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노 관련된 바이러스, 또는 하나 초과의 바이러스 요소를 함유하는 하이브리드에 기초한 시스템을 포함한다. 비-바이러스 전달 시스템은 양이온성 지질 및 양이온성 폴리머(예컨대, 양이온성 리포좀)를 포함한다.
하나 이상의 신생항원 펩티드는 바이러스 기반 시스템을 사용하여 생체내에서 코딩 및 발현될 수 있다. 바이러스 벡터는 본 개시내용에서 재조합 벡터로서 사용될 수 있으며, 바이러스 게놈의 일부는 바이러스의 감염성을 파괴하지 않으면서 새로운 유전자를 도입하기 위해 결실된다. 본 개시내용의 바이러스 벡터는 비-병원성 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 포유동물에서 특정 세포 유형에 대한 친화성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 바이러스 벡터는 수지상 세포 및 대식구와 같은 전문 항원 제시 세포를 감염시킬 수 있다. 본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 바이러스 벡터는 포유동물의 임의의 세포를 감염시킬 수 있다. 바이러스 벡터는 또한 종양 세포를 감염시킬 수 있다. 본 개시내용에서 사용되는 바이러스 벡터는 폭스바이러스, 예컨대 백시니아 바이러스, 아비폭스 바이러스, 조류폭스 바이러스 및 고도로 약독화된 백시니아 바이러스(앙카라 또는 MVA), 레트로바이러스, 아데노바이러스, 배큘로바이러스 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
백신은 다양한 경로를 통해 전달될 수 있다. 전달 경로는 경구(협측 및 설하 포함), 직장, 비강, 국부, 경피 패치, 폐, 질, 좌제, 또는 비경구(근육내, 동맥내, 경막내, 피내, 복강내, 피하 및 정맥내 포함) 투여, 또는 에어로졸화, 흡입 또는 통기에 의한 투여에 적합한 형태를 포함할 수 있다. 약물 전달 시스템에 대한 일반 정보는 문헌(Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lippencott Williams & Wilkins, Baltimore Md. (1999))에서 찾을 수 있다. 본원에 기재된 백신은 근육에 투여될 수 있거나, 피내 또는 피하 주사 또는 경피를 통해, 예컨대 이온삼투요법에 의해 투여될 수 있다. 백신의 표피 투여가 이용될 수 있다. 본원에 기재된 백신은 피내 주사, 비강내 스프레이 적용, 근육내 주사, 복강내 주사, 정맥내 주사, 경구 투여, 또는 피하 주사를 통해 투여될 수 있다.
일부 경우에서, 백신은 또한 비강을 통한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 담체가 고체인 비강 투여에 적합한 제형은, 코로 들이마시는 방식으로, 즉 코 가까이에 댄 분말 용기로부터 비강을 통해 빠른 흡입에 의해 투여되는, 예컨대 약 10 내지 약 500 마이크론 범위의 입자 크기를 갖는 거친 분말을 포함할 수 있다. 제형은 비강 스프레이, 비강 점적제, 또는 분무기에 의한 에어로졸 투여일 수 있다. 제형은 백신의 수성 또는 유성 용액을 포함할 수 있다.
백신은 현탁액, 시럽 또는 엘릭서와 같은 액체 제제일 수 있다. 백신은 또한 멸균 현탁액 또는 에멀젼과 같은 비경구, 피하, 피내, 근육내, 또는 정맥내 투여(예컨대, 주사 가능한 투여)를 위한 제제일 수 있다.
백신은 단일 면역화을 위한 물질을 포함할 수 있거나, 다중 면역화을 위한 물질(즉, '다중용량' 키트)을 포함할 수 있다. 보존제를 포함하는 것은 다중용량 방식에서 선호된다. 다중용량 조성물에 보존제를 포함하는 것에 대한 대안으로서 (또는 추가로), 조성물은 물질 제거를 위한 무균 어댑터를 갖는 용기에 함유될 수 있다.
백신은 약 0.5 mL의 용량으로 투여될 수 있고, 어린이에게는 절반 용량(즉, 약 0.25 mL)이 투여될 수 있다. 때때로, 백신은 더 높은 용량, 약 1 ml로 투여될 수 있다.
백신은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 초과의 용량 과정 요법으로 투여될 수 있다. 때때로, 백신은 1, 2, 3 또는 4회 용량 과정 요법으로 투여된다. 때때로, 백신은 1회 용량 과정 요법으로 투여된다. 때때로, 백신은 2회 용량 과정 요법으로 투여된다.
제1 용량 및 제2 용량의 투여는 약 0일, 1일, 2일, 5일, 7일, 14일, 21일, 30일, 2개월, 4개월, 6개월, 9개월, 1년, 1.5년, 2년, 3년, 4년, 또는 그 초과로 분리될 수 있다.
본원에 기재된 백신은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 또는 그 초과 마다 투여될 수 있다. 때때로, 본원에 기재된 백신은 2, 3, 4, 5, 6, 7년 또는 그 초과마다 투여된다. 때때로, 본원에 기재된 백신은 4, 5, 6, 7년 또는 그 초과마다 투여된다. 때때로, 본원에 기재된 백신은 1회 투여된다.
용량의 예는 제한적이지 않으며, 본원에 기재된 백신을 투여하기 위한 특정 투여 요법을 예시하기 위해서만 사용된다. 인간에 사용하기 위한 유효량은 동물 모델로부터 결정될 수 있다. 예컨대, 인간에 대한 용량은 동물에서 효과적인 것으로 밝혀진 순환, 간, 국부 및/또는 위장관 농도를 달성하도록 제형화될 수 있다. 동물 데이터 및 다른 유형의 유사한 데이터에 기초하여, 당업자는 인간에 적합한 백신 조성물의 유효량을 결정할 수 있다.
작용제 또는 작용제의 조합을 언급할 때 유효량은 일반적으로 의료 또는 약학 분야의 임의의 다양한 규제 또는 자문 기관(예컨대, FDA, AMA)에 의해 또는 제조사 또는 공급사에 의해 권장되거나 승인된 용량 범위, 투여 방식, 제형 등을 의미할 것이다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 백신 및 키트는 2℃ 내지 8℃에서 저장될 수 있다. 일부 경우에서, 백신은 냉동 저장되지 않는다. 일부 경우에서, 백신은 -20℃ 또는 -80℃와 같은 온도에서 저장된다. 일부 경우에서, 백신이 햇빛을 피해 저장된다.
7.
키트
본원에 기재된 신생항원 치료제는 투여 설명서와 함께 키트 형태로 제공될 수 있다. 전형적으로, 키트는 용기에 단위 투여 형태의 원하는 신생항원 치료제 및 투여 설명서를 포함할 것이다. 추가의 치료제, 예컨대 시토카인, 림포카인, 체크포인트 억제제, 항체도 키트에 포함될 수 있다. 또한 바람직할 수 있는 다른 키트 구성요소는, 예컨대 멸균 주사기, 부스터 용량, 및 다른 원하는 부형제를 포함한다.
키트 및 제조 물품은 또한 본원에 기재된 하나 이상의 방법과 함께 사용하기 위해 본원에 제공된다. 키트는 하나 이상의 신생에피토프를 포함하는 하나 이상의 신생항원 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 키트는 또한 본원에 기재된 펩티드 또는 단백질 중 하나 이상을 코딩하는 핵산, 본원에 기재된 펩티드 중 하나 이상을 인식하는 항체, 또는 본원에 기재된 펩티드 중 하나 이상으로 활성화된 APC 기반 세포를 함유할 수 있다. 키트는 백신의 구성 및 전달에 필요한 애주번트, 시약 및 버퍼를 추가로 포함할 수 있다.
키트는 또한 바이알, 튜브 등과 같은 하나 이상의 용기를 수용하도록 구획화된 캐리어, 패키지 또는 용기를 포함할 수 있으며, 각각의 용기(들)는 본원에 기재된 방법에 사용될 펩티드 및 애주번트와 같은 개별 요소 중 하나를 포함한다. 적합한 용기는, 예컨대 병, 바이알, 주사기 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 제조될 수 있다.
본원에 제공된 제조 물품은 포장재를 포함한다. 약제학적 포장 재료의 예는 블리스터 팩, 병, 튜브, 백, 용기, 병, 및 선택되는 제형 및 의도된 투여 및 치료 방식에 적합한 임의의 포장재를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 키트는 전형적으로 내용물 및/또는 사용 설명서를 나열하는 표지, 및 사용 설명서가 포함된 패키지 삽입물을 포함한다. 전형적으로 일련의 설명서도 포함될 것이다.
본 개시내용은 구체적인 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명될 것이다. 하기 실시예는 예시의 목적으로 제공되며, 어떠한 방식으로도 본 개시내용을 제한하도록 의도되지 않는다. 당업자는 본 개시내용에 따른 대안적인 실시양태를 산출하기 위해 변경 또는 변형될 수 있는 다양한 중요하지 않은 파라미터를 쉽게 인식할 것이다. 본원에 나열된 모든 특허, 특허 출원 및 인쇄된 공개문은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
실시예
이들 실시예는 설명의 목적으로만 제공되며 본원에 제공된 청구범위를 제한하지 않는다.
실시예 1 - 폴리펩티드의 향상된 절단 및 프로세싱의 평가
T 세포 수용체(TCR) 형질도입된 세포를 사용하여 에피토프 프로세싱 및 제시를 위해 시험관내에서 폴리펩티드를 스크리닝하였다. 검증된 TCR과 함께 CD8을 발현하는 조작된 저캇 세포를 이펙터 세포로 제조하였다. 표적 세포의 경우, 특정 HLA 대립유전자를 갖는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 밤새 FLT3-리간드로 자극하고, 상이한 맥락에서 관심 에피토프를 함유하는 폴리펩티드를 1시간 동안 로딩하고, 시토카인으로 성숙시켰다. 조작된 저캇 세포 및 PBMC를 48시간 동안 공동 배양하고, 조작된 저캇 세포에 의해 분비되는 IL-2 수준을 TCR에 의해 펩티드 인식에 대한 판독값으로 측정하였다. 실험 설계는 도 3에 나타나 있고, 결과는 도 4 및 도 5에 나타나 있다.
실시예 2 - 신생항원 폴리펩티드 면역원성
특정 에피토프 주변에 설계된 다중 폴리펩티드의 면역원성 뿐만 아니라 이러한 폴리펩티드에 대한 T 세포 반응의 품질이 연구되었다. 84마리의 8-12주령 암컷 C57BL/6 마우스(Taconic Biosciences)는 도착 시 처리 그룹으로 무작위로 및 전향적으로 할당되었다. 동물을 연구 시작 전 3일 동안 순응시켰다. 동물을 LabDiet™ 5053 멸균 설치류 먹이로 부양하고 멸균수를 무제한으로 제공하였다. 그룹 1의 12마리의 동물은 백신접종되지 않은 대조군으로 사용되었다. 각각의 그룹 2-7의 12마리의 동물은 50 μg의 polyIC:LC 및 10 μg의 각각의 폴리펩티드(표 13에 정의됨, 굵은 서열은 최소 에피토프를 나타냄) 또는 몰-일치된 등량의 대안적 펩티드 설계(표 14에 정의됨)를 받았다. Kif18b는 CD4 헬퍼 펩티드로 사용되었으며, 그룹 2-7의 모든 마우스에서 변형되지 않은 상태로 사용되었다. 제7일, 제14일 및 제21일에 안구뒤 출혈에 의해 혈액을 수집하였다. 동물의 체중을 매일 측정하고 전반적인 건강 상태를 모니터링하였다. 동물은 연구 완료 제21일에, 제0일의 체중과 비교하여 >30%의 체중이 감소된 경우; 또는 동물이 빈사상태로 발견된 경우, CO2 과다복용에 의해 안락사되었다.
MHC 테트라머는 현장에서 제조되며, 면역원성 검정으로 펩티드 특이적 T 세포 확장을 측정하는 데 사용된다. 평가를 위해, 테트라머를 1% FCS 및 0.1% 아지드화나트륨(FACS 버퍼)을 함유하는 PBS 중의 1 x 105개 세포에 첨가한다. 세포를 암소에서 37℃에서 15분 동안 인큐베이션한다. CD8과 같은 T 세포 마커에 특이적인 항체, 및 CD4/CD11b/CD11c/CD19와 같은 관련 없는 세포 유형에 특이적인 항체를 제조사에 의해 제안된 최종 농도로 첨가하고, 세포를 암소에서 4℃에서 20분 동안 인큐베이션한다. 세포를 차가운 FACS 버퍼로 세척하고, 즉시 LSR2(Becton Dickinson) 기기에서 분석하고, FacsDiva 소프트웨어(Becton Dickinson)를 사용하여 분석한다. 테트라머 양성 세포의 분석을 위해, 림프구 게이트를 전방 및 측면-산란 플롯으로부터 취한다. 데이터는 CD4- CD11b- CD11c- CD19-CD8+/테트라머+인 세포의 백분율로 보고된다.
K4-에피토프로의 면역화는 평가된 6개 에피토프 중 5개에 대해 면역 반응을 상당히 증가시켰다. Alg8, Lama4, Reps1, Adpgk, 및 Obsl1에 대한 면역 반응이 상당히 증가되었다. K4-에피토프로의 면역화는 면역원성이 낮은 에피토프(예: Obsl1)의 면역원성을 증가시킨다. K4-Val-Cit-PABC-에피토프 면역화는 Alg8 특이적 면역 반응을 증가시킨다. 결과는 도 7-9에 나타나 있다.
실시예 3 - 디설파이드 링커의 합성(화합물 5)
단계 1
2,2'-비스(5-니트로피리딜) 디설파이드 2(2 mmol)를 10 mL 디클로로메탄에 현탁시키고, 디클로로메탄(4 mL) 중의 상응하는 메르캅토 알콜 1(1 mmol, R1 및 R2은 본원에서 정의되는 바와 같음)을 현탁액에 첨가하였다. 생성된 현탁액을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 생성된 잔사를 5 mL 디메틸포름아미드에 재용해시키고, 0.05% TFA를 함유하는 아세토니트릴 및 물의 구배와 함께 C18-역상 컬럼을 사용하여 정제하였다. 원하는 분획을 합하고, 동결건조시켜 (5-니트로피리딘-2-일) 디술파네일알킬 알콜 3(~65-82% 수율, > 90% 순도, 220 nm에서 UPLC-MS/UV 분석)을 수득하였다.
단계 2
디메틸포름아미드(2 mL) 중의 (5-니트로피리딘-2-일) 디술파네일알킬 알콜 3(0.5 mmol, R1 및 R2은 본원에서 정의되는 바와 같음)의 용액에 N,N'-디이소프로필에틸아민(1.5 mmol)을 첨가한 후, 4-니트로페닐 클로로포르메이트 4(0.55 mmol)를 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 16시간 동안 교반한 다음, 0.05% TFA를 함유하는 아세토니트릴 및 물의 구배와 함께 C18-역상 컬럼을 사용하여 정제하였다. 원하는 분획을 합하고, 동결건조시켜 4-니트로페닐-(5-니트로피리딘-2-일) 디술파네일알킬 카르보네이트 5(~90-98% 수율, > 90% 순도, 220 nm에서 UPLC-MS/UV 분석)를 수득하였다.
실시예 4 - 디설파이드 함유 펩티드의 합성
단계 1 : 4-니트로-2-피리딜티오 활성화된 디설파이드 펩티드 8의 형성
상기 계획에 따라, 펩티드 결합된 수지 6(고체상 펩티드 합성을 위해 제조된 임의의 수지를 사용할 수 있음)의 N-말단 끝을 링커 5(R1 및 R2은 본원에서 정의되는 바와 같음)를 사용하여 수동으로 아실화시키거나, 자동 펩티드 합성기 상에서 적절히 프로그래밍하였다. 보다 구체적으로, 수지 6(0.05 mmol)을 디메틸포름아미드 중에서 5분 동안 팽창시키고, 배액시켰다. 상응하는 4-니트로페닐-(5-니트로피리딘-2-일) 디술파네일알킬 카르보네이트 5(0.2 mmol) 및 Oxyma Pure Novabiochem®(옥시마 퓨어로도 공지됨, 0.3 mmol)을 1 mL 디메틸포름아미드에 용해시키고, 팽창된 수지 6에 첨가한 다음, N,N'-디이소프로필에틸아민(0.3 mmol)을 첨가하였다. 생성된 수지 현탁액을 3시간 동안 교반시키고, 배액시키고, 생성된 펩티드 결합된 수지 7을 디메틸포름아미드(5x, 5 mL), 디클로로메탄(5x, 5 mL), 및 메탄올(2x, 5 mL)로 세정하였다. 펩티드 결합된 수지 7을 감압 하에 1시간 동안 건조시키고, 3 mL 95% 트리플루오로아세트산(TFA), 2.5% 물, 2.5% 트리이소프로필실란(TIPS)을 사용하여 실온에서 3시간 동안 절단하여 결합되지 않은 펩티드 8 및 7로부터 절단된 수지를 모두 함유하는 절단 용액("A")을 형성하였다. 이어서, 절단 용액 A를 여과시키고, 50 mL 원뿔형 튜브에서 배액시키고, 7로부터의 절단된 수지를 95:5 TFA:수용액(1 mL)으로 세척하고, 여과시키고, 합하여 여과된 펩티드 용액("B")을 생성하였다. 결합되지 않은 펩티드 8을 빙 냉각된 디에틸 에테르로 침전시켜 여과된 펩티드 용액 B로부터 단리시키고, 3600 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 디에틸 에테르를 경사분리시켰다. 이어서, 생성된 펩티드 펠릿을 20 mL 빙 냉각된 디에틸 에테르로 세정하여 현탁액을 생성한 후, 볼텍싱하고, 3600 rpm에서 3분 동안 다시 원심분리하였다. 이를 펠릿을 완전히 세정하기 위해 총 3회의 세척 동안 반복하여 4-니트로페닐-(5-니트로피리딘-2-일) 디술파네일알킬 카르바메이트 펩티드 8을 생성하고, 이를 추가의 정제 없이 다음 합성 단계로 진행하였다.
단계 2 : 디설파이드 함유 펩티드 10을 형성하기 위한 디설파이드 교환 반응
상기 계획에 기재된 바와 같이, 조 4-니트로페닐-(5-니트로피리딘-2-일) 디술파네일알킬 카르바메이트 펩티드 8(R1 및 R2은 본원에서 정의되는 바와 같음)을 원하는 티올 함유 분자 9(G1 및 j는 본원에서 정의되는 바와 같음)로 디설파이드 교환하였다. 보다 구체적으로, 4-니트로페닐-(5-니트로피리딘-2-일) 디술파네일알킬 카르바메이트 펩티드 8(0.05 mmol)을 디메틸포름아미드(1 mL)에 용해시킨 후, 1:1 디메틸포름아미드-1M 트리스 버퍼 중의 원하는 티올 함유 화합물 9(0.05 mmol)의 용액을 첨가하였다. 생성된 황색 용액을 2시간 동안 교반하고, 0.05% TFA를 함유하는 아세토니트릴 및 물의 구배와 함께 C18-역상 컬럼을 사용하여 정제하였다. 원하는 분획을 합하고, 동결건조시켜 디설파이드 함유 펩티드 10(~10-30% 수율, >95% 순도, 220 nm에서 UPLC-MS/UV 분석, 고체상 펩티드 합성으로부터 출발)을 생성하였다.
실시예 5 - PABC 함유 펩티드(13)의 합성
상기 계획에 기재된 바와 같이, 펩티드 결합된 수지 6의 N-말단 끝을 Fmoc-AA-AA-PAB-PNP 11을 사용하여 수동으로 아실화시키거나, 자동 펩티드 합성기 상에서 적절히 프로그래밍하였다. 보다 구체적으로, 수지 6(0.05 mmol)을 디메틸포름아미드 중에서 5분 동안 팽창시키고, 배액시켰다. 상응하는 Fmoc-AA-AA-PAB-PNP 11(0.2 mmol) 및 Oxyma Pure Novabiochem®(옥시마 퓨어로도 공지됨, 0.3 mmol)을 1 mL 디메틸포름아미드에 용해시키고, 수지 6에 첨가한 다음, N,N'-디이소프로필에틸아민(0.3 mmol)을 첨가하였다. 생성된 수지 현탁액을 3시간 동안 교반시키고, 배액시키고, 생성된 Fmoc 보호된 수지 12를 디메틸포름아미드(5x, 5 mL)로 세정하였다. 최종 N-말단 α-Fmoc를 디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘(2x, 5분)으로 제거시켰다. 이 시점에서, 탈보호된 중간체 12는 임의적으로 표준 Fmoc 고체상 펩티드 합성을 이용하여 12의 N-말단 끝에서 추가의 아미노산 잔기와 반응된 후 바로 앞에서 논의된 바와 유사한 절차를 이용하여 N-말단 α-탈보호(들)될 수 있다. 원하는 Fmoc 탈보호(들)가 완결된 후, 수지 12 (또는 확장된 아미노산을 갖는 유사체)를 디메틸포름아미드(5x, 5 mL), 디클로로메탄(5x, 5 mL), 및 이어서 메탄올(2x, 5 mL)로 세정하였다. 펩티드 결합된 수지 12를 감압 하에 1시간 동안 건조시키고, 3 mL 70% 트리플루오로아세트산(TFA), 10% 페놀, 10% 트리이소프로필실란(TIPS) 및 10% 티오아니솔을 사용하여 실온에서 30분 동안 절단하여 결합되지 않은 펩티드 13 및 12로부터 절단된 수지를 모두 함유하는 절단 용액("A")을 형성하였다. 이어서, 절단 용액 A를 여과시키고, 배액시켜 50 mL 원뿔형 튜브에 여과된 펩티드 용액("B")을 생성하였다. 12로부터의 절단된 수지를 95:5 TFA:수용액(1 mL)으로 세척하고, 여과시키고, 배액시키고, 합하여 여과된 펩티드 용액 B를 생성하였다. 결합되지 않은 펩티드 13을 빙 냉각된 디에틸 에테르로 침전시켜 여과된 펩티드 용액 B로부터 단리시키고, 3600 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 디에틸 에테르를 경사분리시켰다. 이어서, 생성된 펩티드 펠릿을 20 mL 빙 냉각된 디에틸 에테르로 세정하여 현탁액을 생성한 후, 볼텍싱하고, 3600 rpm에서 3분 동안 다시 원심분리하였다. 이를 펠릿을 완전히 세정하기 위해 총 3회의 세척 동안 반복하여 화합물 13(~10-30% 수율, > 95% 순도, 220 nm에서 UPLC-MS/UV 분석, 고체상 펩티드 합성으로부터 출발)을 생성하였다.
실시예 6 - TMPRSS2::ERG 에피토프 프로세싱의 평가
T 세포 수용체(TCR)-형질도입된 세포를 사용하여 시험관내에서 HLA-A02:01에 대한 TMPRSS2::ERG 에피토프 프로세싱 및 제시를 평가하였다. 검증된 TCR과 함께 CD8을 발현하는 조작된 저캇 세포를 이펙터 세포로 제조하였다. 표적 세포의 경우, HLA-A02:01을 자연적으로 발현하는 293T 세포에 i) TMPRSS2::ERG 에피토프만을 함유하는 펩티드를 24시간 동안 로딩하거나 ii) 상이한 맥락으로 TMPRSS2::ERG 에피토프를 함유하는 펩티드를 코딩하는 플라스미드(자연적인 맥락에서의 에피토프, 즉 펩티드는 N- 및/또는 C-말단에서 에피토프 서열의 측면에 자연적으로 배치된 아미노산 또는 아미노산 서열을 추가로 포함함, 비-자연적인 맥락에서의 에피토프, 즉 펩티드는 에피토프 서열의 측면에 자연적으로는 배치되지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열, 예컨대 CMVpp65 서열을 추가로 포함함) 또는 비-자연적인 맥락으로 (대조군으로) 관련 없는 에피토프를 함유하는 펩티드를 코딩하는 플라스미드로 안정하게 형질도입하였다. 조작된 저캇 세포 및 293T 세포를 24시간 동안 공동 배양하고, 조작된 저캇 세포에 의해 분비되는 IL-2 수준을 TCR에 의해 펩티드 인식에 대한 판독값으로 측정하였다. 결과는 도 10에 나타나 있다.
실시예 7 - 폴리펩티드의 향상된 절단 및 프로세싱 및 면역원성의 비교
T 세포 수용체(TCR)-형질도입된 세포를 에피토프 프로세싱 및 제시를 위해 RAS-G12V 에피토프 단독, RAS-G12V 에피토프 및 단지 N-말단에서 에피토프의 측면에 배치된 추가의 아미노산 서열, 또는 RAS-G12V 에피토프 및 두 N- 및 C-말단에서 에피토프의 측면에 배치된 추가의 아미노산 서열을 함유하는 펩티드로부터의 RAS-G12V-HLA-A11:01 에피토프의 프로세싱의 시험관내 비교에 사용하였다. 검증된 TCR과 함께 CD8을 발현하는 조작된 저캇 세포를 이펙터 세포로 제조하였다. 표적 세포의 경우, 특정 HLA 대립유전자를 갖는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 밤새 FLT3-리간드로 자극하고, 상이한 맥락에서 RAS-G12V 에피토프를 함유하는 폴리펩티드를 1시간 동안 로딩하고, 시토카인으로 성숙시켰다. 조작된 저캇 세포 및 PBMC를 48시간 동안 공동 배양하고, 조작된 저캇 세포에 의해 분비되는 IL-2 수준을 TCR에 의해 펩티드 인식에 대한 판독값으로 측정하였다. 결과는 도 11에 나타나 있다.
실시예 8 - 에피토프 주변에 상이한 맥락을 갖는 RAS 돌연변이 펩티드의 면역원성 평가
재료:
AIM V 배지(Invitrogen)
인간 FLT3L, 전임상 셀제닉스(CellGenix) #1415-050 스톡 50 ng/μL
TNF-α, 전임상 셀제닉스 #1406-050 스톡 10 ng/μL
IL-1β, 전임상 셀제닉스 #1411-050 스톡 10 ng/μL
PGE1 또는 알프로스타딜(Alprostadil) - 체코 공화국으로부터의 카이만(Cayman) 스톡 0.5 μg/μL
R10 배지- RPMI 1640 글루타막스(glutamax) + 10% 인간 혈청 + 1% PenStrep
20/80 배지- 18% AIM V + 72% RPMI 1640 글루타막스 + 10% 인간 혈청 + 1% PenStrep
IL7 스톡 5 ng/μL
IL15 스톡 5 ng/μL
절차:
단계 1: 2 mL AIM V 배지에 FLT3L을 갖는 24웰 플레이트의 각각의 웰에 500만개의 PBMC (또는 관심 세포)를 플레이팅.
단계 2: AIMV에서 펩티드 로딩 및 성숙:
1. 관심 펩티드 풀(펩티드가 없는 조건은 제외)을 각각의 웰에서 PBMC (또는 관심 세포)와 혼합.
2. 1시간 동안 인큐베이션.
3. 인큐베이션 후 각각의 웰에 성숙 칵테일(TNF-α, IL-1β, PGE1 및 IL-7 포함)을 혼합.
단계 3: 최종 농도가 10 부피%가 되도록 각각의 웰에 인간 혈청을 첨가하고 혼합.
단계 4: 배지를 IL7 + IL15가 보충된 신선한 RPMI+ 10% HS 배지로 교체.
단계 5: 배지를 인큐베이션 기간 동안 1-6일마다 IL7 + IL15가 보충된 신선한 20/80 배지로 교체.
단계 6: 2 mL AIM V 배지에 FLT3L을 갖는 새로운 6-웰 플레이트의 각각의 웰에 500만개의 PBMC (또는 관심 세포)를 플레이팅.
단계 7: 재자극을 위한 펩티드 로딩 및 성숙(새로운 플레이트):
1. 관심 펩티드 풀(펩티드가 없는 조건은 제외)을 각각의 웰에서 PBMC (또는 관심 세포)와 혼합.
2. 1시간 동안 인큐베이션.
3. 인큐베이션 후 각각의 웰에 성숙 칵테일을 혼합.
단계 8: 재자극:
1. 제1 자극 FLT3L 배양물을 계수하고, 새로운 재자극 플레이트에 500만개의 배양된 세포를 첨가.
2. 배양 부피를 5 mL(AIM V)로 만들고, 500 ul의 인간 혈청(10 부피%)을 첨가.
단계 9: 3 ml의 배지를 제거하고, IL7 + IL15가 보충된 6 ml의 RPMI+ 10% HS 배지를 첨가.
단계 10: 75%의 배지를 IL7 + IL15가 보충된 신선한 20/80 배지로 교체.
단계 11: 필요한 경우, 재자극을 반복
항원 특이적 유도의 분석
MHC 테트라머를 구입하거나 현장에서 제조하여 면역원성 검정에서 펩티드 특이적 T 세포 확장을 측정하는 데 사용한다. 평가를 위해, 테트라머를 제조사의 지침에 따라 1% FCS 및 0.1% 아지드화나트륨(FACS 버퍼)을 함유하는 PBS 중의 1 x 105개 세포에 첨가한다. 세포를 실온에서 20분 동안 암소에서 인큐베이션한다. 이어서, CD8과 같은 T 세포 마커에 대해 특이적인 항체를 제조사에 의해 제안된 최종 농도로 첨가하고, 세포를 암소에서 4℃에서 20분 동안 인큐베이션한다. 세포를 차가운 FACS 버퍼로 세척하고, 1% 포름알데히드를 함유하는 버퍼에 재현탁시킨다. 세포를 LSR Fortessa(Becton Dickinson) 기기에서 획득하고, FlowJo 소프트웨어(Becton Dickinson)를 사용하여 분석한다. 테트라머 양성 세포의 분석을 위해, 림프구 게이트를 전방 및 측면-산란 플롯으로부터 취한다. 데이터는 CD8+/테트라머+인 세포의 백분율로 보고된다.
펩티드 면역원성 워크플로우(즉, T 세포 유도 및 테트라머 분석)를 이용하여 도 11에 기재된 3개의 펩티드 설계의 상대적인 면역원성을 평가하였다. 3개의 도너에 걸친 히트율에 기초하여 중간에 에피토프를 갖는 펩티드에 비해 C-말단에 에피토프를 갖는 펩티드의 증가된 면역원성을 나타내는 예시적인 데이터가 도 12 상단에 나타나 있다. 동일한 3개의 펩티드 설계를 또한 실시예 2에 기재된 바와 같이 생체내 마우스 백신접종 전략을 이용하여 평가하였다. 중간에 에피토프를 갖는 펩티드에 비해 C-말단에 에피토프를 갖는 펩티드의 증가된 면역원성을 나타내는 예시적인 데이터가 도 12 하단에 나타나 있다.
실시예 9 - APC가 펩티드를 코딩하는 mRNA로 자극될 때의 높은 CD8 히트율
쇼트머(9-10개 아미노산) 또는 롱머(25개 아미노산)를 도 13a에 그래프로 나타낸 바와 같이 연결된 신생항원 스트링의 형태로 구축하였다. 항원에 대한 서열은 유색 박스로 표시된다. 링커 서열(K, QLGL 또는 GVGT - 청색 원으로 표시됨)은 NetChop(인간 프로테옴의 절단을 예측하는 알고리즘)에 의해 예측되는 바와 같이 항원 서열 사이에 추가되었다. 서열이 항원 서열 내에서 절단될 것으로 예측되는 경우, 절단 부위를 추가하여 항원 서열 사이의 절단을 촉진하였다. 이어서, PBMC를 전술된 다중 항원 코딩 mRNA 구축물로 뉴클레오펙션하고, T 세포를 자극하는 데 사용하였다. 일치된(congruent) 펩티드 풀로 나란히 비교하였으며, 길이 및 서열은 RNA 스트링 내에 코딩된 것과 동일하였다. 짧은 RNA 서열 및 긴 RNA 서열은 멀티머에 반응하는 유사한 CD8+ T 세포를 발생시킨다(표 15). 특히, 롱머 및 쇼트머를 코딩하는 mRNA를 사용하여 강력한 CD8 반응이 관찰되었다.
도 13b에 나타난 바와 같이, Gli3 에피토프는 펩티드 뿐만 아니라 mRNA에 의해 잘 표시되고 제시되지만, mRNA 코딩된 Gli3 쇼트머 에피토프 로딩된 PBMC가 더 높은 Gli3 특이적 CD8+ T 세포를 초래하였다(멀티머 검정에 의해 검출됨). 멀티머 검정에 대한 대표적인 유동 세포측정 결과가 도 13c에 나타나 있다. 이 스트링에서, Gli3 서열 앞의 서열은 비-자연적 맥락으로부터의 것이다. 이는 폴리펩티드 스트링으로부터 Gli3의 프로세싱 및 제시를 향상시킬 수 있으며, 펩티드에 비해 반응을 증가시켰다. 추가적으로, mRNA 쇼트머 스트링은 일치된 짧은 펩티드 풀에 존재하지 않는 ME-1 T 세포 반응을 일으켰다. 본 발명자들의 스트링에서, ME-1은 에피토프 서열 전후에 절단 부위를 가지며, 에피토프에 대한 이러한 향상된 프로세싱 및 제시는 우수한 T 세포 반응을 초래할 수 있었다.
실시양태의 단락
[1] 항원 제시 세포(APC)의 클래스 I MHC 또는 클래스 II MHC에 의해 제시되는 에피토프를 포함하고, 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는 폴리펩티드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
Yn-Bt-Ar-Xm-As-Cu-Zp
화학식 (I)
(i) Xm은 에피토프이고, 각각의 X는 독립적으로 대상체의 게놈 내 핵산 서열에 의해 코딩되는 인접 아미노산 서열의 아미노산을 나타내고,
(a) MHC는 클래스 I MHC이고 m은 8 내지 12의 정수이거나,
(b) MHC는 클래스 II MHC이고 m은 9 내지 25의 정수이고;
(ii) 각각의 Y는 독립적으로 아미노산, 또는 이의 유사체 또는 유도체이고,
(A) 화학식 (I)에서 Ar의 변수 r이 0인 경우, Yn은 Bt-Ar-Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않거나,
(B) 화학식 (I)에서 Ar의 변수 r이 1이고 화학식 (I)에서 Bt의 변수 t가 0인 경우, Yn은 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않거나,
(C) 화학식 (I)에서 Ar의 변수 r이 1이고 화학식 (I)에서 Bt의 변수 t가 1 이상인 경우, Yn은 Bt를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산에 의해 코딩되지 않고;
추가로 n은 0 내지 1000의 정수이고;
(iii) 각각의 Z는 독립적으로 아미노산, 또는 이의 유사체 또는 유도체이고,
(A) 화학식 (I)에서 As의 변수 s가 0인 경우, Zp는 Xm-As-Cu를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않거나,
(B) 화학식 (I)에서 As의 변수 s가 1이고 화학식 (I)에서 Cu의 변수 u가 0인 경우, Zp는 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않거나,
(C) 화학식 (I)에서 As의 변수 s가 1이고 화학식 (I)에서 Cu의 변수 u가 1 이상인 경우, Zp는 Cu를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산에 의해 코딩되지 않고;
추가로 p는 0 내지 1000의 정수이고;
추가로
n이 0인 경우, p는 1 내지 1000의 정수이고;
p가 0인 경우, n은 1 내지 1000의 정수이고;
(iv) Ar은 링커이고, r은 0 또는 1이고;
(v) As는 링커이고, s는 0 또는 1이고;
(vi) 각각의 B는 독립적으로 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 대상체의 게놈 내 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산을 나타내고,
t는 0 내지 1000의 정수이고;
(vii) 각각의 C는 독립적으로 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 대상체의 게놈 내 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산을 나타내고,
u는 0 내지 1000의 정수이고;
추가로
(a) 폴리펩티드는 클래스 I MHC에 의해 제시되는 4개의 상이한 에피토프로 이루어지지 않고/않거나;
(b) 폴리펩티드는 적어도 2개의 상이한 폴리펩티드 분자를 포함하고/하거나;
(c) 에피토프는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산을 포함하고/하거나;
(d) Yn 및/또는 Zp는 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때 에피토프로부터 절단된다.
[2] 단락 [1]에 있어서, 에피토프가 클래스 II MHC에 의해 제시되는 것인 폴리펩티드.
[3] 단락 [1] 또는 [2]에 있어서, m이 9 내지 25의 정수인 폴리펩티드.
[4] 단락 [1] 내지 [3] 중 어느 한 단락에 있어서, t가 1, 2, 3, 4, 또는 5 또는 그 초과이고 r이 0인 폴리펩티드.
[5] 단락 [1] 내지 [4] 중 어느 한 단락에 있어서, u가 1, 2, 3, 4, 또는 5 또는 그 초과이고 s가 0인 폴리펩티드.
[6] 단락 [1] 내지 [5] 중 어느 한 단락에 있어서, t가 1 이상이고, r이 0이고, n이 1-1000인 폴리펩티드.
[7] 단락 [1] 내지 [6] 중 어느 한 단락에 있어서, u가 1 이상이고, s가 0이고, p가 1-1000인 폴리펩티드.
[8] 단락 [1] 내지 [7] 중 어느 한 단락에 있어서, t가 0인 폴리펩티드.
[9] 단락 [1] 내지 [8] 중 어느 한 단락에 있어서, u가 0인 폴리펩티드.
[10] 단락 [1] 내지 [9] 중 어느 한 단락에 있어서, t가 적어도 1이고 Bt가 리신을 포함하는 것인 폴리펩티드.
[11] 단락 [1] 내지 [10] 중 어느 한 단락에 있어서, u가 적어도 1이고 Cu가 리신을 포함하는 것인 폴리펩티드.
[12] 단락 [1] 내지 [11] 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때, Bt가 에피토프로부터 절단되는 것인 폴리펩티드.
[13] 단락 [1] 내지 [12] 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때, Cu가 에피토프로부터 절단되는 것인 폴리펩티드.
[14] 단락 [1] 내지 [13] 중 어느 한 단락에 있어서, n이 1 내지 5 또는 7-1000의 정수인 폴리펩티드.
[15] 단락 [1] 내지 [14] 중 어느 한 단락에 있어서, p가 1 내지 4 또는 6-1000의 정수인 폴리펩티드.
[16] 단락 [1] 내지 [15] 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩티드가 클래스 I MHC에 의해 제시되는 4개의 상이한 에피토프로 이루어지지 않는 것인 폴리펩티드.
[17] 단락 [1] 내지 [16] 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩티드가 클래스 I MHC에 의해 제시되는 4개의 상이한 에피토프를 포함하지 않는 것인 폴리펩티드.
[18] 단락 [1] 내지 [17] 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩티드가 적어도 2개의 상이한 폴리펩티드 분자를 포함하는 것인 폴리펩티드.
[19] 단락 [1] 내지 [18] 중 어느 한 단락에 있어서, 에피토프가 적어도 하나의 돌연변이 아미노산을 포함하는 것인 폴리펩티드.
[20] 단락 [19]에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이 아미노산이 대상체의 게놈 내 핵산 서열에서 삽입, 결실, 프레임쉬프트, neoORF, 또는 포인트 돌연변이에 의해 코딩되는 것인 폴리펩티드.
[21] 단락 [1] 내지 [20] 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때, Yn 및/또는 Zp가 에피토프로부터 절단되는 것인 폴리펩티드.
[22] 단락 [1] 내지 [21] 중 어느 한 단락에 있어서, Xm의 m이 적어도 8이고, Xm이 AA1AA2AA3AA4AA5AA6AA7AA8AA9AA10AA11AA12AA13AA14AA15AA16AA17AA18AA19AA20AA21AA22AA23AA24AA25이고, 여기서 각각의 AA가 아미노산이고, AA9, AA10, AA11, AA12, AA13, AA14, AA15, AA16, AA17, AA18, AA19, AA20, AA21, AA22, AA23, AA24 중 하나 이상이 임의적으로 존재하고, 추가로 적어도 하나의 AA가 돌연변이 아미노산인 폴리펩티드.
[23] 단락 [1] 내지 [22] 중 어느 한 단락에 있어서, r이 1인 폴리펩티드.
[24] 단락 [1] 내지 [23] 중 어느 한 단락에 있어서, s가 1인 폴리펩티드.
[25] 단락 [1] 내지 [24] 중 어느 한 단락에 있어서, r이 1이고 s가 1인 폴리펩티드.
[26] 단락 [1] 내지 [25] 중 어느 한 단락에 있어서, r이 0인 폴리펩티드.
[27] 단락 [1] 내지 [26] 중 어느 한 단락에 있어서, s가 0인 폴리펩티드.
[28] 단락 [1] 내지 [27] 중 어느 한 단락에 있어서, r이 0이고 s가 0인 폴리펩티드.
[29] 단락 [1] 내지 [28] 중 어느 한 단락에 있어서, Ar 및/또는 As가 비-폴리펩티드 링커인 폴리펩티드.
[30] 단락 [1] 내지 [29] 중 어느 한 단락에 있어서, Ar 및/또는 As가 화학적 링커인 폴리펩티드.
[31] 단락 [1] 내지 [30] 중 어느 한 단락에 있어서, Ar 및/또는 As가 비-천연 아미노산을 포함하는 것인 폴리펩티드.
[32] 단락 [1] 내지 [31] 중 어느 한 단락에 있어서, Ar 및/또는 As가 아미노산을 포함하지 않는 것인 폴리펩티드.
[33] 단락 [1] 내지 [32] 중 어느 한 단락에 있어서, Ar 및/또는 As가 천연 아미노산을 포함하지 않는 것인 폴리펩티드.
[34] 단락 [1] 내지 [33] 중 어느 한 단락에 있어서, Ar 및/또는 As가 펩티드 결합 이외의 결합을 포함하는 것인 폴리펩티드.
[35] 단락 [1] 내지 [34] 중 어느 한 단락에 있어서, Ar 및/또는 As가 디설파이드 결합을 포함하는 것인 폴리펩티드.
[36] 단락 [1] 내지 [35] 중 어느 한 단락에 있어서, Ar 및 As가 상이한 것인 폴리펩티드.
[37] 단락 [1] 내지 [36] 중 어느 한 단락에 있어서, Ar 및 As가 동일한 것인 폴리펩티드.
[38] 단락 [1] 내지 [37] 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩티드가 친수성 테일을 포함하는 것인 폴리펩티드.
[39] 단락 [1] 내지 [38] 중 어느 한 단락에 있어서, Yn-Bt-Ar 및/또는 As-Cu-Zp가 Yn-Bt-Ar 및/또는 As-Cu-Zp를 함유하지 않는 상응하는 펩티드와 비교하여 폴리펩티드의 용해도를 향상시키는 것인 폴리펩티드.
[40] 단락 [1] 내지 [39] 중 어느 한 단락에 있어서, Xm의 각각의 X가 천연 아미노산인 폴리펩티드.
[41] 단락 [1] 내지 [40] 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때, 에피토프가 Yn-Bt-Ar 및/또는 As-Cu-Zp로부터 방출되는 것인 폴리펩티드.
[42] 단락 [1] 내지 [41] 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩티드가 Ar 및/또는 As에서 절단되는 것인 폴리펩티드.
[43] 단락 [1] 내지 [42] 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩티드가, n이 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 절단과 비교하여 더 높은 속도로 절단되고/되거나;
폴리펩티드가, p이 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 절단과 비교하여 더 높은 속도로 절단되는 것인 폴리펩티드.
[44] 단락 [1] 내지 [42] 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩티드가, n이 1 내지 1000의 정수인 경우, t가 적어도 1이고 화학식 (I)의 Ar의 변수 r이 0인 Bt-Xm을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 절단과 비교하여 더 높은 속도로 절단되고/되거나;
폴리펩티드가, p이 1 내지 1000의 정수인 경우, u가 적어도 1이고 화학식 (I)의 As의 변수 s가 0인 Xm-Cu을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 절단과 비교하여 더 높은 속도로 절단되는 것인 폴리펩티드.
[45] 단락 [1] 내지 [44] 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩티드가, n이 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 절단과 비교하여 더 높은 속도로 Ar에서 절단되고/되거나;
폴리펩티드가, p이 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 절단과 비교하여 더 높은 속도로 As에서 절단되는 것인 폴리펩티드.
[46] 단락 [1] 내지 [45] 중 어느 한 단락에 있어서, APC에 의한 에피토프 제시가, n이 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 제시와 비교하여 향상되고/되거나;
APC에 의한 에피토프 제시가, p가 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 에피토프 제시와 비교하여 향상되는 것인 폴리펩티드.
[47] 단락 [1] 내지 [45] 중 어느 한 단락에 있어서, APC에 의한 에피토프 제시가, n이 1 내지 1000의 정수인 경우, t가 적어도 1이고 화학식 (I)의 Ar의 변수 r이 0인 Bt-Xm을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 에피토프 제시와 비교하여 향상되고/되거나;
APC에 의한 에피토프 제시가, p이 1 내지 1000의 정수인 경우, u가 적어도 1이고 화학식 (I)의 As의 변수 s가 0인 Xm-Cu을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 에피토프 제시와 비교하여 향상되는 것인 폴리펩티드.
[48] 단락 [1] 내지 [47] 중 어느 한 단락에 있어서, APC가 에피토프를 면역 세포에 제시하는 것인 폴리펩티드.
[49] 단락 [1] 내지 [48] 중 어느 한 단락에 있어서, APC가 에피토프를 포식 세포에 제시하는 것인 폴리펩티드.
[50] 단락 [1] 내지 [49] 중 어느 한 단락에 있어서, APC가 에피토프를 수지상 세포, 대식구, 비만 세포, 호중구, 또는 단핵구에 제시하는 것인 폴리펩티드.
[51] 단락 [1] 내지 [50] 중 어느 한 단락에 있어서, APC가 에피토프를 면역 세포, 포식 세포, 수지상 세포, 대식구, 비만 세포, 호중구, 또는 단핵구에 우선적으로 또는 특이적으로 제시하는 것인 폴리펩티드.
[52] 단락 [1] 내지 [51] 중 어느 한 단락에 있어서, 면역원성이, n이 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 면역원성과 비교하여 향상되고/되거나;
면역원성이, p가 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 면역원성과 비교하여 향상되는 것인 폴리펩티드.
[53] 단락 [1] 내지 [51] 중 어느 한 단락에 있어서, 면역원성이, n이 1 내지 1000의 정수인 경우, t가 적어도 1이고 화학식 (I)의 Ar의 변수 r이 0인 Bt-Xm을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 면역원성과 비교하여 향상되고/되거나;
면역원성이, p이 1 내지 1000의 정수인 경우, u가 적어도 1이고 화학식 (I)의 As의 변수 s가 0인 Xm-Cu을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 면역원성과 비교하여 향상되는 것인 폴리펩티드.
[54] 단락 [1] 내지 [53] 중 어느 한 단락에 있어서, 항-종양 활성이, n이 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 항-종양 활성과 비교하여 향상되고/되거나;
항-종양 활성이, p가 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 항-종양 활성과 비교하여 향상되는 것인 폴리펩티드.
[55] 단락 [1] 내지 [53] 중 어느 한 단락에 있어서, 항-종양 활성이, n이 1 내지 1000의 정수인 경우, t가 적어도 1이고 화학식 (I)의 Ar의 변수 r이 0인 Bt-Xm을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 항-종양 활성과 비교하여 향상되고/되거나;
항-종양 활성이, p이 1 내지 1000의 정수인 경우, u가 적어도 1이고 화학식 (I)의 As의 변수 s가 0인 Xm-Cu을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 항-종양 활성과 비교하여 향상되는 것인 폴리펩티드.
[56] 단락 [1] 내지 [55] 중 어느 한 단락에 있어서, Yn 및/또는 Zp가 poly-Lys(polyK) 및 poly-Arg(polyR)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
[57] 단락 [56]에 있어서, Yn 및/또는 Zp가 polyK-AA-AA 및 polyR-AA-AA로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하고, 여기서 각각의 AA가 아미노산 또는 이의 유사체 또는 유도체인 폴리펩티드.
[58] 단락 [56] 또는 [57]에 있어서, polyK가 poly-L-Lys를 포함하는 것인 폴리펩티드.
[59] 단락 [56] 또는 [57]에 있어서, polyR이 poly-L-Arg을 포함하는 것인 폴리펩티드.
[60] 단락 [56] 내지 [59] 중 어느 한 단락에 있어서, polyK 또는 polyR이 각각 적어도 3개 또는 4개의 인접 리신 또는 아르기닌 잔기를 포함하는 것인 폴리펩티드.
[61] 단락 [1] 내지 [60] 중 어느 한 단락에 있어서, Ar 및/또는 As가 디설파이드; p-아미노벤질옥시카르보닐(PABC); 및 AA-AA-PABC로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 각각의 AA가 아미노산 또는 이의 유사체 또는 유도체인 폴리펩티드.
[62] 단락 [61]에 있어서, AA-AA-PABC가 Ala-Lys-PABC, Val-Cit-PABC, 및 Phe-Lys-PABC로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
[63] 단락 [1] 내지 [60] 중 어느 한 단락에 있어서, Ar 및/또는 As가 하기 화학식 (II)인 폴리펩티드:
화학식 (II)
[64] 단락 [1] 내지 [60] 중 어느 한 단락에 있어서, Ar 및/또는 As가 하기 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)인 폴리펩티드:
화학식 (III)
화학식 (IV)
상기 식에서,
R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 (C1-C6) 알킬이고;
j는 1 또는 2이고;
G1은 H 또는 COOH이고;
i는 1, 2, 3, 4, 또는 5이다.
[65] 단락 [1] 내지 [64] 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩티드가 유비퀴틴화되는 것인 폴리펩티드.
[66] 단락 [65]에 있어서, 폴리펩티드가 절단 전에 유비퀴틴화되는 것인 폴리펩티드.
[67] 단락 [65] 또는 [66]에 있어서, 폴리펩티드가 리신 잔기에서 유비퀴틴화되는 것인 폴리펩티드.
[68] 단락 [1] 내지 [67] 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩티드가 대상체에서 APC에 의해 프로세싱되기 전에 또는 APC에 의한 내재화 전에 절단되지 않는 것인 폴리펩티드.
[69] 단락 [1] 내지 [68] 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩티드가 APC에 의한 프로세싱 전에 또는 APC에 의한 내재화 전에 대상체의 혈액에서 절단되지 않는 것인 폴리펩티드.
[70] 단락 [1] 내지 [69] 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩티드가 혈액에서 프로테아제에 의해 절단되지 않는 것인 폴리펩티드.
[71] 단락 [1] 내지 [70] 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩티드가 플라스민, 혈장 칼리크레인, 조직 칼리크레인, 트롬빈, 또는 응고 인자에 의해 절단되지 않는 것인 폴리펩티드.
[72] 단락 [1] 내지 [71] 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩티드가 인간 혈장에서 안정한 것인 폴리펩티드.
[73] 단락 [1] 내지 [72] 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩티드가 인간 혈장에서 1시간 내지 5일의 반감기를 갖는 것인 폴리펩티드.
[74] 단락 [1] 내지 [73] 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩티드가 리소좀, 엔도리소좀, 엔도좀, 또는 세포질세망(ER)에서 절단되는 것인 폴리펩티드.
[75] 단락 [1] 내지 [74] 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩티드가 아미노펩티다제에 의해 절단되는 것인 폴리펩티드.
[76] 단락 [75]에 있어서, 아미노펩티다제가 인슐린 조절된 아미노펩티다제(IRAP) 또는 세포질세망 아미노펩티다제(ERAP)인 폴리펩티드.
[77] 단락 [1] 내지 [74] 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩티드가 프로테아좀 및/또는 면역프로테아좀의 트립신-유사 도메인에 의해 프로세싱되는 것인 폴리펩티드.
[78] 단락 [77]에 있어서, 트립신-유사 도메인이 트립신-유사 활성, 키모트립신-유사 활성, 또는 펩티딜글루타밀-펩티드 히드롤라제(PGPH) 활성을 포함하는 것인 폴리펩티드.
[79] 단락 [1] 내지 [74] 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩티드가 프로테아제에 의해 절단되는 것인 폴리펩티드.
[80] 단락 [79]에 있어서, 프로테아제가 트립신-유사 프로테아제, 키모트립신-유사 프로테아제, 또는 펩티딜글루타밀-펩티드 히드롤라제(PGPH)인 폴리펩티드.
[81] 단락 [79]에 있어서, 프로테아제가 아스파라긴 펩티드 리아제, 아스파르트산 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 메탈로프로테아제, 세린 프로테아제, 및 트레오닌 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
[82] 단락 [81]에 있어서, 프로테아제가 칼파인, 카스파제, 카텝신 B, 카텝신 C, 카텝신 F, 카텝신 H, 카텝신 K, 카텝신 L1, 카텝신 L2, 카텝신 O, 카텝신 S, 카텝신 W, 및 카텝신 Z로 이루어진 군으로부터 선택되는 시스테인 프로테아제인 폴리펩티드.
[83] 단락 [1] 내지 [82] 중 어느 한 단락에 있어서, 대상체가 포유동물인 폴리펩티드.
[84] 단락 [1] 내지 [83] 중 어느 한 단락에 있어서, 대상체가 인간인 폴리펩티드.
[85] 단락 [1] 내지 [84] 중 어느 한 단락에 있어서, 에피토프가 MHC I 클래스 HLA에 결합하는 것인 폴리펩티드.
[86] 단락 [85]에 있어서, 에피토프가 10분 내지 24시간의 안정성으로 MHC I 클래스 HLA에 결합하는 것인 폴리펩티드.
[87] 단락 [85]에 있어서, 에피토프가 0.1 nM 내지 2000 nM의 친화도로 MHC I 클래스 HLA에 결합하는 것인 폴리펩티드.
[88] 단락 [1] 내지 [84] 중 어느 한 단락에 있어서, 에피토프가 MHC II 클래스 HLA에 결합하는 것인 폴리펩티드.
[89] 단락 [88]에 있어서, 에피토프가 10분 내지 24시간의 안정성으로 MHC II 클래스 HLA에 결합하는 것인 폴리펩티드.
[90] 단락 [88]에 있어서, 에피토프가 0.1 nM 내지 2000 nM, 1 nM 내지 1000 nM, 10 nM 내지 500 nM, 또는 1000 nM 미만의 친화도로 MHC II 클래스 HLA에 결합하는 것인 폴리펩티드.
[91] 단락 [1] 내지 [90] 중 어느 한 단락에 있어서, n이 1 내지 20 또는 5 내지 12의 정수인 폴리펩티드.
[92] 단락 [1] 내지 [91] 중 어느 한 단락에 있어서, p가 1 내지 20 또는 5 내지 12의 정수인 폴리펩티드.
[93] 단락 [1] 내지 [92] 중 어느 한 단락에 있어서, 에피토프가 종양 특이적 에피토프를 포함하는 것인 폴리펩티드.
[94] 단락 [1] 내지 [93] 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩티드가 적어도 2개의 폴리펩티드를 포함하고, 적어도 2개의 폴리펩티드 중 2개 이상은 동일한 화학식 Yn-Bt-Ar-Xm-As-Cu-Zp를 갖는 것인 폴리펩티드.
[95] 단락 [94]에 있어서, 폴리펩티드가 적어도 2개의 폴리펩티드 분자를 포함하는 것인 폴리펩티드.
[96] 단락 [94] 또는 [95]에 있어서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자 중 2개 이상의 Xm이 동일한 것인 폴리펩티드.
[97] 단락 [94] 내지 [96] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자 중 2개 이상의 Yn이 동일한 것인 폴리펩티드.
[98] 단락 [94] 내지 [97] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자 중 2개 이상의 Zp가 동일한 것인 폴리펩티드.
[99] 단락 [94] 내지 [98] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자 중 2개 이상의 Ar 및/또는 As가 상이한 것인 폴리펩티드.
[100] 단락 [94] 내지 [99] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제1의 것에 대해 r=0이고 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제2의 것에 대해 r=1인 폴리펩티드.
[101] 단락 [94] 내지 [100] 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제1의 것에 대해 s=0이고 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자의 제2의 것에 대해 s=1인 폴리펩티드.
[102] 단락 [1] 내지 [101] 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩티드가 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 초과의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분자를 포함하는 것인 폴리펩티드.
[103] 단락 [1] 내지 [102] 중 어느 한 단락에 있어서, 에피토프가 RAS 에피토프인 폴리펩티드.
[104] 단락 [103]에 있어서, 에피토프가 G12, G13, 또는 Q61에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 RAS 단백질의 적어도 8개의 인접 아미노산 및 G12, G13, 또는 Q61에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 RAS 펩티드 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
[105] 단락 [104]에 있어서, G12, G13, 또는 Q61에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 RAS 단백질의 적어도 8개의 인접 아미노산이 G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V, Q61H, Q61L, Q61K, 또는 Q61R 돌연변이를 포함하는 것인 폴리펩티드.
[106] 단락 [104] 또는 [105]에 있어서, G12, G13, 또는 Q61에서의 돌연변이가 G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V, Q61H, Q61L, Q61K, 또는 Q61R 돌연변이를 포함하는 것인 폴리펩티드.
[107] 단락 [1] 내지 [106] 중 어느 한 단락에 있어서, Yn 및/또는 Zp가 pp65, HIV, 또는 MART-1과 같은 CMV의 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
[108] 단락 [1] 내지 [107] 중 어느 한 단락에 있어서, n 및/또는 p가 1, 2, 3, 또는 3 초과의 정수인 폴리펩티드
[109] 단락 [1] 내지 [108] 중 어느 한 단락에 있어서, 에피토프가 10 μM 미만, 1 μM 미만, 500 nM 미만, 400 nM 미만, 300 nM 미만, 250 nM 미만, 200 nM 미만, 150 nM 미만, 100 nM 미만, 또는 50 nM 미만의 친화도로 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합하는 것인 폴리펩티드.
[110] 단락 [1] 내지 [109] 중 어느 한 단락에 있어서, 에피토프가 24시간 초과, 12시간 초과, 9시간 초과, 6시간 초과, 5시간 초과, 4시간 초과, 3시간 초과, 2시간 초과, 1시간 초과, 45분 초과, 30분 초과, 15분, 또는 10분 초과의 안정성으로 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합하는 것인 폴리펩티드.
[111] 단락 [109] 또는 [110]에 있어서, HLA 대립유전자가 HLA-A02:01 대립유전자, HLA-A03:01 대립유전자, HLA-A11:01 대립유전자, HLA-A03:02 대립유전자, HLA-A30:01 대립유전자, HLA-A31:01 대립유전자, HLA-A33:01 대립유전자, HLA-A33:03 대립유전자, HLA-A68:01 대립유전자, HLA-A74:01 대립유전자, 및/또는 HLA-C08:02 대립유전자 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
[112] 단락 [1] 내지 [111] 중 어느 한 단락에 있어서, 에피토프가 하기의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드: 
.
[113] 단락 [1] 내지 [112] 중 어느 한 단락에 있어서, Yn이 하기의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드: 
.
[114] 단락 [1] 내지 [113] 중 어느 한 단락에 있어서, Zp가 하기의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드: 
.
[115] 단락 [1] 내지 [102] 중 어느 한 단락에 있어서, 에피토프가 RAS 에피토프가 아닌 것인 폴리펩티드.
[116] 단락 [1] 내지 [115] 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩티드가 하기가 아닌 것인 폴리펩티드: 
.
[117] 단락 [1] 내지 [102] 중 어느 한 단락에 있어서, 에피토프가 GATA3 에피토프인 폴리펩티드.
[118] 단락 [117]에 있어서, GATA3 에피토프가 하기의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드: 
.
[119] 단락 [1] 내지 [118] 중 어느 한 단락의 폴리펩티드를 포함하는 세포.
[120] 단락 [119]에 있어서, 세포가 항원 제시 세포인 세포.
[121] 단락 [120]에 있어서, 세포가 수지상 세포인 세포.
[122] 단락 [119]에 있어서, 세포가 성숙한 항원 제시 세포인 세포.
[123] 폴리펩티드를 절단시키는 방법으로서, 단락 [1] 내지 [118] 중 어느 한 단락의 폴리펩티드를 APC에 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
[124] 단락 [123]에 있어서, 방법이 생체내에서 수행되는 것인 방법.
[125] 단락 [123]에 있어서, 방법이 생체외에서 수행되는 것인 방법.
[126] Yn-Ar 및/또는 As-Zp를 에피토프를 포함하는 서열에 연결시키는 단계를 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 에피토프 서열은 항원 제시 세포(APC)의 클래스 I MHC 또는 클래스 II MHC에 의해 제시되고;
(i) 각각의 Y는 독립적으로 아미노산, 또는 이의 유사체 또는 유도체이고, Yn은 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않고,
n은 0 내지 1000의 정수이고;
(ii) 각각의 Z는 독립적으로 아미노산, 또는 이의 유사체 또는 유도체이고, Zp는 에피토프를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않고,
p는 0 내지 1000의 정수이고;
(iii) Ar은 링커이고 As는 링커이고, r 및 s 중 적어도 하나는 1이고;
추가로
(a) 폴리펩티드는 클래스 I MHC에 의해 제시되는 4개의 상이한 에피토프로 이루어지지 않고/않거나;
(b) 폴리펩티드는 적어도 2개의 상이한 폴리펩티드 분자를 포함하고/하거나;
(c) 에피토프는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산을 포함하고/하거나;
(d) Yn 및/또는 Zp는, 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때, 에피토프로부터 절단되는 것인 방법.
[127] Yn을 Bt-Xm에 및/또는 Zp를 Xm-Cu에 연결시키는 단계를 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, Xm은 항원 제시 세포(APC)의 클래스 I MHC 또는 클래스 II MHC에 의해 제시되는 에피토프 서열이고;
(i) 각각의 B는 독립적으로 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 대상체의 게놈 내 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산을 나타내고,
t는 0 내지 1000의 정수이고;
(ii) 각각의 C는 독립적으로 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 대상체의 게놈 내 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산을 나타내고,
u는 0 내지 1000의 정수이고;
(iii) 각각의 Y는 독립적으로 아미노산, 또는 이의 유사체 또는 유도체이고, Yn은 Bt-Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않고,
n은 0 내지 1000의 정수이고;
(iv) 각각의 Z는 독립적으로 아미노산, 또는 이의 유사체 또는 유도체이고, Zp는 Xm-Cu를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않고,
p는 0 내지 1000의 정수이고;
추가로
(a) 폴리펩티드는 클래스 I MHC에 의해 제시되는 4개의 상이한 에피토프로 이루어지지 않고/않거나;
(b) 폴리펩티드는 적어도 2개의 상이한 폴리펩티드 분자를 포함하고/하거나;
(c) 에피토프는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산을 포함하고/하거나;
(d) Yn-Bt 및/또는 Cu-Zp는, 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때, 에피토프로부터 절단되는 것인 방법.
[128] 단락 [126] 또는 [127]에 있어서, n이 0인 경우, p가 1 내지 1000의 정수이고; p가 0인 경우, n이 1 내지 100의 정수인 방법.
[129] 단락 [126] 내지 [128] 중 어느 한 단락에 있어서, 각각의 X가 독립적으로 대상체의 게놈 내 핵산 서열에 의해 코딩되는 임의의 인접 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 서열의 아미노산을 나타내고, (a) MHC가 클래스 I MHC이고 m이 8 내지 12의 정수이거나, (b) MHC가 클래스 II MHC 이고 m이 9 내지 25의 정수인 방법.
[130] 단락 [1] 내지 [118] 중 어느 한 단락의 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
[131] 단락 [130]에 있어서, 면역조절제 또는 애주번트를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
[132] 단락 [131]에 있어서, 면역조절제 또는 애주번트가 poly-ICLC, 1018 ISS, 알루미늄 염, 암플리박스, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, ARNAX, STING 효능제, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, 이미퀴모드, ImuFact IMP321, IS 패치, ISS, ISCOMATRIX, 주브이뮨, LipoVac, MF59, 모노포스포릴지질 A, 몬타니드 IMS 1312, 몬타니드 ISA 206, 몬타니드 ISA 50V, 몬타니드 ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PepTel®, 벡터 시스템, PLGA 마이크로입자, 레시퀴모드, SRL172, 비로좀 및 다른 바이러스-유사 입자, YF-17D, VEGF 트랩, R848, 베타-글루칸, Pam2Cys, Pam3Cys, Pam3C-SK4, 및 어퀼러 QS21 스티물론으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물.
[133] 단락 [131] 또는 [132]에 있어서, 면역조절제 또는 애주번트가 poly-ICLC를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
[134] 단락 [130] 내지 [133] 중 어느 한 단락에 있어서, 약제학적 조성물이 백신 조성물인 약제학적 조성물.
[135] 단락 [130] 내지 [134] 중 어느 한 단락에 있어서, 약제학적 조성물이 수성 또는 액체인 약제학적 조성물.
[136] 단락 [130] 내지 [135] 중 어느 한 단락에 있어서, 에피토프가 1 ng 내지 10 mg 또는 5 μg 내지 1.5 mg의 양으로 약제학적 조성물에 존재하는 것인 약제학적 조성물.
[137] 단락 [130] 내지 [136] 중 어느 한 단락에 있어서, DMSO를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
[138] 단락 [130] 내지 [137] 중 어느 한 단락에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제가 물을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
[139] 단락 [130] 내지 [138] 중 어느 한 단락에 있어서, 약제학적 조성물이 1 mM 미만 또는 1 mM 초과의 농도로 존재하는 pH 조절제를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
[140] 단락 [139]에 있어서, pH 조절제가 디카르복실레이트 염 또는 트리카르복실레이트 염인 약제학적 조성물.
[141] 단락 [139]에 있어서, pH 조절제가 숙신산의 디카르복실레이트 염, 또는 디숙시네이트 염인 약제학적 조성물.
[142] 단락 [139]에 있어서, pH 조절제가 시트르산의 트리카르복실레이트 염, 또는 트리시트레이트 염인 약제학적 조성물.
[143] 단락 [139]에 있어서, pH 조절제가 이나트륨 숙시네이트인 약제학적 조성물.
[144] 단락 [141]에 있어서, 숙신산의 디카르복실레이트 염, 또는 디숙시네이트 염이 0.1 mM - 1 mM의 농도로 약제학적 조성물에 존재하는 것인 약제학적 조성물.
[145] 단락 [141]에 있어서, 숙신산의 디카르복실레이트 염, 또는 디숙시네이트 염이 1 mM - 5 mM의 농도로 약제학적 조성물에 존재하는 것인 약제학적 조성물.
[146] 단락 [130] 내지 [145] 중 어느 한 단락에 있어서, 에피토프에 대한 면역 반응이 대상체에게 투여될 때 증가되는 것인 약제학적 조성물.
[147] 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 단락 [130] 내지 [146] 중 어느 한 단락의 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 그 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
[148] 단락 [147]에 있어서, 질환 또는 병태가 암인 방법.
[149] 단락 [148]에 있어서, 암이 폐암, 비-소세포 폐암, 췌장암, 결장직장암, 자궁암, 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
[150] 단락 [147] 내지 [149] 중 어느 한 단락에 있어서, 투여가 피내 주사, 비강내 스프레이 적용, 근육내 주사, 복강내 주사, 정맥내 주사, 경구 투여, 또는 피하 주사를 포함하는 것인 방법.
[151] 대상체를 예방하는 방법으로서, 대상체의 세포를 단락 [1] 내지 [122] 및 [130] 내지 [146] 중 어느 한 단락의 폴리펩티드, 세포, 또는 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
[152] 대상체의 종양 세포에 의해 발현되는 에피토프를 확인하는 단계 및 에피토프를 포함하는 폴리펩티드를 생성하는 단계를 포함하는 방법으로서, 폴리펩티드가 하기 화학식 (I)의 구조 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 갖는 것인 방법:
Yn-Bt-Ar-Xm-As-Cu-Zp
화학식 (I)
상기 식에서,
(i) Xm은 에피토프이고, 각각의 X는 독립적으로 대상체의 게놈 내 핵산 서열에 의해 코딩되는 인접 아미노산 서열의 아미노산을 나타내고,
(a) MHC는 클래스 I MHC이고 m은 8 내지 12의 정수이거나,
(b) MHC는 클래스 II MHC이고 m은 9 내지 25의 정수이고;
(ii) 각각의 Y는 독립적으로 아미노산, 또는 이의 유사체 또는 유도체이고,
(A) 화학식 (I)에서 Ar의 변수 r이 0인 경우, Yn은 Bt-Ar-Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않거나,
(B) 화학식 (I)에서 Ar의 변수 r이 1이고 화학식 (I)에서 Bt의 변수 t가 0인 경우, Yn은 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않거나,
(C) 화학식 (I)에서 Ar의 변수 r이 1이고 화학식 (I)에서 Bt의 변수 t가 1 이상인 경우, Yn은 Bt를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산에 의해 코딩되지 않고;
추가로 n은 0 내지 1000의 정수이고;
(iii) 각각의 Z는 독립적으로 아미노산, 또는 이의 유사체 또는 유도체이고,
(A) 화학식 (I)에서 As의 변수 s가 0인 경우, Zp는 Xm-As-Cu를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않거나,
(B) 화학식 (I)에서 As의 변수 s가 1이고 화학식 (I)에서 Cu의 변수 u가 0인 경우, Zp는 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않거나,
(C) 화학식 (I)에서 As의 변수 s가 1이고 화학식 (I)에서 Cu의 변수 u가 1 이상인 경우, Zp는 Cu를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산에 의해 코딩되지 않고;
추가로 p는 0 내지 1000의 정수이고;
추가로
n이 0인 경우, p는 1 내지 1000의 정수이고;
p가 0인 경우, n은 1 내지 1000의 정수이고;
(iv) Ar은 링커이고, r은 0 또는 1이고;
(v) As는 링커이고, s는 0 또는 1이고;
(vi) 각각의 B는 독립적으로 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 대상체의 게놈 내 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산을 나타내고,
t는 0 내지 1000의 정수이고;
(vii) 각각의 C는 독립적으로 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 대상체의 게놈 내 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산을 나타내고,
u는 0 내지 1000의 정수이고;
추가로
(a) 폴리펩티드는 클래스 I MHC에 의해 제시되는 4개의 상이한 에피토프로 이루어지지 않고/않거나;
(b) 폴리펩티드는 적어도 2개의 상이한 폴리펩티드 분자를 포함하고/하거나;
(c) 에피토프는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산을 포함하고/하거나;
(d) Yn 및/또는 Zp는, 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때, 에피토프로부터 절단된다.
[153] 단락 [152]에 있어서, 확인 단계는, 대상체의 비-종양 세포로부터 시퀀싱된 핵산 서열의 풀에 존재하지 않는 하나 이상의 상이한 돌연변이를 포함하는 복수의 후보 펩티드 서열을 코딩하는 대상체의 종양 세포로부터 시퀀싱된 핵산 서열의 풀로부터 복수의 핵산 서열을 선택하는 것을 포함하고, 대상체의 종양 세포로부터 시퀀싱된 핵산 서열의 풀 및 대상체의 비-종양 세포로부터 시퀀싱된 핵산 서열의 풀은 전체 게놈 시퀀싱 또는 전체 엑솜 시퀀싱에 의해 시퀀싱되는 것인 방법.
[154] 단락 [152] 또는 [153]에 있어서, 확인 단계는, 복수의 후보 펩티드 서열 중 어느 후보 펩티드 서열이 HLA 펩티드 결합 분석에 의해 동일한 대상체의 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질과 복합체를 형성하는지를 예측 또는 측정하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
[155] 단락 [152] 내지 [154] 중 어느 한 단락에 있어서, 확인 단계는, HLA 펩티드 결합 분석에 기초하여 후보 펩티드 서열로부터 복수의 선택된 종양 특이적 펩티드 또는 복수의 선택된 종양 특이적 펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 선택하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
[156] 단락 [152] 내지 [155] 중 어느 한 단락에 있어서, 대상체에게 폴리펩티드를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
[157] 단락 [156]에 있어서, 투여 단계는 피내 주사, 비강내 스프레이 적용, 근육내 주사, 복강내 주사, 정맥내 주사, 경구 투여, 또는 피하 주사를 포함하는 것인 방법.
[158] 단락 [152] 내지 [157] 중 어느 한 단락에 있어서, 면역 반응이 대상체에서 유도되는 것인 방법.
[159] 단락 [152] 내지 [158] 중 어느 한 단락에 있어서, 대상체의 종양 세포에 의해 발현되는 에피토프가 신생항원, 종양 관련된 항원, 돌연변이된 종양 관련된 항원이고/이거나, 에피토프의 발현이 대상체의 정상 세포에서의 에피토프의 발현과 비교하여 대상체의 종양 세포에서 더 높은 것인 방법.
SEQUENCE LISTING
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 8
Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys Ser Ala
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 9
Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser Ala
1 5
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 10
Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val
1 5 10
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 11
Phe Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Leu
1 5 10
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 12
Phe Met Val Val Val Gly Ala Cys Gly Ile
1 5 10
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 13
Phe Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Ile
1 5 10
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 14
Phe Met Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val
1 5 10
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 15
Phe Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val
1 5 10
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 16
Met Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val
1 5 10
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 17
Phe Met Val Val Val Gly Ala Cys Gly Leu
1 5 10
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 18
Tyr Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val
1 5 10
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 19
Lys Met Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val
1 5 10
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 20
Tyr Met Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val
1 5 10
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 21
Met Met Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val
1 5 10
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 22
Asp Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 23
Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr Ser Ala Met
1 5 10
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 24
Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly His Glu
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 25
Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly His
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 26
Ile Leu Asp Thr Ala Gly His Glu Glu
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 27
Ile Leu Asp Thr Ala Gly His Glu
1 5
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 28
Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 29
Asp Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr Ser
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 30
Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly His
1 5 10
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 31
Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg Glu
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 32
Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 33
Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg Glu Glu
1 5
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 34
Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg Glu
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 35
Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg
1 5 10
<210> 36
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 36
Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr Ser Ala Met
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 37
Arg Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 38
Asp Thr Ala Gly Lys Glu Glu Tyr Ser Ala Met
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<210> 39
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 39
Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Lys
1 5 10
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 40
Asp Thr Ala Gly Lys Glu Glu Tyr
1 5
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 41
Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Lys
1 5 10
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 42
Ile Leu Asp Thr Ala Gly Lys Glu
1 5
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 43
Ile Leu Asp Thr Ala Gly Lys Glu Glu
1 5
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 44
Asp Thr Ala Gly Leu Glu Glu Tyr
1 5
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 45
Ile Leu Asp Thr Ala Gly Leu Glu
1 5
<210> 46
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 46
Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Leu
1 5
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 47
Ile Leu Asp Thr Ala Gly Leu Glu Glu
1 5
<210> 48
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 48
Gly Leu Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr
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<210> 49
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 49
Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Leu Glu
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 50
Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 51
Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Leu Glu
1 5
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 52
Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Leu Glu Glu Tyr
1 5 10
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 53
Ala Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu
1 5
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 54
Gly Ala Ala Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu
1 5 10
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 55
Ala Ala Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu
1 5
<210> 56
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 56
Cys Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu
1 5
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 57
Ala Cys Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu
1 5
<210> 58
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 58
Asp Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu
1 5
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 59
Ala Asp Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu
1 5
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 60
Asp Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile
1 5 10
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 61
Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys Ser Ala
1 5
<210> 62
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 62
Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val
1 5 10
<210> 63
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 63
Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val
1 5
<210> 64
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 64
Ser Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu
1 5
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 65
Val Val Val Gly Ala Ser Gly Val Gly Lys
1 5 10
<210> 66
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 66
Gly Ala Ser Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu
1 5 10
<210> 67
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 67
Val Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu
1 5
<210> 68
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 68
Val Val Val Gly Ala Gly Cys Val Gly Lys
1 5 10
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 69
Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Cys
1 5
<210> 70
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 70
Gly Asp Val Gly Lys Ser Ala Leu
1 5
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 71
Asp Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile
1 5
<210> 72
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 72
Val Val Val Gly Ala Gly Asp Val Gly Lys
1 5 10
<210> 73
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 73
Thr Ala Gly Lys Glu Glu Tyr Ser Ala Met
1 5 10
<210> 74
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 74
Asp Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr Ser Ala Met
1 5 10
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 75
Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr Ser Ala
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 76
Asp Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr Ser Ala Met
1 5 10
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 77
Thr Ala Gly Lys Glu Glu Tyr Ser Ala
1 5
<210> 78
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 78
Ala Ala Gly Val Gly Lys Ser Ala
1 5
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 79
Ala Gly Cys Val Gly Lys Ser Ala Leu
1 5
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 80
Ala Gly Asp Val Gly Lys Ser Ala Leu
1 5
<210> 81
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 81
Ala Gly Lys Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg
1 5 10
<210> 82
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 82
Ala Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile
1 5 10
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 83
Ala Arg Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu
1 5
<210> 84
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 84
Ala Ser Gly Val Gly Lys Ser Ala
1 5
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 85
Ala Ser Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu
1 5
<210> 86
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 86
Ala Val Gly Val Gly Lys Ser Ala
1 5
<210> 87
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 87
Cys Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile
1 5
<210> 88
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 88
Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Lys
1 5
<210> 89
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 89
Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr
1 5 10
<210> 90
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 90
Asp Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg
1 5 10
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 91
Asp Thr Ala Gly Lys Glu Glu Tyr Ser
1 5
<210> 92
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 92
Asp Thr Ala Gly Lys Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg
1 5 10
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 93
Asp Thr Ala Gly Leu Glu Glu Tyr Ser
1 5
<210> 94
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 94
Asp Thr Ala Gly Leu Glu Glu Tyr Ser Ala
1 5 10
<210> 95
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 95
Asp Thr Ala Gly Leu Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg
1 5 10
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 96
Asp Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr Ser
1 5
<210> 97
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 97
Asp Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg
1 5 10
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 98
Gly Ala Ala Gly Val Gly Lys Ser Ala
1 5
<210> 99
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 99
Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys Ser
1 5
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 100
Gly Ala Gly Asp Val Gly Lys Ser Ala
1 5
<210> 101
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 101
Gly Ala Gly Asp Val Gly Lys Ser Ala Leu
1 5 10
<210> 102
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 102
Gly Ala Ser Gly Val Gly Lys Ser Ala
1 5
<210> 103
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 103
Gly Cys Val Gly Lys Ser Ala Leu
1 5
<210> 104
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 104
Gly Cys Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile
1 5 10
<210> 105
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 105
Gly His Glu Glu Tyr Ser Ala Met
1 5
<210> 106
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 106
Gly Lys Glu Glu Tyr Ser Ala Met
1 5
<210> 107
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 107
Gly Leu Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg
1 5
<210> 108
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 108
Gly Arg Glu Glu Tyr Ser Ala Met
1 5
<210> 109
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 109
Gly Arg Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg
1 5
<210> 110
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 110
His Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp
1 5
<210> 111
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 111
Lys Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp
1 5
<210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 112
Lys Leu Val Val Val Gly Ala Ser Gly
1 5
<210> 113
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 113
Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg
1 5
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 114
Leu Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp
1 5
<210> 115
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 115
Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val
1 5
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 116
Leu Val Val Val Gly Ala Ser Gly Val
1 5
<210> 117
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 117
Arg Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr
1 5 10
<210> 118
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 118
Arg Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu
1 5
<210> 119
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 119
Thr Ala Gly Leu Glu Glu Tyr Ser Ala
1 5
<210> 120
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 120
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Ala
1 5 10
<210> 121
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 121
Val Gly Ala Ala Gly Val Gly Lys Ser Ala
1 5 10
<210> 122
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 122
Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys
1 5
<210> 123
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 123
Val Gly Ala Ser Gly Val Gly Lys Ser Ala
1 5 10
<210> 124
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 124
Val Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile
1 5 10
<210> 125
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 125
Val Val Val Gly Ala Ala Gly Val
1 5
<210> 126
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 126
Val Val Val Gly Ala Val Gly Val
1 5
<210> 127
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 127
Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys
1 5
<210> 128
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 128
Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp
1 5
<210> 129
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 129
Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg
1 5
<210> 130
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 130
Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Lys Glu
1 5
<210> 131
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 131
Ile Asp Ile Ile Met Lys Ile Arg Asn Ala
1 5 10
<210> 132
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 132
Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe
1 5 10 15
Phe Phe Phe Phe Ile Ile Phe Phe Ile Phe Phe Trp Met Cys
20 25 30
<210> 133
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 133
Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe
1 5 10 15
Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Ala Ala Phe Trp Phe Trp
20 25 30
<210> 134
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 134
Ile Phe Phe Ile Phe Phe Ile Ile Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe
1 5 10 15
Phe Phe Phe Phe Ile Ile Ile Ile Ile Ile Ile Trp Glu Cys
20 25 30
<210> 135
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 135
Phe Ile Phe Phe Phe Ile Ile Phe Phe Phe Phe Phe Ile Phe Phe Phe
1 5 10 15
Phe Phe Ile Phe Ile Ile Ile Ile Ile Ile Phe Trp Glu Cys
20 25 30
<210> 136
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 136
Thr Glu Tyr Lys Leu Val
1 5
<210> 137
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 137
Trp Gln Ala Gly Ile Leu Ala Arg
1 5
<210> 138
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 138
His Ser Tyr Thr Thr Ala Glu
1 5
<210> 139
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 139
Pro Leu Thr Glu Glu Lys Ile Lys
1 5
<210> 140
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 140
Gly Ala Leu His Phe Lys Pro Gly Ser Arg
1 5 10
<210> 141
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 141
Arg Arg Ala Asn Lys Asp Ala Thr Ala Glu
1 5 10
<210> 142
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 142
Lys Ala Phe Ile Ser His Glu Glu Lys Arg
1 5 10
<210> 143
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 143
Thr Asp Leu Ser Ser Arg Phe Ser Lys Ser
1 5 10
<210> 144
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 144
Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 145
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 145
Cys Leu Leu Leu His Tyr Ser Val Ser Lys
1 5 10
<210> 146
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 146
Lys Lys Lys Lys Ile Ile Met Lys Ile Arg Asn Ala
1 5 10
<210> 147
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 147
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val
1 5
<210> 148
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 148
Lys Lys Asn Lys Lys Asp Asp Ile
1 5
<210> 149
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 149
Lys Lys Asn Lys Lys Asp Asp Ile Lys Asp
1 5 10
<210> 150
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 150
Ala Gly Asn Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
1 5 10 15
Asp Asp Asp Asp Lys Lys Asp Lys Asp Asp Asp Asp Asp Asp
20 25 30
<210> 151
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 151
Ala Gly Asn Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Asn Asn Asn Asn Asn Asn
1 5 10 15
Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn
20 25 30
<210> 152
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 152
Ala Gly Arg Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
1 5 10 15
Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
20 25 30
<210> 153
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 153
Ser Ala Leu Thr Ile
1 5
<210> 154
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 154
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu
1 5
<210> 155
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 155
Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu
1 5
<210> 156
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 156
Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile
1 5
<210> 157
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 157
Gln Gly Gln Asn Leu Lys Tyr Gln
1 5
<210> 158
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 158
Ile Leu Gly Val Leu Leu Leu Ile
1 5
<210> 159
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 159
Glu Lys Glu Gly Lys Ile Ser Lys
1 5
<210> 160
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 160
Ala Ala Ser Asp Phe Ile Phe Leu Val Thr
1 5 10
<210> 161
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 161
Lys Glu Leu Lys Gln Val Ala Ser Pro Phe
1 5 10
<210> 162
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 162
Lys Lys Lys Leu Ile Asn Glu Lys Lys Glu
1 5 10
<210> 163
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 163
Lys Lys Cys Asp Ile Ser Leu Gln Phe Phe
1 5 10
<210> 164
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 164
Lys Ser Thr Ala Gly Asp Thr His Leu Gly
1 5 10
<210> 165
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 165
Ala Thr Phe Tyr Val Ala Val Thr Val Pro
1 5 10
<210> 166
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 166
Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr Asp Pro
1 5 10 15
Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
20 25 30
<210> 167
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 167
Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr Asp Pro Thr
1 5 10 15
Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly Glu
20 25 30
<210> 168
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 168
Lys Lys Lys Lys Lys Pro Lys Arg Asp Gly Tyr Met Phe Leu Lys Ala
1 5 10 15
Glu Ser Lys Ile Met Phe Ala Thr
20
<210> 169
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 169
Lys Lys Lys Lys Tyr Met Phe Leu Lys Ala Glu Ser Lys Ile Met Phe
1 5 10 15
Ala Thr Leu Gln Arg Ser Ser
20
<210> 170
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 170
Lys Lys Lys Lys Lys Ala Glu Ser Lys Ile Met Phe Ala Thr Leu Gln
1 5 10 15
Arg Ser Ser Leu Trp Cys Leu
20
<210> 171
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 171
Lys Lys Lys Lys Lys Ile Met Phe Ala Thr Leu Gln Arg Ser Ser Leu
1 5 10 15
Trp Cys Leu Cys Ser Asn His
20
<210> 172
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 172
Lys Lys Lys Lys Met Phe Ala Thr Leu Gln Arg Ser Ser Leu Trp Cys
1 5 10 15
Leu Cys Ser Asn His
20
<210> 173
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 173
Met Leu Thr Gly Pro Pro Ala Arg Val
1 5
<210> 174
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 174
Ser Met Leu Thr Gly Pro Pro Ala Arg Val
1 5 10
<210> 175
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 175
Val Leu Pro Glu Pro His Leu Ala Leu
1 5
<210> 176
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 176
Lys Pro Lys Arg Asp Gly Tyr Met Phe
1 5
<210> 177
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 177
Lys Pro Lys Arg Asp Gly Tyr Met Phe Leu
1 5 10
<210> 178
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 178
Glu Ser Lys Ile Met Phe Ala Thr Leu
1 5
<210> 179
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 179
Lys Arg Asp Gly Tyr Met Phe Leu
1 5
<210> 180
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 180
Pro Ala Val Pro Phe Asp Leu His Phe
1 5
<210> 181
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 181
Ala Glu Ser Lys Ile Met Phe Ala Thr Leu
1 5 10
<210> 182
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 182
Phe Ala Thr Leu Gln Arg Ser Ser Leu
1 5
<210> 183
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 183
Ala Arg Val Pro Ala Val Pro Phe Asp
1 5
<210> 184
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 184
Ile Met Lys Pro Lys Arg Asp Gly Tyr
1 5
<210> 185
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 185
Asp Gly Tyr Met Phe Leu Lys Ala
1 5
<210> 186
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 186
Met Phe Leu Lys Ala Glu Ser Lys Ile Met Phe
1 5 10
<210> 187
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 187
Leu Thr Gly Pro Pro Ala Arg Val
1 5
<210> 188
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 188
Ala Arg Val Pro Ala Val Pro Phe
1 5
<210> 189
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 189
Ser Met Leu Thr Gly Pro Pro Ala Arg
1 5
<210> 190
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 190
Arg Val Pro Ala Val Pro Phe Asp Leu
1 5
<210> 191
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 191
Leu Thr Gly Pro Pro Ala Arg Val Pro
1 5
<210> 192
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 192
Val Val Val Gly Ala Ala Gly Val Gly Lys
1 5 10
<210> 193
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 193
Val Val Val Gly Ala Ala Gly Val Gly
1 5
<210> 194
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 194
Val Val Gly Ala Ala Gly Val Gly Lys
1 5
<210> 195
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 195
Val Val Gly Ala Ala Gly Val Gly
1 5
<210> 196
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 196
Val Gly Ala Ala Gly Val Gly Lys
1 5
<210> 197
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 197
Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys
1 5 10
<210> 198
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 198
Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly
1 5
<210> 199
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 199
Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val
1 5
<210> 200
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 200
Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys
1 5
<210> 201
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 201
Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly
1 5
<210> 202
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 202
Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys
1 5
<210> 203
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 203
Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys
1 5 10
<210> 204
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 204
Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly
1 5
<210> 205
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 205
Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val
1 5
<210> 206
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 206
Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys
1 5
<210> 207
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 207
Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly
1 5
<210> 208
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 208
Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys
1 5 10
<210> 209
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 209
Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly
1 5
<210> 210
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 210
Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys
1 5
<210> 211
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 211
Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly
1 5
<210> 212
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 212
Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys
1 5
<210> 213
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 213
Val Val Val Gly Ala Ser Gly Val Gly
1 5
<210> 214
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 214
Val Val Val Gly Ala Ser Gly Val
1 5
<210> 215
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 215
Val Val Gly Ala Ser Gly Val Gly Lys
1 5
<210> 216
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 216
Val Val Gly Ala Ser Gly Val Gly
1 5
<210> 217
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 217
Val Gly Ala Ser Gly Val Gly Lys
1 5
<210> 218
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 218
Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys
1 5 10
<210> 219
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 219
Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly
1 5
<210> 220
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 220
Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys
1 5
<210> 221
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 221
Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly
1 5
<210> 222
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 222
Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys
1 5
<210> 223
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 223
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5
<210> 224
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 224
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5
<210> 225
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 225
Lys Thr Glu Tyr
1
<210> 226
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 226
Lys Thr Glu Tyr Lys
1 5
<210> 227
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 227
Lys Thr Glu Tyr Lys Leu
1 5
<210> 228
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 228
Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val
1 5
<210> 229
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 229
Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val
1 5
<210> 230
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 230
Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val
1 5
<210> 231
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 231
Lys Lys Thr Glu Tyr
1 5
<210> 232
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 232
Lys Lys Thr Glu Tyr Lys
1 5
<210> 233
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 233
Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu
1 5
<210> 234
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 234
Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val
1 5
<210> 235
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 235
Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val
1 5
<210> 236
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 236
Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val
1 5 10
<210> 237
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 237
Lys Lys Lys Thr Glu Tyr
1 5
<210> 238
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 238
Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys
1 5
<210> 239
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 239
Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu
1 5
<210> 240
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 240
Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val
1 5
<210> 241
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 241
Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val
1 5 10
<210> 242
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 242
Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val
1 5 10
<210> 243
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 243
Lys Lys Lys Lys Thr Glu Tyr
1 5
<210> 244
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 244
Lys Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys
1 5
<210> 245
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 245
Lys Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu
1 5
<210> 246
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 246
Lys Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val
1 5 10
<210> 247
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 247
Lys Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val
1 5 10
<210> 248
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 248
Lys Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val
1 5 10
<210> 249
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 249
Thr Glu Tyr Lys
1
<210> 250
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 250
Thr Glu Tyr Lys Leu
1 5
<210> 251
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 251
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val
1 5
<210> 252
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 252
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val
1 5
<210> 253
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 253
Ser Ala Leu Thr Ile Lys
1 5
<210> 254
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 254
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys
1 5
<210> 255
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 255
Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys
1 5 10
<210> 256
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 256
Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Lys
1 5
<210> 257
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 257
Ser Ala Leu Thr Ile Lys Lys
1 5
<210> 258
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 258
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys
1 5
<210> 259
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 259
Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys
1 5 10
<210> 260
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 260
Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Lys Lys
1 5
<210> 261
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 261
Ser Ala Leu Thr Ile Lys Lys Lys
1 5
<210> 262
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 262
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys Lys
1 5 10
<210> 263
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 263
Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys Lys
1 5 10
<210> 264
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 264
Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Lys Lys Lys
1 5 10
<210> 265
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 265
Ser Ala Leu Thr Ile Lys Lys Lys Lys
1 5
<210> 266
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 266
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys Lys Lys
1 5 10
<210> 267
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 267
Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys Lys Lys
1 5 10
<210> 268
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 268
Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu
20
<210> 269
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 269
Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu
20
<210> 270
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 270
Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu
20
<210> 271
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 271
Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu
20
<210> 272
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 272
Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly
1 5 10 15
Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu
20
<210> 273
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 273
Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly
1 5 10 15
Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu
20
<210> 274
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 274
Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly
1 5 10 15
Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu
20
<210> 275
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 275
Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly
1 5 10 15
Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu
20
<210> 276
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 276
Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val
1 5 10 15
Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu
20 25
<210> 277
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 277
Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val
1 5 10 15
Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu
20 25
<210> 278
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 278
Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val
1 5 10 15
Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu
20 25
<210> 279
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 279
Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val
1 5 10 15
Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu
20 25
<210> 280
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 280
Lys Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly
1 5 10 15
Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu
20 25
<210> 281
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 281
Lys Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly
1 5 10 15
Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu
20 25
<210> 282
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 282
Lys Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly
1 5 10 15
Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu
20 25
<210> 283
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 283
Lys Lys Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly
1 5 10 15
Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu
20 25
<210> 284
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 284
Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly
1 5 10 15
Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys
20 25
<210> 285
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 285
Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly
1 5 10 15
Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys
20 25
<210> 286
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 286
Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly
1 5 10 15
Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys
20 25
<210> 287
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 287
Lys Lys Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly
1 5 10 15
Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys
20 25
<210> 288
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 288
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys
20
<210> 289
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 289
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys
20
<210> 290
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 290
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys
20
<210> 291
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 291
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys
20
<210> 292
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 292
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys
20
<210> 293
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 293
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys
20
<210> 294
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 294
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys
20
<210> 295
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 295
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys
20
<210> 296
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 296
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys Lys
20 25
<210> 297
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 297
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys Lys
20 25
<210> 298
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 298
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys Lys
20 25
<210> 299
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 299
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys Lys
20 25
<210> 300
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 300
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys Lys Lys
20 25
<210> 301
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 301
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys Lys Lys
20 25
<210> 302
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 302
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys Lys Lys
20 25
<210> 303
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 303
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ile Gln Leu Lys Lys Lys Lys
20 25
<210> 304
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 304
Ala Leu Asn Ser Glu Ala Leu Ser Val
1 5
<210> 305
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(10)
<223> This region may encompass 5-10 residues
<220>
<223> See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments
<400> 305
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5 10
<210> 306
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> This region may encompass 4-7 residues
<220>
<223> See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments
<400> 306
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 307
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 307
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 308
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> This region may encompass 5-10 residues
<220>
<223> See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments
<400> 308
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 309
<211> 62
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 309
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu
50 55 60
<210> 310
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 310
Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val
1 5
<210> 311
<211> 62
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 311
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu
50 55 60
<210> 312
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 312
Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val
1 5 10
<210> 313
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 313
Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val
1 5
<210> 314
<211> 62
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 314
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu
50 55 60
<210> 315
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 315
Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val
1 5 10
<210> 316
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 316
Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val
1 5
<210> 317
<211> 101
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 317
Ala Gly Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn
1 5 10 15
His Phe Val Asp Glu Tyr Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys
20 25 30
Gln Val Val Ile Asp Gly Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr
35 40 45
Ala Gly His Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr
50 55 60
Gly Glu Gly Phe Leu Cys Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe
65 70 75 80
Glu Asp Ile His His Tyr Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser
85 90 95
Glu Asp Val Pro Met
100
<210> 318
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 318
Ile Leu Asp Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr
1 5 10
<210> 319
<211> 101
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 319
Ala Gly Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn
1 5 10 15
His Phe Val Asp Glu Tyr Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys
20 25 30
Gln Val Val Ile Asp Gly Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr
35 40 45
Ala Gly Leu Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr
50 55 60
Gly Glu Gly Phe Leu Cys Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe
65 70 75 80
Glu Asp Ile His His Tyr Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser
85 90 95
Glu Asp Val Pro Met
100
<210> 320
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 320
Ile Leu Asp Thr Ala Gly Leu Glu Glu Tyr
1 5 10
<210> 321
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 321
Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Leu
1 5 10
<210> 322
<211> 101
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 322
Ala Gly Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn
1 5 10 15
His Phe Val Asp Glu Tyr Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys
20 25 30
Gln Val Val Ile Asp Gly Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr
35 40 45
Ala Gly Lys Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr
50 55 60
Gly Glu Gly Phe Leu Cys Val Phe Ala Ile Asn Asn Ser Lys Ser Phe
65 70 75 80
Ala Asp Ile Asn Leu Tyr Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser
85 90 95
Asp Asp Val Pro Met
100
<210> 323
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 323
Ile Leu Asp Thr Ala Gly Lys Glu Glu Tyr
1 5 10
<210> 324
<211> 101
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 324
Ala Gly Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn
1 5 10 15
His Phe Val Asp Glu Tyr Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys
20 25 30
Gln Val Val Ile Asp Gly Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr
35 40 45
Ala Gly Arg Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr
50 55 60
Gly Glu Gly Phe Leu Cys Val Phe Ala Ile Asn Asn Ser Lys Ser Phe
65 70 75 80
Ala Asp Ile Asn Leu Tyr Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser
85 90 95
Asp Asp Val Pro Met
100
<210> 325
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 325
Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr
1 5 10
<210> 326
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 326
Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr Ser
1 5 10 15
Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met
20
<210> 327
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 327
Ala Gly His Glu Glu Tyr Ser Ala Met
1 5
<210> 328
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 328
Leu Asp Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr
1 5
<210> 329
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 329
Asp Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr Ser Ala
1 5 10
<210> 330
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 330
Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr Ser
1 5 10 15
Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met
20
<210> 331
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 331
Asp Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr
1 5
<210> 332
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 332
Ala Gly Arg Glu Glu Tyr Ser Ala Met
1 5
<210> 333
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 333
Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr Ser Ala
1 5
<210> 334
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 334
Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg
1 5 10
<210> 335
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 335
Ala Gly Arg Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg
1 5 10
<210> 336
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 336
Leu Asp Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr
1 5
<210> 337
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 337
Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Lys Glu Glu Tyr Ser
1 5 10 15
Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met
20
<210> 338
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 338
Ala Gly Lys Glu Glu Tyr Ser Ala Met
1 5
<210> 339
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 339
Leu Asp Thr Ala Gly Lys Glu Glu Tyr
1 5
<210> 340
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 340
Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Leu Glu Glu Tyr Ser
1 5 10 15
Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met
20
<210> 341
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 341
Asp Thr Ala Gly Leu Glu Glu Tyr Ser Ala Met
1 5 10
<210> 342
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 342
Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Leu
1 5 10
<210> 343
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 343
Leu Asp Thr Ala Gly Leu Glu Glu Tyr
1 5
<210> 344
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 344
Ala Gly Leu Glu Glu Tyr Ser Ala Met
1 5
<210> 345
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 345
Ala Gly Leu Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg
1 5 10
<210> 346
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 346
Gly Leu Glu Glu Tyr Ser Ala Met
1 5
<210> 347
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 347
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Ala Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu
20
<210> 348
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 348
Leu Val Val Val Gly Ala Ala Gly Val
1 5
<210> 349
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 349
Lys Leu Val Val Val Gly Ala Ala Gly Val
1 5 10
<210> 350
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 350
Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Ala
1 5
<210> 351
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 351
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu
20
<210> 352
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 352
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu
20
<210> 353
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 353
Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys Ser Ala
1 5 10
<210> 354
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 354
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu
20
<210> 355
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 355
Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu
1 5 10
<210> 356
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 356
Arg Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile
1 5 10
<210> 357
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 357
Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg
1 5
<210> 358
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 358
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Ser Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu
20
<210> 359
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 359
Lys Leu Val Val Val Gly Ala Ser Gly Val
1 5 10
<210> 360
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 360
Ser Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile
1 5 10
<210> 361
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 361
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu
20
<210> 362
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 362
Ala Val Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu
1 5
<210> 363
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 363
Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val
1 5
<210> 364
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 364
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Cys Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu
20
<210> 365
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 365
Val Val Gly Ala Gly Cys Val Gly Lys
1 5
<210> 366
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 366
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Asp Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu
20
<210> 367
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 367
Val Val Gly Ala Gly Asp Val Gly Lys
1 5
<210> 368
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 368
Ala Leu Asn Ser Glu Ala Leu Ser Val Val
1 5 10
<210> 369
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 369
Met Ala Leu Asn Ser Glu Ala Leu Ser Val
1 5 10
<210> 370
<211> 71
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 370
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Val Val
50 55 60
Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys
65 70
<210> 371
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 371
ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc 30
<210> 372
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 372
ggcggcagcc tgggcggcgg cggcagcggc 30
<210> 373
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 373
ggcgtcggca cc 12
<210> 374
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 374
cagctgggcc tg 12
<210> 375
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 375
caactgggat tg 12
<210> 376
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
6xHis tag
<400> 376
His His His His His His
1 5
<210> 377
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 377
Ala Val Gly Ile Thr Tyr Thr Trp Thr Arg Leu Tyr Ala Ser Val Leu
1 5 10 15
Thr Gly Ser Leu Val Ser Lys Thr Lys Lys
20 25
<210> 378
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 378
Ile Gln Lys Ile Ser Phe Phe Asp Gly Phe Glu Val Gly Phe Asn Phe
1 5 10 15
Arg Thr Leu Gln Pro Asn Gly Leu Leu Phe Tyr Tyr Thr
20 25
<210> 379
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 379
Gly Ile Pro Val His Leu Glu Leu Ala Ser Met Thr Asn Met Glu Leu
1 5 10 15
Met Ser Ser Ile Val His Gln Gln Val Phe Pro Thr
20 25
<210> 380
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 380
Gly Arg Val Leu Glu Leu Phe Arg Ala Ala Gln Leu Ala Asn Asp Val
1 5 10 15
Val Leu Gln Ile Met Glu Leu Cys Gly Ala Thr Arg
20 25
<210> 381
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 381
Lys Ala Arg Asp Glu Thr Ala Ala Leu Leu Asn Ser Ala Val Leu Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Phe Val Pro Pro Ala Asp
20 25
<210> 382
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 382
Arg Glu Gly Val Glu Leu Cys Pro Gly Asn Lys Tyr Glu Met Arg Arg
1 5 10 15
His Gly Thr Thr His Ser Leu Val Ile His Asp
20 25
<210> 383
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 383
Pro Ser Lys Pro Ser Phe Gln Glu Phe Val Asp Trp Glu Asn Val Ser
1 5 10 15
Pro Glu Leu Asn Ser Thr Asp Gln Pro Phe Leu
20 25
<210> 384
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Cit
<400> 384
Lys Lys Lys Lys Val Xaa
1 5
<210> 385
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 385
Gln Leu Gly Leu
1
<210> 386
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 386
Gly Val Gly Thr
1
<210> 387
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 387
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ile
20
<210> 388
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 388
Lys Lys Lys Lys Ile Ile Met Lys Ile Arg Asn Ala Val Val Gly Ala
1 5 10 15
Val Gly Val Gly Lys Lys Lys Asn Lys Lys Asp Asp Ile
20 25
<210> 389
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 389
Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu
1 5 10 15
<210> 390
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 390
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
<210> 391
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 391
Trp Gln Ala Gly Ile Leu Ala Arg Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly
1 5 10 15
Lys Gln Gly Gln Asn Leu Lys Tyr Gln
20 25
<210> 392
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 392
His Ser Tyr Thr Thr Ala Glu Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ile Leu Gly Val Leu Leu Leu Ile
20
<210> 393
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 393
Pro Leu Thr Glu Glu Lys Ile Lys Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly
1 5 10 15
Lys Glu Lys Glu Gly Lys Ile Ser Lys
20 25
<210> 394
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 394
Gln Leu Gly Leu Lys
1 5
<210> 395
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 395
Lys Gln Leu Gly Leu
1 5
Claims (48)
- 항원 제시 세포(APC)의 클래스 I MHC 또는 클래스 II MHC에 의해 제시되는 에피토프를 포함하고, 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는 폴리펩티드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
Yn-Bt-Ar-Xm-As-Cu-Zp
화학식 (I)
상기 식에서,
(i) Xm은 에피토프이고, 각각의 X는 독립적으로 대상체의 게놈 내 핵산 서열에 의해 코딩되는 인접 아미노산 서열의 아미노산을 나타내고,
(a) MHC는 클래스 I MHC이고 m은 8 내지 12의 정수이거나,
(b) MHC는 클래스 II MHC이고 m은 9 내지 25의 정수이고;
(ii) 각각의 Y는 독립적으로 아미노산, 또는 이의 유사체 또는 유도체이고,
(A) 화학식 (I)에서 Ar의 변수 r이 0인 경우, Yn은 Bt-Ar-Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않거나,
(B) 화학식 (I)에서 Ar의 변수 r이 1이고 화학식 (I)에서 Bt의 변수 t가 0인 경우, Yn은 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않거나,
(C) 화학식 (I)에서 Ar의 변수 r이 1이고 화학식 (I)에서 Bt의 변수 t가 1 이상인 경우, Yn은 Bt를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산에 의해 코딩되지 않고;
추가로 n은 0 내지 1000의 정수이고;
(iii) 각각의 Z는 독립적으로 아미노산, 또는 이의 유사체 또는 유도체이고,
(A) 화학식 (I)에서 As의 변수 s가 0인 경우, Zp는 Xm-As-Cu를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않거나,
(B) 화학식 (I)에서 As의 변수 s가 1이고 화학식 (I)에서 Cu의 변수 u가 0인 경우, Zp는 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되지 않거나,
(C) 화학식 (I)에서 As의 변수 s가 1이고 화학식 (I)에서 Cu의 변수 u가 1 이상인 경우, Zp는 Cu를 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산에 의해 코딩되지 않고;
추가로 p는 0 내지 1000의 정수이고;
추가로
n이 0인 경우, p는 1 내지 1000의 정수이고;
p가 0인 경우, n은 1 내지 1000의 정수이고;
(iv) Ar은 링커이고, r은 0 또는 1이고;
(v) As는 링커이고, s는 0 또는 1이고;
(vi) 각각의 B는 독립적으로 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 대상체의 게놈 내 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산을 나타내고,
t는 0 내지 1000의 정수이고;
(vii) 각각의 C는 독립적으로 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 대상체의 게놈 내 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산을 나타내고,
u는 0 내지 1000의 정수이고;
추가로
(a) 폴리펩티드는 클래스 I MHC에 의해 제시되는 4개의 상이한 에피토프로 이루어지지 않고/않거나;
(b) 폴리펩티드는 적어도 2개의 상이한 폴리펩티드 분자를 포함하고/하거나;
(c) 에피토프는 적어도 하나의 돌연변이 아미노산을 포함하고/하거나;
(d) Yn 및/또는 Zp는 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때 에피토프로부터 절단된다. - 제1항에 있어서, 에피토프가 클래스 II MHC에 의해 제시되고 m이 9 내지 25의 정수인 폴리펩티드.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, Yn-Bt-Ar 및/또는 As-Cu-Zp이 Yn-Bt-Ar 및/또는 As-Cu-Zp를 함유하지 않는 상응하는 펩티드와 비교하여 폴리펩티드의 용해도를 향상시키는 것인 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 APC에 의해 프로세싱될 때, 에피토프가 Yn-Bt-Ar 및/또는 As-Cu-Zp로부터 방출되는 것인 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가, n이 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 절단과 비교하여 더 높은 속도로 절단되고/되거나;
폴리펩티드가, p이 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 절단과 비교하여 더 높은 속도로 절단되는 것인 폴리펩티드. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, APC에 의한 에피토프 제시가, n이 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 에피토프 제시와 비교하여 향상되고/되거나;
APC에 의한 에피토프 제시가, p가 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 에피토프 제시와 비교하여 향상되는 것인 폴리펩티드. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, APC가 에피토프를 면역 세포에 제시하는 것인 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성이, n이 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 면역원성과 비교하여 향상되고/되거나;
면역원성이, p가 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 면역원성과 비교하여 향상되는 것인 폴리펩티드. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항-종양 활성이, n이 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 상류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 항-종양 활성과 비교하여 향상되고/되거나;
항-종양 활성이, p가 1 내지 1000의 정수인 경우, Xm 및 Xm을 코딩하는 대상체의 게놈 내 핵산 서열의 바로 하류에 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함하는 동일한 길이의 상응하는 폴리펩티드의 항-종양 활성과 비교하여 향상되는 것인 폴리펩티드. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, Yn 및/또는 Zp가 리신(Lys), poly-Lys(polyK) 및 poly-Arg(polyR)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
- 제10항에 있어서, polyK가 poly-L-Lys를 포함하는 것인 폴리펩티드.
- 제10항에 있어서, polyR이 poly-L-Arg를 포함하는 것인 폴리펩티드.
- 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, polyK 또는 polyR이 각각 적어도 2, 3 또는 4개의 인접 리신 또는 아르기닌 잔기를 포함하는 것인 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프가 MHC II 클래스 HLA에 결합하는 것인 폴리펩티드.
- 제14항에 있어서, 에피토프가 10분 내지 24시간의 안정성으로 MHC II 클래스 HLA에 결합하는 것인 폴리펩티드.
- 제14항에 있어서, 에피토프가 0.1 nM 내지 2000 nM, 1 nM 내지 1000 nM, 10 nM 내지 500 nM, 또는 1000 nM 미만의 친화도로 MHC II 클래스 HLA에 결합하는 것인 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 대상체에서 APC에 의한 프로세싱 전에 또는 APC에 의한 내재화 전에 절단되지 않는 것인 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 인간 혈장에서 안정한 것인 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 인간 혈장에서 1시간 내지 5일의 반감기를 갖는 것인 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프가 10 μM 미만, 1 μM 미만, 500 nM 미만, 400 nM 미만, 300 nM 미만, 250 nM 미만, 200 nM 미만, 150 nM 미만, 100 nM 미만, 또는 50 nM 미만의 친화도로 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합하는 것인 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프가 24시간 초과, 12시간 초과, 9시간 초과, 6시간 초과, 5시간 초과, 4시간 초과, 3시간 초과, 2시간 초과, 1시간 초과, 45분 초과, 30분 초과, 15분 초과, 또는 10분 초과의 안정성으로 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질에 결합하는 것인 폴리펩티드.
- 제21항 또는 제22항에 있어서, HLA 대립유전자가 HLA-A02:01 대립유전자, HLA-A03:01 대립유전자, HLA-A11:01 대립유전자, HLA-A03:02 대립유전자, HLA-A30:01 대립유전자, HLA-A31:01 대립유전자, HLA-A33:01 대립유전자, HLA-A33:03 대립유전자, HLA-A68:01 대립유전자, HLA-A74:01 대립유전자, 및/또는 HLA-C08:02 대립유전자 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프가 종양 특이적인 에피토프를 포함하는 것인 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프가 적어도 하나의 돌연변이 아미노산을 포함하는 것인 폴리펩티드.
- 제25항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이 아미노산이 대상체의 게놈 내 핵산 서열에서 삽입, 결실, 프레임쉬프트, neoORF, 또는 포인트 돌연변이에 의해 코딩되는 것인 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프가 RAS 에피토프인 폴리펩티드.
- 제27항에 있어서, 에피토프가 G12, G13, 또는 Q61에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 RAS 단백질의 적어도 8개의 인접 아미노산 및 G12, G13, 또는 Q61에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 RAS 펩티드 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
- 제28항에 있어서, G12, G13, 또는 Q61에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 RAS 단백질의 적어도 8개의 인접 아미노산이 G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V, Q61H, Q61L, Q61K, 또는 Q61R 돌연변이를 포함하는 것인 폴리펩티드.
- 제28항 또는 제29항에 있어서, G12, G13, 또는 Q61에서의 돌연변이가 G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V, Q61H, Q61L, Q61K, 또는 Q61R 돌연변이를 포함하는 것인 폴리펩티드.
- 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, RAS 에피토프가 하기의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드:
.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, Yn이 하기의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드:.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, Zp가 하기의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드:.
- 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 하기의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드:
.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프가 RAS 에피토프가 아닌 것인 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 하기가 아닌 것인 폴리펩티드:
.
- 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, Yn 및/또는 Zp가, 에피토프가 유래되는 단백질과 상이한 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, Yn 및/또는 Zp가 pp65, HIV, 또는 MART-1과 같은 CMV의 단백질의 아미노산을 포함하는 것인 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, n이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 20 초과의 정수인 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, p가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 20 초과의 정수인 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
- 제41항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 mRNA인 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 제41항 또는 제42항의 폴리뉴클레오티드; 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
- 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 제43항의 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 그 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 제44항에 있어서, 질환 또는 병태가 폐암, 비-소세포 폐암, 췌장암, 결장직장암, 자궁암, 전립선암, 간암, 담도 악성종양, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 간암, 골수성 백혈병 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암인 방법.
- 제44항 또는 제45항에 있어서, 투여가 피내 주사, 비강내 스프레이 적용, 근육내 주사, 복강내 주사, 정맥내 주사, 경구 투여, 또는 피하 주사를 포함하는 것인 방법.
- 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법으로서, 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 제41항 또는 제42항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항원 제시 세포로 T 세포를 자극하는 단계를 포함하는 방법.
- 제47항에 있어서, 방법이 생체외에서 수행되는 것인 방법.
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