MXPA01003503A - Nuevos metodos terapeuticos de vacunacion. - Google Patents

Abstract

La presente invencion describe un metodo para inducir la inmunidad celular mediada contra antigenos celulares. Mas especificamente, la invencion proporciona un metodo para inducir la inmunidad de linfocitos T citotoxicos contra antigenos debiles, notablemente autoproteinas. El metodo sustituye que las celulas presentan el antigeno sean inducidas para presentar al menos un epitope CTL de un antigeno debil y al mismo tiempo presentan al menos un epitope de linfocito T colaborador extrano. En una modalidad preferida el antigeno es un antigeno especifico de cancer, por ejemplo PSM, Her2, o FGF8b. El metodo puede ser realizado por la utilizacion tradicional de vacunacion de polipeptidos, pero tambien pueden ser utilizadas usando vacunas vivas atenuadas o vacunas de acido nucleico. La invencion ademas proporciona analogos inmunogenicos de PSM, Her2, y FGF8b, tambien como moleculas de acido nucleico que codifican estos analogos. Tambien se describen vectores y celulas transformadas. La invencion tambien proporciona una metodo para la identificacion de analogos inmunogenicos de antigenos debiles o no inmunogenicos.

Description

NUEVOS METODOS TERAPEUTICOS DE VACUNACION CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a nuevos métodos para combatir enfermedades, tal como cánceres, que se caracterizan por la presencia de los productos de expresión génica, asociados con células, que son no inmunogénicos o pobremente inmunogénicos. En particular, la presente invención se refiere a métodos para inducir una respuesta inmunitaria conducida por linfocitos T citotóxicos (CTL) , por lo que las células que tienen epitopes de los productos de expresión génica se atacan y aniquilan por los CTL. La invención también se refiere a un método para preparar antígenos polipeptidicos , modificados, inmunogénicos que se derivan de antigenos débilmente inmunogénicos. La invención se refiere adicionalmente a una serie de aplicaciones de la tecnología de auto-vacunación de los solicitantes (que es el tema de la WO 95/05849) dentro del campo de la vacunación terapéutica contra el cáncer .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La idea de vacunar contra el cáncer ha estado por más de cien años y ha contado con despliegues recurrentes de actividad, particularmente al final de este siglo. REF: 128761 Sin embargo, durante los últimos 10 años, se ha mejorado considerablemente el entendimiento de los mecanismos moleculares fundamentales de la respuesta inmunitaria. Entre los hechos memorables más importantes logrados durante este periodo ha sido el descubrimiento de la lista aún creciente de citocinas y factores de crecimiento, el entendimiento de los mecanismos de interacción entre las células T y B, así como el establecimiento de las rutas de procesamiento de antígenos celulares incluyendo el papel y estructura de las moléculas clase I y clase II de MHC en la presentación del antigeno. También, los descubrimientos importantes con respecto a la inmunología del cáncer, aunque aún no se entienden completamente, fueron el esclarecimiento de los mecanismos fundamentales de la inducción de la tolerancia inmunológica en un hospedador. Toda esta investigación ha conducido a una cantidad enorme de esfuerzos a fin de lograr desarrollar nuevos tratamientos para el cáncer humano. Dependiendo de cómo se adquiera la inmunidad al tumor por el paciente, se pueden categorizar los regímenes de inmunoterapia ya sea como pasivos o activos. En los regímenes pasivos de inmunoterapia, el paciente recibe de forma pasiva los componentes inmunitarios tal como citocinas, anticuerpos, células T citotóxicas o células aniquiladoras activadas por linfocitos (LAK) . En contraste, los protocolos de inmunoterapia, específicos, activos abarcan la inmunidad de tumor inducida activamente mediante la vacunación con la célula de tumor o sus componentes antigénicos. Esta última forma de tratamiento se prefiere debido a que se prolonga la inmunidad. Las vacunas contra el cáncer, pasivas y activas, se han enfocado a la inducción a respuestas inmunitarias ya sea humorales o celulares. Para vacunas activas, está bien establecido que la inducción de células auxiliares T positivas a CD4 es necesaria a fin de inducir de forma secundaria ya sea anticuerpos o células T positivas a CD8, citotóxicas .

Vacunación pasiva con anticuerpos Desde el descubrimiento de la tecnología de anticuerpos monoclonales a la mitad de los años setenta, se han desarrollado un gran número de anticuerpos monoclonales, terapéuticos dirigidos contra los antígenos asociados con el tumor o específicos del tumor. Sin embargo, la terapia de anticuerpos monoclonales da origen a varios problemas serios. - La inyección de estas substancias extrañas induce una respuesta inmunitaria en el paciente hacia los anticuerpos inyectados, que puede conducir a un tratamiento menos eficiente así como a serios defectos laterales alérgicos en los pacientes. - Los anticuerpos monoclonales usualmente se deben administrar en grandes cantidades. Esto es un problema, puesto que son grandes los costos de producción de los anticuerpos monoclonales. - Los anticuerpos monoclonales se deben administrar via la ruta parenteral y debido a las cantidades relativamente grandes necesarias, el paciente se debe hospitalizar de forma frecuente durante el tratamiento . - Las inyecciones de anticuerpos monoclonales se deben repetir a intervalos más bien cortos (semanas) a fin de mantener el efecto terapéutico.

- Los anticuerpos monoclonales usualmente no son capaces de activar los sistemas efectores secundarios del sistema inmunitario tal como el complemento, células NK o macrófagos que aniquilan las células de tumor. Esta última desventaja es de importancia particular en la terapia contra el cáncer y puede ser una razón importante por la que la terapia contra el cáncer con anticuerpos monoclonales, en varios casos, no ha sido particularmente exitosa. Los llamados anticuerpos monoclonales humanizados ahora usados por muchas compañías son menos inmunogénicos, pero desdichadamente aún son menos capaces de activar los sistemas efectores, inmunitarios , secundarios. Adicionalmente, los ejemplos de la consecuencia secundaria de tumores que carezcan del antigeno de tumor original se han observado, puesto que estos anticuerpos no inducen efectos "curiosos, Cándidos" en las células de tumor que no tienen el antígeno de tumor. La pobre capacidad efectora de los anticuerpos monoclonales ha conducido al desarrollo de anticuerpos monoclonales conjugados químicamente a diferentes toxinas y radioisótopos. Pharmacia Upjohn AB ha desarrollado, por ejemplo, un conjugado entre un anticuerpo monoclonal específico de tumor y la toxina A de Staphylococcus aureus con el propósito de activar células T en el tumor. Medarex Inc. ha desarrollado anticuerpos monoclonales biespecífieos que contienen un fragmento Fab específico de tumor, así como un fragmento de anticuerpo específico del receptor Fe con el propósito de activar la aniquilación por macrófagos de las células de tumor. Ambas construcciones son más efectivas que el anticuerpo monoclonal solo, pero también son más costosas e inmunogénicas . También, los anticuerpos conjugados a los radioisótopos son costosos así como inmunogénicos y se observan otros efectos laterales, tóxicos, generales. La aparición de la tecnología de los anticuerpos monoclonales fue un paso mayor hacia lo que permite la producción de moléculas de unión de alta afinidad, bien definidas. Sin embargo, siendo irionoclonales estos anticuerpos sólo reaccionan con un tipo individual de epitope en un antigeno de tumor. Esto es la razón principal por la cual usualmente no son capaces de activar el sistema de complemento o la ; unión a los receptores Fe de las células NK y macrófagos. Estos sistemas efectores muy potentes usualmente | requieren la co-localización de múltiples fragmentos de anticuerpo Fe que sobresalen del antigeno. Por lo tantd, otros investigadores han intentado usar dos anticuerpos rrjonoclonales en combinación y esto ha conducido a un efecto ! mej orado . Por consiguiente, parece muy razonable en cambio atacar las células de tumor con anticuerpos policlonales altamente específicos dirigidos contra un tumor espe'pífico, o contra antigenos (sobre-expresados) asociados al tumor o receptores del factor de crecimiento. Estos anpicuerpos serán capaces completamente de activar los sistemas efectores secundarios mencionados con anterioridad. Adjicionalmente, es probable que la reacción inflamatoria ¡ local inducida por estos sistemas efectores pueda conducir a efectos secundarios en las i células "curiosas, Cándidas" que no expresen el antígeno de tumor en cuestión, ' así como la activación de TIL (linfocitos de infiltración al tumor) específicos del tumor en el tejido de tumor. Estos efectos se han observado por Medarex Inc. usando sus conjugados de anticuerpos monoclonales , biespecificos . Desde el descubrimiento de la tecnología de anticuerpos monoclonales, no se ha explotado mucho el uso potencial de anticuerpos policlonales para la terapia contra el cáncer (excepto por los antígenos descritos posteriormente) . Una razón principal es que los antígenos de superficie asociados con el tumor o específicos del tumor, bien definidos, sólo se han caracterizado dentro de los años recientes, pero, de manera más importante, muchos de éstos se han rechazado para ser autoantígenos y por lo tanto no inmunogénicos . Por consiguiente, los anticuerpos policlonales xenogénicos necesariamente se habrían usado para estudiar los efectos. Sin embargo, nuestros anticuerpos inducen una respuesta inmunitaria vigorosa hacia los anticuerpos policlonales extraños, inyectados que eliminan rápidamente los efectos terapéuticos.

Vacunación activa para inducir anticuerpos Han sido exitosos los intentos recientes para inducir auto-anticuerpos policlonales terapéuticos en los pacientes con cáncer mediante la vacunación activa. Las vacunas contra los autoantígenos de carbohidrato unidos a la membrana (tal como los antígenos Tn y sTn expresados de forma anormal, O-enlazados y los liposacáridos GM2 y GD3 de gangliósido) se han desarrollado. Estas pequeñas estructuras de carbohidratos, sin embargo, son antigenos muy pobres, de modo que se deben usar conjugados de esta moléculas con moléculas portadoras tal como hemocianina de lapa (KLH) o mucinas de oveja (que contienen Tn y sTn) . En los pacientes con melanoma, la inducción de anticuerpos anti-GM2 se asoció con un intervalo prolongado libre de enfermedad y una supervivencia completa después de un seguimiento mínimo de cincuenta y un meses. También, los estudios de fase II aleatorizados se han llevado a cabo en pacientes con cáncer de mama usando un conjugado de sTn y KLH en el adyuvante DETOX-B (BIOMIRA Inc.) que muestran que los pacientes inmunitarios de sTn tienen una supervivencia media significativamente más prolongada en comparación a los controles. Otro ejemplo de la inducción activa de anticuerpos policlonales en el cáncer es el uso de la vacunación específica de idiotipo contra linfomas de células B, que, aunque ha sido prometedor, limita a este tipo de cáncer únicamente. Finalmente, la compañía norteamericana Aphton Inc. ha desarrollado vacunas de conjugado, activas contra la hormona de liberación de gonadotropina (GnRH) y gastrina. Se ha demostrado, que esta vacuna es capaz de controlar la actividad biológica de estas hormonas, que también puede funcionar como factores de crecimiento autócrinos para ciertas células de tumor. Los ensayos clínicos de fase II exitosos se han llevado a cabo en pacientes con cáncer gastrointestinal y están en caminos los ensayos clínicos de la fase III.

Células T citotóxicas Claramente, se ha demostrado por varios grupos que las células T citotóxicas, específicas de tumor (CTL) están presentes en muchos tumores. Estas CTL se llaman linfocitos de infiltración al tumor (TIL) . Sin embargo, estas células se vuelven en cierta forma no sensibles o anérgicas por varios mecanismos posibles, diferentes que incluyen la secreción de citocinas inmunosupresoras por las células de tumor, carencia de señales co-estimuladoras, regulación descendente de las moléculas de la clase I de MHC, etc. Ha habido muchos intentos para aislar los péptidos unidos de la clase I de HLA, específicos de tumor, reconocidos por los TIL, y en algunos casos también han sido exitosos (por ejemplo, péptidos de los antígenos asociados con melanoma) . Estos péptidos se han usado para inducir una respuesta inmunitaria específica del tumor en el hospedador, pero el uso práctico de los péptidos específicos del tumor en vacunas se restringe a un segmento limitado de la población debido a la especificidad estrecha de unión de la clase I de HLA de los péptidos. Adicionalmente, usualmente es relativamente difícil provocar una respuesta de CTL in vivo usando péptidos sintéticos debido a la baja vida media biológica de estas substancias así como a las dificultades con la cebadura exogena de las moléculas de la clase I de MHC. Se han intentado muchos otros planteamientos a fin de provocar una respuesta de CTL específica de tumor incluyendo el uso de citocinas (por ejemplo, IL-2, IFN-?, IL-6, IL-4, IL-10 ó GM-CSF) o moléculas co-estimuladoras (B7) ya sea en forma soluble o expresadas por la célula de tumor transfectada . Adicionalmente, las inmunizaciones con células completas halogenéicas o autólogas, o de antígenos de tumor preparados en adyuvantes especializados, diseñados para presentar el antígeno vía la ruta de presentación de antígeno clase I de MHC, o antígenos de tumor expresados en por ejemplo vectores de vaccinia, etc., se han usado con éxito variable. Aún la creencia en general entre los inmunologos de tumor por lo tanto es que una de las mejores maneras para eliminar los tumores sería inducir una fuerte respuesta de CTL anti-tumor, específica. Aparte del hecho que estos tratamientos usualmente son muy costosos y difíciles de reproducir, también ha resultado difícil obtener una buena respuesta inmunitaria hacia el tumor puesto que muchos de los antigenos asociados con el tumor son verdaderas auto-proteínas a las cuales la mayoría de las células T parecen ser tolerantes. Por lo tanto, parece ser necesario inducir una condición auto-inmunitaria, celular, controlada en el paciente .

OBJETO DE LA INVENCIÓN Es un objeto de la presente invención proporcionar métodos mejorados y agentes para inducir respuestas inmunitarias en organismos hospedadores contra antígenos indeseables, por ejemplo, antígenos de tumor. Adicionalmente, es un objeto proporcionar un método para preparar análogos de polipéptido de estos antígenos indeseables, análogos que son capaces de inducir una respuesta inmunitaria efectiva contra el antígeno indeseado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Dogmáticamente, la presentación de antígenos, se ha mirado como dos rutas discretas, una ruta exógena clase II y una ruta endógena clase I. De manera breve, una proteína extraña del exterior de la célula o de la membrana celular se toma por la APC como una endosoma que se fusiona con un compartimiento intracelular que contiene enzimas proteoliticas y moléculas clase II de MHC. Algunos de los péptidos producidos se unen a la clase II que luego se desplazan a la membrana celular. La ruta endógena clase I se caracteriza por la presentación predominante de proteínas citosólicas. Esto se cree que se presenta por la escisión mediada por proteasoma seguida por el transporte de los péptidos hacia el retículo endoplasmático (ER) vía las moléculas TAP localizadas en la membrana del ER. En el ER los péptidos se unen a la clase I seguido por el transporte a la membrana plasmática. Sin embargo, estas 2 rutas no son completamente distintas. Sin embargo, se sabe que las células dendríticas y a algún grado, los macrófagos son capaces de la endocitosis (pinocitosis ) de proteínas extracelulares y las presentan subsecuentemente en el contexto de la clase I de MHC. También se ha demostrado previamente que el uso de rutas de administración especializadas, por ejemplo, por el acoplamiento a cuentas de óxido de · hierro, los antígenos exógenos son capaces de entrar a la ruta de la clase I (Rock, 1996) . Este mecanismo parece ser central, debido a la importancia de una expresión concomitante tanto de la clase I como de la clase II en las mismas APC para producir una agrupación del tipo de tres células. Esta agrupación del tipo de tres células de interacción se ha propuesto por Mitchison (1987) y posteriormente por otros autores. Éstos mostraron la importancia de la presentación concomitante de los epitopes de la clase I y la clase II en las mismas APC. De acuerdo a los mecanismos recientemente descritos para la activación de CTL (comparar, Lanzavecchia, 1998, Nature 393: 413, Matzinger, 1999, Nature Med. 5: 616, Ridge et al., 1998, Nature 393: 474, Bennett et al., 1998, Nature 393: 478, Schoenberger et al., 1998, Nature 393: 480, Ossendrop et al., 1998, J. Exp. Med 187: 693, y Mackey et al., 1998, J. Immunol 161: 2094), de las APC profesionales que presentan el antigeno en la clase II de MHC se reconocen por las células auxiliares T. Esto da por resultado una activación de las APC (mediada por la interacción de CD40L en la célula auxiliar T y de CD40 en las APC) . Esto permite que las APC estimulen directamente las CTL que se activan de este modo. Comparar, también Figura 2. Se ha demostrado, previamente que la inserción de un epitope extraño de célula auxiliar T, restringido a la clase II de MHC, en un auto-antigeno da por resultado la provisión de un antigeno capaz de inducir fuertes respuestas de anticuerpos de reactividad cruzada, dirigidas contra el auto-antigeno no modificado (comparar, la WO 95/05849 del solicitante) . Se mostró que la inducción de auto-anticuerpos se provoca por la ayuda de células T específicas inducida por el epítope extraño insertado. Sin embargo, se ha llegado a la conclusión que los autoantígenos modificados, con la ayuda de adyuvantes apropiados, deben ser capaces también de inducir fuertes respuestas de CTL contra los autoepítopes restringidos de la clase I de MHC y por lo tanto, la tecnología descrita en WO 95/05849 se puede adaptar también para proporcionar vacunación contra los antígenos intracelulares y otros asociados a células que tienen epítopes presentados en el contexto de la clase I de MHC. La tecnología de autovacunación descrita en la WO 95/05849 tiene el efecto que se proporciona ayuda de células T específicas a las células B autorreactivas cuando se administra un autoantígeno modificado para la captación en la ruta de procesamiento de antígenos clase II de MHC (comparar Figura 1, y Dalum I et al., 1996, J. Immunol. 157: 4796-4804 así como Dalum I et al., 1999, Nature Biotechnol. 17: 666-669). Se mostró que los linfocitos B potencialmente autorreactivos que reconocen a las autoproteínas están presentes de forma fisiológica en individuos normales. Sin embargo, a fin de que estos linfocitos B se induzcan para producir realmente anticuerpos reactivos con las autoproteínas pertinentes, se necesita ayuda de citocinas que produzcan linfocitos auxiliares T (células TH o linfocitos TH) . Normalmente esta ayuda no se proporciona debido a que los linfocitos T en general no reconocen a los epitopes de células T derivados de las autoproteinas cuando se presentan por las células que presentan el antigeno (APC) . Sin embargo, al proporcionar un elemento de "carácter extraño" en una auto-proteína (es decir, al introducir una modificación inmunológicamente significativa), las células T que reconocen el elemento extraño se activan en el reconocimiento del epítope extraño en una APC (tal como, inicialmente, una célula mononuclear) . Los linfocitos B policlonales (que presentan los epitopes de células T) capaces de reconocer los auto-epítopes en la auto-proteína modificada también incorporan el antígeno y presentan subsecuentemente el (los) epítope (s) de células T extrañas de los mismos, y los linfocitos T activados proporcionan subsecuentemente ayuda de citocinas a estos linfocitos B policlonales auto-reactivos. Puesto que los anticuerpos producidos por estos linfocitos B policlonales son reactivos con diferentes epitopes en el polipéptido modificado, incluyendo aquellos que también están presentes en el polipéptido nativo, un anticuerpo reactivo de forma cruzada con la auto-proteína no modificada se induce. En conclusión, los linfocitos T se puede hacer que actúen como si la población de linfocitos B policlonales hayan reconocido un antígeno completamente extraño, en tanto que en realidad sólo el (los) epítope(s) insertado(s) es (son) extraño (s) al hospedador. De manera, los anticuerpos capaces de la reacción cruzada con los auto-antigenos no modificados, se inducen. Como se menciona anteriormente, las CTL también requieren ayuda de células T especificas, aunque aun no es claro el mecanismo para esto. La presente invención se basa en la nueva teoría que las auto-proteínas que contienen epítopes clase II de MHC, extraños, después de la captación exógena, pueden obtener acceso en la ruta de presentación del antígeno clase I de MHC de por ejemplo, macrófagos y células dendríticas. De esta manera, se podría inducir una fuerte respuesta de CTL contra epítopes de sub-dominio en la auto-proteína. De manera alternativa, se pueden administrar genes que codifican para antígenos modificados de tumor, como vacunas de ácido nucleico que también conduzcan eventualmente a respuestas inmunitarias mediadas por la clase II de MHC así como de la clase I de MHC. Las células de tumor son células que presentan muy pobremente el antígeno debido a la expresión insuficiente de la clase I de MHC, la carencia de moléculas co-estimuladoras o secreción de citocinas inmunosupresoras, etc. Usando las construcciones de auto-vacuna y el protocolo de vacunación mencionado con anterioridad, el antígeno modificado de tumor se podría presentar por la clase I de MHC así como por las moléculas de la clase II de MHC en células profesionales que presenten el antígeno. La co-presentación de auto-epítopes subdominantes en la clase I de MHC y epítopes extraños inmunodominantes en las moléculas de la clase II de MHC mediarán una ayuda directa de citocinas de las células auxiliares T restringidas de la clase II de MHC, activadas a las CTL restringidas de la clase I de MHC (Figura 2) . Esto conducirá, en nuestra opinión, a una suspensión específica de la auto-tolerancia de células T hacia el antígeno de tumor y esto exactamente es lo que se desea en la inmunoterapia del cáncer. En conclusión, una vacuna construida usando la tecnología resumida anteriormente inducirá una respuesta de auto-anticuerpos, humoral con activación secundaria de la actividad de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y del complemento. También se espera que esto inducirá una respuesta de células citotóxicas dirigida contra por ejemplo un antígeno de membrana específico de tumor. Por lo tanto, en el alcance más amplio y más general, la presente invención se refiere a un método para inducir una respuesta inmunitaria contra un antígeno de polipéptido en un animal, incluyendo un ser humano, el antígeno polipeptídico que es débilmente inmunogénico o no inmunogénico en el animal, el método comprende efectuar la presentación simultánea por células que presentan el antigeno (APC) desde el sistema inmunitario del animal de una cantidad inmunológicamente efectiva de: 1) al menos un epitope de CTL derivado del antigeno de polipéptido y/o al menos un epitope de células B derivado del antigeno polipeptidico asociado con la célula, y 2) al menos un primer epitope de células auxiliares T (epitope TH) que es extraño al animal. En una variante más especifica del método inventivo, la invención se refiere a un método para regular descendentemente un antigeno polipeptidico asociado con la célula, en un animal, incluyendo un ser humano, el antigeno polipeptidico que es débilmente inmunogénico o no inmunogénico en el animal, al inducir una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) , especifica, contra células que tienen el antigeno polipeptidico asociado a la célula en su superficie o que hospedan el antigeno polipeptidico asociado a la célula en su compartimiento intracelular, el método comprende efectuar, en el animal, la presentación simultánea por una célula adecuada que presenta el antigeno (APC) de 1) al menos un epitope de CTL derivado del antigeno polipeptidico asociado con la célula; y 2) al menos un primer epitope de linfocito auxiliar T (TH) que es extraño al animal. También, la nueva estrategia para preparar un agente inmunogénico es parte de la invención. Esta nueva estrategia abarca la selección y producción de análogos de antigenos débiles asociados con la célula, donde se tiene como mira la conservación de una fracción substancial de los epitopes de CTL conocidos y previstos, mientras que al mismo tiempo se introduce al menos un epitope TH extraño. Adicionalmente, la invención se refiere a ciertas construcciones inmunogénicas especificas basadas en los antigenos conocidos asociados al tumor, así como a composiciones que contienen estas construcciones. Finalmente, la invención se refiere a fragmentos de ácido nucleico, vectores, células transformadas y otras herramientas útiles en los métodos de biología molecular para la producción de los análogos de los antígenos asociados al tumor.

LEYENDAS DE LAS FIGURAS Figura 1: El concepto tradicional de autovacunación . A: auto-epítopes tolerodominantes presentados en la clase II de MHC en una célula que presenta el antígeno (APC) se ignoran debido al agotamiento en el repertorio de células auxiliares T (Th) (célula auxiliar T indicada con lineas punteadas) . Los epitopes extraños, insertados de células T, inmunodominantes presentados en la clase II de MHC activan las células auxiliares T y células B (B) especificas para partes nativas de la auto-proteina que presenta los epitopes de células T, inmunodominantes, extraños en la clase II de MHC se activan por la ayuda de citocinas proporcionada por la célula auxiliar T. Figura 2 : El concepto de auto-vacunación para inducir una respuesta de CTL. Los epitopes de células T, inmunodominantes, extraños, insertados presentados en la clase II de MHC activan células auxiliares T. Los auto-epitopes sub-dominantes que reconocen la CTL, presentados en la clase I de MHC se activan por la célula auxiliar T activada, adyacente Figura 3: Una representación esquemática del polipéptido Her2 con indicaciones de regiones epitópicas y sitios de N-glicosilación . Los 4 dominios extracelulares , el dominio de transmembrana (TM) y los 2 dominios intracelulares se representan con indicaciones de sitios que con grados variables de homología y sitios que contienen epitopes de CTL putativos/determinados. Figura 4: Una representación esquemática del polipéptido PSM humano con indicaciones de las regiones de inserción para los epitopes P2 y P30. .afinar Figura 5: Los genes y proteínas FGF. A: Estructura exón-intrón de los genes FGF8 humanos y de ratón. Posteriormente se ilustran las ocho diferentes formas de unión exón-intrón (de Gemel 1996) . B: Secuencia de aminoácidos de las diferentes isoformas FGF8. Los alargamientos polipeptídicos únicos a FGF8, FGF8 f y FGF8e se indican por caracteres en negritas e itálicas o subrayados. FGF8a es la variante más corta que no contiene ninguna de estas secuencias resaltadas. El péptido de señal se espera que se escinda C-terminalmente a Ala22. Los dos residuos de cisteína encontrados en FGF8 maduro (todas las isoformas) se indican por un subrayado grueso. Los dos sitios de N-glicosilación potenciales de FGF8b se indican por Ñ. La numeración está de acuerdo con FGF8b. Figura 6: Ilustraciones de cuatro variantes diferentes de FGF8b designadas para la auto-vacunación. Panel superior: modelos teóricos de los puntos de inserción de los epítopes usando la estructura cristalina de FGF2 como plantilla. Panel inferior: Secuencias de aminoácidos de FGF8b tipo silvestre (WT) y las cuatro variantes F30N, F2I, F30I y F2C. El péptido de señal se marca con subrayado individual. Los péptidos insertados se marcan con subrayado doble. La secuencia N-terminal (MetAla) de todas las variantes es debida a la generación de una secuencia Kozak (Kozak 1991) para mejor traducción en sistemas eucarióticos .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones En lo siguiente, se definirán varios términos usados en la presente especificación y reivindicaciones, y se explicarán en detalle a fin de poner en claro las asignaciones y delimitaciones de la invención. Un "antigeno polipeptidico asociado a las células" es en la siguiente especificación y reivindicaciones, propuesto para denotar un polipéptido que se confina a una célula que está algo relacionada a un proceso patológico. Adicionalmente, la célula presenta epítopes de CTL del antigeno polipeptidico unido a las moléculas de la clase I de MHC en su superficie. Por lo tanto, los antigenos polipeptídicos asociados a la célula pueden ser verdaderamente antigenos intracelulares (y de este modo no alcanzables para una respuesta inmunitaria humoral) o antigenos unidos a la superficie de las células. El antigeno asociado a la célula puede ser el producto de la expresión génica propia de la célula, de un parásito intracelular, de un virus, o de otra célula. En este último caso, el antigeno polipeptidico o de polipéptido se asocia subsecuentemente con la célula que está comprendida en el proceso patológico.

Los términos "linfocito T" y "célula T" se usaran de forma indistinta para linfocitos de origen químico que son responsables de varias respuestas inmunitarias mediadas por célula así como por funciones efectoras tal como actividad auxiliar en la respuesta inmunitaria humoral. Igualmente, los términos "linfocito B" y "célula B" se usará de forma intercambiable para linfocitos que produzcan anticuerpos. Una "célula que presenta el antígeno" (APC) , es una célula que presenta epítopes a células T. Las células típicas que presentan el antígeno son macrófagos, células dendríticas y otras células de fagocitosis y pinocitosis. Se debe señalar que las células B también funcionan como APC al presentar epítopes TH unidos a las moléculas de la clase II de CH a células TH pero cuando se usa en general el término APC en la presente especificación y en las reivindicaciones, se propone que se refiera a las células de fagocitosis y pinocitosis, mencionadas con anterioridad. Los "linfocitos T auxiliares" o "células TH" denotan células T positivas a CD4 que proporcionan ayuda a células B y células T citotóxicas vía el reconocimiento de los epítopes TH unidos a las moléculas de la clase II de MHC en las células que presentan el antígeno. El término "linfocito T citotóxico" (CTL) se usará para células T positivas a CD8 que requieren la asistencia de células TH a fin de llegar a ser activadas. Una respuesta inmunitaria "especifica" es en el presente contexto, propuesta para denotar una respuesta inmunitaria policlonal dirigida predominantemente contra una molécula o un grupo de moléculas cuasi-idénticas o, de manera alternativa, contra moléculas que presenten epitopes de CTL de la molécula o el grupo de moléculas cuasi-idénticas . Un "antigeno polipeptidico débil o no inmunogénico" se propone en la presente para denotar polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de los antigenos de proteína, asociados a la célula, débiles, derivados del animal en cuestión (por ejemplo, en humanos) , pero se abarcan por el término también polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos idéntica a los análogos de estas proteínas, aislados de otras especies. También, se incluyen dentro de los límites del término de las formas de los polipéptidos que tienen diferentes patrones de glicosilación debido a su producción en sistemas heterólogos (por ejemplo, levaduras u otros sistemas de expresión eucarióticos, no de mamífero, aun sistemas procarióticos) . Sin embargo, se debe señalar que cuando se usa el término, se propone que el polipéptido en cuestión sea normalmente no inmunogénico o sólo débilmente inmunogénico en su ubicación natural en el animal que se va El término "polipéptido" en el presente contexto se propone para querer decir tanto polipéptidos cortos de 2 a 10 residuos de aminoácidos, oligopéptidos de 11 a 100 residuos de aminoácido, y polipéptidos de más de 100 residuos de aminoácido. Adicionalmente, el término también se propone para incluir proteínas, es decir, biomoléculas funcionales que comprenden al menos un polipéptido; cuando comprenden al menos dos polipéptidos, éstos pueden formar complejos, se enlazan covalentemente, o pueden ser enlazados de forma no covalente. El (los) polipéptido (s) en una proteína se puede glicosilar y/o tratar con lípidos y/o comprender grupos prostéticos. El término "secuencia" significa cualquier alargamiento consecutivo de al menos 3 aminoácido o, cuando sea pertinente, de al menos 3 nucleótidos, derivados directamente de una secuencia de aminoácidos que se presente de forma natural o una secuencia de ácido nucleico, respectivamente. El término "animal" en el presente contexto se propone en general para denotar una especie de animal (de manera preferente, un mamífero) , tal como Homo sapiens, Canis domesticus, etc. y no sólo como un animal individual. Sin embargo, el término también denota una población de esa especie de animal, puesto que es importante que los individuos inmunizados de acuerdo al método de la invención tengan todas substancialmente el mismo antigeno polipeptidico, débil, asociado con la célula, permitiendo la inmunización de animales con el mismo(s) antigeno(s). Por ejemplo, si las variantes génicas de los polipéptidos existen en diferentes poblaciones humanas, puede ser necesario usar diferentes inmunógenos en estas diferentes poblaciones, a fin de ser capaces de suspender la autotolerancia hacia el antigeno polipeptidico débil asociado con la célula, en cada población. Por el término "regulación descendente de un antigeno polipeptidico asociado a la célula" se quiere decir en la presente la reducción en el organismo vivo de la cantidad y/o actividad del antigeno en cuestión. La regulación descendente se puede obtener por medio de varios mecanismos: de estos, la interferencia simple con el sitio activo en el antigeno por la unión del anticuerpo es la más simple. Sin embargo, también está dentro del alcance de la presente invención que la unión del anticuerpo dé por resultado la remoción del polipéptido por las células eliminadoras (tal como macrófagos y otras células de fagocitosis) , y de manera más importante, que las células que tienen o que hospedan el antigeno se aniquilen por las CTL en el animal. La expresión "que efectúa la presentación simultánea por una APC adecuada" se propone que denote que el sistema inmunitario del animal se someta a una estimulación inmunogénica de una manera controlada que dé por resultado la presentación simultánea por las APC de los epitopes en cuestión. Como será evidente de la descripción siguiente, esta estimulación del sistema inmunitario se puede efectuar de varias maneras de las cuales las más importantes son la vacunación con "farmacinas" ¦ que contienen el polipéptido (es decir, una vacuna que se administra para tratar o mejorar la enfermedad corriente) o la vacunación de "farmacina" de ácido nucleico. El resultado importante para lograr es que las células inmunitarias competentes en el animal se confronten con las APC que exhiben los epitopes pertinentes de una manera inmunológicamente efectiva. El término "cantidad inmunológicamente efectiva" tiene su significado usual en la técnica, es decir, una cantidad de un inmunógeno que sea capaz de inducir una respuesta inmunitaria que se acople de manera significativa con los agentes patogénicos que comparten características inmunológicas con el inmunógeno. Cuando se usa la expresión que los antígenos polipeptídicos débiles asociados con la célula se han sometido a una "modificación" se quiere decir en la presente una modificación química del polipéptido que constituye la estructura del polipéptido en cuestión. Esta modificación puede ser por ejemplo derivatización (por ejemplo, alquilación) de ciertos residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácidos, pero como se apreciará de la descripción posterior, las modificaciones preferidas comprenden cambios de la estructura primaria de la secuencia de aminoácidos. Cuando se discute la "tolerancia" y "auto-tolerancia" se entiende que puesto que los polipéptidos que son los objetos del presente método inventivo son auto-proteínas en la población que se va a vacunar o proteínas que no dan por resultado la inducción de una respuesta inmunitaria efectiva, los individuos normales en la población no montan una respuesta inmunitaria contra el polipéptido. No se puede excluir, sin embargo, qué individuos ocasionales en una población de animales pudieran ser capaces de producir anticuerpos contra el antígeno polipeptídico nativo, por ejemplo, como parte de un desorden auto-inmunitario . A cualquier proporción, un animal normalmente será solo auto-tolerante hacia su propio antígeno polipeptídico, pero no se puede excluir que los análogos derivados de otras especies de animales o de una población que tiene un diferente fenotipo también se tolerarán por el animal. Un "epítope de célula T, extraño" es un péptido que es capaz de unirse a una molécula de MHC y estimula las células T en una especie de animal. Los epitopes extraños preferidos son epitopes "promiscuos", es decir, epitopes que se unan a una fracción substancial de las moléculas de la clase II de MHC en una especie o población de animales. Solo, se conocen un número muy limitados de epitopes promiscuos de células T, y se analizarán en detalle posteriormente. Se debe señalar que a fin de que los inmunógenos que se usan de acuerdo con la presente invención sean efectivos en una fracción de la población animal tan grande como sea posible, puede ser necesario 1) insertar varios epitopes extraños de célula T en el mismo análogo o 2) preparar varios análogos en donde cada análogo tiene un diferente epitope promiscuo insertado. Se debe señalar que el concepto de epitopes extraños de células T también abarca el uso de epitopes críticos de células T, es decir, epitopes que se derivan de una auto-proteina y que solo ejercen comportamiento inmunogénico cuando existen en forma aislada sin que sean parte de la auto-proteína en cuestión. Un "epitope extraño de linfocito auxiliar T" (un epitope TH extraño) es un epitope extraño de célula T que se une a la molécula de la clase II de MHC y se puede presentar en la superficie de una célula que presenta el antígeno (APC) unido a la molécula de la clase II de MHC.

Un epítope de "CTL" es un péptido que es capaz de unirse a una molécula de la clase I de MHC. Una "parte funcional" de una (bio) molécula se propone, en el presente contexto, que signifique la parte de la molécula que es responsable por al menos uno de los efectos bioquímicos o fisiológicos ejercidos por la molécula. Es bien conocido en la técnica que muchas enzimas y otras moléculas efectoras tengan un sitio activo que sea responsable de los efectos ejercidos por la molécula en cuestión. Otras partes de la molécula pueden servir para el propósito de mejorar la solubilidad o estabilización y por lo tanto se pueden dejar si estos propósitos no son de pertinencia en el contexto de una cierta modalidad de la presente invención. Por ejemplo, es posible usar ciertas citocinas como una porción de modificación en el análogo (comparar, el análisis detallado posterior, y en este caso, puede ser irrelevante la cuestión de estabilidad puesto que el acoplamiento del análogo proporciona la estabilidad necesaria . El término "adyuvante" tiene su significado usual en la técnica de la tecnología de vacunación, es decir, una sustancia o una composición de materia que 1) no sea por sí misma capaz de montar una respuesta inmunitaria específica contra el inmunógeno de la vacuna, pero que 2) sea capaz, sin embargo, de mejorar la respuesta inmunitaria contra el inmunógeno . O, en otras palabras, la vacunación con el adyuvante no proporcione sólo una respuesta inmunitaria contra el inmunógeno, la vacunación con el inmunógeno puede ocasionar, o no, una respuesta inmunitaria contra el inmunógeno, pero la vacunación combinada del inmunógeno y el adyuvante induce una respuesta inmunitaria contra el inmunógeno que es más fuerte que la inducida por el inmunógeno solo. "Dirección hacia el objetivo" de una molécula se propone, en el presente contexto para denotar la situación donde una molécula en la introducción en el animal aparecerá de manera preferente en ciertos tejidos o se asociará de manera preferente con ciertas células o tipos de células. El efecto se puede lograr de varias maneras incluyendo formulación de la molécula en una composición que facilite la dirección al objetivo o por la introducción en la molécula de grupos que faciliten la dirección al objetivo. Estos tejidos se analizarán en detalle de manera posterior. La "estimulación del sistema inmunitario" significa que una sustancia o composición de materia exhibe un efecto inmunoestimulador general, no especifico. Varios adyuvantes y adyuvantes putativos (tal como ciertas citocinas) comparten la capacidad para estimular el sistema inmunitario. El resultado de usar un agente inmunoestimulante es un "estado de alerta" incrementado del sistema inmunitario queriendo decir que la inmunización simultánea o subsecuente con un inmunógeno induce una respuesta inmunitaria signific itivamente más efectiva en comparación al uso aislado del nmunógeno .

Modalidades Preferidas A fin de inducir una respuesta de CTL contra una célula que presente epitopes derivados del antigeno polipeptidico en su superficie, normalmente es necesario que al menos un epitope de CTL, cuando se presente, se asocie con una molécula de la clase I de MHC en la superficie de la APC. Adicionalmente, se prefiere que al menos un primer epitope TH extraño, cuando se presente, se asocie con una molécula de la clase II de MHC en la superficie de la APC. Las APC preferidas que presentan los epitopes son células dendriticas y macrófagos, pero cualquier APC de pino- o fagocitosis que sea capaz de presentar simultáneamente 1) epitopes de CTL unidos a las moléculas de la clase I de MHC y 2) epitopes TH unidos a las moléculas de la clase II de MHC, es una APC preferida de acuerdo con la invención. De acuerdo con la invención, el antigeno polipeptidico asociado a la célula se selecciona de manera preferente de un antigeno asociado al tumor y otras auto-proteínas que se relacionan a procesos patológicos pero también antígenos virales y antígenos derivados de un parásito intracelular o bacteria. Es bien conocido en la técnica que estos antígenos asociados a los patógenos frecuentemente son inmunógenos relativamente pobres (por ejemplo, antígenos de micobacterias tal como Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae, pero también de protozoarios tal como Plasmodium spp.) . Se cree que el método de la invención, aparte de hacer posible la producción del anticuerpo y respuestas de CTL contra verdaderos antígenos de auto-proteína, es capaz de mejorar la respuesta inmunitaria frecuentemente insuficiente montada por el organismo contra estos antígenos intracelulares . Normalmente, será ventajoso confrontar el sistema inmunitario con una gran fracción de las secuencias de aminoácidos del antígeno polipeptídico que es el objetivo de la vacuna. Por lo tanto, en una modalidad preferida, la presentación por la APC del epítop de CTL y el primer epítope TH extraño se efectúa al presentar el sistema inmunitario del animal con al menos un primer análogo del antígeno polipeptídico asociado a la célula, el primer análogo que comprende una variación de la secuencia de aminoácidos del antígeno polipeptídico asociado a la célula, esta variación que contiene al menos el epitope de CTL y el primer epitope TH extraño. Esto es en contraste a por ejemplo, una estrategia de vacunación de ADN donde los epitopes de CTL y TH se expresan por la misma célula, pero como partes de polipéptidos separados; esta estrategia de vacunación de ADN también es una modalidad de la invención, pero se cree que tiene los dos epitopes como parte del mismo polipéptido que normalmente mejorará la respuesta inmunitaria, a cualquier proporción, y la provisión de solo un producto de expresión será necesaria. A fin de aumentar al máximo las oportunidades de montar una respuesta inmunitaria efectiva, se prefiere que el primer análogo mencionado con anterioridad contenga una fracción substancial de epitopes de CTL conocidos y previstos del antigeno polipeptidico asociado a la célula, es decir, una fracción de los epitopes de CTL conocidos y previstos que se une a fracciones suficientes de las moléculas de la clase I de MHC en una población. Por ejemplo, se prefiere que la fracción substancial de los epitopes de CTL conocidos y previstos en la secuencia de aminoácidos de los análogos se reconocen por al menos 50% de los haplotipos de MHC-I que reconocen todos los epitopes de CTL conocidos y previstos en el antigeno polipeptidico asociado a la célula, pero se prefieren porcentajes mayores, tal como al menos 60, al menos 70, al menos 80 y al menos 90%. Especialmente preferido es el uso de análogos que conservan substancialmente todos los epitopes de CTL conocidos del antigeno polipeptidico asociado a la célula que están presentes en el análogo, es decir, cercano al 100% de los epitopes de CTL, conocidos. Por consiguiente, también es especialmente preferido que substancialmente todos los epitopes de CTL previstos del antigeno polipeptidico asociado a la célula estén presentes en al menos el primer análogo. Los métodos para predecir la presencia de epitopes de CTL son bien conocidos en la técnica, comparar, por ejemplo, Rothbard et al. EMBO J. 7:93-100 (1988). Como será evidente de la presente especificación y las reivindicaciones, se espera que el método inventivo descrito en la presente hará posible la inducción efectiva de respuestas de CTL contra antigenos polipeptidicos asociados a la célula. En los casos donde el antigeno polipeptidico asociado a la célula sea verdaderamente intracelular, la inducción de una respuesta de CTL contra las células que hospedan el antigeno es la única manera para lograr su regulación descendente por medios inmunológicos específicos. Sin embargo, en el caso de los antígenos polipeptidicos asociados a la membrana, es ventajoso inducir una respuesta de anticuerpos contra el antígeno polipeptidico, débil asociado a la célula. Sin embargo, cuando se formula una respuesta inmunitaria humoral contra un antigeno débil asociado a la célula, se prefiere restringir substancialmente la respuesta de anticuerpos a la interacción con las partes del antigeno, que normalmente se exponen a las posibles interacciones con los anticuerpos. De otro modo, el resultado probablemente sería la inducción de una respuesta de anticuerpo contra partes del antígeno que normalmente no están acoplando el sistema inmunitario humoral, y esto a su vez incrementará el riesgo de inducir reactividad cruzada con los antígenos no relacionados a alguna patología. Una manera elegante de obtener esta restricción es realizar la vacunación de ácido nucleico con un análogo del antígeno débil asociado a las células, donde la parte extracelular del mismo ya sea no se altera o incluye un epítope TH que no altera substancialmente la estructura 3D de la parte extracelular del antígeno. Como una alternativa posible, se puede realizar la inmunización tanto con un inmunógeno dirigido de CTL y un inmunógeno dirigido por células B donde el inmunógeno dirigido por células B es substancialmente incapaz de efectuar la inmunización contra la parte intracelular del antígeno objetivo (el inmunógeno dirigido por células B podría carecer, por ejemplo, de cualquier material no extracelular del antígeno) .

La inducción de las respuestas de anticuerpos se puede lograr de varias maneras conocidas por las personas expertas en la técnica. Por ejemplo, al menos un primer análogo puede comprender una parte que consiste de una modificación de la estructura del antigeno polipeptídico asociado a la célula, esta modificación que tiene como resultado que la inmunización del animal con el primer análogo induce la producción de anticuerpos en el animal contra el antígeno polipeptídico asociado a la célula, esta variante es como se menciona anteriormente especialmente adecuada para la vacunación de ácido nucleico. De manera alternativa, el método de la invención puede comprender el efectuar la presentación al sistema inmunitario del animal de una cantidad inmunológicamente efectiva de al menos un segundo análogo del antígeno polipeptídico asociado a la célula que contiene esta modificación. Una manera conveniente para lograr que la modificación tenga el efecto deseado de inducir anticuerpos, es incluir al menos un segundo epítope TH extraño en el segundo análogo, es decir, una estrategia similar a la usada por el primer análogo. En los casos donde se desee también montar una respuesta inmunitaria, humoral, efectiva, es ventajoso que el primero y/o segundo análogo (s) comprenda (n) una fracción substancial de los epítopes de las células B del antígeno polipeptídico asociado a la célula, especialmente una fracción substancial de estos epitopes de células B que son extracelulares en la forma que se presenta de manera natural del antigeno en el animal pertinente. Las variaciones y modificaciones analizadas anteriormente del antigeno polipeptidico débil asociado a la célula pueden tomar diferentes formas. Se prefiere que la variación y/o modificación comprenda sustitución y/o supresión y/o inserción y/o adición de aminoácidos. Estas operaciones fundamentales que se refieren a la manipulación de una secuencia de aminoácidos se propone que cubran tanto los cambios de aminoácido individual asi como las operaciones que comprenden tramos de aminoácidos (es decir, desordenamiento de los tramos de aminoácidos dentro del antigeno polipeptidico; esto es especialmente interesante cuando el antigeno es un verdadero antigeno intracelular, puesto que solo son pertinentes las consideraciones con respecto a la conservación de los epitopes de CTL) . Se entenderá, que en la introducción de por ejemplo una inserción o supresión individual de aminoácido puede ocasionar la emergencia de un epitope TH extraño en la secuencia del análogo, es decir, la emergencia de una secuencia de unión a la molécula de la Clase II de MHC. Sin embargo, en la mayoría de las situaciones, es preferible (y aun necesario) introducir un epitope TH extraño, conocido, y esta operación requerirá la substitución y/o inserción ácida (o algunas veces la adición en la forma de ya sea conjugación a una proteina portadora o la provisión de un polipéptido de fusión por medio de métodos de biología molecular) . Se prefiere que el número de inserciones, supresiones, substituciones o adiciones de aminoácidos sea al menos 2, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 2,0, y 25 inserciones, substituciones, adiciones o supresiones. Adicionalmente, se prefiere que el número de substituciones de aminoácidos no exceda los 150, tal como a lo mucho 100, a lo mucho 90, a lo mucho 80, y a lo mucho 70. Se prefiere de manera especial que el número de sustituciones, inserciones, supresiones o adiciones no exceda a los 60, y en particular el número no debe exceder 50 ó aún 40. Se prefiere, además, un número no mayor de 30. Las modalidades preferidas de la invención incluyen modificación al introducir al menos un epítope TH inmunodominante, extraño. Se entenderá que la cuestión de la dominación inmunitaria del epítope de célula T depende de la especie de animal en cuestión. Como se usa en la presente, el término "inmunodominación" se refiere simplemente a epítopes que en el individuo/población vacunada ocasionan una respuesta inmunitaria significativa, pero es un hecho bien conocido que un epítope de célula T que es inmunodominante en un individuo no necesariamente es inmunodominante en otro individuo de la misma especie, aunque puede ser capaz de unir las células de MHC II en este último individuo. Los epitopes TH inmunodominantes, verdaderos son aquellos que, independientes del polipéptido en donde forman una secuencia, ocasionan una activación de células TH, en otras palabras, algunos epitopes TH tienen, como una característica intrínseca, la característica de que substancialmente nunca son críticos puesto que son substancialmente procesados por las APC y se presentan en el contexto de una molécula de MHC II en la superficie de la APC. Otro punto importante es la cuestión de la restricción de MHC de los epitopes de células T. En general, los epitopes de células T que se presentan de forma natural se restringen por MHC, es decir, un cierto epítope que constituye un epítope de célula T solo se unirá de forma efectiva a un subconjunto de moléculas de la clase II de MHC. Esto a su vez tiene el efecto que en la mayoría de los casos, el uso de un epítope específico de células T dará por resultado un componente de vacuna que solo sea efectivo en una fracción de la población, y dependiendo del tamaño de esa fracción, puede ser necesario incluir más epitopes de células T en la misma molécula, o de manera alternativa preparar una vacuna de varios componentes en donde los componentes son variantes del antígeno que se distinguen entre si por la naturaleza del epitope de célula T introducido. Si la restricción por MHC de las células T usadas es completamente desconocida (por ejemplo, en una situación donde el animal vacunado tiene una composición de MHC pobremente definida) , la fracción de la población cubierta por una composición de vacuna especifica se puede determinar por medio de la siguiente formula: n •^oblación ( P«) (II) donde pi es la frecuencia de la población de respondedores al ±-Símo epitope extraño de célula T presente en la composición de vacuna, y n es el número total de epitopes extraños de células T en la composición de vacuna. De esta manera, una composición de vacuna que contiene tres epitopes extraños de células T que tiene frecuencias de respuesta en la población de 0.8, 0.7 y 0.6, respectivamente, dará: 1 - 0.2 x 0.3 x 0.4 = 0.976 es decir, 97.6 por ciento de la población montará estadísticamente una respuesta mediada por MHC-II a la vacuna . La fórmula anterior no parece aplicar en situaciones donde se conozca un patrón más o menos preciso de restricción de MHC de los péptidos usados. Por ejemplo, si un cierto péptido solo se une a las moléculas humanas de MHC II codificadas por los alelos de HLA-DR, DR1, DR3, DR5 y DR7, entonces el uso de este péptido junto con otro péptido que se una a las moléculas restantes de MHC II codificadas por los alelos de HLA-DR logrará 100 % de cobertura en la población en cuestión. Igualmente, si el segundo péptido solo se une a DR3 y DR5, la adición de este péptido no incrementará la cobertura por completo. Si una base al cálculo de la respuesta de la población solo en la restricción de MHC de los epitopes de células T en la vacuna, la fracción de la población cubierta por una composición de vacuna específica se puede determinar por medio de la siguiente fórmula: / J población donde 0j es la suma de las frecuencias en la población de haplotipos alélicos que codifican para las moléculas de MHC que se unen a cualquiera de los epitopes de células T en la vacuna y que corresponden a la j~ésimo de los 3 locus de HLA conocidos (DP, DR y DQ) ; en la practica, se determina primero qué moléculas de MHC reconocerán cada epitope de célula T en la vacuna y posteriormente, éstas se listan por el tipo (DP, DR y DQ) , luego, las frecuencias individuales de los diferentes haplotipos alélicos listados se suman para cada tipo, produciendo de esta manera 0i, 02 y 3. Puede presentarse que el valor pi en la Fórmula II exceda el valor teórico correspondiente p donde es la suma de las frecuencias en la población del haplotipo alélico que codifica para las moléculas de MHC que se unen al i"ésimo epitope de célula T en la vacuna y que corresponden al j~ésimo de los 3 locus de HLA conocidos (DP, DR y DQ) . Esto significa que en 1 —?? de la población está una frecuencia de respondedores de fresiduai-i = (??-??)/(1-??) . Por lo tanto, la Fórmula III se puede ajustar para producir la Fórmula V: retidual (V) donde el término 1-fresiduai-x se ajusta a cero si es negativo. Se debe señalar que la Fórmula V requiere que todos los epitopes se hayan correlacionado por el haplotipo contra conjuntos idénticos de haplotipos. Por lo tanto, cuando se seleccionan los epitopes de células T para ser introducidos en el análogo, es importante incluir todo el conocimiento de los epitopes que esté disponible: 1) la frecuencia de los respondedores en la población a cada epitope, 2) los datos de restricción de MHC y 3) la frecuencia en la población de los haplotipos pertinentes . Existe un número de epitopes de células T "promiscuos" que se presentan de forma natural, que son nativos en una gran proporción de individuos de una especie de animal o una población de animales y estos se introducen de manera preferente en la vacuna reduciendo de este modo la necesidad de un número muy grande de diferentes análogos en la misma vacuna. El epitope promiscuo de acuerdo con la invención puede ser un epitope de célula T, humano, que se presenta de forma natural tal como los epitopes del toxoide de tétano (por ejemplo, los epitopes P2 y P30) , toxoide de difteria, hemaglutinina de virus de influenza (HA) , y antigenos CS de P. falciparum. Durante los años, se han identificado varios epitopes promiscuos de células T. Especialmente, los péptidos capaces de la unión a una gran proporción de moléculas HLA-DR codificadas por los diferentes alelos de HLA-DR se han identificado y éstos son todos los epitopes de células T posibles que se van a introducir en los análogos usados de acuerdo con la presente invención. Comparar también los epitopes analizados en las siguientes referencias que de este modo se incorporan como referencia en la presente: (Frazer IH et al., asignado a The University of Queensland) ; Southwood S et al., 1998, J. Immunol. 160: 3363-3373; Sinigaglia F et al., 1988, Nature 336: 778-780; Rammensee HG et al., 1995, Immunogenetics 41: 4 178-228; Chicz RM et al., 1993, J. Exp. Med 178: 27-47; Ham er J et al., 1993, Cell 74: 197-203; y Falk K et al., 1994, Immunogenetics 39: 230-242. Esta última referencia también trata con ligandos HLA-DQ y -DP. Todos los epitopes listados en estas 5 referencias son pertinentes como epitopes naturales candidatos para ser usados en la presente invención, puesto que son epitopes que comparten porciones comunes con éstos. De manera alternativa, el epitope puede ser cualquier epitope artificial de célula T que sea capaz de unirse a una gran proporción de haplotipos. En este contexto, los péptidos de epitope pan DR ("PADRE") descritos en la WO 95/07707 y en el articulo correspondiente de Alexander J et al., 1994, Immunity 1: 751-761 (arabas descripciones que se incorporan en la presente como referencia) son candidatos interesantes para epitopes que se van a usar de acuerdo con la presente invención. Se debe señalar que los péptidos PADRE más efectivos descritos en estos artículos tienen D-aminoácidos en el C- y N-término a fin de mejorar la estabilidad cuando se administran. Sin embargo, la presente invención tiene como meta principalmente la incorporación de epitopes pertinentes como parte del antígeno modificado que entonces se deban descomponer subsecuentemente de forma enzimática dentro del compartimiento lisosomal de las PAC para permitir la presentación subsecuente en el contexto de una molécula de MHC II, y por lo tanto, no es oportuno incorporar D-aminoácidos en los epitopes usados en la presente invención. Un péptido PADRE especialmente preferido es el que tiene la secuencia de aminoácidos AKFVAA TLKAAA o una secuencia inmunológicamente efectiva de la misma. Éste y otros epitopes que tienen la misma carencia de restricción de MHC son epitopes preferidos de células T que de deben presentar en los análogos usados en el método inventivo. Estos epitopes superpromiscuos permitirán las modalidades más simples de la invención, en donde solo se presenta un análogo individual al sistema inmunitario del animal vacunado . La naturaleza de la vacunación/modificación analizada anteriormente, comprende de manera preferente que : - Al menos una primera porción se incluya en el primero y/o segundo análogo (s), la primera porción que efectúa la dirección al objetivo del análogo a una célula que presenta el antigeno (APC) , y/o - Al menos una segunda porción se incluye en el primero y/o segundo análogo (s), la segunda porción que estimula el sistema inmunitario, y/o - Al menos una tercera porción se incluye en el primero y/o segundo análogo (s), la tercera porción que optimiza la presentación del análogo al sistema inmunitario. Las características funcionales y estructurales que se refieren a estas primera, segunda y tercera porciones se analizarán en lo siguiente: Se pueden presentar en la forma de grupos laterales unidos de manera covalente o no covalente a grupos químicos adecuados en la secuencia de aminoácidos del antígeno polipeptídico asociado a la célula o una secuencia de la misma. Esto no significa que los tramos de residuos de aminoácidos derivados del antigeno polipeptidico se deriven sin alterar la secuencia primaria de aminoácidos, o al menos sin introducir cambios en las uniones peptidicas entre los aminoácidos individuales en la cadena . Las porciones también pueden estar en la forma de compañeros de fusión a la secuencia de aminoácidos derivada del antigeno polipeptidico asociado a la célula. A este respecto, se debe mencionar que ambas posibilidades incluyen la opción de conjugar la secuencia de aminoácidos a un portador, por ejemplo, comparar, el análisis de éstos posteriormente. En otras palabras, en el presente contexto, el término "rutina de fusión" no se restringe solamente a una construcción de fusión preparada por medio de la expresión de un fragmento de ADN que codifica para la construcción, sino también a un conjugado entre las dos proteínas que se unen por medio de una unión peptídica en una reacción química subsecuente. Como se menciona con anterioridad, el análogo también puede incluir la introducción de una primera porción que dirige el análogo a una APC o un linfocito B. Por ejemplo, la primera porción puede ser un compañero de unión específico para un antígeno de superficie específico del linfocito B, o para un antígeno de superficie específico a APC. Muchos de estos antígenos de superficie específicos se conocen en la técnica. Por ejemplo, la porción puede ser un carbohidrato para la cual existe un receptor en el linfocito B o en la APC (por ejemplo, mañano o mañosa) . De manera alternativa, la segunda porción puede ser hapteno. También, un fragmento de anticuerpo que reconozca de manera específica una molécula de superficie en las APC o en los linfocitos se puede usar como una primera porción (la molécula de superficie puede ser por ejemplo un receptor de FCY de macrófagos y monocitos, tal como FCyRI o de manera alternativa, cualquier otro marcador de superficie específico tal como CD40 ó CTLA-4). Se debe señalar que todas estas moléculas de ejemplo de dirección al objetivo se pueden usar como parte de un adyuvante, comparar, por ejemplo ligando CD40, anticuerpos contra CD40 de unión que dirigirá el análogo a las células dendríticas. Al mismo tiempo, los resultados recientes han mostrado que la interacción con la molécula de CD40 vuelve a las células TH no esenciales para obtener una respuesta de CTL. Por lo tanto, se contempla que el uso general de las moléculas de unión de CD40 como la primera porción (o como adyuvantes, comparar posteriormente) mejorará considerablemente las respuestas de CTL. En realidad, el uso de estas moléculas de unión de CD40 como adyuvantes y "primeras porciones" en el significado de la presente invención se cree que es inventivo por su propio derecho.

Como una alternativa al complemento a la dirección del objetivo del análogo a un cierto tipo celular a fin de lograr una respuesta inmunitaria mejorada, es posible incrementar el nivel de sensibilidad del sistema inmunitario al incluir la segunda porción mencionada con anterioridad que estimula el sistema inmunitario. Los ejemplos típicos de estas segundas porciones son citocinas, proteínas de choque térmico, y hormonas, así como partes efectivas de los mismos. Las citocinas adecuadas que se van a usar de acuerdo con la invención son aquellas que normalmente también funcionarán como adyuvantes en una composición de vacuna, por ejemplo, interferón ? (IFN-?) , ligando Flt3 (Flt3L), interleucina 1 (IL-1), interleucina 2 (IL-2) , interleucina 4 (IL-4), interleucina 6 (IL-6) , interleucina 12 (IL-12), interleucina 13 (IL-13), interleucina 15 (IL-15) , y el factor de estimulación de colonia de granulocito-macrófago (GM-CSF) ; de manera alternativa, la parte funcional de la molécula de citocina puede ser suficiente como la segunda porción. Con respecto al uso de estas citocinas como substancias adyuvantes, comparar, el análisis posterior. De manera alternativa, la segunda porción puede ser una toxina, tal como, listeriolicina (LLO) , lípido ? y enterotoxina lábil al calor. También, varios derivados micobacterianos tal como MDP (dipéptido de muramilo) , CFA (adyuvante completo de Freund) y diésteres de trehalosa TDM y TDE son posibilidades interesantes. De acuerdo con la presente invención, las proteínas adecuadas del choque térmico usadas como la segunda porción pueden ser: HSP70, HSP90, HSC70, GRP94, y calreticulina (CRT) . También, la posibilidad de introducir una tercera porción que mejore la presentación del análogo al sistema inmunitario es una modalidad importante de la invención. La técnica ha mostrado varios ejemplos de este principio. Por ejemplo, se conoce que la ancla de lapidación de palmitoilo en la proteína de Borrelia burg-dorferi . OspA, se puede utilizar para proporcionar polipéptidos auto-adyuvantes (comparar, por ejemplo, WO 96/40718) . Parece que las proteínas atadas con lípido forman estructuras tipo micela con un núcleo que consiste de las partes de ancla de lipidación de los polipéptidos y las partes restantes de la molécula que sobresalen del mismo, dando por resultado múltiples presentaciones de determinantes antigénicos. Por lo tanto, el uso de este planteamiento y el planteamiento relacionados que usan diferentes anclas de lipidación (por ejemplo, un grupo de miristilo, un grupo de farnesilo, un grupo de geranil-geranilo, un ancla GPI, y un grupo de N-acil-diglicérido) , son modalidades preferidas de la invención, especialmente puesto que la provisión de esta ancla de lipidación en una proteína recombinantemente producida es bastante directo y solo requiere el uso de por ejemplo una secuencia de señal que se presenta de forma natural como un compañero de fusión para el análogo. Otra posibilidad es el uso del fragmento C3d del factor de complemento C3 ó C3 mismo (comparar, Dempsey et al., 1996, Science 271, 348-350 y Lou & Kohler, 1998, Nature Biotechnology 16, 458-462). Es importante señalar que cuando se intenta usar el método de la invención contra por ejemplo, los antígenos polipeptídicos unidos a membrana, que se exponen al compartimiento extracelular, es más preferido que el primero y/o segundo análogo (s) tenga substancialmente la estructura terciaria completa del antígeno polipeptídico asociado a la célula. En la presente especificación y en las reivindicaciones, esto se propone para querer decir que la estructura terciaria completa de la parte del antígeno polipeptídico que se expone de forma extracelular, se conserva, puesto que, como se menciona anteriormente, la estructura terciaria de los polipéptidos intracelulares necesarios no se acopla al sistema inmunitario humeral. En realidad, como parte de la estrategia de vacunación, se desea frecuentemente evitar la exposición al compartimiento extracelular de los epítopes putativos de células B derivados de la parte intracelular de los antigenos polipeptidicos ; de esta manera, se pueden reducir al mínimo los efectos potencialmente adversos provocados por la reactividad cruzada con otros antígenos. Para los propósitos de la presente invención, es suficiente, sin embargo, si la variación/modificación (sea una inserción, adición, supresión o substitución) ocasiona un epítope extraño de células T y al mismo tiempo conserva un número substancial de epítopes de CTL en el antígeno polipeptídico (y algunas veces también un número substancial de epítopes de células B) . La siguiente fórmula describe las construcciones cubiertas en general por la invención: (MODi)si(PAGei)ni(MOD2)82{PAG2e2)n2 (MODx) sx (PAGe ) nx (I) donde PAGei-PAGex son x secuencias que contienen el epítope de células B y/o CTL del antígeno polipeptídico pertinente que independientemente son idénticas o no idénticas y que pueden contener o no contener grupos laterales extraños, x es un número entero =3, nl-nx son x números enteros =0 (al menos 1 es = 1) , MODi-MODx son x modificaciones introducidas entre los epítopes conservados, y sl-sx son x números enteros =0 (al menos 1 es =1 si no se introducen grupos laterales en las secuencias) . De esta manera, dadas las restricciones funcionales generales en la inmunogenicidad de las construcciones, la invención permite todas las clases de permutaciones de la secuencia original del antigeno, y todas las clases de modificaciones en la misma. De esta manera, incluidos en la invención están los análogos obtenidos por la omisión de partes de la secuencia del antígeno polipeptidico que, por ejemplo, archive efectos adversos in vivo o la emisión de partes que- son normalmente intracelulares y de esta manera podrían ocasionar reacciones inmunológicas indeseadas, por ejemplo, ver el análisis detallado posterior. Una elaboración adicional del principio anterior incluye el uso de los epitopes de CTL y/o células B de más de un antigeno relacionado a la patología. Por ejemplo, existen varios antígenos relacionados al cáncer que ejercen sus efectos oncogénicos cuando están' en forma mutada solo, los ejemplos son K-ras y P53 mutados que son ambos proteínas cruciales en la regulación normal del ciclo celular y que ambos son productos de expresión en la mayoría de las células normales. En algunos casos, las CTL se han mostrado que reconocen péptidos mutados de estos antígenos. Por lo tanto, es importante que el sistema inmunitario responda al péptido mutado únicamente, y no a las partes no mutadas, si se instiga la inmunoterapia específica al antígeno. Se contempla una estrategia por la cual se podrían usar secuencias de 8-25 aminoácidos de estas proteínas relacionadas a la enfermedad, como epítopes adicionales en una construcción de auto-vacunación; en una modalidad preferida, los epítopes introducidos proporcionarán al mismo tiempo la emergencia de epítopes TH en la construcción final, comparar, el análisis posterior. Los epítopes usados para este propósito, serán aquellos que comprendan la región mutada de la proteína relacionada a la enfermedad. Al usar este planteamiento, será posible generar CTL, (y posiblemente anticuerpos, donde sea aplicable) solo contra la forma mutada del antígeno relacionada a la enfermedad. En los casos donde el antígeno relacionada a la enfermedad proporcione la emergencia de un epítope TH, el uso de un epítope TH verdaderamente extraño se podría emitir completamente. Una modalidad de este principio podría ser por ejemplo la vacunación con una vacuna de ácido nucleico que codifique para un análogo de un antígeno polipeptídico (por ejemplo Her2 ó PSM) , en donde se ha introducido al menos un epítope TH y al menos un péptido derivado de otro antígeno relacionado a la enfermedad (por ejemplo, un péptido de la forma mutada de una proteína oncogénica) . En una modalidad preferida, al menos un epítope TH se introduce como una consecuencia de la introducción del péptido. Adicionalmente, se prefiere que la variación y/o modificación incluya duplicación, donde sea aplicable, de al menos un epitope de células B, o de al menos un epitope de CTL del antigeno polipeptidico asociado a la célula. Esta estrategia dará el resultado que múltiples copias de las regiones epitópicas preferidas se presenten al sistema inmunitario aumentando de esta manera al máximo la probabilidad de una respuesta inmunitaria efectiva. Por lo tanto, esta modalidad de la invención utiliza múltiples presentaciones de epitopes derivados del antigeno polipeptidico (es decir, fórmula I, en donde al menos está presente un epitope de células B en dos posiciones) . Este efecto se puede lograr de varias maneras, por ejemplo, al preparar simplemente polipéptidos de fusión que comprenden la estructura (PAG)m, en donde m es un número entero =2 y luego introducir las modificaciones analizadas en la presente en al menos una de las secuencias del antigeno polipeptidico. Una modalidad alternativa de la invención que también da por resultado la presentación preferida de múltiples copias (por ejemplo, al menos 2) de las regiones epitópicas importantes del antigeno al sistema inmunitario, es el acoplamiento covalente del antigeno, secuencia o variantes del mismo a ciertas moléculas. Por ejemplo, se pueden usar polímeros, por ejemplo, carbohidratos tal como dextrano, comparar, por ejemplo Lees A et al., 1994, Vaccine 12: 1160-1166; Lees A et al'., 19909, J. Immunol. 145: 3594-3600, pero también mañosa y mañano son alternativas útiles. Las proteínas de membrana integrales de por ejemplo E. Coli y otras bacterias también son compañeros de conjugación útiles. Las moléculas portadoras tradicionales tal como hemocianina de lapa (KLH) , toxoide de tétano, toxoide de difteria y albúmina de suero bovino (BSA) también se prefieren y son compañeros de conjugación útiles . El mantenimiento de la fracción substancial algunas veces ventajosa de los epitopes de células B o aún la estructura terciaria completa de una proteína que se somete a la modificación como se describe en la presente, se puede lograr de varias maneras. Simplemente se prepara un anticuerpo policlonal dirigido contra el antígeno polipeptídico (por ejemplo, un antisuero preparado en un conejo) y posteriormente usar este antisuero como un reactivo de prueba (por ejemplo, en un ELISA competitivo) contra las proteínas modificadas que se producen. Las versiones modificadas (análogo) que reaccionan a algún grado con el antisuero como lo hace el antígeno polipeptídico se deben considerar como que tienen la misma estructura terciaria completa como el antígeno polipeptídico, en tanto que los análogos que exhiben una reactividad limitada (pero aún significativa y específica) con este antisuero se considera como que han mantenido una fracción substancial de los epitopes originales de células B) . De manera alternativa, una selección de anticuerpos monoclonales reactivos con distintos epitopes en el antígeno polipéptido se pueden preparar y usar como un panel de prueba. Este planteamiento tiene la ventaja de permitir 1) una correlación de epitopes del antigeno polipeptidico en cuestión y 2) una correlación de los epitopes que se mantienen en los análogos preparados. Por supuesto, un tercer planteamiento seria resolver la estructura tridimensional del antigeno polipeptidico o de un truncado biológicamente activo del mismo (comparar anteriormente) y comparar esto a la estructura tridimensional resuelta de los análogos preparados. La estructura tridimensional se puede resolver por la ayuda de estudios de difracción con rayos x y espectroscopia de MR . La información adicional que se refiere a la estructura terciaria puede ser obtenida en algún grado de estudios de dicroismo circular que tienen la ventaja de requerir solamente el polipéptido en forma pura (en tanto que la difracción con rayos X requiere la provisión del polipéptido cristalizado y la RMN requiere la provisión de variantes isotópicas del polipéptido) , a fin de proporciona información útil a cerca de la estructura terciaria de una molécula dada. Sin embargo, finalmente la difracción con rayos X y/o RMN es necesaria para obtener datos concluyentes puesto que el dicroísmo circular solo puede proporcionar evidencia indirecta de la estructura tridimensional correcta, via la información de elementos secundarios de estructura. En esencia, existe en la actualidad tres maneras factibles de obtener la presentación de los epítopes pertinentes al sistema inmunitario: vacunación de subunidades, tradicional con antigenos polipeptidicos, administración de una vacuna viva genéticamente modificada, y vacunación de ácido nucleico. De estas tres posibilidades se analizarán de manera separada en lo siguiente : Vacunación de polipéptido Esto conlleva a la administración al animal en cuestión de una cantidad inmunogénicamente efectiva de al menos un primer análogo y cuando es pertinente, la administración de una cantidad inmunológicamente efectiva de al menos un segundo análogo. De manera preferente, al menos un primero y/o segundo análogo (s) se formula conjuntamente con un portador farmacéutica e inmunológicamente aceptable y/o vehículo y de manera opcional, un adyuvante.

Cuando se efectúa la presentación del análogo al sistema inmunitario del animal, por medio de la administración del mismo al animal, la formulación del polipéptido sigue los principios generales reconocidos en la técnica. La preparación de vacunas que contienen secuencias peptidicas como ingredientes activos en general se entiende bien en la técnica, como se ejemplifica por las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231, 4,599,230; 4,596,792; y 4,578,770 todas incorporadas en la presente como referencia. Típicamente, estas vacunas se preparan como productos inyectables ya sea como soluciones o suspensiones liquidas; formas sólidas adecuadas para la solución en, o suspensión en, líquido antes de la inyección también se pueden preparar. La preparación también se puede emulsionar. El ingrediente inmunogénico activo frecuentemente se mezcla con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Los excipientes adecuados son por ejemplo, agua, solución salina, dextroxa, glicerol, etanol, o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la vacuna puede contener cantidades menores de substancias auxiliares tal como agentes de humectación o emulsionamiento, agentes amortiguadores del pH, o adyuvantes que mejoran la efectividad de las vacunas; comparar, el análisis detallado de los adyuvantes de manera posterior. Las vacunas se administran de forma convencional parenteralmente, por inyección, por ejemplo, ya sea de manera subcutánea, intradérmica, subdérmica o intramuscular. Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y en algunos casos, formulaciones orales, bucales, sublinguales, intraperitoneales, intravaginales, anales e intracraneales. Para los supositorios, los aglutinantes y portadores tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos; estos supositorios se pueden formar de mezclas que contengan el ingrediente activo en el intervalo de 0.5% a 10%, de manera preferente 1-2%. Las formulaciones orales incluyen excipientes normalmente empleados tal como por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, pildoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen de 10-95% de ingrediente activo, de manera preferente 25-70%. Para formulaciones orales, la toxina de cólera es un compañero de formulación interesante (y también un posible compañero de conjugación) .

Los polipéptidos se pueden formular en la vacuna como formas neutrales o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del péptido) y que se forman con ácidos inorgánicos tal como por ejemplo, ácidos clorhídrico fosfórico, o ácidos orgánicos tal como ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tal como por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tal como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetano, histidina, procaína y similares . Las vacunas se administran de una manera compatible con la formulación de dosis, y en una cantidad tal como será terapéuticamente efectiva e inmunogénica . La cantidad que se va administrar depende del sujeto que se va a tratar, incluyendo, por ejemplo, la capacidad del sistema inmunitario del individuo para montar una respuesta inmunitaria, y el grado de protección deseado. Los intervalos adecuados de dosis son , del orden de varios cientos de microgramos de ingrediente activo por vacunación como un intervalo preferido de aproximadamente 0.1 pg a 2000 pg (aunque se contemplan cantidades mayores en el intervalo de 1-10 mg) , tal como en el intervalo de aproximadamente 0.5 pg a 1000 pg, de manera preferente en el intervalo de 1 pg a 500 pg y de manera especial en el intervalo de aproximadamente 10 pg a 100 pg. Los regímenes adecuados para la administración inicial e inyecciones de refuerzo también son variables pero se tipifican por una administración inicial seguido por inoculaciones subsecuentes u otras administraciones. La manera de aplicación se puede variar ampliamente. Cualquiera de los métodos convencionales para la administración de una vacuna son aplicables. Estos incluyen aplicación oral en una base sólida o fisiológicamente aceptable o en una dispersión fisiológicamente aceptable, de manera parenteral, por inyección o similares. La dosis de la vacuna dependerá de la ruta de administración y variará de acuerdo a la edad de la persona que se va a vacunar y la formulación del antígeno . Algunos de los polipéptidos de la vacuna son suficientemente inmunogénicos en una vacuna, pero para algunos otros, la respuesta inmunitaria se mejorará si la vacuna comprende adicionalmente una sustancia adyuvante. Especialmente, se prefiere usar un adyuvante que pueda demostrar la facilitación de la suspensión de la auto- tolerancia a los auto-antigenos. Varios métodos para lograr el efecto adyuvante de la vacuna, son conocidos. Se detallan principios y métodos generales en "The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E.S. Stewart-Tull (ed.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6, y también en "Vaccines: New Generationn Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G et al., (eds.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9) , ambos de los cuales se incorporan en la presente como referencia. Los adyuvantes preferidos facilitan la captación de moléculas de vacuna por las APC, tal como células dendriticas, y activan éstas. Los ejemplos no limitantes se seleccionan del grupo que consiste de un adyuvante de selección inmunitaria, un adyuvante de modulación inmunitaria tal como una toxina, una citocina y un derivado micobacteriano; una formulación de aceite; un polímero; un adyuvante de formación de micelas; una saponina; una matriz de complejo de inmunoestimulación (matriz ISCOM) ; una partícula; DDA; adyuvantes de aluminio; adyuvantes de ADN; ?-inulina; y un adyuvante de encapsulamiento . En general, se debe señalar que las descripciones anteriores que se relacionan a compuestos y agentes útiles como la primera, segunda y terceras porciones en los análogos también se refieren mutatis mutandis a su uso en el adyuvante de una vacuna de la invención. La aplicación de adyuvantes incluye el uso de agentes tal como hidróxido de aluminio o fosfato (alum) , usados comúnmente como una solución al 0.05 a 0.1 por ciento en solución salina amortiguada, mezcla con polímeros sintéticos de azúcar (por ejemplo, Carbopol®) usados como solución al 0.25 por ciento, agregación de la proteína en la vacuna por tratamiento térmico con temperaturas que varían entre 70° y 101 °C durante periodos de 30 segundos a 2 minutos, respectivamente, y también agregación por medio de agentes de reticulación, son posibles. También se puede emplear la agregación por reactivación con anticuerpos tratados con pepsina (fragmentos Fab) a albúmina, mezcla con células bacterianas tal como C. parvum o endotoxinas o componentes de lipopolisacáridos de bacterias gram-negativas, emulsión en vehículos de aceite fisiológicamente aceptables tal como mono-oleato de manido (Aracel A) o emulsión son solución al 20 por ciento de un perfluorocarburo (Fluosol-DA) usado como un substituto de bloque. También se prefiere la mezcla con aceites tal como escualeno e IFA. De acuerdo con la invención, el DDA (bromuro de dimetildioctadecilamonio) es un candidato interesante para un adyuvante como es ADN y ?-inulina, pero también los adyuvantes completo e incompleto de Freunds así como saponinas de quillaja tal como QuilA y QS21 son interesantes. Las posibilidades adicionales son lípido A de monofosforilo (MPL) y los C3 y C3d mencionados con anterioridad. También se sabe que las formulaciones de liposoma confieren efectos adyuvantes, y por lo tanto los adyuvantes de liposoma se prefieren de acuerdo con la invención. También, los adyuvantes tipo matriz de complejo de inmunoestimulación (matriz ISCOM®) son elecciones preferidas de acuerdo con la invención, especialmente puesto que se ha mostrado que este tipo de adyuvantes son capaces de regular de ascendentemente la expresión de la clase II de MHC por las APC. La matriz ISCOM® consiste de saponinas (opcionalmente fraccionadas) (triterpenoides) de Quillaja saponaria, colesterol y fosfolipido. Cuando se mezclan con la proteina inmunogénica, la formulación en partículas, resultante es lo que se conoce como una partícula ISCOM donde la saponina constituye 60-70% p/p, el colesterol y el fosfolipido 10-15% p/p, y la proteína 10- 15% p/p. Los detalles con respecto a la composición y uso de los complejos de inmunoestimulación se pueden encontrar, por ejemplo, en los libros de texto mencionados con anterioridad que tratan con los adyuvantes, pero también Morein B et al., 1995, Clin. Immunother. 3:461-475 así como Barr' lG y Mitchell GF, 1996, Immunol y Cell Biol. 74:8-25 (ambos incorporados como referencia en la presente) proporcionan instrucciones útiles para la preparación de complejos inmunoestimuladores completos. Otra posibilidad altamente interesante (y de esta manera, preferida) para lograr el efecto adyuvante es emplear la técnica descrita en Gosselin et al., 1992 (que se incorpora de este modo como referencia en la presente) . En resumen, la presentación de un antigeno pertinente tal como un antigeno de la presente invención se puede mejorar al conjugar el antigeno a anticuerpos (o fragmentos de anticuerpo de unión al antigeno) contra los receptores FCy en monocitos/macrófagos . Especialmente, los conjugados entre el antigeno y anti-FcyRI se ha demostrado que mejoran la inmunogenicidad para los propósitos de vacunación. Otras posibilidades comprenden el uso de sustancias de inmunomodulacion y dirección al objetivo (es decir, citocinas) , mencionadas anteriormente como candidatos para la primera y segunda porciones en los análogos modificados. A este respecto, también son posibilidades los inductores sintéticos de citocinas, tal como poli I:C. Los derivados micobacterianos adecuados se seleccionan del grupo que consiste de dipéptido de muramilo, adyuvante completo de Freund, RIBI, y un diéster de trehalosa tal como TDM y TDE. Los adyuvantes inmunitarios de dirección al objetivo, adecuados, se seleccionan del grupo que consiste del ligando CD40 y anticuerpos CD40 ó específicamente de fragmentos de unión de los mismos (comparar, el análisis anterior), mañosa, un fragmento de Fab, y CTLA-4. Los adyuvantes de polímero, adecuados se seleccionan del grupo que consiste de un carbohidrato tal como dextrano, PEG, almidón, mañano, y mañosa, un polímero plástico; y látex tal como cuentas de látex. Aun otra manera interesante de modular una respuesta inmunitaria es incluir inmunógeno (opcionalmente junto con adyuvantes y portadores y vehículos farmacéuticamente aceptables) en un "nodulo linfático virtual" (VLN) (un dispositivo medico patentado desarrollado por ImmunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501) . El VLN (un dispositivo tubular delgado) imita la estructura y función de un nódulo linfático. La inserción de un VLN bajo la piel crea un sitio de inflamación estéril con un despliegue vertiginoso de citocinas y quimiocinas. Las células T y B así como las APC responden rápidamente a las señales de peligro, se dirigen al sitio inflamado y se acumulan dentro de la matriz porosa del VLN. Se ha mostrado que la dosis necesaria de antígeno requerida para montar una respuesta inmunitaria a un antígeno se reduce cuando se usa el VLN y la protección inmunitaria conferida por la vacunación usando un VLN suprimió la inmunización convencional usando Ribi como un adyuvante. La tecnología se describe, brevemente en Gelber C et al., 1998, "Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node", en: "From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, Octubre 12-15 1998, Seascape Resort, Aptos, California". Hallazgos recientes han demostrado que la coadministración de agonistas H2 mejora la supervivencia en el tumor de células aniquiladoras naturales y las CTL. Por 10 tanto, también se contempla incluir agonistas H2 como adyuvantes en los métodos de la invención. Se espera que la vacuna se deba administrar al menos una vez al año, tal como al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 12 veces por año. De manera más especifica, se esperan 1- 12 veces por año, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 veces por año a un individuo en necesidad de la misma. Previamente, se ha mostrado que la inmunidad de memoria inducida por el uso de las autovacunas preferidas de acuerdo con la invención no es permanente, y por esto el sistema inmunitario necesita ser estimulado periódicamente con los análogos. Debido a la variación genética, los diferentes individuos pueden reaccionar con respuestas inmunitarias de fuerza variable al mismo polipéptido. Por consiguiente, la vacuna de acuerdo con la invención puede comprender varios polipéptidos diferentes a fin de incrementar la respuesta inmunitaria, comparar, también el análisis anterior con respecto a la elección de las introducciones del epitope extraño de células T. La vacuna puede comprender dos o más polipéptidos, donde todos los polipéptidos son como se definen anteriormente. La vacuna puede comprender en consecuencia 3-20 polipéptidos diferentes, modificados o no modificados, tal como 3-10 polipéptidos diferentes. Sin embargo, normalmente se buscará mantener el número de péptidos, a un mínimo tal como 1 ó 2 péptidos.

Vacunas vivas La segunda alternativa para efectuar la presentación al sistema inmunitario es el uso de la tecnología de vacuna viva. En la vacunación viva, la presentación al sistema inmunitario se efectúa al administrar, a un animal, un microorganismo no patógeno que se ha transformado con un fragmento de ácido nucleico que codifica para las regiones epitópicas necesarias o un primero y/o segundo análogo completo. De manera alternativa, el microorganismo se transforma con un vector que incorpora este fragmento de ácido nucleico. El microorganismo no patógeno puede ser cualquier cepa bacteriana adecuada, atenuada (atenuada por medio del paso o por medio de la remoción de, productos de expresión patógenos por tecnología de ADN recombinante) , por ejemplo, Mycobacteriu bovis BCG., Streptococcus spp no patógeno, E. Coli, Salmonella spp., Vijbrio cholerae, Shigella, etc. Las revisiones que tratan con la preparación de las vacunas vivas del estado de la técnica se pueden encontrar, por ejemplo en Saliou P, 1995, Rev. Prat. 45: 1492-1496 y Walker PD, 1992, Vaccine 10: 977-990, ambos incorporados como referencia en la presente. Para detalles acerca de los fragmentos de ácido nucleico y vectores usados en estas vacunas vivas, comparar el análisis posterior. En cuanto a la vacuna de polipéptido, el epítope TH y/o la primera y/o segunda y/o tercera porciones pueden estar, si están presentes, en la forma de compañeros de fusión a la secuencia de aminoácidos derivada del antígeno polipeptídico asociado en la célula. Como una alternativa a las vacunas vivas, bacterianas, el fragmento de ácido nucleico de la invención analizado posteriormente se puede incorporar en un vector de vacuna viral no virulento. Una posibilidad es un virus de viruela tal como vaccinia, MVA (virus de Vaccinia modificado) , viruela canaria, avi-viruela, y viruela de pollo, etc. De manera alternativa, se puede usar una variante de virus de herpes simplex.

Normalmente, el microorganismo o virus no patógeno se administra solo una vez al animal, pero en ciertos casos, puede ser necesario administrar el microorganismo más de una vez en el tiempo de vida. También, el microorganismo se puede transformar con el (los) ácido (s) nucleico (s) que contenga (n) las regiones que codifiquen para la primera, segunda y/o tercera porciones, por ejemplo, en la forma de substancias inmunomoduladoras descritas anteriormente. tal como citocinas analizadas como adyuvantes útiles. Una versión preferida de esta modalidad abarca el tener la región de codificación para el análogo y la región de codificación para el inmunomodulador en diferentes cuadros de lectura abiertos, o al menos bajo el control de diferentes promotores. De este modo, se evita que el análogo o epitopes se produzcan como compañeros de fusión al inmunomodulador. De manera alternativa, se pueden usar dos fragmentos de nucleósidos distintos, como los agentes de transformación.

Vacunación de ácido nucleico Como una alternativa a la administración clásica de una vacuna basada en péptido, la tecnología de vacunación de ácido nucleico (también conocida como "inmunización de ácido nucleico", "inmunización genética", "inmunización génica" y "vacunación de ADN") ofrece varias características atractivas. Primero, en contraste al planteamiento tradicional de vacuna, la vacunación de ácido nucleico no requiere una producción a gran escala que consuma recursos del agente inmunogénico (por ejemplo, en la forma de la fragmentación a escala industrial de microorganismos que produzcan los análogos necesarios en la vacunación del polipéptido) . Adicionalmente no hay necesidad de dispositivo de purificación y esquemas de replegado para el inmunógeno. Y finalmente, puesto que la vacunación de ácido nucleico depende del aparato bioquímico del individuo vacunado a fin de producir el producto de expresión del ácido nucleico introducido, el procesamiento post-transduccional óptimo del producto de expresión se espera que se presente; esto es especialmente importante en el caso de la auto-vacunación, puesto que, como se menciona anteriormente, una fracción significativa de los epítopes originales de células B se debe presentar en los análogos derivados de las secuencias polipeptídicas expuestas de forma extracelular, y puesto que los epítopes de células B en principio se pueden constituir por partes de cualquier (bio) molécula (por ejemplo, carbohidrato, lípido, proteína, etc. Por lo tanto, la glicosilación nativa y los patrones de lapidación del inmunógeno pueden variar bien siendo de importancia para la inmunogenicidad completa y esto se asegura mejora al tener el hospedador que produzca el inmunógeno. Por lo tanto, una modalidad importante del método de la invención comprende que la presentación se efectúe por la introducción in vivo, en la APC, de al menos un fragmento de ácido nucleico que codifique y exprese al menos un epitope de CTL y/o al menos un epitope de célul B, y al menos un primer epitope TH extraño (una alternativa abarca la administración de al menos dos distintos fragmentos de ácido nucleico, donde uno codifica para al menos un epitope de CTL y el otro codifica para al menos un epitope TH extraño) . De manera preferente, esto se hace al usar un fragmento de ácido nucleico que codifica y expresa el primer análogo analizado anteriormente. Si el primer análogo está equipado con los epitopes TH detallados anteriormente y/o la primera y/o segunda y/o tercera porción, entonces están presentes en la forma de compañeros de fusión a la secuencia de aminoácidos derivada del antigeno polipeptidico asociado a la célula, y la construcción de fusión que se codifica por el fragmento de ácido nucleico. En cuanto al planteamiento tradicional de vacunación, la vacunación de ácido nucleico se puede combinar con la introducción in vivo, en la APC, de al menos un fragmento de ácido nucleico que codifica y expresa el segundo análogo. Las consideraciones con respecto a la primera, segunda y tercera porción y los epitopes ?? aplican también aqui . En esta modalidad, el ácido nucleico introducido es de manera preferente ADN que puede estar en la forma de ADN desnudo, ADN formulado con lipidos cargados o no cargados, ADN formulado en liposomas, ADN incluido en un vector viral, ADN formulado con una proteína o polipéptido que facilitan la transcripción, ADN formulado con una proteína o polipéptido de dirección al objetivo, ADN formulado con agentes de precipitación de calcio, ADN acoplado a una molécula portadora inerte, y ADN formulado con un adyuvante. En este contexto, se señala que prácticamente todas las consideraciones con respecto al uso de adyuvantes en la formulación tradicional de vacuna aplican para la formulación de vacunas de ADN. Por lo tanto, todas las descripciones en la presente que se relacionan a la lucha de adyuvantes en el contexto de vacunas basadas en polipéptido aplican mutatis mutandis a su uso en la tecnología de vacunación de ácido nucleico. Lo mismo se mantiene verdadero para otras consideraciones con respecto a la formulación y modo y ruta de administración y por lo tanto, también estas consideraciones analizadas anteriormente en unión con la vacuna tradicional aplican mutatis mutandis a su uso en la tecnología de vacunación de ácido nucleico. Un tipo especialmente preferido de formulación de vacunas de ácido nucleico son micropartículas que contienen el ADN. Las micropartículas adecuadas se describen por ejemplo en WO 98/31398. Adicionalmente, el (los) ácido (s) nucleico (s) usado (s) como un agente de inmunización puede contener regiones que codifiquen para la Ia, 2a y/o 3a porciones, por ejemplo, en la forma de substancias inmunomodulantes descritas anteriormente tal como las citocinas analizadas como adyuvantes útiles. Una versión preferida de esta modalidad abarca el tener la región de codificación para el análogo y la región de codificación para el inmunomodulador en diferentes cuadros de lectura abiertos o al menos bajo el control de diferentes promotores. De este modo, se evita que el análogo o epítope se produzca como un compañero de fusión al inmunomodulador. De manera alternativa, se pueden usar dos distintos fragmentos de nucleótido, pero esto es menos preferido debido a la ventaja de la co-expresión asegurada cuando se tienen ambas regiones de codificación incluidas en la misma molécula. Bajo circunstancias normales, el ácido nucleico de la vacuna se introduce en la forma de un vector, en donde la expresión es bajo el control de un promotor viral.

Para más análisis detallados de los vectores de acuerdo con la invención, comparar la descripción posterior. También, las descripciones detalladas con respecto a la formulación y uso de vacunas de ácido nucleico están disponibles, comparar Donnelly JJ et al., 1997, Annu. Rev. Immunol. 15:617-648 y Donnelly JJ et al., 1997, Life Sciences 60: 163-172. Ambas de estas referencias se incorporan en la presente como referencia. Una parte importante de la invención se refiere a un nuevo método para seleccionar un análogo inmunogénico apropiado y un antigeno polipeptídico asociado en la célula que es débilmente inmunogénico o no inmunogénico en un animal, el análogo inmunogénico que es capaz de inducir una respuesta de CTL en el animal contra células que exhiben una molécula de clase I de MHC unida a un epítope derivado del antígeno polipeptídico asociado a la célula. Este •método comprende los pasos de: a) identificar al menos una secuencia de la secuencia de aminoácidos del antígeno polipeptídico asociado a la célula, donde la secuencia no contiene epítopes de CTL conocidos o previstos; b) preparar al menos un análogo putativamente inmunogénico del antígeno polipeptídico asociado a la célula al introducir, en la secuencia de aminoácidos del antígeno polipeptídico asociado a la célula, al menos un epitope TH extraño al animal en una posición dentro de al menos una secuencia identificada en el paso a) , y c) seleccionar los/aquellos análogos preparados en el paso b) que sean capaces en forma confirmable de inducir una respuesta de CTL en el animal. De manera alternativa, el método de selección anterior comprende la preparación de un fragmento de ácido nucleico para propósitos de vacunación de ácido nucleico. En esa situación, se requiere que el péptido codificado incluya al menos un epitope de TH. Cuando el análogo se deriva de un antigeno que se expone a la fase extracelular, se prefiere que la secuencia identificada en el paso a) no contenga adicionalmente residuos de cisteina, o de manera alternativa, que el epitope TH introducido en el paso b) no altere substancialmente el patrón de residuos de cisteina. Este planteamiento facilita la conservación de los epitopes especiales de células B en la construcción resultante que son similares a los epitopes de células B en el antigeno polipeptidico, débil asociado a la célula. Por las mismas razones, se prefiere que la secuencia identificada en el paso a) no contenga adicionalmente sitios de glicosilación conocidas o previstos, o de manera alternativa, en donde el epitope TH introducido en el paso b) no altere de forma substancial el patrón de glicosilación . Ciertos antigenos polipeptidicos débiles asociados a la células, ejercen efectos indeseables al tener un papel patofisiológico . Es deseable que estos efectos no se ejerzan por las construcciones de vacunación, y por lo tanto, se prefiere que la secuencia identificada en el paso a) contribuya de forma significativa al efecto patofisiológico ejercido por el antigeno polipeptidico asociado a la célula, y que la introducción en el paso b) del epitope TH extraño reduzca o anule el efecto patofisiológico . Un ejemplo de este planteamiento es remover el sitio activo en una enzima, hormona o citocina y intercambiar esto con el epitope TH extraño. Otra consideración importante se refiere a la cuestión de la reactividad inmunológica cruzada del producto polipeptidico de la vacuna con otras auto- proteínas que no están relacionadas a la patología. Esta reactividad cruzada se debe evitar de forma preferente y por lo tanto una modalidad importante de este método de la invención es una donde la secuencia identificada en el paso a) es homologa a una secuencia de aminoácidos de un antígeno de proteína diferente del animal, y donde la introducción del epitope TH en el paso b) remueve substancialmente la homología. Con relación a esta modalidad, está una modalidad -'".'¦.'·<-' ¦' .' .'·. ¦ ¦'. j-J, .... . donde cualquier secuencia de aminoácidos que 1) no se exponga normalmente a la fase extracelular y 2) que pueda constituir epítopes de células B del antigeno polipeptidico, débil asociado a la célula, no se conserve en el análogo. Esto se puede lograr al intercambiar estas secuencias de aminoácidos con epítopes TH que no constituyan epítopes de células B, al removerlas completamente, o al removerlas parcialmente. Por otra parte, se prefiere que cualquier epítope "verdadero" de células B del antígeno polipeptidico, débil asociado a la célula se conserve a un alto grado, y por lo tanto una modalidad importante del método de selección de la invención comprende que la introducción en el paso b) del epítope TH extraño dé por resultado la conservación de una fracción substancial de los epítopes de células B del antígeno polipeptidico asociado a la célula. Especialmente, se prefiere que el análogo conserve la estructura terciaria completa del antígeno polipeptidico asociado a la célula. La preparación en el paso b) se logra de manera preferente por medios biológicos moleculares o por medio de síntesis peptídica de fase sólida o liquida. Se pueden preparar de manera preferente péptidos más cortos por medio de técnicas bien conocidas de síntesis peptídica de fase sólida o liquida. Sin embargo, los avances recientes en esta tecnología han hecho posible la producción de polipéptidos y proteínas de longitud completa por estos medios, y por lo tanto también está dentro del alcance de la presente invención preparar las construcciones largas por medios sintéticos. Después de haber identificado las secuencias útiles de acuerdo al método analizado anteriormente, es necesario producir el análogo en mayor escala. Los polipéptidos se preparan de acuerdo a los métodos bien conocidos en la técnica. Esto se. puede hacer por medios biológicos moleculares que comprenden un primer paso para preparar una célula transformada al introducir, en un vector, una secuencia de ácido nucleico que codifica para un análogo que se ha seleccionado de acuerdo al método y transformar una célula hospedadora adecuada con el vector. El próximo paso es cultivar la célula transformada bajo condiciones que faciliten la expresión del fragmento de ácido nucleico que codifica para el análogo del antígeno asociado a la célula, y recuperar subsecuentemente el análogo del sobrenadante de cultivo o directamente de las células, por ejemplo, en la forma de un lisado) . De manera alternativa, el análogo se puede preparar por síntesis peptídicas a gran escala, de fase sólida o líquida, como anteriormente. Finalmente, el producto, dependiendo de la célula elegida como una célula hospedadora o del método de síntesis usado, se puede someter a modificaciones post-transduccionales, artificiales. Estos pueden ser esquemas de re-plegado conocidos en la técnica, el tratamiento con enzimas (a fin de obtener glicosilación o remoción de los compañeros de fusión indeseados, modificaciones químicas (nuevamente glicosilación es una posibilidad) , y conjugación, por ejemplo, a moléculas tradicionalmente portadoras. Se debe señalar que los análogos preferidos de la invención (y también los análogos pertinentes usados en los métodos de la invención) comprenden modificaciones que dan por resultado un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% con el antígeno polipeptídico o con una sub-secuencia de la misma de al menos 10 aminoácidos del longitud. Se prefieren mayores identidades de secuencia, por ejemplo, al menos 75% o aún al menos 80% a 85%. La identidad de secuencia para las proteínas de ácido nucleico se puede calcular como (Nref-Ndif) · 100/Nref, en donde Ndif es el número total de residuos no idénticos en las dos secuencias cuando se alinean y en donde Nref es el número de residuos en una de las secuencias. Por lo tanto, la secuencia de ADN AGTCAGTC, tendrá una identidad de secuencias del 75% con la secuencia AATCAATC. (Ndif=2 y Nref=8) .

Objetivos específicos de ejemplo para el método de la invención Como se analiza anteriormente, los antígenos polipeptídicos , débiles, preferidos asociados a la célula son antigenos asociados al tumor. Se da una lista no limitante de éstos en la siguiente tabla: Antígeno Referencia 5-alfa- Délos S, Carsol JL, Fina F, Raynaud JP, Martin reductasa PM. 5alpha-reductase and 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase expression in epithelial cells from hyperplastic and malignant human prostate. Int J Cáncer 1998 Mar 16 75:6 840-6 a- Esteban C, Terrier P, Frayssinet C, Uriel J. fetoproteína Expression of the alpha-fetoprotein gene in human breast cáncer. Tumour Biol 1996 17:5 299-305 AM-1 Harada Y, Ohuchi N, Masuko T, Funaki Y, Mori S, Satomi S, Hashimoto Y. Characterization of a new breast cancer-associated antigen and its relationship to MUC1 and TAG-72 antigens. Tohoku J Exp Med 1996 Nov 180:3 273-88 APC Dihlmann S, Amler LC, Schwab M, Wenzel A. 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Antígeno de membrana específico de próstata , PSM En los Estados Unidos de América, el cáncer de próstata es la segunda causa principal de muerte por cáncer (aproximadamente 40,000 por año) y se diagnostican 200,000 pacientes por año (Boring 1993) . Aproximadamente 1 de cada 11 hombres desarrolla eventualmente cáncer de próstata. Adicionalmente, cerca de 40-60% de los pacientes con cáncer de próstata desarrollan extensión extra-prostática de la enfermedad (Babaian 1994). La estrategia principal en la presente invención es usar una vacuna terapéutica como una terapia complementaria a la prostatectomia a fin de eliminar el tejido residual de tumor y la metástasis. Varias condiciones patológicas se localizan en la glándula de la próstata, incluyendo crecimiento benigno (BPH) , infección (prostatitis) y neoplasia (cáncer prostático) . La agresividad biológica del cáncer prostático es variable. En algunos pacientes, el tumor detectado permanece como un tumor histológico, latente y nunca llega a ser significativo de forma clínica. En otros pacientes, el tumor progresa rápidamente, desarrolla metástasis y aniquila al paciente en un periodo de tiempo relativamente corto (2-5 años) . El tratamiento primario, corriente del cáncer de próstata es la prostatectomia. Sin' embargo, debido a la amplia propagación de las células del cáncer de próstata, la mayoría de los pacientes con cáncer prostático no se curan por cirugía local. Los pacientes con la enfermedad no confinada reciben eventualmente terapia de ablación con andrógenos sistemáticos, pero la proporción anual de muertes del cáncer prostático no ha declinado por completo durante los 50 años desde que la ablación con andrógeno llego a ser una terapia normal para la enfermedad metastática . El PSM es una proteina de membrana que es altamente específica para tejidos prostéticos, benigna así como maligna, aunque la expresión de PSM también se ha observado en otros tejidos tal como tejido renal y tumor renal, intestino delgado, cerebro y neovasculatura del tumor. Por lo tanto, si la cirugía fue exitosa, los pacientes con cáncer que se les practicó la prostatectomía deben expresar teóricamente PSM en el tejido de tumor prostático, maligno, residual o la metástasis que se originan del tumor. Al inducir una fuerte respuesta de CTL y/o una fuerte respuesta de anticuerpos policlonales hacia PSM, se espera que se pueda eliminar el tejido residual de tumor. De manera interesante, la regulación ascendente de la expresión de PSM se ve después de la terapia de privación de andrógeno de los pacientes con cáncer de próstata (Wright 1996) . Esto haría a un tratamiento dirigido a PSM muy bien adecuado para seguir la terapia tradicional con privación de andrógeno. El PSM se identificó primero en 1987 como resultado de la generación de un anticuerpo monoclonal, el 7E11-C5.3, formulado contra una célula de cáncer prostático, humana, aislada, LNCaP (Horoszewicz 1987) . El anticuerpo reconoció tanto el epitelio prostático normal como maligno, y se usó en 1993 para purificar y determinar la secuencia de aminoácidos de la proteina PSM y clonar eventualmente el gen (Israeli 1993) . El PSM es una glicoproteina de transmembrana tipo II con un peso molecular de 84 kD como se prevé de la secuencia de ácido nucleico en tanto que la versión glicosilada tiene un peso molecular observado de 100-120 kD. La secuenciación del gen que codifica para PSM reveló una región que abarca la membrana putativa en unión con tres residuos de anclaje de arginina, citosólicos. La parte extracelular de PSM constituye 707 de los 750 aminoácidos totales de la proteina, en tanto que el dominio citoplasmático se prevé que sea de 19 aminoácidos de largo (Israeli 1993) . Se ha detectado el ARNm especifico de PSM en el tejido de tumor de próstata (Israeli 1994), indicando que el antigeno de tumor no es una proteina anormalmente glicosilada que es el caso como por ejemplo los antigenos de tumor Tn o sTn. El ADNc de longitud completa de PSM se ha transfectado en y expresado en una linea de células de cáncer de próstata, humana, negativa a PSM, la PC-3 (Kahn 1994). Adicionalmente, el ADNc de longitud completa (2.65 kilobases) se ha trascrito y traducido in vivo (Kahn 1994). Recientemente, se ha demostrado que el PSM posee actividad hidrolitica que se asemeja a aquella de la dipeptidasa ácida a-enlazada N-acetilada (NAALADasa) , en realidad se ha demostrado que las dos proteínas son idénticas. La NAALADasa es una hidrolasa unida a membrana del sistema nervioso, que catagoliza el N-acetilaspartil-glutamato de neuropéptido (NAAG) a fin de afectar los procesos de señalización glutamatérgicos . Aun no se sabe si esta actividad del PSM tiene alguna función biológica pertinente. Es de alguna importancia predecir si la reactividad cruzada indeseada con otras proteínas accesibles para la CTL o anticuerpos se esperará después del tratamiento con una auto-vacuna que induzca respuestas inmunitarias específicas de PSM. Se ha mostrado que una parte de la región de codificación del gen de PSM (posiciones de aminoácidos 418-567) tiene 54% de homología al receptor de transferrina humana (Israeli 1993) . También, se ha encontrado la identidad de secuencia completa con la enzima NAALADasa, comparar anteriormente. No se puede hacer identificación de una similitud funcionalmente pertinente con otras peptidasas. La homología al receptor de transferrina es muy baja y de manera preferente se desestabilizará en alguna de las construcciones inventivas. La identidad de secuencia observada con la NAALADasa humana no se espera que sea un obstáculo para una vacuna de PSM, parcialmente debido a la baja capacidad de los anticuerpos y las CTL para penetrar la barrera sanguínea del cerebro. En conjunto, aún con la mayoría de las construcciones tipo PSM, no se espera experimentar reactividad cruzada prohibitiva con otras proteínas en los pacientes. De los estudios anteriores, es claro que el PSM se expresa en la mayoría de las células de cáncer de próstata y las metástasis de origen de próstata, probadas. Adicionalmente, la mayoría de los otros cánceres probados, tal como carcinomas, sarcomas y melanomas de diferentes tejidos así como un gran panel de líneas celulares de cáncer humano no prosaicas han probado ser negativas a PSM. Además de esto, un número muy grande de otros tejidos se han encontrado que son negativos a PSM. Estos incluyen colon, mama, pulmón, ovario, hígado, vejiga urinaria, útero, bronquios, bazo, páncreas, lengua, esófago, estómago, tiroides, paratiroides , adrenal, nódulo linfático, aorta, vena cava, piel, glándula mamaria y placenta. Sin embargo, la RT-PCR ha revelado la existencia de ARNm de PSM en algunos de estos tejidos. Aunque el PSM se encuentra predominantemente como una molécula unida a membrana en el tejido de próstata, también se pueden detectar cantidades pequeñas de PSM en los sueros de individuos normales y en niveles elevados en pacientes con cáncer de próstata (Rochon 1994, Murphy 1995) . El nivel de PSM en circulación en estos pacientes por lo tanto permiten monitoreo serológico de la efectividad de una vacuna de PSM. En conclusión, en base a la cantidad completa de datos disponibles a la fecha, el PSM es un antigeno con una alta especificidad para el tejido de próstata humano y tumores que se originan del mismo. Esto significa que en pacientes quienes hayan sufrido prostatectomia, el PSM es un auto-antigeno cuasi-especifico de tumor. Por lo tanto, una vacuna de PSM efectiva probablemente va a buscar como objetivo principalmente el tejido metastático de origen de próstata, o prostético. Como será claro del Ejemplo 1, el método de la invención conlleva de manera preferente que el epitope extraño de células TH se introduzca en una parte de la secuencia de aminoácidos de PSM, definida por SEC. ID No. 2, posiciones 16-52 y/o 87-108 y/o 210-230 y/o 269-89 y/o 298-324 y/o 442-465 y/o 488-514 y/o 598-630 y/o 643-662 y/o 672-699. Adicionalmente, una molécula modificada de PSM que tiene un epitope TH extraño introducido en estas posiciones también es una parte de la invención. Por consiguiente, la invención también se refiere a un análogo de PSM humano que es inmunogénico en humanos, este análogo que comprende una parte substancial de todos los epitopes de células B y CTL, conocidos y previstos del PS y que incluye al menos un epitope TH extraño como se analiza en la presente. Los análogos preferidos de PSM son aquellos en donde al menos un epitope ?? extraño está presente como una extensión en la secuencia de aminoácidos de PSM o como una substitución de parte de la secuencia de aminoácidos de PSM o como resultado de la supresión de parte de la secuencia de aminoácidos de PSM, y los análogos más preferidos son aquellos en donde se introduce un epitope de célula TH extraño en una parte de la secuencia de aminoácidos de PSM definida por la SEC. ID No. 2 posiciones 16-52 y/o 87-108 y/o 210-230 y/o 269-289 y/o 298-324 y/o 442-465 y/o 488-514 y/o 598-630 y/o 643-662 y/o 672-699.

Gonadotropina coriónica humana (HCG) La relación entre los marcadores embriónicos y fenotipos malignos ha estado bajo análisis durante muchas décadas. Un cuerpo creciente de datos sugiere que al menos un marcador, la gonadotropina beta coriónica humana (hCG ) , se detecta consistentemente en células de cáncer de muy diferentes orígenes histológicos, y que la expresión de esta proteína frecuentemente se correlaciona con las propiedades metastáticas incrementadas. Una respuesta inmunitaria humoral dirigida contra esta proteína soluble puede reducir las oportunidades de propagación de tumor y/o puede inhibir la recurrencia de nuevos crecimientos primarios después de la cirugía. La gonadotropina coriónica humana corresponde a una familia de hormonas de glicoproteinas , que incluyen la hormona de estimulación del folículo (FSH) , la hormona de estimulación de tiroides (TSH) , y la hormona luteinizante (LH) , todas las cuales son reguladoras importantes de la expresión reproductiva y supervivencia fetal. Los miembros de esta familia de hormonas son heterodímeros, que comparten una a-cadena común. La ß-cadena es única a cada hormona y proporciona la especificidad, con la ß-cadena de LH que exhibe la homología de secuencia más fuerte a hCGP (aproximadamente 80%) . El peso molecular aparente de hCG-holo, es de 37 kD, de lo cual un tercio se contribuye por el carbohidrato. Las modificaciones de azúcar pos-trasduccionales incluyen el carbohidrato tanto N-enlazado como O-enlazado. : Se presentan abundantes residuos de ácido siálico y éstos dan a la proteína una gran carga negativa. La estructura cristalina de hCG-holo se ha resuelto (Lapthorn et al., 1994). Basándose en la estructura de cristal se encontró que hCG exhibe homología a una familia de factores de crecimiento, incluyendo PDGF y TGF (Lapthorn et al., 1994). Esto sugiere que la expresión de hCG puede ayudar a regular el crecimiento de las células de cáncer.

La gonadotropina coriónica ' humana es una hormona de glicoproteína, que se produce por los sincitiotrofoblastos placentarios inmediatamente después de la concepción, y es esencial para la gestación exitosa en la mujer embarazada. No se conoce el papel patofisiológico de los marcadores embriónicos para el desarrollo o mantenimiento de una masa de cáncer. Sin embargo, es de interés señalar que los trofoblastos (donde se producen normalmente estas proteinas) tienen características tanto angiogénicas como invasoras, ambas de las cuales también son propiedades necesarias para una célula de cáncer. Adicionalmente, se ha sugerido que la hCG (o sus subunidades) pueden inhibir las respuestas inmunitarias celulares, maternales al tejido fetal. Por ejemplo, los estudios han mostrado que la hCG suprime directamente las respuestas de células T (Jacoby et al., 1984) y se ha propuesto que debido a que los nódulos linfáticos que drenan (en este caso) un tumor de melanoma primario, se inmunosuprimen, puede resultar un ambiente más favorable para que los tumores metastásicos se establezcan por sí mismos. Como consecuencia, la expresión de hCGP puede ayudar a la propagación de las células de cáncer hasta los órganos linfoides secundarios. Finalmente, como se menciona con anterioridad, se ha demostrado la homología estructural entre hCG y varios factores de crecimiento.

Por lo tanto, otra posibilidad es que la secreción de hCG por células de cáncer puede ocasionar una ventaja de. crecimiento para el tumor. Se ha mostrado que la expresión de hCGP en muchos tipos diferentes de cáncer, por ejemplo: a) adenocarcinoma de próstata: positividad para hCGp en secciones de tejido se observaron para pacientes con una pobre prognosis, a pesar del grado histológico del tumor (Sheaff et al., 1996) , b) diferentes clases de carcinomas de pulmón; células escamosas (SQCC) , adenocarcinoma (AC) , y células grandes (LCC) , todas mostraron un alto porcentaje de reactividad para CG (Boucher et al., 1995), c) adenocarcinoma pancreático (Syrigos et al., 1998), d) neuroblastomas, cánceres de cerebro, retinoblastomas (Acevedo et al., 1997), e) melanoma maligno (Doi et al, 1996), f) carcinomas de vejiga (Lazar et al., 1995). Un articulo reciente describe un planteamiento de ADN, en el cual se inmunizaron ratones con una construcción de expresión de hCGp (Geissler et al., 1997). En este modelo in vivo, la inhibición del crecimiento de tumor se asoció fuertemente con la actividad de CTL, sin embargo, también se detectaron altos títulos de anticuerpos (que neutralizaron el efecto biológico de la hCG intacta en su receptor celular) . El uso de hCG como un inmunógeno se ha descrito en varios artículos, que enfocan su uso como una vacuna anticonceptiva (Talwar et al., 1976 y Talwar et al., 1994). Se ha observado un muy alto grado de eficacia y seguridad en un ensayo clínico de anti-fertilidad, usando una vacuna contra hCG-holo (Talwar et al., 1994). Los ensayos clínicos de Fase I de pacientes con cáncer y los pacientes de cáncer con una vacuna contra un péptido carboxi-terminal sintético de hCGP conjugado a toxoide de difteria también se ha llevado a cabo (Triozzi et al., 1994) y se están llevando a cabo los ensayos de la fase II. A pesar del hecho que la idea de usar hCGp como un objetivo de vacuna de cáncer ha estado rondando durante algún tiempo, no se ha explorado en unión con la tecnología de auto-vacunación. Se sabe que las células de un tejido no embriónico, o neoplasmas benignos, no expresan hCG . Por lo tanto, no debe haber efectos laterales potenciales de la vacunación contra esta molécula (aparte de los efectos de embarazo) . Debido a que se expresa por clases muy diferentes de cánceres, esta molécula se ha propuesto que sea el "biomarcador de cáncer definitivo" (Acevedo et al., 1995 y Regelson W., 1995) y como tal sería un objetivo atractivo a seguir. Los modelos de animales adecuados para los estudios adicionales de la eficacia de una vacuna basada en hCG se pueden encontrar en Acevedo et al., Cáncer Det. Y Prev. Suppl. (1987) 1:477-486, y en Kellen et al., Cáncer Immunol. Immun. Ther. (1982) 13:2-4.

Her2 Los receptores de tirosina-cinasa Her2 y EGFr se cree que juegan un papel crucial en la transformación maligna de células normales y en el crecimiento continuo de células de cáncer. La sobre expresión se enlaza usualmente a una prognosis muy pobre. Durante los últimos años, han existido muchos informes que se refieren al uso de anticuerpos contra estos receptores como terapia para cánceres que sobreexpresan cualquiera de estos receptores, o ambos. Genentech Inc. ha terminado varios ensayos clínicos exitosos en pacientes con cáncer de mama usando un anticuerpo monoclonal contra Her2 y ha obtenido recientemente una aprobación por la FDA para la comercialización de la preparación de anticuerpo monoclonal anti-Her2, Herceptin®. La tecnología de auto-vacunación descrita en la presente como se aplica en la molécula Her2 producirá anticuerpos policlonales que reaccionarán de forma predominante con Her2. Estos anticuerpos se espera que ataquen y eliminen las células de tumor así como que prevengan de que las células metastáticas se desarrollen en metástasis. El mecanismo efector de este efecto anti-tumor se medía vía la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo y el complemento. Dependiendo de la elección de las construcciones, los anticuerpos inducidos también pueden inhibir el ' crecimiento de células de cáncer a través de la inhibición de la oligo-dimerización e internalización dependiente del factor de crecimiento, de los receptores. De manera más importante, los análogos de Her2 se espera que sean capaces de introducir respuestas de CTL dirigidas contra epítopes de Her2 conocidos y/o previstos, exhibidos por las células de tumor. El Her2 es un miembro de la familia de los receptores de factores de crecimiento epidérmicos (c-erbB) que consiste de cuatro diferentes receptores a la fecha: c-erbB-1 (EGFr) , c-erbB-2 (Her2, c-Neu) , c-erbB-3 y c-erbB-4 (Salomón et al., 1995). C-erbB-3 y c-erbB-4 están menos bien caracterizados que EGFr y Her2. El Her2 es una glicoproteína integral. La proteína madura tiene un peso molecular de 185 kD con características estructurales que se asemejan cercanamente al receptor de EGFr (Prigent et al., 1992). El EGFr también es un receptor de membrana integral que consiste de una sub-unidad. Tiene un peso molecular aparente de 170 kD y consiste de un dominio de unión a ligando de superficie de 621 aminoácidos, un dominio de transmembrana hidrófobo, individual de 23 aminoácidos, y un dominio de tirosina-cinasa, citoplasmático, altamente conservado de 542 aminoácidos. La proteina está N-glicosilada (Prigent et al., 1994). Todas las proteinas en esta familia son tirosinas-cinasas . La interacción con el ligando conduce a la dimerización del receptor, que incrementa la acción catalítica de la tirosina-cinasa (Bernard, 1995, Chantry 1995) . Las proteinas dentro de la familia son capaces de homo- y hetero-dimerizarse que es importante para su actividad. El EGFr transporta efectos de promoción de crecimiento y estimula la captación de glucosa y aminoácidos por las células (Prigent et al., 1992). El Her2 también transporta señales de promoción de crecimiento. Únicamente el EGFr se une a EGF y TGF-alfa. Estos ligandos no se unen a los otros receptores en la familia (Prigent et al., 1992). Los ligandos para Her2 no se determinan completamente. Sin embargo, se ha mostrado que la heregulina induce la fosforilación al activar Her2. Esto no parece ser debido a una unión directa al receptor, si no se cree que la heregulina es un ligando para erbB-3 y erbB-4 que luego activan Her2 por la oligo-dimerización (Solomon et al. , 1995) . La homología entre las proteínas de la familia de receptores de EGF se pronuncia más en el dominio de tirosina-cinasa en la parte citoplasmática de las moléculas (82% entre EGFr y Her2). La homología es menor en la parte extracelular; de 41% a 46% en diferentes dominios (Prigent et al. , 1992) . El receptor del factor de crecimiento epidérmico se expresa en tejidos normales en bajas pocas cantidades, pero se sobre expresa en muchos tipos de cánceres. El EGFr se sobre expresa en cánceres de mama (Earp et al., 1993, Eppenberger 1994), gliomas (Schlegel et al., 1994), cáncer gástrico (Tkunaga et al., 1995), carcinoma escamoso cutáneo (Fujii 1995), cáncer de ovario (van Dam et al., 1994) y otros. El Her2 también se expresa en pocos tejidos normales humanos en baja cantidad, más característicamente en el epitelio secretor. La sobre expresión de Her2 se presenta en aproximadamente 30% de los cánceres de mama, gástrico, pancreático, vejiga y ovario. La expresión de estos receptores varía dependiendo del grado de diferenciación de los tumores y el tipo de cáncer, por ejemplo, en cáncer de mama, los tumores primarios sobre expresan ambos receptores; en tanto que en el cáncer gástrico, la sobre expresión se presenta en una etapa posterior en los tumores metastáticos (Salomón et al., 1995). El número de receptores sobre expresados en células de carcinoma es mayor de 106/célula para varios cánceres de cabeza y cuello, líneas de cáncer de vulva, mama y ovario aisladas de pacientes (Dean et al., 1994).

Existen varias razones por las que la familia de EGFr de receptores constituye objetivos adecuados para la inmunoterapia de tumor. Primero, se sobre expresan en muchos tipos de cánceres, que deben dirigir la respuesta inmunitaria hacia el tumor. Segundo, los tumores frecuentemente expresan o sobreexpresan los ligandos para estas familias de receptores y algunos son hipersensibles a los efectos proliferativos mediados por los ligandos. Tercero, los pacientes con tumores que sobre expresan los receptores de factor de crecimiento frecuentemente tienen una pobre prognosis. La sobre expresión se ha enlazado cercanamente con la pobre prognosis especialmente en el cáncer de mama, cáncer de pulmón y cáncer de vejiga (2) y se asocia aparentemente con fenotipos invasores/metastáticos, que en cambio son insensibles a las terapias convencionales (Eccles et al., 1994). La sobre expresión de Her2 es en algunos casos un resultado de la amplificación del gen y en otros casos una trascripción y traducción incrementada. La sobre expresión de Her2 se asocia con la prognosis pobre en cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer gástrico, cáncer de vejiga y posiblemente en cánceres de pulmón de células no pequeñas (Solomon et al., 1995). Se han realizado ensayos clínicos de la Fase I con un anticuerpo biespecifico en pacientes con cáncer de ovario y mama avanzado. El anticuerpo fue biespecifico contra Her2 y FcyRI (Weiner et al., 1995). La lisis eficiente de las células de tumor que sobre expresan Her2 se observó en un anticuerpo biespecifico contra Her2 y CD3 (Zhu et al. , 1995) . El tratamiento de ratones scid xenoin ertados con cáncer gástrico humano con un anticuerpo monoclonal anti-Her2 prolongó la supervivencia de los ratones (Ohniski et al., 1995). Las actividades anti-tumor de los anticuerpos monoclonales contra Her2, in vitro e in vivo no es debido a un mecanismo idéntico; pueden actuar como agonistas de ligando parciales, alterar el recambio metabólico del receptor Her2 y la fosforilación o pueden afectar la dimerización (Lupu et al, 1995) . De manera similar, se ha mostrado que los anticuerpos a EGFr también pueden interferir con las interacciones del factor de crecimiento (Baselga et al., 1994, Modjahedi et al., 1993a, Wu et al., 1995, Modjahedi et al, 1993b, Tosi et al., 1995, Dean et al., 1994, Bier et al., 1995, Modjtahedi et al., 1996, Valone 1995). Por lo tanto, una modalidad importante de los métodos de la invención es una en donde se introduce el epitope extraño de células T en una parte de la secuencia de aminoácidos de Her2 definida por la numeración de aminoácidos en SEC. ID No. 3, posiciones 5-25 y/o 59-73 y/o 103-117 y/o 149-163 y/o 210-224 y/o 250-264 y/o 325-339 y/o 369-383 y/o 465-479 y/o 579-593 y/o 632-652 y/o 653-667 y/o 661-675 y/o 695-709 y/o 710-730, comparar los Ejemplos. Por consiguiente, la invención también se refiere a un análogo de Hér2 humano que es inmunogénico en humanos, el análogo que comprende una parte substancial de los epitopes de células B y de CTL, conocidos y previstos de Her2 y que incluye al menos un epitope TH extraño como se analiza en la presente. Se prefiere que al menos un epitope TH extraño esté presente como una inserción en la secuencia de aminoácidos de Her2 o como una substitución de parte de la secuencia de aminoácidos de Her2 ó como el resultado de la supresión de parte de la secuencia de aminoácidos de Her2. Los análogos más preferidos son aquellos definidos anteriormente, es decir, aquellos en donde el epitope extraño de células T se introduce en una parte de la secuencia de aminoácidos Her2 definida por SEC. ID No. 3, posiciones 5-25 y/o 59-73 y/o 103-117 y/o 149-163 y/o 210-224 y/o 250-264 y/o 325-339 y/o 369-383 y/o 465-479 y/o 579-593 y/o 632-652 y/o 653-667 y/o 661-675 y/o 695-709 y/o 710-730.

FGF8b Se ha mostrado por varios investigadores que FGF8b puede inducir proliferación, transformación, diferenciación y en algunos casos incrementar grandemente la tumorigenicidad de células y tejidos de mamífero (Tanaka 1992, ouhara 1994, Lorenzi 1995, MacArtur 1995a, Crossley 1996a, 1996b, Ghosh 1996, Ohuchi 1997a, Rudra-Ganguly 1998). Estos efectos se medían principalmente a través de la unión de FGF8b a miembros de los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos FGFR2, FGFR3, y FGFR4 (MacArthur 1995b, Blunt 1997, Tanaka 1998). De esta manera, las células que expresan uno de estos receptores y FGF8(b) se ha mostrado que proporcionan una cascada de señalización de crecimiento autocrina que conduce a la proliferación.. El efecto biológico de FGF8b se medía más probablemente de manera parcial a través de la ruta JAK/STAT3, puesto que se ha observado que la adición de FGF8b al medio de crecimiento de ciertas células promueve la fosforilación de STAT3, una característica que se sospecha que vuelve a las células resistentes apoptosis (Catlett-Falcone 1999) . Además, de las observaciones in vi tro mencionadas con anterioridad, se ha mostrado recientemente que la expresión de FGF8 (b) se regula ascendentemente y de forma significativa tanto en cánceres de próstata como de mama (Marsh 1999, Dorkin 1999) . Por lo tanto, se cree, que una auto-vacuna contra FGF8 (b) será un medio muy eficiente para tratar un número de tumores que expresan FGF8, o quizá incrementen su sensibilidad hacia los agentes de inducción de apoptosis.

Cáncer de próstata La agresividad biológica del cáncer de próstata es variable. En algunos pacientes, el tumor detectado permanece como un tumor histológico latente y nunca llega a ser clínicamente significativo. En otros pacientes, el tumor progresa rápidamente, se sufre metástasis y mata al paciente en un tiempo relativamente corto (2-5 años) . Para los propósitos de diagnosis, y para seguir la respuesta a la terapia del cáncer de próstata, se ha usado principalmente la determinación de los niveles en circulación de dos pacientes: ácido prostático-fosfatasa (PAP) y antígeno específico de próstata (PSA) (Nguyen 1990, Henttu 1989) . Debido a la interrupción de la arquitectura normal de la glándula de próstata en respuesta al desarrollo del cáncer, estas proteínas solubles se liberan en la circulación donde se pueden detectar como marcadores, por ejemplo, para la propagación metastática. El tratamiento primario corriente del cáncer de próstata es la prostatectomía . Sin embargo, debido a la amplia propagación de las células de cáncer de próstata, la mayoría de los pacientes con cáncer prostático no se curan por cirugía local. Los pacientes con enfermedad no confinada reciben terapia de ablación de andrógeno, sistémica, pero la proporción de muertes anuales del cáncer de próstata no ha declinado én los últimos 50 años puesto que la ablación de andrógeno llega a ser una terapia normal para la enfermedad metastática. El análisis por RT-PCR ha mostrado que el ARNm de FGF8 se produce por las líneas de células de tumor epitelial, prostático, humano LNCaP, PC-3, ALVA-31 y DU145, respectivamente, con FGF8b que es la isoforma más prominente (Tanaka 1995, Ghosh 1996) . El crecimiento de las células LNCaP sensibles a andrógeno se estimulan por la adición de FGF8b recombinante (Tanaka 1995), en tanto que las células DU145 se podría inhibir en el crecimiento por transfección con vira que ¦ exprese FGF8b anti-sentido (Rudra-Ganguly 1998) . Esto, junto con la evidencia de estudios de desarrollo analizados anteriormente, indica un papel para FGF8b en el mantenimiento del estado canceroso de estas líneas celulares. Usando el ADNc de FGF8a para experimentos de hibridación in situ, Leung y colaboradores han mostrado que una alta proporción (80% (n=106) , y 71% (n=31) ) de los cáncer prostáticos producen ARNm de FGF8, y que la cantidad de ARNm de FGF8 correlacionan con la severidad de los tumores (P<0.0016 y P0<0.05, respectivamente) (Leung 1996, Dorkin 1999) . Usando un anticuerpo monoclonal anti-FGF8b, esta isoforma se mostró responsable para la sobre expresión de FGF8b (Dorkin 1999) . Adicionalmente , los hombres con tumores que expresaron altos niveles de FGF8 tienen la peor supervivencia (P=0, 034), y que la expresión de FGF8 persistió en cánceres de próstata independiente de andrógeno (Dorkin 1999) . De acuerdo a. los datos presentados por Dorkin y colaboradores, la expresión de FGF8b en cáncer de próstata puede predecir la supervivencia del paciente. El análisis inmunohistoquímico usando un anticuerpo monoclonal contra FGF8, ha detectado la proteina en 93% (n=43) de los cánceres de próstata humano (Tanaka 1998). El tejido prostético normal o la hiperplasia prostética anormal produce bajos niveles de ARNm de FGF8, y no contiene cantidades detectables de proteina de FGF8 (Leung 1996, Yoshimura 1996, Ghosh 1996, Tanaka 1998, Dorkin 1999) . Estos resultados indican . que una auto-vacuna contra FGF8 (b) será reactiva contra el tejido de tumor prostético y de esta manera, . extremadamente valiosa en el tratamiento del cáncer prostético.

Cáncer de mama El tratamiento corriente de cáncer de mama es la cirugía. Sin embargo, debido a la amplia propagación de las células de cáncer de mama, una gran parte de los pacientes con cáncer de mama no se curan por cirugía local.

Los pacientes con enfermedad no confinada reciben eventualmente terapia de ablación de andrógeno, quimioterapia y/o terapia de radiación. La proporción de muertes anuales del cáncer de mama sin embargo aún permanece relativamente alta. El FGF8 se aisló originalmente de una linea de células de carcinoma mamario de ratón (SC-3) , de la cual se puede inducir la expresión al adicionar andrógeno al medio (Nonomura 1990). La proteína también se conoce que induce la proliferación de éstas así como otras células de mamífero. Recientemente, el ARNm de FGF8b se ha mostrado que está presente en ocho (n=8) líneas celulares de cáncer de mama humano (MDA-MB-231, MDA-MB-415, ZR 75-1, T-47-D, SK-BR-III, PMC-42, HBL-100 y MCF-7) (Tanaka 1995, Payson 1996, Wu 1997, Marsh 1998) . Los ratones transgénicos Wnt-1 infectados con virus de tumor mamario de ratón (MMTV) desarrollaron tumores mamarios. La transcripción de FGF8 se activa en 50% de estos tumores (MacArthur 1995c, Kapoun 1997). Ratones transgénicos que están portando el ADNc de FGF8b bajo el control del promotor de virus de tumor mamario de ratón, muy específico (MMTV) , se muestra que desarrollan espontáneamente tumores mamarios que expresan FGF8b (Coombes, comunicación personal) . Los datos muy recientes muestran que la expresión de FGF8 (b) se regula ascendentemente en el cáncer de mama (Tanaka 1998, Marsh 1999) . Tanaka y colaboradores usaron un nuevo anticuerpo monoclonal de FGF8 en estudios inmunohistoquímicos . Mostraron que el FGF8 estaba presente en 67% (n=12) de los cáncer de mama, y que los receptores de andrógeno estuvieron presentes en 89% de las enfermedades de mama positivas a FGF8 (Hiperplasia, Fibroadenoma, Papiloma intraductal, y cánceres) , que permitiría que el crecimiento autócrino que promueve la asa esté comprendido en el progreso de los cánceres de mama (Tanaka 1998). Usando un método de RT-PCR semi-cuantitativo, se mostró que se encontraron niveles elevados de ARNm de FGF8 en tejidos de mama malignos en comparación a los no malignos. Significativamente, los tejidos más malignos estaban expresando FGF8 (p=0.019) a niveles significativamente mayores (p=0.031) (68 cánceres de mama y 24 tejidos de mama no malignos) (Marsh 1999). Aún no se ha establecido completamente que el FGF8 (b) funcione como un factor de crecimiento autócrino. Sin embargo, el hecho que un gran número de tumores sobre expresen FGF8b argumenta fuertemente que una auto-vacuna contra FGF8b podría ser efectiva contra un gran porcentaje de cánceres de mama y próstata. Los datos reportados por Marsh, Dorkin y Tanaka indican que una auto-vacuna contra FGF8 (b) se podría usar para el tratamiento tanto de cánceres de mama como de próstata, y los datos más bien vagos presentados por Dorkin et al., es un soporte adicional de la opinión que el FGF8 está comprendido en la proliferación de células de cáncer humano.

Descripción de FGF8b El FGF8 corresponde a la familia de factores de crecimiento de fibroblasto (FGF) . Estas proteínas reguladoras de crecimiento son pequeñas proteínas de aproximadamente 200 residuos de aminoácidos que están comprendidas todas en la inducción de la proliferación y diferenciación de un amplio intervalo de células. Para una revisión reciente de la implicación de los factores de crecimiento de fibroblasto en el desarrollo de miembros de vertebrados, ver Johnson 1997. Los miembros de la familia de FGF están relacionados por evolución y comparten 20-50% de identidad de secuencia de aminoácidos. El FGF8b es una variante de unión exon-intron de FGF8, originalmente llamado factor de crecimiento inducido por andrógeno (AIGF) . El AIGF se identificó primero como una proteína segregada por una línea de células derivada de carcinoma mamario murino (SC-3) en la estimulación con andrógeno (Nonomura 1990) . El gen FGF8 murino contiene 6 exones, que codifican potencialmente para ocho diferentes isorformas de FGF8 (FGF8a-h) , diferenciándose solo en la parte N-terminal de las moléculas (Crossley 1995, MacArthur 1995b) . El FGF8 humano tiene la misma estructura génica como el gen murino. Sin embargo, debido a un codón finalizador en el exón IB, el FGF8 humano puede existir posiblemente en cuatro isoformas diferentes específicamente el FGF8a, FGF8b, FGF8e y FGF8f (Gemel 1996) . Las estructuras génicas y las secuencias de aminoácidos de las cuatro isoformas humanas se ilustran en la Figura 5. El FGF8b maduro contiene 193 residuos de aminoácidos y tiene un peso, molecular calculado de 22.5 kDa . La proteína altamente básica contiene 21 residuos de arginina y 14 de lisina dando por resultado un punto isoeléctrico calculado de 10.84 y una carga positiva calculada de 19.8 a pH 7.0. Contiene dos residuos de cisteína, y tiene dos sitios potenciales de N- glicosilación . Debido a la naturaleza de las investigaciones realizadas que comprenden FGF8b muy poco se conoce a cerca de la porción de proteína de FGF8b. Sin embargo, se ha expresado de forma heteróloga de bacterias, se ha purificado mediante el uso de una marca de hexa- histidina C-terminal, y se ha replegado in vitro a un estado soluble y biológicamente activo (MacArthur 1995a, Blunt 1997) .

Actividad biológica de FGF8b Como se menciona con anterioridad, el FGF8 (b) se aisló primero como un factor que se liberó de una línea de células de tumor mamario, de ratón, dependiente de andrógeno, y se ha mostrado que esta proteína puede inducir la proliferación de estas células. Los cambios morfológicos se parecen a aquellos inducidos por la testosterona, que también se conoce que induce la síntesis de ARNm de FGF8 (b) (Tanaka 1992) . La proliferación se puede inhibir por oligos anti-sentido de FGF8 (b) (Nonomura 1990, Tanaka 1992, y Yamanishi 1994) . En realidad, una línea de células de cáncer de próstata humano, DU145, se podría inhibir en crecimiento por la transfección con vira que expresen FGF8b anti-sentido (Rudra-Ganguly 1998) . Los datos recientes muestran que FGF8b induce fosforilación de STAT3; una proteína que se sospecha que está comprendida en la resistencia de la apoptosis (Catlett-Falcone 1999, Johnston, C.L., resultados sin publicar). El FGF8b se ha mostrado, por varios investigadores, muy diferente en la inducción de la transformación de células NIH3T3 ó SC115 células (Miyashita 1994, ouhara 1994, Lorenzi 1995, MacArthur 1995a) . Al usar proteínas recombinantemente expresadas, también se ha mostrado que esta inducción de cambios morfológicos es más eficiente con FGF8b que cuando se usa FGF8a ó FGF8c (MacArthur 1995a, Ghosh 1996) . De manera interesante, la mitad N-terminal de la molécula FGF8b sola, se mostró que es suficiente para la transformación de células NIH3T3, y aún el pequeño péptido especifico de FGF8b (QVTVQSSPNFT) podría permitir que las células crezcan 2-3 veces más tiempo que lo normal en suero al 0.1% (Rudra-Ganguly 1998). Adicionalmente, las células NIH3T3 transíectadas establemente con un vector de expresión que codifica para FGF8b se ha reportado que son muy tumorigénicas cuando se inyectan de forma infraocular en ratones desnudos (Kouhara 1994, Ghosh 1996) . In vivo, se sabe que el FGF8b se expresa en ciertas etapas del desarrollo en vertebrados. En la Tabla 1 se muestra un resumen de los papeles biológicos asignados a FGF8 (b) . Para revisiones en la implicación de FGF8 en el desarrollo de vertebrados ver Goldfarb 1999, y Johnson 1997.

Tabla : Varios sitios/tejidos conocidos que producen el(los) apel(es) biológico(s) propuesto (s ) .

Se cree que FGF8 (b) media su acción a través de la unión a los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) . De manera específica, el FGF8b se sabe que es capaz de activar FGFR2c, FGFR3c, FGFR4c y en algún grado también FGFRlc, pero no FGFRlb, -2b ó -3b (MacArthur 1995b, Blunt 1997) . En el caso de la inducción de la excrescencia de miembros ectópicos de pollo, se implica que FGF10, FGFR2 y FGF8 interactúan y que esto puede ser suficiente para la excrescencia (Kuwana 1997, Xu 1998). Estos resultados soportan la hipótesis que FGF8 (b) puede actuar de una manera auto- y para-crina, conduciendo a la excrescencia normal y moldeo de varias estructuras anatómicas durante el desarrollo de los vertebrados. De manera importante, los ratones de "eliminación total" de FGF8 no sobreviven más probablemente debido a la implicación compleja de la proteina en el desarrollo del embrión .

Homología a otras proteínas Es de importancia significativa predecir si se esperará reactividad cruzada indeseada con otras proteínas accesibles para los anticuerpos, después del tratamiento con una auto-vacuna que induzca anticuerpos específicos de FGF8b. Debido al alto grado de identidad de secuencia entre FGF8b y las otras moléculas de FGF8, se esperará que una auto-vacuna reaccione de forma cruzada con estas proteínas. Sin embargo, esto presumiblemente será ventajoso, puesto que ninguna de estas proteínas se reporta que se expresen : 139 en tejidos o por líneas celulares que no expresen ya FGF8b. Los residuos de aminoácidos 55 hasta 175 de FGF8b muestran un grado relativamente bajo, pero significativo, de identidad de secuencia a los otros FGF. Se acepta 5 comúnmente (y varias veces se prueba) que un grado significativo de identidad de secuencia entre dos dominios de proteína también se refleja en un alto grado de similitud de estructura terciaria. Por lo tanto, los miembros de la familia de FGF se esperan todos en general 10 que sean estructuralmente similares. La estructura tridimensional de FGF2 se ha resuelto de cristales así como en solución (Ago 1991, Zhang 1991, Zhu 1991, Eriksson 1993, Blaber 1996, Moy 1996) . El FGF2 se compone completamente de estructura de beta-lámina, que comprende una repetición 15 de tres pliegues de un beta-laberinto anti-paralelo de cuatro hebras. Esta estructura de beta-barril está totalmente conservada entre interleucina 1, FGF2 (ó FGF básico) , y FGF1 (ó FGF ácido) . El análisis de resonancia magnética nuclear de FGF2 en solución ha mostrado que la 20 parte N-terminal de la molécula forma una estructura relativamente flexible. La parte restante de FGF8b (residuos de aminoácido 1-54 y 176-215) solo muestra un bajo grado de identidad de secuencia a proteínas conocidas. En base a los datos estructurales y de 25 alineación, se asume en general que el núcleo estructural tridimencional de los otros factores de crecimiento de fibroblastos se asemejan cercanamente a aquellos de FGF1 y FGF2. Estas consideraciones estructurales son factores importantes en el diseño de las moléculas de auto-vacuna, mutante de FGF8. De manera importante, · debido al grado relativamente bajo de identidad de secuencia entre FGF8 y cualquiera de los otros miembros de la familia de FGF, la superficie de FGF8 será muy diferente de los otros FGF, reduciendo de este modo al mínimo la reactividad cruzada de los anticuerpos generados por la auto-vacuna de FGF8 con otros miembros de la familia de FGF. Debido al grado relativamente bajo de homología a otras proteínas, que los factores de crecimiento de fibroblastos, no se esperará que una auto-vacuna contra FGF8b reaccione en forma cruzada con cualquier otra proteína. Sin embargo, se debe enfatizar que, una auto-vacuna contra FGF8b probablemente reaccionará en forma cruzada con todas las isoformas de FGF8. Sin embargo, esto presumiblemente no será un problema puesto que ninguna de las isoformas de FGF8 se esperará que se exprese a niveles significativos en el adulto. Aún es posible que esta reacción cruzada será benéfica en el tratamiento de cáncer, puesto que se ha mostrado que al menos algunas líneas de células de cáncer expresan otras isoformas además de la FGF8b.

Distribución en tejido de FGF8b De forma ideal, los auto-anticuerpos inducidos y los mecanismos efectores subsecuentes asi como la respuesta esperada de CTL formulada por la auto-vacunación solo se debe dirigir hacia tejidos que se van a eliminar en el paciente. Por lo tanto, la distribución de tejido del antigeno, que se dirige por una auto-vacuna, es una cuestión de gran importancia con respecto a la seguridad de la vacuna.

Tabla: Expresión de FGF8b en varios tejidos y células Humano Lineas de células de cáncer ( (RT-PCR) Tanata 1995, Payson de mama (MDA-MB-231, DA-MB- 1996, Wu 1997, Marsh 1999) 415, ZR75-1, T-47-D, SK-BR- III, PMC-42, HBL-100, y MCF-7) Tumores de mama ( (mAb) Tanaka 1998, (RT-PCR) Marsh 1999) Tejido de mama normal ((RT-PCR) Wu 1997, Marsh 1999 (mAb) Tanaka 1998) Cáncer de próstata (93%) ( (in situ hyb.) Leung 1996, Dorkin 1999, (mAb) Tanaka 1998) Enfermedad de mama ( (mAb) Tanaka 1998) Células de tumor prostético ( (RT-PCR) Tanaka 1995, Ghosh (LNCaP, PC-3, DU145, y ALVA- 1996, Schmitt 1996) 31) Riñon fetal ( (transferencia northern) Ghosh 1996) Próstata adulta, testículos, ( (RT-PCT) Ghosh 1996, Wu riñon, neuronas 1997, Dorkin 1999) Células de teratocarcinoma ( (RT-PCR) Wu 1997) (Tera-2) Murino Líneas de células de cáncer ( (RT-PCR) Yoshimura 1996) de mama (SC-115, RENCA) Hipotálamo, testículos ( (RT-PCR) Yoshimura 1996) Tumores mamarios (Wnt-1 ( (Transferencia Northern) transgénicos) MacArthur 1995c) Cerebro embriónico ( (in situ hyb.) Crossley 1995, Heikinheimo 1994, Ohuchi 1994, Shimamura 1997, (RT-PCR) Blunt 1997) Ovario, testículos ( (Transferencia Northern) Valve 1997) Desarrollo de brotes de ( (pAb) MacArthur 1995b {in miembros y cara situ hyb.) Heikinheimo 1994, Ohuchi 1994, Crossley 1995) Gástrula ( (in situ hyb.) Crossley 1995) Pollo Cerebro embriónico ( (in situ hyb.) Crossley 1996a) Brotes de miembros en ( (in situ hyb.) Ohuchi desarrollo 1997a, b) Rata Próstata y testículos (RT-PCR) Scmitt 1996 La tabla anterior muestra una amplia selección de la distribución en tejido, y los datos de líneas celulares de la expresión de FGF8b. Como se ve de la tabla, la mayoría de los datos con respecto a la distribución el tejido se generan usando el método sensible de RT-PCR. Esto es debido a que el análisis por transferencia Northern no de detecta ningún ARNm de FGF8b en algunos tejidos normales excepto del riñon fetal. De estos escasos datos, se asume en general que la expresión de ARNm de FGF8b en el adulto es muy limitada, y de esta manera, una auto-vacuna contra FGF8b presumiblemente no será reactiva contra el tejido normal. Debido al hecho que pequeñas cantidades de FGF8b podrían interactuar en sistemas conocidos en el adulto, la distribución en tejido de las proteínas necesitan análisis adicional. Sin embargo, en la presente opinión no existen indicaciones que una auto-vacuna contra FGF8b dará por resultado serios efectos indeseados en los pacientes .

Efectos de anticuerpos contra FGF8b Hasta ahora, no se han publicado intentos para tratar el cáncer de próstata usando anticuerpos monoclonales . Los ensayos clínicos con anticuerpos monoclonales son sin embargo corrientes en los estudios de terapia de cáncer de mama. Los anticuerpos contra FGF8b probablemente bloquearán la interacción entre FGF8b y sus receptores, que inhibirá la irritación de la membrana celular y la proliferación celular, disminuyendo muy probablemente la motilidad e invasión de las células de cáncer. Así pues, la invención también se refiere a modalidades de los métodos descritos en la presente donde, el epítope extraño de células T se introduce en una parte de la secuencia de aminoácidos de FGF8b definida por SEC. ID No. 6, posiciones 1-54 y/o 178-215 y/o 55-58 y/o 63-68 y/o 72-76 y/o 85-91 y/o 95-102 y/o 106-111 y/o 115-120 y/o 128-134 y/o 138-144 y/o 149-154 y/o 158-162 y/o 173-177. Se debe señalar que es especialmente preferido no introducir variaciones o modificaciones en las posiciones 26-45 y en el C-término que inicia en los aminoácidos 186- 215, puesto que estos tramos muestran la menor homología con una proteína recientemente descubierta, la FGF-18, que parece ser expresada en una variedad de tejidos que no son de tumor. Por consiguiente, la invención también se refiere a un análogo de FGF8b humano/murino que es inmunogénico en humanos, el análogo que comprende una parte substancial de todos los epítopes de células B y de CTL, conocidos y previstos del FGF8b y que incluye al menos un epítope TH extraño como se analiza en la presente. Se prefiere que al menos un epítope TH extraño se presente como una inserción en la secuencia de aminoácidos de FGF8b o como una substitución de parte de la secuencia de aminoácidos de FGF8b ' o como el resultado de la supresión de parte de la secuencia de aminoácidos de FGF8b. Los análogos más preferidos en esta modalidad son aquellos donde el epítope de células T extraño se introduce en una parte de la secuencia de aminoácidos FGF8b definida por SEC. ID No. 6, posiciones 1-54 y/o 178-215 y/o 55-58 y/o 63-68 y/o 72-76 y/o 85-91 y/o 95-102 y/o 106-111 y/o 115-120 y/o 128-134 3.46 y/o 138-144 y/o 149-154 y/o 158-162 y/o 173-177.

Mucinas La invención también se refiere a métodos de la invención que emplean versiones especialmente modificadas de las mucinas humanas, y especialmente cualquiera de MUC-1 hasta MUC-4, de manera preferente MUC-1. Los análogos comprenden la siguiente estructura: TR(-S-P-S-(TR)m)n donde TR es una repetición en tándem derivada de la mucina que se presentan de forma natural, P es un epitope TH extraño como se analiza en la presente, S es un péptido separador inerte que tiene de 0 a 15 residuos de aminoácidos, de manera preferente entre 0 y 10 residuos de aminoácidos, y n es un número entero de 1 a 30, y m es un número entero de 1 a 10, de manera preferente de 3 a 5. Cuando se produce este análogo de mucina en por ejemplo, una linea de células humanas o por purificación de un tejido, el resultado directo no tendrá normalmente un patrón de glicosilación como se desea, es decir, un patrón de glicosilación anormal que se asemeja a aquel de una mucina derivada de tumor. Sin embargo, es posible producir el análogo de forma recombinante en por ejemplo E. Coli o por medios sintéticos, y glicosilar subsecuentemente el producto de forma enzimática para lograr un patrón de glicosilación de Tn o S-Tn específico para MUC-1 expresada en tumores. De manera alternativa, el polipéptido se puede preparar en una línea de células de mamífero o en una línea de células de insecto, por ejemplo, células de Drosophila, que carece de la enzima pertinente o al expresar la proteína de forma intracelular (al omitir un péptido de señal de secreción) donde no se presente la glicosilación.

Vectores y fragmentos de ácido nucleico de la invención Se apreciará a partir de la descripción anterior que se pueden preparar análogos por medio de la tecnología génica recombinante, pero también por medio de síntesis química o semi-síntesis; estas dos últimas opciones son especialmente pertinentes cuando la modificación consiste en el acoplamiento a portadores de proteína (tal como KLH, toxoide de difteria, toxoide de tétano, y BSA) y moléculas no proteínicas tal como polímeros de carbohidrato y por supuesto también cuando la modificación comprende la adición de cadenas laterales o grupos laterales a una cadena peptídica derivada de polipéptido. Para el propósito de la tecnología génica recombinante, y por supuesto también para el propósito de la inmunización de ácido nucleico, los fragmentos de ácido nucleico que codifican para las regiones epitópicas necesarias y los análogos son productos químicos importantes. Por lo tanto, una parte importante de la invención se refiere a un fragmento de ácido nucleico que codifica para un análogo . descrito anteriormente de cualquiera de los polipéptidos especificos de tumor, pertinentes, de manera preferente un polipéptido en donde se ha introducido un epitope de células TH extraño por medio de la inserción y/o adición, de manera preferente por medio de la substitución y/o supresión. Los fragmentos de ácido nucleico de la invención son ya sea fragmentos de ADN o ARN. Los fragmentos de ácido nucleico de la invención normalmente se insertarán en vectores adecuados para formar vectores de clonación o expresión que tienen los fragmentos de ácido nucleico de la invención; estos nuevos vectores también son parte de la invención. Los detalles con respecto a la construcción de estos vectores de la invención se analizarán en el contexto de células transformadas y microorganismos, de manera posterior. Los vectores pueden estar en la forma de, dependiendo del propósito y tipo de aplicación, de plásmidos, fagos, cósmidos, mini-cromosomas, o virus, pero también ADN desnudo que se expresa solo de forma transiente en ciertas células, es un vector importante. Los vectores de clonación y expresión preferidos de la invención son capaces de la replicación autónoma, permitiendo de este modo altos números de copia para los propósitos de la expresión a alto nivel o la replicación a alto nivel para la clonación subsecuente . El perfil general de un vector de la invención comprende las siguientes características en la dirección 5'?3' y un enlace operable: un promotor para impulsar la expresión del fragmento de ácido nucleico de la invención, opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido guía que permite la secreción de, o la integración en la membrana del, fragmento polipeptídico, el fragmento de ácido nucleico de la invención, y una secuencia de ácido nucleico que codifica para un terminador. Cuando se opera con los vectores de expresión en cepas productoras o líneas celulares, es para los propósitos de la estabilidad genética de la célula transformada, preferible que el vector cuando se introduzca en una célula hospedadora se integre en el genoma de la célula hospedadora. En contraste, cuando se trabaja con vectores que se van a usar para efectuar la expresión in vivo en un animal (es decir, cuando se usa el vector en una vacunación de ADN, es por razones de seguridad preferido que el vector no sea capaz de ser integrado en el genoma de la célula hospedadora; típicamente, ADN desnudo o vectores ' · fií 'i'i'"irt -nái^iitr virales no integrantes son los que se usan, las selecciones de los cuales son bien conocidas por la persona experta en la técnica. Los vectorés de la invención se usan para transformar células hospedadoras para producir el análogo de la invención. Estas células transformadas, que también son parte de la invención, pueden ser células cultivadas o lineas celulares usadas para la propagación de los fragmentos de ácido nucleico y vectores de la invención, usados para la producción recombinante de los análogos de la invención. De manera alternativa, las células transformadas pueden ser cepas de vacuna, vivas, adecuadas en donde el fragmento de ácido nucleico (una copia individual o múltiples copias) se ha insertado para efectuar la secreción o integración en la membrana bacteriana o pared celular del análogo. Las células transformadas, preferidas de la invención son microorganismos tal como bacterias (tal como las . especies Escherichia [por ejemplo E. Coli], Bacillus [por ejemplo, Bacillus subtilis], Salmonella, o Mycobacterium [de manera preferente no patógenos, por ejemplo M. bovis BCG] ) , levaduras (tal como Saccharomyces cerevisiae) , y protozoarios . De manera alternativa, las células transformadas se derivan de un organismo multicelular tal como un mango, una célula de insecto, una célula vegetal, una célula de mamífero. Las más preferidas son células derivadas de un ser humano, por ejemplo, comparar el análisis de las líneas celulares y vectores posterior . Para los propósitos de clonación y/o expresión optimizada, se prefiere que la célula transformada sea capaz de replicar el fragmento de ácido nucleico de la invención. Las células que expresan el fragmento nucleico son modalidades útiles, preferidas de la invención; se pueden usar para la preparación a pequeña escala o gran escala del análogo, o, en el caso de bacterias no patógenas, como constituyentes de vacuna en una vacuna viva. Cuando se produce el análogo de la invención por medio de las células transformadas, es conveniente, aunque menos esencial que el producto de expresión ya sea se exporte en el medio de cultivo o se porte en la superficie de la célula transformada. Cuando se ha identificado una célula productora, efectiva, se prefiere, en base a la misma, establecer una línea de células estables que tengan el vector de la invención y que expresen el fragmento de ácido nucleico que codifica para el análogo. De manera preferente, esta línea de células estables segrega y obtiene el análogo de la invención, facilitando de este modo la purificación del 1S2 mismo . En general, los vectores de plásmido que contienen el replicón y secuencias de control que se derivan de especies compatibles con la célula hospedadora se usan en unión con los hospedadores . El vector tiene ordinariamente un sitio de replicación, asi como secuencias de marcado que son capaces de proporcionar la selección fenotipicas en células transformadas. Por ejemplo, E. Coli se transforma típicamente usando pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. Coli (ver, por ejemplo, Bolívar et al., 1977). El plásmido pBR322 contiene genes para la resistencia a ampicilina y tetraciclina y de esta manera proporciona un medio fácil para identificar las células transformadas. El plásmido pBR, u otro plásmido microbiano o fago, también debe contener, o se modifica para contener, promotores que se pueden usar por el microorganismo procariótico para la expresión. Aquellos promotores usados más comúnmente en la construcción de ADN recombinante incluyen los sistemas promotores de B-lactamasa ( (penicilinasa) y lactosa (Chang et al., 1978; Itakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979) y un sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel et al., 1979; EP-A-0 03.6 776) . En tanto que estos son los más comúnmente usados, se han descubierto y utilizado otros promotores microbianos, y los detalles con respecto a sus secuencias de nucleótidos se han publicado, permitiendo que un experto los ligue funcionalmente con los vectores de plásmido (Siebwenlist et al., 1980). Ciertos genes de las procariotas se pueden expresar de manera eficiente en E. Coli de sus propias secuencias promotoras, previniendo la necesidad de la adición de otro promotor por medios artificiales . Además de las procariotas, los microbios eucarióticos, tal como los cultivos de levadura también se pueden usar, y aquí, el promotor debe ser capaz de impulsar la expresión. La Saccharomyces cerevisiase, o la levadura común de pan es la más comúnmente usada entre los microorganismos eucarióticos, aunque varias otras cepas están comúnmente disponibles tal como Pichia pastoris. Para la expresión en Saccharomyces, el plásmido YRp7, por ejemplo, se usa comúnmente (Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980). Este plásmido contiene ya el gen trpl que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptofano, por ejemplo, ATCC No. 44076 ó PEP4-1 (Jones, 1977). La presencia de la lesión trpl como una característica del genoma de la célula hospedadora de levadura, entonces proporciona un ambiente efectivo para la detección de la transformación por el crecimiento en la ausencia de triptofano . Las secuencias promotoras adecuadas en vectores de levadura incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato-cinasa (Hitzman et al., 1980) u otras enzimas glicoliticas (Hess et al., 1968; Holland et al., 1978), tal como enalosa, gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato-descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato-isomerasa, 3-fosfoglicerato-mutasa, piruvato-cinasa, triosefosfato-isomerasa, fosfoglucosa-isomerasa y glucocinasa. En la construcción de plásmidos de expresión , adecuados, las secuencias de terminación asociadas con estos genes también se ligan en el vector de expresión 3' de la secuencia deseada para ser expresada para proporcionar la poliadenilación del ARNm y terminación. Otros promotores, que tienen la ventaja adicional de la trascripción controlada por las condiciones de crecimiento son las región promotora para la alcohol-deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradantes asociadas con el metabolismo de nitrógeno y la gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa mencionada con anterioridad, y enzimas responsables para la utilización de maltosa y galactosa. Es adecuado cualquier vector de plásmido que contenga un promotor compatible con levadura, origen de replicación y secuencias de terminación.

Además de los microorganismos, también se pueden usar como hospedadores los cultivos de células derivadas de organismos multicelulares. En principio, se puede trabajar cualquier cultivo celular, ya sea de cultivo vertebrado o invertebrado. Sin embargo, el interés ha sido mayor en células de vertebrados, y la propagación del vertebrado en cultivo (cultivo de tejido) ha llega a ser un procedimiento de rutina en años recientes (Tissue Culture, 1973) . Los ejemplos de estas líneas celulares hospedadoras útiles son células VERO y HeLa, líneas de células de ovario de hámster Chino (CHO) , y líneas de células W138, BHK, COS-7 293 y MDCK. Los vectores de expresión para estas células incluyen de forma ordinaria (si es necesario) , un origen de replicación, un promotor localizado enfrente del gen que se va a expresar, junto con cualquier sitio de unión de ribosoma necesario, sitios de unión de exon-intron de ARN, sitio de poliadenilación y secuencias terminadoras transcripcionales . Para el uso en células de mamífero, las funciones de control en los vectores de expresión se proporcionan frecuentemente para material viral. Por ejemplo, los promotores comúnmente usados se derivan de polioma, adenovirus 2, y de manera más frecuente virus de simio 40 (SV40) . Los promotores temprano y tardío del virus SV40 son particularmente útiles debido a que se obtienen ambos fácilmente del virus como un fragmento que también contiene el origen de replicacion viral de SV40 (Fiers et al., 1978) . Los fragmentos más largos c más pequeños de SV40 también se pueden usar, con la condición de que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio HindIII hacia el sitio Bgll localizado en el origen de replicacion viral. Adicionalmente, también es posible, y frecuentemente deseable, utilizar las secuencias promotoras o de control asociadas normalmente con la secuencia génica deseada, con la condición de que estas secuencias de control sean compatibles con los sistemas de células hospedadoras . Se puede proporcionar un origen de replicacion ya sea por construcción del vector para incluir un origen exógeno, tal como se puede derivar de SV40 u otro viral (por ejemplo, Polioma, Adeno, VSV, BPV) o se puede proporcionar por el mecanismo de replicacion cromosómica de la célula hospedadora. Si el vector se integra en el cromosoma de la célula hospedadora, este último es suficiente de forma frecuente.

Composiciones de la invención La invención también se refiere a una composición inmunogénica que comprende, como un agente inmunogénico efectivo, al menos uno de los análogos descritos en la presente en mezcla con un portador farmacéuticamente e inmunológicamente aceptable, vehículo, diluyente o excipiente, y opcionalmente un adyuvante, comparar también la discusión de estas entidades en la descripción del método de la invención anterior. Adicionalmente, la invención también se refiere a una composición para inducir la producción de anticuerpos contra cualquiera de los antígenos de tumor analizados anteriormente, la composición comprende: - un fragmento de ácido nucleico o un vector de la invención, y un diluyente farmacéuticamente e inmunológicamente aceptable y/o vehículo y/o portador y/o excipiente y/o adyuvante. La formulación y otras cuestiones específicas con respecto a estas composiciones se analizan en la sección pertinente con respecto a la inmunización de ácido nucleico anterior.

EJEMPLO 1 Vacunación contra PSM En lo siguiente, se describirá cómo se puede desarrollar una auto-vacuna humana contra PSM a través de la modificación de la molécula por inserción de uno o más epitopes de célula T, extraño, promiscuo, para revelar un panel de moléculas de PSM inmunogenizadas . Las construcciones se probarán para su capacidades para inducir respuestas especificas de CTL contra células de tumor que tienen PSM. Adicionalmente, las construcciones se preparan para su capacidad para inducir anticuerpos que son reactivos en forma cruzada con las partes nativas de la molécula de PSM. Subsecuentemente, en varios ensayos in vitro y modelos de animal in vivo, se valora la eficacia de las diferentes construcciones. Los anticuerpos inducidos se probarán por su capacidad para activar el complemento via la ruta clásica y para iniciar el ADCC via los receptores Fe. Finalmente, se probarán las diferentes moléculas en modelos de animal de cáncer de próstata humano.

Estrategia en el diseño de una auto-vacuna de FSM De manera breve, el plan de vacunación de PSM conlleva las siguientes tareas experimentales.

Diseño y producción de un panel de mutantes de PSM humanos - Clonación de las secuencias de PSM de humano y rata/ratón - Trabajo de mutación para generar moléculas inmunogenizadas de hPSM - Expresión de las moléculas hPSM tipo silvestre e inmunogenizadas en E. Coli y/o Plchia pastoris y/o células de mamífero y/o células de insecto (tal como la línea de células S2) . - Purificación, repliegue y caracterización de las moléculas hPSM inmunogenizadas.

Vacunación de ADN contra PSM - Generación de vectores de vacunación de ADN para hPSM que codifican para moléculas de hPSM inmunogenizadas . - Prueba de los vectores de vacunación de hPSM en experimentos in vitro e in vivo- Selección de candidatos de hPSM - Inmunizaciones de ratones/cone os - ELISA - Análisis por FACS . - En el caso de respuestas de anticuerpo: ensayo proliferativo de células de tumor - Ensayo de células de T Prueba de imitantes de hPSM in vivo - Modelo de tumor sólido/metástasis en ratones Estudio conceptual: Inducción de CTL por auto-vacunación - Construcción de PSM de ratón/rata inmunogenizada que corresponde a los candidatos seleccionados de hPSM (por ejemplo, en la forma de vacunas de ADN) - Prueba de la respuesta inmunitaria formulada por mutantes de PSM de ratón/rata en ensayos in vitro: ensayos inmunoquimicos, ELISA, análisis por FACS, ensayos celulares, lisis de complemento de células que tienen PSM, ensayos de ADDCC, ensayo de actividad de CTL, ensayo proliferativo de células de tumor, ensayos de presentación de células T. - Prueba de los mutantes de mPSM in vivo en un modelo de tumor sólido/metástasis en ratones.

Nomenclatura de las construcciones de hPSM La PSM es una proteina de membrana tipo II de 750 aminoácidos, comparar SEC. ID No. 2 que expone la secuencia tipo silvestre con la excepción que Gly substituye a Trp en la posición 2 debido a la introducción de un sitio Ncol y una secuencia Kozak en SEC. ID No. 1, donde ggt substituye a tgg en las posiciones 4-6. Sin embargo, la PSM nativa (es decir, la PSM que tiene un Trp en la posición 2) í también se ha usado para algunas construcciones de auto-vacuna basadas en PSM humana.

En la PSM, la parte extracelular construye los 707 aminoácidos C-terminales, en tanto que el dominio citoplasmático se predice que sea de 19 aminoácidos de largo y la parte de transmembrana de la proteina consiste de 24 aminoácidos (aa 20-43) . Como punto de inicio para las construcciones, también se ha usado la variante de unión de exón-intrón, PSM' . Nuestra versión de esta variante de unión tiene la secuencia de aminoácidos que corresponde a los residuos 58-750 en SEC. ID No. 2. Para facilidad de nomenclatura, las regiones en PSM' se numeran de acuerdo a la numeración en PSM (queriendo decir que por ejemplo, la región 2 consiste de los aminoácidos 87-108 en PSM y los aminoácido 30-51 en PSM' ) , comparar también el análisis posterior de las regiones. Todas las construcciones genéticas de la PSM humana se designan hPSM (o hPSM' si PSM' se usa como un punto de inicio, donde la primera— es la región de inserción usada para la inserción de P2, y el segundo — es la región de inserción usada para P30. Si no está presente P2 ó P30 en la proteina, se designa el número 0 (cero) . La hPSM tipo silvestre de longitud completa se designa hPSM 0.0 y la hPSM tipo silvestre que carece de las partes citoplasmáticas y de transmembrana se designa hPSM÷0.0. Los 13 genes de hPSM inmunogenizados, planeados que contienen todos un epitope P2 y un epitope P30 se llamarán hPSMl.l, PSM6.1, hPSM8.1, hPSMIO.l, hPSM1.6, hPSM1.8, hPSMl.10, hPSM1.2, hPSM1.3, hPSM1.5, hPSM2.1, hPSM3.1, hPSM10.3, hPSM6.3, hPSM'10.3, hPS '6.3, hPSM8.3, hPSM' 8.3 y hPSM5.1, comparar detalles posteriormente. En hPSMl.l, ambos epitopes P2 y P30 se insertan en tándem en la región de inserción numero 1 (la región que abarca la membrana. Teóricamente, este mutante, hPSMl.l, se puede considerar un candidato de vacuna muy atractivo para inducción de producción de anticuerpos, debido a que el dominio extracelular completo de esta vacuna está intacto. Para la inducción de respuestas de CTL usando la inmunización de ácido nucleico, las construcciones tal como hPSM10.3 y hPSM6.3 se consideran útiles. A fin de facilitar los procedimientos de clonación y mutagénesis, mucho del trabajo de construcción molecular se hace usando ya sea la parte N-terminal (aminoácidos 1-436) o la C-terminal (aminoácidos 437-750) del gen hPSM como material de inicio. Estas dos partes del gen hPSM se desginan hPSMI y hPSMII- , respectivamente, donde el primer — es la región de inserción usada para la inserción de P2, y el segundo — es la región de inserción usada para P30. Nuevamente, si no está presente P2 ó P30 en al proteína, se designa el número 0 (cero) y los tipos silvestres se llaman hPSMIO.O y hPSMIIO.O, respectivamente. Una variante especial de hPSMIO.O sin la parte citoplasmática de hPSM se designa hPSMI÷0.0. Prácticamente, la mayoría del trabajo de mutagénesis se hace usando hPSMIO.O y hPSMIIO.O como material de inicio. Las proteínas mutantes de hPSM expresadas se designarán PROS , donde el primer — es la región usada para la inserción de P2, y el segundo — es la región de inserción usada para P30. Si no está presente P2 ó P30 en la proteína, se designa el número 0 (cero) . La hPSM tipo silvestre se designa PROS0.0. El PROSIIO.O es el producto de proteína de los aminoácidos 437-750 de hPSM. Las proteínas marcadas de HIS se llaman HIS-PROS . Puesto que las marcas de His se han usado, la SEC. ID No. 21 para la expresión en levaduras y bacterias, en tanto que SEC. ID No. 23 se ha usado para la expresión en células de mamífero .

Clonación de la secuencia de PSM humana La línea de células LNCaP que se origina de una lesión metastática del adenocarcinoma prostático humano se compró de la American Type Culture Collection (ATCC) . El ARNm se aisló de esta línea de celular y se transcribió en forma invertida usando un equipo normal a fin de obtener el ADNc que codifica para la secuencia de PSM humana. Usando diferentes conjuntos de cebadores específicos de hPSM, los productos de PCR que codifican para PSM (437-750) se obtienen y se clonan adicionalmente en pUcl9 (número de plásmido pMR300) y se verifican por la secuenciación de ADN. Está parte C-terminal del PSM tipo silvestre se designa hPSM partell (hPSMIIO.O). De manera similar, la parte I de hPSM tipo silvestre (hPSMIO.O se ha clonado en pUcl9 usando cebadores para amplificar la parte I tanto con (hPSMIO.O) y sin (hPSMI÷0.0) los dominios de transmembrana+citoplasmáticos . Los clones se secuenciaron por control y hPSMIO.O y hPSMIIO.O se fusionaron usando ligación en el sitio EcoRI . Los clones resultantes de hPSMO .0 (SEC. ID No: 2) y hPSM÷0.0 se han subclonado en varios vectores de expresión pro- y eu-carióticos y nuevamente se verificó la secuencia. La forma intracelularmente expresada de PSM humana (designada hPSM' - aminoácidos 58-750 de SEC. ID No: 2) también se ha construido usando el ADNc como material de inicio. Esta secuencia también se ha subclonado en vectores de expresión de mamífero y se ha usado como material de inicio para algunas construcciones de auto-vacuna de hPSM, por ejemplo, hPSM'10.3 y hPSM'6.3.

Clonación de las secuencias de FSM de rata y ratón Se compraron dos clones EST (marca de secuencia expresadas) que contienen las secuencia de ADNc de PSM (de riñón murino fetal y macrófagos murinos, respectivamente) de la American Type Culture Collection (ATCC) . Conjuntamente, estas EST cubrieron la secuencia de ADNc de PSM de ratón, y de esta manera se subclonaron tanto la PSM de ratón de longitud completa (SEC. ID No: 7 y 8) asi como la PSM' murina (SEC. ID No: 9 y 10) en vectores bacterianos y vectores de expresión de mamífero. Las construcciones de Auto-Vacunación de PSM murina también se han elaborado por inserción de P30 en el ADNc de PSM de ratón.

Expresión de hPSM tipo silvestre en E. Coli La parte C-terminal (aminoácidos 437-750) de hPSM, hPSMIIO.O, se ha clonado en el vector de expresión bacteriano pET28b a fine obtener un producto con la extremidad de poli-histidina N-terminal (HIS) que facilita una fácil purificación a gran escala y la identificación con anticuerpos anti-poli-HIS . El producto de proteína de hPSMIIO.O marcado con poli-HIS (producto de proteína designado HIS-PROSII0.0) se expresó en E. Coli. El ADN que codifica para la PSM humana tipo silvestre truncada, hPSM÷cyt0.0 también se ha expresado de pET28b en la cepa de E. Coli BL21 (DE3) donde el producto de expresión se localiza en los cuerpos de inclusión. Los análisis de SDS-PAGE del lisado bacteriano mostraron un producto con la migración esperada y la transferencia Western con PROSIIO.O anti-HIS de conejo también dio la banda esperada. Adicionalmente, la secuenciación N-terminal de cinco aminoácidos de este producto eluido de un gel de SDS-PAGE da la secuencia de aminoácidos esperada. La construcción de hPSM tipo silvestre, hPSMO.O, hPSM÷0.0 (asi como los dos mutantes de hPSM, hPSMl .1 y hPSMM6.1, ver posteriormente) se han clonado en diferentes vectores de expresión de E. Coli a fin de permitir una expresión más eficiente y algún grado de repliegue de las proteínas recombinantes en E. Coli. Los sistemas de expresión elegidos son: pMCT6 que genera versiones N-terminalmente marcadas con His de las proteínas recombinantes, expresadas, pGH433 que expresa las proteínas recombinantes en unión a una secuencia guía pelB de 22 aminoácidos que debe dirigir la proteína al espacio periplasmático de la bacteria de E. Coli, y pMal-p2 en la cual las proteínas recombinantes se expresan como fusiones C-terminales a la proteína de unión de maltosa (MBP) que contiene la secuencia guía periplasmática MBP natural. Los anticuerpos contra MBP se pueden usar para la detección de las proteínas de fusión y. se puede usar una columna acoplada a carbohidrato para la purificación por afinidad del producto. Sin embargo, los experimentos de expresión de E. Coli de las proteínas hPSM tipo silvestre de estos vectores solo mostraron un nivel de expresión aceptable de pMCT6. Los problemas de obtener la expresión periplasmática de las proteínas hPSM tipo silvestre' aún no se solucionan en la actualidad.

Expresión de hPSM tipo silvestre en Pichia pastoría Debido al peso molecular relativamente alto de la proteína PSM y su relativamente alto grado de glicosilacion (aproximadamente 16% del peso molecular) y a fin de facilitar la purificación mediante la eliminación del paso de repliegue, se ha decidido implementar tecnología alternativa para la expresión eucariótica de las proteínas recombinantes . Se han evaluado varios sistemas de expresión eucarióticos , bien caracterizados, y para la selección inicial de mutantes de hPSM, la levadura Pichia pastoris se ha elegido como alternativa a la expresión de E. coli. Un sistema de expresión basado en la levadura Pichia Pastoris se ha aplicado en las construcciones de PSM. · El patrón de glicosilacion de las proteínas recombinantes expresadas en este organismo se espera que se asemeje a los patrones de glicosilación de mamífero más que por ejemplo Saccharomyces cerevisiae debido a una menor manosilación ramificada de la proteína recombinante . Se ha mostrado que la captación mediada por el receptor de mañosa de los antígenos por células dendríticas da por resultado una presentación más eficiente por aproximadamente 100 veces a las células T en comparación a la captación endocitosada de fase influida. Por lo tanto, la manosilación puede jugar un papel para la antigenicidad (y especialmente la capacidad para inducir respuestas de CTL) de los mutantes de hPSM y otros antígenos contra los cuales es deseable una respuesta de CTL. Se ha comprado de Invitrogen una cepa de Pichia pastoris así como dos diferentes vectores de expresión. El vector pPICZaA tiene un promotor inducíble por metanol en la dirección 5' del sitio de policlonación, en tanto que el vector pGAPZaA expresa proteínas de forma constitutiva. Ambos vectores codifican para la señal de secreción del factor a a fin de exportar las proteínas recombinantes al medio. El sistema de selección de estos vectores es la resistencia a zeolina. Las secuencias que codifican para hPSMO.O, y hPSM÷0.0, así como un mutante de hPSM, hPSMl.l, comparar posteriormente) se subclonaron en estos vectores (en cuadro con un epítope de identificación c-myc C-terminal, SEC. ID No: 27).

Cuatro cepas de Pichia pastoris (X-33, SMD1168, GS115 y 71) que difieren por ejemplo en sus requerimientos de crecimiento se transformaron con cada uno de estos plásmidos (linealizados) usando electroporación . El procedimiento de transformación se repitió varias veces con cambios menores a fin de obtener un gran número de clones resistentes a zeocina. La expresión de hPSM÷0.0 tipo silvestre (asi como hPSMl.l, ver posteriormente) se obtuvo en el sistema de Pichia pastoris. Los productos expresados se pueden detectar en la transferencia Western de lisados de transformante de Pichia pastoris usando tanto un anticuerpo monoclonal anti-hPSM como un anticuerpo monoclonal anti-c-myc como el primario. Sin embargo, los productos recombinantes fueron detectados de forma intracelular .

Expresión de hPSM tipo silvestre en células de mamífero. Un sistema de expresión que usa células CHO (de ovario de hámster Chino) también se implementará para la prueba final y producción de moléculas seleccionadas. Hasta ahora, las células CHO se han transfectado con hPSM tipo silvestre y hPSMl.l con/sin secuencias guia en cuadro en el vector de expresión de mamífero, pcADN3.1. Se han obtenido células resistentes a geneticina. En las células COS, transfectadas transcientemente con las mismas construcciones, tanto hPSMO .0 como hPSMl.l se detectó en la transferencia Western de sedimentos celulares usando un anticuerpo monoclonal anti-hPSM.

Distribución en tejido de hPSM Se ha comprado un equipo comercial a fin de determinar si la expresión de hPSM ' se puede detectar en varios tejidos humanos incluyendo próstata, sangre y cerebro. El método se basa en una detección de transferencia en mancha de ARNm que contienen poliA extraído de 50 diferentes tejidos humanos. Los resultados preliminares no indican hiperexpresión de hPSM en tejidos tal como cerebro o sangre. Sin embargo, después de la fecha de prioridad de la presente solicitud, otros han demostrado la presencia de PSM en otros tejidos, comparar, anteriormente .

Diseño de los mutantes de hPSM Cuando se diseña, el trabajo de mutación en PSM, algunas regiones de la proteína son muy importantes para conservar en las construcciones modificadas, por ejemplo, epítope de células T, potenciales e identificados, epítopes de células B y residuos de cisteína de puente de disulfuro. Por lo tanto, estas regiones "prohibida" se han identificado dentro de la secuencia de PSM dejando un número limitado de regiones "abierta" de 20 aminoácido o más disponibles para el intercambio con los epitopes P2 y/o P30 auxiliares T extraños. Por definición, la región de transmembrana también se considera una región "abierta" puesto que los auto-anticuerpos dirigidos contra esta región son ajenos y la eliminación de esta secuencia se cree que mejora la solubilidad de las proteínas de PSM mutadas pero no se puede excluir que esta región contenga importantes epitopes de CTL, por lo tanto, la conservación de la región de transmembrana en por ejemplo hPSM10.3. De acuerdo a la presente expectación que la autovacuna inducirá una respuesta de CTL, será importante identificar y conservar los epitopes de CTL potencialmente subdominantes en las construcciones. Estos dos epitopes se conocen ya de la literatura: 1) el péptido que comprende los aminoácidos 4-12 de PSM (LLHETDSAV) se pueden presentar en la molécula de la clase I de MHC humana, HLA-A2.1 (Tjoa 1996), y 2) la PSM(711-719) (ALFDIESKV) también se une a HLA-A2.1 (ref 25). También se ha buscado la secuencia de aminoácidos de PSM a fin de identificar los residuos de ancla primarios de las porciones de unión de la clase I de HLA como se describe por Rammensee et al., (Rammensee, 1995) para los tipos de la clase I de HLA más abundantes (HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A23, HLA-A24 y HLA-A28), que constituyen conjuntamente el 80% de los tipos HLA-A de la población humana. Igualmente, los epitopes HLA-B y HLA-C potenciales se han identificado y designado como áreas "prohibidas". Debido a que la intención inicial fue usar ratones híbridos C57/negrox SJL Fl en este caso se decidió usar ratones transgénicos para probar las construcciones de auto-vacunas de PSM, se han identificado ciertos epitopes auxiliares T H-2b y H-23, de ratón, potenciales y se consideraron regiones "prohibidas" (Rammensee 1995) . También es importante conservar las regiones de unión de anticuerpo, conocidos en la molécula de PSM, debido a que podrían ser importantes en la inducción de auto-anticuerpos anti-PSM, específicos. Cinco de estas regiones se han descrito ya: PSM(63-68), PSM ( 132-137 ) , PSM(482-487) (WQ 94/09820), PSM(716-723) y PSM (1-7) (Murphy, 1996) . Usando el método de Hopp y Woods basado en computadora para la predicción de determinantes antigénicos, se predicen cinco regiones: PSM(63-69), PSM(183-191) , PSM(404-414) , PSM(479-486) y PSM(716-723) (Hopp 1983) , algunas de éstas que traslapan los epitopes de células B, experimentalmente encontrados. Estas regiones también se conservarán en las moléculas candidatas de vacuna de PSM. La proteína de PSM contiene 4 residuos de cisteína (posiciones de aminoácido 22, 196, 466 y 597) que se conservarán en las construcciones inmunogenizadas debido a su importancia potencial en la formación de puentes de disulfuro . En base a las regiones "prohibidas" y "abiertas" mencionadas con anterioridad en la proteina hPSM, se identificaron 10 regiones adecuadas para la inserción de epitopes auxiliares T extraños.

Regiones de inserción en hPSMI (del sitio de iniciación al sitio EcoRI, aa 1-437) : Región 1: aa 16-52 en PSM (4 aa que precede a TM, TM (24 aa) y 9 aa después de TM = 37 aa) .

Región 2: aa .87-108 en PSM, aa 30-51 en PSM' (22 aa) Región 3: aa 210-230 en PSM, aa 153-173 en PSM' (21 aa) Región 4: aa 269-289 en PSM, aa 212-232 en PSM' (21 aa) Región 5: aa 298-324 en PSM, aa 241-267 en PSM' (27 aa) .

Regiones de inserción en hPSMII (desde el sitio EcoRI al sitio de terminación, aa 437-750) Región 6: aa 442-465 en PSM, aa 385-408 en PSM' (24 aa) Región 7: aa 488-514 en PSM, aa 431-457 en PSM' (27 aa) Región 8: aa 598-630 en PSM, aa 541-573 en PSM' (33 aa) Región 9: aa 643-662 en PSM, aa 586-605 en PSM' (20 aa) Región 10: aa 672-699 en PSM, aa 615-642 en PSM' (28 aa) Las regiones de inserción asi como las regiones "prohibidas" se representan gráficamente en la Figura 4.

Varias construcciones de PSM inmunogenizadas, diferentes se elaborarán por substitución de un segmento de aminoácidos de dos de las regiones de inserción listadas anteriormente con P2 ó P30. Cada pro eína mutante contendrá de esta manera tanto P2 como P30, aunque estas construcciones sólo son de ejemplo, también los mutantes individuales están dentro del alcance de la presente invención. De forma experimental, las mutaciones se harán en clones del ADNc de hPSMI y hPSMII, respectivamente, y las dos partes mutadas se combinarán subsecuentemente por ligación (en el sitio EcoRI) . Los epitopes P2 y P30 se han insertado inicialmente en las regiones de inserción 1, 2, 3, 5, 6, 8 y 10 a fin de crear los matantes. Las secuencias de P2 y P30 son: P2: QYIKANSKFIGITEL (SEC. ID No: 12, 15 aa) , en este caso codificada por la secuencia de nucleótidos cag tac ate aaa gct aac tec aaa ttc ate ggt ate acc gag ctg (SEC. ID No: 11, 45 nucleótidos), donde la secuencia en negritas es un sitio SacI . Pueden presentarse otras elecciones de codon, dependiendo de la elección del vector de clonación y el sistema de expresión, dependiendo de la elección del vector de clonación y el sistema de expresión. P30: FN'NFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEC. ID No. 14, 21 aa) , en este caso codificado por la secuencia de nucleótidos ttc aac aac ttc acc gta age ttc tgg ctg cgt gtt ceg aaa gtt age gCT AGC CAC ctg gaa (SEC. ID No. 13, 63 nucleótidos), donde en negritas indica un sitio HindIII, el subrayado individual indica un sitio Eco47III, las letras mayúsculas indican un sitio BstNI, y el doble subrayado indica un sitio Nhel. La siguiente tabla resume las construcciones de PSM humanas, usadas en la presente: Construcciones moleculares de los mutantes de hPSM Las mutaciones para insertar secuencias de codificación P2 y P30 se han realizado usando tanto hPSMIO.O y hPSMIIO.O como material de inicio. A fin de generar una mayoría de los mutantes de hPSM, P2 y P3 se insertaron inicialmente en hPSMIO.O en la posición de inserción 1. El material resultante (hPSMIl.O y hPSMIO.l, respectivamente), se usó subsecuentemente como material de inicio para mutagénesis para insertar P2 y P30 en las posiciones 2, 3 y 5 y para ligación con hPSMII mutado en el epítope. El hPSMIl.O se construyó usando PCR de SOE (extensión de traslape individual) y se verificó subsecuentemente en la secuencia. hPSMIO.l se construyó usando la técnica de "cambio rápido" y se verificó subsecuentemente en la secuencia. El epítope P2 se insertó en las posiciones 2, 3 y 5 de hPSMIl.O usando SOE-PCR para crear hPSMIl.2, hPSMI1.3 y hPSMI1.5. Estas construcciones se combinaron con hPSMIIO.O para crear hPSM1.2, hPSM1.3 y hPSM1.5. Se construyeron hPSMl2.1, hPSMl3.1 y hPSMI5.1 POR soe-pcr USANDO hPSMIO.l como material de inicio. Este material se ha ensamblado con hPSMIIO.O por ligación en el sitio EcoRI a fin de crear los mutantes de longitud completa, hPSM2.1, hPSM3.1 y hPSM5.1.

El epitope P2 se insertó en tres diferentes posiciones de hPSMIIO.O a fin de crear hPSMII6.0, hPS II8.0 y hPSMIIIO.O usando la técnica de "cambio rápido", y estos clones se verificaron subsecuentemente en la secuencia. Subsecuentemente, hPSMlO.l se ligó con hPSMH6.0, hPSMII8.0 y hPSMIIHO.O para obtener hPSM6.1 hPSM8.1 y hPSMlO.l, y los clones se verificaron en la secuencia. La inserción del epitope P30 en hPSMII se está haciendo actualmente para generar hPSMHO.6, hPSMII0.8 y hPSMIIO.10 usando SOE-PCR. Se construyó hPSMl.l usando dos mutaciones de PCR de dos pasos seguido por la ligación en un sitio HindIII dentro de la secuencia del epitope. La construcción de longitud completa se verifica en secuencia. HPSM10.3, hPSM'10.3 y hPSM6.3 se ha construido usando SO-PCR. Variantes de hPSM diferente tanto con P2 como P30 insertados en la parte extracelular de hPSM se están construyendo actualmente (hPSM'6.3, hPSM8.3, hPSM' 8.3). Además de los mutantes originalmente contemplados, cada uno que contiene P y P30, se han construido cuatro mutantes que solo' contienen un epitope extraño individual, y se verifican en secuencia: hPSMl.O, hPSM8.0, hPSMIO.O y hPSMO.l.

Expresión de mu'tan'tes de hPSM en E . Coli En experimentos a pequeña escala, siete imitantes de hPSM, hPSMl.l, hPSM6.1, hPSM8.1f hPSMIO.l, hPSM2.1, hPSM3.1 y hPSM5.1 se expresaron de pET28b en la cepa de E. Coli BL21(DE3), y los productos inducibles por IPTG del tamaño esperado se identificaron en los geles de SDS-PAG teñidos con azul de Coomassie. Sin embargo, no se fue detectable un producto de hPSMl.l. Los niveles de expresión de estos mutantes de hPSM fueron muy bajos en comparación al producto de la construcción tipo silvestre hPSM÷0.0. En este punto, un nivel de expresión aceptable de los mutantes de hPSM usando el sistema pET en E. Coli parece imposible, y de esta manera es necesario el uso de otros sistemas de expresión de E. Coli y/o otros organismos hospedadores . Como se menciona con anterioridad, se han subclonado hPSM76.1 y hPSMl.l en diferentes vectores de expresión de E. Coli a fin de generar - Versiones N-terminalmente marcadas con His de las proteínas recombinantes, expresadas usando el vector pMCT6, - Versiones de las proteínas expresadas con la secuencia guia pelB que dirige la proteína al espacio periplasmático de las bacterias de E. Coli usando el vector pGH433, y - Versiones de las proteínas recombinantes expresadas como una proteína de fusión C-terminal a la proteína de unión a maltosa ( BP) usando el vector pMal-p2.

Hasta ahora, no se ha obtenido un nivel de expresión suficiente a partir de cualquiera de estas construcciones. Puesto que hPSMO.O se expresa de forma aceptable en E. Coli, en tanto que un nivel de expresión similar de hPSMO.O de longitud completa o los mutantes de hPSM no se ha observado, es posible que la presencia de la parte citoplasmática de la molécula hPSM pueda "inhibir" algo la expresión de las construcciones de hPSM de longitud completa en E. Coli. Para probar esta hipótesis, se elaboraron inicialmente dos construcciones genéticas de hPSMl.l y hPS 6.1 sin dominios citoplasmáticos . Sin embargo, en los experimentos de expresión de E. Coli, hubo solo expresión débil de estos productos génicos de ÷cyt.

Expresión de mutantes de hPSM en Pichla pastoría A fin de expresar la proteína mutante hPSMl.l de la levadura Pichia pastoris, la secuencia de hPSMl.l se ha subclonado (en cuadro con un epítope de identificación c-myc C-terminal, SEC. ID No. 27) en los dos diferentes vectores de expresión pPICZaA y pGAPZaA, y las secuencias se han verificado. La expresión hPS l.l (asi como hPSM÷0.0, ver anteriormente) se detectó de forma intracelular en los transformantes de Pichia pastoris .

Expresión de mutantes de hPSM en células de mamífero Como se mencionó anteriormente, se ha subclonado hPSMl.l en los vectores de expresión de mamífero pcDNA3.1(+) y pZeoSV2 y estas construcciones (y otras) se podrían usar por la expresión en por ejemplo células CHO. La expresión trasciente de hPSMl.l así como hPSMO.O se han obtenido en células COS como se verifica por la transferencia Western.

Vacunación de ADN La vacunación de ADN será, si es efectiva, muy adecuada para la auto-vacunación de PSM, especialmente debido a que esta forma de administración se ha mostrado que promueve las reacciones inmunitarias mediadas por CTL como la producción de anticuerpos. Por lo tanto, fue la intención realizar un estudio paralelo con la finalidad de investigar el efecto de la vacunación de ADN de ratones con vectores apropiados que codifican para la ubiquina de ratón inmunogenizada y/o T Fcc de ratón. La vacunación de ADN con hPSM (y/o mutante) que codifican para el ADN desnudo también se hará.

Estudio de factibilidad usando ubiquina inmunogenizada para la vacunación de ADN Se realizó un estudio de factibilidad que señala el efecto de la vacunación de ADN con una auto-proteina inmunogenizada, usando ubiquina con un epitope auxiliar T insertado de la ovalbúmina (UbiOVA) como una proteina modelo. Las secuencias que codifican para UbiOVA así como la ubiquina tipo silvestre se subclonaron en el vector de expresión de mamífero pcDNA3.1(-). Se inmunizaron grupos de 5 ratones BALB/c con 40 g de construcción pcADN-UbiOV o pcADN-ubiquina ya sea de forma intramuscular en los cuadríceps o de manera intradérmica . Un grupo de control recibió proteína UbiOVA en el adyuvante completo de Freund. A las tres y seis semanas posteriormente, las inmunizaciones se repitieron con la única diferencia que la proteína UbiOVA se emulsionó en el adyuvante incompleto de Freund UbiOVA. Los ratones se sangraron regularmente y se determinaron los grupos de anticuerpos anti-ubiquina . En los grupos UbiOVA vacunados de ADN, solo se obtuvieron títulos de anticuerpo anti-ubiquina muy débiles. Subsecuentemente, todos los grupos se reforzaron con proteína UbiOVA en el adyuvante incompleto de Freund y se sangraron a fin de determinar si la vacunación de ADN con UbiOVA (y sin ubiquina) podría potenciar la respuesta de anticuerpos hacia la proteína UbiOVA. Los resultados de este experimento mostraron que no hubo diferencia significativa entre los grupos de UbiOVA y los grupos de control, todos los ratones desarrollaron fuertes anticuerpos anti-ubiquina en este refuerzo individual de UbiOVA/FIA.

Vacunación de ADN usando construcciones de hPSM Corrientemente, varios experimentos de vacunación de ADN están siendo llevados a cabo usando construcciones de hPSM. Se han subclonado varias construcciones de auto-vacunación tipo silvestre de PSM humana (tal como por ejemplo hPSMO.O, hPSM÷0.0, hPSM'0.0, hPSMl.l, hPSM10.3) en los vectores de vacunación de ADN (tal como pcADN3.1(+ ), pcADN3.1(-), pVAX y pZeoSV2). En algunas de las construcciones, se han incluido diferentes secuencias guía (tal como las secuencias guía CDlla, tPA y IL-5; SEC. ID Nos. 29, 25 y 31, respectivamente), directamente de forma N-terminal y en cuadro para permitir la secreción de in vivo de las proteínas de hPSM expresadas. Todas las construcciones en los vectores de vacunación de ADN se han codificado al secuenciar el ADN y por traducción in vitro. Los ratones de diferentes razas (tal como Balb/cA, Balb/cJ, DBA/2 y A/J se han inyectado con las vacunas de ADN de hPSM descritas anteriormente ya sea de forma intradérmica o intramuscular y se han reforzado varias veces usando las mismas construcciones. Se han obtenido muestras de suero durante el periodo de inmunización y se almacenan a -20°C. estas muestras se analizarán para la presencia de anticuerpos reactivos con hPSM tipo silvestre. También, se están estableciendo ensayos para monitorear las respuestas proliferativas auxiliares de CTL y T en estos ratones. Los resultados preliminares sugieren que la inducción de respuestas tanto de CTL como de anticuerpos contra PSM se pueden lograr.

Purificación/caracterización de hPSM (437-750) marcada con HIS (HIS-PROSIIO .0) Se expresó la hPSMII tipo silvestre marcada con HIS (HIS-PROSIIO .0) de pET28b, y se aplicaron cuerpos de inclusión solubilizados a una columna de FPLC de filtración en gel y se eluyeron en un amortiguador que contiene urea 8M. Las fracciones que contienen predominantemente hPSMII se sometieron a varias condiciones de repliegue para optimizar el procedimiento. El producto solubilizado, dializado contra un amortiguador Tris se estimó que es de más de 90% puro usando SDS-PAGE teñido con plata. Se inmunizaron conejos con la HIS-PROSII0.0 purificada a fin de usar el antisuero resultante para la detección posteriori y posiblemente la purificación por afinidad de los mutantes hPSM.

Purificación/caracterización de hPSM soluble (PROS÷0.0) La HIS tipo silvestre que carece de las partes citoplasmática y de transmembrana, PROS÷0.0, se ha expresado en la cepa de E. Coli, BL21 (DE3) en la inducción con IPTG y se podría detectar en los cuerpos de inclusión. El SDS-PAGE de este lisado bacteriano seguido por transferencia Western con anti-HIS-PROSUO .0 de conejo mostró un producto con la migración esperada. La secuenciación N-terminal de los cinto primeros aminoácidos de este producto eluido de un gel de SDS-PAGE mostró la secuencia esperada que corresponde, a PSM humana. El producto se sometió a una gran serie de experimentos de solubilización y repliegue. Un producto que está en solución se puede obtener en un amortiguador Tris sin desnaturalizante o reductor, pero el análisis por SDS-PAGE revela que el material forma probablemente grandes agregados. Se han inmunizado ratones y conejos con este material a fin de obtener anticuerpo contra hPSM por ejemplo para propósitos analíticos, los antisueros no reaccionan con hPSM de LNCap. Un lote de cuerpos de inclusión de E. Coli, lavados de PROS÷0.0 se ha preparado para inmunización de conejos para generar un antisuero policlonal contra PSM. Aproximadamente 50% del contenido de proteina en el material sedimentado, contenido fue PROS÷0.0. Los antisueros no reaccionan con hPSM de LNCap en la transferencia Western.

Preparación de péptidos de hPSM conjugados con KLH para la inmunización Tres péptidos 15-mer se sintetizaron a fin de elaborar un conjugado inmunogénico de los epitopes de células B, de hPSM, conocidos con una molécula portadora inmunológica para obtener un antisuero policlonal que es capaz de reconocer hPSM. Estos péptidos contienen el epitope de células B de PSM más 5-6 aminoácido de PSM de flanqueo en cada extremo. Los péptidos se elaboraron por síntesis automática, se purificaron por HPLC y se secuenciaron con control usando degradación de Edman. Un conjugado químicamente enlazado se preparó al reticular el epitope de célula B que contiene los péptidos de Hpsm-KLH usando un procedimiento de un paso, normal con glutaraldehído como el agente de reticulación.

Síntesis de péptidos P2 y P30 con secuencias de hPSM de flanqueo Se han diseñado seis péptidos que corresponden a los epítopes P2 y P3 con 5 aminoácidos de hPSM de flanqueo en cada extremo. Los aminoácidos de flanqueo corresponden a los sitios de inserción de epítopes 6, 8 y 10. Los péptidos se usarán en por ejemplo ensayos de proliferación de células T, pero también para otros propósitos tal como ensayos ELIS u otros ensayos in vitro. Las secuencias peptídicas son: PSMpep007 P2 insertado en posición 6 de inserción de hPS QERGVOYIKANSKFIGITELRVDCT (SEC. ID No. 15) PSMpep008 P2 insertado en posición 8 de inserción de hPSM AVVLROYI ANSKFIGITELEMKTY (SEC. ID No. 16) PSMpep009 P2 insertado en posición 10 de inserción de hPSM MFLEROYI ANSKFIGITELHVIYA (SEC. ID No. 17) PSMpepOlO P30 insertado en posición 6 de inserción de hPSM NSRLLFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEVDCTP (SEC. ID No. 18) PSMpepOll P30 insertado en posición 8 de inserción de hPSM VVLRKFNNFTVSFWLRVPKVSASHLESFDSL (SEC. ID No. 19) PSMpep012 P30 insertado en posición 10 de inserción de hPSM LMFLEFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEPSSHN (SEC. ID No. 20) Están subrayados los epitopes P2 y P30. Los péptidos se hacen por síntesis automática y se someten al proceso de purificación por HPLC seguido por la secuenciación de control usando la degradación Edman.

Ensayos de inmunogenicidad Se han iniciado diferentes planes experimentales a fin de producir materiales y establecer ensayos inmunogénicos para la prueba futura de, y la selección entre, las construcciones mutadas de PSM Generación de antisueros conjugados anti-KLH-PSM-péptido y anti-HIS-PROSUO .0 de conejo, policlonales Se inmunizaron dos conejos con HIS-PROSII0.0 purificado, la parte C-terminal marcada con HIS de la proteína hPSM (aminoácido 437-75)0 emulsionados 1:1 con el adyuvante completo de Freund y reforzados dos veces (en los días 28 y 55) con el mismo antígeno emulsionado en el adyuvante incompleto de Freund. Se inmunizaron dos conejos con un cóctel que consiste del conjugado peptidico KLH-PSM más cada uno de los tres péptidos libres. Estos tres péptidos contienen cada uno un epitope de célula B previamente definido de HPS. El cóctel se emulsionó 1:1 con el adyuvante completo de Freund. Los conejos se reforzaron dos veces (en los días 28 y 55) con el mismo antigeno emulsionado en el adyuvante incompleto de Freund. Se demostró en ensayos ELISA la reactividad cruzada entre anti-HIS-PROSIIO .0 y PSMpep005 y la reactividad cruzada entre anti-conjugado peptidico de KLH-PSM más péptidos y HIS-PROSIIO .0. El anticuerpo anti-HIS-PROSSIIO.O tiene la capacidad de reconocer la hPSM nativa en lasados de células LNCaP en transferencia Western.

Inmunización de ratones con hPSMO .0 retroviralmente expresada En esta etapa del proyecto de PSM, un obstáculo serio es aún la carencia de anticuerpos que son capaces de reconocer correctamente la hPSM nativa, plegada. Por lo tanto, se realizó un experimento de inmunización usando hPSM 0.0 retrovialmente expresada. Se inmunizaron seis grupos de ratones Balb/c con ya sea: 1) células de fibrosarcoma BALB/c tratadas con mitomicina C (79.24.H8) traducida con ADNc de hPSMO.O (CMV- Koz-hPSM) , 2) células de fibrosarcoma BALB/c tratadas con mitomicina C y BALN/c (79.24.H8), traducidas con vector vacío (CMVBipep) , 3) células de empaque (BOSC) transfectadas con ADNc de hPSMO .0 (C V-Koz-hPSM) , 4) células de empaque (BOSC) transfectadas con vector vacío (CMVipep) , 5) material de retrovirus que expresa ADNc de hPSMO.O (CMV-KOZ-hPSM) ó 6) material de retrovirus, vector vacío (CMVBipep) . En varios puntos de tiempo, los ratones se sangraron y los sueros obtenidos se probaron para la reactividad en ELISA para la reactividad contra HIS- PROSII0.0. Desdichadamente, ninguno de los ratones desarrolló anticuerpos capaces de reconocer específicamente la preparación de HIS-PROSII0.0 Establecimiento de un ELISA anti-hPSM Se usó HIS-PROSII0.0 purificado para revestir placas de microtítulo de poliestireno (Maxisorp) para el propósito de establecer un ensayo de ELISA para probar por ejemplo sobrenadantes de hibridoma o antisueros de ratón y conejo. Los sueros de ratones BALB/c inmunizados con la misma preparación de HIS-PROSII0.0 fueron reactivos con HIS-PROSII0.0 inmobilizados a 0.5 µq por cavidad usando Ig anti-ratón de conejo, marcada con peroxidasa de rábano, como anticuerpo secundario. Como se mencionó anteriormente, la capacidad de un antisuero formulado en conejos contra el conjugado KLH-PSMpep004-PSMpep005-PSMpep006 mezclado con los péptidos libres para reaccionar con HIS-PROSIIO .0 inmovilizado se demostró usando este ensayo de ELISA. Usando placas de microtitulo AquaBind® (comparar la descripción en WO 94/03530 que describe superficies de microtitulo revestidas con dextrano activado con tresilo que ahora se vende bajo la marca registrada AquaBind), un ELISA que usa péptidos de PSM inmovilizados (PSMpep004, PSMpep005 y PS pep006) se estableció. Las placas de AquaBind® revestidas con estos péptiaos podrían detectar un antisuero de conejo formulado contra la misma preparación de antígeno. Como se menciona con anterioridad, la anti-HIS-PROSII0.0 de conejo se podría detectar en placas de AquaBind® revestidas con PSMpep005.

Establecimiento de una transferencia Western anti-hPSM usando células LNCaP y el anticuerpo monoclonal 7E11C5 Hibridomas de células B 7E11C5 que segregan el anticuerpo monoclonal IgG2a de ratón contra un epítope intracelular de PSM humana se compraron de ATCC. Se recolecó el sobrenadante de cultivo de aproximadamente 90% de células muestras y se usó una transferencia Western para la detección de PSM humana en ambas preparaciones enriquecidas con membrana de células LNCaP asi como en Usados celulares LNCaP. Este anticuerpo se purificó usando columnas de proteína G, y se verificó su reactividad con LNCaP en transferencia Western.

Establecimiento de un método de FACS para detectar hPSM en células LNCaP Se han establecido métodos de FACS mutuamente independientes para detectar hPSM en células LNCaP. Varios problemas se están afrontando: las células LNCaP crecen muy lentamente y en aglomeraciones irregulares, y por lo tanto, el método para preparar suspensiones celulares individuales se debe optimizar. Segundo, el epítope reconocido por el mAb 7E11C5 se define en la literatura que está en el dominio citoplasmático de hPSM. Por lo tanto, el método para fijar y permeabiüzar las células se ha desarrollado. Para este propósito, el anticuerpo 7E11C5 purificado por proteína G se ha conjugado con FITC y de esta manera se puede usar sin anticuerpo secundario en el análisis de FACS . También, se ha establecido un método de FACS usando el anticuerpo monoclonal anti-hPSM, J591, que reconoce un epítope en la parte extracelular de hPSM. El anticuerpo se obtuvo de BZL Biologicals y se conjugó con FITC y se usó subsecuentemente para el análisis por FACS y clasificaciones de por ejemplo células LNCaP y transíectantes de hPSM (ver posteriormente) .

Establecimiento de un ensayo de citotoxicidad Se ha implementado un método para purificar células dendriticas a partir de la médula ósea de ratón. Usando proteínas modelo, la inmunización de ratones con células dendriticas impulsadas con péptidos clase I de modelo y proteína y se han inmunizado. También, se han inmunizado ratones con una proteína modelo (ß-galactosidasa) formulada en la forma de ISCOMS. Células T purificadas de ratones inmunizados se han re-estimulado in vitro con diferentes formas de los antígenos correspondientes. Se midió subsecuentemente la capacidad de estas CTL re-estimuladas para lisar diferentes clases de células objetivo (incluyendo células dendriticas tratadas con impulsos así como transíectantes que expresan retroviralmente el péptido clase I citosólico, expresado) . Se han establecido dos diferentes ensayos in vitro para medir la actividad de CTL, usando ya sea la liberación de cromo y/o fragmentación de ADN (método de JAM) como medidas de citotoxicidad. Se obtuvieron los resultados muy nítidos con la proteína modelo ß-galactosidasa y con varias combinaciones de los péptidos modelo de unión clase I y clase II de MHC.

Establecimiento de herramientas para estudiar la suspensión de la auto-tolerancia hacia PSM de ratón en ratones Es la intención estudiar si se puede suspender la autotolerancia dé PSM de ratón en los ratones por inmunización y/o vacunación de ADN contra PSM murina usando moléculas de auto-vacunación de PSM murina. Como se menciona anteriormente, el ADNc que codifica para PSM murina (mPSM) se ha obtenido y secuenciado por ADN. Están siendo generadas cuatro moléculas variantes de mPSM por inserción de P30 en sitios bien definidos en ya sea mPSM o mPSM1 de longitud completa. Las construcciones son como sigue: Aminoácidos de mPSM Longitud de la substituidos con P30 molécula MpsmO .0 ÷ 752 mPSM' 0.0 ÷ 694 mPSMx 255-271 (de SEC. ID No. 8) 756 mPSMy 689-700 (de SEC. ID No. 8) 760 mPSM' x 197-213 (de SEC. ID No. 10) 698 mPSM' Y 631-642 (de SEC. ID No. 10) 702 Inicialmente, las moléculas análogas y tipo 'fiAi · - iVffliiTiWffira. silvestre de mPSM se subclonan en vectores de vacunación de ADN y se usan para la vacunación de ADN de ratones. Es la intención analizar respuestas inmunitarias tal como respuestas de CTL y eliminación de tumor en los ratones. Para esto, se transfectaron línea de células de tumor murino co PSM murina tipo silvestre (fusionada en cuadro con una marca de identificación, por ejemplo, el epitope c-myc, SEC. ID No. 27), para propósitos de detección) .

Modelos de tumores PSM in vivo Ensayos de proliferación de células T de ratones con P2 y P30 Se llevó a cabo una serie de experimentos de proliferación de células T a fin de establecer la inmunogenicidad de células T de los péptidos P2 y P30 en varias razas de ratón (BALB/cA (H-2d) , C3H/Hen (H-2d) , DBA/1 (H-2q) y C57BL/6 (H-2b) ) . Es bien sabido que estos epitopes son promiscuos en humanos, pero la promiscuidad de células T también se necesita confirmar en ratones usando planes experimentales de M&E. De esta manera, se mostró que P30 es inmunogénica a células T en las razas BALB/cA y C57BL/6 en tanto que ni P2 ni P30 se mostraron que son inmunogénicas de células T en la raza C3H/Hen. En DBA/1, las células T se podrían formular contra P2.

Generación de células de tumor de ratón que expresan hPSM Para el uso de un modelo de tumor especifico de hPSM, en ratones así como para el uso en ensayos proliferativos de células de tumor, se está estableciendo un panel de células de tumor de ratón que expresen hPSM. Un planteamiento en general estas líneas celulares al traducir las células . de tumor murino con vectores retrovirales que codifiquen para el ADNc de hPSMO.O tipo silvestre, de longitud completa. Se construyeron tres diferentes construcciones que codifican para el ADNc tipo silvestre, de longitud completa que codifica para PSM humana insertada en el sitio de policlonación del vector retroviral CMVBipep, dos de éstos que contienen una secuencia corta de ozak en la dirección 5' del codón de inicio. Estas construcciones se tradujeron en tres diferentes líneas de células de tumor de ratón: P815 (mastocitoma, H-2d8>' B16-F10 (melanoma) , H-2†b9) y 79.24.H8 (Fibrosarcoma, H-2d) usando la línea de células de empaque BOSC. Se han obtenido clones de resistencia a geniticina para los tres tipos celulares, y se verificó en análisis de PCR en la plantilla de ADN genómica de las construcciones retrovirales se integraron en las células hospedadoras .

Aún no ha sido posible detectar un producto génico de PSM expresado en transferencia Western o en análisis de FACS usando el anticuerpo monoclonal 7E11C5. Se han establecido por transfección dos lineas de células de tumor de ratón como estables que la PSM humana tipo silvestre unida a membrana. Esto se hizo usando el ADNc de hPSMO .0 subclonado en el vector de expresión de mamífero pcDNA3.1(=) bajo el control del promotor CMV y que contiene una secuencia Kozak en la dirección 5' del codon de inicio. El plásmido resultante se transfectó en dos diferentes líneas de células de tumor de ratón: 79.24.H8 ( fibrosarcoma, derivado de Balb/c) y SalN ( fibrosarcoma, derivado de A/J) . Se obtuvieron cultivos resistentes a geniticina que se sometieron a transferencia Western y análisis de FACS usando los anticuerpos monoclonales anti-hPSM, J591 y 7E11C5. Usando el anticuerpo J591, las células se clasificaron por FACS varias veces hasta que se obtuvo una población positiva a hPSM. La expresión de hPSM se verificó nuevamente por tinción de FACS intracelular usando el anticuerpo 7E11C5. También se verificó por análisis de FACS que los niveles de expresión de clase I de MHC fueron del mismo nivel como los niveles de las líneas de células parentales. Los cultivos de las líneas celulares 79.24.H8 y SalN que expresan hPSM se clonaron al limitar la dilución. Se obtuvieron varios clones y se probaron para diferentes niveles de expresión de hPSM por análisis de FACS usando el anticuerpo monoclonal anti-hPSM, J591. Se transfectaron células 79.24.H8 que expresan hPSM con el gen que codifica para B7.1 para el uso en por ejemplo ensayos in vítro para monitorear respuestas de CTL especificas de hPSM y/o liberación de interferón-gamma . Las composición de vacuna se clasificaron por FACS en el momento de usar un antisuero anti-B7,l.

Establecimiento de un modelo de tumor especifico de hPSM en ratones Se ha decidido establecer al menos dos modelos de tumor in vivo en ratones competentes inmunitarios a fin de determinar el efecto anti-tumor de anticuerpos formulados en ratones contra las moléculas hPSM inmunogenizadas. Esto se hará con la esperanza al inyectar linea de células de tumor de ratón singeneicas, modificadas para expresar hPSM tipo silvestre en la membrana superficial. Las células que forman tumores sólidos y/o células que se conoce que metastizan se usarán. Las lineas celulares que se pueden implantar en ratones singeneicos sin que se rechacen debido a la presencia de la molécula hPSM extraña se usarán en el modelo. La capacidad de las vacunas de hPSM para eliminar estas células de tumor se usará para la selección de los candidatos de vacuna hPSM. Para evaluar el crecimiento de las células SalN con PSM humana de longitud completa, se inyectaron diferentes dosis (2xl06 y 5xl06) de células SalN transfectadas con hPSM (S-PSM, clasificada 5 veces), de forma subcutánea en el flanco derecho inferior de los grupos de ratones A/J. Sin embargo, no se establecieron tumores sólidos. Subsecuentemente, se inyectaron subcutáneamente tres clones de células S-PSM con diferente nivel de expresión de hPSM de forma subcutánea en tres grupos de ratones A/J a una dosis de 107 células/ratón. Los tamaños de lós tumores establecidos se midieron con un calibre que mide dos diferentes diámetros que se multiplicaron para dar el tamaño de tumor en mm2. Estos valores se compararon para los tres grupos. En el espacio de 3-6 días, todos los ratones desarrollaron una estructura tipo tumor sólido que desapareció nuevamente cerca del dia 15. Esto es probablemente debido a la presencia de PSM humana en las superficies de las células de tumor, aunque aún no se ha verificado. Las células SalN transfectadas solo con el vector pcADN3.1 continuaron creciendo como tumores sólidos en los ratones. Se observa una imagen similar en los ratones inyectados con 106, 5xl06, ó 101 células 19.24.H8 transfectadas con hPSM y clasificadas varias veces para la expresión de hPSM. Estas células (llamadas 79-PSM) también no se establecieron como tumores en ratones Balb/c ni en DBA/2. Sin embargo, cuando se inyectó un clon de células 79.24.H8 transfectadas con hPSM, 79-PSM.3, en ratones Balb/c ó DBA/2, los ratones desarrollaron estructuras tipo tumor sólido que desaparecieron nuevamente por el dia 10-20. Las 79.24.H8 transfectadas con el vector continuaron creciendo en ratones Balb/c. Aún permanece por ser evaluado si estos "tumores" son tratables, o si un modelo de tumor mejor se puede establecer en base a los clones y lineas de células S-PSM y 79-PSM, descritas.

Conclusiones En el trabajo de construcción molecular se ha acertado en la clonación del gen de PSM humana y en la obtención del ADNc de PSM de ratón. Se ha producido un arreglo de construcciones de auto-vacuna de hPSM, inmunogenizadas, completamente secuenciadas . Los mutantes de hPSM asi como las diferentes moléculas de hPSM tipo silvestre se han expresado en E. Coli, y se encontró y verificó que el nivel de expresión en E. Coli es muy bajo. Se han inducido en conejos anticuerpos policlonales contra la mitad C-terminal de hPSM. Se han hecho esfuerzos a fin de implementar diferentes marcas de expresión (marca His-tag y fusión de proteina de unión a maltosa) asi como sistemas de expresión alternativos a los cuerpos de inclusión de E. Coli. La hPSM tipo silvestre y/o de auto-vacuna, recombinante se ha detectado en células de mamífero y de Pichia pastoris transíectadas . Se han hecho consideración es útiles con respecto a la tecnología de vacuna de ADN, y se realizó un estudio de factibilidad preliminar. Los experimentos de vacunación de ADN con moléculas de auto-vacuna de hPSM están llevándose a cabo y muestran resultados preliminares promisorios. Los diferentes ensayos in vitro útiles para la prueba y selección entre las construcciones de PSM mutadas, se establecen, incluyendo ensayos inmunogénicos y de análisis de FACS. Se han transfectado establemente células de tumor de ratón con hPSM tipo silvestre de longitud completa y se han clasificado por FACS para la expresión de superficie de hPSM. Se han obtenido clones de estas líneas celulares. Los modelos de tumor xenogénicos in vivo en ratones se están evaluando usando estas células de tumor de ratón, singeneicas, que tienen hPSM. Se ha realizado un arreglo de los ensayos de proliferación de células T a fin de seleccionar las razas de ratón par los modelos de tumor. Se están optimizando los ensayos de CTL, y se han obtenido resultados convincentes con los antígenos modelo usando diferentes métodos de inmunización y condiciones de ensayo. Adicionalmente, las herramientas necesarias para estudiar la suspensión de la tolerancia a PSM de ratón por inmunización contra auto-vacunas de PSM de ratón se están estableciendo .

Ejemplo 2 Preparación de una auto-vacuna de Her2 Se puede desarrollar una auto-vacuna humana contra Her2 a través de la modificación de la molécula por inserción de uno o más epítopes de células T, extraños, promiscuos para revelar un panel de molécula Her2 inmunogenizadas . Estas proteínas modificadas se probarán para su capacidad para inducir anticuerpos que son reactivos en forma cruzada con las partes nativas de la molécula Her2. Subsecuentemente, en varios ensayos in vitro y modelos de animal in vivo, se valorará la eficacia de las diferentes construcciones (como puede ser el caso con la vacunación de ADN) y proteínas modificadas. La inducción de respuestas de CTL específicas contra células de tumor que tienen Her2 se analizará. También, los anticuerpos inducidos se probarán para su capacidad para activar el complemento vía la ruta clásica y para iniciar la ADCC vía los receptores Fe. Finalmente, las diferentes 'r '*'1 _? lili »j¿í moléculas modificadas se probarán de modelos de animal del cáncer de mama humano para examinar sus efectos en el tratamiento de tumores. Se construirán moléculas humanas y de rata, inmunogénicas con epítopes de células T promiscuas en diferentes posiciones en la molécula. Durante la vacunación contra el dominio extracelular completo de Her2 existe una posibilidad de algún grado de reacción cruzada de los anticuerpos con otros receptores de EGFr puesto que algunos de estos receptores son homólogos por hasta 40-46% en los dominios extracelulares . Por lo tanto, se planea que las regiones conservadas de Her2 se desestabilizarán al insertar epitopes dé células T extraños al menos en algunas de las proteínas modificadas (ver posteriormente para detalles) . Las regiones de Her2 que pueden ser potencialmente epítopes de CTL o de células B se evitan al diseñar las construcciones como se ve en la Figura 3. El fundamento para usar estas posiciones es como sigue: La secuencia de Her2 humana se puede dividir en varios dominios en base únicamente a la estructura primaria de la proteína .

Parte extracelular (receptor) ; 1-173: Dominio I (dominio N-terminal de polipéptido maduro) 174-323: Dominio II (dominio rico en cisteina, 24 residuos de cisteina) 324-483: Dominio II (dominio i de unión a ligando, el receptor EGF homologo) 484-623: Dominio IV (dominio rico en cisteina, 20 residuos de cisteina) 624-654: Dominio transmembrana (residuos TM de 654- 675) Parte intracelular (cinasa) : 655-1010: Dominio de tirosina-cinasa (dominio de núcleo TK desde 725-992) 1011-1235: Dominio C-terminal La selección de sitios en la secuencia de aminoácidos de Her2 que se va a exhibir por ya sea los epitopes auxiliares T humanos P2 o P30 se ha realizado considerando los siguientes parámetros (prioritizados libremente) : 1. Epitopes de CTL conocidos y previstos 2. Homología a receptores relacionados (en particular EGFR) Conservación de residuos de cisteína Estructuras de asa, a-hélice y ß-lámina, Sitios de N-glicosilación potenciales Predicción de residuos de aminoácidos ocultos . Organización de dominio Los epitopes de CTL parecen estar agrupados en el dominio I, dominio III, el dominio TM y en dos o tres "puntos calientes" en el dominio TK. De acuerdo con la invención, estos estarán grandemente conservados. Las regiones con un alto grado de homologia con otros receptores probablemente van a ser estructuralmente importantes para la estructura terciaria "completa" de Her2, y por lo tanto para reconocimiento de anticuerpos, en •tanto que las regiones con baja homologia posiblemente se puedan intercambiar con solo alteraciones locales de la estructura como consecuencia. Frecuentemente los residuos de cisteina están comprendidos en la formación de fuentes de disulfuro intramoleculares y de esta manera son cruciales para la estructura terciaria y de manera preferente no se deben cambiar. Las regiones previstas para formar estructuras de ß-hélice o ß-lámina se deben evitar de manera preferente como puntos de inserción de epitopes extraños, puesto que estas regiones probablemente son importantes para el pliegue de la proteína. Los sitios de N-glicosilación potenciales de manera preferente también se deben conservar debido a que se desea la manosilación de la proteína (por ejemplo, por la expresión en levadura), comparar la presencia de receptores de mañosa en las APC. Las ' r regiones previstas (por sus propiedades hidrófobas) para ser interiores en la molécula de manera preferente se deben conservar puesto que éstas pueden estar comprendidas en el pliegue. En contraste, las regiones expuestas a solvente podrían servir como posiciones candidatas para la inserción de los epitopes P2 y P30 TH modelo . Finalmente, la organización de dominio de la proteína también se ha tomado en consideración debido a su pertinencia para la estructura y función de la proteína. El enfoque de la estrategia ha sido conservar la estructura de la parte extracelular de Her2 tanto como sea posible, debido a que esta es la parte de la proteína que es pertinente como objetivo para los anticuerpos de neutralización. En contraste, la parte intracelular de la membrana nativa unida a Her2 en la superficie de las células de cáncer es inaccesible para el sistema inmunitario humoral. Por lo tanto, sólo, la presencia de epitopes de CTL da razón para incluir esta parte en una vacuna. Por lo tanto, es obvio colocar uno o más epitopes ahí. Si resulta que es imposible expresar la molécula Her22 de longitud completa en E. Coli o en levadura, la parte intracelular se podría truncar después del primer "punto caliente" del epítope de CTL (alrededor de la posición 800) . Posteriormente se pueden adicionar epitopes adicionales de CTL al extremo C-terminal de la molécula truncada. La región transmembrana probablemente es una unidad de pliegue independiente y la substitución de esto con epitopes TH tal como P2 ó P30 probablemente no afectará la estructura de Her2 y el pliegue o plegado. Además, el dominio TM podría provocar grandes problemas para la expresión de levadura y E. Coli y en cualquier caso se debe sustituir. De esta manera, se debe colocar de manera preferente un epítope en este dominio en todas las construcciones (quizá dejarlo intacto en una construcción puesto que contiene varios epitopes de CTL y debido a que está comprendido algo en la transmisión de señales en la unión de ligando) . El dominio extracelular se podría mantener principalmente intacto al colocar P2 y P30 en los dominios intracelular y de transmembrana, aumentando de este modo al máximo el número de epitopes potenciales de células B e interfiriendo tan poco como sea posible con la estructura. Sin embargo, el alto grado de homología a EGFR y Her-3 uy Her-4 ocasiona un riesgo para la reactividad cruzada a estos receptores que pueden ser indeseables (o no) . además, algunos anticuerpos monoclonales se han descrito como que funcionan como agonistas para el receptor (quizá al estimular la heterodimerización o la unión a ligando) e incrementan el tamaño de tumor, in vivo. Por lo tanto, se han seleccionado posiciones en el dominio extracelular que de este modo reducirán con esperanza estos riesgos. Esta selección ha comprendido todos los parámetros mencionados con anterioridad y se ha basado en dos diferentes suposiciones: (i) la inserción en regiones no conservadas (con respecto a los receptores relacionados) ayudará a mantener la estructura terciaria y puede reducir la activación indeseada por anticuerpos. (ii) la inserción en las regiones bien conservadas puede alterar la estructura, pero puede al mismo tiempo reducir el riesgo de reactividad cruzada al destruir las secuencias más relacionadas. Ambas suposiciones son especulativas, pero como es muy difícil predecir el efecto de colocar un epítope en cualquier posición a la proteína, se han incluido algunas de estas posiciones en las construcciones. £09 Se ha especulado que podría ser una ventaja remover los dos dominios ricos en cisteina de forma completa. Estos se predice que forman estructuras de asa expuestas a solvente y podrían formar unidades de plegado independientes quizá comprendidas en la dimerización (como se indica por las muchas cisteínas que podrían servir para mantener una estructura rígida necesaria para formar un dominio de dimerización. La supresión de estas estructuras por lo tanto puede eliminar el riesgo de activación por anticuerpos así como reducir el número de anticuerpos de reacción cruzada puesto que estos dominios son los más bien conservados de la parte extracelular de la proteína. Además, estos dominios ricos en cisteina podrían ser problemáticos para producirse en células de E. Coli o de levadura. Los detalles de las construcciones son como sigue usando los epítopes P2 y P30 como ejemplos no limitantes: el epítope P2 se colocará principalmente en el dominio extracelular de Her2 en combinación con la parte sustituyente del epítope P30 ó toda la región que abarca la membrana. El epítope P2 se colocará en regiones en base a los criterios analizados anteriormente. Las construcciones preferidas tienen las siguientes estructura: Nombre de Posición de P2 Posición de P3 Longitud construcción hHER2MA2-¦1A 59-•73 632--652 795 hHER2MA2-•2A 103-•117 632--652 795 hHER2MA2-•3A 149-¦163 632--652 795 hHER2MA2-•4A 210-¦224 632--652 795 hHER2MA2-•5A 250--264 632--652 795 hHER2MA2-¦6A 325--339 632--652 795 hHER2MA2-•7A 369--383 632--652 795 hHER2MA2-•8A 465--479 632--652 795 hHER2MA2-¦9A 579--593 632--652 795 hHER2MA2--IB 59--73 661--675 795 hHER2MA2-¦2B 103--117 661--675 795 hHER2MA2--3B 149--163 661--675 795 hHER2MA2--4B 210--224 661--675 795 hHER2MA2--5B 250--264 661--675 795 hHER2MA2--6B 325--339 661--675 795 hHER2MA2--7B 369--383 661--675 795 hHER2MA2--8B 465--479 661--675 795 hHER2MA2--9B 579--593 661--675 795 hHER2MA2--1Y 59--73 710--730 795 hHER2MA2--2Y ; 103--117 710--730 795 hHER2MA2--3Y 149--163 710--730 795 hHER2MA2--4Y 210--224 710--730 795 hHER2MA2--5Y 250--264 710--730 795 hHER2MA2--6Y 325--339 710--730 795 hHER2MA2--7Y 369--383 710--730 795 hHER2MA2--8Y 465--479 710--730 795 hHER2MA2--9Y 579--593 710--730 795 hHER2MA2--Z 695--709 710--730 795 hHER2MA2--C 653--709 632· -652 795 hHER2MA2--BX 695· -709 661· -675 795 hHER2MA2--AX 695--709 632--652 795 hHER2MA2--4E 210· -224 5-•25 795 hHER2MA2--6E 325--339 5-•25 795 HhER2MA2--8E 465-479- 5-•25 795 HhER2MA5--4D 210· -224 632-•652* 666 HhER2MA5--6D : 325--339 632-¦652* 666 HhER2MA5--8D 465· -479 632-¦652* 66 HhER2MA6--C 653· -667 632 -652 702 La posición del epitope indica la primera y última posición de aminoácido del epitope con relación al punto de inicio de la Her2 madura. La longitud es la longitud en aminoácidos de la construcción completa. En todas las construcciones, excepto aquellas donde la posición se indica con *, el epitope substituye un tramo de aminoácidos de la misma longitud como el epitope. indica que el epitope se inserta más bien en vez de estar substituido en Her2. Todas las construcciones listadas anteriormente son por lo tanto truncados de Her2 maduro, donde la parte medida es del C-término. La mayoría de las construcciones existen en diferentes versiones, por ejemplo en el vector pcADN3.1+ en fusión con la secuencia de péptido de señal de Her2 natural, en el vector pMT/BiP/V5-His-A como una fusión con el péptido guía BiP para la expresión en células de Drosofila y sin la secuencia guía en el vector pET28b para la expresión en células E. Coli. A continuación se describen los modelos que se proponen para el uso en la selección y detección de proteínas Her2 modificadas. 1. Inducción de anticuerpos en ratones de Her2 de rata transgénica y en conejos a Her2 de rata y humano, respectivamente, se investigará por tecnología convencional de ELISA después de al menos tres inmunizaciones. Los anticuerpos comercialmente disponibles a Her2 humana y de rata se usarán como controles positivos. 2. Estos anticuerpos de conejo se usarán para estudiar la inhibición putativa del crecimiento de células de tumor y de humano y de ratón transgénico que sobreexpresan Her2 en un modelo in vitro. 3. La proliferación de células T de PBL de pacientes inmunizados con tétano hacia moléculas Her2 humanas seleccionadas se investigará por métodos convencionales . 4. La capacidad de moléculas Her2 de rata, modificadas para inducir respuestas de CTL en ratones transgénicos de Her2 de rata se estudiará usando tumores de estos ratones como objetivos. 5. Se propone sintetizar un conjunto seleccionado de péptidos en la región de transmembrana de Her2 humana que abarca los epitopes P2 y P30. Estos péptidos se probarán en la proliferación de PBL de humanos inmunizados previamente con toxoide de tétanos para determinar si epitopes P2 y P30 se podrían procesar eficientemente desde dentro de las secuencias de Her2 y presentar a células T. 6. Es completamente posible que las proteínas Her2 humanas, modificadas, seleccionadas se probarán para generar anticuerpos de neutralización en un ratón que se ha construido genéticamente para expresar solo genes de VDJ humanos. Este ratón está disponible de Abgenix, Fremont, CA, Estados Unidos de América como una colaboración. Los cuatro modelos de ratón transgénico, bien caracterizados para el cáncer de mama que contienen el oncogen Her2 de rata se han descrito. Los primeros tres ratones transgénicos expresan el oncogen Her2 activado en tanto que el cuarto modelo utiliza Her2 inactivado. Todos los modelos utilizan un promotor MMTV para impulsar la expresión en glándulas mamarias. Se ha decidido usar dos modelos de ratones transgénicos: 1) un modelo de tumor más agresivo descrito por Muller et al., usando el oncogen Her2 activado (Muller et al., 19989) y 2) un modelo de tumor menos agresivo en el cual se usa Her2 inactivado para crear tumores mamarios locales con latencia alargada (Guy et al., 1992). Ambos ratones transgénicos se compraron de Jackson y/o Charles Rivers Laboratories. En los experimentos iniciales, estos ratones se dejaron producir anticuerpos y respuestas de CTL al inmunizar y reforzar con proteínas Her2 de rata, modificadas. La incidencia de tumores luego se investigó como se describe por otros (Muller et al., 1989; Guy et al., 1992; Katsumata et al., 1995). Se medirán los niveles de anticuerpos por un ensayo de ELISA. La actividad de CTL se determinará al generar células objetivo que expresen Her2 de rata como se menciona anteriormente. De manera alternativa, el modelo de carcinoma de xenoinjerto de ratón desnudo se puede usar para experimentos de vacunación pasiva. Se pueden trasplantar ratones desnudos con tumores humanos y se puede intentar la inhibición de tumores con transferencia pasiva del suero desde ratones normales o humanizados, inmunizados con proteínas Her2 modificadas. En tanto que esto sería útil para estudiar el papel del anticuerpos en la supresión de tumores, la actividad de CTL no se puede medir directamente en este sistema. En el segundo modelo in vivo, los tumores en ratones también se generarán al trasplantar líneas de células de tumores de ratones transgénicos descritos anteriormente . Las líneas celulares generadas de estos ratones se transferirán en la raza pertinente de ratón y la localización se establece usando protocolos normales. Transferencia de células de tumor de ratón que sobreexpresan Her2 de rata. En este sistema, se transíectarán células con genes de rata y se transferirán a ratones compatibles con MHC. Se logrará la inhibición del crecimiento de tumor al generar respuestas anti-Her2. En estos sistemas; se usarán proteínas Her2 modificadas como vacuna en adyuvantes para generar anticuerpos y respuestas de CTL. Se ha usado exitosamente la vacunación de ADN en varios sistemas para montar una respuesta inmunitaria efectiva. Se están investigando actualmente medios de distribución de ADN usando auto-proteinas modificadas. Es la presente intención utilizar el planteamiento de vacunación de ADN para determinar los efectos de las construcciones de Her2 modificadas en la inhibición de tumores en modelos de ratones transgénicos de cáncer de mama. Entonces se puede aplicar posiblemente un planteamiento similar en humanos para el tratamiento de esta enfermedad.

Ejemplo 3 Preparación de una vacuna anti-FGF8b En lo siguiente, se describirá cómo se puede desarrollar una auto-vacuna humana contra FGF8b a través de la modificación de la molécula por inserción de uno o más epitopes de células T, extraños, promiscuos para revelar un panel de moléculas "FGFeb" inmunogenizadas . Las construcciones se probarán para su capacidad para inducir anticuerpos que son reactivos en forma cruzada con las partes auténticas de la molécula FGF8b. Subsecuentemente, en varios ensayos in vitro y modelos de animal in vivo, se evaluará la eficacia de las diferentes construcciones. Los anticuerpos inducidos se probarán para su capacidad para activar el complemento vía la ruta clásica y para iniciar ADCC vía los receptores FC. Finalmente, las diferentes moléculas se probarán en modelos de animal de cáncer de mama y próstata, humanos.

Construcción de una auto-vacuna contra FGF8b. Debido a la identidad completa de los polipéptidos FGF8b murinos y humanos, todas las construcciones se pueden usar para los experimentos tanto en humanos como en ratones. Los epitopes P2 y P30 de células auxiliares T, de toxoide de tétano, promiscuos, usados con éxito en la vacuna de TNFa humano se insertarán en el polipéptido FGF8b. Debido al pequeño tamaño de FGF8b, las construcciones se harán con un epitope por molécula. También se pueden considerar otros epitopes de célula auxiliar T, promiscuos tal como el epitope HA (307-319) de hemaglutinina de influenza y otros epitopes de células T analizados en la presente (O'Sullivan 1991). Se han elaborado 4 diferentes construcciones de FGF8b inmunogenizadas con los epitopes descritos a lo largo de la molécula. Estas cuatro construcciones se hacen en base a alineaciones múltiples y en pares de la familia FGF de proteínas. Una alineación en par de FGF2 y FGF8b se usa como base para un análisis de la estructura secundaria prevista (es decir, la distribución de ß-lámina) a lo largo de la molécula FGF8b. Los residuos que se conservan entre FGF2 y FGF8b no se agrupan donde quiera en la estructura tridimensional, lo que indica que no hay regiones particulares de la molécula que no se puedan reemplazar sin tener efectos per udiciales en las capacidades de pliegue. Los residuos de aminoácido en FGF2 que se alinean a los residuos de cisteína en FGF8b son colocados muy cerca entre sí de forma tridimensional, indicando que forman un puente de disulfuro en FGF8b, y la alineación es correcta. La flexibilidad de la parte N-terminal de FGF2 también se consideró. La variante de FGF8b con el epítope P30 en la N-terminal (F30N) se diseñó en base a las alineaciones de no separación de los residuos de aminoácidos de la proteína FGF8b y el epítope P30 (SEC. ID No. 14), y marcando las diferentes posiciones con respecto a las propiedades químicas de cada residuo de aminoácido. Solo en la región N-terminal de la estructura de beta-barril prevista se consideró. En el caso de F30N, hubo 9 similares de los 21 residuos. Usando este pseudo-algoritmo, las substituciones se esperarán que den por resultado cambios estructurales completos mínimos. Las secuencias de las cuatro construcciones diferentes, asi como las representaciones tridimensionales de los aminoácidos reemplazados se muestran en la Figura 6. La variante de FGF8b con el epitope P2 (SEC. ID No. 12) en la C-terminal (F2C) se diseñó inicialmente como F30N. Se predice, sin embargo, un buen epitope Kd en las posiciones 195-203. Por lo tanto, el epitope P2 se inserta justo en la C-terminal de este epitope. Nuevamente, se consideró solo la región C-terminal del beta-barril previsto. Las variantes internas de FGF8b (F30I y F2I) se construyeron al reemplazar las asas externas en la estructura de FGF2 con los epitopes P2 y P30, respectivamente, por lo cual permanecerá sin cambio la estructura de beta-barril de la estructura de FGF. Las moléculas de FGF8b inmunogenizadas se han expresado en Escherichia coli, que facilita la producción a gran escala de las proteínas a costos mínimos. Aunque, FGF8b contiene dos sitios de N-glicosilación potenciales (Asn31 y Asnl77), se ha mostrado que FGF8b recombinante bacterianamente expresado es biológicamente activo (MacArthur 1995a, Blunt 1997) . A fin de facilitar la purificación y el re-pliegue, las variantes de FGF8b se han producido en una versión marcada con His, volviendo de este modo posible el acoplamiento a una columna cargada con Ni.

La purificación de las moléculas se ha realizado utilizando la alta carga positiva de las moléculas de proteina o la marca His, y el replegado se realizará usando procedimientos normales tomando en cuenta la formación del puente de disulfuro . Las cuatro moléculas inmunogenizadas también se han insertado, junto con el ADNc de FGF8b tipo silvestre, en los vectores de vacunación de ADN.

Detección y selección de moléculas modificadas de F6F8b Las cuatro moléculas de FGF8b inmunogenizadas se han expresado en bacterias y purificado de manera subsecuente de cuerpos de inclusión. En paralelo, las construcciones se usarán como vacunas de ADN. Las diferentes construcciones entonces se compararán para su capacidad para inducir varios efectos, que se desean en el tratamiento de pacientes con cáncer de próstata y mama. Estas investigaciones se realizarán usando varios diferentes ensayos in vitro e in vivo. Finalmente, los resultados de los experimentos formarán la base de la selección final de uno o más candidatos para una vacuna de FGF8b en humanos .

Modelos in v tro Análisis en el sistema murino Se inmunizarán ratones de diferentes haplotipos asi como conejos, con las diferentes construcciones de FGF8b en el adyuvante completo de Freund y se reforzarán subsecuentemente al menos dos veces con los mismos antigenos emulsionados en el adyuvante incompleto de Freund. De esta manera, la capacidad de las diferentes construcciones para suspender la tolerancia de células B se puede comparar. Se realizará la vacunación de ADN en otros animales usando ADN purificado en el adyuvante completo de Freund/ adyuvante incompleto de Freund inyectado de forma intramoscular con intervalos de 14 días. Se obtendrán muestras de suero en varios puntos de tiempo durante el programa de inmunización, y se determinará la capacidad de las diferentes construcciones para inducir anticuerpos específicos de FGF8b usando un método convencional de ELISA (Rochon 1994). Un antisuero policlonal comercial, así como un antisuero monoclonal comercial formulado contra FGF8b (R&D) , se usará para controles positivos. La proteína FGF8b está comercialmente disponible (R&D) pero también se producirá junto con las tras construcciones de FGF8b y se purifica/repliega subsecuentemente. Este producto entonces se puede usar para revestimiento de placas en un ELISA directo para la prueba de los sueros de ratones/conejos inmunizados con las proteínas variantes de FGF8b. Una herramienta valiosa para investigar los efectos de la vacunación contra FGF8b será una línea de células de cáncer.- dependiente de FGF8b. Varias líneas de células de cáncer positivas a FGF8b, por ejemplo MCF-7 ó SC-3, se describen en la literatura. Esta línea de células de cáncer murino, dependiente de FGF8b se identificará usando RT-PCR cuantitativo, experimentos de proliferación celular y ensayos de fosforilación con STAT-3 La presencia de FGF8b ligado a un receptor de FGF en la superficie celular se detectará con anticuerpos específicos de FGF8b en el análisis con FACS o ELISA. Los anticuerpos dirigidos contra varios receptores diferentes de FGF están comercialmente disponibles (R&D) . Las construcciones se compararán con respecto a su capacidad para inducir anticuerpos capaces de activar la lisis del complemento de las células que producen/que tienen FGF8b. Esto se puede detectar con una de las líneas de células de tumor de ratón que expresen FGF8b descritas anteriormente, o de manera alternativa, usando células cargadas osmóticamente con FGF8b. Los sueros de ratones normales o transgénicos (ver posteriormente) inmunizados con las construcciones de FGF8b humanas se incubarán con la linea celular y se incubarán subsecuentemente con el complemento fresco de cobayo. La lisis del complemento mediada por anticuerpos de células se puede detectar por procedimientos normales. La capacidad de los anticuerpos inducidos para mediar ADCC se puede estudiar al medir la liberación de 51Cr de las células que expresan FGF8b marcadas. Las células efectoras serán PBMC de ratones singeneicos. Para establecer el ensayo, puede ser conveniente usar una linea de células de ratón capaz de mediar ADCC (positiva para, receptores Fe) como célula efectora con un anticuerpos contra FGF8b humana. A fin de mostrar que las vacunas candidatas de FGF8b no promueven nada el crecimiento de tumor inducido por auto-anticuerpos también se realizará un ensayo de proliferación de tumor. Las muestras de suero de ratones inmunizados se incubarán con células de tumor que expresen FGF8b. La proliferación de las células de tumor entonces se puede detectar por su capacidad para incorporar 3H-timidina, que subsecuentemente se adiciona a las células. Puesto que se sabe que FGF8b induce la proliferación de un intervalo de células de mamífero, también será necesario examinar los efectos de promoción de crecimiento de las proteínas variantes. Esto se puede hacer usando los ensayos de proliferación celular como el usado por Marsh 1999.

El efecto biológico de FGF8b en células de mamífero se deben neutralizar por los auto-anticuerpos. Estos se pueden mostrar al usar FGF8b recombinante y por ejemplo NIH3T3 en los estudios de proliferación celular (y cambios de morfología.). La adición de los auto-anticuerpos debe anular la actividad de transformación de FGF8b.

Protocolo de inmunización El número de animales que va a entrar a un experimento de inmunización de auto-vacunación de FGF8b debe depender de la penetración esperada de la enfermedad en el modelo, de esta manera, los números necesitan obtener información estadísticamente significativa. El protocolo de inmunización se debe bazar en la experiencia que se ha tenido del proyecto de auto-vacunación de TNFa. Se han usado varios protocolos de inmunización para inmunizar ratones con los varios análogos de TNFa para propósitos específicos, pero se realizaron muchos experimentos usando el protocolo siguiente: 1. Los ratones se deben marcar individualmente ya sea por marcas de oreja o con transpondedores, 10 animales en cada jaula. Presuntamente, se deben evaluar de forma separada machos y hembras, pero en cualquier caso, no se tendrán ambos sexos en la misma jaula. Los animales se deben dejar descansar al menos 3 días después del transporte marcado. 2. El antígeno a 1 mg/ml en amortiguador de PBS se emulsionó con un volumen igual del antigeno completo de Freund (CFA) (Difco o Sigma) . La emulsión se verificó al colocar una gota de la emulsión en una superficie de agua y se observa si la gota se detiene conjuntamente o se dispersa. Se mantiene mezclado hasta que la gota no se dispersa. 3. La dosis de inmunización normal es de 100 µg de antigeno en un volumen de 100 µ? + 100 µ? de adyuvante. De esta manera, el volumen total de inmunizaciones de 200 µ?, administrados s.c. (subcutáneamente) sobre la espalda del animal. 4. Se realizan refuerzos 2-3 semanas después de la inmunización primaria, y subsecuentemente a intervalos de 2-3 semanas. El material de refuerzo/inmunización se prepara y administra exactamente como el material de inmunización, pero se usa el adyuvante incompleto de Freund. Probablemente tres refuerzos se inducirán al titulo máximo. De esta manera, los títulos más altos se obtendrán 6-9 semanas después de la primera inmunización. 5. Los sangrados son sangrados orbitales de 50- 100 µ? usualmente tomados antes de la primera inmunización y una semana después de cada refuerzo. Los sangrados en la cola también se pueden usar, y son suficientes 10-20 µ? para cada determinación de titulo. El punto de inicio del programa de inmunización dependerá del desarrollo de la enfermedad, y la estrategia que se desea adoptar. Inicialmente, se sugiere que se intente generar la inmunidad máxima tan pronto como sea posible, pero es difícil empezar las inmunizaciones demasiado pronto en aproximadamente 5 semanas de edad. Posteriormente, se deben mantener otros títulos al reforzar a intervalos de 6-8 semanas, después de los tres refuerzos iniciales. Existe un problema potencial si el frecuentemente es necesario para el desarrollo normal del ratón joven, y por lo tanto, se podría argumentar a favor de iniciar las inmunizaciones posteriormente en el ratón adulto .

Análisis en sistema humano En la selección entre las diferentes construcciones de FGF8b, la capacidad de las células humanas que presentan el antígeno para presentar los epítopes de células T, inmunogénicos, insertados a las células T humanas se investigará. Esto se hará al usar los mismos ensayos de procesamiento in vitro para la presentación P2 y P30 que se usaron para la vacuna de TNFa. Las líneas de células T humanas, que son específicas para P2 y P30, se establecerán de donadores vacunados contra tétano. Las células que presentan el antígeno (PBMC) de algunos donadores se incubarán con las diferentes construcciones y se adicionarán las lineas de células T. El nivel de presentación de los epítopes y células T insertados entonces se puede comparar al medir la estimulación de las líneas de células T.

Modelos de animales in vivo Se pueden usar al menos tres sistemas diferentes para monitorear si los anticuerpos de FGF8b inducidos son capaces de controlar una FGF8b un efecto in vivo dependiente de FGF8b. Se transplantarán ratones con las células de tumor que expresan FGF8b, murinas, y se valorará la inhibición del progreso del tumor con auto-vacunación usando las proteínas de FGF8b modificadas o las vacunas de ADN de FGF8b. El sistema ideal comprende el uso de células aisladas de tumores murinos . De manera alternativa, se usarán otras líneas de células murinas (por ejemplo, Balb/3T3) transíectadas de forma estable con el ADNc de FGF8b en un vector de expresión. El modelo de carcinoma de xenoinjerto de ratón se usará para los experimentos de vacunación pasiva. Se transplantarán ratones desnudos con tumores humanos, y se intentará la inhibición de tumores con la transferencia de suero de ratones normales o humanizados, inmunizados con proteínas FGF8b modificadas o vacunas de ADN de FGF8b. Esto será muy útil para estudiar la capacidad de los anticuerpos formulados para suprimir los tumores. Otro planteamiento para lograr la prueba del concepto comprenderá el uso de ratones transgénicos para FGF8b . Estos ratones, que están portando el ADNc de FGF8b bajo el control del promotor de virus de tumor mamario de ratón, muy específico (MMTV) , se muestra que desarrollan espontáneamente tumores mamarios que expresan FGF8b (Coombes, comunicación personal) . La auto-vacunación de estos ratones con las proteínas variantes de FGF8b o vacunas de ADN de FGF8b permitirá mostrar si la auto-vacuna será capaz de que los ratones supriman o rechacen los tumores. Un posible planteamiento para obtener la prueba de concepto será usar el ratón transgénico Wnt-1 (MacArthur 1995c) . Se reporta la inducción de cánceres de mama por virus MMTV para activar la expresión de FGF8b en más de la mitad de los ratones que desarrollan tumores. La dependencia de FGF8b de los tumores, se podría establecer si la presente auto-vacuna pudiera suprimir la incidencia o velocidad de crecimiento de los tumores. El hecho que ratones transgénicos muestran frecuentemente patrones de tolerancia inmunológica no fisiológicos probablemente no afectará este proyecto puesto que los polipéptidos de FGF8b son idénticos para humano y ratón . Cuando, se ha demostrado un efecto benéfico de las inmunizaciones de FGF8b de forma eventual, en el modelo de ratón y se han seleccionado candidatos adecuados de vacuna humana, será posible realizar un número limitado de estudios de toxicologia. Subsecuentemente, para obtener una prueba de concepto final, se pueden llevar a cabo estudios de vacuna en pacientes con cáncer de mama y próstata . De manera importante, si los experimentos que usan modelos in vitro han resultado positivos, se construirán muchos mutantes en base a los datos dipsonibles .

Ejemplo 4 Preparación de análogo MUC-1 Sólo se ha elaborado una molécula de auto-vacunación MUC-1. Esto comprende, en total, las nuevas repeticiones de mucina cada una que tiene las secuencia SEC. ID No. 33. La construcción inicia con tres de estas secuencias, seguidas por un epitope P2, seguido por tres más secuencias de mucina, seguidas por un epitope P30, terminado por tres secuencias de mucinas. La construcción se ha elaborado con y sin una marca UNI-his N-terminal (SEC. ID o¿ 23) . Ambas variantes se han expresado en E. Coli. Se ha confirmado la identidad de la proteína expresada tanto por transferencia Western como por secuenciación N-terminal. La proteina se expresa en forma soluble, pero como un dimero que se suprime algo. La molécula MUC-1 marcada con HIS se ha purificado por cromatografía de afinidad con metal. La cantidad de proteína pura y la pureza se desconocen actualmente .

Ejemplo 5 Suspensión de auto-tolerancia en un sistema de modelo urino Los experimentos de CTL donde se han inmunizado ratones con células dendríticas impulsadas tanto con el epítope de la clase I como de la clase II han mostrado previamente una inducción mejorada al CTL cuando se inmuniza así como la re-estimulación in vitro tanto con un epítope de la clase I como de la clase II en comparación a una inmunización y re-estimulación con solo un epítope de la clase II. Esta situación es comparable con la inmunización con una auto-vacuna, donde se inserta un epitope de la clase II extraño en una auto-proteina . La captación y procesamiento de estas moléculas por células profesionales que presentan el antigeno, tal como células dendriticas, conduce la presentación del epitope clase II extraño junto con algunos auto-epitopes clase I. Se sabe que es posible producir las CTL auto-reactivas, pero la presencia de un epitope auxiliar clase II extraño muy probablemente debe mejorar esta inducción de CTL. La ventaja potencial de la presente invención para la inducción de las CTL auto-reactivas se está investigando actualmente en ratones transgénicos de albúmina. Existen cuatro diferentes lineas transgénicas con diferentes niveles de expresión de ovalbúmina y estados de tolerancia, comparar Kurts C et ál., 1997, J. Exp. Med. 186:239-245, que describe el ratón transgénico RIP-mOVA (que expresa ovalbúmina en páncreas, riñon y timo y que tiene un alto grado de tolerancia) y Kurts C et al., 1998, J. Exp. Med. 188:409-414 que describe los ratones transgénicos RIP-OVAlos y RIP-OVAhigh, que tienen baja y alta expresión de ovalbúmina, respectivamente. Esta última linea, RIP-OVAint que expresa ovalbúmina a un nivel intermedio se ha obtenido del Dr. William R. Heat, co-autor de las dos referencias mencionadas anteriormente. En el cuerpo, existen diferentes grados de tolerancia a diferentes antigenos. Uno de los menos grados de tolerancia se encuentra en los antigenos de circulación en grandes cantidades. Esos antigenos entrarán todos en el timo, donde se suprimen las células T auto-reactiva. Estos antigenos están bajo "tolerancia central". Los antigenos específicos del tejido, por otra parte, no entran directamente al timo y en general están bajo "tolerancia periférica", ejercida por ejemplo anergia de células T. Se han producido dos construcciones de auto-vacunación de ovalbúmina. Se refieren ambas a la secuencia con número de acceso J00845 en EMBL donde la secuencia de P30 (SEC. ID No. 14) se ha insertado en dos diferentes posiciones. En la construcción "OVA 3.1", P30 se inserta en la posición que corresponde a los aminoácidos números 272-292 en ovalbúmina. En la construcción "OVA 3.2", P30 se inserta en la posición que corresponde a los aminoácidos números 321-341 en ovalbúmina. Estas construcciones se han insertado en el vector pVaxl y se usan para la inmunización de ADN. Se han inmunizado de manera intradérmica ratones una vez con 100 ^g cada uno de ADN. Tres semanas de esta inmunización, se removieron los bazos y se estableció un ensayo de CTL usando células objetivo que expresen el epítope SIINFEKL de ovalbúmina dominante y el péptido FILKSINE no mezclado como control. Las inmunizaciones proporcionan una inducción de CTL clara en ratones C57BL/6 tipo silvestre, como se esperaba, puesto que tanto la ovalbúmina como P30 son extraños en estos ratones. Ahora se propone inmunizar las 4 lineas de los ratones transgénicos de ovalbúmina con estas construcciones de auto-vacunación. Los RIP-OVAlow, RIP-OVAint y RIP-OVAhigh expresan cantidades crecientes de ovalbúmina y tienen diferentes grados de tolerancia y como se menciona anteriormente, también RIP-mOVA tiene un alto grado de tolerancia . En estas lineas a ratones transgénicos, solo P30 será extraño. La ovalbúmina es una auto-antigeno en estos ratones y esta situación por lo tanto constituirá una auto-vacunación verdadera para la inducción de CTL hacia la ovalbúmina . Los resultados preliminares obtenidos en ratones RIP-OVlow que tienen el menor grado de "tolerancia periférica" a ovalbúmina demostraron que tanto la ovalbúmina con P30 insertado como las moléculas de ovalbúmina que se presentan de forma natural son capaces de inducir respuestas de CTL, se espera que los ratones transgénicos que tienen mayores grados de tolerancia solo serán capaces de montar una respuesta de CTL contra las moléculas modificadas de ovalbúmina y no la forma que se presenta de forma natural LISTAS DE REFERENCIAS Ago H et al. (1991). J Biochem (Tokyo) , 110, 360-3. Abdel-Nabi H et al. (1992). Sem. Urol. 10, 45-54. Acevedo et al. (1995), Cáncer 76; 1467-1475. Acevedo et al. (1997), Cáncer Detect. Prev. 21; 295-303. Adelstein S et al. (1991), Science 251: 1223-1225. Babaian RJ et al. (1994), J. 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Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para regular descendentemente células que expresan un antigeno polipeptidico asociado a la célula, en un animal, incluyendo un ser humano, el antigeno polipeptidico que es débilmente inmunogénico o no inmunogénico en el animal, al inducir una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos contra las células que tienen el antígeno polipeptidico asociado a la célula en su superficie o que alojan el antígeno polipeptidico asociado a la célula en su compartimiento intracelular, el método está caracterizado porque comprende efectuar, en el animal, la presentación simultánea por una células adecuada que presenta el antígeno (APC) de 1) al- menos un epítope de CTL derivado del antígeno polipeptidico asociado a la célula; y 2) al menos un primer epítope de linfocitos auxiliares T (TH) que es extraño al animal. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el animal es un ser humano. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque al menos un epítope de CTL cuando se presenta está asociado con una molécula de la clase I de MHC en la superficie de las APC y/o en donde al menos un primer epítope de TH extraño cuando se presenta está asociado con una molécula de la clase II de MHC en la superficie de las APC. 4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la APC es una célula dendritica o un macrófago. 5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el antigeno polipeptidico se selecciona de un antigeno polipeptidico asociado a tumor, una auto-proteina, un antigeno polipeptidico viral, y un antigeno polipeptidico derivado de un parásito intracelular o bacteria. 6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la presentación por la APC del epítope de CTL y el primer epitope de TH extraño se efectúa al presentar al sistema inmunitario del animal al menos un primer análogo del antígeno polipeptidico, el primer análogo que comprende una variación de la secuencia de aminoácidos del antígeno polipeptidico, la variación que contiene al menos el epítope de CTL y el primer epítope de TH extraño. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque al menos el primer análogo contiene una fracción substancial de los epítopes de CTL conocidos y previstos del antigeno polipeptidico asociado a la célula. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la fracción substancial de los epitopes de CTL conocidos y previstos en la secuencia de aminoácidos del análogo se reconocen por al menos 90% de los haplotipos de MHC-I que reconocen todos los epitopes de CTL conocidos y previstos en el antigeno polipeptidico asociado a la célula. 9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-8, caracterizado porque substancialmente todos los epitopes de CTL conocidos del antigeno polipeptidico asociado a la célula están presentes en el análogo y/o en donde substancialmente todos los epitopes de CTL previstos del antigeno polipeptidico asociado a la célula se presentan en al menos un primer análogo. 10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-9, caracterizado porque al menos un primer análogo comprende adicionalmente una parte que consiste en una modificación de la estructura del antigeno polipeptidico asociado a la célula, la modificación que tiene como resultado que la inmunización del animal con el primer análogo induce la producción de anticuerpos en el animal contra el antigeno polipeptidico asociado a la célula. 11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende efectuar la presentación al sistema inmunitario del animal de una cantidad inmunogénicamente efectiva de al menos un segundo análogo del antigeno polipeptidico, el segundo análogo que contiene una modificación de la estructura del antigeno polipeptidico, la modificación que tiene como resultado que la inmunización del animal con el segundo análogo induce la producción de anticuerpos contra el antigeno polipeptidico asociado a la célula. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la modificación comprende que al menos un segundo epitope de TH extraño se incluye en el segundo análogo. 13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-12, caracterizado porque el primero y/o segundo análogo comprende (n) una fracción substancial de los ep topes de células B del antigeno polipeptidico asociado a la célula. 14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-13, caracterizado porque la variación y/o modificación comprende la substitución y/o supresión y/o inserción y/o adición de aminoácidos. 15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-14, caracterizado porque la variación y/o modificación comprende que: - al menos una primera porción se incluya en el primero y/o segundo análogo, la primera porción que efectúa la dirección al objetivo del análogo a una célula que presenta el antigeno (APC) y/o - al menos una segunda porción se incluya en el primero y/o segundo análogo, la segunda porción que estimula el sistema inmunitario; y/o - al menos una tercera porción se incluye en el primero y/o segundo análogo, la tercera porción que optimiza la presentación del análogo al sistema inmunitario . 16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-15, caracterizado porque la variación y/o modificación incluye la duplicación de al menos un epitope de células B o de al menos un epitope de CTL del antigeno polipeptidico asociado a la célula. 17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-16, caracterizado porque la variación y/o modificación incluye la introducción de un hapteno . 18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el primero y/o segundo epitope de TH extraño es inmunodominante . 19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el primero y/o segundo epitope de TH extraño es promiscuo. 20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-19, caracterizado porque el primero y/o segundo epitope de TH extraño se selecciona de un epitope de TH natural y una secuencia peptídica de unión a MHC-II, artificial. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el epitope de TH natural se selecciona de un epitope de toxoide de tétano tal como P2 o P30, un epitope de toxoide de difteria, un epitope de hemaglutinina de virus de influencia y un epitope de CS P. Falsiparum. 22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-21, caracterizado porque el primero y/o segundo epitopes de TH y/o la primera y/o segunda y/o tercera porciones se presentan en la forma de: grupos laterales unidos covalentemente o de manera no covalente a grupos químicos adecuados en la secuencia de aminoácidos del antígeno polipeptídico asociado a la célula o una sub-secuencia de la misma, y/0 compañeros de fusión a la secuencia de aminoácidos derivada del antígeno polipeptídico asociado a la célula. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la primera porción es un compañero de unión substancialmente especifico para un antígeno de específico a PC, tal como un carbohidrato para el cual existe un receptor en la APC, por ejemplo mañano o mañosa. 24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones .15-23 , caracterizado porque la segunda porción es una citosina seleccionada de interferón ? (IFN-y) , Flt3L, interlucina 1 (IL-1), interlucina 2 (IL-2), interlucina 4 (IL-4), interlucina 6 (IL-6), interlucina 12 (IL-12), interlucina 13 (IL-13), interlucina 15 (IL-15), y el factor de estimulación de colonia de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) , o una parte efectiva del mismo; una proteína de choque térmico seleccionada de HSP70, HSP90, HSC70, GRP94, y calreticulina (CRT) , o una parte efectiva de los mismos; o una hormona. 25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-24, caracterizado porque la tercera porción es un lípido tal como un grupo palmitoilo, un grupo miristilo, un grupo farnesilo, un grupo geranil-geranilo, un ancla de GPI y un grupo N-acil-diglicerido . 26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-25, caracterizado porque el primero/segundo análogo (s) tiene substancialmente la estructura terciaria completa del antígeno polipeptídico asociado a la célula. 27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-26, caracterizado porque la presentación por la APC se efectúa al administrar, al animal, una cantidad inmunogénicamente efectiva de al menos un primer análogo. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque también se administra una cantidad inmunologicamente efectiva de al menos un segundo análogo. 29. El método de conformidad con la reivindicación 27 o 28, caracterizado porque al menos un primero y/o un segundo análogo (s) se formula conjuntamente con un portador farmacéutica e inmunologicamente aceptable y/o vehículo, y opcionalmente, un adyuvante. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el adyuvante facilita la captación por las APC, tal como células dendríticas, de por lo menos el primero y/o segundo análogos . 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el adyuvante se selecciona del grupo que consiste de un adyuvante inmunitario de dirección al objetivo; un adyuvante inmunitario de modulación tal como una toxina, una citosina y un derivado micobacteriano; una formulación de aceite; un polímero; un adyuvante de formación de micela; una saponina; una matriz compleja de inmunoestimulación (matriz ISCO ) ; una partícula; DDA; adyuvantes de aluminio; adyuvantes de ADN; ?-inulina; y un adyuvante de encapsulamiento . 32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la citosina es como se define en la reivindicación 24, o una parte efectiva de la misma donde la toxina se selecciona del grupo que consiste de listeriolicina (LLO) , lípido A (MPL, L180.5/RaILPS) , y enterotoxina lábil al calor, en donde el derivado micobacteriano se selecciona del grupo que consiste de dipéptido de muramilo, adyuvante completo de Freund, RIBI, y un diéster de trehalosa tal como TDM y TDE, en donde el adyuvante inmunitario de dirección al objetivo se selecciona del grupo que consiste de ligando CD40, anticuerpo CD40 o específicamente fragmentos de unión de los mismos, mañosa, un fragmento Fab y CTLA-4, en donde la formulación de aceite comprende escualeno o adyuvante incompleto de Freund, en donde el polímero se selecciona del grupo que consiste de un carbohidrato tal como dextrano PEG, almidón, mañano y mañosa; un polímero plástico tal como; y látex tal como cuentas de látex, en donde la saponina es saponina de Quillaja saponaria, Quil A, y QS21, en donde la partícula comprende látex o dextrano. 33. El método según cualquiera de las reivindicaciones 27-32, caracterizado porque incluye la administración vía una ruta seleccionada de la ruta oral y la ruta parenteral tal como la ruta intradérmica, la subdérmica, la intracutánea, la subcutánea, la peritoneal, la bucal, la sublingual, la epidural, la espinal, la anal, y la intracraneal. 34. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-33, caracterizado porque incluye al menos una sola administración al año; tal como al menos 2, 3, 4, 5, 6, y 12 administraciones al año. 35. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la presentación se efectúa al administrar al animal, un microorganismo no patógeno o virus, que está portando un fragmento de ácido nucleico que codifica y que expresa al menos un epítope de CTL y al menos un epítope de TH. 36. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-14, caracterizado porque la presentación se efectúa al administrar, al animal un microorganismo o virus no patógeno que está portando al menos un fragmento de ácido nucleico que codifica y expresa al menos el primer análogo. 37. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-26, caracterizado porque el epitope TH y/o la primera y/o segunda y/o terceras porciones se presentan en la forma de compañeros de fusión a la secuencia de aminoácidos derivada del antigeno polipeptidico asociado a la célula, y en donde la presentación se efectúa al administrar al animal, un microorganismo o virus no patógeno que está portando al menos un fragmento de ácido nucleico que codifica para, y que expresa el primero y/o segundo análogo. 38. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-14 o 36, caracterizado porque la presentación e efectúa al administrar al animal, un microorganismo o virus patógeno que está portando al menos un fragmento de ácido nucleico que codifica para, y expresa, al menos el segundo análogo. 39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el microorganismo o virus no patógeno se administra una vez al animal. 40. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la presentación se efectúa al introducir in vivo, en la APC, al menos un fragmento de ácido nucleico que codifica para, y expresa, al menos un epitope de CTL y/o al menos un epitope de células B, y al menos un primer epitope TH extraño . 41. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-14, caracterizado porque la presentación se efectúa al introducir in vivo, en la APC, al menos un fragmento de ácido nucleico que codifica y que expresa el primer análogo. 42. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-26, caracterizado porque el primer epitope T¾ y/o la primera y/o segunda y/o terceras porciones están presentes en la forma de compañeros de fusión a la secuencia de aminoácidos derivada del antigeno polipeptidico asociado a la célula, y en donde la presentación se efectúa al introducir in vivo, el APC al menos un fragmento de ácido nucleico que codifica para, y expresa, el primero y/o segundo análogo. 43. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-14 y 41, caracterizado porque además comprende la introducción in vivo en la APC, de al menos un fragmento de ácido nucleico que codifica para, y expresa el segundo análogo. 44. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15,. caracterizado porque la presentación se efectúa al co-introducir in vivo, en la APC, al menos dos fragmentos de ácido nucleico en donde uno codifica para, y expresa al menos un epitope CTL y en donde el otro codifica para, y expresa al menos un primer epitope TH extraño, en donde el primer epitope TH extraño es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 21- 45. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-44, caracterizado porque el (los) fragmento (s) de ácido nucleico introducido se selecciona (n) de ADN desnudo, ADN formulado con lipidos cargados o no cargados ADN formulado y liposomas, ADN incluido en un vector vial, ADN formulado con una proteina o polipéptido que facilita la transfección, ADN formulado con una proteina polipéptido predirección al objetivo, ADN formulado con un carbohidrato de dirección al objetivo, ADN formulado con agentes de precipitación en calcio, ADN acoplado a una molécula portadora inerte y ADN formulado con un adyuvante. 46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el adyuvante se selecciona del grupo que consiste de los adyuvantes definidos en cualquiera de las reivindicaciones 30-32. 47. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones. 40-46, caracterizado porque el medio de administración es como se define en las reivindicaciones 33 a 34. 48. Un método para la selección de un análogo inmunogénico de un antigeno polipeptidico asociado a la ...^H^Uiii,''. célula que es débilmente inmunogénico o no inmunogénico en un animal, el análogo inmunogénico es capaz de inducir una respuesta de CTL en el animal contra células que exhiben una molécula de la Clase I MHC unida a un epitope derivado del antigeno polipeptídico asociado a la célula, el método está caracterizado porque comprende a) identificar al menos una secuencia de la secuencia de aminoácidos del antígeno polipéptido asociado a la célula que no contiene epítópes de CTL conocidos o previstos, b) prepara al menos un análogo putativamente inmunogénico del antigeno polipeptídico asociado a la célula al introducir, en la secuencia de aminoácidos del antígeno polipeptídico asociado a la célula, al menos un epitope TH extraño al animal en una posición dentro de al menos una sub-secuencia identificada en el paso a), y c) seleccionar los análogos preparados en el paso b) que son capaces en forma confiable de inducir una respuesta de CTL en el animal. 49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque 1) la subsecuencia identificada en el paso a) no contiene adicionalmente residuos de cisteina o de manera alternativa, en donde el epitope TH introducido en el paso b) no altera de forma substancial el patrón de los residuos de cisteina, y/o 2) la secuencia identificada en el paso a) no contiene adicionalmente sitios de glicosilación conocidos o previstos, de manera alternativa, en donde el epitope ?? introducido en el paso b) no altera de forma substancial el patrón de glicosilación, y/o 3) la subsecuencia identificada en el paso a) contribuye significativamente un efecto patofisiológico ejercido por el antigeno polipeptidico asociado a la célula, y en donde la introducción al paso b) del epitope TH extraño reduce o anula el efecto patofisiológico, y/o 4) la subsecuencia identificad en el paso a) es homologa . a una secuencia de aminoácidos de un antigeno de proteina diferente del animal, y en donde la introducción del epitope TH en el paso b) remueve sustancialmente la homología, y/o 5) la introducción en el paso b) del epitope TH extraño da por resultado la preservación de una fracción substancial de los epítopes de células B del antígeno polipeptidico asociado a la célula. 50. El método de conformidad con la reivindicación 49, cuando incluye la variante 5, caracterizado porque el análogo tiene la estructura terciaria completa del antigeno polipeptidico asociado a la célula. 51. Un método para al preparación de una célula que produce un análogo de un antigeno polipeptidico asociado a la célula, el método está caracterizado porque comprende introducir, en un vector, una secuencia de ácido nucleico que codifica para un análogo que está seleccionado de acuerdo al método de cualquiera de las reivindicaciones 48-50 y transformar una célula hospedadora adecuada con el vector. 52. Un método para la preparación de un análogo de un antigeno polipeptidico asociado en la célula, el método está caracterizado porque' comprende cultivar la célula obtenida de acuerdo al método de la reivindicación 51 bajo condiciones que facilitan la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica para el antigeno polipeptidido asociado a la célula y recuperar e análogo del sobrenadante de cultivo o de las células. 53. El método de . conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque además comprende el paso de purificar el análogo recuperado y opcionalmente someter el producto purificado a modificaciones pos-transduccionales artificiales tal como replegado, tratamiento con enzimas, modificación química y conj ugación . 54. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el antigeno débil asociado a las células se selecciona del grupo que consiste de 5-alfa reductasa, a-fetoproteina, AM-1, APC, APRIL, ' BAGE, ß-catenina, Bcl2, bcr-abl (b3a2 ) , CA-125, CASP-8 /FLICE, Catepsinas, CP19, CD20, CD21, CD23, CD22, CD33, CD35, CD44, CD45, CD46, CD5, CD46, CD5, CD52, CD55, (791Tgp72), CD59, CDC2 , CDK , CEA, c-myc, Cox-2, DCC, DCR3, E6,/E7, EGFR, EMBP, Ena78, farsil-transferasa, FGF8a o FGF8b, FLK-1/ DR, Receptor de Ácido Fólico, G250, Familia GAGE, gastrina 17, hormona de liberación de Gastrina (Bombesina) , GD2/GD3/GM2, GnRH, GnTV, GP1, gplOO/Pmel 17, gp-100-in4, gpl5, gp75/TRP-l, hCG, Heparanasa, Her2/neu, HMTV, Hsp70, hTERT (telomerasa) , IGFR1 , IL-13R, iNOS, Ki 67, KIAA0205, K-ras, H-ras, N-ras, SA (C017-1A) , LDLR-FUT, Familia MAGE, (MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, etc) , Mamoglobina, MAP17, Melan-A/MART-1 , mesotelina, MIC A/B, MT-MMP's, Moxl, Mucina tal como MUC-1, MUC-2> MUC-3, y MUC-4, que están glicosiladas de forma normal, MUM-1, NY-ESO-1, Osteonectina, pl5, P170/MDR1, p53, p97/melanotransferrina, PAI-1, PDGF, plasminógeno (uPA) PRAME, Probasina, Progenipoyetina, PSA, PSM, RAGE-1, Rb, RCAS1, SART-1, familia génica SSX (mucina asociada), TAG- 72, TGF-a, TGF-ß, Timosina ß 15, TNF-a TPA, TPI, TRP-2, Tirosina, VEGF, ZAG, pl6INK4, y Glutationa-S-transferasa . 55. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el antígeno polipeptidico asociado a la célula es PSM humana. 56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el epitope de células T, extraño se introduce en una parte de la secuencia de aminoácidos de PSM definida por SEQ ID NO: 2 posiciones 16-52 y/o 87-108 y/o 210-230 y/o 269-289 y/o 298-324 y/o 442-465 y/o 488-514 y/o 598-630 y/o 643-662 y/o 672-699. 5 . El método de conformidad con la reivindicación 55 o 56, caracterizado porque se usa en el tratamiento o mejora en el cáncer de próstata. 58. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el antigeno polipeptidico asociado a la célula es el factor de crecimiento de fibroblastos 8b (FGF8b) . 59. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el epitope de células T extraños se introduce en una parte de la secuencia de aminoácidos FGF8b definida por SEQ ID NO: 6, posiciones 1-54 y/o 178-215 y/o 55-58 y/o 63-68 y/o 72-76 y/o 85-91 y/o 95-102 y/o 106-111 y/o 115-120 y/o 128-134 y/o 138-144 y/o 149-154 y/o 158-162 y/o 173-177, y en donde la introducción no comprende de forma substancialmente preferente los aminoácidos 26-45 y los aminoácidos 186-215. 60. El método de conformidad con la reivindicación 58, o 59, caracterizado porque se usa en el tratamiento o mejora del cáncer tal como cáncer de próstata y cáncer de mama. 61. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el antígeno polipeptidico asociado a la células es Her2. 62. E método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque el epitope de células T, extraño se introduce en una parte de la secuencia de aminoácidos de Her2 definida de SEQ ID NO: 3 posiciones 5-25 y/o 59-73 y/o 103-117 y/o 149-163 y/o 210- 224 y/o 250-264 y/o 325-339 y/o 369-383 y/o 465-479 y/o 579-593.y/o 632-652 y/o 653-667 y/o 661-675 y/o 695-709 y/o 710-730. 63. El método de conformidad con la reivindicación 61 o 62, caracterizado porque se usa en el tratamiento o mejora del cáncer del mama. 6 . Un análogo del PSM humana que es inmunogénico en humanos, el análogo caracterizado porque comprende una parte substancial de los epítopes de células B y de CTL conocidos y previstos de PSM y que incluye al menos un epitope TH extraño como se define en cualquiera de las reivindicaciones 18-21. 65. El análogo de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque al menos un epitope TH extraño está presente como una inserción en la secuencia de aminoácidos de PSM o como una substitución de parte de la secuencia de aminoácidos de PSM o como el resultado de la supresión de parte de la secuencia de aminoácidos de PSM. 66. El análogo de conformidad con la reivindicación 65, ». caracterizado porque el epitope TH extraño se introduce, en las posiciones definidas en la reivindicación 56. 67. Un análogo de Her2 humano que es inmunogénico en humanos, el análogo caracterizado porque comprende una parte substancial de todos los epitopes de células B de CTL conocidos y previstos de Her2 y que incluye al menos un epitope TH extraño como se define en cualquiera de las reivindicaciones 18-21. 68. El análogo de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque al . menos un epitope TH extraño está presente como una inserción en la secuencia de aminoácidos Her2 o como una substitución de parte de la secuencia de aminoácidos Her2 o como resultado de la supresión de parte de la secuencia de aminoácidos Her2. 69. El análogo de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el epitope TH extraño se introduce en las posiciones definidas en las reivindicaciones 62. 70. Un análogo de FGF8b humano/murino que inmunogénico en humanos, el análogo caracterizado porque comprende una parte substancial de todos los epitopes de células B y células CTL, conocidos y previstos de FGF8b y que incluye al meno-s un epitope TH extraño como se define en cualquiera de las reivindicaciones 18-21. 71. El análogo de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque al menos un epitope TH extraño está presente como una inserción en la secuencia de aminoácidos FGF8b o como una substitución de parte de la secuencia de aminoácidos de FGF8b o como el resultado de la supresión de parte de la secuencia de aminoácido de FGF8b. 72. £1 análogo de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque el epitope TH extraño se introduce en las posiciones definidas en las reivindicaciones 59. 73. Una composición inmunogénica caracterizada porque comprende, como un agente inmunogénico efectivo el análogo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 64-72 se mezcla con un portador o vehículo farmacéuticamente e inmunológicamente aceptable, y opcionalmente un adyuvante. 74. Un fragmento de ácido nucleico caracterizado porque codifica para un análogo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 64-72. 75. Un vector caracterizado que tiene el fragmento de ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 74. 76. El vector de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque es capaz de la replicación autónoma. 77. El método de conformidad con la reivindicación 75 o 76, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de un plásmido, un fago, un cósmido, un mini-cromosoma, y un virus. 78. El vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 75-77, caracterizado porque comprende, en la dirección 5' 63' y el enlace operable, un promotor para impulsar la expresión del fragmento de ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 74, opcionalmente, una secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido guia que permite la secreción de, o interacción en, la membrana del fragmento polipeptidico, el fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 74, y opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica .·*-··· · 264 para un terminador. 79. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 75-78, caracterizado porque cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de la célula hospedadora o no es capaz de ser integrado en el genoma de la célula hospedadora. 80. Una célula transformada caracterizada porque tiene el vector de cualquiera de las reivindicaciones 75-79. 81. Una composición para inducir la producción de anticuerpos contra , PSM,. Her2> : o FGF8b, la composición está caracterizada porque comprende 1) un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 74, o un vector con cualquiera de las reivindicaciones 75-79, y 2) un diluyente farmacéuticamente e inmunológicamente aceptable y/o vehículo y/o un adyuvante. 82. Una línea de células estables caracterizada porque tiene el vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 75-79 y que expresa el fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 74, y que se agrega de forma opcional o tiene un análogo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 64-72 en su superficie. 83. Un método para la preparación de una de las células de acuerdo con la reivindicación 80, el método está caracterizado porque comprende transformar una célula hospedadora con el fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 74 o el vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 75-79.