KR20010085894A - 치료적 백신화를 위한 새로운 방법 - Google Patents

Abstract

세포성 항원에 대해 세포-매개성 면역성을 유도하기 위한 방법이 개시된다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 약한 항원, 특히 자가-단백질에 대해 세포독성 T-임파구 면역성을 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명은 약한 항원의 적어도 하나의 CTL 에피토프를 제시하고 이와 동시에 적어도 하나의 외래 T-헬퍼 임파구 에피토프를 제시하도록 항원 제시 세포를 유도하는 것을 수반한다. 바람직한 구체예에서, 이 항원은 예컨대 PSM, Her2, 또는 FGF8b와 같은 암에 특이적인 항원인 것이 좋다. 본 발명의 방법은 전통적인 폴리펩타이드 백신화를 이용해서 수행되지만, 살아있는 약독화 백신 도는 핵산 백신화도 이용할 수 있다. 또한 본 발명은 PSM, Her2 및 FGF8b의 면역원성 유사체, 및 이들 유사체를 코딩하는 핵산 분자들도 제공한다. 또한 벡터와 형질전환 세포들도 개시된다. 본 발명은 약하게 면역원성인 또는 비-면역원성인 항원의 면역원적 유사체의 동정방법도 제공한다.

Description

치료적 백신화를 위한 새로운 방법{NOVEL METHODS FOR THERAPEUTIC VACCINATION}

암에 대한 백신화라는 아이디어는 지난 100년 이상 동안 계속 제기되어왔고 그에 대한 활발한 연구가 지속되어 왔으며 이는 금세기 들어 더욱 그러하다.

그러나, 지난 10년간 면역 응답의 기초적인 분자수준의 메카니즘에 대한 이해가 상당한 수준으로 향상되었다. 이 기간 동안 달성된 가장 중요한 이정표는 지금도 그 목록이 늘어나고 있는 시토카인류와 성장 인자의 발견, T 세포와 B 세포사이의 상호작용 메카니즘의 이해뿐만 아니라 항원 제시시 MHC 클래스 I과 II 분자의 역할과 구조를 비롯한 세포성 항원 프로세싱 경로의 확립에 대한 이해였다. 암 면역학과 관련한 중요한 발견들 - 비록 아직도 완전히 이해되고 있지는 않지만 - 역시 숙주 내에서의 면역학적 관용성 유도의 기저에 깔려있는 메카니즘을 밝혀주었다. 이러한 모든 연구는 사람의 암의 새로운 치료법을 개발하려는 수많은 시도로 이어졌다.

종양 면역이 환자에 의해 어떻게 획득되는지에 따라, 면역요법은 수동과 능동으로 분류될 수 있다. 수동 면역요법에서는 환자가 시토카인, 항체, 세포독성 T-세포, 또는 임파구 활성화 킬러 (LAK: lymphocyte activated killer) 세포)와 같은 면역성분을 수동적으로 받는다. 이와 대조적으로, 능동 특이적 면역요법 프로토콜은 종양 세포나 그의 항원 성분의 백신화에 의한 종양 면역을 능동적으로 유도해내는 것을 포함한다. 이 후자의 형태가 바람직한데 이는 면역성이 연장되기 때문이다.

수동 및 능동적인 암 백신은 체액성 면역응답이나 또는 세포성 면역 응답을 유도하는데 촛점이 맞추어져 왔다. 능동 백신의 경우 항체나 세포독성 CD8 양성 T 세포를 2차적으로 유도하기 위해서는 CD4 양성 T 헬퍼 세포의 유도가 필요하다는 것은 잘 확립되어 있다.

항체를 이용한 수동 백신화

70년대 중반 모노클로날 항체 기술이 발견된 이래, 종양 특이적 또는 종양 관련 항원에 지향된 수많은 치료적 모노클로날 항체가 개발되었다. 모노클로날 항체 용법은 그러나, 다음과 같은 몇가지 심각한 문제점을 가지고 있다:

- 이들 외래 물질의 주입은 주입된 항체에 대한 환자의 면역 응답을 유도하고, 이는 치료효율을 감소시킬 뿐만 아니라 환자에게 심각한 알레르기성 부작용을 일으킬 수 있다.

- 모노클로날 항체는 대개 대량으로 투여하여야 한다. 이것은, 모노클로날 항체의 생산비용이 고가임을 감안할때 큰 문제가 된다.

- 모노클로날 항체는 비경구 경로로 투여되어야만 하고 비교적 대량으로 필요하기 때문에, 환자들은 치료기간 중에 종종 입원해야만 한다.

- 치료 효과를 유지하기 위해서는 모노클로날 항체의 주입을 비교적 자주 (주일 단위로) 반복해야만 한다.

- 모노클로날 항체는 대개는, 보체, NK-세포 또는 종양 세포를 사멸시키는 대식세포와 같은 면역 시스템의 2차 이펙터 (effector) 시스템을 활성화시키지 못한다.

마지막 단점은 특히 암 치료시 중요하며 몇가지 경우에 있어서 왜 암에 대한 모노클로날 항체 요법이 특히 성공적이지 못했는지에 대한 중요한 이유가 될 수 있다. 요새 여러 회사들이 이용하고 있는 소위 인간화 (humanised) 모노클로날 항체는 덜 면역원성이지만, 불행히도 이들은 2차 면역 이펙터 시스템을 활성화시키는 능력은 덜하다. 뿐만 아니라, 본래의 종양 항원이 결여된 종양의 2차적인 결과의 예가 관찰되었는데, 이는 이러한 항체들이 종양 항원을 지니지 않는 종양 세포에 대해 "무고한 방관자 (innocent bystander)"를 유도하지 않기 때문이다.

모노클로날 항체의 빈약한 이펙터 능력은 여러가지 독소와 방사능 동위원소에 화학적으로 컨쥬게이트된 모노클로날 항체의 개발로 이어졌다. 예컨대 Pharmacia Upjohn AB사는 종양에서의 T 세포를 활성화시킬 목적에서 모노클로날 종양 특이적 항체와 Staphylococcus aureus 독소 A 사이의 컨쥬게이트를 개발하였다. Medarex Inc.사는 종양 세포의 대식세포 사멸을 활성화시킬 목적으로, 종양 특이적인 Fab 단편뿐만 아니라 Fc-수용체 특이적인 항체 단편을 함유하는 이중특이적인 모노클로날 항체를 개발하였다. 두가지 구조물 모두 모노클로날 항체 단독에 비해 더욱 효과적이지만, 그만큼 더 비싸고 면역원적이기도 하다. 방사능동위원소에 컨쥬게이트된 항체들 역시 고가일 뿐만 아니라 면역원성이고 그 밖의 일반적인 독성 부작용도 관찰된다.

모노클로날 항체 기술의 출현은 잘 정의된, 고-친화성 결합 분자의 생산을 가능케 한 중요한 진전이었다. 그러나, 이들 항체들은 모노클로날이기 때문에 종양 항원 상의 오직 한 종류의 에피토프와만 반응한다. 이것은 이들이 왜 대체로 보체 시스템이나 대식세포와 NK-세포의 Fc-수용체에 대한 결합을 활성화시키지 못하는지에 대한 중요한 이유이다. 이들 매우 강력한 이펙터 시스템은 대개 항원으로부터 뻗어나온 복수개의 Fc 항체 단편들의 공동-국소화 (co-localisation)을 필요로 한다.

따라서 다른 연구자들은 2개의 모노클로날 항체들을 결합적으로 사용하는 시도를 했는데 이는 향상된 효과를 일으켰다. 따라서 그 대신 종양-특이적인 또는 (과발현된) 종양 관련 항원 또는 성장인자 수용체에 지향된 고도로 특이적인 폴리클로날 항체로 종양세포를 공걱하는 것이 매우 합리적인 것처럼 보인다. 이러한 항체들은 상술한 2차 이펙터 시스템을 완전히 활성화시킬 수 있을 것이다. 뿐만 아니라, 이러한 이펙터 시스템에 의해 유도된 국소적인 염증성 반응은 종양 조직 중 종양 특이적인 TIL's (tumor infiltrating lymphocytes: 종양 침윤 임파구)의 활성화 뿐만 아니라 문제의 종양 항원을 발현하지 않는 "순결한 방관자" 세포에 대해서도 2차적인 효과를 미칠 수 있을 것이다. 이러한 효과는 이중-특이적인 모노클로날 항체 컨쥬게이트를 이용한 Medarex Inc.사에 의해 관찰되었다.

모노클로날 항체 기술의 발견 이래로 암 치료를 위한 폴리클로날 항체의 잠재적인 용도는 그다지 많이 연구되지 않았다 (후술될 항원의 경우를 제외하고). 그 한가지 중요한 이유는 잘 정의된 종양 특이적인 또는 종양 관련 효면 항원이 최근들어서야 비로소 특성화되었다는 것이지만, - 보다 중요하게는 - 이들 중 많은 것이 자가-항원 (self-antigens)으로 판명되었기 때문에 비-면역원성이기 때문이었다. 따라서, 그 효과를 연구하기 위해서 이종 (xenogenic) 폴리클로날 항체가 이용되게 되었다. 그러나, 이러한 항체는 주입된 외래 폴리클로날 항체에 대해 격렬한 면역 응답을 유도하므로 이는 치료효과를 급속히 상쇄시킨다.

항체를 유도하기 위한 능동 백신화

암 환자에 있어서 능동 백신화에 의해 치료적인 폴리클로날 자가항체를 유도하기 위한 최근의 시도는 성공적이었다. 막 결합 탄수화물 자가 항원 (O-결합된 비정상적으로 발현된 Tn 및 sTn-항원과 강글리오사이드 리포사카라이드 GM2 및 GD3 등)에 대한 백신이 개발되었다. 이들 작은 탄수화물 구조물들은 그러나, 매우 약한항원이어서, 이 분자들과 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 또는 양의 뮤신 (Tn- 및 sTn을 함유하는)과 같은 담체 분자들과의 컨쥬게이트들이 이용되어야만 한다. 흑색종 환자에 있어서 항-GM2 항체들의 유도는 연장된 51개월 후의 최소 팔로우-업 후 전체적인 생존능력과 질병없는 기간이 연장된 것과 관련있다. 또한 유방암 환자에 있어서 DETOX-B 어쥬번트 (BIOMIRA Inc.) 중 sTn과 KLH의 컨쥬게이트를 이용한 무작위화된 페이즈 II 연구도 행해졌는데, 그 결과 sTn 면역 환자가 대조군에 비해 평균 생존 시간이 현저히 연장된 것으로 나타났다. 암에 있어서 폴리클로날 항체의 능동 유도의 또 다른 예는 B-세포 임파종에 대한 이디오타잎 특이적인 백신화의 용도로서 이것은 - 비록 이것이 유망하기는 하지만 - 이 암 종류에만 한정되어 있다.

마지막으로, 미국 회사인 Aphton Inc.사는 고나도트로핀 방출 호르몬 (GnRH)와 가스트린에 대한 능동적인 컨쥬게이트 백신을 개발하였다. 이 백신은 어떤 종양 세포에 대한 오토크라인 성장 인자로서 기능할 수 있는 것으로도 알려진 이들 호르몬의 생물학적 활성을 제어할 수 있다는 것이 증명되었다. 성공적인 제 2상 임상 시도가 위장 암 환자에 행해졌으며 제 III상 임상 시도도 진행중에 있다.

세포독성 T-세포

여러 그룹의 연구진들에 의해 많은 종양에 종양 특이적인 세포독성 T 세포 (CTL's)가 존재한다는 것이 명백히 입증된 바 있다. 이 CTL's은 종양 침윤 임파구 (TIL's: tumour infiltrating lymphocytes)라고 명명된다. 그러나, 이 세포들은 종양 세포에 의한 면역억압적 시토카인의 분비, 공동-자극 시그날의 결핍, MHC 클래스 I 분자의 다운 조절 등을 비롯한 여러가지 다양한 가능한 메카니즘에 의해 어떻든 간에 비-응답성 또는 면역결핍성 (anergic)으로 된다.

TILs에 의해 인식되는 종양 특이적인 HLA 클래스 I 결합 펩타이드를 분리하려는 시도가 많이 행해져 왔는데, 몇몇 경우에는 성공적이기도 하였다 (예컨대 흑색종 관련 항원으로부터의 펩타이드). 이러한 펩타이드들은 숙주에서 종양 특이적인 면역 응답을 유도하는데 이용되어 왔지만 백신에 있어서 종양 특이적인 펩타이드의 실제적인 이용은 펩타이드의 HAL 클래스 I 결합 특이성이 좁기 때문에 제한된 파퓰레이션 범위로 제한되고 있다. 뿐만 아니라, 합성 펩타이드를 이용해서 생체내에서 CTL 응답을 일으키는 것은, MHC 클래스 I 분자의 외래적인 프라이밍이 어렵기도 하지만 이 물질들의 생물학적 반감기가 낮은 이유로 해서 대개는 비교적 어렵다.

시토카인을 이용하거나 (예컨대 IL-2, IFN-감마, IL-6, IL-4, IL-10 또는 GM-CSF) 또는 공동-자극 분자 (B7)를 용해된 형태나 또는 형질전환된 종양 세포에 의해 발현된 형태로 이용하는 등 종양 특이적인 CTL 응답을 일으키기 위해 많은 다른 접근방식이 시도되었다. 또한, 동종적 (allogenic) 또는 자가적 (autologous) 전체 세포를 이용한 면역화, 또는 MHC 클래스 I 항원 제시 경로를 통해 항원을 제시하기 위해 고안된 특이화된 어쥬번트 중에 제조된 종양 항원 또는 예컨대 백시니아 벡터 등 중에서 발현된 종양 항원의 면역화가 이용되어 왔으며 그 성공도는 각기 달랐다. 따라서 종양 면역학자은 아직까지 종양을 제거하는 가장 좋은 방법은 강력하고 특이적인 항-종양 CTL 응답을 유도하는 것이라고 일반적인 믿고 있다.

이러한 처치가 대개 매우 돈이 많이 들고 재생하기가 어렵다는 사실은 차치하고, 많은 종양 관련 항원들이 대부분의 T 세포가 관용적인 것으로 나타나는 진정한 자가-단백질이므로 해서 우수한 면역 응답을 얻기가 매우 어렵다는 것도 드러났다. 따라서, 환자에게서 조절적인 방식으로 세포성 자가면역 조건을 유도할 필요가 있는 것으로 보인다.

발명의 목적

본 발명의 한가지 목적은 예컨대 종양 항원과 같이 바람직하지 못한 항원에 대해 숙주 생명체 내에서 면역 응답을 유도하기 위한 개선된 방법 및 제제를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 바람직하지 못한 항원에 대해 효과적인 면역 응답을 유도할 수 있는 그러한 바람직하지 못한 항원, 유사체 (analogue)등과 같은 폴리펩타이드 유사체를 제조하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

발명의 요약

항원의 생산은 2가지 별개의 경로, 즉, 클래스 II 외래성 경로와 클래스 I 내인성 경로로 이루어지는 것으로 도그마적으로 여겨져왔다.

간단히 말해서, 세포 외부로부터 또는 세포막으로부터의 외래 단백질이 APC에 의해 엔도좀으로서 테이크업되어 이것이 단백질 분해 효소와 MHC 클래스 II 분자를 함유하는 세포내 구회과 융합한다는 것이다. 생산된 펩타이드들 중 몇몇은 클래스 II와 결합하고 이는 다시 세포 막으로 전위된다.

클래스 I 내인성 경로는 주로 세포질 단백질을 생산한다는 특징을 갖는다. 이것은 소포체 (ER:endoplasmic recitulum) 막에 이치하는 TAP 분자를 통해 소포체내로의 펩타이드의 전달이 부수되는 프로테아좀 매개성 분할에 의해 일어나는 것으로 믿어지고 있다. ER 에서 펩타이드는 클래스 I에 결합된 다음 플라즈마 막에 전달된다.

그러나, 이들 2가지 경로들은 완전히 구별되지는 않는다. 예컨대, 수지상 세포와 어느 정도까지의 대식세포들은 세포외 단백질에 대한 식세포 (음세포) 작용을 할 수 있고 그 후 이들을 MHC 클래스 I의 관점에서 생산하는 것으로 알려져 있다. 또한 예컨대 산화철 비드에의 커플링에 의해, 특이화된 투여경로를 이용함으로써 외래성 항원을 클래스 I 경로에 진입시킬 수 있다는 것도 이전부터 입증된 바 있다 (Rock, 1996). 이 메카니즘은 세가지 세포 유형의 클러스터를 이끌어내기 위핸 동일한 APC에 대한 클래스 I 및 클래스 II 두가지 모두의 동시적인 발현의 중요성으로 인해 중추적인 것으로 보인다. 이 세가지 세포 클러스터 유형의 상호작용은 Mitchison (1987)에 의해 그리고 나중에 다른 저자들에 의해 제안되었다. 이들은 동일한 APC에 대한 클래스 I과 클래스 II 에피토프의 동시적인 제시가 중요하다는 것을 보여주었다. CTL 활성화에 대한 최근 설명된 메카니즘에 따르면 (cf. Alanzavecchia, 1998, Nature393: 413, Matzinger, 1999, Nature Med.5: 616, Ridge 외, 1998, Nature393: 474, Bennet 외, 1998, Nature393: 478, Schoenberger 외 1998, Nature393: 480, Ossendrop 외, 1998, J. Exp. Med187: 693 및 Mackey외, 1998, J. Immunol161: 2094), MHC 클래스 II에 대한 전문적인 APCs 제시 항원은 T 헬퍼 세포에 의해 인식된다. 이것은 APC의 활성화를 야기한다 (T 헬퍼 세포에 대한 CD40L과 APC에 대한 CD40의 상호작용에 의해 매개됨). 이것은 APC로 하여금 CTLs을 직접 자극할 수 있게 하여 그를 활성화시킬 수 있게 된다. 예컨대 도 2 참조.

외래 MHC 클래스 II 제한 T 헬퍼 세포 에피토프의 자가-항원내로의 삽입은 비-변형 자가-항원에 대ㅐ 지향된 강력한 교차-반응적 항체 응답을 유도해낼 수 있는 항원을 제공시킨다는 것이 이전부터 입증되어 있다 (예컨대 본 출원인의 WO95/05849 참조). 자가항원의 유도는 삽입된 외래 에피토프에 의해 유도된 특이적인 T 헬퍼 세포에 의해 기인한다는 것이 알려져 있다.

그러나, 본 발명자들은 변형된 자가-항원들이 - 적절한 어주번트의 협력 하에 - MHC 클래스 I 제한된 자가-에피토프에 대한 강력한 CTL 응답도 유도할 수 있어야 한다는 결론에 이르게 되었고, 그 결과 WO95/05849에 설명된 기술을 변형시켜 MHC 클래스 I의 컨텍스트에서 제시된 에피토프를 갖는 세포내 및 기타 세포-관련 항원에 대한 백신화도 제공할 수 있었다.

WO 95/05849에 설명된 자가백신 기술은 MHC 클래스 II 항원 프로세싱 경로 내로의 업테이크를 위해 변형된 자가-항원이 투여될 경우 자가-반응성 B 세포에 특이적인 T 세포 협력이 제공된다는 효과를 갖는다 (예컨대 도 1, 및 Dalum I 외, 1996, J. Immunol. 157: 4796-4804 및 Dalum I 외, 1999, Nature Biotechnol. 17: 666-669 참조). 자가-단백질을 인식하는 잠재적으로 자가-반응성인 B-임파구들이 정상적인 개체에서 생리학적으로 존재한다는 것이 알려졌다. 그러나, 해당 자가-단백질과 반응성인 항체들을 실질적으로 생산하기 위해 이러한 B-임파구들이 유도되기 위해서는 시토카인 생산 T-헬퍼 임파구로부터의 도움이 필요하다 (T_H-세포 또는T_H-임파구). 일반적으로 T-임파구는 항원 제시 세포 (APCs: antigen presenting cells)에 의해 제공될 경우 자가-단백질로부터 유도된 T-세포 에피토프를 인식하지 않기 때문에 이러한 도움은 제공되지 않는다. 그러나, 자가-단백질에 "외래성" 요소를 제공함으로써 (즉, 면역학적으로 유의적인 변형을 도입함으로써), 외래 요소를 인식하는 T-세포들이 APC에 대한 외래 에피토프를 인식하면 활성화된다. (먼저 단핵세포 등과 같이). 변형된 자가-단백질에 대한 자가-에피토프를 인식할 수 있는 폴리클로날 B-임파구 (T-세포 에피토프를 생산하는) 역시 항원을 인터널라이즈하여 후속적으로 그의 외래 T-세포 에피토프(들)을 제시시키며, 활성화된 T-임파구는 이들 자가-반응성 폴리클로날 B-임파구에 시토카인 원조를 제공해준다. 이들 폴리클로날 B-임파구에 의해 생산된 항체들은, 천연 폴리펩타이드 내에 존재하는 것들을 비롯한, 변형된 폴리펩타이드 상의 상이한 에피토프들과 반응성이기 때문에, 변형되지 않은 자가-단백질과 교차-반응하는 항체들이 유도된다. 결론적으로, 삽입된 에피토프(들)만이 숙주에 대해 외래성인데도 불구하고, 폴리클로날 B-임파구 집단이 완전히 외래성인 항원을 인식하기라도 한 것처럼 T-임파구가 작용하도록 유도될 수 있다. 이러한 방식으로, 변형되지 않은 자가-항원과 교차-반응할 수 있는 항체들이 유도된다.

상술한 바와 같이, CTL's 역시 특이적인 T 세포 원조를 요구하는데, 아직 그에 대한 정확한 메카니즘은 밝혀지지 않았다.

본 발명은 외래 MHC 클래스 II 에피토프를 함유하는 자가-단백질들이 외래업테이크에 이어, 예컨대 대식세포와 수지상 세포의 MHC 클래스 I 항원 프로세싱 경로 내로 접근할 수 있다는 본 발명자들의 새로운 이론에 기초하고 있다. 이러한 방식으로 자가-단백질 중 두번째로 우세한 에피토프에 대한 강력한 CTL 응답을 유도할 수 있다. 다른 한편, 변형된 종양 항원을 코딩하는 유전자들은 핵산 백신으로서 투여될 수 있으며 이는 실질적으로 MHC 클래스 I 매개성 면역 응답뿐만 아니라 MHC II 클래스 매개성 면역 응답도 이끌어낸다.

종양 세포는 불충분한 MHC 클래스 I 발현, 면역억압성 시토카인의 분비 또는 공동-자극 분자의 결핍 등으로 인해 매우 약한 항원 제시 세포들이다. 상술한 자가백신 구조물과 백신화 프로토콜을 이용함으로써 전문적인 항원 제시 세포에 대한 MHC 클래스 II 분자들 뿐만 아니라 MHC 클래스 I 분자들에 의해 변형된 종양 항원이 제시될 수 있다. MHC 클래스 I에 대한 버금가는 자가-에피토프와 MHC 클래스 II 분자에 대한 면역으뜸적인 외래 에피토프의 공동-제시는 MHC 클래스 I 제한 CTLs에 대한 활성화된 MHC 클래스 II 제한 T-헬퍼 세포들에게로 직접적인 시토카인 원조를 매개해줄 것이다 (도 2). 이것은 본 발명자들의 의견으로는 종양 항원을 향한 T 세포 자가관용의 특이적인 파괴로 이어질 것이고 이것은 암 면역요법에서 설명되는 것과 정확하게 일치하는 것이다.

결론적으로 말하면, 상기 개략한 바와 같은 기술을 이용해서 제조된 백신은항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC: antibody dependent cellular cytotoxicity) 활성 및 보체의 2차적인 활성화에 의해 체액성 자가항체 응답을 유도할 것이다. 또한 예컨대 종양 특이적인 막 항원에 대해 지향된 세포독성 T 세포 응답도 유도할것으로 기대된다.

따라서, 최광의 및 가장 일반적인 범주에서, 본 발명은 인간을 비롯한 동물에 있어서, 그 동물에 있어서 약하게 면역원성이거나 또는 비-면역원성인 폴리펩타이드 항원에 대한 면역 응답을 유도하기 위한 방법에 관한 것으로, 이 방법은 그 동물의 면역계로부터의 항원 제시 세포 (APCs)에 의해,

1) 폴리펩타이드 항원으로부터 유래된 적어도 하나의 CTL 에피토프 및/또는 세포-관련 폴리펩타이드 항원으로부터 유래된 적어도 하나의 B-세포 에피토프 및

2) 그 동물에 대해 외래성인 적어도 하나의 제 1 T 헬퍼 세포 에피토프 (T_H에피토프)의 면역원적 유효량을 동시적으로 제시시키는 것으로 이루어진다.

본 발명의 방법의 보다 구체적인 변형예에서는, 본 발명은 표면에 세포-관련 폴리펩타이드 항원을 담지하거나, 세포내 구획 내에 세포-관련 폴리펩타이드 항원을 지니고 있는 특이적인 세포독성 T-임파구 (CTL) 응답을 유도함으로써, 인간을 비롯한 동물에서 그 동물에 있어서 약하게 면역원성이거나 비-면역원성인 세포-관련성 폴리펩타이드 항원을 다운-조절하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 그 동물에서 적절한 항원 제시 세포 (APC)에 의해,

1) 세포-관련 폴리펩타이드 항원으로부터 유래된 적어도 하나의 CTL 에피토프 및

2) 그 동물에 대해 외래성인 적어도 하나의 제 1 T-헬퍼 임파구 (T_H) 에피토프를 동시에 제시시키는 것으로 이루어진다.

또한, 면역원성 제제를 제조하기 위한 새로운 전략도 본 발명의 일부이다. 이러한 신규한 전략은 약한 세포-관련 항원의 유사체의 선별 및 생산을 포함하며, 여기서, 공지의 예측되는 CTL 에피토프의 실질적인 분획의 보존이 목표가 되며, 이와 동시에 적어도 하나의 외래성 T_H에피토프의 도입도 목표가 된다.

뽄만 아니라, 본 발명은 공지의 종양-관련 항원에 기초한 특정한 특이적 면역원성 구조물 및 이러한 구조물을 함유하는 조성물에도 관계된다.

마지막으로, 본 발명은 핵산 단편, 벡터, 형질전환된 세포 및 종양-관련 항원의 유사체 생산을 위한 분자생물학적 방법에 유용한 기타의 수단에도 관계된다.

본 발명은 비-면역원성 또는 면역원성이 약한 세포-관련 유전자 발현 산물의 존재로 특징지어지는 암과 같은 질환을 치료하는 새로운 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 세포독성 T-임파구 (CTLs: cytotoxic T-lymphocytes)에 의해 수행되는 면역응답을 유도함으로써 유전자 발현 산물로부터의 에피토프를 지니는 세포들을 CTLs에 의해 공격 및 사멸시키기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 약하게 면역원적인 항원으로부터 유래된 면역원성의 변형된 폴리펩타이드 항원을 제조하는 방법에 관한 것이기도 하다.

본 발명은 암에 대한 치료적 백신화 분야의 범위 내에서는 본 출원인의 AutoVac 기술 (WO 95/05849의 주제임)에 관한 일련의 출원에도 관계되어 있다.

도 1은 전통적인 AutoVac 개념도이다. A: T 헬퍼 세포 (Th) 레퍼토리 중에서의 고갈로 인해 항원 제시 세포 (APC)상에서 MHC 클래스 II 상에 제시된 으뜸관용성 자가-에피토프는 무시된다 (T 헬퍼 세포는 점선으로 표시됨). MHC 클래스 II 상에 삽입된 외래의 으뜸 면역성 T 세포 에피토프와 MHC 클래스 II 상의 외래성 으뜸면역성 T 세포 에피토프를 제시하는 자가-단백질의 천연적인 일부에 대해 특이적인B 세포 (B)는 T 헬퍼 세포에 의해 제공된 시토카인 협력에 의해 활성화된다.

도 2는 CTL 응답을 유도하기 위한 AutoVac 개념도이다. MHC 클래스 II 상에 제시된 삽입된 외래 으뜸면역성 T 세포 에피토프들은 T 헬퍼 세포들을 활성화시킨다. MHC 클래스 I상에 제시된 버금가는 자가-에피토프를 인식하는 CTL's'은 인접한 활성화된 T 헬퍼 세포에 의해 활성화된다.

도 3은 Her2 폴리펩타이드를 도식적으로 나타낸 도면으로서 에피토프 대역과 N-글리코실화 부위를 나타내었다. 4개의 세포외 대역, 즉 트랜스막 (TM) 대역과 2개의 세포내 대역은 여러가지 상동 정도 및 추정적/결정된 CTL 에피토프를 함유하는 부위를 표시하면서 나타내었다.

도 4는 인간의 PSM 폴리펩타이드를 개략적으로 나타낸 것으로 P2 및 P30 에피토프에 대한 삽입 대역을 표시하였다.

도 5는 FGF 유전자 및 단백질을 나타낸 도면이다. A: 인간 및 마우스 FGF8 유전자의 엑손-인트론 구조. 아래에 8개의 상이한 스플라이스 형태 (Gemel 1996으로부터)를 도시하였다. B: 여러가지 FGF8 이소형태의 아미노산 서열. FGF8b, FGF8f, 및 FGF8a에 독특한 폴리펩타이드 스트레치들을 굵운 문자 및 이탤릭체 또는 밑줄로 표시하였다. FGF8a는 이들 하일라이트된 서열을 어느것도 함유하지 않는 최단 변형물이다. 시그날 펩타이드는 Ala22로 C-말단적으로 절단될 것으로 예상된다. 성숙한 FGF8에서 발견되는 2개의 시스테인 잔기 (모두 이소형태)는 굵은 문자로 밑줄표시하였다. FGF8b의 2개의 잠재적인 N-글리코실화 부위는 N으로 표시한다. 넘버링은 FGF8b에 따른다.

도 6은 자가박신화를 위해 고안된 FGF8b의 4가지 상이한 변형예를 도시한 것이다. 상부 패널: 템플레이트로서 FGF2 결정 구조를 이용한 에피토프의 삽입-포인트의 이론적 모델. 하부 패널: 야생형 FGF8b (WT) 및 4개의 변형체 F30N, F2I, F30I 및 F2C의 아미노산 서열. 시그날 펩타이드를 한번 밑줄그었다. 삽입된 펩타이드들은 두번 밑줄그어 표시하여다. 모든 변형체의 N-말단 서열 (MetAla)은 진핵생물 시스템에서 보다 나은 번역을 위한 Kozak-서열 (Kozak 1991)의 생산에 기인한다.

정의

본 발명의 경계 및 범위를 명료히 하기 위해 다음에 본 발명의 상세한 설명과 청구범위에서 사용된 몇가지 용어들을 상세히 정의 및 설명한다.

본 발명의 명세서와 청구범위에서 "세포-관련 폴리펩타이드 항원:cell-associated polypeptide antigen"이라 함은 여하튼 병리학적 경과와 관련된 세포에로 한정된 폴리펩타이드를 가리키는 것이다. 또한, 이 세포는 그 표면에 MHC 클래스 I 분자에 결합된 폴리펩타이드 항원의 CTL 에피토프를 제시한다. 따라서 세포-관련 폴리펩타이드 항원은 진정한 세포내 항원 (따라서 체액성 면역 응답에 도달불가능한 (unreachable)) 또는 세포 표면에 결합된 항원일 수 있다. 세포-관련 항원은 세포 자신의 유전자 발현, 세포내 기생충, 또는 바이러스, 또는 다른 세포의 산물일 수 있다. 후자의 경우 폴리펩타이드 항원은 후속적으로 병리학적 경과에 관려된 세포와 연관된다.

"T-임파구"와 "T-세포"라는 용어는 체액성 면역 응답에 있어서 헬퍼 활성과 같은 이펙터 기능뿐만 아니라 여러가지 세포 매개성 면역 응답에 책임이 있는 흉선 기원의 임파구를 가리키는데 혼용될 것이다. 마찬가지로, "B-임파구"와 "B-세포"라는 용어도 항체-생산 임파구를 가리키는 용어로써 함께 사용될 것이다.

"항원 제시 세포" (APC)는 T-세포에 에피토프를 제시하는 세포이다. 전형적인 항원-제시 세포는 대식세포, 수지상 세포 및 기타 식세포작용과 음세포작용을 하는 세포들이다. B- 세포도 T_H세포에 대한 MCH 클래스 II 분자에 결합된 T_H에피토프를 제시함으로써 APC로서 기능하긴 하지만, 일반적으로 본 발명에서 APC라는 용어는 상술한 식세포 및 음세포를 가리키는 것으로 의도된다.

"헬퍼 T-임파구" 또는 "T_H세포"라 함은 항원 제시 세포상의 MHC 클래스 II 분자에 결합된 T_H에피토프의 인식을 통해 세포독성 T-세포와 B-세포를 돕는 CD4 양성 T-세포를 가리킨다.

"세포독성 T-임파구" (CTL: cytotoxyc T-lymphocyte)는 활성화되려면 T_H세포의 도움을 필요로 하는 CD8 양성 T-세포를 가리키는 것이다.

본문에서 "특이적" 면역 응답이라는 용어는 주로 분자 또는 준-동일 (quasi-identical) 분자 그룹에 대해 지향된, 또는 다른 한편으로는, 분자 또는 준-동일 분자 그룹의 CTL 에피토프를 제시하는 세포들에 대해 지향된 폴리클로날 면역 응답을 가리키는 것으로 한다.

"약한 면역원성 또는 비-면역원성 폴리펩타이드 항원"이라는 용어는 문제의 동물로부터 유래된 약한 세포-관련 단백질 항원의 아미노산 서열을 갖는 것을 가리키는 것이지만, 다른 종으로부터 분리된 이러한 단백질의 유사체와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드도 이 용어에 포함되는 것으로 한다. 이종 시스템에서의 그의 생산으로 인해 (예컨대 효모 또는 다른 비-포유류 진핵세포 발현계 또는 심지어는 원핵세포계) 글리코실화 패턴을 달리하는 폴리펩타이드 형태들도 이 용어의 범주에 포함된다. 그러나, 이 용어를 사용할 경우, 문제의 폴리펩타이드가 보통은 처리하고자 하는 동물에서의 그의 천연적인 위치에서 비-면역원성이거나 오직 약하게만 면역원성인 것을 가리키는 것임에 유의하여야 한다.

본 발명에서 "폴리펩타이드"라 함은 2 내지 10개의 아미노산 잔기로 된 짧은 펩타이드, 11 내지 100개의 아미노산 잔기로 된 올리고펩타이드, 및 100개가 넘는 아미노산 잔기로 된 폴리펩타이드를 모두 의미하는 것으로 한다. 뿐만 아니라, 이 용어는 단백질, 즉 적어도 하나의 폴리펩타이드를 함유하는 기능적인 바이오분자와 같은 단백질도 의도하는 것이며; 적어도 2개의 폴리펩타이드를 함유할 경우, 이들은 공유적으로 연결될 복합체를 형성하거나, 또는 비-공유적으로 연결될 수 있다. 어떤 단백질 중의 폴리펩타이드(들)은 글리코실화 및/또는 지질화 및/또는 보철기 (prosthetic groups)를 함유할 수 있다.

"서브서열 (subsequence)"이라 함은 자연발생적인 아미노산 서열, 또는 핵산 서열로부터 각각 적어도 3개의 아미노산, 또는 타당한 경우, 적어도 3개의 뉴클레오타이드의 연속적인 스트레치를 의미하는 것이다.

본 발명에서 "동물"이라는 용어는 일반적으로 Homo sapiens, Canis domesticus,등과 같은 동물 종 (바람직하게는 포유류)를 가리키는 것이며, 어떤 하나의 단일 동물만을 가리키는 것이 아니다. 그러나, 이 용어는 어떤 동물 종과 같은 집단을 가리키기도 하는데, 이는 본 발명의 방법에 따라 면역된 동물 개체들 모두가 동일한 면역원(들)을 이용한 동물의 면역화를 가능케하는, 실질적으로 동일한 약한, 세포-관련 폴리펩타이드 항원을 제공하는 것이 중요하기 때문이다. 예컨대, 폴리펩타이드의 유전적 변형물이 상이한 인간 집단에 존재할 경우, 각각의 집단에서 약한, 세포-관련 폴리펩타이드 항원에 대한 자가관용을 파괴할 수 있기 위해서는 이들 상이한 집단에서 상이한 면역원을 이용할 필요가 있을 수 있다.

본 발명에서 "세포-관련 폴리펩타이드 항원의 다운-조절"이라는 용어는 문제의 항원의 양 및/또는 활성이 살아있는 생명체 내에서 감소함을 의미한다. 다운-조절 (down-regulation)은 몇가지 메카니즘에 의해 얻어질 수 있다: 이들 중, 항체 결합에 의한 항원 중의 활성 부위의 간단한 간섭이 가장 간편하다. 그러나, 항체 결합이 스캐빈져 세포 (예컨대 대식세포 및 기타 식세포작용을 하는 세포들)에 의한 폴리펩타이드의 제거를 초래하고, 더욱 중요한 것으로서, 항원을 지니거나 제공하는 세포들이 동물에서 CTL에 의해 사멸되는 것도 본 발명의 범위에 포함되는 것이다.

"적절한 APC에 의한 동시적인 제시의 수행 (effecting simultaneous presentation by a suitable APC)"라는 표현은 그 동물의 면역계를 조절적인 방식으로 면역원성 챌린지시키고 그로 인해 문제의 에피토프의 APCs에 의해 동시적인 제시가 야기된다는 것이다. 하기 설명으로부터 나타나는 바와 같이, 면역계의 이러한 챌린지는 몇가지 방식으로 수행될 수 있으며 그 중 가장 중요한 것은 "파마신(pharmaccines)" (즉 진행중인 질병을 치료 또는 경감시키기 위해 투여되는 백신)을 함유하는 폴리펩타이드를 이용한 백신화이거나 또는 핵산 "파마신" 백신화이다. 동물에 있어서 면역 경쟁적인 세포들이 면역학적으로 효과적인 방식으로 타당한 에피토프를 나타내는 APCs에 직면하게 하는 것이 달성하고자 하는 주요과제이다.

"면역원적 유효량"이라 함은 기술분야에서 통용되는 의미, 즉, 면역원과 면역학적 특성을 공유하는 병원성 물질을 유의적으로 포괄하는 면역 응답을 유도할 수 있는 면역원의 양을 의미한다.

약한 세포-관련 폴리펩타이드 항원을 "변형(modificatin)"시켰다는 표현은 문제의 폴리펩타이드 골격을 구성하는 폴리펩타이드의 화학적 변형을 의미하는 것이다. 이러한 변형은 예컨대 아미노산 서열에 있어서 특정 아미노산 잔기의 유도 (예컨대 알킬화)일수 있지만, 하기 설명으로부터 명확히 드러나는 바와 같이, 바람직한 변형은 아미노산 서열의 일차 구조의 변화가 될 것이다.

"관용성 (tolerance)" 및 "자가관용성 (autotolerance)"를 논의할 때에는 본 발명의 방법의 표적 폴리펩타이드가 백신화시키고자 하는 집단 중의 자가- 단백질이거나 또는 효과적인 면역 응답 유도를 초래하지 않는 단백질이기 때문에 집단중의 정상적인 개체는 폴리펩타이드에 대한 면역 응답을 일으키지 않는다. 그러나,동물 집단 중 때로 개체들이 예컨대 자가면역 질환의 일부로서 자연적인 폴리펩타이드 항원에 대한 항체를 생산할 수 있다는 것을 배제할 수는 없다. 어떻든, 동물은 그 자신의 폴리펩타이드 항원에 대해 대개 자가관용적일 뿐일 것이지만, 다른 동물 종으로부터 유래된 유사체 또는 상이한 표현형을 갖는 집단으로부터 유래된 유사체 역시 상기 동물에 의해 관용될 것임을 배제할 수는 없다.

"외래 T-세포 에피토프"는 동물 종에서 MHC 분자와 결합해서 T-세포를 자극할 수 있는 것이다. 바람직한 외래 에피토프는 "난잡한 (promiscuous)" 에피토프, 즉, 동물 종 또는 집단에서 MHC 클래스 II 분자의 실질적인 분획에 결합하는 에피토프인 것이 좋다. 이러한 난잡한 T-세포 에피토프는 매우 제한적인 수로만 알려져 있으며, 이들은 이하에서 자세히 논의될 것이다. 본 발명에 따라 사용될 면역원이 동물 집단에서 가능한 한 큰 분획으로 효과적이기 위해서는, 1) 동일한 유사체애 몇가지 외래 T-세포 에피토프를 삽입하거나 2) 각각의 유사체가 삽입된 상이한 난잡한 에피토프를 갖는 몇개의 유사체를 준비할 필요가 있다. 외래 T-세포 에피토프의 개념 역시 숨은 T-세포 에피토프, 즉, 자가-단백질로부터 유래되고 문제의 자가-단백질의 일부가 아닌 분리된 형태로 존재할 경우 면역원성 양태만을 발휘하는 에피토프의 사용을 포괄함을 이해하여야 한다.

"외래 T 헬퍼 임파구 에피토프" (외래 T_H에피토프)는 MHC 클래스 II 분자에 결합하여 MHC 클래스 II 분자에 결합된 항원 제시 세포 (APC)의 표면 위에 제시될 수 있는 외래 T 세포이다.

"CTL" 에피토프는 MHC 클래스 I 분자에 결합할 수 있는 펩타이드이다.

본 발명에서 (바이오) 분자의 "기능성 부분"이란 그 분자가 발휘하는 생화학적 또는 생리학적 효과중 적어도 하나에 책임이 있는 그 분자의 일부를 의미하는 것이다. 기술분야에는 많은 효소들과 다른 이펙터 분자들이 문제의 분자가 발휘하는 효과에 책임이 있는 활성 부위를 갖는다는 것이 잘 알려져 있다. 분자의 다른 부분들은 안정화 또는 용해성 증진 목적에 일익을 담당할 수 있으며 따라서, 이러한 목적이 본 발명의 특정 구체예에서 타당하지 않을 경우에는 제외될 수 있다. 예컨대 유사체 중 어떤 시토카인을 변형 부분으로서 사용할 수 있으며 (하기 상세한 설명 참조), 이러한 경우, 유사체에의 커플링이 안정을 필수적으로 만들기 때문에 안정성은 문제되지 않을 것이다.

"어쥬번트 (adjuvant)"라 함은 백신 기술 분야에서 이 용어가 갖는 통상적인 의미, 즉, 1) 그 자신은 백신의 면역원에 대한 특이적인 면역 응답을 마운트할 수 없지만, 2) 그럼에도 불구하고, 면역원에 대한 면역 응답을 증진시킬 수 있는 물질이나 물질의 조성물을 가리키는 것이다. 또는, 다른 말로 하면, 어쥬번트 단독을 이용한 백신화는 면역원에 대한 면역 응답을 제공하지 못하고, 면역원에 의한 백신화는 면역원에 대한 면역 응답을 일으킬수도, 일으키지 못할수도 있지만, 면역원과 어쥬번트를 함께 이용한 백신화는 면역원 단독에 의해 유도되는 것보다 더 강력하게 면역원에 대한 면역 응답을 일으킨다는 것이다.

본 발명에 있어서 어떤 분자를 "표적화"한다 함은 동물 내로 도입된 분자가 어떤 조직(들)에서 우선적으로 나타나거나 또는 특정 세포들이나 세포 유형과 우선적으로 연계되어 나타나게됨을 가리키는 것으로 의도한다. 이러한 효과는 표적화를 용이하게 해주는 조성물 중에 분자를 형성시키거나 표적화를 용이하게 해주는 일군의 분자 중에 도입하는 등 몇가지 방법에 의해 달성될 수 있다.

"면역계의 자극"이라 함은 어떤 물질 또는 물질의 조성물이 일반적이고, 비-특이적인 면역자극 효과를 나타냄을 의미한다. 몇몇 어쥬번트와 추정적인 어쥬번트 (예컨대 특정 시토카인)는 면역계를 자극할 수 있는 능력을 공유한다. 면역자극화제의 사용은 면역계의 증가된 "경보성 (alertness)"을 결과시키고 이는 면역원을 이용한 동시적인 또는 후속적인 면역화가 면역원을 별도로 사용하는 경우에 비해 면역 응답을 훨씬 더 효과적으로 유도한다는 것을 의미한다.

바람직한 구체예

표면에 폴리펩타이드 항원으로부터 유도된 에피토프를 제시하는 세포에 대해 CTL 응답을 유도하기 위해서는, 일반적으로, 적어도 하나의 CTL 에피토프가, 제시된 때, APC 표면 상의 MHC 클래스 I 분자와 결합할 필요가 있다. 뿐만 아니라, 적어도 하나의 제 1 외래 T_H에피토프가 제시된 때, APC 표면 상의 MHC 클래스 II 분자와 결합하는 것이 바람직하다.

에피토프를 제시하는 바람직한 APCs는 수지상 세포 (dendritic cells)와 대식세포이지만, 1) MHC 클래스 I 분자에 결합된 CTL 에피토프와 2) MHC 클래스 II 분자에 결합된 T_H에피토프를 동시에 제시할 수 있는 음세포작용- 또는 식세포작용을 하는 APC이면 어느 것이든 본 발명에 따른 바람직한 APC라고 할 수 있다.

본 발명에 따라, 세포-관련 폴리펩타이드 항원은 종양-관련 항원 및 병리학적 경과와 관련이 있는 기타의 자가-단백질 뿐만 아니라 바이러스 항원 및 세포내 기생충 또는 세균들로부터 유도된 항원 중에서 선택되는 것이 바람직하다. 이러한 병원균-관련 항원이 종종 비교적 약한 면역원 (예컨대,Mycobacterium tuberculosis및Mycobacterium leprae와 같은 미코박테리아 뿐만 아니라Plasmodium spp.와 같은 원생동물로부터의 항원)이라는 것은 기술 분야에 잘 알려져 있다. 본 발명의 방법은 진짜 자가-단백질 항원에 대한 CTL 응답과 항체의 생산을 가능케 하는 것 말고도, 이러한 세포내 항원에 대한, 개체에 의해 제기되는 종종 불충분한 면역 응답을 증진시킬 수도 있는 것으로 믿어진다.

일반적으로, 백신 표적인 폴리펩타이드 항원의 커다란 아미노산 서열 분획으로 면역 시스템과 맞서게 하는 것이 바람직할 것이다. 따라서, 바람직한 구체예에서, APC에 의한 CTL 에피토프 및 제 1 외래 T_H에피토프의 제시는 동물의 면역계에 적어도 하나의 세포-관련-폴리펩타이드 항원의 제 1 유사체를 제공함으로써 수행되며 여기서 상기 제 1 유사체는 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 아미노산 서열의 변형체를 함유하며, 상기 제 1 유사체에는 적어도 하나의 CTL 에피토프와 제 1 외래 T_H 에피토프가 포함된다. 이것은 예컨대 CTL과 T_H에피토프를 동일한 세포에 의해 그러나 별개의 폴리펩타이드의 일부로서 발현시키는 DNA 백신화 전략과는 대조적인 것이며; 이러한 DNA 백신화 전략 역시 본 발명의 한 구체예이지만 동일한 폴리펩타이드의 일부로서 2개의 에피토프를 갖게되면 어떻든지 면역 응답을 일반적으로 증진시킬 것이고, 오직 하나의 발현 산물만 제공되면 될 것이다.

효과적인 면역 응답을 제공할 기회를 최대화 하기 위해서는, 상술한 제 1 유사체가 세포-관련 폴리펩타이드 항원의, 기지의 예측된 CTL 에피토프, 즉, 어떤 집단에서 MHC 클래스 I 분자의 충분한 분획과 결합하는 기지의 예측된 CTL 에피토프를 실질적인 분획으로 함유하는 것이 바람직하다. 예컨대, 유사체 중 아미노산 서열의 기지의 예측된 CTL 에피토프의 실질적인 분획은 세포-관련 폴리펩타이드 항원 중 기지의 예측된 모든 CTL 에피토프를 인식하는 MHC-I 반수체형 (haplotypes)의 적어도 50%에 의해 인식되는 것이 바람직하며, 이보다 더 높은 백분율, 예컨대 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 및 적어도 90%에 의해 인식되면 더욱 바람직하다. 특히, 유사체 중에 존재하는 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 실질적으로 모든 기지의 CTL 에피토프를 보존하는 유사체를 사용하는 것이 특히 바람직하다 (즉, 기지의 CTL 에피토프의 100%에 가깝게). 따라서, 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 실질적으로 모든 예측된 CTL 에피토프가 적어도 제 1 유사체 중에 존재하는 것 역시 특히 바람직하다.

CTL 에피토프의 존재여부를 예측하기 위한 방법은 기술분야, 예컨대 Rothbard 등, EMBO J. 7:93-100 (1988)에 잘 알려져 있다.

본 발명의 상세한 설명과 특허청구범위로부터 명확히 이해될 수 있는 바와 같이, 본 명세서에 설명된 진보적인 방법은 세포-관련 폴리펩타이드 항원에 대한 CTL 응답의 효과적인 유도를 가능케 해 줄 수 있을 것으로 기대된다.

세포-관련 폴리펩타이드 항원이 진실로 세포내적인 것인 경우 항원을 숨기고있는 세포에 대한 CTL 응답의 유도는 특이적인 면역학적 수단에 의해 그의 다운-조절을 달성할 수 있는 유일한 방법이 된다. 그러나, 막-관련 항원의 경우, 약한, 세포-관련 폴리펩타이드 항원에 대해 항체 응답을 유도하는 것이 유리하다. 그러나, 약한 세포-관련 항원에 대한 체액성 면역 응답을 일으킬 경우, 항체와의 가능한 결합체 일반적으로 노출되어 있는 항원의 일부와의 상호반응에 대한 항체 응답을 실질적으로 제한하는 것이 바람직하다. 그렇지 않을 경우 그 결과는 체액성 면역계와 대개 연관되어 있지 않은 항원의 일부에 대한 항체 응답을 유도할 가능성이 지극히 높아지고, 이것은, 다시 어떠한 병리학과도 관련이 없는 항원과의 교차-반응을 유도할 위험성을 증대시키게 될 것이다. 이러한 제한을 가능케하는 한가지 우아한 방식은 약한 세포-관련 항원의 유사체를 이용해서 핵산 백신화를 수행하는 것으로, 여기서 그의 세포외 부분은 변경되지 않거나 또는 항원의 세포외 부분의 3차원 구조를 실질적으로 변경시키지 않는 T_H에피토프를 포함하는 것이다. 한가지 가능한 대체방법으로서, CTL-지향된 면역원과 B-세포 지향된 면역원 두가지를 모두 이용해서 면역화를 수행하는 방법을 들 수 있는데 여기서 B-세포 지향된 면역원은 표적 항원의 세포내 일부에 대한 면역화는 수행할 수 없는 것이다 (B-세포 지향된 면역원은 예컨대 항원으로부터의 비-세포외적인 물질을 결여할 수 있다).

항체 응답은 본 발명이 속한 기술분야의 당업자에게 잘 알려진 몇가지 방식으로 유도해낼 수 있다. 예컨대, 적어도 하나의 제 1 유사체는 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 구조의 변형 부분을 포함할 수 있으며, 여기서 이러한 변형의 결과 제1 유사체로 그 동물을 면역화하면 세포-관련 폴리펩타이드 항원에 대한 동물의 항체생산이 유도될 것이다 - 이러한 변형은 상기한 바와 같이 핵산 백신화에 있어서 특히 적합하다. 다른 한편, 본 발명의 방법은 동물의 면역계에 이러한 변형을 포함한 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 적어도 하나의 제 2 유사체의 면역학적인 유효량을 동물의 면역계에 제공하는 것을 수행하는 것과 연관될 수 있다. 소망되는 항체-유도 효과를 위한 변형을 달성하는 편리한 한가지 방법은 제 1 유사체에 이용된 것과 같은 전략, 즉, 제 2 유사체에 적어도 하나의 제 2 외래 T_H에피토프를 포함시키는 것이다.

효과적인 체액성 면역 응답을 마운트시키는 것도 소망되는 경우에는, 제 1 및/또는 제 2 유사체(들)이 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 B-세포 에피토프의 실질적인 분획, 특히 해당 동물에 있어서 자연발생적인 형태의 항원에서 세포외적인 B-세포 에피토프의 실질적인 분획을 함유하는 것이 유리하다.

상기 논의된 약한, 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 변이 및 변형은 다른 형태를 취할 수도 있다. 변이 및/또는 변형은 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입 및/또는 부가와 관련된 것이 바람직하다. 아미노산 서열 조작과 관련된 이러한 기본적인 작업은 아미노산의 스트레치와 관련된 작업은 물론 단일-아미노산 변화를 모두 카바하기 위한 것이다 (i.a.폴리펩타이드 항원 내에서의 아미노산 스트레치의 셔플링; 이것은 항원이 진정한 세포내 항원인 경우 특히 흥미로운데, 이는, CTL 에피토프의 보존에 관한 고려만이 타당하기 때문이다). 예컨대 단일 아미노산의 삽입 또는 결실은 유사체 서열 중에서 외래 T_H에피토프의 출현, 즉, MHC 클래스 II 분자 결합 서열의 출현을 야기시킬 수있다. 그러나, 대부분의 경우 공지의 외래 T_H에피토프를 도입하는 것이 바람직하며 (심지어 필요하고), 이러한 조작은 산 치환 및/또는 삽입 (또는 때로는 담체 단백질에의 컨쥬게이션 또는 분자 생물학적 방법에 의한 융합 단백질의 제공)을 요구할 것이다. 삽입, 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산의 수는 적어도 2개, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 및 25개인 것이 바람직하다. 아미노산 치환 갯수는 150개를 초과하지 않는 한도, 예컨대 100개 이하, 90개 이하, 80개 이하, 및 70개 이하인 것이 바람직하다. 치환, 삽입, 결실 또는 부가되는 아미노산의 수가 60개를 넘지 않는 것, 특히 50개, 심지어 40개를 초과하지 않는 것이 특히 바람직하다. 가장 바람직한 수는 30개를 초과하지 않는 것이다.

본 발명의 바람직한 구체예는 적어도 하나의 외래의 으뜸면역성 T_H에피토프를 도입함에 의한 변형을 포함한다. T-세포 에피토프의 으뜸 면역성 문제는 문제의 동물 종에 의존함이 이해될 것이다. 본 발명에서 "으뜸면역성 (immunodominance)"라 함은 간단히 말해서, 백신화된 개인/집단에 있어서 유의적인 면역 응답을 일으키는 에피토프를 가리키는 것이지만, 어떤 개체에서 으뜸면역성을 갖는 T-세포 에피토프가 동일 종의 다른 개체에서도, 심지어, 이 다른 개체에서 MHC-II 분자에 결합할 수 있는 경우에조차 반드시 으뜸면역성을 갖는것은 아니라는 것이 잘 알려져 있다. 진정한 으뜸 면역성 T_H에피토프는 그가 서브서열을 형성하는 폴리펩타이드와관계없이, T_H세포를 활성화시키는 것이다 - 즉, 다른 말로 하면, 몇몇 T_H에피토프들은 그 고유한 특성으로서, 실질적으로 전혀 비밀스럽지 않다는 특징을 갖는데 이는 이들이 실질적으로 항상 APCs에 의해 프로세스되어 APC 표면 상에 MHC II 분자 관점에서 제시되기 때문이다.

또 다른 중요한 사항은 T 세포 에피토프의 MHC 제한에 관한 문제이다. 일반적으로 자연발생적인 T-세포 에피토프는 MHC 제한적이다. 즉, T-세포 에피토프를 구성하는 특정 펩타이드들은 MHC 클래스 II 분자의 서브세트에만 효과적으로 결합할 것이다. 이것은 대부분의 경우 어떤 특이적인 T-세포 에피토프를 이용할 경우 그 집단의 분획에서만 효과적인 백신 성분을 결과시킬 것이고 그 분획의 크기에 따라, 동일 분자에서 더 많은 T-세포 에피토프를 포함시킬 필요가 있을 수 있고, 또는 도입되는 T-세포 에피토프의 특성에 의해 서로 서로 구별되는, 항원 변이체들인 다-성분 백신을 준비할 필요가 있을 수 있다.

사용되는 T-세포의 MHC 제한이 완전히 알려져 있지 않을 경우 (예컨대 백신화된 동물이 잘 정의되지 않은 MHC 조성을 갖는 경우), 특이적인 백신 조성물에 의해 커버되는 집단의 분획은 다음 식으로부터 구할 수 있다

식 중, p_i는 백신 조성물에 존재하는 i번째 외래 T-세포 에피토프에 대한 응답자 집단 중에서의 빈도수, n은 백신 조성물 중 외래 T-세포 에피토프의 총 수를 말한다. 따라서, 집단 중 각각 0.8, 0.7, 및 0.6의 응답 빈도를 갖는 외래 T-세포에피토프를 함유하는 백신 조성물은

1 - 0.2 x 0.3 x 0.4 = 0.976

의 값을 가질 것이고, 즉, 통계학적으로 집단의 97.6퍼센트가 백신에 대한 MHC-II 매개성 응답을 마운트할 것이다.

상기 식은 사용되는 펩타이드의 정확한 MHC 제한 패턴이 다소 정확한 상황에서는 적용되지 않는다. 만일, 특정 펩타이드가 HLA-DR 대립유전자 DR1, DR3, DR5, 및 DR7에 의해 코딩된 인간 MHC-II 분자에만 결합한다면, 상기 펩타이드를 HLA-DR 대립유전자에 의해 코딩된 나머지 MHC-II 분자에 결합하는 또 다른 펩타이드와 함께 사용할 경우 문제의 집단에서 100% 커버가 가능할 것이다. 마찬가지로, 만일 2번째 펩타이드가 DR3과 DR5에만 결합한다면, 이 펩타이드의 부가는 그러한 커버리지를 전혀 증가시키지 않을 것이다. 만일 집단 응답의 산출을 전적으로 백신 중의 T-세포 에피토프의 MHC 제한에만 의존한다면, 특이적인 백신 조성물에 의해 커버되는 집단의 분획은 다음 식에 의해 결정될 수 있다:

- 식 중, Φ_j는 집단중, 백신의 여하한 T-세포 에피토프에 결합하고 3개의 공지 HLA 위치 (DP, DR 및 DQ)의 j번째에 속하는 MHC 분자를 코딩하는 대립유전자 반수체형의 빈도수의 합이다; 실제로, 어떤 MHC 분자가 백신 중 각각의 T-세포 에피토프를 인식할 것인지를 먼저 결정한 후 이들을 유형별로 수록하고 (DP, DR 및 DQ) - 이어서, 수록된 여러가지 대립유전자 반수체형의 개별적인 빈도를 각 유형별로 요약함으로써 Φ₁, Φ₂, 및 Φ₃을 얻는다.

식 II에서 p_i값이 그에 대응하는 이론치 π_i를 초과할 수 있다;

- 식 중, ν_j는 백신에서 i번째 T-세포 에피토프에 결합하고 3개의 알려진 HLA 위치 (DR, DR 및 DQ)의 j번째에 속하는 MHC 분자를 코딩하는 대립유전자 반수체형 집단에서의 빈도수의 합이다. 이것은 집단의 1-π_i 가 f_{residual_i =}(p_i-π_i) / (1 -π_i)의 응답자 빈도임을 의미한다. 따라서, 식 III을 변형시켜 다음 식 V를 얻을 수 있다:

- 식 중, 1-f_residual-i는 음수일 경우 0으로 맞춘다. 식 V는 동일한 반수체 세트에 대해 모든 에피토프가 반수체 매핑될 것을 요구함을 이해하여야 한다.

따라서, 유사체 내로 도입될 T-세포 에피토프를 선택할 때, 1) 각각의 에피토프에 대한 집단 내에서의 응답자의 빈도수, 2) MHC 제한 데이타, 및 3) 집단 중 상응하는 반수체의 빈도수 등 에피토프에 관해 가능한 모든 지식을 포함시키는 것이 중요하다.

어떤 동물 종 또는 집단의 개체의 큰 비율에서 활성적인 자연발생적인 "난잡한" T 세포 에피토프가 몇가지 존재하며 이들을 백신 내로 도입함으로써 동일한 백신에서 다른 유사체를 매우 많은 수로 필요로 하는 것을 감소시킬 수 있다.

난잡한 에피토프는 본 발명에 따라 파상풍 독소 (예컨대 P2 및 P30 에피토프), 디프테리아 독소, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA), 및 P falciparum CS 항원으로부터의 에피토프와 같이 자연발생적인 인간 T-세포 에피토프일 수 있다.

지난 수년간 다른 난잡한 T-세포 에피토프가 다수 동정되었다. 특히 상이한 HLA-DR 대립유전자에 의해 코딩된 HLA-DR 분자의 커다란 부분에 결합할 수 있는 펩타이드들이 동정되었으며 이들은 모두 본 발명에 따라 이용된 유사체 내로 도입될 가능한 T-세포 에피토프들이다. 다음의 참조문헌에서 논의되는 에피토프들 역시 본 발명에 모두 참고로 통합된다: WO98/23635 (Frazer IH 외, University of Queensland에 양도); Southwood S. 외, 1998, J. Immunol. 160: 3363-3373; Sinigaglia F. 외, 1988, Nature 336: 778-780; Rammensee HG외, 1995, Immunogenetics 41: 4 178-228; Chicz RM 외, 1993, J. Exp. Med 178: 27-47; Hammer J. 외, 1993, Cell 74: 197-203; 및 Falk K. 외, 1994, Immunogenetics 39: 230-242. 후자의 참고문헌 역시 HLA-DQ 및 -DP 리간드를 다루고 있다. 이들 5가지 참고문헌에 기재된 에피토프들은 모두 본 발명에서 사용될 자연적인 에피토프 후보가 될 수 있을 뿐만 아니라, 이들과 공통적인 모티프를 공유하는 에피토프들도 후보가 될 수 있다.

다른 한편, 에피토프는 큰 비율의 반수체에 결합가능한 여하한 인공적인 T-세포 에피토프일 수 있다. 이러한 관점에서 WO 95/07707 및 그에 상응하는Alexander J. 등의 논문 Immunity 1: 751-761 (두가지 모두 본 발명에 참고됨)에 설명된 범 (pan)DR 에피토프 ("PADRE")는 본 발명에 따라 사용될 에피토프로서 흥미로운 후보이다. 이 논문들에 설명된 가장 효과저긴 PADRE 펩타이드들이 투여시 안정성 증진을 위해 C- 및 N-말단에 D-아미노산을 지니고 있음을 유의하여야 한다. 그러나, 본 발명은 변형된 항원의 일부로서 해당 에피토프를 인코포레이션시킨 후 APCs의 리소좀 구획 내부에서 효소적으로 분해시킴으로써 MHC-II 분자 관점에서 후속적인 제시를 허락하는데 그 주요 목적이 있으므로, 본 발명에서 사용되는 에피토프에 D-아미노산을 인코포레이션시키는 것은 그다지 좋은 방법이 아니다.

특히 바람직한 한가지 PADRE 펩타이드는 아미노산 서열 AKFVAAWTLKAAA 또는 면역학적으로 유효한 그의 서브서열을 갖는 것이다. 이것 및 동일한 mhc 제한이 결여된 다른 에피토프들은 본 발명의 방법에서 사용되는 유사체 내에 존재하여야 하는 바람직한 T-세포 에피토프들이다. 이러한 극도로-난잡한 에피토프들은 본 발명의 가장 단순한 구체예를 제공할 것이며 여기서 오직 하나의 단일 유사체만이 백신화된 동물의 면역계에 제공되게 된다.

상술한 변이/변형의 특성은 바람직하게는 다음으로 이루어진다:

- 적어도 하나의 제 1 부분이 제 1 및/또는 제 2 유사체(들) 내에 포함되어 있고, 여기서 상기 제 1 부분은 유사체를 항원 제시 세포 (APC)에 표적화시키고/또는,

- 적어도 하나의 제 2 부분이 제 1 및/또는 제 2 유사체(들) 내에 포함되어 있고, 여기서 상기 제 2 부분은 면역계를 자극시키는 것이고/또는

- 적어도 하나의 제 3 부분이 제 1 및/또는 제 2 유사체(들) 내에 포함되어 있고, 여기서 상기 제 3 부분은 유사체의 제시를 면역계에 대해 최적상태로 최적화시켜주는 것임.

이러한 제 1, 제 2 및 제 3 부분들에 관련된 기능적 및 구조적 특징들을 다음에 설명하였다;

이들은 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 아미노산 서열 또는 그의 서브서열에서 적절한 화학적 기에 공유적 또는 비공유적으로 부착된 측쇄기의 형태로 존재할 수 있다. 이것은 폴리펩타이드 항원으로부터 유래된 아미노산 잔기들의 스트레치가 1차 아미노산 서열을 변경시킴이 없이 또는 적어도 사슬 중의 개별적인 아미노산들 사이의 펩타이드 결합에 어떠한 변화도 도입함이 없이, 유래된 것임을 의미하는 것이다.

이 부분들 역시 세포-관련 폴리펩타이드 항원으로부터 유도된 아미노산 서열에 대한 융합 파트너의 형태일 수 있다. 이와 관련해서, 두가지 가능성 모두 아미노산 서열의 담체와의 컨쥬게이션의 선택성을 포함하며, 이에 대해서는 하기 내용을 참조할 수 있다. 다른 말로 하면, "융합 단백질"이라는 용어는 구조물을 코딩하는 DNA 단편의 발현에 의해서 제조된 융합 구조물에만 제한되는 것이 아니라, 후속적인 화학 반응에서 펩타이드 결합의 수단에 의해 결합된 2개의 단백질 사이의 컨쥬게이트로도 한정됨을 의미하는 것이다.

상기한 바와 같이, 유사체 역시 유사체를 APC 또는 B-임파구에 표적화시키는 제 1 부분의 도입을 포함할 수 있다. 예컨대, 제 1 부분은 B-임파구 특이적인 표면항원 또는 APC 특이적인 표면 항원에 대한 틀이적인 결합 파트너가 될 수 있다. 이러한 특이적인 많은 표면 항원들이 기술분야에 알려져 있다. 예컨대, 이 부분은 그에 대해 B-임파구 또는 APC 상에 수용체가 있는 탄수화물일 수 있다 (예컨대 만난 또는 만노오스). 다른 한편, 제 2 부분은 합텐일 수 있다. 또한 APCs 또는 임파구 상에서 표면 분자를 특이적으로 인식하는 항체 단편은 제 1 부분으로서 사용될 수 있다 (표면 분자는 예컨대 ECΥRI과 같은 대식세포 및 단구의 FCΥ 수용체, 또는 다른 한편, CD40 또는 CTLA-4와 같은 다른 여하한 특이적인 표면 마커일 수 있다). 이들 모든 예시적인 표적화 분자들은 어쥬번트의 일부로서 사요가능함을 유의해야 한다. 예컨대 하기 설명 참조. CD40 리간드, CD40에 대한 항체, 또는 CD40에 결합하는 그의 변이체들은 유사체를 수지상 세포에 표적화시킬 것이다. 동시에, 최근의 연구결과는 CD40 분자와의 상호반응이 CTL 응답을 얻어내는데 있어서 T_H세포를 비필수적으로 만듦을 보여주었다. 따라서, CD40 결합 분자들을 일반적인 제 1 부분 (또는 어쥬번트로서, 하기 설명참조)으로서 사용할 경우 CTL 응답을 크게 향상시킬 것으로 예상되며; 실지로, 본 발명의 의미에서 이러한 CD40 결합 분자를 어쥬번트 및 "제 1 부분"으로서 사용한다는 것은 그 자체로 진보적인 것으로 믿어진다.

개선된 면역 응답을 달성하기 위해 유사체를 특정 세포 유형에 표적화시키는 것의 대안 또는 보강으로서 면역계를 자극하는 상기 ㅈ 2 부분을 유도함으로써 면역계의 응답 수준을 증가시킬 수 있다. 이러한 제 2 부분의 전형적인 예로는 시토카인, 열충격 단백질, 및 호르몬 뿐만 아니라 그의 효과적인 일부분들을 들 수 있다.

본 발명에 따라 사용될 적절한 시토카인들은 백신 조성물에서 어쥬번트로서의 기능도 일반적으로 수행하게 될 것들이며, 그 예로서 인터페론 γ (IFN- γ), Flt3 리간드 (Flt3L), 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 12 (IL-12), 인터류킨 13 (IL-13), 인터류킨 15 (IL-15) 및 과립구-대식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF)를 들 수 있으며;다른 한편, 시토카인 분자의 기능적 일부분은 제 2 부분으로서 기능하는데 충분할 것이다. 이러한 시토카인을 어쥬번트 물질로서 사용하는 것과 관련해서는 다음 설명을 참조하면 된다.

다른 한편, 제 2 부분은 예컨대 리스테리오라이신 (LLO), 지질 A 및 열-불안정한 엔테로톡신과 같은 독소일 수 있다. 또한, MDP (뮤라밀 디펩타이드), CFA (완전 Freund' 어쥬번트)와 같은 몇몇 미코박테리아계 유도체도 흥미로운 가능성을 갖는다.

본 발명에 따라, 제 2 부분으로서 사용되는 적절한 열 충격 단백질 (heat shock proteins)로는 HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 및 칼레티큘린 (CRT)를 들 수 있다.

면역계에 유사체 제시를 증진시켜주는 제 3 부분의 도입 가능성 역시 본 발명의 주요한 구체예이다. 기술분야예서는 이러한 원리의 몇가지 예가 제시된 바 있다. 예컨대, Borrelia burgdorferi 단백질 OspA 중에서 팔미토일 리피다토인 앵커는 자가-어쥬베이팅 폴리펩타이드를 제공하는데 이요될 수 있는 것으로 알려져 있다 (예컨대 WO 96/40718). 지질화된 단백질은 폴리펩타이드의 지질화 앵커 부분과그로부터 돌출된 분자의 잔여부분으로 이루어진 중심을 갖는 미셀-비슷한 구조를 형성하여, 항원성 결정인자를 다중 제시하는 결과를 나타내는 것으로 보인다. 따라서, 이것의 사용과 상이한 지질화 앵커 (예컨대 미리스틸기, 파네실기, 제라닐-제라닐기, GPI-앵커, 및 N-아실 디글리세라이드기)를 이용한 관련 접근방식은 본 발명의 바람직한 구체예인데, 이는 이러한 지질화 앵커의 재조합적으로 생산된 단백질에의 제공이 매우 직선적이며 단지 예컨대 유사체를 위한 융합 파트너로서 자연발생적인 시그날 서열을 이용할 필요가 전부이기 때문이다. 또 다른 가능성은 보체 인자 C3 의 C3d 단편 또는 C3 자체를 이용하는 것이다 (Dempsey 외, 1996, Science 271, 348-350 및 Lou & Kohler, 1998, Nature Biotechnology 16, 458-462).

본 발명의 방법을 예컨대 세포외 구획에 노출된 막결합 폴리펩타이드 항원에 대해 이용하려고 시도하는 경우, 제 1 및/또는 제 2 유사체(들)은 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 전체적인 3차 구조를 실질적으로 갖는 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 상세한 설명과 청구범위에서, 상기한 바와 같이, 절대적인 세포내 폴리펩타이드는 체액성 면역계와 연관되어 있지 않기 때문에, 세포외적으로 노출된 폴리펩타이드 항원의 일부의 전체적인 3차 구조는 보존되는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 실제로, 백신화 전략의 일부로서, 폴리펩타이드 항원의 세포내 부분으로부터 유도된 추정적인 B-세포 에피토프의 세포외 구획에 노출되지 않는 것이 종종 요망되며; 이러한 방식으로, 다른 항원과의 교차반응에 기인하는 잠재적 부작용을 최소화할 수 있다.

그러나, 본 발명의 목적을 위해서는, 변이/변형 (삽입, 부가, 결실 또는 치환)이 외래 T-세포 에피토프를 일으키고 이와 동시에 폴리펩타이드 항원 중 CTL 에피토프의 실제적인 수 (및 때로는 B-세포 에피토프의 실제적인 수도)를 유지하기만 하면, 충분하다.

다음의 식은 본 발명에 의해 일반적으로 포괄 되는 구조를 설명하는 것이다:

-식 중, PAG_el-PAG_ex는 서로 같거나 다르고, 외래의 측쇄기를 함유하거나 함유하지 않을 수 있는, 해당 폴리펩타이드 항원의 서브서열을 함유하는 x CTL 및/또는 B-세포 에피토프이고, x는 ≥3의 정수, nl-nx는 x 정수 ≥0 (적어도 하나는 ≥1), MOD₁-MOD_x는 보존된 에피토프 사이에 도입된 x 변형이고, sl-sx는 x 정수 ≥0 (만일 서열에 어떠한 측쇄도 도입되지 않은 경우, 적어도 하나는 ≥1)이다. 따라서, 구조물의 면역원성에 일반적인 기능적 제한이 주어진다면, 본 발명은 본래의 항원 서열에 모든 종류의 과돌연변이 (permutations), 모든 종류의 변형을 허락한다. 따라서, 본 발명은 폴리펩타이드 항원 서열의 일부 누락에 의해 또는, 일반적으로는 세포내 특성을 가짐으로 인해 따라서, 바람직하지 못한 면역학적 반응을 일으킬 수 부위들의 누락으로 인해 얻어지는, 예컨대 생체내에서 부작용을 나타내지 않는, 유사체를 포함한다. 그 상세한 설명은 다음과 같다.

상기 원리의 추가적인 확장은 두개 이상의 병리학-관련 항원으로부터의 CTL 및/또는 B-세포 에피토프의 이용을 포함한다. 예컨대, 돌연변이 형태일 경우에만그의 온코진 효과를 발휘하는, 암 관련 항원이 몇개 있는데 -그 예로는 돌연변이된 K-ras와 p53을 들 수 있으며 이들 두가지는 모두 정상적인 세포 주기 조절에 중요한 단백질들로서, 두가지 모두 대부분의 정상세포의 발현 산물이다. 몇가지 경우, CTLs는 이들 항원으로부터의 돌연변이된 펩타이드를 인식하는 것으로 나타났다. 따라서 항원 특이적인 면역요법이 가해질 경우, 면역계가 돌연변이된 펩타이드에 대해서만 응답할 뿐, 돌연변이되지 않은 부분에 대해서는 응답하지 않는다는 것은 중요한 것이다.

본 발명자들은 AutoVac 구조물에서 이러한 질병-관련 단백질의 8-25 아미노산 서열이 부가적인 에피토프로서 사용될 수 있는 전략을 고안하였다 - 바람직한 구체예에서, 도입된 에피토프들은 동시에, 최종 구조물에서 T_H에피토프의 출현을 제공하게 될 것이다. 자세한 설명은 하기 참조. 이러한 목적에 이용된 에피토프들은 질병-관련 단백질의 돌연변이된 부분을 포함하는 것들이 될 것이다. 이러한 접근을 이용함으로써, 질병-관련 항원의 돌연변이 형태에 대해서만 CTLs (그리고 적용가능한 경우 항체도)을 생산하는 것이 가능할 것이다. 질병-관련 항원이 T_H에피토프를 출현시킬 경우, 진정한 외래 T_H에피토프는 완전히 생략될 수 있다. 이 원리의 구체예는 예컨대 적어도 하나의 T_H에피토프와 적어도 하나의, 다른 질병-관련 항원으로부터 유도된 적어도 하나의 펩타이드 (예컨대 온코진 단백질의 돌연변이된 부분으로부터의 펩타이드)가 도입된, 폴리펩타이드 항원 (예컨대 Her2 또는 PSM)의 동족체를 코딩하는 핵산 백신으로 백신화시키는 것이 될 것이다. 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 T_H에피토프는 펩타이드 도입 결과로서 도입된다.

또한, 적용가능한 경우, 변이 및/또는 변형은 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 적어도 하나의 B-세포 에피토프의 복제, 또는 적어도 하나의 CTL 에피토프의 복제를 포함하는 것이 바람직하다. 이 전략은 바람직한 에피토프 대역의 복수개의 복제물이 면역계에 제시되고 따라서 유효한 면역응답의 가능성을 최대화시켜준다는 것이다. 따라서, 본 발명의 이 구체예는 폴리펩타이드 항원으로부터 유도된 에피토프의 복수 제시를 이용하는 것이다 (즉 적어도 하나의 B-세포 에피토프가 2 위치에 존재하는 식 I).

이 효과는 여러가지 방식으로 달성될 수 있으며, 예컨대 구조 (PAG)_m(여기서 m은 ≥의 정수임)로 된 융합 폴리펩타이드를 제조한 다음 적어도 하나의 폴리펩타이드 항원 서열에 상기한 변형을 가하는 것을 들 수 있다.

면역계에 복수개 (예컨대 적어도 2개)의 중요한 항원의 에피토프 대역 복제물을 바람직하게 제시시키는 결과를 초래하는 본 발명의 또 다른 구체예는, 특정 분자에 항원, 서브서열 또는 그의 변이체를 공유 커플링시키는 것이다. 예컨대, 덱스트란과 같은 탄수화물 (예컨대 Lees A 외, 1994, Vaccine 12: 1160-1166; Lees A 외, 1990, J. Immunol. 145: 3594-3600)을 이용할 수 있으며 뿐만 아니라 만노오스와 만난도 유용한 대용물이다. 예컨대 E. coli와 기타 박테리아로부터의 완전한 (integral) 막 단백질 역시 유용한 컨쥬게이션 파트너이다. 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 파상풍 독소, 디프테리아 독소, 및 소의 혈청 알부민 (BSA)와 같은 전통적인 담체 분자도 바람직하며 유용한 컨쥬게이션 파트너이다.

B-세포 에피토프의 때때로 유리한 실질적인 분획 또는 심지어는 본문에서 설명된 바와 같이 변형되게 될 단백질의 전체적인 삼차 구조를 여러가지 방식으로 유지시킬 수 있다. 한가지 방법은 단순히 폴리펩타이드 항원에 대해 지향된 폴리클로날 항혈청을 만든다음 (예컨대 토끼에서 제조된 항혈청), 이 항혈청을 생산된 변형 단백질에 대한 시약으로서 (예컨대 경쟁적 ELISA에서) 사용하는 것이다. 폴리펩타이드 상원과 동일한 정도로 항혈청과 반응하는 변형된 버젼은 폴리펩타이드 항원과 전체적으로 동일한 삼차 구조를 갖는 것으로 간주되어야 하는 반면 이러한 항혈청에 대해 제한된 (그러나 여전히 유의적이고 특이적인) 반응성을 나타내는 유사체들은 본래의 B-세포 에피토프의 실질적인 분획을 유지한 것으로 간주된다.

다른 한편, 폴리펩타이드 항원 상의 독특한 에피토프들과 반응성인 모노클로날 항체들을 선별해서 테스트 패널로서 이용할 수 있다. 이러한 접근법은 1) 문제의 폴리펩타이드 항원의 에피토프 매핑을 가능케 하고 2) 제조된 유사체 중에 유지된 에피토프의 매핑을 가능케한다는 장점을 갖는다.

물론, 세번째 접근법은 폴리펩타이드 항원의 3차원 구조 또는 그의 생물학적 활성 절단물의 3차원 구조 (상기내용 참조)를 알아내서 이것을, 제조된 유사체의 해상된 3차원 구조와 비교하는 것이 될 것이다. 3차원 구조는 X-선 회절 연구와 NMR-분광학을 이용함으로서 해결될 것이다. 주어진 분자의 3차원 구조에 고나한 유용한 정보를 제공하기 위해, 단순히 순수한 형태의 폴리펩타이드를 요구하는 (X-선 회절은 결정화된 폴리펩타이드의 제공을 요하고 NMR은 폴리펩타이드의 동위원소 변이체의 제공을 요하는데 비해서) 장점을 갖는 원형 이색성으로부터 3차원 구조에 관한 정보를 어느 정도까지 얻을 수 있다. 그러나, 원형 이색성은 2차 구조 요소의 정보를 통해 정확한 3차원 구조의 간접적인 증거만을 제공할 뿐이기 때문에 결정적인 자료를 얻기 위해서는, 궁극적으로는 X-선 회절 및/또는 NMR이 필요하다.

기본적으로 면역계에 상응하는 에피토프를 제시시키는 방법으로는 현재 세가지를 들 수 있다: 즉 폴리펩타이드 항원을 이용한 전통적인 서브-유닛 백신화, 유전적으로 변형된 살아있는 백신의 투여 및 핵산 백신화가 그것이다. 이들 세가지 가능성을 다음에 별도로 설명한다:

폴리펩타이드 백신화

이것은 문제의 동물에게 면역학적 유효량의 적어도 하나의 제 1 유사체, 및 타당한 경우 면역학적 유효량의 적어도 하나의 제 2 유사체를 투여하는 것이다. 바람직하게는, 적어도 한의 제 1 및/또는 제 2 유사체(들)은 약학적 및 면역학적으로 허용가능함 담체 및/또는 비히클, 및 임의로 어쥬번트와 함께 조성되는 것이 바람직하다.

동물에게 동물의 면역계에 대한 유사체를 투여함으로써 그를 제시시키는 경우, 폴리펩타이드의 조성은 기술분야에서 일반적으로 알려진 이론에 따른다.

활성성분으로서 펩타이드 서열을 함유하는 백신의 제조방법은 기술분야에 일반적으로 잘 알려져 있으며, 예컨대 미국특허 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792; 및 4,578,770호를 들 수 있으며 이들 모두 본 발명에 참고되었다. 일반적으로, 이러한 백신은 주사가능한 액체 용액이나 현탁액;용액이나 현탁액으로 만들기에 적합한 고체 형태로 제조되며, 액체는 주사전에도 만들 수 있다.이러한 제제는 또한 유화시킬 수도 있다. 활성 면역원 성분은 종종 약학적으로 허용가능하며 활성성분과 혼용가능한 부형제와 혼합시킨다. 적절한 부형제로는 예컨대 물, 생리식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 혼합물을 들 수 있다. 또한, 소망되는 경우, 백신은 습윤제나 유화제, pH 완충제, 또는 백신의 효능을 증진시키는 어쥬번트 (어쥬번트에 대해서는 하기에 상세히 설명함)와 같은 보조물질을 소량 함유할 수 있다.

백신은 일반적으로 예컨대 피하, 피내, 진피하 또는 근육내 주사와 같은 주사에 의해, 비경구적으로 투여된다. 다른 투여 유형에 적합한 부가적인 조성물로는 좌제, 및 몇몇 경우 경구, 볼 (buccal), 설하, 복강내, 질내, 항문 및 두엽내 투여용 조성물을 들 수 있다. 좌제의 경우, 전통적인 결합체와 담체, 예컨대 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세라이드를 포함할 수 있으며; 이러한 좌제는 활성성분을 0.5 내지 10%, 바람직하게는 1 내지 2% 함유하는 혼합물로부터 제조될 수 있다. 경구용 조성물에는 일반적으로 사용되는 부형제, 예컨대 제약등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등이 포함될 수 있다.이 조성물들은 용액, 현탁액, 정제, 알약, 캡슐제, 서방형 조성물 또는 분말제 형태를 취할 수 있으며 활성성분을 10-95%, 바람직하게는 25-705의 양으로 함유한다. 경구용 조성물의 경우, 콜레라 독소는 흥미로운 조성물 파트너 (컨쥬게이션 파트너이기도 하다).

폴리펩타이드는 중성 또는 염 형태로서 백신 내로 조성될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염으로는, 예컨대 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산과 함께 형성되는 산부가염 (펩타이드의 유리 아미노기와 함께 형성됨)을 들 수 있다. 유리 카르복실기와 형성되는 염은 예컨대 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘 또는 페릭 히드록사이드와 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수도 있다.

백신은 투여 조성물과 혼용가능한 방식으로, 그리고 치료적으로 유효하고 면역원적인 양으로 투여된다. 투여량은 치료하고자 하는 대상에 따라, 예컨대 면역응답을 마운트시킬 개체의 면역계의 능력, 및 소망되는 보호정도 등에 따라 달라진다. 적절한 투여량 범위는 1회 백신화 당 활성성분 수백 마이크로그램 정도로서, 바람직한 범위는 약 0.1 내지 2000 μg (이보다 많은 1 ㄴ지 10mg의 범위도 생각할 수 있지만), 예컨대 0.5 내지 1000 μg, 바람직하게는 1 내지 500 μg, 특히 10 내지 100 μg의 범위이다. 초기 투여 및 부스터 샷에 적절한 요법 역시 가변적이지만 초기 투여 및 이어지는 접종 또는 다른 투여에 의해 정형화된다.

투여방식은 크게 다를 수 있다. 백신 투여에 종래부터 이용되어 온 방법이면 어느 것이든 이용가능하다. 여기에는 고상의 생리적으로 허용가능한 베이스를 이용한 경구 투여 또는 생리적으로 허용가능한 분산액을 이용하여 주사 등에 의한 비경구 투여가 포함된다. 백신의 투여량은 투여경로에 따라 달라지며 백신화시키고자 하는 대상의 연령과 항원 조성에 따라 달라질 것이다.

백신의 몇몇 폴리펩타이드들은 백신에서 충분히 면역원적이지만 몇가지 다른것들의 경우, 백신이 어쥬번트 물질을 추가로 함유한다면, 면역 응답이 증강될 것이다. 자가항원에 대한 자가관용성을 파괴시키는 것을 용이하게 해주는 것으로 입증될 수 있는 어쥬번트를 이용하는 것이 특히 바람직하다.

백신에 대해 어쥬번트 효과를 달성하는 방법들이 다양하게 알려져 있다. 일반적인 원리와 방법은 "The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E.S. Stewart-Tull (ed), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6-, 및 "Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G. 외 (eds.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9에 잘 설명되어 있으며 두 문헌 모두 본 발명에 참고되었다.

바람직한 어쥬번트는 수지상 세포와 같은 APCs에 의한 백신 분자의 업테이크를 용이하게 해주고 이들을 활성화시킨다. 예컨대 면역 표적화 어쥬번트; 독소, 시토카인 및 미코박테리아 유도체와 같은 면역 조절용 어쥬번트; 오일 조성물; 폴리머; 미셀 형성 어쥬번트; 사포닌; 면역자극 복합 매트릭스 (ISCOM matrix); 입자; DDA; 알루미늄 어쥬번트; DNA 어쥬번트; γ-인슐린; 및 캡슐화 어쥬번트를 들 수 있으며 이에 한정되지 않는다. 일반적으로 유사체 중 제 1, 제 2 및 제 3 부분으로서 유용한 화합물과 제제에 관련된 상기 설명들은 본 발명의 백신의 어쥬번트에 있어서의 이들의 용도에도 준용된다.

어쥬번트의 적용은 알루미늄 하이드록사이드 또는 포스페이트 (명반)와 같은 제제를, 일반적으로 완충염수 중 0.05 내지 0.1% 용액으로, 슈가의 합성 폴리머 (예컨대 Cabopol)와 혼합해서 0.25% 용액으로서, 70 내지 101℃의 온도범위에서30초 내지 2분동안 행하며 가교제를 이용한 응집도 가능하다. 펩신 처리된 항체를 이용한 재활성화에 의한 알부민, C. parvum 또는 내독소, 만나이드 모노올리에이트 (Aracel A)와 같은 생리적으로 허용가능한 오일 담체 중의 에멀젼, 또는 블록 치환체로서 사용되는 퍼플루오로카본 (Fluosol-DA)의 20% 용액과의 에멀젼에의 응집 (Fab 단편)도 이용가능하다. 스쿠알렌 및 IFA와 같은 오일과의 혼합도 바람직하다.

본 발명에 따라 DDA (디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드)는 DNA 및 γ-인슐리놔 같이 흥미로운 어쥬번트 후보일 뿐만 아니라, Freund's 완전 및 불완전 어쥬번트 및 QuilA 및 QS21과 같은 퀼라야 (quillaja) 사포닌도 흥미로운 후보이다. 몬포스포릴 지질 A (MPL) 및 상기한 C3과 C3d도 가능한 추가의 예이다.

리포좀 조성물 역시 어쥬번트 효과를 부여하는 것으로 알려져 있으므로 리포좀 어쥬번트는 본 발명에서 바람직하다.

또한 면역자극 복합 매트릭스 타잎 (ISCOM매트릭스) 어쥬번트는 본 발명에서 바람직한 선택이 될 수 있는데, 이는, 이러한 유형의 어쥬번트가 APCs에 의한 MHC 클래스 II 발현을 업-조절할 수 있는 것으로 알려져 있기 때문이다. ISCOM매트릭스는 Quillaja saponaria, 콜레스테롤 및 인지질로부터의 사포닌 (트리터페노이드)로 이루어진다 (임의로 분획화될 수 있음). 면역원성 단백질과 함께 혼합될 경우, ISCOM 입자로 알려진 입자 조성물을 얻을 수 있고, 여기서 사포닌 함량은 60-70% w/w, 콜레스테롤과 인지질은 10-15% w/w, 단백질 함량은 10-15% w/w이다. 조성물 및 면역자극 복합체의 용도에 관한 상세는 예컨대 어쥬번트를 다루고 있는 상기한 교재에서 찾아볼 수 있으며, Morein B 등, 1995, Clin. Immunother. 3:461-475, Barr IG 및 Mitchell GF, 1996, Immunol. 및 Cell Biol. 74: 8-25 (두가지 모두 본문에 참조됨) 역시 완전한 면역자극 복합체 제조를 위한 유용한 지침을 제공해준다.

어쥬번트 효과를 달성할 수 있는 또 다른 매우 흥미로운 가능성 (따라서 바람직하기도 한)은 Gosselin 등이, 1992에 설명한 (이 문헌 역시 본문에 참조됨) 기술이다. 요약하면, 본 발명의 항원과 같은 관련 항원의 제시가 단구/대식세포 상의 FcγRI 수용체에 대한 항체 (또는 항원 결합 항체 단편)를 컨쥬게이션함으로써 증진될 수 있다는 것이다. 특히 항원과 항-FcγRI 간의 컨쥬게이트가 백신화 목적을 위한 면역원성을 증강시키는 것으로 입증되었다.

또 다른 가능성은 변형된 유사체에서 제 1 및 제 2 부분의 후보로서 위에서 언급된 표적화 및 면역조절화 물질 (예, 시토카인)을 사용하는 것이다. 이와 관련해서, 폴리 I:C와 같은 시토카인의 합성 유도체도 가능하다.

적절한 미코박테리아 유도체는 뮤라밀 디펩타이드, 완전 Freund's 보조제, RIBI 및 TDM 및 TDE와 같은 트레할로스의 디에스테르이다.

적절한 면역 표적화 어쥬번트는 CD40 리간드와 CD40 항체 또는 그의 특이적 결합 단편 (상기한 바 있음), 만노오스, Fab 단편, 및 CTLA-4 중에서 선택된다.

적절한 폴리머 어쥬번트는 덱스트란, PEG, 전분, 만난, 및 만노오스와 같은 탄수화물; 플라스틱 폴리머; 및 라텍스 비드와 같은 라텍스 중에서 선택된다.

면역 응답을 조절하는 또 다른 흥미로운 방법은 "가상 임파절 (VLN: virtual lymph node)" (ImmunTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501이 개발한 독점적인 의료기기)에 면역원 (임의로 어쥬번트 및 약학적으로 허용가능한 담체 및 비히클과 함꼐)을 포함시키는 것이다. VLN (얇은 관상 장치)은 임파절의 구조와 기능을 모방한 것이다. 피부 밑에 VLN을 삽입하면 시토카인과 케모카인의 급증하면서 멸균 염증 부위가 생성된다. APCs 뿐만 아니라 T- 및 B-세포도 위험한 시그날에 신속하게 응답하며, 염증 부위로 귀소하여 VLN의 다공성 매트릭스 내부에 축적된다. VLN을 사용하자 항원에 대한 면역 응답을 마운트시키는데 필요한 항원 투여량이 감소하고, VLN을 이용한 백신화에 의해 부여된 면역 보호도는 보조제로서 Ribi를 이용한 종래의 면역화를 앞선 것으로 나타났다. 이 기술은 "From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, october 12th - 15th 1998, Seascape Resort, ptos, California" 중, Gelber C 등의 1998, "Elicitation of Robust Cellular and Humora Immune Responses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel medical Device Designated the Virtual Lymph Node"에 잘 설명되어 있다.

최근의 발견으로부터 H2 아고니스트를 함께 투여하면 내츄럴 킬러 세포와 CTLs의 종양내 생존능이 증진되었음이 입증되었다. 따라서, 본 발명의 방법에 H2 아고니스트를 어쥬번트로서 포함시키는 것도 고려할 수 있다.

백신은 1년에 적어도 1회, 예컨대 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 12회 투여하여야 한다. 보다 구체적으로는 필요로 하는 개체에게 1년에 1-12회, 즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12회 투여한다. 본 발명에 따른 바람직한 자가백신을 사용함으로써 유도되는 기억 면역은 영구적인 것이 아닌 것으로 밝혀진 바 있으므로, 면역계를 주기적으로 유사체로 챌린지시킬 필요가 있다.

유전적 다양성으로 인해, 개인들은 동일한 폴리펩타이드에 대해 여러가지 강도로 면역 응답할 수 있다.따라서, 본 발명에 따른 백신은 면역 응답을 증가시키기 위해 몇가지 상이한 폴리펩타이드를 포함할 수 있으며; 이에 대해서는 외래 T-세포 에피토프 도입 선택과 관련해서 상술한 바 있다. 백신은 상기 정의된 바와 같은 2개 이상의 폴리펩타이드를 함유할 수 있다.

결과적으로 백신은 3-10개의 상이한 폴리펩타이드와 같이 변형되거나 변형되지 않은 3-20개의 상이한 폴리펩타이드를 함유할 수 있다. 그러나, 일반적으로 펩타이드의 수는 1 또는 2개의 펩타이드와 같이 최소한도로 유지된다.

생백신 (Live vaccine)

면역 시스템에 효과를 유발하는 제 2 선택은 생백신 기술을 이용하는 것이다. 생백신화에서, 면역 시스템에의 제공은, 필요한 에피토프의 영역 또는 완전한 일차 및/또는 이차 유사체를 코딩하는 핵산 단편에 의해 형질전환된 비-병원성 미생물을 동물에 투여함으로써 이루어진다. 선택적으로, 미생물은 그러한 핵산 단편에 병합하는 벡터에 의해 형질전환된다. 비-병원성 미생물은 어떠한 적절한 독성약화 박테리아 균주(재조합 DNA 기술에 의해 병원성 발현 생성물을 운반 또는 제거시켜 독성을 약화시킨), 예컨대 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) BCG, 비-병원성 스트렙토코커스 종(Streptococcusspp.), 이.콜라이(E.coli), 살모넬라 종(Salmonellaspp.), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 시겔라(Shigella) 등일 수 있다. 당해 분야에서 생백신의 제조에 대해 다룬 것을 Saliou P, 1995,Rev.Prat. 45:1492-1496과 Walker PD, 1992, Vaccine 10:977-990에서 검토할 수 있고, 두가지 모두가 여기서 참조로써 관계한다. 이러한 생백신에 이용하는 핵산 단편과 벡터에 관한 상세한 설명을 후술한다.

폴리펩타이드 백신에서, T_H에피토프 및/또는 제 1 및/또는 제 2 및/또는 제 3부분들이, 존재한다면, 세포-관련 폴리펩타이드 항원으로부터 유래한 아미노산 서열과의 융합 파트너 형태로 존재한다.

선택적인 박테리아의 생백신에서, 후술하는 본 발명의 핵산이 비-독성 바이러스 백신 벡터에 융합할 수 있다. 한가지 가능성이 백시니아, MVA(변형된 백시니아 바이러스), 조류-폭스 및 수두 등과 같은 폭스 바이러스이다. 선택적으로, 단순 포진 바이러스 변종을 이용할 수 있다.

보통은, 비-병원성 미생물 또는 바이러스가 동물에 단지 1회 투여되나, 특정한 경우에 일생에 한번 이상 미생물을 투여하는 것이 필요하다.

또한, 제 1, 제 2 및/또는 제 3부분의 코딩 영역을 포함하는 핵산(들)을 이용하여, 예컨대 유용한 보조제로서 논의한 사이토킨과 같이, 상술한 면역 조절 물질의 형태로 미생물을 형질전환시킬 수 있다. 이 구체예의 바람직한 변형은 유사체에 대한 코딩 영역과 별개의 해독프레임 또는 별개의 프로모터 조절하에 면역조절자에 대한 코딩 영역을 함유하도록 초래된다. 그것에 의하여, 유사체 또는 에피토프가 면역조절자에 대한 융합 파트너로서 생산되는 것을 피할 수 있다. 선택적으로, 두 별개의 뉴클레오타이드 단편을 형질전환 약제로서 이용할 수 있다.

핵산 백신화

전형적인 펩타이드-기재 백신의 투여에 대한 대안으로서, 핵산 백신화 기술(또한 "핵산 면역화", "유전적 면역화" 및 "유전자 면역화"로 알려진)이 흥미로운 많은 특징을 제공한다.

우선, 전통적인 백신 접근과 대조적으로, 핵산 백신화는 면역원 약제의 대량 생산을 소비하는 공급원을 요구하지 않는다(예컨대, 폴리펩타이드 백신화에서 필수적인 유사체를 생산하는 미생물의 산업적 규모의 발효 형태에서). 더욱이, 면역원을 위한 정제 장치 및 리폴딩 설계가 필요없다. 그리고 마지막으로, 도입된 핵산의 발현 생성물을 제공하기 위하여 핵산 백신화가 백신화 개체의 생화학적인 기관에 의존하기 때문에, 발현 생성물의 번역후 최적의 처리가 발생한다고 예상된다; 이것은 상기 기술한대로 원시 B-세포 에피토프의 상당한 부분이 세포외적으로 노출된 폴리펩타이드 서열으로부터 유래한 유사체에서 보존되어야 하고, 대체로 B-세포 에피토프가 어떠한 (바이오)분자(예컨대, 탄수화물, 지질, 단백질 등)의 부분에 의해 구성될 수 있기 때문에 자가백신화의 경우 특히 중요하다. 따라서 면역원의 본래 글리코실화 및 지질화 패턴이 전체적인 면역원성에 매우 중요하고 이것은 면역원을 제공하는 숙주를 가짐으로써 가장 잘 보증된다.

그러므로, 본 방법의 바람직한 구체예는 한가지 이상의 CTL 에피토프 및/또는 한가지 이상의 B-세포 에피토프, 그리고 한가지 이상의 제 1 외래 T_H에피토프(선택적으로, 두가지 이상의 별개의 핵산 단편을 투여하며, 이 중 하나가 한가지 이상의 CTL 에피토프를 코딩하고, 다른 하나가 한가지 이상의 외래 T_H에피토프를 코딩한다)를 코딩하고 발현시키는 한가지 이상의 핵산 단편을 생체내 APC에 도입시킴으로써 표시를 유발하는 것을 포함한다. 바람직하게도 이것은 상기 논의한 제 1 유사체를 코딩하고 발현시키는 핵산 단편을 이용하여 수행한다. 제 1 유사체가 상기-설명한 T_H에피토프 및/또는 제 1 및/또는 제 2 및/또는 제 3부분들을 갖고 있다면, 이들은 세포-관련 폴리펩타이드 항원으로부터 유래한 아미노산 서열과의 융합 파트너 형태로서 존재하고, 융합 구조물은 핵산 단편에 의해 코딩된다.

백신화에 대한 전통적인 접근에서, 핵산 백신화는, 제 2 유사체를 코딩하고 발현시키는 한가지 이상의 핵산 단편을 APC로 생체내 도입시키는 것과 함께 이루어질 수 있다. 제 1, 제 2와 제 3부분들 및 T_H에피토프에 대한 연구가 또한 여기서 적용된다.

이 구체예에서, 도입된 핵산은 네이키드 DNA, 하전된 또는 하전되지 않은 지질과 배합된 DNA, 리포솜상에서 배합된 DNA, 바이러스 벡터에 포함된 DNA, 형질도입-촉진 단백질 또는 폴리펩타이드와 배합된 DNA, 칼슘 침전제와 배합된 DNA, 불활성 담체 분자와 결합된 DNA 및 보조제와 배합된 DNA의 형태가 될 수 있는 DNA인 것이 바람직하다. 이러한 관계에서, 전통적인 백신 배합물에 보조제를 사용하는 경우 고려되는 모든 실질적인 사항들이 DNA 백신의 배합에 적용된다. 그러므로 폴리펩타이드를 기재로 하는 백신에서 보조제의 사용과 관련하여 언급한 모든 설명이 필요한 변경을 가하여 핵산 백신화 기술에 그 용도를 적용시킬 수 있다. 배합 및 투여경로와 투여 설계에 관한 그외의 고찰에서도 상기물이 유효하므로 전통적인 백신에 대한 상기 논의점들을 필요한 변경을 가하여 핵산 백신화 기술에 적용한다.

핵산 백신의 배합물 중 특히 바람직한 타입은 DNA를 함유하는 미세입자이다. 적절한 미세입자가, 예컨대 WO 98/31398에 기술되어 있다.

게다가, 면역화 약제로서 이용하는 핵산(들)이, 예컨대 유용한 보조제로서 논의한 사이토킨과 같이 상기 기술한 면역조절 물질의 형태로서 제 1, 제 2 및/또는 제 3부분을 코딩하는 영역을 포함한다. 이러한 구체예의 바람직한 형태는 유사체의 코딩 영역과, 별개의 해독프레임 또는 적어도 별개 프로모터의 조절하에 면역조절자의 코딩 영역을 갖도록 초래된다. 따라서 유사체 또는 에피토프가 면역조절자의 융합 파트너로서 제공되는 것을 피할 수 있다. 선택적으로, 별개의 두 뉴클레오타이드 단편을 이용할 수 있으나, 두개 모두의 코딩 영역을 동일한 분자에 포함시킬 때 확보되는 공동-발현의 이점 때문에 이것은 보다 덜 바람직하다.

정상적인 환경에서, 백신의 핵산이 벡터 형태로 도입되고, 이 때 발현은 바이러스 프로모터의 조절하에 있다. 본 발명의 벡터에 대한 보다 상세한 설명은 후술한다. 또한 핵산 백신의 배합 및 용도와 관련한 상세한 설명을 Donnelly JJ 등, 1997, Annu. Rev. Immunol. 15:617-648 및 Donnelly JJ 등, 1997, Life Sciences 60:163-172에서 볼 수 있다. 두 참조 문헌 모두 여기서 참조로써 관계한다.

본 발명의 중요한 부분은 동물에서 약하게 면역원성이거나 비-면역원성인 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 적절한 면역원성 유사체를 선별하는 신규한 방법에 관한 것이고, 상기 면역원성 유사체는 세포-관련 폴리펩타이드 항원 유래의 에피토프와 결합한 MHC 클래스 I 분자를 표시하는 세포에 대항하여 동물에서 CTL 반응을 유발할 수 있다. 이 방법은

a) 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 한가지 이상의 아미노산 서열 부속체(subsequence)를 동정하고, 이 때 상기 부속체가 알려진 또는 예견되는 CTL 에피토프를 포함하지 않으며,

b) 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 아미노산 서열에서, 한가지 이상의 외래 T_H에피토프를 a)단계에서 동정된 한가지 이상의 부속체내 위치로 동물에 도입시켜 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 한가지 이상의 추정되는 면역원성 유사체를 제조하고,

c) 동물에서 CTL 반응의 유발을 검증할 수 있는, 단계 b)에서 제조한 유사체를 선별하는 것으로 이루어진다.

선택적으로, 상기 선별 방법은 핵산 백신화를 목적으로 하는 핵산 단편의 제조를 포함한다. 이 경우, 코딩되는 펩타이드가 한가지 이상의 T_H에피토프를 포함해야 한다.

유사체가 세포외상(extracellular phase)에 노출되는 항원으로부터 유래할 때, 단계 a)에서 동정된 부속체가 추가로 시스테인 잔사를 함유하지 않고, 또는 선택적으로 단계 b)에서 도입된 T_H에피토프가 시스테인 잔사의 패턴을 실질적으로 변경시키지 않는 것이 바람직하다. 이러한 접근으로 약한, 세포-관련 폴리펩타이드 항원에서 B-세포 에피토프와 유사한 생성 구조물의 경우 B-세포 에피토프의 공간적인 보존이 촉진된다.

동일한 이유로, 단계 a)에서 동정된 부속체가 알려진 또는 예견되는 글리코실화 부위를 추가로 함유하지 않고, 또는 선택적으로 이 때 단계 b)에서 도입되는 T_H에피토프가 글리코실화 패턴을 실질적으로 변경시키지 않는 것이 바람직하다.

특정한 약한, 세포-관련 폴리펩타이드 항원이 병리생리학적 역할을 수행함으로써 소망하지 않는 효과가 부여된다. 백신화 구조물이 이러한 효과를 발휘하지 않는 것이 바람직하므로, 단계 a)에서 동정된 부속체가 세포-관련 폴리펩타이드 항원이 부여하는 병리생리학적 효과에 상당한 공헌을 하지 않고 b)에서 외래 T_H에피토프의 도입이 상기 병리생리학적 효과를 감소 또는 폐지시키는 것이 바람직하다. 이러한 접근의 예로 효소, 호르몬 또는 사이토킨에서 활성 부위를 제거하고 외래 T_H에피토로 이를 교환한다.

또다른 중요한 연구는 질병과 상관없는 다른 자가-단백질과 백신의 폴리펩타이드 생성물과의 면역학적 가교-반응에 대한 것이다. 그러한 가교-반응을 피하는 것이 바람직하며, 따라서 본 방법의 중요한 구체예에서, 단계 a)에서 동정되는 부속체가 동물의 구별되는 단백질 항원의 아미노산 서열에 대해 동종이고 단계 b)에서 T_H에피토프의 도입이 실질적으로 상동성을 제거한다.

비교예는, 1)보통은 세포외상에 노출되지 않고 2)약한, 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 B-세포 에피토프를 구성하지 않는 어떠한 아미노산 서열이 유사체에서 보존되지 않는 구체예이다. 이것은 그러한 아미노산 서열을, 완전하게 제거하거나또는 부분적으로 제거시켜, B-세포 에피토프를 구성하지 않는 T_H에피토프로 교환시킴으로써 달성할 수 있다.

반면, 약한 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 어떠한 "진실한(true)" B-세포 에피토프를 높은 수준으로 보존하는 것이 바람직하므로, 본 발명의 선택적인 방법의 중요한 구체예는 단계 b)에서 외래 T_H에피토프를 도입하여 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 실질적인 B-세포 에피토프 부분의 보존을 야기한다. 유사체가 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 전체적인 삼차 구조를 유지하는 것이 특히 바람직하다.

분자 생물학 방법 또는 고체 또는 액체상 펩타이드 합성 방법에 의해 단계 b)의 제조가 바람직하게 수행된다. 바람직하게도 고체- 또는 액체-상 펩타이드 합성의 잘-알려진 기술에 의해 보다 짧은 펩타이드가 제조된다. 그러나 최근 기술의 진보로 인해 이 기술을 이용한 총-길이 폴리펩타이드와 단백질의 생산이 가능하게 되었고, 따라서 합성 방법에 의해 긴 구조물을 제조하는 것이 본 발명의 범위내에 있다.

상기의 방법에 따라 유용한 유사체의 동정 후, 보다 큰 규모로 유사체를 생산하는 것이 필요하다. 당해 분야에서 잘-알려진 방법으로 폴리펩타이드를 제조한다.

제 1 단계로 본 방법에 따라 선별된 유사체를 코딩하는 핵산 서열을 벡터에 도입시키고, 이 벡터로 적절한 숙주 세포를 형질 전환시킴으로써 형질전환된 세포를 제조하는 분자 생물학적 방법으로 이를 수행할 수 있다. 다음 단계는 형질전환된 세포를, 세포-관련 항원의 유사체를 코딩하는 핵산 단편의 발현을 촉진시키는 조건하에 배양하고, 이어서 배양 상등액 또는 세포로부터 직접 유사체를 회수하는 것이다(예컨대, 용해질 형태로). 선택적으로 유사체는 상기의 대-규모 고체 또는 액체상 펩타이드 합성에 의해 제조할 수 있다.

끝으로, 숙주 세포로 선택된 세포 또는 이용된 합성 방법에 따라서, 생성물의 번역-후 인공적인 변형을 가한다. 이것은 당해 분야의 리폴딩 반응, 효소 처리(글리코실화하거나 소망하지 않는 융합 파트너를 제거하기 위한), 화학적 변형(재글리코실화가 가능) 및 통상의 담체 분자에 대한 컨쥬게이션일 수 있다.

본 발명의 바람직한 유사체(및 또한 본 발명의 방법에서 이용한 적절한 유사체)가 폴리펩타이드 항원 또는 10개 이상의 아미노산 길이를 갖는 그 부속체와 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 야기시키는 변형을 포함한다는 것을 지적해야 한다. 보다 높은 서열 동일성, 예컨대 75% 이상 또는 심지어 80 또는 85% 이상이 바람직하다. 단백질과 핵산에 대한 서열 동일성은 (N_ref- N_dif) ·100 / N_ref의 식으로 계산할 수 있고, 식 중 N_dif은 정렬시 두 서열간 동일하지 않은 잔사의 총수이고 N_ref는 한 서열의 잔사 수이다. 그러므로, DNA 서열 AGTCAGTC는 서열 AATCAATC와 75%의 서열 동일성을 갖는다( N_dif=2와 N_ref=8).

본 방법의 구체적인 본보기 표적

상기 논의한대로, 약한 세포-관련 폴리펩타이드 항원이 종양-관련 항원인 것이 바람직하다. 다음 표에 이들의 비-제한적인 목록을 제시한다.

다음에, 수많은 구체적인 종양-관련 항원을 자세하게 논의할 것이다.

전립선-특이적인 막 항원, PSM

미국에서, 전립암은 제 2의 암 사인으로 꼽히고(연간 약 40,000), 연간 200,000명의 환자에서 진단된다(Boring 1993). 결국, 약 11명의 남성 중 1명꼴로 전립암이 발병하는 것이다. 게다가, 전립암 환자 중 약 40-60%에서 전립선외의 질병으로 확장된다. 본 발명의 주된 방법은 잔여의 종양 조직과 전이를 제거하기 위해 전립선 절제술에 보조적인 치료로서 치료 백신을 사용하는 것이다.

양성 성장(BPH), 감염(전립선염) 및 종양(전립암)을 포함하는 여러가지 병리적 질병이 전립선에 존재한다.

전립암의 생리적 공격성은 다양하다. 어떤 환자에서 탐지된 종양은 잠복기의조직적 종양으로 잔존하고 임상적으로 전혀 유효하지 않다. 다른 환자에서의 종양은 급속하게 진행 및 전이되어 비교적 단기간(2-5년)에 치사에 이르게 한다.

현재의 일차적인 전림암의 치료는 전립선 절제술이다. 그러나, 대부분의 전립암 환자의 경우 전립암 세포가 넓게 퍼져 있기 때문에 국소적인 수술로는 치료할 수 없다. 결국 질병을 제한할 수 없는 환자는 전신의 안드로겐 제거 치료를 받게 되나, 안드로겐 치료는 질병의 전이에 대한 표준적인 치료일 뿐이므로 50년에 걸쳐 전립암으로 인한 연간 치사율은 감소하지 않았다.

PSM의 발현이 신장 조직과 신장 종양, 소장, 뇌 및 종양 신혈관과 같은 다른 조직에서 또한 관찰될지라도, PSM은 악성 뿐 아니라 양성의 전립선 조직에 고도로 특이적인 막 단백질이다. 따라서, 수술이 성공적이라면, 이론상 전립선 절제된 암 환자는 잔여의 악성 전립선 종양 조직 또는 그 종양에 기원한 전이에 대하여 PSM을 발현시켜야 한다. PSM에 대한 강한 CTL 반응 및/또는 강한 다중클로날 항체 반응을 유발함으로써 잔여의 종양 조직이 제저될 수 있다고 기대된다.

흥미롭게도, 전립암 환자의 다음의 안드로겐-상실 치료에서 PSM 발현의 상향 조절을 볼 수 있다(Wright 1996). 이는 전통적인 안드로겐-상실 치료에 이어 매우 적절한 PSM-표적화 치료를 형성한다.

PSM은, 분리된 인간의 전립암 세포, LNCaP에 대항하는 모노클로날 항체, 7E11-C5.3의 생성 결과 1987년 최초로 동정되었다(Horoszewicz 1987). 이 항체는 정상 그리고 악성의 전립선 상피 둘다를 인식하며 1993년 PSM 단백질의 아미노산 서열과 그 결과 유전자의 클론을 정제 및 결정하는데 이용되었다(Israeli 1993).

PSM은 핵산 서열로부터 예견되는 분자량 84kD를 갖는 타입 II 막전위 당단백질인 한편, 글리코실화 형태는 분자량 100-120kD를 갖는 것으로 관찰된다. PSM을 코딩하는 유전자 서열은 원형질의 세 아르기닌 유지 잔사와 관련된 추정의 막 스패닝(spanning) 영역을 드러내었다. PSM의 세포외 부분이 단백질의 총 750 아미노산 중 707로 구성되는 한편, 세포질의 도메인은 19 아미노산 길이인 것으로 예상된다(Israeli 1993). 종양 항원이, 예컨대 Tn- 또는 sTn-종양 항원을 갖는 경우의 비정상적으로 글리코실화된 단백질이 아닌 것을 지적하면서, PSM-특이적인 mRNA가 전립선 종양 조직에서 검출되었다(Israeli 1994).

총 길이의 PSM cDNA를 형질도입하고, PSM 음성인 인간의 전립암 세포라인, PC-3에서 발현시켰다(Kahn 1994). 게다가, 총 길이(2.65킬로베이스) cDNA를 실험관에서 전사 및 번역하였다(Kahn 1994).

PSM이 N-아세틸화 α-결합된 산성 디펩티다제(NAALADase)와 유사한 가수분해 활성을 갖는 것이 최근 입증되었다 - 사실상 두개의 단백질이 동일하다는 것이 입증되었다. NAALADase는 신경계의 막-결합 가수분해 효소이고, 이것은 글루타메이트의 신호 처리에 영향을 주기 위하여 신경펩타이드 N-아세틸아스파틸 글루타메이트(NAAG)를 분해한다. PSM의 이러한 활성이 어떠한 생리적 기능과 관련이 있는지는 아직 알려져 있지 않다.

CTLs 또는 항체에 접근가능한 다른 단백질과의 소망하지 않는 가교 반응이 PSM-특이적인 면역 반응을 유발하는 자가백신의 처리에 이어 예상되는가가 다소 중요한 문제이다. PSM 유전자의 일부 코딩 영역(아미노산 위치 418-567)이 인간의 트랜스페린 수용체와 54%의 상동성을 갖는다(Israeli 1993). 또한, 상술한대로 NAALADase 효소와 완전한 서열 동일성이 발견되었다. 알려진 다른 펩티다제와 기능적으로 관련된 유사성은 확인할 수 없었다.

트랜스페린 수용체에 대한 상동성은 매우 낮고 본 발명의 몇몇 구조물에서 바람직하게 붕괴될 것이다. 부분적으로, 항체와 CTLs가 혈액-뇌 장애에 대해 낮은 통과력을 가지므로, 인간 NAALADase와의 관찰된 서열 동일성이 PSM-백신에 대해 방해물이 되지 않을 것으로 예상된다. 전적으로, 심지어 대부분의 PSM-같은 구조물에서, 환자의 다른 단백질에 대해 금지의 가교-반응을 경험하지 않을 것으로 기대된다.

이전의 연구로부터, PSM이 대부분의 전립암 세포와 전립선 기원의 시험된 전이에 발현하는 것이 명백하다. 추가로, 비-전립선의 인간 암세포의 광범한 패널뿐 아니라 별개 조직의 암종, 육종 및 흑색종과 같이 시험을 거친 대부분의 다른 암이 PSM 음성임을 입증하였다.

여기에 추가하여, 매우 많은 수의 다른 조직들이 PSM 음성임을 발견하였다. 여기에는 결장, 유방, 폐, 난소, 간, 방광, 자궁, 기관지, 비장, 췌장, 혀, 식도, 위, 갑상선, 부갑상선, 부신, 림프 노드, 대동맥, 대정맥, 피부, 유방선과 태반이 포함된다. 그러나 RP-PCR이 이들 조직 중 몇몇에 PSM mRNA의 존재를 밝혀내었다.

비록 PSM이 전립선 조직상 막 결합 분자로서 현저하게 발견될지라도 소량의 PSM이 또한 표준 개체의 혈청에서 그리고 전립암 환자에서 증가된 수준으로 검출될 수 있다(Rochon 1994, Murphy 1995). 그 결과 이들 환자에서 순환하는 PSM의 수준은 PSM 백신의 유효성을 혈청학적으로 모니터링할 수 있게 한다.

결론적으로, 현개까지의 유효한 모든 자료에 기초할 때, PSM은 인간의 전립선 조직과 그로부터 기원한 종양에 높은 특이성을 갖는 항원이다. 이것은 전립선 절제술을 진행한 환자에서 PSM이 종양 의사-특이적인 자가-항원이라는 것을 의미한다. 따라서 유효한 PSM 백신이 전립선 또는 전립선-기원의 전이 조직을 주요한 표적으로 할 것이다.

실시예 1에서 명백히 한대로, 본 방법은 바람직하게 SEQ ID NO: 2 위치 16-52 및/또는 87-108 및/또는 210-230 및/또는 269-289 및/또는 298-324 및/또는 442-465 및/또는 488-514 및/또는 598-630 및/또는 643-662 및/또는 672-699로 정의된 일부분의 PSM 아미노산 서열에 외래 T_H-세포 에피토프를 도입하는 것을 수반한다. 더욱이, 이들 위치에 도입된 외래의 T_H-에피토프를 갖는 변형된 PSM 분자가 또한 본 발명의 일부이다.

따라서, 본 발명은 또한 인간에서 면역원성인 인간의 PSM 유사체에 관한 것이고, 상기 유사체는 모든 알려지고 예상되는 PSM의 CTL 및 B-세포 에피토프의 실질적인 부분을 포함하며 여기서 기술한대로 한가지 이상의 외래 T_H에피토프를 함유한다. 바람직한 PSM 유사체는, 한가지 이상의 외래 T_H유사체가 PSM 아미노산 서열의 삽입체로서 또는 일부 PSM 아미노산 서열의 치환체로서 존재하거나 일부 PSM 아미노산 서열을 제거시킨 결과 형성된 것이고, 대부분의 바람직한 유사체가 SEQ ID NO: 2 위치 16-52 및/또는 87-108 및/또는 210-230 및/또는 269-289 및/또는 298-324 및/또는 442-465 및/또는 488-514 및/또는 598-630 및/또는 643-662 및/또는 672-699로 정의되는 일부분의 PSM 아미노산 서열에 외래 T_H-세포 에피토프를 도입시킨 것이다.

인간의 융모막성 고나도트로핀(HCG)

배자 마커와 악성 페노타입간 관계는 수년동안 논의되어왔다. 신체에 관한 자료의 증가는 한가지 이상의 그러한 마커, 인간의 융모막성 고나도트로핀 베타(hCGβ)가 별개의 수많은 조직적 선원의 암세포에서 검출되며 이 단백질의 발현이 종종 전이성의 증가와 상관 관계가 있다고 제안한다. 이 용해성 단백질에 대항하여 유도되는 인간의 면역 반응이 종양 확산을 감소시키고 및/또는 수술-후 새로운 초기 생성의 반복을 억제할 것이다.

인간의 융모막성 고나도트로핀은, 모두가 생식 발현과 태아 생존의 중요한 조절자인 난포-촉진 호르몬(FSH), 타이로이드-촉진 호르몬(TSH) 및 황체 형성 호르몬(LH)를 포함하며, 당단백질 호르몬 족에 속한다. 이들 호르몬 족의 요소는 헤테로다이머이고, 이것은 공통의 α-사슬을 공유한다. β-사슬은, LH의 β-사슬이 hCGβ에 가장 강한 서열 상동성을 나타내면서(약 80%), 각 호르몬에 유일하고, 특이성을 제공한다. hCG-holo의 명백한 분자량은 37kD이고, 이것의 1/3이 탄수화물에 의해 부여된다. 번역-후의 당 변형은 N-결합된 그리고 O-결합된 탄수화물 둘다를 포함한다. 시알산 잔사가 풍부하게 존재하고 이들이 단백질에 다량의 음전하를 수여한다. hCG-holo의 결정 구조를 해석하였다(Lapthorn 등, 1994).

결정 구조에 기초하여, PDGF와 TGFβ를 포함하는 성장 인자 족에 대해 hCG가 상동성을 나타내는 것을 발견하였다(Lapthorn 등, 1994). 이것은 hCG 발현이 암세포 성장의 조절을 원조할 수 있다는 것을 제안한다.

인간의 융모막 고나도트로핀은 당단백질 호르몬이고, 이것은 임신 직후 태반의 융합세포 영양막에 의해 제공되며, 임신 여성에서 성공적인 임신을 위해 필수적인 것이다.

암 집단의 발전 또는 유지를 위한 배자 마커의 병리생리학적 역할은 알려져 있지 않다. 그러나, 영양세포막(이들 단백질이 정상적으로 제공되는)이 혈관 생성과 공격적인 특성 모두를 갖고, 이들 두가지가 또한 암세포 특성에 필수적인 것은 흥미로운 점이다. 추가로, hCG(또는 그 서브유닛)가 태아의 조직에 대해 모체의 세포 면역 반응을 억제할 수 있다고 제안된다. 예를 들어, 연구 결과, hCG가 직접적으로 T 세포 반응을 억제하였고(Jacoby 등, 1984) 초기의 흑색종을 고갈(이 경우에)시키는 림프 노드가 면역억제되기 때문에 그들 자신을 안정시킨 전이 종양에 보다 적합한 환경이 야기되었다고 제안한다. 결과적으로 hCGβ의 발현이 이차의 임파성 기관으로 암세포의 확장을 보조할 것이다. 끝으로, 상기 논의한대로 hCG와 수많은 성장 인자간 구조적인 상동성이 입증되었다. 따라서 또다른 가능성은 암세포에 의한 hCG의 분비가 종양의 성장에 이점을 제공하는 것이다.

많은 다른 타입의 암에서 hCGβ의 발현을 볼 수 있다. 예를 들어 a)전립선 선암종: 종양의 조직적 등급에 상관없이, 예후 정도가 낮은 환자에서 조직 구획상 hCGβ에 대한 적극성이 보여진다(Sheaff 등, 1996), b)다른 종류의 간암종; 편평세포(SQCC), 선암종(AC) 및 거대 세포(LCC), 모두 hCGβ에 대한 높은 반응 퍼센티지를 나타낸다(Boucher 등, 1995), c)췌장 선암종(Syrigos 등, 1998), d)신경모세포종, 뇌 암, 망막모세포종(Acevedo 등, 1997), e)악성 흑색종(Doi 등, 1996), f)방광암종(Lazar 등, 1995)이다. 최근의 연구논문에서 DNA 접근을 제시하며, 생쥐를 hCGβ 발현 구조물로 면역화시켰다(Geissler 등, 1997). 이러한 생체내 모델에서 종양 성장의 억제가 CTL-활성과 강력한 관계가 있으나 또한 높은 항체가(그 세포의 수용체상에서 완전한 hCG의 생리적 효과가 중화되는)가 탐지된다.

면역원으로서 hCG의 이용은 피임용 백신으로서의 이용에 촛점을 맞추어 여러개의 논문에서 기술되었다(Talwar 등, 1976과 Talwar 등, 1994). 매우 높은 수준의 효능과 안전성이, hCG-holo에 대항하는 백신을 이용하여, 항-번식성 임상 실험에서 관찰되었다(Talwar 등, 1994). 또한 디프테리아 독소와 컨쥬게이트하는 hCGβ의 합성 카르복시-말단 펩타이드에 대항하는 백신을 이용하여 암환자의 단계 I 임상 실험을 수행하였고(Triozzi 등, 1994) 단계 II 실험을 진행중이다. 암 백신의 표적으로서 hCGβ를 사용하는 발상이 수회 대두되긴 하였으나 자가백신(AutoVac) 기술과 결합하여 탐구된 적은 없었다.

비-태자 조직의 세포, 또는 양성 종양은 hCGβ를 발현시키지 않는다고 알려져 있다. 따라서, 이 분자에 대항하는 백신화로 인한 잠재적인 부작용이 없어야 한다(임신에의 효과와 별개로). 그렇게 많은 다른 종류의 암에 의해 발현되기 때문에, 이 분자는 "한정적인 암 바이오마커"인 것으로 제안되어졌고(Acevedo 등, 1995와 Regelson W., 1995) 그렇게 진행을 위한 흥미로운 표적이 될 것이다.

백신 기재의 hCG 효능의 추가적인 연구를 위한 적절한 동물 모델을 Acevedo 등, Cancer Det.와 Prev. Suppl.(1987) 1:477-486 및 Kellen 등, Cancer Immunol. Immun. Ther. (1982) 13: 2-4에서 찾아볼 수 있다.

Her2

타이로신 키나아제 수용체 Her2와 EGFr이 표준 세포의 악성 전환 및 암 세포의 지속적인 성장에 중대한 역할을 한다고 여겨진다. 일반적으로 과발현이 매우 빈약한 예후와 연결된다. 지난 수십년동안 이들 수용체의 어느 하나 또는 두가지 모두를 과발현시키는 암에 대한 치료로서 이들 수용체에 대항하는 항체의 생산과 관련된 많은 보고들이 이루어졌다. Genentech Inc.사는 Her2에 대항하는 모노클로날 항체를 이용하여 유방암 환자에 대한 성공적인 임상 실험을 수차례 행하였고 최근 항-Her2 모노클로날 항체 조제물, Herceptin의 판매를 위해 FDA 승인을 받았다.

Her2 분자에 적용한대로 여기서 제시한 자가 백신 기술은 Her2와 우세하게 반응하는 다중클로날 항체를 유도할 것이다. 그러한 항체는 전이성 세포가 발전하여 전이되는 것을 억제할 뿐 아니라 종양 세포를 공격하고 제거시킬 것으로 기대된다. 이 항-종양 효과의 작동체 메카니즘은 세포 파괴에 의존하는 보체와 항체를 통해 매개될 것이다.

구조물의 선택에 따라서, 유발된 자가항체가 또한 수용체의 올리고-다이머화 및 내재화에 의존하는 성장 인자의 억제를 통해 암 세포의 성장을 억제할 수 있다. 그리고 가장 중요하게도, 종양 세포가 표출하는 알려진 및/또는 예견되는 Her2 에피토프에 대항하도록 Her2 유사체가 CTL 반응을 유발할 수 있다고 기대된다.

Her2는 별개의 내 수용체로 구성된 상피의 성장 인자 수용체 족(c-erbB)중 하나이다: c-erbB-1(EGFr), c-erbB-2(Her2, c-Neu), c-erbB-3 및 c-erbB-4(Salomon 등, 1995). c-erbB-3과 c-erbB-4는 EGFr과 Her2보다 덜 특징적이다. Her2는 필수 당단백질이다. 성숙한 단백질은 EGFr 수용체와 유사한 구조적 특징과 함께 185kD의 분자량을 갖는다(Prigent 등, 1992). EGFr은 또한 하나의 서브유닛으로 구성된 완전한 막 수용체이다. 이것은 명백하게 170kD의 분자량을 갖고, 621 아미노산의 표면 리간드-결합 도메인, 23 아미노산의 단일한 소수성 막전위 도메인 그리고 고도로 보존된 542 아미노산의 원형질 타이로신 키나아제 도메인으로 구성된다. 단백질은 N-글리코실화된다(Prigent 등, 1994).

이 족의 모든 단백질은 타이로신 키나아제이다. 리간드와의 상호작용은 수용체 다이머화를 유발하고, 타이로신 키나아제의 촉매 작용을 증가시킨다(Bernard, 1995, Chantry 1995). 족 내에서 이들의 활성이 중요한 단백질이 호모- 및 헤테로다미어화할 수 있다. EGFr은 성장 촉진 효과를 전달하고 세포가 글루코스와 아미노산을 취하도록 자극한다(Prigent 등 1992). Her2도 또한 성장 촉진 신호를 전달한다. 단지 EGFr만이 EGF 및 TGF-알파와 결합한다. 이들 리간드는 족의 다른 수용체와 결합하지 않는다(Prigent 등, 1992). Her2에 대한 리간드는 완전히 확인되지 않았다. 그러나, 헤레귤린(heregulin)이 Her2를 활성화시켜 포스포릴화를 유발하는 것으로 보인다. 이것은 수용체와의 직접적인 결합에 기인하지 않으나, 헤레귤린이, 이후 올리고-다이머화에 의해 Her2를 활성화시키는 erbB-3과 erbB-4의 리간드인 것으로 여겨진다(Solomon 등 1995).

EGF 수용체 족의 단백질간 상동성이 분자 원형질 부분의 타이로신 키나아제 도메인에서 대부분 판명된다(EGFr과 Her2 사이에 82%). 상동성은 세포외 부분에서 감소한다 - 별개의 도메인에서 41& 내지 46%(Prigent 등, 1992).

상피의 성장 인자 수용체는 소량의 표준 조직에서 발현되나, 많은 종류의 암에서 과발현된다. EGFr은 유방암(Earp 등, 1993, Eppenberger 1994), 신경교종(Schlegel 등, 1994), 위암(Tkunaga 등, 1995), 피부 편평암종(Fujii 1995), 난소암(van Dam 등, 1994) 등에서 과발현된다. Her2는 또한 소량으로 소수의 표준 인간 조직, 보다 특징적으로 분비성 상피에서 발현된다. Her2 과발현의 30%는 유방, 위, 췌장, 방광 및 난소암에서 발생한다.

이들 수용체의 발현은 종양의 분화 정도와 암의 종류에 따라 다양하다. 예컨대, 유방암에서 초기 종양이 두가지 모두의 수용체를 과발현시킨다; 한편 위암에서는 전이성 종양의 나중 단계에서 과발현이 발생한다(Salomon 등, 1995). 종양 세포에서 과발현되는 수용체의 수는, 환자에서 분리한 여러개의 머리와 목 암, 음문, 유방과 난소암 라인에서 10⁶/세포 이상이다(Dean 등, 1994).

EGFr 족의 수용체가 종양의 면역치료에서 적절한 목적이 되는데는 여러가지 이유가 있다. 첫째로, 그들은 많은 종류의 암에서 과발현되고, 이것은 종양에 대한 면역 반응을 지휘할 것이다. 둘째로, 종양이 종종 이 족의 수용체에 대해 리간드를 발현 또는 과발현시키고 몇몇은 리간드가 매개하는 증식성 효과에 지나친 감응성을 나타낸다. 셋째로, 성장 인자 수용체를 과발현시키는 종양 환자는 종종 빈약한 예후를 갖는다. 과발현이 유방암과 방광암 (2)에서 특이 빈약한 예후와 밀접하게 연결되고 명백하게 공격성/전이성 페노타입과 결합하며, 이것은 통상의 치료에 다소 불감응성이다(Eccles 등, 1994).

Her2의 과발현은 몇몇 경우에 유전자의 증폭 결과이고, 다른 경우 증가된 전사와 번역 때문이다. Her2의 과발현은 유방, 난소암, 위암, 방광암과 가능한 비-소세포 간암에서 빈약한 예후와 관계된다(Solomon 등, 1995).

유방암과 난소암이 진행중인 환자에서 이특이적인 항체를 이용한 단계 I 임상 실험을 수행하였다. 항체는 Her2와 FcγRI에 대해 이특이적이다(Weiner 등, 1995). Her2와 CD3에 대항하는 이특이적인 항체를 이용하여 Her2가 과발현되는 종양 세포의 유효한 용해를 관찰하였다(Zhu 등, 1995).

인간의 위암을 갖는 이종이식된 중증복합면역결핍증(scid) 생쥐를 항-Her2 모노클로날 항체로 처리하여 생쥐의 생존을 연장시켰다(Ohniski 등, 1995). 실험관과 생체내에서 Her2에 대항하는 모노클로날 항체의 항-종양 활성은 동일한 메카니즘에 기인하지 않는다; 그들은 부분적인 리간드 길항제로서 작용할 수 있고, Her2 수용체의 반전 및 포스포릴화를 변경시키거나 다이머화에 영향을 줄 수 있다(Lupu 등, 1995).

유사하게, EGFr에 대한 항체가 또한 성장 인자의 상호작용을 방해할 수 있다(Baselga 등, 1994, Modjahedi 등, 1993a, Wu 등, 1995, Modjahedi 등, 1993b, Tosi 등, 1995, Dean 등, 1994, Bier 등, 1995, Modjtahedi 등, 1996, Valone 1995).

그러므로, 본 방법의 중요한 구체예는, SEQ ID NO:3 위치 5-25 및/또는 59-73 및/또는 103-117 및/또는 149-163 및/또는 210-224 및/또는 250-264 및/또는 325-339 및/또는 369-383 및/또는 465-479 및/또는 579-593 및/또는 632-652 및/또는 653-667 및/또는 661-675 및/또는 695-709 및/또는 710-730에서 아미노산 번호로 정의되는 일부분의 Her2 아미노산 서열로 외래 T-세포 에피토프를 도입하는 것이다.

따라서, 본 발명은 또한 인간에서 면역원성인 인간 Her2의 유사체에 관한 것이고, 상기 유사체는 알려지고 예견되는 모든 CTL과 Her2의 B-세포 에피토프의 실질적인 부분을 포함하며 여기서 논의한 한가지 이상의 외래 T_H에피토프를 함유한다. 한가지 이상의 외래 T_H에피토프가 Her2 아미노산 서열의 삽입체 또는 일부 Her2 아미노산 서열의 치환체로서 존재하거나 일부 Her2 아미노산 서열을 제거시킨 것이 바람직하다. 대부분의 바람직한 유사체가 상기 정의한 것들이고, 즉 SEQ ID NO: 3 위치 5-25 및/또는 59-73 및/또는 103-117 및/또는 149-163 및/또는 210-224 및/또는 250-264 및/또는 325-339 및/또는 369-383 및/또는 465-479 및/또는 579-593 및/또는 632-652 및/또는 653-667 및/또는 661-675 및/또는 695-709 및/또는 710-730으로 정의되는 일부분의 Her2 아미노산 서열에 외래 T_H-세포 에피토프를 도입시킨 것이다.

FGF8b

FGF8b가 증식, 형질전환, 분화 및 몇몇 경우 포유류 세포와 조직의 종양발생을 상당히 증가시킬 수 있다는 것이 수차례 발견되었다(Tanaka 1992, Kouhara 1994, Lorenzi 1995, MacArthur 1995a, Crossley 1996a, 1996b, Ghosh 1996, Ohuchi 1997a, Rudra-Ganguly 1998). 이러한 효과는 FGF8b와 섬유모세포 성장 인자 수용체의 일원인 FGFR2, FGFR3 및 FGFR4와의 결합을 통해 우선적으로 매개된다(MacArthur 1995b, Blunt 1997, Tanaka 1998). 따라서 한가지 이상의 이들 수용체를 발현시키는 세포와 FGF8(b)가 증식을 유발하는 자가분비 성장-신호성 증폭 반응을 제공하는 것으로 보인다. 본 발명자와 다른 이들이 FGF8b를 특정 세포의 성장 배지에 첨가했을 때 STAT3의 포스포릴화를 촉진시키고 세포에 세포소멸에 대한 내성을 부여하는 특성이 예측되므로, FGF8b의 생리적 효과는 대부분 JAK/STAT3 경로를 통해 부분적으로 매개된다.

상기 언급한 실험관내 관찰에 추가하여, FGF8(b) 발현이 전립선과 유방암 모두에서 현저하게 상향조절되는 것이 최근 밝혀졌다(Marsh 1999, Dorkin 1999). 그러므로, FGF8(b)에 대항하는 자가백신이 수많은 FGF8-발현 종양을 치료하는데 매우 유효한 수단이 될 것이고, 또한 약제를 유도하는 세포소멸에 대해 그 감응성을 증가시킬 것으로 여겨진다.

전립선암

전립선암의 생물학적 공격성은 가변적이다. 몇몇 환자에게 관찰되는 종양은 잠복 조직 종양으로 남고 결코 임상적으로 중요하지 않게 된다. 나머지 다른 환자에게서, 종양은 빠르게 진행되고, 전이되고, 또한 비교적 짧은시간(2-5년)내에 환자를 죽인다.

진단의 목적으로, 그리고 전립선암의 치료에 대한 반응을 따르기 위해서, 두가지 단백질의 순환레벨의 결정이 최초로 이용되었다: 전립선산인산효소 (PAP)와 전립선특이항원 (PSA) (Nguyen 1990, Henttu 1989). 암발생에서 전립선의 정상구조의 붕괴 탓에, 이들 수용성 단백질은 예를 들어 전이적 확장의 표지로서 관찰되어지는 순환속으로 방출된다.

현재 전립선암에 대한 주된 처치는 전립선절제술이다. 그러나, 전립선암세포의 광범위한 확장으로 인해 다수의 전립선암환자는 국소수술로는 치유되지 않는다. 제한되지않은 질병을 가진 환자는 체계적인 안드로겐 절제요법을 받지만, 전립선암으로 인한 연사망율은 안드로겐 절제가 전이적 질병의 표준 치료요법으로 자리잡은 이래로 50여년에 걸쳐 감소하지 않고 있다.

RT-PCR 분석은 FGF8이 인간의 전립선상피종양의 세포주인 LNCaP, PC-3, ALVA-31, DU145에 의해 만들어지고, FGF8b는 대부분 현저한 아이소형으로 만들어짐을 보여준다 (Tanaka 1995, Ghosh 1996). 안드로겐에 민감한 LNCaP 세포의 성장은재조합 FGF8b의 첨가로 자극되는 반면 (Tanaka 1995), DU145 세포는 항센스 FGF8b를 발현하는 바이러스의 트랜스펙션으로 인해 성장이 저해된다 (Rudra-Ganguly 1998). 이것은 아래서 토론할 발전적인 연구에서 나오는 증거와 함께 이들 세포주의 암에 걸린 상태를 유지함에 있어 FGF8b에 대한 역할을 나타낸다.

동소부합결합 실험을 위해 FGF8a cDNA를 사용할 때, Leung와 그 협력자들은 전립선암의 높은 비율이 (80% (n=106)와 71% (n=31)) FGF8 mRNA를 생산하고 있음과, 많은 FGF8 mRNA가 종양의 심각함 (각각 P<0.0016과 P<0.05) 과 관련이 있음을보였다 (Leung 1996, Dorkin 1999). 모노클로날 항FGF8b 항체를 사용할 때, 이 아이소형은 FGF8b의 과다발현에 대한 책임이 보여진다 (Dorkin 1999). 덧붙여 높은 레벨의 FGF8을 발현하는 종양을 가진 사람은 낮은 생존율 (P=0.034)을 가졌고, 그 FGF8의 발현은 안드로겐의 영향을 받지 않는 전립선암에서 지속되었다 (Dorkin 1999). Dorkin과 그 협력자들에 의해 제시된 데이타에 따르면, 전립선암에서 FGF8b의 발현은 환자의 생존을 암시할 수 있었다.

FGF8에 대항하는 모노클로날항체를 사용하는 면역조직화학적 분석은 인간의 전립선암의 93% (n=43)에서 단백질을 검출한다. (Tanaka 1998). 정상 전립선조직이나 양성전립선과형성은 낮은 레벨의 FGF8 mRNA를 생산하고, 관찰가능한 정도의 FGF8 단백질을 포함하지 않는다 (Leung 1996, Yoshimura 1996, Ghosh 1996, Tanaka 1998, Dorkin 1999).

이상의 결과들은 FGF8(b)에 대항하는 자동백신이 전립선종양조직에 대항하여 반응하고, 따라서 전립선암의 처치요법에 대단히 유용함을 나타낸다.

유방암

유방암에 대한 현재의 처치요법은 수술이다. 그러나, 유방암세포의 광범위한 확장으로 인하여 많은 유방암 환자들은 국소수술로는 치유되지 않는다. 제한되지않은 질병을 가진 환자들은 최후에 안드로겐 절제요법, 화학요법 및/또는 방사선요법을 받게 된다. 그렇지만 유방암으로 인한 연사망율은 여전히 상대적으로 높다.

FGF8은 본래 그 배지에 안드로겐을 첨가함으로서 그 발현이 유도되어지는 마우스유방암종의 세포주 (SC-3)으로부터 분리된다. 그 단백질은 또한 다른 포유류세포 뿐 아니라 이들의 증식을 유도하는 것으로 알려져 있다. 최근에 FGF8b mRNA가 8개의 인간의 유방암의 세포주 (MDA-MB-231, MDA-MB-415, ZR 75-1, T-47-D, SK-BR-III, PMC-42, HBL-100, MCF-7)에 존재하는 것으로 알려지고 있다 (Tanaka 1995, Payson 1996, Wu 1997, Marsh 1998).

마우스유방종양바이러스 (MMTV)로 감염된 Wnt-1 유전전환마우스는 유방종양을 발달시킨다. FGF8 전사는 50%의 종양에서 활성화되어진다 (MacArthur 1995c, Kapoun 1997).

매우 특이한 마우스유방종양바이러스 (MMTV)의 프로모터의 통제하에 FGF8b cDNA를 운반하는 형질전환마우스는 유방종양을 발현하는 FGF8b를 자발적으로 발생하는 것으로 보여진다 (Coombes, personal communication).

아주 최근의 데이타는 FGF8(b)의 발현이 유방암에서 상향조절됨을 보여준다 (Tanaka 1998, Marsh 1999). 타나카와 그 협력자들은 면역조직화학적 연구에서 새로운 모노클로날 FGF8 항체를 사용했다. 그들은 FGF8이 유방암의 67% (n=12)에 존재하며 안드로겐 수용체는 자가분비성장을 하는 프로모팅 루프가 유방암의 진행에 연관이 있음을 나타내는 FGF8 양성유방질병들 (과다형성, 섬유선종, 관내유두종, 암) 의 89%에 존재함을 보여줬다 (Tanaka 1998). 반정량 RT-PCR 방법을 사용하면 약간 높은 레벨의 FGF8 mRNA가 악성이 아닌 유방조직과 비교해 악성에서 발견되어짐을 알 수 있다. 주목할만한 것은 보다 악성인 조직이 보다 높은 레벨 (p=0.031)에서 FGF8 (p=0.019)을 발현하고 있다는 점이다 (68개의 유방암과 24개의 악성이 아닌 유방조직) (Marsh 1999).

FGF8(b)이 자가분비성장인자로서 기능을 한다는 것이 아직까지 완전하게 확립된 것은 아니다. 그렇다 하더라도, 많은 종양이 FGF8b를 과다발현한다는 사실은 FGF8b에 대항하는 자동백신이 많은 비율의 유방암과 전립선암에 대해 효과적일 수 있음을 강력하게 뒷받침한다. Marsh, Dorkin 그리고 Tanaka에 의해 보고된 데이타는 FGF8(b)에 대항하는 자동백신이 유방암과 전립선암 모두에 대한 처치요법으로 사용될 수 있음을 나타낸다. 그리고 Dorkin 등에 의해 제시된 다소 명확치 않은 데이타는 FGF8이 인간의 암세포의 증식에 관련이 있다는 견해를 더욱 깊이 지지한다.

FGF8b에 대한 설명

FGF8은 섬유모세포성장인자과에 속한다 (FGFs). 성장을 조절하는 이들 단백질은 작은 것에서부터 200개의 아미노산 잔기를 가진 단백질까지 다양한데, 이들 단백질은 모두 광범위한 세포의 증식과 분화의 유도에 관련되어 있다. 척추동물의 사지발달에 대한 섬유모세포성장인자의 연관성에 관한 최근의 재검토에 있어서 (Johnson 1997), FGF과의 일원은 진화적으로 관계가 있고 20-50%의 일치된 아미노산 배열을 공유한다.

FGF8b는 FGF8의 스플라이스 변이체로서, 본래는 성장인자를 유도하는 안드로겐 (AIGF)을 칭했다. AIGF는 먼저 안드로겐의 자극에 의존하는 세포주 (SC-3)에서 파생된 마우스유방암종에 의하여 분비되는 단백질로서 동정되어졌다(Nonomura 1990). 마우스의 FGF8 유전자는 잠재적으로 8개의 다른 FGF8 아이소형 (FGF8a-h)을 코딩하면서, 단지 그 분자의 N-말단부분만이 다른 6개의 엑손을 포함한다(Crossley 1995, MacArthur 1995b). 인간의 FGF8은 마우스의 유전자와 동일한 유전자구조를 가진다. 그러나 엑손 1B의 정지코돈 때문에 인간의 FGF8은 이름하여 FGF8a, FGF8b, FGF8e, FGF8f라는 4개의 다른 아이소형으로 존재하는 것이 가능하게 된다 (Gemel 1996). 4개의 인간의 아이소형의 유전자 구조와 아미노산 배열은 그림 5에서 설명하고 있다.

성숙한 FGF8b는 193갸의 아미노산 잔기를 포함하고, 분자량이 22.5kDa으로 측정된다. 가장 기본적인 단백질은 21개의 아르기닌과 14개의 라이신 잔기를 포함하는데, 이 단백질은 등전점이 10.84이고 pH 7.0에서 양전하가 19.8이다. 또한 이 단백질은 2개의 시스테인 잔기를 함유하며, 2개의 잠재적인 N-글리코실레이션(당화)사이트를 가진다. FGF8b에 관해 행해지는 연구의 본질 탓에, FGF8b 단백질 성분에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. 그러나 FGF8b 단백질은 박테리아로부터 이종적으로 발현되어왔고, C-말단의 헥사-히스티딘 꼬리의 사용으로 정제되어왔다. 그리고 이 단백질은 시험관내에서 수용성이면서 생물학적으로 활성을 띤 상태로 되접혀져왔다 (MacArthur 1995a, Blunt 1997).

FGF8b의 생물학적 활성

위에서 언급한 바에 따라, FGF8(b)는 안드로겐에 의존하는 마우스유방종양세포주로부터 방출되어진 인자로써 처음 분리되었다. 그리고 이 단백질은 이들 세포의 증식을 유도할 수 있음을 보여줘왔다. 형태학적 변화는 FGF8(b) mRNA의 합성을 또한 유도하는 것으로 알려진 테스토스테론에 의하여 유도되는 변화들과 흡사하다 (Tanaka 1992). 증식은 FGF8(b) 항센스올리고에 의해 저해될 수 있다 (Nonomura1990, Tanaka 1992, Yamanishi 1994). 게다가 인간의 전립선암세포주 DU145는 항센스 FGF8b를 발현하는 바이러스를 트랜스펙션하여 성장을 저해할 수 있다 (Rudra-Ganguly 1998). 최근의 데이타는 FGF8b가 STAT3--세포괴사에 대한 내성과 연관이 있는 것으로 추측되는 단백질--의 인산화를 유도함을 보여준다 (Catlett-Falcone 1999, Johnston, C.L., 발표되지않은 결과들).

FGF8b는 몇몇 연구자들에 의해 NIH3T3 또는 SC115 세포의 형질전환을 유도하는데 매우 유효함을 보여왔다 (Miyashita 1994, Kouhara 1994, Lorenzi 1995, MacArthur 1995a). 재조합적으로 발현된 단백질의 사용에 의해, 이러한 형태학적 변화의 유도는 FGF8a나 FGF8c를 사용할 때보다 FGF8a를 사용할 때 보다 더 효과가 뛰어남을 또한 보여준다 (MacArthur 1995a, Ghosh 1996). 흥미롭게도, FGF8b 분자의 N-말단의 절반만으로도 NIH3T3 세포의 형질전환에 충분함이 밝혀졌으며, 그리고 FGF8b의 작고 특이적인 펩타이드 (QVTVQSSPNFT)조차도 0.1%의 세럼에서 세포가 정상의 경우보다 2-3배 정도 길게 자라게 할 수 있었다 (Rudra-Ganguly 1998). 더군다나 FGF8b를 코딩한 발현벡터로 안정하게 감염된 NIH3T3 세포는 무모마우스 내로 intraocular하게 주입되었을 때 매우 발암성이 있다고 보고되어져 오고 있다 (Kouhara 1994, Ghosh 1996).

생체내에서, FGF8b는 척추동물의 어떤 발달단계에서 발현하는 것으로 알려진다. 표 1은 FGF8(b)의 생물학적 역할에 대해 간단히 설명하고 있다. Goldfarb 1999와 Johnson 1997는 척추동물의 발달에서 FGF8의 연관성에 대해서 재검토하고 있다.

표 1: FGF8을 만드는 것으로 알려진 여러가지 사이트와 조직, 그리고 제안되어지는 그 생물학적 역할.

FGF8(b)는 섬유모세포성장인자수용체 (FGFR's)에 결합함으로써 그 작용을 전달하는 것으로 생각되고 있다. 보다 엄밀하게 말하면, FGF8b는 FGFR2c, FGFR3c, FGFR4c, 그리고 어느 정도의 FGFR1c를 활성화할 수 있는 것으로 알려져 있으나, FGFR1b, -2b, 또는 -3b는 활성화시킬 수 없는 것으로 알려져 있다 (MacArthur 1995b, Blunt 1997). 닭의 이소성 수족 돌기 (limb bud)의 증식을 유도하는 경우에서 FGF10, FGFR2, FGF8은 서로 상호작용을 하고 이 상호작용은 증식을 위해 충분함을 암시한다 (Kuwana 1997, Xu 1998).

이러한 결과들은 FGF8(b)가 척추동물의 발달과정 동안 몇가지 해부학적 구조의 정상적인 증식과 패턴을 유도하면서, 자가분비와 측분비 방식으로 작용할 수 있다는 가설을 뒷받침해준다. 중요하게도, FGF8 "total knock out" 마우스는 아마도 배아발달에서 단백질의 정교한 연관성 때문에 생존하지 못할 것이다.

다른 단백질에 대한 상동성

항체에 접근용이한 다른 단백질과의 원치않은 교차반응성을 FGF8b의 특이자가항체를 유도하는 자가백신으로 다음의 처리를 기대할 수 있을지를 예상하는 것은 매우 중요한 문제이다. FGF8b와 나머지 FGF8 분자간의 서열의 일치성의 높은 정도 때문에 자가백신은 이들 단백질과의 교차반응이 기대되어진다. 그러나, 이것은 이들 단백질중 어느 것도 이미 FGF8b를 발현하지 않은 조직에서 또는 세포주에 의해 발현되지 않은 것으로 보고되고 있으므로 유리할 것이다.

FGF8b의 55에서 175까지의 아미노산잔기는 나머지 FGFs에 대한 서열의 일치성에 있어서 상대적으로 낮지만 중요한 일치성정도를 보인다. 두 개의 단백질도메인 사이에서의 서열일치성의 중요도는 또한 높은 정도의 3차 구조 유사성을 반영함이 일반적으로 받아들여진다 (그리고 몇차례 증명되었다). 따라서, FGF군의 일원들은 모두 일반적으로 유사한 구조를 가지는 것으로 기대된다. FGF2의 3차원구조는 용액에 용해될 뿐 아니라 결정으로부터도 분해된다 (Ago 1991, Zhang 1991, Zhu 1991, Eriksson 1993, Blaber 1996, Moy 1996). FGF2는 전체적으로 4가닥의 반평형 베타-꼬임이 3겹으로 반복되어 있는 베타-평면구조로 구성된다. 이 베타-베럴 구조는 인터루킨 1, FGF2 ( 또는 기본 FGF), FGF1( 또는 산성 FGF) 사이에서 전반적으로 보존된다. 용액내에서 FGF2의 핵자기공명분석은 분자의 N-말단부분이 상대적으로 유연한 구조를 형성함을 보여준다. FGF8b의 남은 부분 (아미노산잔기 1-54와 176-215)은 알려진 단백질에 대해 단지 낮은 정도의 서열일치성을 보인다.

구조적이고 정렬된 데이터에 바탕을 두면, 다른 섬유모세포성장인자의 3차원 구조의 핵심은 FGF1와 FGF2의 3차구조의 핵심과 밀접하게 유사하다는 가정이 가능하다. 이런 구조적 가정은 본 발명자들이 FGF8b 돌연변이체 자가백신분자를 디자인하는데 중요한 인자이다.

중요하게도, FGF8과 FGF군의 다른 일원들 사이의 상대적으로 낮은 서열 일치성 탓에, FGF8의 표면은 다른 FGFs의 표면과는 매우 다르며, 그것에 의해서 FGF군의 일원을 가진 항체를 생성하는 FGF8b의 교차반응성을 최소화한다. 섬유 모세포성장인자보다 다른 단백질에 대한 매우 낮은 상동성 때문에, 본 발명자들은 다른 단백질과 교차작용하기 위해 FGF8b에 대항하는 자가백신을 기대하지는 않는다.

그렇다 하더라도, FGF8b에 대항하는 자가백신은 아마도 FGF8의 모든 아이소형과 교차반응을 한다는 것은 강조할만하다. 그러나, 이것은 FGF8 아이소형 중 어느것도 성인에게서는 현저한 레벨로 발현이 기대되지 않기 때문에 별로 문제되지는 않는다. 적어도 몇몇 암세포주는 FGF8b외에도 다른 아이소형을 발현한다는 것이 알려진 이래로 이러한 교차반응은 암의 처치요법에 유익할 가능성이 있다.

FGF8b의 조직분배

이상적으로는, 자가접종으로 일어난 예상되어진 CTL반응 뿐만 아니라 유도된 자가항체와 이에 종속된 작동메카니즘은 환자에게서 없어질 조직을 향하고 있다. 따라서 자가백신이 목표로 삼는 항원의 조직분배는 백신의 안전성에 대하여 제일 중요한 문제이다.

표: 여러 가지 조직과 세포에서 FGF8b의 발현

상기 표는 FGF8b발현에서 조직분배의 광범위한 선택과 세포주데이타를 보여준다. 표에서 본 것처럼, 조직분배에 관한 대부분의 데이터는 민감한 RT-PCR방법을 이용해 얻어졌다. 이것은 노스턴블럿분석이 태아의 간으로부터 제외된 정상조직에서 어떤 FGF8b mRNA를 검출하지 못하기 때문이다. 이런 이상스런 데이터로부터, 성인의 FGF8b mRNA 발현은 매우 제한적이며, 따라서 FGF8b에 대항하는 자가백신은 아마도 정상조직에 대항하여 반응하지 않을 것이다. 적은양의 FGF8b이 성인의 미지의 시스템과 상호작용할 수 있다는 사실 때문에, 단백질의 조직분배는 보다 더 분석이 필요하다. 그러나 FGF8b에 대항하는 자가백신이 환자에게 원치않던 심각한 영향을 끼치게 됨을 암시하는 본 발명자들의 견해는 없다.

FGF8b에 대항하는 항체의 영향

지금까지, 모노클로날항체를 이용한 전립선암을 처치하기 위한 시도들은 발표되어진 바가 없지만, 모노클로날항체로 하는 임상실험은 유방암치료연구에서 진행되고 있다.

FGF8b에 대항하는 항체는 아마도 FGF8b와 그것의 수용체 간의 상호작용을 막아 세포막의 파상운동과 세포증식을 저해할 것이고 그리하여 암세포의 운동성과 침입성을 감소될지도 모른다.

그러므로 본 발명은 또한 다음에서 설명하는 방법의 구체화와 관련된다. 외부 T세포 에피토프를 SEQ ID NO:6 위치 1-54 및/또는 178-215 및/또는 55-58 및/또는 63-68 및/또는 72-76 및/또는 85-91 및/또는 95-102 및/또는 106-111및/또는 115-120 및/또는 128-134 및/또는 138 - 144 및/또는 149-154 및/또는 158-162 및/또는 173-177로 정의되어지는 FGF8b의 아미노산서열부분으로 도입하였다. 이러한연장은 여러 가지의 비종양조직에서 발현될 것 같은 단백질로서 최근 발견된 FGF-18와 최소의 상동성을 보이기 때문에, 위치 26-45와 아미노산 186-215에서 시작하는 C-말단에서 변이와 변형을 도입하지 않는 것을 특히 선호한다는 것이 주목할만한 일이다.

그러므로 본 발명은 인간에서 면역원성 인간/마우스 FGF8b의 유사체와 또한 관계가 있다. 이 유사체는 이하에서 얘기되어지는 것처럼 모두 잘 알려져 있고 예상되어지는 CTL과 FGF8b의 B-세포 에피토프의 실질적인 부분을 구성하며 적어도 하나 이상의 외부T_H에피토프를 포함하는 유사체다. FGF8b 아미노산 서열로의 주입으로서 또는 FGF8b 아미노산서열부분의 치환으로서 또는 FGF8b 아미노산서열부분의 삭제의 결과로서 적어도 하나 이상의 외부T_H에피토프가 존재한다는 것을 선호한다. 이러한 구체화에서 선호되어지는 대부분의 유사체는 외부T-세포 에피토프를 SEQ ID NO:6 위치 1-54 및/또는 178-215 및/또는 55-58 및/또는 63-68 및/또는 72-76 및/또는 85-91 및/또는 95-102 및/또는 106-111 및/또는 115-120 및/또는 128-134 및/또는 138 - 144 및/또는 149-154 및/또는 158-162 및/또는 173-177로 정의되어지는 FGF8b의 아미노산서열부분으로 도입하는 것들이다.

뮤신

본 발명은 또한 인간의 뮤신 --특히 MUC-1에서 MUC-4까지이며 MUC-1를 선호한다 --의 특이적 변형을 쓰는 발명방법과 관계가 있다. 그 유사체는 TR(-S-P-S-(TR)_m)_n의 구조로 이루어져 있다. 여기서 TR은 본래의 뮤신으로부터 유도된 탄뎀의반복이고, P는 여기서 얘기되어지는 외부T_H에피토프이고, S는 0개 내지 15개의 아미노산잔기를 가진 주입스페이스펩타이드이다. 그리고 n은 1에서 30까지의 정수이며, m은 1에서 10까지의 정수로서 3에서 5가 더욱 바람직하다.

인간의 세포주에서 뮤신유사체를 생산하거나 조직으로부터의 정제를 통해 뮤신유사체를 생산할 때, 그 직접적인 결과는 바라는 바대로의 글리코실화 패턴을 정상적으로 가지지 않을 것이다. 즉 종양유도뮤신의 변칙글리코실화패턴과 유사한 변칙적인 글리코실화패턴을 가지게 될 것이다. 그러나,E.coli와 같은 균에서나 또는 다른 합성수단에 의해서 재조합적으로 유사체를 생산하는 것은 가능한 일이고, 이에 부수적으로 종양상에서 발현되는 MUC-1에 대한 특이적인 Tn 혹은 S-Tn 글리코실화패턴을 달성하기 위해서 효소적으로 산물을 글리코실화하는 것이 가능하다. 폴리펩타이드는 포유동물세포주나 곤충세포주에서 조제하거나 또는 (분비신호펩타이드의 생략으로 인하여) 세포내적으로 글리코실화가 일어나지 않는 단백질을 발현함으로써 택일적으로 조제할 수 있다. 곤충세포주로는 예를 들자면 연관효소가 부족한Drosophila세포가 있다.

본 발명의 핵산 단편 및 벡터

위에서 드러난 사항들로부터 유사체가 화학적합성이나 반합성방법에 의해서 뿐만 아니라 재조합유전자조작에 의해서도 만들어질 수 있다는 것이 일단 이해되어진다. 화학합성이나 반합성은 그 변형이 단백질 운반체(KLH, diphtheria toxoid, tetanus toxid, BSA등)와 탄수화물다량체와 같은 비단백질분자에 대한 커플링으로이루어질 때 특히 연관이 있다. 그리고 물론 그 변형이 폴리펩타이드를 유도하는 펩타이드체인에 대한 사이드체인이나 사이드그룹의 부가로 이루어질 때도 마찬가지이다.

재조합유전자조작의 목적을 위해서, 그리고 물론 핵산면역의 목적을 위해서도, 필수적인 에피토프구역과 유사체를 코딩하는 핵산 단편은 중요한 화학산물이다. 그러하므로, 본 발명의 중요부분은 연관되는 종양-특이 폴리펩타이드, 특히 주입 및/또는 부가의 방법에 의하여 외부 T_H-세포 에피토프를 도입하는 폴리펩타이드 중에서, 위에서 설명한 바 있는 유사체를 코딩하는 핵산 단편과 연관이 있다. 이 경우 치환 및/또는 삭제가 더 선호적이다. 본발명의 핵산 단편은 DNA조각이거나 또는 RNA조각이다.

본 발명의 핵산 단편은 정상적으로 발명의 핵산 단편을 운반하는 클로닝이나 발현벡터를 형성하기 위해서 적합한 벡터내로 주입된다; 그런 신규벡터도 본발명의 부분임은 물론이다. 이들 벡터의 구성에 관한 상세는 아래의 형질전환된 세포와 미생물에 관한 문단에서 얘기되어질 것이다. 벡터는 그 적용의 목적이나 형태에 의존하긴 하지만 플라스미드, 파아지, 코즈미드, 미니-크로모좀 또는 바이러스의 형태가 있을 수 있다. 물론 어떤 세포에서는 단지 일시적인 발현이 가능한 누드 DNA가 중요한 벡터이기도 하다. 발명에서 클로닝과 발현벡터는 독립적으로 복제가 가능하고 그 결과 부수적인 클로닝에서 높은레벨의 발현이나 높은레벨의 복제를 위해 높은 복제수가 가능한 것이 바람직하다.

벡터의 일반적인 윤곽은 5'→3'방향에서 작용가능한 연결상태에서 아래의 특징으로 이루어진다: 핵산 단편의 발현원동력이 되는 프로모터, 선택사항으로서 폴리펩타이드 단편의 막 안으로 분비나 삽입이 가능하게 하는 리더펩타이드를 코딩하는 핵산서열, 발명의 핵산 단편, 터미네이터를 코딩하는 핵산서열. 생산균주나 세포주에서 발현벡터를 가지고 작동할 때, 형질전환된 세포의 유전적 안정성을 위해서는 벡터가 숙주세포내로 들어갈 때 그 벡터를 숙주세포게놈내로 삽입하는 것이 바람직하다. 이와 대조적으로, 동물에서 생체내 발현을 가져오는데 이용되기 위해 벡터를 가지고 작업을 행할 때(즉 DNA접종에서 벡터를 사용할 때), 안전성을 이유로벡터는 숙주세포게놈내로 삽입될 수 없다고 봄이 바람직하다.; 전형적으로는 이 분야의 전문가에게는 잘 알려진 선택인, 누드DNA 또는 삽입되지 않는 바이러스성 벡터가 이용된다.

본 발명에서 벡터는 본 발명의 유사체를 생산하기 위해 숙주세포를 형질전환시키는 데 이용된다. 그러한 형질전환된 세포는 본 발명의 핵산 단편이나 세포주의 증식을 위해 이용되는 세포나 세포주로 배양될 수 있으며, 또는 발명의 유사체의 재조합 생산을 위해 이용되는 세포나 세포주로도 배양이 가능하다. 택일적인 사항으로, 유사체의 박테리아성 막이나 세포벽 속으로 분비 혹은 삽입되기 위해 핵산 단편(싱글 또는 멀티플 카피)이 주입되어진다는 점에서 형질전환된 세포는 생백신균주에 적합하다.

이 발명에서 선호되는 형질전환된 세포는 박테리아 (Escherichia종 [예를들어E.coli], Bacillus종 [예를들어Bacillus subtilis], Salmonella종, 또는Mycobacterium종 [비병원성이 선호적, 예를들어M.bovisBCG]등과 같은), 효모 (Saccharomyces cerevisiae등과 같은)등과 같은 미생물과 원생동물이다. 택일적인 사항이긴 하지만, 형질전환세포는 곰팡이, 곤충세포, 식물세포, 혹은 포유동물세포등과 같은 다세포생물로부터 유래되기도 한다. 가장 선호도가 높은 세포는 인간으로부터 유래한 세포이다, cf.세포주와 벡터에 대해서는 아래서 기술.

클로닝 및/또는 최적의 발현을 위해서는 형질전환세포가 본발명의 핵산 단편을 복제할 능력이 있는 것이 바람직하다. 핵산 단편을 발현하는 세포는 본발명을 구체화하는데 바람직하면서도 유용하다. 이들 세포는 소규모 혹은 대규모로 유사체를 제조하는데 이용되며, 비병원성 박테리아의 경우에는 생백신에서 백신의 성분으로서 이용된다.

형질전환세포에 의해 본발명의 유사체를 생산하는데 있어서는, 비록 필수적이지는 않다 하더라도, 발현산물을 배양배지내로 내보내던지 아니면 형질전환세포의 표면상으로 운반하는 것이 편리하다.

산물생성력이 유리한 세포를 동정할 때는 기본적인 이론상, 본발명의 벡터를 운반하면서 유사체를 코딩하는 핵산 단편을 발현하는 안정한 세포주를 확립하는 것이 바람직하다. 간편용이한 정제이론에 의하면, 이러한 안정한 세포주 본발명의 유사체를 분비 혹은 운반하는데 있어 바람직하다.

일반적으로, 숙주세포와 양립가능한 종으로부터 유래한 복제단위와 통제서열을 함유하고 있는 플라스미드벡터가 숙주와의 접촉에 이용된다. 보통 벡터는 형질전환세포에서 표현형선발을 제공할 수 있는 표지서열 뿐만 아니라 복제사이트도 운반한다. 예를 들면,E.coli는 전형적으로E.coli종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322로 형질전환된다 (Boliver et al., 1977을 보라). pBR322플라스미드는 엠피실린과 테트라사이클린 내성유전자를 가지고 있어서 형질전환세포를 동정하기에 쉬운 수단을 제공한다. pBR플라스미드 또는 다른 미생물성 플라스미드 또는 파아지는 발현을 위해 원핵미생물이 이용가능한 프로모터를 가져야만 하거나 아니면 가지도록 변형되어져야 한다.

일반적으로 재조합DNA구성에 쓰이는 이들 프로모터는 B-락타미아제(페니실리니아제)와 락토오스 프로모터 시스템 (Chang et al., 1978; Itakura et al., 1977; Goeddel et al.,1979)과 트립토판(trp) 프로모터 시스템을 포함한다 (Goeddel et al., 1979; EP-A-0 036 776). 대부분은 이러한 프로모터가 이용되는 동안에도, 다른 미생물성 프로모터가 발견되고, 활용되어지며, 그것의 뉴클레오타이드서열에 관한 상세가 발표되어져 왔다. 그리고 전문가들이 플라스미드벡터를 가지고 그것의 뉴클레오타이드서열을 깨뜨리는 것도 가능해졌다 (Siebwenlist et al.,1980). 인위적인 수단에 의해 또다른 프로모터를 부가하는 것은 제외하고라도 원핵생물의 어떤 유전자는 그 자신의 프로모터서열로부터E.coli상에서 유효하게 발현될 수도 있다.

원핵생물외에도, 효모배양과 같은 진핵미생물 또한 이용되고 여기서도 프로모터는 추진발현을 할 수 있어야 한다. 비록Pichia pastoris와 같은 다른 많은 균주들도 쓸모있다 하더라도,Saccharomyces cerevisiase나 보통 빵효모가 진핵미생물 중에서는 대개 일반적으로 이용된다. Saccharomyces에서의 발현을 위해서는, 예를들면 플라스미드 YRp7이 대개 이용된다 (Stinchcomb et al.,1979; Tschemper et al.,1980). 이 플라스미드 YRp7은 트립토판존재하에서는 성장능력이 결손되는 효모돌연변이균주를 선택하기 위한 표지를 제공하는 trp1유전자를 이미 가지고 있는데, 이들 효모돌연변이주로는 ATCC No.44076이나 PEP4-1등이 있다 (Jones, 1977). 효모 숙주세포게놈의 특징인 trp1에 손상이 있게되면 이 균주를 트립토판이 없는 배지에서 성장시킴으로서 효과적으로 형질전환을 검출할 수 있게 된다.

효모벡터에서 적합한 프로모팅서열은 3-포스포글리세리트 키나아제 (Hitzman et al., 1980) 또는 에놀라아제,3-인산 글리세르알데하이드 탈수소효소 , 헥소키나아제, 피루브산 탈카르복시기효소, 포스포프럭토키나아제, 포도당6인산이성화효소, 3-포스포글리세리트 뮤타아제, 피루브산 키나아제, 삼탄당인산이성화효소, 포스포글루코오스이성화효소, 글루코키나아제 등과 같은 다른 해당효소 (Hess et al., 1968; Holland et al., 1978) 에 대한 프로모터들을 포함한다. 적당한 발현플라스미드를 구성함에 있어서는, 이들 유전자들과 결합하는 종결서열이 mRNA의 폴리아데닐레이션과 종결을 제공하기 위해 발현됨이 바람직한 그 서열의 발현벡터 3'안으로 깨지게 된다.

성장조건에 의해 통제되는 전사의 부가적인 잇점을 가지는 다른 프로모터는알콜탈수소효소2, 아이소사이토크롬C, 탈인산가수분해효소, 질소동화작용과 관련이 있는 분해효소, 앞에서 말한 3-인산 글리세르알데하이드 탈수소효소, 그리고 말토오스와 갈락토오스 이용에 관여하는 효소들에 대한 프로모터구역이다. 효모와 양립가능한 프로모터, 복제개시점, 종결서열을 함유하는 플라스미드벡터가 적당하다.

미생물외에도, 다세포생물로부터 유래된 세포배양도 숙주로서 사용될 수 있다. 기본적으로, 척추동물배양이든 무척추동물배양이든간에 세포배양은 진행가능하다. 그러나 척추동물배양에 대한 관심이 무엇보다도 크고, 배양에서 척추동물의 증식(조직배양)은 최근 몇년사이 틀에 박힌 과정이 되어버렸다 (Tissue Culture, 1973). 유용한 숙주세포주로는 VERO, HeLa세포, Chinese hamster ovary (CHO)세포주, W138, BHK, COS-7, MDCK세포주등을 예로 들 수 있다.

그런 세포에 대한 발현벡터는 보통은 (만일 필요하다면) 복제개시점, 발현되는 유전자의 앞쪽에 위치하는 프로모터, 필요한 리보솜이 결합하는 사이트, RNA스플라이스 사이트, 폴리아데닐레이션 사이트, 전사종결서열등을 포함한다.

포유동물세포에서의 이용을 위해서, 발현벡터상에서 통제기능은 종종 바이러스성 물질이 제공한다. 예를 들자면, 보통 사용되는 프로모터는 polyoma, Adenovirus 2로부터 유래된 것이며, Simian Virus 40 (SV40)로부터 유래된 프로모터가 빈번하게 사용된다. SV40바이러스의 초기와 나중 프로모터는 특히나 유용한데 , 그이유는 이 두 프로모터 모두가 SV40바이러스의 복제개시점을 포함하고 있는 조각으로서 바이러스로부터 쉽게 얻을수 있기 때문이다 (Fiers et al., 1978). 보다 작거나 보다 큰 SV40조각이 바이러스의 복제개시점에 위치하고 있는 Bg1I사이트를 향해 HindIII사이트로부터 늘어난 약 250bp의 서열을 포함하고 있다면 이 조각들이 또한 사용되어질 수도 있다. 게다가, 만일 그런 통제서열이 숙주세포시스템과 양립가능하다면, 바람직한 유전자서열과 정상적으로 연계된 프로모터나 통제서열을 활용하는 것이 또한 가능하며 종종 이것이 바람직할 수도 있다.

복제개시점은 SV40이나 다른 바이러스(예를 들면 Polyoma, Adeno, VSV, BPV등)에서 유래된 외래성개시점을 포함하는 벡터구성에 의해서 제공되거나 아니면 숙주세포의 염색체복제 메카니즘에 의해서 제공된다. 만일 벡터가 숙주세포 염색체내로 삽입된다면, 위의 둘중에서 후자만으로도 충분한 경우가 종종 있다.

본 발명의 조성물

본 발명은 또한 유효한 면역원성 제제로서 본문에서 설명된 적어도 하나의 유사체를 약제학적으로나 면역학적으로나 허용가능한 담체, 비히클, 희석제, 부형제, 그리고 임의로 어쥬번트와 혼합하여 포함하는 면역원 조성물에도 관계된다.

게다가, 발명은 또한 위에서 얘기되어진 종양항원중 하나에 대항하는 항체의 생산을 유도하기 위한 성분과 관련이 있다. 이 성분은 발명에서 핵산 단편이나 벡터, 그리고 약제학적으로나 면역학적으로나 받아들일 수 있는 희석제 및/또는 매개체 및/또는 운반체 및/또는 부형제 및/또는 보조제로 이루어져 있다.

이러한 성분에 관한 형성과 다른 특이성은 위에서의 핵산면역에 관해 언급하고 있는 관련부분에서 얘기되고 있는 바이다.

실시예 1

PSM에 대한 백신화

다음에서는 면역원성 PSM분자의 패널을 드러내기위해 하나나 그이상의 불규칙한 외부T세포 에피토프의 주입함으로서 분자변형을 통해 어떻게 PSM에 대한 인간의 자가백신을 개발할 수 있는지에 대해 설명할 것이다.

본 발명자들은 PSM 지지 종양세포에 대항하여 특이한 CTL반응을 유도하기 위한 그 구조물의 능력을 검정할 것이다. 이에 덧붙여, 그 구조물은 PSM분자의 본래 부분과 교차반응하는 항체 유도능력을 검정받게 될 것이다. 부수적으로 몇몇 실험실내의 분석와 생체내 동물모델에서는 다른 구조물의 유효성의 평가되어질 것이다. 유도된 항체는 분류된 경로를 통해 보체를 활성화시킬 수 있는 항체의 능력과 Fc-수용체를 통해 ADCC를 초기화할 수 있는 항체능력을 검정받게 될 것이다. 마지막으로, 다른 분자들은 인간의 전립선암의 동물모델로 검정될 것이다.

PSM 자가백신의 디자인 전략

PSM 백신을 만드는 방법을 간략하게 설명하자면 아래의 실험과 같다.

인간의 PSM 돌연변이체 패널의 디자인과 생산

-인간과 랫/마우스로부터 PSM 서열의 클로닝

-면역원성 hPSM 분자를 생성하는 돌연변이작업

-E.coli및/또는Pichia pastoris및/또는 포유동물세포 및/또는 곤충세포 ( S₂세포주와 같이)에서야생형 및 면역유전된 hPSM 분자의 발현

-면역원화된 hPSM 분자의 정제, 되접힘, 특징짓기

PSM에 대항하는 DNA의 접종

-면역원화된 hPSM 분자를 코딩하는 hPSM DNA 접종 벡터의 생산

-실험실내와 생체내에서 각각 hPSM 접종 벡터의 검정

hPSM 후보의 선택

-마우스/래빗의 면역화

-ELISA

-FACS 분석

-항체 반응의 경우 : 종양세포의 증식 분석

-T 세포 분석

생체내에서 hPSM 돌연변이체의 검정

-마우스에서 고체 종양/전이 모델

개념적 연구 : 자가접종에 의한 CTL 유도

-선택된 hPSM 표본에 대응하는 면역유전된 마우스/랫 PSM의 구성 (예를 들어 DNA 백신의 형태로)

-실험실내의 분석으로 마우스/랫의 PSM 돌연변이체에 의해 일어나는 면역반응을 검정: 면역화학 분석, ELISA, FACS 분석, 세포분석, PSM 지지세포의 보체용해, ADCC분석, CTL활성분석, 종양세포의 증식분석, T 세포제공 분석.

-생체실험으로 마우스의 고체 종양/전이 모델에서 mPSM 돌연변이체의 검정

hPSM 구조물의 명명

PSM은 750개의 아미노산으로 이루어진 Ⅱ형 막단백질이다, cf. 4-6위치에서 ggt가 tgg로 치환되는 SEQ ID NO:1에서, NcoI사이트와 Kozak서열의 도입으로 인하여 2번위치에서 Gly가 Trp로 치환되는 것을 제외하고는 야생형서열을 말하는 SEQ ID NO:2. 그러나 본래의 PSM (2번위치에 Trp를 가진 PSM)가 자가백신구조물에 기초한 약간의 인간의 PSM을 위해 이용되어져 왔음은 물론이다.

PSM에서, 부분은 707개의 C-말단 아미노산으로 구성되어 있는 반면, 세포질도메인은 19개의 아미노산으로 이루어져 있고 막횡단부분의 단백질은 24개의 아미노산으로 이루어져 있다 (aa 20-43).

구조물의 시작시점으로서, 스플라이스 변종 PSM'이 또한 사용되어져왔다. 이 스플라이스변종에 대해서 본 발명자들은 이것이 SEQ ID NO:2의 잔기 58-750에 대응하는 아미노산서열을 갖는다고 해석한다. 쉽게 명명하자면, PSM'에서의 구역은 PSM에서의 숫자매김에 따라 그 숫자가 부여된다(예를 들어 구역2가 PSM에서는 87-108개의 아미노산으로 구성되고, PSM'에서는 30-51개의 아미노산으로 이루어짐을 뜻한다), cf. 구역에 대해서는 아래에서 다시 다루겠다.

인간의 PSM의 모든 유전적 구조물은 hPSM＿ㆍ＿ (또는 만약 PSM'이 시작시점으로 이용된다면 hPSM'＿ㆍ＿ )로 정해진다. 여기서 처음의＿은 P2의 주입을 위한 주입구역이고 두번째의 ＿은 P30을 위한 주입구역이다.

만일 P2나 P30이 단백질에 존재하지 않는다면, 숫자 0(제로)로 정해진다. 야생형 hPSM의 전체길이는 hPSM0.0으로 지정되고 세포질부분과 막횡단부분이 부족한 야생형 hPSM는 hPSM÷0.0으로 지정된다. 모두가 하나의 P2 에피토프와 하나의 P30 에피토프를 포함하는 13개의 계획된 면역유전된 hPSM 유전자는 hPSM1.1, hPSM6.1, hPSM8.1, hPSM10.1, hPSM1.6, hPSM1.8, hPSM1.10, hPSM1.2, hPSM1.3, hPSM1.5, hPSM2.1, hPSM3.1, hPSM10.3, hPSM6.3, hPSM'10.3, hPSM'6.3, hPSM8.3, hPSM'8.3, hPSM5.1로 명명한다, cf.자세한 것을 아래에서 설명.

hPSM1.1에서, P2와 P30 에피토프는 주입구역 no.1의 탄뎀으로 주입되어진다 (막이 펼쳐진 구역). 이론상, 이 돌연변이체 hPSM1.1은 항체생산을 유도하기 위한 매우 매력적인 백신표본으로 고려되어진다. 왜냐하면 이 분자의 세포외부도메인전체는 손상되지 않은 상태이기 때문이다. 핵산면역을 이용하여 CTL반응을 유도하기 위하여, hPSM10.3, hPSM6.3과 같은 구조물이 유용하다고 여겨진다.

클로닝과 돌연변이 과정을 촉진시키기 위하여는 많은 분자구성작업이 시작물질로서 hPSM 유전자의 N-말단 (아미노산 1-436) 혹은 C-말단 (아미노산 437-750)부분에서행해진다. hPSM유전자의 이들 두부분은 hPSMI＿ㆍ＿와 hPSMII＿ㆍ＿로 정해진다. 각각, 첫번째의＿는 P2를 주입하기 위한 주입구역이고 두번째＿는 P30을 주입하기 위한 주입구역이다. 다시 말하자면, 만일 P2나 P30이 단백질에 존재하지 않는다면, 숫자 0(제로)로 정해진다. 그리고 야생형은 각각 hPSMI0.0과 hPSMII0.0으로 명명된다. hPSM의 세포질부분이 없는 hPSMI0.0의 특이변종은 hPSMI÷0.0으로 정해진다.

사실상, 대부분의 돌연변이작업은 hPSMI0.0과 hPSMII0.0을 시작물질로 하여 진행된다.

발현된 hPSM돌연변이체단백질은 PROS＿ㆍ＿로 정해진다, 여기서 첫번째의＿는 P2를 주입하기 위한 주입구역이고 두번째＿는 P30을 주입하기 위한 주입구역이다. 만일 P2나 P30이 단백질에 존재하지 않는다면, 숫자 0(제로)로 정해진다. 야생형hPSM는 PROS0.0로 정해지고 PROSII0.0은 hPSM의 아미노산 437-750로 된 단백질산물이다. HIS 꼬리가 붙은 단백질은 HIS-PROS＿ㆍ＿로 불린다. His테그는 효모와 박테리아에서의 발현을 위해 SEQ ID NO:21을 이용하는 반면, SEQ ID NO:23는 포유동물세포에서의 발현을 위해 이용된다.

인간의 PSM서열의 클로닝

인간의 전립선선암종의 전이성손상에서 기인한 LNCaP 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC)로부터 얻어진다. 이 세포주에서 mRNA를 분리하고 인간의 PSM서열을 코딩하는 cDNA를 얻을 목적으로 이를 표준키트를 사용하여 역전사시켰다. hPSM의 특이프라이머의 다른 집합을 이용할 때, PSM(437-750)을 코딩하는 PCR산물이 얻어지고 나아가 이 PCR산물은 pUc19(플라스미드넘버 pMR300)로 클론되며 DNA시퀀싱에 의해 증명된다. 이 야생형 PSM의 C-말단부분은 hPSMpartII (hPSMII0.0)으로 정해진다.

이와 유사하게, 야생형 hPSMpartI (hPSMI0.0)은 막횡단+세포질도메인을 가진 hPSMI0.0과 이를 가지지 않은 hPSMI÷0.0 둘다를 가지고 partI을 증폭하기 위해 프라이머를 사용하여 pUc19로 클론된다. 이 클론은 통제서열이 되고 hPSMI0.0와 hPSMII0.0는 EcoRI사이트에서의 라이게이션을 이용하여 융합되어진다. hPSM0.0 (SEQ ID NO:2)와 hPSMI÷0.0의 클론결과물은 많은 원핵발현벡터와 진핵발현벡터로 서브클론되고 다시 그 서열들은 증명된다. 인간의 PSM의 세포외적인 발현형태 (hPSM'--SEQ ID NO:2의 아미노산 58-750--로 정해진다)는 또한 시작물질로 cDNA를 사용하면서 구성된다. 이 서열은 또한 포유동물발현벡터로 서브클론되고 약간의 hPSM 자가백신구조물, 예를 들어 hPSM'10.3과 hPSM'6.3을 위한 시작물질로서 사용된다.

랫과 마우스PSM서열의 클로닝

마우스PSM cDNA 서열을 포함하는 두개의 EST (발현된 서열tag)클론(각각 마우스신장과 마우스메크로파지로부터 나온)은 American Type Culture Collection (ATCC)으로부터 얻어졌다. 이와함께 마우스 PSM cDNA 서열은 이들 EST's로 싸여있고, 따라서 마우스 PSM'(SEQ ID NO:9 & 10)뿐만 아니라 완전한 길이의 마우스 PSM (SEQ ID NO:7 & 8)은 박테리아벡터와 포유동물발현벡터로 서브클론된다. 마우스PSM AutoVac 구조물은 또한 P30을 마우스PSM cDNA 내부로 주입함으로써 만들어진다.

E.coli 에서 야생형 hPSM의 발현

항poly-HIS 항체를 가지고 있어 큰규모의 정제와 동정을 손쉽게 해주는 N-말단 폴리히스티딘(poly-HIS)을 가진 산물을 얻기 위해서 hPSM, hPSMII0.0의 C-말단부분 (아미노산 437-750)은 박테리아발현벡터 pET28b로 클론되어진다. poly-HIS가 꼬리에 붙여진 hPSMII0.0 (HIS-PROSII0.0을 제시하는 단백질산물)의 단백질생산은E.coli에서 발현되어졌다.

절단된 야생형 인간의 PSM hPSM÷cyt0.0을 코딩하는 DNA는 그 발현산물이 인클루젼바디에 위치하는E.coli균주 BL21(DE3)에서 pET28b로부터 또한 발현되어진다. 박테리아여액의 SDS-PAGE분석은 기대하던 이동을 보였고 래빗의 항HIS-PROSII0.0을 가지고 행한 웨스턴블럿은 또한 기대하던 띠를 주었다. 게다가 SDS-PAGE겔로부터 용출된 이 산물의 5개아미노산의 N-말단서열은 기대하는 아미노산서열을 주었다.

야생형 hPSM 구조물인 hPSM0.0, hPSM0.0(2개의 hPSM 돌연변이체인 hPSM1.1과 hPSM6.1뿐만 아니라)은E.coli에서 재조합단백질의 보다 효율적인 발현과 어느정도의 접힘이 가능하도록 하기 위해서 다른E.coli발현벡터로 클론되어졌다.그 선택된 발현체계는 아래와 같다.:

발현된 재조합단백질의 N-말단에 His꼬리를 형성하는 pMCT6,

E.coli박테리아의 주변세포질공간 단백질을 가리키는 22개의 아미노산 pelB 리더와 관련된 재조합단백질을 발현하는 pGH433,

그리고 자연적인 MBP 주변세포질의 리더서열을 포함하는 말토오스가 결합된 단백질 (MBP)에 대한 C-말단 융합체로서 재조합단백질이 발현되어지는 pMal-p2.MBP에 대항하는 항체가 융합단백질의 검출에 사용될수 있고 당질이 커플링된 칼럼이 산물의 흡착정제에 사용될 수 있다.

그러나 이들 벡터로부터 얻어진 야생형 hPSM 단백질에 대한E.coli발현실험은 단지 pMCT6로부터만 상당한 발현레벨을 보여준다. 야생형 hPSM 단백질의 주변세포질발현을 생기게 하는 문제는 지금까지도 여전히 풀리지 않고 남아있다.

Pichia pastoris 에서 야생형 hPSM의 발현

PSM단백질의 상대적으로 큰 분자량과 상대적으로 높게 일어나는 글리코실화(겉보기분자량의16%) 때문에, 그리고 되접히는단계를 없애서 정제를 손쉽게 하기위하여, 재조합단백질을 진핵발현시키기 위한 대안적인 기술을 도구로서 결정하였다. 몇몇의 잘 특징지워진 진핵발현시스템의 가치를 검토하였고, 그리고 hPSM돌연변이체의 초기 스크리닝을 위해 효모Pichia pastoris는E.coli발현에 대한 대안으로 선택되었다.

효모Pichia pastoris에 기초한 발현시스템은 PSM구성에 적용되었다. 이 상물체에서 발현되는 재조합 단백질의 글리코실화패턴은 재조합단백질에서 분기된 만노실화가 적게 생기기 때문에Saccharomyces cerevisiae보다는 포유동물의 글리코실화에 유사할것으로 예상된다. 수상세포에 의해 만노스수용체를 매개로 항원을 흡수한 결과 유체상의 엔도사이토즈드 흡수와 비교하여 T세포로 대략 100배 이상의 보다 효율적인 전달을 얻음을 보여준다. 따라서, 만노실화는 hPSM돌연변이체와 다른 항원의 항원성(그리고 특별히 CTL반응을 유도하는 능력)을 위한 역할을 수행할지도 모르는데, 여기서는 hPSM돌연변이체와 다른 항원에 대항하는 CTL반응이 바람직하다.

두개의 다른 발현벡터 뿐만 아니라Pichia pastoris균주도 인비트로겐으로부터 얻었다. 벡터pPICZαA는 폴리클로닝사이트의 윗쪽에서 메탄올을 유도하는 프로모터를 운반하는 반면, pGAPZαA벡터는 구성단백질을 발현한다. 배지로 재조합단백질을 내보내기 위해 두 벡터 모두 α- 인자의 분비신호를 인코딩한다.이들 벡터의 선택체계는 제오신내성이다. hPSM0.0과 hPSM ÷0.0(한개의 hPSM돌연변이체인 hPSM1.1뿐만 아니라, cf. 아래)을 인코딩하는 서열은 이들 벡터로 서브클론되었다 (C-말단의 c-myc동정 에피토프를 가진 틀내에서, SEQ ID NO:27).

그 성장요구조건을 각각 다르게 한 4종류의Pichia pastoris균주 (X-33, SMD1168, GS115,KM71)를 전기영동을 이용하여 이들 (직선인) 플라스미드를 가지고 형질전환시켰다. 형질전환과정은 많은 제오신내성클론을 얻기 위해서 사소한 변화를 동반하여 수회 반복되어졌다. 야생형 hPSM ÷0.0 (hPSM1.1뿐 아니라, 아래를 보라)의 발현은Pichia pastoris시스템에서 얻어졌다. 기본적으로 발현산물은 항-hPSM 모노클로날항체와 항-c-myc모노클로날항체를 이용하여Pichia pastoris형질전환체의 여액을 웨스턴블럿방법으로 검출할 수 있다. 그러나 재조합산물은 세포내적으로 검출된다.

포유동물세포에서 야생형 hPSM의 발현

CHO(차이니즈 햄스터의 난소)세포를 이용하는 발현시스템은 또한 선택된 분자의 최종 검정과 생산을 위한 도구로서 주어질 것이다.

지금까지, CHO세포는 포유동물발현벡터인 pcDNA3.1에서 프레임리더서열을 가지거나 또는 가지지 않은 야생형hPSM와 hPSM1으로 감염되었다. 같은 구조물을 가지고 일시적으로 감염된 COS세포에서는 hPSM0.0과 hPSM1.1 모두 항hPSM 모노클로날항체를 사용하여 세포펠렛을 웨스턴블럿방식으로 검출하였다.

hPSM의 조직분배

상업적인 키트를 hPSM발현이 전립선, 혈액, 뇌등을 포함하여 다양한 인간조직에서 검출가능한지를 결정하기 위해서 구입하였다. 이 방법은 50개의 다른 인간의 조직으로부터 추출된 mRNA를 가지는 polyA의 도트블럿검출에 기초한 방법이다. 예비결과는 혈액이나 뇌와 같은 조직에서는 hPSM의 과다발현을 암시하지는 않는다. 그러나, 현출원의 우선일 이후에 다른이들은 다른 조직들에서 PSM의 존재를 증명하고 있다, cf. 위

hPSM 돌연변이체의 디자인

PSM에서의 돌연변이작업을 디자인할 때에는, 몇개의 단백질 구역은 잠재적이고 일치성이 있는 T세포에피토프, B세포에피토프와 이중황결합을 가진 시스테인잔기와 같은, 변형된 구조물을 보존하는 데 있어서 매우 중요하다. 따라서, 그런 "금지"구역은 20개의 아미노산을 가진 한정된 양의 "오픈"구역을 남기거나 또는 외부T helper 에피토프인 P2 및/또는 P30와의 교환에 보다 쓸모가 있는 PSM서열 내에서 동정되어져 왔다. 정의에 의하면, 막횡단구역은 이 구역에 대항하는 자가항체가 부적절하고 이 서열의 제거가 돌연변이된 PSM단백질의 용해성을 향상시킨다고 믿은이래로 또한 "오픈"구역으로 고려되어진다. 그러나 이구역이 중요한 CTL 에피토프를 포함한다는 것을 배제할 수는 없고, 그러므로 hPSM10.3 상의 막횡단구역은 보존된다.

자가백신이 CTL반응을 유도하리라는 기대에 따라, 구조물에서 버금가는 CTL 에피토프를 잠정적으로 동정하고 보존하는 것이 중요하다. 그러한 두개의 에피토프는 문헌을 통해 이미 알려져 있다 : 1) PSM 아미노산 4-12로 이루어진 펩타이드 (LLHETDSAV)는 인간의 MHC I군 분자 HLA-A2.1상에 나타난다 (Tjoa, 1996), 그리고 2) PSM (711-719) (ALFDIESKV)가 또한 HLA-A2.1에 결합한다 (ref 25). 본 발명자들은 인간 개체의 HLA-A형의 80%를 구성할 정도로 아주 풍부한 HLA군 I형 (HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A23, HLA-A24, HLA-A28)을 대해 Rammensee et al.에 의해 설명된 바 있는 모티프가 결합된 HLA I군의 1차 앵커잔기를 동정하기 위해서 PSM아미노산서열을 검색한다 (Rammensee, 1995). 마찬가지로 잠재적인 HLA-B와 HLA-C 에피토프는 "금지"지역으로서 동정되고 지정되어진다.

초기의도는 PSM자가백신 구조물을 검정하기 위해 유전전환된 마우스를 사용하기로 결정된 경우에 C57/black x SJL F1 혼성마우스를 사용하는 것이었기 때문에, 어떤 잠재성 마우스H-2^b와 H-2^ST helper 에피토프는 "금지"구역에서 동정되고 고려되어졌다 (Rammensee, 1995).

PSM분자에서 항체가 결합된 것으로 알려진 구역을 보존하는 것 또한 중요한데, 그 이유는 특이 항-PSM 자가항체의 유도에 있어서 그 구역이 중요하기 때문이다. 5개의 그러한 구역이 이미 설명된 바 있다: PSM(63-68), PSM(132-137), PSM(482-487) (WO 94/09820), PSM(716-723), PSM(1-7) (Murphy, 1996). 항원 결정군을 예정하기 위해 Hopp와 Woods의 방법에 기초하여 컴퓨터를 이용하면, 5개의 구역이 예정되어진다: PSM(63-69), PSM(183-191), PSM(404-414), PSM(479-486), PSM(716-723) (Hopp, 1983), 이 때 이들 PSM의 몇몇은 실험적으로 발견된 B세포에피토프와 부분적으로 겹쳐진다. 이들 구역은 또한 PSM백신 표본분자에서 보존되어진다.

PSM 단백질은 4개의 시스테인잔기(아미노산 위치는 22, 196, 466, 597)를 가지는데, 이들 잔기는 이중황결합의 생성에 있어 잠재적으로 중요하기 때문에 면역유전적 구조물로 보존되어진다.

위에서 언급되어진 hPSM 단백질상에서의 "금지"구역과 주입구역을 바탕으로 하면, 외부 T helper 에피토프를 주입하는데 적합한 10개의 구역이 아래와 같이 정해진다.

hPSMI상에서의 주입구역 (초기사이트로부터 EcoRI사이트까지, aa 1-437):

구역 1 : PSM상 aa 16-52 (TM 이전에 4 aa, TM (24 aa), TM 이후에 9 aa = 37 aa)

구역 2 : PSM상 aa 87-108, PSM'상 aa 30-51 (22 aa)

구역 3 : PSM상 aa 210-230, PSM'상 aa 153-173 (21 aa)

구역 4 : PSM상 aa 269-289, PSM'상 aa 212-232 (21 aa)

구역 5 : PSM상 aa 298-324, PSM'상 aa 241-267 (27 aa)

hPSMII상에서의 주입구역 (EcoRI사이트로부터 종결사이트까지, aa 437-750):

구역 6 : PSM상 aa 442-465, PSM'상 aa 385-408 (24 aa)

구역 7 : PSM상 aa 488-514, PSM'상 aa 431-457 (27 aa)

구역 8 : PSM상 aa 598-630, PSM'상 aa 541-573 (33 aa)

구역 9 : PSM상 aa 643-662, PSM'상 aa 586-605 (20 aa)

구역 10 : PSM상 aa 672-699, PSM'상 aa 615-642 (28 aa)

그림 4는 "금지"구역과 주입구역을 도표화하여 나타내고 있다.

많은 다른 면역유전된 PSM구조물은 P2와 P30을 가지고 있는 위 리스트의 주입구역 중 두 곳에서 아미노산단편을 치환하여 만들어진다. 각 돌연변이된 단백질은 따라서 P2와 P30을 둘다 가질 것이다. 비록 그러한 구조물이 싱글돌연변이체가 그러하듯이 현발명의 영역 내에서 단지 본보기에 불과하더라도 말이다. 실험적으로 , 돌연변이체는 각각 hPSMI와 hPSMII cDNA의 클론상에 만들어지고 두 돌연변이된 부분은 부수적으로 라이게이션(EcoRI 사이트에서)에 의해 혼합되어진다. P2와 P30 에피토프는 돌연변이체를 만들기 위해 초기에 주입구역 1, 2, 3, 5, 6, 8 그리고 10에 주입되어진다.

P2와 P30의 서열은 아래와 같다:

P2: 뉴클레오타이드 서열 cag tac atc aaa gct aac tcc aaa ttc atc ggt atc accgag ctg (SEQ ID NO: 11,45 뉴클레오타이드)에 의해서 코딩되는 경우에 QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 12, 15 aa)이며, 여기서 굵은글씨체로 표시된 서열은 SacI사이트이다. 어떠한 클로닝벡터와 발현시스템을 선택하느냐에 따라 다른 코돈형태로도 나타날 수 있다.

P30: 뉴클레오타이드 서열(SEQ ID NO: 13, 63 뉴클레오타이드)에 의해 코딩되는 경우, FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 14, 21 aa)이며, 굵은글씨체는 HindIII사이트를 나타내고, 한줄 밑줄친 서열은 Eco47III사이트를, 대문자로 표시된 서열은 BstNI사이트를 나타낸다. 그리고 두줄로 밑줄쳐진 서열은 NheI사이트를 나타낸다.

아래의 표는 여기서 이용되어지는 인간의 PSM구조물을 요약한 것이다.:

hPSM 돌연 변이체의 분자적 구조

P2와 P30 암호화 서열을 삽입하는 돌연변이는 시작 물질로서 hPSMI0.0과 hPSMII0.0 모두를 사용하여 수행된다.

다량의 hPSM 돌연 변이체의 발생을 위해 P2와 P30은 hPSMI0.0의 삽입 자리1에 처음부터 삽입되어 있었다. 결과 물질 (hPSMI0.0과 hPSMII0.0 각각)은 자리 2,3과 5에 P2와 P30을 삽입하는 돌연 변이 유발과 에피토프변이된 hPSMII를 이용한 연결(ligation)을 위한 시작 물질로 연속적으로 이용된다. hPSMI1.0은 SOE(single overlap extention) PCR을 사용하여 만들어졌고 연속해서 서열이 검증되었다. hPSMI0.1은 "Quick change"기술을 사용하여 만들어졌고 연속해서 서열이 검증되었다.

hPSMI1.2, hPSMI1.3, hPSMI1.5를 만들기 위하여 P2 에피토프가 hPSMI1.0의 자리 2,3과 5에 SOE-PCR을 사용하여 삽입되었다. 이러한 구조들은 hPSMI1.2, hPSMI1.3,그리고 hPSMI1.5를 만들기 위하여 hPSMI0.0과 조합되었다.

hPSMI2.1, hPSMI3.1, hPSMI5.1은 시작 물질로 hPSMI0.1을 사용하는 SOE-PCR에 의해 제작되었다. 이 물질은 전길이의 돌연 변이체 hPSM2 .1, hPSM3.1,그리고 hPSM5.1을 만들기 위해 EcoRI 자리에서 연결된 hPSMII0.0로 조립되었다.

P2 에피토프는 hPSMII6.0, hPSMII8.0, 그리고 hPSMII10.0을 만들기 위해 "Quick change"기술을 이용하여hPSMII0.0의 세 개의 다른 자리에 삽입되었고, 이러한 클론들은 뒤이어 서열 검증되었다.

연속해서, hPSM6.1, hPSM8.1, hPSM10.1을 얻기 위해 hPSMI0.1을 hPSMII6.0, hPSMII8.0, hPSMII10.0으로 연결시키고 이 클론을 서열 검증하였다.

hPSMII0.6, hPSMII0.8, hPSMII0.10을 만들기 위하여 SOE PCR을 사용하여 P30 에피토프를 hPSMII로 삽입하는 일이 곧바로 행해진다.

hPSM1.1은 두 개의 두단계 PCR 돌연변이를 이용하여 제작되고 에피토프 서열 내의HindIII 자리에서의 연결이 뒤따른다. 전 길이의 구조물이 서열 검증된다.

hPSM10.3, hPSM′10.3과 hPSM6.3은 SOE-PCR을 사용하여 제작되었다. hPSM의 세포외 부분에 삽입된 P2와 P30를 모두 가진 몇 몇 다른 hPSM 변형체들은 일반적으로 널리 제작된다 (hPSM′6.3, hPSM8.3, hPSM′8.3) .

각각 P2와 P30을 모두 포함하는 처음 계획된 돌연 변이체에 추가하여, 오직 하나의 외래 에피토프만 포함하는 네 개의 돌연 변이체가 제작되었고 서열이 검증되었다 : hPSM1.0, hPSM8.0, hPSM10.0, hPSM0.1

E. coli 에서의 hPSM 돌연면이체의 발현

소규모의 실험에 있어서, 7개의 hPSM 돌연 변이체 , hPSM1.1, hPSM6.1,hPSM8.1, hPSM10.1, hPSM2.1, hPSM3.1 그리고 hPSM5.1 들이E. coli균주 BL21(DE3)의 pET28b로부터 발현되었고, 기대되는 크기의 IPTG 유도 산물이 쿠마지 블루 (Coomassie Blue)로 염색된 SDS-PAGE gels 상에서 확인되었다. 그러나, hPSM1.1의 산물은 탐지되지 않았다. 이들 hPSM 돌연 변이체의 발현 수준은 야생형 구조물 hPSM÷0.0의 산물과 비교하여 매우 낮았다. 이때,E. coli의 pET 시스템을 사용한 hPSM 돌연 변이체의 만족할만한 발현 수준은 불가능해 보이며, 그러므로 다른E. coli발현 시스템 및/또는 다른 숙주 생물의 사용이 필요하다.

상기한 바와 같이, 벡터 pMCT6 을 사용하는 발현된 재조합 단백질의 N-말단이 His-표지된 버전(versions), 벡터 pGH433을 사용하여 단백질을E. coli박테리아의 주변 세포질(periplasmic space) 공간으로 지시하는 리더 서열 pelB를 가지고 발현하는 단백질 버전 그리고 벡터 pMal-p2를 사용하여 C-말단 융합 단백질로써 말토오즈(maltose) 결합 단백질로 발현되는 재조합 단백질 버전을 생성하기 위해, hPSM6.1과 hPSM1.1이 다른E. coli벡터로 서브클론 된다.

지금까지는 어떠한 이러한 구조들로부터도 충분한 발현 수준이 얻어지지 않았다.

전길이(full length)의 hPSM0.0 또는 hPSM 돌연 변이체의 비슷한 발현 수준은 관찰되지 않는 것에 반하여 hPSM0.0 은 완전히 발현하기 때문에, hPSM 분자의 세포질 부분의 존재가 어떻게 해서든지E. coli의 전길이 hPSM 구조의 발현을 "억제"할 가능성이 있다. 이 가설을 검증하기 위해 본 발명자들은 우선 세포질 영역을 갖지 않는 두 개의 hPSM1.1과 hPSM6.1의 유전적 구조를 만들었다. 그러나,E.coli발현 실험에있어서 이들 ÷cyt 유전자 산물의 발현은 미약했다.

Pichia pastoris 에서의 hPSM 돌연 변이체의 발현

효모Pichia pastoris로부터 hPSM1.1 돌연 변이체 단백질을 발현시키기 위해 hPSM1.1 서열을 두 개의 다른 발현 벡터 pPICZαA와 pGAPZαA로 서브클론 시키고 (C-말단 c-myc 동일 에피토프, SEQ ID NO : 27 을 가지고 프레임 내로), 서열을 검증한다. hPSM1.1의 발현 (또한 hPSM0.0, 위에서 본 바와 같이) 이Pichia pastoris형질 전환체에서 세포내적으로 탐지되었다.

포유류 세포에서의 hPSM 돌연 변이체의 발현

상기한 바와 같이, hPSM1.1을 포유류의 발현 벡터 pcDNA3.1(+)와 pZeoSV2 내로 서브클론 시키고 이 구조물들(그리고 다른 것들) 은 예를 들어 CHO 세포에서 발현하기 위해 사용될 수 있다. hPSM0.0 뿐아니라 hPSM1.1의 일시적인 발현은 웨스턴 블라팅에 의해 검증된 COS 세포에서 얻어 진다.

DNA 백신화

실제로, 특히 이러한 처리 형태는 CTL 매개 면역 반응과 항체 산물 모두를 증진시키는 것으로 보이기 때문에, DNA 백신화는 PSM 자가백신 (autovaccine)에 매우 적합하다. 그러므로, 면역원화 된 마우스의 유비퀴틴(ubiquitin)과/또는 마우스의 TNFα를 암호화 하는 적절한 벡터를 가지고 쥐들의 DNA 백신화의 효과를 조사하는 것을 목적을 가진 유사한 연구의 수행이 의도한 바였다. 네이키드(naked) DNA를 암호화 하는 hPSM(그리고/또한 돌연변이체)을 이용한 DNA 백신화 또한 수행될 것이다.

DNA 백신화를 위해 면역원화 된 유비퀴틴(ubiquitin)을 사용하는

가능성(feasibility) 연구　

면역원화 된 자기의 단백질을 사용하는 DNA 백신화의 효과를 말해주는 편리성 연구는 모델 단백질로써 오브알부민으로부터 십입된 T 헬퍼 에피토프를 가진 유비퀴논(UbiOVA)을 사용하여 수행되었다. 야생형의 유비퀴논 뿐아니라 UbiOVA를 암호화하는 서열도 포유류 발현 벡터 pcDNA3.1(-)로 서브클론 되었다.

5 BALB 쥐들 그룹이 사두근(quadriceps)에서 40 ㎍ pcDNA-UbiOVA 또는 pcDNA-유비퀴틴 구조로 근육내적으로 또는 피부내적으로 면역화 되었다. 대조군은 완전 Freund' 어쥬번트 중의 UbiOVA 단백질을 투여하였다.

3~6주 후, UbiOVA 단백질이 불완전 Freunds 어쥬번트에서 유화된 것만 다르게 하여 면역화를 반복하였다.

그 쥐들은 규칙적으로 출혈이 있었고 항 유비퀴틴 항체 역가가 결정되었다. DNA 백신화된 UbiOVA 그룹에서는 매우 약한 항 유비퀴틴 항체 역가가 얻어 졌다. 연속적으로, UbiOVA (유비퀴틴이 아님)을 가진 DNA 백신화가 항체가 UbiOVA 단백질에 대해 반응할 잠재성을 가지는지를 결정하기 위해 모든 그룹이 불완전 Freunds 어쥬번트 중의 UbiOVA 단백질로 촉진되었고 출혈되어졌다. 이 실험의 결과는 UbiOVA 그룹과 대조군과 중대한 차이가 없음을 보여주며, 모든 쥐들은 단일 UbiOVA/FIA 촉진제에 대한 강력한 항 유비퀴틴 항체를 발달시킴을 보여준다.

hPSM 구조를 사용하는 DNA 백신화

일반적으로, 다양한 DNA 백신화 실험은 hPSM 구조를 사용하여 진척중이다.다양한 인간 PSM 야생형과 AutoVac 구조 (예를 들어, hPSM0.0, hPSM÷0.0, hPSM′0.0, hPSM1.1, hPSM10.3 )를 DNA 백신화 벡터(예를 들어, pcDNA3.1(+), pcDNA3.1(-), pVAX 그리고 pZeoSV2)로 서브클론시켰다. 구조들 중 몇몇에 있어서 다른 리더 서열(예를 들어, CD11a, tPA, 그리고 IL-5 리더 서열; SEQ ID NOs:29,25,그리고 31, 각각)이 생체내에서 발현된 hPSM 단백질의 분비를 허용하기 위해N-말단적으로 그리고 프레임 내에 직접적으로 포함되었다. DNA 백신화 벡터안의 모든 구조들은 DNA 서열화과 생체외의 번역(translation)에 의해 검증되었다.

다른 계통(예컨데, Balb/cA, Balb/cJ, DBA/2 그리고 A/J)의 쥐들에게 상기한 hPSM DNA 백신화가 피부내적으로 또는 근육내적으로 주사하였고 같은 구조물을 사용하여 몇 배 부스트하였다.

면역화 기간동안 혈청 샘플을 얻고 -20℃에 저장하였다. 이들 샘플은 야생형의 hPSM과 반응할 항체의 존재를 위해 분석될 것이다.

또한, 이 쥐들에 있어 CTL과 T 헬퍼의 증식 반응을 탐지하는 시험이 확립된다.

예비적인 결과가 항체 뿐 아니라 CTL의 PSM에 대한 반응 모두의 유도가 달성될 수 있다는 것을 주장한다.

His-표지된 hPSM(437-750)의 정제/특정화 (HIS-PROSII0.0)

His-표지된 야생형의 hPSMII (HIS-PROSII0.0)이 pET28b로부터 발현되었고, 용해된 포함체는 젤 여과 FPLC 컬럼에 적용되고 8 M 요소를 포함하는 완충제 안에서 회피되었다. 지배적으로 hPSMII를 포함하는 단편들은 절차를 효과적으로 활용하기 위해 다양한 리폴딩 조건들이 되었다.

트리스 완충제 (Tris buffer)에서 투석된 용해된 산물은 은-스트레인드 SDS-PAGE를 사용하여 평가한 결과 90%이상의 순도를 보였다.

토끼가 나중의 탐지를 위한 결과적인 항혈청과 hPSM 돌연 변이체의 정제의 친화성을 사용하기 위해 정제된 HIS-PROSII0.0을 가지고 면역화 하였다.

가용성의 hPSM (PROS÷0.0)의 정제/특정화

세포질과 트랜스멤브레인 부분이 결여된 야생형의 hPSM (PROS÷0.0)이E.coli계통 BL21(DE3)에서 IPTG를 사용한 유도에 발현되었고 포함체에서 발견될 수 있었다. 이 박테리아 용해 산물(lysate)의 SDS-PAGE에 뒤따른 토끼의 항-HIS-PROSII0.0을 이용한 웨스턴 블라팅은 기대되는 이동(migration)에 의한 산물을 보여준다. SDS-PAGE 젤로부터 용출된(eluted)된 산물의 처음 다섯 개의 아미노산의 N-말단 서열은 인간 PSM에 대응하는 기대되는 서열을 보여준다. 이 산물은 다수의 일련의 용해성과 리폴딩 실험들을 받게 된다. 용액에 남아 있는 산물은 변성이나 환원 없이 트리스 완충제 안에서 얻을 수 있다. 그러나 SDS-PAGE 분석은 아마도 물질이 거대한 집합체를 형성한다는 것을 드러낸다. 쥐들과 토끼는 항혈청이 LNCap hPSM 과 반응하지 않았다는 분석적인 목적을 위해, hPSM 등에 대항하는 항체를 얻기 위해 이 물질들로 면역화 되었다.

PROS÷0.0의 포함체인 일군의 세척된 E.coli이 PSM에 대항하는 폴리클로날 항혈청을 생성하기 위해 토끼의 면역화를 위해 준비되었다. 포함된 젖은 알약화 된 물질에 있어 단백질 함유량의 약 50% 가 PROS÷0.0 였다. 이 항혈청은 웨스턴 블라팅에서 LNCap hPSM와 반응하지 않았다.

면역화를 위해 KLH-접합된 hPSM의 표본(preparation)

3개의 15-mer 펩타이드가 hPSM을 인지할 수 있는 항혈청을 얻기 위해 면역학적 운반 분자를 가지고 알려진 hPSM B 세포 에피토프의 면역원 접합체를 만들기 위해 합성되었다. 이 펩타이드는 5∼6 개의 측면에 접하는 PSM 아미노산이 양 말단에 더해진 hPSM B 세포 에피토프를 포함하고 있다.

이 펩타이드는 자동적인 합성에 의해 만들어지고, HPLC 정제되고, 에드만(Edman) 분해(degradation)을 이용하여 콘트롤-서열결정 되었다.

화학적으로 연결된 접합체를 가교 시약으로써 글루타르알데하이드를 갖는 표준 1-단계 과정을 사용하여 hPSM 펩타이드 KLH를 포함하는 B 세포의 클로스 링킹에 의해 준비한다.

측면에 접하는 hPSM 서열을 사용하는 P2 와 P30 펩타이드의 합성

양 말단에 5개의 측면에 접하는 hPSM 아미노산을 갖는 P2 와 P30 에피토프와 대응하는 6개의 펩타이드가 디자인 되었다. 측면에 접하는 아미노산은 에피토프 삽입 자리 6, 8 그리고 10에 대응된다. 이 펩타이드는 예컨데 T 세포의 증식 검사에 사용될 수 있으나, ELISA나 다른 생체외의 검사 같은 다른 목적을 위해서도 사용된다.

펩타이드의 서열은 다음과 같다.

PSMpep007 hPSM 삽입 자리 6에 삽입된 P2

QERGVOYIKANSKFIGITELRVDCT (SEQ ID NO : 15 )

PSMpep008 hPSM 삽입 자리 8에 삽입된 P2

AVVLROYIKANSKFIGITELEMKTY (SEQ ID NO : 16 )

PSMpep009 hPSM 삽입 자리 10에 삽입된 P2

MFLEROYIKANSKFIGITELHVIYA (SEQ ID NO : 17 )

PSMpep010 hPSM 삽입 자리 6에 삽입된 P30

NSRLLFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEVDCTP (SEQ ID NO : 18 )

PSMpep011 hPSM 삽입 자리 8에 삽입된 P30

VVLRKFNNFTVSFWLRVPKVSASHLESFDSL (SEQ ID NO : 19 )

PSMpep012 hPSM 삽입 자리 10에 삽입된 P30

LMFLEFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEPSSHN (SEQ ID NO : 20 )

P2 와 P30 에피토프는 밑줄이 그어져 있다. 펩타이드는 자동적 합성에 의해 만들어지고 HPLC 정제 과정에 뒤이어 에드만 분해을 사용하는 콘트롤-서열결정이 수행된다.

면역 유전성 검사

다른 실험의 장치들이 물질을 생산하고 미래의 테스트와 돌여변이 된 PSM 구조물간의 선택을 위한 면역 유전성 검사를 수행하기 위해 개시되었다.

폴리클로날 토끼 항-HIS-PROSII0.0과 항-KLH-펩타이드 접합체 항혈청의 생

성

두 마리 토끼가 정제된 HIS-PROSII0.0, 완전 Fruends' 어쥬번트와 1:1로 유화 되고 불완전 Freund' 어쥬번트에서 유화 된 같은 시약으로 두배 (28-55일에) 부스티드된 hPSM 단백질(아미노산 437-750)의 HIS-표지된 C-말단 부분에 의해 면역화되었다.

두 마리 토끼는 각각의 3개의 프리 펩타이드가 더해진 KLH-PSM 펩타이드 접합체를 구성하는 칵테일로 면역화되었다. 이들 3개의 펩타이드는 각각 미리 한정된 hPSM의 B 세포 에피토프를 포함한다. 이 칵테일은 완전 Freund' 어쥬번트와 1:1로 유제화 되어 있다. 토끼들은 불완전 Freund' 어쥬번트에서 유제화 된 같은 시약으로 두배 (28-55일) 부스트 시켰다.

항-HIS-PROSII0.0과 PSMpep005간의 교차 반작용과 펩타이드가 더해진 항-KLH-PSM 펩타이드 접합체와 HIS-PROSII0.0 간의 교차 반작용은 ELISA 검사에서 보여진다. 항-HIS-PROSII0.0 항체는 웨스턴 블라팅에 있어 LNCaP 세포의 용해 산물의 네이티브 hPSM을 인지하는 능력을 가지고 있다.

리트로바이럴하게 발현된 hPSM0.0을 이용한 쥐들의 면역화

PSM 프로젝트의 이 단계에 있어서, 정확하게 접혀진 네이티브 hPSM을 인지할 수 있는 항체가 여전히 결여되어 있다는 심각한 장애가 있다. 그러므로, 리트로바이럴하게 발현된 hPSM0.0을 사용하는 면역화 실험이 수행되었다.

Balb/c 쥐들의 6개 그룹이 다음 중의 하나로 면역화 되었다. : 1) hPSM0.0 cDNA (CMV-Koz-hPSM)을 가지고 형질 도입된 BALB/c 섬유 육종 세포로(79.24.H8) 처리된 마이토마이신 C (mitomycin C), 2) 엠티(empty) 벡터 (CMVBipep)를 가지고 형질 도입된 BALB/c 섬유 육종 세포로(79.24.H8) 처리된 마이토마이신 C (mitomycin C), 3) hPSM0.0 cDNA (CMV-Koz-hPSM)을 가지고트래스펙트된(transfected) 패키징(packaging) 세포 (BOSC), 4) 엠티(empty) 벡터(CMVBipep)를 가지고 트래스펙트된(transfected) 패키징(packaging) 세포 (BOSC), 5) hPSM0.0 cDNA (CMV-Koz-hPSM)를 발현하는 리트로바이러스 군체(stock) 또는 6) 엠티 벡터(CMVBipep)를 발현하는 리트로바이러스 군체

몇몇 시점에서, 쥐들은 출혈이 있었고, 얻어진 혈청은 HIS-PROSII0.0 에 대한 반응성을 위한 ELISA에서의 반응성 검사를 하였다. 불행하게도, 쥐들 중 어느것도 HIS-PROSII0.0 표본(preparation)을 특정적으로 인지할 수 있는 항체를 만들지 못했다.

항-hPSM ELISA의 확립 (establishment)

정제된 HIS-PROSII0.0 는 상청액(supernatant) 하이브리도마(hybridoma)나 마우스와 토끼의 항혈청 같은 것을 검사하기 위한 ELISA 에세이의 확립을 목적으로 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트 (Maxisorp)를 코팅하는데 사용된다. 같은 HIS-PROSII0.0 표본으로 면역화된 BALB/c 쥐들로부터 얻은 혈청은 이차 항체로서 토끼의 항-마우스 Ig로 표지된 홀스 라디쉬(horse radish) 과산화 효소를 사용하여 구멍(well) 당 0.5㎍ 들어있는 고정된 HIS-PROSII0.0과 반응을 나타낸다.

상기한 바와 같이, 고정된 HIS-PROSII0.0와 반응하기 위한 3 개의 프리 펩타이드와 혼합된 토끼에 있는 KLH-PSMpep004-PSMpep005-PSMpep006 접합체에 대한 항혈청의 능력은 이 ELISA 검사를 사용하여 보여진다.

AquaBind마이크로타이터 플레이트 (등록상표 AquaBind로 현제 시판되고 있는 트레실(tresyl)-활성화된 덱스트란(dextran)으로 코팅된 i.a. 마이크로타이터표면을 설명하는 WO94/03530의 출원 명세서를 참고할 것)를 사용하여, 고정된 PSM 펩타이드 (PSMpep004, PSMpep005와 PSMpep006 )를 사용한 ELISA가 확립되었다. 3개의 펩타이드로 코팅된 AquaBind플레이트는 같은 항원 표본에 대항하여 발생하는 토끼의 항혈청을 감지할 수 있다. 상기한 바와 같이, 토끼의 항-HIS-PROSII0.0 은 PSMpep005로 코팅된 AquaBind플레이트 상에서 감지될 수 있다.

LNCaP 세포와 모노클로날 항체 7E11C5를 사용하는 항 hPSM 웨스턴 블라팅의 확립

인간 PSM의 세포내 에피토프에 대항하는 쥐의 IgG2a 모노클로날 항체를 분비하는 7E11C5 B 세포 하이브리도마는 ATCC로부터 얻었다. 약 90%의 사멸 세포로부터 얻은 상청액 배양은 LNCap 세포 용해 산물 뿐아니라 LNCap 세포의 표본이 풍부한 멤브레인에 모두 있는 인간 PSM의 탐지를 위한 웨스턴 블라팅에서 모아지고 사용된다. 이 항체는 단백질 G 컬럼을 사용하여 정제되었고, 이것의 웨스턴 블라팅에서의 LNCaP와의 반응성이 검증되었다.

LNCaP 세포 상의 hPSM의 탐지를 위한 FACS 방법의 확립

본 발명자들은 LNCaP 세포 상의 hPSM의 탐지를 위한 상호 독립적인 FACS 방법들을 확립해왔다. 다음과 같은 몇가지 문제점들이 건의된다. : LNCaP 세포는 매우 천천히 그리고 불규칙하게 군생을 이루며 자란다. 그러므로 단일 세포 현탁액을 제작하는 방법이 가장 효과적이어야 한다. 둘째로, mAb 7E11C5 에 의해 인지되는 에피토프는 hPSM의 세포질 영역 안에서 존재하는 것으로 문헌상 정의되어 있다. 그러므로 세포를 고정하고 투과하게 하는 방법이 개발되어 왔다. 이것을 위해,7E11C5 항체로 정제된 단백질 G가 FITC 접합되었고, 그러므로 FACS 분석에 있어 이차 항체 없이 사용될 수 있게 되었다

또한, hPSM의 세포외 부분 상의 에피토프를 인지하는 항-hPSM 모노클로날 항체 J591를 사용하는 FACS 방법이 확립되어 왔다. 항체가 BZL 생물학적 제제(biologicals)로부터 얻어졌고 FITC 접합되었고 뒤이어 FACS 분석과 LNCaP 세포와 hPSM 트랜스펙턴트(transfectants) 같은 것의 분류에 사용되었다. (아래 참조)

세포 독성 검사 확립

마우스의 골수로부터 얻은 수지상의 세포를 정제하는 방법이 수행되고 있다. 모델 단백질을 이용하여, 모델 클래스 Ⅰ 펩타이드와 단백질이 가해진 수지상 세포를 이용한 쥐들의 면역화가 효과적으로 활용되고 있다. 또한, 쥐들이 ISCOMS 형태에서 고안된 모델 단백질 (β-갈락토시데이즈)로 면역화 되었다. 면역화된 쥐들로부터 정제된 T-세포가 생체외에서 대응하는 항원의 서로 다른 형태로 레스티뮬레이트(restimulated) 되었다. 이들 레스티뮬레이트된 CTLs의 다른 종류의 목적 세포(리트로바이랄하게 발현된 사이토졸릭 클래스 Ⅰ펩타이드를 발현시키는 형질 전환체 뿐아니라 수지상 세포가 더해진 것 포함)를 분해하는 능력이 뒤이어 측정되었다. CLT의 활성을 측정하는 생체외에서의 두 개의 다른 검사가 세포 독성의 측정으로서의 크롬 방출 또는/그리고 DNA 단편화(JAM 방법)을 이용하여 확립되고 있다. β-갈락토시데이즈 모델 단백질과 MHC 클래스Ⅰ과 클래스Ⅱ 결합 모델 펩타이드의 다양한 조합을 가지고 매우 좋은 결과를 얻었다.

쥐들에 있어 마우스 PSM에 대한 자가관용(autotolerance)의 파괴를 연구하는 수단의 확립

쥐에 있어 마우스 PSM에 대한 자가관용이 쥐(murine) PSM AutoVac 분자를 사용하는 쥐 PSM에 대항하는 면역화 그리고/또는 DNA 백신화에 의해 파괴될 수 있을지를 연구하는 것이 목적이다.

상기한 바와 같이, 쥐 PSM (mPSM)을 암호화하는 cDNA가 얻어지고 DNA 서열화 되고 있다. 4개의 mPSM 변형체 분자가 전길이 mPSM 또는 mPSM′중 하나에 있는 잘 특정된 자리에 P30을 삽입함으로써 만들어지고 있다. 그 구조는 다음과 같다.

최초로, mPSM 야생형과 유사체 분자가 DNA 백신화 벡터로 서브클론 되고, 쥐들의 DNA 백신화에 사용되었다.

쥐들에서의 CTL 반응과 종양 제거 같은 면역 반응의 분석이 목적이다. 이를 위해, 쥐 종양 세포주는 야생형 쥐 mPSM(탐지 목적을 위해 c-myc 에피토프, SEQ ID NO : 27 같은 인식표를 가지고 프레임 내로 융합된)에 의해 트랜스펙트될 것이다.

생체내의 PSM 종양 모델

P2와 P30에 의한 마우스 T 세포 증식 검사

다양한 마우스 계통(BALB/cA (H-2^d), C3H/Hen (H-2^k), DBA/1 (H-2^q) 그리고 C57BL/6 (H-2^b)에 있는 P2와 P30 펩타이드의 T 세포 면역 유전성의 확립을 위해 일련의 T 세포 증식 실험이 수행되고 있다. 이들 에피토프들은 인간에 있어 무작위로 위치해 있지만, T 세포의 무작위성은 M&Es 실험 장치를 이용하여 쥐들에서 강화시키기 위해서 필요하다. 그러므로 P2 이나 P30 중 어느 것도 C3H/Hen 계통에서 T 세포 면역 유전성을 보여주지 않았음에 반해 P30은 BALB/cA와 C57BL/6 계통에서 T 세포 면역 유전성을 보여준다. DBA/1에서 T 세포는 P2에 대항하여 일어날 수 있다.

마우스의 종양 세포를 발현시키는 hPSM의 생성

종양 세포 증식 검사에서의 사용을 위할 뿐 아니라 마우스들에 있어서의 hPSM 특정 종양 모델의 사용을 위해 마우스 종양 세포를 발현시키는 hPSM의 패널이 확립되었다

하나의 접근방식은 전길이 야생형 hPSM0.0 cDNA를 암호화하는 리트로바이랄 벡터를 가지고 마우스 종양 세포주를 형질 도입함에 의해 이들 세포주를 생성하는 것이다.

리트로바이랄 벡터 CMVBipep 의 폴리클로날 자리에 삽입된 인간 PSM을 암호화하는 전길이 야생형 cDNA를 암호화하는 3개의 다른 조성물이 조립되었고, 이들 중 2개는 개시 코돈의 상류의 짧은 Kozak 서열을 포함한다.

이들 조성물은 BOSK 패키징 세포주를 사용하여 3개의 다른 마우스 종양 세포주으로 형질 도입되었다 : P815 (비만 세포(mastocytoma), H-2^d), B16-F10 (색소 침착 세포(melanoma), H-2^b) 그리고 79.24.H8 (섬유 육종(fibrosarcoma), H-2^d). 제네티신(geneticin) 저항 클론이 모든 3개의 세포 유형을 위해 얻어 졌고, 리트로바이랄 구조물이 숙주 세포 안으로 통합된 것이 유전적 DNA 주형 상의 PCR 분석에서 검증되었다. 7E11C5 모노클로날 항체를 사용하는 웨스턴 블라팅이나 FACS 분석에 있어 하나의 발현된 PSM 유전자 산물이 탐지되는 것은 아직 불가능하다.

야생형 인간 PSM이 결합된 멤브레인에 잠복중인 2개의 안정한 마우스 종양 세포주는 트랜스펙션에 의해 확립된다. 이러한 방법은 CMV 프로모터의 통제하에서 포유류의 발현 벡터 pcDNA3.1(÷)안에서 서브클론되고 개시 코돈의 상류에 Kozak 서열을 포함하는 hPSM0.0 cDNA을 사용하여 행해졌다.

결과적인 플라즈미드가 두 개의 다른 마우스 종양 세포주으로 트랜스펙션되었다 : 79.24.H8 (섬유 육종, Balb/c 유래의) 그리고 Sa1N (섬유 육종, A/J 유래의). 제네티신 저항 배양이 얻어졌고, J591과 7E11C5 항-hPSM 모노클로날 항체를 사용하는 웨스턴 블라팅과 FACS 분석법이 수행되었다. J591 항체를 이용하여, 세포들이 hPSM 양성 개체군이 얻어질 때까지 몇 개의 원형의 것들이 FACS 분류되었다. hPSM 발현은 7E11C5 항체를 사용하는 세포내 FACS 염색에 의해 다시 검증되었다. 또한 MHC 클래스Ⅰ 발현 정도가 어버이의 세포주의 수준과 같은 수준이라는 것이 FACS 분석에 의해 확인되었다.

hPSM을 발현하는 79.24.H8과 Sa1N 세포주의 배양이 제한된 희석에 의해 클론되었다. 몇 개의 클론이 얻어졌고 항-hPSM 모노클로날 항체 J591을 사용하는 FACS 분석에 의해 다른 hPSM 발현 수준이 검사되었다.

hPSM을 발현하는 79.24.H8 세포는 예컨데, hPSM 특정 CTL 반응과/또는 인터페론-감마 방출을 감독하는 생체외에서의 검사에 사용하기 위한 B7.1을 암호화하는 유전자를 가지고 트랜스펙션되었다. 이 세포들은 항-B7.1 항혈청을 사용하여 한번 FACS 분류되었다.

마우스에서의 hPSM 특이적 종양 모델의 확립

면역 유전된 hPSM 분자에 대항하여 마우스에서 생기는 항체의 항-종양 효과를 결정하기 위해 적어도 두 개의 생체 내에서의 종양 모델을 면역 적격 미우스에 확립하는 것이 결정되어 왔다. 이것은 표면 멤브레인 상에서 야생형 hPSM의 발현을 위해 변형된 공통 유전형 마우스 종양 세포주를 주사함으로써 희망을 걸고 행해질 것이다. 고형의 종양을 형성하는 세포 그리고/또는 전이한다고 알려진 세포가 사용될 것이다. 외래의 hPSM 분자의 존재 때문에 거부당함 없이 공통 유전형 마우스에 이식될 수 있는 세포주가 그 모델에 사용될 것이다. 이러한 종양 세포를 제거하는 hPSM 백신의 능력은 hPSM 백신 후보의 선택을 위해 사용될 것이다.

전길이 인간 PSM으로 트랜스펙트된 Sa1N 세포의 성장을 평가하기 위하여, hPSM 트랜스펙트된 Sa1N 세포 (S-PSM, 5 times로 분류된) 의 다른 양 (2×10⁶그리고 5×10⁶) 이 A/J 쥐들 그룹의 오른쪽 옆구리 아래쪽의 피하에 주사되었다. 그러나. 고형의 종양은 확립되지 않았다. 뒤이어, hPSM의 다른 발현 수준을 갖는 S-PSM의 3개의 클론이 A/J 마우스의 3개의 그룹에 10⁷cells/mouse의 양으로 피하에 주사되었다. 확립된 종양의 크기는 종양의 크기를 ㎟ 단위로 제시하기 위하여 멀티플된 두 개의 다른 지름을 측정한 직경으로 측정된다. 이들 값은 세 그룹으로 비교된다. 3-6일 이내에, 모든 마우스들은 고형의 종양 유사한 구조를 발생시키고 대략 15일까지는 다시 사라진다. 아직 검증되지 않았음에도, 이것은 종양 세포 표면상의 인간 PSM의 존재 때문인 것과 비슷하다. 단지 pcDNA3.1 벡터만으로 트랜스펙트된 Sa1N 세포가 마우스들에서 고형의 종양으로 자라는 것을 계속하였다.

비슷한 상태가 106, 5×106, 또는 hPSM으로 트랜스펙트되고 hPSM 발현을 위해 몇 개의 라운드로 분류되는 107 79.24.H8 세포가 주사된 마우스들에서 관찰되었다. 이들 세포 (79 PSM로 불리어지는) 또한 Balb/c에서 뿐 아니라 DBA/2 쥐들에서도 종양으로서 확립되지 않았다. 그러나, hPSM 트랜스펙트된 79.24.H8 세포, 79-PSM.3의 클론이 Balb/c 또는 DBA/2 쥐들 안으로 주사되었을 때, 마우스들은 10-20일 될 때까지 다시 사라지는 고형 종양 유사한 구조를 발달시킨다.

이들 "종양"이 치료가능한지, 또는 설명된 S-PSM과 79-PSM 세포주과 클론에 기초한 보다 좋은 종양 모델이 확립될 수 있는지를 평가하는 것이 아직 남아 있다.

결론

분자적 구조 작업에서 본 발명자들은 인간 PSM 유전자의 클로닝과 마우스 PSM cDNA를 얻는 것을 성공하였다. 완전히 서열화 된 면역 유전된 hPSM 자가백신 구조물의 배열이 생산되고 있다. 다른 야생형의 hPSM 분자 뿐 아니라 hPSM 돌연변이체가 E.coli에서 발현되었고, E.coli에서의 발현 수준이 매우 낮다는 것이 발견되고 검증되었다. hPSM의 C-말단 절반에 대항하는 폴리클로날 항체가 토끼에서 유도되었다. E.coli 포함체에 선택적인 발현 시스템 뿐 아니라 다른 발현 표지 (His-tag 와 말토오즈 결합 단백질의 융합)를 수행하기 위한 노력이 있어 왔다. 재조합 야생형 및/또는 자가백신 hPSM이 트랜스펙트된pinchia pastoris와 포유류 세포에서 탐지되어왔다. DNA 백신 기술에 관한 유용한 고려가 행해지고 있으며, 예비적인 가능성 연구가 수행 중이다. hPSM 자가백신 분자를 이용한 DNA 백신화 실험이 진척중이며, 유망한 예비적인 결과를 보여준다. 면역 화학적 검사와 FACS 분석을 포함하여, 돌연 변이된 PSM 구조물들 간의 시험과 선택을 위한 유용한 생체 외에서의 다른 검사들이 확립되고 있다. 마우스 종양 세포가 전길이 야생형 hPSM으로 안정적으로 트랜스펙트되고 hPSM 표면 발현을 위해 FACS 분류되고 있다. 이들 세포주의 클론들이 얻어졌다. 생체 내에서, 쥐들에서의 완전 변이(xenogenic) 종양 모델을 공통 유전형 마우스 종양 세포를 함유한 이들 hPSM를 사용하여 평가할 수 있다. T 세포 배열의 예비적 검사는 종양 모델을 위한 마우스 계통을 선택하기 위해 수행되고 있다. CTL 검사가 효과적으로 활용되고 있으며, 모델 항원에 의한 설득력 있는 결과가 다른 면역화 방법과 검사 조건을 사용하여 얻어지고 있다. 게다가, 마우스 PSM 자가백신에 대항하는 면역화에 의한 마우스 PSM에 대한 관용의 파괴 연구를 위해 필요한 도구들이 확립되었다.

실시예 2

Her2 자가백신의 생산

Her2에 대한 인간 자가백신은 면역 유전된 Her2 분자들의 패널을 드러내는 하나 또는 그 이상의 무작위의 외래 T 세포 에피토프의 삽입에 의한 분자의 변형을 통해 발달될 수 있다. 이들 변형된 단백질은 Her2 분자의 네이티브 부분과 교차 반응하는 항체를 유도하는 능력이 시험될 것이다. 뒤이어, 몇 개의 생체 외의 검사와 동물 모델의 생체 내에서의 검사에 있어 다른 조성물들 (아마도 DNA백신화 경우로서) 과 변형된 단백질의 효능이 평가될 것이다. 종양 세포를 포함하는 Her2에 대항하는 특이적 CTL 반응의 유도가 분석될 것이다. 또한, 유도된 항체는 전형적인 과정을 거친 보충물을 활성화시키고 Fc-수용체를 경유하여 ADCC를 개시하는 능력이 시험될 것이다. 마지막으로, 이 다른 변형된 분자는 종양의 치료에 대한 효과를 시험하기 위해 인간 유방암의 동물적 모델에서 시험될 것이다.

면역원인 랫(rat)와 인간 분자들은 무작위 T 세포 에피토프로 분자의 다른 위치에서 조제될 것이다.

Her2의 전 세포외 영역에 대한 백신화 동안 이들 수용체 중 약간이 세포 외 영역에서 40-46%이상 동일하기 때문에 다른 EGFr 수용체를 가진 항체의 교차 반응이 약간 있을 가능성이 있다. 그러므로 이 Her2의 보존 구역이 외래 T 세포 에피토프를 변형된 단백질 (상세한 것은 아래 참조)들 중 적어도 몇 개에 삽입함으로써 분열될 것이 계획된다.

아마도 잠재적으로는 CTL 또는 B-세포 에피토프인 Her2의 구역은 도 3에서 보여진 구조의 설계에 있어 회피된다. 이들 자리를 사용하는 이론적 근거는 다음에 기술한다 :

인간 Her2 서열은 단백질의 1차 구조에 기초하여 많은 영역으로 분리 가능하다

세포외 (수용체) 부분 :

1-173 : 영역Ⅰ(성숙한 폴리펩타이드의 N-말단 )

174-323 : 영역Ⅱ (시스테인이 풍부한 영역, 24 시스테인 잔기들 )

324-483 : 영역Ⅲ (리간드 결함 영역ⅰ EGF 수용체와 상동 )

484-623 : 영역Ⅳ (시스테인이 풍부한 영역, 20 시스테인 잔기들 )

624-654 : 트랜스멤브레인 영역 (654 - 675 부터 TM 잔기들 )

세포내 (키나제) 부분:

655-1010 : 티로신 키나제 영역 (725 - 992 부터 핵심 TK 영역 )

1011-1235 : C-말단 부분

P2 또는 P30 인간 T 세포 에피토프 증 하나에 의해 대체될 HER2의 아미노산 서열에 있어서의 자리의 선택은 다음의 변수들을 고려하여 행해진다. (대충 순위를 정함) :

1. 알려지고 예측된 CTL 에피토프

2. 관련된 수용체와의 상동성 (특히 EGFR )

3. 시스테인 잔기의 보존

4. 예측된 루프, α-나선과 β-시트 구조

5. 잠재적인 N-글루코실화 자리

6. 노출되고 숨겨진 아미노산 잔기의 예측

7. 조직화 영역

CTL 에피토프는 영역Ⅰ, 영역Ⅲ, TM 영역과 TK 영역의 두 개 또는 세 개의 " hot spot "에서 덩어리지는 것으로 보인다. 본 발명에 따르면 이들은 대체적으로 보존되어있다.

낮은 상동성을 갖는 구역이 단지 국소적인 변경으로 변경될 수 있는 것에 반하여, 다른 수용체와 높은 정도의 상동성을 갖는 구역은 "일반적인" Her2의 3차 구조에 있어 구조적으로 중요하고 따라서 항체 인지에도 중요한 것 같다.

시스테인 잔기들은 종종 분자내 다이설파이드 브릿지 형성에 수반되고 그러므로 3차 구조에 아주 중요하고 잘 변하지 않는다.

α-나선 또는 β-시트 구조를 형성할 것으로 예측되는 구역은 되도록이면 외래 에피토프의 삽입 지점으로 되길 피하고, 이들 구역은 아마도 단백질의 폴딩에 중요하다.

단백질의 만노실화(mannosylation) (예컨데 효모에서의 발현에 의한) 요구되기 때문에 (cf. APCs 상의 만노스 수용체의 존재 ) 잠재적인 N-글루코실화 자리가 또한 바람직하게 보존되어야 한다.

분자에서 즐겨 내부에 있을것으로 예측되는 (이들의 소수성에 의해 ) 구역은 이들이 폴딩에 수반될 수 있었던 것 처럼 보존적일 것이다. 반대로, 노출된 구역의 용매는 모델 T_H에피토프 P2와 P30의 삽입을 위한 후보 자리로서 제공한다.

마지막으로, 단백질의 조직화 영역은 또한 그것의 단백질 구조와 기능과의관련성 때문에 고려되어진다.

전략의 초점은 가능한 많이 Her2의 세포외 부분의 구조가 보존적이어야 한다는 것이다. 왜냐하면 이것이 중립적인 항체을 위한 목표로서 연관되어 있는 단백질의 부분이기 때문이다. 대조적으로 종양 세포 표면상에 Her2가 부착된 네이티브 멤브레인의 세포외 부분은 인간 면역 시스템에 접근하기 어렵다.

따라서, CTL 에피토프의 존재만이 백신에서 이 부분을 포함하는 이유를 제공한다. 그러므로 하나 또는 이상의 에피토프를 여기에 위치시킴이 명백하다. 만약 E.coli이나 효모 내에서 전길이 Her22 분자의 발현이 불가능함이 밝혀지면, 세포내 부분은 최초 CTL 에피토프 "hot spot" (자리 800 근처 ) 다음에서 끝이 잘려질 수 있다. 이후의 추가적인 CTL 에피토프는 잘려진 분자의 C-말단 끝에 더해질 수 있다.

트랜스멤브레인 구역은 독립적인 폴딩 단위이고 이것을 P2 또는 P30 같은 T_H에피토프 로 대체하는 것은 아마도 HER2 구조와 폴딩에 영향이 없을 것이다. 추가로, TM 영역은 효모와 E.coli에서의 발현에 지대한 문제를 야기하고 어떤 경우에도 대체되어진다. 그러므로, 에피토프는 될 수 있으면 머든 구조에 있어 이 영역에 위치하여야 한다(아마도 그것이 몇 개의 CTL 에피토프를 포함하기 때문에 그리고 리간드 결합에 관한 신호의 전달에 수반되기 때문에 1 구조에 있어 그것을 원상태 대로 남겨 놓음) .

세포외 영역은 P2와 P30이 세포내와 트랜스멤브레인 영역에 자리하고 잠재적인 B-세포 에피토프의 수를 최대화하고 구조에 대해 가능한 한 적게 방해함에 의해 대체로 원래대로 유지 가능하다. 그러나, EGFR과 Her-3와 Her-4에 대한 높은 정도의 상동성이 바람직하거나 또는 그렇지 않은 이들 수용체에 대한 교차 반응의 위험을 만든다. 추가로, 약간의 모노클로날 항체가 수용체에 대해 길항적이고 (아마도 잡종 이합체 형성 또는 리간드 결합에 의해) 생체 내에서 종양의 크기를 증가시킨다는 기능이 설명되었다. 세포외 영역에서의 위치는 그러므로 이러한 위험을 줄일 수 있게 선택된다.

이러한 선택은 전술한 모든 변수들을 수반하며 두 개의 다른 가설에 기초한다 : (ⅰ) 비보존적인(관련된 수용체에 대한 고려로) 구역에의 삽입은 3차 구조를 유지하는데 도움이 될 것이며 항체에 의한 원치 않는 활성화를 줄여 줄 것이다. (ⅱ) 잘 보존된 구역에의 삽입은 구조를 바꿀 수 있지만 동시에 관련된 서열들의 파괴에 의한 교차 반응의 위험을 줄일 수 있다. 두 가설 모두 추리적이지만, 에피토프가 단백질의 어떤 자리에 위치하는 효과를 예측하기가 매우 어렵기 때문에 이들 위치 중 몇몇은 구조 내에 포함되어 있다.

두 개의 시스테인이 풍부한 영역을 완전히 체거하는 것이 유리하다고 추측된다. 이들은 노출된 루프 구조의 용매를 형성할 것으로 예측되고 이합체화에 수반될지도 모르는 독립된 폴딩 단위를 형성할 수 있었다 (이합체화 영역의 형성에 필요한 단단한 구조의 유지에 알맞은 많은 시스테인에 의해 지시됨으로써). 이들 영역이 단백질의 세포외 부분 중 가장 잘 보존되어 있기 때문에, 그러므로 이들 구조의 결실은 교차 반응하는 항체의 수를 감소시킬 뿐 아니라 항체에 의한 활성화의 위험을 제거한다. 추가로, 이러한 시스테인 풍부한 영역은 E.coli이나 효모 세포 내에서의 생산에 있어 의심스럽다.

구조에 대한 상세한 설명은 무제한 예로 P2와 P30 에피토프를 사용하여 뒤이어진다 : P2 에피토프는 멤브레인이 미치는 구역의 일부 또는 전부를 대체하는 P30에 의한 재조합에있어 Her2의 세포외 영역에 원래부터 위치할 것이다. P2 에피토프는 위에서 논한 기준에 기초한 구역에 위치할 것이다. 바람직한 구조믈은 다음 구조를 갖는다.

에피토프의 위치는 성숙한 Her2의 개시점과 관련된 에피토프의 아미노산 위치의 처음과 마지막을 지시한다. 길이는 완전한 구조의 아미노산에 있어서의 길이이다. 이들이 존재하는 것을 제외하고 모든 구조물에 있어 위치는 * 로 표시하였다. 에피토프는 에피토프로서 같은 길이의 아이노산 스트레치를 대체한다. "*"는 에피토프가 Her2를 대체하기보다는 삽입되었다는 것을 보여준다. 위에 열거된 모든 구조물은 성숙한 Her2가 C-말단으로부터 온 생략된 부분에서 잘린 것이다.

대부분의 구조들은 예컨데, 자연적인 HER2 신호 펩타이드서열에 있는 pcDNA3.1+ 벡터, 초파리 세포에서의 발현을 위한 BiP 리더 서열을 가지고 E.coli세포에서의 발현을 위한 pET28b 벡터에 있는 리더 서열 없이 융합된 pMT/BiP/V5-His-A 벡터 같은 다른 버전들에 존재한다.

아래에는 변형된 HER2 단백질의 감별과 선택에의 사용을 위해 의도된 모델이 설명되어진다.

1. 형질 전환 랫(rat) Her2 쥐들 와 토끼에 있는 항체의 랫과 인간 Her2 로의 유도는 적어도 3번의 면역화 후에 각각 전통적인 ELISA 기술에 의해 조사될 것이다. 인간과 랫 Her2에 대한 상업적으로 이용가능한 항체가 양성 조절로서 사용될 것이다.

2. 이들 토끼의 항체는 생체 외에서의 모델에 있는 Her2를 과발현하는 인간과 형질 전환 마우스 종양 세포의 성장의 추정되는 억제연구에 사용될 것이다.

3. 선택된 인간 Her2 분자에 대해 파상풍균 면역화된 환자로부터 얻은 PBL의 T 세포 증식은 전형적인 방법에 의해 조사될 것이다.

4. 변형된 랫 Her2 분자들이 랫 Her2 형질 전환 쥐들에서 CTL 반응을 유도하는 능력은 표적으로서 이 쥐들로부터 얻은 종양들을 사용하여 연구된다.

5. P2와 P30 에피토프를 내포하는 인간 Her2의 트랜스멤브레인 구역에 있는 펩타이드의 선택된 세트를 합성하는 것이 의도되었다. P2와 P30 에피토프가 Her2 서열 내로부터 유효하게 처리되고 T 세포에 제공되 수 있는지를 결정하기 위해 이들 펩타이드는 파상풍균 유독소(toxoid)로 미리 면역화된 인간으로부터 얻은 PBL의 증식에 있어서 시험될 것이다.

6. 선택된 인간의 변형된 Her2는 단지 인간 VDJ 유전자를 발현시키기 위해유전적으로 구성된 마우스에 있는 중립적인 항체의 생성을 위해 검사될 것이라는게 가능하다. 이러한 마우스는 공동 연구의 일환으로로서 Abgenix, Fremont, CA, U.S.A 로부터 이용가능하다.

마우스 Her2 발암 유전자를 포함하는 유방암을 위한 네 개의 잘 특성이 밝혀진 형질 전환 마우스 모델이 설명되고 있다. 처음 세 형질 전환 마우스들은 네 번째 모델이 불활성화된 Her2를 이용하는 동안 활성화된 Her2 발암 유전자를 발현시켰다. 모든 모델이 유선에서의 발현을 드라이브하는 MMTV 프로모터를 사용한다.

본 발명자들은 두 형질 전환 마우스들의 모델을 사용할 것을 결정하였다 : 1) Muller와 다른사람들에 의해 설명된 활성화된 Her2 발암 유전자를 사용하는 (Muller et al, 1989) 보다 공격적인 종양 모델과 2) 불활성화된 Her2가 긴 잠복기를 가지고 있는 유방 종양을 만드는데 사용되는 보다 덜 공격적인 종양 모델 (Guy et al, 1992). 두 형질 전환 마우스들은 Jackson 과/또는 Charles River 연구소로부터 구입되었다.

최초의 실험에 있어, 이들 마우스들은 항체를 만드는 것과 변형된 랫 Her2 단백질에 의한 면역화와 부스팅에 의한 CTL 반응이 허용되었다. 그래서 종양의 영향 범위가 다른 사람들에 의한 설명으로써 조사되었다 (Muller et al, 1989 ; Guy et al, 1992 ; Katsumata et al, 1995 ). 항체 수준은 ELISA 검사에 의해 측정될 것이다. CTL 활성은 상기한 대로 랫 Her2를 발현시키는 표적 세포의 생성에 의해 결정된다.

선택적으로, 누드 마우스 이종 조직 이식 암 모델이 수동적인 백신화 실험을위해 사용될 수 있다. 누드 마우스들은 인간 종양들로 이식될 수 있고, 종양들의 억제는 정상적인 또는 변형된 Her2 단백질로 면역화된 인간화된 마우스의 혈청의 수동적인 이동으로 시도될 수 있다. 이것이 종양을 억제하는데 있어서의 항체의 역할을 연구하기 위해 유용한 반면, CTL 횔성은 이 시스템에서 직접적으로 측정될 수 없다.

두 번째 생체내 모델에 있어서, 마우스들에 있는 종양은 또한 전술된 형질 전환 마우스들의 종양으로부터 얻은 세포주를 이식함에 의해 생성될 수 있다. 이들 마우스들로부터 생성된 세포주는 관련된 마우스 계통으로 이전될 수 있고 표준적인 프로토콜을 사용하여 국지화를 확립할 수 있다.

랫 Her2를 과발현시키는 마우스 종양 세포의 트랜스퍼 : 이 시스템에 있어서, 세포들은 랫 유전자로 트랜스펙?i>?/i>되고 MHC 적합한 쥐들로 이전될 것이다. 종양 성장의 억제는 항 Her2 반응의 생성에 의해 달성된다.

이들 시스템에 있어서 ; 변형된 Her2 단백질은 항체와 CTL 반응을 생성하는 어쥬번트에 있는 백신으로서 사용된다.

DNA 백신화는 효과적인 면역 반응을 갖춘 몇몇 시스템에서 성공적으로 사용되었다. 본 발명자들은 일반적으로 변형된 자기 단백질을 사용하는 DNA 배달의 방법을 조사사고 있다. 유방암 형질 전환 마우스 모델의 종양의 억제에 있어서 변형된 Her2 조성물의 효과를 결정하기 위해 DNA 백신화 접근을 사용하는 것이 본 발명자들의 의도이다. 비슷한 접근이 이 질병을 치료하기 위해 인간에 적용될 수 있다.

실시예 3

항-FGF8b 백신의 생산

면역원화된 "FGF8b" 분자의 패널을 보여주기 위해 하나 또는 이상의 무작위 외래 T 세포 에피토프의 삽입에 의한 분자의 변형을 통해서 FGF8b에 대한 인간 자가백신이 어떻게 발달하는지가 다음에서 설명될 것이다. 구조물들은 FGF8b 분자의 확실한 부분과 교차 반응하는 항체를 유도하는 그들의 능력을 시험받을 것이다. 뒤이어, 몇 몇 생체외의 검사와 동물 모델의 생체내의 검사에 있어 다른 구조물의 효과가 평가될 것이다. 유도된 항체는 전형적인 과정을 거친 보충물을 활성화하고 Fc-수용체를 경유하여 ADCC를 개시하는 그들의 능력이 검사될 것이다. 마지막으로, 다른 분자들이 인간 전립선과 유방암의 동물 모델에서 검사될 것이다.

FGF8b에 대한 자가백신의 조제

쥐와 인간의 FGF8b 폴리펩타이드의 완전한 동일성 때문에 모든 구조물은 인간과 쥐들 모두의 실험에 사용될 수 있다.

인간 TNFα 백신에 성공적으로 사용된 무작위 파상풍균 유독소 T 헬퍼 세포 에피토프 P2와 P30은 FGF8b 폴리펩타이드로 삽입될 것이다. 작은 크기의 FGF8b 때문에 구조물들이 한 분자당 하나의 에피토프를 가지고 만들어진다. 인플루엔자 해마글루티닌(haemagglutinin) 에피토프 HA (307-319), 여기서 논의된 다른 T 세포 에피토프 같은 다른 무작위 T 헬퍼 세포 에피토프 또한 고려될 수있다.(O'Sullivan 1991).

4 개의 다른 면역원화된 FGF8b 구조물들이 분자를 따라 분포된 에피토프로만들어진다. 이들 4개의 구조물들은 단백질의 FGF 패밀리의 다양하고 패어와이즈된 (pairwise)한 정렬의 기초위에 만들어졌다. FGF2와 FGF8b의 페어와이즈된 정렬은 FGF8b 분자를 따라 추정되는 이차 구조 (바꿔 말하면 β-시트 분포)의 분석을 위한 기초로 사용된다. FGF2와 FGF8b 사이에 보존된 잔기들은 3차원적 구조 상에서는 어디에서도 집락화하지 않고, 이것은 폴딩 능력에 대해 해로운 효과를 가짐 없이대체될 수 없는 분자의 특별한 구역은 없다는 것을 보여준다. FGF8b안의 시스테인 잔기들이 일렬로 늘어선 FGF2 안의 아미노산 잔기들은 삼차원적으로 서로 매우 가깝게 위치하고 있으며, 그들이 FGF8b에서 다이설파이드 결합을 형성함을 보여주며, 그 정렬이 옳다는 것을 보여준다. FGF2 의 N-말단 부분의 유연성 또한 고려되어야 한다.

N-말단 (F30N)에서 P30 에피토프를 가진 FGF8b 변형체는 FGF8b 단백질의 아미노산 잔기들과 P30 에피토프 (SEQ ID NO : 14) 의 간격이 없는 정렬에 기초하여 설계되었고, 각 아미노산 잔기의 화학적 성질에 대해 다른 위치를 갖게 되었다. 예측된 베타 - 배럴(β- barrel) 구조의 N-말단 구역이 고려되었다. F30N의 경우, 21 잔기 중에서 9개가 비슷하다. 이러한 수도-알고리즘을 사용하면, 최소한의 전체적인 구조의 변화를 야기하는 대체가 기대되어 진다. 대체된 아미노산 3 차원적 표시 뿐 이니라 네 개의 다른 구조물의 서열도 도 6에서 나타내었다.

C-말단(F2C)에서 P2 에피토프 (SEQ ID NO : 12)를 가진 FGF8b의 변형체가 F30N와 같이 최초로 설계되었다. 그러나, 195- 203 자리에 있는 예측된 알맞은 Kd 에피토프가 있다. 그러므로, P2 에피토프가 바로 에피토프의 C-말단에 삽입되었다. 다시, 오직 예측된 베타 - 배럴의 C-말단만이 고려되었다.

내부의 FGF8b 변형체 (F30I와 F2I)는 에피토프 P2와 P30 각각을 가진 FGF2 구조안의 외부의 루프를 대체함으로써 조제되고, 그래서 FGF 구조의 베타 - 배럴 구조 골격은 바뀌지 않고 남아 있을 것이다.

면역원화된 FGF8b 분자들은 E.coli에서 발현되어지고, 이것은 최소한의 대가로 단백질을 대량 생산하도록 촉진한다. 비록, FGF8b가 잠재적인 두 개의 N-글루코실화 자리(Asn31과 Asn177)를 가지고 있지만, 세균적으로 발현된 재조합 FGF8b는 생물학적으로 활성인 것으로 보여진다 (MacArthur 1995a, Blunt 1997). 정제와 리폴딩을 촉진하기 위해서, FGF8b 변형체들이 His-표지된 버전으로 생산되고, 그것에 의하여 Ni-포화된(charged) 컬럼과의 결합이 가능하게 되었다.

분자들의 정제는 단백질 분자 또는 His-표지의 높은 양 전하를 사용하여 수행되어지고, 리폴딩은 다이설파이드 브릿지의 형성을 행하는 표준적인 과정을 이용하여 수행되어진다.

4개의 면역원화된 분자들은 또한 DNA 백신화 백터로 삽입되는 야생형 FGF8b cDNA를 다같이 가지고 있다.

변형된 FGF8b 분자의 감별과 선택

4개의 면역원화된 분자들은 세균내에서 발현되고 연속적으로 포함체로부터 정제된다. 이와 병행하여, 구조물들은 DNA 백신으로 사용될 것이다. 그러면, 다른 구조물들의 전립선과 유방암 환자들이 바라는 여러 가지 효과를 유도하는 능력을 비교할 것이다. 이러한 조사는 몇몇의 다른 생체외 그리고 생체내의 검사를 사용하여 수행될 것이다. 마지막으로, 실험의 결과는 인간에 있는 FGF8b 백신을 위한 하나 또는 두개의 후보의 최종적인 선택의 기초를 형성할 것이다.

생체외의 모델

쥐(murine) 시스템의 분석

토끼 뿐 아니라 다른 반수체(haplotype)을 갖는 쥐들은 완전 Fruend's 어쥬번트에 있는 다른 FGF8b 구조물들로 면역화될 것이고 연속적으로 불완전 Fruend's 어쥬번트에 유화된 동일한 시약으로 적어도 두 번 부스트될 것이다. 그러므로, B 세포 관용을 파괴하는 다른 구조물들의 능력이 비교될 수 있다. DNA 백신화는 14일의 간격을 두고 근육 내에 주사된 완전 Fruend's 어쥬번트/불완전 Fruend's 어쥬번트에 있는 정제된 DNA을 사용하는 다른 동물들 상에서 수행될 것이다.

혈청 샘플이 면역과 계획동안에 몇 번 얻어졌다. 그리고 FGF8b 특이적 항체를 유도하는 다른 구조물들의 능력이 전통적인 ELISA 방법(Rochon 1994)을 사용하여 결정될 것이다. FGF8b (R&D)에 대항하여 발생된 상업적인 모노클로날 항체 뿐 아니라 상업적인 폴리클로날 항혈청도 또한 다른 FGF8b 구조물을 가지고 생산되고 연속하여 정제/리폴딩 될 것이다. 그러면 이 산물은 FGF8b 변형체 단백질로 면역화된 쥐들/토끼들로부터 얻은 혈청을 시험하는 직접적인 ELISA에서의 플레이트의 코팅에 사용될 수 있다.

FGF8b에 대한 백신화의 효과를 조사하는 중요한 도구는 FGF8b 의존적 암 세포주가 될 것이다. 몇몇 FGF8b 양성 암 세포주들은, 예컨데 MCF-7 또는 SC-3 같은, 문헌적으로 설명되어있다. FGF8b 의존적 쥐 암 세포주는 계량할 수 있는 RT-PCR,세포 증식 실험, 그리고 STAT-3 인산화 검사를 사용하여 정해질 것이다.

세포 표면에서 FGF 수용체에 연결된 FGF8b의 존재는 FACS 또는 ELISA 분석에 있는 FGF8b 특이적 항체로 탐지될 것이다. 몇몇 다른 FGF 수용체에 대항하여 지시된 항체가 상업적으로 이용가능하다 (R&D).

구조물들은 보충물의 FGF8b의 생산/포함 세포의 용균을 활성화시킬 수 있는 항체를 유도하는 그들의 능력이라는 점에서 비교될 것이다. 이것은 전에 설명된 FGF8b를 발현시키거나 또는 선택적으로 삼투적으로 FGF8b-섞여진 세포를 사용하는 하나의 마우스 종양 세포주으로 탐지된다. 정상적인 또는 인간 FGF8b 구조물로 면역화된 형질 전환 쥐들 (아래 참조)로부터 얻은 혈청이 세포주과 함께 배양되고 연속해서 신선한 기니아(guinea) 돼지 보충물과 함께 배양될 것이다. 보충물 세포 용균 매개의 항체는 표준적인 과정으로 탐지 가능하다.

ADCC를 매개하는 항체의 유도 능력은 FGF8b 발현 세포 표지된 51Cr-방출을 측정함으로써 연구할 수 있다. 주효 세포는 공동 유전형 쥐로부터 얻은 PBMC가 될 것이다. 검사의 확립을 위해, 인간 FGF8b에 대한 항체를 가진 주효 세포로서 ADCC를 매개할 수 있는 쥐 세포주를 사용하는 것이 편리할 것이다.

FGF8b 후보 백신이 종양 성장에 유도된 자가항체를 증진시키지 못함을 보여주기 위해 본 발명자들은 또한 종양 증식 검사를 수행할 것이다. 면역화된 쥐들에서 얻은 혈청 샘플이 종양 세포를 발현시키는 FGF8b와 함께 배양될 것이다. 종양 세포의 증식은 연속하여 세포에 첨가된 3H-thymidine을 혼합하는 그들의 능력에 의하여 탐지될 수 있다.

FGF8b가 포유류 세포 범위의 증식을 유도하는 것으로 알려져 있기 때문에 변형체 단백질의 효과를 증진시키는 성장의 시험이 필요하다. 이것은 Marsh 1999에 의해 사용된 것과 같은 세포 증식 검사를 사용하여 행해질 수 있다.

포유류 세포에 대한 FGF8b의 생물학적 효과는 자가항체에 의해 상쇄될 것이다. 이것은 세포 증식 (그리고 형태적 변형) 연구에 있어 재조합 FGF8b와 예컨데 NIH3T3 같은 것을 사용함으로써 보여질 수 있다. 자가항체의 추가는 FGF8b의 형질 전환 능력을 소멸시킬 것이다.

면역화 프로토콜

FGF8b AutoVac 면역화 실험에 참가하는 동물의 수는 모델에 있어 기대되는 질병의 침투성에 달려있으며, 그러므로, 통계학적으로 중요한 정보를 얻기 위해 필요한 숫자에 의존한다. 프로토콜의 면역화는 본 발명자들이 TNFa AutoVac 프로젝트로부터 얻은 경험에 기초하여야 한다. 다양한 프로토콜의 면역화가 특정 목적을 위한 다양한 TNFa 유사체로 마우스를 면역화하기 위해 사용되어 왔다. 그러나 대부분의 실험은 다음의 프로토콜을 사용하여 수행되었다 :

1. 마우스들은 각 본 발명자들에 10마리씩 하고, 귀표에 의해서 또는 트랜스폰더를 사용하여 개별적으로 표시되어야 한다. 아마, 수컷과 암컷을 분리하여 평가하여야 하지만, 어떤 경우에도 암컷과 수컷을 한 본 발명자들안에 두지않는다. 이동 및 표시 후 적어도 3일동안 동물들을 쉬게 한다.

2. PBS 완충제에 있는 항원 1 ㎎/㎖ 는 같은 부피의 완전 Freund' 항원 (CFA) (DiFco 또는 Sigma) 으로 유화되었다. 이 현탁액은 물 표면상에서의 현탁액방울의 위치에 의해 검사되다. 그리고 방울이 모여있는지 아니면 흩어지는지를 관찰한다. 방울이 흩어지지 않을 때까지가 혼합이 유지되는 것이다.

3. 표준적인 면역화 투여양은 어쥬번트 100㎕ 부피 + 100㎕ 안에 있는 항원 100㎍이다. 그러므로, 동믈의 등에 피하로(subcutaneously) 처리된 총 면역화 부피는 200 ㎕ 이다.

4. 부스팅은 최초 면역화로부터 2-3주 후에 수행되며, 연속하여 2-3주 간격으로 수행된다. 부스팅/ 면역화 물질은 면역화 물질로서 정확하게 준비되고 처리되지만, 불완전 Freund' 어쥬번트가 사용된다. 아마 3개의 부스팅은 최대 역가를 유도할 것이다. 그래서, 최고치 역가가 처음 면역화 후 6-9주 후에 얻어질 것이다.

5. 출혈은 최초 면역화 전과 각 부스팅 후 1주 되는 때에 보통 얻어지는 50-100㎕ 의 오비탈 출혈이다.

면역화 프로그램의 개시점은 질병의 발달과 본 발명자들이 채택하기 원하는 전략에 의존한다. 처음으로, 본 발명자들은 가능한 한 빨리 최대의 면역을 생성하는 것을 시도하고, 그러나 생후 5주의 근사치보다 더 빠르게 면역화를 시작하기 어렵다고 주장한다. 지금부터는, 3번의 부스트 개시 후 6-8주 간격으로 한 부스팅에 의해 높은 역가가 유지되어야 한다. FGF8b가 어린 마우스의 정상적인 발달에 필요하다면 잠재적인 문제가 있다. 그러므로, 혹자는 성체 마우스가 된 후 면역화를 시작하여야 한다는 것에 찬성하여 논쟁할 수 있다.

인간 시스템의 분석

다른 FGF8b 구조물간의 선택에 있어서 인간 항원 존재 세포가 삽입된 면역화된 T 세포 에피토프에 존재하는 능력은 조사될 수 있다. 이것은 TNFa 백신을 위해 사용된 P2와 P30의 표시를 위한 것과 같은 생체 외에서 수행되는 검사를 사용하여 행해질 것이다. P2와 P30에 특이적인 인간 T 세포주가 파상풍균에 대해 백신화된 공여자로부터 확립될 것이다. 같은 공여자로부터 얻은 항원 존재 세포(PBMCs)가 다른 구조물과 함께 배양될 것이고 T 세포주가 첨가될 것이다. 삽입된 T 세포 에피토프를 표시하는 수준은 T 세포주의 자극을 측정함으로써 비교될 수 있다.

생체 내의 동물 모델

적어도 세 개의 다른 시스템이 유도된 FGF8b 항체가 FGF8b 의존 생체 내 효과를 조절할 수 있는지를 모니터하기 위해 사용될 수 있다.

마우스들은 종양 세포 발현시키는 마우스 FGF8b로 이식될 것이고, 종양 진행의 억제는 변형된 FGF8b 단백질 또는 FGF8b DNS 백신을 사용하는 자가백신으로 검사될 수 있다. 이상적인 시스템은 마우스 종양으로부터 고립된 세포의 사용을 수반한다. 선택적으로, 본 발명자들은 발현 백터에 있어 FGF8b cDNA로 안정하게 형질 변형된 다른 마우스 세포주 (예컨데, Balb/3T3)을 사용할 수 있다.

마우스 이종 조직 이식 암종 모델이 수동적 백신화 실험에 사용된다. 누드 마우스들을 인간 종양으로 이식하여, 종양의 억제가 변형된 FGF8b 단백질 또는 FGF8b DNA 백신으로 면역화된 정상적인 또는 인간화된 쥐들로부터 얻은 혈청의 이식과 함께 시도한다. 이것은 생성된 항체의 종양을 억제하는 능력의 연구에 유용하다.

개념의 증명을 성취할 수 있는 다른 접근은 FGF8b를 위한 형질 전환 마우스들의 사용을 수반한다. 매우 특이적인 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터의 조절 하에서 FGF8b cDNA를 운반하는 이 마우스들은 유방 종양을 발현시키는 FGF8b의 자발적인 발달로 보여진다. FGF8b 변형체 단백질 또는 FGF8b DNA 백신에 대한 이들 마우스들의 자가 백신화는 본 발명자들이 자가백신이 마우스의 종양을 억제하거나 거부할 수 있게 할 수 있는지를 보여줄 수 있게 한다.

개념의 증명을 얻기 위해 가능한 접근은 Wnt-1 형질 전환 마우스을 사용하는 것이다(MacArthur 1995c). MMTV 바이러스에 의한 유방암의 유도는 종양 발생중인 쥐들의 반 이상에 있어서 FGF8b 발현을 활성화시키는 것으로 보고된다. 종양의 FGF8b-의존성은 만일 본 발명자들 자가백신이 종양의 영향 범위나 성장률을 억제할 수 있다면 확립될 수 있을 것이다.

인간과 마우스의 FGF8b 폴리펩타이드가 동일하기 때문에 형질 전환 쥐들이 가끔 비생리적인 면역학적 관용 패턴을 보여준다는 사실은 이 프로젝트에 영향이 없어 보인다.

FGF8b 면역화의 유익한 효과는 마침내 이 마우스 모델에서 보여지고 적당한 인간 백신 후보들이 선택되어 질 때, 제한된 수의 독물학 연구가 수행되는 것이 가능해 질 것이다. 연속해서, 개념의 최종 증명을 얻기 위해, 유방과 전립선암 환자들에 대한 백신 연구가 수행될 수 있다.

중요하게, 만일 생체 내 모델을 사용하는 실험이 긍정적인 결과를 갖는다면, 더 많은 돌연 변이체가 사용가능한 데이터에 기초하여 제작될 것이다.

실시예 4

MUC-1 유사체의 준비

오직 하나의 MUC-1 자가백신 분자가 만들어졌다. 전체적으로 이것은 각각 SEQ ID NO : 33 서열을 갖는 9개의 뮤신(mucin) 반복으로 구성된다. 이 구조는 3개의 서열들로 시작하고 뒤에 P2 에피토프가, 그 뒤에 3개 이상의 뮤신 서열이, 그 뒤에 P30 에피토프가 오며 3개의 뮤신 서열로 종결된다.

이 구조는 N-말단 UNI-His 표지 (SEQ ID NO : 23) 가지고 그리고 가지지 않고 만들어진다. 두 변형체는 모두 E.coli에서 발현된다. 발현되는 단백질의 동일성이 웨스턴 블라팅과 N-말단 서열화에 모두에 의해 확인된다. 단백질은 용해 가능한 형태로 발현되지만, 어쨌든 놀라운 이합체로도 발현된다.

HIS-표지된 MUC-1 분자가 금속 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 순수한 단백질의 양과 그 순도는 일반적으로 알려지지 않았다.

실시예 5

마우스 모델 시스템에서의 자가 관용의 파괴

마우스를 클래스Ⅰ과 클래스 Ⅱ 에피토프 모두에 의해 펄스된 수지상 세포로 면역화시킨 CTL 실험은 생체외에서의 클래스Ⅰ과 클래스Ⅱ 펩타이드 모두에 의한 재자극 뿐 아니라 면역화가 단지 클래스Ⅰ에피토프에 의해 면역화와 재자극을 비교할 때 강화된 CTL 유도를 이미 보여주었다. 이 상황은 외래의 클래스II 에피토프가 자기 단백질에서 삽입된 자리에서의 자가 면역에 의한 면역화와 비교될만하다. 수지상 세포 같은 전문적인 항원 검열 세포들에 의한 이들 분자들의 이해와 가공은 몇몇 자기의 클래스Ⅰ에피토프와 함께 외래의 클래스Ⅱ에피토프의 표시를 이끈다.자가반응하는 CTL′를 이끄어내는 것이 가능하다는 것이 알려졌다. 그러나 외래의 클래스Ⅱ헬퍼 에피토프의 존재는 이 CTL의 유도를 강화하는 것 같다.

자가 반응 CTLs의 유도에 대한 본 발명의 잠재적인 이점은 일반적으로 오브알부민 형질 전환 마우스들에서 조사되고 있다. 다른 오브알부민 발현 수준과 관용 상태를 갖는 4개의 다른 형질 전환 계통이 있다. Kurt C 외 1997, J. EXP. Med. 186을 참조하면 : 239-245는 RIP-mOVA 형질 전환 마우스 (이자, 신장 그리고 흉선에서 발현하고 높은 관용 정도를 갖는) 를 밝히고 있고, Kurt C 외 1998, J. EXP. Med. 188을 참조하면 : 409-414는 RIP-OVA^low와 RIP-mOVA^high형질 전환 쥐들을 자세히 밝히고 있으며, 각각, 오브알부민의 낮은 그리고 높은 발현을 가진다. 마지막 계통인, 중간 단계 수준으로 오브알부민을 발현시키는 RIP-OVA^int이 상기한 참조 문헌의 공동 저자인 William R. Heath 박사로부터 얻어졌다.

체내에서는 다른 항원에 대한 관용의 정도가 다르다. 가장 적은 정도의 관용 중의 하나는 원형화된 항원 상에서 다량으로 발견된다. 이들 항원은 모두 흉선으로 들어갈 것이고, 거기에서 자기 반응 T 세포가 탐지된다. 이들 항원은 "중추적 관용" 하에 있다. 반면, 조직 특이적 항원은 흉선에 직접 들어가지 못하고 일반적으로, T 세포 면역성 결핍 같은 경우에 나타나는, "말초적 관용" 하에 있다.

2개의 오브알부민 AutoVac 구조가 생산되었다. 이들 둘은 P30 (SEQ ID NO : 14)로부터 얻은 서열이 다른 두 개의 자리에 십입된 EMBL 안의 NO : J00845 의 접근을 갖는 서열과 관련있다.

구조물 "OVA3.1" 에 있어, P30이 오브알부민의 아미노산 nos. 272-292 에 대응하는 자리에 삽입된다. 구조물 "OVA3.2" 에 있어, P30이 오브알부민의 아미노산 nos. 321-341에 대응하는 자리에 삽입된다. 이들 구조물들은 백터 pVax1에 삽입되었고 DNA 면역화에 사용되었다.

마우스들을 각각 DNA 100㎍으로 한번 피부내적으로 면역화시켰다. 이 면역화의 3주 후, 비장이 제거되고 CTL 검사가 우성인 오부알부민 에피토프 SIINFEKL과 조절로써 스크램블된 FILKSINE 펩타이드를 발현시키는 표적 세포를 사용하여 준비되었다. 면역화는 야생형 C57/6 마우스들 - 기대되는 것 처럼 오브알부민과 P30 모두가 이 마우스들에 있어 외래의 것이므로 - 에 있어서의 명확한 CTL 유도를 제공하였다.

본 발명자들은 이제 이들 AutoVac 구조물로 오브알부민 형질 전환 쥐들의 4계통을 면역화 할것을 의도한다. RIP-OVA^low, RIP-OVA^int, 그리고 RIP-mOVA^high가 오브알부민의 증가하는 양을 발현하고, 다른 정도의 관용을 가지며, 상기한 바와 같이, 또한 RIP-mOVA은 높은 정도의 관용을 갖는다.

형질 전환 마우스들의 이들 4개 계통에 있어서, 오직 P30만이 외래의 것이다. 오브알부민은 이 마우스들에 있어 자기-항원이고 그러므로 이런 상황은 오브알부민에 대한 CTL 유도를 위한 진실한 자가백신을 구성할 것이다.

오브알부민에 대한 가장 낮은 정도의 "말초적 관용"을 갖는 RIP-OVA^low쥐들에서 얻어진 예비적인 결과는 P30에 삽입된 오브알부민과 자연적으로 발생한 오브알부민 분자 모두가 CTL 반응을 유도할 수 있었다는 것을 보여주었다 - 보다 높은 정도의 관용을 갖는 형질 전환 쥐들이 자연적으로 발생한 형태가 아닌 변형된 오브알부민 분자에 대한 CTL 반응을 단지 마운팅할 수 있다는 것이 기대되어진다.

Claims (83)

1. 동물의 면역계의 항원 제시 세포 (APCs)에 의해

   1) 폴리펩타이드 항원으로부터 유래된 적어도 하나의 CTL 에피토프 및/또는 세포-관련 폴리펩타이드 항원으로부터 유래된 적어도 하나의 B-세포 에피토프 및

   2) 상기 동물에 대해 외래성인 적어도 하나의 제 1 T 헬퍼 세포 에피토프 (T_H에피토프)

   의 면역학적 유효량을 동시적으로 제시시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간을 비롯한 동물에 있어서, 상기 동물에서 약하게 면역원성이거나 비-면역원성인 폴리펩타이드 항원에 대한 면역 응답을 유도하기 위한 방법.
2. 표면에 세포-관련 폴리펩타이드 항원을 담지하거나, 세포내 구획 내에 세포-관련 폴리펩타이드 항원을 지니고 있는 특이적인 세포독성 T-임파구 (CTL) 응답을 유도함으로써, 인간을 비롯한 동물에서 그 동물에 있어서 약하게 면역원성이거나 비-면역원성인 세포-관련성 폴리펩타이드 항원을 다운-조절하는 방법으로서,이 방법은 그 동물에서 적절한 항원 제시 세포 (APC)에 의해,

   1) 세포-관련 폴리펩타이드 항원으로부터 유래된 적어도 하나의 CTL 에피토프 및

   2) 그 동물에 대해 외래성인 적어도 하나의 제 1 T-헬퍼 임파구 (T_H) 에피토프를 동시에 제시시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 적어도 하나의 CTL 에피토프는 제시시 APC의 표면 상의 MHC 클래스 I 분자와 관련되고/또는 상기 적어도 하나의 제 1 외래 T_H에피토프는 제시시 APC 표면상에서 MHC 클래스 II 분자와 관련되는 것이 특징인 방법.
4. 전항 중 어느 한 항에 있어서, APC가 수지상 세포 또는 대식세포인 방법.
5. 전항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드 항원이 종양 관련 폴리펩타이드 항원, 자가-단백질, 바이러스 폴리펩타이드 항원, 세포내 기생충 또는 박테리아로부터 유래된 폴리펩타이드 항원인 방법.
6. 전항 중 어느 한 항에 있어서, APC에 의한 CTL 에피토프와 제 1 외래 T_H에피토프의 제시가 그 동물의 면역계에 폴리펩타이드 항원의 적어도 하나의 유사체를 제시시킴으로써 수행되는 것이고, 여기서 상기 제 1 유사체는 폴리펩타이드 항원의 아미노산 서열의 변이를 함유하고, 상기 변이는 적어도 CTL 에피토프와 제 1 외래 T_H에피토프를 함유하는 것인 방법.
7. 제 6항에 있어서, 적어도 제 1 유사체는 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 공지 및 예측된 CTL 에피토프의 실질적인 분획을 함유하는 방법.
8. 제 7항에 있어서, 유사체의 아미노산 서열 중 공지의 예측된 CTL 에피토프의 실질적인 분획이 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 모든 공지의 예측된 CTL 에피토프를 인식하는 MHC-I 반수체의 적어도 90%에 의해 인식되는 방법.
9. 제 6항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서, 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 실질적으로 모든 공지의 CTL 에피토프가 유사체 내에 존재하고/또는 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 실질적으로 모든 예측된 CTL 에피토프가 적어도 제 1 유사체 내에 존재하는 방법.
10. 제 6항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 제 1 유사체가 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 구조 변형을 포함하는 일부를 포함하고, 여기서 상기 변형 결과, 제 1 유사체를 이용한 동물의 면역화가 세포-관련 폴리펩타이드 항원에 대해 동물에서 항체 생산을 유도하게 되는 방법.
11. 전항 중 어느 한 항에 있어서, 동물 면역계에 폴리펩타이드 항원의 적어도 하나의 제 2 유사체의 면역학적 유효량을 제시시키는 것을 포함하고, 여기서 상기 제 2 유사체는 폴리펩타이드 항원의 구조 변형을 포함하고, 상기 변형의 결과, 제2 유사체를 이용한 동물의 면역화가 세포-관련 폴리펩타이드 항원에 대한 항체 생산이 유도되는 방법.
12. 제 11항에 있어서, 적어도 하나의 제 2 외래 T_H에피토프가 제 2 유사체에 포함되도록 변형시키는 방법.
13. 제 6항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 및/또는 제 2 유사체(들)이 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 B-세포 에피토프의 실질적인 분획을 함유하는 방법.
14. 제 6항 내지 13항 중 어느 한 항에 있어서, 변이 및/또는 변형이 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입 및/또는 부가와 관련된 방법.
15. 제 6항 내지 14항 중 어느 한 항에 있어서, 변이 및/또는 변형이

    - 제 1 및/또는 제 2 유사체(들) 중에, 항원 제시 세포 (APC)에 유사체를 표적화시키는 적어도 하나의 제 1 부분이 포함되고/또는,

    - 제 1 및/또는 제 2 유사체(들) 중에, 면역계를 자극하는 적어도 하나의 제 2 부분이 포함되며/또는,

    - 제 1 및/또는 제 2 유사체(들) 중에, 면역계에 유사체 제시를 최적화시키는 적어도 하나의 제 3 부분이 포함되도록 이루어지는 것이 특징인 방법.
16. 제 6항 내지 15항 중 어느 한 항에 있어서, 변이 및/또는 변형이 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 적어도 하나의 B-세포 에피토프 또는 적어도 하나의 CTL 에피토프의 복제를 포함하는 방법.
17. 제 6항 내지 16항 중 어느 한 항에 있어서, 변이 및/또는 변형이 합텐의 도입을 포함하는 방법.
18. 전항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 및/또는 제 2 외래 T_H에피토프(들)이 으뜸면역성 (immunodominant)을 갖는 방법.
19. 전항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 및/또는 제 2 외래 T_H에피토프(들)이 난잡성 (promiscuous)인 방법.
20. 제 12항 내지 19항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 및/또는 제 2 외래 T_H에피토프(들)이 천연적인 T_H에피토프 및 인공적인 MHC-II 결합 펩타이드 서열 중에서 선택되는 방법.
21. 제 20항에 있어서, 천연적인 T_H에피토프가 P2 또는 P30과 같은 파상풍 독소 에피토프, 디프테리아 독소성 에피토프, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 에피토프, 및P. falciparumCS 에피토프 중에서 선택되는 방법.
22. 제 12항 내지 21항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 및/또는 제 2 T_H에피토프 및/또는 제 1 및 및/또는 제 2 및/또는 제 3 부분이

    - 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 아미노산 서열 또는 그의 서브서열에 공유 또는 비공유적으로 부착된 측쇄기 및/또는

    - 세포-관련 폴리펩타이드 항원으로부터 유래된 아미노산 서열에 대한 융합 파트너의 형태로 존재하는 방법.
23. 제 22항에 있어서, 제 1 부분이 예컨대 만난 또는 만노오스와 같이, APC에 대한 수용체가 있는 탄수화물과 같은 APC 특이적인 표면 항원에 대해 실질적으로 특이적인 결합 파트너인 방법.
24. 제 15항 내지 23항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 부분이 인터페론 γ (IFN- γ), Flt3L, 인터류킨 1 (IL-1), 인터류킨 2 (IL-2), 인터류킨 4 (IL-4), 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 12 (IL-12), 인터류킨 13 (IL-13), 인터류킨 15 (IL-15) 및 과립구-대식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF), 또는 그의 유효한 일부분; HSP70, HSP90,HSC70, GRP94 및 칼레티큘린 (CRT), 또는 그의 유효한 일부분 중에서 선택된 열충격 단백질; 또는 호르몬 중에서 선택된 방법.
25. 제 15항 내지 24항 중 어느 한 항에 있어서, 제 3 부분이 팔미토일기, 미리스틸기, 파네실기, 제라닐-제라닐기, GPI-앵커, 및 N-아실 디글리세라이드기와 같은 지질인 방법.
26. 제 6항 내지 25항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 및/또는 제 2 유사체(들)이 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 실질적으로 전체적인 3차 구조를 갖는 방법.
27. 제 6항 내지 26항 중 어느 한 항에 있어서, APC에 의한 제시가 동물에게 적어도 하나의 제 1 유사체의 면역학적 유효량을 투여함으로써 수행되는 방법.
28. 제 27항에 있어서, 적어도 하나의 제 2 유사체의 면역학적 유효량도 투여되는 방법.
29. 제 27항 또는 제 28항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제 1 및/또는 제 2 유사체(들)이 약학적 및 면역학적으로 허용가능한 담체 및/또는 비히클 및, 임의로 어쥬번트와 함께 조성되는 방법.
30. 제 29항에 있어서, 상기 어쥬번트가 수지상 세포와 같은 APCs에 의한 적어도 제 1 및/또는 제 2 유사체의 업테이크를 용이하게 해주는 방법.
31. 제 30항에 있어서, 어쥬번트가 면역 표적화 보조제; 독소, 시토카인 및 미코박테리아 유도체와 같은 면역조절용 어쥬번트; 오일 조성물; 폴리머; 미셀 형성 어쥬번트; 사포닌; 면역자극 복합 매트릭스 (ISCOM 매트릭스); 입자; DDA; 알루미늄 어쥬번트; DNA 어쥬번트; γ- 인슐린; 및 캡슐화 어쥬번트 중에서 선택되는 방법.
32. 제 31항에 있어서, 시토카인은 제 24항에서 정의된 바와 같거나 그의 유효한 일부분이고, 여기서 독소는 리스테리오라이신 (LLO), 지질 A (MPL, L180.5/RalLPS), 및 열-불안정한 내독소이며, 미코박테리아 유도체는 뮤라밀 디펩타이드, 완전 Freund' 어쥬번트, RIBI, TDM 및 TDE와 같은 트레할로스의 디에스테르 중에서 선택되며; 면역 표적화 어쥬번트는 CD40 리간드, CD40 항체 또는 그의 특이적인 결합 단편, 만노오스, Fab 단편, 및 CTLA-4이고, 오일 조성물은 스쿠알렌 또는 불완전 Feund' 어쥬번트를 함유하고, 폴리머는 덱스트란, PEG, 전분, 만난 및 만노오스와 같은 탄수화물; 플라스틱 폴리머; 라텍스 비이드와 같은 라텍스 중에서 선택되며; 사포닌은Quillaja saponaria사포닌, Quil A, QS21이고, 입자는 라텍스 또는 덱스트란인 방법.
33. 제 27항 내지 32항 중 어느 한 항에 있어서, 피내 (intradermal), 진피하(subdermal), 피내 (intracutaneous), 피하 (subcutaneous); 복강내, 볼내, 설하, 경막외, 척추, 항문 및 두엽내 경로와 같은 비경구 및 경구 경로를 통한 투여단계를 포함하는 방법.
34. 제 27항 내지 33항 중 어느 한 항에 있어서, 1년에 적어도 1회, 예컨대 적어도 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 및 12회 투여되는 방법.
35. 제 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 CTL 에피토프와 적어도 하나의 T_H에피토프를 코딩 및 발현하는 핵산 단편을 지니는 비-병원성 미생물 또는 바이러스를 동물에게 투여함으로써 제시를 수행하는 방법.
36. 제 6항 내지 14항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 제 1 유사체를 코딩 및 발현하는 적어도 하나의 핵산 단편을 지니는 비-병원성 미생물 또는 바이러스를 동물에게 투여함으로써 제시를 수행하는 방법.
37. 제 15항 내지 26항항 중 어느 한 항에 있어서, T_H에피토프 및/또는 제 1 및/또는 제 2 및/또는 제 3 부분이 세포-관련 폴리펩타이드 항원으로부터 유도된 아미노산 서열의 융합 파트너 형태로 존재하고, 이 때, 동물에게 제 1 및/또는 제 2 유사체를 코딩 및 발현하는 적어도 하나의 핵산 단편을 지니는 비-병원성 미생물또는 바이러스를 투여함으로써 제시를 수행하는 방법.
38. 제 11항 내지 14항 또는 36항 중 어느 한 항에 있어서, 동물에게 적어도 제 2 유사체를 코딩 및 발현하는 적어도 하나의 핵산 단편을 지니는 비-병원성 미생물 또는 바이러스를 투여함으로써 제시를 수행하는 방법.
39. 제 38항에 있어서, 비-병원성 미생물 또는 바이러스가 동물에게 1회 투여되는 방법.
40. 제 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 CTL 에피토프 및/또는 적어도 하나의 B-세포 에피토프, 및 적어도 하나의 제 1 외래 T_H에피토프를 코딩 및 발현하는 적어도 하나의 핵산 단편을 APC 내로 생체내 도입함으로써 제시를 수행하는 방법.
41. 제 6항 내지 14항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 유사체를 코딩 및 발현하는 적어도 하나의 핵산 단편을 APC 내로 생체내 도입함으로써 제시를 수행하는 방법.
42. 제 15항 내지 26항 중 어느 한 항항에 있어서, T_H에피토프 및/또는 제 1 및/또는 제 2 및/또는 제 3 부분이 세포-관련 폴리펩타이드 항원으로부터 유래된아미노산 서열에 대한 융합 파트너 형태로 존재하고, 제 1 및/또는 제 2 유사체를 코딩 및 발현하는 적어도 하나의 핵산 단편을 APC 내로 생체내 도입함으로써 제시를 수행하는 방법.
43. 제 11항 내지 14항 및 제 41항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 유사체를 코딩 및 발현하는 적어도 하나의 핵산 단편을 APC 내로 생체내 도입하는 것을 추가로 포함하는 방법.
44. 제 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 핵산 단편을 APC 내로 생체내로 공동-도입함으로써 제시를 수행하는 방법으로서, 이 때 상기 핵산들 중 하나는 적어도 하나의 CTL 에피토프를 코딩 및 발현하는 것이고 또 다른 핵산은 적어도 하나의 제 1 외래 T_H에피토프를 코딩 및 발현하는 것이며, 여기서 제 1 외래 T_H에피토프는 제 1항, 2항 및 21항 내지 24항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 것인 방법.
45. 제 40항 내지 44항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 단편(들)이 네이키드 (naked) DNA, 하전된 또는 하전되지 않은 지질과 함께 조성된 DNA, 리포좀 중에 조성된 DNA, 바이러스 벡터내에 포함된 DNA, 트랜스펙션-용이화 단백질 또는 폴리펩타이드와 함께 조성된 DNA, 표적화 단백질 또는 폴리펩타이드와 함께 조성된 DNA,표적화 탄수화물과 함께 조성된 DNA, 칼슘 침전제와 함께 조성된 DNA, 불활성 담체 분자에 커플링된 DNA, 어쥬번트와 함께 조성된 DNA 이거나 이들 중에서 선택된 것인 방법.
46. 제 45항에 있어서, 어쥬번트가 제 30항 내지 32항 중 어느 한 항에서 정의된 어쥬번트 중에서 선택되는 방법.
47. 제 40항 내지 46항 중 어느 한 항에 있어서, 투여 형태가 제 33항 또는 34항에서 정의된 바와 같은 방법.
48. 동물에서 약학 면역원적이거나 비-면역원성인 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 면역원성 유사체를 선별하는 방법으로서, 여기서 상기 면역원성 유사체는 세포-관련 폴리펩타이드 항원으로부터 유래된 에피토프에 결합된 MHC 클래스 I 분자를 나타내는 세포에 대해 동물 중에서 CTL 응답을 유도할 수 있는 것이고, 이 방법은

    a) 공지이거나 예측된 CTL 에피토프를 함유하지 않는 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 아미노산 서열의 적어도 하나의 서브서열을 동정하고,

    b) 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 아미노산 서열에, 상기 a) 단계에서 동정된 적어도 하나의 서브서열 중의 어느 위치에서, 그 동물에 외래성인 적어도 하나의 T_H에피토프를 도입함으로써 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 적어도 하나의 추정적으로 면역원성인 유사체를 제조한 다음;

    c) 그 동물에서 CTL 응답을 유도할 수 있을 것으로 증명가능한 b) 단계에서 제조된 유사체들을 선별하는 단계를 포함하는 방법.
49. 제 48항에 있어서,

    1) a) 단계에서 동정된 서브서열이 추가로 시스테인 잔기를 함유하지 않거나, 또는 다른 한편, b) 단계에서 도입된 T_H에피토프가 실질적으로 시스테인 잔기의 패턴을 변경시키지 않고/또는

    2) a) 단계에서 동정된 서브서열이 추가로 공지 또는 예측된 글리코실화 부위를 함유하지 않거나, 또는 다른 한편, b) 단계에서 도입된 T_H에피토프가 실질적으로 글리코실화 패턴을 변경시키지 않고/또는

    3) a) 단계에서 동정된 서브서열이 세포-관련 폴리펩타이드 항원에 의해 발휘되는 병리학적 효과에 유의적으로 기여하고, b) 단계에서의 T_H에피토프의 도입이 상기 병리학적 효과를 제거 또는 파괴하고/또는

    4) a) 단계에서 동정된 서브서열이 동물의 상이한 단백질 항원으 암노산 서열과 상동적이며, b) 단계에서의 T_H에피토프의 도입이 상동성을 실질적으로 제거하며/또는

    5) b) 단계에서의 외래 T_H에피토프의 도입이 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 B-세포 에피토프의 실질적인 분획의 보존을 결과시키는 방법.
50. 제 49항에 있어서, 유사체가 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 전체적인 3차원 구조를 갖는 변형법 5인 방법.
51. 제 48항 내지 50항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 선별된 유사체를 코딩하는 핵산 서열을 벡터 내로 도입하여 상기 벡터로 적절한 숙주 세포를 형질전환시키는 것을 포함하는, 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 유사체를 생산하는 세포를 제조하는 방법.
52. 세포-관련 폴리펩타이드 항원을 코딩하는 핵산 서열을 발현을 용이하게 해주는 조건 하에서 제 51항의 방법에 따라 얻어진 세포를 배양한 다음, 유사체를 배양 사등액 또는 세포로부터 회수하는 단계를 포함하는 세포-관련 폴리펩타이드 항원의 유사체를 제조하는 방법.
53. 제 52항에 있어서, 회수된 유사체를 정제하고, 이 정제된 생성물을 임의로 리폴딩, 효소 처리, 화학적 변형 및 컨쥬게이션과 같은 방법으로 인공적인 후-번역적 변형 처리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
54. 전항 중 어느 한 항에 있어서, 약한 세포-관련 항원이 5 알파 리덕타제, α-피토단백질, AM-1, APC, APRIL, BAGE, β- 카테닌, Bcl, bcr-ab1 (bea2), CA-125, CASP-8 / FLICE, 카텝신, CD19, CD20, CD21, CD23, CD22, CD33, CD35, CD44, CD45, CD46, CD5, CD52, CD55, (791Tgp 72), CD59, CD27, CDK4, CEA, c-myc, Cox-2, DCC, DcR3, E6 / E7, EGFR, EMBP, Ena78, 파르실 트랜스페라제, FGF8a 또는 FGF8b, FLK-1/KDR, 엽산 수용체, G250, GAGE-패밀리, 가스트린 17, 가스트린-방출 호르몬 (Bombesin), GD2 / GD3 / GM2, GnRH, GnTV, GP1, gp100 / Pmel 17, gp-100-in4, gp15, gp75 / TRP-1, hCG, 헤파라나제, Her2 / neu, HMTV, Hsp70, hTERT (텔로머라제), IGFR1, IL-13R, iNOS, Ki67, KIAA0205, K-ras, H-ras, N-ras, KSA (CO17-1A), LDLR-FUT, MAGE 패밀리 (MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, 등), 마마글로빈, MAp17, Melan-A / MART-1, 메소텔린, MIC A/B, MT-MMP's, Moxl, 글리코실화된 MUC-1, MUC-2, MUC-3 및 MUC-4와 같은 뮤신, MUM-1, NY-ESO-1, 오스테오넥틴, p15, p170 / MDR1, p53, p97 / 멜라노트랜스페린, PAI-1, PDGF, 플라스미노겐 (uPA), PRAME, 프로바신, 프로제니포이에틴, PSA, PSM, RAGE-1, Rb, RCAS1, SART-1, SSX 유전자 패밀리, STAT3, STn (mucin assoc.), TAG-72, TFG-α, TGF-β, 티모신 β15, TNF α, TPA, TPI, TRP-2, 티로시나제, VEGF, ZAG, p16INK4, 및 글루타치온 S-트랜스페라제 중에서 선택되는 방법.
55. 제 54항에 있어서, 세포-관련 폴리펩타이드 항원이 인간의 PSM인 방법.
56. 제 55항에 있어서, 외래 T 세포 에피토프가 SEQ ID NO: 2에 의해 정의되는PSM 아미노산 서열의 일부: 2 위치 16-52 및/또는 87-108 및/또는 210-230 및/또는 269-289 및/또는 298-324 및/또는 442-465 및/또는 488-514 및/또는 598-630 및/또는 643-662 및/또는 672-699에 도입되는 방법.
57. 제 55항 또는 56항에 있어서, 전립선암의 치료 또는 완화에 이용되는 방법.
58. 제 54항에 있어서, 세포-관련 폴리펩타이드 항원이 섬유아세포 성장 인자 8b (FGF8b)인 방법.
59. 제 58항에 있어서, 외래 T-세포 에피토프가 SEQ ID NO: 6에 의해 정의되는 FGF8b 아미노산 서열의 일부: 6 위치 1-54 및/또는 178-215 및/또는 55-58 및/또는 63-68 및/또는 72-76 및/또는 85-91 및/또는 95-102 및/또는 106-111 및/또는 115-120 및/또는 128-134 및/또는 138-144 및/또는 149-154 및/또는 158-162 및/또는 173-177에 도입되고, 여기서 도입은 바람직하게는 아미노산 26-45와 아미노산 186-215를 실질적으로 포함하지 않는 방법.
60. 제 58항 또는 59항에 있어서, 전립선암 및 유방암과 같은 암의 치료 또는 완화에 이용되는 방법.
61. 제 54항에 있어서, 세포-관련 폴리펩타이드 항원이 Her2인 방법.
62. 제 61항에 있어서, 외래 T-세포 에피토프가 SEQ ID NO: 3에 의해 정의되는 Her2 아미노산 서열의 일부: 3 위치 5-25 및/또는 59-73 및/또는 103-117 및/또는 149-163 및/또는 210-224 및/또는 250-264 및/또는 325-339 및/또는 369-383 및/또는 465-479 및/또는 579-593 및/또는 632-652 및/또는 653-667 및/또는 661-675 및/또는 695-709 및/또는 710-730에 도입되는 방법.

    72-86 및/또는 146-160 및/또는 221-235 및/또는 257-271 및/또는 387-401.
63. 제 61항 또는 62항에 있어서, 유방암의 치료 또는 완화에 이용되는 방법.
64. PSM의 공지이고 예측되는 모든 CTL 및 B-세포 에피토프의 실질적인 부분을 포함하고 청구범위 제 18항 내지 21항 중 어느 한 항에서 정의된 적어도 하나의 외래 T_H에피토프를 포함함을 특징으로 하는, 인간에서 면역원성인 인간 PSM의 유사체.
65. 제 64항에 있어서, 적어도 하나의 외래 T_H에피토프가 PSM 아미노산 서열 중 삽입으로 또는 PSM 아미노산 서열의 일부의 치환으로 또는 PSM 아미노산 서열의 일부의 결실의 결과로 존재하는 유사체.
66. 제 65항에 있어서, 외래 T_H에피토프가 제 56항에 정의된 서열에 도입된 유사체.
67. Her2의 공지이고 예측되는 모든 CTL 및 B-세포 에피토프의 실질적인 부분을 포함하고 청구범위 제 18항 내지 21항 중 어느 한 항에서 정의된 적어도 하나의 외래 T_H에피토프를 포함함을 특징으로 하는, 인간에서 면역원성인 인간 Her2의 유사체.
68. 제 67항에 있어서, 적어도 하나의 외래 T_H에피토프가 Her2 아미노산 서열 중 삽입으로 또는 Her2M 아미노산 서열의 일부의 치환으로 또는 Her2 아미노산 서열의 일부의 결실의 결과로 존재하는 유사체.
69. 제 68항에 있어서, 외래의 T_H에피토프가 제 62항에 정의된 위치에 도입된 유사체.
70. FGF8b의 공지이고 예측되는 모든 CTL 및 B-세포 에피토프의 실질적인 부분을 포함하고 청구범위 제 18항 내지 21항 중 어느 한 항에서 정의된 적어도 하나의 외래 T_H에피토프를 포함함을 특징으로 하는, 인간에서 면역원성인 인간 / 쥐 FGF8b의유사체.
71. 제 70항에 있어서, 적어도 하나의 외래 T_H에피토프가 FGF8b 아미노산 서열 중 삽입으로 또는 FGF8b 아미노산 서열의 일부의 치환으로 또는 FGF8b 아미노산 서열의 일부의 결실의 결과로 존재하는 유사체.
72. 제 71항에 있어서, 외래 T_H에피토프가 제 59항에 정의된 위치에 도입된 유사체.
73. 효과적인 면역원 제제로서 제 64항 내지 72항 중 어느 한 항에 따른 유사체를 약학적 및 면역학적으로 허용되는 담체 또는 비히클, 및 임의로 어쥬번트와 혼합하여 포함하는 면역원 조성물.
74. 제 64항 내지 72항 중 어느 한 항에 따른 유사체를 코딩하는 핵산 단편.
75. 제 74항에 따른 핵산 단편을 지니는 벡터.
76. 제 75항에 있어서, 자율 복제가 가능한 벡터
77. 제 75항 또는 76항에 있어서 플라스미드, 파지, 코스미드, 미니-염색체 및 바이러스 중에서 선택된 벡터.
78. 제 75항 내지 77항 중 어느 한 항에 있어서, 5'-3' 방향으로 작동가능한 연결상태로, 제 74항에 따른 핵산 단편의 발현을 추진하기 위한 프로모터, 폴리펩타이드 단편의 막 내로 통합되거나 또는 분비가능한 리더 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열, 제 74항에 따른 핵산 단편 및 임의로 터미네이터를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터.
79. 제 75항 내지 78항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주세포 내로 도입시, 숙주 세포의 게놈 내로 통합되거나 또는 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 없는 벡터.
80. 제 75항 내지 79항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 지니는 형질전환된 세포.
81. 1) 제 74항에 따른 핵산 단편 또는 제 75항 내지 79항 중 어느 한 항에 따른 벡터, 및

    2) 약학적 및 면역학적으로 허용되는 희석제 및/또는 비히클 및/또는 어쥬번트를 포함하는, PSM, Her2, 또는 FGF8b에 대한 항체 생산 유도용 조성물.
82. 제 75 항 내지 79항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 지니고 제 74항에 따른 핵산 단편을 발현하며, 제 64항 내지 72항 중 어느 한 항에 따른 유사체를 그의 표면에 분비하거나 담지하는 안정한 세포주.
83. 제 74항에 따른 핵산 단편 또는 제 75항 내지 79항 중 어느 한 항에 따른 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 것을 포함하는, 제 80항에 따른 세포의 제조방법.