NO20011586L - Nye fremgangsmater for terapeutisk vaksinasjon - Google Patents

Abstract

En fremgangsmåte er beskrevet for å indusere cellestyrt immunitet mot cellulære antigener. Mer spesifikt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å indusere cytotoksisk T- lymfocyttimmunitet mot svake antigener, da spesielt selv-proteiner. Fremgangsmåten innbefatter at antigenpresenterende celler innføres for å presentere minst en CTL-epitop av et svakt antigen og samtidig presentere minst en fremmed T- hjelpelymfocyttepitop. I en foretrukket utførelse er antigenet et cancerspesifikt antigen, for eksempel PSM, Her2 eller FGF8b. Fremgangsmåten kan gjennomgås ved å bruke tradisjonell polypeptidvaksinasjon, men også ved å bruke levende svekkede vaksiner eller nukleinsyrevaksinasjon. Oppfinnelsen tilveiebriijger videre immunogene analoger av PSM, Her2 og FGF8b, såvel som nukleinsyremolekyler som koder disse analoger. Det er også beskrevet vektorer og transformerte celler. Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for å identifisere immunogene analoger av svake eller ikke-immunogene antigener.

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår nye fremgangsmåter for bekjempelse av sykdommer, så som cancer, som erkarakterisert vedet nærvær av celleassosierte genekspresjonsprodukter som er ikke-immunogene eller svakt immunogene. Mer spesielt angår oppfinnelsen fremgangsmåter for å indusere en immunreaksjon ved hjelp av cytotoksiske T-lymfocytter (CTL-celler), hvor de celler som bærer epitoper fra genekspresjonsproduktene blir angrepet og drept av nevnte CTL-celler. Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte for å fremstille immunogene, modifiserte popypeptidantigener som er avledet fra svakt immunogene antigener.

Oppfinnelsen angår videre en serie søknader i forbindelse med søkerens AutoVac-teknologi (som er det bærende prinsipp i WO 95/05849) som angår terapeutisk vaksinasjon mot cancer.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Ideen om å vaksinere mot cancer har vært kjent i mer enn hundre år, med flere gjentatte utbrudd av aktivitet, spesielt etter avslutningen av forrige århundre.

I løpet av det siste året er det imidlertid skjedd en sterkt forbedret forståelse av de fundamentale molekylære mekanismer som skjer ved en immunreaksjon. Blant de viktigste oppdagelser som er skjedd i denne perioden, er oppdagelsen av en stadig voksende liste av cytokiner og vekstfaktorer, forståelsen av mekanismen ved interaksjonen mellom T- og B-celler, såvel som en oppdagelse av de reaksjonsveier som foreligger ved en cellulær antigenbearbeiding, og heri inngår rollen og strukturen på MCH klasse I og II-molekyler i antigenforekomsten. Viktige oppdagelser med hensyn til cancerimmunologien, skjønt den ikke fullt ut er forstått, er også belysningen av de mekanismer som ligger under induksjon og immunologisk toleranse for en vert. All denne forskningen har ført til store anstrengelser for å kunne utvikle nye behandlinger for human cancer.

Avhengig av hvordan tumorimmunitet er ervervet av pasienten, kan immunoterapiregimene kategoriseres eller katalogiseres enten som passive eller aktive. I passive immunoterapiregimer vil pasienten passivt motta immunkomponenter så som cytokiner, antistoffer, cytotoksiske T-celler eller lymfocyttaktivert dreper (LAK) celler. I motsetning til dette foreskriver aktive spesifikke immunoterapiprotokoller en aktiv induksjon av tumorimmunitet ved vaksinasjon med tumorcellen eller dens antigene komponenter. Denne sistnevnte behandlingsformen er foretrukket fordi den gir lengre immunitet.

Passive og aktive cancervaksiner har fokusert på en induksjon enten av humoral eller cellulær immunreaksjon. Ved aktive vaksiner er det velkjent at

induksjon av CD4-positive T-hjelpeceller er nødvendig for sekundært å indusere enten antistoffer eller cytotoksiske CD8-positive T-celler.

Passiv vaksinasjon med antistoffer

Etter oppdagelsen av den monoklonale antistoffteknologien på midten av 1970-årene, er det utviklet en rekke terapeutiske monoklonale antistoffer som er rettet inn mot tumorspesifikke eller tumorassosierte antigener. Monoklonal antistoffterapi gir imidlertid opphav til en rekke alvorlige problemer: - Injeksjon av disse fremmede stoffene induserer en immunreaksjon hos pasienten mot de injiserte antistoffene, og dette kan føre til en mindre effektiv behandling såvel som alvorlige allergiske bivirkninger i pasientene. - Monoklonale antistoffer må vanligvis administreres i store mengder. Dette er et problem ettersom det er store produksjonsomkostninger forbundet med monoklonale antistoffer. - Monoklonale antistoffer må administreres parenteralt, og på grunn av de relativt store mengder som er nødvendig, så må pasienten ofte legges inn på sykehus under behandlingen. - Injeksjoner av monoklonale antistoffer må gjentas med relativt korte mellomrom (uker) for å opprettholde den terapeutiske effekten. - Monoklonale antistoffer er vanligvis ikke i stand til å aktivere sekundære effektorsystemer i immunsystemet, så som komplement, NK-celler eller makrofagdreping av tumorceller.

Den siste ulempen er spesielt viktig i cancerterapi og kan være en viktig årsakt til at monoklonal antistoffterapi for behandling av cancer i flere tilfeller ikke har falt særlig heldig ut. De såkalte humaniserte monoklonale antistoffene som nå brukes av mange firmaer og institusjoner er mindre immunogene, men er dessverre også i mindre grad i stand til å aktivere de sekundære immuneffektorsystemene. Det er videre blitt observert eksempler på sekundær utvekst av tumorer som mangler det opprinnelige tumorantigenet, ettersom disse antistoffene ikke induserer »uskyldig tilskuer» effekter på tumorceller som ikke er tumorantigene.

Den dårlige effektorevnen for de monoklonale antistoffene har ført til

utvikling av monoklonale antistoffer som kjemisk er konjugert til forskjellige toksiner og radioisotoper. Pharmacia Upjohn AB har for eksempel utviklet et konjugat mellom et monoklonalt tumorspesifikt antistoff og Staphylococcus aureus-toksinet A med det formål å aktivere T-celler i tumoren. Medarex Inc. har utviklet bispesifikke monoklonale antistoffer som inneholder et tumorspesifikt Fab-fragment såvel som et Fc-reseptorspesifikt antistoffragment med det formål å aktivere makrofagdreping av tumorceller. Begge konstruksjonene er mer effektive enn de monoklonale antistoffet alene, men de er også mer kostbare og immunogene. Antistoffer konjugert til radioisotoper er også kostbare såvel som immunogene, og en har vanligvis også kunnet observere toksiske sideeffekter.

Utviklingen av den monoklonale antistoffteknologien var et viktig skritt fremover, og gjorde det mulig å fremstille veldefinerte, høyaffinitetsbindende molekyler. Ettersom disse antistoffene imidlertid er monoklonale, så reagerer de bare med en enkelt epitoptype på et tumorantigen. Dette er hovedårsaken til at de vanligvis ikke er i stand til å aktivere komplementsystemet eller binde seg til Fc-reseptorene på NK-cellene og makrofagene. Disse meget kraftige effektorsystemene krever vanligvis en samlokalisering av multiple Fc-antistoffragmenter som stikker ut fra antigenet.

Andre forskere har derfor forsøkt å anvende monoklonale antistoffer i kombinasjon, og dette har ført til en bedret effekt. Det synes derfor å være mer logisk og fornuftig å angripe tumorcellene med sterkt spesifikke polyklonale antistoffer som er rettet inn mot et tumorspesifikt, eller mot (overuttrykt) tumorassosierte antigener eller vekstfaktorreseptorer. Slike antistoffer vil være i stand til å aktivere de sekundære effektorsystemer som er nevnt ovenfor. Det synes videre sannsynlig at den lokale inflammatoriske reaksjonen som er indusert av disse effektorsystemene, kan føre til sekundære effekter på »uskyldig tilskuer» celler som ikke uttrykker det gjeldende tumorantigenet, såvel som aktiveringen av tumorspesifikke TIL- celler (tumorinfiltrerende lymfocytter) i tumorvevet. Slike effekter er blitt observert av Medarex Inc. ved anvendelse av deres bi-spesifikke monoklonale antistoffkonjugater.

Etter oppdagelsen av den monoklonale antistoffteknologien, har en mulig anvendelse av polyklonale antistoffer for cancerterapi ikke vært særlig mye undersøkt eller utviklet (bortsett fra de antigener som er beskrevet nedenfor).

En vesentlig årsak til dette er at veldefinerte, tumorspesifikke eller tumorassosierte overflateantigener bare har blittkarakteriserti løpet av de siste årene, men - mer viktig - mange av disse har vist seg å være selv-antigener og derfor ikke-immunogene. Følgelig er bare xenogene polyklonale antistoffer blitt brukt for å studere disse effektene. Slike antistoffer induserer imidlertid en kraftig immunreaksjon mot de injiserte fremmede polyklonale antistoffene, som meget raskt eliminerer de terapeutiske effektene.

Aktiv vaksinasjon for å indusere antistoffer

Nylige forsøk på å indusere terapeutiske polyklonale autoantistoffer i cancerpasienter ved aktiv vaksinasjon, har gitt gode resultater. Vaksiner mot membranbundede karbohydratselv-antigener (så som de O-forbundede avvikende uttrykte Tn- og sTn-antigenene og gangliosidliposakkaridene GM2 og GD3) er blitt utviklet. Disse små karbohydratstrukturene er imidlertid meget dårlige antigener, slik at man må bruke konjugater av disse molekylene med bærermolekyler så som nøkkelhull limpet (Keyhole limpet) haemocyanin (KLH) eller sauemuciner (som inneholder Tn- og sTn). I melanompasienter har en induksjon av anti-GM2 antistoffer gitt lange sykdomsfrie intervaller og en generell overlevelse etter en minimal oppfølging på 51 måneder. Også fase II-studier med blindprøver er blitt utført på brystcancerpasienter ved å bruke et konjugat av sTn og KLH i DETOX-B-tilsetningsmiddelet (BIOMIRA Inc.) og viser at sTn-immune pasienter hadde betydelig lengre midlere overlevelse sammenlignet med kontrollpasientene. Et annet eksempel på den aktive induksjonen av polyklonale antistoffer i cancer er bruken av idiotypisk spesifikk vaksinasjon mot B-cellelymfomer, skjønt den har vist seg lovende, er den utelukkende begrense til denne type cancer.

Til slutt kan det nevnes at US-kompaniet Aphton Inc. har utviklet aktive konjugatvaksiner mot gonadotropinfrigjørende hormon (GnRH) og gastrin. Det har vist seg at disse vaksinene er i stand til å kontrollere den biologiske aktiviteten for disse hormonene, som også kan fungere som autokrine vekstfaktorer for visse tumorceller. Vellykkede fase II-kliniske forsøk er blitt utført på gastrointestinale cancerpasienter, og fase III-kliniske forsøk er under utvikling.

Cytotoksiske T-celler

Det er klart blitt vist av flere grupper at tumorspesifikke cytotoksiske T-celler (CTL-celler) er tilstede i mange tumorer. Disse CTL-cellene blir ofte betegnet som tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL-celler). Disse cellene blir imidlertid ofte gjort ikke-reaktive eller anergiske ved flere forskjellige mulige mekanismer, så som en sekresjon av immunosupressive cytokiner av tumorcellene, mangel på sam-stimulerende signaler, nedregulering av MHC-klasse I-molekyler etc.

Det har vært gjort mange forsøk på å isolere de svulstspesifikke HLA-klasse I-bundede peptider som gjenkjennes av TIL-celler, og i visse tilfeller har dette gitt gode resultater (for eksempel peptider fra de melanomassosierte antigenene). Slike peptider er blitt brukt for å indusere en tumorspesifikk immunreaksjon i verten, men den praktiske bruken av disse tumorspesifikke peptidene i vaksiner er begrenset til et lite utvalg av befolkningen, noe som skyldes at peptidene har en relativt begrenset HLA-klasse I-bindende spesifitet. Videre er det vanligvis relativt vanskelig å frembringe en CTL-reaksjon in vivo ved å bruke syntetiske peptider, noe som skyldes det lave biologiske halvlivet for disse stoffene, så vel som vanskeligheter med hensyn til eksogen priming av MHC-klasse I-molekyler.

Det har vært gjort en rekke forsøk på å frembringe en tumorspesifikk CTL-reaksjon som blant annet innbefatter bruken av cytokiner (for eksempel IL-2, IFN-y, IL-6, IL-4, IL-10 eller GM-CSF) eller samstimulerende molekyler (B7) enten i løselig form eller uttrykt av transfekterte tumorceller. Videre har det med varierende hell vært brukt immuniseringer med allogene eller autologe hele celler, eller med tumorantigener fremstilt i spesialiserte tilsetningsstoffer som er utformet slik at de tilveiebringer antigenet via en tilveiebringelse av MHC-klasse I-antigener, eller tumorantigener uttrykt, blant annet i vaksineavektorer etc. Det er derfor stadig en generell holdning blant tumorimmunologer at den beste måten å eliminere tumorer på vil være å indusere en sterk spesifikk antitumor CTL-reaksjon.

Bortsett fra det faktum at disse behandlingene vanligvis er meget kostbare og vanskelige å reprodusere, har det også vist seg å være vanskelig å oppnå en god immunreaksjon mot tumoren, ettersom mange av de tumorassosierte antigenene er virkelige selv-proteiner overfor hvilke de fleste T-cellene synes å være tolerante. Det synes derfor å være nødvendig å indusere en kontrollert cellulær autoimmun tilstand i pasienten.

Hensikt ved oppfinnelsen

Det er en hensikt ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe forbedrede fremgangsmåter og midler for å indusere immunreaksjoner i vertsorganismer mot uønskede antigener, for eksempel tumorantigener. Det er videre en hensikt å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av polypeptidanaloger av slike uønskede antigener, analoger som er i stand til å indusere en effektiv immunreaksjon mot det uønskede antigenet.

Sammendrag av oppfinnelsen

Rent dogmatisk har det vært antatt at en presentasjon eller tilveiebringelse av antigener har skjedd langs to helt forskjellige veier, en klasse II eksogen og en klasse I endogen vei.

Kort forklart blir et fremmed protein fra yttersiden av cellen eller fra cellemembranen tatt opp ved hjelp av APC som et endosom som smelter sammen med et intracellulært område som inneholder proteolytiske enzymer og MHC-klasse II-molekyler. Noen av de fremstilte peptider binder seg til klasse II, som deretter blir translokert til cellemembranen.

Den nevnte klasse I-endogene veien erkarakterisert veden dominerende presentasjon eller tilveiebringelse av cytosole proteiner. Det er antatt at dette skjer ved hjelp av en proteosomstyrt spalting fulgt av en transportering av peptidene over i det endoplasmatiske retikulum (ER) via TAP-molekyler som er plassert i membranen i det endoplasmatiske retikulumet. I dette binder peptidene seg til klasse I fulgt av en transport til plasmamembranen.

Disse to veiene er imidlertid ikke fullt ut distinkte. Det er for eksempel kjent at dendritiské celler og til en viss grad også makrofager, er i stand til å utføre en endocytosering (pinocytosering) av de ekstracellulære proteinene og deretter tilveiebringe dem i sammenheng med MHC klasse I. Det er også tidligere vært vist at ved å bruke spesialiserte administreringsveier, for eksempel ved kobling til jernoksydperler, så er eksogene antigener i stand til å trenge inn i klasse I-veien (Rock, 1996). Denne mekanismen synes å være sentral, på grunn av viktigheten av en samtidig ekspresjon av både klasse I og klasse II på den samme APC, noe som utløser eller frembringer en klynge av tre celletyper. Interaksjonen i denne klyngen av tre celletyper har vært foreslått av Mitchison (1987) og senere av andre forskere. De viste viktigheten av en samtidig presentasjon av klasse I og klasse II-epitoper på

det samme APC. Ifølge en nylig beskrevet mekanisme for CTL-aktivering (kfr. Lanzaveccia, 1998, Nature 393: 413, Matzinger, 199, Nature Med. 5: 616, Ridge et al., 1998, Nature 393: 474, Bennett et al., 1998, Nature 393: 478, Schoenberger et al., 1998, Nature 393: 480, Ossendrop et al., 1998, J. Exp. Med. 187: 693, og Mackey et al., 1998, J. Immunol. 161: 2094), så er profesjonelle APC som presenterer et antigen på MHC klasse II, gjenkjent av T-hjelpeceller. Dette resulterer i en aktivering av APC (styrt eller kontrollert ved en interaksjon ved hjelp av CD40L på T-hjelpecellen og CD40 på APC). Dette gjør det mulig for APC å direkte stimulere CTL-cellene som derved blir aktivert. Krf. også figur 2.

Det er tidligere blitt vist at en innsetting av en fremmed MHC klasse II-begrenset hjelpecelleepitop i et selv-antigen, resulterer i at antigenet blir i stand til å indusere en sterk kryss-reaktiv antistoffreaksjon som er rettet inn mot det ikke-modifiserte selv-antigenet (kfr. søkerens WO 95/05849). Det er også vist at autoantistoffinduksjonen er forårsaket av spesifikk T-cellehjelp indusert ved den innsatte fremmede epitopen.

Foreliggende søkere er imidlertid kommet til den konklusjon at modifiserte selv-antigener - med hjelp av passende tilsetningsstoffer - bør være i stand til også å indusere en sterk CTL-reaksjon mot MHC klasse I-begrensede selv-epitoper, og følgelig at den teknologi som er beskrevet i WO 95/05849 kan tilpasses slik at man får tilveiebragt vaksinasjon mot intracellulære og andre celleassosierte antigener som har epitoper presentert i sammenheng med

MHC klasse I.

Den autovaksineteknologi som er beskrevet i WO 95/05849 har den effekt at spesifikk T-cellehjelp er tilveiebragt til selv-reaktive B-celler, når et modifisert selv-antigen blir administrert for opptak i bearbeidelsesreaksjonsveien for MHC klasse II-antigener (kfr. figur 1 og Dalum I et al., 1996, J. Immunol. 157: 4796-4804 så vel som Dalum I et al.,

1999, Nature Biotechnol. 17: 666-669). Det er vist at mulige selv-reaktive B-lymfocytter gjenkjenner selv-proteiner som fysiologisk er tilstede i normale individer. For at disse B-lymfocyttene skal induseres slik at de virkelig produserer antistoffer som er reaktive med de relevante selv-proteinene, er det imidlertid behov for cytokinproduserende T-hjelpelymfocytter (TH-celler eller TH-lymfocytter). Normalt blir denne hjelpen ikkeltilveiebragt fordi T-lymfocyttene generelt ikke gjenkjenner T-celleepitoper som er avledet fra

selv-proteiner når disse blir tilveiebragt av antigentilveiebringene celler (APC-celler). Ved imidlertid å tilveiebringe et element av »fremmedhet» i et selv-protein (for eksempel ved å introdusere en immunologisk signifikant modifikasjon), så vil de T-celler som gjenkjenner det fremmede elementet bli aktivert når de gjenkjenner den fremmede epitop på en antigenpresenterende celle (så som opprinnelig, en mononukleær celle). Polyklonale B-lymfocytter (som presenterer T-celleepitoper) som er i stand til å gjenkjenne selv-epitoper på de modifisert selv-proteinet, vil også internalisere antigenet og følgelig presentere den eller de fremmede T-celleepitop(er), hvoretter de aktiverte T-lymfocyttene tilveiebringer cytokinhjelp til disse selv-reaktive polyklonale B-lymfocytter. Ettersom antistoffer produsert av disse polyklonale B-lymfocytter er reaktive med forskjellige epitoper på det modifiserte polypeptidet, og heri inngår de som også er tilstede i det opprinnelige polypeptidet, så blir det indusert et antistoff som er kryss-reaktivt med det ikke-modifiserte selv-proteinet. Konklusjonen er at T-lymfocyttene kan ledes til å virke som om populasjonen av polyklonale B-lymfocytter har gjenkjent hele det fremmede antigenet, mens i virkeligheten er bare de eller den innsatte epitop(er) fremmed til verten. På denne måten blir det indusert antistoffer som er i stand til å kryssreagere med ikke-modifiserte celle-antigener.

Som nevnt ovenfor krever også CTL-celler spesifikk T-cellehjelp, skjønt mekanismen for dette ikke er helt ut forstått.

Foreliggende oppfinnelse er basert på den nye teori at selv-proteiner inneholder fremmede MHC klasse II-epitoper, kan etter eksogent opptak, vinne innpass i MHC klasse I-antigenbearbeidingsveien, det vil si makrofage og dendritiske celler. På denne måten kan man få indusert en sterk CTL-reaksjon mot subdominante epitoper i selv-proteinet. Alternativt kan man administrere gener som koder for modifiserte tumorantigener som nukleinsyrevaksiner, noe som eventuelt også vil føre til MHC klasse II såvel som MHC klasse I-styrte immunreaksjoner.

Tumorceller er meget dårlige antigenpresenterende celler, noe som skyldes en utilstrekkelig MHC klasse I-ekspresjon, mangel på sam-stimulerende molekyler eller sekresjon av immunundertrykkende cytokiner etc. Ved å bruke de autovaksinekonstruksjoner og den vaksinasjonsprotokoll som er

beskrevet ovenfor, kan et modifisert tumorantigen bli presentert av MHC klasse I såvel som MHC klasse II-molekyler på profesjonelle antigenpresenterende celler. En sampresentasjon av subdominante selv-epitoper på MHC klasse I og immunodominante fremmede epitoper på MHC klasse II-molekyler, vil styre en direkte cytokinhjelp fra aktiverte MHC klasse II-begrensede T-hjelpeceller til MHC klasse I-begrensede CTL-celler (figur 2). Dette vil etter vår oppfatning føre til et spesifikt brudd med hensyn til T-celleautotoleransen mot tumorantigenet, og dette er nøyaktig hva som er ønskelig i cancer immunoterapi.

Konklusjonen er at en vaksine konstruert ved hjelp av den teknologi som er angitt ovenfor, vil indusere en humoral autoantistoffreaksjon med sekundær aktivering av komplement og antistoffavhengig cellulær cytotoksisk (ADCC) aktivitet. Det er også forventet at en slik fremgangsmåte vil indusere en cytotoksisk T-cellereaksjon rettet mot, for eksempel et tumorspesifikt membranantigen.

Foreliggende oppfinnelse angår således i videste forstand en fremgangsmåte for å indusere en immunreaksjon mot et popypeptidantigen i et dyr, og heri inngår mennesket, og hvor nevnte popypeptidantigen er svakt immunogent eller ikke-immunogent i dyret, og hvor fremgangsmåten innbefatter å tilveiebringe en simultan presentasjon av antigenpresenterende celler (APC-celler) fra dyrets immunsystem i en immunogen effektiv mengde av 1) minst en CTL-epitop avledet fra polypeptidantigenet og/eller minst en B-celleepitop avledet fra det celle-assosierte polypeptidantigenet, og 2) minst en første T-hjelpecelleepitop (TH-epitop) som er fremmed for dyret. I en mer spesifikk variant av foreliggende fremgangsmåte angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for å nedregulere et celleassosiert polypeptidantigen i et dyr, og heri inngår et menneske, og hvor nevnte polypeptidantigen er svakt immunogent eller ikke-immunogent i dyret, ved å indusere en spesifikk cytotoksisk T-lymfocytt (CTL) reaksjon mot celler som bærer det celle-assosierte polypeptidantigenet på sin overflate eller inneholder det celle-assosierte polypeptidantigenet i sin intracelleulære compartment, og hvor fremgangsmåten innbefatter i dyret å tilveiebringe en simultan presentasjon av en egnet antigenpresenterende celle (APC) med 1) minst en CTL-epitop avledet fra det celle-assosierte polypeptidantigenet, og 2) minst en første T-hjelpelymfocytt (TH) epitop som er fremmed for dyret. Den nye strategien for fremstilling av et immunogent middel er også en del av oppfinnelsen. Denne nye strategien innbefatter å foreta en seleksjon og produksjon av analoger av svake celle-assosierte antigener, og hvor det er et mål å bevare en vesentlig del av kjente og forutsigbare CTL-epitoper samtidig som man samtidig innfører minst en fremmed TH-epitop. Oppfinnelsen angår videre visse spesifikke immunogene konstruksjoner basert på kjente tumor-assosierte antigener såvel som blandinger og preparater som inneholder disse konstruksjoner.

Endelig angår oppfinnelsen nukleinsyrefragmenter, vektorer, transformerte celler og andre redskaper som er brukbare i molekylære biologiske metoder og fremgangsmåter for fremstillingen av analogene av de tumor-assosierte antigenene.

Forklaring til figuren

Figur 1: Det tradisjonelle AutoVac-konseptet. A: Tolerodominante selv-epitoper presentert på MHC klasse II på en antigenpresenterende celle (APC) blir oversett på grunn av en svekkelse av T-hjelpecelle (Th) repertoaret (T-hjelpecellen er indikert med stiplede linjer). Innsatte fremmede immunodominante T-celleepitoper presentert på MHC klasse II aktiverer T-hjelpeceller og B-celler (B) som er spesifikke for de opprinnelige delene av det selv-proteinet som presenterer fremmede immunodominante T-celleepitoper på MHC klasse II, blir aktivert av cytokinhjelpen som er tilveiebragt av T-hjelpecellen. Figur 2: AutoVac-konseptet for å indusere en CTL-reaksjon. Innsatte fremmede immunodominante T-celleepitoper presentert på MHC klasse II aktiverer T-hjelpeceller. CTL-cellene gjenkjenner de subdominante selv- epitopene som er presentert på MHC klasse I, og blir derfor aktivert av den tilstøtende aktiverte T-hjelpecellen. Figur 3: En skjematisk presentasjon av Her2 polypeptidet med indikasjonen på de epitopiske områdene og N-glykosyleringssetene. De fire ekstracellulære områdene, transmembran TM-området og de to intracellulære områdene er angitt med indikasjoner på seter med varierende grad av homologi og seter som inneholder formodede/bestemte CTL-epitoper. Figur 4: En skjematisk fremstilling av det humane PSM-polypeptidet med indikasjoner på innsettings områder for P2 og P30-epitopene. Figur 5: FGF-gener og proteiner. A. Exon-intronstruktur i de humane og muse FGF8-genene. Nedenfor er vist de åtte forskjellige spaltede formene (fra Gemel 1996). B: Aminosyresekvensen for de forskjellige FGF8-isoformene. Polypeptidet strekker seg unikt til FGF8b, FGF8f og FGF8e er angitt som fet skrift og som kursiv skrift eller som understrekede sekvenser. FGF8a er den korteste varianten som inneholder ingen av disse fremholdte sekvenser. Signalpeptidet er forventet å bli spaltet C-terminalt til Ala22. De to cysteinresidua som finnes i fullt utviklet FGF8 (alle isoformer) er angitt med tykk understreking. De to mulige N-glykosyleringssetene i FGF8b er angitt ved N. Nummereringen er ifølge FGF8b. Figur 6: Illustrasjoner av fire forskjellige varianter av FGF8b utformet for autovaksinasjon. Øvre del: Teoretiske modeller for innsettingspunktene for epitopene ved å bruke FGF2-krystallstrukturen som templat. Nedre del: Aminosyresekvensen for villtypen av FGF8b (WT) og de fire variantene F30N, F2I, F30I og F2C. Signalpeptidet er markert med en enkel understrekning. De innsatte peptider er markert med dobbelt understrekning. Den N-terminale sekvensen (MetAla) i alle varianter skyldes en utvikling av en Kozak-sekvens (Kozak 1991) for bedre translatering i eukaryotiske systemer.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Definisjoner

I det følgende er det definert og forklart en rekke av de begreper som er brukt i foreliggende beskrivelse og krav for derved å kunne gi en bedre forståelse av oppfinnelsen.

Et »celle-assosiert polypeptidantigen» betyr i foreliggende beskrivelse og etterfølgende krav et polypeptid som er begrenset til en celle som på en eller annen måte er forbundet til en patologisk prosess. Videre vil cellen presentere CTL-epitoper av det polypeptidantigen som er bundet til MHC klasse I-molekyler på sin overflate. Celleassosierte polypeptidantigener kan derfor være virkelige intracellulære antigener (og derved ikke mulig å nå for en humoral immunreaksjon) eller antigener som er bundet til overflaten av cellene. Det celleassosierte antigenet kan være produktet av cellens egen genekspresjon, en intracellulær parasitt, et virus eller en annen celle. I sistnevnte tilfelle vil polypeptidantigenet følgelig være assosiert med den cellen som inngår i den patologiske prosessen.

Begrepene »T-lymfocytt» og »T-celle» vil bli brukt om hverandre for lymfocytter av tymusopprinnelse som er ansvarlig for forskjellige cellestyrte immunreaksjoner såvel som for effektorfunksjoner, så som en hjelpeaktivitet i den humorale immunreaksjonen. På lignende måte vil begrepene »B-lymfocytt» og »B-celle» bli brukt om hverandre for antistoff-produserende lymfocytter.

En »antigenpresenterende celle» (APC) er en celle som presenterer epitoper til T-celler. Typiske antigen-presenterende celler er makrofager, dendritiske celler og andre fagocytiserende og pinocytiserende celler. Det skal bemerkes at B-celler også fungerer som antigenpresenterende celler ved å presentere TH-epitoper bundet til MCH klasse II-molekyler til TH-celler, men den generelle anvendelsen av begrepet APC i foreliggende beskrivelse og krav refererer seg til ovennevnte fagocytiserende og pinocytiserende celler.

»Hjelpe-T-lymfocytter» eller »TH-celler» betegner CD4-positive T-celler som tilveiebringer hjelp til B-celler og cytotoksiske T-celler via gjenkjennelsen av TH-epitoper som er bundet til MHC klasse II-molekyler på antigenpresenterende celler.

Begrepet »cytotoksisk T-lymfocytt» (CTL) vil bli brukt for CD8-positive T-celler som krever assistanse av TH-celler for å bli aktivert.

En »spesifikk» immunreaksjon betegner en polyklonal immunreaksjon som i alt vesentlig er rettet mot et molekyl eller en gruppe av kvasi-identiske molekyler, eller alternativt, mot celler som presenterer CTL-epitoper av molekylet eller gruppen av kvasi-identiske molekyler.

Et »svakt eller ikke-immunogent polypeptidantigen» betegner polypeptider med den samme aminosyresekvensen som i de svake celle-assosierte proteinantigenene som er avledet fra det angjeldende dyr (for eksempel et menneske), men innbefatter også polypeptider hvor aminosyresekvensen er identisk til analoger av slike proteiner isolert fra andre arter. Begrepet innbefatter også former av polypeptider med forskjellige glykosyleringsmønstre, fordi deres produksjon i heterologe systemer (for eksempel gjær eller andre ikke-pattedyreukaryotiske ekspresjonssystemer eller endog prokaryotiske systemer). Det skal imidlertid bemerkes at når begrepet brukes, så er det underforstått at det angjeldende polypeptidet normalt er ikke-immunogent eller bare svakt immunogent i sin naturlige plassering i det dyr som skal behandles.

Begrepet »polypeptid» innbefatter både korte peptider med fra 2 til 10 aminosyresidua, oligopeptider med fra 11 til 100 aminosyreresidua, og polypeptider med mer enn 100 aminosyresidua. Videre innbefatter begrepet også proteiner, det vil si funksjonelle biomolekyler som innbefatter minst ett polypeptid, og når disse innbefatter minst to polypeptider så kan disse være i form av komplekser, som kan være kovalent bundet sammen eller kan være ikke-kovalent bundet sammen. Polypeptidet(ene) i et protein kan være glykosylert og/eller lipidert og/eller kan innbefatte prostetiske grupper.

Med begrepet »subsekvens» forstås enhver følgende strekning på minst 3 aminosyrer, eller når det er relevant, minst 3 nukleotider, avledet direkte fra en naturlig forekommende aminosyresekvens eller nukleinsyresekvens henholdsvis.

Begrepet »dyr» i foreliggende søknad og krav betegner generelt en dyreart (fortrinnsvis et pattedyr), så som Homo sapiens, Canis domesticus etc, men ikke nødvendig bare ett enkelt dyr. Begrepet betegner således også en populasjon av en slik dyreart, ettersom det er viktig at individer som immuniseres ifølge foreliggende fremgangsmåte alle i alt vesentlig har det samme celleassosierte polypeptidantigenet som muliggjør en immunisering av dyrene med sammen immunogen(er). Hvis for eksempel det eksisterer genetiske varianter av polypeptider i forskjellige menneskepopulasjoner, så kan det være nødvendig å bruke forskjellige immunogener på disse forskjellige befolkningsgruppene for derved å kunne bryte autotoleransen mot det svake, celleassosierte polypeptidantigenet i hver befolkningsgruppe. Med begrepet «nedregulering av et celleassosiert polypeptidantigen» forstås her reduksjon i den levende organismen av mengden og/eller aktiviteten for det angjeldende antigenet. Nedregulering kan oppnås ved hjelp av flere forskjellige mekanismer: Den enkleste av disse er et enkelt inngrep i det aktive setet i antigenet ved antistoffbinding. Det ligger imidlertid også innenfor den foreliggende oppfinnelsen at antistoffbindingen resulterer i en fjerning av polypeptidet ved hjelp av renseceller (så som makrofager eller andre fagocytiserende celler), eller endog mer viktig, at cellene som bærer eller inneholder antigenet blir drept av CTL-celler i dyret.

Begrepet «frembringer simultan presentasjon av egnet APC» betegner at dyrets immunsystem underkastes en immunogen utfordring på en kontrollert måte som resulterer i en samtidig presentasjon av de angjeldende epitopene på APC-cellene. Som det vil fremgå av den etterfølgende beskrivelse kan en slik utfordring av immunsystemet utføres på en rekke forskjellige måter, hvorav den viktigste er vaksinasjon med polypeptidholdige »farmasiner» (det vil si en vaksine som blir administrert for å behandle eller å lette en pågående sykdom) eller en nukleinsyre »farmasin» vaksinasjon. Det viktigste er å oppnå at de immunkompetente cellene i dyret blir konfrontert med APC-celler som presenterer de relevante epitopene på en immunologisk effektiv måte.

Begrepet »immunogen effektiv mengde» har sin vanlige betydning, det vil si en mengde av en immunogen som er i stand til å indusere en immunreaksjon som er tilstrekkelig til å engasjere patogene midler som har felles immunologiske trekk med immunogenet.

Ved å bruke uttrykket at de svake celleassosierte polypeptidantigenene er blitt underkastet en «modifikasjon», forstås her en kjemisk modifikasjon av polypeptidet, som utgjør hovedkjeden i det angjeldende polypeptidet. En slik modifikasjon kan for eksempel være en derivatisering (for eksempel alkylering) av visse aminosyreresidua i aminosyresekvensen, men som det vil fremgå av den etterfølgende beskrivelse, så vil foretrukne modifikasjoner innbefatte forandringer av den primære struktur på aminosyresekvensen.

Ved diskusjon av begrepene »toleranse» og »autotoleranse» er det underforstått, at ettersom de polypeptidene som er mål for den foreliggende fremgangsmåten, er selv-proteiner i den befolkningsgruppe som skal vaksineres, eller proteiner som ikke resulterer i en induksjon av en effektiv immunreaksjon, så vil normale individer i befolkningen ikke utvikle en immunreaksjon mot polypeptidet. Det kan imidlertid ikke utelukkes at enkelte individer i en dyrebefolkning eller populasjon kan være i stand til å produsere antistoffer mot det opprinnelige polypeptidantigenet, det vil si som en del av en autoimmunologisk sykdom. I ethvert tilfelle vil et dyr normalt bare være autotolerant mot sitt eget polypeptidantigen, men det kan ikke

utelukkes at analoger avledet fra andre dyrearter eller fra en

befolkningsgruppe med forskjellig fenotype, også kan være tolerert av nevnte dyr.

En »fremmed T-celleepitop» er et peptid som er i stand til å binde seg til et MHC-molekyl og stimulere T-celler i en dyreart. Foretrukne fremmede epitoper er «promiskuøse» epitoper, det vil si epitoper som binder seg til en vesentlig del av MHC klasse II-molekylene i en dyreart eller i en befolkning. Skjønt det bare er kjent et meget begrenset antall slike promiskuøse T-celleepitoper, så vil de bli diskutert i detalj i det etterfølgende. Det skal bemerkes at for at de immunogener som brukes i foreliggende oppfinnelse, skal være effektive i en så stor del som mulig av en dyrepopulasjon, så kan det være nødvendig å 1) innsette flere fremmede T-celleepitoper i den samme analogen, eller 2) fremstille flere analoger hvor hver analog har en forskjellig innsatt promiskuøs epitop. Det skal bemerkes at begrepet fremmede T-celleepitoper også innbefatter bruken av kryptiske T-celleepitoper, det vil si epitoper som er avledet fra et selv-protein, og som bare utøver sin immunogene effekt når de eksisterer i en isolert form uten å være en del av det angjeldende selv-proteinet.

En »fremmed T-hjelpelymfocytteepitop» (fremmed TH-epitop) er en fremmed T-celleepitop som binder et MHC klasse II-molekyl og som kan være presentert eller tilstede på overflaten av en antigenpresenterende celle (APC) som er bundet til MHC klasse II-molekylet.

En »CTL»-epitop er et peptid som er i stand til å binde seg til et MHC klasse I-molekyl.

En «funksjonell del» av et (bio)molekyl betyr i foreliggende sammenheng den delen av molekylet som er ansvarlig for minst en av de biokjemiske eller fysiologiske effekter som utøves av molekylet. Det er velkjent at mange enzymer og andre effektormolekyler har et aktivt sete eller posisjon som er ansvarlig for de effekter som utøves av det angjeldende molekylet. Andre deler av molekylet kan være stabiliserende eller gi bedret løselighet og kan derfor utelates hvis disse formål ikke har relevans i forbindelse med visse

utførelser av den foreliggende oppfinnelse. For eksempel er det mulig å bruke visse cytokiner som en modifiserende gruppe i analogen (se for eksempel detaljert diskusjon i det etterfølgende), og i et slikt tilfelle, vil et krav til stabilitet være irrelevant, ettersom koblingen til analogen gir den nødvendige stabiliteten.

Begrepet »adjuvant» har sin vanlige betydning innenfor vaksineteknologien,

det vil si et stoff eller en blanding som er 1) i seg selv ikke i stand til å frembringe en spesifikk immunreaksjon mot immunogenet i vaksinen, men som er 2) ikke desto mindre i stand til å forbedre immunreaksjonen mot immunogenet. Med andre ord en vaksinasjon med adjuvanten alene gir ikke en immunreaksjon mot immunogenet, og en vaksinasjon med immunogenet kan dels gi og dels ikke gi opphav til en immunreaksjon mot immunogenet, men en kombinert vaksinasjon med immunogen og adjuvant induserer en immunreaksjon mot immunogenet som er sterkere enn det som blir indusert av immunogenet alene.

«Målsøkende» med hensyn til et molekyl i foreliggende sammenheng, betegner den situasjon hvor et molekyl ved innføring i et dyr vil opptre fortrinnsvis i visse typer vev, eller vil fortrinnsvis være assosiert med visse celler eller celletyper. Denne effekten kan oppnås på en rekke forskjellige måter som innbefatter opparbeidelsen av molekylet i en sammenheng eller blanding som letter målsøking, eller ved å innføre molekylet i grupper som letter målsøkingen. Disse begreper vil bli beskrevet mer detaljert i det etterfølgende.

»Stimulering av immunsystemet» betyr at et stoff eller en blanding eller et preparat viser en generell, ikke-spesifikk immunostimulerende effekt. En rekke av adjuvanter og mulige adjuvanter (som for eksempel visse cytokiner) har denne evnen til å stimulere immunsystemet. Resultatet av å bruke et immunostimulerende middel er en forhøyet »beredskap» i immunsystemet, noe som betyr at en simultan eller etterfølgende immunisering med en immunogen induserer en signifikant mer effektiv immunreaksjon sammenlignet med den isolerte anvendelsen av immunogenet.

Foretrukne utførelser

For å indusere en CTL-reaksjon mot en celle som presenterer epitoper avledet fra polypeptidantigenet på sin overflate, er det normalt nødvendig at minst en CTL-epitop, når denne er presentert, er assosiert med et MHC klasse I-molekyl på overflaten av nevnte APC. Videre er det foretrukket at minst en første fremmed TH-epitop, når denne er tilveiebragt eller presentert, er assosiert med et MHC klasse II-molekyl på overflaten av de antigenpresenterende cellene.

Det er foretrukket at de antigenpresenterende celler som tilveiebringer epitopene, er dendritiske celler og makrofager, men enhver pino- eller fagocytiserende antigenpresenterende celle som er i stand til samtidig å presentere 1) CTL-epitoper bundet til MHC klasse I-molekyler og 2) TH-epitoper bundet til MHC klasse II-molekyler, er en foretrukket antigenpresenterende celle ifølge oppfinnelsen.

Ifølge foreliggende oppfinnelse vil det celle-assosierte polypeptidantigenet fortrinnsvis være valgt fra tumor-assosierte antigener og andre selv-proteiner som er relatert til patologiske prosesser, der også virale antigener og antigener avledet fra en intracellulær parasitt eller bakterie kan brukes. Det er velkjent at slike patogen-assosierte antigener ofte er relativt svake immunogener (for eksempel antigener fra mycobakterier så som Mycobacterium tuberculosis og Mycobacterium leprae, men også fra protozoer så som Plasmodium spp.). Det er antatt at fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, bortsett fra at den gjør det mulig å fremstille antistoff og CTL-reaksjoner mot virkelige selv-proteinantigener, også er i stand til å forbedre en ofte utilstrekkelig immunreaksjon som utvikles av organismen mot slike intracellulære antigener.

Normalt vil det være fordelaktig å konfrontere immunsystemet med en stor fraksjon av aminosyresekvensen i det polypeptidantigen som er vaksinemålet. I en foretrukket utførelse er følgelig presentasjonen av den antigenpresenterende cellen på nevnte CTL-epitop og den første fremmede TH-epitop, være frembragt ved å presentere dyrets immunsystem med minst en første analog av det celleassosierte polypeptidantigenet, og hvor denne første analogen innbefatter en variasjon av aminosyresekvensen i det celleassosierte polypeptidantigenet, og hvor nevnte variasjon inneholder minst CTL-epitopen og nevnte første fremmede TH-epitop. Dette står i motsetning til for eksempel en DNA-vaksinasjonsstrategi, hvor CTL og TH-epitopene blir uttrykt av den samme cellen, men som deler av separate polypeptider, og en slik DNA-vaksinasjonsstrategi er også en utførelse av foreliggende oppfinnelse, men det er antatt at å ha to epitoper som del av det samme polypeptidet, vil normalt forbedre immunreaksjonen, og i ethvert tilfelle så vil det bare være nødvendig å tilveiebringe et ekspresjonsprodukt.

For å maksimalisere sjansene for å utvikle en effektiv immunreaksjon, er det foretrukket at ovennevnte første analog inneholder en vesentlig del av kjente og forutsigbare CTL-epitoper av nevnte celle-assosierte polypeptidantigen, det vil si en fraksjon eller en del av de kjente og forutsigbare CTL-epitopene som binder en vesentlig del av MHC klasse I-molekylene i en befolkning. Det er for eksempel foretrukket at en vesentlig del av kjente og forutsigbare CTL-epitoper i aminosyresekvensen i analogen, blir gjenkjent av minst 50% av MHC-I haplotypene som gjenkjenner alle kjente og forutsagte CTL-epitoper i det celleassosierte polypeptidantigenet, men også høyere prosentsatser er foretrukket, så som minst 60, minst 70 og minst 80 og minst 90%. Spesielt foretrukket er anvendelsen av analoger som bevarer i alt vesentlig alle kjente CTL-epitoper i det celleassosierte polypeptidantigenet som er tilstede i analogen, det vil si nær opp til 100% av de kjente CTL-epitopene. Det er følgelig også spesielt foretrukket at i alt vesentlig alle de forutsigbare CTL-epitoper i det celle-assosierte polypeptidantigenet, er tilstede i det minste i den første analogen.

Fremgangsmåter for å forutsi nærværet av CTL-epitoper er velkjente, se for eksempel Rothbard et al., EMBO J. 7: 93-100 (1988).

Det vil fremgå fra den foreliggende beskrivelse og etterfølgende krav at det er forventet at den fremgangsmåte som her er beskrevet, vil gjøre det mulig å effektivt indusere CTL-reaksjoner mot celle-assosierte polypeptidantigener.

I de tilfeller hvor det celle-assosierte polypeptidantigenet er virkelig intracellulært, så vil en induksjon av en CTL-reaksjon mot de celler som inneholder et antigen, være den eneste måten for å oppnå en nedregulering ved hjelp av spesifikke immunologiske fremgangsmåter. I forbindelse med membran-assosierte antigener er det imidlertid fordelaktig å indusere en antistoffreaksjon mot det svake celleassosierte polypeptidantigenet. Når man imidlertid frembringer en humoral immunreaksjon mot et svakt celle-assosiert antigen, er det foretrukket i det alt vesentlige å begrense antistoffreaksjonen til en interaksjon med de deler av antigenet som normalt er eksponert, for en mulig interaksjon med antistoffer. Resultatet ellers ville kunne være en induksjon av en antistoffreaksjon mot deler av antigenet som normalt ikke inngår i det humorale immunsystemet, og dette vil igjen øke risikoen for å indusere en tverr-reaktivitet med antigener som ikke er relatert til en eller flere patologier. En elegant måte for å oppnå denne begrensningen, er å utføre en nukleinsyrevaksinasjon med en analog av det

svake celleassosierte antigenet, og hvor dettes ekstracellulære del enten er uendret eller innbefatter en TH-epitop som i vesentlig grad ikke endrer den tredimensjonale strukturen på antigenets ekstracellulære del. Som et mulig alternativ kan immuniseringen utføres både med et CTL-rettet immunogen og et B-cellerettet immunogen, hvor sistnevnte i det alt vesentlige ikke er i stand til å frembringe en immunisering mot den intracellulære delen av

målantigenet (det B-cellerettede immunogenet kan for eksempel mangle ethvert ikke-ekstracellulært materiale fra antigenet).

Induksjon av antistoffreaksjoner kan oppnås på en rekke måter som er velkjente innenfor genteknologien. For eksempel kan en første analog innbefatte en del som består av en modifikasjon av strukturen i det celleassosierte polypeptidantigenet, og hvor nevnte modifikasjon har som resultat at immuniseringen av dyret med denne første analogen induserer produksjon av antistoffer i dyret mot det celleassosierte polypeptidantigenet, og denne varianten er, som nevnt tidligere, spesielt godt egnet for nukleinsyrevaksinasjon. Alternativt kan fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatte å konfrontere dyrets immunsystem med en immunogen effektiv mengde av minst en annen analog av det celleassosierte polypeptidantigenet, som inneholder en slik modifikasjon. En hensiktsmessig måte å sikre at modifikasjonen har den forønskede antistoff-induserende effekt, er å innbefatte minst en annen fremmed TH-epitop i den andre analogen, det vil si en strategi som ligner på den man anvender for den første analogen.

I tilfeller hvor det er ønskelig også å frembringe en effektiv humoral immunreaksjon, er det fordelaktig at den første og/eller andre analogen innbefatter en vesentlig del av de B-celleepitoper som forefinnes i det celleassosierte polypeptidantigenet, spesielt en vesentlig del av slike B-celleepitoper som er ekstracellulære i den naturlig forekommende form av antigenet i det angjeldende dyr.

De ovenfor angitte variasjoner og modifikasjoner av det svake celle-assosierte polypeptidantigenet kan ha forskjellige former. Det er foretrukket at variasjonen og/eller modifikasjonen innbefatter aminosyresubstitusjon og/eller deletering og/eller innsetting og/eller addering. Disse fundamentale operasjoner angår manipuleringen av en aminosyresekvens som er tenkt å dekke både enkelt-aminosyreforandringer så vel som operasjoner som innbefatter strekninger av aminosyrer (det vil si å ombytte

aminosyrestrekninger inne i polypeptidantigenet; og dette er spesielt interessant når antigenet er et virkelig intracellulært antigen, ettersom man her bare er interessert i bevaring av CTL-epitoper). Det er underforstått at innføringen av for eksempel en enkelt aminosyreinnsetting eller deletering kan resultere i at det opptrer en fremmed TH-epitop i analogens sekvens, det vil si en opptreden eller frembringelse av en MHC klasse Il-molekylbindende sekvens. I de fleste situasjoner er det imidlertid foretrukket (og endog

nødvendig) å innføre en kjent fremmed TH-epitop, og en slik operasjon vil kreve syresubstitusjon og/eller innsetting (og enkelte ganger addering i form av enten konjugering til et bærerprotein eller tilveiebringelse av et kondensert polypeptid ved hjelp av molekylære biologiske metoder). Det er foretrukket at antallet aminosyreinnsettinger, deleteringer (fjerninger), substitusjoner eller adderinger er minst 2, så som 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 og 25 innsettinger, substitusjoner, adderinger, eller deleteringer. Det er videre foretrukket at antall aminosyresubstitusjoner ikke overstiger 150, så som maksimalt 100, mer foretrukket maksimalt 90 og mer foretrukket 80 og maksimalt 70. Det er spesielt foretrukket at antallet substitusjoner, innsettinger, deleteringer og adderinger ikke overstiger 60, mer spesielt bør antallet ikke overstige 50 eller endog 40. Mest foretrukket er det at antallet ikke overstiger 30.

Foretrukne utførelser av oppfinnelsen innbefatter modifikasjon ved å innføre minst en fremmed immunodominant TH-epitop. Det er underforstått at spørsmålet med hensyn til immundominans av en T-celleepitop er avhengig av den angjeldende dyrearten. Slik begrepet brukes her, betyr »immunodominans» ganske enkelt epitoper som er i det vaksinerte individ/befolkning gir opphav til en signifikant immunreaksjon, men det er velkjent at en T-celleepitop som er immunodominant i et individ, ikke nødvendigvis er immunodominant i et annet individ av samme art, selv når det er i stand til å binde MHC-II-molekyler i sistnevnte individ. Virkelige immundominante TH-epitoper er de som uavhengig av polypeptidet hvor de danner en sekvens, gir opphav til aktivering av TH-celler, med andre ord, noen TH-epitoper har som en grunnleggende egenskap at de i det alt vesentlige aldri er kryptiske, ettersom de i det alt vesentlige alltid bearbeides ved hjelp av antigenpresenterende celler og tilveiebringes i sammenheng med et MHC II-molekyl på overflaten av den antigenpresenterende cellen.

Et annet viktig trekk er spørsmålet om MHC-restriksjon av T-celleepitoper. Vanligvis vil naturlig forekommende T-celleepitoper være MHC-begrenset,

det vil si at visse peptider som utgjør en T-celleepitop bare binder seg effektivt til et mindre utvalg av MHC klasse II-molekyler. Dette har så igjen den effekt i de fleste tilfeller at en bruk av en spesifikk T-celleepitop vil resultere i en vaksinekomponent som bare er effektiv for en del av en befolkning, og avhengig av størrelsen på denne delen, kan det være nødvendig å inkludere flere T-celleepitoper i samme molekyl, eller alternativt fremstille en multi-komponentvaksine hvor komponentene er varianter av antigenet som skilles fra hverandre ved den type T-celleepitop som er innført.

Hvis MHC-begrensningen eller restriksjonen av de T-celler som brukes, er fullstendig ukjent (for eksempel i en situasjon hvor det vaksinerte dyret har en dårlig definert MHC-sammensetning), så vil den delen av befolkningen som dekkes av en spesifikk vaksineblanding eller preparat bestemmes ved hjelp av følgende formel

- hvor pj er frekvensen i befolkningen som reagerer på den ith-fremmede T-celleepitop som er tilstede i vaksineblandingen, og n er det totale antall fremmede T-celleepitoper i vaksineblandingen. En vaksineblanding som således inneholder tre fremmede T-celleepitoper har en respons eller reaksjons frekvens i befolkningen på 0,8, 0,7 og 0,6 henholdsvis, gi opphav til - det vil si 97,6% av befolkningen vil statistisk kunne utvikle en MHC-II-styrt reaksjon på vaksinen.

Den ovennevnte formel gjelder ikke situasjoner hvor det er kjent et mindre presist MHC-restriksjonsmønster i de anvendte peptider. Hvis for eksempel et visst peptid bare binder de humane MCH-II-molekyler som er kodet av

HLA-DR-allelene DR1, DR3, DR5 og DR7, så vil bruken av dette peptidet sammen med et annet peptid som binder de gjenværende MHC-II-molekylene som kodes av HLA-DR-alleler, gi en 100% dekning av den angjeldende befolkning. På lignende måte hvis det andre peptidet bare binder DR3 og DR5, så vil en tilsetting av dette peptidet ikke øke dekningen i det hele tatt. Hvis man baserer beregningen av befolkningens reaksjon utelukkende på MHC-restriksjon av T-celleepitoper i vaksinen, så vil den del av befolkningen som dekkes av en spesifikk vaksineblanding, kunne bestemmes ved hjelp av følgende formel: - hvor (pjer summen av frekvensene i befolkningen med alleliske haplotyper som koder MHC-molekyler som binder seg til en av de tilgjengelige T-celleepitoper i vaksinen og som hører til j<th>av de tre.kjente HLA-loci (DP, DR og DQ). I praksis vil man først bestemme hvilke MHC-molekyler som vil gjenkjenne hver T-celleepitop i vaksinen, og deretter sette opp en typeliste (DP, DR og DQ), hvoretter de individuelle frekvenser av de forskjellige angitte alleliske haplotyper summeres for hver type, noe som vil gi<q>>j,<<p>2 og <p3.

Det kan skje at verdien pji formel II, overstiger den tilsvarende teoretiske verdien tz{\

- derUjer summen av frekvenser i befolkningen av en allelisk haplotype som koder for MHC-molekyler som binder den nevnte i<th>T-celleepitop i vaksinen og hører til j<th>av de tre kjente HLA-loci (DP, DR og DQ). Dette betyr at l-7ijav befolkningen har en frekvens av personer som reagerer på vaksinen på fresiduai_i<=>(Pi_ ^/(l -Tt;). Formel III kan derfor justeres slik at den gir formel V: - hvor begrepet l-fresiduai-i er satt lik nu^ h\ds den er negativ. Det skal bemerkes at formel V krever at alle epitoper er haplotype kartlagt mot identiske sett av haplotyper.

Når man derfor velger T-hjelpeepitoper som skal innføres i analogen, så er det viktig å innbefatte all tilgjengelig kjennskap med hensyn til epitopene: 1) Frekvensen av individer i befolkningen som reagerer på hver epitop, 2) MHC-restriksjonsdata, og 3) frekvensen i befolkningen av de relevante haplotypene.

Det eksisterer et visst antall naturlig forekommende «promiskuøse» T-celleepitoper som er aktive i et stort antall individer av en dyreart eller en befolkning, og disse bør fortrinnsvis innføres i vaksinen og derved redusere behovet for tilstedeværelsen av et stort antall forskjellige analoger i samme vaksine.

Den promiskuøse epitop kan ifølge foreliggende oppfinnelse være en naturlig forekommende human T-celleepitop, så som epitoper fra tetanus toxoid (for eksempel P2 og P30-epitopene), difteri toxoid, influensavirus hemaglutinin (HA) og P. falciparum CS antigen.

I løpet av de siste år er det blitt identifisert et stort antall andre promiskuøse T-celleepitoper. Spesielt er det blitt identifisert peptider som er i stand til å binde et stort antall HLA-DR-molekyler som kodes av forskjellige HLA-DR-alleler, og alle disse er mulige T-celleepitoper for innføring i analoger som skal brukes ifølge foreliggende oppfinnelse. Dette gjelder også epitoper som er beskrevet eller diskutert i de følgende referanser som her alle inngår i sin helhet: WO 98/23635 (Frazer IH et al., tilknyttet til The University of Queensland); Southwood S et al., 1998, J. Immunol. 160: 3363-3373; Sinigaglia F et al., 1988, Nature 336: 778-780; Rammensee HG et al., 1995, Immunogenetics 41: 4 178-228; Chicz RM et al., 1993, J. Exp. Med. 178: 27-47; Hammer J et al., 1993, Cell 74: 197-203; og Falk K et al., 1994, Immunogenetics 39: 230-242. Den sistnevnte referansen beskriver også HLA-DQ og -DP-ligander. Alle epitoper som er angitt i disse fem referansene er relevante som mulige naturlige epitoper som kan brukes i foreliggende oppfinnelse, såvel som epitoper som har fellestrekk med disse.

Alternativt kan epitopen være enhver kunstig T-celleepitop som er i stand til å binde et stort antall haplotyper. I denne sammenheng er de pan DR-epitoppeptidene (»PADRE») som er beskrevet i WO 95/07707 og i den tilsvarende tidsskriftartikkelen Alexander et al., 1994, Immunity 1: 751-761 (som her begge inngår som referanser), interessante kandidater for epitoper som kan brukes ifølge foreliggende oppfinnelse. Det skal bemerkes at de mest effektive PADRE-peptider som er beskrevet i disse referansene, bærer D-aminosyrer i C- og N-termini for å bedre stabiliteten ved administrering. Foreliggende oppfinnelse angår imidlertid en inkorporering av relevante epitoper som en del av det modifiserte antigenet som deretter vil brytes ned enzymatisk inne i den lysosomale delen av de antigenpresenterende cellene for derved å få en etterfølgende presentasjon i sammenheng med et MHC-II-molekyl, så er det derfor ikke kritisk å inkorporere D-aminosyrer i de epitoper som brukes i foreliggende oppfinnelse.

Et spesielt foretrukket PADRE-peptid er et som har aminosyresekvensen AKFVAAWTLKAAA eller en immunologisk effektiv sekvens av denne. Denne og andre epitoper med samme mangel på MHC-restriksjon er foretrukne T-celleepitoper som bør være tilstede i de analoger som brukes i foreliggende fremgangsmåte. Slike super-promiskuøse epitoper vil muliggjøre bruken av de mest enkle utførelser av oppfinnelsen hvor bare en enkelt analog er tilstede i det vaksinerte dyrets immunsystem.

De ovenfor angitte variasjoner/modifikasjoner bør fortrinnsvis være slik at

- minst en første gruppe er inkludert i den første og/eller andre analogen, og hvor nevnte første gruppe frembringer en målsøking av analogen til en antigenpresenterende celle (APC), og/eller - minst en annen gruppe er inkludert i den første og/eller andre analogen, og hvor nevnte andre gruppe stimulerer immunsystemet, og/eller - minst en tredje gruppe er inkludert eller inngår i den første og/eller andre analogen, og hvor den tredje gruppen optimaliserer presentasjonen av analogen til immunsystemet.

De funksjonelle og strukturelle trekk som angår disse første, andre og tredje grupper vil bli diskutert i det følgende: De kan være tilstede i form av sidegrupper som kovalent eller ikke-kovalent er bundet til egnede kjemiske grupper i aminosyresekvensen i det celleassosierte polypeptidantigenet eller en sekvens av denne. Dette betyr at strekninger av aminosyreresidua avledet fra polypeptidantigenet blir derivatisert uten at man endrer den primære aminosyresekvensen, eller i det minste uten å innføre forandringer i peptidbindingene mellom de individuelle aminosyrene i kjeden.

Gruppene kan også være i form av såkalte fusjonspartnere til den aminosyresekvens som er avledet fra det celleassosierte polypeptidantigenet. I denne sammenheng skal det nevnes at begge muligheter innbefatter en konjugering av aminosyresekvensen til en bærer, se for eksempel den beskrivelse som er gitt i det etterfølgende. Med andre ord i foreliggende sammenheng betyr begrepet «fusjonsprotein» ikke bare en fusjonskonstruksjon fremstilt ved hjelp av ekspresjon av et DNA-fragment som koder for konstruksjonen, men også et konjugat mellom to proteiner som er forbundet ved hjelp av en peptidbinding i en etterfølgende kjemisk reaksjon.

Som nevnt ovenfor kan analogene også innbefatte innføringen av en første gruppe som målsøker analogen til en antigenpresenterende celler eller en B-lymfocytt. For eksempel kan en første gruppe være en spesifikk bindende partner for et B-lymfocyttspesifikt overflateantigen eller et APC-spesifikt overflateantigen. Mange slike spesifikke overflateantigener er velkjente. For eksempel kan gruppen være et karbohydrat for hvilket det er en reseptor på B-lymfocytten eller den antigenpresenterende cellen (for eksempel mannan eller mannose). Alternativt kan den andre gruppen være et hapten. Et antistoffragment som spesifikt gjenkjenner et overflatemolekyl på en antigenpresenterende celle eller lymfocytt, kan også brukes som en første gruppe (overflatemolekylet kan for eksempel være en FCy-reseptor i makrofager og monocytter, så som FCYRI, eller alternativt enhver annen spesifikk overflatemarkør, så som CD40 eller CTLA-4). Det skal bemerkes at alle disse eksempler på målsøkende molekyler kan brukes som en del av en adjuvant, se for eksempel slik dette er angitt nedenfor. CD40-ligand, antistoffer mot CD40 og varianter av disse som binder CD40, vil målsøke analogen til dendritiske celler. Samtidig har nye resultater vist at

interaksjonen med CD40-molekyler gjør TH-cellene ikke-vesentlige for å frembringe en CTL-reaksjon. Det er derfor antatt at en generell bruk av CD40-bindende molekyler som den første gruppen (eller som adjuvanter, kfr. slik det er angitt nedenfor), vil bedre CTL-reaksjonen i betydelig grad; og i virkeligheten er bruken av slike CD40-bindende molekyler som adjuvanter og »første grupper» i den foreliggende sammenheng, antatt å være en ny

oppfinnelse som sådan.

Som et alternativ til supplement til å målrette analogen til disse celletyper for å oppnå en forbedret immunreaksjon, så er det mulig å øke graden av reaktivitet i immunsystemet ved å inkludere den ovennevnte andre gruppen som stimulerer immunsystemet. Typiske eksempler på slike andre grupper er cytokiner, varmesjokkproteiner og hormoner såvel som effektive deler av disse.

Egnede cytokiner som kan brukes ifølge oppfinnelsen, er de som normalt også fungerer som adjuvanter i en vaksineblanding, for eksempel interferon y (IFN-y), Flt3-ligand (Flt3L), interleukin 1 (IL-1), interleukin 2 (IL-2), interleukin 4(IL-4), interleukin 6 (IL-6), interleukin 12 (IL-12), interleukin 13 (IL-13), interleukin 15 (IL-15) og granulocyt-makrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF); alternativt kan en funksjonell del av cytokinmolekylet være tilstrekkelig som den andre gruppen. Med hensyn til bruken av slike cytokiner som adjuvante stoffer, kfr. den etterfølgende beskrivelse.

Alternativt kan den andre gruppen være et toksin, så som listeriolycin (LLO), lipid A og varmelabilt enterotoksin. Interessante muligheter er også en rekke myobakterielle derivater så som MDP (muramyldipeptid), CF A (komplett Freunds adjuvant) og trehalosediestrene TDM og TDE.

Ifølge foreliggende forbindelse er egnede varmesjokkproteiner som kan brukes som den andre gruppen, for eksempel HSP70, HSC70, GRP94 og calreticulin (CRT).

Muligheten for å innføres en tredje gruppe som bedrer presentasjonen av analogen for immunsystemet, er også et viktig trekk ved foreliggende oppfinnelse. Det er i litteraturen beskrevet flere eksempler på dette prinsippet. Det er for eksempel kjent at palmitoyllipideringsankeret i Borrelia burgdorferi-proteinet OspA kan brukes for å tilveiebringe selv-adjuverende polypeptider (kfr. for eksempel WO 96/40718). Det synes som at de lipiderte proteinene danner en micelle-lignende struktur med en kjerne som består av

lipideringsankerdeler av polypeptidet, mens de gjenværende deler av molekylet stikker ut fra disse, noe som resulterer i en multippel presentasjon av antigene determinanter. Bruken av denne og nærstående fremgangsmåter hvor man anvender forskjellige lipideringsankere (for eksempel en myristylgruppe, en farnesylgruppe, en geranyl-geranylgruppe, et GPI-anker og en N-acyldiglyseridgruppe) er følgelig foretrukne utførelser av oppfinnelsen, ettersom tilveiebringelsen av et slikt lipideringsanker i et rekombinant fremstilt protein, er relativt enkelt å utføre og krever utelukkende bruk av for eksempel en naturlig forekommende signalsekvens som en fusjonspartner for analogen. Andre muligheter er bruken av C3d-fragmentet av komplementfaktoren C3 eller C3 i seg selv (kfr. Dempsey et al., 1996, Science 271, 348-350 og Lou & Kohler, 1998, Nature Biotechnology 16, 458-462).

Det er viktig å bemerke at når man forsøker å bruke den foreliggende fremgangsmåten mot for eksempel membranbundede polypeptidantigener, som er eksponert for det ekstracellulære rom, så er det mest foretrukket at den første og/eller andre analogen i det alt vesentlige har den samme tertiære struktur som det celleassosierte polypeptidantigenet. I foreliggende beskrivelse og etterfølgende krav betyr dette at den totale tertiære struktur på den delen av polypeptidantigenet som er ekstracellulært eksponert, er bevart, ettersom slik det er nevnt ovenfor, så vil den tertiære strukturen for de obligate intracellulære polypeptidene ikke inngå i det humorale immunsystemet. Som en del av vaksinasjonsstrategien så er det faktisk ofte ønskelig å unngå en eksponering av det ekstracellulære rom for mulige B-celleepitoper som er avledet fra den intracellulære delen av polypeptidantigenene, fordi man på denne måten minimaliserer mulige skadelige effekter som måtte være forårsaket av en tverreaktivitet med andre antigener.

For det foreliggende formål så er det imidlertid tilstrekkelig hvis variasjonen/modifikasjonen (enten denne er en innsetting, addering, fjerning eller substitusjon) gir opphav til en fremmed T-celleepitop og på samme tid bevarer en vesentlig del av CTL-epitopene i polypeptidantigenet (og samtidig også et vesentlig antall av B-celleepitopene).

Den følgende formelen beskriver konstruksjoner som generelt dekkes av oppfinnelsen: - hvor (PAGel)-(PAG?xer x CTL og/eller B-celleepitop som inneholder subsekvenser av det relevante polypeptidantigenet som uavhengig av hverandre er identiske eller ikke-identiske, og som kan være med eller uten fremmede sidegrupper, x er et tall som er > 3, nl-nx er x tall > 0 (hvorav minst en > 1), MODrMODxer x modifikasjoner innført mellom bevarte epitoper, og sl-sx er x tall > 0 (minst en > 1 hvis ingen sidegrupper er innført i sekvensen). Gitt de generelle funksjonelle begrensninger med hensyn til konstruksjonens immunogenitet, så muliggjør således oppfinnelsen alle typer permuteringer av den opprinnelige antigensekvensen, og alle typer modifikasjoner i den. Oppfinnelsen innbefatter således analoger oppnådd ved å utelate deler av polypeptidantigensekvensen, som for eksempel utøver skadelige effekter in vivo, eller utelukkelse av deler som normalt er intracellulære og således kunne gi opphav til uønskede monologiske reaksjoner, kfr. de detaljer som er gitt i det etterfølgende.

En videre bearbeiding av det ovennevnte prinsipp innbefatter bruken av CTL og/eller B-celleepitoper fra mer enn ett patologi-relatert antigen. Det er for eksempel flere cancerrelaterte antigener som utøver sine onkogene effekter når de bare er i en mutert form, eksempler er mutert K-ras og P53 som begge er avgjørende proteiner i en normal cellesyklusregulering, og som begge er ekspresjonsprodukter i de fleste normale celler. I enkelte tilfeller har CTL-celler vist seg å gjenkjenne muterte peptider fra disse antigenene. Det er derfor viktig at immunsystemet bare reagerer overfor det muterte peptidet, og ikke på de umuterte delene, hvis det er ønskelig med en antigenspesifikk immunoterapi.

Foreliggende søkere har utviklet en strategi hvor sekvenser på fra 8-25 aminosyrer i slike sykdomsrelaterte proteiner kan brukes som ytterligere epitoper i en AutoVac-konstruksjon, og i foretrukne utførelser vil de innførte epitoper samtidig tilveiebringe en tilsynekomst av TH-epitoper i den endelige konstruksjonen, se for eksempel den diskusjonen som er gitt ovenfor. Epitoper som kan brukes for dette formål vil være de som innbefatter det muterte området i det sykdomsrelaterte proteinet. Ved å bruke en slik

fremgangsmåte vil det være mulig å utvikle CTL-celler (og eventuelt antistoffer når dette er anvendbart) mot bare den muterte formen av det sykdomsrelaterte antigenet. I de tilfeller hvor det sykdomsrelaterte antigenet tilveiebringer en opptreden av en TH-epitop, så vil man fullstendig kunne utelate bruken av en virkelig fremmed TH-epitop. En utførelse av dette prinsippet kan for eksempel være vaksinasjon med en nukleinsyrevaksine som koder en analog av et polypeptidantigen (for eksempel Her2 eller PSM) som er blitt innført i minst en TH-epitop og i minst ett peptid avledet fra et annet sykdomsrelatert antigen (for eksempel et peptid fra den muterte del av et onkogent protein). I en foretrukket utførelse vil minst en TH-epitop bli

innført som en konsekvens av innføringen av peptidet.

Det er videre foretrukket at variasjonen og/eller modifikasjonen innbefatter en duplisering når dette er anvendbart, av minst en B-celleepitop, eller av minst en CTL-epitop i det celleassosierte polypeptidantigenet. Denne strategi vil som resultat gjøre at multiple kopier av foretrukne epitopiske områder blir presentert eller eksponert for immunsystemet, og således maksimere muligheten for en effektiv immunreaksjon. Denne utførelsen av oppfinnelsen anvender således multiple presentasjoner av epitoper avledet fra polypeptidantigenet (for eksempel med formel I hvor minst en B-celleepitop er tilstede i to stillinger).

Denne effekten kan oppnås på forskjellige måter, for eksempel ved ganske enkelt å fremstille fusjonspolypeptider som innbefatter strukturen (PAG)m, hvor m er et tall som > 2, og så innføre de modifikasjoner som heri er beskrevet, i minst en av polypeptidantigensekvensene.

En alternativ utførelse av oppfinnelsen som også resulterer i den foretrukne presentasjonen av multiple (det vil si minst 2) kopier av viktige epitopiske områder av antigenet for immunsystemet, er den kovalente koblingen av antigenet, subsekvenser eller varianter av dette, til visse molekyler. For eksempel kan polymerer brukes, for eksempel karbohydrater så som dekstran, kfr. Lees A et al., 1994, Vaccine 12: 1160-1166; Lees A et al., 1990, J. Immunol. 145: 3594-3600, men brukbare alternativer er også mannose og mannan. Integrale membranproteiner, for eksempel fra E. coli og andre bakterier, er også brukbare konjugeringspartnere. Tradisjonelle bærermolekyler så som keyhole limpet haemocyanin (KLH), tetanus toksoid, difteri toksoid og storfe serum albumin (BSA) er også foretrukket og anvendbare som konjugeringspartnere.

Opprettholdelse av den enkelte ganger fordelaktige vesentlige delen av B-celleepitoper eller endog den totale tertiære struktur for et protein som underkastes en modifikasjon som beskrevet her, kan oppnås på flere måter. En måte er ganske enkelt å fremstille et polyklonalt antiserum rettet inn mot polypeptidantigenet (for eksempel et antiserum fremstilt i en kanin), og deretter bruke dette antiserumet som en testreagens (for eksempel i en konkurrerende ELISA) mot de modifiserte proteiner som blir produsert. Modifiserte versjoner (analoger) som reagerer i samme grad med antiserumet som polypeptidantigenet, må anses å ha den samme generelle tertiære struktur som polypeptidantigenet, mens analoger som viser en begrenset (men dog signifikant og spesifikk) reaktivitet med et slikt antiserum, må anses å ha beholdt en vesentlig del av de opprinnelige B-celleepitopene.

Alternativt kan man fremstille et utvalg av monoklonale antistoffer som er reaktive med distinkte epitoper på polypeptidantigenet, og bruke disse som et prøvepanel. Denne fremgangsmåten har den fordel at det gjør det mulig 1) å utføre en kartlegging av en epitop på det angjeldende polypeptidantigenet, og 2) utføre en kartlegging av de epitopene som er blitt beholdt i de fremstilte analogene.

Selvsagt vil en tredje fremgangsmåte være å oppløse den tredimensjonale strukturen på polypeptidantigenet eller en biologisk aktiv avkuttet del av dette (kfr. ovenfor), og sammenligne dette med den oppløste tredimensjonale strukturen og de fremstilte analoger. En tredimensjonal struktur kan oppløses ved hjelp av røntgendiffraksjonsstudier og NMR-spektroskopi. Ytterligere informasjon som angår den tertiære strukturen kan i visse tilfeller oppnås ved såkalte sirkulære tofargestudier, som har den fordel at de utelukkende krever polypeptidet i ren form (mens røntgendiffraksjonsundersøkelser krever at det er tilveiebragt krystallisert polypeptid, mens NMR krever at det er tilveiebragt isotopvarianter av polypeptidet), for å kunne oppnå brukbar informasjon omkring den tertiære strukturen på et gitt molekyl. Det er imidlertid til slutt nødvendig med røntgendiffraksjon og/eller NMR for å oppnå avgjørende data, ettersom nevnte sirkulære tofargestudier bare kan gi et indirekte bevis på en korrekt tredimensjonal struktur via informasjon om sekundære strukturelementer.

Som konklusjon kan det angis at det for tiden er tre mulige måter for å oppnå en presentasjon av relevante epitoper til immunsystemet: Tradisjonell sub-enhetsvaksinasjon med polypeptidantigener, administrering av en genetisk modifisert levende vaksine og nukleinsyrevaksinasjon. Disse tre mulighetene vil bli diskutert separat i det følgende:

Polypeptidvaksinasion

Dette angjelder administreringen til det angjeldende dyr av en immunogen effektiv mengde av minst en første analog, og når det måtte være relevant, administrering av en immunologisk effektiv mengde av minst en annen analog. Fortrinnsvis er nevnte første og/eller andre analog opparbeidet sammen med en farmasøytisk og immunologisk akseptabel bærer og/eller væske, og eventuelt en adjuvant.

Når analogen presenteres for dyrets immunsystem ved at analogen administreres til dyret, så vil blandingen eller preparatet som inneholder polypeptidet følge de vanlige kjente prinsipper innenfor den farmasøytiske industri.

Fremstilling av vaksiner som inneholder peptidsekvenser som aktive bestanddeler er generelt velkjente innen den farmasøytiske industri, se for eksempel US-patentene 4 608 251; 4 601903; 4 599 231; 4 599 230; 4 596 792 og 4 578 770, som alle her inngår som referanser. Typisk vil slike vaksiner bli fremstilt som injiserbare preparater, enten som flytende løsninger eller suspensjoner; men også faste former kan fremstilles som egnet for oppløsning i eller suspendering i en væske før injeksjon. Preparatet kan også emulgeres. Den aktive immunogene bestanddelen blir ofte blandet med fortyrmingsmidler som er farmasøytisk akseptable og kompatible med den aktive bestanddelen. Egnede fortynningsmidler er for eksempel vann, saltløsning, dekstrose, glyserol, etanol eller lignende eller blandinger av disse. I tillegg kan vaksinen hvis dette er ønskelig, inneholde mindre mengder av tilsetningsstoffer så som fukt- og emulgeringsmidler, pH-buffere eller adjuvanter som bedrer effektiviteten på vaksinene; se den detaljerte diskusjon av adjuvanter i det etterfølgende.

Vaksinene blir hensiktsmessig administrert parenteralt, for eksempel ved injeksjon, enten subkutant, intradermalt, subdermalt eller intramuskulært. Ytterligere preparater og blandinger som er egnet for andre tilførselsveier

innbefatter suppositorier, og i visse tilfeller orale, bukale, sublinguale, intraperitoneale, intravaginale, anale og intrakraniale preparater. For suppositorier kan man bruke tradisjonelle bindemidler og bærere, for eksempel polyalkalenglykoler eller triglyserider; og slike suppositorier kan fremstilles fra blandinger som inneholder den aktive bestanddelen i et variasjonsområde fra 0,5 til 10%, fortrinnsvis 1-2%. Orale preparater innbefatter vanlige anvendte fortynningsmidler, for eksempel farmasøytiske kvaliteter av mannitol, laktose, stivelse, magnesiumstearat, natriumsakkarin, cellulose, magnesiumkarbonat og lignende. Slike preparater eller blandinger kan være i form av løsninger, suspensjoner, tabletter, piller, kapsler,

preparater for en forsinket frigjøring, eller pulvere, og kan inneholde fra 10-95% av den aktive bestanddelen, fortrinnsvis 25-70%. For orale preparater er koleratoksin en interessant bestanddel (og dessuten en mulig" konjugeringspartner).

Polypeptidene kan være tilstede i vaksinen som nøytrale eller som saltformer. Farmasøytisk akseptable salter innbefatter syreaddisjohssalter (dannet med de frie aminogruppene i peptidet) og som er dannet med uorganiske syrer som for eksempel saltsyre eller fosforsyre, eller organiske syrer så som eddiksyre, oksalsyre, tartarsyre, mandelsyre og lignende. Salter dannet med de frie karboksylgruppene kan også være avledet fra uorganiske baser, for eksempel natrium, kalium, ammonium, kalsium eller treverdig jernhydroksyd, foruten organiske baser som isopropylamin, trimetylamin, 2-etylaminoetanol, histidin, prokain og lignende.

Vaksinene blir administrert på en måte som er forenlig med preparatformen, og i en slik mengde slik at vaksinen er terapeutisk effektiv og immunogen. Den mengde som skal administreres er avhengig av den pasient som skal behandles, og innbefatter for eksempel kapasiteten til individets immunsystem til å frembringe en immunreaksjon, og den grad av beskyttelse som er ønskelig. Egnede doseringsområder er av størrelsesorden på flere hundre mikrogram aktiv bestanddel pr. vaksinasjon med et foretrukket område fra ca. 0,1 ug til 2000 fig (og man kan også anvende enda høyere mengder, for eksempel fra 1-10 mg), for eksempel i et område fra 0,5 ug til 1000 ug, fortrinnsvis i området fra 1 |ig til 500 jig og mer spesielt fra ca. 10 \ ig til 100 \ xg. Egnede regimer for den første administrering og senere supplerende vaksiner er også variable, men er typisk ved at det foretas en første administrering fulgt av etterfølgende inokuleringer eller andre administreringer.

Anvendelsesmåten kan variere meget sterkt. Man kan anvende enhver av de vanlige kjente fremgangsmåter for administrering av en vaksine. Dette innbefatter oral administrering i en fast fysiologisk akseptabel base eller i en fysiologisk akseptabel dispersjon, parenteralt, ved injeksjon eller lignende. Dosen av vaksinen vil være avhengig av administrasjonsveien og vil variere etter alderen på den person som skal vaksineres, og opparbeidelsen av antigenet.

Enkelte av polypeptidene i vaksinen er tilstrekkelig immunogene i en vaksine, men for enkelte andre vil immunreaksjonen kunne bedres hvis vaksinen også inneholder et adjuvant stoff. Det er spesielt foretrukket å bruke en adjuvant som er vist å kunne lette nedbrytingen av autoantigenenes autotoleranse.

Det er kjent forskjellige fremgangsmåter for å oppnå en adjuvant effekt i vaksiner. Generelle prinsipper og fremgangsmåter er beskrevet i »The Theory and Practical Application of Adjuvants», 1995, Duncan E.S. Stewart-Tull (ed.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6 og også i »Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants», 1995, Gregoriadis G et al., (eds.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9, som begge her inngår som referanse.

Foretrukne adjuvanter letter opptaket av vaksinemolekylene av de antigenpresenterende celler, så som dendritiske celler, og aktiverer disse. Ikke-begrensende eksempler er valgt fra gruppen bestående av en immunsøkende adjuvant; en immunmodulerende adjuvant så som et toksin, et cytokin og et myobakterielt derivat; et oljepreparat; en polymer; en micelledannende adjuvant; et saponin; en immunostimulerende kompleks matrise (ISCOM-matrise); en partikkel; DDA; aluminiumadjuvanter; DNA-adjuvanter; y-inulin og et innkapslende adjuvant. Det skal bemerkes at de ovenfor angitte detaljer refererer seg til forbindelser og midler som kan brukes som første, andre og tredje grupper i analogene, men refererer seg også mutatis mutandis til deres anvendelse i adjuvanten i en vaksine ifølge foreliggende oppfinnelse.

Anvendelsen av adjuvanter innbefatter bruken av stoffer så som aluminiumhydroksid eller fosfat (alum), som vanligvis brukes som 0,05 til

0,1% løsning i bufret saltløsning, eventuelt blandet med syntetiske polymerer av sukkeret (for eksempel Carbopol®), brukt som en 0,25% løsning,

aggregering av proteinet i vaksinen med varmebehandling ved temperaturer som varierer fra 70 til 101°C i fra 30 sekunder til 2 minutter henholdsvis, foruten at man også kan bruke aggregering ved hjelp av tverrbindende midler. Man kan også utføre aggregeringen ved en reaktivering med pepsinbehandlede antistoffer (Fab-fragmenter) til albumin, blanding med bakterieceller så som C. parvum eller endotoksiner eller lipopolysakkaridkomponentene i gram-negative bakterier, en emulsjon i en fysiologisk akseptabel flytende olje så som mannid mono-oleat (Aracel A) eller som en emulsjon med en 20% løsning av et perfluorkarbon (Fluosol-DA) brukt som en blokkerstatning. Blanding med oljer så som squalen og IFA er også foretrukket.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er DDA

(dimetyldioktadecylammoniumbromid) et interessant tilsetningsstoff for en adjuvant så som DNA og y-inulin, men interessante er også Freunds fullstendige og ufullstendige adjuvanter såvel som quillaja saponiner så som QuilA og QS21. Andre muligheter er monofosforyllipid A (MPL), og de ovennevnte C3 og C3d.

Liposompreparater er også kjent å gi adjuvante effekter, og derfor er liposomadjuvanter foretrukket ifølge oppfinnelsen.

Foretrukne valg ifølge foreliggende oppfinnelse som adjuvanter er også immunostimulerende kompleks av matrisetypen (ISCOM®-matrise), spesielt ettersom det har vist seg at denne type adjuvanter er i stand til å oppregulere MHC klasse II-ekspresjonen av antigenpresenterende celler. En ISCOM®-matrise består av (eventuelt fraksjonert) saponiner (triterpenoider) fra Quillaja saponaria, kolesterol og fosfolipid. Når det resulterende partikkelformede preparatet blandes med det immunogene proteinet, får man hva som er kjent som en ISCOM-partikkel hvor saponinet utgjør fra 60-70 vektprosent, kolesterolet og fosfolipidet fra 10-15 vektprosent og proteinet fra 10-15 vektprosent. Detaljer med hensyn til sammensetning og bruk av immunostimulerende komplekser kan for eksempel finnes i de ovennevnte tekstbøker som angår adjuvanter, men også Morein B et al., 1995, Clinj. Immunother. 3: 461-475 så vel som Barr IG og Mitchell GF, 1996, Immunol. and Cell Biol. 74: 8-25 (som begge her inngår som referanser) beskriver brukbare detaljer for fremstillingen av fullstendige immunostimulerende komplekser.

En annen meget interessant (og således foretrukket) mulighet for å oppnå en adjuvant effekt, er å anvende den teknikk som er beskrevet av Gosselin et al., 1992 (som her inngår som referanse). Kort fortalt kan presentasjonen av et relevant antigen, så som et antigen ifølge foreliggende oppfinnelse, forbedres ved å konjugere antigenet til antistoffer (eller antigenbindende anti sto f fragmenter) mot Fcy-reseptorene på monocyttene/makrofagene. Spesielt har konjugater mellom antigen og anti- FcyRI vist seg å bedre immunogeniteten ved vaksinasjonen.

Andre muligheter innbefatter bruken av målsøkende og immunmodulerende stoffer (for eksempel cytokiner) slik disse er nevnt ovenfor som kandidater for nevnte første og andre grupper i de modifiserte analogene. I denne sammenheng kan man også bruke syntetiske induserende forbindelser av cytokiner, for eksempel poly I:C.

Egnede myobakterielle derivater velges fra gruppen bestående av muramyl dipeptid, fullstendig Freunds adjuvant, RIBI og en diester av trehalose, så som TDM og TDE.

Egnede immunsøkende adjuvanter velges fra gruppen bestående av CD40-ligand og CD40-antistoffer eller dennes spesifikt bindende fragmenter (kfr. den diskusjonen som er angitt ovenfor), mannose, et Fab-fragment og CTLA-4.

Egnede polymeradjuvanter er valgt fra gruppen bestående av et karbohydrat så som dekstran, PEG, stivelse, mannan og mannose; et plastisk polymer og lateks så som lateks »beads».

En annen interessant for å modellere en immunreaksjon er å inkludere immunogenet (eventuelt sammen med adjuvanter og farmasøytisk akseptable bærere og væsker) i en »virtuell lymfekjertel» (VLN) (en beskyttet medisinsk anordning utviklet av ImmunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501). nevnte virtuelle lymfekjertel (en tynn rørformet anordning) etterligner strukturen og funksjonen til en lymfekjertel. Innsetting av en slik anordning under huden skaper et område med en steril inflammasjon med en sterk opphopning av cytokiner og kjemokiner. T- og B-celler såvel som antigenpresenterende celler vil meget raskt reagere på faresignalene, og vil så bevege seg til det inflammerte området og deretter

akkumuleres på innersiden av den porøse matrisen av den virtuelle lymfekj eitelen. Det har vist seg at den antigendose som er nødvendig for å

frembringe en immunreaksjon mot et antigen, er redusert når man bruker en slik kunstig lymfekjertel, og at den immunbeskyttelse som utvikles ved en vaksine ved å bruke en slik kunstig lymfekjertel blir bedre enn vanlig

immunisering ved å bruke RIBI som en adjuvant. Teknologien er blant annet kort beskrevet i Gelber C et al., 1998, »Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node», i : »>From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, 12.-15. oktober 1998, Seascape Resort, Aptos, California».

Nylige oppdagelser har vist at en samadministrering av H2-agonister gjør at naturlige dreperceller og CTL-celler får en bedret overlevelse inne i tumor. En kan således tenke seg å bruke H2-agonister som adjuvanter i de foreliggende fremgangsmåter.

Det er forventet at vaksinen bør administreres minst en gang om året, for eksempel minst 1, 2, 3, 4, 5, 6 og 12 ganger i et år. Mer spesifikt er det forventet fra 1-12 ganger pr. år, så som 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 eller 12 ganger i et år til et individ som har behov for en slik vaksine. Det er tidligere blitt vist at den memorerte immunitet som er indusert ved bruken av foretrukne autovaksiner ifølge foreliggende oppfinnelse, ikke er permanent, og derfor må immunsystemet periodevis eksponeres overfor analogene.

På grunn av genetisk variasjon vil forskjellige individer reagere med immunreaksjoner av varierende styrke overfor det samme polypeptidet. En vaksine ifølge foreliggende oppfinnelse kan derfor innbefatte flere forskjellige polypeptider for å øke immunreaksjonen, kfr. også den beskrivelse som er gitt ovenfor med hensyn til valg av innføring av en fremmed T-celleepitop. Vaksinen kan innbefatte to eller flere polypeptider, og hvor alle polypeptidene er som definert ovenfor.

Vaksinen kan således innbefatte fra 3-20 forskjellige modifiserte eller umodifiserte polypeptider, for eksempel fra 3-10 forskjellige polypeptider. Normalt vil en imidlertid prøve å holde antallet peptider på et minimum, for eksempel 1 eller 2 peptider.

Levende vaksiner

Det andre alternative for å frembringe en presentasjon til immunsystemet er bruken av såkalt levende vaksineteknologi. I levende vaksiner vil presentasjonen til immunsystemet utføres ved at dyret administreres med en ikke-patogen mikroorganisme som er blitt transformert med et nukleinsyrefragment som koder de nødvendige epitopiske områdene eller en fullstendig første og/eller andre analog. Alternativt kan mikroorganismen være transformert med en vektor som inkorporerer et slikt nukleinsyrefragment. Den ikke-patogene mikroorganismen kan være enhver egnet svekket bakteriestamme (svekket ved overføring eller ved å fjerne patogene ekspresjonsprodukter ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi), for eksempel Mycobacterium bovis BCG, ikke-patogene Streptococcus-arter, E. coli, Salmonella-arter, Vibrio cholerae, Shigella etc. Detaljer med hensyn til fremstillingen av moderne levende vaksiner, kan for eksempel finnes i Saliou P, 1995, Rev. Prat. 45: 1492-1496 og Walker PD, 1992, Vaccine 10: 997-990, som begge her inngår som referanser. For detaljer med hensyn til bruken av nukleinsyrefragmenter og vektorer som kan brukes i vaksiner, se den beskrivelse som er gitt i det etterfølgende.

Som for polypeptidvaksinen kan TH-epitopen og/eller den første og/eller den andre og/eller den tredje gruppen, hvis disse er tilstede, være i form av fusjonspartnere til aminosyresekvensen som er avledet fra det celleassosierte polypeptidantigenet.

Som et alternativ til bakterielle levende vaksiner kan det nukleinsyrefragmentet ifølge foreliggende oppfinnelse slik dette er beskrevet i det etterfølgende, inkorporeres i en ikke-virulent viral vaksinevektor. En mulighet er en koppervirus så som vaccinia, MVA (modifisert Vacciniavirus), foruten forskjellige typer fuglekopper. Alternativt kan en anvende en herpes siplex virusvariant.

Normalt vil den ikke-patogene mikroorganismen eller virus bare å administrere dyret en gang, men i enkelte tilfeller kan det være nødvendig å administrere mikroorganismen mer enn en gang i livet.

Også mikroorganismen kan transformeres med nukleinsyre(er) som inneholder områder som koder for nevnte første, andre og/eller tredje gruppe, for eksempel i form av de immunomodellerende stoffer som er beskrevet

ovenfor, for eksempel cytokiner, som kan brukes som adjuvanter. En foretrukket versjon av denne utførelsen innbefatter å ha det kodende området for analogen og det kodende området for immunomodulatoren i forskjellige åpne avlesningsrammer eller i det minste under kontroll av forskjellige promotorer. På denne måten unngår man at analogen eller epitopene fremstilles som fusjonspartnere til immunomodulatoren. Alternativt kan en bruke to distinkte nukleotidfragmenter som transformeringsmidler.

Nukleinsyrevaksinasj on

Som et alternativ til den klassiske administreringen av en peptidbasert vaksine, så gir teknologien med nukleinsyrevaksinasjon (også kjent som »nukleinsyreimmunisering», «genetisk immunisering», »genimmunisering» og »DNA-vaksinasjon»), en rekke tiltrekkende muligheter.

For det første i motsetning til tradisjonelle vaksinemetoder, så krever en nukleinsyrevaksinasjon ingen ressurskrevende produksjon i stor skala av det immunogene middelet (for eksempel i form av fermentering i industriell skala av de mikroorganismer som fremstiller de analoger som er nødvendige i en polypeptidvaksinasjon). Videre er det intet behov for å utvikle fremgangsmåter med hensyn til rensing og utfolding av immunogenet. Og endelig ettersom nukleinsyrevaksinasjon bruker det biokjemiske apparatet i det vaksinerte individet for å fremstille ekspresjonsproduktet fra den innførte nukleinsyren, så er det å forvente at det skjer en optimal posttranslatering av ekspresjonsproduktet; og dette er spesielt viktig i forbindelse med autovaksinasjon, ettersom slik det er beskrevet ovenfor, så bør en signifikant del av de opprinnelige B-celleepitopene bli bevart i analogene som er avledet fra de ekstracellulært eksponerte polypeptidsekvensene, blant annet fordi B-celleepitoper i prinsippet kan være sammensatt av deler fra mange forskjellige typer (bio)molekyler (for eksempel karbohydrat, lipid, protein etc). Den naturlige glykosyleringen og lipideringen av immunogenet kan derfor følgelig være av viktighet for den totale immunogeniteten, og dette sikres best ved at verten produserer immunogenet.

En viktig utførelse av den foreliggende fremgangsmåten er følgelig at presentasjonen utføres ved en in vivo innføring, i den antigenpresenterende cellen, minst ett nukleinsyrefragment som koder og uttrykker minst en CTL-epitop og/eller minst en B-celleepitop, og minst en første fremmed TH-epitop

(et alternativ innbefatter administreringen av minst to distinkte nukleinsyrefragmenter, hvorav det ene koder minst en CTL-epitop mens den andre koder minst en fremmed TH-epitop). Dette utføres fortrinnsvis ved å bruke et nukleinsyrefragment som koder og uttrykker den ovenfor diskuterte første analogen. Hvis den første analogen er utstyrt med de ovenfor detaljert beskrevne TH-epitoper og/eller første og/eller andre og/eller tredje grupper, så vil disse da være tilstede i form av fusjonspartnere til aminosyresekvensen som er avledet fra det celleassosierte polypeptidantigenet, og hvor fusjonskonstruksjonen blir kodet av nukleinsyrefragmentet.

Som i vanlige kjente tradisjonelle vaksinasjonsmetoder, så kan nukleinsyrevaksinasjonen kombineres med en in vivo innføring, i nevnte antigenpresenterende celle, minst ett nukleinsyrefragment som koder og uttrykker den andre analogen. De betraktninger som angitt i første, andre og tredje grupper og TH-epitopene har anvendelse også her.

I denne utførelsen vil den innførte nukleinsyren fortrinnsvis være DNA som kan være i form av ren DNA, DNA opparbeidet med ladede eller uladede lipider, DNA opparbeidet i liposomer, DNA som inngår i en viral vektor, DNA opparbeidet med et transfeksjons-lettende protein eller polypeptid, DNA opparbeidet med et målsøkende protein eller polypeptid, DNA opparbeidet med kalsiumutfellende midler, DNA koblet til et inert bærermolekyl, og DNA opparbeidet med en adjuvant. I denne sammenhengen skal det bemerkes at praktisk talt alle de betraktninger som angår bruken av adjuvanter i tradisjonelle vaksinepreparater, også gjelder for opparbeidingen av DNA-vaksiner. Alle de beskrivelser som her er gjort og som angår bruken av adjuvanter i sammenheng med polypeptidbaserte vaksiner, gjelder følgelig mutatis mutandis også deres bruk i nukleinsyrevaksinasjonsteknologi. Det

samme gjelder for andre betraktninger som angår fremstilling av preparater og måter for administrering, og følgelig vil de betraktninger som er angitt

ovenfor i sammenheng med tradisjonell vaksine også angå mutatis mutandis deres anvendelse i nukleinsyrevaksinasjonsteknologien.

En spesiell type for preparater som inneholder nukleinsyrevaksiner, er mikropartikler som inneholder DNA. Egnede mikropartikler er beskrevet i »0 98/31398.

De eller den nukleinsyre som brukes som et immuniseringsmiddel kan videre

inneholde områder som koder nevnte første, andre og/eller tredje grupper, det vil si være i form av immunomodullerende stoffer slik dette er beskrevet ovenfor, så som de cytokiner som er diskutert ovenfor som brukbare adjuvanter. En foretrukket versjon av denne utførelsen innbefatter å ha det kodende området for analogen og det kodende området for immunomodulatoren i forskjellige åpne avlesningsrammer, eller i det minste under kontroll av forskjellige promotorer. På denne måten er det mulig å unngå at analogen eller epitopen blir fremstilt som fusjonspartner til immunomodulatoren. Alternativt kan man anvende to distinkte nukleotidfragmenter, men dette er mindre foretrukket fordi man da mister fordelen ved en sikret samekspresjon som skjer når begge de kodende områdene inngår i det samme molekylet.

Under normale omstendigheter vil nukleinsyren i vaksinen bli innført i form av en vektor, hvor ekspresjonen er under kontroll av en viral promotor. For mer detaljerte diskusjoner og beskrivelser av vektorer ifølge foreliggende oppfinnelse, så henvises det til den etterfølgende diskusjon. Det er også tilgjengelig forskjellige detaljerte beskrivelser som angår opparbeidelsen av preparater og anvendelse av nukleinsyrevaksiner, se for eksempel Donnelly JJ et al., 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648 og Donnelly JJ et al., 1997, Life Sciences 60: 163-172. Begge disse inngår her som referanser.

En viktig del av foreliggende oppfinnelse angår en ny fremgangsmåte for å velge ut en passende immunogen analog av et celleassosiert polypeptidantigen, som er svakt immunogent eller ikke-immunogent i et dyr, og hvor nevnte immunogene analog er i stand til å indusere en CTL-reaksjon i dyret mot celler som har et MHC klasse I-molekyl bundet til en epitop avledet fra det celleassosierte polypeptidantigenet. Denne fremgangsmåten innbefatter følgende trinn: a) identifikasjon av minst en subsekvens av aminosyresekvensen i det celleassosierte polypeptidantigenet, og hvor nevnte subsekvens ikke

inneholder kjente eller forutsigbare CTL-epitoper,

b) fremstilling av minst en mulig immunogen analog av det celleassosierte polypeptidantigenet ved å innføre i nevnte aminosyresekvens fra det celleassosierte polypeptidantigenet, minst en TH-epitop som er fremmed for dyret, i en stilling som ligger inne i minst en av de subsekvenser som er identifisert i trinn a), og c) velge den eller de analoger som er fremstilt i trinn b) og som verifiserbart er i stand til å indusere en CTL-reaksjon i dyret.

Alternativt kan ovennevnte seleksjonsmetode innbefatte fremstillingen av et nukleinsyrefragment for nukleinsyrevaksinasjonsformål. I en slik situasjon er det nødvendig at det kodede peptidet innbefatter minst en TH-epitop.

Når analogen som er avledet fra et antigen som er eksponert overfor den ekstracellulære fasen, så er det foretrukket at den subsekvens som er identifisert i trinn a), ikke inneholder noen cysteinresidua, eller alternativt, at den TH-epitop som er innført i trinn b), ikke i vesentlig grad endrer mønsteret på tilstedeværende cysteinresidua. Denne fremgangsmåten gjør det lettere å bevare romlige B-celleepitoper i den resulterende konstruksjonen, og som er lik de B-celleepitoper som forefinnes i det svake, celleassosierte

polypeptidantigenet.

På samme måte er det foretrukket at den subsekvens som er identifisert i trinn a), ikke inneholder kjente eller forutsigbare glykosyleringsseter, eller alternativt, at den TH-epitop som er innført i trinn b), ikke i vesentlig grad endrer glykosyleringsmønsteret.

Enkelte av de svake, celle-assosierte polypeptidantigenene utøver uønskede effekter ved å ha en patofysiologisk rolle. Det er ønskelig at disse effekter ikke utøves av vaksinasjonskonstruksj onene, og det er derfor foretrukket at den subsekvens som er identifisert i trinn a), bidrar vesentlig til en patofysiologisk effekt utøvet av det celleassosierte polypeptidantigenet, og at innføringen i trinn b) av den fremmede TH-epitop reduserer eller fjerner nevnte patofysiologiske effekt. Et eksempel på denne fremgangsmåten er å fjerne den aktive posisjonen i et enzym, hormon eller cytokin, og bytte denne ut med nevnte fremmede TH-epitop.

En annen viktig betraktning angår spørsmålet om hvorvidt vaksinens polypeptidprodukt har immunologisk tverreaktivitet med andre selv-proteiner som ikke angår en patologi. En slik tverr-reaktivitet bør unngås, og det er følgelig et viktig trekk ved foreliggende fremgangsmåte at den subsekvens som er identifisert i trinn a), er homolog til en aminosyresekvens i et annet proteinantigen i dyret, og hvor innføringen av nevnte TH-epitop i trinn b), i det alt vesentlige fjerner homologien.

En variant av denne utførelsen er en hvor enhver aminosyresekvens som 1)

ikke normalt er eksponert overfor den ekstracellulære fasen, og 2) som kan utgjøre B-celleepitoper i det svake celle-assosierte polypeptidantigenet, ikke er bevart i analogen. Dette kan oppnås ved å bytte ut slike

aminosyresekvenser med TH-epitoper som ikke utgjør B-celleepitoper, noe som kan skje ved enten fullstendig eller delvis å fjerne disse.

På den annen side er det foretrukket at eventuelle «virkelige» B-celleepitoper i det svake celle-assosierte polypeptidantigenet er bevart i høy grad, og en viktig utførelse av seleksjonsmetoden ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter følgelig at innføringen i trinn b) av den fremmede TH-epitop, resulterer i en bevaring av en vesentlig del av B-celleepitopene i det celleassosierte polypeptidantigenet. Det er spesielt foretrukket at analogen bevarer den totale tertiære struktur i det celleassosierte polypeptidantigenet.

Fremstillingen i trinn b) blir fortrinnsvis utført ved hjelp av molekylærbiologiske metoder, eller metoder som innbefatter fast eller flytende fase peptidsyntese. Kortere peptider blir fortrinnsvis fremstilt ved hjelp av velkjent teknikk innenfor fast eller væskefasebasert peptidsyntese. Nyere utviklinger innenfor denne teknologien har imidlertid gjort det mulig å fremstille polypeptider og proteiner av full lengde ved hjelp av nevnte teknikk, og det ligger derfor innenfor den foreliggende oppfinnelse å fremstille de lange konstruksjonene på syntetisk måte.

Etter å ha identifisert de brukbare analogene ved hjelp av den ovenfor angitte fremgangsmåten, er det nødvendig å fremstille analogen i stor skala. Polypeptidene blir derfor fremstilt ved hjelp av fremgangsmåter som i seg selv er velkjente innen den farmasøytiske industrien.

Dette kan gjøres ved molekylærbiologiske fremgangsmåter som innbefatter et første trinn for fremstillingen av en transformert celle ved at det i denne innføres en vektor, en nukleinsyresekvens som koder en analog, som er valgt ut på passende måte og transformert over i en egnet vertscelle med vektoren. Det neste trinnet er å dyrke den transformerte cellen under betingelser som letter ekspresjonen av det nukleinsyrefragment, som koder analogen av det celleassosierte antigenet, og deretter innvinne analogen fra kulturmediet eller direkte fra cellene, for eksempel i form av et lysat). Alternativt kan analogen fremstilles ved fast eller væskebasert peptidsyntese i stor skala slik det er angitt ovenfor.

Endelig kan produktet, avhengig av den celle som velges som vertscelle eller den syntesemetode som er anvendt, underkastes kunstig post-translaterte modifikasjoner. Disse fremgangsmåtene kan innbefatte forskjellige typer av foldinger ved hjelp av kjente fremgangsmåter, behandling med enzymer (for å oppnå glykosylering eller fjerning av uønskede fusjonspartnere, kjemiske modifikasjoner (igjen er glykosylering en mulighet), og konjugeringer, for eksempel til tradisjonelle bærermolekyler.

Det skal bemerkes at foretrukne analoger ifølge oppfinnelsen (og dette gjelder også relevante analoger som brukes i foreliggende fremgangsmåte), innbefatter modifikasjoner som kan resultere i et polypeptid som har en sekvensidentitet på minst 70% med polypeptidantigenet, eller en subsekvens av dette med en lengde på minst 10 aminosyrer. Høyere sekvensidentiteter er foretrukket, for eksempel minst 75%, eller endog minst 80 eller 85%». Sekvensidentiteten for proteiner og nukleinsyrer kan beregnes som (Nref-Ndif) • 100/Nref, hvor Ndifer det totale antall av ikke-identiske residua når disse blir sammenlignet (alignert), og hvor Nrefer antallet residua i en av sekvensene. DNA-sekvensen AGTCAGTC vil følgelig ha en sekvensidentitet på 75% med sekvensen AATCAATC (Ndif = 2 og Nref=8).

Spesifikke eksempler på mål for fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse

Foretrukne svake, celle-assosierte polypeptidantigener er som beskrevet ovenfor, tumor-assosierte antigener. En ikke-begrensende liste av disse er gitt i den følgende tabell.

I det følgende vil det detaljert bli beskrevet en rekke spesifikke tumor-assosierte antigener.

Prostata-spesifikt membranantigen, PSM

I USA er prostatacancer den nest viktigste årsak til cancerdød (ca. 40 000 pr. år), og 200 000 pasienter blir hvert år diagnostisert med denne type cancer (Boring 1993). Ca. 1 av 11 menn vil eventuelt utvikle prostatacancer. Videre vil fra ca. 40-60% av pasienter med prostatacancer eventuelt utvikle en ekstra prostatisk forlengelse av sykdommen (Babian 1994). Den viktigste strategien ifølge foreliggende oppfinnelse er å bruke en terapeutisk vaksine som supplerende terapi til prostaektomi for å eliminere gjenværende tumorvev og metastaser.

Flere patologiske tilstander er tilstede i prostatakjertelen, og heri inngår godartet vekst (BPH), infeksjon (prostatitt) og neoplasi (prostatacancer).

Den biologiske aggressiviteten til en prostatacancer er sterkt variabel. Hos enkelte pasienter vil en påvist tumor forbli en. latent histologisk tumor og aldri bli klinisk signifikant. I andre pasienter utvikler tumoren seg meget raskt, og det oppstår metastaser og pasienten dør i løpet av et relativt kort tidsrom (2-5 år).

Den vanligste primære behandlingen pr. i dag av prostatacancer er prostataektomi. På grunn av sterk spredning av prostatacancerceller, så vil imidlertid størstedelen av prostatacancerpasientene ikke være helbredet ved lokalt kirurgisk inngrep. Pasienter med en ikke-begrenset sykdom vil eventuelt kunne behandles ved hjelp av systemisk androgen ablasjonsterapi, men den årlige dødsfrekvensen fra prostatacancer har ikke avtatt i løpet av de 50 år hvor androgen ablasjon har vært standard terapi for metastatisk sykdom.

PSM er et membranprotein som er sterkt spesifikt for prostatavev, godartet såvel som ondartet, skjønt en har kunnet påvise ekspresjon av PSM i andre typer vev, så som nyrevev og nyretumor, tynntarm, hjernen og tumorneovaskulatur. Hvis derfor kirurgisk inngrep gir et godt resultat, så skulle cancerpasienter hvor prostata er fjernet i teorien uttrykke PSM i gjenværende ondartet prostatatumorvev eller metastaser som kommer fra denne tumoren. Ved å indusere en sterk CTL-reaksjon og/eller en sterk polyklonal antistoffreaksjon mot PSM, så kan det forventes at gjenværende tumorvev kan elimineres.

Interessant nok har en kunnet observere en oppregulering av PSM-ekspresjon etter androgen-deprivasjonsterapi hos prostatacancerpasienter (Wright 1996).

Dette skulle gjøre en PSM-målsøkende behandling meget egnet som en oppfølging etter tradisjonell androgen-deprivasjonsterapi.

PSM ble først identifisert i 1987 som et resultat av en utvikling av et monoklonalt antistoff, 7E11-C5.3, som var utviklet mot en isolert human prostatacancercelle LNCaP (Horoszewicz 1987). Antistoffet gjenkjente både normalt og ondartet prostataepitel, og ble brukt i 1993 for å rense og bestemme aminosyresekvensen i PSM-proteinet og eventuelt klone genet (Israeli 1993).

PSM er et type II transmembrant glykoprotein med en molekylvekt på 84 kD slik det kan beregnes ut fra nukleinsyresekvensen, mens den "glykosylerte versjonen har en molekylærvekt på fra 1000-120 kD. En sekvensering av det genet som koder PSM har vist et mulig membranovergripende område i forbindelse med tre cytosole argininankerresidua. Den,ekstracellulære delen av PSM uttrykker 707 av de totale 750 aminosyrene i proteinet, mens det cytoplasmiske området er beregnet til å ha en lengde på 19 aminosyrer (Israeli 1993). PSM-spesifikt mRNA er blitt påvist i prostatatumorvev (Israeli 1994), noe som indikerer at tumorantigenet ikke er et avvikende glykosylert protein, noe som for eksempel er tilfellet med Tn- eller Stn-tumorantigenene.

PSM cDNA med full lengde er blitt transfektert inn i og uttrykt i en PSM-negativ human prostatacancercellelinje, PC-3 (Kahn 1994). Videre er den hele lengden (2,65 kilobaser) av cDNA blitt transkribert og translatert in vitro (Kahn 1994).

Det er nylig blitt påvist at PSM har en hydrolytisk aktivitet som ligner på den en finner i N-acetylert a-forbundet sur dipeptidase (NAALADase), og i virkeligheten er det blitt påvist at de to proteinene er identiske. NAALADase er en membran-bundet hydrolase i nervesystemet, og som kataboliserer neuropeptidet N-acetylaspartylglutamat (NAAG) for å påvirke de glutanergiske signalprosessene. Det er pr. i dag ikke kjent hvorvidt denne aktiviteten til PSM har en eventuell relevant biologisk funksjon.

Det er av en viss viktighet å kunne forutsi hvorvidt en kan forvente uønsket kryssreaktivitet med andre proteiner som er tilgjengelige for CTL-celler eller

antistoffer, etter en behandling med en auto vaksine som induserer en PSM-spesifikk immunreaksjon. Det er blitt påvist at en del av det kodende området for PSM-genet (aminosyreposisjonene 418-567) har 54% homologi med den humane transferrinreseptoren (Israeli 1993). En har også som nevnt ovenfor, kunnet påvise en fullstendig sekvensidentitet med NAALADase-enzymet. En har ikke kunnet påvise noen identifikasjon av en funksjonalitet som har relevant likhet med andre kjente peptidaser.

Homologien til transferrinreseptoren er meget lav og vil fortrinnsvis bli brutt opp i enkelte av de foreliggende konstruksjoner. En observerte sekvensidentiteten med human NAALADase er ikke forventet å være et hinder for utvikling av en PSM-vaksine, noe som delvis skyldes at både antistoffene og CTL har lav evne til å trenge gjennom blod-hjernebarrieren. Konklusjonen er at selv med de mest PSM-lignende konstruksjoner så er det ikke forventet at det oppstår prohibitiv kryssreaktivitet med andre proteiner i pasientene.

Fra tidligere undersøkelser er det klart at PSM er uttrykt i de fleste prostatacancerceller og prostataopprinnelige metastaser som er undersøkt. Videre har det vist seg at de fleste andre cancere som har vært testet, så som carcinomer, sarcomer og melanomer av forskjellige typer vev, såvel som et stort utvalg av ikke-prostata humane cancercellelinjer, har vist seg å være PSM-negative.

I tillegg til dette har man funnet at et stort antall andre typer vev har vist seg å være PSM-negative. Disse innbefatter tykktarmen, brystet, lunger, eggstokker, lever, urinblære, livmor, bronkier, milt, pancreas, tunge, svelg, magesekk, tyroidkjertelen, paratyroidkjertelen, binyrene, lymfekjertler, aorta, vena cava, hud, melkekjertler og placenta. RT-PCR har imidlertid påvist en eksistens av PSM mRNA i enkelte av disse vevstyper.

Skjønt PSM i det alt vesentlige er funnet som et membranbundet molekyl i prostatavev, så kan mindre menger PSM også påvirkes i sera fra normale individer og i forhøyede nivåer i prostatacancerpasienter (Rochon 1994, Murphy 1995). Nivået med hensyn til sirkulerende PSM i disse pasientene gjør det derfor mulig å utføre en serologisk måling av effekten på en PSM-vaksine.

Basert på all data som for tiden er tilgjengelig, så er konklusjonen at PSM er et antigen med høy spesifitet for humant prostatavev og svulster som oppstår i denne kjertelen. Dette betyr at for pasienter som har vært underkastet prostataektomi, så vil PSM være et tumorkvasi-spesifikt selv-antigen. En effektiv PSM-vaksine vil derfor med stor sannsynlighet målsøke i alt vesentlig prostatavev eller prostataopprinnelig metastatisk vev.

Det vil fremgå fra eksempel 1 at fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse fortrinnsvis innbefatter at en fremmed TH-celleepitop innføres i en del av den PSM aminosyresekvens som er definert ved sekvensid nr.: 2, posisjonene 16-52 og/eller 87-108 og/eller 210-230 og/eller 269-289 og/eller 298-324 og/eller 442-465 og/eller 488-514 og/eller 598-630 og/eller 643-662 og/eller 672-699. Videre så vil et modifisert PSM-molekyLsom har en fremmed TH-epitop og som er innført i disse stillingene, også være en del av oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse angår således også en analog av humant PSM som er immunogent i mennesker, og hvor nevnte analog innbefatter en vesentlig del av alle kjente og forutsagte CTL og B-celleepitoper i PSM, og innbefatter minst en fremmed TH-epitop slik dette er beskrevet her. Foretrukne PSM-analoger er de hvor minst en fremmed TH-epitop er tilstede som en innsetting i PSM -aminosyresekvensen, eller som en substitusjon av en del av PSM-aminosyresekvensen, eller som et resultat av en deletering av en del av PSM-aminosyresekvensen, og de mest foretrukne analoger av de hvor en fremmed TH-celleepitop er innført i en del av PSM-aminosyresekvensen definert ved sekv.id. nr. 2, posisjonene 16-52 og/eller 87-108 og/eller 210-230 og/eller 269-289 og/eller 298-324 og/eller 442-465 og/eller 488-514 og/eller 598-630 og/eller 643-662 og/eller 672-699.

Humant korionisk gonadotropin (HCG)

Forholdet mellom embryoniske markører og ondartede fenotyper har vært diskutert i mange tiår. En stadig økende datainformasjon antyder at minst en slik markør, nemlig human korionisk gonadotropin beta (hCGP), alltid kan påvises i cancerceller av mange forskjellige histologiske opprinnelser, og at ekspresjonen av dette proteinet ofte er korrelert med økende metastatiske egenskaper. En humoral immunreaksjon rettet inn mot dette løselige proteinet kan redusere sjansene for en tumorspredning og/eller kan eventuelt hemme et tilbakefall etter et kirurgisk inngrep.

Human korionisk gonadotropin hører til en gruppe av glykoproteinhormoner, og heri inngår follikkel-stimulerende hormon (FSM), tyroid-stimulerende hormon (TSH) og luteiniserende hormon (LH), som alle er viktige regulatorer av den reproduktive ekspresjon og fosteroverlevelse. De individuelle forbindelsene i denne gruppen av hormoner er heterodimerer, det vil si at de har en felles a-kjede. (3-kjeden er unik for hvert enkelt hormon og tilveiebringer spesifiteten, og hvor P-kjeden i LH viser den sterkeste sekvenshomologien med hCG|3 (ca. 80%). Den tilsynelatende molekylvekten på hCG-holo er 37 kD, hvorav karbohydratet bidrar med ca. en tredjedel. De post-translatale sukkermodifikasjonene innbefatter både N-forbundet og O-forbundet karbohydrat. Tallrike sialinsyreresidua er tilstede, bg disse gir proteinet en stor negativ ladning. Krystallstrukturen på hCG-holo er blitt løst (Lapthorn et al., 1994).

Basert på krystallstrukturen har en funnet at cHG viser homologi til en gruppe av vekstfaktorer som innbefatter PGDF og TGF[3 (Lapthorn et al., 1994). Dette antyder at hCG-ekspresjonen kan være til hjelp under reguleringen av cancercellevekst.

Human korionisk gonadotropin er et glykoproteinhormon som blir fremstilt av de placentale syncytiotrofoblastene like etter befruktning, og er vesentlige for en vellykket utvikling av svangerskapet.

Den patofysiologiske rollen for embryoniske markører for utvikling og opprettholdelse av en cancermasse er ikke kjent. Det er imidlertid av interesse å kunne bemerke at trofoblaster (hvor disse proteiner normalt blir fremstilt), har både angiogene og invasive egenskaper, og begge disse er også nødvendige egenskaper for en cancercelle. Det er videre blitt foreslått at hCG (eller dets underenheter), kan hemme maternale cellulære immunreaksjoner i fostervev. Således har for eksempel undersøkelser vist at hCG direkte undertrykker T-cellereaksjoner (Jacoby et al., 1984), og det er blitt foreslått at fordi lymfekjertler som tapper (i dette tilfellet) en primær melanomtumor, blir immunoundertrykt, så vil dette i seg selv resultere i et mer gunstig miljø for etablering av metastatiske svulster. Som en konsekvens så vil en ekspresjon av hCGp gjøre at cancercellene sprer seg letter over i sekundære lymfeorganer. Videre som nevnt ovenfor så har en kunnet påvise strukturell homologi mellom hCG og en rekke vekstfaktorer. En annen mulighet er derfor at sekresjonen av hCG av cancercellene kan gi svulsten en vekstfordel.

Ekspresjon av hCGp er blitt påvist i mange forskjellige typer cancer, for eksempel: a) Prostata adenocarcinom: positivitet for hCGp i vevsseksjoner er blitt sett i pasienter med dårlig prognose, uansett den histologiske graden på svulsten (Sheaff et al., 1996), b) forskjellige typer lungecarcinomer; squamøs celle (SQCC), adenocarcinom (AC) og stor celle (LCC), viste alle en høy prosent reaktivitet for hCGp (Boucher et al., 1995), c) pancreasadenocarcinom (Syrigos et al., 1998), d) neuroblastomer, hjernecancer, retinoblastomer (Acevedo et al., 1997), e) ondartet melanom (Doi et al., 1996), f) urinblærecarcinom (Lazar et al., 1995). En nylig publikasjon beskriver en DNA-metode, hvor mus ble immunisert med en hCGP-ekspresjonskonstruksjon (Geissler et al., 1997). I denne in vivo-modellen var inhiberingen av svulstveksten sterkt assosiert med CTL-aktivitet, men det ble også påvist høye titreringsverdier med hensyn til antistoffer (som nøytraliserte den biologiske effekten av intakt hCG på dens cellulære reseptor).

Bruken av hCG som en immunogen er blitt beskrevet i flere publikasjoner som har fokusert på dens anvendelse som en kontraseptiv vaksine (Talwar et al., 1976 og Talwar et al., 1994). Det ble observert høy grad av effekt og sikkerhet i et anti-fertilitetsklinisk forsøk, hvor en brukte en vaksine mot hCG-holo (Talwar et al., 1994). Det er også blitt utført fase I-kliniske forsøk på cancerpasienter med en vaksine mot et syntetisk karboksy-terminalt peptid av hCGp konjugert til difteritoksoid (Triozzi et al., 1994), og fase II-forsøk er for tiden under utvikling. Til tross for det faktum at ideen om å anvende hCGp som et cancervaksinemål har vært kjent i en viss tid, så er den aldri blitt utviklet eller undersøkt i forbindelse med AutoVac-teknologien.

Det er kjent at celler fra ikke-embryonisk vev eller godartet neoplasma ikke uttrykker hCGp. Det skulle derfor ikke være noen mulige sideeffekter ved en vaksinasjon ved hjelp av dette molekylet (bortsett fra effekter i et eventuelt svangerskap). Fordi dette molekylet uttrykkes av så mange forskjellige typer cancere, så har det vært foreslått at det skal betegnes som den «definitive cancerbiomarkør» (Aceveco et al., 1995 og Regelson W., 1995), og skulle derfor være et aktivt mål for videre utvikling.

Egnede dyremodeller for ytterligere studier av effekten av en hCG-basert

vaksine kan finnes i Acevedo et al., Cancer Det. and Prev. Suppl. (1987) 1: 477-486, og i Kellen et al., Cancer Immunol. Immun. Ther. (1982) 13: 2-4.

Her2

Tyrosinkinasereseptorene Her2 og EGFr er antatt å spille en viktig og vesentlig rolle ved en ondartet transformasjon av normale celler og i fortsatt vekst av cancerceller. En overekspresjon er vanligvis forbundet med en meget dårlig prognose. I løpet av de siste år er det publisert en rekke rapporter som angår bruken av antistoffer mot disse reseptorer som terapi i cancer som overuttrykker enten en eller begge disse reseptorer. Genetech Inc. har avsluttet flere kliniske forsøk på brystcancerpasienter med godt resultat ved å bruke et monoklonalt antistoff mot Her2, og har nylig fått myndighetenes godkjennelse i de forente stater for å markedsføre sitt anti-Her2 monoklonale antistoffpreparat, det vil si Herceptin®.

Den autovaksinasjonsteknologi som her er beskrevet og eventuelt anvendt på Her2-molekylet, vil kunne frembringe polyklonale antistoffer som i alt vesentlig grad vil reagere med Her2. Slike antistoffer er forventet å angripe og eliminere tumorceller såvel som å hindre metastatiske celler fra å utvikle seg til metastaser. Effektormekanismen i denne antitumoreffekten vil kunne styres via komplement og antistoffavhengig cellulær cytotoksitet.

Avhengig av valg av konstruksjoner, så vil de induserte antistoffene også kunne hemme cancercellevekst ved en inhibering av vekstfaktoravhengig oligo-dimerisering og internalisering av reseptorene. Enda viktigere er det at Her2-analogene kan forventes å være i stand til å indusere CTL-reaksjoner rettet inn mot kjente og/eller forutsatte Her2-epitoper på tumorcellene.

Her2 er en del av den epidermale vekstfaktorreseptorgruppen (c-erbB), som for tiden består av fire forskjellige reseptorer: c-erbB-1 (EGFr), c-erbB-2 (Her2, c-Neu), c-erbB-3 og c-erbB-4 (Salomon et al., 1995). C-erbB-3 og c-erbB-4 er mindre godtkarakterisertenn EGFr og Her2. Her2 er et integralt glykoprotein. Det fullt utviklede proteinet har en molekylvekt på 185 kD med strukturelle trekk som i sterk grad minner om EGFr-reseptoren (Prigent et al., 1992). EGFr er også en integral membranreseptor som består av en underenhet. Den har en tilsynelatende molekylvekt på 170 kD og består av et overflateligand-bindende område med 621 aminosyrer, et enkelt hydrofobt transmembranområde med 23 aminosyrer og et sterkt bevart cytoplasmisk tyrosinkinaseområde med 542 aminosyrer. Proteinet er N-glykosylert (Prigent et al., 1994).

Alle proteinene i denne gruppen er tyrosinkinaser. Interaksjonen med liganden fører til reseptordimerisering, noe som øker den katalytiske virkningen av tyrosinkinasen (Bernard, 1995, Chantry, 1995). Proteinene i denne gruppen er i stand til homo- og heterodimerisering, noe som er viktig for deres aktivitet. EGFr styrer vekstfremmende effekter og stimulerer opptak i cellene av glukose og aminosyrer (Prigent et al., 1992). Her2 bidrar også med vekstfremmende signaler. Bare EGFr binder EGF og TGF-alfa. Disse ligandene binder seg ikke til andre reseptorer i gruppen (Prigent et al., 1992). En har ikke fullt ut kunnet bestemme ligandene for Her2. Heregulin er imidlertid blitt påvist å indusere fosforylering ved aktivering av Her2. Dette synes ikke å skyldes en direkte binding til reseptoren, men det er antatt at heregulin er en ligand for erbB-3 og erbB-4 som så aktiverer Her2 ved en oligo-dimerisering (Solomon et al., 1995).

Homologien mellom proteinene i EGF-reseptorgruppeh er mest påfallende i tyrosinkinaseområdet i den cytoplasmiske delen av molekylene (82% mellom EGFr og Her2). Homologien er lavere i den ekstracellulære delen - fra 41 til 46%) i forskjellige områder (Prigent et al., 1992).

Den epidermale vekstfaktorreseptoren blir uttrykt i normalt vev i lave mengder, men blir overuttrykt i mange typer cancer. EGFr blir overuttrykt i brystcancer (Earp et al., 1993, Eppenberger, 1994), glioma (Schlegel et al., 1994) , magecancer (Tkunaga et al., 1995), kutant plateepitel carcinom (Fujii, 1995) , eggstokkcancer (van Dam et al., 1994) og andre. Her2 blir også uttrykt i få normale humane vevstyper i lave mengder, mest karakteristisk i sekretorisk epitel. Overekspresjon av Her2 skjer i ca. 30% av cancer i bryst, magesekk, pancreas, urinblæren og eggstokkene.

Ekspresjonen av disse reseptorene varierer avhengig av graden av differensiering på tumorene og cancertypen, for eksempel i brystcancer, hvor de primære tumorer overuttrykker begge reseptorene; mens i magecancer så skjer overekspresjonen bare i et senere trinn av metastatiske tumorer (Salamon et al., 1995). Antallet overuttrykte reseptorer i carcinomceller er større enn IO<6>pr. celle i flere hode og nakkecancere, vulva, bryst og eggstokkcancerlinjer som er isolert fra pasienter (Dean et al., 1994).

Det er flere grunner til at EGFr-gruppen av reseptorer er egnede mål for

tumorimmunoterapi. For første blir de overuttrykt i mange typer cancere, noe som skulle dirigere en immunreaksjon mot tumoren. For det andre så

uttrykker eller overuttrykker tumorene ofte ligandene for denne gruppen av reseptorer, noen er hypersensitive til de formerende effekter som styres av ligandene. For det tredje har pasienter med tumorer som overuttrykker vekstfaktorreseptorer ofte en meget dårlig prognose. Overekspresjonen er nært knyttet til dårlig prognose, spesielt i brystcancer, lungecancer og urinblærecancer (2), og er tilsynelatende assosiert med invasive/metastatiske fenotyper, som ellers er relativt insensitive overfor vanlige terapier (Eccles et al., 1994).

Overekspresjon av Her2 resulterer i enkelte tilfeller av en oppformering av genet, og i andre tilfeller en forøket transkripsjon og translatering. Overekspresjonen av Her2 er forbundet med dårlige prognoser i bryst, eggstokk og magesekkcancer, cancer i urinblæren og muligens også i såkalte non-small cellelungecancere (Solomon et al., .1995).

Det er blitt utført fase I-kliniske forsøk med et bispesifikt antistoff i pasienter med langt utviklet bryst- og eggstokkcancer. Antistoffet var bispesifikt mot Her2 og FcyTI (Weiner et al., 1995). Effektiv oppløsning av tumorceller som overuttrykte Ffer2, ble observert med et bispesifikt antistoff mot Her2 og

CD3 (Zhuet al., 1995).

Behandling av scid-mus som var transplantert med human magesekkcancer med et anti-Her2 monoklonalt antistoff, forlenget levetiden for musene (Ohniski et al., 1995). Anti-tumoraktivitetene for monoklonale antistoffer mot Her2 in vitro og in vivo skyldes ikke en identisk mekanisme, men de kan virke som delvise ligandagonister, de kan endre levetiden for Her2-reseptorer og fosforyleringen eller kan påvirke dimeriseringen (Lupu et al., 1995).

På lignende måte er det blitt vist at antistoffer til EGFr også kan påvirke vekstfaktorinteraksjoner (Baselga et al., 1994, Modjahedi et al., 1993a, Wu et al., 1995, Modjahedi et al., 1993b, Tosi et al., 1995, Dean et al., 1994, Bier et al., 1995, Modjtahedi et al, 1996, Valone, 1995).

En viktig utførelse av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er følgelig en hvor den fremmede T-celleepitop innføres i en del av Her2 aminosyresekvensen slik denne er definert ved aminosyrenummereringen i sekv.id. nr. 3 posisjonene 5-25 og/eller 59-73 og/ellér 103-117 og/eller 149-163 og/eller 210-224 og/eller 250-264 og/eller 325-339 og/eller 369-383 og/eller 465-479 og/eller 579-593 og/eller 632-652 og/eller 653-667 og/eller 661-675 og/eller 695-709 og/eller 710-730, kfr. eksemplene.

Oppfinnelsen angår følgelig også en analog av human Her2 som er immunogen i mennesker, og hvor nevnte analog innbefatter en vesentlig del av alle kjente og forutsagte CTL og B-celleepitoper i Her2 og innbefatter minst en fremmed TH-epitop slik disse er beskrevet her. Det er foretrukket at minst en fremmed TH-epitop er tilstede som en innsetting i Her2 aminosyresekvensen eller som en substitusjon av en del av Her2 aminosyresekvensen, eller som et resultat av en deletering eller fjerning av en del av Her2 aminosyresekvensen. De mest foretrukne analogene er de som er definert ovenfor, det vil si de hvor den fremmede TH-epitop er innført som en del av Her2 aminosyresekvensen definert ved sekv.id. nr. 3 posisjonene 5-25 og/eller 59-73 og/eller 103-117 og/eller 149-163 og/eller 210-224 og/eller

250-264 og/eller 325-339 og/eller 369-383 og/eller 465-479 og/eller 579-593 og/eller 632-652 og/eller 653-667 og/eller 661-675 og/eller 695-709 og/eller 710-730.

FGF8b

Det er ved flere undersøkelser vist at FGF8b kan indusere formering, transformering, differensiering og i enkelte tilfeller i høy grad øke tumorigeniteten på pattedyrceller og vev (Tanaka 1992, Kouhara 1994, Lorenzi 1995, MacArthur 1995a, Crossley 1996a, 1996b, Ghosh 1996, Chuchu 1997a, Rudra-Ganguly 1998). Disse effektene styres primært gjennom bindingen av FGF8b til deler av fibroblastvekstfaktorreseptorene FGFR2, FGFR3 og FGFR4 (MacArthur 1995b, Blunt 1997, Tanaka 1998). Celler som uttrykker en av disse reseptorer og FGF8(b) har således vist seg å tilveiebringe en autokrin vekst-signaliserende kaskade som fører til formering. Den biologiske effekten av FGF8b styres sannsynligvis gjennom JAK/STAT3-reaksjonsveien, ettersom både vi og andre har observert at tilsetting av FGF8b til vekstmediet for visse celler fremmer fosforyleringen av STAT3, et trekk man antar gjør cellene resistente mot apoptose (Catlett-Falcone 1999).

I tillegg til de in vitro observasjoner som er nevnt ovenfor, så er det nylig blitt vist at FGF8(b)-ekspresjonen er signifikant oppregulert i både prostata og brystcancere (Marsh 1999, Dorkin 1999). Man antar derfor at en autovaksine mot FGF8(b) vil være en meget effektiv måte for behandling av en rekke FGF8-uttrykkende tumorer, og kanskje øke deres følsomhet mot apoptoseinduserende midler.

Prostatacancer

Den biologiske aggressiviteten på en prostatacancer er meget variabel. Hos enkelte pasienter kan den påviste tumoren forbli en latent histologisk tumor og aldri bli klinisk signifikant. I andre pasienter vil tumoren utvikle seg raskt, danne metastaser og pasienten vil dø i løpet av et relativt kort tidsrom (2-5 år).

For diagnostiske formål og for å følge reaksjonen med hensyn til terapi ved behandling av prostatacancer, så har en i alt vesentlig brukt bestemmelse av nivået på to sirkulerende proteiner: prostatinsyrefosfatase (PAP) og prostataspesifikt antigen (PSA) (Nguyen 1990, Henttu 1989). På grunn av et sammenbrudd i den normale strukturen i prostatakj eitelen på grunn av cancerutviklingen, vil disse løselige proteinene bli frigjort til sirkulasjon i blodbanen, hvor de kan påvises som markører, blant annet for spredning av metastaser.

Den mest vanlige behandlingen av prostatacancer pr. i dag er prostataektomi. På grunn av ofte sterk spredning av prostatacancerceller, så vil imidlertid de aller fleste prostatacancerpasientene ikke bli helbredet ved lokale kirurgiske inngrep. Pasienter med en ikke-begrenset sykdom vil vanligvis bli behandlet med en systemisk androgen ablasjonsterapi, men antallet årlige dødsfall som skyldes prostatacancer har ikke avtatt i løpet av de 50 år etter at androgen ablasjon ble standard terapi for behandling av metastase i forbindelse med denne type cancer.

RT-PCPv-analyse har vist at FGF8 mRNA blir fremstilt av de humane prostataepiteliske tumorcellelinjene LNCaP, PC-3, ALVA-31 og DU145 henholdsvis, hvor FGF8b er den mest fremtredende isoformen (Tanaka 1995, Ghosh 1996). Veksten av de androgen-responsive LNCaP-cellene blir stimulert ved å tilsette rekombinant FGF8b (Tanaka 1995), mens DU 145-celler kunne hemmes i veksten ved en transfeksjon med vira som uttrykker anti-sense FGF8b (Rudra-Ganguly 1998). Dette sammen med indikasjoner fra utviklingsundersøkelser som er beskrevet i det etterfølgende, indikerer at FGF8b har en rolle ved å opprettholde de cancerlignende tilstandene i disse cellelinjene.

Ved å bruke FGF8a cDNA i in situ hydridiseringseksperimenter, så kunne Leung og medarbeidere vise at en stor andel (80% (n = 106) og 71% (n = 31)) av prostatacancere produserer FGF8 mRNA, og at mengden av FGF8 mRNA er korrelert med utviklingsgraden på tumorene (P < 0,0016 og P < 0,05 henholdsvis) (Leung 1996, Dorkin 1999). Ved å bruke et monoklonalt anti-FGF8b, kunne en vise at denne isoformen var ansvarlig for overekspresjonen av FGF8b (Dorkin 1999). Videre viste det seg at menn med tumorer som uttrykte høye nivåer av FGF8 hadde dårligst overlevelse (P = 0,034), og at FGF8-ekspresjonen vedvarte i androgene uavhengige prostatacancere (Dorkin 1999). Ifølge de data som er publisert av Dorkin og samarbeidere, så kan ekspresjonen av FGF8b i prostatacancer forutsi pasientens overlevelse.

Immunohistokjemisk analyse ved å bruke et monoklonalt antistoff mot FGF8 har påvist proteinet i 93% (n = 43) av humane prostatacancere (Tanaka 1998) . Normalt prostatavev eller godartet prostatahypérplasi produserer bare lave nivåer av FGF8 mRNA, og inneholder ikke påvisbare mengder av FGF8-proteinet (Leung 1996, Yoshimura 1996, Ghosh 1996, Tanaka 1998, Dorkin 1999) .

Disse resultatene indikerer at en autovaksine mot FGF8(b) vil være reaktiv mot prostatatumorvev og således være meget verdifull ved behandlingen av prostatacancer.

Brystcancer

Den for tiden vanligste behandlingen av brystcancer er kirurgisk inngrep. På grunn av en ofte sterk spredning av brystcancerceller, så vil imidlertid et stort antall pasienter med brystcancer ikke bli helbredet ved lokale kirurgiske inngrep. Pasienter med en ikke-begrenset sykdom vil eventuelt bli behandlet ved androgen ablasjons terapi, kjemoterapi eller bestrålingsterapi. Det årlige antall dødsfall som skyldes brystcancer er imidlertid stadig relativt høyt.

FGF8 ble opprinnelig isolert fra en musemelkekjertelcarcinomcellelinje (SC-3), fra hvilken en ekspresjon kunne induseres ved å tilsette androgen til mediet (Nonomura 1990). Proteinet er også kjent for å kunne indusere oppformering av disse såvel som andre pattedyrceller. Nylig er det vist at FGF8b mRNA er tilstede i åtte (n = 8) humane brystcancercellelinjer: 8MDA-MB-231, MDA-MB-415, ZR 75-1, T-47-D, SK-BR-III, PMC-42, HBL-100 og MCF-7) (Tanaka 1995, Payson 1996, Wu 1997, Marsh 1998).

Wnt-1-transgene mus som ble infisert med musemelkekjerteltumorvirus (MMTV) utvikler tumorer i melkekj erti ene. FGF8-transkripsjonen er aktivert i 50% av disse tumorer (MacArthur 1995c, Kapoun 1997).

Transgene mus som er bærere av FGF8b cDNA under kontroll av den meget spesifikke musemelkekjerteltumorvirus (MMTV) promotoren, har vist seg spontant å utvikle FGF8b-uttrykkende melkekjerteltumorer (Coombes, personlig informasjon).

Nye data viser at FGF8(b)-ekspresjonen er oppregulert i brystcancer (Tanaka 1998, Marsh 1999). Tanaka og medarbeidere brukte et nytt monoklonalt FGF8-antistoff i immunohistokjemiske undersøkelser. De viste at FGF8 var tilstede i 67% (n = 12) av brystcancere, og at androgenreseptorer var tilstede i 89% av FGF8-positive brystsykdommer (hyperplasi, fibroadenom, intraduktal papillom og cancere), noe som gjør det mulig for den autokrine vekstfremmende sløyfen å være involvert i progresjonen av brystcancere (Tanaka 1998). Ved å bruke en semi-kvantitativ RT-PCR-metode, så ble det vist at forhøyede nivåer av FGF8 mRNA var tilstede i ondartede sammenlignet med ikke-ondartede brystvev. Signifikant ble det også påvist at mer ondartet vev uttrykte FGF8 (p = 0,019) på et signifikant høyere nivå (p = 0,031) (68 brystcancere og 24 ikke-ondartede brystvev) (Marsh 1999).

Det har for tiden ikke vært mulig å fastslå at FGF8(b) fungerer som en autokrin vekstfaktor. Det faktum imidlertid at et stort antall tumorer overuttrykker FGF8b er et sterkt argument for at en autovaksine mot FGF8b vil være effektiv for behandling av en stor prosent av bryst- og prostatacancere. De data som er angitt av Marsh, Dorkin og Tanaka indikerer at en autovaksine mot FGF8(b) kan bli brukt for behandling av både bryst- og prostatacancer, og de heller vage data som er angitt av Dorking et al., understøtter videre den oppfatning at FGF8 inngår i oppformeringen av humane cancerceller.

Beskrivelse av FGF8b

FGF8 hører til en gruppe av fibroblastvekstfaktorer (FGFs). Disse vekstregulerende proteiner er små, det vil si at de alle har ca. 200

aminosyreresidua, og alle inngår i induksjonen av oppformering og differensiering av en rekke forskjellige celler. For en nylig oversikt over hvorledes fibroblastvekstfaktorer inngår i utviklingen av lemmer hos vertebrater, se Johnson 1997. Enkelte av proteinene i FGF-gruppen er utviklingsmessig nærstående, og har fra 20-50% aminosyresekvensidentitet.

FGF8b er en avspaltningsvariant av FGF8, opprinnelig betegnet som en androgenindusert vekstfaktor (AIGF). AIGF ble først identifisert som et protein som ble utskilt av en musemelkekjertelcarcinomaavledet cellelinje (CD-3) ved stimulering med androgen (Nonomura 1990). Muse-FGF8-genet inneholder 6 exons, noe som muliggjør koding av åtte forskjellige FGF8-isoformer (FGF8a-h), som bare skiller seg i den N-terminale delen av molekylene (Crossley 1995, MacArthur 1995b). Det humane"FGF8 har den samme genstrukturen som musegenet. På grunn av et stoppekodon i exon IB, så kan imidlertid det humane FGF8 muligens eksistere i fire forskjellige isoformer, det vil si FGF8a, FGF8b, FGF8e og FGF8f (Gemel 1996). Genstrukturene og aminosyresekvensene i de fire humane isoformene er vist på figur 5.

Fullt utviklet FGF8b inneholder 193 aminosyreresidua og har en beregnet molekylvekt på 22,5 kDa. Det sterkt basiske proteinet inneholder 21 arginin og 14 lysinresidua, noe som resulterer i et beregnet isoelektrisk punkt på 10,84 og en beregnet positiv ladning på 19,8 ved pH 7,0. Det inneholder to cysteinresidua, og har to mulige N-glykosyleringsseter. På grunn av den type undersøkelser som har vært utført i forbindelse med FGF8b, så kjenner en lite til FGF8b-proteingruppen. Den har imidlertid blitt uttrykt heterologt fra bakterier, renset ved hjelp av en C-terminal heksa-histidintag, og in vitro foldet om igjen til en løselig og biologisk aktiv tilstand (MacArthur 1995a, Blunt 1997).

Biologisk aktivitet for FGF8b

Som nevnt ovenfor, så ble FGF8(b) ført isolert som en faktor som ble frigjort fra en androgenavhengig musemelkekjerteltumorcellelinje, og det er siden blitt vist at dette proteinet kan indusere oppformering av disse celler. De morfologiske forandringene etterligner de som blir indusert ved hjelp av testosteron, som også er kjent for å indusere syntesen av FGF8(b) mRNA (Tanaka 1992). Oppformeringen kan hemmes av FGF8(b)-antisensoligoer (Nonomura 1990, Tanaka 1992 og Yamanishi 1994). Det har i virkeligheten

vist seg at en human prostatacancercellelinje DU 145 kunne veksthemmes ved transfeksjon med vira som uttrykker anti-sens FGF8b (Rudra-Ganguly 1998).

Nye data viser at FGF8b induserer fosforyleringen av STAT3, et protein som man mistenker for være involvert i resistens til apoptose (Catlett-Falcone

1999, Johnston, C.L., upubliserte resultater).

Flere undersøkelser har vist at FGF8b er meget effektivt for å indusere transformasjonen av NIH3T3 eller SC115-celler (Miyashita 1994, Kouhara 1994, Lorenzi 1995, MacArthur 1995a). Ved å bruke rekombinant uttrykte proteiner, har man også kunnet vise at denne induksjonen av morfologiske forandringer er langt mer effektiv med FGF8b enn ved å bruke FGF8a eller FGF8c (MacArthur 1995a, Ghosh 1996). Interessant nok har det vist seg at den N-terminale halvparten av FGF8b-molekylet alene har vist seg å være tilstrekkelig for transformasjon av NIH3T3-celler, og selv et lite FGF8b-spesifikt peptid (QVTVQSSPNFT) kunne gjøre det mulig for cellene å vokse 2-3 ganger lengre enn normalt i 0,1% serum (Rudra-Ganguly 1998). Videre er det vist at NIH3T3-celler stabilt transfektert med en ekspresjonsvektor som koder FGF8b, er meget tumorigen når den intraokulært injiseres i nakne mus (Kouhara 1994, Ghosh 1996).

Det er kjent at FGF8b in vivo kan uttrykkes på visse utviklingsstadier i vertebrater. En oversikt over de biologiske roller som er tillagt FGF8(b), er vist i tabell 1. For oversikter med hensyn til hvorledes FGF8 inngår i vertebratutviklingen, se Goldfarb 1999 og Johnson 1997.

Det er antatt at FGF8(b) styrer sin virkning gjennom binding til fibroblastvekstfaktorreseptorene (FGFR's). Mer spesifikt er det kjent at FGF8b er i stand til å aktivere FGFR2c, FGFR3c, FGFR4c og dessuten også til en viss grad FGFRlc, men ikke FGFlb, -2b eller -3b (MacArthur 1995b, Blunt 1997). I forbindelse med induksjonen av utvekst av ektopiske kyllinglemmer, så er det antatt at FGF10, FGFR2 og FGF8 virker sammen, og at dette er tilstrekkelig for utvekst (Kuwana 1997, Xu 1998).

Disse resultater understøtter hypotesen om at FGF8(b) kan virke på en auto-og parakrin måte, noe som fører til en normal utvekst og mønsterdannelse i flere anatomiske strukturer under vertebratutvikling. Mer viktig har det vist seg at FGF8 »total knock-out»-mus ikke overlever, og at dette mest sannsynlig skyldes en innviklet involvering av proteinet i utviklingen av embryoet.

Homologi til andre proteiner

Det er av stor viktighet å kunne forutsi hvorvidt man kan forvente uønsket kryssreaktivitet med andre proteiner som er tilgjengelige for antistoffene

etter en behandling med en autovaksine, for eksempel en som induserer FGF8b-spesifikke autoantistoffer. På grunn av en høy grad av sekvensidentitet mellom FGF8b og andre FGF8-molekyler, kan man forvente at en autovaksine vil tverreagere med disse proteinene. Dette vil imidlertid sannsynligvis være fordelaktig, ettersom ingen av disse proteinene er angitt å være uttrykt i vev eller i cellelinjer som ikke allerede uttrykker FGF8b.

Aminosyreresiduaene fra 55 til og med 175 i FGF8b, viser en relativt lav, men signifikant grad av sekvensidentitet med de andre FGF-molekylene. Det er vanlig akseptert (og bevist flere ganger) at en signifikant grad av sekvensidentitet mellom to proteinområder også reflekterer en høy grad av likhet med hensyn til tertiære strukturer. Det er derfor forventet at alle forbindelsene i FGF-gruppen er strukturelt like. Den tredimensjonale strukturen på FGF2 er blitt oppløst ved hjelp av krystallstudier, såvel som i løsning (Ago 1991, Zhang 1991, Zhu 1991, Eriksson 1993, Blaber 1996, Moy 1996). FGF2 har en fullstendig ren beta-platestruktur, og innbefatter en firetrådet antiparallell beta-meander som er foldet tre ganger på hverandre. Denne såkalte beta-tønne-strukturen er helt bevart både i interleukin 1, FGF2 (eller basisk FGF) og FGF1 (eller sur FGF). Kjernemagnetisk resonnansanalyse av FGF2 i løsning har vist at den N-terminale del av molekylet danner en relativt fleksibel struktur. Den gjenværende delen av FGF8b (aminosyreresiduaene 1-54 og 176-215), viser bare lav grad av sekvensidentitet med kjente proteiner.

Basert på strukturelle og alignmentdata, er det generelt antatt at den tredimensjonale strukturelle kjernen i andre fibroblastvekstfaktorer er meget lik de en finner i FGF1 og FGF2. Disse strukturelle betraktninger er viktige faktorer med hensyn til utforming av de FGF8b-mutante autovaksinemolekylene.

Videre er det viktig på grunn av den relativt lave graden av sekvensidentitet mellom FGF8 og eventuelle andre forbindelser i FGF-gruppen, at overflaten på FGF8 vil være ganske forskjellig fra den man finner i andre FGF-molekyler, noe som minimaliserer muligheten for tverreaktivitet mellom FGF8b-autovaksineutviklede antistoffer og andre forbindelser i FGF-gruppen. På grunn av den lave graden av homologi med andre proteiner enn de nevnte fibroblastvekstfaktorene, forventer man ikke at en autovaksine mot FGF8b vil tverreagere med andre proteiner.

Det skal imidlertid understrekes at en autovaksine mot FGF8b sannsynligvis vil tverreagere med alle isoformene av FGF8. Dette vil imidlertid sannsynligvis ikke være et problem, ettersom det ikke er forventet at noen av FGF8-isoformene blir uttrykt i særlig grad i en voksen person. Det er endog mulig at denne tverreaksjonen vil være fordelaktig ved behandling av cancer, ettersom det er vist at i det minste noen cancercellelinjer uttrykker andre isoformer i tillegg til FGF8b.

Vevsfordeling av FGF8b

Ideelt så skulle de induserte autoantistoffer og de etterfølgende effektormekanismer såvel som den forventede CTL-reaksjonen som er utvirket av auto vaksinasjonen, bare være rettet inn mot vev som skal elimineres i pasienten. Vevsfordelingen av antigenet som er målet for en autovaksine, er følgelig en meget viktig faktor med hensyn til vaksinens sikkerhet. Den ovennevnte tabellen viser et stort utvalg av vevsfordeling og cellelinjedata med hensyn til FGF8b-ekspresjon. Det fremgår av tabellen at de fleste data som angår vevsfordelingen er frembragt ved å bruke den følsomme RT-PCR-metoden. Dette skyldes at Northern blotting-analyse ikke

påviser eventuelt FGF8b mRNA i normalt vev, bortsett fra i fosternyre. Fra disse sparsomme data er det generelt antatt at ekspresjonen av FGF8b mRNA

hos voksne personer er sterkt begrenset, og således er det å forvente at en autovaksine mot FGF8b ikke vil være reaktivt i normalt vev. På grunn av det faktum at små mengder av FGF8b vil kunne virke sammen i ukjente systemer hos voksne personer, så må vevsfordelingen av proteinet underkastes ytterligere analyse. Det er imidlertid i foreliggende søkers oppfatning ingen indikasjoner på at en autovaksine mot FGF8b vil resultere i alvorlige uønskede effekter hos pasientene.

Effekter av antistoffer mot FGF8b

Hittil har det ikke vært publisert noen forsøk på å behandle prostatacancer ved hjelp av monoklonale antistoffer. Kliniske forsøk med monoklonale antistoffer er imidlertid startet når det gjelder brystcancerterapi.

Antistoffer mot FGF8b vil sannsynligvis blokkere interaksjonen mellom FGF8b og dens reseptorer, og dette vil hemme kryssing av cellemembranen og celleformeringen, og høyst sannsynligvis nedsette bevegeligheten og invaderingsevnen for cancercellene.

Foreliggende oppfinnelse angår således også utførelser av de fremgangsmåter som her er beskrevet, hvor den fremmede T-celleepitop innføres i en del av FGF8b-aminosyresekvensen som definert ved sekv.id. nr. 6 posisjonene 1-54 og/eller 178-215 og/eller 55-58 og/eller 63-68 og/eller 72-76 og/eller 85-91 og/eller 95-102 og/eller 106-111 og/eller 115-120 og/eller 128-134 og/eller 138-144 og/eller 149-154 og/eller 158-162 og/eller 173-177. Det skal bemerkes at det er spesielt foretrukket å ikke innføre variasjoner eller modifikasjoner i posisjonene 26-45 og i den C-terminusgruppen som starter ved aminosyrene 186-215, ettersom disse strekningene viser den laveste homologi med et nylig oppdaget protein, FGF-18, som synes å være uttrykt i en rekke forskjellige ikke-tumorvev.

Oppfinnelsen angår følgelig også en analog av humant/muse FGF8b som er immunogent i mennesker, og hvor nevnte analog innbefatter en vesentlig del av alle kjente og forutsigbare CTL- og B-celleepitoper i FGF8b og innbefatter minst en fremmed TH-epitop som beskrevet her. Det er foretrukket at minst en fremmed TH-epitop er tilstede som en innsetting i FGF8b-aminosyresekvensen eller som en erstatning for en del av FGF8b-aminosyresekvensen eller som et resultat av en fjerning av en del av FGF8b-aminosyresekvensen. Mest foretrukket er det at analogene i denne utførelsen er de hvor den fremmede TH-cellepitop er innført i en del av FGF8b-aminosyresekvensen slik denne er definert ved sekv.id. nr. 6 posisjonene 1-54 og/eller 178-215 og/eller 55-58 og/eller 63-68 og/eller 72-76 og/eller 85-91 og/eller 95-102 og/eller 106-111 og/eller 115-120 og/eller 128-134 og/eller 138-144 og/eller 149-154 og/eller 158-162 og/eller 173-177.

Muciner

Oppfinnelsen angår også fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen hvor man anvender spesifikt modifiserte versjoner av de humane mucinene, da spesielt enhver av MUC-1 til og med MUC-4, fortrinnsvis MUC-1. Analogene har følgende struktur

- hvor TR er en tandemgjentagende enhet avledet fra det naturlig forekommende mucin, P er en fremmed TH-epitop som beskrevet her, S er et inert spacerpeptid med fra 0 til 15 aminosyreresidua, fortrinnsvis mellom 0 og 10 aminosyreresidua, og n er et tall fra 1 til 30, og m er et tall fra 1 til 10, fortrinnsvis fra 3 til 5.

Når man produserer en slik mucinanalog, for eksempel i en human cellelinje eller ved rensing fra et vev, så vil det direkte resultatet normalt ikke ha et ønskelig glykosyleringsmønster, det vil si et avvikende glykosyleringsmønster som ligner det man finner i et tumoravledet mucin. Det er imidlertid mulig å fremstille analogen rekombinant, for eksempel i E. coli eller ved hjelp av syntesemetoder, og deretter glykosylere produktet enzymatisk slik at man oppnår et Tn eller S-Tn glykosyleringsmønster som er spesifikt for MUC-1 som er uttrykt på tumorer. Alternativt kan polypeptidet fremstilles i en pattedyrcellelinje eller en insektcellelinje, for eksempel Drosophila celler, som mangler det relevante enzym eller ved å uttrykke proteinet intracellulært (ved å utelate et sekresjonssignalpeptid) hvor det ikke skjer noen glykosylering.

Nukleinsyrefragmenter og vektorer ifølge oppfinnelsen

Det vil fremgå av det som er beskrevet ovenfor, at analogene kan fremstilles ved hjelp av rekombinant genteknologi, men også ved hjelp av kjemisk syntese eller semisyntese, og de to sistnevnte mulighetene er spesielt relevante når modifikasjonen innbefatter en kobling til proteinbærere (så som KLH, difteritoksoid, tetanustoksoid og BSA), og ikke-proteinaktige molekyler så som karbohydratpolymerer, og selvsagt også når modifikasjonen innbefatter en addering av sidekjeder eller sidegrupper til en polypeptidavledet peptidkjede.

I forbindelse med rekombinant genteknologi og selvsagt også i forbindelse med nukleinsyreimmunisering, så er nukleinsyrefragmenter som koder de nødvendige epitopeområdene og analogene meget viktige kjemiske produkter. En viktig del av oppfinnelsen angår således et nukleinsyrefragment som koder en analog som beskrevet ovenfor av enhver av de relevante tumorspesifikke polypeptidene, fortrinnsvis et polypeptid hvor det er innført en fremmed TH-celleepitop ved hjelp av innsetting og/eller addering, fortrinnsvis ved hjelp av substitusjon og/eller deletering. Nukleinsyrefragmentene ifølge foreliggende oppfinnelse er enten DNA eller RNA-fragmenter.

Nukleinsyrefragmentene ifølge foreliggende oppfinnelse vil normalt være innsatt i egnede vektorer for å danne klonings- eller ekspresjonsvektorer som bærer nukleinsyrefragmentene ifølge oppfinnelsen; og slike nye vektorer er også en del av oppfinnelsen. Detaljer med hensyn til konstruksjonen av disse vektorer ifølge oppfinnelsen vil bli beskrevet nedenfor i sammenheng med transformerte celler og mikroorganismer. Vektorene kan, avhengig av formål og type anvendelse, være i form av plasmider, fager, kosmider, mini-kromosomer eller virus, men også nakent DNA som bare uttrykkes midlertidig i visse celler er også en viktig vektor. Foretrukne klonings- og ekspresjonsvektorer ifølge foreliggende oppfinnelse er i stand til en autonom replikasjon, noe som gjør det mulig å oppnå et høyt kopitall for det formål å oppnå ekspresjon og replikasjon på et høyt nivå ved en etterfølgende kloning.

Den generelle sammensetningen på en vektor ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter de følgende karaktertrekk i 5'-3'-retningen og i en opererbar

binding: En promotor for å drive ekspresjonen av nukleinsyrefragmentet ifølge foreliggende oppfinnelse, eventuelt en nukleinsyresekvens som koder

et lederpeptid som gjør det mulig for polypeptidfragmentet enten å bli utskilt av eller integrert i membranen, nukleinsyrefragmentet ifølge foreliggende oppfinnelse, og en nukleinsyresekvens som koder en terminator. Når man anvender ekspresjonsvektorer i produserende stammer eller cellelinjer for å oppnå genetisk stabilitet i den transformerte cellen, så er det foretrukket at vektoren når denne innføres i en vertscelle, blir integrert i vertscellens genom. I motsetning til dette når man anvender vektorer som skal brukes for å frembringe en in vivo ekspresjon i et dyr (for eksempel når man bruker vektoren i DNA-vaksinasjon), så er det av sikkerhetsgrunner foretrukket at vektoren ikke er i stand til å bli integrert i vertscellens genom, typisk vil man da bruke nakent DNA eller ikke-integrerende viralvektorer, og valg av disse er velkjente for personer som arbeider innenfor det molekylærbiologiske

området.

Vektorene ifølge oppfinnelsen brukes for å transformere vertsceller for derved å produsere analogen ifølge oppfinnelsen. Slike transformerte celler som også er en del av oppfinnelsen, kan være dyrkede celler eller cellelinjer som brukes for en oppformering av nukleinsyrefragmentene og vektorene ifølge oppfinnelsen, eller kan brukes for en rekombinant produksjon av analogene ifølge oppfinnelsen. Alternativt kan de transformerte cellene egnet være levende vaksinestammer hvor nukleinsyrefragmentet (bare en enkelt eller flere kopier) er blitt innsatt slik at en frembringer en sekresjon eller integrering av analogen i bakteriemembranen eller celleveggen.

Foretrukne transformerte celler ifølge oppfinnelsen er mikroorganismer så som bakterier (da spesielt arter av Escherichia (for eksempel E. coli), Bacillus (for eksempel Bacillus subtilis), Salmonella eller Mycobacterium (fortrinnsvis ikke-patogen, for eksempel M. bovis (BCG)), gjær (så som Saccharomyces cerevisiae), og protozoer. Alternativt kan de transformerte cellene være avledet fra flercellede organismer så som en sopp, en insektcelle, en plantecelle eller en pattedyrcelle. Mest foretrukket er det at cellene er avledet fra et menneske, kfr. den diskusjon og beskrivelse av cellelinjer og vektorer som er gitt i det etterfølgende.

For det formål å oppnå en kloning og/eller en optimal ekspresjon, så er det foretrukket at den transformerte cellen er i stand til å replikere eller kopiere nukleinsyrefragmentet ifølge oppfinnelsen. Celler som uttrykker nukleinsyrefragmentet er foretrukket som brukbare utførelser av oppfinnelsen, og de kan brukes for fremstilling av analogen i liten eller stor skala, eller i forbindelse med ikke-patogene bakterier, som vaksinebestanddeler i en levende vaksine.

Når en ønsker å fremstille analogen ifølge oppfinnelsen ved hjelp av transformerte celler, så er det hensiktsmessig, skjønt ikke vesentlig, at ekspresjonsproduktet enten sendes ut i dyrkningsmediet eller bæres på overflaten av den transformerte cellen.

Når en effektiv produserende celle er blitt identifisert så er det foretrukket på basis av denne, å etablere en stabil cellelinje som bærer vektoren ifølge oppfinnelsen, og som uttrykker det nukleinsyrefragment som koder analogen. Det er foretrukket at denne stabile cellelinjen skiller ut eller bærer analogen ifølge oppfinnelsen, noe som vil lette rensingen av denne.

Generelt vil plasmidvektorer som inneholder replikon og kontrollsekvenser som er avledet fra arter som er forenlige med vertscellen, bli brukt i forbindelse med vertene. Vektoren vil vanligvis ha et replikasjonssete, såvel som markørsekvenser som er i stand til å tilveiebringe fenotypisk seleksjon i de transformerte cellene. For eksempel blir E. coli typisk transformert ved å bruke pBR322, et plasmid avledet fra en E. coli-stamme (se for eksempel Bolivar et al., 1977). pBR322-plasmidet inneholder gener for ampicillin og tetrasyklinresistens, noe som gjør det lett å identifisere de transformerte cellene. pPR-plasmidet eller annet mikrobielt plasmid eller fag må også innehold, eller bli modifisert slik at det inneholder, promotorer som kan brukes for ekspresjon av den prokaryotiske mikroorganismen.

De promotorer som mest vanligvis brukes i rekombinant DNA-konstruksjon innbefatter B-laktamasen (penicillinase) og laktosepromotorsystemer (Chang et al., 1978; Itakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979) og et tryptofan (trp) promotorsystem (Goeddel et al., 1979; EP-A-0 036 776). Skjønt disse er de mest vanlig brukte, så er også andre mikrobielle promotorer blitt oppdaget og anvendt, og detaljer med hensyn til deres nukleotidsekvenser er blitt publisert, noe som gjør det mulig for en fagperson å ligere dem funksjonelt med plasmidvektorer (Siebwenlist et al., 1980). Visse gener fra prokaryoter kan uttrykkes effektivt i E. coli fra sine egne promotorsekvenser, noe som ikke gjør det nødvendig å tilsette en annen promotor på kunstig måte.

I tillegg til prokaryoter så kan også eukaryotiske mikrober, så som gjærkulturer brukes, og her må også promotoren være i stand til å drive ekspresjonen. Saccharomyces cerevisiase eller vanlig bakegjær, er mest vanlig brukt blant eukaryotiske mikroorganismer, skjønt også en rekke andre arter er vanlig tilgjengelig, så som Pichia pastoris. For ekspresjon i Saccharomyces så er det vanlig å bruke plasmidet YRp7 (Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980). Dette plasmidet inneholder allerede trpl-genet som gir en seleksjonsmarkør for en mutant gjærstamme som mangler evnen til å vokse i tryptofan, for eksempel ATCC nr. 44076 eller PEP4-1 (Jones, 1977). Nærværet av trpl-lesjonen er en karakteristisk egenskap for gjærvertscellegenomet som derved gir et effektivt miljø eller en måte for å påvise transformasjon ved vekst i fravær av tryptofan.

Egnede promotersekvenser i gjærvektorer innbefatter promotorer for 3-fosfoglyseratkinase (Hitzman et al., 1980) eller andre glykolytiske enzymer (Hess et al., 1968; Holland et al., 1978), så som enolase, glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenase, heksokinase, pyruvatdekarboksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfatisomerase, 3-fosfoglyseratmutase, pyruvatkinase, triosefosfatisomerase, fosfoglykoseisomerase og glykokinase. Ved konstruksjonen av egnede ekspresjonsplasmider, så blir de avsluttende sekvenser som er assosiert med disse genene, også ligert inn i ekspresjonsvektoren, 3' av den sekvensen det er ønskelig å få uttrykt, for derved å tilveiebringe polyadenylering av mRNA og en avslutning.

Andre promotorer som har den ytterligere fordel at transkripsjonen er kontrollert av vekstbetingelsene, er promotorområdet for alkoholdehydrogenase 2, isocytokrom C, syrefosfatase, degraderte enzymer assosiert med nitrogenmetabolismen, og den forannevnte glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenasen og enzymer som er ansvarlige for utnyttelse av maltose og galaktose. Enhver plasmid vektor som inneholder en gjærkompatibel motor, replikasjonsopprinnelse og termineringssekvenser er egnet.

I tillegg til mikroorganismer så kan også kulturer av celler avledet fra flercellede organismer brukes som verter. I prinsippet kan enhver slik cellekultur brukes, enten fra vertebrat eller invertebrat kultur. Det har imidlertid vært størst interesse for vertebratceller og oppformering av slike celler i kultur (vevskultur), noe som er blitt en ren rutine i de senere år (Tissue Culture, 1973). Eksempler på slike brukbare vertscellelinjer er VERO og HeLa-celler, kinesisk hamstereggstokk (CHO) cellelinjer og W138, BHK, COS-7 293 og MDCK-cellelinjer.

Ekspresjonsvektorer for slike celler vil vanligvis innbefatter (hvis dette er nødvendig) en replikasjonsopprinnelse, en promotor plassert foran det genet som skal uttrykkes, sammen med eventuelle nødvendige ribosombindende seter, RNA-spleiseseter, et polyadenyleringssete og

transkripsjonstermiantorsekvenser.

For bruk i pattedyrceller blir ofte kontrollfunksjonene med hensyn til ekspresjonsvektorene ofte tilveiebragt ved hjelp av viralt materiale. Således er for eksempel vanlig brukte promotorer avledet fra polyoma, Adenovirus 2, og mest anvendt er Simian Virus 40 (SC40). Tidlige og senere promotorer i SV40-virus er spesielt brukbare, fordi de begge lett oppnås fra nevnte virus som et fragment som også inneholder den SV40-virale replikasjonsopprinnelsen (Fiers et al., 1978). Mindre og større SV40-fragmenter kan også brukes, forutsatt at det inngår den sekvens på ca. 240 basepar som strekker seg fra Hindlll-setet mot Bgll-setet som er plassert i den virale replikasjonsopprinnelsen. Videre er det også mulig, og ofte ønskelig, å bruke en promotor eller kontrollsekvenser som normalt er assosiert med den forønskede gensekvensen, forutsatt at slike kontrollsekvenser er forenlige med vertscellesystemene.

En såkalt replikasjonsopprinnelse kan være tilveiebragt enten ved konstruksjonen av vektoren slik at denne innbefatter en eksogen opprinnelse, og kan som sådan være avledet fra SV40 eller en annen type virus (for eksempel Polyoma, Adeno, VS V, BP V), eller kan være tilveiebragt ved hjelp av vertscellens kromosomale replikasjonsmekanisme. Hvis vektoren er integrert i vertscellekromosomet, så vil sistnevnte ofte være tilstrekkelig.

Blandinger ifølge oppfinnelsen

Oppfinnelsen angår også en immunogen blanding eller et preparat som innbefatter som et effektivt immunogent middel, minst en av de analoger som her er beskrevet, i blanding med en farmasøytisk og immunologisk akseptabel bærer, væske, fortynningsmiddel eller lignende, og eventuelt en adjuvant, se også den beskrivelse som er gitt i det foregående.

Videre angår oppfinnelsen også en blanding eller et preparat for å indusere

produksjon av antistoffer mot enhver av de ovenfor angitte tumorantigener, og hvor blandingen innbefatter

- et nukleinsyrefragment eller en vektor ifølge oppfinnelsen, og

- et farmasøytisk og immunologisk akseptabelt fortynningsmiddel og/eller væske og/eller bærer og/eller fortynningsmiddel og/eller adjuvant.

Sammensetning og andre spesifikke detaljer med hensyn til slike blandinger og preparater er diskutert og beskrevet i den relevante del ovenfor som angår nukleinsyreimmunis ering.

EKSEMPEL 1

Vaksinasjon mot PSM

Det vil i det følgende bli beskrevet hvordan en human autovaksine mot PSM kan utvikles ved modifikasjon av molekylet ved innsetting av en eller flere promiskuøse fremmede T-celleepitoper for derved å eksponere eller avsløre et utvalg av immunogeniserte PSM-molekyler.

Konstruksjonene vil bli testet for sin evne til å indusere spesifikke CTL-reaksjoner mot PSM-bærende tumorceller. Videre vil konstruksjonene bli testet for sin evne til å indusere antistoffer som er tverreaktive med de opprinnelige delene av PSM-molekylet. Deretter vil flere in vitro-prøver og in vivo-dyremodeller bedømme effekten av de forskjellige konstruksjonene. De induserte antistoffene vil bli testet for sin evne til å aktivere komplement via den klassiske reaksjonsveien og kunne starte ADCC via Fc-reseptorer. Til slutt vil de forskjellige molekylene bli testet i dyremodeller for human

prostatacancer.

Strategi ved utforming av en PSM-autovaksine

PSM-vaksinasjonsplanen vil innbefatte de følgende eksperimentelle områder

Design og produksjon av et utvalg av humane PSM- mutanter

- Kloning av PSM-sekvensene fra menneske og rotte/mus.

- Mutasjonsarbeid for å utvikle immunogeniserte hPSM-molekyler.

- Ekspresjon av villtypen og immunogeniserte hPSM-molekyler i E. coli og/eller Pichia pastoris og/eller pattedyrceller og/éller insektceller (så som S2-cellelinjen). - Rensing og refolding og karakterisering av de immunogeniserte hPSM-molekylene.

DNA- vaksinasjon mot PSM

- Utvikling av hPSM DNA-vaksinasjons vektorer som koder de immunogeniserte hPSM-molekyler. - Testing av hP SM-vaksinasjons vektorene i in vitro og in vivo-eksperimenter.

Seleksjon av hPSM- kandidater

- Immunisering av mus/kaniner.

- ELISA.

- FACS-analyse.

- I tilfelle en antistoffreaksjon: Tumorcelleformeringsprøve.

- T-celleprøver.

Testing av hPSM- mutantene in vivo

- Fast tumor/metastasemodell i mus.

Konseptuell undersøkelse: CTL- induksjon ved auto vaksinasjon

- Konstruksjon av immunogenisert mus/rotte PSM som tilsvarer de valgte hPSM-kandidatene (for eksempel i form av DNA-vaksiner). - Testing av immunreaksjonen frembragt av mus/rotte PSM-mutantene i in vitro-prøver: Immunokjemiske prøver, ELISA, FACS-analyse, cellulære prøver, komplementoppløsning av PSM-bærende celler, ADCC-prøve,

CTL-aktivitetsprøve, tumorcelleformeringsprøve, T-cellepresentasjonsprøver. - Testing av PSM-mutantene in vivo i en fast tumor/metastasemodell i mus.

Nomenklatur for hPSM-konstruksjonene

PSM er en type II-membranprotein med 750 aminosyrer, kfr. sekv.id. nr. 2

som angir villtypesekvensen med unntak av at Gly erstatter Trp i posisjonen 2 på grunn av innføringen av et Ncol-sete og en Kozak-sekvens i sekv.id. nr. 1, hvor ggt erstatter tgg i posisjonene 4-6. Imidlertid så er også naturlig forekommende PSM (det vil si PSM med en Trp i posisjon 2) også brukt for enkelte humane PSM-baserte autovaksinekonstruksjoner.

I PSM utgjør den ekstracellulære delen de 707 C-terminale aminosyrene, mens det cytoplasmiske området er beregnet til å være 19 aminosyrer langt, mens den transmembrane delen av proteinet består av 24 aminosyrer (aa 20-43).

Som et startpunkt for konstruksjonene har en også brukt spleisevarianten PSM'. Vår versjon av denne spleisevarianten har den aminosyresekvens, som tilsvarer residuaene 58-750 i sekv.id. nr. 2. For å lette nomenklaturen er områdene i PSM' merket på samme måte som i PSM (det vil si at område 2 består av aminosyrene 87-108 i PSM og aminosyrene 30-51 i PSM'), men se også den etterfølgende diskusjon og beskrivelse av områdene.

Alle de genetiske konstruksjonene av humant PSM er betegnet hPSM_._

(eller hPSM'_._ hvis PSM' blir brukt som et startpunkt), hvor den første _ er innsettingsområdet som blir brukt for innsetting av P2, mens den andre _ er det innsettingsområdet, som er brukt for P30. Hvis P2 eller P30 ikke er tilstede i proteinet, så er tallet 0 (null) angitt. Den hele lengden på villtypen av hPSM er angitt som hPSMO.0, og villtype hPSM som mangler de cytoplasmiske og transmembrane deler er betegnet som hPSM-K).0. De 13 planlagte immunogeniserte hPSM-genene som alle inneholder en P2-epitop og en P30-epitop, vil bli betegnet hPSMl.l, hPSM6.1, hPSM8.1, hPSMlO.l, hPSM1.6, hPSM1.8, hPSMl.lO, hPSM1.2, hPSM1.3, hPSM1.5, hPSM2.1, hPSM3.1, hPSMlO.3, hPSM6.3, hPSM'10.3, hPSM'6.3, hPSM8.3, hPSM'8.3 og hPSM5.1, se også de etterfølgende detaljer.

I hPSMl.l er både P2 og P30-epitopene innsatt i tandem i innsettingsområde nr. 1 (det membranovergripende området). Teoretisk kan denne mutanten hPSMl.l anses å være en meget tiltrekkende vaksinekandidat for induksjon av antistoffproduksjon, fordi hele det ekstracellulære området for molekylet er intakt. For induksjon av CTL-reaksjoner ved å anvende nukleinsyreimmunisering, så anses konstruksjoner som hPSM10.3 og hPSM6.3 å være brukbare.

For å lette kloningen og mutagenesemetodene, så kan mye av det molekylære konstruksjonsarbeidet gjøres ved enten å bruke den N-terminale (aminosyrene 1-436) eller den C-terminale (aminosyrene 437-750) del av hPSM-genet som utgangsmateriale. Disse to delene av hPSM-genet er betegnet hPSMI_._ og hPSMII_._, henholdsvis, hvor den første _ er det innsettingsområde som brukes for innsetting av P2, mens den andre _ er det innsettingsområde, som brukes for P30. Igjen hvis P2 eller P30 ikke er tilstede i proteinet, så er dette angitt med tallet 0 (null), og villtypene er betegnet hPSMIO.O og hPSMIIO.O henholdsvis. En spesiell variant av hPSMIO.O uten den cytoplasmiske delen av hPSM, er betegnet hPSMIO.O.

I praksis ble mesteparten av det mutagene arbeidet gjort ved å bruke hPSMIO.O og hPSMIIO.O som utgangsmateriale.

De uttrykte hPSM-mutantproteiner vil bli betegnet PROS_._, hvor den første _ er innsettingsområde som ble brukt for innsetting av ,P2, mens den andre er det innsettingsområde, som ble brukt for P30. Hvis P2 eller P30 ikke er tilstede i proteinet, så er dette angitt med tallet 0 (null). Villtypen hPSM er betegnet PROS0.0. PROSIIO.O her hPSM-proteinproduktet med aminosyrene 437-750. His-taggede proteiner er kalt HIS-PROS_._. Som His-tagger har en brukt sekv.id. nr. 21 for ekspresjon i gjær og bakterier, mens sekv.id. nr. 23 er brukt for ekspresjon i pattedyrceller.

Kloning av den humane PSM-sekvensen

LNCaP-cellelinjen som opprinnelig kommer fra et metastatisk sår i human prostataadenocarcinom, ble kjøpt fra den amerikanske typekultursamlingen (ATCC). mRNA ble isolert fra denne cellelinjen og revers transkribert ved å bruke et standardsett for å oppnå cDNA som koder den humane PSM-sekvensen. Ved å bruke forskjellige sett av hPSM-spesifikke primere, fikk man fremstilt PCR-produkter som koder PSM (437-750), og disse ble så klonet over i pUcl9 (plasmid nummer pMR300), og verifisert ved DNA-sekvensering. Denne C-terminale delen av villtype PSM er betegnet hPSM del II (hPSMIIO.O).

På lignende måte er villtype hPSM del I (hPSMIO.O) blitt klonet over i pUcl9 ved å bruke primere for å oppformere del I både med (hPSMIO.O) og uten (hPSMIO.O) de transmembrane- og cytoplasmiske områder. Klonene ble kontrollert, sekvensert og hPSMIO.O og hPSMIIO.O ble fusjonert ved å bruke ligering ved EcoRI-setet. De resulterende klonene av hPSMO.O (sekv.id. nr. 2) og hPSMIO.O ble så subklonet over i en rekke pro- og eucaryotiske ekspresjonsvektorer og igjen sekvensverifisert. Den intracellulært uttrykte formen av humant PSM (betegnet hPSM' - aminosyrene 58-750 i sekv.id. nr. 2) ble også konstruert ved å bruke cDNA som utgangsmateriale. Denne sekvensen ble også subklonet over i pattedyrekspresjonsvektorer og ble brukt som utgangsmateriale for enkelte hPSM-autovaksinekonstruksjoner, for eksempel hPSM'10.3 og hPSM'6.3.

Kloning av rotte og muse PSM-sekvensene

To EST (uttrykt sekvenstag) kloner som inneholdt muse PSM cDNA-sekvenser (fra musefosterayrer og musemakrofager henholdsvis) ble kjøpt fra den amerikanske typekultursamlingen (ATCC). Sammen dekker disse EST-molekylene muse PSM cDNA-sekvensen, og således ble hele lengden av mus PSM (sekv.id. nr. 7 og 8) såvel som muse PSM' (sekv.id. nr. 9 og 10) subklonet over i bakterielle vektorer og pattedyrekspresjons vektorer. Mus PSM AutoVac-konstruksjoner ble også fremstilt ved å innsette P30 i nevnte mus PSM cDNA.

Ekspresjon av villtype hPSM i E. coli

Den C-terminale delen (aminosyrene 437-750) i hPSM, hPSMIIO.O ble klonet over i den bakterielle ekspresjonsvektoren pET28b for å oppnå et produkt med en N-terminal poly-histidin (HIS) hale, noe som letter rensingen i stor skala og identifikasjon med anti-poly-HIS-antistoffer. Proteinproduktet av poly-HIS tagget hPSMIIO.O (proteinproduktet ble betegnet HIS-PROSII0.0) ble uttrykt i E. coli.

DNA som koder den trunkerte villtype humane PSM hPSM+cytO.O ble også uttrykt fra pET28b i E. coli-stammen BL21 (DE3), hvor ekspresjonsproduktet er plassert i inklusjonslegemer. SDS-PAGE-analyse av bakterielt lysat viste et produkt med den forventede vandring, og Western blotting med kanin anti-HIS-PROSIIO.O ga også det forventede bånd. Videre ga den N-terminale sekvensen på fem aminosyrer fra dette produktet elevert fra en SDS-PAGE-gel, den forventede aminosyresekvensen. Villtype hPSM-konstruksjonene hPSMO.O, hPSMIO.O (såvel som de to hPSM-mutantene hPSMl.l og hPSM6.1 se nedenfor) ble klonet over i forskjellige E. coli-ekspresjonsvektorer for å få en mer effektiv ekspresjon og til en viss grad

folding av de rekombinante proteinene i E. coli. De valgte ekspresjonssystemene er de følgende: pMCT6 som utvikler N-terminalt His-taggede versjoner av de uttrykte rekombinante proteinene,

pGH433 som uttrykker de rekombinante proteinene i forbindelse til en 22 aminosyre pelB-ledersekvens som skulle dirigere proteinet til den periplasmiske delen av E. coli-bakterien, og

pMal-p2 hvor rekombinante proteiner blir uttrykt som C-terminale fusjoner til maltosebindende protein (MBP) som inneholder den naturlige MBP-periplasmiske ledersekvensen. Antistoffer mot MBP kan brukes for påvisning av fusjonsproteinene og en karbohydratkoblet kolonne kan brukes for affinitetsrensing av produktet.

E. coli-ekspresjonseksperimenter av villtype hPSM-proteiner fra disse vektorer har imidlertid bare vist et midlere ekspresjonsnivå fra pMCT6. Problemene med å få fremstilt periplasmisk ekspresjon av villtype hPSM-proteinene er ennå ikke løst på dette tidspunkt.

Ekspresjon av villtype hPSM i Pichia pastoris

På grunn av den relativt høye molekylvekten for PSM-proteinet og dets relative høye grad av glykosylering (ca. 16% av molekylevekten) og for å lette rensing ved eliminering av refoldingstrinnet, så er det besluttet å anvende alternativ teknologi for eukaryotisk ekspresjon av de rekombinante proteinene. Flere vel karakteriserte eukaryotiske ekspresjonssystemer er blitt undersøkt og bedømt, og for en første screening av hPSM-mutanter, har man valgt å bruke gjæren Pichia pastoris som et alternativ til E. coli-ekspresjon.

Et ekspresjonssystem basert på gjæren Pichia pastoris er blitt anvendt på

PSM-konstruksjoner. Glykosyleringsmønsteret for de rekombinante proteinene uttrykt i denne organismen er forventet å ligne pattedyrglykosyleringsmønsteret mer enn i Saccharomyces cerevisiae, noe som skyldes en mindre grenet mannosylering i det rekombinante proteinet. Det er også blitt vist at mannoreseptor-styrt opptak av antigener av dendritiske celler resulterer i en ca. 100 ganger mer effektiv presentasjon til T-celler sammenlignet med et endocytosert opptak i væskefase. Mannosyleringen kan derfor spille en rolle for antigeniteten (da spesielt

evnen til å indusere CTL-reaksjoner) for hPSM-mutantene og andre antigener hvor det er ønskelig med en CTL-reaksjon.

En stamme av Pichia pastoris såvel som to forskjellige ekspresjonsvektorer ble kjøpt fra Invitrogen. Vektoren pPICZccA bærer en metanolinduserbar promotor oppstrøms for polykloningssetet, mens pGAPZctA-vektoren uttrykker proteinene konstitutivt. Begge vektorene koder a-faktor sekresjonssignalet for å kunne eksportere de rekombinante proteinene over i mediet. Seleksjons systemet i disse vektorene er zeosinresistent. Sekvensene som koder hPSMO.O og hPSM-0.0 (såvel som en hPSM-mutant, hPSMl.l, kfr. nedenfor) ble subklonet over i disse vektorer (i-ramme med en C-terminal c-myc identifikasjonsepitop, sekv.id. nr. 27).

Fire Pichia pastoris-stammer (X-33, SMD1168, GS115 og KM71) som skiller seg med hensyn til sine vekstkrav, ble transformert med hver av disse (lineariserte) plasmidene ved å bruke elektroporering. Selve transformeringen ble gjentatt flere ganger med mindre forandringer for å kunne oppnå et stort antall zeosinresistente kloner. Ekspresjon av villtype hPSMIO.O (såvel som hPSMl.l, se nedenfor) ble oppnådd ved hjelp av dette Pichia pastoris-systemet. De uttrykte produkter kunne påvises i Western blotting av lysater av Pichia pastoris-transformantene både ved å bruke et anti-hPSM-monoklonalt antistoff og et anti-c-myc monoklonalt antistoff som primer. De rekombinante produktene ble imidlertid påvist intracellulært.

Ekspresjon av villtype hPSM i pattedyrceller

Et ekspresjonssystem hvor man bruker CHO (kinesisk hamstereggstokk) celler vil også bli anvendt for den endelige testing og produksjon av utvalgte molekyler.

Så langt har CHO-cellene blitt transfektert med villtype hPSM og hPSMl.l med og uten en rammeledersekvens i pattedyrekspresjons vektoren pcDNA3.1. Det ble oppnådd geniticinresistente celler. COS-celler ble så midlertidig transfektert med den samme konstruksjonen, og både hPSMO.O og hPSMl.l ble påvist ved hjelp av Western blotting på cellepellets ved å bruke anti-hPSM monoklonalt antistoff.

Vevsfordeling av hPSM

Et kommersielt sett ble kjøpt for å kunne bestemme hvorvidt hPSM-ekspresjon kan påvises i forskjellige typer humant vev, og heri inngår prostata, blod og hjerne. Metoden er basert på en punktblot-påvisning av polyA-inneholdende mRNA ekstrahert fra 50 forskjellige humane vev. De preliminære resultatene indikerte ikke en hyperekspresjon av hPSM i vev så som blod og hjerne. Etter prioritetsdato for den foreliggende søknad, så har imidlertid andre påvist nærværet av PSM i andre typer vev, kfr. det som er angitt ovenfor.

Utforming av hPSM-mutantene

Ved utforming av mutasjonsteknikken for PSM, så er enkelte områder i proteinet meget viktige å bevare i de modifiserte konstruksjoner, for eksempel mulige og identifiserte T-celleepitoper, B-celleepitoper og disulfidbrocysteinresidua. Slike »forbudte» områder ble derfor identifisert i PSM-sekvensen, noe som gjorde at det til overs ble et begrenset antall såkalte »åpne» områder på 20 eller flere aminosyrer som var tilgjengelige for utbytting med de fremmede T-hjelpeepitopene P2 og/eller P30. Pr. definisjon så ble også transmembranområdet ansett for å være et »åpent» område, ettersom autoantistoffer rettet inn mot dette området er irrelevante og eliminering av denne sekvensen antas å bedre løseligheten av de muterte PCM-proteinene, men det kan ikke utelukkes at dette området inneholder viktige CTL-epitoper, og følgelig ble transmembranområdet bevart, for eksempel i hPSM10.3.

Ut fra en generell forventning om at autovaksinen vil indusere en CTL-reaksjon, er det viktig å identifisere og bevare mulige subdominante CTL-epitoper i konstruksjonene. To slike epitoper er allerede kjent fra litteraturen: 1) det peptid som innbefatter PSM-aminosyrene 4-12 (LLHETDSAV) kan presenteres på det humane MHC klasse I-molekylet HLA-A2.1 (Tjoa, 1996), og 2) PSM(711-719) (ALFDIESKV) som også binder HLA-A2.1 (ref. 25). Man har også undersøkt PSM-aminosyresekvensen for å identifisere primære ankerresidua av HLA klasse I-bindende sekvenser slik dette er beskrevet av Rammensee et al. (Rammensee, 1995) for de mest vanlige HLA klasse I-typene (HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A23, HLA-A24 og HLA-A28), som til sammen utgjør 80% av HLA-A-typene hos mennesket. På lignende måte ble mulige HLA-B og HLA-C-epitoper identifisert og betegnet som «forbudte» områder.

Ettersom den første intensjonen var å bruke C57/svart x SJL Fl hybridmus hvis det siden skulle bli besluttet å bruke transgene mus for å teste PSM-autovaksinekonstruksjonene, så ble visse mulige mus H-2b og H-2S T-hjelpeepitoper identifisert og ansett som »forbudte» områder (Rammensee, 1995).

Det er også viktig å bevare kjente antistoffbindende områder i PSM-molekylet, fordi disse kan være viktige ved induksjonen av spesifikke anti-PSM autoantistoffer. Fem slike områder er allerede blitt beskrevet: PSM(63-68), PSM(132-137), PSM(482-487) (WO 94/09820), PSM(716-723) og PSM(l-7) (Murphy, 1996). Ved å bruke den datamaskinbaserte metoden til Hopp og Woods for å forutsi antigene determinanter, blir fem områder forutsatt: PSM(63-69), PSM(183-191), PSM(404-414), PSM(479-486) og PSM(716-723) (Hopp, 1983), og noen av disse overlapper de eksperimentelt påviste B-celleepitopene. Disse områdene vil også bli bevart i PSM-vaksinekandidatmolekylene.

PSM-proteinet inneholder 4 cysteinresidua (aminosyreposisjonene 22, 196, 466 og 597), som alle vil bli bevart i de immunogeniserte konstruksjonene, på grunn av deres mulige viktighet ved dannelsen av disulfidbroer.

Basert på de ovennevnte »forbudte» og »åpne» områder i hPSM-proteinet, ble det identifisert 10 områder som er egnet for innsetting av fremmede T-hjelpeepitoper: Innsettingsområder i hPSMI (fra intitieringssetet til EcoRI-setet, aa 1-437): Område 1: aa 16-52 i PSM (4 aa ligger foran TM, TM (24 aa) og 9 aa etter

TM = 37 aa)

Område 2: aa 87-108 i PSM, aa 30-51 i PSM' (22 aa)

Område 3: aa 210-230 i PSM, aa 153-173 i PSM' (21 aa)

Område 4: aa 269-289 i PSM, aa 212-232 i PSM' (21 aa)

Område 5: aa 298-324 i PSM, aa 241-267 i PSM' (27 aa)

Innsettingsområder i hPSMII (fra EcoRI-setet til termineringssetet, aa 437-750):

Område 6: aa 442-465 i PSM, aa 385-408 i PSM' (24 aa)

Område 7: aa 488-514 i PSM, aa 431-457 i PSM' (27 aa)

Område 8: aa 598-630 i PSM, aa 541-573 i PSM' (33 aa)

Område 9: aa 643-662 i PSM, aa 586-605 i PSM' (20 aa)

Område 10: aa 672-699 i PSM, aa 615-642 i PSM' (28 aa)

Innsettingsområdene såvel som de »forbudte» områdene er vist grafisk på figur 4.

En rekke forskjellige immunogeniserte PSM-konstruksjoner vil bli fremstilt ved å substituere et segment av aminosyrer fra to av de ovennevnte angitte innsettingsområder med P2 eller P30. Hvert mutant protein vil således inneholde både P2 og P30, skjønt dette kun må anses å være et eksempel, idet enkeltmutanter også ligger innenfor den foreliggende oppfinnelsen. Eksperimentelt vil mutasjonene bli fremstilt i kloner av hPSMI og hPSMII cDNA henholdsvis, og de to muterte delene vil deretter bli kombinert ved ligering (ved EcoRI-setet). P2 og P30-epitopene var opprinnelig blitt innsatt i innsettingsområdene 1, 2, 3, 5, 6, 8 og 10 for å skape mutantene.

Sekvensene for P2 og P30 er:

P2: QYIKANSKFIGITEL (sekv.id. nr. 12, 15 aa), og i dette tilfellet kodet av nukleotidsekvensen cag tac atc aaa gct aac tcc aaa ttc atc ggt atc acc gag etg (sekv.id. nr. 11, 45 nukleotider), hvor sekvensen i fet skrift er et Sacl-sete. Andre kodonvalg kan opptre, avhengig av valg av kloningsvektor og ekspresjonssystem.

P30: FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (sekv.id. nr. 14, 21 aa), og i dette tilfellet kodet av nukleotidsekvensen ttc aac aac ttc acc gta age ttc tgg etg cgt gtt eeg aaa gtt age gCT AGC ca c etg gaa (sekv.id. nr. 13, 63 nukleotider), hvor fet skrift indikerer et Hindlll-sete, og hvor enkel understreking indikerer et Eco47III-sete, blokkbokstaver indikerer et BstNI-sete og dobbel understreking indikerer et Nhel-sete.

Den følgende tabell angir de humane PSM-konstruksjoner som her ble brukt:

Molekylære konstruksjoner av hPSM-mutantene

Mutasjoner for innsetting av P2 og P30-kodende sekvenser ble utført ved å bruke både hPSMIO.O og hPSMIIO.O som utgangsmateriale.

For å utvikle størsteparten av hPSM-mutantene, ble P2 og P30 først innsatt i hPSMIO.O i innsettingsposisjon 1. Det resulterende materialet (hPSMIl.O og hPSMIO.l henholdsvis) ble deretter brukt som utgangsmateriale for mutagenese for innsetting av P2 og P30 i stillingene 2, 3 og 5 for ligering med epitopmutert hPSMII. hPSMIl.O ble konstruert ved å bruke SOE (enkelt overlappingsforlengelse) PCR og deretter ble sekvensen verifisert. hPSMIO.l ble konstruert ved å bruke den såkalte »Quick Change»-teknikken hvoretter sekvensen ble verifisert.

P2-epitopet ble innsatt i posisjonene 2, 3 og 5 i hPSMIl.O ved å bruke SOE-PCR for å skape hPSMI1.2, hPSMI1.3 og hPSMI1.5. Disse konstruksjonene ble kombinert med hPSMIIO.O for å skape hPSM1.2, hPSM1.3 og hPSM1.5.

hPSMI2.1, hPSMD.l og hPSMI5.1 ble konstruert ved SOE PCR ved å bruke hPSMIO.l som utgangsmateriale. Dette ble satt sammen med hPSMIIO.O ved ligering ved EcoRI-setet for å skape fullengdemutantene hPSM2.1, hPSM3.1 oghPSM5.1.

P2-epitopet ble innsatt i tre forskjellige posisjoner i hPSMIIO.O for å skape hPSMII6.0, hPSMII8.0 og hPSMIHO.O ved å bruke »Quick Change»-teknikken, hvoretter sekvensene i disse klonene ble verifisert.

Deretter ble hPSMIO.l ligert med hPSMII6.0, hPSMII8.0 og hPSMII 10.0 for å oppnå hPSM6.1, hPSM8.1 og hPSMIO.l hvoretter sekvensene i klonene ble verifisert.

Innsetting av P30-epitopet i hPSMII ble så utført for å skape hPSMII0.6, hPSMII0.8 og hPSMIIO.10 ved å bruke SOE PCR.

hPSMl.l ble konstruert ved å bruke to totrinns PCR-mutasjoner fulgt av

ligering i et Hindlll-sete med epitopesekvensen. Sekvensen i fullengdekonstruksjonen ble så verifisert.

hPSM10.3, hPSM'10.3 og hPSM6.3 ble konstruert ved å bruke SOE-PCR. Flere andre hPSM-varianter med både P2 og P30 innsatt i den ekstracellulære delen av hPSM er for tiden under konstruksjon (hPSM'6.3, hPSM8.3, hPSM'8.3).

I tillegg til de opprinnelige planlagte mutantene som hver inneholder både P2 og P30, så ble det også konstruert fire mutanter som bare inneholder en enkelt fremmed epitop, og deres sekvens ble verifisert: hPSMl.O, hPSM8.0, hPSMIO.O oghPSMO.l.

Ekspresjon av hPSM-mutanter i E. coli

I småskalaeksperimenter ble syv hPSM-mutanter, hPSMl.l, hPSM6.1, hPSM8.1, hPSMIO.l, hPSM2.1, hPSM3-l og.hPSM5.1 uttrykt fra pET28b i E. coli-stammen BL21 (DE3), og IPTG-induserbare produkter med den forventede størrelse ble identifisert på Coomassie blåfargede SDS-PAGE-geler. Et produkt av hPSMl.l lot seg imidlertid ikke påvise. Ekspresjonsnivåene av disse hPSM-mutantene var meget lavt sammenlignet med produktet av villtypekonstruksjonen hPSMIO.O. På dette punkt synes det umulig å oppnå et rimelig ekspresjonsnivå av hPSM-mutantene ved å bruke pET-systemet i E. coli, og det er således nødvendig å bruke andre E. coli

ekspresjonssystemer og/eller andre vertsorganismer.

Som nevnt ovenfor ble hPSM6.1 og hPSMl.l subklonet over i forskjellige E. coli ekspresjonsvektorer for å utvikle

- N-terminalt His-taggede versjoner av de uttrykte rekombinante proteinene ved å bruke vektor pMCT6, - versjoner av proteinene uttrykt med pelB-ledersekvensen som styrer proteinet til det periplasmiske rommet i E. coli-bakteriene ved å bruke vektor pGH433, og - versjoner av de rekombinante proteinene uttrykt som et C-terminalt fusjonsprotein til maltosebindende protein (MBP), ved å bruke vektor pMal-p2.

Så langt har en ikke oppnådd tilfredsstillende ekspresjonsnivåer for noen av disse konstruksjonene.

Ettersom hPSMO.O blir rimelig bra uttrykt i E. coli mens en ikke har kunnet observere tilsvarende ekspresjonsnivå for fullengde hPSMO.O eller hPSM-mutantene, så er det mulig at nærværet av den cytoplasmiske delen av hPSM-molekylet på en eller annen måte kan »hemme» ekspresjonen av fullengde hPSM-konstruksjonene i E. coli. For å teste denne hypotesen ble det først fremstilt to genetiske konstruksjoner av hPSMl.l og hPSM6.1 uten cytoplasmiske områder. I E. coli ekspresjonseksperimenter var det imidlertid bare en meget svak ekspresjon av disse^-cyt genproduktene.

Ekspresjon av hPSM-mutanter i Pichia pastoris

For å uttrykke det hPSMl.l-mutante proteinet fra gjæren Pichia pastoris, ble hPSMl.l-sekvensen subklonet (i-ramme med en C-terminal c-myc identifikasjonsepitop, sekv.id. nr. 27) i de to forskjellige ekspresjonsvektorene pPICZaA og pGAPZaA, og sekvensene ble verifisert. Det ble påvist hPSMl.l-ekspresjon (såvel som hPSMn-O.O, se ovenfor) intracellulært i Pichia pastoris-transformantene.

Ekspresjon av hPSM-mutanter i pattedyrceller

Som nevnt ovenfor ble hPSMl.l subklonet over i

pattedyrekspresjonsvektorene pcDNA3.1(+) og pZeoSV2, og disse konstruksjonene (og andre) kunne brukes for ekspresjon, for eksempel i CHO-celler. Midlertidig ekspresjon av hPSMl.l såvel som hPSMO.O ble oppnådd i COS-celler slik dette kunne påvises ved Western blotting.

DN A-vaksinas j on

DNA-vaksinasjon hvis den var effektiv, kan være meget godt egnet for PSM-autovaksinen, spesielt fordi denne administrasjonsformen har vist seg å fremme både CTL-styrte immunreaksjoner og antistoffproduksjon. Det var derfor en hensikt å utføre en parallell undersøkelse med det mål å se hvorvidt effekten av DNA-vaksinasjon av mus med passende vektorer som koder immunogenisert muse ubiquitin og/eller mus TNFa. DNA-vaksinasjon med hPSM (og/eller mutanter) som koder nakent DNA vil også bli utført.

Gjennomførbarhetsundersøkelser ved å bruke immunogenisert ubiquitin for DNA-vaksinasjon

En gjennomførbarhetsundersøkelse for å se på effekten av DNA-vaksinasjon med immunogenisert selvprotein ble utført ved å bruke ubiquitin med en innsatt T-hjelpeepitop fra ovalbumin (UbiOVA) som modellprotein. Sekvenser som kodet UbiOVA såvel som villtype ubiquitin ble subklonet over i pattedyrekspresjonsvektoren pcDNA3.1(-).

Grupper på 5 BALB/c-mus ble immunisert med 40 jig pcDNA-UbiOVA eller pcDNA-ubiquitinkonstruksjoner, enten intramuskulært eller i quadriceps eller intradermalt. En kontrollgruppe fikk UbiOVA-protein i fullstendig Freunds adjuvant. Tre og seks uker senere ble immuniseringene gjentatt bare med den forskjell at UbiOVA-proteinet var emulgert i ufullstendig Freunds adjuvant.

Det ble tatt blodprøver av musene regelmessig og en bestemte anti-ubiquitinantistofftitreringsverdiene. I UbiOVA-gruppene som var DNA-vaksinerte ble det bare oppnådd meget svake anti-ubiquitinantistofftitreringsverdier. Deretter ble alle grupper supplert med UbiOVA-protein i ufullstendig Freunds adjuvant, hvoretter blodprøver ble tatt for å bestemme hvorvidt DNA-vaksinasjonen med UbiOVA (og ikke ubiquitin) kunne forsterke antistoffreaksjonen mot UbiOVA-protein. Resultatene av dette eksperimentet viste at det var ingen signifikant forskjell mellom UbiOVA-gruppene og kontrollgruppene, og alle musene utviklet sterke anti-ubiquitinantistoffer ved denne enkle UbiOVA/FIA-forsterkning.

DNA-vaksinasjon ved å bruke hPSM-konstruksjoner

Det foregår for tiden forskjellige DNA-vaksinasjonseksperimenter ved å bruke hPSM-konstruksjoner. Forskjellige humane PSM villtype og AutoVac-konstruksjoner (så som for eksempel hPSMO.O, hPSMn-0.0, hPSM'0.0, hPSMl.l, hPSM10.3) ble subklonet over i DNA-vaksinasjonsvektorer (så som pcDNA3.1(+), pcDNA3.1(-), pVAX og pZeoSV2). I noen av disse konstruksjonene ble forskjellige ledersekvenser (så som CD1 la, tPA og IL-5- ledersekvensene, sekv.id. nr. 29, 25 og 31 henholdsvis) inkludert direkte N-terminalt og i-ramme for å muliggjøre sekresjon av de uttrykte hPSM-proteinene in vivo. Alle konstruksjonene i DNA-vaksinasjons vektorene ble verifisert ved DNA-sekvensering og in vitro translatering.

Mus av forskjellige stammer (så som Balb/cA, Balb/cJ, DBA/2 og A/J) ble injisert med de ovenfor beskrevne hPSM DNA-vaksiner, enten intradermalt eller intramuskulært og forsterket flere ganger med de samme konstruksjoner.

Serumprøver ble oppnådd under immuniseringsperioden og lagret ved -20°C. Disse prøvene vil bli analysert for nærvær av antistoffer som er reaktive med villtype hPSM.

Det er også etablert prøver for å kontrollere CTL og T-hjelpeproliferative reaksjoner i disse musene.

Preliminære resultater antyder at man kan oppnå en induksjon av både CTL såvel som antistoffreaksjoner mot PSM.

Rensing/karakterisering av HIS-tagget hPSM(437-750) (HIS-PROSII0.0)

HIS-tagget villtype hPSMII (HIS-PROSII0.0) ble uttrykt fra pET28b, og løseliggjorte inklusjonslegemer ble påsatt en gelfiltrerings FPLC-kolonne og eluert i en buffer inneholdende 8 M urea. Fraksjoner som i det alt vesentlige inneholdt hPSMII ble underkastet forskjellige refoldingsbetingelser for å optimalisere fremgangsmåten. Oppløst produkt dialysert mot en Tris-buffer ble beregnet til å være mer enn 90% ren ved å bruke sølvfarget SDS-PAGE.

Kaniner ble immunisert med det rensede HIS-PROSIIO.O for å bruke det resulterende antiserumet for senere påvisning og eventuell affinitetsrensing av hPSM-mutantene.

Rensing/karakterisering av løselig hPSM (PROS^O.O)

Villtype hPSM som manglet cytoplasma og transmembrandelen, PROS-^-0.0 ble uttrykt i en E. coli-stamme BL21 (DE3) etter induksjon med IPTG og kunne påvises i inklusjonslegemer. SDS-PAGE ave dette bakterielle lysatet fulgt av Western blotting med kanin anti-HIS-PROSIIO.O viste et produkt med den forventede vandring. N-terminal sekvensering av de første fem aminosyrene av dette produktet eluert fra en SDS-PAGE-gel viste den forventede sekvens som tilsvarte det humane hPSM. Produktet ble så underkastet en stor serie løselighetsgjørings- og refoldingseksperimenter. Et produkt som forblir i løsning kan oppnås i en Tris-buffer uten denaturant eller reduktant, men en SDS-PAGE-analyse viser at materialet sannsynligvis danner store aggregater. Mus og kaniner er blitt immunisert med dette materialet for å oppnå antistoff mot hPSM, for eksempel for analytiske formål, og antisera reagerte ikke med LNCap hPSM.

En porsjon av vaskede E. coli inklusjonslegemer av PROS-e-0.0 er blitt fremstilt for immunisering av kaniner for å utvikle et polyklonalt antiserum mot PSM. Cirka 50% av proteininnholdet i det våte pelleterte materialet var PROS^O.O. Antiseraet reagerte ikke med LNCap hPSM i Western Blotting.

Fremstilling av KLH-konjugerte hPSM-peptider for immunisering

Tre 15-mer-peptider ble syntetisert for å fremstille et immunogent konjugat av kjente hPSM B-celleepitoper med et immunologisk bærermolekyl for derved å få fremstilt et polyklonalt antiserum som er i stand til å gjenkjenne hPSM. Disse peptidene inneholder PSM B-celleepitopen foruten 5-6 flankerende PSM-aminosyrer i hver ende.

Peptidene ble fremstilt ved en automatisk syntese, HPLC-renset og kontrollsekvensert ved å bruke Edman-degradering.

Et kjemisk bundet konjugat ble fremstilt ved å tverrbinde B-celleepitopen inneholdende hPSM-peptidene KLH ved å bruke en standard entrinnsmetode med glutaraldehyd som tverrbindingsmiddel.

Syntese av P2 og P30-peptider med flankerende hPSM-sekvenser

Seks peptider ble utformet som tilsvarer P2 og P30-epitopene med 5 flankerende hPSM-aminosyrer i hver ende. De flankerende aminosyrene tilsvarte epitopinnsettingssetene 6, 8 og 10. Peptidene vil bli brukt, blant annet i T-celleformeringsprøver, men også for andre formål, så som ELISA eller andre in vitro prøver. Peptidsekvensene var følgende: PSMpep007 P2 innsatt i hPSM-innsettingsposisjon 6

OERGV OYIKANSKFIGITELRVDCT (sekv.id. nr. 15)

PSMpep008 P2 innsatt i hPSM-innsettingsposisjon 8

AVVLR OYIKANSKFIGITELEMKTY (sekv.id. nr. 16)

PSMpep009 P2 innsatt i hPSM-innsettingsposisjon 10

MFLER OYIKANSKFIGITELHVIYA (sekv.id. nr. 17)

PSMpepOlO P30 innsatt i hPSM-innsettingsposisjon 6

NSRLL FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEVDCTP (sekv.id.

nr. 18)

PSMpepOl 1 P30 innsatt i hPSM-innsettingsposisjon 8

VVLRK FNNFTVSFWLRVPKVSASHLESFDSL (sekv.id.

nr. 19)

PSMpepOl2 P30 innsatt i hPSM-innsettingsposisjon 10

LMFLE FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEPSSHN (sekv.id.

nr. 20)

P2 og P30-epitopene er understreket. Peptidene ble fremstilt ved automatisk syntese og renset ved hjelp av HPLC fulgt av en kontrollsekvensering ved å bruke Edman-degradering.

Immunogenitetsprøver

Det ble utformet forskjellige eksperimenter for å produsere materialer og etablere immunogenitetsprøver for fremtidig testing av og seleksjon mellom muterte PSM-konstruksjoner.

Utvikling av polyklonalt kanin anti-HIS-PROSIIO.O og anti KLH-PSM-peptidkonjugatantisera

To kaniner ble immunisert med renset HIS-PROSII0.0, og hvor den HIS-taggede C-terminale delen av P30 innsatt i hPSM-proteinet (aminosyrene 437-750) var emulgert 1:1 med fullstendig Freunds adjuvant og forsterket to ganger (på dag 28 og 55) med det samme antigenet emulgert i ufullstendig Freunds adjuvant.

To kaniner ble immunisert med en blanding bestående av KLH-PSM-peptidkonjugatet pluss hver av de tre frie peptidene. Disse tre peptidene inneholder hver en på forhånd definert B-celleepitop av hPSM. Blandingen ble emulgert 1:1 med fullstendig Freunds adjuvant. Kaninene ble forsterket to ganger (på dag 28 og 55) med det samme antigenet emulgert i fullstendig Freunds adjuvant.

Tverreaktivitet mellom anti-HIS-PROSIIO.O og PSMpep005 og tverreaktivitet mellom anti-KLH-PSM-peptidkonjugatet pluss peptidene og HIS-PROSIIO.O ble påvist i ELISA-prøver. Anti-HIS-PROSIIO.O-antistoffet hadde evnen til å gjenkjenne naturlig hPSM i lysater av LNCaP-celler i Western blotting.

Immunisering av mus med retroviralt uttrykt hPSMO.O.

På dette trinn av PSM-prosjektet var det en alvorlig hindring at det stadig var mangel på antistoffer som var i stand til å gjenkjenne korrekt foldet nativ hPSM. Det ble derfor utført et immuniseringseksperiment ved å bruke retroviralt uttrykt hPSMO.O.

Seks grupper av Balb/c-mus ble immunisert med enten: 1) mitomycin C-behandlet BALB/c fibrosarcomceller (79,24.H8) transdusert med hPSMO.O cDNA (CMV-Koz-hPSM), 2) mitomycin C-behandlet BALB/c firbosarcomceller (79,24.H8), transdusert med tom vektor (CMVBipep), 3) pakkende celler (BOSC) transfektert med hPSMO.O cDNA (SMV-Koz-hPSM), 4) pakkende celler (BOSC) transfektert med tom vektor (CMVBipep), 5) retroviruskultur som uttrykte hPSMO.O cDNA (CMV-Koz-hPSM) eller 6) retroviruskultur, tom vektor (CMVBipep).

På flere tidspunkter ble det tatt blodprøver av musene og sera ble oppnådd og testet for reaktivitet i ELISA for reaktivitet mot HIS-PROSIIO.O. Dessverre utviklet ingen av musene antistoffer som spesifikt var i stand til å gjenkjenne HIS-PROSIIO.O-preparatet.

Etablering av et anti-hPSM ELISA

Renset HIS-PROSIIO.O ble brukt for å belegge polystyren mikrotiteringsplater (Maxisorp) for det formål å etablere en ELISA-prøve for testing, blant annet av hybridomsupernatanter og mus og kanin antisera. Sera fra BALB/c-mus immunisert med det samme preparatet av HIS-PROSIIO.O var reaktive med det immobiliserte HIS-PROSIIO.O ved en konsentrasjon på 0,5 (ig pr. brønn ved å bruke pepperrotperoksidasemerket kanin anti-mus lg som det sekundære antistoffet.

Som nevnt ovenfor så ble det vist ved hjelp av denne ELISA-prøven at et antiserum som var frembragt i kaniner mot KLH-PSMpep004-PSMpep005-PSMpep006-konjugatet blandet med de fire peptidene, kunne reagere med immobilisert HIS-PROSIIO.O.

Ved å bruke AquaBind® mikrotiteringsplater (se for eksempel beskrivelsen gitt i WO 94/03530 som beskriver blant annet mikro ti treringsplater belagt

med tresyl-aktivert dekstran og som nå markedsføres under det registrerte varemerket AquaBind), ble det etablert en ELISA-prøve ved hjelp av immobilisert PSM-peptider (PSMpep004, PSMpep005 og PSMpep006). De belagte AquaBind®-platene med disse peptidene kunne påvise et kanin antiserum som var frembragt mot det samme antigenpreparatet. Som nevnt ovenfor kunne kanin anti-HIS-PROSIIO.O påvises på AquaBind®-plater belagt med PSMpep005.

Etablering av et anti-hPSM Western blot ved å bruke LNCaP-celler og det monoklonale antistoffet 7E11C5

7E11C5 B-cellehybridomer som skiller ut mus IgG2a monoklonalt antistoff mot en intracellulær epitop i humant PSM, ble kjøpt fra ATCC. Kultursupernatanten fra ca. 90% døde celler ble oppsamlet og brukt i Western blotting for påvisning av humant PSM både i humananrikede preparater av LNCaP-celler såvel som i oppløste LNCaP-celler. Dette antistoffet ble renset ved å bruke protein G-kolonner, og dets reaktivitet ble verifisert med LNCaP i Western blotting.

Etablering av en FACS-metode for påvisning av hPSM i LNCaP-celler Man har etablert gjensidig uavhengige FACS-metoder for å påvise hPSM i LNCaP-celler. Flere problemer ble søkt løst: LNCaP-cellene vokser meget langsomt og i uregelmessige klumper, og man må derfor optimalisere fremgangsmåten for å fremstille enkeltcellesuspensjoner. For det andre så er den epitop som gjenkjennes av mAb 7E11C5 i litteraturen definert å ligge i det cytoplasmiske området av hPSM. Det er derfor utviklet en fremgangsmåte for å fiksere og permeabilisere cellene. For dette formål ble protein G-renset 7E1 lC5-antistoffer blitt FITC-konjugert, og kan således brukes uten sekundært antistoff i FACS-analyser.

Det er videre utviklet en FACS-metode som anvender anti-hPSM monoklonalt antistoff J591, som gjenkjenner en epitop på den ekstracellulære delen av hPSM. Antistoffet ble oppnådd fra BZL Biologicals og FITC-konjugert og deretter brukt for en FACS-analyse og sortering, for eksempel av LNCaP-celler og hPSM-transfektanter (se nedenfor).

Etablering av en cytotoksisk prøve

Det er anvendt en fremgangsmåte for å rense dendritiske celler fra musebenmarg. Ved å bruke modellproteiner har man optimalisert

immuniseringen av mus med dendritiske celler pulset med modell klasse I-peptider og proteiner. Videre er mus også blitt immunisert med et modellprotein (p-galaktosidase) opparbeidet i form av ISCOMS. T-celler renset fra de immuniserte mus er in vitro blitt restimulert med forskjellige former av de tilsvarende antigene. Evnen til disse restimulerte CTL-cellene til å oppløse forskjellige typer målceller (heri inngår pulserte dendritiske celler såvel som transfektanter som uttrykker retroviralt uttrykt cytosolisk klasse I-peptid) og deretter målt. Det ble utviklet to forskjellige in vitro-prøver som måler CTL-aktivitet, enten ved å bruke kromfrigjøring eller/og DNA-fragmentering (JAM-metode) som et mål på cytotoksitet. Det oppnådd meget gode resultater med P-galaktosidasemodellproteinet og med forskjellige kombinasjoner av MHC klasse I og klasse Il-bindende modellpeptider.

Etablering av verktøy for å studere bryting av autotoleranse mot mus PSM i mus

Det har vært en hensikt å undersøke hvorvidt autotoleranse til mus PSM kan brytes i mus ved immunisering og/eller DNA-vaksinering mot mus PSM, ved å bruke mus PSM AutoVac-molekyler.

Som nevnt ovenfor har man oppnådd cDNA som koder mus PSM (mPSM), dette produkt ble DNA-sekvensert. Fire mPSM-variantmolekyler ble utviklet ved innsetting av P30 på veldefinerte seter i enten fullengde mPSM eller mPSM'. Konstruksjonene var som følger:

Først ble mPSM villtype og analogmolekyler subklonet over i DNA-vaksinasjonsvektorer og brukt for DNA-vaksinering av mus.

Det er en hensikt å analysere immunreaksjonene så som CTL-reaksjoner og tumoreliminering i musene. For dette formål ble mus tumorcellelinjer transfektert med villtype mus PSM (fusjoner i-ramme med en identifikasjonstag, for eksempel c-myc-epitopen, sekv.id. nr. 27 for påvisningsformål).

In vivo PSM tumormodeller

Muse T-celleoppformeringsprøver med P2 og P30

En serie T-celleoppformeringseksperimenter ble utført for å etablere T-celleimmunogeniteten for P2 og P30-peptidene i forskjellige musestammer (BALB/cA (H-2<d>), C3H/Hen (H-2<k>), DBA/1 (H-2") og C57BL/6 (H-2<b>)). Det er velkjent at disse epitopene er promiskuøse i mennesker, men T-cellepromiskuiteten må også bekreftes i mus ved å bruke M&Es-eksperimenter. Det ble således vist at P30 er T-celleimmunogen i BALB/c A og C57BL/6-stammene mens hverken P2 eller P30 viste seg å være T-celleimmunogen i C3H/Hen-stammen. I DBA/1 kunne T-cellene reagere mot P2.

Utvikling av hPSM som uttrykker musetumorceller

For anvendelsen av en hPSM-spesifikk tumormodell i mus såvel som en anvendelse i tumorcelleformeringsprøver, ble det etablert musetumorceller som uttrykte hPSM.

En fremgangsmåte er å utvikle disse cellelinjene ved å transdusere musetumorcellelinjer med retrovirale vektorer som koder fullengde villtype hPSMO.O cDNA.

Det ble konstruert tre forskjellige konstruksjoner som koder fullengde villtype cDNA som igjen koder humant hPSM og disse ble innsatt i polykloningssetet i den retrovirale vektoren CMVBipep, og to av disse konstruksjonene inneholder en kort Kozak-sekvens oppstrøms for startkodonet.

Disse tre konstruksjonene ble så transdusert over i tre forskjellige

musetumorcellelinjer: P815 (mastocytom, H-2<d>), B16-F10 (melanom, H-2<b>) og 79.24.H8 (fribrosarcom, H-2<d>) ved å bruke den BOSC-pakkende cellelinjen. Geneticinresistente kloner ble oppnådd for alle tre celletypene, og det ble verifisert ved hjelp av en PCR-analyse på et genomisk DNA-templat, at de retrovirale konstruksjonene var integrert i vertscellene. Det har hittil ikke vært mulig å påvise et uttrykt PSM-genprodukt ved hjelp av Western blot eller en FACS-analyse ved å bruke det 7E11C5 monoklonale antistoffet.

Det ble etablert to stabile musetumorcellelinjer som inneholdt membranbundet villtype human PSM, som ble utført ved hjelp av transfeksjon. Dette ble gjort ved å bruke hPSMO.O cDNA som var subklonet over i pattedyrekspresjons vektoren pcDNA3.1(^-) under kontroll av CMV-promotoren og som inneholdt en Kozak-sekvens oppstrøms for startkodonet.

Det resulterende plasmidet ble transfektert over i to forskjellige musetumorcellelinjer: 79.24.H8 (fibrosarcom, Balb/c-avledet) og SalN (fibrosarcom, A/J-avledet). Geneticinresistente kulturer ble oppnådd og underkastet en Western blotting og en FACS-analyse ved å bruke J591 og 7E11C5 anti-hPSM monoklonale antistoffer. Ved å bruke J591-antistoffet, ble cellene FACS-sortert i flere runder inntil man hadde oppnådd en hPSM-positiv populasjon. hPSM-ekspresjonen ble igjen verifisert ved intracellulær FACS-farging ved å bruke 7E1 lC5-antistoffet. Det ble også kontrollert ved hjelp av FACS-analyse at MHC klasse I-ekspresjonsnivåene var på samme nivå som i de parenterale cellelinjene.

Kulturer av 79.24.H8 og SalN-cellelinjene som uttrykte hPSM ble klonet ved begrensende fortynning. Det ble oppnådd flere kloner og disse ble undersøkt for forskjellige hPSM-ekspresjonsnivåer ved hjelp av FACS-analyse og ved å anvende det anti-hPSM monoklonale antistoffet J591.

79.24.H8-celler som uttrykte hPSM ble transfektert med det genet som koder B7.1 for anvendelse for eksempel i in vitro-prøver for å kontrollere hPSM-

spesifikke CTL-reaksjoner og/eller interferon-gamma-frigjøring. Cellene ble FACS-sortert en gang ved å bruke et anti-B7.1 antiserum.

Etablering av en hPSM-spesifikk tumormodell i mus

Det ble besluttet å etablere minst to in vivo tumormodeller i immunkompetente mus for derved å kunne bestemme anti-tumoreffekten for antistoffer som var frembragt i mus mot de immunogeniserte hPSM-molekylene. Dette vil forhåpentligvis bli gjort ved å injisere syngeniske musetumorcellelinjer modifisert slik at de uttrykker villtype hPSM på overflatemembranen. Celler som danner faste tumorer og/eller celler som er kjent for å danne metastaser vil bli brukt. I denne modellen vil det bli brukt cellelinjer som kan implanteres i syngeniske mus uten å bli avstøtt på grunn av det fremmede hPSM-molekylet. Man vil her bruke evnen til hPSM-vaksinene til å eliminere slike tumorceller for seleksjon av hPSM-vaksinekandidater.

For å bedømme veksten av SalN-celler transfektert med fullengde humant hPSM, ble forskjellige doser (2x10<6>og 5x10<6>) av hPSM-transfekterte SalN-celler (S-PSM, sortert 5 ganger) injisert subkutenøst i nedre høyre side i grupper av A/J-mus. faste tumorer lot seg imidlertid ikke etablere. Deretter ble trekloner av S-PSM-celler med forskjellige ekspresjonsnivåer av hPSM injisert subkutenøst i tre grupper av A/J-mus i en dose på IO<7>celler pr. mus. Størrelsen på de etablerte tumorer ble målt ved hjelp av en målepasser som måler to forskjellige diametere som ble multiplisert, og dette gir tumorstørrelsen i mm<2>. Disse verdiene ble så sammenlignet for de tre gruppene. I løpet av 3-6 dager utviklet alle mus en fast tumor-lignende struktur som igjen forsvant omkring dag 15. Dette skyldes antagelig nærværet av humant hPSM på tumorcelleoverflatene, skjønt dette ikke fullt ut er blitt verifisert. SalN-celler transfektert bare med pcDNA3.1-vektoren fortsatte å vokse som faste tumorer i mus.

Et lignende mønster kunne observeres i mus injisert med IO<6>, 5x10<6>eller 79.24.H8-celler transfektert med hPSM og sortert flere runder for hPSM-ekspresjon. Disse cellene (som ble betegnet 79-PSM) etablerte heller ikke tumorer i Balb/c eller DBA/2-mus. Når imidlertid en klone av hPSM transfekterte 79.24.H8-celler, 79-PSM.3, ble injisert i Balb/c eller DBA/2-mus, så utviklet musene faste tumorlignende strukturer som igjen forsvant mellom dag 10 og 20. Vektortransfektert 79.24.H8 fortsatte å vokse i Balb/c-mus.

Det gjenstår stadig å bedømme om disse »tumorene» er behandlbare, eller om det kan etableres en bedre tumormodell basert på de beskrevne S-PSM og 79-PSM-cellelinjene og klonene.

Konklusjoner

I det foreliggende molekylære konstruksjonsarbeidet har man maktet å klone det humane PSM-genet og oppnå muse PSM cDNA. Det er blitt produsert et stort utvalg av fullsekvenserte immunogeniserte hPSM-autovaksinekonstruksjoner. hPSM-mutantene såvel som forskjellige villtype hPSM-molekyler er blitt uttrykt i E. coli, og man har funnet og verifisert at ekspresjonsnivået i E. coli er meget lavt. Polyklonale antistoffer mot den C-terminale halvdelen av hPSM er blitt indusert i kaniner. Det er gjort anstrengelser for å implementere forskjellige ekspresjonstagger (His-tag og maltosebindende proteinfusjon) såvel som ekspresjonssystemer som er alternative til E. coli-inklusjonslegemer. Rekombinant villtype og/eller autovaksine hPSM er blitt påvist i transfektert Pichia pastoris og i pattedyrceller. Det er fremsatt brukbare betraktninger med hensyn til DNA-vaksineteknologi, og det er utført en preliminær studie for mulig gjennomføring av det foreliggende program. DNA-vaksinasjonseksperimenter med hPSM autovaksinemolekyler er under utvikling og viser lovende preliminære resultater. Det er blitt etablert forskjellige in vitro-prøver som kan brukes for testing og seleksjon av muterte PSM-konstruksjoner, heri inngår immunokjemiske prøver og FACS-analyser. Musetumorceller er blitt stabilt transfektert med fullengde villtype hPSM og disse er FACS-sortert for hPSM-overflateekspresjon. Det er også oppnådd kloner av disse cellelinjene. In vivo er xenogene tumormodeller i mus blitt bedømt ved å bruke disse hPSM-bærende syngeniske musetumorceller. Det er gjennomført en serie med T-celleoppformeringsprøver for å kunne velge musestammer for tumormodellene. CTL-prøvene er blitt optimalisert, og man har oppnådd overbevisende resultater med modellantigener ved å bruke forskjellige immuniseringsmetoder og prøvebetingelser. Videre har man etablert det verktøy som er nødvendig for å undersøke brytningen av toleransen for mus PSM ved immunisering mot muse PSM-autovaksiner.

EKSEMPEL 2

Produksjon av en Her2-autovaksine

En human autovaksine mot Her2 kan utvikles ved en modifikasjon av molekylet ved innsetting av en eller flere promiskuøse fremmede T-celleepitoper, noe som vil frembringe et stort utvalg av immunogeniserte Her2-molekyler. Disse modifiserte proteinene kan så testes for sin evne til å indusere antistoffer som er tverreaktive med de naturlige deler av Her2-molekylet. Deretter kan man i flere in vitro-prøver og in vivo dyremodeller bedømme effekten av de forskjellige konstruksjonene (noe som kan være tilfelle med DNA-vaksinasjonen) og de modifiserte proteinene. Induksjonen av spesifikke CTL-reaksjoner mot Her2-bærende tumorceller vil så bli analysert. De induserte antistoffer vil også bli undersøkt for sin evne til å aktivere komplement via den klassiske reaksjonsveien og for å starte ADCC via Fc-reseptorer. Endelig vil forskjellige modifiserte molekyler bli undersøkt i dyremodeller for human brystcancer for derved å kunne undersøke deres effekter på behandlingen av tumorer.

Immunogene rotter og humane molekyler vil bli konstruert med promiskuøse T-celleepitoper i forskjellige posisjoner i molekylet.

Under vaksinasjon mot det hele ekstracellulære området for Her2 er det en mulighet for en viss grad av tverreaksjon mellom antistoffene og andre EGFr-reseptorer, ettersom enkelte av disse har en homologi på opptil 40-46% i det ekstracellulære området. Det er derfor planlagt at de bevarte områdene av Her2 kan brytes opp ved å innsette fremmede T-celleepitoper i det minste i noen av de modifiserte proteinene (se nedenfor for detaljer).

Områder av Her2 som eventuelt kan være CTL eller B-celleepitoper er unngått ved utformingen av konstruksjonene, noe som fremgår av figur 3. Årsaken til at man ønsker å bruke disse posisjonene er som følger:;

Den humane Her2-sekvensen kan deles i en rekke områder basert utelukkende på proteinets primære struktur.

Ekstracellulær ( reseptor) del:

1-173: Område I (N-terminalt område i det fullt utviklede polypeptidet).

174-323: Område II (cysteinrikt område, 24 cysteinresidua).

324-483: Område III (ligandbindende område i den homologe EGF-reseptoren).

484-623: Område IV (cysteinrikt område, 20 cysteinresidua).

624-654: Transmembranområde (TM-residua fra 654-675).

Intracellulær ( kinase*) del:;655-1010: Tyrosinkinaseområde (kjerne TK-område fra 725-992). ;1011-1235: C-terminalt område.;Det er blitt utført en seleksjon av seter i aminosyresekvensen for HER2 som kan erstattes enten med P2 eller P30 humane T-hjelpeepitoper, idet man har tatt hensyn til de følgende parametere (svak prioritering): ;1. Kjente og forutsigbare CTL-epitoper.;2. Homologi til nærstående reseptorer (EGFR spesielt).;3. Konservering av cysteinresidua.;4. Forutsagt sløyfe, a-heliks og p-platestrukturer.;5. Mulige N-glykosyleringsseter.;6. Forutsigelse av eksponerte og skjulte aminosyreresidua.;7. Områdeorganisering.;CTL-epitopene synes å være samlet i område I, område III, TM-området og i to eller tre »hot spots» i TK-området. Ifølge foreliggende oppfinnelse bør disse i det alt vesentlige bli bevart. ;Områder med høy grad av homologi med andre reseptorer vil sannsynligvis være strukturelt viktige for den »totale» tertiære strukturen på Her2, og følgelig for antistoffgjenkjennelse, mens områder med lav homologi sannsynligvis kan byttes ut uten at dette har andre konsekvenser enn små lokale endringer av strukturen. ;Cysteinresidua inngår ofte i en dannelse av intramolekylære disulfidbroer, og er således meget vesentlige for den tertiære struktur og bør fortrinnsvis derfor ikke forandres. ;Områder hvor man kan forutsi at det vil bli dannet a-heliks eller platestrukturer bør fortrinnsvis unngås som innsettingspunkter for fremmede epitoper, ettersom disse områdene sannsynligvis er viktige for folding av proteinet. ;Mulige N-glykosyleringsseter bør fortrinnsvis også bevares, ettersom mannosyleringen av proteinet (for eksempel ved ekspresjon i gjær) er ønskelig, kfr. nærværet av mannosereseptorer på APC-celler. ;Områder som man kan forutsi (på grunn av deres hydrofobe egenskaper) er i den indre del av molekylet, bør fortrinnsvis bevares, ettersom disse muligens kan inngå i foldingen. I motsetning til dette vil løsemiddeleksponerte områder tjene som kandidatposisjoner for innsetting av modell TH-epitopene P2 og P30. ;Endelig er proteinets områdeorganisering blitt tatt hensyn til, ettersom denne organiseringen har relevans for proteinets struktur og funksjon. ;Strategien har fokusert på å bevare så mye som mulig av strukturen på den ekstracellulære delen av Her2, fordi det er denne delen av proteinet, som er relevant som mål for nøytraliserende antistoffer. I motsetning til dette er den intracellulære delen av naturlig membranbundet Her2 på overflaten av ;cancerceller, utilgjengelige for det humorale immunsystemet.;Det er følgelig bare nærværet av CTL-epitoper som gjør at det er ønskelig å innbefatte denne delen i en vaksine. Det er følgelig innlysende at det er ønskelig å plassere en eller flere epitoper her. Hvis det viser seg at det er umulig å uttrykke fullengde Her2-molekylet i E. coli eller i gjær, så bør den intracellulære delen kuttes etter det første CTL-epitop »hot spot» (omkring posisjon 800). Ytterligere CTL-epitoper kan deretter adderes til den C-terminale enden på det avkuttede molekylet. ;Transmembranområdet er antagelig en uavhengig foldingsenhet, og en erstatning av denne med TH-epitoper så som P2 eller P30, vil sannsynligvis ikke påvirke Her2-strukturen og foldingen. I tillegg kan TM-området forårsake store problemer for ekspresjon i gjær og E. coli, og bør i ethvert tilfelle erstattes. Således bør en epitop fortrinnsvis plasseres i dette området i alle konstruksjoner (eventuelt kan den forbli intakt i første konstruksjon ettersom denne inneholder flere CTL-epitoper og fordi denne på en eller annen måte inngår i transmisjonen av signaler ved ligandbinding). ;Det ekstracellulære området bør prinsipielt holdes intakt ved å plassere P2 og P30 i de intracellulære og transmembrane områdene, noe som maksimaliserer ;antallet mulige B-celleepitoper samtidig som strukturen påvirkes så lite som mulig. Den høye graden av homologi mellom EGFR og Her-3 og Her-4, gjør imidlertid at det er en viss risiko for tverreaktivitet til disse reseptorene, som kan (eller kan ikke) være uønsket. I tillegg er det blitt beskrevet enkelte monoklonale antistoffer som fungerer som agonister for reseptoren (eventuelt ved å stimulere heterodimeriseringen eller ligandbinding), og øke tumorstørrelsen in vivo. Man har derfor valgt posisjoner i det ekstracellulære området fordi dette forhåpentligvis vil redusere de risikoer som er nevnt ovenfor. ;Dette valget er blitt gjort på basis av alle de forannevnte parametere og er basert på to forskjellige antagelser: (i) Innsetting i ikke-bevarte (med hensyn til nærstående reseptorer) områder vil hjelpe til å opprettholde den tertiære strukturen og kan redusere uønsket aktivering av antistoffer, (ii) Innsetting i godt bevarte områder kan endre strukturen, men kan på den annen side samtidig redusere risikoen for tverreaktivitet ved å ødelegge de mest relaterte sekvensene. Begge antagelser er spekulative, men det er meget vanskelig å forutsi effekten av å plassere en epitop i enhver stilling i proteinet, og enkelte av disse posisjonene er derfor inkludert i konstruksjonene. ;Det har vært spekulert om det kan være en fordel fullstendig å fjerne de to cysteinrike områdene. Det har vært antydet at disse kan danne løsemiddeleksponerte sløyfestrukturer og kan danne uavhengige foldingsenheter, eventuelt inngå i dimerisering (noe som er indikert ved at de mange cysteingruppene kan tjene til å opprettholde den avstivede struktur som er nødvendig for å kunne danne et dimeriseringsområde). En fjerning av disse strukturene vil derfor eliminere risikoen for aktivering av antistoffer såvel som å redusere antallet tverreagerende antistoffer, ettersom disse områdene er de best bevarte av den ekstracellulære delen av proteinet. I tillegg vil slike cysteinrike områder kunne være problematiske med hensyn til produksjon i E. coli eller gjærceller. ;Detaljene i konstruksjonene er som følger ved å bruke P2 og P30-epitoper som ikke-begrensende eksempler: P2-epitopen vil primært bli plassert i det ekstracellulære området av Her2 i kombinasjon med P30-epitopen som erstatter delvis eller hele det membranovergripende området. P2-epitopen vil bli plassert i områder som er basert på de kriterier som er angitt ovenfor. De foretrukne konstruksjoner har de følgende strukturer: ; Epitopens posisjon indikerer den første og siste aminosyreposisjonen i epitopen i forhold til startpunktet for fullt utviklet Her2. Lengde er lengden i aminosyrer i den fullstendige konstruksjonen. I alle konstruksjoner, bortsett fra de hvor posisjonen er angitt med , erstatter epitopen en aminosyrestrekning med den samme lengden som i epitopen. »<*>» indikerer at epitopen er innsatt snarere enn å opptre som en erstatning i Her2. Alle de ovenfor angitte konstruksjoner er derfor avkortede versjoner av fullt utviklet Her2, hvor den utelatte del er fra C-terminusdelen.

De fleste konstruksjonene eksisterer i forskjellige versjoner, for eksempel i pcDNA3.1+-vektoren i fusjon med den naturlige HER2 signalpeptidsekvensen, i vektoren pMT/BiP/V5-His-A som en fusjon med BiP-lederpeptidet for ekspresjon i Drosophila-celler og uten ledersekvens i pET28b-vektoren for ekspresjon i E. coli-celler.

Nedenfor er det beskrevet modeller som er tenkt brukt under en screening og seleksjon av modifiserte Her2-proteiner. 1. Induksjon av antistoffer i transgen rotte Her2-mus og i kaniner til rotte og human Her2 henholdsvis, vil bli undersøkt ved hjelp av vanlig ELISA-teknologi etter minst immuniseringer. Kommersielt tilgjengelige antistoffer til human og rotte Her2 vil bli brukt som positive kontroller. 2. Disse kaninantistoffene vil bli brukt for å undersøke en mulig inhibering med hensyn til veksten av humane og transgene musetumorceller som overuttrykker Her2 i en in vitro-modell. 3. T-celleformering av PBL fra tetanus-immuniserte pasienter mot utvalgte humane Her2-molekyler vil bli undersøkt ved hjelp av vanlige kjente fremgangsmåter. 4. Evnen til modifiserte rotte Her2-molekyler til å indusere CTL-reaksjoner i rotte Her2-transgene mus, vil bli undersøkt ved å bruke tumorer fra disse musene som mål. 5. Det er en intensjon å syntetisere et utvalgt sett av peptider i det transmembrane området av human Her2 som innbefatter P2 og P30-epitoper. Disse peptidene vil bli testet ved en oppformering av PBL fra mennesker som tidligere var immuniserte med tetanustoksoid for derved å bestemme hvorvidt P2 og P30-epitoper effektivt kan fungere innenfor Her2-sekvensen og presenteres til T-celler. 6. Det er også mulig at utvalgte humane modifiserte Her2-proteiner vil bli testet for å utvikle nøytraliserende antistoffer i en mus som er blitt genetisk konstruert slik at den bare uttrykker humane VDJ-gener. Slike mus er tilgjengelige fra Abgenix, Fremont, CA, USA som et samarbeid.

Det er beskrevet fire godt karakteriserte transgene musemodeller for brystcancer som inneholder rotte Her2-onkogenet. De første tre transgene musene uttrykker aktivert Her2-onkogen mens den fjerde modellen bruker inaktivert Her2. Alle modellene bruker en MMTV-promoter for å drive ekspresjonen i pattedyrkjeitler.

Man har besluttet å bruke to transgene musemodeller: 1) en mer aggressiv

tumormodell som er beskrevet av muller et al som bruker aktivert Her2-onkogen (Muller et al, 1989), og 2) en noe mindre aggressiv tumormodell hvor inaktivert Her2 brukes for å skape fokale brystsvulster med lang latens (Guy et al, 1992). Begge typer transgene mus kan kjøpes fra Jackson og/eller Charles Rivers Laboratories.

I de innledende eksperimenter vil man la disse mus produsere antistoffer og CTL-reaksjoner ved å foreta en immunisering og forsterking med modifiserte rotte Her2-proteiner. Forekomst av tumorer vil så bli undersøkt slik dette er beskrevet av andre (Muller et al, 1989; Guy et al, 1992; Katsumata et al,

1995). Antistoffnivåene vil bli målt ved hjelp av en ELISA-prøve. CTL-aktiviteten kan så bestemmes ved å utvikle målceller som uttrykker rotte Her2 slik dette er nevnt ovenfor.

Alternativt kan man bruke en carcinommodell hvor nakne transplanterte mus brukes for passive vaksinasjonseksperimenter. Nakne mus kan transplanteres med humane tumorer, og man kan forsøke å hemme disse tumorene ved passiv overføring av serum fra normale og humaniserte mus som er blitt immuniserte med modifiserte Her2-proteiner. Skjønt dette kan være en fordelaktig modell for å undersøke antistoffenes rolle ved å undertrykke tumorer, så kan CTL-aktiviteten ikke måles direkte i dette systemet.

I den andre in vivo-modellen kan tumorer i mus utvikles ved å transplantere cellelinjer fra tumorer i transgene mus slik dette er beskrevet ovenfor. Cellelinjer som er utviklet fra disse mus kan så overføres til relevante musestammer og deretter fastslå plasseringen av tumorene ved hjelp av standardprotokoller.

Overføring av musetumorceller som overuttrykker rotte Her2: I dette systemet vil celler bli transfektert med rottegener og overført til MHC-kompatible mus. Hemming av tumorveksten vil kunne oppnås ved å utvikle anti-Her2-reaksjoner.

I disse systemene vil modifiserte Her2-proteiner kunne brukes som en vaksine i adjuvanter for å utvikle antistoffer og CTL-reaksjoner.

DNA-vaksinasjon er med godt hell brukt i flere systemer for å utvikle en effektiv immunreaksjon. Man undersøker for tiden muligheter for å tilføre DNA ved å bruke modifiserte selvproteiner. Det er en intensjon å anvende DNA-vaksinasjonsmetoder for å bestemme effektene av modifiserte Her2-konstruksjoner til å hemme tumorer i transgene musemodeller for

brystcancer. Lignende metoder kan muligens anvendes i mennesker for behandling av denne sykdommen.

EKSEMPEL 3

Produksjon av en anti-FGF8b-vaksine

Det vil i det følgende bli beskrevet hvordan man kan utvikle en human autovaksine mot FGF8b ved modifikasjon av molekylet ved innsetting av en eller flere promiskuøse fremmede T-celleepitoper for derved å få et utvalg av immunogeniserte »FGF8b»-molekyler. Disse konstruksjonene vil så bli testet for sin evne til å indusere antistoffer som er tverreaktive med de autentiske delene av FGF8b-molekylet. Deretter vil man i flere in vitro-prøver og in vivo dyremodeller bedømme effekten av de forskjellige konstruksjonene. De induserte antistoffene vil bli testet for sin evne til å aktivere komplement via den klassiske reaksjonsveien og for å starte ADCC via Fc-reseptorer. Endelig vil de forskjellige molekylene bli testet i dyremodeller for prostata og

brystcancer hos mennesker.

Konstruksjon av en autovaksine mot FGF8b

Ettersom FGF8b-polypeptidene er fullstendig identiske både i mus og hos mennesker, så kan alle konstruksjonene brukes i eksperimenter både i mennesker og mus.

De promiskuøse tetanustoksoid T-hjelpecelleepitopene P2 og P30 som med godt resultat er brukt i den humane TNFa-vaksinen, vil bli innsatt i FGF8b-polypeptidet. På grunn av den lille størrelsen på FGF8b, vil konstruksjonene bli fremstilt bare med en epitop pr. molekyl. Andre promiskuøse T-hjelpecelleepitoper som også kan komme i betraktning er for eksempel den influensa haemagglutininepitopen HA(307-319) og andre T-celleepitoper (0'Sullivan 1991).

Det er blitt fremstilt fire forskjellige immunogeniserte FGF8b-konstruksjoner hvor epitoper er fordelt langsetter molekylet. Disse fire konstruksjonene ble fremstilt på basis av multiple og parvise sammenligninger (alignments) av proteiner i FGF-gruppen. En parvis sammenligning og analyse av FGF2 og FGF8b blir brukt som basis for en analyse av en antatt sekundær struktur (for eksempel beta-plateforderling) langs FGF8b-molekylet. Residua som er bevart mellom FGF2 og FGF8b danner ingen klynger noe som helst sted i den tredimensjonale strukturen, noe som indikerer at det er ingen spesielle områder i molekylet som ikke kan erstattes uten at det opptrer skadelige effekter på foldingsevnene. De aminosyreresidua i FGF2 som tilsvarer cysteinresidua i FGF8b er plassert svært nær hverandre tredimensjonalt, noe som indikerer at de danner en disulfidbinding i FGF8b, og at sammenligningen og analysen er korrekt. I dette arbeidet tok man også hensyn til fleksibiliteten ved den N-terminale delen av FGF2.

Varianten av FGF8b med P30-epitopen i N-terminalen (F30N) ble utformet på basis av såkalte »no-gap» innstillinger av aminosyreresiduaene i FGF8b-proteinet og P30-epitopen (sekv.id. nr. 14), og så sortert etter forskjellige posisjoner med hensyn til kjemiske egenskaper for hver eneste aminosyregruppe. Bare området N-terminalt i forhold til den forutsatte beta-tønnestrukturen ble betraktet. Med hensyn til F30N er det 9 like ut av 21 residua. Ved å bruke denne pseudo-algoritmen kunne substitusjoner forventes å resultere i minimale totale strukturelle forandringer. Sekvensene i de fire forskjellige konstruksjonene, såvel som tredimensjonale fremstillinger av de erstattede aminosyrene, er vist på figur 6.

Varianten av FGF8b med P2-epitopen (sekv.id. nr. 12) i C-terminalen (F2C) ble opprinnelig betegnet som F30N. Det er imidlertid forutsatt at det forefinnes en god Kd-epitop i posisjonene 195-203. P2-epitopen ble derfor innsatt C-terminalt i forhold til denne epitopen. Igjen ble bare området C-terminalt av den forutsatte beta-tønnestrukturen betraktet.

De interne variantene av FGF8b (F30I og F2I) ble konstruert ved å erstatte ytre sløyfer i FGF2-strukturen med epitopene P2 og P30 henholdsvis, noe som gjør at beta-tønnestrukturkjeden i FGF-strukturen sannsynligvis vil bli uforandret.

De immunogeniserte FGF8b-molekylene er blitt uttrykt i Escherichia coli, noe som letter storskalaproduksjon av proteinene med minimale omkostninger. Skjønt FGF8b inneholder to mulige N-glykosyleringsseter (Asn31 og Asnl77), så har bakterielt uttrykt rekombinant FGF8b vist seg å være biologisk aktivt (MacArthur 1995a, Blunt 1997). For å lette rensing og refolding ble FGF8b-variantene fremstilt i en His-tagget versjon, noe som gjør det mulig med en kobling til en Ni-ladet kolonne.

Rensingen av molekylene ble utført ved å bruke den høye positive ladning på

proteinmolekylene eller His-taggen, og refolding vil bli utført ved hjelp av standardmetoder idet man tar hensyn til dannelsen av disulfidbroen.

De fire immunogeniserte molekylene har også sammen med villtype FGF8b cDNA blitt innsatt i DNA-vaksinasjonsvektorer.

Sortering og seleksjon av de modifiserte FGF8b-molekylene

De fire immunogeniserte FGF8b-molekylene ble uttrykt i bakterier og deretter renset for inklusjonslegemer. I parallell vil konstruksjonene bli brukt som DNA-vaksiner. De forskjellige konstruksjonene vil så bli sammenlignet for sin evne til å indusere forskjellige effekter, som er ønskelige ved behandlingen av prostata og brystcancerpasienter. Slike undersøkelser vil bli utført ved å bruke forskjellige in vitro og in vivo-prøver. Endelig vil resultatene av eksperimentene danne en basis for det endelige valg av en eller to kandidater for en FGF8b-vaksine i mennesker.

In vitro-modeller

Analyser i musesystemet

Mus av forskjellige haplotyper såvel som kaniner vil bli immunisert med forskjellige FGF8b-konstruksjoner i fullstendig Freunds adjuvant og deretter forsterket minst to ganger med samme antigener emulgert i ufullstendig Freunds adjuvant. Således kan man sammenligne evnen til de forskjellige konstruksjonene til å bryte B-celletoleransen. DNA-vaksinasjon ble utført også på andre dyr ved å bruke renset DNA i fullstendig Freunds adjuvant/ufullstendig Freunds adjuvant injisert intramuskulært med 14 dagers mellomrom.

Serumprøver vil bli tatt flere ganger under immuniseringsperioden, og man vil bestemme evnen til de forskjellige konstruksjoner til å indusere FGF8b-spesifikke antistoffer ved å bruke en vanlig ELISA-metode (Rochon 1994). Et kommersielt polyklonalt antiserum såvel som et kommersielt monoklonalt antistoff utviklet mot FGF8b (R&D) kan brukes som positive kontroller. FGF8b-proteinet er kommersielt tilgjengelig (R&D), men vil også bli fremstilt sammen med andre FGF8b-konstruksjoner og deretter renset/refoldet. Dette produkt kan så brukes for belegging av plater i en direkte ELISA-metode for testing av serumet fra mus/kaniner immunisert med FGF8b-variantproteinene.

Et verdifullt verktøy for å undersøke effektene av en vaksinasjon mot FGF8b vil være en FGF8b-avhengig cancercellelinje. Det er beskrevet flere FGF8b-positive cancercellelinjer i litteraturen, for eksempel MCF-7 eller SC-3. En slik FGF8b-avhengig musecancercellelinje vil kunne identifiseres ved å bruke kvantitative RT-PCR, celleoppformeringseksperimenter og STAT-3 fosforyleringsprøver.

Nærværet av FGF8b ligert til en FGF-reseptor på celleoverflaten vil kunne påvises eller bestemmes ved hjelp av FGF8b-spesifikke antistoffer i FACS eller ELISA-analyser. Antistoffer rettet inn mot flere av de forskjellige FGF-reseptorene er kommersielt tilgjengelige (R&D).

Konstruksjonene vil bli sammenlignet med hensyn til deres evne til å indusere antistoffer som er i stand til å aktivere en komplementoppløsning av FGF8b-produserende/bærende celler. Dette kan påvises med en av musetumorcellelinjene som uttrykker FGF8b som beskrevet tidligere, eller alternativt ved å bruke osmotisk FGF8b-belastede celler. Sera fra normale eller transgene mus (se det etterfølgende) immunisert med de humane FGF8b-konstruksjonene vil bli inkubert med cellelinjen og deretter inkubert med friskt marsvinkomplement. Antistoffstyrt komplementoppløsning av cellene kan påvises ved standardmetoder.

Evnen til de induserte antistoffer til å styre ADCC kan undersøkes ved å måle 51 Cr-frigjøringen fra merkede FGF8b-uttrykkende celler. Effektorcellene vil være PBMC fra syngene mus. For etablering av prøven kan det være hensiktsmessig å bruke en musecellelinje som er i stand til å styre ADCC (positiv for Fc-reseptorene) som effektorcelle med et antistoff mot humant FGF8b.

For å vise at FGF8b-kandidatvaksiner ikke fremmer en autoantistoffindusert tumorvekst, vil man også utføre en tumoroppformeringsprøve. Serumprøver fra immuniserte mus vil bli inkubert med FGF8b-uttrykkende tumorceller. Oppformering av tumorcellene kan så påvises ved deres evne til å inkorporere 3H-tymidin, som deretter tilsettes cellene.

Ettersom FGF8b er kjent for å indusere oppformering av en rekke forskjellige pattedyrceller, vil det også være nødvendig å undersøke vekstfremmende effekter av de forskjellige variantproteinene. Dette kan gjøres ved å bruke celleoppformeringsprøver, for eksempel av den type som er brukt av Marsh 1999.

Den biologiske effekten av FGF8b på pattedyrceller bør kunne nøytraliseres ved hjelp av autoantistoffer. Dette kan påvises ved å bruke rekombinant FGF8b og for eksempel NIH3T3 i celleroppformerings (og morforologiforandrings) undersøkelser. Tilsetting av autoantistoffene skulle også fjerne transformeringsaktiviteten til FGF8b.

Immuniseringsprotokoll

Det antall dyr som skal brukes i et FGF8b AutoVac

immuniseringseksperiment vil være avhengig av den forventede inntrenging av sykdommen i modellen, og antallet må derfor være nødvendig til at man kan oppnå statistisk signifikant informasjon. Immuniseringsprotokollen må være basert på den erfaring man har fra det nevnte TNFa AutoVac-prosjektet. Det er brukt forskjellige immuniseringsprotokoller for immunisering av mus med de forskjellige TNFa-analogene for spesifikke formål, men de fleste eksperimentene ble utført ved hjelp av følgende protokoll:

1. Musene må individuelt merkes enten ved hjelp av et øremerke eller med såkalte transpondere, 10 dyr i hvert bur. Sannsynligvis må hanner og hunner bedømmes separat, men i ethvert tilfelle vil man ikke ha begge kjønn i samme bur. Dyrene skal hensettes for hvile i minst 3 dager etter transport og merking. 2. Antigen 1 mg/ml i PBS-buffer ble emulgert med et tilsvarende volum av Freunds fullstendige antigen (CFA) (Difco eller Sigma). Emulsjonen ble kontrollert ved å plassere en dråpe av den på en vannoverflate og deretter observere hvorvidt dråpen holdes sammen eller sprer seg. Blanding ble opprettholdt til dråpen ikke sprer seg. 3. Standardimmuniseringsdosen er 100 [ ig antigen i et 100 (il volum + 100 (il adjuvant. Det totale immuniseringsvolum er således 200 (il, administrert subkutenøst på ryggen av dyret. 4. Forsterkninger ble utført 2-3 uker etter den første immuniseringen og deretter med 2-3 ukers mellomrom. Det forsterkende/immuniserende materialet ble fremstilt og administrert som forklart ovenfor, bortsett fra at man anvendte Freunds ufullstendige adjuvant. Sannsynligvis vil tre forsterkninger indusere den maksimale titreringsverdien. Den høyeste titreringsverdi vil således bli oppnådd fra 6-9 uker etter den første immuniseringen. 5. Det ble tatt orbitale blodprøver på 50-100 ul, vanligvis før den første immuniseringen og en uke etter hver forsterkning. Blodprøver fra halen kan også brukes, og 10-20 ul kan være tilstrekkelig for en titreringsbestemmelse.

Startpunktet for immuniseringsprogrammet vil være avhengig av utviklingen av sykdommen og den strategi man ønsker å bruke. Opprinnelig ble det forsøkt å utvikle en maksimal immunitet så raskt som mulig, men det er vanskelig å starte immuniseringen raskere enn når dyrene er ca. 5 uker gamle. Deretter skulle høye titreringsverdier kunne opprettholdes med en forsterkning med fra 6-8 ukers mellomrom, etter de første tre opprinnelige forsterkningene. Dette kan muligens være et problem hvis FGF8b-molekylene er nødvendige for en normal utvikling av de unge musene, og man kunne derfor argumentere for å starte immuniseringsprosessen senere når musene er fullt utvokste.

Analyser i det humane systemet

I seleksjonen mellom de forskjellige FGF8b-konstruksjonene vil man undersøke evnen til de humane antigenpresenterende celler til å presentere de innsatte immunogene T-celleepitopene til humane T-celler. Dette vil bli gjort ved å bruke de samme in vitro bearbeidingsprøvene for P2 og P30-presentasjon som ble brukt for TNFa-vaksinen. Humane T-cellelinjer som er spesifikke for P2 og P30 vil bli etablert ved hjelp av donorer som er vaksinert mot tetanus. Antigenpresenterende celler (PBMC) fra de samme donorer vil bli inkubert med forskjellige konstruksjoner, og T-cellelinjer vil så bli tilsatt. Nivået med hensyn til presentasjon av de innsatte T-celleepitopene kan så sammenlignes ved å måle stimuleringen av T-cellelinjene.

in vivo dyremodeller

Minst tre forskjellige systemer kan brukes for å kontrollere hvorvidt de induserte FGF8b-antistoffene er i stand til å kontrollere en FGF8b-avhengig in vivo-effekt.

Mus vil bli transplantert med mus FGF8 som uttrykker tumorceller, og inhibering av tumorutvikling vil bli undersøkt med en autovaksinasjon hvor man bruker modifiserte FGF8b-proteiner eller FGF8b DNA-vaksiner. Det ideelle systemet innbefatter bruken av celler som er isolert fra musetumorer. Alternativt kan man bruke andre musecellelinjer (for eksempel Balb/3T3) som stabilt er transfektert med FGF8b cDNA i en ekspresjonsvektor.

Carcinommodellen med transplanterte mus vil bli brukt for passive vaksinasjonseksperimenter. Nakne mus vil bli transplantert med humane tumorer, og inhibering av tumorene vil bli forsøkt ved overføring av serum fra normale eller humaniserte mus immunisert med modifiserte FGF8b-proteiner eller FGF8b DNA-vaksiner. Dette kan være meget fordelaktig for å undersøke hvorvidt de utviklede antistoffene har evnen til å undertrykke tumorer.

En annen fremgangsmåte for å oppnå et bevis på at opplegget fungerer, vil involvere bruken av mus som er transgene for FGF8b. Disse musene som er bærere av FGF8b cDNA under kontroll av den meget spesifikke mus brysttumorvirus (MMTV) promotoren, har vist seg å spontant utvikle FGF8b-uttrykkende brysttumorer (Coombes personlige kommunikasjon). Autovaksinasjon av disse musene med FGF8b-variantproteiner eller FGF8b DNA-vaksiner vil gjøre det mulig å vise hvorvidt autovaksinen vil gjøre musene i stand til å undertrykke eller å forkaste tumorene.

En mulig fremgangsmåte for å oppnå et bevis på at fremgangsmåten fungerer, er å bruke Wnt-1 transgene mus (MacArthur 1995c). Induksjon av brystcancere ved hjelp av MMTV-virus er angitt å aktivere FGF8b-ekspresjonen i mer enn halvparten av de musene som utviklet tumorer. FGF8b-avhengighet av tumorene vil kunne fastslås hvis de foreliggende autovaksiner kan undertrykke forekomsten eller veksthastigheten for disse tumorene.

Det er vist at transgene mus ofte viser ikke-fysiologiske immunologiske toleransemønstre som sannsynligvis ikke vil påvirke dette prosjekt, ettersom FGF8b-polypeptidene er identiske for både mennesker og mus.

Når eventuelt en fordelaktig effekt av FGF8b-immuniseringene er blitt vist i musemodellen, og egnede humane vaksinekandidater er blitt valgt, vil det være mulig å utføre et begrenset antall toksikologiundersøkelser. Deretter for

å oppnå et endelig bevis på opplegget, så vil man utføre vaksineundersøkelser på bryst og prostatacancerpasienter.

Hvis eksperimentene hvor man bruker in vivo-modeller har et positivt resultat, så er det viktig å understreke at da vil flere mutanter bli konstruert basert på de tilgjengelige data.

EKSEMPEL 4

Fremstilling av MUC-l-analog

Bare ett MUC-1 autovacmolekyl er blitt fremstilt. Dette innbefatter totalt ni mucingjentatte enheter, som hver har sekv.id. nr. 33. Konstruksjonen starter med tre slike sekvenser fulgt av en P2-epitop, fulgt av tre flere mucinsekvenser fulgt av en P30-epitop for så å ende med tre mucinsekvenser.

Konstruksjonen er blitt utført med og uten en N-terminal UNI-his-tag (sekv.id. nr. 23). Begge varianter er blitt uttrykt i E. coli. Identiteten på de uttrykte proteiner har blitt bekreftet både ved Western blotting og N-terminal sekvensering. Proteinet blir uttrykt i løselig form, men som en dimer, noe som er relativt overraskende.

Det HIS-taggede MUC-1-molekylet er blitt renset ved metallaffinitetskromatografl. Mengden av det rene proteinet og renhetsgraden er for tiden ikke kjent.

EKSEMPEL 5

Bryting av autotoleranse i et musemodellsystem

CTL-eksperimenter hvor mus er blitt immunisert med dendritiske celler pulset med både en klasse I og en klasse Il-epitop, har tidligere vist en bedret CTL-induksjon når immunisering og restimulering in vitro er utført med både et klasse I og et klasse Il-peptid, sammenlignet med en immunisering og restimulering med bare en klasse I-epitop. Denne situasjonen lar seg sammenligne med en immunisering med en autovaksine, hvor en fremmed klasse II-epitop er innsatt i et selvprotein. Opptak og bearbeiding av disse molekylene av profesjonelle antigenpresenterende celler så som dendritiske celler, fører til presentasjon av den fremmede klasse II-epitop sammen med noen selv klasse I-epitoper. Det er kjent at det er mulig å utløse autoreaktive CTL-reaksjoner, men nærværet av en fremmed klasse II-hjelpeepitop vil

høyst sannsynlig bedre denne CTL-induksjonen.

En mulig fordel ved foreliggende oppfinnelse for induksjon av selvreaktivt CTL, blir for tiden undersøkt i ovalbumintransgene mus. Det eksisterer fire forskjellige transgene linjer med forskjellige ovalbuminekspresjonsnivåer og toleransetilstander, kfr. Kurts C et al. 1997, J. Exp. Med. 186: 239-245, som beskriver RIP-mOVA-transgene mus (som uttrykker ovalbumin i pancreas, nyrer og tymus, og som har høy grad av toleranse), og Kurts C et al, 1998, J. Exp. Med. 188: 409-414, som beskriver RIP-OVA<lav>og RIP-OVA<høy>

transgene mus, som henholdsvis har lave og høye ekspresjonsnivåer av ovalbumin. Den siste linjen, RIP-OVA"<1>' som uttrykker ovalbumin på et intermediært nivå, er blitt levert av Dr. William R. Heath, som er samforfatter av de to ovennevnte referanser.

I kroppen er det forskjellige grader av toleranse overfor forskjellige antigener. En av de minste toleransegrader finnes i sirkulerende antigener i store mengder. Disse antigener vil alle trenge.inn i tymus, hvor selvreaktive T-celler blir ødelagt. Disse antigener er under »sentral'toleranse». Vevsspesifikke antigener på den annen side, vil ikke direkte trenge inn i tymus, og er vanligvis under en »perifer toleranse», som for eksempel utøves av T-celleanergi.

To ovalbumin AutoVac-konstruksjoner ble fremstilt. De angår begge sekvensen med tilvekstnr. J00845 i EMBL, hvor sekvensen fra P30 (sekv.id. nr. 14) er innsatt i to forskjellige posisjoner.

I konstruksjonen »OVA 3.1», er P30 innsatt i den posisjon som tilsvarer aminosyrene nr. 272-292 i ovalbumin. I konstruksjonen »OVA 3.2», er P30 innsatt i den posisjon som tilsvarer aminosyrene nr. 321-341 i ovalbumin. Disse konstruksjonene er blitt innsatt i vektoren pVaxl og brukt for DNA-immunisering.

Mus er blitt immunisert intradermalt en gang med 100 |ig hver av DNA. Tre uker etter denne immuniseringen ble miltene fjernet, og det ble utført en CTL-prøve ved å bruke målceller som uttrykker den dominante ovalbuminepitopen SIINFEKL, og det kuttede FILKSINE-peptidet som kontroll. Immuniseringene ga en klar CTL-induksjon i villtype C57BL/6-mus, noe som var forventet, ettersom både ovalbumin og P30 er fremmede i disse musene.

Man har nå til hensikt å immunisere de fire linjene med ovalbumintransgene mus med disse AutoVac-konstruksjonene. RIP-OVA<Iav>, RIP-OVA<int>og RIP-OVA<høy>uttrykker økende mengder av ovalbumin og har forskjellige toleransegrader slik det er nevnt ovenfor, foruten at også RIP-mOVA har høy toleransegrad.

I disse fire linjene med transgene mus, vil bare P30 være fremmed. Ovalbumin er et selv-antigen i disse musene, og denne situasjonen vil derfor utgjøre en virkelig autovaksinasjon for CTL-induksjon mot ovalbumin.

Preliminære resultater som er oppnådd i RIP-OVA<lav->mus med den laveste grad av »perifer toleranse» overfor ovalbumin, har vist at både ovalbuminet med innsatt P30 og naturlig forekommende ovalbuminmolekyler, er i stand til å indusere CTL-reaksjoner, og det er forventet at transgene mus med høyere toleransegrader bare vil være i stand til å utvikle en CTL-reaksjon mot de modifiserte ovalbuminmolekyler og ikke i den naturlige forekommende formen.

REFERANSELISTE

Ago H et al. (1991). J. Biochem (Tokyo), 110, 360-3.

Abdel-Nabi H et al. (1992). Sem. Uroi. 10, 45-54.

Acevedo et al. (1995), Cancer 76; 1467-1475.

Acevedo et al. (1997), Cancer Detect. Prev. 21; 295-303.

Adelstein S et al. (1991), Science 251: 1223-1225.

Babaian RJ et al. (1994), J. Uroi 152, 1952-1955.

Barnard JA et al. (1995) Gastroenterol. 108(2): 564-580.

Bier H et al. (1995), Eur. Arch. Otorhinolaryngol. 252(7): 433-9.

Bouchard L et al. (1989), Cell 57(6): 931-36.

Blaber M et al. (1996), Biochemistry 35, 2086-94.

Blimt AG et al. (1997), J Biol Chem 272, 3773-8.

Boring CC et al. (1993), CA Cancer J. Clin. 43: 7-26.

Boucher et al. (1995), Hum. Pathol. 26; 1201-1206.

Callahan R (1996), Breast Cancer Res Treat, 39, 33-44.

Carter RE (1996), Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 93, 749-753.

Chang et al., (1981), Fertil. Steril. 36; 659-663.

Chantry A, 1995, J. Biol. Chem. 270(7): 3068-73.

Crossley PH et al. (1996b), Cell, 84, 127-36.

Crossley PH et al. (1995), Development, 121, 439-51.

Crossley PH, Martinez, S. og Martin, G.R. (1996a) Midbrain-development induced by FGF8 in the chick embryo. Nature, 380, 66-8.

Dean C et al. (1994), Int. J. Cancer, suool 8: 103-107.

Dillioglugil 6 et al. (1995), Eur. Uroi. 28, 85-101.

Doi et al. (1996), Int. J. Cancer 65; 454-459.

Douglas TH et al. (1995), J. Surg. Oncol. 59(4), 246-250.

Earp HS et al. (1995), Breast Cancer Res. Treat. 35(1): 115-32.

Eccles SA (1994), Invasion Metastasis 14 (1-6): 337-48.

Eppenberger U et al. (1994),. J. Neurooncol. 22(3): 249-54.

Dorking TJ et al. (1999), Oncogene 18: 2755-2761.

Eriksson AE et al. (1993), Protein. Sei. 2: 1274-84.

Fernandez-Teran M. et al. (1997), Dev. Biol. 189, 246-55.

Fujii K et al. (1995), Exp. Cell. Res. 216(1): 261-72.

Furst J et al. (1994), Uroi. Res. 22, 107-113.

Furthauer M et al. (1997), Development 124: 4253-64.

Geissler et al. (1997), Lab. Invest. 76: 859-871.

Gemel J et al. (1996), Genomics 35: 253-7.

Ghosh AK et al. (1996), Cell Growth Differ 7: 1425-34.

Goldfarb M et al. (1996), Cytokine Growth Factor Rev 7: 311-25.

Goodnow CC et al. (1988), Nature 334: 676-682.

Goodnow CC et al. (1991), Nature 352: 532-536.

Greenberg NM et al. (1995), Proe. Nati. Acad. Sei. USA 92: 3439-3443.

Guy CT et al. (1992), Proe. Nati. Acad. Sei, USA 89: 10578-10582.

Heikinheimo M et al. (1994),. Mech Dev, 48: 129-38.

Henttu P og Vihko P (1989), Bioch. Biophys. Res. Comm. 160: 903-910.

Hopp TP og Woods KR (1983), Mol. Immunol. 20: 483-9. -

Horoszewicz JSH et al. (1983), Cancer Res. 43: 1803-1818.

Horoszewicz JSH et al. (1987), Anticancer Res. 7: 927-936.

Hoshikawa M et al. (1998), Biochem Biophys Res Commun 244: 187-91.

Husmann I et al. (1996), Cytokine Growth Factor Rev 7: 249-58.

Israeli RS et al. (1994), Cancer Res. 54: 1807-1811.

Israeli RS et al. (1993), Cancer Res. 53: 227-230.

Israeli RS et al. (1994), Cancer Res. 54: 6306-6310.

Jacoby et al. (1984), Adv. Immunol. 35: 157-208.

Johnson RL og Tabin CJ (1997), Cell 90: 979-90.

Kahn D et al. (1994), J. Uroi. 152: 1490-1495.

Kapoun AM og Shackleford GM (1997), Oncogene 14: 2985-9.

Kettunen P og Thesleff I (1998), Dev Dyn 211: 256-68.

Koga M et al. (1995), J. Steroid Biochem Mol Biol 54: 1-6.

Kouhara H et al., (1994), Oncogene 9: 455-62.

Kozak M (1991), J Cell Biol 115: 887-903.

Lapthorn et al. (1994), Nature 369: 455-461.

Lazar et al. (1995), Cancer Res. 55: 3735-3738.

Leek J et al. (1995), British Journal of Cancer 72: 583-588.

Leung HY et al. (1996), Oncogene 12: 1833-5.

Lopes AD (1990), Cancer Res. 50: 6423-6429.

Loric S et al. (1995), Clin. Chem. 41(12): 1698-1704.

Lupu R et al. (1995), Semin. Cancer. Biol. 6: 135-145.

MacArthur CA et al. (1995a), Cell Growth Differ 6: 817-25.

MacArthur CA et al. (1995b), Development 121: 3603-13.

MacArthur CA et al. (1995c), J Virol 69: 2501-7.

Manabe et al. (1985), Gastroenterology 89: 1319-1325.

Marsh SK et al. (1999), Oncogene 18, 1053-1060.

Martin L et al. (1993), J. Immunol. 150(49): 1234-1243.

Mattei MG et al. (1995), Mamm Genome 6: 196-7.

McDonnel WM og Askari FD (1996), New Engl. J. Med 334: 42-45.

Meyers EN et al. (1998), Nat Genet 18: 136-41.

Milich DR et al. (1994), J. Immunol. 153(1): 429-435.

Milner PG et al. (1989), Biochem Biophus Res Commun 165: 1096-103.

Miyashita Y et al. (1994), Jpn J Cancer Res 85: 1117-23.

Modjtahedi H et al. (1993a), Br. J. Cancer 67(2): 254-261.

Modjtahedi H et al. (1993b), Cell. Biophys. 22(1-3): 129-46.

Modjtahedi H et al. (1996), Br. J. Cancer 73(2): 228-35.

Moy FJ et al. (1996), Biochemistry, 35: 13552-13561.

Muller WJ et al. (1988), Cell 54(1): 105-115.

Murphy GP et al. (1996), Prostate 28: 266-271.

Murphy GP et al. (1995), Prostate 26: 164-168.

Murphy GP et al. (1995), Anticancer Research 15(4): 1473-1379.

Nguyen L et al. (1990), Clin. Chem. 35: 1450-1455.

NonomuraN et al. (1990), Cancer Res 50: 2316-2321.

0'Sullivan D et al. (1991), J. Immunology 147: 2663-9.

Ohnishi Y et al. (1995), Br. J. Cancer 71(5): 969-73.

Ohuchi H et al. (1997a), Development 124: 2235-44.

Ohuchi H et al. (1997b), Mech Dev 62: 3-13.

Ohuchi H et al. (1994), Biochem Biophys Res Commun 204: 882-8.

Payson RA et al. (1996), Oncogene 13: 47-53 .

Pillai et al. (1996), FEBS Lett. 387: 23-26.

Pollard M og Luckert PH (1994), Anticancer Res. 14: 901-903.

Prigent SA og Lemoine NR (1992), Progress in Growth Factor Research 4: 1-24.

R&D focus, Drug News, (1996) 5, 21, 9.

Rammensee H-G. et al. (1995), Immunogenetics 41: 178-228.

Regelson W (1995), Cancer 76: 1299-1301.

Ries LAG et al. (1996), SEER Cancer Statistics Review, 1973-1993: Tables and Graphs, National Cancer Institute, Bethesda, MB.

Rinker-Schaeffer CW et al. (1995), Genomics, 30(1): 105-108.

Rochon YP et al. (1994), Prostate 25: 219-223.

Rock KL et al. (1996), Vaccina 14: 1560-1568.

Rock KL og Clark K (1996), J. Immunol. 156: 3721-3726.

Rudra-Ganguly N et al. (1998), Concogene 16: 1487-92.

Salomon DS et al. (1995), Critical reviews in Onocology/Hematology 19: 183-232.

Sato B et al. (1993), J Steroid Biochem Mol Biol 47: 91-8.

Schlegel J et al. (1994), J. Neurooncol. 22(3): 249-54.

Schmitt JF et al. (1996), J Steroid Biochem Mol Biol 57: 173-8.

Sheaff et al. (1996), J. Clin. Pathol. 49: 329-332.

Sherman L et al. (1998), Genes Dev 12: 1058-71.

Shimamura K og Rubenstein JL (1997), Development 124: 2709-18.

Shirai A og Klinman DM (1993), AIDS Res. Hum. Retroviruses 9, 979-983.

Sokoloff M et al. (1996), Cancer 77(9): 1862-1872.

Steinhoff U et al. (1994), Eur. J. Immunol. 24(3): 773-76.

Stevens VC (1986), CibaFound. Symp. 119: 200-225.

Su SL et al. (1995), Cancer Res. 55: 1441-1443.

Syrigos et al. (1998), Gut 42: 88-91.

Talwar et al. (1976), PNAS 73: 218-222.

Talwar et al. (1994), PNAS 91: 8532-8536.

Tanaka A et al. (1992), Proe Nati Acad Sei USA 89: 8928-32.

Tanaka A et al. (1998), Cancer Research 58: 2053-56.

Tanaka A et al. (1995), FEBS Lett 363: 226-30.

Thomas H et al. (1996), Br. J. Cancer, 73(1): 65-72.

Tjoa B et al. (1996), Prostate 28: 65-69.

Tjoa B et al. (1995), Prostate 27: 63-69.

Tokunaga A et al., (1995), Cancer 75 (6 suppl): 1418-25.

Tosi E et al. (1995), Int. J. Cancer 62(5): 643-50.

Triozzi et al. (1994), Int. J. One. 5: 1447-1453.

Troyer JK et al. (1995), Int. J. Cancer 62: 552-558.

Valone FH et al. (1995), J. Clin. Oncol. 13(9): 2281-92.

Valve E et al. (1997), Biochem Biophys Res Commun 232: 173-7.

van Dam PSA et al. J. Clin. Pathol. 1994 47(10): 914-19.

Weiner LM et al. (1995), Cancer Res. 55(20): 4586-4593.

Wright GL Jr et al. (1996), Urology 48: 326-334.

Wu J et al. (1997), J Steroid Biochem Mol Biol 62: 1-10.

Wy X et al., Fan, Z., Masui, FL, Rosen, N., Mendelsohn, J. Apoptosis induced by an anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody in a human clolrectal carcinoma cell line and its delay by insulin.

Wynant GE et al. 81991), Prostate 18: 229-241.

Xu X et al. (1998), Development 125: 753-65.

Yamanishi H et al. (1995), J Steroid Biochem Mol Biol 52: 49-53.

Yogeeswaran og Salk (1981), Science 212: 1514-1516.

Yokoyama H et al. (1998), dev Biol 196: 1-10.

Yoshimura K et al. (1996), Cancer Lett 103: 91-7.

Yoshiura K et al. (1997), Am J Med Genet 72: 354-62.

Young RA og Davis RW (1983), Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 80: 1194-1198.

Yule TD (1993), J. Immunol. 151(6): 3057-3069.

Zhang JD et al. (1991), [published erratum appears in Proe Nati Acad Sei USA 88(12):5477], Proe Nati Acad Sei USA 88, 3446-50.

Zhu Z et al. (1995), Int. J. Cancer 62(3): 319-324.

ZhuXet al. (1991), Science 251: 90-3.

Claims (83)

1. Fremgangsmåte for nedregulering av celler som uttrykker et celle-assosiert polypeptidantigen i et dyr, inkludert et menneske, hvor nevnte polypeptidantigen er svakt immunogent eller ikke-immunogent i dyret, ved å indusere en spesifikk cytotoksisk T-lymfocytt (CTL) respons mot cellene som bærer det celle-assosierte antigenet på sin overflate eller som har det celle-assosierte polypeptidantigenet i sine intracellulære rom, karakterisert ved at den består av å utføre, i dyret, samtidig presentasjon av en egnet antigenpresenterende celle (APC) med 1) minst én CTL-epitop avledet fra det celle-assosierte polypeptidantigen, og 2) minst én første T-hjelpelymfocytt (TH ) epitop som er fremmed for dyret.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at dyret er et menneske.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at minst én CTL-epitop når den presenteres er assosiert med et MHC klasse I molekyl på overflaten av APC og/eller hvori nevnte ene første fremmede TH-epitop når det presenteres er assosiert med et MHC klasse II molekyl på overflaten av APC.

4. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at APC er en dendrittisk celle eller en makrofag.

5. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at polypeptidantigenet er valgt fra et tumorassosiert polypeptidantigen, et selvprotein, et viralt polypeptid antigen, og et polypeptid antigen avledet fra en intracellulær parasitt eller bakterie.

6. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at presentasjonen av APC med CTL-epitopen og den første fremmede TH-epitop blir utført ved å presentere dyrets immunsystem med minst én første analog av polypeptidantigenet, hvor nevnte første analog omfatter en variasjon av aminosyresekvensen til polypeptidantigenet, hvor nevnte variasjon inneholder minst CTL-epitopen og den første fremmede TH-epitop.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at minst første analog inneholder en betydelig fraksjon av kjente og forutsagte CTL-epitoper av det celle-assosierte polypeptidantigen.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at en betydelig del av dé kjente og forutsagte CTL-epitopene i aminosyresekvensen til analogen blir gjenkjent av minst 90 % av MHC-I haplotyper som gjenkjenner alle kjente og forutsagte CTL-epitoper i det celle-assosierte polypeptidantigen.

9. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 6-8, karakterisert ved at hovedsakelig alle kjente CTL-epitoper i det celle-assosierte polypeptidantigen er tilstede i analogen og/eller hvori hovedsakelig alle forutsagte CTL-epitoper i det celle-assosierte polypeptidantigen er tilstede i minst den første analog.

10. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 6-9, karakterisert ved at minst én første analog videre omfatter en del som består av en modifikasjon av strukturen til det celle-assosierte polypeptidantigen, hvor nevnte modifikasjon har som resultat at immunisering av dyret med den første analog induserer produksjon av antistoffer i dyret mot det celle-assosierte polypeptidantigen.

11. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at det omfatter å utvirke presentasjon for dyrets immunsystem av en immunogen effektiv mengde av minst en andre analog av polypeptidantigenet, hvor nevnte analog inneholder en modifikasjon av strukturen til polypeptidantigenet, hvor nevnte modifikasjon har som resultat at immunisering av dyret med den andre analog induserer produksjonen av antistoffer mot det celle-assosierte polypeptidantigen.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 11, karakterisert ved at modifikasjonen omfatter at minst én andre fremmed TH-epitop er inkludert i den andre analogen.

13. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 6-12, karakterisert ved at den første og/eller andre analog omfatter en hovedsakelig del av det celle-assosierte polypeptid antigens B-celle-epitoper.

14. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 6-13, karakterisert ved at variasjonen og/eller modifikasjon omfatter aminosyresubstitusjon og/eller delesjon og/eller innskudd og/eller tillegg.

15. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 6-14, karakterisert ved at variasjonen og/eller modifikasjon omfatter at - minst én første del inkluderes i den første og/eller andre analog, hvor første del påvirker målretting av analogen til en antigenpresenterende celle (APC), og/eller - minst én andre del er inkludert i den første og/eller andre analog, hvor nevnte andre del stimulerer immunsystemet og/eller - minst én tredje del er inkludert i første og/eller andre analog, hvor nevnte tredje del optimaliserer presentasjon av analogen til immunsystemet.

16. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 6-15, karakterisert ved at variasjonen og/eller modifikasjon inkluderer duplisering av minst én C-celleepitop eller minst én CTL-epitop i det celle-assosierte polypeptidantigen.

17. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 6-16, karakterisert ved at variasjonen og/eller modifikasjon inkluderer introduksjon av et hapten.

18. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at den første og/eller andre fremmede TH-epitop er immunodominerende.

19. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at den første og/eller andre fremmede TH-epitop er promiskuøs.

20. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 12-19, karakterisert ved at den første og/eller andre fremmede TH-epitop er valgt fra en naturlig TH-epitop og en kunstig MHC-II bindende peptidsekvens.

21. Fremgangsmåte som angitt i krav 20, karakterisert ved at den naturlige TH-epitop er valgt fra en Tetanus toksoid epitop såsom P2 eller P30, en difteritoksoidepitop, en influensavirus hemagluttininepitop, og en P. falciparum CS-epitop.

22. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 12-21, karakterisert ved at den første og/eller andre TH-epitop og/eller første og/eller andre og/eller tredje del er presentert i form av - sidegrupper festet kovalent eller ikke-kovalent til egnede kjemiske grupper i aminosyresekvensen til det celle-assosierte polypeptidantigen eller en subsekvens derav, og/eller - fusjonspartnere til aminosyresekvensen avledet fra det celle-assosierte polypeptidantigen.

23. Fremgangsmåte som angitt i krav 22, karakterisert ved at den første del er en hovedsakelig spesifikk bindingspartner for et APC spesifikt overflateantigen, såsom et karbohydrat for hvilke det er en reseptor på APC, f.eks. mannan eller mannose.

24. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 15-23, karakterisert ved at den andre del er et cytokin valgt fra interferon y (IFN-y), Flt3L, interleukin 1 (IL-1), interleukin 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4), interleukin 6 (IL-6), interleukin 12 (IL-12), interleukin 13 (IL-13), interleukin 15 (IL-15), og granulocytt-makrofag kolonistimulerende faktor (GM-CSF), eller en effektiv del derav; et varmesjokkprotein valgt fra HSP70, HSP90, HSP70, GRP94, og kalretikulin (CRT), eller en effektiv del derav, eller et hormon.

25. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 15-24, karakterisert ved at den tredje del er et lipid såsom en palmitoylgruppe, en myristylgruppe, en farnesylgruppe, en geranyl-geranylgruppe, et GPI-anker og en N-acyldiglysedridgruppe.

26. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 6-25, karakterisert ved at den første og/eller andre analog har hovedsakelig den totale tertiære struktur til det celle-assosierte polypeptidantigen.

27. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 6-26, karakterisert ved at presentasjonen av APC blir effektuert ved å administrere til dyret en immunogen effektiv mengde av minst én første analog.

28. Fremgangsmåte som angitt i krav 27, karakterisert ved at det også blir administrert en immunologisk effektiv mengde av minst en andre analog.

29. Fremgangsmåte som angitt i krav 27 eller 28, karakterisert ved at minst én første og/eller andre analog er formulert sammen med en farmasøytisk og immunologisk akseptabel bærer og/eller vehikkel og, eventuelt, en adjuvans.

30. Fremgangsmåte som angitt i krav 29, karakterisert ved at nevnte adjuvans fasiliterer opptak av APC, såsom dendrittceller, av minst første og/eller andre analoger.

31. Fremgangsmåte som angitt i krav 30, karakterisert ved at adjuvansen er valgt fra gruppen som består av en immunmålrettende adjuvans; en immunmodulerende adjuvans, såsom et toksin, et cytokin og et mykobakteriederivat; en oljeformulering, en polymer; en micelldannende adjuvans; et saponin; en immunostimulerende kompleksmatriks (ISCOM-matriks); en partikkel; DD A; aluminiumadjuvansia; DNA-adjuvansia; y-inulin; og en innkapslende adjuvans.

32. Fremgangsmåte som angitt i krav 31, karakterisert ved at cytokinet er som definert i krav 24, eller en effektiv del derav, hvori toksinet er valgt fra gruppen som består av listerolicin (LLO), lipid A (MPL, L180.5/RaILPS), og varmestabilt enterotoksin, hvori mykobakteriederivatet er valgt fra gruppen som består av muramyldipeptid, fullstendig Freunds adjuvans, RIBI, og en diester eller trehalose såsom TDM og TDE, hvori den immunmålrettende adjuvans er valgt fra gruppen som består av CD40 ligand, CD40 antistoffer eller spesifikt bindende fragmenter derav, mannose, et Fab-fragment, og CTLA-4, hvori oljeformuleringen omfatter squalen eller ufullstendig Freunds adjuvans, hvori polymeren er valgt fra gruppen som består av karbohydrat såsom dekstran, PEG, stivelse, mannan og mannose; en plastpolymerL; og lateks såsom latekskuler, hvpri saponinet er Quillaja saponaria saponin, Quil A, og QS21 og hvori partikkelen omfatter lateks eller dekstran.

33. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 27-32, som inkluderer administrering via en rute valgt fra den orale rute og den parenterale rute såsom intradermal, subdermal, intrakutan, subkutan, peritoneal, bukal, sublingual, epidural, spinal, anal og intrakranial rute.

34. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 27-33, karakterisert ved at den inkluderer minst én administrering pr. år, såsom minst 2, 3, 4, 5, 6 og 12 administreringer pr. år.

35. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1-5, karakterisert ved at presentasjonen ble utført ved å administrere til dyret en ikke-patogen mikroorganisme eller virus som bærer et nukleinsyrefragment som koder og uttrykker minst én CTL-epitop og minst én TH-epitop.

36. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 6-14, karakterisert ved at presentasjonen ble utført ved å administrere til dyret en ikke-patogen mikroorganisme eller virus som bærer minst et nukleinsyrefragment som koder og uttrykker minst den første analog.

37. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 15-26, hvori TH-epitopen og/eller den første og/eller andre og/eller tredje del er tilstede i form av fusjonspartnere til aminosyresekvensen avledet fra det celle-assosierte polypeptidantigen, og hvori presentasjonen blir utført ved å administrere til dyret en ikke-patogen mikroorganisme eller virus som bærer minst ett nukleinsyrefragment som koder og uttrykker den første og/eller den andre analog.

38. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 11-14 eller 36, karakterisert ved at presentasjonen ble utført ved å administrere til dyret en ikke-patogen mikroorganisme eller virus som bærer minst ett nukleinsyrefragment som koder og uttrykker minst den andre analog.

39. Fremgangsmåte som angitt i krav 38, karakterisert ved at den ikke-patogene mikroorganisme eller virus blir administrert én gang til dyret.

40. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1-5, karakterisert ved at presentasjonen blir utført ved in vivo introdusering, i APC, minst ett nukleinsyrefragment som koder og uttrykker minst én CTL-epitop og/eller minst én B-celleepitop og minst én første fremmed TH-epitop.

41. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 6-14, karakterisert ved at presentasjonen ble utført ved in vivo introdusering, i APC, minst ett nukleinsyrefragment som koder og uttrykker den første analog.

42. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 15-26, karakterisert ved at TH-epitopen og/eller den første og/eller den andre og/eller den tredje del er tilstede i form av fusjonspartnere til aminosyresekvensen avledet fra det celle-assosierte polypeptidantigen, og hvori presentasjonen blir utført ved in vivo introdusering, inn i APC, minst ett nukleinsyrefragment som koder og uttrykker den første og/eller andre analog.

43. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1-14 og 41, karakterisert ved at den ytterligere omfatter in vivo introduksjon, inn i APC, av minst ett nukleinsyrefragment som koder og uttrykker den andre analog.

44. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1-5, karakterisert ved at presentasjonen ble utført ved in vivo sam-introdusering, inn i APC, minst to nukleinsyrefragmenter, hvori én koder og uttrykker minst én CTL-epitop, og hvori en annen koder og uttrykker minst én første fremmed TH-epitop, og hvori den første fremmede TH-epitop er definert i ett av kravene 1, 2 og 21-24.

45. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 40-44, karakterisert ved at nukleinsyrefragmentet(ene) introdusert er valgt fra nakent DNA, DNA formulert med ladede eller uladede lipider, DNA formulert til liposomer, DNA inkludert i en viral vektor, DNA formulert med et transfeksjonsfasiliterende protein eller polypeptid, DNA formulert med et målrettende protein eller polypeptid, DNA formulert med et målrettende karbohydrat, DNA formulert med kalsiumpresipiterende midler, DNA koplet til et inert bæremolekyl, og DNA formulert med adjuvans.

46. Fremgangsmåte som angitt i krav 45, karakterisert ved at adjuvansen er valgt fra gruppen som består av adjuvansene definert i ett av kravene 30-32.

47. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 40-46; karakterisert ved at administrasjonsmåten er definert i krav 33 eller 34.

48. Fremgangsmåte for seleksjon av en immunogen analog av et celle-assosiert polypeptidantigen som er svakt immunogent eller ikke-immunogent i et dyr, hvor nevnte immunogene analog er i stand til å indusere en CTL-respons i dyret mot cellene som utviser et MHC klasse I molekyl bundet til en epitop avledet fra det celle-assosierte polypeptidantigen, karakterisert ved at den omfatter: a) identifisering av minst én subsekvens av aminosyresekvensen til det celle-assosierte polypeptidantigen som ikke inneholder kjente eller forutsagte CTL-epitoper, b) preparere minst én muligens immunogen analog av det celle-assosierte polypeptidantigen ved å innføre, i aminosyresekvensen til det celle-assosierte polypeptidantigenet, minst én TH-epitop fremmed for dyret i en stilling innenfor minst én subsekvens identifisert i trinn a), og c) å velge den/de analoger fremstilt i trinn b) som er verifiserbart i stand til å indusere en CTL-respons i dyret.

49. Fremgangsmåte som angitt i krav 48, karakterisert ved 1) at subsekvensen identifisert i trinn a) videre ikke inneholder cysteinrester eller alternativt hvori TH-epitopen innført i trinn b) ikke hovedsakelig forandrer mønsteret til cysteinrestene, og/eller 2) subsekvensen identifisert i trinn a) videre ikke inneholder kjente eller forutsagte glykosyleringssteder, eller, alternativt, hvori TH-epitopen innført i trinn b) ikke hovedsakelig forandrer glykosyleringsmønsteret, og/eller 3) subsekvensen identifisert i trinn a) bidrar signifikant til en patofysologisk virkning utført ved det celleassosierte polypeptidantigen, og hvori introduksjonen i trinn b) av den fremmede TH-epitop reduserer eller utvisker nevnte patofysiologiske virkning, og/eller 4) subsekvensen identifisert i trinn a) er homolog til en aminosyresekvens av et forskjellig proteinantigen til dyret, og hvori innføringen av TH-epitopen i trinn b) hovedsakelig fjerner homologien, og/eller 5) introduksjon i trinn b) av den fremmede TH-epitop resulterer i preservering av en hovedsakelig fraksjon av B-celleepitoper til det celle-assosierte polypeptidantigen.

50. Fremgangsmåte som angitt i krav 49, karakterisert ved at når variant 5 inkluderes har analogen den totale tertiære struktur til det celle-assosierte polypeptidantigen.

51. Fremgangsmåte for fremstilling av celle som produserer en analog til et celle-assosiert polypeptidantigen, karakterisert ved at den omfatter å innføre, inn i en vektor, en nukleinsyresekvens som koder en analog som har blitt valgt i henhold til fremgangsmåten i ett av kravene 48-50 og transformere en egnet vertscelle med vektoren.

52. Fremgangsmåte til fremstilling av en analog av et celle-assosiert polypeptidantigen, karakterisert ved at den omfatter å dyrke cellen oppnådd i henhold til fremgangsmåten i krav 51 under betingelser som fasiliterer uttrykk av nukleinsyresekvensen som koder det celle-assosierte polypeptidantigen og gjenvinne analogen fra kultursupernatanten eller fra cellene.

53. Fremgangsmåte som angitt i krav 52, karakterisert ved at den ytterligere omfatter trinnet å rense den gjenvunnende analog og eventuelt utsette det rensede produkt for kunstige post-translasjonelle modifikasjoner såsom omfolding, behandling med enzymer, kjemisk modifikasjon og konjugering.

54. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at det svake celle-assosierte antigen er valgt fra gruppen som bestpr av 5 alfa reduktase, a-fetoprotein, AM-1, APC, APRIL, BAGE, P-kateni9n, Bcl2, bcr-abl (b3a2), CA-125, CASP-8/FLICE, katepsiner, CD19, CD20, CD21, CD23, CD22, CD33, CD35, CD44, CD45, CD46, CD5, CD52, CD55 (791Tgp72), CD59, CDC27, CDK4, CEA, c-myc, Cox-2, DCC, DcR3, E6/E7, EGFR, EMBP, Ena78, farsyl transferase, FGF8a eller FGF8b, FLK-1/KDR, folinsyrereseptor, G250, GAGE-Family, gastrin 17, gastrinfrigjørende hormon (Bombesin), GD2/GD3/GM2, GnRH, GnTV, GP1, gplOO/Pmel 17, gp-100-in4, gpl5, gp75/TRP-l, hCG, heparanase, Her2/neu, HMTV, Hsp70, hTERT (telomerase), IGFR1, IL-13R, iNOS, Ki 67, KIAA0205, K-ras, H-ras, N-ras, KSA (C017-1A), LDLR-FUT, MAGE Family (MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, etc), mammaglobin, MAPI7, Melan-A/MART-l,mesotelin, MIC A/B, MT-MMP, Moxl, Mucin såsom MUC-1, MUC-2, MUC-3 og MUC-4 som er tilfeldig glykolysert, MUM-1, NY-ESO-1, osteonektin, pl5, P170/MDR1, p53, p97/melanotransferrin, PAI-1, PDGF, plasminogen (uPA), PRAME, probasin, progenipoietin, PS A, PSM, RAGE-1, Rb, RCAS1, SART-1, SSX genfamilie, STAT3, Stn (mucin assosiert), TAG-72, TGF-a, TGF-P, tymosin p 15, TNF-a, TPA, TPI, TRP-2, tyrosinase, VEGF, ZAG, pl6INK4, og glutation S-transferase.

55. Fremgangsmåte som angitt i krav 54, karakterisert ved at det celle-assosierte polypeptidantigen er humant PSM.

56. Fremgangsmåte som angitt i krav 55, karakterisert ved at den fremmede T-celleepitop er introdusert i en del av PSM aminosyresekvensen definert ved SEKV. ID nr. 2 stillinger 16-52 og/eller 87-108 og/eller 210-230 og/eller 269-289 og/eller 298-324 og/eller 442-465 og/eller 488-514 og/eller 598-630 og/eller 643-662 og/eller 672-699.

57. Fremgangsmåte som angitt i krav 55 eller 56, karakterisert ved at den ble brukt til behandling eller lindring av prostatakreft.

58. Fremgangsmåte som angitt i krav 54, karakterisert ved at det celle-assosierte polypeptidantigen er fibroblast vekstfaktor 8b (FGF8b).

59. Fremgangsmåte som angitt i krav 58, karakterisert ved at den fremmede T-celleepitop blir innført i en del av FGF8b aminosyresekvens definert ved SEKV. ID. nr. 6 stillinger 1 54 og/eller 178 215 og/eller 55 58 og/eller 63 68 og/eller 72 76 og/eller 85 91 og/eller 95 102 og/eller 106 111 og/eller 115 120 og/eller 128 134 og/eller 138 144 og/eller 149 154 og/eller 158 162 og/eller 173 177, og hvori introduksjonen fortrinnsvis ikke hovedsakelig involverer aminosyrer 26-45 og aminosyrer 186-215.

60. Fremgangsmåte som angitt i krav 58 eller 59, karakterisert ved at det ble brukt i behandling eller letting av kreft såsom prostatakreft og brystkreft.

61. Fremgangsmåte som angitt i krav 54, karakterisert ved at det celle-assosierte polypeptidantigen er Her2.

62. Fremgangsmåte som angitt i krav 62, karakterisert ved at den fremmede T-celleepitopen blir introdusert i en del av Her2 aminosyresekvensen definert ved SEKV. ID. nr. 3 stillinger 5-25 og/eller 59-73 og/eller 103-117 og/eller 149-163 og/eller 210-224 og/eller 250-264 og/eller 325-339 og/eller 369-383 og/eller 465-479 og/eller 579-593 og/eller 632-652 og/eller 653-667 og/eller 661-675 og/eller 695-709 og/eller 710-730.

63. Fremgangsmåte som angitt i krav 61 eller 62, karakterisert ved at den ble brukt til behandling eller lindring av brystkreft.

64. Analog av human PSM som er immunogen hos mennesker, karakterisert ved at den omfatter en hovedsakelig del av alle kjente og forutsagte CTL og B-celleepitoper til PSM og inkluderer minst én fremmed TH-epitop som definert i et av kravene 18-21.

65. Analog som angitt i krav 64, karakterisert ved at minst én fremmed TH-epitop er tilstede som et innskudd i PSM-aminosyresekvensen eller som en substitusjon av del av PSM-aminosyresekvensen eller som et resultat av delesjon av en del av PSM-aminosyresekvensen.

66. Analog som angitt i krav 65, karakterisert ved at den fremmede TH-epitop er introdusert i stillinger definert i krav 54.

67. Analog av human Her2 som er immunogen hos mennesker, karakterisert ved at den omfatter en hovedsakelig del av alle kjente og forutsagte CTL og B-celleepitoper i Her2 og inkluderer minst én fremmed TH-epitop som definert i et av kravene 18-21.

68. Analog som angitt i krav 67, karakterisert ved at minst én fremmed TH-epitop er tilstede som et innskudd i Her2 aminosyresekvensen eller som en substitusjon av del av Her2 aminosyresekvensen eller som et resultat av delesjon av del av Her2 aminosyresekvensen.

69. Analoger som angitt i krav 68, karakterisert ved at den fremmede TH-epitop er introdusert i stillinger definert i krav 62.

70. Analog av human/murin FGF8b som er immunogen hos mennesker, karakterisert ved at den omfatter en hovedsakelig del av alle kjente og forutsagte CTL og B-celleepitoper til FGF8b og inkluderer minst én fremmed TH-epitop som definert i et av kravene 18-21.

71. Analog som angitt i krav 70, karakterisert ved at minst én fremmed TH-epitop er tilstede som et innskudd i FGF8b aminosyresekvensen eller som en substitusjon av del av FGF8b aminosyresekvensen eller som resultat av delesjon av del av FGF8b aminosyresekvensen.

72. Analog som angitt i krav 71, karakterisert ved at den fremmede TH-epitop er introdusert i stillinger definert i krav 59.

73. Immunogen sammensetning, karakterisert ved at den omfatter som et effektivt immunogent middel analogen som angitt i et av kravene 64-72 blandet med en farmasøytisk og immunologisk akseptabel bærer eller vehikkel, og eventuelt en adjuvans.

74. Nukleinsyrefragment, karakterisert ved at det koder en analog som angitt i et av kravene 64-72.

75. Vektor, karakterisert ved at den bærer nukleinsyrefragmentet som angitt i krav 74.

76. Vektor som angitt i krav 75, karakterisert ved at den er i stand til autonom replikasjon.

77. Vektor som angitt i krav 75 eller 76, karakterisert ved at den er valgt fra gruppen som består av et plasmid, en fag, et kosmid, et minikromosom og en virus.

78. Vektor som angitt i et av kravene 75-77, karakterisert ved at det omfatter i 5'-3' retning og i operativ kobling, en promoter for å drive ekspresjon av nukleinsyrefragmentet i henhold til krav 74, eventuelt en nukleinsyresekvens som koder et styrepeptid som er i stand til sekresjon av eller integrasjon i membranen til polypeptidfragmentet, nukleinsyrefragmentet i henhold til krav 74, og eventuelt en nukleinsyresekvens som koder en terminator.

79. Vektor som angitt i et av kravene 75-78, karakterisert ved at når den introduseres i en vertscelle blir integrert i vertscellegenomet eller er ikke istand til å bli integrert i vertscellegenomet.

80. Transformert celle, karakterisert ved at det bærer vektoren som angitt i et av kravene 75-79.

81. Sammensetning for å indusere produksjon av antistoffer mot PSM, Her2 eller FGF8b, karakterisert ved at den omfatter 1) et nukleinsyrefragment som angitt i krav 74 eller en vektor som angitt i et av kravene 75-79, og 2) en farmasøytisk og immunologisk akseptabel diluent og/eller vehikkel og/eller adjuvans.

82. Stabil cellelinje, karakterisert ved at den bærer vektoren som angitt i et av kravene 75-79 og som uttrykker nukleinsyrefragmentet som angitt i krav 74 og som eventuelt sekrerer eller bærer analogen som angitt i et av kravene 64-72 på sin overflate.

83. Fremgangsmåte for fremstilling av cellen som angitt i krav 80, karakterisert ved at den omfatter å transformere en vertscelle med nukleinsyrefragmentet som angitt i krav 74 eller med vektoren i henhold til et av kravene 75-79.