PL202399B1 - Zastosowanie adiuwanta i pierwszego analogu polipeptydowego antygenu związanego z komórką lub co najmniej jednego fragmentu kwasu nukleinowego kodującego epitop CTL pochodzący z antygenu polipeptydowego związanego z komórką lub niepatogennego mikroorganizmu lub wirusa, który niesie fragment kwasu nukleinowego, który koduje i wyraża co najmniej jeden epitop CTL pochodzący z antygenu polipeptydowego związanego z komórką, sposób selekcji immunogennego analogu antygenu polipeptydowego związanego z komórką, sposób wytwarzania komórki wytwarzającej analog an - Google Patents

Abstract

1. Zastosowanie (a) adiuwanta i pierwszego analogu polipeptydowego antygenu zwi azanego z komórk a, który to analog obejmuje znane i przewidywane epitopy CTL rozpoznawane przez co najmniej 50% haplotypów MHC-I rozpoznaj acych wszyst- kie znane i przewidywane epitopy CTL w antygenie polipeptydowym zwi azanym z komórk a pochodz acym od antygenu polipep- tydowego zwi azanego z komórk a, który jest s labo immunogenny albo nieimunogenny u zwierz ecia, a ponadto ten pierwszy analog obejmuje co najmniej jeden pierwszy epitop limfocytu pomocniczego T (TH), który jest obcy dla zwierz ecia, i który jest wprowadzany do sekwencji aminokwasowej antygenu polipeptydowego zwi azanego z komórk a przez substytucj e i/lub delecj e i/lub insercj e, lub (b) co najmniej jednego fragmentu kwasu nukleinowego koduj acego epitop CTL pochodz acy z antygenu poli- peptydowego zwi azanego z komórk a, który jest s labo immunogenny albo nieimunogenny u zwierz ecia i co najmniej jednego pierwszego fragmentu kwasu nukleinowego koduj acego epitop limfocytu pomocniczego T (TH), który jest obcy dla zwierz ecia, przy czym fragmenty kwasu nukleinowego koduj ace epitopy CTL i TH s a cz esci a tej samej cz asteczki, epitopy CTL s a rozpo- znawane przez co najmniej 50% haplotypów MHC-I rozpoznaj acych wszystkie znane i przewidywane epitopy CTL w antygenie polipeptydowym zwi azanym z komórk a lub (c) niepatogennego mikroorganizmu lub wirusa, który niesie fragment kwasu nukle- inowego, który koduje i wyra za co najmniej jeden epitop CTL pochodz acy z antygenu polipeptydowego zwi azanego z komórk a, który jest s labo immunogenny albo nieimunogenny u zwierz ecia, i co najmniej jeden pierwszy epitop limfocytu pomocniczego T (TH), który jest obcy dla zwierz ecia, przy czym, gdy te fragmenty kwasu nukleinowego koduj ace epitopy CTL i TH s a cz esci a tej samej cz asteczki, epitopy CTL s a rozpoznawane przez co najmniej 50% haplotypów MHC-I rozpoznaj acych wszystkie znane i przewidywane epitopy w antygenie polipeptydowym zwi azanym z komórk a, do wytwarzania immunogennej kompozycji do leczenia patologicznego procesu wybranego spo sród nowotworu, infekcji wirusowej i infekcji wywo lanej przez wewn atrzkomór- kowego paso zyta lub bakteri e, przez indukowanie swoistej odpowiedzi cytotoksycznego limfocytu T (CTL) u zwierz ecia przeciw komórkom nios acym antygen polipeptydowy zwi azany z komórk a na powierzchni lub w wewn atrzkomórkowym kompartmencie, po podaniu tej kompozycji, przy czym antygen polipeptydowy zwi azany z komórk a jest wybrany spo sród antygenu polipeptydo- wego zwi azanego z nowotworem, w lasnego bia lka, polipeptydowego antygenu wirusowego i polipeptydowego antygenu pocho- dz acego od wewn atrzkomórkowego paso zyta lub bakterii. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie adiuwanta i pierwszego analogu polipeptydowego antygenu związanego z komórką lub co najmniej jednego fragmentu kwasu nukleinowego kodującego epitop CTL pochodzący z antygenu polipeptydowego związanego z komórką lub niepatogennego mikroorganizmu lub wirusa, który niesie fragment kwasu nukleinowego, który koduje i wyraża co najmniej jeden epitop CTL pochodzący z antygenu polipeptydowego związanego z komórką, sposób selekcji immunogennego analogu antygenu polipeptydowego związanego z komórką, sposób wytwarzania komórki wytwarzającej analog antygenu polipeptydowego związanego z komórką, sposób wytwarzania analogu antygenu polipeptydowego związanego z komórką, analog ludzkiego PSM, analog ludzkiego Her2, analog ludzkiego/mysiego FGF8b, kompozycja immunogenna, fragment kwasu nukleinowego kodujący analog, wektor niosący ten fragment, komórka transformowana tym wektorem, kompozycja dla indukowania wytwarzania przeciwciał przeciw PSM, Her2 lub FGF8b, stabilna linia komórkowa, sposób wytwarzania komórki.

Wynalazki jak przedstawione powyżej umożliwiają wprowadzenie nowych terapii do zwalczania chorób, takich jak nowotwory, które charakteryzują się występowaniem związanych z komórką produktów ekspresji genu, które są słabo lub są nieimmunogennne. Szczególnie, obecny wynalazek umożliwia wywoływanie odpowiedzi immunologicznej zależnej od cytotoksycznych limfocytów T (CTL), gdzie komórki niosące epitopy z produktów ekspresji genu są atakowane i zabijane przez CTL, oraz wytwarzanie immunogennego, zmodyfikowanego polipeptydu przeciw genom, które pochodzą od słabo immunogennych antygenów.

Ideę szczepienia przeciw nowotworowi rozważa się od ponad stu lat z okresami zwiększonego zainteresowania, szczególnie na początku tego wieku.

Jednakże w ciągu ostatnich 10 lat znacząco zwiększyło się zrozumienie podstawowych mechanizmów molekularnych odpowiedzi immunologicznej. Wśród najważniejszych przełomowych odkryć dokonanych w tym czasie znajduje się odkrycie cytokin i czynników wzrostowych, których lista nieustannie się wydłuża, zrozumienie mechanizmu oddziaływania pomiędzy limfocytami T i B, jak również ustalenie szlaków obróbki antygenów komórkowych włącznie z rolą i strukturą cząsteczek MHC klas I i II w prezentacji antygenu. Ważnymi odkryciami, które dotyczą immunologii nowotworu - choć nadal nie jest ona w pełni zrozumiana - było również wyjaśnienie mechanizmów indukcji tolerancji immunologicznej w gospodarzu. Wszystkie te badania prowadziły do ogromnych wysiłków celem opracowania nowych sposobów leczenia raka u człowieka.

Zależnie od tego jak przez pacjenta jest nabyta odporność wobec nowotworu postępowanie w immunoterapii może być podzielone na bierne lub czynne. W biernej immunoterapii pacjent otrzymuje biernie składniki odpornościowe, takie jak cytokiny, przeciwciała, cytotoksyczne limfocyty T lub aktywowane przez limfocyt komórki NK (LAK). Natomiast, aktywne specyficzne protokoły immunoterapii obejmują aktywną indukcję imunogenności wobec guza przez szczepienie komórką nowotworu lub jej antygenowymi składnikami. Ta ostatnia postać leczenia jest korzystna z uwagi na przedłużoną odporność.

Bierne i czynne szczepienie przeciw rakowi skupia się na wywołaniu humoralnej albo i komórkowej odpowiedzi immunologicznej. W odniesieniu do aktywnego szczepienia dobrze ustalono, że indukcja pomocniczych limfocytów T CD4 dodatnich jest niezbędna, ponadto dla dalszej indukcji przeciwciał lub limfocytów T cytotoksycznych CD8 dodatnich.

Bierne szczepienie przeciwciałami.

Od odkrycia technologii przeciwciał monoklonalnych w połowie lat siedemdziesiątych opracowano wiele leczniczych przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko antygenom swoistym dla nowotworu lub towarzyszącym nowotworowi. Jednakże leczenie przeciwciałem monoklonalnym jest przyczyną szeregu poważnych problemów:

- Wstrzyknięcie takiej obcej substancji indukuje u pacjenta odpowiedź immunologiczną przeciw wstrzykniętym przeciwciałom, co może prowadzić do mniej skutecznego leczenia jak również do poważnych alergicznych efektów ubocznych u pacjenta.

- Przeciwciał a monoklonalne zazwyczaj muszą być podane w duż ych iloś ciach. Jest to problemem ponieważ koszt wytworzenia przeciwciał monoklonalnych jest ogromny.

- Przeciwciał a monoklonalne muszą być podane drogą pozajelitową i w zwią zku z tym potrzebne są ich stosunkowo duże ilości, a pacjenci muszą często być w czasie leczenia hospitalizowani.

PL 202 399 B1

- Wstrzyknięcia przeciwciał monoklonalnych musz ą być powtórzone w raczej krótkich odstępach czasu (tygodnie) celem podtrzymania efektu terapeutycznego.

- Zazwyczaj przeciwciała monoklonalne nie są zdolne do aktywowania drugorzędowych uk ładów efektorowych układu immunologicznego, takich jak układ dopełniacz, komórki NK lub makrofagi zabijające komórki nowotworowe.

Ta ostatnia wada ma szczególne znaczenie w leczeniu raka i może być ważnym powodem, dlaczego leczenie przeciwciałem monoklonalnym raka, w szeregu przypadkach nie było szczególnie pomyślne. Obecnie używane przez wiele firm tak zwane humanizowane przeciwciała monoklonalne są mniej immunogenne, lecz niestety są jeszcze mniej zdolne do aktywowania drugorzędowych efektorowych układów immunologicznych. Ponadto, obserwowano przypadki przerzutowych guzów nowotworowych, które nie miały oryginalnego antygenu guza, bowiem przeciwciała te nie indukują efektu typu „niewinnego/przypadkowego świadka obecności” na komórkach guza nie niosących antygenu guza.

Słabe zdolności efektorowe przeciwciał monoklonalnych prowadzą do opracowania przeciwciał monoklonalnych chemicznie skoniugowanych z różnymi toksynami i izotopami promieniotwórczymi. Pharmacia Upjohn AB np. opracowała koniugaty pomiędzy monoklonalnymi przeciwciałami swoistymi wobec nowotworu a toksyną A ze Staphylococcus aureus celem aktywowania w nowotworze limfocytów T. Medarex Inc. opracował biswoistwe przeciwciała monoklonalne zawierające swoisty wobec nowotworu fragment Fab, jak również swoisty względem receptora Fc fragment przeciwciała w celu pobudzenia zabijania przez makrofagi komórek nowotworu. Oba konstrukty są bardziej skuteczne niż samo przeciwciało monoklonalne, lecz są one również droższe i bardziej immunogenne. Przeciwciała skoniugowane z izotopami promieniotwórczymi są również drogie jak również immunogenne i obserwuje się inne, na ogół toksyczne skutki uboczne.

Pojawienie się w technologii przeciwciała monoklonalnego było głównym krokiem umożliwiającym wytwarzanie cząsteczek dobrze określonych, o wysokim powinowactwie wiązania. Jednakże, ponieważ przeciwciała te są monoklonalne reagują z jednym rodzajem epitopu na antygenie nowotworowym. Jest to główny powód, z którego nie są one zdolne do aktywowania układu dopełniacza lub wiązania z receptorami Fc komórek NK i makrofagów. Te bardzo silne układy efektorowe zazwyczaj wymagają współlokalizacji wielu fragmentów przeciwciała Fc wystających z antygenu.

Zatem więc inni badacze podejmują próby zastosowania dwóch przeciwciał monoklonalnych w kombinacji, co prowadzi do poprawionego efektu. Wydaje się to bardzo sensowne zamiast atakowania komórek nowotworowych wysoko specyficznymi przeciwciałami poliklonalnymi skierowanymi specyficznie przeciw nowotworowi, lub przeciw (nadwyrażonymi) antygenami towarzyszącymi nowotworowi lub receptorom czynnika wzrostowego. Takie przeciwciała będą w pełni zdolne do aktywowania drugorzędowych układów efektorowych wymienionych powyżej. Ponadto, prawdopodobnie, lokalne reakcje zapalne indukowane przez te układy efektorowe mogą prowadzić do wtórnego działania na komórki, które są „niewinnym/przypadkowym świadkiem” i nie wyrażają ujawnionego antygenu nowotworowego jak również do aktywacji specyficznej dla nowotworu TIL (limfocyty naciekające guz) w tkance nowotworowej. Efekty takie był y obserwowane przez Medarex Inc., gdy stosowali swoje koniugaty bispecyficznego przeciwciała monoklonalnego.

Od czasu opracowania technologii przeciwciał monoklonalnych, nie była zbyt intensywnie badana możliwość potencjalnego użycia przeciwciał poliklonalnych do leczenia raka (z wyjątkiem opisanych poniżej antygenów). Głównym powodem jest, że dobrze określona specyficzność wobec guza lub towarzyszących guzowi antygenów powierzchniowych została scharakteryzowana dopiero w ostatnich latach, lecz - co ważniejsze - wiele z nich zostało odrzuconych jako antygeny własne, a co za tym idzie nie immunogenne. Zgodnie z tym, do badania ich działania powinny być użyte ksenogeniczne poliklonalne przeciwciała. Jednakże, takie przeciwciała indukują silną odpowiedź odpornościową przeciw wstrzykniętym obcym przeciwciałom poliklonalnym, co szybko likwiduje efekt leczniczy.

Aktywne szczepienie w celu indukcji przeciwciał

Obecne próby indukcji leczniczego autoprzeciwciała poliklonalnego u pacjentów z rakiem przez aktywne szczepienie zakończyły się sukcesem. Zostały opracowane szczepionki przeciw związanym z błoną węglowodanowym autoantygenom (takim jak O-związane nieprzewidzianie wyrażane antygeny Tn i sTn i liposacharydy gangliozydów GM2 i GD3). Te małe struktury węglowodanowe są jednakże bardzo słabymi antygenami, tak że muszą być zastosowane koniugaty tych cząsteczek z cząsteczkami nośnikowymi, takimi jak hemocyjanina ze skałoczepa (KLH) lub mucyny owcy (zawierające Tni sTn). U pacjentów z czerniakiem indukcja przeciwciał przeciw GM2 była związana z przedłużonymi okresami bez choroby i ogólne przeżycie po co najmniej 5 miesiącach. Również faza II badań loso4

PL 202 399 B1 wych została przeprowadzona na pacjentach z rakiem sutka, z zastosowaniem koniugatu sTn i KLH w adiuwancie DETOX-B (BIOMIRA Inc.) pokazując, że pacjenci immunizowani sTn mieli znacząco dłuższą medianę przeżycia w porównaniu z kontrolami. Kolejnym przykładem aktywnej indukcji poliklonalnych przeciwciał w raku jest zastosowanie idiotypowo specyficznego szczepienia przeciw limfoma z limfocytów B, które; choć było obiecujące, jest ograniczone jedynie do tego typu raka.

I w ko ń cu firma z USA Aphton Inc. opracował a aktywne skoniugowane szczepionki przeciw hormonowi uwalniającemu gonadotropinę GnRh i gastrynie. Wykazano, że ta szczepionka jest zdolna do kontrolowania aktywności biologicznej tych hormonów, które mogą również działać jako autokrynny czynnik wzrostu dla pewnych komórek nowotworowych. Pomyślne próby II fazy klinicznej zostały przeprowadzone z pacjentami z rakiem żołądkowo-jelitowym i trwają postępowania III fazy klinicznej.

Cytotoksyczne limfocyty T

Kilka grup jasno wykazało, że specyficzne względem guza limfocyty T cytotoksyczne (CTL) występują w wielu nowotworach. Te CTL są określane jako limfocyty naciekające guz (TIL). Jednakże, komórki te są w jakiś sposób stały się anergiczne i nie dające odpowiedzi w wyniku działania szeregu różnych możliwych mechanizmów, włącznie z wydzielaniem, przez komórki nowotworu, immunosupresyjnych cytokin, utratą sygnałów wywołujących współpobudzenie, hamowaniem cząsteczek MHC klasy I itp.

Podjęto liczne próby izolacji specyficznych dla nowotworu peptydów wiążących się z HLA klasy I, rozpoznawanych przez TIL, w niektórych przypadkach z powodzeniem (np. peptydy z antygenów towarzyszących szpiczakowi). Takich peptydów użyto do wywołania u gospodarza odpowiedzi specyficznej wobec nowotworu, lecz praktyczne zastosowanie peptydów specyficznych dla nowotworu w szczepionkach jest ograniczone do wą skiego wycinka populacji z powodu wą skiej specyficznoś ci wiązania peptydów przez HLA klasy I. Ponadto, stosunkowo trudno wywołuje się odpowiedź CTL in vivo przy pomocy syntetycznych peptydów, z uwagi na krótki półokres trwania tych substancji w układach biologicznych, jak również trudności z egzogennym piętnowaniem cząsteczek MHC klasy I.

Podjęto wiele innych prób celem wywołania odpowiedzi CTL specyficznej dla nowotworu, włącznie z użyciem cytokin (np. IL-2, IFN-γ, IL-6, IL-4, IL-10 lub GM-CSF) lub cząsteczek kostymulujących (B7) albo w postaci rozpuszczalnej albo wyrażonej przez stransfekowaną komórkę nowotworową. Ponadto immunizacje całymi komórkami allogenicznymi lub autologicznymi lub antygenami guza przygotowanymi w adiuwantach specjalnie zaprojektowanych dla prezentacji antygenu drogami prezentacji antygenu MHC klasy I, lub antygenami nowotworowymi wyrażanymi w np. wektorach z wirusa krowianki itp., były stosowane z różnym powodzeniem. Nadal istnieje powszechne przekonanie wśród immunologów zajmujących się nowotworami, że jednym z najlepszych sposobów zlikwidowania nowotworu byłaby indukcja silnej specyficznej odpowiedzi przeciw nowotworowi przez CTL.

Poza faktem, że takie leczenie jest zazwyczaj bardzo drogie i trudne do powtórzenia, odrzucono je również z uwagi na trudność w uzyskaniu dobrej odpowiedzi immunologicznej przeciw nowotworowi, ponieważ liczne towarzyszące guzowi antygeny są faktycznie białkami specyficznymi dla gospodarza, względem których większość limfocytów T, jak się wydaje, jest tolerancyjnymi. Zatem wydaje się iż konieczne jest wywołanie u pacjenta możliwego do kontrolowania stanu komórkowej odpowiedzi autoimmunologicznej.

Celem obecnego wynalazku jest dostarczenie udoskonalonych sposobów i czynników dla wywołania w organizmie gospodarza odpowiedzi immunologicznej przeciw niepożądanym antygenom, np. antygenom nowotworu. Dalszym celem wynalazku jest dostarczenie sposobu wytworzenia polipeptydowych analogów takich niepożądanych antygenów, analogów, które są zdolne do indukcji skutecznej odpowiedzi immunologicznej przeciw niepożądanemu antygenowi.

W zakres wynalazku wchodzi zatem zastosowanie (a) adiuwanta i pierwszego analogu polipeptydowego antygenu związanego z komórką, który obejmuje znane i przewidywane epitopy CTL rozpoznawane przez co najmniej 50% haplotypów MHC-I rozpoznających wszystkie znane i przewidywane epitopy CTL w antygenie polipeptydowym związanym z komórką pochodzącym od antygenu polipeptydowego związanego z komórką, który jest słabo immunogenny albo nieimunogenny u zwierzęcia, a ponadto obejmuje co najmniej jeden pierwszy epitop limfocytu pomocniczego T (TH), który jest obcy dla zwierzęcia, i który jest wprowadzany w sekwencji aminokwasowej antygenu polipeptydowego związanego z komórką przez substytucję i/lub delecję i/lub insercję, lub (b) co najmniej jednego fragmentu kwasu nukleinowego kodującego epitop CTL pochodzący z antygenu polipeptydowego związanego z komórką, który jest słabo immunogenny albo nieimunogenny u zwierzęcia i co najmniej pierwszego fragmentu kwasu nukleinowego kodującego epitop limfocytu pomocniczego T (TH), który jest obcy dla zwierzęcia, przy czym fragmenty kwasu nukleinowego kodujące epitopy CTL i TH są częścią

PL 202 399 B1 tej samej cząsteczki, epitopy CTL są rozpoznawane przez co najmniej 50% haplotypów MHC-I rozpoznających wszystkie znane i przewidywane epitopy CTL w antygenie polipeptydowym związanym z komórką lub (c) niepatogennego mikroorganizmu lub wirusa, który niesie fragment kwasu nukleinowego który koduje i wyraża co najmniej jeden epitop CTL pochodzący z antygenu polipeptydowego związanego z komórką, który jest słabo immunogenny albo nieimunogenny u zwierzęcia, i co najmniej jeden pierwszy epitop limfoocytu pomocniczego T (TH), który jest obcy dla zwierzęcia, przy czym, gdy te fragmenty kwasu nukleinowego kodujące epitopy CTL i TH są częścią tej samej cząsteczki, epitopy CTL są rozpoznawane przez co najmniej 50% haplotypów MHC-I rozpoznających wszystkie znane i przewidywane epitopy w antygenie polipeptydowym związanym z komórką, do wytwarzania immunogennej kompozycji do leczenia patologicznego procesu wybranego spośród nowotworu, infekcji wirusowej i infekcji wywołanej przez wewnątrzkomórkowego pasożyta lub bakterię, przez indukowanie swoistej odpowiedzi cytotoksycznego limfocytu T (CTL) u zwierzęcia przeciw komórkom niosącym antygen polipeptydowy związany z komórką na powierzchni lub w wewnątrzkomórkowym kompartmencie, po podaniu tej kompozycji, przy czym antygen polipeptydowy związany z komórką jest wybrany spośród antygenu polipeptydowego związanego z nowotworem, własnego białka, polipeptydowego antygenu wirusowego i polipeptydowego antygenu pochodzącego od wewnątrzkomórkowego pasożyta lub bakterii. Korzystnie zwierzęciem jest istota ludzka.

Korzystnie w wariancie (a) znane i przewidywane epitopy CTL w sekwencji aminokwasowej co najmniej jednego pierwszego analogu są rozpoznawane przez co najmniej 90% haplotypów MHC-I rozpoznających wszystkie znane i przewidywane epitopy CTL w antygenie polipeptydowym związanym z komórką, lub zasadniczo wszystkie znane epitopy CTL antygenu polipeptydowego związanego z komórką są obecne w co najmniej jednym pierwszym analogu i/lub zasadniczo wszystkie przewidywane epitopy CTL antygenu polipeptydowego związanego z komórką są obecne w co najmniej jednym pierwszym analogu.

Korzystnie w wariancie (a) antygen polipeptydowy związany z komórką obejmuje części, które są zewnątrzkomórkowe, przy czym co najmniej pierwszy analog ponadto obejmuje część składającą się z modyfikacji struktury antygenu polipeptydowego związanego z komórką, powodującej w wyniku immunizacji zwierzęcia pierwszym analogiem indukowanie wytwarzania przeciwciał u zwierzęcia przeciw antygenowi polipeptydowemu związanemu z komórką.

Korzystnie w wariancie (a) antygen polipeptydowy związany z komórką obejmuje części, które są zewnątrzkomórkowe, a zastosowanie ponadto obejmuje zastosowanie co najmniej jednego drugiego analogu antygenu polipeptydowego albo fragmentu kwasu nukleinowego kodującego jeden drugi analog antygenu polipeptydowego lub co najmniej jednego niepatogennego mikroorganizmu lub wirusa niosącego fragment kwasu nukleinowego kodującego co najmniej jeden drugi analog antygenu polipeptydowego do wytwarzania immunogennej kompozycji do skutecznego prezentowania zwierzęcemu układowi odpornościowemu immunogennie skutecznej ilości co najmniej jednego drugiego analogu antygenu polipeptydowego, który zawiera modyfikację struktury antygenu polipeptydowego, której efektem jest indukowanie wytwarzania przeciwciał przeciw antygenowi polipeptydowemu związanemu z komórką po immunizacji zwierzęcia drugim analogiem.

Korzystnie modyfikacja polega na tym, że co najmniej jeden drugi obcy epitop TH jest włączony do drugiego analogu, a jeszcze bardziej korzystnie drugi analog obejmuje znaczną frakcję epitopów limfocytów B antygenu polipeptydowego związanego z komórką.

Korzystniej w kompozycji podawana jest również immunologicznie skuteczna ilość co najmniej jednego drugiego analogu.

Korzystnie w wariancie (a) do pierwszego i/lub drugiego analogu(ów) jest włączone co najmniej jedno pierwsze ugrupowanie skutecznie kierujące analog do komórki prezentującej antygen (APC) i/lub co najmniej jedno drugie ugrupowanie stymulujące układ odpornościowy i/lub co najmniej jedno trzecie ugrupowanie optymalizujące prezentację analogu układowi odpornościowemu.

Korzystnie pierwsze i/lub drugie i/lub trzecie ugrupowanie są obecne w postaci

- grup bocznych przyłączonych kowalencyjnie lub niekonwalencyjnie do odpowiednich grup chemicznych w sekwencji aminokwasowej antygenu polipeptydowego związanego z komórką lub jego podsekwencji i/lub

- partnerów fuzyjnych z sekwencją aminokwasową pochodzącą z antygenu polipeptydowego związanego z komórką.

Jeszcze bardziej korzystnie pierwsze ugrupowanie jest zasadniczo specyficznym partnerem wiążącym dla specyficznego antygenu powierzchniowego APC, takim jak węglowodan, dla którego na

PL 202 399 B1 powierzchni APC znajduje się receptor, np. mannan lub mannoza, a drugie ugrupowanie jest cytokiną wybraną spośród interferonu γ (IFN-γ), Flt3L, interleukiny 1 (IL-1), interleukiny 2 (IL-2), interleukiny 4 (IL-4), interleukiny 6 (IL-6), interleukiny 12 (IL-12), interleukiny 13 (IL-13), interleukiny 15 (IL 15) i czynnika stymulującego kolonie granulocytów-makrofagów (GM-CSF) lub ich aktywnej części; białka szoku cieplnego wybranego z pośród HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 i kalretikuliny (CRT) lub ich aktywnej części lub hormonu.

Korzystniej trzecie ugrupowanie jest lipidem, takim jak grupa palmoilowa, grupa mirystylowa, grupa farnezylowa, grupa geranyl-geranyl, kotwicząca grupa GPI i grupa N-acylodiglicerydowa.

Korzystnie w wariancie (a) pierwszy i/lub drugi analog obejmuje podwojenie co najmniej jednego epitopu limfocytów B lub co najmniej jednego epitopu CTL antygenu polipeptydowego związanego z komórką.

Korzystnie też w wariancie (a) co najmniej pierwszy i/lub drugi analog obejmuje wprowadzony hapten.

Korzystnie w wariancie (a) pierwszy i/lub drugi obcy epitop TH jest immunodominujący.

Korzystnie także w wariancie (a) pierwszy i/lub drugi obcy epitop TH jest różnorodny.

Korzystnie pierwszy i/lub drugi obcy epitop TH jest wybrany spośród naturalnego epitopu TH i sztucznej sekwencji peptydowej wiążącej MCH-II.

Korzystnie naturalny epitop TH jest wybrany z spośród epitopu toksoidu tężcowego, takiego jak P2 lub P30, epitopu toksoidu błonniczego, epitopu hemaglutyniny wirusa grypy i epitopu CS z P. falciparum.

Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku pierwszy i/lub, gdzie jest to odpowiednie, drugi analog ma zasadniczo ogólną strukturę trzeciorzędową części zewnątrzkomórkowych antygenu polipeptydowego związanego z komórką.

Korzystnie w wariancie (a) co najmniej jeden pierwszy i/lub drugi analog jest sformułowany razem z farmaceutycznie i immunologicznie akceptowalnym nośnikiem i/lub podłożem.

Korzystnie w wariancie (a) adiuwant ułatwia wychwyt przez APC, takie jak komórki dendrytyczne, co najmniej pierwszego i/lub drugiego analogu.

Korzystnie adiuwant jest wybrany z grupy składającej się z immunogennego adiuwanta kierującego; immunogennego adiuwanta modulującego, takiego jak toksyna, cytokina i pochodne z mykobakterii; preparatu olejowego; polimeru; adiuwanta tworzącego micele; saponiny; macierzy kompleksu immunostymulującego (macierz ISCOM); cząstki; DDA; adiuwantów glinowych; adiuwantów DNA, γ-inuliny i adiuwantów zamykających.

Korzystnie cytokina jest cytokiną określoną powyżej lub jej skuteczną częścią, toksyna jest wybrana z grupy obejmującej listeriolicynę (LLO), lipid A (MPL, L180.5/RalLPS) i wrażliwą na ciepło enterotoksynę, pochodna z mykobakterii jest wybrana z grupy obejmującej dipeptyd muramylu, kompletny adiuwant Freund'a, RIBI i diester trehalozy, taki jak TDM i TDE, a immunogenny adiuwant kierujący jest wybrany z grupy obejmującej ligand CD40, przeciwciała przeciw CD40 lub jego specyficznie wiążące fragmenty, mannozę, fragment Fab i CTLA-4, preparat olejowy zawiera skwalen lub niepełny adiuwant Freund'a, polimer jest wybrany z grupy obejmującej węglowodany, takie jak dekstran, PEG, skrobia, mannan i mannoza; polimery stanowiące tworzywa sztuczne jako takie, i lateks, taki jak perełki lateksowe, saponiną jest saponina z Quillaja saponaria, Quil A i QS21, a cząstki stanowią lateks lub dekstran.

Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku w wariancie (a) w wytworzonej kompozycji co najmniej jeden pierwszy analog jest podawany drogą wybraną spośród drogi doustnej i pozajelitowej, takiej jak śródskórna, podskórna, donabłonkowa, lub podnabłonkowa, dootrzewnowa, dopoliczkowa, podjęzykowa, nadtwardówkowa, dokręgowa, doodbytnicza i droga śródczaszkowa.

Korzystnie w wariancie (a) co najmniej jeden pierwszy analog jest podawany co najmniej raz w roku, tak jak przynajmniej 2, 3, 4, 5, 6 i 12 razy w ciągu roku.

Korzystnie w wariancie (c) niepatogenny mikroorganizm lub wirus niesie co najmniej jeden fragment kwasu nukleinowego, który koduje i wyraża co najmniej pierwszy analog jak określony powyżej.

Korzystnie w wariancie (c) epitop TH i/lub pierwsze i/lub drugie i/lub trzecie ugrupowanie jak określone powyżej w zastrz. 16-19 są obecne w postaci partnerów fuzyjnych z sekwencją aminokwasową pochodzącą z antygenu polipeptydowego związanego z komórką, a niepatogenny mikroorganizm lub wirus niesie co najmniej jeden fragment kwasu nukleinowego kodującego i wyrażającego pierwszy i/lub drugi analog.

Korzystnie w wariancie (c) niepatogenny mikroorganizm lub wirus niesie co najmniej jeden fragment kwasu nukleinowego kodującego i wyrażającego co najmniej drugi analog. Korzystnie niepatogenny mikroorganizm lub wirus w kompozycji jest podawany zwierzęciu jednokrotnie.

PL 202 399 B1

Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku w wariancie (b) co najmniej jeden fragment kwasu nukleinowego koduje i wyraża pierwszy analog jak określony powyżej.

Korzystnie w wariancie (b) epitop TH i/lub pierwsze i/lub drugie i/lub trzecie ugrupowanie są obecne w postaci partnerów fuzyjnych z sekwencją aminokwasową pochodzącą z antygenu polipeptydowego związanego z komórką, a co najmniej jeden fragment kwasu nukleinowego koduje i wyraża pierwszy i/lub drugi analog.

Korzystnie zastosowanie według wynalazku w wariancie (b) obejmuje ponadto zastosowanie co najmniej jednego fragmentu kwasu nukleinowego kodującego i wyrażającego drugi analog określony powyżej do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do wprowadzania in vivo do APC co najmniej jednego fragmentu kwasu nukleinowego kodującego i wyrażającego drugi analog.

Korzystniej w wariancie (b) wprowadzony fragment(y) kwasu nukleinowego jest/są wybrany spośród nagiego DNA, DNA sformułowanego z lipidami posiadającymi lub nieposiadającymi ładunku, DNA zawartego w liposomach, DNA wbudowanego do wektora wirusowego, DNA sformułowanego z białkiem lub polipeptydem umożliwiającym transfekcję, DNA sformułowanego z białkiem lub polipeptydem kierującym, DNA sformułowanego z kierującym węglowodanem, DNA sformułowanego z czynnikami wytrącającymi wapń, DNA przyłączonego do obojętnej cząsteczki nośnika i DNA spreparowanego z adiuwantem.

Korzystnie adiuwant jest wybrany z grupy obejmującej adiuwanty określone powyżej.

Korzystnie w wariancie (b) tryb podania wytworzonej kompozycji jest określony powyżej.

Korzystnie wytwarza się kompozycję do podawania co najmniej dwóch fragmentów kwasu nukleinowego, z których jeden koduje i wyraża co najmniej epitop CTL, a drugi koduje i wyraża co najmniej jeden pierwszy obcy epitop TH jak określony powyżej.

Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku słaby związany z komórką antygen jest wybrany z grupy obejmują cej 5-alfa reduktazę , α -fetoproteinę , AM-1, APC, APRIL, BAGE, β -kateninę , Bc12, bcr-abl (b3a2), CA-125, CASP-8/FLICE, katepsyny, CD19, CD20, CD21, CD23, CD22, CD33, CD35, CD44, CD45, CD46, CD5, CD52, CD55 (791Tgp72), CD59, CDC27, CDK4, CEA, c-myc, Cox-2, DCC, DcR3, E6/E7, EGFR, EMBP, Ena78, transferazę farnezylową, FGF8a lub FGF8b, FLK-1/KDR, receptor kwasu foliowego, G250, rodzinę GAGE, gastrynę 17, hormon uwalniający gastrynę (bombezyna), GD2/GD3/GM2, GnRH, GnTV, GP1, gp100/Pmel 17, gp-100-in4, gp15, gp75/TRP-1, hCG, heparanazę, Her2/neu, HMTV, Hsp70, hTERT (telomeraza), IGFR1, IL-13R, iNOS, Ki 67, KIAA0205, K-ras, H-ras, N-ras, KSA (C017-1A), LDLR-FUT, rodzinę MAGE (MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, itp.), mammaglobinę, MAP17, Melan-A/MART-1, mezotelinę, MIC A/B, MT-MMP, Moxl, mucynę, taką jak MUC-1, MUC-2, MUC-3 i MUC-4, które są nienormalnie glikozylowane, MUM-1, NY-ESO-1, osteonektynę, p15, p170/MDR1, p53, p97/melanotransferynę, PAI-1, PDGF, plazminogen (uPA), PRAME, probazynę, progenipoetynę, PSA, PSM, RAGE-1, Rb, RCAS1, SART-1, rodzinę genu SSX, STAT3, STn (towarzyszące mucynie), TAG-72, TGF-α, TGF-β, tymozynę β 15, TNF-α, TPA, TPI, TRP-2, tyrozynazę, VEGF, ZAG, p16 INK4 i S-transferazę glutationową.

Korzystniej antygen polipeptydowy związany z komórką jest ludzkim PSM.

Korzystniej obcy epitop limfocytu T jest wprowadzony do części sekwencji aminokwasowej PSM określonej przez SEK. ID. NR: 2 pozycje 16-52 i/lub 87-108 i/lub 210-230 i/lub 269-289 i/lub 298-324 i/lub 442-465 i/lub 488-514 i/lub 598-630 i/lub 643-662 i/lub 672-699.

Gdy antygen polipeptydowy związany z komórką jest ludzkim PSM lub gdy obcy epitop limfocytu T jest wprowadzony do części sekwencji aminokwasowej PSM określonej przez SEK. ID. NR: 2 Bardziej korzystnie że kompozycja farmaceutyczna jest stosowana do leczenia lub łagodzenia nowotworu prostaty.

Korzystnie antygen polipeptydowy związany z komórką jest czynnikiem wzrostu fibroblastu 8b(FGF8b), a obcy epitop limfocytu T jest wprowadzony do części sekwencji aminokwasowej FGF8b określonej przez SEK. ID. NR: 6 pozycje 1-54 i/lub 178/215 i/lub 55-58 i/lub 63-68 i/lub 72-76 i/lub 85-91 i/lub 95-102 i/lub 106-111 i/lub 115-120 i/lub 128-134 i/lub 138-144 i/lub 149-154 i/lub 158-162 i/lub 173-177, przy czym wprowadzenie korzystnie nie obejmuje zasadniczo aminokwasów 26-45 i aminokwasów 186-215 i wówczas korzystnie kompozycja farmaceutyczna jest stosowana do leczenia lub łagodzenia nowotworu, takiego jak nowotwór prostaty i nowotwór sutka.

Korzystnie antygenem polipeptydowym związanym z komórką jest Her2, a obcy epitop limfocytu T jest wprowadzony do części sekwencji aminokwasowej Her2 określonej przez SEK. ID. NR: 3 w pozycjach 5-25 i/lub 59-73 i/lub 103-117 i/lub 149-163 i/lub 210-224 i/lub 250-264 i/lub 325-339 i/lub 369-383 i/lub 465-479 i/lub 579-593 i/lub 632-652 i/lub 653-667 i/lub 661-675 i/lub 695-709 i/lub 7108

PL 202 399 B1

730 i wówczas korzystnie kompozycja farmaceutyczna jest stosowana do leczenia lub łagodzenia nowotworu sutka.

Ponadto w zakres wynalazku wchodzi sposób selekcji immunogennego analogu antygenu polipeptydowego związanego z komórką, który w zwierzęciu jest słabo imunogenny lub nieimmunogenny, zdolnego do indukcji w zwierzęciu odpowiedzi CTL przeciw komórkom prezentującym cząsteczkę MHC klasy I związaną z epitopem pochodzącym z antygenu powierzchniowego związanego z komórką, który obejmuje

a) identyfikację przynajmniej jednej podsekwencji sekwencji aminokwasowej antygenu polipeptydowego związanego z komórką, która nie zawiera znanych lub przewidywanych epitopów CTL,

b) wytworzenie przynajmniej jednego potencjalnie immunogennego analogu antygenu polipeptydowego związanego z komórką, przez wprowadzenie do sekwencji aminokwasowej antygenu polipeptydowego związanego z komórką przynajmniej jednego obcego dla zwierzęcia epitopu TH, w miejsce w obrębie przynajmniej jednej podsekwencji zidentyfikowanej w punkcie a) i

c) selekcję tego/tych analogów wytworzonych w etapie b), które zostały zweryfikowane z uwagi na ich zdolność do wywoływania u zwierzęcia odpowiedzi CTL, przy czym antygen polipeptydowy związany z komórką jest wybrany spośród antygenu polipeptydowego związanego z nowotworem, własnego białka, antygenu polipeptydowego wirusa, antygenu polipeptydowego pochodzącego z wewnątrzkomórkowego pasożyta lub bakterii.

Korzystnie i) podsekwencja zidentyfikowana w etapie a) nie zawiera też reszt cysteiny lub alternatywnie, epitop TH wprowadzony w etapie b) nie różni się zasadniczo wzorem cystein i/lub ii) podsekwencja zidentyfikowana w etapie a) nie zawiera też znanych lub przewidywanych miejsc glikozylacji lub alternatywnie, wprowadzony w etapie b) epitop TH zasadniczo nie zmienia wzoru glikozylacji i/lub iii) podsekwencja zidentyfikowana w etapie a) przyczynia się znacząco do patofizjologicznego efektu wywołanego przez antygen polipeptydowy związany z komórką i wprowadzony w etapie b) obcy epitop TH zmniejsza lub znosi wspomniany efekt patofizjologiczny i/lub iv) podsekwencja zidentyfikowana w etapie a) jest homologiczna do sekwencji aminokwasowej innego antygenu białkowego zwierzęcia i wprowadzenie epitopu TH w etapie b) zasadniczo usuwa homologię i/lub

v) wprowadzenie w etapie b) obcego epitopu TH daje zachowanie zasadniczej frakcji epitopów limfocytów B antygenu polipeptydowego związanego z komórką.

Korzystnie w wariancie v) analogi mają ogólną trzeciorzędową strukturę antygenu polipeptydowego związanego z komórką.

Korzystnie w sposobie według wynalazku słaby antygen związany z komórką jest wybrany z grupy składającej się z 5-alfa reduktazy, α-fetoproteiny, AM-1, APC, APRIL, BAGE, β-kateniny, Bc12, bcr-abl (b3a2), CA-125, CASP-8/FLICE, katepsyn, CD19, CD20, CD21, CD23, CD22, CD33, CD35, CD44, CD45, CD46, CD5, CD52, CD55 (791Tgp72), CD59, CDC27, CDK4, CEA, c-myc, Cox-2, DCC, DcR3, E6/E7, EGFR, EMBP, Ena78, transferazy farnezylowej, FGF8a lub FGF8b, FLK-1/KDR, receptora kwasu foliowego, G250, rodziny GAGE, gastryny 17, hormonu uwalniającego gastrynę (bombezyna), GD2/GD3/GM2, GnRH, GnTV, GP1, gp100/Pmel 17, gp-100-in4, gp15, gp75/TRP-1, hCG, heparanazy, Her2/neu, HMTV, Hsp70, hTERT (telomeraza), IGFR1, IL-13R, iNOS, Ki 67, KIAA0205, K-ras, H-ras, N-ras, KSA (CO17-1A), LDLR-FUT, rodzinę MAGE (MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, itp.), mammaglobiny, MAP17, Melan-A/MART-1, mezoteliny, MIC A/B, MT-MMP, Mox1, mucyny, takiej jak MUC-1, MUC-2, MUC-3 i MUC-4, które są nienormalnie glikozylowane, MUM-1, NY-ESO-1, osteonektyny, p15, p170/MDR1, p53, p97/melanotransferyny, PAI-1, PDGF, plazminogenu (uPA), PRAME, probazyny, progenipoetyny, PSA, PSM, RAGE-1, Rb, RCAS1, SART-1, rodziny genu SSX, STAT3, STn (towarzyszące mucynie), TAG-72, TGF-α, TGF-β, tymozyny β 15, TNF-α, TPA, TPI, TRP-2, tyrozynazy, VEGF, ZAG, p16 INK4 i S-transferazy glutationowej.

Korzystnie antygen polipeptydowy związany z komórką jest ludzkim PSM.

Korzystnie obcy epitop limfocytu T jest wprowadzony w części sekwencji aminokwasowej PSM określonej w SEK. ID. NR: 2 w pozycjach 16-52 i/lub 87-108 i/lub 210-230 i/lub 269-289 i/lub 298-324 i/lub 442-465 i/lub 488-514 i/lub 598-630 i/lub 643-662 i/lub 672-699.

Korzystnie antygenem polipeptydowym związanym z komórką jest czynnik wzrostu fibroblastów 8b(FGF8b).

Korzystniej obcy epitop limfocytu T jest wprowadzony w części sekwencji aminokwasowej FGF8b określonej w SEK. ID. NR: 6 w pozycjach 1-54 i/lub 178/215 i/lub 55-58 i/lub 63-68 i/lub 72-76 i/lub 85-91 i/lub 95-102 i/lub 106-111 i/lub 115-120 i/lub 128-134 i/lub 138-144 i/lub 149-154 i/lub 158PL 202 399 B1

162 i/lub 173-177, przy czym wprowadzenie korzystnie nie dotyczy zasadniczo aminokwasów 26-45 i aminokwasów 186-215.

Korzystnie że antygenem polipeptydowym związanym z komórką jest Her2.

Bardziej korzystnie obcy epitop limfocytu T jest wprowadzony w części sekwencji aminokwasowej Her2 określonej przez SEK. ID. NR: 3 w pozycjach 5-25 i/lub 59-73 i/lub 103-117 i/lub 149-163 i/lub 210-224 i/lub 250-264 i/lub 325-339 i/lub 369-383 i/lub 465-479 i/lub 579-593 i/lub 632-652 i/lub 653-667 i/lub 661-675 i/lub 695-709 i/lub 710-730.

Ponadto wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania komórki wytwarzającej analog antygenu polipeptydowego związanego z komórką, który obejmuje wprowadzenie do wektora sekwencji kwasu nukleinowego kodującej analog, który został wybrany sposobem określonym powyżej i transformowanie wektorem odpowiedniej komórki gospodarza.

W zakres wynalazku wchodzi też sposób wytwarzania analogu antygenu polipeptydowego związanego z komórką, który obejmuje hodowanie komórki wytworzonej sposobem określonym powyżej w warunkach ułatwiających ekspresję sekwencji kwasu nukleinowego kodującej antygen polipeptydowy związany z komórką i odzyskiwanie analogu z supernatantu hodowli lub z komórek.

Korzystnie sposób dodatkowo obejmuje etap oczyszczania odzyskanego analogu i ewentualnie poddania oczyszczonego produktu sztucznemu procesowi modyfikacji posttranslacyjnej, takiego jak składanie, poddanie działaniu enzymów, modyfikacji chemicznej i koniugacji.

W zakres wynalazku wchodzi takż e analog ludzkiego PSM, który jest immunogenny u ludzi, obejmujący istotną część wszystkich znanych i przewidywanych CTL i epitopy limfocytu B z PSM i zawiera przynajmniej jeden obcy epitop TH jak okre ś lony powy ż ej.

Korzystnie przynajmniej jeden obcy epitop TH jest obecny jako wstawka w sekwencji aminokwasowej PSM lub jako podstawienie części sekwencji aminokwasowej PSM lub jako wynik delecji części sekwencji aminokwasowej PSM i jest wprowadzony w pozycje określone powyżej w części dotyczącej zastosowania.

Wynalazek dotyczy również analogu ludzkiego Her2, który jest immunogenny u ludzi, obejmującego istotną część wszystkich znanych i przewidywanych CTL i epitopy Her2 limfocytu B2 i zawierającego przynajmniej jeden obcy epitop TH jak określony powyżej.

Korzystnie przynajmniej jeden obcy epitop TH jest obecny jako wstawka w sekwencji aminokwasowej Her2 lub jako podstawienie części sekwencji aminokwasowej Her2 lub jako wynik delecji części sekwencji aminokwasowej Her2 i jest wprowadzony w pozycje określone powyżej dla antygenu polipeptydowego Her2.

W zakres wynalazku wchodzi również analog ludzkiego/mysiego FGF8b, który jest immunogenny u ludzi, obejmujący istotną część wszystkich znanych i przewidywanych CTL i epitopy FGF8b limfocytu B i zawiera przynajmniej jeden obcy epitop TH jak określony powyżej.

Korzystnie przynajmniej jeden obcy epitop TH jest obecny jako wstawka w sekwencji aminokwasowej FGF8b lub jako podstawienie części sekwencji aminokwasowej FGF8b lub jako wynik delecji części sekwencji aminokwasowej FGF8b i jest wprowadzony w pozycje określone powyżej w odniesieniu do FGF8b jako antygenu polipeptydowego.

Wynalazek dotyczy też kompozycji immunogennej która zawiera jako skuteczny czynnik immunogenny analog określony powyżej zmieszany z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub zaróbką i ewentualnie adiuwantem.

Wynalazek dotyczy ponadto fragmentu kwasu nukleinowego kodującego analog określony powyżej.

W zakres wynalazku wchodzi wektor niosą cy fragment kwasu nukleinowego okre ś lony powyżej.

Korzystnie wektor jest zdolny do autonomicznej replikacji.

Korzystnie wektor jest wybrany z grupy obejmującej plazmid, fag, kosmid, minichromosom i wirus.

Korzystnie wektor zawiera w kierunku 5' >3' przyłączony funkcjonalnie promotor kierujący ekspresją fragmentu kwasu nukleinowego określonego powyżej, ewentualnie sekwencję kwasu nukleinowego kodującą peptyd liderowy umożliwiający sekrecję lub wbudowanie do błony fragmentu polipeptydu, fragment kwasu nukleinowego określony powyżej i ewentualnie sekwencję kwasu nukleinowego kodującą terminator. Wektor wprowadzony do komórki gospodarza, integruje się z genomem komórki gospodarza lub nie jest zdolny do integracji z genomem komórki oraz stabilnej linii komórkowej, która niesie wektor określony powyżej, który wyraża określony powyżej fragment kwasu nukleinowego i która ewentualnie wydziela lub niesie na swojej powierzchni określony powyżej analog.

PL 202 399 B1

Wynalazek dotyczy też stransformowanej komórki niosącej powyżej określony wektor. Ponadto wynalazek dotyczy kompozycji do indukowania wytwarzania przeciwciał przeciw PSM, Her2 lub FGF8b, która zawiera

1) fragment kwasu nukleinowego określony powyżej lub wektor określony powyżej i

2) farmaceutycznie i immunologicznie dopuszczalny rozpuszczalnik i/lub podłoże i/lub adiuwant.

W zakres wynalazku wchodzi również sposób wytwarzania określonej powyżej komórki, który obejmuje transformację in vitro komórki gospodarza powyżej określonym fragmentem kwasu nukleinowego lub powyżej określonym wektorem.

Prezentowanie antygenów było dogmatycznie rozumiane jako nieciągłe szlaki, szlak egzogenny klasy II i endogenny klasy I.

Pokrótce, obce białko pochodzące z zewnątrz komórki lub z błony komórkowej jest pobierane przez APC jako endosom, który zlewa się z wewnątrzkomórkowym kompartmentem zawierającym enzymy proteolityczne i cząsteczki MHC klasy II. Niektóre z wytworzonych peptydów wiążą się z klasą II, a następnie są przenoszone do błony komórkowej.

Endogenny szlak klasy I charakteryzuje się głównie prezentowaniem białek cytozolowych. Przyjmuje się, że zachodzi to przez cięcie za pośrednictwem proteasomu, a następnie przez transportowanie peptydów do retikulum endoplazmatycznego (ER) za pośrednictwem cząsteczek TAP umiejscowionych w błonie ER. W ER peptydy wiążą się z klasą I, a następnie są transportowane do błony plazmatycznej.

Jednakże te dwa szlaki nie są w pełni rozróżnialne. Przykładowo, wiadomo, że komórki dendrytyczne i w pewnym stopniu makrofagi są zdolne do endocytozy (pinocytozy) białek zewnątrzkomórkowych i następnie prezentowania ich w kontekście MHC klasy I. Uprzednio wykazano również, że gdy stosuje się szczególne drogi podania np. przez wiązanie się z ziarnami tlenku żelaza, egzogenne antygeny są zdolne do wykorzystania szlaku klasy I (Rock, 1996). Wydaje się, że mechanizm ten wydaje jest kluczowy, z uwagi na znaczenie równoczesnego wyrażania zarówno klasy I jak i II na tych samych APC dla pobudzania grupy trzech typów komórek. Ta interakcja grupy trzech typów komórek została zaproponowana przez Mitchison (1987) i później przez innych autorów. Wykazali oni znaczenie równoczesnej prezentacji na tej samej APC epitopów klasy I i klasy II. Zgodnie z ostatnio opisanym mechanizmem aktywacji CTL (Lanzavecchia, 1998, Nature 393: 413, Matzinger, 1999, Nature Med. 5: 616, Ridge i wsp., 1998, Nature 393: 474, Bennett i wsp., 1998, Nature 393: 478, Schoenberger i wsp., 1998, Nature 393: 480, Ossendrop i wsp., 1998, J. Exp. Med. 187: 693 i Mackey i wsp., 1998, J. Immunol 161: 2094), profesjonalne APC prezentujące antygen na MHC klasy II są rozpoznawane przez limfocyty T pomocnicze. W wyniku tego aktywowane są APC (za pośrednictwem oddziaływania CD40L na limfocytach T pomocniczych i CD40 na APC). Umożliwia to APC bezpośrednie pobudzanie CTL, które są w wyniku tego aktywowane. Patrz również Fig. 2.

Wcześniej pokazano, że wbudowanie ograniczonego epitopu pomocniczego limfocytu T obcej klasy MHC II do auto antygenu powoduje powstanie antygenu zdolnego do indukcji silnie reaktywnej odpowiedzi krzyżowej w postaci przeciwciała skierowanego przeciw nie zmodyfikowanemu autoantygenowi (przykładowo WO 95/05849). Pokazano, że indukcja autoprzeciwciała jest wywołana przez specyficzny limfocyt T pomocniczy pobudzony przez wbudowanie obcego epitopu.

Jednakże, doszliśmy do wniosku, że zmodyfikowane autoantygeny z dodatkiem odpowiednich adiuwantów - również powinny być zdolne do indukcji silnej odpowiedzi CTL przeciw własnym ograniczonym epitopom MHC klasy I i tym samym technologia opisana w WO 95/05849 może być zaadaptowana również dla dostarczenia sposobu szczepienia przeciw wewnątrzkomórkowym i innym związanym z komórką antygenom, które mają epitopy prezentowane w kontekście MHC klasy I.

Opisana w WO 95/05849 technologia autoszczepionki ma skutek taki, że dostarczony jest specyficzny limfocyt T pomocniczy do samoreaktywnych limfocytów B, gdy zmodyfikowany autoantygen jest podany dla włączenia do szlaku obróbki antygenu MHC klasy II (patrz. Fig. 1 i Dalum I i wsp., 1996, J. Immunol. 157: 4796-4804, jak również Dalum I. i wsp., 1999, Nature Biotechnol. 17: 666669). Wykazano, że potencjalnie autoreaktywne limfocyty B rozpoznające własne białka są fizjologicznie obecne u zdrowych osobników. Jednakże, aby te limfocyty B były indukowane i rzeczywiście wytwarzały przeciwciała reaktywne względem odpowiednich białek własnych, potrzebny jest udział wytwarzających cytokiny limfocytów T pomocniczych (TH-komórki lub TH-limfocyty). Zwykle taka pomoc nie jest dostarczana, ponieważ limfocyty T na ogół nie rozpoznają epitopów komórek T pochodzących z białek własnych, gdy są prezentowane przez komórki prezentujące antygen (APC). Jednakże, dostarczając czynnik „obcości” we własnym białku (np. przez wprowadzenie znaczącej immuPL 202 399 B1 nologicznie modyfikacji), komórki T rozpoznając obcy element są aktywowane do rozpoznania obcego epitopu na APC (tak jak pierwotnie komórka jednojądrzasta). Poliklonalne limfocyty B (które prezentują epitopy komórki T) zdolne do rozpoznania własnych epitopów na zmodyfikowanym własnym białku również internalizują antygen i następnie prezentują komórce T obcy(e) epitop(y) i później aktywowane limfocyty T dostarczając cytokiny pomagają autoreaktywnym poliklonalnym limfocytom B. Ponieważ przeciwciała wytwarzane przez takie poliklonalne limfocyty B są reaktywne wobec różnych epitopów na zmodyfikowanym polipeptydzie, włącznie z tymi, które są również obecne na natywnym polipeptydzie, indukowane jest przeciwciało reagujące krzyżowo z nie zmodyfikowanym własnym białkiem. Wniosek jest taki, że, limfocyty T mogą być prowadzone do takiego działania, jeśli populacja poliklonalnych limfocytów B rozpoznaje całkowicie obcy antygen, podczas gdy w rzeczywistości jedynych wbudowanych epitop(y) jest/są obcy(e) dla gospodarza. W ten sposób indukowane są przeciwciała zdolne do reakcji krzyżowej z niezmodyfikowanymi antygenami własnymi.

Jak wspomniano powyżej CTL wymagają również specyficznej pomocy komórki T, choć mechanizm tego nadal nie jest jasny.

Oparliśmy obecny wynalazek na naszej nowej teorii, że białka własne zawierające obce epitopy klasy II, po egzogennym wychwycie, mogą uzyskać dostęp do szlaku obróbki antygenu MHC klasy I np. makrofagów i komórek dendrytycznych. W ten sposób może być indukowana silna odpowiedź CTL przeciw subdominującym epitopom własnych białek. Alternatywnie, geny kodujące zmodyfikowane antygeny nowotworowe, mogą być podane jako szczepionki z kwasem nukleinowym prowadzące w końcu również do odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem MHC klasy II jak również MHC klasy I.

Komórki nowotworowe są bardzo słabymi komórkami prezentującymi antygen z uwagi na niedostateczną ekspresję MHC klasy I, brak współ-pobudzających cząsteczek lub wydzielania immunosupresyjnych cytokin itp. Stosując konstrukty autoszczepionki i wspomniany powyżej protokół szczepienia zmodyfikowany antygen nowotworowy może być prezentowany przez cząsteczki MHC klasy I jak również MHC klasy ll na wyspecjalizowanych komórkach prezentujących antygen. Współprezentowanie subdominujących epitopów własnych na MHC klasy I i immunodominujących obcych epitopów na cząsteczkach MHC klasy II będzie pośredniczyło w bezpośredniej pomocy cytokin z aktywowanych MHC klasy II ograniczonych komórek T-pomocniczych do MHC klasy I ograniczonych CTL (Fig. 2). To, naszym zdaniem, będzie prowadzić do specyficznego przerwania autotolerancji komórki T względem antygenu nowotworowego, a to właśnie jest pożądane w immunoterapii raka.

Podsumowując, szczepionka skonstruowana przy użyciu wyżej opisanej technologii będzie indukowała humoralną odpowiedź w postaci autoprzeciwciała z wtórną aktywacją dopełniacza i zależnej od przeciwciała aktywności cytotoksycznej wobec komórki (ADCC). Oczekuje się również, że będzie to indukowało odpowiedź cytotoksyczną komórki T skierowaną przeciw np. specyficznemu wobec nowotworu antygenowi błonowemu.

Częścią wynalazku jest również nowa strategia wytworzenia czynnika immunogennego. Ta nowa strategia obejmuje selekcję i wytworzenie analogów słabych antygenów związanych z komórką, gdzie celem jest zachowanie istotnych części znanych i przewidywanych epitopów CTL i gdzie w tym samym czasie wprowadzany jest przynajmniej jeden obcy epitop TH.

Wreszcie, wynalazek dotyczy fragmentów kwasu nukleinowego, wektorów, stransformowanych komórek i innych narzędzi użytecznych w metodach biologii molekularnej dla wytworzenia analogów antygenów związanych z nowotworem.

Opisy Figur.

Fig. 1: Tradycyjna koncepcja autoszczepionki AutoVac. A: dominujące z uwagi na tolerancję epitopy własne prezentowane na MHC klasy II na komórce prezentującej antygen (APC) są ignorowane z powodu pozbawienia komórki T-pomocniczej (Th) repertuaru (T komórka pomocnicza wskazana linią kropkowaną). Wbudowane obce immunodominujące epitopy komórki T prezentowane na aktywowanych MHC klasy II komórkach T pomocniczych i komórkach B (B) specyficzne dla naturalnej części własnego białka prezentującej obce, immunodominujące epitopy komórki T na MHC klasy II są aktywowane z pomocą cytokiny dostarczonej przez komórkę T pomocniczą.

Fig. 2: Koncepcja AutoVac dla indukcji odpowiedzi CTL. Wbudowanie obcych, immunodominujących epitopów komórki T prezentowanych na MHC klasy II aktywowanych komórkach T pomocniczych. CTL rozpoznające subdominujące epitopy własne prezentowane na MHC klasy I są aktywowane przez sąsiadującą aktywowaną komórkę T pomocniczą.

Fig. 3: Schematyczne przedstawienie polipeptydu Her2 z zaznaczeniem regionów epitopów i miejsc N-glikozylacji. Cztery zewnątrzkomórkowe domeny, domena transbłonowa (TM) i dwie we12

PL 202 399 B1 wnątrzkomórkowe domeny są przedstawione ze wskazaniem miejsc o różnych stopniach homologii i miejsc zawierających potencjalne/określone epitopy CTL.

Fig. 4: Schematyczne przedstawienie ludzkiego polipeptydu PSM ze wskazaniem miejsc wbudowania dla epitopów P2 i P30.

Fig. 5: Geny FGF i białka. A: struktura egzon-intron ludzkich i mysich genów FGF8. Poniżej jest zilustrowanych osiem różnych postaci będących wynikiem składania (z Gemel 1996). B: Sekwencja aminokwasowa różnych izoform FGF8. Fragmenty polipeptydu unikalne dla FGF8b, FGF8f i FGF8e są wskazane pogrubionymi literami i wersalikami lub podkreślone. FGF8a jest najkrótszym wariantem niezawierającym takich wyszczególnionych sekwencji. Oczekuje się, że peptyd sygnałowy będzie cięty na C-końcu przy Ala22. Dwie reszty cysteinowe znalezione w dojrzałym FGF8 (wszystkie izoformy) są wskazane przez grube podkreślenie. Dwa potencjalne miejsca N-glikozylacji FGF8b są wskazane przez Ń. Numeracja jest zgodna z FGF8b.

Fig. 6: Ilustracje czterech różnych wariantów FGF8b przeznaczonych do autoszczepionki. Górny panel: teoretyczne modele punktów wbudowania epitopów przy pomocy struktury kryształu FGF2 jako matrycy. Niższy panel: sekwencje aminokwasów FGF8b (WT) typu dzikiego i cztery warianty F30N, F2I, F30I i F2C. Peptyd sygnałowy jest zaznaczony pojedynczym podkreśleniem. Wbudowane polipeptydy są zaznaczone podwójnym podkreśleniem. N-końcowa sekwencja (MetAla) wszystkich wariantów jest związana z wytworzeniem sekwencji Kozak (Kozak 1991) dla lepszej translacji w systemie eukariotycznym.

Definicje „Antygen polipeptydowy związany z komórką” jest w obecnym opisie i zastrzeżeniach oznacza polipeptyd, który znajduje się w komórce, która jest w jakiś sposób związana z procesem patologicznym. Ponadto, komórka prezentuje epitopy CTL antygenu polipeptydowego związanego na jej powierzchni z cząsteczkami MHC klasy I. Związane z komórką antygeny polipeptydowe mogą być, zatem, prawdziwymi antygenami wewnątrzkomórkowymi (skutkiem tego nieosiągalnym dla humoralnej odpowiedzi immunologicznej) lub antygenami związanymi z powierzchnią komórek. Antygeny związane z komórką mogą być produktem ekspresji genu komórki lub wewnątrzkomórkowego pasożyta, wirusa lub innej komórki. W ostatnim przypadku antygen polipeptydowy następnie wiąże się z komórką, która jest zaangażowana w proces patologiczny.

Terminy „limfocyt T” i „komórka T” będą używane wymiennie dla limfocytów pochodzących z grasicy, które są odpowiedzialne za odpowiedzi immunologiczne za pośrednictwem różnych komórek, jak również funkcji efektorowych, takich jak aktywność pomocnicza w humoralnej odpowiedzi immunologicznej. Podobnie terminy „limfocyt B” i „komórka B” będą użyte wymiennie dla limfocytów produkujących przeciwciała.

„Komórka prezentująca antygen” (APC) jest komórką, która prezentuje epitopy komórkom T. Typowymi komórkami prezentującymi antygen są makrofagi, komórki dendrytyczne i inne komórki fagocytujące i pinocytujące. Należy zauważyć, że komórki B działają również jako APC przez prezentowanie epitopów TH związanych z cząsteczkami MCH klasy II komórkom TH, lecz gdy w obecnym opisie zastrzeżeniach na ogół używa się określenia APC, należy je odnosić go do wyżej wspomnianych komórek fagocytujących i pinocytujących.

„Limfocyty T pomocnicze” lub „komórki TH” oznaczają komórki T pozytywne względem CD4, które dostarczają pomocy komórkom B i cytotoksycznym komórkom T przez rozpoznanie epitopów TH związanych z cząsteczkami MHC klasy II na komórkach prezentujących antygen.

Termin „cytotoksyczne limfocyty T” (CTL) będzie używany dla CD8 dodatnich komórek T, które wymagają wspomagania komórek TH do swojej aktywacji. „Specyficzna” odpowiedź immunologiczna w obecnym kontekście oznacza, że poliklonalna odpowiedź immunologiczna jest skierowana głównie przeciw cząsteczce lub grupie pseudoidentycznych cząsteczek lub alternatywnie, przeciw komórkom, które prezentują epitopy CTL cząsteczki lub grupy pseudoidentycznych cząsteczek.

Termin „słaby lub nieimmunogenny antygen polipeptydowy” obejmuje polipeptydy mające sekwencję aminokwasową słabego antygenu białkowego związanego z komórką pochodzącego od danego osobnika (np. człowieka), a także polipeptydy mające identyczną sekwencję aminokwasową z analogami takich białek izolowanych od innych gatunków. Również postaci polipeptydów o odmiennych wzorach glikozylacji, z powodu ich wytwarzania w układach heterologicznych (np. drożdżach lub innych niessaczych eukariotycznych układach ekspresyjnych lub nawet w układach prokariotycznych) są objęte tym terminem. Jednakże należy mieć na uwadze, gdy stosuje się ten termin, że dany poliPL 202 399 B1 peptyd, normalnie nie jest immunogenny lub jedynie słabo immunogenny w swoim naturalnym miejscu lokalizacji w danym leczonym zwierzęciu.

Termin „polipeptyd” w obecnym kontekście oznacza zarówno krótkie polipeptydy zbudowane z 2 do 10 reszt aminokwasowych, oligopeptydy o 11 do 100 resztach aminokwasowych i polipeptydy o więcej niż 100 resztach aminokwasowych. Ponadto, termin ten również obejmuje białka, np. funkcjonalne biocząsteczki zawierające przynajmniej jeden polipeptyd; gdy zawierają przynajmniej dwa polipeptydy, mogą tworzyć kompleksy, mogą być związane kowalencyjnie lub niekowalencyjnie. Polipeptyd(y) w białku mogą być glikozylowane i/lub lipidowane i/lub mogą zawierać grupy prostetyczne.

Termin „podsekwencja” oznacza dowolny nieprzerwany ciąg przynajmniej 3 aminokwasów lub zależnie od kontekstu, przynajmniej 3 nukleotydów, pochodzących bezpośrednio z występujących naturalnie odpowiednio sekwencji aminokwasów lub sekwencji kwasu nukleinowego.

Terminem „zwierzę” w obecnym kontekście ogólnie określa się gatunki zwierząt (korzystnie ssaków), takich jak Homo sapiens, Canis domesticus itd., a nie tylko jedno pojedyncze zwierzę. Jednakże termin ten określa również populację takich gatunków zwierząt, bowiem jest ważne aby wszystkie osobniki immunizowane kompozycją wytworzoną zgodnie z zastosowaniem według wynalazku nosiły zasadniczo taki sam słaby związany z komórką antygen polipeptydowy pozwalający na immunizację zwierząt tym samym immunogenem(ami). Jeśli, na przykład, w różnych populacjach człowieka występują genetyczne warianty polipeptydów, niezbędnym może być użycie różnych immunogenów w tych różnych populacjach, celem przełamania autotolerancji względem występującego w każdej populacji słabego, związanego z komórką polipeptydu.

Termin „hamowanie polipeptydowego antygenu związanego z komórką” oznacza tu zmniejszenie w żywym organizmie ilości i/lub aktywności danego antygenu. Hamowanie może być uzyskane przez szereg mechanizmów z których najprostszym jest oddziaływanie przeciwciała z miejscem aktywnym w antygenie. Jednakże, jest również w zakresie obecnego wynalazku, że wiązanie przeciwciała powoduje usunięcie polipeptydu przez komórki żerne (takie jak makrofagi i inne fagocytujące komórki) i, co może nawet ważniejsze, komórki niosące lub zawierające antygen są zabijane w zwierzęciu przez CTL.

Wyrażenie „wpływanie na jednoczesną prezentację przez odpowiednie APC” oznacza, że zwierzęcy układ immunologiczny jest poddany prowokacji immunologicznej w kontrolowany sposób, w wyniku której nastę puje jednoczesna prezentacja przez APC danych epitopów. Jak wyniknie z poniższego ujawnienia, taka prowokacja układu immunologicznego może być efektem wielu sposobów, z których najważniejszymi są szczepienia zawierającym polipeptyd „farmaceutykiem” (np. szczepionką, która jest podawana celu leczenia lub złagodzenia trwającej choroby) lub „farmaceutykiem” z kwasem nukleinowym. Ważnym wynikiem, który się uzyskuje jest to, że immuno-kompetentne komórki w zwierzętach są konfrontowane z APC prezentującymi odpowiednie epitopy w skuteczny immunologicznie sposób.

Termin „ilość immunologicznie skuteczna” ma swoje tradycyjnie stosowane w nauce znaczenie, np. ilość immunogenu, która jest zdolna do indukowania odpowiedzi immunologicznej, która w sposób znaczący dotyczy czynnika patogennego, który ma wspólne cechy immunologiczne z immunogenem.

Gdy użyte jest określenie, że słabe antygeny polipeptydowe związane z komórką(ce) są zostały poddane „modyfikacji”, oznacza to chemiczną modyfikację polipeptydu, który tworzy szkielet danego polipeptydu. Taką modyfikacją może np. być derywatyzacja (np. alkilacja) pewnych reszt aminokwasowych w sekwencji aminokwasowej, lecz, co powinno być zrozumiałe na podstawie poniższego ujawnienia, korzystne modyfikacje obejmują zmiany pierwszorzędowej struktury sekwencji aminokwasowej.

Gdy omawiana jest „tolerancja” i „autotolerancja” jest zrozumiałe, że ponieważ polipeptydy, które są celami w leczeniu kompozycją wytworzoną zgodnie z zastosowaniem według wynalazku są własnymi białkami w szczepionej populacji lub białkami, które nie indukują skutecznej odpowiedzi immunologicznej, u zdrowych osobników w populacji nie wywołuje odpowiedzi immunologicznej przeciw polipeptydowi. Nie można wykluczyć, że przypadkowi osobnicy w populacji zwierząt mogą być zdolni do wytwarzania przeciwciał przeciw natywnemu polipeptydowemu antygenowi np. jako część zaburzenia autoimmunologicznego. Na dowolnym poziomie, zwierzęta normalnie będą jedynie autotolerancyjne wobec ich własnych antygenów polipeptydowych, lecz nie można wykluczyć, że analogi pochodzące od innych gatunków zwierząt lub z populacji mającej odmienny fenotyp mogą również być tolerowane przez wspomniane zwierzę.

„Obcy epitop komórki T” jest peptydem, który jest zdolny do wiązania się z cząsteczką MHC i pobudzania komórek T u zwierzą t. Korzystnie obce epitopy są „epitopami mieszanymi” tj. epitopami, które wiążą się z zasadniczą frakcją cząsteczek MHC klasy II u zwierząt lub populacji. Znana jest je14

PL 202 399 B1 dynie bardzo ograniczona liczba takich mieszanych epitopów komórki T i będą one w szczegółach omówione poniżej. Należy zauważyć, że aby immunogeny, które są zastosowane zgodnie z obecnym wynalazkiem, były skuteczne dla znacznego odsetka populacji zwierząt, musi być konieczne 1) wstawienie kilku obcych epitopów komórki T do tego samego analogu lub 2) wytworzenie kilku analogów, z których każdy ma wbudowany inny mieszany epitop. Należy zauważyć, że koncepcja obcych dla komórki T epitopów obejmuje również użycie kryptycznych epitopów komórki T, tj. epitopów, które pochodzą z białek własnych i które wykazują zachowanie immunogenne jedynie, gdy występują w postaci wyizolowanej nie będąc częścią i omawianego białka własnego.

„Epitop obcy dla limfocytu pomocniczego T” (obcy epitop TH) jest epitopem obcym dla komórki T, który wiąże cząsteczkę MHC klasy II i może być prezentowany na powierzchni komórki prezentującej antygen (APC) związanej z cząsteczką MHC klasy II.

Epitop „CTL” jest peptydem, który jest zdolny do związania cząsteczki MHC klasy I.

„Funkcjonalna część” (bio)cząsteczki w obecnym kontekście oznacza część cząsteczki, która jest odpowiedzialna za przynajmniej jedno, działanie biochemiczne lub fizjologiczne wywierane przez cząsteczkę. Jest dobrze znane w dziedzinie, że wiele enzymów i innych cząsteczek efektorowych ma miejsca aktywne, które jest odpowiedzialne za działania wywierane przez dane cząsteczki. Inne części cząsteczki mogą służyć stabilizacji lub zwiększeniu rozpuszczalności i z tego powodu mogą być odrzucone, jeśli właściwości te nie mają znaczenia w kontekście określonego wykonania i obecnego wynalazku. Przykładowo, możliwe jest użycie określonych cytokin jako modyfikującej reszty w analogu (patrz, szczegółowe omówienie poniżej) i w takim przypadku stabilność może być nie istotna, ponieważ przyłączenie do analogu zapewnia niezbędną stabilność.

Termin „adiuwant” ma swoje zwyczajowe znaczenie używane w dziedzinie technologii szczepionek tj. substancja lub kompozycja, która 1) sama nie jest zdolna do wywołania specyficznej odpowiedzi immunologicznej przeciw immunogenowi ze szczepionki, ale która 2) niezależnie od tego jest zdolna do wzmocnienia reakcji immunologicznej przeciw immunogenowi lub, innymi słowy, szczepienie samym adiuwantem nie powoduje odpowiedzi immunologicznej przeciw immunogenowi, szczepienie immunogenem może wywoływać lub nie odpowiedź immunologiczną przeciw immunogenowi, lecz kombinacja szczepienia immunogenem i adiuwantem indukuje odpowiedź immunologiczną przeciw immunogenowi, która jest silniejsza niż odpowiedź, indukowana przez sam immunogen.

„Kierowanie” cząsteczki w obecnym kontekście oznacza sytuację, w której cząsteczka po wprowadzeniu do zwierzęcia będzie występowała preferencyjnie w określonej tkance(kach) lub będzie preferencyjnie związana z określonymi komórkami lub typami komórek. Skutek może być osiągnięty różnymi sposobami, włącznie z formułowaniem cząsteczki w postać kompozycji ułatwiającej kierowanie lub przez wprowadzenie do cząsteczki grup które ułatwiają kierowanie, co będzie szczegółowo omówione poniżej.

„Pobudzenie systemu immunologicznego” oznacza, że substancja lub kompozycja wykazuje ogólne niespecyficzne działanie immunopobudzające. Kilka adiuwantów i przewidywanych adiuwantów (takich jak pewne cytokiny) ma zdolność do pobudzania układu immunologicznego. Wynikiem zastosowania czynnika immunostymulującego jest zwiększenie „gotowości” układu immunologicznego, co oznacza że równoczesna lub sekwencyjna immunizacja indukującym immunogenem indukuje znacznie bardziej skuteczną odpowiedź immunologiczną w porównaniu z jednostkowym użyciem samego immunogenu.

Korzystne wykonania

W celu wywołania odpowiedzi CTL przeciw komórce, która prezentuje epitopy pochodzące od antygenu peptydowego na swojej powierzchni, zwykle konieczne jest aby przynajmniej jeden epitop CTL, gdy jest prezentowany, był związany z cząsteczką MHC klasy I na powierzchni APC. Ponadto korzystnie aby co najmniej jeden pierwszy obcy epitop TH gdy jest obecny, jest związany z cząsteczką MHC klasy II na powierzchni APC.

Korzystnymi, APC prezentującymi epitopy są komórki dendrytyczne i makrofagi, lecz korzystna APC zgodnie z obecnym wynalazkiem jest dowolną APC pino- lub fagocytująca, która jest zdolna do równoczesnego prezentowania 1) epitopów CTL związanych z cząsteczkami MHC klasy I i 2) epitopy TH związane z cząsteczkami MHC klasy II.

Zgodnie z wynalazkiem antygen polipeptydowy związany z komórką jest korzystnie wybrany z antygenów towarzyszących guzowi i innych białek własnych związanych z patologicznym procesem, lecz również antygenów wirusowych i antygenów pochodzących od wewnątrzkomórkowych pasożytów lub bakterii. Dobrze wiadomo w nauce, że takie antygeny towarzyszące patogenowi są często stosunPL 202 399 B1 kowo słabymi immunogenami (np. antygeny z mykobakterii, takich jak Mycobacterium tuberculosis i Mycobacterium leprae, lecz również z pierwotniaków, takich jak Plasmodium sp.). Uważa się, że rozwiązania według wynalazku oprócz umożliwienia wytwarzania przeciwciała i odpowiedzi CTL przeciw prawdziwym własnym antygenom, i mogą wzmacniać często niewystarczającą odpowiedź immunologiczną wytworzoną przez organizm przeciw takim wewnątrzkomórkowym antygenom.

Zwykle będzie korzystne jest skonfrontowanie układu immunologicznego z dużą frakcją sekwencji aminokwasowej antygenu peptydowego, który jest celem szczepionki. Co za tym idzie, w korzystnym wykonaniu prezentowanie przez APC epitopu CTL i pierwszego obcego epitopu TH jest efektem prezentowania układowi immunologicznemu zwierzęcia przynajmniej jednego pierwszego analogu antygenu peptydowego związanego z komórką, przy czym pierwszy analog obejmuje zmianę w sekwencji aminokwasowej antygenu polipeptydowego związanego z komórką, a wspomniana zmiana zawiera co najmniej epitop CTL i pierwszy obcy epitop TH. Jest to, w przeciwieństwie do np. szczepienia DNA, strategia, według której epitopy CTL i TH są wyrażane przez tę samą komórkę lecz jako części oddzielnych polipeptydów. Taka strategia szczepienia DNA jest również wykonaniem wynalazku, lecz uważa się, że mając dwa epitopy jako część tego samego polipeptydu będzie się normalnie zwiększać odpowiedź immunologiczną w dowolnym stopniu, z tym warunkiem, że niezbędny będzie jedynie produkt ekspresji.

Dla zmaksymalizowania szansy uzyskania skutecznej odpowiedzi immunologicznej, korzystnie wyżej wspomniany pierwszy analog powinien zawierać zasadniczą frakcję znanych i przewidywanych epitopów CTL antygenu peptydowego związanego z komórką tj. frakcję znanych i przewidywanych epitopów CTL, które wiążą dostateczną frakcję cząsteczek MHC klasy I w populacji. Przykładowo, zasadnicza frakcja znanych i przewidywanych epitopów CTL w sekwencji aminokwasowej analogu jest rozpoznawana przez co najmniej 50% haplotypów MHC-I rozpoznających wszystkie znane i przewidywane epitopy CTL w związanym z komórką antygenie peptydowym, lecz korzystnie procenty są wyższe, jak przynajmniej 60, przynajmniej 70, przynajmniej 80 i przynajmniej 90%. Szczególnie korzystne jest użycie analogów, które posiadają zasadniczo wszystkie znane epitopy CTL antygenu polipeptydowego związanego z komórką i które występują w analogach, tj. prawie 100% znanych epitopów CTL. Zgodnie z tym jest również szczególnie korzystne że zasadniczo wszystkie przewidywane epitopy CTL antygenu polipeptydowego związanego z komórką są obecne przynajmniej w pierwszym analogu.

Sposoby dla przewidywania obecności epitopów CTL są dobrze znane w dziedzinie np.

Rothbard i wsp., EMBO J. 7: 93-100 (1988).

Jak to wynika z obecnego opisu i zastrzeżeń oczekuje się, że opisywane tu rozwiązania według wynalazku sprawnie umożliwią skuteczną indukcję odpowiedzi CTL przeciw antygenom polipeptydowym związanym z komórką.

W przypadku, gdy antygen polipeptydowy związany z komórką jest naprawdę wewnątrzkomórkowy, indukcja odpowiedzi CTL przeciw komórkom niosącym antygen jest jedyną drogą do osiągnięcia ich zmniejszenia specyficznymi immunologicznymi środkami. Jednakże, w przypadku antygenów związanych z błoną korzystne jest indukowanie odpowiedzi w postaci przeciwciała przeciw słabemu antygenowi polipeptydowemu związanemu z komórką. Jednakże, gdy rozwija się humoralna odpowiedź immunologiczna przeciw słabemu antygenowi związanemu z komórką, korzystnie należałoby zasadniczo ograniczyć odpowiedź przeciwciała na oddziaływanie z częściami antygenu, które normalnie są wystawione na potencjalne oddziaływanie z przeciwciałami. W innym przypadku wynikiem będzie najprawdopodobniej indukcja odpowiedzi w postaci przeciwciała przeciwko częściom antygenu, który normalnie nie jest zaangażowany przez humoralny układ immunologiczny i to z kolei będzie zwiększać ryzyko indukowania reakcji krzyżowej z antygenami nie związanymi z jakąkolwiek patologią. Jednym eleganckim sposobem otrzymania tego ograniczenia jest przeprowadzenie szczepienia kwasem nukleinowym z analogiem słabego antygenu związanego z komórką, gdzie jego zewnątrzkomórkowa część jest niezmieniona lub obejmuje epitop TH, który zasadniczo nie zmienia 3D struktury zewnątrz komórkowej części antygenu. Jako jedna możliwa alternatywa, immunizacja może być przeprowadzona zarówno immunogenem kierowanym do CTL jak i immunogenem kierowanym do komórki B, przy czym immunogen kierowany do komórki B jest zasadniczo niezdolny do wywołania immunizacji przeciw wewnątrzkomórkowym częściom docelowego antygenu (immunogenowi kierowanemu do komórki B może np. brakować niezewnątrzkomórkowego materiału pochodzącego z antygenu).

Indukcja odpowiedzi w postaci przeciwciał może być osiągnięta różnymi znanymi specjalistom sposobami. Przykładowo, przynajmniej jeden pierwszy analog może zawierać część składającą się

PL 202 399 B1 z modyfikacji struktury antygenu polipeptydowego związanego z komórką, przy czym wynikiem tej modyfikacji jest to, że immunizacja zwierzęcia pierwszym analogiem indukuje w zwierzęciu wytwarzanie przeciwciał przeciw antygenowi polipeptydowemu związanemu z komórką - wariant ten jest jak wspomniano powyżej, szczególnie odpowiedni dla szczepienia kwasem nukleinowym. Alternatywnie, rozwiązania według wynalazku umożliwiają skuteczną prezentację układowi immunologicznemu zwierzęcia skutecznej immunogennie ilości co najmniej jednego drugiego analogu antygenu polipeptydowego związanego z komórką, który zawiera taką modyfikację. Dogodnym sposobem uzyskania tego, że modyfikacja ma żądany wpływ na indukcję przeciwciała jest włączenie co najmniej jednego drugiego obcego epitopu TH w drugim analogu, tj. strategia taka jaką użyto dla pierwszego analogu.

W przypadku gdy pożądane jest również wywołanie skutecznej humoralnej odpowiedzi immunologicznej, korzystne jest aby pierwszy i/lub drugi analog(i) obejmował(y) zasadniczą część epitopów komórki B związanych z komórką polipeptydowych antygenów, szczególnie zasadniczą frakcję takich epitopów komórki B, które są zewnątrzkomórkowe u naturalnie występujących postaci antygenu u odnośnego zwierzęcia. Wyżej omówione warianty i modyfikacje słabego antygenu polipeptydowego związanego z komórką mogą przyjmować różne postaci. Korzystnie te warianty i/lub modyfikacje obejmują podstawienia i/lub delecję, i/lub insercję, i/lub addycję aminokwasu. Te podstawowe operacje dotyczące manipulowania sekwencją aminokwasową są obejmują zarówno zmiany pojedynczego aminokwasu jak również operacje dotyczące ciągów aminokwasów (np. tasowanie ciągu aminokwasów w antygenie polipeptydowym, co jest szczególnie interesujące, gdy antygen jest prawdziwym wewnątrzkomórkowym antygenem, ponieważ istotne są jedynie rozważania dotyczące zachowania epitopów CTL). Należy rozumieć, że wprowadzenie np. insercji lub delecji pojedynczego aminokwasu może być przyczyną pojawienia się obcego epitopu TH w sekwencji analogu tj. pojawienia się sekwencji wiążącej cząsteczkę MHC klasy II. Jednakże, w większości sytuacji jest korzystne (i nawet niezbędne) wprowadzenie znanego obcego epitopu TH i taka operacja będzie wymagała podstawienia i/lub insercji (lub czasem dodania w postaci koniugatu z białkiem nośnikowym lub dostarczenia peptydu fuzyjnego przy pomocy metod biologii molekularnej). Korzystnie, liczba insercji, delecji, substytucji lub addycji aminokwasów wynosi co najmniej 2, tak jak 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 i 25 insercji, substytucji, addycji lub delecji. Ponadto korzystnie liczba aminokwasowych podstawień nie przekracza 150, i więcej najwyżej 100, najwyżej 90, najwyżej 80 i najwyżej 70. Szczególnie korzystnie liczba substytucji, insercji, delecji lub addycji nie przekracza 60, a szczególnie liczba ta nie powinna przekraczać 50 lub nawet 40. Najkorzystniej jeśli liczba ta nie jest większa niż 30.

Korzystnie wykonania wynalazku obejmują modyfikacje przez wprowadzenie przynajmniej jednego, obcego immunodominującego epitopu TH. Zrozumiałe jest, że sprawa immunodominacji epitopu komórki T zależy od danego gatunku zwierzęcia. W użytym tu znaczeniu termin „immunodominujący” oznacza po prostu epitopy, które w szczepionym osobniku/populacji powodują rozwinięcie znaczącej odpowiedzi immunologicznej, lecz jest dobrze znany fakt, że epitop komórki T, który jest immunodominujący u jednego osobnika niekoniecznie jest immunodominujący u innego osobnika tego samego gatunku, nawet jeśli może być zdolny, u tego ostatniego osobnika, do wiązania cząsteczek MHC-II. Prawdziwe immunodominujące epitopy TH to takie, które są niezależne od polipeptydu, w którym tworzą podsekwencję, powodują aktywację komórek TH, innymi słowy niektóre epitopy TH mają właściwą im cechę, to że zasadniczo nigdy nie są kryptyczne, ponieważ są one zasadniczo zawsze obrabiane przez APC i prezentowane w kontekście cząsteczki MHC II na powierzchni APC.

Kolejnym ważnym punktem jest kwestia ograniczenia MHC epitopów komórki T. Ogólnie, naturalnie występujące epitopy komórki T są ograniczone z uwagi na MHC tj. pewne polipeptydy stanowiące epitopy komórki T będą się wiązać skutecznie tylko do cząsteczek z podzbioru MHC klasy II. To z kolei ma taki skutek, że w większości przypadków zastosowanie specyficznego epitopu komórki T da składnik szczepionki, który jest skuteczny jedynie w przypadku części populacji i zależy od wielkości tej części frakcji, wobec czego może być konieczne włączenie większej liczby epitopów komórki T w tej samej cząsteczce lub alternatywnie, przygotowanie wieloskładnikowej szczepionki, w której składniki są wariantami antygenu, które różnią się między sobą dzięki charakterowi wprowadzonych epitopów komórki T.

Jeśli ograniczenie MHC użytych komórek T jest całkowicie nieznane (przykładowo, w sytuacji gdzie szczepione zwierzę ma słabo określony skład MHC) część populacji objętej specyficzną kompozycją szczepionki może być określony poniższym wzorem II

PL 202 399 B1 ^fpopulacja = ^{1 -} Π ^{(1 -} Pi) w którym pi oznacza czę stość w populacji odpowiadają cych do i^tgo obcego epitopu komórki T obecnego w kompozycji szczepionki, a n jest całkowitą liczbą obcych epitopów komórki T w kompozycji szczepionki. Tak więc kompozycja szczepionki zawierająca trzy obce epitopy komórki T wykazuje częstość odpowiedzi w populacji odpowiednio 0,8; 0,7 i 0,6 co daje

- 0,2 x 0,3 x 0,4 = 0,976 to jest 97,6% populacji będzie statystycznie indukować odpowiedź na szczepionkę za pośrednictwem MHC-II.

Powyższy wzór nie dotyczy sytuacji, w których znany jest bardziej lub mniej dokładny wzór ograniczenia stosowanych peptydów przez MHC. Jeśli, przykładowo, określony peptyd wiąże się tylko z czą steczkami ludzkich MHC-II kodowanymi przez allele HLA-DR takie jak DR1, DR3, DR5 i DR7, wtedy użycie tego peptydu wraz z innym peptydem, który wiąże pozostałe cząsteczki MHC-II kodowane przez allele HLA-DR, będzie obejmowało 100% wspomnianej populacji. Podobnie, gdy drugi peptyd wiąże jedynie DR3 i DR5, dodanie tego peptydu wcale nie zwiększy obszaru pokrycia. Jeśli jedną z podstaw obliczenia odpowiedzi populacji jest jedynie ograniczenie epitopów komórek T z uwagi na MHC w szczepionce, to frakcja populacji objęta przez specyficzną kompozycję szczepionki może być określona według poniższego wzoru III ^fpopulacja = ¹ Π (1 ^φ j) gdzie φ jest sumą częstości w populacji allelicznych haplotypów kodującego cząsteczki MHC, które wiążą jakikolwiek epitop komórki T w szczepionce i które należy do j z 3 znanych loci HLA (DP, DR i DQ); w praktyce najpierw określa się, które cząsteczki MHC będą rozpoznawały każdy epitop komórki T w szczepionce, potem wyszczególnia się przez typy (DP, DR i DQ) - następnie poszczególne częstości różnych wyszczególnionych allelicznych haplotypów zbiera dla każdego typu uzyskując w ten sposób φ1, φ2 i φ3.

Może się zdarzyć, że wartość p we wzorze II przekroczy odpowiadającą jej wartość teoretyczną Π,:

IV ⁿi = ^{1 -} Π ^{(1 - ν}j)² j=1 gdzie Vj jest sumą częstości w populacji allelicznego haplotypu kodującego cząsteczki MHC, które wiążą i-ty epitop komórki T w szczepionce i który należy do j-tego z 3 znanych loci HLA (DP, DR i DQ). To oznacza, że 1 - π, populacji jest częstością odpowiadających na f_resztJ = (p, - n_i)/(1 - π,). Zatem wzór III może być przekształcony tak, że uzyska się wzór V:

IV

3n ^fpopulacja = ^{1 -} Π ^{(1 -} Φj )² + ^{(1 -} Π ^{(1 - f}reszt 1 )) j =1 i =1 gdzie za wyrażenie 1- freszt_i wstawia się wartość zero, jeśli jest ujemne. Należy zauważyć, że wzór V wymaga, aby wszystkie epitopy były haplotypami zmapowanymi przeciw identycznemu zestawowi haplotypów.

Zatem, gdy do analogów wprowadzone są wybrane epitopy komórki T, ważne jest uwzględnienie całej wiedzy o dostępnych epitopach: 1) częstość odpowiadających w populacji reagujących na każdy epitop, 2) dane o ograniczeniu MHC i 3) częstość w populacji mających związek haplotypów.

Istnieje kilka naturalnie występujących „mieszanych” epitopów komórki T, które są aktywne u znacznej części przedstawicieli gatunków zwierząt lub populacji zwierząt i są korzystnie włączone do szczepionki tym samym ograniczając potrzebę bardzo dużej liczby różnych analogów w tej samej szczepionce.

Mieszany epitop może, zgodnie z wynalazkiem, być występującym w naturze ludzkim epitopem komórki T, takim jak epitopy z toksoidu tężca (np. epitopy P2 i P30), toksoidu krztuśca, hemaglutyniny z wirusa grypy (HA) i antygenu CS z P. falciparum. Przez lata zidentyfikowano szereg innych mieszanych epitopów komórki T. Szczególnie zostały zidentyfikowane peptydy zdolne do wiązania znacznej części cząsteczek HLA-DR kodowanych przez różne allele HLA-DR i są one potencjalnymi epitopami

PL 202 399 B1 komórki T, które będą wprowadzone do analogów stosowanych zgodnie z obecnym wynalazkiem. Ponadto, dotyczy to również epitopów omawianych w poniższych odnośnikach literaturowych: WO 98/23635 (Frazer IH i wsp., przypisane University of Queensli); Southwood S i wsp., 1998, J. Immunol. 160; 3363-3373; Sinigaglia F i wsp., 1988, Nature 336: 778-780; Rammensee HG i wsp., 1995, Immunogenetics 41; 4 178-228; Chicz RM i wsp., 1993, J. Exp. Med 178: 27-47; Hammer J i wsp., 1993, Cell 74: 197-203; i Falk K i wsp., 1994, Immunogenetics 39: 230-242. Ostatnie odniesienie literaturowe dotyczy również ligandów HLA-DQ i -DP. Wszystkie epitopy wyszczególnione w tych pięciu odniesieniach literaturowych mają znaczenie jako kandydaci będący naturalnymi epitopami do zastosowania w obecnym wynalazku, jak również epitopy, które mają z nimi wspólne motywy.

Alternatywnie, epitopem może być jakikolwiek sztuczny epitop komórki T, który jest zdolny do związania znacznej części haplotypów. W tym kontekście epitop peptydowy pan DR („PADRE”) opisany w WO 95/07707 i odpowiadającej mu publikacji Alexander J i wsp., 1994, Immunity 1: 751-761 są interesującymi kandydatami na epitopy, które mogą być stosowane zgodnie z obecnym wynalazkiem. Należy odnotować, że najbardziej skuteczne peptydy PADRE ujawnione w tych artykułach niosą D-aminokwasy na C- i N-końcu w celu poprawienia stabilności po podaniu. Jednakże, pierwszoplanowym celem obecnego wynalazku jest włączenie odpowiednich epitopów jako części zmodyfikowanego antygenu, który następnie będzie enzymatycznie zdegradowany wewnątrz kompartmentu lizosomalnego APC pozwalając następnie na prezentację w kontekście cząsteczki MHC-II i wobec tego nie jest celowe włączanie D-aminokwasów do stosowanych w obecnym wynalazku epitopów.

Jednym, szczególnie korzystnym, peptydem PADRE, jest peptyd, który ma sekwencję aminokwasową AKFVAAWTLKAAA lub jej immunologicznie skuteczną podsekwencję. Te i inne epitopy charakteryzujące się tym samym brakiem ograniczenia MHC są korzystnymi epitopami komórki T, które powinny być prezentowane w analogach stosowanych w wynalazku. Takie super-mieszane epitopy będą pozwalały na najprostsze wykonania wynalazku, w których tylko pojedynczy analog jest prezentowany układowi immunologicznemu szczepionego zwierzęcia.

Charakter wyżej omawianych wariantów/modyfikacji korzystnie obejmuje te w których

- co najmniej jedno pierwsze ugrupowania cząsteczki jest wbudowane w pierwszym i/lub drugim analogu(ach), przy czym pierwsze ugrupowanie powoduje kierowanie analogu do komórki prezentującej antygen (APC), i/lub

- co najmniej jedno drugie ugrupowanie i jest zawarte w pierwszym i/lub drugim analogu(ach), i to drugie ugrupowanie pobudza układ immunologiczny i/lub

- co najmniej jedno trzecie ugrupowanie jest zawarte w pierwszym i/lub drugim analogu(ach), i to trzecie ugrupowanie optymalizuje prezentację analogu układowi immunologicznemu.

Funkcjonalne i strukturalne właściwości dotyczące tego pierwszego, drugiego i trzeciego ugrupowania będą omawiane poniżej:

Ugrupowania te mogą być obecne w postaci grup bocznych przyłączonych kowalencyjnie lub nie-kowalencyjnie do odpowiednich grup chemicznych w sekwencji aminokwasowej antygenu polipeptydowego związanego z komórką lub jego podsekwencji. Co oznacza, że ciągi kolejnych reszt aminokwasowych pochodzących z antygenu polipeptydowego są derywatyzowane bez zmiany pierwszorzędowej sekwencji aminokwasowej lub przynajmniej bez wprowadzania zmian w wiązania peptydowe pomiędzy poszczególnymi aminokwasami w łańcuchu.

Ugrupowania mogą być również w postaci partnerów fuzyjnych dla sekwencji aminokwasowej pochodzącej z antygenu polipeptydowego związanego z komórką. W związku z tym należy wspomnieć, że obie możliwości obejmują opcję sprzężenia sekwencji aminokwasowej z nośnikiem, co będzie omawiane poniżej. Innymi słowy w obecnym kontekście „białko fuzyjne” nie jest jedynie ograniczone do konstruktu fuzyjnego wytworzonego przez ekspresję fragmentu DNA kodującego konstrukt, lecz również obejmując koniugat dwóch białek, które są połączone wiązaniem peptydowym w kolejnej reakcji chemicznej.

Jak wspomniano powyżej analogi mogą obejmować również wprowadzenie pierwszego ugrupowania, które kieruje analog do APC lub limfocytu B. Przykładowo, pierwsze ugrupowanie może być specyficznym wiążącym partnerem dla antygenu powierzchniowego specyficznego wobec limfocytu B lub antygenu powierzchniowego specyficznego dla APC. W nauce znanych jest wiele takich, specyficznych antygenów powierzchniowych. Przykładowo, ugrupowanie może być węglowodanem, dla którego istnieje receptor na limfocycie B lub APC (np. mannan lub mannoza). Alternatywnie, drugim ugrupowaniem może być hapten. Również jako pierwsze ugrupowanie może być użyty fragment przeciwciała, który specyficznie rozpoznaje cząsteczkę powierzchniową na APC lub limfocycie (cząsteczka

PL 202 399 B1 powierzchniowa może przykładowo być receptorem FCy na makrofagach i monocytach, takim jak FCyRI lub alternatywnie jakimkolwiek innym specyficznym markerem powierzchniowym, takim jak CD40 lub CTLA-4). Należy zauważyć, że wszystkie te przykładowe cząsteczki kierujące mogą być użyte jako część adiuwanta, patrz poniżej. Ligand CD40, przeciwciała wobec CD40 lub ich warianty, które wiążą CD40, będą kierowały analog do komórek dendrytycznych. W tym samym czasie ostatnie wyniki pokazały, że oddziaływanie z cząsteczką CD40 powoduje, że komórki TH nie są istotne dla uzyskania odpowiedzi CTL. Z tego powodu rozważa się, że ogólne użycie cząsteczek wiążących CD40 jako pierwszego ugrupowania (lub jako adiuwantów, patrz poniżej) będzie wzmacniać znacząco odpowiedź CTL; w rzeczywistości zastosowanie takich cząsteczek wiążących CD40 jako adiuwantów i „pierwszych ugrupowań” w znaczeniu obecnego wynalazku jest uważana za wynalazcze samo w sobie.

Jako alternatywa, lub rozwiązanie dodatkowe do kierowania analogu do określonego typu komórki celem uzyskania wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej jest możliwe zwiększenie poziomu wrażliwości składu immunologicznego przez włączenie wyżej wymienionego drugiego ugrupowania, które pobudza układ immunologiczny. Typowymi przykładami takiego drugiego ugrupowania są cytokiny, białka szoku cieplnego i hormony jak również ich efektywne części.

Odpowiednimi cytokinami, które mogą być stosowane zgodnie z wynalazkiem są te, które normalnie również funkcjonują jako adiuwanty w kompozycji szczepionki np. interferon γ (IFN-γ), ligand Flt3 (Flt3L), interleukina 1 (IL-1), interleukina 2 (IL-2), interleukina 4 (IL-4), interleukina 6 (IL-6), interleukina 12 (IL-12), interleukina 13 (IL-13), interleukina 15 (IL-15) i czynnik pobudzający tworzenie kolonii granulocyty-makrofagi (GM-CSF); alternatywnie funkcjonalna część cząsteczki cytokiny może być wystarczająca jako drugie ugrupowanie. Odnośnie użycia takich cytokin jako substancji adiuwantowych patrz omówienie poniżej.

Alternatywnie, drugim ugrupowaniem może być toksyna, taka jak listeriolicyna (LLO), lipid A i termolabilna enterotoksyna. Interesującymi możliwościami jest również szereg substancji pochodzących z mykobakterii, takich jak MDP (muramylodipeptyd), CFA (kompletny adiuwant Freund'a) i diestry trehalozy TDM i TDE. Zgodnie z wynalazkiem, odpowiednimi białkami szoku cieplnego użytymi jako drugie ugrupowanie mogą być HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 i kalretikulina (CRT).

Ważnym wykonaniem wynalazku jest również możliwość wprowadzenia trzeciego ugrupowania, które wspomaga prezentację analogu układowi immunologicznemu. W technice istnieje szereg przykładów takiej zasady. Przykładowo wiadomo, że grupa palmitoilowa, która jest kotwicą lipidową w białku OspA Borrelia burgdorferi, może być wykorzystana do dostarczenia białka będącego polipeptydem, który sam jest adiuwantem (patrz np. WO 96/40718). Wydaje się, że lipidowane białka tworzą struktury podobne do miceli z rdzeniem składającym się z części polipeptydu stanowiących kotwicę lipidacji i pozostałymi częściami cząsteczki wystającymi z niej, dzięki czemu uzyskuje się wielokrotne prezentacje determinant antygenowych. Stąd użycie tego i pokrewnych podejść przy pomocy różnych kotwic lipidujących (np. grupy mirystylowej, grupy fernezylowej, grupy geranylo-geranylowej, kotwicy GPI i grupy N-acylodiglicerydowej) są korzystnymi wykonaniami wynalazku, szczególnie ponieważ dostarczenie takiej kotwicy lipidującej w rekombinacyjnie wytwarzanym białku jest dosyć proste i wymaga tylko użycia np. naturalnie występującej sekwencji sygnałowej jako partnera fuzyjnego dla analogu. Inną możliwością jest użycie fragmentu C3d dopełniacza czynnika C3 lub samego C3 (patrz Dempsey i wsp., 1996, Science 271, 348-350 i Lou & Kohler, 1998, Nature Biotechnology 16, 458-462).

Należy zwrócić uwagę, że gdy usiłuje się zastosować rozwiązania według wynalazku przeciw np. antygenom polipeptydowym związanym z błoną, które są eksponowane na zewnątrzkomórkowe kompartmenty, jest najbardziej korzystne, gdy pierwszy i/lub drugi analog(i) ma zasadniczo całą strukturę trzeciorzędową antygenu polipeptydowego związanego z komórką. W obecnym opisie i w zastrzeżeniach oznacza to, że ogólna struktura trzeciorzędowa części antygenu polipeptydowego, który jest prezentowany poza komórkę jest zachowana, ponieważ, jak wspomniano powyżej, trzeciorzędowa struktura niezbędnego wewnątrzkomórkowego polipeptydu nie angażuje humoralnego układu immunologicznego. W rzeczywistości jako część strategii szczepienia jest często pożądane uniknięcie ekspozycji na zewnątrzkomórkowy kompartment potencjalnych epitopów komórki B pochodzących z części wewnątrzkomórkowej antygenów polipeptydowych; w ten sposób mogą być zminimalizowane potencjalne szkodliwe działania powodowane przez reakcję krzyżową z innymi antygenami.

Dla celów obecnego wynalazku jest jednakże wystarczające, jeśli wariant/modyfikacja (będzie nim insercja, addycja, delecja lub substytucja) prowokuje obcy epitop komórki T i w tym samym czasie zachowaje zasadniczą liczbę epitopów CTL w antygenie polipeptydowym (i czasem również istotną liczbę epitopów komórki B).

PL 202 399 B1

Poniższy wzór opisuje konstrukty ogólnie objęte wynalazkiem:

(MOD1)s1(PAGe1)n1(MOD2)s2(PAGe2)n2 . . . . (MODx)sx(PAGex)nx (I)

- gdzie PAGe1-PAGex oznaczają x CTL i/lub epitop komórki B zawierający podsekwencje odpowiedniego antygenu polipeptydowego, które niezależnie są identyczne lub nie są identyczne i które mogą zawierać lub nie zawierają obcych grup bocznych, x jest liczbą całkowitą > 3 nl-nx są x liczbami całkowitymi > 0 (przynajmniej jedna jest > 1), MOD₁-MOD_x są x modyfikacjami wprowadzonymi pomiędzy zachowane epitopy i s1-sx są x liczbami całkowitymi > 0 (przynajmniej jedna jest > 1, jeśli do sekwencji nie są wprowadzone grupy boczne). Zatem mając ogólne funkcjonalne ograniczenia immunogeniczności konstruktów, wynalazek pozwala na wszystkie rodzaje permutacji oryginalnej sekwencji antygenowej i wszystkie rodzaje jej modyfikacji. Stąd wynalazkiem objęte są analogi uzyskane przez pominięcie części sekwencji antygenu polipeptydowego, które np. wykazują in vivo szkodliwe działania uboczne lub pominięcie części, które normalnie są wewnątrzkomórkowe i dlatego mogą dawać niepożądane reakcje immunologiczne patrz szczegółowe omówienie poniżej.

Dalsze szczegółowe omówienie powyższej zasady obejmuje zastosowanie epitopów CTL i/lub komórki B z więcej niż jednego antygenu związanego z patologią. Przykładowo, istnieje wiele antygenów związanych z rakiem, które mają działanie onkogenne, jedynie wtedy gdy występują w postaci zmutowanej - przykładami są zmutowane K-ras i P53, które oba są kluczowymi białkami w prawidłowej regulacji cyklu komórkowego i które oba są produktami ekspresji większości prawidłowych komórek. W niektórych przypadkach pokazano, że CTL rozpoznaje zmutowane peptydy z tych antygenów. Dlatego ważne jest aby układ immunologiczny odpowiadał jedynie na zmutowane peptydy i nie reagował na ich niezmutowane części, jeśli przystępuje się do specyficznej immunoterapii.

Opracowaliśmy strategię, w której sekwencje 8-25 aminokwasów takich związanych z chorobą białek można byłoby użyć jako dalsze epitopy w konstrukcie AutoVac - w korzystnych wykonaniach, a wprowadzone epitopy w tym samym czasie spowodowałyby pojawienie się epitopów TH w ostatecznym konstrukcie, patrz omówienie powyżej. Użyte dla tego celu epitopy, zawierają zmutowany region białka towarzyszącego chorobą. Przez użycie takiego podejścia, możliwe będzie wytworzenie CTL (i przypuszczalnie przeciwciał, gdzie jest to właściwe) przeciw jedynie zmutowanej postaci antygenu towarzyszącego chorobie. W przypadkach gdy antygen towarzyszący chorobie powoduje pojawienie się epitopu TH, całkowicie pominięte może być użycie naprawdę obcego epitopu TH. Wykonaniem tej zasady może być np. szczepienie szczepionką kwasu nukleinowego kodującego analog antygenu polipeptydowego (np. Her2 lub PSM), gdzie wprowadzony został przynajmniej jeden epitop TH i przynajmniej jeden polipeptyd pochodzący z innego antygenu związanego z chorobą (np. peptyd ze zmutowanej części onkogennego białka). W korzystnym wykonaniu, przynajmniej jeden epitop TH jest wprowadzony jako konsekwencja wprowadzenia peptydu.

Ponadto jest korzystne, że wariant i/lub modyfikacja obejmuje duplikację, gdy jest odpowiednie, przynajmniej jednego epitopu komórki B lub przynajmniej jednego epitopu CTL antygenu peptydowego związanego z komórką. Ta strategia w efekcie da to, że wiele kopii korzystnych epitopowych regionów będzie prezentowanych układowi immunologicznemu, tym samym maksymalizując prawdopodobieństwo skutecznej odpowiedzi immunologicznej. Zatem to wykonanie wynalazku wykorzystuje wielokrotną prezentację epitopów pochodzących z antygenu polipeptydowego (tj. wzór I, w którym w dwóch pozycjach jest obecny przynajmniej jeden epitop komórki B).

Efekt ten można osiągnąć różnymi drogami, np. przez proste wytworzenia peptydów fuzyjnych zawierających strukturę (PAG)_m, gdzie m jest liczbą całkowitą > 2 i następnie wprowadzenie omówionych tu modyfikacji w przynajmniej jednej sekwencji antygenu polipeptydowego.

Alternatywnym wykonaniem wynalazku, które również prowadzi do korzystnej prezentacji wielu (np. przynajmniej 2) kopii ważnych epitopowo regionów antygenu, układowi immunologicznemu jest kowalencyjne związanie antygenu, jego podsekwencji lub wariantów z pewnymi cząsteczkami. Przykładowo mogą być użyte polimery np. węglowodany, takie jak dekstran patrz np. Lees A i wsp., 1994, Vaccine 12: 1160-1166; Lees A i wsp., 1990, J Immunol. 145: 3594-3600, lecz również alternatywnie użyteczna jest mannoza i mannan. Integralne białka błonowe z np. E. coli i innych bakterii są również użytecznymi partnerami w koniugacji. Tradycyjne cząsteczki nośnika, takie jak hemocyjanina ze skałoczepa (KLH), toksoid tężca, toksoid duru brzusznego i albumina z surowicy bydlęcej (BSA) są również korzystnymi i użytecznymi partnerami dla koniugacji.

PL 202 399 B1

Zachowanie czasem korzystnych istotnych frakcji epitopów komórki B lub nawet ogólnej trzeciorzędowej struktury białka, które jest poddane modyfikacji jak to tu opisano, może być osiągnięte różnymi drogami. Jedną jest proste wytwarzanie poliklonalnej surowicy odpornościowej skierowanej przeciw antygenowi polipeptydowemu (np. surowica odpornościowa wytworzona w króliku) i później użycie tej surowicy odpornościowej jako reagenta w teście (np. w teście współzawodnictwa ELISA) przeciw zmodyfikowanym białkom, które są wytwarzane. Zmodyfikowane wersje (analogi), które reagują w tym samym zakresie z surowicą odpornościową jak antygen polipeptydowy, muszą być uważane za mające tę samą ogólną strukturę trzeciorzędową jak antygen polipeptydowy podczas gdy analogi wykazujące ograniczoną (lecz nadal znaczącą i specyficzną) reaktywność z taką surowicą odpornościową, są uważane za zachowujące zasadniczą frakcję oryginalnych epitopów komórki B.

Alternatywnie, selekcja przeciwciał monoklonalnych reaktywnych z różnymi epitopami na antygenie polipeptydowym może być przeprowadzone i wykorzystane jako panel testowy. To podejście ma następujące zalety 1) mapowanie epitopu danego antygenu polipeptydowego i 2) mapowanie epitopów, które są zachowane w wytworzonych analogach.

Oczywiście trzecim podejściem będzie rozwiązanie struktury trójwymiarowej antygenu polipeptydowego lub jego biologicznie aktywnej skróconej postaci (patrz powyżej) i porównanie z opracowaną trójwymiarową strukturą wytworzonego analogu. Trójwymiarowa struktura może być opracowana przy pomocy badań z dyfrakcją promieni X i spektroskopią NMR. Dalsze informacje dotyczące trzeciorzędowej struktury można w pewnym zakresie uzyskać z badań nad dichroizmem kołowym, które mają tę zaletę, że wymagają jedynie polipeptydu w postaci czystej (podczas gdy dyfrakcja promieni X wymaga dostarczenia wykrystalizowanego polipeptydu, a NMR wymaga dostarczenia izotopowych wariantów polipeptydu) celem dostarczenia użytecznej informacji o trzeciorzędowej strukturze danej cząsteczki. Jednakże, ostatecznie dyfrakcja promieni X i/lub NMR są niezbędne dla uzyskania ostatecznych danych, bowiem dichroizm kołowy może dostarczyć jedynie pośredniego dowodu na poprawną strukturę trójwymiarowej przez informację o elementach struktury drugorzędowej.

Zasadniczo, istnieją trzy możliwe do zastosowania sposoby uzyskania prezentacji odpowiednich epitopów układowi immunologicznemu: tradycyjne szczepienie podjednostkami z antygenami polipeptydowymi, podanie genetycznie zmodyfikowanej żywej szczepionki i szczepienie kwasem nukleinowym. Poniżej te trzy możliwości będą omówione kolejno:

Szczepienie polipeptydem

Szczepienie to obejmuje podanie właściwemu zwierzęciu immunologicznie skutecznej ilości przynajmniej jednego pierwszego analogu i, gdy jest to wskazane podanie immunologicznie skutecznej ilości przynajmniej jednego drugiego analogu. Korzystnie, przynajmniej jeden pierwszy i/lub drugi analog(i) jest/są formułowane razem z farmaceutycznie i immunologicznie akceptowalnym nośnikiem i/lub podłożem, i ewentualnie adiuwantem.

Gdy do prezentacji analogu układowi immunologicznemu zwierzęcia doprowadza się przez podanie go zwierzęciu, formulację polipeptydu sporządza się zgodnie z ogólnymi zasadami w tej dziedzinie.

Wytworzenie szczepionek, które zawiera sekwencje polipeptydowe jako aktywne składniki, jest ogólnie dobrze znane w dziedzinie, jak przykładowo podano w patentach US 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792 i 4,578,770. Typowo, takie szczepionki są wytwarzane jako nadające się do wstrzyknięcia roztwory ciekłe lub zawiesiny. Mogą być także wytworzone postaci stałe odpowiednie do rozpuszczania w lub zawieszania w, wytworzone cieczy być również płyny przed wstrzyknięciem. Preparat może być również w postaci emulsji. Aktywny immunogenny składnik jest często mieszany z substancjami pomocniczymi, które są farmaceutycznie akceptowalne i zgodne z aktywnym składnikiem. Odpowiednimi środkami pomocniczymi są przykładowo woda, solanka, dekstroza, glicerol, etanol lub im podobne i ich kombinacje. Dodatkowo, jeśli jest to konieczne, szczepionka może zawierać mniejsze ilości substancji pomocniczych, takich jak czynniki zwilżające lub emulgujące, czynniki buforujące pH lub adiuwanty, które zwiększają skuteczność szczepionek; patrz poniżej na szczegółowe omówienie.

Szczepionki są konwencjonalnie podawane pozajelitowo przez wstrzyknięcie, przykładowo, podskórnie, śródskórnie, lub domięśniowo. Dodatkowe formulację, które są odpowiednie dla innych dróg podawania obejmują czopki i, w niektórych przypadkach, postaci doustne, do - policzkowe, podjęzykowe, dootrzewnowe, dopochwowe, doodbytnicze i do czaszkowe. W czopkach zawarte mogą być tradycyjne substancje wiążące i nośniki, przykładowo, glikole polialkilenowe lub triglicerydy; takie czopki mogą być sporządzone z mieszanin zawierających składnik aktywny w ilości 0,5% do 10%,

PL 202 399 B1 korzystnie 1-2%. Formulację doustne obejmują takie, zwykle stosowane, substancje pomocnicze jak, przykładowo, mannitol o jakości farmaceutycznej, laktoza, skrobia, stearynian magnezu, sacharynian sodu, celuloza, węglan magnezu i im podobne. Takie kompozycje przyjmują postać roztworów, zawiesin, tabletek, pigułek, kapsułek, formulacji o przedłużonym uwalnianiu lub proszków i zawierają 10-95% aktywnego składnika, korzystnie 25-70%. Dla formulacji doustnych toksyna cholery jest interesującym partnerem w recepturze (i również możliwym partnerem dla koniugacji).

Polipeptydy mogą być formułowane w szczepionkę w postaci obojętnej lub jako sole. Farmaceutycznie dopuszczalne sole obejmują sole addycyjne z kwasem (tworzone z wolnymi grupami aminowymi peptydu) i które są wytworzone z kwasami nieorganicznymi, takimi jak, przykładowo, kwas solny lub kwasy fosforowe lub z takimi kwasami organicznymi jak octowy, szczawiowy, winowy, migdałowy lub podobne. Sole utworzone przez wolne grupy karboksylowe mogą również być pochodzić od nieorganicznych zasad, takich jak, na przykład, wodorotlenki sodu, potasu, amonu, wapnia lub wodorotlenek żelaza i takich zasad organicznych jak izopropyloamina, trimetyloamina, 2-etyloaminoetanol, histydyna, prokaina i podobne.

Szczepionki są podawane w sposób zgodny z postacią dawki i w takiej ilości, aby była terapeutycznie skuteczna i immunogenna. Podawane ilości zależą od leczonego osobnika np. zdolności osobniczego układu immunologicznego do ustalenia odpowiedzi immunologicznej i stopnia żądanej ochrony. Zakresy odpowiedniej dawki są rzędu kilkuset mikrogramów aktywnego składnika na szczepienie z korzystnym zakresem od około 0,1 μg do 2000 μq (pomimo tego rozważane są wyższe ilości w zakresie 1-10 mg) takie jak w zakresie od około 0,5 μq do 1 000 μg, korzystnie w zakresie od 10 μg do 100 μg. Odpowiednie reżimy dla początkowego podawania i iniekcji przypominających są również zmienne ale są określone przez początkowe podawania, z kolejnymi szczepieniami lub podawaniem innymi sposobami.

Sposoby podawania mogą się bardzo różnić. Można stosować dowolne z tradycyjnych sposobów podawania szczepionki. Obejmują one podanie doustne na stałej, fizjologicznie dopuszczalnej bazie lub w fizjologicznie dopuszczalnej dyspersji, pozajelitowo, przez wstrzyknięcie lub w podobny sposób. Dawka szczepionki będzie zależała od drogi podania i będzie się różnić zależnie od wieku osoby szczepionej i formulacji antygenu.

Niektóre polipeptydy ze szczepionki są dostatecznie immunogenne w szczepionce, lecz dla niektórych innych odpowiedź immunologiczna będzie wzmocniona, jeśli szczepionka dodatkowo będzie zawierała substancję będącą adiuwantem. Szczególnie korzystne jest stosowanie adiuwanta, który wykazuje ułatwienie przełamania autotolerancji względem autoantygenów.

Znane są różne sposoby osiągnięcia przez szczepionki efektu adiuwanta. Ogólne zasady I sposoby są opisane w „The Theory and Practical Application of Adjuvants”, 1995, Duncan E.S. StewartTull (wyd.), John Wiley & Sons Ltd. ISBN 0-471-95170-6, jak również w „Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants”, 1995, Gregoriadis G i wsp., (wyd.), Plenum Press, Nowy Jork, ISBN 0-30645283-9. Korzystne adiuwanty ułatwiają wychwyt cząsteczek szczepionki przez APC, takie jak komórki dendrytyczne i aktywowanie ich. Nie ograniczające przykłady są wybrane z grupy składającej się z adiuwantów kierujących substancje immunogenne; adiuwantów modulujących odpowiedź immunologiczną, takich jak toksyny i cytokiny i pochodne mykobakterii; formulacji olejowych, polimeru; adiuwanta tworzącego micele, saponiny; kompleksu immunostymulującego (macierz ISCOM); cząstki; DDA; adiuwantów glinowych; adiuwantów DNA; γ-inuliny i czynnika kapsułkującego. Powyższe ujawnienie, które dotyczy związków i czynników przydatnych jako pierwsze, drugie i trzecie ugrupowanie w analogach, również odnosi się mutatis mutandis do ich użycia w adiuwancie kompozycji immunogennej.

Podanie adjuwantów obejmuje użycie czynników takich jak wodorotlenek glinu lub fosforan (alum), powszechnie używany jako 0,05 do 0,1 procentowy roztwór w zbuforowanej solance, zmieszany z syntetycznymi polimerami cukrów (np. Carbopol®) użytego jako 0,25 procentowy roztwór, segregowanie białek w szczepionce przez poddanie działaniu temperatury w zakresie 70° do 101°C przez czas odpowiednio 30 sekund do 2 minut i również agregowanie w znaczeniu że możliwe jest użycie czynników sieciujących. Może być również zastosowane agregowanie przez reaktywowanie z przeciwciałami poddanymi działaniu pepsyny (fragmenty Fab) do albuminy, mieszanie z komórkami bakterii takimi jak C. parvum lub endotoksynami lub związkami lipopolisacharydów z bakterii gram ujemnej, emulsji fizjologicznie akceptowalnego olejowego nośnika takiego jak monooleinian mannitu (Aracel A) lub emulsji z 20 procentowym roztworem perfluorowęglanu (Fluorosol-DA) użytych jako blokujące substytuty. Korzystne jest również dodanie olei takich jak skwalen i IFA.

PL 202 399 B1

Zgodnie z wynalazkiem DDA (bromek dimetylodioktadecyloamonu) jest interesującym kandydatem na adiuwant jakim jest DNA i γ-inulina, lecz również interesujące są kompletny i niekompletny adjuwanty Freund'a jak również saponiny Quillaja takie jak QuilA i QS21. Dalszymi możliwościami są monoufosforylowany lipid A (MPL) i powyżej wspomniany C3 i C3d.

Preparaty liposomów są również znane jako ustalające efekty adiuwanta i co za tym idzie zgodnie z wynalazkiem korzystne są adiuwanty liposomowe.

Również korzystnym, zgodnym z wynalazkiem, wyborem są immunopobudzające kompleksy macierzy (macierz ISCOM®) jako adiuwanty, szczególnie że było pokazane, że ten typ adiuwantów jest zdolny do pobudzania ekspresji MHC klasy II przez APC.

Macierz ISCOM® zawiera (warunkowo frakcjonowana) saponiny (triterpenoidy) z Quillaja saponaria, cholesterol i fosfolipidy. Gdy zmieszane z immunogenicznym białkiem, uzyskana szczególna receptura jest znana jako cząsteczka ISCOM, gdzie saponina stanowi 60-70% wag./wag., cholesterol i fosfolipid 10-15% wag./wag. i białko 10-15% wag./wag. Szczegóły dotyczące kompozycji i użycie kompleksów immunostymulujących może np. być znalezione w wyżej wspomnianych podręcznikach wyszczególniających adiuwanty, lecz również przez Morein B i wsp., 1995, Clinic. Immunother. 3: 461475 jak również Barr IG i Mitchell GF, 1996, Immunol. i Cell Biol. 74: 8-25 (oba włączone przez ich cytowanie) dostarczają użytecznych instrukcji dla sporządzania pełnego kompleksu immunostymulującego.

Inną wysoce interesującą (i co za tym idzie korzystną) możliwością uzyskania efektu adiuwanta jest zastosowanie techniki opisanej w Gosselin i wsp., 1992 (który jest włączony tu przez odniesienie literaturowe). W skrócie, prezentacja odpowiedniego antygenu, takiego jak obecny wynalazek może być wzmocniona przez koniugację antygenu z przeciwciałami (lub antygenu wiążącego fragmenty przeciwciała) ponownie receptory Fc na monocytach/makrofagach. Szczególnie koniugaty pomiędzy antygenem i anty FcyRI pokazały, wzmocnienie immunogeniczności dla celów szczepienia.

Inne możliwości obejmują użycie, wspomnianych powyżej, substancji adresujących i modulujących immunogeniczność (np. cytokin) jako kandydatów na pierwszą i drugą cząsteczkę w modyfikowanych analogach. W tym połączeniu możliwościami są również syntetyczne induktory cytokin jak poli I:C.

Użyteczne pochodne mykobakterii są wybrane z grupy obejmującej dipeptyd muramylu, kompletny adiuwant Freund'a, RIBI i diester trahelozy, taki jak TDM i TDE.

Użyteczne adresujące immunoadiuwanty są wybrane z grupy obejmującej ligi CD40 i przeciwciała CD40 lub ich specyficznie wiążące fragmenty (przykładowo dyskutowane powyżej), mannoza, fragment Fab i CTLA-4.

Użyteczne polimerowe adiuwanty są wybrane z grupy obejmującej węglowodany takie jak dekstran, PEG, skrobia, mannan i mannoza; polimer plastiku i lateks taki jak ziarna lateksu.

W jeszcze kolejnej interesującej drodze modulowania odpowiedzi immunologicznej jest uwzględniony immunogen (warunkowo z adiuwantami i farmaceutycznie akceptowalnymi nośnikami i ośrodkami) w „wirtualnym węźle limfatycznym” (VLM) (w odpowiednim urządzeniu medycznym opracowanym przez ImmunoTherapy Inc., 360 Lexington Avenue, Nowy Jork, NY 1017 6501. VLN (małe urządzenie w kształcie dzwonu) naśladuje strukturę i funkcję węzła limfatycznego. Wszczepienie VLN pod skórę kreuje miejsce jałowego stanu zapalnego z uwolnieniem cytokin i chemokin. Komórki T i B jak również APC gwałtownie reagują na sygnały niebezpieczeństwa pochodzące z miejsca zapalenia i gromadzą się w porowatej macierzy VLN. Pokazano, że niezbędna jest dawka antygenu dla ustalenia odpowiedzi immunologicznej na antygen, która jest ograniczona gdy stosowany jest VLN i ochrona immunologiczna ustalona przez szczepienie przy pomocy VLN przewyższa tradycyjną immunizację przy użyciu Ribi jako adiuwanta. Technologia jest przykładowo krótko opisana w Gelber C i wsp., 1998, „Elicitation of Robust Cellular i Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Device designated the Virtual Lymph Node” w: „From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, October 12^th - 15^th 1998, Seascape Resort, Aptos, California”.

Współczesne odkrycia pokazały, że współpodanie agonisty K2 zwiększa przeżycie w guzie komórek NK i CTL. Co za tym idzie jest również rozważane uwzględnienie jako adiuwantów, w metodach z wynalazku, agonistów H2.

Oczekuje się również, że szczepionka powinna być podana co najmniej raz w roku, tak jak co najmniej 1, 2, 3, 4, 5, 6, i 12 razy w roku. Dokładniej, oczekuje się, że osobnik będzie wymagał tego 1-12 razy w roku, oczekuje się, że 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub 12 razy w roku. Wcześniej pokazano, że pamięć immunologiczna indukowana przez użycie korzystnych autoszczepionek zgodnych z wynalazkiem nie jest trwała i co za tym idzie potrzebnym jest aby system immunologiczny był okresowo pobudzany analogami.

PL 202 399 B1

Zależnie od zmienności genetycznej, różne osobniki mogą reagować na ten sam polipeptyd odpowiedzią immunologiczną o różnej sile. Co za tym idzie szczepionka według wynalazku może zawierać szereg różnych polipeptydów celem zwiększenia odpowiedzi immunologicznej, patrz również powyższa dyskusja dotycząca wyboru wprowadzenia obcego epitopu komórki T. Szczepionka może obejmować dwa lub więcej polipeptydy, gdzie wszystkie polipeptydy są określone powyżej.

Konsekwentnie szczepionka może zawierać 3-20 różnych zmodyfikowanych lub niezmodyfikowanych polipeptydów, tak jak 3-10 różnych polipeptydów. Jednakowoż normalnie liczba polipeptydów będzie utrzymywana na minimalnym poziomie czyli 1 lub 2 peptydy.

Żywe szczepionki.

Drugą alternatywą uzyskania skutecznej prezentacji systemowi immunologicznemu jest użycie technologii żywej szczepionki. W szczepieniu zwierząt żywą szczepionką, nie patogeniczne mikroorganizmy, które zostały stransformowane fragmentami kwasu nukleinowego kodują niezbędny obszar epitopowy lub pełen 1-szy i/lub 2-gi analog. Alternatywnie mikroorganizm jest stransformowany wektorem z wbudowanym takim fragmentem kwasu nukleinowego. Nie patogeniczne mikroorganizmy mogą być użytecznie atenuowanymi szczepami bakterii (atenuowanymi w sensie przepasażowania lub w sensie usunięcia produktów ekspresji patogenu przy pomocy technologii rekombinacji DNA), np. Mycobacterium bovis BCG., nie patogeniczny Streptococcus sp., E. coli, Salmonella sp., Vibrio cholerae, Shigella sp. itp.. Przegląd znanych nauce preparatów żywych szczepionek może być znaleziony np. w Soliou P, 1995, Rev. Prat. 45: 1492-1496 i Walker PD, 1992, Vaccine 10: 977-990, obie włączone tu przez cytowanie. Dla szczegółów o fragmentach kwasów nukleinowych i wektorach użytych w takich ż ywych szczepionkach patrz poniż sza dyskusja.

Jak dla szczepionki polipeptydowej epitop TH i/lub pierwsza i/lub druga i/lub trzecia cząsteczka mogą, jeśli występują, być w postaci partnerów fuzyjnych dla sekwencji aminokwasowej pochodzącej z towarzyszącego komórce antygenu polipeptydowego.

Jako alternatywę dla żywej szczepionki bakteryjnej, włączony może być, dyskutowany powyżej, fragment kwasu nukleinowego z wynalazku wbudowany do wektora nie wirulentnej szczepionki wirusowej. Jedną możliwością jest poksy wirus, taki jak wirus krowianki, MVA (modyfikowany wirus krowianki), poksy wirus kanarka, ptasi poksy wirus, i poksy wirus kurczaka itp.. Alternatywnie może być użyty wariant wirusa opryszczki.

Normalnie nie patogeniczne mikroorganizmy lub wirusy są podane zwierzęciu tylko jednokrotnie, lecz w określonych przykładkach może być niezbędnym podanie mikroorganizmu więcej niż raz w ciągu życia.

Mikroorganizmy mogą być również stransformowane kwasem(ami) nukleinowym zawierającym obszar kodujący 1-szą, 2-gą i/lub 3-cią cząsteczkę np. w postaci opisanej powyżej substancji immunomodulującej, takiej jak cytokiny dyskutowane jako użyteczne adiuwanty. Korzystne wersje tych postaci obejmują obszary kodujące dla analogów i obszary kodujące dla immunomodulatorów w różnych ramkach odczytu lub przynajmniej pod kontrolą różnych promotorów. Co za tym idzie zapobiega się temu, że analogi lub epitopy są wytwarzane jako fuzje partnerów dla immunomodulatora. Alternatywnie, mogą być użyte jako czynniki transformujące dwa oddzielne fragmenty sekwencji nukleotydowej.

Szczepienie kwasem nukleinowym

Jako alternatywę klasycznego podania szczepionki opartej na peptydzie technologia szczepienia kwasem nukleinowym (znana również jako „immunizacja kwasem nukleinowym”, „immunizacja genetyczna”, „immunizacja genem” i „szczepienie DNA”) oferuje szereg atrakcyjnych właściwości.

W przeciwień stwie do tradycyjnego sposobu szczepienia, szczepienie kwasem nukleinowym nie wymaga zasobów jaki pochłania wielkoskalowe wytwarzanie czynnika immunizującego (np. w postaci prowadzonej na skalę przemysłową fermentacji mikroorganizmów wytwarzających analogi niezbędne w szczepieniu polipeptydem). Ponadto, nie jest wymagane urządzenie oczyszczające i schemat skł adania immunogenu. I ostatecznie ponieważ szczepionka z kwasu nukleinowego wpł ywa na aparat biochemiczny szczepionego osobnika celem wytworzenia produktu kodowanego przez wprowadzony kwas nukleinowy oczekuje się, że nastąpi optymalna posttranskrypcyjna obróbka produktu ekspresji; jest to szczególnie ważne, jak wspomniano powyżej, w przypadku autoszczepienia, znacząca frakcja wyjściowych epitopów komórki B powinna być zachowana w analogach pochodzących z prezentowanych poza komórkę sekwencji polipeptydowych i ponieważ epitopy komórki B zasadniczo mogą być określone przez część jakiejkolwiek (bio)cząsteczki (np. węglowodanu, lipidu, białka itp.). Co za tym idzie naturalny wzór glikozylacji i ulipidowania immunogenu może być bardzo ważny dla ogólnej immunogeniczności i jest najlepiej uzyskać pewność posiadając gospodarza wytwarzającego immunogen.

PL 202 399 B1

Co za tym idzie ważna postać sposobu z wynalazku wymaga aby prezentacja była skutkiem wprowadzenia in vivo do APC przynajmniej jednego fragmentu kwasu nukleinowego, który koduje i wyraża przynajmniej jeden epitop CTL i/lub przynajmniej jeden epitop komórki B i przynajmniej jeden, pierwszy obcy epitop TH (alternatywa obejmuje podanie przynajmniej dwóch różnych fragmentów kwasu nukleinowego gdzie jeden koduje przynajmniej jeden epitop CTL i drugi koduje przynajmniej jeden obcy epitop TH). Korzystnie, jest to przeprowadzone przez użycie fragmentu kwasu nukleinowego, który koduje i wyraża dyskutowany powyżej pierwszy analog. Jeśli pierwszy analog jest wyposażony w wyżej podane epitopy TH i/lub pierwszą i/lub drugą i/lub trzecią cząsteczkę, które następnie występują w postaci partnerów fuzyjnych sekwencji aminokwasowej pochodzącej z towarzyszącego komórce antygenu polipeptydowego, konstrukt fuzyjny jest kodowany przez fragment kwasu nukleinowego.

Jak w tradycyjnym sposobie szczepienia, szczepienie kwasem nukleinowym może być połączone z wprowadzeniem in vivo do APC przynajmniej jednego fragmentu kwasu nukleinowego kodującego i wyrażającego drugi analog. Zastosowane jest tu również rozważanie dotyczące 1-ej, 2-ej i 3-ej cząsteczki i epitopów TH.

W tej postaci wprowadzanym kwasem nukleinowym jest korzystnie DNA, którym może być nagi DNA, DNA w postaci z posiadającymi ładunek lub nie posiadającymi ładunku lipidami, DNA w liposomach, DNA zawarty w wektorze wirusowym, DNA utworzony z białkami lub polipeptydami zapewniającymi transfekcję, DNA utworzony z białkiem adresującym lub polipeptydem, DNA utworzony z czynnikami wytrącającymi wapniem, DNA związany z obojętną cząsteczką nośnika i DNA w postaci z adiuwantem. W tym kontekście trzeba odnotować, że praktycznie wszystkie rozważania dotyczą użycia adiuwantów w tradycyjnej recepturze szczepionki zastosowanej dla sporządzenia szczepionek DNA. Co za tym idzie wszystkie te ujawnienia, które dotyczą użycia adiuwantów w kontekście szczepionek opartych na polipeptydach mają zastosowanie mutatis mutiis w technologii szczepienia kwasem nukleinowym. To samo pozostaje prawdą dla innych rozważań dotyczących postaci i sposobu i drogi podania i co za tym idzie również dyskutowane powyżej stwierdzenia w połączeniu z tradycyjną szczepionką dotyczą mutatis mutiis ich użycia w technologii szczepienia kwasem nukleinowym.

Jednym, szczególnie korzystnym rodzajem postaci szczepionek kwasu nukleinowego są mikrocząsteczki zawierające DNA. Korzystnie, mikrocząsteczki są np. opisane w WO 98/31398.

Ponadto, kwas(y) nukleinowe użyte jako czynnik immunizujący mogą zawierać obszary kodujące 1-szą, 2-gą i/lub 3-cią cząsteczkę np. w postaci opisanych powyżej substancji immunomodulujących takich jak cytokiny dyskutowane jako użyteczne adiuwanty. Korzystna wersja takiej postaci obejmuje obszar kodujący analog i obszar kodujący immunomodulator w różnych ramkach odczytu lub przynajmniej pod kontrolą różnych promotorów. Co za tym idzie zapobiega się temu, że analog lub epitop jest wytwarzany jako partner fuzyjny dla immunomodulatora. Alternatywnie mogą być użyte dwa różne fragmenty nukleotydowe, lecz jest to mniej korzystne z uwagi na korzyść z uzyskania pewności współekspresji gdy oba obszary kodujące zawarte są w tej samej cząsteczce.

W normalnych warunkach kwas nukleinowy szczepionki jest wprowadzony w postaci wektora, w którym ekspresja znajduje się pod kontrolą promotora wirusowego, bardziej szczegółowa dyskusja wektorów zgodnych z wynalazkiem zamieszczona jest poniżej. Dostępne jest również szczegółowe ujawnienie dotyczące postaci i użycia szczepionek z kwasu nukleinowego, patrz Donnelly JJ i wsp., 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648 i Donnelly JJ i wsp., 1997, Life Sciences 60: 163-172. Obie te pozycje są włączone przez ich cytowanie.

Ważna część wynalazku dotyczy nowego sposobu selekcji odpowiednich immunogenicznych analogów antygenu towarzyszącego komórce, który u zwierzęcia jest słabo immunogeniczny lub nie immunogeniczny, wspomniany immunogeniczny analog jest zdolny do indukcji u zwierząt odpowiedzi CTL przeciw komórkom ujawniającym cząsteczkę MHC klasy I związaną z epitopem pochodzącym z towarzyszącego komórce antygenu polipeptydowego. Metoda ta obejmuje etapy:

a) identyfikacji przynajmniej jednej subsekwencji sekwencji aminokwasowej towarzyszącego komórce antygenu polipeptydowego, gdzie wspomniana sekwencja nie zawiera znanego lub przewidywanych epitopów CTL,

b) przygotowania przynajmniej jednego potencjalnie immunogenicznego analogu towarzyszącego komórce antygenu polipeptydowego przez wprowadzenie do sekwencji aminokwasowej towarzyszącego komórce antygenu polipeptydowego przynajmniej jednego, obcego dla zwierzęcia epitopu TH w miejscu, w którym znajduje się przynajmniej jedna subsekwencja zidentyfikowana w etapie a) i

c) selekcji tego/tych analogów, które sporządzono w etapie b), które są w sposób weryfikowalny zdolne do indukcji u zwierzęcia odpowiedzi CTL.

PL 202 399 B1

Alternatywnie, powyższa metoda selekcji wymaga sporządzenia fragmentu kwasu nukleinowego celem szczepienia kwasem nukleinowym. W sytuacji tej jest wymagane aby kodowany peptyd zawierał przynajmniej jeden epitop TH.

Gdy analog pochodzi z antygenu, który jest eksponowany do fazy zewnątrzkomórkowej jest pożądanym aby subsekwencja została zidentyfikowana w etapie a), dla określenia czy nie zawiera reszt cysteiny lub alternatywnie aby epitop TH wprowadzony w etapie b) zasadniczo nie zmieniał wzoru reszt cysteiny. Takie podejście pozwala na zachowanie epitopów komórki B w otrzymanym konstrukcie, które są podobne do epitopów komórki B w słabym, towarzyszącym komórce antygenie polipeptydowym.

Z pewnych względów jest korzystne aby sekwencja zidentyfikowana w etapie a) dodatkowo nie zawierała znanych lub postulowanych miejsc glikozylacji lub alternatywnie, epitopy TH wprowadzone w etapie b) nie zmieniały w sposób zasadniczy wzoru glikozylacji.

Pewne słabe towarzyszące komórce antygeny polipeptydowe ujawniają niepożądane efekty uboczne przez pełnienie funkcji patofizjologicznej. Jest pożądanym aby efekty te nie były przenoszone przez konstrukty dla szczepienia, i co za tym idzie jest korzystnym aby etap a) identyfikacji subsekwencji przyczyniał się znacząco do skutków patofizjologicznych wywoływanych przez towarzyszący komórce antygen polipeptydowy, i aby wprowadzenie w etapie b) obcego epitopu TH znacznie ograniczało lub znosiło wspomniany efekt patofizjologiczny. Przykładem takiego podejścia jest usunięcie aktywnego miejsca w enzymie, hormonie lub cytokinie i zastąpienie go obcym epitopem TH.

Inna ważna uwaga dotyczy pytania o immunologiczną reaktywność krzyżową produktu szczepionki polipeptydowej z innymi białkami własnymi, które nie są związane z patologią. Taka reaktywność krzyżowa powinna być korzystnie pominięta i ponieważ ważna postać tej metody z wynalazku jest taki gdzie sekwencja aminokwasowa zidentyfikowana w etapie a) jest homologiczna z sekwencją aminokwasową innego antygenu białkowego zwierzęcia i gdzie wprowadzenie epitopu TH w etapie b) zasadniczo usuwa homologię.

Powiązana z tą postacią jest postać w której jakiekolwiek sekwencje aminokwasowe, które 1) nie są normalnie eksponowane do przestrzeni zewnątrzkomórkowej i 2) które mogą tworzyć epitopy komórki B słabego towarzyszącego komórce antygenu, nie są zachowane w analogu. Może być to osiągnięte przez zamianę takich sekwencji aminokwasowych epitopami TH, które nie tworzą epitopów komórki B, przez całkowite ich usunięcie lub ich usunięcie częściowe.

Z drugiej strony jest korzystnym gdy jakiekolwiek „prawdziwe” epitopy komórki B słabego towarzyszącego komórce antygenu są zachowane w znacznym stopniu i co za tym idzie ważna postać metody selekcji z wynalazku obejmuje aby w etapie b) wprowadzony był obcy epitop TH, a w wyniku tego była zachowana zasadnicza część epitopów komórki B z antygenu polipeptydowego towarzyszącego komórce. Jest szczególnie korzystne, że analogi zachowują ogólną trzeciorzędową strukturę antygenu towarzyszącego komórce.

Preparatyka z etapu b) jest korzystnie zrealizowana sposobami biologii molekularnej lub sposobami syntezy polipeptydu w cieczy lub na fazie stałej. Krótsze peptydy są korzystnie sporządzone przy pomocy dobrze znanych technik syntezy peptydów na fazie stałej lub w cieczy. Jednakowoż obecny postęp w tych technikach stwarza możliwość wytworzenia, tymi sposobami, polipeptydów i białek pełnej długości, a co za tym idzie one również mieszczą się w zakresie obecnego wynalazku dla sporządzenia długich konstruktów przez tego typu syntezę.

Posiadając zidentyfikowane i użyteczne analogi uzyskane zgodnie z wyżej omówionym sposobem, jest niezbędnym wytworzenie analogu na większą skalę. Polipeptydy są sporządzone zgodnie ze znanymi nauce sposobami.

Może być to wykonane sposobami biologii molekularnej obejmującymi pierwszy etap sporządzania stransformowanej komórki przez wprowadzenie do wektora sekwencji kwasu nukleinowego kodującej analog, który został wyselekcjonowany zgodnie ze sposobem i wprowadzony przez transformację z wektorem do użytecznej komórki gospodarza. Następnym etapem jest hodowanie stransformowanych komórek w warunkach umożliwiających ekspresję fragmentu kwasu nukleinowego kodującego analog towarzyszącego komórce antygenu i następnie odzyskanie analogu z nadsączu z hodowli lub bezpośrednio z komórek np. w postaci lizatu). Alternatywnie analog może być sporządzony, jak to powiedziano powyżej, przez wielkoskalową syntezę peptydu na fazie stałej lub w płynie.

Ostatecznie produkt może zależnie od komórki wybranej jako komórka gospodarza lub wybranej metody syntezy, może być poddany sztucznym post translacyjnym modyfikacjom. Mogą to być schematy refoldowania, które są znane nauce, działanie enzymami (celem uzyskania glikozylacji lub

PL 202 399 B1 usunięcia niepożądanych partnerów fuzyjnych, chemiczne modyfikacje (ponownie możliwa jest glikozylacja) i koniugacja np. do tradycyjnej cząsteczki nośnika.

Powinno być odnotowane, że korzystnymi analogami z wynalazku (i również odpowiednie analogi użyte w metodach z wynalazku) obejmujące analogi użyte w metodach z wynalazku) obejmujące modyfikacje, których wynikiem jest polipeptyd posiadający sekwencję identyczną w przynajmniej 70% z antygenem polipeptydowym lub z jej subsekwencja o co najmniej 10 aminokwasach długości. Wyższe identyczności sekwencji są korzystne np. w co najmniej 75% i nawet w przynajmniej 80% lub 85%. identyczność sekwencji białek i kwasów nukleinowych może być obliczona według wzoru (Nref Ndif) x 100/Nref gdzie Ndif jest całkowitą liczbą nie identycznych reszt dwóch sekwencji gdy są zestawione i gdzie Nref jest liczbą reszt w jednej z sekwencji. Gdzie sekwencja DNA AGTCAGTC będzie sekwencją identyczną w 75% z sekwencją AATCAATC (Ndif=2 i Nref=8).

Specyficzne przykłady celów dla metody z wynalazku

Jak dyskutowano powyżej, korzystne słabe antygeny polipeptydowe towarzyszące komórce są antygenami towarzyszącymi nowotworom. Nie ograniczona ich lista została podana w poniższej tabeli.

Antygen alpha reduktaza α-fetoproteina

AM-1

APC

APRIL

BAGE β-katenina

Bcl2 bcr-ab1 (b3a2)

CA-125

CASP-8/FLICE

Katepsyny

CD19

CD20

Literatura

Delos S, Carsol JL, Fina F, Raynaud JP, Martin PM. 5 alpha-reductase and 17 beta-hydroxysteroid dehydrogenase expression in epithelial cells from hyperplastic and malignant human prostate. Int J Cancer 1998 marzec 16 75: 6 840-6

Esteban C, Terrier P, Frayssinet C, Uriel J. Expression of the alphafetoprotein gene in human breast cancer. Tumour Biol 1996 17: 5 299-305 Harada Y, Ohuchi N, Masuko T, Funaki Y, Mori S, Satomi S, Hashimoto Y. Characterization of a new breast cancer-associated antigenand its relationship to MUC1 and TAG-72 antigens. Tohoku J Exp Med 1996 Nov 180:

273-88

Dihlmann S, Amler LC, Schwab M, Wenzel A. Variations in the expression of the adenomatous polyposis coli (APC) tumor suppressor gene in human cancer cell lines of different tissue origin. Oncol Res 1997 9: 3 119-27 LE, Sordat B, Rimoldi D, Tschopp J. APRIL, a new ligand of the tumor necrosis factor family, stimulates tumor cell growth. J Exp Med 1998 wrzesień 21 188: 6 1185-90

Boel P, Wildmann C, Sensi ML, Brasseur R, Renauld J-C, Coulie P, Boon T, and Van der Bruggen P. BAGE: a new gene encoding an antigen recognized on human melanomas by cytolytic lymphocytes. Immunity 1995, 2: 167-175. Hugh TJ, Dillon SA, O'Dowd G, Getty B, Pignatelli M, Poston GJ, Kinsella AR. beta-catenin expression in primary and metastatic colorectal carcinoma. Int J Cancer 1999 sierpień 12 82: 4 504-11

Koty PP, Zhang H, Levitt ML. Antisense bcl-2 treatment increases programmed cell death in non-small cell lung cancer cell lines. Lung Cancer 1999 luty 23: 2 115-27

Verfaillie CM, Bhatia R, Miller W, Mortari F, Roy V, Burger S, McCullough J, Stieglbauer K, Dewald G, Heimfeld S, Miller JS, Mc'Glave PB. BCR/ABLnegative primitive progenitors suitable for transplantation can be selected from the marrow of most early-chronic phase but not accelerated-phase chronic myelogenous leukemia patients. Blood 1996 czerwiec 1 87: 11 4770-9 Bast RC Jr, Xu FJ, Yu YH, Barnhill S, Zhang Z, Mills GB. CA 125: the past and the future. Int J Biol Markers 1998 listopad, grudzień 13: 4179-87 Mandruzzato S, Brasseur F, Andry G, Boon T, van der Bruggen P., A CASP-8 mutation recognized by cytolytic T lymphocytes on a human head and neck carcinoma. J Exp Med 1997 sierpień 29 186: 5 785-93.

Thomssen C, Schmitt M, Goretzki L, Oppelt P, Pache L, Dettmar P, Janicke F, Graeff H. Prognostic value of the cysteine proteases cathepsins B and cathepsin L in human breast cancer. Clin Cancer Res 1995 lipiec 1: 7 741-6 Scheuermann RH, Racila E. CD19 antigen in leukemia and lymphoma diagnosis and immunotherapy. Leuk Lymphoma 1995 sierpień 18: 5-6 385 97 Knox SJ, Goris ML, Trisler K, Negrin R, Davis T, Liles TM, Grillo-López A, Chinn P, Varns C, Ning SC, Fowler S, Deb N, Becker M, Marquez C, Levy R,. Yttrium-90 labeled anti-CD20 monoclonal antibody therapy of recurrent B-cell lymphoma. Clin Cancer Res 1996 marzec 2: 3 457-70

PL 202 399 B1

CD21

CD23

CD22

CD33

CD35

CD44

CD45

CD46

CD5

CD52

CD55 (79ITgp72)

CD59

CDC27

CDK4

CEA c-myc

Cox-2

DCC

Shubinsky G, Schlesinger M, Polliack A, Rabinowitz R. Pathways controlling the expression of surface CD21 (CR2) and CD23 (Fc(epsilon)IIR) proteins in human malignant B cells. Leuk Lymphoma 1997 maj 25: 5-6 521-30 Shubinsky G, Schlesinger M, Polliack A, Rabinowitz R. Pathways controlling the expression of surface CD21 (CR2) i CD23 (Fc(epsilon)IIR) proteins in human malignant B cells. Leuk Lymphoma 1997 Maj 25: 5-6 521-30 French RR, Penney CA, Browning AC, Stirpe F, George AJ, Glennie MJ. Delivery of the ribosome-inactivating protein, gelonin, to lymphoma cells via CD22 i CD38 using bispecific antibodies. Br J Cancer 1995 maj 71: 5 986-94 Nakase K, Kita K, Shiku H, Tanaka I, Nasu K, Dohy H, Kyo T, Tsutani H, Kamada N. Myeloid antigen, CD13, CD14, i/or C033 expression is restricted to certain lymphoid neoplasms. Am J Clin Pathol 1996 czerwiec 105: 6 761-8 Yamakawa M, Yamada K, Tsuge T, Ohrui H, Ogata T, Dobashi M, Imai Y. Protection of thyroid cancer cells by complement-regulatory factors. Cancer 1994 czerwiec 1 73: 11 2808-17

Naot D, Sionov RV, Ish-Shalom D. CD44: structure, function, and association with the malignant process. Adv Cancer Res 1997 71: 241-319 Buzzi M, Lu L, Lombardi AJ Jr, Posner MR, Brautigan DL Fast LD, Frackelton AR Jr. Differentiation-induced changes in protein-tyrosine phosphatase activity and commensurate expression of CD45 in human leukemia cell lines. Cancer Res 1992 lipiec 15 52: 14 4027-35 Yamakawa M, Yamada K, Tsuge T, Ohrui H, Ogata T, Dobashi M, Imai Y. Protection of thyroid cancer cells by complement-regulatory factors. Cancer 1994 czerwiec 1 73: 11 2808-17

Stein R, Witz IP, Ovadia J, Goldenberg DM, Yron I. CD5+ B cells i naturally occurring autoantibodies in cancer patients. Clin Exp Immunol 1991 wrzesień 85: 3 418-23

Ginaldi L, De Martinis M, Matutes E, Farahat N, Morilla R, Dyer MJ, Catovsky

D. Levels of expression of CD52 in normal and leukemic B i T cells: correlation with in vivo therapeutic responses to Campath-IH. Leuk Res 1998 luty 22: 2 185-91

Spendlove, I, L. Li, J. Carmichael, & L. G. Durrant. Decay accelerating factor (CD55): A target for cancer vaccine? (1999) Cancer Research 59: 22822286.

Jarvis GA, Li J, Hakulinen J, Brady KA, Nordling S, Dahiya R, Meri S. Expression andi function of the complement membrane attack complex inhibitor protectin (CD59) in human prostate cancer. Int J Cancer 1997 czerwiec 11 71: 6 1049-55

Wang RF, Wang X, Atwood AC, Topalian SL, Rosenberg SA. Cloning genes encoding MHC class II-restricted antigens: mutated CDC27 as a tumor antigen. Science 1999 maj 21 284: 5418 1351-4

Wolfel, T., Hauer, M., Schneider, J., Serrano, M, Wolfel, C, Klehmann-Hieb,

E. , de Plaen, E., Hankeln, T., Meyer zum Bϋϋschenfelde, K, i Beach, D. A pl6INK4a-insensitive CDK4 mutant targeted by cytolytic T lymphocytes in a human melanoma. Science 1995 wrzesień 1 269: 5228 1281-4 Kass E, Schlom J, Thompson J, Guadagni F, Graziano P, Greiner JW. Induction of protective host immunity to carcinoembryonic antigen (CEA), a self-antigen in CEA transgenic mice, by immunizing with a recombinant vaccinia-CEA virus. Cancer Res 1999 luty 1 59: 3 676-83 Watson PH, Pon RT, Shiu RP. Inhibition of c-myc expression byphosphorothioate antisense oligonucleotide identifies critical role for c-myc in the growth of human breast cancer. Cancer Res 1991 sierpień 1 51:

3996-4000

Tsujii M i wsp., Cycloxygenase regulates angiogenesis induced by colon cancer cells. Cell 1998; 93: 705-716

Gotley DC, Reeder JA, Fawcett J, Walsh MD, Bates P, Simmons DL, Antalis,TM. The deleted in colon cancer (DCC) gene is consistently expressed in colorectal cancers and metastases. Oncogene 1996 sierpień 15 13: 4 787-95

PL 202 399 B1

DcR3

E6/E7

EGFR

EMBP

Enal8

Transferaza fernazylowa FGF8b and FGF8a

FLK-1/KDR

Receptor kwasu foliowego

G250

Rodzina GAGE gastrin 17

Hormon uwalniający gastrynę (Bombezyna)

GD2/GD3/GM2

GnRH

GnTV

GP1 gp100 Pmel 17

Genomic ampliphication of a decoy receptor for Fas ligand in lung and colon cancer. Pitti R et al., Nature 396, 699-703. 1998.

Steller MA, Zou Z, Schiller JT, Baserga R. Transformation by human papillomavirus 16 E6 i E7: role of the insulin-like growth factor 1 receptor. Cancer Res 1996 listopad 1 56: 21 5087-91

Yang XD, Jia XC, Corvalan JR, Wang P, Davis CG, Jakobovits A: Eradication of established tumors by a fully human monoclonal antibody to the epidermal growth factor receptor without concomitant chemotherapy. Cancer Res 1999, 59(6): 1236-43.

Clinical study on estramustine binding protein (EMBP) in human prostate. Shiina H, Igawa M, Ishibe T. Prostate 1996 wrzesień 29:3 169-76.

D.A. Arenberg et. al., Epithelial-neutrophil activating peptide (ENA 78) is an important angiogenic factor in non-small cell lun cancer. J. Clin. Invest. (1998) 102; 465-472.

Dorkin TJ, Robinson MC, Marsh C, Bjartell A, Neal DE, Leung HY. FGF8 over-expression in prostate cancer is associated with decreased patient survival and persists in androgen independent disease. Oncogene 1999 kwiecień 29 18: 17 2755-61

T. Annie T. Fong et al., SU5416 is a potent and selective inhibitor of the vascular endothelial growth factor receptor (Flk-1/KDR) that inhibits tyrosine kinase catalysis, tumor vacularization and growth of multiple tumor type. Cancer Res, 59, 99-106, 1999

Dixon KH, Mulligan T, Chung KN, Elwood PC, Cowan KH. Effects of folate receptor expression following stable transfection into wild type and methotrexate transport-deficient ZR-75-1 human breast cancer cells. J Biol Chem 1992 listopad 25 267: 33 24140-7

Divgi CR, Banderr NH, Scott AM, O'Donoghue JA, Sgouros G, Welt S, Finn RD, Morrissey F, Capitelli P, Williams JM, Deland D, Nakhre A, Oosterwijk E, Gulec S, Graham MC, Larson SM, Old LJ. Phase I/II radioimmunotherapy trial with iodine-131-labeled monoclonal antibody G250 in metastatic renal cell carcinoma. Clin Cancer Res 1998 listop. 4: 11 2729-39 De Backer 0, 10 innych, Boon T, van der Bruggen P. Characterization of the GAGE genes that are expressed in various human cancers and in normal testis. Cancer Res 1999 czerwiec 1; 9(13): 3157-3165.

Watson SA, Michaeli D, Grimes S, Morris TM, Crosbee D, Wilkinson M, Robinson G, Robertson JF, Steele RJ, Hardcastle JD. Antigastrin antibodies raised by gastrimmune inhibit growth of the human colorectal tumour AP5.

Int J Cancer 1995 kwiecień 10 61: 2 233-40

Wang QJ, Knezetic JA, Schally AV, Pour PM, Adrian TE.

Bombesin may stimulate proliferation of human pancreatic cancer cells through an autocrine pathway. Int J Cancer 1996 listopad 15 68: 4 528-34 GD2/GD3 GM2 Wiesner DA, Sweeley CC. Circulating gangliosides of breastcancer patients. Int J Cancer 1995 styczeń 27 60: 3294-9 Wiesner DA, aweeley CC. Circulating gangliosides of Brest - cancer patients. Int j Cancer 1995 Styczeń 27 60: 3 294-9

Bahk JY, Hyun JS, Lee H, Kim MO, Cho GJ, Lee BH, Choi WS. Expression of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) and GnRH receptor mRNA in prostate cancer cells and effect of GnRH on the proliferation of prostate cancer cells. Urol Res 1998 26: 4 259-64

Hengstler JG, Arand M, Herrero ME, Oesch F. Polymorphisms of N-acetyltransferases, glutathione S-transferases, microsomal epoxide hydrolase and sulfotransferases: influence on cancer susceptibility. Recent Results Cancer Res 1998 154: 47-85

Wagner SN, Wagner C, Schultewolter T, Goos M. Analysis of Pmel 17/gp100 expression in primary human tissue specimens: implications for melanoma immuno- and gene-therapy. Cancer Immunol Immunother 1997 czerwiec 44: 4 239-47

PL 202 399 B1 gp-100-in4 gp15 gp75/TRP-1 hCG

Heparanaza

Her2/neu

HMTV

Hsp70 hTERT (telomeraza)

IGFR1

IL-13R iNOS

Ki 67

KIAA0205

K-ras, H-ras, N-ras KSA (CO17-1A)

LDLR-FUT

MAGE rodzina (MAGE1, MAGE3)

Manunaglobina

MAP17

Melan-A/MART-1

Kirkin AF, Dzhizhugazyan K, Zeuthen J. Melanomaassociated antigens recognized by cytotoxic T lymphocytes. APMIS 1998 czerwiec 106: 7 665-79 Maeurer MJ, and wsp. New treatment options for patients with melanoma: review of melanoma-derived T-cell epitope-based peptide vaccines. Melanoma Res. 1996 luty;6(1): 11-24.

Lewis JJ, Houghton AN. Definition of tumor antigens suitable for vaccine construction. Semin Cancer Biol 1995 grudzień 6: 6 321-7 Hoermann R, Gerbes AL, Spoettl G, Jϋϋngst D, Mann K. Immunoreactive human chorionic gonadotropin and its free beta subunit in serum and ascites of patients with malignant tumors. Cancer Res 1992 marzec 15 52: 6 1520-4 Vlodavsky I, Friedmann Y, Elkin M, Aingorn H, Atzmon R, Ishai-Michaeli R, Bitan M, Pappo O, Peretz T, Michal I, Spector L, Pecker I. Mammalian heparanase: gene cloning, expression and function in tumor progression and metastasis [see comments]. Nat Med 1999 lipiec 5: 7 793-802 Lewis JJ, Houghton AN. Definition of tumor antigens suitable for vaccine construction. Semin Cancer Biol 1995 grudzień 6: 6 321-7 Kahl LP, Carroll AR, Rhodes P, Wood J, Read NG. An evaluation of the putative human mammary tumour retrovirus associated with peripheral blood monocytes. Br J Cancer 1991 kwiecień 63: 4 534Jaattela M, et al. Hsp70 exerts its anti-apoptotic function downstream of caspase-3-likeproteases. EMBO J. 1998 Nov 2; 17(21): 6124-34. Vonderheide RH, Hahn WC, Schultze JL, Nadler LM. The telomerase catalytic subunit is a widely expressed tumor-associated antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes. Immunity czerwiec; 10: 673-679. 1999.

M.J. Ellis et. al., Insulin-like growth factors in human breast cancer. Breast Cancer Res. Treat. (1998) 52; 175-184.

Murata T, Obiri NI, Debinski W, Puri RK. Structure of IL-13 receptor: analysis of subunit composition in cancer and immune cells. Biochem Biophys Res

Cormun 1997 wrzesień 8 238: 1 90-4

Klotz T, Bloch W, Volberg C, Engelmann U, Addicks K. Selective expression of inducible nitric oxide synthase in human prostate carcinoma. Cancer 1998 maj 15 82: 10 1897-903

Gerdes, J., U. Schwab, H. Lemke, and H. Stein. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation. Int J Cancer 31, 13-20, 1983

Gueguen M, Patard JJ, Gaugler B, Brasseur F, Renauld JC, Van Cangh PJ, Boon T, Van den Eynde BJ. An antigen recognized by autologous CTLs on a human bladder carcinoma. J Immunol 1998 czerwiec 15 160: 12 6188-94 Abrams SI, Hand PH, Tsang KY, Schlom J. Mutant ras epitopes as targets for cancer vaccines. Semin Oncol 1996 luty 23: 1 118-34

Zhang S, Zhang HS, Reuter VE, Slovin SF, Scher HI, Livingston PO. Expression of potential target antigens for immunotherapy on primary and metastatic prostate cancers. Clin Cancer Res 1998 luty 4: 2 295-302 Caruso MG, Osella AR, Notarnicola M, Berloco P, Leo S, Bonfiglio C,

Di Leo A. Prognostic value of Iow density lipoprotein receptor expression in colorectal carcinoma. Oncol Rep 1998 lipiec-sierpień 5: 4 927-30 Marchi M, et al., Tumor regressions observed in patients with metastatic melanoma treated with an antigenic peptide encoded by gene MAGE-3 and presented by HLA-AL. Int J Cancer 1999 styczeń 18; 80(2): 219-30.

Watson MA, Dintzis S, Darrow CM, Voss LE, DiPersio J, Jensen R, Fleming TP, Mammaglobin expression in primary, metastatic, i occult breast cancer. Cancer Res 1999 lipiec 1 59: 13 3028-31.

Kocher O, Cheresh P, Lee SW - Identification and partial characterization of a novel membrane-associated protein (MAP17) up-regulated in human carcinomas and modulating cell replication and tumor growth. Am J Pathol 1996 sierpień 149: 2 493-500

Lewis JJ, Houghton AN. Definition of tumor antigens suitable for vaccine construction. Semin Cancer Biol 1995 grudzień 6: 6 321-7

PL 202 399 B1 mesotelina

MIC A/B

MT-MMP's, takie jak MP2, MMP3, MMP7, i MMP9 Moxl

Mucyna, taka jak MUC-1, MUC-2, MUC-3 and MUC-4 MUM-1 NY-ESO-1

Osteonektyna

P15

P170/MDR1 p53 p97/transferynaszpiczakowa

PAI-1

PDGF

Plazminogen (uPA)

PRAME

Probazyna

Progenipoetyna PSA

Chang K, et al.. Molecular cloning of mesothelin, a differentiation antigen present on mesothelium, mesotheliomas, and ovarian cancers. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 styczeń 9; 93(1): 136-40

Groh V, Steinle A, Bauer S, and Spies T. Recognition of stress-induced MHC molecules by intestinal epithelial gammadelta T cells. Science 1998, 279: 1737-1740.

Sato H and Seiki M., Membrane-type matrix metalloproteinases (MT-MMPs) in tumormetastasis., J Biochem (Tokyo) 1996 luty; 119(2): 209-15 Candia AF, Hu J, Crosby J, Lalley PA, Noden D, Nadeau JH, Wright CV. Mox-1 and Mox-2 define a novel homeobox gene subfamily and are differentially expressed during early mesodermal patterning in mouse embryos. Development 1992 grudzień 116: 4 1123-36 Lewis JJ, Houghton AN. Definition of tumor antigens suitable for vaccine construction. Semin Cancer Biol 1995 grudzień 6: 6 321-7 Kirkin AF, Dzhizhugazyan K, Zeuthen J. Melanomaassociated antigens recognized by cytotoxic T lymphocytes. APMIS 1998 lipiec 106: 7 665-79 Jager, E. et. al. Simultaneous humoral and cellular immune response against cancer-testis antigen NY-ESO-1: definition of human histocompatibility leukocyte antigen (HLA)-A2-binding peptide epitopes. J. Exp. Med. 1998, 187: 265-270.

Graham JD, Balleine RL, Milliken JS, Bilous AM, Clarke CL. Expression of osteonectin mRNA in human breast tumours is inversely correlated with oestrogen receptor content. Eur J Cancer 1997 wrzesień 33: 10 1654-60 Yoshida S, Todoroki T, Ichikawa Y, Hanai S, Suzuki H, Hori M, Fukao K, Miwa M, Uchida K. Mutations of pl6Ink4/CDKN2 and pl5Ink4B/MTS2 genes in biliary tract cancers. Cancer Res 1995 lipiec 1 55: 13 2756-60 Trock BJ, Leonessa F, Ciarke R. Multidrug resistance in breast cancer: a meta-analysis of MDRl/gpl70 expression and its possible functional significance- J Natl Cancer Inst 1997 lipiec 2 89: 13 917-31 Roth J, Dittmer D, Rea D, Tartaglia J, Paoletti E, Levine AJ. p53 as a target for cancer vaccines: recombinant canarypox virus vectors expressing p53 protect mice against lethal tumor celi challenge. Proc Natl Acad Sci USA 1996 maj 14 93: 10 4781-6.

Furukawa KS, Furukawa K, Real FX, Old LJ, Lloyd KO. A unique antigenic epitope of human melanoma is carried on the common melanoma glycoprotein gp95/p97. J Exp Med 1989 luty 1 169: 2 585-90

Grondahl-Hansen J, Christensen U, Rosenquist C, Bmnner N, Mouridsen HT,

Dano K, Blichert-Toft M. High levels of urokinase-type plasminogen activator and its inhibitor PAI-1 in cytosolic extracts of breast carcinomas are associated with poor prognosis. Cancer Res 1993 czerwiec 1 53: 11 2513-21

Vassbotn FS, Andersson M, Westermark B, Heldin CH, Ostman A. Reversion of autocrine transformation by a dominant negative platelet-derived growth factor mutant. Mol Cell Biol 1993 lipiec 13: 7 4066-76

Naitoh H, Eguchi Y, Ueyama H, Kodama M, Hattori T. Localization of urokinase-type plasminogen activator, plasminogen activator inhibitor-1, and plasminogen in colon cancer. Jpn and Cancer Res 1995 styczeń 86:

48-56

Kirkin AF, Dzhizhugazyan K, Zeuthen J. Melanomaassociated antigens recognized by cytotoxic T lymphocytes. APMIS 1998 lipiec 106: 7 665-79

Matuo Y, Nishi N, Muguruma Y, Yoshitake Y, Kurata N, Wada F. Localization of prostatic basie protein (“Probasin) in the rat prostates by use of monoclonal antibody. Biochem Biophys Res Commun 1985 lipiec 16 130: 1 293-300

Sanda MG, Smith DC, Charles LG, Hwang C, Pienta KJ, Schlom J, Milenic D,

Panicali D, Montie JE. Recombinant vaccinia-PSA (PROSTVAC) can induce a prostate-specific immune response in androgen-modulated human prostate cancer. Urology 1999 luty 53: 2 260-6.

PL 202 399 B1

PSM

RAGE-1

Rb

RCAS1

SART-1 rodzina genu SSX

STAT3

STn (tow. mucynie)

TAG-72

TGF-α

TGF-β

Tymozyna β 15

TNF-α

TPA

TPI

TRP-2

Tyrozynaza

VEGF

Kawakami M, Nakayama J. Enhanced expression of prostate-specific membrane antigen gene in prostate cancer as revealed by in situ hybridization. Cancer Res 1997 lipiec 15 57: 12 2321-4 Gaugler B, 7 others, Van den Eynde BJ. A new gene coding for an antigen recognized by autologous cytolytic T lymphocytes on a human renal carcinoma. Immunogenetics 1996; 44(5): 323-330.

Dosaka-Akita H, Hu SX, Fujino M, Harada M, Kinoshita I, Xu HJ, Kuzumaki N, Kawakami Y, Benedict WF. Altered retinoblastoma protein expression in nonsmall cell lung cancer: its synergistic effects with altered ras and p53 protein status on prognosis. Cancer 1997 kwiecień 1 79: 7 1329-37 Sonoda K, Nakashima M, Kaku T, Kamura T, Nakano H, Watanabe T.,

A novel tumor-associated antigen expressed in human uterine and ovarian carcinomas. Cancer 1996 kwiecień 15; 77(8): 1501-1509.

Kikuchi M, Nakao M, Inoue Y, Matsunaga K, Shichijo S, Yamana H, Itoh K. Identification of a SART-1-derived peptide capable of inducing HLA-A24restricted and tumor-specific cytotoxic T lymphocytes. Int J Cancer 1999 maj 5 81: 3 459-66

Gure AO, ΤϋϋΐΌοί O, Sahin U, Tsang S, Scanlan MJ, Jager E, Knuth A,

Pfreundschuh M, Old LJ, Chen YT. SSX: a multigene family with several members transcribed in normal testis and human cancer. Int J Cancer 1997 wrzesień 17 72: 6 965-71

Bromberg JF, Wrzeszczynska MH, Devgan G, Zhao Y, Pestell RG, Albanese C, Darnell JE Jr. Stat3 as an oncogene. Cell 1999 sierpień 6; 98(3): 295-303 Sandmaier BM, Oparin DV, Holmberg LA, Reddish MA, MacLean GD, Longenecker BM. Evidence of a cellular immune response against sialyi-Tn in breast and ovarian cancer patients after high-dose chemotherapy, stem cell rescue, and immunization with Theratope STn-KLH cancer vaccine.

J Immunother 1999 styczeń 22: 1 54-66

Kuroki M, Fernsten PD, Wunderlich D, Colcher D, Simpson JF, Poole DJ, Schlom J. Serological mapping of the TAG72 tumor-associated antigen using distinct monoclonal antibodies. Cancer Res 1990 sierpień 15 50: 16 4872-9 Imanishi K, Yamaguchi K, Suzuki M, Honda S, Yanaihara N, Abe K. Production of transforming growth factor-alpha in human tumour cell lines.

Br J Cancer 1989 maj 59: 5 761-5

Picon A, Gold LI, Wang J, Cohen A, Friedman E. A subset of metastatic human colon cancers exoresses elevated levels of transforming growth factor betal. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1998 lipiec 7: 6 497-504

Bao, L., Loda, M., Janmey, P. A., Stewart, R., Anand-Apte, B., and Zetter, B.

R. Thymosin beta 15: a novel regulator of tumor cell motility upregulated in metastatic prostate cancer. Nature Medicine. 2(12), 1322-1328. 1996 Moradi MM, Carson LF, Weinberg B, Haney AF, Twiggs LB, Ramakrishnan

S. Serum and ascitic fluid levels of interleukin-1, interleukin-6, and tumor necrosis factor-alpha in patients with ovarian epithelial cancer. Cancer 1993 październik 15 72: 8 2433-40

Maulard C, Toubert ME, Chretien Y, Delanian S, Dufour B, Housset M.

Serum tissue polypeptide antigen (S-TPA) in bladder cancer as a tumor marker. A prospective study. Cancer 1994 Jan 15 73: 2 394-8 Nishida Y, Sumi H, Mihara H. A thiol protease inhibitor released from cultured human malignant melanoma cells. Cancer Res 1984 sierpień 44: 8 3324-9 Parkhurst MR, Fitzgerald EB, Southwood S, Sette A, Rosenberg SA, Kawakami Y. Identification of a shared HLA-A*0201-restricted T-cell epitope from the melanoma antigen tyrosinase-related protein 2 (TRP2). Cancer Res 1998 listopad 1 58: 21 4895-901

Kirkin AF, Dzhandzhugazyan K, Zeuthen J. Melanomaassociated antigens recognized by cytotoxic T lymphocytes. APMIS 1998 lipiec 106: 7 665-79 Hyodo I, Doi T, Endo H, Hosokawa Y, Nishikawa Y, Tanimizu M, Jinno K,

Kotani Y. Clinical significance of plasma vascular endothelial growth factor in gastrointestinal cancer. Eur J Cancer 1998 grudzień 34: 13 2041-5

PL 202 399 B1

ZAG pl6INK4 transferaza-S-glutationowa

Sanchez LM, Chirino AJ, Bjorkman Pj. 1999, Crystal structure of human ZAG a fat-depleting factor related to MHC molecules-Science 19; 283(5409): 1914-9

Quelle DE, Ashmun RA, Hannon GJ, Rehberger PA, Trono D, Richter KH, Walker C, Beach D,Sherr CJ, Serrano M. Cloning and characterization of murine pl61NK4a and pl51NK4b genes. Oncogene 1995 sierpień 17; 11(4): 635-45

Hengstler JG, Ari M, Herrero ME, oesch F. Polyinorphisms of N-acetyltransferases, glutathione S-transferases, microsomal epoxide hydrolase and sulfotransferases: influence on cancer susceptibility. Recent Results Cancer Res 1998 154: 47-85

Poniżej będzie omówionych szczegółowo kilka specyficznych antygenów towarzyszących nowotworowi.

Specyficzny dla prostaty antygen błonowy, PSM

W U.S.A. rak prostaty jest drugą wiodącą przyczyną śmierci związanej z rakiem (około 40 000 rocznie), a w ciągu roku jest diagnozowanych 200 000 pacjentów (Boring 1993). U około 1 z 11 mężczyzn rozwinie się ewentualnie rak prostaty. Ponadto u około 40-60% pacjentów z rakiem prostaty w końcu rozwinie nie pozasterczowa kontynuacja choroby (Babaian 1994). Podstawową obecnie strategią jest zastosowanie terapeutycznej szczepionki jako terapii uzupełniającej prostatektomię w celu wyeliminowania resztek tkanki nowotworowej i przerzutów.

Szereg stanów patologicznych jest zlokalizowanych w gruczole krokowym, w tym łagodny wzrost (BPH), infekcja (zapalenie gruczołu krokowego) i neoplazja (rak prostaty).

Biologiczna agresywność raka prostaty jest zmienna. U pewnych pacjentów wykryty nowotwór pozostaje histologicznie latentnym nowotworem i nigdy nie stanie się klinicznie znaczący. U innych pacjentów, rozwój nowotworu postępuje gwałtownie, dochodzi do przerzutów i śmierci pacjenta w stosunkowo krótkim czasie (2-5 lat).

Obecnie stosowanym zasadniczym leczeniem raka prostaty jest prostatektomia. Jednakże, z uwagi na rozległe rozsianie komórek raka prostaty większość pacjentów z rakiem prostaty nie jest leczona przez chirurgię miejscową. Pacjenci z nie ograniczoną chorobą w końcu otrzymują układową terapię polegającą na ablacji androgenów, lecz roczna częstotliwość śmierci spowodowanych rakiem prostaty nie zmniejszyła się od ponad 50 lat, od chwili gdy standardowym leczeniem stała się ablacja androgenów w chorobie z przerzutami.

PSM jest białkiem błonowym o wysokiej specyficzności dla tkanki prostaty, zarówno stanów łagodnych jak również złośliwych, choć ekspresję PSM obserwowano również w innych tkankach, takich jak tkanka nerkowa lub nowotwór nerki, jelito cienkie, mózg i w powstających w nowotworze naczyń krwionośnych. Dlatego jeśli zabieg chirurgiczny był udany to pacjenci po prostatektomii raka powinni teoretycznie wyrażać PSM w obrębie pozostałości złośliwej tkanki nowotworu prostaty lub przerzutów pochodzących z nowotworu. Uważa sie, że można będzie wyeliminować pozostałości tkanki nowotworu przez indukcję silnej odpowiedzi CTL i/lub silnej odpowiedzi przeciwciała poliklonalnego przeciw PSM.

Interesujące, że zwiększenie PSM obserwuje się u pacjentów z rakiem prostaty po terapii pozbawiającej androgenów (Wright 1996). To może spowodować, że leczenie ukierunkowane na PSM byłoby bardzo odpowiednie do stosowania po tradycyjnej terapii pozbawiającej androgenów PSM po raz pierwszy zidentyfikowano w 1987 jako wynik wytworzenia przeciwciała monoklonalnego, 7E11-C5.3, wzbudzonego przeciw wyizolowanym komórkom raka prostaty, LNCaP (Horoszewicz, 1987). Przeciwciało rozpoznawało zarówno prawidłowe jak i złośliwe komórki nabłonka nowotworu prostaty i było użyte w 1993 roku do oczyszczania i określenia sekwencji aminokwasowej białka PSM i wreszcie sklonowania genu (Israeli 1993).

PSM jest transbłonową glikoproteiną typu II o masie cząsteczkowej 84 kD co wydedukowano z sekwencji kwasu nukleinowego, podczas gdy wersja glikozylowana ma wykrywaną masę cząsteczkową 100-120 kD. Sekwencjonowanie genu kodującego PSM ujawnia potencjalny region przenikający przez błonę w połączeniu z trzema resztami kotwiczącymi argininę w cytozolu. Zewnątrzkomórkowa część PSM tworzy 707 z wszystkich 750 aminokwasów białka, podczas gdy domena cytoplazmatyczna jest przewidziana jako odcinek o długości 19 aminokwasów (Israeli 1993). mRNA specyficzny dla PSM został wykryty w tkance nowotworu prostaty (Israeli, 1994), wskazując, że antygen nowotworowy nie jest nieprawidłowo glikozylowanym białkiem, co ma miejsce w przypadku np. antygenów nowotworowych Tn- lub sTn.

PL 202 399 B1

Pełnej długości cDNA dla PSM był wprowadzony przez transfekcję i wyrażony w linii komórkowej ludzkiego raka prostaty ujemnej ze względu na PMS, PC-3 (Kann, 1994). Ponadto, pełnej długości (2,65 kilo zasad) cDNA ulegało in vitro transkrypcji i translacji (Kahn, 1994).

Ostatnio pokazano, że PSM posiada aktywność hydrolityczną podobną do aktywności, N-acetylowanej α-związanej kwaśnej dipeptydazy (NAALADaza) - faktycznie wykazano, że te dwa białka są identyczne. NAALADaza jest w układzie nerwowym hydrolazą związaną z błoną, która katabolizuje neuropeptyd-N-acetylo-aspartyloglutaminianowy (NAAG), celem oddziaływania na proces glutaminergicznego przekazywania sygnału. Nadal nie jest wiadomo czy ta aktywność PSM ma odpowiednią funkcję biologiczną.

Pewne znaczenie ma przewidywanie czy po leczeniu autoszczepionką wywołującą odpowiedzi immunologiczne specyficzne dla PSM można oczekiwać niepożądanej reakcji krzyżowej z innymi białkami dostępnymi dla CTL lub przeciwciałami. Wykazano, że część regionu kodującego genu PSM (aminokwasy w pozycjach 418-537) wykazuje 54% homologii do receptora ludzkiej transferyny (Israeli, 1993). Stwierdzono również całkowitą identyczność sekwencji z enzymem NAALADaza, patrz powyżej. Nie stwierdzono żadnych tego typu podobieństw funkcjonalnych z innymi znanymi peptydazami.

Homologia do receptora transferyny jest bardzo niska i korzystnie będzie zniszczona w niektórych konstruktach wynalazczych. Nie uważa się, żeby obserwowana identyczność sekwencji z ludzką NAALADazą była przeszkodą dla szczepionki PSM, częściowo z uwagi na niską zdolność przeciwciał i CTL do przenikania przez barierę mózg - krew. Podsumowując, nawet z konstruktami najbardziej przypominającymi PSM nie oczekuje się niepożądanej reaktywności krzyżowej z innymi białkami u pacjentów.

Z wcześniejszych badań jest jasne, że PSM jest wyrażany na większości komórek raka prostaty i badanych przerzutów pochodzących z prostaty. Ponadto, wykazano, że większość innych badanych nowotworów, takich jak raki, mięsaki i czerniaki z różnych tkanek jak również obszerny panel linii komórkowych ludzkich nowotworów nie będących nowotworami prostaty są ujemne wobec PSM.

Ponadto, stwierdzono, że wiele innych tkanek jest ujemnych wobec PSM. Obejmują one okrężnicę, sutki, płuca, jajnik, wątrobę, pęcherz moczowy, macicę, oskrzela, śledzionę, trzustkę, język, przełyk, żołądek, tarczycę, przytarczyczki, nadnercza, węzeł limfatyczny, aortę, żyłę główną, skórę, gruczoł mleczny i łożysko. Jednakże, RT-PCR ujawniła występowanie m RNA dla PSM w niektórych z tych tkanek.

Chociaż PSM znajduje się głównie jako cząsteczka związana z błoną w tkance prostaty małe ilości PSM można również wykryć w surowicy zdrowych osobników i na podniesionym poziomie u pacjentów z rakiem prostaty (Rochon, 1994, Murphy, 1995). Dlatego poziom PSM krążącego u tych pacjentów pozwala na serologiczne monitorowanie skuteczności szczepionki PSM.

Podsumowując, w oparciu o wszystkie dostępne dane PSM jest antygenem o wysokiej specyficzności wobec ludzkiej tkanki prostaty i wywodzących się z niej nowotworów. Oznacza to, że u pacjentów, którzy zostali poddani prostatektomii PSM jest quasi- specyficznym dla nowotworu antygenem własnym. Zatem skuteczna szczepionka PSM jest prawdopodobnie kierowana głównie do tkanki prostaty lub tkanek pochodzących z tkanek przerzutów pochodzących z prostaty.

Na podstawie Przykładu 1 będzie jasne, że w rozwiązaniach według wynalazku korzystnie obcy epitop komórki TH jest wprowadzony w części sekwencji aminokwasowej PSM określonej przez SEKW ID NR: 2 pozycjami 16-52 i/lub 87-108 i/lub 210-230 i/lub 269-289 i/lub 298-324 i/lub 442-465 i/lub 488-514 i/lub 598-630 i/lub 643-662 i/lub 672-699. Ponadto, zmodyfikowana cząsteczka PSM która ma obcy epitop TH wprowadzony w te miejsca stanowi również część wynalazku.

Zgodnie z tym wynalazek dotyczy również analogu ludzkiego PSM, który jest immunogenny u ludzi, i który zawiera istotną część wszystkich znanych i przewidywanych epitopów CTL i komórki B z PSM i zawiera jak to tu omawiano, przynajmniej jeden obcy epitop TH. Korzystnymi analogami PSM są te, w których co najmniej jeden obcy epitop TH jest obecny jako insercja w sekwencji aminokwasowej PSM lub jako substytucja części sekwencji aminokwasowej PSM lub jako wynik delecji części sekwencji aminokwasowej PSM, a najkorzystniejszymi analogami są te, w których obcy epitop komórki TH jest wprowadzony w części sekwencji aminokwasowej PSM określonej przez SEK ID NR: 2 pozycje 16-52 i/lub 87-108 i/lub 210-230 i/lub 269-289 i/lub 298-324 i/lub 442-465 i/lub 488-514 i/lub 598630 i/lub 643-662 i/lub 672-699.

Ludzka gonadotropina kosmówkowa (HCG)

Zależność pomiędzy znacznikami zarodkowymi i fenotypami nowotworów złośliwych jest omawiana od wielu dziesięcioleci. Rosnąca liczba danych sugeruje, że co najmniej jeden taki znacznik, ludzka gonadotropina kosmówkowa typu beta (hCGe) jest konsekwentnie wykrywana na komórkach

PL 202 399 B1 rakowych o wielu różnych histologicznie pochodzeniach i że ekspresja tego białka często koreluje z rosnącymi możliwościami przerzutu. Skierowana przeciw temu rozpuszczalnemu białku odpowiedź humoralna może zmniejszyć szansę na rozsianie się nowotworu i/lub może hamować po zabiegu chirurgicznym nawrót w postaci nowego pierwotnego wzrostu.

Ludzka gonadotropina kosmówkowa należy do rodziny hormonów glikoproteinowych włącznie z folikulostymuliną (FSH), tyreotropiną (TSH) i hormonem luteinizującym (LH), które wszystkie są ważnymi regulatorami ekspresjii podczas rozmnażania i przeżycia płodu. Przedstawiciele tej rodziny hormonów są heterodimerami o wspólnym łańcuchu α. Łańcuch β jest unikalny dla każdego hormonu i dostarcza specyficzności, przy czym łańcuch β w LH wykazuje najsilniejszą homologię sekwencji do hCGe (około 80%). Pozorna masa cząsteczkowa hCG-holo wynosi 37 kD, z czego 1/3 stanowi węglowodan. Post-translacyjne modyfikacje cukru obejmują zarówno N-związany jak i O-związany węglowodan. Obecne są liczne reszty kwasu sialowego, co nadaje białku duży ładunek ujemny. Na podstawie badania kryształu opracowana została struktura hCG-holo (Lapthorn i wsp., 1994).

Opierając się na strukturze kryształu stwierdzono, że hCG wykazuje homologię do rodziny czynników wzrostowych, w tym PDGF i TGFe (Lapthorn i wsp., 1994). Sugeruje to, że ekspresja hCG może pomagać w regulacji wzrostu komórki raka.

Ludzka gonadotropina kosmówkowa jest hormonem glikoproteinowym, który jest wytwarzany przez łożyskowe syncytiotrofoblasty wkrótce po zapłodnieniu i jest kluczowy dla pomyślnego przebiegu ciąży u ciężarnej kobiety.

Patologiczna rola znaczników zarodkowych dla rozwoju i utrzymania masy rakowej nie jest znana. Jednakże ważnym jest aby zauważyć, że trofoblasty (gdzie te białka są normalnie wytwarzane) mają zarówno angiogenny jak również inwazyjny charakter, które to obie właściwości są również niezbędne dla komórki rakowej. Dalej sugerowano, że hCG lub jej podjednostki mogą hamować matczyną immunologiczną odpowiedź komórkową na tkankę płodu. Przykładowo, badania wykazały, że hCG bezpośrednio hamuje odpowiedzi komórek T (Jacoby i wsp., 1984) i zaproponowano, że z uwagi na opróżnienie węzłów limfatycznych (w tym przypadku) pierwotny czerniak jest hamowany immunologicznie i wynikiem może być korzystniejsze środowisko dla przerzutu nowotworów. W konsekwencji ekspresja hCGe może pomagać komórkom rakowym rozprzestrzeniać się w drugorzędowych organach limfatycznych. Ostatecznie, jak wspomniano powyżej, została pokazana strukturalna homologia między hCG i szeregiem czynników wzrostowych. Co za tym idzie dalszą możliwością jest, że sekrecja hCG przez komórki raka może korzystnie wpływać na wzrost guza.

Ekspresję hCGe wykryto w wielu różnych rodzajach raka, przykładowo a) gruczolakoraku: pozytywnym dla hCGe na wydzielanie tkankowe obserwowano u pacjentów ze złymi rokowaniami niezależnie od histologicznej oceny guza (Sheaff i wsp., 1996), b) różnych rodzajach raków płuc; komórkach łuskowatych (SQCC), gruczolakoraku (AC), i komórkach olbrzymich (LCC), wszystkie ujawniają wysoki procent reaktywności wobec hCGe (Boucher i wsp., 1995), c) gruczolakorak trzustki (Syrigos i wsp., 1998), d) nerwiakach niedojrzały, raki mózgu i glejaku siatkówki (Acevedo i wsp., 1997), e) czerniaku złośliwym (Doi i wsp., 1996), f) raku pęcherza moczowego (Lazar i wsp., 1995). W ostatnich publikacje opisano sposoby wykorzystujące DNA, w których myszy były immunizowane konstruktami wyrażającymi hCGe (Geissler i wsp., 1997). W tym nowym modelu hamowania in vitro wzrost guza był silnie związany z aktywnością CTL, jednakowoż wykryto również wysokie miana przeciwciał (które neutralizują efekt biologiczny pełnego hCG na jego receptor komórkowy).

Użycie hCG jako immunogenu było opisane w kilku pracach koncentrujących się na jego użyciu jako szczepionki antykoncepcyjnej (Talwar i wsp., 1976 i Talwar i wsp., 1994). Obserwowano wysoki stopień skuteczności i bezpieczeństwa w klinicznym postępowaniu obniżającym płodność z zastosowaniem szczepionki przeciw hCG-holo (Talwar i wsp., 1994). Przeprowadzono również pierwszą fazę prób klinicznych u pacjentów z rakiem z szczepionką przeciw syntetycznemu peptydowi hCGe z końcem karboksylowym skoniugowanemu z toksoidem błonicy (Triozzi i wsp., 1994), a postępowania fazy II są w toku. Pomijając fakt, że idea użycia hCGe jako szczepionki skierowanej do raka istniała od jakiegoś czasu to nie była ona stosowana w połączeniu z technologią AutoVac.

Wiadomo, że komórki z tkanki niezarodkowej lub z łagodnego nowotworu nie wyrażają hCGe. Dlatego nie powinno być potencjalnych skutków ubocznych w wyniku szczepienia przeciw tej cząsteczce (oprócz wpływu na ciążę). Ponieważ jest to wyrażane przez tak wiele różnych rodzajów raków to cząsteczka ta była proponowana jako „definitywny biomarker raka” (Acevedo i wsp., 1995 i Regelson W., 1995) i jako taka powinna być atrakcyjnym celem do poszukiwań.

PL 202 399 B1

Odpowiednie modele zwierzęce dla dalszych badań skuteczności szczepionki opartej na hCG można znaleźć w Acevedo i wsp., Cancer Det. i Prev. Suppl. (1987) 1: 477-486, i w Kellen i wsp., Cancer Immunol. Immun.Ther. (1982) 13: 2-4.

Her 2

Uważa się, że receptory kinazy tyrozynowej Her2 i EGFr odgrywają kluczową rolę w transformacji złośliwej normalnych komórek i ciągłym wzroście komórek raka. Nadekspresja jest zazwyczaj związana z bardzo złymi prognozami. W czasie kilku ostatnich lat było wiele doniesień dotyczących zastosowania przeciwciał przeciw tym receptorom jako terapii przeciwko rakom, które nadmiernie wyrażają jeden z nich lub oba te receptory. Genentech Inc. zakończył pomyślnie szereg prób klinicznych na pacjentach z rakiem sutka stosując przeciwciało monoklonalne przeciw Her2 i ostatnio uzyskano zgodę FDA na wprowadzenie na rynek preparatu przeciwciała monoklonalnego przeciw - Her2, Herceptin®.

Ujawniona tutaj technologia autoszczepienia jak stosowana dla cząsteczki Her2 wywołuje przeciwciała poliklonalne, które reagują głównie z Her2. Oczekuje się, że takie przeciwciała atakują i eliminują komórki guza jak również zapobiegają rozwojowi przerzutów komórek. Mechanizm efektorowy tego przeciwnowotworowego działania będzie odbywać się za pośrednictwem dopełniacza i cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciała.

Zależnie od wyboru konstruktu indukowane autoprzeciwciała mogą również hamować wzrost komórki raka przez hamowanie zależnych od czynnika wzrostu zależnego od oligodimeryzacji i internalizacji receptorów. I co najważniejsze, sądzi się, że analogi Her2 są zdolne do indukcji odpowiedzi CTL skierowanej przeciw znanym i/lub przewidywanym epitopom Her2 prezentowanym przez komórki guza.

Her2 jest przedstawicielem rodziny receptora epidermalnego czynnika wzrostu (c-erbB), która obejmuje do chwili obecnej cztery różne receptory: c-erbB-1 (EGFr), c-erbB-2 (Her2, c-Neu), c-erbB-3 i cerbB-4 (Salomon i wsp., 1995). C-erbB-3 i c-erbB-4 są słabiej scharakteryzowane niż EGFr i Her2. Her2 jest integralną glikoproteiną. Dojrzałe białko ma masę cząsteczkową 185 kD z cechami strukturalnymi, które bardzo przypominają receptor EGFr (Prigent i wsp., 1992). EGFr jest również integralnym receptorem błonowym zbudowanym z jednej podjednostki. Jego pozorna masa cząsteczkowa wynosi 170 kD i zawiera on powierzchniową domenę wiążącą ligand o 621 aminokwasach, pojedynczą hydrofobową domenę transbłonową o 23 aminokwasach i wysoce konserwowaną domenę cytoplazmatycznej kinazy tyrozynowej o 542 aminokwasach. Białko jest N-glikozylowane (Prigent i wsp., 1994).

Wszystkie białka z tej rodziny są kinazami tyrozynowymi. Oddziaływanie z ligandem prowadzi do dimeryzacji receptora, co zwiększa aktywność katalityczną kinazy tyrozynowej (Bernard, 1995, Chantry 1995). Białka z rodziny są zdolne do homo i heterodimeryzacji, co jest ważne dla ich aktywności. EGFr zapewniają wzrost i pobudzają pobieranie glukozy i aminokwasów przez komórki (Prigent i wsp., 1992). Her2 przekazuje również sygnały sprzyjające wzrostowi. Jedynie EGFr wiąże EGF i TGF-alfa. Te ligandy nie wiążą innych receptorów z rodziny (Prigent i wsp., 1992). Ligandy dla Her2 nie zostały w pełni określone. Jednak pokazano, że heregulina indukuje fosforylację przez aktywację Her2. Nie wydaje się, ze jest to spowodowane bezpośrednim wiązaniem z receptorem, lecz uważa się, że heregulina jest ligandem dla erbB-3 i erbB-4, które następnie aktywują Her2 przez oligodimeryzację (Solomon i wsp., 1995).

Homologia pomiędzy białkami z rodziny receptora EGF jest najbardziej wyraźna w domenie kinazy tyrozynowej w cytoplazmatycznej części cząsteczki (82% pomiędzy EGFr i Her2). Homologia jest mniejsza w części zewnątrzkomórkowej - od 41% do 46% w różnych domenach (Prigent i wsp., 1992). Receptor epidermalnego czynnika wzrostu jest wyrażany w prawidłowych tkankach w niskich ilościach, lecz jest nadprodukowany w wielu rodzajach raków. EGFr jest nadprodukowany w nowotworach sutków (Earp i wsp., 1993, Eppenberger, 1994), glejakach (Schleger i wsp., 1994), raku żołądka (Tkunaga i wsp., 1995), w raku płaskokomórkowym (Fujii, 1995), raku jajnika (van Darni wsp., 1994) i innych. Her2 w małych ilościach jest wyrażany również na kilku prawidłowych tkankach człowieka, w najbardziej charakterystyczny sposób na nabłonku wydzielniczym. Nadekspresja Her2 występuje w około 30% raków sutka, żołądka, trzustki, pęcherza moczowego i jajnika.

Ekspresja tych receptorów różni się zależnie od stopnia zróżnicowania guza i rodzaju raka, np. w raku sutka, pierwotne nowotwory nadwytwarzają w nadmiernych ilościach oba receptory, podczas gdy w raku żołądka nadekspresja występuje w późnych stadiach guzów z przerzutami (Salomon i wsp., 1995). Liczba nadwyrażanych receptorów na komórkach raka jest większa niż 10⁶/komórkę dla szeregu raków głowy i szyi, linii komórkowych raków sromu, sutka i jajnika izolowanych od pacjentów (Dean i wsp., 1994).

PL 202 399 B1

Jest szereg powodów, dla których rodzina receptorów EGFr stanowi odpowiednie cele dla immunoterapii nowotworu. Po pierwsze, są one nadwyrężane w wielu rodzajach raków, co powinno kierunkować odpowiedź immunologiczną na guz. Po drugie, guzy często wyrażają lub nadwyrażają ligandy dla tej rodziny receptorów i niektóre są nadwrażliwe na skutki proliferacji, w których pośredniczą te ligandy. Po trzecie, pacjenci z nowotworami, które nadwyrażają receptory czynników wzrostowych często mają złe prognozy. Nadekspresja jest ściśle związana ze złymi prognozami, szczególnie w przypadku raka sutka, raka płuc i raka pęcherza moczowego (2) i faktycznie jest związana z fenotypami inwazyjne/przerzutowe, które raczej są niewrażliwe na tradycyjne leczenie (Eccles i wsp., 1994).

Nadekspresja Her 2 w pewnych przypadkach jest wynikiem amplifikacji genu, a w innych zwiększonej transkrypcji i translacji. Nadekspresja Her2 jest związana ze złą prognozą dla pacjenta z nowotworem sutka, jajnika, żołądka, pęcherza moczowego i prawdopodobnie w drobnokomórkowym nowotworze płuc (Solomon i wsp. 1995).

Próby kliniczne fazy I były przeprowadzone z bispecyficznymi przeciwciałami u pacjentów z zaawansowanymi nowotworami sutka i jajnika. Przeciwciała były bispecyficzne w stosunku do Her2 i FcyRI (Weiner i wsp., 1995). Wydajną lizę i komórek nowotworu nadwyrażających Her2 obserwowano w obecności bispecyficznych przeciwciał przeciw Her2 i CD3 (Zhu i wsp., 1995).

Leczenie myszy SCID z heterogenicznym przeszczepem ludzkiego nowotworu żołądka monoklonalnym przeciwciałem przeciw Her2 przedłużyło życie myszy (Ohniski i wsp., 1995). Przeciwnowotworowa aktywność przeciwciał monoklonalnych przeciw Her2 in vitro i in vivo nie jest związana z identycznym mechanizmem; mogą one działać jako częściowi agoniści ligandu zmieniając obrót receptora Her2 i fosforylację lub mogą zaburzać dimeryzację (Lupu i wsp., 1995).

Podobnie pokazano, że przeciwciała wobec EGFr mogą również przeszkadzać interakcjom z czynnikiem wzrostowym (Baselga i wsp., 1994, Modjahedi i wsp, 1993a, Wu i wsp., 1995, Modjahedi i wsp., 1993b, Tosi i wsp., 1995, Dean i wsp., 1994, Bier i wsp., 1995, Modjahedi i wsp., 1996, Valone 1995).

Zatem ważnym wykonaniem wynalazku jest takie w którym obcy epitop komórki T jest wprowadzony do części sekwencji aminokwasowej Her2 określonej pozycjami ponumerowanymi zgodnie z SEKW ID NR: 3 w pozycjach 5-25 i/lub 59-73 i/lub 103-117 i/lub 149-163 i/lub 210-224 i/lub 250-264 i/lub 325-339 i/lub 369-383 i/lub 465-479 i/lub 579-593 i/lub 632-652 i/lub 653-667 i/lub 661-675 i/lub 695-709 i/lub 710-730, patrz Przykłady.

Zgodnie z tym wynalazek dotyczy również analogu ludzkiego Her2, który jest immunogenny u ludzi, obejmuje istotną część wszystkich znanych i przewidywanych epitopów z Her2 dla CTL i komórki B i zawiera, jak to omówiono powyżej, przynajmniej jeden obcy epitop TH. Korzystnie aby przynajmniej jeden obcy epitop TH występuje jako wstawka w sekwencji aminokwasowej Her2 lub jako podstawienie części sekwencji aminokwasowej Her2 lub jako wynik delecji części sekwencji aminokwasowej Her2. Najkorzystniejszymi analogami są te określone powyżej, tzn. te, w których obcy epitop dla komórki T był wprowadzony w części sekwencji aminokwasowej Her2 określonej przez SEKW ID NR: 3 w miejsca 5-25 i/lub 59-73 i/lub 103-117 i/lub 149-163 i/lub 210-224 i/lub 250-264 i/lub 325339 i/lub 369-383 i/lub 465-479 i/lub 579-593 i/lub 632-652 i/lub 653-667 i/lub 661-675 i/lub 695-709 i/lub 710-730.

FGFBb

Kilku badaczy wykazało, że FGF8b może indukować proliferację, transformację, różnicowanie i w niektórych przypadkach znacznie zwiększać skłonność do nowotworzenia komórek i tkanek ssaka (Tanaka 1992, Kouhara 1994, Lorenzi 1995, MacArthur 1995a, Crossley 1996a, 1996b, Ghosh 1996, Ohuchi 1997a, Rudra-Ganguly 1998). Efekty te zachodzą głównie za pośrednictwem wiązania FGF8b z przedstawicielami receptorów czynników wzrostu fibroblastów FGFR2, FGFR3 i FGFR4 (MacArthur 1995b, Blunt 1997, Tanaka 1998). Tak więc, wykazano, że komórki wyrażające jeden z tych receptorów i FGF8(b) dostarczają autokrynnej kaskady sygnału wzrostu prowadząć do proliferacji. Działanie biologiczne FGF8b odbywa się prawdopodobnie częściowo za pośrednictwem szlaku JAK/STAT3, ponieważ my i inni obserwowaliśmy, że dodatek FGF8b do podłoża wzrostowego pewnych komórek wywołuje fosforylację STAT3; jest to właściwość, po której oczekuje się, że nada komórkom odporność na apoptozę (Catlett-Falcone 1999).

Dodatkowo do wyżej wspomnianych obserwacji in vitro, ostatnio wykazano, że ekspresja FGF8(b) jest znacząco zwiększona zarówno w nowotworze prostaty jak i nowotworach sutka (Marsh 1999, Dorkin 1999). Zatem uważamy, że autoszczepionka przeciw FGF8(b) będzie bardzo skutecznym sposobem leczenia szeregu nowotworów wyrażających FGF8, lub prawdopodobnie będzie zwiększać ich wrażliwość na czynniki indukujące apoptozę.

PL 202 399 B1

Nowotwór prostaty

Agresywność biologiczna nowotworu prostaty jest zmienna. U niektórych pacjentów wykryty nowotwór przyjmuje postać nowotworu latentnego histologicznie i nigdy nie staje się istotnym klinicznie. U innych pacjentów rozwój guza jest gwałtowny, dochodzi do przerzutów i śmierci pacjenta w stosunkowo krótkim czasie (2-5 lat).

Dla celów diagnostycznych i dalej dla leczenia nowotworu prostaty głównie stosowano określanie poziomów w krążeniu dwóch białek: kwaśnej fosfatazy prostaty (PAP) i antygenu specyficznego dla prostaty (PSA) (Nguyen 1990, Henttu 1989). Z powodu zniszczenia normalnej architektury gruczołu krokowego, w odpowiedzi na rozwój raka, te rozpuszczalne białka są uwalniane do krążenia, gdzie mogą być wykryte jako znaczniki np. rozsianego przerzutu.

Obecnie głównym leczeniem nowotworu prostaty jest prostatektomia. Jednakże z uwagi na szybki rozsiew komórek nowotworowych prostaty, większość pacjentów z rakiem prostaty nie jest wyleczonych przez miejscowy zabieg chirurgiczny. Pacjenci z nieograniczonymi postaciami choroby otrzymują leczenie układowe polegające na ablacji androgenów, lecz doroczna częstość śmierci spowodowanych przez nowotwór prostaty nie zmniejszyła się przez ostatnie 50 lat, od kiedy ablacja androgenów stała się typową terapią dla choroby dającej przerzuty.

Analizy RT-PCR pokazały, że mRNA FGF8 jest wytwarzany przez linie komórkowe odpowiednio LNCaP, PC-3, ALVA-31 i DU145 komórek nabłonkowych z nowotworu ludzkiej prostaty, gdzie FGF8b jest dominującą izoformą (Tanaka 1995, Ghosh 1996). Wzrost reagujących na androgen komórek LNCaP jest pobudzany przez podanie zrekombinowanego FGF8b (Tanaka 1995), podczas gdy komórki DU145 mogą mieć zahamowany wzrost przez transfekcję wirusem wyrażającym antysensowny FGF8b (Rudra-Ganguly 1998). To wraz z danymi, z omawianych poniżej badań rozwojowych, wskazuje na rolę FGF8b w podtrzymywaniu stanu rakowego tych linii komórkowych.

Stosując cDNA FGF8a w doświadczeniach z hybrydyzacją in situ, Leung i współpracownicy wykazali, że duży odsetek (80% (n=106), i 71% (n=31)) raków prostaty wytwarzają mRNA dla FGF8, i że ilość mRNA dla FGF8 koreluje ze zjadliwością nowotworu (odpowiednio P<0,0016 i P<0,05) (Leung 1996, Dorkin 1999). Stosując monoklonalne przeciwciało anty-FGF8b pokazano, że ta izoforma jest odpowiedzialna za nadekspresję FGF8b (Dorkin 1999). Ponadto ludzie z nowotworami, którzy ujawniają wysoki poziom ekspresji FGF8 gorzej przeżywają (P=0,034), i ekspresja FGF8 nie ustaje w rakach prostaty niezależnych od androgenów (Dorkin 1999). Zgodnie z danymi przedstawionymi przez Dorkina i współpracowników, na podstawie ekspresji FGF8b w raku prostaty można przewidzieć czas przeżycia pacjenta.

W badaniach immunohistochemicznych z użyciem przeciwciał przeciw FGF8 wykryto to białko w 93% (n=43) raków prostaty u ludzi (Tanaka 1998). Prawidłowa tkanka prostaty lub łagodny przerost prostaty wytwarza niewielkie ilości mRNA dla FGF8 i nie zawiera wykrywalnej ilości białka FGF8 (Leung 1996, Yoshimura 1996, Ghosh 1996, Tanaka 1998, Dorkin 1999).

Te wyniki wskazują, że autoszczepionka przeciw FGF8(b) będzie reaktywna przeciw tkance nowotworu prostaty, a zatem niezwykle wartościowa w leczeniu nowotworu prostaty.

Nowotwór sutka

Obecnie leczenie nowotworu sutka jest chirurgiczne. Jednakże z powodu ekstensywnego rozsiewu komórek raka sutka znaczna część pacjentów z rakiem sutka nie jest wyleczona przez miejscowy zabieg chirurgiczny. Pacjenci z nieograniczoną chorobą zazwyczaj poddani są leczeniu przez ablację androgenów, chemoterapię i leczenie przez napromienienie. Poziom śmierci w ciągu roku, spowodowanych rakiem sutka, jest jednakże wciąż stosunkowo wysoki.

Oryginalnie FGF8 był izolowany z linii komórkowej mysiego raka gruczołu mlecznego (SC-3), w której ekspresję można indukować przez dodanie androgenu do pożywki (Nonomura 1990). O białku tym wiadomo również, że indukuje proliferację zarówno tych, jak również innych komórek ssaka. Ostatnio wykazano, że mRNA dla FGF8b występuje w ośmiu (n=8) liniach komórek ludzkiego raka sutka (MDA-MB-231, MDA-MB-415, ZR 75-1, T-47-D, SK-BR-III, PMC-42, HBL-100 i MCF-7) (Tanaka 1995, Payson 1996, Wu 1997, Marsh 1998).

Myszy transgeniczne Wnt-1 zainfekowane wirusem mysiego nowotworu gruczołu mlecznego (MMTV) rozwijają nowotwór. Transkrypcja FGF8 jest aktywowana w 50% tych nowotworów (MacArthur 1995c, Kapoun 1997).

Wykazano, że transgeniczne myszy niosące sekwencję kodującą cDNA dla FGF8b pod kontrolą bardzo specyficznego promotora wirusa mysiego nowotworu gruczołu mlecznego (MMTV) spontanicznie rozwijają nowotwory gruczołu mlecznego wyrażające FGF8b (Coombes, doniesienie ustne).

PL 202 399 B1

Bardzo niedawne dane pokazują że ekspresja FGF8(b) wzrasta w raku sutka (Tanaka 1998, Marsh 1999). Tanaka i współpracownicy użyli nowego monoklonalnego przeciwciała FGF8 w badaniach immunohistochemicznych. Autorzy wykazali, że FGF8 występuje w 67% (n=12) nowotworów sutka, i że receptory androgenowe są obecne w 89% FGFB dodatnich chorobach sutka (rozrost, gruczolakowłókniak, brodawczak wewnątrzprzewodowy i raki), które pozwoliłyby na pętlę promującą autokrynny wzrost zaangażowaną w rozwój raków sutka (Tanaka 1998). Stosując metodę półilościowego RT-PCR pokazano, że podwyższone poziomy mRNA dla FGF8 znaleziono w złośliwych tkankach w porównaniu z niezłośliwymi tkankami sutków. Znacząco więcej złośliwych tkanek wyraża FGF8 (p=0,019) na znacząco wyższych poziomach (p=0,031) (68 raków sutka i 24 niezłośliwe tkanki sutka) (Marsh 1999).

Do tej pory nie zostało w pełni dowiedzione, że FGF8(b) działa jako autokrynny czynnik wzrostu. Jednakże fakt, że znaczna liczba nowotworów nadwyraża FGF8(b) mocno dowodzi, że autoszczepionka przeciw FGF8(b) może być skuteczna przeciw dużemu procentowi raków sutka i prostaty. Dane przedstawione przez Marsh, Dorkin i Tanaka pokazują, że autoszczepionka przeciw FGF8(b) może być stosowana zarówno dla leczenia raków sutka jak i prostaty i raczej niejasne dane prezentowane przez Dorkin i wsp., dodatkowo wspierają pogląd, że FGF8 uczestniczy w proliferacji ludzkich komórek rakowych.

Opis FGF8(b)

FGF8 należy do rodziny czynników wzrostu fibroblastów (FGF). Te białka regulujące wzrost są małymi białkami o ~ 200 aminokwasach, które są zaangażowane w indukcję proliferacji i różnicowanie szerokiej gamy komórek. Ostatni przegląd dotyczący zaangażowania fibroblastowych czynników wzrostowych w rozwój kończyn kręgowca przedstawia Johnson 1997. Przedstawiciele rodziny FGF są spokrewnieni ewolucyjnie i posiadają 20-50% identyczności sekwencji aminokwasowych.

FGF8b jest wariantem składania FGF8, oryginalnie nazwanym czynnikiem wzrostowym indukowanym przez androgen (AIGF). AIGF był po raz pierwszy zidentyfikowany jako białko wydzielane przez linię komórkową pochodzącą z mysiego raka gruczołu mlecznego (SC-3) po pobudzeniu androgenem (Nonomura 1990). Mysi gen dla FGF8 zawiera 6 egzonów potencjalnie kodujących 8 różnych izoform FGF8 (FGF8a-h), różniących się jedynie w N-końcowej części cząsteczek (Crossley 1995, MacArthur 1995b). Ludzki gen kodujący FGF8 ma taką samą strukturę jak mysi, jednakże z powodu kodonu stop w egzonie 1B ludzki FGF8 może przypuszczalnie występować w czterech różnych izoformach, mianowiciee FGF8a, FGF8b, FGF8e i FGF8f (Gemel 1996). Struktura genu i sekwencje aminokwasowe czterech ludzkich izoform są zilustrowane na Fig. 5.

Dojrzały FGF8b zawiera 193 aminokwasy i ma obliczoną masę cząsteczkową 22,5 kDa. Silnie zasadowe białko zawiera 21 reszt argininy i 14 reszt lizyny, co daje obliczony punkt izoelektryczny 10,84 i obliczony ładunek dodatni 19,8 przy pH 7,0. Zawiera on dwie reszty cysteiny i ma dwa potencjalne miejsca N-glikozylacji. Zależnie od charakteru przeprowadzonych badań dotyczących FGF8(b) bardzo mało wiadomo o ugrupowaniu białka FGF8(b). Jednak było ono wyrażane jako heterologiczne w bakteriach, oczyszczone przez zastosowanie C-końcowego znacznika heksa-histydyna i sfałdowane in vitro do rozpuszczalnej i biologicznie aktywnej postaci (MacArthur 1995a, Blunt 1997).

Aktywność biologiczna FGF8(b)

Jak wspomniano powyżej FGF8(b) był najpierw wyizolowany jako czynnik, który jest uwalniany z zależnych od androgenów linii komórek mysiego nowotworu gruczołu mlecznego i wykazano, że białko to może indukować proliferację tych komórek. Zmiany morfologiczne naśladują te, które są indukowane przez testosteron, o którym wiadomo również, że indukuje syntezę mRNA dla FGF8(b) (Tanaka 1992). Proliferacja może być hamowana przez antysensowne oligonukleotydy dla FGF8(b) (Nonomura 1990, Tanaka 1992, i Yamanishi 1994). Rzeczywiście wzrost linii komórkowej ludzkiego raka prostaty DU145 może być zahamowany przez transfekcję wirusem wyrażającym antysensowny FGF8(b) (Rudra-Ganguly 1998). Ostatnie dane pokazują, że FGF8b indukuje fosforylację STAT3białka, po którym oczekuje się, że uczestniczy w odporności na apoptozę (Catlett-Falcone 1999, Johnston, C.L., wyniki nie publikowane).

Wielu badaczy pokazało, że FGF8b jest bardzo skuteczny w indukowaniu transformacji komórek NIH3T3 lub SC115 (Miyashita 1994, Kouhara 1994, Lorenzi 1995, MacArthur 1995a). Stosując białka wyrażane jako zrekombinowane wykazano również, że ta indukcja zmian morfologicznych jest znacznie bardziej skuteczna z FGF8b niż przy użyciu FGF8a lub FGF8c (MacArthur 1995a, Ghosh 1996). Co ciekawe, sama N-końcowa połowa cząsteczki FGF8b okazuje się być wystarczająca dla transformacji komórek NIH3T3, i nawet mały specyficzny peptyd FGF8b (QVTVQSSPNFT) może

PL 202 399 B1 spowodować dwu do trzykrotnie dłuższy wzrost komórek niż normalnie w 0,1% surowicy (RudraGanguly 1998). Ponadto, doniesiono, że komórki NIH3T3 stabilnie stransfekowane wektorem ekspresyjnym kodującym FGF8b są bardzo rakotwórcze gdy zostały wstrzyknięte śródocznie do nagich myszy (Kouhara 1994, Ghosh 1996).

Wiadomo, że FGF8b ulega ekspresji in vivo na określonych etapach rozwoju kręgowców. Podsumowanie biologicznej roli FGF8(b) przedstawiono w Tabeli 1. Przegląd dotyczący zaangażowania FGF8 w rozwój kręgowców przedstawili o Goldfarb 1999, i Johnson 1997.

T a b e l a 1: Różne miejsca/tkanki, o których wiadomo, że wytwarzają FGF8 i proponowana funkcja(e) biologiczna(e)

Działanie/mechanizm/obecność (gatunek)

Obecne w rozwijających się zawiązkach kończyn myszy Rosnący zawiązek kończyn (kurczak)

Indukcja ektopowego tworzenia kończyny z mezodermy (kurczak) Indukcja tworzenia śródmózgowia z międzymózgowia (kurczak) Zapoczątkowanie wzrostu skrzydeł bezskrzydłego mutanta (kurczak) Funkcja w gradiencie grzbietobrzusznym gastruli (danio pręgowany) Wymagany w czasie gastrulacji i rozwoju serca, twarzowej części czaszki tyłomózgowia, śródmózgowia i rozwoju móżdżku (myszy z tkankowo specyficznym knock out)

Rola w morfogenezie zębów (mysz) literatura

Heikinheimo 1994, Ohuchi 1994

Kuwana 1997, Xu 1998

Crossley 1996b

Crossley 1996a

Ohuchi 1997a

Fϋrthauer 1997

Meyers 1998

Kettunen 1998

Uważa się, że FGF8(b) pośredniczy w działaniu przez wiązanie receptorów dla fibroblastowego czynnika wzrostu (FGFR). Wiadomo, że FGF8b jest zdolny do aktywowania FGFR2c, FGFR3c, FGFR4c, i w pewnym zakresie również FGFR1c, lecz nie FGFR1b, -2b lub -3b (MacArthur 1995b, Blunt 1997). W przypadku indukcji ektopowego wzrostu kończyn kurczęcia, pociąga za sobą interakcje FGF10, FGFR2 i FGF8 i może to być wystarczające dla wzrostu (Kuwana 1997, Xu 1998). Wyniki te podtrzymują hipotezę, że FGF8(b) może działać w sposób auto- i parakrynny, prowadząc do normalnego wzrostu i powstania szeregu anatomicznych struktur podczas rozwoju kręgowca. Co ważne, myszy z „całkowitym knock outem” FGF8 nie przeżywają prawdopodobnie z uwagi na określone wymaganie białka w rozwoju zarodka.

Homologia z innymi białkami

Jest istotne aby przewidzieć czy po leczeniu autoszczepionką indukującą specyficzne autoprzeciwciała przeciw FGF8b można się spodziewać niepożądanej reakcji krzyżowa z innymi, dostępnymi dla przeciwciał białkami. Z powodu wysokiego stopnia identyczności sekwencji między FGF8b i innymi cząsteczkami FGF8 oczekuje się, że autoszczepionka będzie reagowała krzyżowo z tymi białkami. Jednakże przypuszczalnie będzie to korzystne, ponieważ nie zauważono, że któreś z tych białek jest wyrażane w tkankach lub przez linie komórek, które już nie wyrażają FGF8b.

Reszty aminokwasowe 55 do 175 z FGF8b wykazują stosunkowo niski lecz znaczący stopień identyczności sekwencji z innymi FGF. Jest to powszechnie akceptowane (i kilka razy potwierdzone), że znaczący stopień identyczności sekwencji między dwoma domenami białka znajduje również odbicie w znacznym podobieństwie struktury trzeciorzędowej. Dlatego na ogół oczekuje się, że wszyscy przedstawiciele rodziny FGF są strukturalnie podobni. Trójwymiarowa struktura FGF2 została określona dla kryształów, jak również dla roztworu (Ago 1991, Zhang 1991, Zhu 1991, Eriksson 1993, Blaber 1996, Moy 1996). FGF2 jest zbudowany całkowicie ze struktury beta-kartki obejmuje trzy powtórzenia struktury czteroniciowych antyrównoległych zwojów-beta. Ta struktura beta-beczki jest całkowicie konserwowana między interleukiną 1, FGF2 (lub zasadowy FGF) i FGF1 (lub kwaśny FGF). Analiza techniką jądrowego rezonansu magnetycznego dla FGF2 w roztworze wykazała, że N-końcowa część cząsteczki tworzy stosunkowo giętką strukturę. Pozostała część FGF8b (aminokwasy 1-54 i 176-215) wykazują jedynie niski stopień identyczności sekwencji ze znanymi białkami.

Opierając się na danych dotyczących struktury i porównania na ogół zakłada się, że trójwymiarowa struktura rdzenia innych czynników wzrostu fibroblastów bardzo przypomina struktury FGF1 i FGF2. Te uwagi dotyczące struktury są ważnymi czynnikami w naszym projektowaniu cząsteczek do autoszczepionek na zmutowane FGF8b.

Ważne jest, że z powodu niskiego stopnia identyczności sekwencji między FGF8 i którymkolwiek z innych przedstawicieli rodziny FGF, powierzchnia FGF8 będzie bardzo różnić się od poPL 202 399 B1 wierzchni innych FGF, tym samym, minimalizując reaktywność krzyżową przeciwciał wytworzonych w odpowiedzi na autoszczepionkę FGF8b z innymi przedstawicielami rodziny FGF. Z powodu bardzo niskiej homologii z białkami innymi niż czynniki wzrostu fibroblastów nie oczekujemy, aby autoszczepionka przeciw FGF8b reagowała krzyżowo z jakimikolwiek innymi białkami.

Należy podkreślić, że jednakże autoszczepionka przeciw FGF8b prawdopodobnie będzie reagowała krzyżowo ze wszystkimi izoformami FGF8. Jednakże prawdopodobnie nie będzie to problemem, gdyż nie oczekuje się, aby u osobników dorosłych występowała którakolwiek z izoform FGF8 w znaczącej ilości. Jest nawet możliwe, że ta reakcja krzyżowa będzie korzystna w leczeniu raka, ponieważ pokazano, że przynajmniej niektóre linie komórkowe raka wyrażają inne izoformy oprócz FGF8b.

Rozmieszczenie FGF8b w tkankach

Idealnie, zaindukowane autoprzeciwciała i następnie mechanizmy efektorowe, jak również oczekiwana odpowiedź CTL, wzbudzona przez autoszczepienie powinny być skierowane jedynie przeciw tkankom, które należy usunąć u pacjenta. Zatem, tkankowe rozmieszczenie antygenu w tkankach, co jest celem autoszczepionki jest przedmiotem wielkiej wagi, bowiem dotyczy bezpieczeństwa szczepionki.

T a b e l a: Ekspresja FGF8b w różnych tkankach i komórkach Człowiek

Linie komórkowe raka sutka (MDA-MB-231, MDA-MB-415, ZR 75-1, T-47-D, SK-BR-III, PMC-42, HBL-100 i MCF-7)

Raki sutka

Normalna tkanka sutka

Rak prostaty(a) (93%)

Choroba sutka(i)

Komórki raka prostaty (LNCAP, PC-3, DU145 i ALVA-31)

Nerka płodowa

Dojrzała prostata, jądra, nerka, neurony komórki teratokarcinomy (Tera-2)

Mysz

Linie komórek raka sutka(i) (SC-115, RENCA)

Przysadka, jądra

Nowotwory gruczołu mlecznego (transgeniczne Wnt-1)

Mózg zarodkowy

Jajniki, jądra

Rozwój twarzy i zawiązki kończyny

Gastrula

Kurczak

Mózg zarodkowy

Rozwój zawiązka kończyny

Szczur

Prostata i jądra ((RT-PCR) Tanaka 1995, Payson

1996, Wu 1997, Marsh 1999) ((mAb) Tanaka 1998, (RT-PCR) Marsh 1999) ((RT-PCR) Wu 1997, Marsh 199 (mAb) Tanaka 1998) ((in situ hyb.) Leung 1996, Dorkin

1999, (mAb) Tanaka 1998) ((mAb) Tanaka 1998) ((RT-PCR) Tanaka 1995, Ghos 1996, Schmitt 1996) ((Northern blot) Ghosh 1996) ((RT-PCR) Ghosh 1996, Wu 1997, Dorkin 1999) ((RT-PCR) Wu 1997) ((RT-PCR) Yoshimura 1996) ((RT-PCR)Yoshimura1996) ((Northern blot) MacArthur 1995c) ((in situ hyb.) Crossley 1995, Heikinheimo 1994, Ohuchi 1994, Shimamura 1997, (RT-PCR) Bunt 1997) ((Northern blot) Valve 1997) ((pAb) MacArthur 1995b (in situ hyb.)

Heikinheimo 1994, Ohuchi 1994, Crossley 1995) ((in situ hyb.) Crossley 1995) ((in situ hyb.) Crossley 1996a) ((in situ hyb.) Ohuchi 1997a, b) (RT-PCR) Schmitt 1996

Powyższa Tabela przedstawia szeroki wybór danych dotyczących rozkładu w tkankach i ekspresji w liniach komórkowych FGF8b. Jak widać z Tabeli, większość danych dotyczących rozkładu w tkankach jest uzyskana przy pomocy czułej metody RT-PCR, żadnego mRNA dla FGF8b w jakichkolwiek prawidłowych tkankach z wyjątkiem nerki płodowej. Na podstawie tych ograniczonych danych można przypuszczać, że ekspresja mRNA dla FGF8b u dorosłych jest bardzo ograniczona, a zatem autoszczepionka przeciw FGF8b będzie przypuszczalnie niereaktywna przeciw prawidłowej tkance.

PL 202 399 B1

Ponieważ małe ilości FGF8b mogą oddziaływać u dorosłych w nieznanych układach, rozkład w tkankach białka wymaga dalszych badań. Jednakże, naszym zdaniem, nie ma wskazówek, że autoszczepionka przeciw FGF8b będzie powodowała u pacjentów poważne niepożądane działania.

Działania przeciwciał przeciw FGF8b

Jak dotąd, nie opublikowano żadnych prób leczenia raka prostaty z zastosowaniem przeciwciał monoklonalnych, które byłyby publikowane. Trwają próby kliniczne z przeciwciałami monoklonalnymi w badaniach nad leczeniem nowotworu sutka.

Przeciwciała przeciw FGF8b będą prawdopodobnie blokowały oddziaływanie między FGF8b i jego receptorami, co będzie hamowało marszczenie się błony komórkowej i proliferację komórek, bardzo prawdopodobnie zmniejszając ruchliwość i inwazyjność komórek rakowych.

Zatem wynalazek dotyczy również wykonań opisanych tu metod, gdzie obce dla komórki T epitopy są wprowadzane jako część sekwencji aminokwasowej FGF8b zdefiniowanej przez SEKW. ID NR: 6 w pozycjach 1-54 i/lub 178-215 i/lub 55-58 i/lub 63-68 i/lub 72-76 i/lub 85-91 i/lub 95-102 i/lub 106-111 i/lub 115-120 i/lub 128-134 i/lub 138-144 i/lub 149-154 i/lub 158-162 i/lub 173-177. Należy zauważyć, że jest szczególnie korzystne jest niewprowadzanie zmiany lub modyfikacji w pozycje 26-45 i do C-końca począwszy od aminokwasów 186-215, ponieważ te ciągi wykazują najmniejszą homologię z ostatnio ujawnionym białkiem, FGF-18, które wydaje się być wyrażane w różnorodnych nierakowych tkankach.

Zgodnie z tym wynalazek dotyczy również analogu ludzkie/mysie FGF8b, który u ludzi jest immunogenny i który obejmuje istotną część wszystkich znanych i przewidywanych epitopów CTL i z FGF8b komórek B i obejmuje co najmniej, jak to tu omawiano, przynajmniej jeden obcy epitop TH. Jest korzystne, aby przynajmniej jeden obcy epitop TH występował jako wstawka w sekwencji aminokwasowej FGF8b lub jako podstawienie części sekwencji aminokwasowej FGF8b lub jako wynik delecji części sekwencji aminokwasowej FGF8b. Najkorzystniejszymi analogami w tym wykonaniu są te, w których obcy epitop komórki T jest wprowadzony jako część sekwencji aminokwasowej FGF8b określonej przez SEKW. ID NR: 6 w miejsca 1-54 i/lub 178-215 i/lub 55-58 i/lub 63-68 i/lub 72-76 i/lub 85-91 i/lub 95-102 i/lub 106-111 i/lub 115-120 i/lub 128-134 i/lub 138-144 i/lub 149-154 i/lub 158-162 i/lub 173-177.

Mucyny

Wynalazek dotyczy również sposobów według wynalazku wykorzystujących specyficznie zmodyfikowane wersje ludzkiej mucyny, szczególnie którejkolwiek z MUC-1 do MUC-4, korzystnie MUC-1. Analogi obejmują poniższą strukturę

TR(-S-P-S-(TR)m)n

- w której TR jest tandemowym powtórzeniem pochodzącym z naturalnie występującej mucyny, P jest obcym epitopem TH, jak tu omówiono, S jest obojętnym peptydem odstępnikowym obejmującym o od 0 do 15 reszt aminokwasowych, korzystnie 0 i 10 reszt aminokwasowych, a n jest liczbą całkowitą od 1 do 30, a m jest liczbą całkowitą od 1 do 10, korzystnie od 3 do 5.

Gdy wytwarza się takie analogi mucyny np. w ludzkiej linii komórkowej lub przez oczyszczenie z tkanki, bezpośredni produkt zwykle nie będzie miał pożądanego wzoru glikozylacji tj. zaburzony wzór glikozylacji przypominający mucynę pochodzącą z nowotworu. Jednakże, możliwe jest rekombinacyjne wytworzenie analogu np. w E.coli lub przez syntezę i następnie enzymatyczną glikozylacją produktu, tak aby uzyskać wzory glikozylacji Tn lub S-Tn specyficzne dla MUC-1 wyrażanej w nowotworach. Alternatywnie, polipeptydy mogą być wytworzone w ssaczej linii komórkowej lub owadziej linii komórkowej np. komórkach Drosophila, które utraciły odpowiedni enzym lub przez wewnątrzkomórkową ekspresję białka (przez pominięcie sygnałowego peptydu dla sekrecji), gdzie nie występuje glikozylacją.

Fragmenty kwasu nukleinowego i wektory według wynalazku

Należy rozumieć z powyższego ujawnienia, że analogi mogą być wytworzone dzięki technologii rekombinowania genu, lecz również przez chemiczną syntezę lub półsyntezę; te dwie ostatnie możliwości są szczególnie dogodne, gdy modyfikacja polega na przyłączeniu do białkowych nośników (takich jak KLH, toksoid błonicy, toksoid tężca i BSA) i niebiałkowych cząsteczek, takich jak polimery węglowodanów i oczywiście także gdy modyfikacja obejmuje dodanie łańcuchów bocznych lub grup bocznych do łańcucha peptydowego pochodzenia polipeptydowego.

Dla celów technologii rekombinacji genu i oczywiście również dla celu immunizacji kwasem nukleinowym, fragmenty kwasu nukleinowego kodujące niezbędne regiony epitopowe i analogi są ważnymi produktami chemicznymi. Ponieważ ważna część wynalazku dotyczy fragmentu kwasu nuklePL 202 399 B1 inowego, który koduje opisane powyżej analogi któregokolwiek z odpowiednich specyficznych dla nowotworu polipeptydów, korzystnie polipeptydu, do którego został wprowadzony obcy epitop komórki TH sposobem insercji i/lub addycji, korzystnie sposobem substytucji i/lub delecji. Fragmenty kwasu nukleinowego według wynalazku są fragmentami DNA lub RNA.

Fragmenty kwasu nukleinowego według wynalazku będą zazwyczaj wbudowane do odpowiednich tworząc wektory ekspresyjne niosące fragmenty kwasu nukleinowego według wynalazku; takie nowe wektory są również częścią wynalazku. Szczegóły dotyczące konstrukcji takich wektorów według wynalazku będą omówione poniżej w kontekście transformowanych komórek i mikroorganizmów. Wektory mogą, zależnie od celów i rodzaju zastosowania być w postaci plazmidów, fagów, kosmidów, mini-chromosomów lub wirusów, lecz również nagi DNA, który jest jedynie przejściowo wyrażany w określonych komórkach, jest ważnym wektorem. Korzystne wektory według wynalazku ekspresyjne i do klonowania są zdolne do autonomicznej replikacji, w ten sposób umożliwiając uzyskanie dużej ilości kopii w celu uzyskania wysokiego poziomu ekspresji lub wysokiego poziomu replikacji dla kolejnego klonowania.

Ogólna postać wektora według wynalazku obejmuje następujące cechy w kierunku 5' >3' i w funkcjonalnym połączeniu: promotor do kierowania ekspresją fragmentu kwasu nukleinowego według wynalazku, ewentualnie sekwencję kwasu nukleinowego kodującą peptyd liderowy umożliwiający sekrecję lub włączenie do błony fragmentu polipeptydu, fragment kwasu nukleinowego według wynalazku i sekwencję kwasu nukleinowego kodującą terminator. Gdy wektory ekspresyjne działają w szczepie wytwarzającym lub w liniach komórkowych, wówczas w celu uzyskania stabilności genetycznej stransformowanych komórek jest korzystne aby wektor, po wprowadzeniu do komórki gospodarza, był zintegrowany z genomem komórki gospodarza. Przeciwnie, gdy się pracuje z wektorami które będą użyte dla wywołania ekspresji in vivo w zwierzęciu (tj. gdy używa się wektora w szczepieniu DNA) z uwagi na bezpieczeństwo korzystne jest, aby wektor nie był zdolny do integracji z genomem komórki gospodarza; typowo użyty może być nagi DNA lub nie-integrujący wektor wirusowy, których wybór jest dobrze znany specjalistom w dziedzinie.

Wektory według wynalazku są stosowane do transformacji komórek gospodarza w celu wytworzenia analogu według wynalazku. Takie stransformowane komórki, które są również częścią wynalazku, mogą być hodowanymi komórkami lub liniami komórkowymi użytymi do namnażania fragmentów kwasu nukleinowego i wektorów według wynalazku lub użytymi do rekombinacyjnego wytwarzania analogów według wynalazku. Alternatywnie stransformowane komórki mogą być odpowiednimi szczepami żywej szczepionki, w których fragment kwasu nukleinowego (w jednek kopii lub w wielu kopiach) został wbudowany tak, aby wpływał na sekrecję analogu lub jego integrację z błoną bakterii lub ściany komórkowej.

Korzystnymi stransformowanymi komórkami według wynalazku są mikroorganizmy, takie jak bakteria (taka jak gatunki Escherichia [np. E. coli], Bacillus [np. Bacillus subtilis], Salmonella lub Mycobacterium [korzystnie niepatogenne np. M. bovis BCG]), drożdże (takie jak Saccharomyces cerevisiae) i pierwotniaki. Alternatywnie stransformowane komórki pochodzą od organizmu wielokomórkowego, takiego jak grzyby lub komórka owadzia, komórka roślinna lub komórka ssacza. Najkorzystniej komórki pochodzą od ludzi, patrz poniższe omówienie linii komórkowych i wektorów.

Dla celów klonowania i/lub optymalizacji ekspresji jest korzystne, aby stransformowana komórka była zdolna do replikacji fragmentu kwasu nukleinowego według wynalazku. Komórki wyrażające fragmenty kwasu nukleinowego są korzystnie użytecznymi wykonaniami wynalazku; mogą być one użyte do przygotowywania preparatów analogów na małą skalę lub na dużą skalę lub, w przypadku niepatogennych bakterii, jako składniki w żywej szczepionce.

Gdy wytwarza się analogi według wynalazku sposobem transformowania komórek, jest to dogodne, chociaż jest krytyczne, że produkt ekspresji jest albo eksportowany poza komórkę do pożywki hodowlanej albo przeprowadzony na powierzchnię stransformowanej komórki.

Gdy zostaną zidentyfikowane komórki producenci, korzystnie, w oparciu o nie ustala się stabilną linię komórkową, która niesie wektor według wynalazku i która wyraża fragment kwasu nukleinowego kodujący analog. Korzystnie, ta stabilna linia komórkowa wydziela lub przenosi analogi według wynalazku, tym samym umożliwiając ich oczyszczanie.

Na ogół, wektory plazmidowe zawierające replikon i sekwencje kontrolujące pochodzące od gatunków zgodnych z komórką gospodarza są stosowane w połączeniu z gospodarzami. Wektor zazwyczaj niesie miejsce replikacji jak również sekwencje znacznikowe, które są zdolne do dostarczenia selekcji fenotypowej w stransformowanych komórkach. Przykładowo, E.coli jest typowo transformo44

PL 202 399 B1 wana przy pomocy pBR322, plazmidu pochodzącego z gatunków E.coli (patrz np., Bolivar i wsp., 1977). Plazmid pBR322 zawiera geny odporności na ampicylinę i tetracyklinę i w ten sposób dostarcza łatwych środków do identyfikacji stransformowanych komórek. Plazmid pBR lub inne plazmidy pochodzące z drobnoustrojów lub fagi muszą także zawierać lub być zmodyfikowane tak aby do zawierały promotory, które mogą być stosowane przez mikroorganizmy prokariotyczne do ekspresji. Te promotory najczęściej używane w konstrukcji zrekombinowanych DNA obejmują B-laktamazę (penicylinazę) i systemy promotora laktozowego (Chang i wsp., 1978; Itakura i wsp., 1977; Goeddel i wsp., 1979) i system promotora tryptofanowego (trp) (Goeddel i wsp., 1979; EP-A-0 036 776). Podczas gdy te są najpowszechniej używane, mogą być też odkryte i wykorzystane inne promotory drobnoustrojowe i, a szczegóły dotyczące ich nukleotydowych sekwencji były opublikowane umożliwiając specjaliście ich funkcjonalne połączenie przez ligację z wektorami plazmidowymi (Siebwenlist i wsp., 1980). Pewne geny z prokariontów mogą być wydajnie wyrażone w E.coli z ich własnych sekwencji promotorowych wykluczając potrzebę dodawania, w sztuczny sposób, innego promotora.

Oprócz, do prokariontów mogą być użyte eukariotyczne mikroorganizmy, takie jak kultury drożdży i tu promotor powinien być zdolny do kierowania ekspresji. Saccharomyces cerevisiae lub pospolite drożdże piekarnicze są powszechnie stosowane wraz z innymi eukariotycznymi mikroorganizmami, choć szereg innych szczepów, takich jak Pichia pastoris jest powszechnie dostępnych. Dla ekspresji w Saccharomyces powszechnie używany jest plazmid YRp7 (Stinchcomb i wsp., 1979; Kingsman i wsp., 1979; Tschemper i wsp., 1980). Plazmid ten zawiera już gen trp1, który dostarcza markera selekcyjnego dla zmutowanego szczepu drożdży, który utracił zdolność do wzrostu na pożywce z tryptofanem, przykładowo ATCC No. 44076 lub PEP4-1 (Jones, 1977). Obecność zmiany zależnej od trp1 jako cechy charakterystycznej genomu komórek drożdży będących gospodarzem dostarcza skutecznego środowiska dla wykrycia transformacji przez wzrost przy braku tryptofanu.

Odpowiednie sekwencje promotora w wektorach drożdżowych obejmują promotory dla kinazy 3'fosfoglicerynianowej (Hitzman i wsp., 1980) lub innych enzymów glikolitycznych (Hess i wsp., 1968; Holland i wsp., 1978), takich jak enolaza, dehydrogenaza gliceroaldehydo-3-fosforanowa, heksokinaza, dekarboksylaza pirogronianowa, fosfofruktokinaza, izomeraza glukozo-6-fosforanowa, mutaza 3'fosfoglicerynianowa, kinaza pirogronianowa, izomeraza triozofosforanowa, izomeraza fosfoglukozowa i glukokinaza. W konstrukcji odpowiednich plazmidów ekspresyjnych sekwencje terminacyjne związane z tymi genami są również przyłączone przez ligację do 3' końca wektora ekspresyjnego do sekwencji, której ekspresja będzie pożądana dla dostarczenia sygnałów poliadenylacji i terminacji mRNA.

Inne promotory, które mają dodatkową zaletę transkrypcji kontrolowanej przez warunki wzrostu, są regionem promotora dla dehydrogenazy alkoholowej 2, izocytochromu C, kwaśnej fosfatazy, enzymów degradujących związanych z metabolizmem azotu i wymienionej powyżej dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej i enzymów odpowiedzialnych za wykorzystanie maltozy i galaktozy. Odpowiedni jest każdy wektor plazmidowy zawierający promotor zgodny z drożdżami, miejsce inicjacji replikacji i sekwencje terminacyjne.

Oprócz mikroorganizmów jako gospodarze mogą być stosowane hodowle komórek pochodzące z organizmów wielokomórkowych. Zasadniczo, zdolna do pracy jest każda taka hodowla komórkowa, niezależnie czy pochodzi z kręgowca czy z bezkręgowca. Jednakże, bardziej interesujące są komórki kręgowca i namnażanie komórek kręgowca w hodowli (hodowla tkankowa) w ostatnich latach staje się procedurą rutynową (Tissue Culture, 1973). Przykłady takich użytecznych linii komórkowych gospodarza stanowią komórki VERO i HeLa, komórki linii komórkowych jajnika chomika (CHO), i W138, BHK, COS-7 293 i komórki linii MDCK.

Wektory ekspresyjne dla takich komórek obejmują zazwyczaj (jeśli jest to konieczne) miejsce inicjacji replikacji, promotor umiejscowiony na początku genu, który będzie wyrażany, wraz z niezbędnymi miejscami wiązania rybosomu, miejscami składania RNA, miejscem poliadenylacji i sekwencjami terminatora transkrypcji.

Dla użycia w komórkach ssaka funkcje kontrolujące na wektorach ekspresyjnych są często dostarczone przez materiał wirusowy. Przykładowo powszechnie użyte promotory pochodzą z wirusa poliomy, adenowirusa 2 i najczęściej z SV40. Szczególnie użyteczne są wczesny i późny promotor wirusa SV40, ponieważ oba są łatwo uzyskiwane z wirusa jako fragmenty, które również zawierają miejsce inicjacji replikacji SV40 (Fiers i wsp., 1978). Mniejsze lub większe fragmenty SV40 mogą być również użyte pod warunkiem, że zawierają sekwencję obejmującą około 250 par zasad rozciągającą się od miejsca Hindlll w kierunku miejsca Bgll zlokalizowanych w miejscu inicjacji replikacji wirusa. Ponadto, jest również możliwe i często pożądane wykorzystanie promotora lub sekwencji kontrolująPL 202 399 B1 cych normalnie towarzyszących żądanej sekwencji genu, pod warunkiem, że takie sekwencje kontrolujące, są zgodne z układami komórek gospodarza.

Miejsce inicjacji replikacji może być dostarczone albo przez konstrukcję wektora tak, aby zawierał egzogenne miejsce inicjacji replikacji, które może pochodzić z SV40 lub innych wirusów (np. polioma, adenowirusa, VSV, BPV) albo może być dostarczone przez mechanizm replikacji chromosomalnej gospodarza. Jeśli wektor jest włączony do chromosomu komórki gospodarza, ten ostatni mechanizm jest zazwyczaj wystarczający.

Kompozycje według wynalazku

Wynalazek dotyczy kompozycji immunogennych, które zawierają jako skuteczny czynnik immunogenny przynajmniej jeden z opisanych tu analogów z domieszką farmaceutycznie i immunologicznie dopuszczalnego nośnika, podłoża, rozcieńczalnika lub substancji pomocniczej i ewentualnie adiuwanta, patrz również omówienie tych składników przedstawiono powyżej.

Ponadto, wynalazek dotyczy również kompozycji do wywoływania wytwarzania przeciwciał przeciwko któremukolwiek z wyżej omówionych antygenów nowotworowych obejmującej

- fragment kwasu nukleinowego lub wektor według wynalazku i

- farmaceutycznie i immunologicznie dopuszczalny rozcieńczalnik i/lub podłoże i/lub nośnik i/lub środek pomocniczy i/lub adiuwant.

Formulacja i inne specyfikacje dotyczące takich kompozycji są omówione powyżej w odpowiednim rozdziale dotyczącym immunizacji kwasem nukleinowym.

P R Z Y K Ł A D 1

Szczepienia przeciw PSM

Poniżej opisano jak można wytworzyć ludzką autoszczepionkę przeciw PSM, przez modyfikację cząsteczki przez wstawienie jednego lub więcej mieszanych, obcych epitopów komórek T, w celu uzyskania panelu immunogenizowanych cząsteczek PSM.

Konstrukty testowano na ich zdolność indukowania specyficznej odpowiedzi CTL przeciwko komórkom nowotworowym niosącycm PSM. Ponadto, konstrukty były testowane na ich zdolność do indukowania przeciwciał które reagują krzyżowo z natywnymi fragmentami cząsteczki PSM. Następnie została oceniona efektywność różnych konstruktów w szeregu testów in vitro i na modelach zwierzęcych in vivo. Testowano zdolność indukowanych przeciwciał do aktywacji dopełniacza przez klasyczny szlak i do inicjowania ADCC przez receptory Fc. Wreszcie różne cząsteczki były testowane na modelach zwierzęcych ludzkiego raka prostaty.

Strategia projektowania autoszczepionki przeciw PSM

Pokrótce, planowanie szczepionki przeciw PSM pociągało za sobą następujące zadania eksperymentalne:

Zaprojektowanie i wytworzenie szeregu mutantów ludzkiego PSM

- Klonowanie sekwencji PSM od człowieka i szczura/myszy.

- Mutageneza w celu wytworzenia immunogenizowanych cząsteczek hPSM.

- Ekspresja cząsteczek typu dzikiego jak i immunogenizowanych hPSM w E. coli i/lub Pichia pastoris i/lub komórkach ssaczych i/lub komórkach owadzich (jak linia komórkowa S2)

- Oczyszczenie, refałdowanie i charakteryzacja immunogenizowanych cząsteczek hPSM.

Szczepienia DNA przeciw PSM

- Skonstruowanie wektorów szczepionkowych DNA dla hPSM kodujących immunogenizowane cząsteczki hPSM.

- Testowanie wektorów szczepionkowych hPSM w doświadczeniach in vitro i in vivo.

Wybór kandydatów hPSM

- Immunizacja myszy/królików

- ELISA

- analiza FACS

- W przypadku odpowiedzi w postaci przeciwciał: testy na proliferację komórek guza.

- testy z komórkami T.

Testowanie mutantów hPSM in vivo

- model guza litego/metastazy u myszy.

Badania koncepcyjne: indukcja CTL autoszczepieniami

- Wytworzenie immunogenizowanych mysich/szczurzych PSM, odpowiadających wybranym kandydatom hPSM (np. w formie szczepionek DNA).

PL 202 399 B1

- Testowanie odpowiedzi immunologicznej wywołanej mysimi/szczurzymi mutantami PSM w testach in vitro: oznaczenia immunochemiczne, ELISA, analiza FACS, oznaczenia komórkowe, liza komórek niosących PSM zależna od dopełniacza, testy ADCC, oznaczenia aktywności CTL, testy na proliferację komórek guza, testy na prezentację komórkom T.

- Testowanie mutantów mPSM in vivo na modelu guza litego/metastazy u myszy.

Nomenklatura konstruktów hPSM

PSM jest białkiem błonowym typu II złożonym z 750 aminokwasów, cf. SEKW. ID NR: 2, która przedstawia sekwencję typu dzikiego z wyjątkiem Gly podstawionej przez Trp w pozycji 2 na skutek wprowadzenia miejsca restrykcyjnego NcoI i sekwencji Kozaka w SEKW. ID NR: 1, gdzie ggt zamienia tgg w pozycji 4-6. Jednak, natywne PSM (np. PSM mające Trp w pozycji 2) było także użyte w pewnych konstruktach autoszczepionek, opartych na ludzkim PSM.

Zewnątrzkomórkową część PSM stanowi 707 C-końcowych aminokwasów, podczas gdy cytoplazmatyczną domenę wyznaczono na 19 aminokwasów, a transbłonowa część białka składa się z 24 aminokwasów (aa 20-43).

Jako punkt wyjścia dla konstruktów był użyty także wariant składania PSM'. Nasza wersja tego wariantu składania ma sekwencję aminokwasową odpowiadającą resztom 58-750 w SEKW. ID NR: 2. Dla ułatwienia nomenklatury regiony w PSM' są numerowane zgodnie z numeracją w PSM (oznacza to, że np. region 2 składa się z aminokwasów 87-108 w PSM i aminokwasów 30-51 w PSM'), cf. także poniższe omówienie regionów.

Wszystkie genetyczne konstrukty ludzkiego PSM zostały określone jako hPSM_._ (albo hPSM'_._ jeżeli PSM' został użyty wyjściowo), gdzie pierwsze _ oznacza region insercyjny użyty do wstawienia P2, a drugie _ oznacza region insercyjny użyty dla P30. Jeżeli P2 albo P30 nie są obecne w białku, został przypisany numer 0 (zero). Pełnej długości, hPSM typu dzikiego, jest określony jako hPSM0.0, a dzikiego typu hPSM pozbawione domeny cytoplazmatycznej i transbłonowych części określono jako hPSM:0.0. 13 planowanych, immunogenizowanych genów dla hPSM, z których wszystkie zawierają jeden epitop P2 i jeden epitop P30 zostały nazwane: hPSM1.1, hPSM6.1, hPSM8.1, hPSM10.1, hPSM1.6, hPSM1.8, hPSM1.10, hPSM1.2, hPSM1.3, hPSM1.5, hPSM2.1, hPSM3.1, hPSM10.3, hPSM6.3, hPSM'10.3, hPSM'6.3, hPSM8.3, hPSM'8.3 i hPSM5.1, cf. szczegóły poniżej.

W hPSM1.1 oba epitopy P2 i P30 są wstawione tandemowo w region insercyjny nr 1 (region błonowy). Teoretycznie, ten mutant, hPSM1.1, może być uważany za bardzo atrakcyjnego kandydata na szczepionkę, do indukcji przeciwciał, ponieważ cała domena pozakomórkowa w tej cząsteczce jest nie naruszona. Jako użyteczne do indukcji odpowiedzi CTL po immunizacji kwasem nukleinowym, uznane zostały konstrukty takie jak hPSM10.3 i hPSM6.3.

W celu ułatwienia procedur klonowania i mutagenezy większość konstruktów została wykonana z użyciem jako materiału początkowego N-końcowego (aminokwasy 1-436) albo C-końcowego (aminokwasy 437-750) fragmentu genu hPSM. Te dwie części genu hPSM zostały określone odpowiednio jako hPSMI_._ i hPSMII_._, gdzie pierwsze _ oznacza region insercyjny użyty do wstawienia P2, a drugie _ oznacza region insercyjny użyty dla P30. I znów, jeżeli P2 albo P30 nie są obecne w białku, został przypisany numer 0 (zero), a typy dzikie są określone odpowiednio jako hPSMI0.0 i hPSMII0.0. Specjalny wariant hPSMl0.0 pozbawiony cytoplazmatycznej części hPSM określono jako hPSMI: 0.0.

Praktycznie, większość pracy związanej z mutagenezą została wykonana z użyciem hPSMI0.0 i hPSMII0.0 jako materiału wyjściowego. Wyrażane białka mutantów hPSM zostały określone jako PROS_._, gdzie pierwsze _ oznacza region insercyjny użyty do wstawienia P2, a drugie _ oznacza region insercyjny użyty dla P30. Jeżeli P2 albo P30 nie są obecne w białku, został przypisany numer 0 (zero). Białko hPSM typu dzikiego jest określone jako PROS0.0. PROSII0.0, jest produktem białkowym złożonym z aminokwasów 437-750 hPSM. Białka ze znacznikami typu His są nazywane HISPROS_._. Jako znaczników His użyto SEKW. ID NR: 21 do ekspresji w drożdżach i bakteriach, podczas gdy do ekspresji w komórkach ssaczych użyto SEKW. ID NR.: 23.

Klonowanie sekwencji ludzkiego PSM

Linia komórkowa LNCaP, wywodząca się z patologicznych zmian metastatycznych gruczolakoraka prostaty człowieka, została nabyta w „American Type Culture Collection” (ATCC). Wyizolowano mRNA z tej linii komórkowej, wykonano reakcję odwrotnej transkrypcji używając standardowego zestawu odczynników w celu otrzymania cDNA kodującego sekwencję ludzkiego PSM. Używając różnych zestawów starterów specyficznych dla hPSM, otrzymano produkty PCR kodujące PSM (437750). Następnie produkty te zostały sklonowane do plazmidu pUc19 (numer plazmidu pMR300) i zwePL 202 399 B1 ryfikowane przez sekwencjonowanie DNA. Ta C-końcowa część PSM typu dzikiego, została określona jako hPSM fragment II (hPSMII0.0).

Podobnie, fragment I dzikiego typu PSM (hPSM0.0) został sklonowany do wektora pUc19, przy użyciu starterów do amplifikacji fragmentu I razem z (hPSMI0.0) i bez (hPSMI: I0.0) domen cytoplazmatycznych i transbłonowych. Klony zostały kontrolnie zsekwencjonowane i hPSMI0.0 i hPSMII0.0 zostały zligowane w miejscu restrykcyjnym EcoRI. Otrzymane klony hPSM0.0 (SEKW. ID NR: 2) i hPSM: 0.0 zostały subklonowane do szeregu pro- i eukariotycznych wektorów ekspresyjnych i ponownie zweryfikowane przez sekwencjonowanie. Także cDNA użyto jako materiału początkowego do skonstruowania formy wyrażanej wewnątrzkomórkowo ludzkiego PSM (oznaczono jako hPSM' - aminokwasy 58-750 z SEKW. ID NR: 2). Ta sekwencja została także wklonowana do ssaczych wektorów ekspresyjnych i została użyta jako materiał wyjściowy dla pewnych konstruktów autoszczepionek hPSM, np. hPSM'10.3 i hPSM'6.3.

Klonowanie szczurzej i mysiej sekwencji PSM

Dwa klony EST (expressed sequence tag) zawierające sekwencje cDNA mysiego PSM (odpowiednio z płodowej nerki mysiej i mysich makrofagów) zostały nabyte z „American Type Culture Collection” (ATCC). Razem oba EST pokryły sekwencję cDNA mysiego PSM

Pełnej długości mysie PSM (SEKW. ID NR: 7 i 8) jak również szczurze PSM' (SEKW ID NR: 9 i 10) zostały wklonowane do bakteryjnych i ssaczych wektorów ekspresyjnych. Szczurze konstrukty PSM AutoVac zostały także wykonane przez insercję P30 w cDNA mysiego PSM.

Ekspresja dzikiego typu hPSM w E. coli

C-końcowa część (aminokwasy 437-750) hPSM, hPSMII0.0, została wklonowana do ekspresyjnego wektora bakteryjnego pET28b w celu otrzymania produktu z N-terminalnym poli-histydynowym (HIS) ogonem, który ułatwia oczyszczanie na dużą skalę i identyfikację przez przeciwciała anty-poliHIS. Został wyrażony w E. coli produkt białkowy hPSMII0.0 znakowany poli-HIS (produkt białkowy oznaczony HIS-PROSII0.0).

DNA kodujące skrócone, ludzkie PSM typu dzikiego hPSM: Hcyt0.0 zostało także wyrażone z wektora pET28b w szczepie E. coli BL21 (DE3), gdzie produkt ekspresji ulokowany jest w ciałkach inkluzyjnych. Analiza typu SDS-PAGE lizatu bakteryjnego wykazała produkt migrujący w oczekiwany sposób, a Western-blotting z króliczym anty-HIS-PROSII0.0 również dał oczekiwany prążek. Następnie, N-końcowe sekwencjonowanie pięciu aminokwasów tego produktu, wyizolowanego z żelu w SDSPAGE, wykazało oczekiwaną sekwencję aminokwasową.

Konstrukty zawierające hPSM dzikiego typu, hPSM0.0, hPSM: 0.0 (także dwa mutanty hPSM, hPSM1.1 i hPSM6.1, patrz niżej) zostały wklonowane w różne wektory ekspresyjne E. coli w celu umożliwienia bardziej wydajnej ekspresji i pewnego stopnia fałdowania rekombinowanych białek w E. coli. Wybrano następujące systemy ekspresyjne:

pMTC6 wytwarzający N-końcowo HIS-znakowane wersje wyrażanych rekombinowanych białek, pGH433 który wyraża rekombinowane białka w połączeniu z 22 aminokwasową sekwencją liderową pelB, która powinna kierować białko do przestrzeni periplazmatycznej bakterii E. coli, oraz pMal-p2, w którym rekombinowane białka są wyrażane jako C-końcowe fuzje z białkiem wiążącym maltozę (MBP) zawierającym naturalną liderową sekwencję periplazmatyczną MBP. Przeciwciała przeciwko MBP mogą być wykorzystane do detekcji białek fuzyjnych, a kolumny ze związanym wodorowęglanem mogą być użyte do oczyszczania produktu przez powinowactwo.

Jednak doświadczenia z ekspresją białek hPSM typu dzikiego w E. coli z tych wektorów, pokazały jedynie dobry poziom ekspresji z pMCT6. Problemy z uzyskaniem ekspresji periplazmatycznej białek hPSM typu dzikiego są wciąż nie rozwiązane.

Ekspresja dzikiego typu hPSM w Pichia pastoris

Z powodu stosunkowo wysokiej masy cząsteczkowej białko PSM i jego stosunkowo wysoki poziom glikozylacji (około 16% masy cząsteczkowej) i w celu ułatwienia oczyszczania przez eliminację etapu refałdowania białka, zadecydowano, aby zastosować alternatywną technologię ekspresji eukariotycznej rekombinowanych białek. Zostało ocenionych kilka dobrze scharakteryzowanych eukariotycznych układów ekspresyjnych i do wstępnych analiz mutantów hPSM wybrano drożdże Pichia pastoris, jako alternatywa dla ekspresji w E. coli.

Układ ekspresyjny oparty na drożdżach Pichia pastoris zastosowano dla konstrukcji PSM. Oczekiwano, że wzór glikozylacji rekombinowanych białek wyrażanych w tym organizmie będzie przypominał ssaczy wzór glikozylacji bardziej niż np. w Saccharomyces cerevisiae, z powodu mniej rozgałęzionej mannozylacji rekombinownych białek. Wykazano, że pobieranie antygenów, dzięki recepto48

PL 202 399 B1 rowi mannozowemu, przez komórki dendrytyczne, skutkuje około 100-krotnie bardziej efektywną prezentacją komórkom T, w porównaniu z pobieraniem przez endocytozę fazy płynnej. Dlatego mannozylacja może odgrywać rolę dla antygenowości (w szczególności w zdolności do indukcji odpowiedzi CTL) mutantów hPSM i innych antygenów przeciw którym pożądana jest odpowiedź CTL

Szczep Pichia pastoris jak i dwa różne wektory ekspresyjne zostały nabyte w Invitrogen.

Wektor pPICZaA niesie powyżej miejsca wielokrotnego klonowania promotor indukowalny metanolem, natomiast ekspresja białek z wektora pGAPZaA jest konstytutywna. Oba wektory kodują sygnał sekrecyjny czynnika - α w celu eksportu rekombinowanych białek do podłoża. Układem selekcyjnym tych wektorów jest oporność na zeocynę. Sekwencje kodujące hPSM0.0 i hPSM: 0.0 (także jednego mutanta hPSM, hPSM1.1, cf niżej) zostały wklonowane do tych wektorów (w ramce z C-końcowym, identyfikacyjnym epitopem c-myc, SEKW. ID NR: 27).

Cztery szczepy Pichia pastoris (X-33, SMD1168, GS115 i KM71) różniące się np. wymaganiami wzrostowymi, zostały stransformowane każdym z tych (zlinearyzowanych) plazmidów, z użyciem elektroporacji. Procedura transformacji była powtarzana kilkakrotnie z mało znaczącymi zmianami w celu otrzymania dużej ilości klonów opornych na zeocynę. Osiągnięto ekspresję dzikiego typu hPSM: 0.0 (także hPSM1.1, patrz niżej) w układzie Pichia pastoris. Wyrażone produkty były wykrywane w analizie Western-blot lizatów transformantów Pichia pastoris, zarówno z użyciem przeciwciał monoklonalnych anty-hPSM jak i przeciwciał monoklonalnych anty-c-myc jako pierwszorzędowych. Jednak rekombinowane produkty były wykrywane wewnątrzkomórkowo.

Ekspresja hPSM typu dzikiego w komórkach ssaczych

Układ ekspresyjny z użyciem komórek CHO (komórki jajnikowe chomika chińskiego) zostanie także zastosowany do końcowego testowania i wytwarzania wybranych cząsteczek.

Narazie, komórki CHO zostały stransfekowane dzikim typem hPSM i hPSM1.1 zgodnym/niezgodnym z ramką sekwencji liderowej na ssaczym wektorze ekspresyjnym pcDNA3.1. Otrzymano komórki oporne na genetycynę. W komórkach COS przejściowo stransfekowanych tymi samymi konstruktami, wykryto oba hPSM0.0 i hPSM1.1 w analizie Western-blot osadów komórek, stosując przeciwciała monoklonalne anty-hPSM.

Rozkład w tkankach PSM

W celu określenia, czy ekspresja hPSM może być wykryta w różnych tkankach ludzkich, w tym prostacie, krwi i mózgu nabyto zestaw handlowy. Metoda jest oparta na punktowej detekcji mRNA zawierającego polyA, ekstrahowanego z 50 różnych ludzkich tkanek. Wstępne wyniki nie wskazują na hiperekspresję hPSM w tkankach, takich jak krew czy mózg. Tym niemniej, w czasie późniejszym niż data pierwszeństwa dla obecnego zgłoszenia, inni wykazali obecność PSM w innych tkankach, powyżej.

Projektowanie mutantów hPSM

Podczas projektowania mutagenezy PSM, bardzo ważne było zachowanie pewnych regionów białka w modyfikowanych konstruktach, takich jak np. potencjalne i zidentyfikowane epitopy komórek T, epitopy komórek B i podstawniki cysteinowe tworzące mostki disiarczkowe. Dlatego, takie „zakazane” regiony zostały zidentyfikowane w sekwencji PSM, z pozostawieniem ograniczonej ilości „otwartych” regionów złożonych z 20 lub więcej aminokwasów, możliwych do wymiany z obcymi epitopami P2 i/lub P30 komórek T pomocniczych. Z definicji region transbłonowy był także rozważany jako region „otwarty” w szczególności gdy auto-przeciwciała przeciw temu regionowi są nie związane z tematem i uważa się, że eliminacja tej sekwencji zwiększa rozpuszczalność zmutowanych białek PSM, ale nie można wykluczyć że ten region zawiera ważne epitopy CTL, stąd zachowanie regionu transbłonowego np. w hPSM10.3.

Zgodnie z naszymi oczekiwaniami autoszczepionka będzie indukować odpowiedź CTL, byłoby więc ważne zidentyfikowanie i zachowanie potencjalnych, sub-dominujących epitopów CTL w konstruktach. Dwa tego typu epitopy są już znane z literatury: 1) peptyd zawierający aminokwasy z pozycji 4-12 PSM (LLHETDSaV) może być prezentowany na ludzkich cząsteczkach MHC klasy I HLA-A2.1 (Tjoa 1996), i 2) PSM (711-719) (ALFDIESKV) także wiąże HLA-A2.1 (ref 25). Przeszukano także sekwencję aminokwasową PSM w celu zidentyfikowania pierwszorzędowych reszt kotwiczących motywów wiążących HLA klasy I, jak opisał Rammensee i wsp. (Rammensee, 1995), dla najbardziej licznych typów HLA klasy I (HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A23, HLA-A24 I HLA-A28), razem stanowiących 80% typów HLA-A w ludzkiej populacji. Podobnie zostały zidentyfikowane potencjalne epitopy HLA-B i HLA-C i określone jako „zabronione”obszary.

Ponieważ początkowo zamierzano użyć C57/black x SJL F1 myszy hybrydowe, w przypadku, gdy zdecydowano użyć myszy transgeniczne do testowania konstruktów autoszczepionek PSM, poPL 202 399 B1 tencjalnie pewne, mysie H-2^b i H-2^s epitopy leukocytów T pomocniczych zostały zidentyfikowane i uznane jako zakazane regiony (Rammensee, 1995).

Było także ważne zachowanie znanych regionów wiążących przeciwciała w cząsteczce PSM, ponieważ mogą one być istotne w indukcji specyficznych autoprzeciwciał anty-PSM. Pięć takich regionów zostało już opisanych: PSM (63-68), PSM (132-137), PSM (482-487) (WO 94/09820), PSM (716-723) i PSM (1-7) (Murphy, 1996). Z użyciem komputerowej metody Hopp'a i Woods'a do przewidywania determinant antygenowych, przewidziano pięć regionów: PSM (63-69), PSM (183-191), PSM (404-414), PSM (479-486) i PSM (716-723) (Hoop, 1983), część z nich nakłada się na eksperymentalnie wyznaczone epitopy komórek B. Te regiony będą także zachowane w cząsteczkach kandydatach dla szczepionki PSM.

Białko PSM zawiera 4 reszty cysternowe (pozycje aminokwasów 22, 196, 466 i 597), które będą zachowane w immunogenizowanych konstruktach z powodu ich potencjalnej ważności w formowaniu mostków disiarczkowych.

W oparciu o powyżej wspomniane „zakazane” i „otwarte” regiony w białku hPSM zostało zidentyfikowanych 10 regionów odpowiednich do wstawienia obcych epitopów komórek T pomocniczych:

Regiony insercyjne w hPSMI (od miejsca inicjacji do miejsca EcoRI, aminokwasy 1-437):

Region 1: aa 16 - 52 w PSM (4 aa poprzedzające TM, TM (24 aa) i 9 aa po TM = 37 aa)

Region 2: aa 87 - 108 w PSM, aa 30 - 51 w PSM' (22 aa)

Region 3: aa 210 - 230 w PSM, aa 153 - 173 w PSM' (21 aa)

Region 4: aa 269 - 289 w PSM, aa 212 - 232 w PSM' (21 aa)

Region 5: aa 298 - 324 w PSM, aa 241 - 267 w PSM' (27aa)

Regiony insercyjne w hPSMII (od miejsca EcoRI do miejsca translacji, aa 437 - 750)

Region 6: aa 442 - 465 w PSM, aa 385 - 408 w PSM' (24 aa)

Region 7: aa 488 - 514 w PSM, aa 431 - 457 w PSM'(27 aa)

Region 8: aa 598 - 630 w PSM, aa 541 - 573 w PSM' (33 aa)

Region 9: aa 643 - 662 w PSM, aa 586 - 605 w PSM' (20 aa)

Region 10: aa 672 - 699 w PSM, aa 615 - 642 w PSM' (28 aa)

Regiony insercyjne jak i „zakazane” regiony zostały przedstawione graficznie na fig. 4.

Szereg różnych immunogenizowanych konstruktów PSM będzie wytworzonych przez podstawienie segmentu aminokwasów z 2, spośród powyżej wymienionych regionów insercyjnych, na P2 lub P30. Każde zmutowane białko będzie zawierało zarówno P2 i P30, chociaż takie konstrukty są tylko przykładowe - pojedyncze mutanty są także rozpatrywane w zakresie obecnego wynalazku. W toku doświadczeń, mutacje będą zrobione odpowiednio w klonach cDNA hPSMI i hPSMII i dwa zmutowane fragmenty będą następnie łączone przez ligację (w miejscu EcoRI). W celu wytworzenia mutantów, epitopy P2 i P30 zostały początkowo wstawione w regiony insercyjne 1, 2, 3, 5, 6, 8 i 10.

Sekwencje P2 i P30 to:

P2: QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 12, 15 aa), w tym przypadku kodowana przez sekwencję nukleotydową cag tac atc aaa gct aac tcc aaa ttc atc ggt atc acc gag ctg (SEKW. ID NR: 11, 45 nukleotydów), gdzie sekwencja zapisana wytłuszczoną czcionką to miejsce Sacl. Może nastąpić inny wybór kodonów, w zależności od wyboru wektorów do klonowania i układów ekspresji.

P30: FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEKW. ID NR: 14, 21 aa) w tym przypadku kodowana przez sekwencję nukleotydową ttc aac aac ttc acc gta agc ttc tgg ctg cgt gtt ccg aaa gtt agc gCT AGC cac ctg gaa (SEKW. ID NR: 13, 63 nukleotydy) gdzie sekwencja zapisana wytłuszczoną czcionką wskazuje miejsce Hindlll, pojedyncze podkreślenie wskazuje miejsce Eco47III, duże litery wskazują miejsce BstNl, a podwójne podkreślenie wskazuje miejsce Nhel.

W poniższej tabeli podsumowano użyte konstrukty ludzkiego PSM:

Konstrukt	Pozycja P2 w białku	Pozycja P30 w białku
1	2	3
hPSM0.0	:	:
hPSM:0.0	:	:
hPSM'0.0	:	:
hPSM1.1	17-31	32-52
hPSM6.1	448-462	21-41

PL 202 399 B1 cd. tabeli

1	2	3
hPSM8.1	606-620	21-41
hPSM10.1	674-688	21-41
hPSM1.6	24-38	443-463
hPSM1.8	24-38	607-627
hPSM1.10	24-38	673-693
hPSM1.2	24-38	87-107
hPSM1.3	24-38	210-230
hPSM1.5	24-38	301-321
hPSM2.1	91-105	21-41
hPSM3.1	213-227	21-41
hPSM5.1	305-319	21-41
hPSM8.0	606-620	+
hPSM10.0	674-688
hPSM0.1	+
hPSM1.0	24-38	21-41
hPSM6.3	448-462	+
hPSM8.3	606-620	210-230
hPSM10.3	674-688	210-230
hPSM'6.3	391-405	210-230
hPSM'8.3	549-563	153-173
hPSM'10.3	617-631	153-173 153-173

Molekularna budowa mutantów hPSM

Mutacje wstawiające sekwencje kodujące P2 i P30 zostały wykonane przy użyciu jako materiału wyjściowego zarówno hPSMI0.0 jak i hPSMII0.0.

W celu wytworzenia większości mutantów hPSM, początkowo P2 i P30 wstawiono w hPSMI0.0 w pozycji insercyjnej 1. Otrzymany materiał (odpowiednio hPSMI1.0 i hPSMI0.1) został następnie użyty jako materiał wyjściowy do mutagenezy przez wstawienie P2 i P30 w pozycjach 2, 3 i 5 i do ligacji z hPSMII mutowanym epitopami. hPSMI1.0 został skonstruowany z użyciem SOE (ang. single overlap extension) PCR i następnie zweryfikowany przez sekwencjonowanie. hPSMI0.1 został skonstruowany z użyciem techniki „Quick Change” i następnie zweryfikowany przez sekwencjonowanie.

Epitop P2 został wstawiony w pozycje 2, 3 i 5 w hPSMI1.0 z użyciem SOE - PCR w celu wytworzenia hPSMI1.2, hPSMI1.3 i hPSMI1.5. Te konstrukty zostały połączone z hPSMI10.0 w celu wytworzenia hPSM1.2, hPSM1.3 i hPSM1.5.

hPSMl2.1, hPSMl3.1 i hPSMI5.1 zostały skonstruowane przez SOE PCR z użyciem hPSMI0.1 jako materiału wyjściowego. W celu wytworzenia pełnej długości mutantów hPSM2.1, hPSM3.1 i hPSM5.1, materiał ten został złożony z hPSMII0.0 przez ligację w miejscu EcoRI.

Epitop P2 został wstawiony w trzech różnych pozycjach w hPSMII0.0 w celu wytworzenia hPSMII6.0, hPSMII8.0 i hPSMII0.0, z użyciem techniki „Quick Change”, a otrzymane klony zostały następnie zweryfikowane przez sekwencjonowanie.

Następnie hPSMI0.1 zligowano z hPSMH6.0, hPSMH8.0 i hPSMIII0.0 w celu otrzymania hPSM6.1, hPSM8.1 i hPSMI0.1, otrzymane klony zostały zweryfikowane przez sekwencjonowanie.

Insercja epitopu P30 w hPSMII jest obecnie wykonywana z użyciem SOE PCR, w celu wytworzenia hPSMII0.6, hPSMII0.8 i hPSMII0.10.

PL 202 399 B1 hPSM1.1 skonstruowano stosując dwie mutacje z wykorzystaniem dwustopniowej PCR, następnie ligację w miejscu Hindlll w sekwencji epitopu. Konstrukt pełnej długości został zweryfikowany przez sekwencjonowanie.

Z użyciem SOE - PCR zostały skonstruowane hPSM10.3, hPSM'10.3 i hPSM6.3. Obecnie konstruowanych jest kilka innych wariantów hPSM z obydwoma P2 i P30 wstawionymi w część poza komórkową hPSM (hPSM'6.3, hPSM8.3, hPSM'8.3).

Dodatkowo do pierwotnie rozważanych mutantów zawierających oba P2 i P30, zostały skonstruowane 4 mutanty zawierające tylko jeden obcy epitop i zweryfikowane przez sekwencjonowanie: hPSM1.0, hPSM8.0, hPSM10.0 i hPSM0.1.

Ekspresja mutantów hPSM w E. coli

W eksperymentach ma małą skalę, siedem mutantów hPSM, hPSM1.1, hPSM6.1, hPSM8.1, hPSM10.1, hPSM2.1, hPSM3.1 i hPSM5.1 wyrażono na wektorze pET28b w szczepie E. coli BL21(DE3) i zidentyfikowano w żelach typu SDS - PAGE barwionych Coomassie Blue, oczekiwanej wielkości produkty ekspresji indukowanej IPTG. Produkt hPSM1.1 nie został wykryty. Poziom ekspresji tych mutantów był bardzo niski w porównaniu do produktu konstruktu dzikiego typu hPSM: 0.0. Narazie czysty poziom ekspresji mutantów hPSM z użyciem systemu pET w E. coli wydaje się nieosiągalny, tak więc jest konieczne użycie innych układów ekspresyjnych w E. coli i/lub innych organizmów gospodarzy.

Jak wspomniano powyżej, hPSM6.1 i hPSM1.1 zostały subklonowane do różnych wektorów ekspresyjnych dla E. coli w celu wytworzenia:

- wariantów rekombinowanych białek wyrażonych z N-terminalnie położonym znacznikiem HIS, z użyciem wektora pMCT6,

- wersji białek wyrażonych z sekwencją liderową pelB, która kieruje białka do przestrzeni periplazmatycznej bakterii E. coli, z użyciem wektora pGH433, i

- wersji rekombinowanych białek wyrażonych jako białka fuzyjne z C-końcowo położonym białkiem wiążącym maltozę (MBP), z użyciem wektora pMal-p2.

Na razie nie został osiągnięty wystarczający poziom ekspresji któregokolwiek z tych konstruktów.

Podobnie hPSM0.0 jest dość dobrze wyrażony w E. coli jest, podczas gdy jednocześnie podobnego poziomu ekspresji hPSM0.0 pełnej długości lub mutantów hPSM nie zaobserwowano, jest możliwe, że obecność cytoplazmatycznej części cząsteczki hPSM może w jakiś sposób „hamować” ekspresję pełnej długości konstruktów hPSM w E. coli. W celu sprawdzenia tej hipotezy początkowo wytworzono dwa konstrukty genetyczne, hPSM1.1 i hPSM6.1, pozbawione domen cytoplazmatycznych. Mimo to w eksperymentach ekspresyjnych w E. coli osiągnięto tylko słabą ekspresję produktów tych genocytów.

Ekspresja mutantów hPSM w Pichia pastoris

W celu wyrażenia zmutowanego białka hPSM1.1 w drożdżach Pichia pastoris, sekwencję hPSM1.1 wklonowano (zgodnie z ramką z C-końcowym epitopem identyfikacyjnym c-myc, SEKW ID NR: 27) do dwóch różnych wektorów ekspresyjnych pPICZaA i pGAPZa i zweryfikowano przez sekwencjonowanie. Ekspresję hPSM1.1 (także hPSM: 0.0, patrz wyżej) wykryto wewnątrzkomórkowo w transformantach Pichia pastoris.

Ekspresja mutantów hPSM w komórkach ssaczych

Jak wspomniano powyżej hPSM1.1 subklonowano do ssaczych wektorów ekspresyjnych pcDNA3.1(+) i pZeoSV2 i te konstrukty (i inne) mogły być użyte do ekspresji w np. komórkach CHO. Została osiągnięta w komórkach COS przejściowa ekspresja hPSM1.1 jak i hPSM0.0, wykrywalna przez analizę Western-blot.

Szczepienia DNA

Szczepienia DNA, jeżeli byłyby efektywne, będą bardzo odpowiednie dla autoszczepionki PSM - w szczególności, ponieważ jak wykazano ta forma podawania szczepionki wzmaga zarówno reakcje immunologiczne, w których pośredniczy CTL i produkcję przeciwciał. Dlatego zamierzano przeprowadzić równoległe badanie, mające na celu zbadanie wpływu szczepień DNA myszy, przeprowadzonych odpowiednimi wektorami kodującymi immunogenną mysią ubikwitynę i/lub mysi TNFa. Były także przeprowadzone szczepienia nagim DNA kodującym hPSM (i/lub mutantami).

Badania wykonalności szczepień DNA z użyciem immunogennej ubikwityny

Badania wykonalności określające efekt szczepień DNA z immunogennym białkiem własnym przeprowadzono z użyciem ubikwityny z wstawionym epitopem komórek pomocniczych T z albuminy jaja kurzego (UbiOVA) jako białka modelowego. Sekwencje kodujące UbiOVA jak również ubikwitynę typu dzikiego, zostały subklonowano do ssaczego wektora ekspresyjnego pcDNA3.1(-). Myszy BALB/c

PL 202 399 B1 w grupach po 5 immunizowano podając 40 μg konstruktów pcDNA-UbiOVA albo pcDNA-ubikwityna, albo domięśniowo, w mięsień czworogłowy, albo śródskórnie. Grupa kontrolna otrzymywała białko UbiOVA w kompletnym adiuwancie Freund'a. Trzy i sześć tygodni później immunizacje powtarzano z tą tylko różnicą, że białko UbiOVA było w emulsyfikowane z niekompletnym adiuwantem Freunds'a.

Regularnie skrwawiano myszy i oznaczano miana przeciwciał anty-ubikwitynowych. W grupach UbiOVA szczepionych DNA otrzymano tylko bardzo niskie miana przeciwciał anty-ubikwitynowych. Następnie wszystkie grupy były stymulowane białkiem UbiOVA w niekompletnym adiuwancie Freund'a i skrwawiane w celu określenia, czy szczepienia DNA z UbiOVA (a nie ubikwityną) mogły wzmocnić odpowiedź przeciwciał przeciw białku UbiOVA. Wyniki tego eksperymentu pokazały, że nie było znaczącej różnicy między grupami UbiOVA i grupami kontrolnymi, po tej pojedynczej stymulacji UbiOVA/FIA u wszystkich myszy rozwinęła się silna odpowiedź przeciwciał anty-ubikwitynowych.

Szczepienia DNA z użyciem konstruktów hPSM

Obecnie są przeprowadzane różne eksperymenty szczepień DNA z użyciem konstruktów hPSM. Różne, ludzkie PSM typu dzikiego i konstrukty AutoVac (takie jak np. hPSM0.0, hPSM: 0.0, hPSM'0.0, hPSM1.1, hPSM10.3) zostały sublonowane do wektorów szczepionek DNA (takich jak pcDNA3.1(+), pcDNA3.1(-), pVAX i pZeoSV2). W celu umożliwienia sekrecji in vivo wyrażanych białek hPSM, w niektórych konstruktach dołączono bezpośrednio na N-końcu i w ramce różne sekwencje liderowe (takie jak sekwencje liderowe CD11a, tPA i IL-5; odpowiednio SEKW ID NR: 29, 25 i 31). Wszystkie konstrukty, które wstawiono do szczepień DNA, zostały zweryfikowane przez sekwencjonowanie DNA i translację in vitro.

Myszom różnych szczepów (takich jak Balb/cA, Balb/cJ, DBA/2 i A/J) wstrzyknięto powyżej opisane szczepionki hPSM DNA, albo domięśniowo albo śródskórnie i ponownie, kilkukrotnie wznawiane z użyciem tych samych konstruktów.

Próbki surowic pobrano w trakcie okresu immunizacji i przechowywano w -20°C. Próbki te będą analizowane pod kątem obecności przeciwciał reagujących z dzikiego typu hPSM.

Opracowano także testy monitorujące odpowiedź CTL odpowiedź i proliferacyjną komórek T pomocniczych w tych myszach.

Wstępne wyniki sugerują, że możliwe jest osiągnięcie zarówno odpowiedzi CTL jak i odpowiedzi w postaci przeciwciał, przeciw PSM.

Oczyszczanie/charakteryzacja hPSM(437-750) znakowanego znacznikiem HIS (HIS-PROSII0.0)

Dzikiego typu hPSMII znakowany znacznikiem typu HIS (HIS-PROSII0.0) wyrażono w wektorze pET28b, rozpuszczone ciałka inkluzyjne nałożono na kolumnę FPLC do filtracji żelowej, eluowano buforem zawierającym 8M mocznik. W celu optymalizacji procedury, frakcje zawierające głównie hPSMII poddano różnym warunkom refałdowania. Z użyciem metody SDS-PAGE z barwieniem srebrem, określono czystość na większą od 90% rozpuszczonego produktu, dializowanego wobec buforu zawierającego Tris.

Immunizowano króliki oczyszczonym HIS-PROSII0.0, w celu zastosowania otrzymanej surowicy odpornościowej do późniejszej detekcji i możliwego oczyszczenia mutantów hPSM przez powinowactwo.

Oczyszczenie/charakteryzacja rozpuszczalnego hPSM (PROS:0.0) hPSM dzikiego typu pozbawiony części cytoplazmatycznych i błonowych, PROS:0.0, wyrażono w szczepie E. coli BL21 (DE3) w warunkach indukcji IPTG, i można go było wykryć w ciałkach inkluzyjnych. Hybrydyzacja typu Western-blot z użyciem króliczych przeciwciał anty-HIS-PROSII0.0 w stosunku do rozdzielonych w SDS-PAGE tych lizatów bakteryjnych, po której przeprowadzano Wester bloking z króliczym anty-HIS-PROSII0.0 wykazały obecność produktu o oczekiwanej migracji. Sekwencjonowanie N-końca produktu wyizolowanego z żelu SDS-PAGE, wykazało że pierwszych pięć aminokwasów odpowiada ludzkiemu PSM. Produkt poddano wielu seriom rozpuszczania i refałdowania. Produkt pozostający w roztworze może być otrzymany w buforze Tris, bez czynników denaturujących lub redukujących, lecz analizy SDS-PAGE wykazały, że materiał prawdopodobnie tworzy duże agregaty. Immunizowano tym materiałem myszy i króliki w celu otrzymania przeciwciał przeciw hPSM np. dla celów analitycznych - surowica odpornościowa nie reagowała z LNCaP hPSM.

W celu wytworzenia poliklonalnej surowicy odpornościowej przeciw PSM, do immunizacji królików przygotowano partię przemytych ciałek inkluzyjnych PROS: 0.0 z E. coli. W mokrym osadzonym materiale około 50% zawartości białka stanowiło PROS: 0.0. Surowica odpornościowa nie reagowała z LNCaP hPSM podczas doświadczeń Western-blot.

Wytworzenie peptydów hPSM koniugowanych z KLH do immunizacji

Zsyntetyzowano trzy 15-merowe peptydy w celu wytworzenia immunogennych koniugatów znanych epitopów hPSM dla komórek B z immunologiczną cząsteczką nośnikową, w celu otrzymania

PL 202 399 B1 poliklonalnej surowicy odpornościowej, która może rozpoznawać hPSM. Peptydy te zawierają epitopy PSM dla komórek B wraz z 5-6 flankującymi aminokwasami PSM z każdego końca.

Peptydy wytworzono przez automatyczną syntezę, oczyszczone przez HPLC i poddano kontrolnemu sekwencjonowaniu metodą degradacji Edman'a.

Chemicznie połączony koniugat wytworzono przez łączenie poprzeczne peptydów KLH hPSM zawierających epitop dla komórek B z użyciem standardowej, 1-etapowej procedury z aldehydem glutarowym jako czynnikiem sieciującym.

Synteza peptydów P2 i P30 z flankującymi sekwencjami hPSM

Zaprojektowano 6 peptydów, które odpowiadają epitopom P2 i P30 z 5 flankującymi aminokwasami hPSM na każdym końcu. Aminokwasy flankujące odpowiadają miejscom insercyjnym epitopów 6, 8 i 10. Peptydy będą użyte w np. testach proliferacji komórek T, ale także do innych celów, takich jak ELISA lub inne testy in vitro. Sekwencje peptydów są następujące:

PSMpep007	P2 wstawiony w hPSM w pozycji insercyjnej 6 OERGVOYIKANSKFIGITELRVDCT (SEKW ID NR: 15)
PSMpep008	P2 wstawiony w hPSM w pozycji insercyjnej 8 AWLROYIKANSKFIGITELEMKTY (SEKW ID NR: 16)
PSMpep009	P2 wstawiony w hPSM w pozycji insercyjnej 10 MFLEROYIKANSKFIGITELHVIYA (SEKW ID NR: 17)
PSMpep010	P30 wstawiony w hPSM w pozycji insercyjnej 6 NSRLLFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEVDCTP (SEKW ID NR: 18)
PSMpep011	P30 wstawiony w hPSM w pozycji insercyjnej 8 VVLRKFNNFTVSFWLRVPKVSASHLESFDSL (SEKW ID NR: 19)
PSMpep012	P30 wstawiony w hPSM w pozycji insercyjnej 10 LMFLEFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEPSSHN (SEKW ID NR: 20)

Podkreślono epitopy P2 i P30. Peptydy wytworzono przez automatyczną syntezę, oczyszczono metodą HPLC i poddano kontrolnemu sekwencjonowaniu metodą degradacji Edman'a.

Oznaczenia immunogenności

Opracowano różne układy eksperymentalne w celu wytworzenia materiałów i doborem oznaczeń immunogenności dla dalszego testowania i wyboru konstruktów zmutowanego PSM.

Wytworzenie króliczej poliklonalnej surowicy odpornościowej anty-HIS-PROSIIO.O i surowicy odpornościowej przeciw koniugatowi KLH-PSM-peptyd

Dwa króliki immunizowano oczyszczonym HIS-PROSII0.0, czyli C-terminalną częścią białka hPSM (aminokwasy 437-750) znakowaną znacznikiem HIS, zemulgowanym 1:1 w kompletnym adiuwancie Freund'a, i ponownie, dwukrotnie (w 28 i 55 dniu) stymulowano tym samym antygenem zemulgowanym w niekompletnym adiuwancie Freund'a.

Dwa króliki immunizowano mieszaniną zawierającą koniugat peptydów KLH-PSM oraz każdy z trzech wolnych peptydów. Każdy z tych trzech peptydów zawierał wcześniej określony epitop hPSM dla komórek B. Mieszaninę zemulgowanoo 1:1 w kompletnym adiuwancie Freund'a. Króliki ponownie, dwukrotnie (w 28 i 55 dniu) stymulowano tym samym antygenem zemulgowanym w niekompletnym adiuwancie Freund'a.

W testach ELISA wykazano krzyżową reaktywność przeciwciał anty-HIS-PROSII0.0 i PSMpep005 oraz reaktywność krzyżową między, przeciwciałami przeciw koniugatom peptydów KLH-PSM i wolnymi peptydami a HIS-PROSII0.0.

W Western-blotting przeciwciało anty-HIS-PROSII0.0 miało zdolność rozpoznawania natywnego hPSM z lizatów komórek LNCaP.

Immunizacja myszy hPSM.0 wyrażonym w układzie retrowirusowym

Na tym etapie projektu PSM, poważną przeszkodą był brak przeciwciał, które byłyby zdolne rozpoznawać prawidłowo sfałdowane, natywne hPSM. Przeprowadzono zatem eksperyment immunizacji z użyciem hPSM0.0 wyrażonym w układzie retrowirusowym.

Sześć grup myszy Balb/c immunizowano zarówno: 1) traktowanymi mitomycyną C komórkami mięsakowłókniakowymi

BALB/c (79.24.H8), transdukowanymi cDNA hPSM0.0 (CMV-Koz-hPSM), 2) traktowanymi mitomycyną C komórkami mięsakowłókniakowymi BALB/c (79.24.H8), transdukowanymi pustym wektorem (CMVBipep), 3) komórkami pakującymi (BOSC) transfekowanymi cDNA hPSM0.0 (CMV-KozhPSM), 4) komórkami pakującymi(BOSC) transfekowanymi pustym wektorem (CMVBipep), 5) retrowi54

PL 202 399 B1 rusem z kolekcji wyrażającym hPSM0.0 cDNA (CMV-Koz-hPSM) lub 6) retrowirusem z kolekcji Stock transformowanym pustym wektorem (CMVBipep).

Myszy były skrwawiane w kilku punktach czasowych, a otrzymywaną surowicę testowano w teście ELISA na reaktywność przeciw HIS-PROSII0.0. Niestety, u żadnej z myszy nie rozwinęły się przeciwciała zdolne do specyficznego rozpoznawania preparatów HIS-PROSII0.0.

Ustalenie warunków testu anty-hPSM ELISA

W celu ustalenia warunków ELISA do np. testowania supernatantów komórek hybrydoma albo mysich lub króliczych surowic odpornościowych, polistyrenowe płytki mikrotitracyjne (Maxisorp) pokryto oczyszczonym HIS-PROSII0.0. Surowice od myszy BALB/c immunizowanych tym samym preparatem HIS-PROSII0.0 reagowały z HIS-PROSII0.0 unieruchomionym w ilości 0,5 μg na studzienkę, z użyciem jako przeciwciała drugorzędowego króliczego anty-mysiego Ig, znakowanego peroksydazą chrzanową.

Jak wspomniano powyżej, w takim teście ELISA wykazano zdolność króliczej surowicy odpornościowej przeciw koniugatowi KLH-PSMpep004-PSMpep005-PSMpep006 zmieszanemu z wolnymi peptydami, do reagowania z unieruchomionym HIS-PROSII0.0.

Przeprowadzono test ELISA z użyciem płytek mikrotitracyjnych AquaBind® (cf. ujawnionych w WO 94/03530 gdzie opisano m.in. powierzchnie mikrotitracyjne pokryte dekstranem aktywowanym trezylem, które są obecnie dostępne na rynku pod zastrzeżonym znakiem towarowym AquaBind), z unieruchomionymi peptydami PSM (PSMpep004, PSMpep005, PSMpep006). Płytki AquaBind® pokryte tymi peptydami mogły wykrywać surowicę odpornościową króliczą wzbudzoną przeciwko temu samemu preparatowi antygenu. Jak wspomniano wyżej, królicze anty-HIS-PROSII0.0 mogło być wykrywane na płytkach AquaBind® pokrytych PSMpep005.

Opracowanie analizy Western-blot wykrywającej hPSM z użyciem komórek LNCaP i przeciwciała monoklonalnego 7E11C5

Z ATCC nabyto hybrydoma 7E11C5 komórek B wydzielające mysie, monoklonalne przeciwciało IgG2a przeciw wewnątrzkomórkowemu epitopowi ludzkiego PSM. Zebrany supernatant z kultur z około 90% martwych komórek, użyto w analizie Western-blot do wykrycia ludzkiego PSM zarówno w wzbogaconych na membranie preparatach komórek LNCaP jak i w lizatach komórek LNCaP. Przeciwciało to oczyszczono z użyciem kolumn z białkiem G i zweryfikowano metodą Western-blot jego reaktywność z LNCaP.

Opracowanie metody FACS do wykrywania hPSM na komórkach LNCaP

Opracowano niezależną metodę FACS do wykrywania hPSM na komórkach LNCaP. Rozpoznano kilka problemów: komórki LNCaP rosną bardzo wolno i w nieregularnych skupiskach, tak więc trzeba było zoptymalizować metodę otrzymywania zawiesiny pojedynczych komórek. Następnie, epitop rozpoznawany przez mAb 7E11C5 znajduje się, według literatury, w domenie cytoplazmatycznej hPSM. Tak więc, rozwinięto metodę utrwalania i permeabilizacji komórek. W tym celu, przeciwciało 7E11C5 oczyszczone przy pomocy białka G skoniugowano z FITC, i jako takie mogło być użyte bez przeciwciała drugorzędowego w analizie FACS.

Opracowano także metodę FACS z użyciem monoklonalnego przeciwciała J591 anty-hPSM, które rozpoznaje epitop na zewnątrzkomórkowej części hPSM. Przeciwciało zostało uzyskane z BZL Biologicals, skoniugowane FITC, a następnie użyte do analiz FACS i sortowania np. komórek LNCaP i transfektantów hPSM (patrz poniżej).

Opracowanie testów cytotoksyczności

Zastosowano metodę oczyszczania komórek dendrytycznych z mysiego szpiku kostnego.

Zoptymalizowano metodę immunizacji myszy komórkami dendrytycznymi pulsowanymi modelowymi peptydami i białkiem klasy I. Myszy były także immunizowane białkiem modelowym (β-galaktozydaza) sformułowanym w postaci ISCOMS.

Oczyszczone komórki T od immunizowanych myszy były ponownie stymulowane in vitro różnymi postaciami odpowiednich antygenów. Następnie zbadano zdolność ponownie stymulowanych CTL do lizy różnych rodzajów komórek docelowych (w tym pulsowane komórki dendrytyczne jak i transfektanty wyrażające cytozolowe peptydy klasy I, wyrażane w układzie retrowirusowym). Opracowano dwa różne testy mierzące in vitro aktywność CTL, z użyciem jako pomiaru cytotoksyczności albo metody uwalniania chromu albo fragmentacji DNA (metoda JAM). Osiągnięto bardzo dobre wyniki z białkiem modelowym β-galaktozydazą i z różnymi kombinacjami modelowych peptydów wiążących MHC klasy I i MHC klasy II.

PL 202 399 B1

Ustalenie narzędzi do badania przełamywania autotolerancji względem mysiego PSM u myszy

Celem jest badanie, czy autotolerancja wobec mysiego PSM może być przełamana u myszy przez immunizację i/lub szczepienie DNA przeciw mysiemu PSM z wykorzystaniem mysich cząsteczek PSM AutoVac.

Jak wspomniano powyżej, cDNA kodujący mysi PSM (mPSM) otrzymano i zsekwencjonowano DNA. Cztery cząsteczki będące wariantami mPSM są wytworzone przez wbudowanie P30 w dobrze określone miejsca do albo pełnej długości mPSM albo do mPSMv. Konstrukty były jak następuje:

Aminokwasy mPSM podstawione przez P30

MPSM0.0 mPSM'0.0 mPSMX mPSMY mPSM'X mPSM'Y

255-271 (z SEKW ID NR: 8) 689-700 (z SEKW ID NR: 8) 197-213 (z SEKW ID NR: 10) 631-642 (z SEKW ID NR: 10)

Długość cząsteczki (liczba aminokwasów) 752 694 756 760 698 702

Początkowo mPSM typu dzikiego i cząsteczki analogów cząsteczek są subklonowane do wektorów stosowanych do szczepienia DNA i użyte do szczepienia myszy DNA.

Celem jest analiza odpowiedzi immunologicznej, takiej jak odpowiedź CTL i usunięcie u myszu nowotworu. W tym celu mysia linia komórkowa będzie stransfekowana mysim PSM typu dzikiego (połączonymi w ramce ze znacznikiem identyfikacyjnym np. epitopem c-myc, SEKW ID NR: 27, dla celów wykrycia).

Modele nowotworu PSM in vivo

Testy proliferacji mysich komórek T z P2 i P30

Przeprowadzono serię doświadczeń nad proliferacją komórki T w celu określenia immunogenności peptydów P2 i P30 względem komórek T u różnych szczepów myszy (BALB/cA (H-2^d), C3H/Hen (H-2^k), DBA/1 (H-2^q) i C57BL/6 (H-2^b)). Wiadomo dobrze, że epitopy te są mieszane u ludzi, lecz mieszanina komórek T powinna być również potwierdzona u myszy przy pomocy układu doświadczalnego M&Es. W ten sposób pokazano, że P30 jest immunogenny dla komórki T w szczepach BALB/cA i C57BL/6, podczas gdy ani P2 ani P30 nie ujawniły immunogenności względem komórki T w szczepie C3H/Hen. W szczepie DBA/l, komórki T mogą reagować przeciw P2.

Wytworzenie mysich komórek nowotworowych wyrażających hPSM

W celu stosowania w myszy hPSM specyficznego modelu nowotworu, jak również w celu użycia w testach na proliferację komórki nowotworowej ustalono panel mysich komórek nowotworowych wyrażających hPSM.

Jednym podejściem jest wytworzenie tych linii komórkowych przez transdukcję mysich nowotworowych linii komórkowych wektorami retrowirusowymi kodującymi pełnej długości cDNA dla hPSM0.0 typu dzikiego.

Trzy różne konstrukty kodujące pełnej długości cDNA typu dzikiego kodujący ludzki PSM wprowadzono w miejsce wielokrotnego klonowania konstruując wektor retrowirusowy CMVBipep, przy czym dwa z nich zawierają powyżej kodonu start krótką sekwencję Kozaka.

Konstrukty te zostały wprowadzone przez transdukcję do trzech różnych mysich, nowotworowych linii komórkowych: P815 (nowotwór komórek tucznych, H-2^d), B16-F10 (czerniak, H-2^b) i 79.24.H8 (włókniakomięsak, H-2^d) przy pomocy linii komórek pakujących BOSC. Kolonie odporne na genetycynę uzyskano dla wszystkich trzech typów komórek i potwierdzono w teście PCR na matrycy genomowego DNA, tak że retrowirusowe konstrukty były zintegrowane do komórek gospodarza. Do tej pory nie było możliwe wykrycie produktu ekspresji genu PSM metodą Western blot lub przez analizy FACS przy użyciu monoklonalnego przeciwciała 7E11C5.

Przez transfekcję ustalono dwie stabilne, mysie, nowotworowe linie komórkowe niosące związane z błoną ludzkie PSM typu dzikiego. Dokonano tego używając cDNA dla hPSM0.0 subklonowanego do ssaczego wektora ekspresyjnego pcDNA3.1(+) pod kontrolą promotora CMV i zawierającego sekwencję Kozaka powyżej kodonu start.

Uzyskany plazmid wprowadzono przez transfekcję do dwóch różnych mysich linii komórkowych: 79.24.H8 (włókniakomięsaka, pochodząca z Balb/c) i SalN (włókniakomięsak, pochodząca z A/J). Otrzymano odporne na genetycynę hodowle, które poddano analizom typu Western blot i FACS stosując monoklonalne przeciwciała J591 i 7E11C5 anty-hPSM. Stosując przeciwciało J591 komórki były

PL 202 399 B1 sortowane przez kilka rund FACS, aż do uzyskania populacji hPSM dodatnich. Ponownie ekspresja hPSM była weryfikowana przez wewnątrzkomórkowe barwienie FACS przy użyciu przeciwciała 7E11C5. Przez analizę FACS sprawdzono również, że poziomy ekspresji MHC klasy I miały takie same poziomy jak poziomy w rodzicielskich liniach komórkowych.

Hodowle linii komórkowych 79.24.H8 i SalN wyrażających hPSM sklonowano przez ograniczające rozcieńczenie. Uzyskano szereg klonów, które testowano na różne poziomy ekspresji hPSM analizą FACS stosując przeciwciało monoklonalne anty-hPSM J591.

Komórki 79.24.H8 wyrażające hPSM transfekowano genem kodującym B7.1 do zastosowania ich w np. oznaczeniach in vitro w celu monitorowania hPSM specyficznych odpowiedzi CTL i/lub uwalniania interferonu gamma. Komórki sortowano FACS stosując jeden raz surowicę odpornościową anty-B7.1.

Ustalenie hPSM specyficznego mysiego modelu nowotworu

Zdecydowano się ustalić przynajmniej dwa modele nowotworu in vivo u myszach immunokompetentnych celem określenia przeciwnowotworowego działania przeciwciał wzbudzonych w myszach przeciw immunizowanym cząsteczkom hPSM. Będzie to przeprowadzone przez wstrzyknięcie syngenicznej nowotworowej mysiej linii komórkowej zmodyfikowanej tak aby wyrażała na powierzchni błony hPSM typu dzikiego. Użyte będą komórki, które tworzą zlite guzy i/lub komórki, o których wiadomo, że dają przerzuty. W modelu będą użyte linie komórkowe, które mogą być wszczepione do syngenicznej myszy, bez ich odrzucenia spowodowanego obecnością obcej cząsteczki hPSM. Zdolność szczepionek hPSM do wyeliminowania takich komórek nowotworowych będzie wykorzystana do selekcji kandydatów na szczepionki hPSM.

Dla oceny wzrostu komórek Sa1N stransfekowanych ludzkim PSM pełnej długości, różne dawki (2 x 10⁶ i 5 x 10⁶) komórek Sa1N stransfekowanych PSM (S-PSM, 5-krotnie sortowane) wstrzyknięto podskórnie w dolną część prawej strony ciała grupa myszy A/J. Jednakże nie doszło do wytworzenia litychch guzów. Następnie trzy klony komórek S-PSM o różnym poziomie ekspresji hPSM wstrzyknięto podskórnie 3 grupom myszy A/J w dawkach 10⁷ komórek/mysz. Wielkości powstałych guzów mierzono kalibratorem dokonującym pomiaru dwóch różnych średnic, które pomnożono w celu określenia wielkości guza w mm². Wartości te porównano dla trzech grup. W ciągu 3-6 dni u wszystkich myszy rozwinęła się struktura podobna do litego guza, która znów zanikła w ciągu około 15 dni. Prawdopodobnie było to spowodowane obecnością ludzkiego PSM na powierzchni komórki nowotworowej, choć do tej pory nie zostało to potwierdzone. Wzrost komórek Sa1N stransfekowanych jedynie wektorem pcDNA3.1 u myszy trwał nadal w postaci guza litego.

Podobny obraz zaobserwowano u myszy, którym wstrzyknięto 10⁶, 5x10⁶ lub 10⁷ komórek 79.24.H8 stransfekowanych hPSM i sortowanych przez kilka rund z uwagi na ekspresję hPSM. Komórki te (określone 79-PSM) również nie rozwijały się jako nowotwory u myszy Balb/c ani DBA/2. Jednakże, gdy klon komórek79.24.H8, 79-PSM.3 stransfekowany hPSM wstrzyknięto myszom Balb/c lub DBA/2 u myszy tych rozwinęły się struktury podobne do guza litego, które ponownie zanikły w dniach 10-20. Stransfekowane wektorem komórki 79.24.H8 kontynuowały wzrost u myszy Balb/c.

Nadal pozostaje do oceny, czy te „nowotwory” dają się leczyć lub czy może być ustalony lepszy model w oparciu o opisane linie komórkowe S-PSM i 79-PSM i klony.

Wnioski

W pracach nad konstruktami molekularnymi odniesiono sukces w klonowaniu ludzkiego genu PSM i uzyskaniu cDNA dla mysiego PSM. Wytworzono układ w pełni zsekwencjonowanych konstruktów autoszczepionek dla immunogenizowanych hPSM. W E. coli uzyskano ekspresję zmutowanych postaci hPSM jak również różnego rodzaju cząsteczek hPSM typu dzikiego i stwierdzono i potwierdzono, że poziom ekspresji w E. coli jest bardzo niski. Przeciwciała poliklonalne przeciw C-końcowej połowie hPSM wywołano u królików. Podjęto starania, aby zastosować różne znaczniki ekspresyjne (znacznik His i białko fuzyjne wiążące maltozę) jak również układy ekspresji alternatywne dla ciałek inkluzyjnych E. coli. Zrekombinowana typu dzikiego i/lub autoszczepionka hPSM była wykryta w stransfekowanej Pichia pastoris i komórkach ssaka. Poczyniono użyteczne spostrzeżenia dotyczące technologii szczepionki DNA i przeprowadzono wstępne możliwe badania. Doświadczenia ze szczepieniem DNA cząsteczkami autoszczepionki hPSM są w toku i ujawniają obiecujące wyniki wstępne. Przeprowadza się różne oznaczenia in vitro, użyteczne dla testowania i selekcji między zmutowanymi konstruktami PSM, w tym oznaczenia immunochemiczne i analizy FACS. Mysie komórki nowotworowe były stabilnie stransfekowane pełnej długości hPSM typu dzikiego i sortowane przez FACS z uwagi na powierzchniową ekspresję hPSM. Uzyskano klony tych linii komórkowych. Modele in vivo ksenogenicznych nowotworów u myszy oceniono posługując się tymi niosącymi hPSM syngenicznymi koPL 202 399 B1 mórkami mysiego nowotworu. Oznaczenia układu proliferacji komórki T przeprowadzono w celu wyboru mysich szczepów dla modeli nowotworu. Oznaczenia CTL są optymalizowane i uzyskano przekonywujące wyniki dla antygenów modelowych przy pomocy różnych metod immunizacji i warunków oznaczenia. Ponadto określono narzędzia niezbędne do badania przełamywania tolerancji na mysi PSM przez immunizację przeciw mysim autoszczepionkom PSM.

P r z y k ł a d 2

Wytwarzanie autoszczepionki przeciw Her2

Ludzka autoszczepionka przeciw Her2 może być opracowana przez modyfikację cząsteczki przez wbudowanie jednego lub większej ilości mieszanych obcych epitopów dla komórki T celem ujawnienia panelu immunogennych cząsteczek Her2. Te zmodyfikowane białka będą testowane z uwagi na ich zdolność do indukcji przeciwciał, które reagują krzyżowo z natywnymi częściami cząsteczki Her2. Następnie, w kilku oznaczeniach in vitro i w modelach zwierzęcych in vivo, oceniano skuteczność różnych konstruktów (co może mieć miejsce w przypadku szczepienia DNA) i zmodyfikowanych białek. Analizowana będzie indukcja specyficznych odpowiedzi CTL przeciw komórkom nowotworowym zawierającym Her2. Również indukowane przeciwciała będą badane z uwagi na ich zdolność do aktywowania dopełniacza klasyczną drogą i z uwagi na zapoczątkowywanie ADCC za pośrednictwem receptorów Fc. Wreszcie różne zmodyfikowane cząsteczki będą badane w zwierzęcych modelach ludzkiego nowotworu sutka dla sprawdzenia ich wpływu na leczenie nowotworów. Skonstruowane będą immunogenne szczurze i ludzkie cząsteczki z mieszanymi epitopami dla komórki T w różnych miejscach cząsteczki.

W czasie szczepienia przeciw całej zewnątrzkomórkowej domenie Her2 istnieje do pewnego stopnia możliwość wystąpienia reakcji krzyżowej przeciwciał z innymi receptorami EGFr, bowiem pewne z tych receptorów są homologiczne w do 40-46% w obrębie domen zewnątrzkomórkowych. Zatem zakłada się, że konserwowane regiony Her2 będą przerwane przez wprowadzenie obcych dla komórki T epitopów przynajmniej w pewnych zmodyfikowanych białkach (szczegóły poniżej).

Regiony Her2, które potencjalnie mogą być epitopami dla CTL lub komórki B są pominięte w projektowaniu konstruktów, jak to widać na Fig. 3. Racjonalne przesłanki dla użycia tych miejsc są następujące: sekwencja ludzkiego Her2 może być podzielona na kilka domen w oparciu wyłącznie o pierwszorzędową strukturę białka.

Część zewnątrzkomórkowa (receptorowa):

1-173: domena I (N-końcowa domena dojrzałego polipeptydu).

174-323: domena II (domena bogata w cysteinę, 24 reszty cysteiny).

324-483: domena III (domena wiążąca ligand i homologiczna do receptora EGF).

484-623: domena IV (domena bogata w cysteinę, 20 reszt cysteiny).

624-654: domena transbłonowa (reszty TM od 654-675).

Część wewnątrzkomórkowa (kinaza):

655-1010: domena kinazy tyrozynowej (rdzeń domeny TK od 725-992).

1011-1235: domena C-końcowa.

Wyboru miejsc w sekwencji aminokwasowej Her2, które będą zastąpione albo przez ludzkie epitopy P2 albo P30 komórki T pomocniczej dokonano biorąc pod uwagę następująceh parametry bez uwzględnienia stopnia natężenia:

1. Znane i przewidywane epitopy CTL

2. Homologia z pokrewnymi receptorami (w szczególności EGFR).

3. Konserwacja reszt cysteinowych,

4. Przewidywane struktury pętli, spirali-alfa i kartki-beta,

5. Potencjalne miejsca N-glikozylacji,

6. Przewidywane reszty aminokwasowe eksponowane i ukryte.

7. Organizacja domeny.

Epitopy dla CTL wydają się być zgrupowane w domenie I, domenie III i domenie TM i w dwóch lub trzech „gorących punktach” w domenie TK. Zgodnie z wynalazkiem powinny być one w znacznym stopniu konserwowane.

Regiony o wysokim stopniu homologii z innymi receptorami są prawdopodobnie strukturalnie ważne dla „ogólnej” trzeciorzędowej struktury Her2 i skutkiem tego dla rozpoznania przez przeciwciało, podczas gdy regiony o małej homologii prawdopodobnie mogą być wymienione jedynie z miejscowymi zmianami struktury będącymi konsekwencją.

PL 202 399 B1

Reszty cysteiny często uczestniczą w tworzeniu wewnątrzcząsteczkowych mostków disiarczkowych i zatem mają kluczowe znaczenie dla struktury trzeciorzędowej i korzystnie nie powinny być zmieniane.

Regiony, które jak się przypuszcza tworzą struktury α-heliksy lub β-kartki powinny być korzystnie pominięte jako miejsca insercji obcych epitopów, ponieważ regiony te są prawdopodobnie ważne dla fałdowania białka.

Potencjalne miejsca N-glikozylacji korzystnie powinny być również zachowane, ponieważ mannozylacja białka (przykładowo przez ekspresję w drożdżach) jest pożądana, z uwagi na obecność receptorów mannozowych na APC.

Regiony, które jak się przewiduje (z uwagi na ich właściwości hydrofobowe), że są wewnętrzną częścią cząsteczki, korzystnie powinny być zachowane, ponieważ mogą one uczestniczyć w fałdowaniu. Przeciwnie, regiony eksponowane na rozpuszczalnik mogą służyć jako miejsca kandydujące do wprowadzenia modelowych epitopów TH P2 i P30.

Ostatecznie, organizacja domen białka również będzie wzięta pod uwagę, ponieważ ma związek ze strukturą i funkcją białka.

Strategia skupia się na zachowaniu w maksymalnie możliwym stopniu struktury zewnątrzkomórkowej części Her2, ponieważ jest to część białka, która jest odpowiednia jako cel dla zobojętniających przeciwciał. Przeciwnie, wewnątrzkomórkowa część natywnego wiążącego się z błoną Her2 na powierzchni komórek rakowych jest niedostępna dla humoralnego układu immunologicznego.

Stąd, jedynie obecność epitopów dla CTL daje powód do uwzględnienia tej części w szczepionce. Jest zatem oczywiste umieszczenie tu jednego lub większej liczby epitopów. Jeśli okaże się, że niemożliwe jest wyrażenie pełnej długości cząsteczki Her2 w E. coli lub w drożdżach, wewnątrzkomórkowa część mogłoby być skrócona po pierwszym „gorącym punkcie” epitopu CTL (około pozycji 800). Następnie dodatkowe epitopy CTL mogą być dodane do C-końca skróconej cząsteczki.

Region transbłonowy jest prawdopodobnie niezależną jednostką składania i zastąpienie go epitopami TH, takimi jak P2 lub P30 prawdopodobnie nie wpłynie na strukturę i składanie HER2. Ponadto, domena TM mogłoby wywoływać duże problemy z jej ekspresją w drożdżach i coli i powinna być w każdym przypadku podstawiona. Zatem epitop powinien być korzystnie umieszczony we wszystkich konstruktach w tej domenie (być może pozostawiając ją nienaruszoną w konstrukcie 1, bowiem zawiera ona szereg epitopów CTL i ponieważ jest w jakiś sposób włączona w transmisji sygnałów po związaniu ligandu). Zewnątrzkomórkowa domena mogłaby być zasadniczo zachowana w nienaruszonej postaci przez umieszczenie P2 i P30 w domenach wewnątrzkomórkowej i transbłonowej, tym samym maksymalizując liczbę potencjalnych epitopów dla komórki B i zaburzając strukturę tylko w niewielkim stopniu. Jednakże, wysoki stopień homologii z EGFR i Her-3 i Her-4 stwarza niebezpieczeństwo reakcji krzyżowej z tymi receptorami, która może (lub nie) być niepożądana. Dodatkowo, opisane były pewne przeciwciała monoklonalne funkcjonujące jako agoniści receptora (prawdopodobnie przez pobudzanie heterodimeryzacji lub wiązanie ligandu) i zwiększenie wielkości guza in vivo. Zatem, pozycje zewnątrzkomórkowych domen są wybrane, tak iż mamy nadzieję, że ograniczą to ryzyko.

Taka selekcja obejmuje wszystkie wcześniej wspomniane parametry i opiera się na dwóch różnych założeniach (i) wstawienie w niekonserwowanych (względem spokrewnionych receptorów) regionach pomoże utrzymać trzeciorzędową strukturę i może ograniczyć niepożądaną aktywację przeciwciał, (ii) Insercja do dobrze konserwowanych regionów może zmienić strukturę, lecz w tym samym czasie może ograniczyć ryzyko reakcji krzyżowej przez zniszczenie najbardziej pokrewnych sekwencji. Oba założenia są spekulatywne, lecz jest bardzo trudno przewidzieć efekt umieszczenia epitopu w jakiejkolwiek pozycji białka, gdzie niektóre z tych pozycji są włączone w konstrukcję.

Spekulowano, że będzie korzystne całkowite usunięcie dwóch domen bogatych w cysteinę. Przewiduje się, że tworzą one wystawione na rozpuszczalnik struktury pętli i mogą tworzyć niezależne jednostki fałdowania, prawdopodobnie włączone w dimeryzację (jak wykazano dla wielu cystein, które mogą służyć do zachowania sztywnej struktury niezbędnej dla utworzenia domeny dimeryzacyjnej). Dlatego, usunięcie tych struktur może wykluczyć ryzyko aktywacji przez przeciwciała, jak również ograniczyć liczbę przeciwciał reagujących krzyżowo, ponieważ te domeny są najbardziej zachowaną zewnątrzkomórkową częścią białka. Dodatkowo, takie domeny bogate w cysteinę mogą być problematyczne dla wytworzenia w E. coli lub komórkach drożdży.

Szczegóły konstruktów są jak poniżej przy użyciu epitopów P2 i P30 jako przykładów nieograniczających: epitop P2 będzie pierwotnie umieszczony w zewnątrzkomórkowej domenie Her2 w kombinacji

PL 202 399 B1 z epitopem P30 podstawiając część lub cały region łączący błonę. Epitop P2 będzie umieszczony w regionach na podstawie omawianych powyżej kryteriów. Korzystne konstrukty mają następujące struktury:

Nazwa konstruktu	Lokalizacja P2	Lokalizacja P30	Długość
1	2	3	4
hHER2MA2-1A	59-73	632-652	795
hHER2MA2-2A	103-117	632-652	795
hHER2MA2-3A	149-163	632-652	795
hHER2MA2-4A	210-224	632-652	795
hHER2MA2-5A	250-264	632-652	795
hHER2MA2-6A	325-339	632-652	795
hHER2MA2-7A	369-383	632-652	795
hHER2MA2-8A	465-479	632-652	795
hHER2MA2-9A	579-593	632-652	795
hHER2MA2-1B	59-73	661-675	795
hHER2MA2-2B	103-117	661-675	795
hHER2MA2-3B	149-163	661-675	795
hHER2MA2-4B	210-224	661-675	795
hHER2MA2-5B	250-264	661-675	795
hHER2MA2-6B	325-339	661-675	795
hHER2MA2-7B	369-383	661-675	795
hHER2MA2-8B	465-479	661-675	795
hHER2MA2-9B	579-593	661-675	795
hHER2MA2-1Y	59-73	710-730	795
hHER2MA2-2Y	103-117	710-730	795
hHER2MA2-3Y	149-163	710-730	795
hHER2MA2-4Y	210-224	710-730	795
hHER2MA2-5Y	250-264	710-730	795
hHER2MA2-6Y	325-339	710-730	795
hHER2MA2-7Y	369-383	710-730	795
hHER2MA2-8Y	465-479	710-730	795
hHER2MA2-9Y	579-593	710-730	795
hHER2MA2-Z	695-709	710-730	795
hHER2MA2-C	653-667	632-652	795
hHER2MA2-BX	695-709	661-675	795
hHER2MA2-AX	695-709	632-652	795
hHER2MA2-4E	210-224	5-25	795

PL 202 399 B1 cd. tabeli

1	2	3	4
hHER2MA2-6E	325-339	5-25	795
hHER2MA2-8E	465-479	5-25	795
hHER2MA5-4D	210-224	632-652*	666
hHER2MA5-6D	325-339	632-652*	666
hHER2MA5-8D	465-479	632-652*	666
hHER2MA6-C	653-667	632-652	702

Pozycja epitopu wskazuje pozycję pierwszego i ostatniego aminokwasu epitopu względem początku dojrzałego Her2. Długość jest długością w aminokwasach całego konstruktu. We wszystkich konstruktach z wyjątkiem tych, których pozycja podana jest z *, epitopy podstawiają ciągi aminokwasów o długości takiej samej jak epitop. „*” wskazuje, że epitop jest wbudowany a nie zastąpiony w Her2. Wszystkie wymienione powyżej konstrukty są skróconymi wersjami, dojrzałych Her2, gdzie pominięta część pochodzi z C-końca.

Większość konstruktów istnieje w różnych wersjach np. w wektorze pcDNA3.1+ w fuzji z naturalną sekwencją peptydu sygnałowego HER2, w wektorze pMT/BiP/V5-His-A jako fuzja z peptydem liderowym BiP dla ekspresji w komórkach Drosophila i bez sekwencji liderowej w wektorze pET28b dla ekspresji w komórkach E. coli.

Poniżej są opisane modele, które zamierza się stosować w przeszukiwaniu i selekcji zmodyfikowanych białek Her2.

1. Indukcja przeciwciał u transgenicznego szczura Her2, myszy i odpowiednio u królików przeciw szczurzemu i ludzkiemu Her2 będzie badana przy pomocy tradycyjnej technologii ELISA po co najmniej trzech immunizacjach. Jako kontrole dodatnie będą stosowane komercyjnie dostępne przeciwciała przeciw ludzkiemu i szczurzemu Her2.

2. Te królicze przeciwciała będą użyte do badania potencjalnego hamowania wzrostu komórek nowotworowych ludzkich i transgenicznej myszy nadwyrażających Her2 w modelu in vitro.

3. Proliferacja komórki PBL od pacjentów immunizowanych tężcem przeciw wybranym cząsteczkom ludzkiego Her2 będzie badana tradycyjnymi sposobami.

4. Zdolność zmodyfikowanych szczurzych cząsteczek Her2 do indukcji odpowiedzi CTL u myszy transgenicznych szczurzym Her2 będzie badana z zastosowaniem guzów od tych myszy jako celów.

5. Zamiarem jest zsyntetyzowanie wyselekcjonowanego zestawu peptydów w transbłonowym regionie ludzkiego Her2 obejmującego epitopy P2 i P30. Peptydy te będą testowane przez badanie proliferacji PBL od ludzi wcześniej immunizowanych toksoidem tężca, celem określenia, czy epitopy P2 i P30 mogą być skutecznie wydzielone z sekwencji Her2 i prezentowane komórkom T.

6. Jest całkiem możliwe, że brane ludzkie, zmodyfikowane białka Her2 będą badane z uwagi na wytwarzanie neutralizujących przeciwciał u myszy, która została genetycznie skonstruowana, aby wyrażać tylko ludzkie geny VDJ. Taka mysz jest dostępna w ramach współpracy z Abgenix, Fremont, CA, USA.

Opisano cztery dobrze scharakteryzowane transgeniczne modele myszy dla nowotworu sutka, które zawierają szczurzy onkogen Her2. Pierwsze trzy transgeniczne myszy wyrażają aktywowany onkogen Her2, podczas gdy czwarty model wykorzystuje inaktywowany Her2. Wszystkie modele wykorzystują promotor MMTV do kierowania ekspresją w gruczołach mlecznych.

Zdecydowano się wykorzystać dwa transgeniczne modele myszy: 1) bardziej agresywny model nowotworu opisany przez Muller i wsp., wykorzystujący aktywowany onkogen Her2 (Muller i wsp., 1989) i 2) mniej agresywny model nowotworu, w którym użyty jest inaktywowany Her2 do wytworzenia ognisk nowotworów sutka o długiej latencji (Guy i wsp., 1992). Obie transgeniczne myszy nabyto z Jackson i/lub Charles Rivers Laboratories.

W początkowych doświadczeniach myszom tym pozwolono na wytworzenie przeciwciał i odpowiedzi CTL przez immunizację i doszczepianie zmodyfikowanymi szczurzymi białkami Her2. Następnie przypadki guzów będą badane tak, jak opisali to inni (Muller i wsp., 1989, Guy i wsp., 1992; Katsumata i wsp., 1995). Poziomy przeciwciał będą mierzone przez oznaczenie ELISA. Aktywność CTL będzie określona przez wytworzenie komórek docelowych wyrażających, jak to wspomniano, powyżej szczurzy Her2.

PL 202 399 B1

Alternatywnie do doświadczeń ze szczepieniem biernym może być użyty model nagiej myszy z ksenoprzeszczepem raka użyty ze szczepieniem biernym. Nagim myszom może być przeszczepiony ludzki nowotwór, a hamowanie nowotworów może być osiągnięte przez bierne przeniesienie surowicy z normalnych lub humanizowanych myszy immunizowanych zmodyfikowanymi białkami Her2. Choć byłoby to użyteczne w badaniu roli przeciwciała w hamowaniu nowotworów, aktywność CTL nie może być bezpośrednio zmierzona w tym układzie.

W drugim modelu in vivo nowotwory u myszy będą również wytworzone przez przeszczepienie linii komórkowych z opisanych powyżej guzów transgenicznych myszy. Linie komórkowe wytworzone z tych myszy będą przeniesione do odpowiednich szczepów myszy i ich lokalizacja ustalona przy pomocy standardowych protokołów postępowania.

Przeniesienie mysich komórek nowotworowych nadwyrażających szczurzy Her2:

W systemie tym komórki będą transfekowane szczurzymi genami i przeniesione do myszy zgodnych pod względem MHC. Hamowanie wzrostu guza osiągnie się przez wytworzenie odpowiedzi przeciw-Her2.

W systemach tych zmodyfikowane białka Her2 będą użyte jako szczepionki z adiuwantami dla wytworzenia przeciwciał i odpowiedzi CTL.

Szczepionkę DNA zastosowano pomyślnie w kilku układach dla ustalenia skutecznej odpowiedzi immunologicznej. Obecnie bada się sposób dostarczenia DNA przy użyciu zmodyfikowanych białek własnych. Zamierzamy wykorzystać podejście ze szczepieniem DNA w celu określenia działania zmodyfikowanych konstruktów Her2 w hamowaniu nowotworów w transgenicznych modelach mysiego raka sutka. Podobne podejście prawdopodobnie będzie mogło być zastosowane u ludzi dla leczenia tej choroby.

P r z y k ł a d 3

Wytworzenie szczepionki anty-FGF8b

Poniżej będzie opisane jak można wytworzyć ludzką autoszczepionkę przeciw FGF8b w wyniku modyfikacji cząsteczki przez wprowadzenie jednego lub większej ilości mieszanych obcych epitopów komórki T dla ujawnienia panelu immunogenizowanych cząsteczek „FGF8b”. Konstrukty będą badane z uwagi na ich zdolność do indukcji przeciwciał, które są krzyżowo reaktywne z autentycznymi częściami cząsteczki FGF8b. Następnie, w kilku oznaczeniach in vitro i w zwierzęcych modelach in vivo oceniana będzie skuteczność różnych konstruktów. Indukowane przeciwciała będą badane na ich zdolność do aktywowania dopełniacza za pośrednictwem klasycznego szlaku i do zapoczątkowania ADCC przez receptory Fc. Wreszcie, różne cząsteczki będą badane w zwierzęcych modelach ludzkich nowotworów prostaty i sutka.

Konstrukcja autoszczepionki przeciw FGF8b

Z uwagi na pełną identyczność polipeptydów FGF8b mysiego i ludzkiego wszystkie konstrukty mogą być użyte w doświadczeniach zarówno na ludziach jak i myszach. Mieszane epitopy P2 i P30 toksoidu tężca dla komórki T pomocniczej użyte z powodzeniem w szczepionce z ludzkim TNFa będą włączone do polipeptydu FGF8b. Z uwagi na małą wielkość FGF8b konstrukty będą wytworzone z jednym epitopem na cząsteczkę. Inne, mieszane epitopy dla komórki T pomocniczej, takie jak epitop hemaglutyniny grypy HA(307-319) i inne epitopy dla komórki T, które tutaj omówiono, mogą również być wzięte pod uwagę (O'Sullivan 1991).

Sporządzono 4 różne immunogenizowane konstrukty FGF8b z epitopami rozmieszczonymi wzdłuż cząsteczki. Te cztery konstrukty wytworzono na podstawie wielokrotnych i parzystych przyrównań białek z rodziny FGF. Parzyste przyrównanie FGF2 i FGF8b jest użyte jako podstawa dla analizy przypuszczalnej struktury drugorzędowej (np. dystrybucji beta-kartek) wzdłuż cząsteczki FGF8b. Reszty, które są konserwowane między FGF2 i FGF8b nie skupiają się nigdzie na trójwymiarowej strukturze, co wskazuje, że nie ma tam szczególnych regionów cząsteczki, które nie mogą być zastąpione bez działania szkodliwego dla jej zdolności do fałdowania. Reszty aminokwasowe w FGF2, które odpowiadają resztom cysteiny w FGF8b, są zlokalizowane bardzo blisko siebie w trójwymiarowej strukturze, co wskazuje, że tworzą one w FGF8b wiązania disiarczkowe i, że przyrównanie jest prawidłowe. Rozważana była również giętkość N-końcowej części FGF2.

Wariant FGF8b z epitopem P30 w N-końcu (F30N) zaprojektowano na podstawie przyrównania bez przerw reszt aminokwasowych białka FGF8b i epitopu P30 (SEKW ID NR: 14) i oceny różnych pozycji zgodnie z właściwościami chemicznymi każdej reszty aminokwasowej. Rozważany był jedynie region N-końcowy przewidywanej struktury beta-beczki. W przypadku F30N było 9 podobnych z 21 reszt aminokwasowych. Stosując ten pseudoalgorytm oczekuje się, że substytucje dadzą mini62

PL 202 399 B1 malne ogólne zmiany strukturalne. Sekwencje czterech różnych konstruktów, jak również trójwymiarowe reprezentacje zastąpionych aminokwasów pokazano na Fig. 6.

Wariant FGF8b z epitopem P2 (SEKW ID NR: 12) na C-końcu (F2C) był początkowo oznaczony jako F30N. Jednakże jest tam przewidywany dobry epitop Kd w pozycjach 195-203. Dlatego epitop P2 jest wstawiony dopiero na C-końcu tego epitopu. I znów rozważany był jedynie region C-końcowy przewidywanej beta-beczki. Wewnętrzne warianty FGF8b (F30I i F2I) były skonstruowane przez zastąpienie zewnętrznych pętli w strukturze FGF2 odpowiednio epitopami P2 i P30 i w ten sposób strukturalne łańcuchy boczne beta-beczki w strukturze FGF przypuszczalnie pozostaną nie zmienione.

Cząsteczki FGF8b o właściwościach immunogennych wyrażono w Escherichia coli, co umożliwia produkcję białek na wielką skalę przy minimalnych kosztach. Choć FGF8b zawiera dwa potencjalne miejsca N-glikozylacji (Asn 31 i Asn 177), wykazano, że wyrażony w bakteriach zrekombinowany FGF8b jest biologicznie aktywny (MacArthur 1995a, Blunt 1997). Celem przeprowadzenia oczyszczenia i refałdowania warianty FGF8b zostały wytworzone jako wersje ze znacznikiem His, skutkiem tego umożliwiając przyłączenie do kolumny ze związanym Ni.

Oczyszczanie cząsteczek przeprowadzono wykorzystując wysoki dodatni ładunek cząsteczek białka lub znacznika His, a refałdowanie będzie przeprowadzone przy użyciu typowych procedur biorących pod uwagę tworzenie mostków disiarczkowych.

Cztery cząsteczki, którym nadano właściwości immunogenne, były również wraz z cDNA dla FGF8b typu dzikiego wbudowane do wektorów DNA do szczepienia.

Wyszukiwanie i selekcja zmodyfikowanych cząsteczek FGF8b

Cztery cząsteczki FGF8b, którym nadano właściwości immunogenne, wyrażono w bakteriach i następnie oczyszczono z ciałek inkluzyjnych. Równolegle, konstrukty będą użyte jako szczepionki DNA. Różne konstrukty będą następnie porównane z uwagi na ich zdolność do indukcji różnych efektów, które są pożądane w leczeniu pacjentów z rakiem prostaty i rakiem sutka. Takie badania będą przeprowadzone przy użyciu szeregu różnych testów in vitro i in vivo. W końcu, wyniki eksperymentów stworzą podstawę dla końcowej selekcji jednego lub dwóch kandydatów na szczepionkę FGF8b u ludzi.

Modele in vitro

Analizy w układzie mysim

Myszy o różnych haplotypach jak również króliki będą immunizowane różnymi konstruktami FGF8b w kompletnym adiuwancie Freund'a i następnie doszczepiane co najmniej dwukrotnie tym samym antygenem zemulgowanym w niekompletnym adiuwancie Freund'a. Zatem może być porównana zdolność różnych konstruktów do przełamania tolerancji komórki B. Szczepienie DNA będzie przeprowadzone na innych zwierzętach przy użyciu oczyszczonego DNA w kompletnym adiuwancie Freund'a/niekompletnym adiuwancie Freund'a, który wstrzyknie się domięśniowo z czternastodniowymi przerwami.

Próbki surowicy uzyska się w kilku punktach czasowych podczas programu immunizacji, a zdolność różnych konstruktów do indukcji specyficznych przeciwciał na FGF8b będzie określona przy pomocy tradycyjnej metody ELISA (Rochon 1994). Jako kontrole dodatnie będą użyte handlowe poliklonalne surowice odpornościowe jak również dostępne w handlu przeciwciała monoklonalne wzbudzone przeciw FGF8b (R&D). Białko FGF8b jest dostępne w handlu (R&D), lecz będzie również wytworzone z innymi konstruktami FGF8b i następnie oczyszczone/refoldowane. Ten produkt może następnie być użyty do opłaszczania płytek w bezpośrednim teście ELISA dla badania surowicy od myszy/królików immunizowanych wariantami białek FGF8b.

Wartościowym narzędziem dla badania efektów szczepienia przeciw FGF8b będzie rakowa linia komórkowa zależna od FGF8b. W literaturze opisanych jest kilka nowotworowych linii komórkowych dodatnich względem FGF8b, np. MCF-7 lub SC-3. Taka zależna od FGF8b mysia rakowa linia komórkowa będzie zidentyfikowana przy pomocy ilościowej RT-PCR, doświadczeń na proliferację komórek i oznaczeń fosforylacji STAT-3. Obecność FGF8b przyłączonych przez ligację do receptora FGF na powierzchni komórki będzie wykryta przeciwciałami specyficznymi przeciw FGF8b w analizach FACS lub ELISA. Przeciwciała skierowane przeciw kilku różnym receptorom FGF są dostępne w handlu (R&D).

Konstrukty będą porównane odnośnie ich zdolności do indukowania przeciwciał zdolnych do aktywowania lizy dopełniaczem komórek wytwarzających/niosących FGF8b. Można to wykryć w jednej lub większej liczbie linii komórkowych wyrażających FGF8b, które opisano wcześniej lub alternatywnie przy pomocy komórek osmotycznie wypełnionych FGF8b. Surowice od normalnej lub transgenicznej myszy (patrz poniżej) immunizowanej konstruktami ludzkiego FGF8b będą inkubowane z linią komórPL 202 399 B1 kową i następnie inkubowane ze świeżym dopełniaczem świnki morskiej. Liza komórek, w której uczestniczy dopełniacz za pośrednictwem przeciwciał może być wykryta standardowymi procedurami.

Zdolność indukowanych przeciwciał do pośredniczenia w ADCC może być badana przez pomiar uwalniania -51CR z wyznakowanych komórek wyrażających FGF8b. Efektorowymi komórkami będą PBMC od syngenicznej myszy. Dla ustalenia oznaczenia może być dogodne użycie mysiej linii komórkowej zdolnej do pośredniczenia w ADCC (dodatnia dla Fc-receptory) jako komórki efektorowej z przeciwciałami przeciw ludzkiemu FGF8b.

W celu pokazania, że szczepionki - kandydaci FGF8b nie powodują, w żaden sposób wzrostu guza indukowanego autoprzeciwciałem przeprowadzi się również oznaczenie proliferacji nowotworu. Próbki surowicy od immunizowanych myszy będą inkubowane z komórkami nowotworowymi wyrażającymi FGF8b. Następnie proliferacja komórek nowotworowych może być wykryta na podstawie z ich zdolności do wbudowywania 3H-tymidyny, która jest następnie dodana do komórek.

Ponieważ o FGF8b wiadomo, że indukuje proliferację szeregu komórek ssaczych, będzie również konieczne zbadanie działań pobudzających wzrost różnych białek. Można to zrobić przy użyciu testów proliferacji komórek, z których jeden zastosował Marsh 1999.

Działanie biologiczne FGF8b na komórki ssaka powinno być zobojętnione przez autoprzeciwciała. Można to przedstawić przy użyciu zrekombinowanego FGF8b i np. przez badania proliferacji komórki NIH3T3 (i zmian morfologicznych). Dodatkowo, autoprzeciwciała powinny znieść aktywność transformującą FGF8b.

Protokół immunizacji

Liczba zwierząt, które są użyte w doświadczeniu nad immunizacją FGF8b AutoVac, musi zależeć od oczekiwanej penetracji choroby w modelu, a zatem, od liczby zwierząt potrzebnej do uzyskania statystycznie znaczącej informacji. Protokół immunizacji musi opierać się na doświadczeniu, które mamy z projektu TNFa AutoVac. Zastosowano różne protokoły immunizacji do immunizacji myszy różnymi analogami TNFa dla specyficznych celów, lecz większość eksperymentów była przeprowadzona przy użyciu następującego protokołu:

1. Myszy powinny być indywidualnie znaczone albo przez znaczniki na uszach albo transpondery; 10 zwierząt w każdej klatce. Prawdopodobnie, oddzielnie muszą być ocenione samce i samice, lecz w żadnym przypadku samce i samice nie będą znajdowały się w tej klatce. Zwierzęta powinny być pozostawione w celu wypoczynku na co najmniej trzy dni po transporcie i znakowaniu.

2. 1 mg/ml antygenu w buforze PBS zemulgowano z równą objętością kompletnego pełnego adiuwanta Freund'a (CFA) (Difco lub Sigma). Emulsję sprawdza się przez umieszczenie kropli emulsji na powierzchni wody i obserwuje się, czy kropla utrzymuje się, czy rozpływa. Mieszanie prowadzi się aż do momentu, gdy kropla nie rozproszy się.

3. Standardową dawką stosowaną w immunizacji jest 100 μg antygenu w 100 μl objętości plus 100 gl adiuwanta. W ten sposób całkowita dawka immunizacyjna wynosi 200 gl, podana s.c. (podskórnie) w bok zwierzęcia.

4. Doszczepienia są przeprowadzane w 2-3 tygodnie po pierwszej immunizacji i następnie co 2-3 tygodnie. Materiał dla doszczepiania/immunizacji jest sporządzony i podawany dokładnie tak, jak materiał dla immunizacji, ale stosuje się niekompletny adiuwant Freund'a. Prawdopodobnie trzy doszczepienia będą indukowały najwyższe miano. Zatem najwyższe miana uzyska się 6-9 tygodni po pierwszej immunizacji.

5. Skrwawień dokonuje się z oczodołu przy czym zazwyczaj przed pierwszą immunizacją i w tydzień po każdym doszczepieniu pobiera się 50-100 gl. Stosowane może być również skrwawienie z ogona i 10-20 gl może być wystarczające dla określenia miana. Moment początkowy programu immunizacji będzie zależał od rozwoju choroby i strategii, którą chce się przyjąć. Sugeruje się aby początkowo podjąć próbę wywołania maksymalnej immunogenności tak szybko, jak jest to możliwe, ale trudno jest rozpocząć immunizację wcześniej niż w wieku około 5 tygodni. Wtedy najwyższe miana powinny być zachowane skane po doszczepianiu w 6-8 tygodni po trzech pierwszych doszczepieniach. Istnieje potencjalny problem, jeśli FGF8b jest niezbędny dla normalnego rozwoju młodych myszy, a zatem można byłoby uważać, że korzystne jest rozpoczęcie immunizacji później u dorosłych myszy.

Analizy w układzie ludzkim

W selekcji między różnymi konstruktami FGF8b badana będzie zdolność komórek prezentujących ludzki antygen do prezentowania wbudowanych immunogennych epitopów komórek T ludzkim komórkom T. Będzie to przeprowadzone przy użyciu tych samych oznaczeń obróbki in vitro, które użyto dla prezentacji P2 i P30 w szczepionce TNFa. Ludzkie linie komórek T, które są specyficzne dla

PL 202 399 B1

P2 i P30 będą ustalone od dawców zaszczepionych przeciw tężcowi. Komórki prezentujące antygen (PBMC) od tego samego dawcy będą inkubowane z różnymi konstruktami i dodane będą linie komórek T. Poziom prezentacji wstawionych do komórki T epitopów może być następnie porównany przez pomiar pobudzenia linii komórkowych T.

Model zwierzęcy in vivo

Co najmniej trzy różne układy mogą być użyte do monitorowania, czy zaindukowane FGF8b przeciwciała są zdolne do kontrolowania zależnego od FGF8b efektu in vivo. Myszom będą wszczepione mysie komórki nowotworowe wyrażające FGF8 i oznaczony będzie postęp w hamowaniu nowotworów z autoszczepieniem przy użyciu zmodyfikowanych białek FGF8b lub szczepionek DNA FGF8b. Idealny układ wymaga zastosowania komórek izolowanych z mysich nowotworów. Alternatywnie, będą użyte inne, mysie linie komórkowe (np. Balb/3T3) stabilnie stransfekowanego cDNA FGF8b na wektorze ekspresyjnym.

W doświadczeniach z biernym szczepieniem będzie zastosowany mysi model ksenoprzeszczepu raka. Nagim myszom przeszczepi się ludzkie nowotwory i spróbuje się osiągnąć hamowanie nowotworów przez przenoszenie surowicy od myszy zdrowych lub humanizowanych myszy immunizowanych zmodyfikowanymi białkami FGF8b lub szczepionkami DNA FGF8b. Będzie to bardzo przydatne dla badania zdolności wzbudzonych przeciwciał do hamowania nowotworów.

Kolejne podejście dla osiągnięcia potwierdzenia koncepcji będzie obejmowało użycie transgenicznych myszy pod względem FGF8b. Myszy te, które niosą cDNA dla FGF8b, pod kontrolą bardzo specyficznego mysiego promotora z wirusa mysiego nowotworu gruczołu mlecznego (MMTV) pokazały spontaniczny rozwój ssaczych nowotworów wyrażających FGF8b (Coombes informacja ustna). Autoszczepienie tych myszy wariantami białek FGF8b lub szczepionkami DNA FGF8b pozwoliłoby na pokazanie, czy autoszczepionka umożliwi myszy zahamowanie lub odrzucenie nowotworu.

Możliwym podejściem w celu uzyskania potwierdzenia koncepcji byłoby użycie myszy transgenicznych pod względem Wnt-1 (MacArthur 1995c). Doniesiono, że indukcja nowotworu sutka przez wirus MMTV aktywuje ekspresję FGF8 u więcej niż połowy myszy, które rozwinęły nowotwory. Zależność nowotworów od FGF8b można ustalić, jeśli nasza autoszczepionka(i) będzie mogła hamować zasięg lub szybkość wzrostu nowotworów.

Fakt, że transgeniczne myszy często wykazują wzory niefizjologicznej immunologicznej tolerancji, nie będzie najprawdopodobniej wpływał na ten projekt, bowiem polipeptydy FGF8b są identyczne dla człowieka i myszy.

Gdy przedstawiony będzie korzystny efekt immunizacji FGF8b w modelu mysim i wyselekcjonowane będą odpowiednie szczepionki-kandydaci dla człowieka, będzie możliwe przeprowadzenie ograniczonej liczby badań toksykologicznych. Następnie, dla uzyskania końcowego potwierdzenia koncepcji można przeprowadzić badania nad szczepionką na pacjentach z nowotworami sutka i prostaty.

Znaczące jest, że jeśli doświadczenia z użyciem modeli in vivo będą miały dodatni wynik, to w oparciu o dostępne dane skonstruowanych będzie więcej mutantów.

P r z y k ł a d 4

Wytworzenie analogu MUC-1

Wytworzono tylko jedną cząsteczkę dla autoszczepionki AUTOVAC MUC-1. Obejmuje ona w całości dziewięć powtórzeń mucyny, z których każde ma sekwencję SEKW. ID NR:33. Konstrukcja rozpoczyna się od trzech takich sekwencji, po których następuje epitop P2, następnie trzy kolejne sekwencje mucyny, następnie epitop P30 i kończy trzema sekwencjami mucyny.

Konstrukcję wytworzono z i bez N-końcowego znacznika UNI-his (SEKW. ID NR: 23). Oba warianty wyrażono w E. coli. Identyczność wyrażonego białka potwierdzono zarówno przez Western blot jak i sekwencjonowanie N-końca. Białko jest wyrażane w postaci rozpuszczalnej, lecz jako dimer, co jest w jakimś stopniu zaskoczeniem.

Cząsteczkę MUC-1 ze znacznikiem HIS oczyszczono przez chromatografię powinowactwa do metalu. Obecnie nie jest znana całkowita ilość białka i jego czystość.

P r z y k ł a d 5

Przełamywanie autotolerancji w układzie modelu mysiego

Doświadczenia CTL, w których myszy immunizowano komórkami dendrytycznymi, które pulsowano zarówno epitopem klasy I jak i klasy II, wcześniej wykazały zwiększoną indukcję CTL, gdy były immunizowane, jak również gdy były ponownie pobudzane in vitro zarówno peptydem klasy I jak i peptydem klasy II w porównaniu z immunizacją i ponownym pobudzaniem tylko epitopem klasy I. Taka sytuacja jest porównywalna z immunizacją autoszczepionką, gdzie obcy epitop klasy II jest wbuPL 202 399 B1 dowany do własnego białka. Pobieranie i obróbka takich cząsteczek przez komórki wyspecjalizowane w prezentowaniu antygenu, takie jak komórki dendrytyczne, prowadzą do prezentowania obcego epitopu klasy II wraz z pewnymi własnymi epitopami klasy I. Wiadomo, że jest możliwe wywołanie autoreaktywnych CTL ale obecność obcego pomocniczego epitopu klasy II z dużym prawdopodobieństwem powinna wzmocnić tę indukcję CTL. Potencjalna korzyść z niniejszego wynalazku dla indukcji własnych reaktywnych CTL jest obecnie badana w myszach transgenicznych pod względem owalbuminy. Istnieją cztery różne linie transgeniczne o różnych poziomach ekspresji owalbuminy i stanach tolerancji, patrz Kurts C i wsp., 1997, J. Exp. Med. 186: 239-245 ujawniający transgeniczną mysz RIPmOVA (wyrażającą owalbuminę w trzustce, nerce i grasicy i o wysokim stopniu tolerancji) i Kurts C i wsp., 1998, J. Exp. Med. 188: 409-414 ujawniający transgeniczną mysz RIP-OVA^low i RIP-OVA^high o odpowiednio niskiej i wysokiej ekspresji owalbuminy. Ostatnią linię RIP-OVA^int, która wyraża owalbuminę na średnim poziomie, otrzymano od Dr William R. Heath współautora wyżej wspomnianych prac.

W organizmie występuje różny stopień tolerancji na różne antygeny. Najniższy stopień tolerancji stwierdzono względem antygenów krążących w dużych ilościach. Wszystkie te antygeny wnikną do grasicy, gdzie usunięte są autoreaktywne komórki T. Te antygeny podlegają „centralnej tolerancji”. Z drugiej strony antygeny tkankowo specyficzne nie wnikają bezpośrednio do grasicy i ogólnie podlegają „tolerancji obwodowej”, nasilonej przez np. anergię komórek T.

Wytworzono dwa owoalbuminowe konstrukty AutoVac. Oba dotyczą sekwencji o numerze dostępu J00845 w EMBL, gdzie sekwencja z P30 (SEKW ID NR: 14) została wbudowana w dwóch różnych pozycjach.

W konstrukcie „OVA 3.1” P30 jest wbudowany w miejsce, które odpowiada aminokwasom owalbuminy o numerach 272-292. W konstrukcie „OVA 3.2” P30 jest wbudowany w pozycję, która odpowiada w owalbuminie aminokwasom numer 321-341. Konstrukty te zostały wbudowane do wektora pVax1 i użyte do immunizacji DNA.

Myszy immunizowano śródskórnie jednokrotnie 100 μg każdego DNA. Trzy tygodnie po tej immunizacji usunięto śledziony i przeprowadzono oznaczenie CTL przy użyciu komórek docelowych wyrażających dominujący epitop owalbuminy SIINFEKL, gdzie jako kontrolę zastosowano startowy peptyd FILKSINE. Immunizacje spowodowały wyraźną indukcję CTL, jak to oczekiwano w myszach typu dzikiego C57BL/6 bowiem zarówno owalbumina jak i P30 są obce dla tych myszy.

Obecnie zamierzamy immunizować przy pomocy konstruktu AutoVac cztery linie myszy transgenicznych z uwagi na owalbuminę. RIP-OVA^low, RIP-OVA^int, RIP-OVA^high wyrażają rosnące ilości owalbuminy i mają różne stopnie tolerancji, jak to wspomniano powyżej, również RIP-mOVA ma wysoki stopień tolerancji.

U tych czterech linii transgenicznych myszy jedynie P30 będzie obcy. W myszach tych owalbumina jest autoantygenem i taka sytuacja stanowi prawdziwe autoszczepienie dla indukcji CTL przeciw owalbuminie.

Wstępne wyniki uzyskane u myszy RIP-OVA^low, które mają najniższy stopień „tolerancji obwodowej” wobec owoalbuminy, pokazują, że zarówno owalbumina z wbudowanym P30 jak i naturalnie występujące cząsteczki owalbuminy są zdolne do indukcji odpowiedzi CTL - oczekuje się, że transgeniczne myszy o wysokim stopniu tolerancji będą zdolne jedynie do ustalenia odpowiedzi CTL przeciw zmodyfikowanym cząsteczkom owalbuminy, a nie przeciw naturalnie występującym postaciom.

LISTA PUBLIKACJI

Ago H i wsp. (1991). J Biochem (Tokyo), 110, 360-3.

Abdel-Nabi H i wsp. (1992). Sem. Urol. 10, 45-54.

Acevedo i wsp. (1995), Cancer 76; 1467-1475.

Acevedo i wsp.(1997), Cancer Detect. Prev. 21; 295-303.

Adelstein S i wsp. (1991), Science 251: 1223-1225.

Babaian RJ i wsp. (1994), J. Urol 152, 1952-1955.

Barnard JA i wsp. (1995) Gastroenterol. 108(2): 564-580.

Bier H i wsp. (1995), Eur. Arch. Otorhinolaryngol. 252(7): 433-9.

Bouchard L i wsp. (1989), Cell 57(6): 931-36.

Blaber M i wsp. (1996), Biochemistry 35, 2086-94.

Blunt AG i wsp. (1997), J Biol Chem 272, 3733-8.

Boring CC i wsp. (1993), CA Cancer J. Clin. 43: 7-26.

Boucher i wsp. (1995), Hum. Pathol. 26; 1201-1206.

PL 202 399 B1

Callahan R (1996), Breast Cancer Res Treat, 39, 33-44.

Carter RE (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93, 749-753

Chang i wsp., (1981), Fertil. Steril. 36; 659-663.

Chantry A, 1995, J-Biol. Chem. 270(7): 3068-73.

Crossley PH i wsp. (1996b), Cell, 84, 127-36.

Crossley PH i wsp. (1995), Development, 121, 439-51.

Crossley PH, Martinez, S. i Martin, G.R. (1996a) Midbrain development induced by FGF8 in the chick embryo. Nature, 380, 66-8.

Dean C i wsp. (1994), Int. J. Cancer, suppl 8: 103-107.

Dillioglugil O i wsp. (1995), Eur. Urol. 28, 85-101.

Doi i wsp. (1996), Int. J. Cancer 65; 454-459.

Douglas TH i wsp. (1995), J. Surg. Oncol. 59(4), 246-250.

Earp HS i wsp. (1995), Breast Cancer Res. Treat. 35(1): 115-32.

Eccles SA (1994), Invasion Metastasis 14 (1-6): 337-48.

Eppenberger U i wsp. (1994),. J. Neurooncol. 22(3): 249-54.

Dorkin TJ i wsp. (1999), Oncogene 18: 2755-2761.

Eriksson AE i wsp. (1993), Protein. Sci. 2: 1274-84.

Ferniez-Teran M. i wsp. (1997), Dev. Biol. 189, 246-55.

Fujii K i wsp. (1995), Exp. Cell. Res. 216(1): 261-72.

Furst J i wsp. (1994), Urol. Res. 22, 107-113.

Furthauer M i wsp. (1997), Development 124: 4253-64.

Geissler i wsp. (1997), Lab. Invest. 76: 859-871.

Gemel J i wsp. (1996), Genomics 35: 253-7.

Ghosh AK i wsp. (1996), Celi Growth Differ 7: 1425-34.

Goldfarb M i wsp. (1996), Cytokine Growth Factor Rev 7: 311-25.

Goodnow CC i wsp. (1988), Nature 334: 676-682.

Goodnow CC i wsp. (1991), Nature 352: 532-536.

Greenberg NM i wsp. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3439-3443.

Guy CT i wsp. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci, USA 89: 10578-10582.

Heikinheimo M i wsp. (1994),. Mech Dev, 48: 129-38.

Henttu P i Vihko P (1989), Bioch. Biophys. Res. Comm. 160: 903-910.

Hopp TP i Woods KR (1983), Mol. Immunol. 20: 483-9.

Horoszewicz JSH i wsp. (1983), Cancer Res. 43: 1803-1818.

Horoszewicz JSH i wsp. (1987), Anticancer Res. 7: 927-936.

Hoshikawa M i wsp. (1998), Biochem Biophys Res Commun. 244: 187-91.

Husmann I i wsp. (1996), Cytokine Growth Factor Rev 7: 249-58.

Israeli RS i wsp. (1994), Cancer Res. 54: 1807-1811.

Israeli RS i wsp. (1993), Cancer Res. 53: 227-230.

Israeli RS i wsp. (1994), Cancer Res. 54: 6306-6310.

Jacoby i wsp. (1984), Adv. Immunol. 35: 157-208.

Johnson RL i Tabin CJ (1997), Cell 90: 979-90.

Kahn D i wsp. (1994), J. Urol. 152: 1490-1495.

Kapoun AM i Shackleford GM (1997), Oncogene 14: 2985-9.

Kettunen P i Thesleff I (1998), Dev Dyn 211: 256-68.

Koga M i wsp. (1995), J Steroid Biochem Mol Biol 54: 1-6.

Kouhara H i wsp., (1994), Oncogene 9: 455-62.

Kozak M (1991), J Cell Biol 115: 887-903.

Lapthorn i wsp. (1994), Nature 369: 455-461.

Lazar i wsp. (1995), Cancer Res. 55: 3735-3738.

Leek i i wsp. (1995), British Journal of Cancer 72: 583-588.

Leung HY i wsp. (1996), Oncogene 12: 1833-5.

Lopes AD (1990), Cancer Res. 50: 6423-6429.

Loric S i wsp. (1995), Clin.Chem. 41(12): 1698-1704.

Lupu R I wsp. (1995), Semin. Cancer. Biol. 6: 135-145.

MacArthur CA i wsp. (1995a), Cell Growth Differ 6: 817-25.

MacArthur CA i wsp. (1995b), Development 121: 3603-13.

PL 202 399 B1

MacArthur CA i wsp. (1995c), J Virol 69: 2501-7.

Manabe i wsp. (1985), Gastroenterology 89: 1319-1325.

Marsh SK i wsp. (1999), Oncogene 18, 1053-1060.

Martin L i wsp. (1993), J. Immunol. 150(49): 1234-43.

Mattei MG i wsp. (1995), Mamm Genome 6: 196-7.

McDonnell WM i Askari FD (1996), New Engl. J. Med 334: 4245.

Meyers EN i wsp. (1998), Nat Genet 18: 136-41.

Milich DR i wsp. (1994), J. Immunol. 153(1): 429-435.

Milner PG i wsp. (1989), Biochem Biophys Res Commun 165: 1096-103.

Miyashita Y i wsp. (1994), Jpn J Cancer Res 85: 1117-23.

Modjtahedi H i wsp. (1993a), Br. J. Cancer 67(2): 254-261.

Modjtahedi H i wsp. (1993b), Cell. Biophys. 22(1-3): 129-46.

Modjtahedi H i wsp. (1996), Br. J. Cancer 73(2): 228-35.

Moy FJ i wsp. (1996), Biochemistry, 35: 13552-13561.

Muller WJ i wsp. (1988), Cell 54(1): 105-115.

Murphy GP i wsp. (1996), Prostate 28: 266-271.

Murphy GP i wsp. (1995), Prostate 26: 164-168.

Murphy GP i wsp. (1995), Anticancer Research 15(4): 1473-1379.

Nguyen L i wsp. (1990), Clin. Chem. 35: 1450-1455.

Nonomura N i wsp. (1990), Cancer Res 50: 2316-21.

O*Sullivan D i wsp. (1991), J. Immunology 147: 2663-9.

Ohnishi Y i wsp. (1995), Br. J. Cancer 71(5): 969-73.

Chuchi H i wsp. (1997a), Development 124: 2235-44.

Ohuchi H i wsp. (1997b), Mech Dev 62: 3-13.

Ohuchi H i wsp. (1994), Biochem Biophys Res Commun 204: 882-8.

Payson RA i wsp. (1996), Oncogene 13: 47-53.

Pillai i wsp. (1996), FEBS Lett. 387: 23-26.

Pollard M i Luckert PH (1994), Anticancer Res. 14: 901-903.

Prigent SA i Lemoine NR (1992), Progress in Growth Factor Research 4: 1-24.

R&D focus, Drug News, (1996) 5, 21, 9.

Rammensee H-G. i wsp. (1995), Immunogenetics 41: 178-228.

Regelson W (1995), Cancer 76: 1299-1301.

Ries LAG i wsp. (1996), SEER Cancer Statistics Review, 1973-1993: Tables i Graphs, National Cancer Institute, Bethesda, MD.

Rinker-Schaeffer CW i wsp. (1995), Genomics, 30(1): 105-108.

Rochon YP i wsp. (1994), Prostate 25: 219-223.

Rock KL i wsp. (1996), Vaccine 14: 1560-1568.

Rock KL i Clark K (1996), J. Immunol. 156: 3721-3726.

Rudra-Ganguly N i wsp. (1998), Oncogene 16: 1487-92.

Salomon DS i wsp. (1995), Critical reviews in Oncology/Hematology 19: 183-232.

Sato B i wsp. (1993), J Steroid Biochem Mol Biol 47: 91-8.

Schlegel J i wsp. (1994), J. Neurooncol. 22(3): 249-54.

Schmitt JF i wsp. (1996), J Steroid Biochem Mol Biol 57: 173-8.

Sheaff i wsp. (1996), J. Clin. Pathol. 49: 329-332.

Sherman L i wsp. (1998), Genes Dev 12: 1058-71.

Shimamura K i Rubenstein JL (1997), Development 124: 2709-18.

Shirai A i Klinman DM (1993), AIDS Res. Hum. Retroviruses 9, 979-963.

Sokoloff M i wsp. (1996), Cancer 77(9): 1862-1872.

Steinhoff U i wsp. (1994), Eur. J. Immunol. 24(3): 773-76.

Stevens VC (1986), Ciba Found. Symp. 119: 200-225.

Su SL i wsp. (1995), Cancer Res. 55: 1441-1443.

Syrigos i wsp. (1998), Gut 42: 88-91.

Talwar i wsp. (1976), PNAS 73: 218-222.

Talwar i wsp. (1994), PNAS 91: 8532-8536.

Tana a A i wsp. (1992), Proc Natl Acad Sci USA 89: 8928-32.

Tanaka A i wsp. (1998), Cancer Research 58: 2053-56.

PL 202 399 B1

Tanaka A i wsp. (1995), FEBS Lett 363: 226-30.

Thomas H i wsp. (1996), Br. J. Cancer, 73(1): 65-72.

Tjoa B i wsp. (1996), Prostate 28: 65-69.

Tjoa B i wsp. (1995), Prostate 27: 63-69.

Tokunaga A i wsp., (1995), Cancer 75 (6 suppl.): 1418-25.

Tosi E i wsp. (1995), Int. J. Cancer 62(5):643-50.

Triozzi i wsp. (1994), Int. J. Onc. 5: 1447-1453.

Troyer JK i wsp. (1995), Int. J Cancer 62: 552-558.

Valone FH i wsp. (1955), J. Clin. Oncol. 13(9): 2281-92.

Valve E i wsp. (1997), Biochem Biophys Res Commun 232: 173-7. van Dam PA i wsp. J. Clin. Pathol. 1994 47(10): 914-19.

Weiner LM i wsp. (1995), Cancer Res. 55(20): 4586-4593.

Wright GL Jr i wsp. (1996), Urology 48: 326-334.

Wu J i wsp. (1997), J Steroid BiochiBm Mol Biol 62: 1-10.

Wu X i wsp., Fan, Z., Masui, H., Rosen, N., Mendelsohn, J. Apoptosis induced by an anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody in a human colorectal carcinoma cell line and its delay by insulin.

Wynant GE i wsp. (1991), Prostate 18: 229-241.

Xu X i wsp. (1998), Development 125: 753-65.

Yamanishi H i wsp. (1995), i Steroid Biochem Mol Biol 52: 49-53.

Yogeeswaran i Salk (1981), Science 212: 1514-1516.

Yokoyama H i wsp. (1998), Dev Biol 196: 1-10.

YoshimuraK I wsp. (1996), Cancer Lett 103: 91-7.

Yoshiura K i wsp. (1997), Am J Med Genet 72: 354-62.

Young RA i Davis RW (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 1194-1198.

Yule TD (1993), J. Immunol. 151(6): 3057-3069.

Zhang JD i wsp. (1991), [published erratum appears in Proc Natl Acad Sci USA 88(12): 5477], Proc Natl Acad Sci USA 88, 3446-50.

Zhu Z i wsp. (1995), Int. J. Cancer 62(3): 319-324.

ZhuX i wsp. (1991), Science 251: 90-3.

PL 202 399 B1

LISTA SEKWENCJI <110> M&E Biotech A/S STEINAA, Lucilla NIELSEN, Klaus Gregorius DALUM, iben HAANING, Jesper LEACH, Dana BIRK, Peter MOURITSEN, Soren GAUTAM, Anand KARLSSON, Gunilla < 12 o > Nowe sposoby leczniczego szczepienia <130> 22113 PC 1 <14 0 < 1 4 1 >

<160> 33 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 ' <211> 2253 ' <212> DNA <213> Homo sapiens <220> .

<221> CDS <222> (1) . . (2253) <220>

<22i> misc_feature <222> (58)..(2253) <22?> ludzki PSM' <220>

<22±> misc feature

<22

2> (

4 ) , .

(6)

<22

3 ggt albo

tgg

koduj ą

,ce,

odpowi

edn

io, Gly al

bo 1

Trp

<40

0> 1

atg

ggt

aat

ctc

ctt

cac

gaa

acc

gac

teg

get

gtg gcc

acc

gcg

cgc

4 8

Ket

Giy

Asn

Leu

Leu

His

Glu

Thr

Asp

Ser-

Ala

Val Ala

Thr

Ala

Arg

1

5

io

15

cgc

ccg

cgc

tgg

ctg

tgc

get

ggg

gcg

ctg

gtg

ctg gcg

ggt

ggc

ttc

96

Arg

Pro

Arg

Trp

Leu

Cys

Ala

Gly

Ala

Leu

Val

Leu Ala

Gly

Gly

Phe

2 0

25

30

tct

ctc

Ctc

ggc

ttc

ct c

ttc

ggg

tgg

ttt

ata

aaa tcc

tcc

aat

gaa

144

Phe

Leu

Leu

Gly

Phe

Leu

Phe

Gly

Trp

Phe

Xlc

Lys Ser

Ser

Asn

Glu

35

40

45

get

act

ci 5 C

aLL

act

cca

aag

cat

aat

atg

□ da

gca ttt

ttg

gat

gaa

192

A.) a

Thr

Asn

Ile

Thr

Prc

Lys

His

Asn

Met

Lys

Ala Phe

Leu

Asp

Glu

5 0

55

50

11: g

= JC:

je:

gag

aac

□ te-

aag

¢3 α g

:: t c

t ta

“ ά

a .j t : 11

la C

2 1 0

Leu

Lys

A1 a

Glu

Asn

lle

Lys

Lys

Phe

Leu

Tyr

Ast. Phe

Thr

Gin

i '

bu

10

'7 Γ,

ci 0

cca

cat

tta

gca

gga

aca

gaa

caa

aac

ttt

cag

ctt gca

aag

caa

att

288

PL 202 399 B1

Pro

His

Leu

Ala

Gly 85

Thr

Glu

Gin

Asn

Phe 90

Gin

Leu

Ala

Lys

Gin 95

Ile

caa

tcc

cag

tgg

aaa

gaa

ttt

ggc

ctg

gat

tct

gtt

gag

eta

gca

cat

336

Gin

Ser

Gin

Trp 100

Lys

Glu

Phe

Gly

Leu 105

Asp

Ser

' Val

Glu

Leu 110

Ala

His

tat

gat

gtc

ctg

ttg

tcc

tac

cca

aat

aag

act

cat

ccc

aac

tac

atc

384

Tyr

Asp

Val 115

Leu

Leu

Ser

Tyr

Pro 120

Asn

Lys

Thr

His

Pro 125

Asn

Tyr

Ile

tea

ata

att

aat

gaa

gat

gga

aat

gag

att

ttc

aac

aca

tea

tta

ttt

432

Ser

Ile 130

Ile

Asn

Glu

Asp

Gly 135

Asn

Glu

Ile

Phe

Asn 140

Thr

Ser

Leu

Phe

gaa

cca

cct

cct

cca

gga

tat

gaa

aat

gtt

teg

gat

att

gta

cca

cct

480

Glu 145

Pro

Pro

Pro

Pro

Gly 150

Tyr

Glu

Asn

Val

Ser 155

Asp

Ile

Val

Pro

Pro 160

ttc

agt

get

ttc

tct

cct

caa

gga

atg

cca

gag

ggc

gat

eta

gtg

tat

528

Phe

Ser

Ala

Phe

Ser 165

Pro

Gir.

Gly

Met

Pro 170

Glu

Gly

Asp

Leu

Val 17 5

Tyr

gtt

aac

tat

gca

ega

act

gaa

gac

ttc

ttt

aaa

ttg

gaa

cgg

gac

atg

576

Val

Asn

- y'r

Al a 180

Arg

Tur

Glu

Asp

Phe 185

Phe

Lys

Leu

Glu

Arg 190

Asp

Met

aaa

a t c

aat

tgc

tct

ggg

aaa

att

gta

at t.

gee

aga

T £ t

ggg

aaa

gtt

624

Lys

Ile

Asn 195

Cys

Ser

Gly

Lys

Ile 200

Val

Ile

Ala

Arg

Tyr 205

Gly

Lys

Val

ttc

aga

gga

aat

aag

gtt

aaa

aat

gee

cag

ctg

gca

ggg

gee

aaa

gga

672

Phe

Arg 210

Gly

Asn

Lys

Val

Lys 215

Asn

Ala

Gin

Leu

Ala 220

Gly

Ala

Lys

Gly

gtc

att

ctc

tac

tcc

gac

cct

get

gac

tac

ttt

get

cct

ggg

gtg

aag

720

Val 225

Ile

Leu

Tyr

Ser

Asp 230

Pro

Ala

Asp

Tyr

Phe 235

Ala

Pro

Gly

Val

Lys 240

tcc

tat

cca

gat

ggt

tgg

aat

ctt

cct

gga

ggt

ggt

gtc

cag

cgt

gga

768

Ser

Tyr

Pro

Asp

Gly 245

Trp

Asn

Leu

Pro

Gly 250

Gly

Gly

Val

Gin

Arg 255

Gly

aat

atc

eta

aat

ctg

aat

ggt

gca

gga

gac

cct

ctc

aca

cca

ggt

tac

816

Asn

Ile

Leu

Asn 260

Leu

Asn

Gly

Ala

Gly 265

Asp

Pro

Leu

Thr

Pro 210

Gly

Tyr

cca

gca

aat

gaa

tat

get

tat

agg

cgt

gga

att

gca

gag

get

gtt

ggt

864

Pro

Ala

Asn 275

Glu

Tyr

Ala

Tyr

Arg 280

Arg

Gly

Ile

Ala

Glu 285

Ala

Val

Gly

ctt

cca

agt

att

cct

gtt

cat

cca

att

gga

tac

tat

gat

gca

cag

aag

912

Leu

Pro 290

Ser

Ile

Pro

Val

His 295

Pro

Tle

Gly

Tyr

Tyr 300

Asp

Ala

Gin

Lys

ctc

eta

gaa

aaa

atg

ggt

ggc

tea

gca

cca

cca

gat

agc

agc

tgg

aga

960

Leu 305

Leu

Glu

Lys

Met

Gly 310

Gly

Ser

Ala

Pro

Pro 315

Asp

Ser

Ser

Trp

Arg 320

gga 1008

agt

ctc

aaa

gtg

ccc

tac

aat

gtt

gga

cct

ggc

ttt

act

gga

aac

Gly

Ser

Leu

Lys

Val 325

Pro

Tyr

Asn

Val

Gly 330

Pro

Gly

Phe

Thr

Gly 335

Asn

ttt

tct

aca

caa

aaa

gtc

aag

atg

cac

atc

cac

tct

acc

aat

gaa

gtg

1056

PL 202 399 B1

Phe Ser

Thr

Gin

Lys

Val

Lys

Met

His

Ile

His

Ser

Thr

Asn

Glu

Val

340

345

350

aca aga 1104

att

tac

aat

gtg

ata

ggt

act

ctc

aga

gga

gca

gtg

gaa

cca

Thr Arg

Ile

Tyr

Asn

Val

Ile

Gly

Thr

Leu

Arg

Gly

Ala

Val

Glu

Pro

355

360

365

gac aga 1152

tat

gtc

att

ctg

gga

ggt

cac

cgg

gac

tca

tgg

gtg

ttt

ggt

Asp Arg

Tyr

Val

Ile

Leu

Gly

Gly

His

Arg

Asp

Ser

Trp

Val

Phe

Gly

370

375

380

ggt att 1200

gac

cct

cag

agt

gga

gca

gct

gtt

gtt

ca t

gaa

att

gtg

agg

Gly Ile

Asp

Pro

Gin

Ser

Gly

Ala

Ala

Val

Val

His

Glu

Ile

Val

Arg

385

390

395

400

agc ttt 1248

gga

aca

ctg

aaa

aag

gaa

ggg

tgg

aga

cct

aga

aga

aca-

att

Ser Phe

Gly

Thr

Leu

Lys

Lys

Glu

Gly

Trp

Arg

Pro

Arg

Arg

Thr

Ile

405

410

415

ttg ttt 1296

gca

agc

tgg

gat

gca

gaa

gaa

ttt

ggt

ctt

ctt

ggt

tct

act·

Leu Phe

Ala

Ser

Trp

Asp

Ala

Glu

Glu

Phe

Gly

Leu

Leu

Gly

Ser

Thr

420

425

430

gag tgg 1344

gca

gag

gag

aat

tca

aga

ctc

Ctt

caa

gag

cgt

ggc

gtg

gct

Glu Trp

Ala

Glu

Glu

Asn

Ser

Arg

Leu

Leu

Gin

Glu

Arg

Gly

Val

Ala

435

440

4 4 5

tat att

aat

gct

gac

r ca

t ct

ata

gaa

gga

3. d C

tac

act

erg

aga

gtt

1392 ' Tyr Ile

Asn

Ala

Asp

Ser

Ser

Ile

Glu

Gly

Asn

Tyr

Thr

Leu

Arg

Val

450

455

4 60

gat tgt 1440

aca

ccg

ctg

atg

tac

agc

ttg

gta

cac

aac

eta

aca

aaa

gag Glu

Asp Cys

Thr

Pro

Leu

Met

Tyr

Ser

Leu

Val

His

Asn

Leu

Thr

Lys

4 6 5

470

475

480

ctg aaa 1488

agc

cct

gat

gaa

ggc

ttt

gaa

ggc

aaa

tct

ctt

tat

gaa

agt

Leu Lys

Ser

Pro

Asp

Glu

Gly

Phe

Glu

Gly

Lys

Ser

Leu

Tyr

Glu

Ser

485

490

495

tgg act 1536

aaa

aaa

agt

cct

tcc

cca

gag

ttc

agt

ggc

atg

ccc

agg

ata

Trp Thr

Lys

Lys

Ser

Pro

Ser

Pro

Glu'

Phe

Ser

Gly

Met

Pro

Arg

Ile

500

5 0 5

510

agć aaa 1584

ttg

gga

t ct

gga

aat

gat

ttt

gag

gtg

ttc

t Lc

Cćia

ega

ctt

Ser Lys

Leu

Gly

Ser

Gly

Asn

Asp

Phe

Glu

Val

Phe

Phe

Gin

Arg

Leu

515

520

525

gga att 16 3 2

gct

tca

ggc

aga

gca

cgq

tat

act

aaa

aat

tgg

gaa

aca

Gly Ile

Ala

Ser

Gly

Arg

Ala

Arg

Tyr

Thr

Lys

Asn

Trp

Glu

Thr

Asn

530

535

540

aaa ttc

agc

ggc

tat

cca

ctg

tat

cac

agt

gtc

tat

gaa

aca

tat

gag

1680 Lys Phe

Ser

Gly

Tyr

Pro

Leu

Tyr

His

Ser

Val

Tyr

Glu

Thr

Tyr

Glu

PL 202 399 B1

545

550

555

560

ttg gtg 1728

gaa

aag

ttt

tat

gat

cca

atg

ttt

aaa

tat

cac

ctc

act

gtg

Leu Val

Glu

Lys

Phe

Tyr

Asp

Pro

Met

Phe

Lys

Tyr

His

Leu

Thr

fal

565

570

575

gcc cag 1776

gtt

ega

gga

ggg

atg

gtg

ttt

gag

eta

gcc

aat

tcc

ata

gtg

Ala Gin

Val

Arg

Gly

Gly

Met

Val

Phe

Glu

Leu

Ala

Asn

Ser

Ile

Val

580

585

590

ctc cct Γ824

ttt

gat

tgt

ega

gat

tat

gct

gta

gtt

tta

aga

aag

tat

gct

Leu Pro

Phe

Asp

Cys

Arg

Asp

Tyr

Ala

Val

Val

Leu

Arg

Lys

Tyr

Ala

595

600'

605

gac aaa 1872

atc

tac

agt

att

tct

atg

aaa

cat

CC5

cag

gaa

atg

aag

aca

Asp Lys

Ile

Tyr

Ser

ile

Ser

Met

Lys

H i s

Pro

Gin

Glu

Met

Lys

T h r

610

615

620

tac agt 1920

gta

tea

ttt

gat

tea

ctt

ttt

tet

gca

gta

aag

aat

ttt

aca

Tyr Ser

Val

Ser

Phe

Asp

Ser

Leu

Phe

Ser

Ala

V a 1

Lys

Asn

Phe

Thr

625

630

635

640

gaa att 1968

gct

tcc

aag

ttc

agt

gag

aga

ctc

cag

gac

ttt

gac

aaa

age

Glu Ile

Ala

Ser

Lys

Phe

Ser

Glu

Arg

Leu

Gin

Asp

Phe

Asp

Lys

Ser

645

650

555

aac cca

ata

gta

tta

aga

atg

atg

aat.

gat

c a a

ctc

atg

ttt

ctg

gaa

2016 Asn Pro

Ile

Val

Leu

Arg

Met

Mer

Asn

Asp

Gin

Leu

Met

Phe

Leu

Glu

660

665

670

aga gca 20 6 4

ttt

att

gat

cca

tta

ggg

tta

cca

gac

agg

ccc

ttt

tat

agg

Arg .Ala

Phe

Ile

As p

Fro

Leu

Gly

Leu

Pro

Asp

Arg

Pro

Fhe

Tyr

Arg

675

680

685

cat gtc 2112

atc

tat

gct

cca

age

age

cac

aac

aag

rat

gca

ggg

gag

tea

His Val

Ile

Tyr

Ala

Pro

Ser

Ser

His

Asn

Lys

Tyr

Ala

dy

Glu

Ser

690

695

700

ttc cca 2160

gga

att

tat

gat

gct

ctg

ttt

gat

att

gaa

age

aaa

gtg

gac

Phe Pro

Gly

Ile

Tyr

Asp

Ala

Leu

Phe

Asp

Ile

Glu

Ser

Lys

Val

Asp

705

710

715

720

cct tcc 2 2 08

aag

gcc

tgg

gga

gaa

gtg

aag

aga

cag

att

tat

gtt

gca

gcc

Pro Ser

Lys

Ala

Trp

Gly

Glu

Val

Lys

Arg

Gin

Ile

Tyr

Val

Ala

Ala

725

730

7 35

11 c a c a

gtg

cag

gca

gct

gag

act

-tg

agt

ci a a

gta

gcc

t aa

2253 Phe Thr

Val

Gin

Ala

Ala

Ala

Glu

Thr

Leu

Sec

G i u

fal

A i a

740

;; 4 5

7 50

<210> 2 <211> 750 <212> PRT

PL 202 399 B1 <213> Homo sapiens <400 2

Met 1

Gly

Asn

Leu

Leu 5

His

Glu

Thr

Asp

Ser 10

Al a

Val

Ala

Thr

Ala 15

Arg

Arg

Pro

Arg

Trp

Leu

Cys

Ala

Gly

Ala

Leu

Val

Leu

Ala

Gly

Gly

Phe

20

25

30

Phe

Leu

Leu

Gly

Phe

Leu

Phe

Gly

Trp

Phe

Ile

Lys

Ser

Ser

Asn

Glu

35

40

45

Ala

Thr

Asn

Ile

Thr

Pro

Lys

His

Asn

Met

Lys

Ala

Phe

Leu

Asp

Glu

50

55

60

Leu

Lys

Ala

Glu

Asn

Ile

Lys

Lys

Phe

Leu

Tyr

Asn

Phe

Thr

Gin

He

65

70

75

80

Pro

His

Leu

Ala

Gly

Thr

Glu

Gin

Asn

Phe

Gin

Leu

Ala

Lys

Gin

Tle

85

90

95

Gin

Ser

Gin

Trp

Lys

Glu

Phe

Giy

Leu

Asp

Ser

Val

Glu

Leu

/Ai. ćł

His

100

105

110

Tyr

Asp

Val

Leu

Leu

Ser

Tyr

Pro

Asn

Lys

Thr

His

Pro

Asn

Tyr

He

115

120

125

Ser

He

Ile

Asn

Glu

Asp

Gly

Asn

Glu

Ile

Phe

Asn

Thr

Ser

Leu

Phe

130

135

140

Glu

Pro

Pro

Pro

Pro

dy

Tyr

Glu

Asn

Val

Ser

Asp

Ile

Val

Pro

Pro

145

150

155

160

Phe

Ser

Ala

Phe

Ser

Pro

Gin

Gly

Met

Pro

Glu

Gly

Asp

Len

Val

Tyr

165

170

175

Val

Asn

Tyr

Ala

Arg

Thr

Glu

Asp

Phe

Phe

Lys

Leu

Glu

Arg

Asp

Met

180

185

190

Lys

Ile

Asn

Cys

Ser

Gly

Lys

Ile

Val

Ile

Ala

Arg

Tyr

Gly

Lys

Val

195

200

205

Phe

Arg

Gly

Asn

Lys

Val

Lys

Asn

Ala

Gin

Leu

Ala

Gly

Ala

Lys

Gly

210

215

220

Vai

Ile

Leu

Tyr

Ser

Asp

Pro

Ara

Asp

Tyr

Phe

A_l 6

Pro

Gly

Vai

Lys

225

230

2 33

2 4 0

Ser

Tyr

Pro

Asp

Gly

Trp

Asn

Leu

Pro

Gly

Gly

Gly

Val

Gin

Arg

Gly

245

250

255

Asn

Ile

Leu

Asn

Leu

Asn

Gly

Ala

Gly

Asp

Pro

Leu

Thr

Pro

Gly

Tyr

260

265

270

Pro

Ala

Asn

Glu

Tyr

Ala

Tyr

Arg

Arg

Gly

He

Ala

Glu

Ala

Val

Giy

275

280

285

Leu

Pro

Ser

Ile

Pro

Val

His

Pro

Ile

Gly

Tyr

Tyr

Asp

Ala

Gin

Lys

290

295

300

Leu

Leu

Glu

Lys

Met

Gly

Giy

Ser

Ala

Pro

Pro

Asp

Ser

Ser

Trp

Arg

305

310

315

320

G u. y

Se r

Leu

Lys

Val

Pro

Tyr

Asr.

Val

Gly

Prc

Gly

Phe

Thr

Gly

Asn

325

330

335

PL 202 399 B1

Phe

Ser

Thr

Gin 340

Lys

Val

Lys

Met

His 345

Ile

His

Ser

Thr

Asn .350

Glu

Val

Thr

Arg

Ile

Tyr

Asn

Val

Ile

Gly

Thr

Leu

Arg

Gly

Ala

Val

Glu

Pro

355

360

365

Asp

Arg

Tyr

val

Ile

Leu

Gly

Gly

His

Arg

Asp

Ser

Trp

Val

Phe

Gly

370

375

380

Gly

Tle

Asp

Pro

Gin

Ser

Gly

Aid

Ala

Val

Vai

His

Glu

Ile

Va l

Arg

385

390

395

400

Ser

Phe

Gly

Thr

Leu

Lys

Lys

Glu

Gly

Trp

Arg

Pro

Arg

Arg

Thr

Ile

405

410

415

Leu

Phe

Ala

Ser

Trp

ASp

Ala

Glu

Glu

Phe

Gly

Leu

Leu

Gly

Ser

Thr

420

425

430

Glu

Trp

Ala

Glu

Glu

Asn

Ser

Arg

Leu

Leu

Gin

Glu

Arg

Gly

Va 1

Ala

435

440

445

Tyr

Tle

Asn

Ala

Asp

Ser

Ser

Ile

Glu

Gly

Asn

Tyr

Thr

Leu

Arg

Val

450

455

460

Asp

Cys

Thr

Pro

Leu

Met

Tyr

Ser

Leu

Va 1

His

Asn

Leu

Thr

Lys

Glu

465

470

475

480

Leu

Lys

Ser

Pro

Asp

Glu

Gly

Phe

Glu

Gly

Lys

Ser

Leu

Tyr

Glu

Ser

455

490

495

Trp

Thr

Lys

Lys

Ser

Pro

Ser

Pro

C-lu

Phe

Ser

Gly

Met

Pro

Arg

11 e

500

505

510

Ser

Lys

Leu

Gly

Ser

Gly

Asn

Asp

Phe

Glu

Val

Phe

Phe

Gin

Arg

Leu

515

520

525

Gly

Tle

Ala

Ser

Gly

Arg

Ala

Arg

Tyr

Thr

Lys

Asn

Trp

Glu

Thr

Asn

530

535

540

Lys

Phe

Ser

Gly

Tyr

Pro

Leu

Tyr

His

Ser

Val

Tyr

Glu

Thr

Tyr

Glu

54 5.

550

555

560

Leu

Val

Glu

Lys

Phe

Tyr

Asp

Pro

Met

Phe

Lys

Tyr

His

Leu

Thr

Val

565

570

575

Al a

Gin

Val

Arg

Gly

Gly

Met

val

Fhe

Glu

Leu

Ala

Asn

Ser

Ile

Val

580

585

590

Leu

Pro

Phe

Asp

Cys

Arg

Asp

Tyr

Ala

Val

Val

T.eu

Arg

Lys

Tyr

A.l a

595

600

605

Asp

Lys

Ile

Tyr

Ser

ile

Ser

Mer

Lys

His

Pro

Gin

Glu

Met

Lys

Thr

610

615

620

Tyr

Ser

Val

Ser

Phe

Asp

Ser

Leu

Phe

Ser

Ala

Va 1

Lys

Asn

Phe

Thr

625

630

635

640

Glu

Ile

Ala

Ser

Lys

Phe

Ser

Glu

Arg

Leu

Gin

Asp

Phe

Asp

Lys

Ser

645

650

655

Asn

Pro

Ile

Val

Leu

Arg

Met

Met

Asn

Asp

Gin

Leu

Met

Phe

Leu

Glu

660

665

670

Arg

Ala

Phe

I le

Asp

Pro

Leu

Gly

Leu

Pro

Asp

Arg

Pro

Phe

Tyr

Arg

675

680

685

PL 202 399 B1

His

Val 690

Ile

Tyr

Ala

Pro

Ser 695

Ser

His

Asn

Lys

Tyr 700

Ala

Gly

Glu

Ser

Phe 705

Pro

Gly

Ile

Tyr

Asp 710

Ala

Leu

Phe

Asp

Ile 715

Glu

Ser

Lys

Val

Asp 720

Pro

Ser

Lys

Ala

Trp 725

Gly

Glu

Val

Lys

Arg 730

Gin

Ile

Tyr

Val

Ala 735

Ala

Phe

Thr

Val

Gin

Ala

Ala

Ala

Glu

Thr

Leu

Ser

Glu

Val

Ala

740 '45 <210> 3 <211> 3768 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (ι; .

(3768) <400> 3

atg	gag	ctg	gcg
Met	Glu	Leu	Ala
			-20
ccc	ccc	gga	gcc
Pro	Prc	Gly	Ala
		-5
ctg	cgg	ctc	cct
Leu	Arg	Leu	Pro

gcc agt cc Ala Ser Pi 15 icc caa gtg tgc acc ggc aca gac atg aag

ΓΗ- G:n Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys

-1 i 5 gag acc cac ctg gac atg ctc cgc cac

Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His

25 .44 ctc tac cag ggc tgc cag gtg gtg cag gga aac ctg gaa ctc acc ta.. Ler Tyr Gin Gly Cys Gin Vai Val Gin Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr

35 40

192 ctg ccc acc aat gcc agc ctg tcc ttc ctg cag gat atc cag gag gtg

Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gin Asp Ile Gin Glu Vai

50 55 cag ggc tac gtg ctc atc gct cac aac caa gtg agg cag gtc cca ctg

Gin Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gin Val Arg Gin Val Pro Leu

20

240

288 tat cag agg ctg cgg att gtg ega ggc acc cag ctc ttt gag gac aat Gin Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gir. Leu Phe Glu Asp Asn Tyr 75 30 ⁸⁵

336 acc ctg gcc gtg eta gac aat gg= gac ccg ctg aac aat acc acc cct Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro 90 95 100

105 gtc aca ggg gcc tcc cca gga ggc ctg cgg gag ctg cag ctt ega agc Va1 Thr Gly Ala Ser Pro Gly Giy Leu Arg Glu Leu Gin Leu Arg Ser 110 . 115 ’

120 ctc aca gag atc ttg aaa gga ggg gtc ttg atc cag cgg aac ccc cag Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Tle Gin Arg Asn Pro Gin 130 135

125 ctc tgc tac cag gac acg att ttg tgg aag gac atc ttc cac aag aac Leu Cys Tyr Gin Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Tle Phe His Lys Asn

384

132

480

528

PL 202 399 B1

140 145 150

aac Asn

cag Gin 155

ctg Leu

gct Ala

ctc Leu

aca Thr

ctg Leu 160'

ata Ile

gac Asp

acc Thr

aac Asn

cgc Arg 165

tct Ser

cgg Arg

gcc Ala

tgc Cys

576

cac

ccc

tgt

tct

ccg

atg

tgt

aag

ggc

tcc

cgc

tgc

tgg

gga

gag

agt

624

His

Pro

Cys

Ser

Pro

Met

Cys

Lys

Giy

Ser

Arg

Cys

Trp

Gly

Glu

Ser

170

175

180

185

tct

gag

gat

tgt

cag

agc

ctg

acg

cgc

act

gtc

tgt

gcc

ggt

ggc

tgt

572

Ser

Glu

Asp

Cys

Gin

Ser

Leu

Thr

Arg

Thr

Val

Cys

Ala

Gly

Gly

Cys

190

195

200

gcc

cgc

tgc

aag

ggg

cca

ctg

ccc

act

gac

tgc

tgc

cat

gag

cag

tgt

720

Ala

Arg

Cys

Lys

Gly

Pro

Leu

Pro

Thr

Asp

Cys

Cys

His

Gid

Gin

Cys

205

210

215

gct

gcc

ggc

tgc

acg

ggc

ccc

aag

cac

tct

gac

tgc

ctg

gcc

tgc

ctc

7 68

Ala

Ala

Gly

Cys

Thr

Gly

Pro

Lys

His

Ser

Asp

Cys

Leu

Ala

Cys

Leu

220

225

230

cac

ttc

aac

cac

agt

ggc

atc

tgt

gag

ctg

cac

tgc

cca

gcc

ctg

gtc

816

His

Phe

Asn

His

Ser

Gly

Ile

Cys

Glu

Leu

His

Cys

Pro

Ala

Leu

Val

235

240

245

acc

tac

aac

aca

gac

acg

ttt

gag

tcc

atg

ccc

aat

ccc

gag

ggc

cgg

864

Thr

Tyr

Asn

Thr

Asp

Thr

Phe

Glu

Ser

Met

Pro

Asn

Pro

Glu

Gly

Arg

250

255

260

2 65

tat

aca

ttc

ggc

gcc

agc

tgt

gtg

act

gcc

tgt

ccc

tac

aac

tac

ctt

912

Tyr

Thr

Phe

Gly

Ala

Ser

Cys

Val

Thr

Ala

Cys

Pro

Tyr

Asn

Tyr

Leu

27 0

275

280

tct

acg

gac

gtg

gga

tcc

tgc

acc

ctc

gtc

tgc

ccc

ctg

cac

aac

caa

960

Ser

Thr

Asp

Val

Gly

Ser

Cys

Thr

Leu

Vai

Cys

Pro

Leu

His

Asn

Gin

2 3 5

290

295

gag

gtg

2C3

gca

gag

gat

gga

a ca

cag

cgc

tgt

gag

ssę

tgc

agc

aag

1008

Glu

Val

Thr 300

Ala

Glu

ASp

Gly

Thr 305

Gin

Arg

Cys

Glu

Lys 310

Cys

Ser

Lys

ccc

tgt

gcc

ega

gtg

tgc

tat

ggt

ctg

ggc

atg

gag

cac

ttg

ega

gag

1056

Pro

Cys

Ala

Arg

Val

Cys

Tyr

Gly

Leu

Gly

Met

Glu

His

Leu

Arg

Glu

315

32C

325

gtg

agg

gca

gtt

acc

agt

gcc

aat

atc

cag

gag

ttt

gct

ggc

tgc

aag

1104

Val

Arg

Ala

Val

Thr

Ser

Ala

Asn

Ile

Gin

Glu

Phe

Ala

Gly

Cys

Lys

330-

335

340

345

aag

atc

ttt

ggg

agc

ctg

gca

ttt

ctg

ccg

gag

agc

ttt

gat

ggg

gac

1152

Lys

Tle

Phe

Gly

Ser

Leu

Ala

Phe

Leu

Pro

G1 u

Ser

Phe

Asp

Giy

Asp

350

3 5 5

360

cca

gcc

tcc

aac

act

gcc

ccg

ct o

cag

cca

g a g

ca g

c t c

C ci β

gtg

ttt

120C

Prc

Ala

Ser

Asn

Thr

Ala

Ero

Leu

Gin

Pro

G i u

G1 n

Leu

G i c

Va 1

Phe

3 65

370

37 5

gag

act

ctg

gaa

gag

atc

aca

ggt

tac

eta

tac

atc

t ca

gca

tgg

ccg

1248

Glu

Thr

Leu

Glu

Glu

Ile

Thr

Gly

Tyr

Leu

Tyr

Ile

Ser

Al a

Trp

Pro

PL 202 399 B1

380

385

390

gac 1296

agc

ctg

cct

gac

ctc

agc

gtc

ttc

cag

aac

ctg

caa

gta

dtC

cgg

Asp

Ser 395

Leu

Pro

Asp

Leu

Ser 400

Val

Phe

Gin

Asn

Leu 405

Gin

Val

Ile

Arg

gga 1344

hqa

att

ctg

cac

aat

ggc

gcc

tac

teg

ctg

acc

ctg

caa

ggg

ctg

Gly 410

Arg

Ile

Leu

His

Asn 415

Gly

Ala

Tyr

Ser

Leu 420

Thr

Leu

Gin

Gly

Leu 425

ggc 1392

atc

agc

tgg

ctg

ggg

ctg

cgc

tea

ctg

agg

gaa

ctg

ggc

agt

gga

Gly

Ile

Ser

Trp

Leu 430

Gly

Leu

Arg

Ser

Leu 435

Arg

Glu

Leu

Gly

Ser 440

Gly

ctg 14 4 C

gcc

ctc

atc

cac

cat

aac

acc

cac

ctc

tgc

ttc

gtg

cac

acg

gtg

Leu

Ala

Leu

Ile 445

His

His

Asn

Thr

His 4 50

Leu

Cys

Phe

Val

His 455

Thr

Val

ccc 1435

tgg

gac

cag

ctc

ttt

cgg

aat

ccg

cac

caa

get

ctg

ctc

cac

act

Pro

Trp

Asp 460

Gin

Leu

Phe

Arg

Asn 465

Pro

His

Gin

Aj. 5.

Leu 470

Leu

His

Thr

gcc 1536

SBC

cgg

cca

gag

gac

gag

ug u

gtg

ggc

gag

ggc

ctg

gcc

tgc

cac

Ala

Asn 475

Arg

Pro

Glu

Asp

Glu 480

Cys

Val

Gly

Glu

Gly 485

Leu

Ala

Cys

His

cag 1584

ctg

tgc

gcc

ega

ggg

cac

tgc

tgg

ggt

cca

ggg

ccc

acc

cag

tgt

Gin 490

Leu

Cys

Ala

Arg

Gly 495

His

Cys

Trp

Gly

Pro 500

Gly

Pro

Thr

Gin

Cys 505

gtc 1632

aac

tgc

agc

cag

ttc

ctt

cgg

ggc

cag

gag

tgc

gtg

gag

gaa

tgc

Val

Asn

Cys

Ser

Gin 510

Phe

Leu

Arg

Gly

Gin 515

Glu

Cys

Val

Glu

Glu 520

Cys

ega 168 0

gta

ctc

cag

ggg

ct c

CCC

agg

gag

tat

gtg

aat

gcc

agg

cac

tgt

Arg

Val

Leu

Gin 525

Gly

Leu

Pro

Arg

Glu 530

Tyr

Va 1

Asn

Ala

Arg 535

His

Cys

ttg 1728

ccg

tgc

cac

cct

gag

tgt

cag

ccc

cag

aat

ggc

t ca

gtg

acc

tgt

Leu

Pro

Cys 540

His

Pro

Glu

Cys

Gin 545

Pro

Gin

Asn

Gly

Ser 550

Val

Thr

Cys

ttt 1776

gga

ccg

gag

get

gac

cag

tgt

gtg

gcc

tgt

gcc

cac

tat

aag

gac

Phe '

Gly 555

Pro

Glu

Ala

Asp

Gin 560

Cys

Val

Ala

Cys

Ala 565

His

Tyr

Lys

Asp

cct 1824

ccc

ttc

tgc

gtg

gcc

cgc

tgc

CCC

agc

ggt

gtg

aaa

cct

gac

ctc

Pro 570

Pro

Phe

Cys

Val

Ala 575

Arg

Cys

Pro

Ser

Gly 580

Val

Lys

Pro

Asp

Leu 585

tcc 1872

t ca C

atg

ccc

atc

tgg

aag

ttt

cca

gat

gag

gag

ggc

gca

tgc

cag

Ser

Tyr

Met

Pro

Ile 590

Trp

Lys

Phe

Pro

Asp 5 95

Glu

Glu

Gly

Ala

Cys 600

Gin

PL 202 399 B1

cct 1920

tgc

ccc

atc

aac

tgc

acc

cac

tcc

tgt

gtg

gac

ctg

gat

gac

aag

Pro

Cys

Pro

Ile 605

Asn

Cys

Thr

His

Ser 610

Cys

Val

Asp

Leu

Asp 615

Asp

Lys

ggc 1968

tgc

ccc

gcc

gag

cag

aga

gcc

age

cct

ctg

acg

tcc

atc

gtc

tct

Gly

Cys

Pro 620

Ala

Glu

Gin

Arg

Ala 625

Ser

Pro

Leu

Thr

Ser 630

11 e

Val

Ser

gcg 2016

gtg

gtt

ggc

att

ctg

ctg

gtc

gtg

gtc

ttg

ggg

gtg

gtc

ttt

ggg

Ala

Va 1 635

Val

Gly

Ile

Leu

Leu 640

Val

Val

Val

Leu

Gly 645

vai

Val

Phe

Gly

atc 2064

ctc

atc

aag

ega

cgg

cag

cag

aag

atc

cgg

aag

tac

acg

atg

cgg

Ile 650

Leu

Ile

Lys

Arg

Arg 655

Gin

Gin

Lys

Ile

Arg 660

Lys

Tyr

Thr

Met

Arg 665

aga 2112

ctg

ctg

cag

gaa

acg

gag

ctg

gtg

gag

ccg

ctg

aca

cct

age

gga

Arg

Leu

Leu

Gin

Glu 670

Thr

Glu

Leu

Val

Glu 675

Pro

Leu

Thr

Pro

Ser 680

Gly

gcg 2160

atg

ccc

aac

cag

gcg

cag

atg

cgg

atc

ctg

aaa

gag

acg

gag

ctg

Ala

Met

Pro

Asn 685

Gin

Ala

Gin

Met

Arg 690

Ile

Leu

Lys

Glu

Thr 6 95

Glu

leu

agg 2208

aag

gtg

aag

gtg

ctt

gga

tet

ggc

gct

ttt

ggc

aca

gtc

tac

aag

Arg

Lys

Val 700

Lys

Val

Leu

Gly

Ser 705

Gly

Ala

Phe

Gly

Thr 710

Val

Tyr

Lys

ggc

atc

tgg

atc

cct

gat

ggg

gag

aat

gtg

aaa

att

cca

gtg

gcc

atc

5 6

Gly

Ile 715

Trp

Ile

Pro

Asp

Gly 720

Glu

Asn

Val

Lys

ile 725

Pro

Val

Ala

ile

aaa 2304

gtg

ttg

agg

gaa

aac

aca

tcc

ccc

aaa

gcc

aac

aaa

gaa

atc

tta

Lys 730

Val

Leu

Arg

Glu

Asn 735

Thr

Ser

Pro

Lys

Al a .740

Asn

Lys

Glu

Ile

Leu 745

gac 2352

gaa

gca

tac

gtg

atg

gct

ggt

gtg

ggc

tcc

cca

tat

gtc

tcc

ege

Asp

Glu

Ala

Tyr

Val 7 50

Met

Za i_ ća

: l. y

Va 1

Gly 5 5

Ser

Pro

Tyr

Val

Ser 7 60

Arg

ctt 2400

ctg

ggc

atc

tgc

ctg

aca

tcc

acg

gtg

cag

ctg

gtg

aca

cag

ctt

Leu

Leu

Gly

Ile 765

Cys

Leu

Thr

Ser

Thr 770

Val

Gin

Leu

Val

Thr 775

Gin

Leu

atg 244 3

ccc

tat

ggc

tgc

ctc

tta

gac

cat

gtc

cgg

gaa

aac

ege

gga

ege

Met

Pro

Tyr 78 0

Gly

Cys

Leu

Leu

Asp 785

His

Val

Arg

Glu

Asn 790

Arg

Gly

Arg

ctg 2496

ggc

tcc

cag

gac

ctg

ctg

aac

tgg

tgt

atg

cag

att

gcc

aag

ggg

Leu

Gly 7 95

Ser

Gin

Asp

Leu

Leu 800

Asn

Trp

Cys

Met.

Gin 805

Ile

Ala

Lys

Gly

PL 202 399 B1

atg agc 2544

tac

ctg

gag

gat

gtg

cgg

ctc

gta

cac

agg

gac

ttg

gcc

gct

Met Ser 810

Tyr

Leu

Glu

Asp 815

Val

Arg

Leu

Val

His 820

Arg

Asp

Leu

Ala

Ala 825

cgg aac 2592

gtg

ctg

gtc

aag

agt

ccc

aac

cat

gtc

aaa

att

aca

gac

ttc

Arg Asn

Val

Leu

Val 830

Lys

Ser

Pro

Asn

His 835

Val

Lys

Ile

Thr

Asp 840

Phe

ggg ctg 2 64 0

gct

cgg

ctg

ctg

gac

att

gac

gag

aca

gag

tac

cat

gca

gat

Gly Leu

Ala

Arg 8 4 5

Leu

Leu

Asp

Ile

Asp 850

Glu

Thr

Glu

Tyr

His 8 55

Ala

Asp

ggg ggc 2688

aag

gtg

ccc

atc

aag

tgg

atg

gcg

ctg

gag

tcc

att

ctc

cgc

Gly Gly

Lys 8 60

Val

Pro

Ile

Lys

Trp 865

Met

Ala

Leu

Glu

Ser 870

Ile

Leu

Arg

cgg cgg 2736

ttc

acc

cac

cag

agt

gat

gtg

tgg

agt

tat

ggt

gtg

act

gtg

Arg Arg 875

Phe

Thr

His

Gin

Ser 880

Asp

Val

Trp

Ser

Tyr 885

Gly

Val

Thr

Val

tgg gag 2784

ctg

atg

act

ttt

ggg

gcc

aaa

cct

tac

gat

ggg

atc

cca

gcc

Trp Glu 890

Leu

Met

Thr

Phe 895

Gly

Ala

Lys

Pro

Tyr 900

Asp

Gly

Ile

Pro

Ala 905

cgg gag 2832

atc

cct

gac

ctg

ctg

gaa

aag

ggg

gag

cgg

ctg

ccc

cag

ccc

Arg Glu

Ile

Pro

Asp 910

Leu

Leu

Glu

Lys

Gly 915

Glu

Arg

leu

Pro

Gin 920

Pro

ccc atc 2880

cgc

acc

att

gar.

g t c

tac

atg

atc

atg

gtc

aaa

tgt

tgg

atg

Pro Ile

Cys

Thr 925

Ile

Asp

Val

Tyr

Met 930

Ile

Met

Val

Lys

Cys 935

Tro

Met

att gac 2928

tet

gaa

tgt

cgg

cca

aga

ttc

cgg

gag

ttg

gtg

tet

gaa

ttc

Ile Asp

Ser 940

Glu

Cys

Arg

Pro

Arg 945

Phe

Arg

Glu

Leu

Val 950

Ser

Glu

Phe

tcc cgc 2976

atg

gcc

agg

gac

ccc

cag

cgc

ttt

gtg

gtc

atc

cag

aat

gag

Ser Arg 955

Met

Ala

Arg

Asp

Pro 960

Gin

Arg

Phe

Val

Val 965

Ile

Gin

Asn

Glu

gac ttg 3024

ggc

cca

gcc

agt

ccc

ttg

gac

agc

acc

ttc

tac

cgc

tca

ctg

Asp Leu 9 7 0

G1 y

Pro

Ala

Ser 975

Pro

Leu

Asp

Se r

Thr 980

Phe

Tyr

Arg

Ser

Leu 985

ctg g o g 3 0 7 2

gac

gat

gac

atg

ggg

gac

ctg

gtg

gat

gct

gag

gag

Σ a Z

ctg

Leu Glu

Asp

Asp

Asp 990

Met

Gly

Asp

Leu

Val 995

Asp

Ala

Glu

Glu T y r 1000

Leu

gta ccc 3120

cag

cag

ggc

ttc

ttc

tgt

cca

gac

cct

gcc

ccg

ggc

gct

ggg

Val Pro

Gin Gin 100 5

Gly

Phe

Phe

Cys Pro 1010

Asp

Pro

Ala

Pro Gly 1015

Ala

Gly

ggc atg

gtc

cac

cac

agg

cac

cgc

agc

tca

tet

acc

agg

agt

ggc

ggt

PL 202 399 B1

3168

Gly

Mer

Val 1020

His

His

Arg

His

Arg 1025

Ser

Ser

Ser

Thr

Arg 1030

Ser

Gly

Gly

ggg

gac

ctg

aca

eta

ggg

ctg

gag

ccc

tct

gaa

gag

gag

gcc

ccc

agg

3216

Gly

Asp

Leu

Thr

Leu

Gly

Leu

Glu

Pro

Ser

Glu

Glu

Glu

Ala

Pro

Arg

1035 1040 1045

tct cca

ctg

gca

ccc

tcc

gaa

ggg

gct

ggc

tcc

gat

gta

ttt

gat

ggt

3264

Ser Pro

Leu

Al a

Pro

Ser

Glu

Gly

Ala

Gly

Ser

Asp

Val

Phe

Asp

Gly

1050

1055

1060

1065

gac ctg

gga

atg

ggg

gca

gcc

aag

ggg

ctg

caa

agc

ctc

ccc

aca

cat

3312

Asp Leu

Gly

Met

Giy

Ala

Ala

Lys

Gly

Leu

Gin

Ser

Leu

Pro

Thr

His

1070 1075 1080

gac ccc 3360 Asp Pro

agc Ser

cct Pro 1085

eta Leu

cag Gin

cgg Arg

tac Tyr

agt Ser 1090

gag Glu

gac Aso

Z 0 c

aca Thr

gta Val 1095

CCC Pro

ctg Leu

ccc tct

gag

act

gat

ggc

tac

gtt

gcc

ccc

ctg

acc

tgc

agc

ccc

cag

3408 Pro Ser

Glu

Thr

Asp

Gly

Tyr

Val

Ala

Pro

Leu

Thr

Cys

Ser

Pro

Gin

1100

1105

1110

cct gaa 3456

tat

gtg

aac

cag

cca

gat

gtt

cgg

CCC

cag

ccc

cct

teg

ccc

Pro Glu

Tyr

Val

Asn

Gin

Pro

Asp

Val

Arg

Pro

G1 a

Pro

Pro

Ser

Pro

1115

1120

1125

ega gag 3504

ggc

cct

ctg

cct

gct

gcc

ega

cct

gct

ggt

gcc

act

ctg

gaa

Arg Glu

Gly

Pro

Leu

Pro

Ala

Ala

Arg

Pro

Ala

Gly

Ala

Thr

Leu

Glu

1130

1135

114 0

1145

agg gcc 3552

aag

act

ctc

tcc

cca

ggg

aag

aa:

ggg

gtc

gtc

aaa

gac

gtt

Arg Ala

Lys

Thr

Leu

Ser

Pro

G1 y

Lys

Asn

Gly

Va 1

Va 1

Lys

Asp

Val

1150

J

L15 5

1160

ttt gcc 3600

ttt

ggg

ggt

gcc

gtg

gag

aac

ccc

gag

tac

ttg

aca

ccc

cag

Phe Ala

Phe

Gly

Gly

Ala

Val

Glu

Asn

Pro

Glu

'Tyr

Leu

Thr

Pro

Gin

1165

1170

1175

gga gga 3648

gct

gcc

cct

cag

ccc

cac

cct

cct

cct

gcc

ttc

agc

cca

gcc

Gly Gly

Ala

Ala

Pro

Gin

Pro

His

Pro

Pro

Pro

Ala

Phe

Ser

Pro

Ala

’ 180

1185

1190

ttc gac 3696

aac

ctc

tat

tac

tgg

gac

cag

gac

cca

cca

gag

cgg

ggg

gct

Phe Asp

Asn

Leu

Tyr

Tyr

Trp

Asp

Gin

Asp

Pro

Pro

Glu

Arg

Gly

Ala

1195

12 00

1205

CCd u CC

3 C U

dCC

ttc

3 G cl

ggg

aca

cct

acg

gc.j

gag

u a c

cca

gag

tac

3 Ί 4 4 Pro Pro

S e r

Thr

Phe

Lys

Gly

Thr

Pro

Thr

A j. a

Glu

Asr.

Pro

Glu

Tyr

1210

1215

12 20

12 2 5

ctg ggt 3768

Ctg

gac

gtg

cca

gtg

tga

PL 202 399 B1

Leu Gly Leu Asp Val Pro Val 1230 <210> 4 <211> 1255 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 4

Leu

Ala

Ala 5

Leu

Cys

Arg

Trp

Gly 10

Leu

Leu

Leu

Ala

Leu 15

Leu

Met 1

Glu

Pro

Pro

Gl.y

Ala

Ala

Ser

Thr

Gin

Val

Cys

Thr

Gly

Thr

Asp

Met

Lys

20

25

30

Leu

Arg

Leu

Pro

Ala

Ser

Pro

Glu

Thr

His

Leu

Asp

Met

Leu

Arg

His

35

40

45

Leu

Tyr

Gin

Gly

Cys

Gin

Val

Val

Gin

Gly

Asn

Leu

Glu

Leu

Thr

Tyr

50

55

60

Leu

Pro

Thr

Asn

Ala

Ser

Leu

Ser

Phe

Leu

Gin

Asp

Ile

Gin

Glu

tal

65

70

75

80

Gin

Gly

Tyr

Va i

Leu

Ile

Ala

His

Asn

Gin

Val

Arg

Gin

Val

Pro

Leu

85

90

95

Gin

Arg

Leu

Arg

Ile

Val

Arg

Gly

Thr

Gin

Leu

Phe

Glu

Asp

Asn

Tyr

100

105

110

Ala

Leu

Ala

Val

Leu

Asp

Asn

Gly

Asp

Pro

Leu

Asn

Asn

Thr

Thr

Pro

115

120

125

Val

Tnr

Gly

Ala

Ser

Pro

Gly

Gly

Leu

Arg

Glu

Leu

Gin

Leu

Arg

Ser

130

135

140

Leu

Thr

Glu

Ile

Leu

Lys

Gly

Gly

Val

Leu

Ile

Gin

Arg

Asn

Pro

Gin

145

150

155

160

Leu

Cys

Tyr

Gin

Asp

Thr

Ile

Leu

Trp

Lys

Asp

Ile

Phe

His

Lys

Asn

165

170

175

Asn

Gin

Leu

Ala

Leu

Thr

Leu

Ile

Asp

Thr

Asn

Arg

Ser

Arg

Ala

Cys

130

185

190

H i s

Pro

Cys

Ser

Pro

Met

Cys

Lys

Gly

Ser

Arg

Cys

Trp

Gly

Glu

Ser

195

200

205

Ser

Glu

Asp

Cys

Gin

Ser

Leu

Thr

Arg

Thr

Val

Cys

Ala

Gly

Gly

Cys

210

215

220

Ala

Arq

Cys

Lys

Gly

Pro

Leu

Pro

Thr

Asp

Cys

Cys

His

Glu

Gin

Cys

225

230

235

240

Ala

Ala

Gly

Cys

Thr

Gly

Pro

Lys

His

Ser

Asp

Cys

Leu

Ala

Cys

Leu

245

250

255

His

Phe

Asn

His

Ser

Gly

Ile

Cys

Glu

Leu

His

Cys

Pro

Ala

Leu

Val

260

265

270

Thr

Tyr

Asn

Thr

Asp

Thr

Phe

Glu

Ser

Met

Pro

Asn

Pro

Glu

Gly

Arg

275

280

285

Tyr

Thr

Phe

Gly

Ala

Ser

Cys

Val

Thr

Ala

Cys

Pro

Tyr

Asn

Tyr

Leu

2 90

295

300

PL 202 399 B1

Ser 305

Thr

Asp

Val

Gly

Ser 310

Cys

Thr

Leu

Val

Cys 315

Pro

Leu

His

Asn

Gin 320

Glu

Val

Thr

Ala

Glu

Asp

Gly

Thr

Gin

Arg

Cys

Glu

Lys

Cys

Ser

Lys

325

330

33 5

Pro

Cys

Ala

Arg

Val

Cys

Tyr

Gly

Leu

Gly

Met

Glu

His

Leu

Arg

Glu

340

345

350

Val

Arg

Ala

Val

Thr

Ser

Ala

Asn

Ile

Gin

Glu

Phe

Ala

Gly

Cys

Lys

355

360

365

Lys

Ile

Phe

Gly

Ser

Leu

Al a

Phe

Leu

Pro

Glu

Ser

Phe

Asp

Gly

Asp

370

375

380

Pro

Ala

Ser

Asn

Thr

Ala

Pro

Leu

Gin

Pro

Glu

Gin

Leu

Gin

Val

Phe

385

390

395

400

Glu

Thr

Leu

Glu

Glu

Ile

Thr

Gly

Tyr

Leu

Tyr

Ile

Ser

Ala

Trp

Pro

405

410

415

t---r

T^n

1

Γ 1 n

C 1 n

V = 1

Γ 1 Ω

* *~c-

420

425

430

Gly

Arg

Ile

Leu

His

Asn

Gly

Ala

Tyr

Ser

Leu

Thr

Leu

Gin

Gly

Leu

435

440

445

Gly

Ile

Ser

Trp

Leu

Gly

Leu

Arg

Ser

Leu

Arg

Glu

Leu

Gly

Ser

Gly

4 50

4 55

4 60

Leu

Ala

T.eu

Ile

His

His

Asn

Thr

His

Leu

Cys

Phe

Pal

His

Thr

Val

4 6 5

473

475

4 8 0

Pro

Trp

Asp

Gin

Leu

Phe

Arg

Asn

Pro

His

Gin

Ala

Leu

Leu

His

Thr

485

490

495

Ala

Asn

Arg

Pro

Glu

Asp

Glu

Cys

Val

Gly

Glu

Gly

Leu

Ala

Cys

His

500

505

510

Gin

Leu

Cys

Ala

Arg

Gly

His

Cys

Trp

Gly

Pro

Gly

Pro

Thr

Gin

Cys

515

520

525

Val

Asn

Cys

Ser

Gin

Phe

Leu

Arg

Gly

Gin

Glu

Cys

Val

Glu

Glu

Cys

530

535

540

Arg

Vd 1

Leu

Gin

Gly

Leu

Pro

Arg

Glu

Tyr

Val

Asn

Ala

Arg

His

Cys

545

550

555

560

Leu

Fro

Cys

His

Pro

Glu

Cys

Gin

Pro

Gin

Asn

Gly

Ser

Val

Thr

Cys

565

570

575

Phe

Gly

Pro

Glu

Ale

Asp

Gin

Cys

Val

Ala

Cys

Ala

His

Tyr

Lys

Asp

580

58 5

590

?ro

Pro

Phe

Cys

Val

Ala

Arg

Cys

Pro

Ser

Gly

Val

Lys

Pro

Asp

Leu

595

600

605

Ser

Tyr

Met

Pro

Ile

Trp

Lys

Phe

Pro

Asp

Glu

Glu

Gly

Ala

Cys

Gin

610

615

620

Pro

Cys

Pro

Ile

Asn

Cys

Thr

His

Ser

Cys

Val

Asp

Leu

Asp

Asp

Lys

625

630

635

640

Gly

Cys

Pro

Ala

Glu

Gin

Arg

Ala

Ser

Pro

Leu

Thr

Ser

Ile

Val

Ser

645 650 655

PL 202 399 B1

Ala

Val

Val

Gly 660

Ile

Leu

Leu

Val

Val 665

Val

Leu

Gly

Val

Val 670

Phe

Gly

Ile

Leu

Ile

Lys

Arg

Arg

Gin

Gin

Lys

Ile

Arg

Lys

Tyr

Thr

Met

Arg

675

680

685

Arg

Leu

Leu

Gin

Glu

Thr

Glu

Leu

Val

Glu

Pro

Leu

Thr

Pro

Ser

Gly

690

695

700

Ala

Met

Pro

Asn

Gin

Ala

Gin

Met

Arg

Ile

Leu

Lys

Glu

Thr

Glu

Leu

705

710

715

720

Arg

T.ys

Val

Lys

Val

Leu

Gly

Ser

Gly

Ala

Phe

Glv

Thr

Val

Tyr

Lys

725

730

7 35

Gly

Ile

Trp

Ile

Pro

Asp

Gly

Glu

Asn

Val

Lys

Ile

Pro

Val

Ala

Ile

740

74 5

750

Lys

Val

Leu

Arg

Glu

Asn

Thr

Ser

Pro

Lys

Ala

Asn

Lys

Glu

Ile

Leu

7 55

760

765

Λ ---r-

Glu

Ala

Va 1

Met

Ala

-r

Val

r. l .,

v-

Pro

w- 1

C r-. V-

Λ v-

— f

ł y J-

,JJ-7

1 y r

W Cl u_

770

775

780

Leu

Leu

Gly

Ile

Cys

Leu

Thr

Ser

Thr

Val

Gin

Leu

Val

Thr

Gin

Leu

785

790

795

800

Met

Pro

Tyr

Gly

Cys

Leu

Leu

Asp

His

Val

Arg

Glu

Asn

Arg

Gly

Arg

805

810

815

Leu

Gly

Ser

Gin

Asp

Leu

Leu

Asn

Trp

Cys

Met

Gin

Ile

Ala

Lys

Gly

820

825

830

Met

Ser

Tyr

Leu

Glu

Asp

fal

Arg

Leu

Val

His

Arg

Asp

Leu

Ala

Ala

835

840

845

Arg

Asn

Val

Leu

Val

Lys

Ser

Pro

Asn

His

Val

Lys

Ile

Thr

Asp

Phe

850

855

360

Gly

Leu

Ala

Arg

Leu

Leu

Asp

Ile

Asp

Glu

Thr

Glu

Tyr

His

Ala

Asp

865

870

875

880

Gly

Gl.y

Lys

Val

Pro

Ile

Lys

Trp

Met

Ala

Leu

Glu

Ser

Ile

Leu

Arg

885

890

895

Arg

Arg

Phe

Thr

His

Gin

Ser

Asp

Val

Trp

Ser

Tyr

Gly

Val

Thr

Vs. 1

900

905

910

Trp

Glu

Leu

Met

Thr

Phe

Gly

Ala

Lys

Pro

Tyr

Asp

Gly

Ile

Pro

Ala

915

920

925

Arg

Glu

Ile

Pro

Asp

Leu

Leu

Glu

Lys

Gly

Glu

Arg

Leu

Pro

Gin

Pro

930

935

940

Pro

Ile

Cys

Thr

Ile

Asp

V a 1

Tyr

Met

Ile

Met

fal

Lys

Cys

Trp

Met

94 5

95 C

95 5

960

Ile

Asp

Ser

Glu

Cys

Arg

Pro

Arg

Phe

Arg

Glu

Leu

Val

Ser

. > 1 u

Fhe

965

970

975

Ser

Arg

Met

Ala

Arg

Asp

Pro

Gin

Arg

Phe

va i

Val

Ile

Gin

Asn

Glu

980

985

990

Asp

Leu

Gly

Pro

Ala

Ser

Pro

Leu

Asp

Ser

Thr

Phe

Tyr

Arg

Ser

Leu

995

1000

1005

PL 202 399 B1

Leu

Glu 1010

Asp Asp

Asp

Met

Gly 1015

Asp Leu

Val

Asp

Ala 1020

Glu Glu

Tyr

Leu

val 025

Pro

Gin Gin

Gly

Phe 1030

Phe

Cys Pro

Asp

Pro 1035

Ala

Pro Gly

Ala

Gly 1040

Gly

Met

Val His

His 1045

Arg

His

Arg Ser

Ser 1050

Ser

Thr

Arg Ser

Gly 1055

Gly

Gly

Asp

Leu Thr 1060

Leu

Gly

Leu

Glu Pro 1065

Ser

G1 u

Glu

Glu Ala 1070

Pro

Arg

Ser

Pro

Leu Ala 1075

Pro

Ser

Glu

Gly Ala 1080

Gly

Ser

Asp

Val Phe 1085

Asp

Gly

Asp

Leu 1090

Gly Met

Gly

Ala

Ala 1095

Lys Gly

Leu

Gin

Ser 1100

Leu Pro

Thr

His

Asp 105

Pro

Ser Pro

Leu

Gin 1110

Arg

Tyr Ser

Glu

Asp 1115

Pro

Thr Val

Pro

Leu 1120

Pro

Ser

Glu Thr

Asp 1125

Gly

Tyr

Val Ala

Pro 1130

Leu

Thr

Cys Ser

Pro 11 3 5

Gir.

Pro

Gid

Tyr Val 1140

Asn

Gin

Pro

Asp Val 1145

Arg

Pro

Gin

Pro Pro 1150

Ser

Pro

Arg

Glu

Gly Pro 115 5

Leu

Pro

Ala

Ala Arg 1160

Pro

Ala

Gly

Ala Thr 1165

Leu

Glu

Arg Ala 1170

Lys Thr

Leu

Ser

Pro 117 5

Gly Lys

Asn

Gly

Val 1180

Val Lys

Asp

Val

Phe 185

Ala

Phe Gly

Gly Ala 1190

Val

Glu Asn

Pro Glu 1195

Tyr

Leu Thr

Pro Gin 1200

Gly

Gly

Ala Ala Pro 1205

Gin

Pro

His Pro Pro 1210

Pro

Ala

Phe Ser Pro 1215

Ala

Phe

Asp

Asn Leu 1220

Tyr

Tyr

Trp

Asp Gin 1225

Asp

Pro

Pro

Glu Arg 1230

Gly

Ala

Pro

Pro

Ser Thr .235

Phe

Lys

Gly Thr Pro 1240

Thr

Ala

GLi

Asn Pro L245

Glu

Tyr

Len Gly Leu Asp Val Pro Val 1250 1255

PL 202 399 B1

Val	Leu	Cys	Leu 20	Gin	Ala	Gin	Val
aca	cag	cat	gtg	agg	gag	cag	agc
Thr	Gin	His 3 5	Val	Arg	Glu	Gin	Ser 40
cgc	ctc	atc	cgg	acc	tac	cag	ctc
Arg	Leu 50	Ile	Arg	Thr	Tyr	Gin 55	Leu
gtg	cag	gtc	ctg	gcc	aac	aag	cgc
Val 6 5	Gin	Val	Leu	Ala	Asn 70	Lys'	Arg
gac	ccc	ttc	gcg	aag	ctc	att	gtg
Asp	Pro	Phe	Ala	Lys 85	Leu	Ile	Val
gtc	ega	gtt	cgc	ggc	gca	gag	aca
Val	Arg	Val	Arg 100	Gly	Ala	Glu	Thr
aag	ggg	aag	eta	att	gcc	aag	agc
Lys	Gly	Lys 115	Leu	Ile	Al a	Lys	Ser 120
ttc	aca	gag	ά l C	gtg	ctg	gag	aac
Phe	Thr 130	Glu	Ile	Val	Leu	Glu 135	Asn
aag	tac	gag	ggc	tgg	tac	atg	gcc
Lys 145	Tyr	Glu	Gly	Trp	Tyr 15Ό	Met	Ala
aag	ggc	tcc	aag	acg	cgc	cag	cat
Lys	Gly	Ser	Lys	Thr 165	Arg	Gin	His
cgc	ctg	ccg	cgg	ggc	cac	cac	acc
Arg	Leu	Pro	Arg 180	Gly	His	His	Thr
ttc	ctc	aac	tac	ccg	ccc	ttc	acg
Phe	Leu	Asn 195	Tyr	Pro	Pro	Phe	Thr 200
act	tgg	gcc	ccg	gag	ccc	ega	tag
Thr	Tro	Ala	Prc	Glu	Pro	Arg

210 215

Val Gin Ser Ser Pro Asn Phe 30 gtg acg gat cag ctc agc cgc 144

Val Thr Asp Gin Len Ser Arg

5 agc cgc acc agc ggg aag cac 192

Ser Arg Thr Ser Gly Lys Pis aac gcc atg gca gaa gac gga 240

Asn Ala Met Ala Glu Asp Gly

80 acc gat act ttt gga agc aga 288

Thr Asp Thr Phe Gly Ser Arg

95 ctc tac atc tgc atg aac aag 336

Leu Tyr Ile Cys Met Asn Łys

110 ggc aaa ggc aag gac tgc gta 384

Gly Lys Gly Lys Asp Cys Val

125 tac acg gcg ctg cag aac. gcc 432

Tyr Thr Ala Leu Gin Asn Ala

140 acc cgc aag ggc cgg ccc cgc 480 Thr Arg Lys Gly Arg Pro Arg

155 160 cgc gag gtg cac ttc atg aag 528

Arg Glu Val His Phe Met Lys 170 175 gag cag agc ctg cgc ttc gag 576 Glu Gir. Ser Leu Arg Phe GLu

190 agc ctg cgc ggc agc cag agg 624

Ser Leu Arg Gly Ser Gin Arg

205 .

648 <210 6 <211> 215 <212> PRT

<213> Homo	sapiens
<400 6 Met Gly 1	Ser	Pro	Arg 5	Ser	Ala	Leu
Val Leu	Cys	Leu 20	Gin	Ala	Gin	Val
Thr Gin	His	Val	Arg	Glu	Gin	Ser

40

Cys Leu Leu Leu His Leu Leu 10 15

Val Gin Ser Ser Pro Asn ?hc 30

Val Thr Asp Gin Leu Ser Arg 45

PL 202 399 B1

Arg

Leu 50

Ile

Arg

Thr

Tyr

Gin 55

Leu

Tyr

Ser

Arg

Thr 60

Ser

Gly Lys

His

Val

Gin

Val

Leu

Ala

Asn

Lys

Arg

Ile

Asn

Ala

Met

Ala

Glu

Asp

Giy

65

70

75

80

Asp

Pro

Phe

Ala

Lys

Leu

Ile

Val

Glu

Thr

Asp

Thr

Phe

Gly

Ser

Arg

85

90

95

Val

Arg

Val

Arq

Gly

Ala

Glu

Thr

Gly

Leu

Tyr

Ile

Cys

Met

Asn

Lys

100

105

110'

Lys

Gly

Lys

Leu

Ile

Ala

Lys

Ser

Asn

Gly

Lys

Giy

Lys

Asp

Cys

7 a 1

115

120

125

Phe

Thr

Glu

Ile

Val

Leu

Glu

Asn

Asn

Tyr

Thr

Ala

Leu

Gin

Asn

Ala

130

135

140

Lys

Tyr

Glu

Gly

Trp

Tyr

Met

Ala

Phe

Thr

Arg

Lys

Gly

Arg

Pro

Arg

145

150

155

160

Lys

Gly

Ser

Lys

Thr

Arg

Gin

His

Gin

Arg

Glu

Val

H i s

Phe

Met

Lys

165

170

175

Arg

Leu

Pro

Arg

Gly

His

His

Thr

Thr

Glu

Gin

Ser

Leu

Arg

Phe

Glu

180

185

190

Phe

Leu

Asn

Tyr

Pro

Pro

Phe

Thr

Arg

Ser

Leu

Arg

Gly

Ser

Gin

Arg

195

200

205

Thr

Trp

Ala

Pro

Glu

Pro

Arg

i.' X 0

215

<210> 7 <211> 2256 <212> DNA <213> Mus musculus

<220 <221> CDS <222> (1) . . <400> 7

(2256)

atg

tgg

aac

gca

ctg

cag

gac

aga

gac

tcc

gcg

gag

gtc

ctg

gga

cac

Met 1

Trp

Asn

Ala

Leu 5

Gin

Asp

Arg

Asp

Ser 10

Ala

Glu

Val

Leu

Gly 15

His

cgc

cag

cgc

tgg

ctc

cgt

gtt

ggg

aca

ctg

gtg

ctg

gct

tta

acc

gga

Arg

Gin

Arg

Trp 20

Leu

Arg

Val

Gly

Thr 25

Leu

Val

Leu

Ala

Leu 30

Thr

Gly

acc

t to

ctc

att

ggc

ttc

ctc

ttt

ggg

tgg

ttt

ata

α ći cl

CC *'

tcc

aat

Thr

Phe

Leu 35

Ile

Giy

Phe

Leu

Phe 40

Gly

Trp

Phe

Ile

Lys 4 5

Pro

Ser

Asn

gaa

gct

act

ggt

aat

gtt

tcc

cat

tct

ggc

atg

aag

aag

gag

ttt

ttg

Glu

Ala 50

Thr

Gly

Asn

Val

Ser 55

His

Ser

Gly

Met

Lys 60

Lys

Glu

Phe

Leu

cat

gaa

ttg

aag

gct

gag

aac

atc

aaa

aaa

ttt

tta

tac

aat

ttc

aca

His 65

Glu

Leu

Lys

Ala

Glu 70

Asn

Ile

Lys

Lys

Phe 75

Leu

Tyr

Asn

Phe

Thr 80

PL 202 399 B1

PL 202 399 B1

1056

Gly

Asn

Phe

Ser

Thr

Gin

Lys

Val

Lys

Met

His

Ile

His

Ser

Tyr

Thr

340

345

35 0

aaa

gtg

aca

aga

atc

tat

aat

gtc

att

ggc

acc

ctc

aaa

gga

gct

ctg

1104

Lys

Val

Thr

Arg

Ile

Tyr

Asn

Val

Ile

Gly

Thr

Leu

Lys

Gly

Ala

Leu

355

360

365

gaa cca

gac

aga

tat

gtt

att

ctt

gga

ggt

cac

ega

gac

gct

tgg

gta

1152

Glu Pro

Asp

Arg

Tyr

Val

Ile

Leu

Gly

Gly

His

Arg

Asp

Ala

Trp

Val

370

375

380

ttt ggt

ggc

att

gac

cct

cag

agt

gga

gca

gct

gtt

gtt

cat

qaa

att

1200

Phe Gly

Gly

Ile

Asp

Pro

Gin

Ser

Gly

Ala

Ala

Val

Val

His

Glu

Ile

385

395

390

400

gtg 1248

cgg

agc

ttt

gga acc

ctg

aag

aag

aaa

gga

cgg

agg

cct

aga

agg

Val

Arg

Ser

Phe

Gly Thr

Leu

Lys

Lys

Lys

Gly

Arg

Arg

Pro

Arg

Arg

4 0 5

.410

4 15

aca utt

t i

ttt

gca

agc

t gg

gat

gca

CJ3ć

g=a ttt ggc

c -1

Ctt

g g t

12 9 6

Thr Ile

Leu

Phe

Al a

Ser

Trp

Aso

Ala

Glu

Glu Phe Gly

Leu

i_»eU

G1 v

420

425

430

tet act

gag

tgg

gca

gag

gaa

cat

tca

aga

ctc eta caa

gag

ega

ggt

1344

Ser Thr

Glu

Trp

Ala

Glu

Glu

His

Ser

Arg

Leu Leu Gin

Glu

Arg

Gly

gtg gct 1392 Val Ala

450

435 tat att aat

Tyr Ile Asn

440 gct gat tet tcc ata

Ala Asp Ser Ser Ile 455

445 gaa gga aat tac

Glu Gly Asn Tyr 4 60 ’ act eta

Thr Leu

aga gtt

gat

tgc

aca

cca

ctg

atg

tac

agc

tta

gtg

tac

aac

eta

aca

1440

Arg Val

Asp

Gys

Thr

Pro

Leu

Met

Tyr

Ser

Leu

Val

Tyr

Asn

Leu

Thr

465

470

A 7 5

480

a a a er a g

ctg

caa

agc

cca

gat

gaa

ggt

ttt

gaa

gga

aaa

tcL

ctt

Lat

1488 '

Lys Glu

Leu

Gin

Ser

Prc

Asp

Glu

Gly

Phe

Glu

Gly

Lys

Ser

Leu

τ -i r >- iyr

485

490

9 5

gac agc

tgg

aaa

gaa

aag

agt

cct

tca

cct

gag

ttc

att

gga

atg

CCC

1536

Asp Ser

Trp

Lys

Glu

Lys

Ser

Pro

Ser

Pro

Glu

Phe

Ile

Gly

Met

Pro

500

505

510

aga att

agc

aag

ctg

ggg

-ct

ggc

aat

gat

ttt

gaa

gtg

ttc

ttc

caa

1584

Arg Ile

Ser

Lys

Le u

Gly

Ser

Gly

Asn

Asp

Phe

Glu

Val

Phe

Phe

Gin

515

520

525

aga ctt

gga

att

gct

tca

ggc

aga

gcc

ega

Lat

act

aaa

aat

tgg

aaa

1632

Arg Leu

Gly

Ile

Ala

Ser

Gly

Arg

Ala

Arg

Tyr

Thr

Lys

Asn

Trp

Lys

5 3 0

535

54 0

act aac

aaa

gtc

agc

agc

tat

cct

ctc

tat

C cl C

agt

gtc

tat

gaa

aca

1680

PL 202 399 B1

Thr 545

Asn

Lys

val

Ser

Ser 550

Tyr

Pro

Leu

Tyr

His 555

Ser

Val

Tyr

Glu

Thr 560

tat 1728

gag

ctg

gta

gta

aaa

ttt

tat

gac

cca

aca

ttt

aaa

tac

cac

ctc

Tyr

Glu

Leu

Val

Val 565

Lys

Phe

Tyr

Asp

Pro 570

Thr

Phe

Lys

Tyr

His 575

Leu

act

gtg

gcc

cag

gtt

ega

gga

gcg

atg

gta

ttt

gaa

ct t

gcc

aat

tct

1776

Thr

Val

Ala

Gin 580

Val

Arg

Gly

Ala

Met ,58 5

Val

Phe

Gin

Leu

A1 a 590

Asn

Ser

ata 182 4

gtg

ctt

ccc

ttt

gac

tgc

caa

agt

tat

get

gta

get

ctg

aag

aag

Ile

Val

Leu 595

Pro

Phe

Asp

Cys

Gin 600

Ser

Tyr

Ala

Val

Ala 605

Leu

Lys

Lys

tat

get

gac

act

atc

tac

aat

att

tea

atg

aaa

cat

cca

caa

gaa

atg

1872

Tyr

Ala 610

Asp

Thr

Ile

Tyr

Asn 615

Ile

Ser

Met

Lys

His 62 0

Pro

Gin

Glu

Met

aag 1920

get

tac

atg

ata

tea

ttt

gat

tea

ctg

ttt

tct

gca

gtc

aat

aat

Lys 625

Ala

Tyr

Met

Ile

Ser 630

Phe

Asp

Ser

Leu

Phe 635

Ser

Ala

V a 1

Asn

Asn 640

ttt

aca

gat

gtt

gca

tct

aag

ttc

aat

cag

aga

ctg

caa

gag

tta

gac

1968

Phe Thr

Asp

Val

Ala

Ser

Lys

Phe

Asn

Gin

Arg

Leu

Gir.

Glu

Leu

Asp

64 5

650

655

aaa agc 2016

aac

ccc

ata

tta

ctg

aga

att

atg

aat

gac

cag

ctg

atg

l do

Lys Ser

Asn

Pro

Ile

Leu

Leu

Arg

Ile

Met

Asn

Asp

Gin

Leu

Met

Tyr

660

665

670

ctg gaa 2064

cgt

gca

ttc

att

gat

cct

tta

ggc

tta

cca

gga

agg

cct

ttc-

Leu Glu

Arg

Ala

Phe

Ile

Asp

Pro

Leu

Gly

Leu

Pro

Gly

Arg

Pro

Phe

67 5

680

685

tac agg 2112

cat

acc

atc

tat

get

cca

agc

agc

cac

aac

aag

tat

gca

gga

Tyr Arg

His

Thr

Ile

Tyr

Ala

Pro

Ser

Ser

His

Asn

Lys

Tyr

Ala

Gly

690

695

700

gaa tea 2160

ttc

cct

ggg

att

tat

gat

gcc

ctt

ttt

gat

ata

agt

agc

aaa

Glu Se σ-

Phe

Pro

u 1 y

Ile

Tyr

Asp

Ala

Leu

Phe

Asp

I le

Ser

Ser

Lys

ι 0 5

710

7 1 5

<20

gtc aat 2208

get

tct

aag

gcc

tgg

aac

gaa

gtg

aag

aga

cag

att

tct

att

Val Asn

Ala

Ser

Lys

Ala

Trp

Asn

Glu

Val

Lys

Arg

Gin

Ile

Ser

Ile

7 25

730

735

gca acc 2256

ttt

aca

gtg

caa

get

gca

gca

gag

act

ctg

agg

gaa

gta

get

Ala Thr

Phe

Thr

Val

Gin

Ala

Ala

Ala

Glu

Thr

Leu

Arg

Glu

v a 1

Ala

740

745

7 50

<210>	8
<2 i 1>	752

PL 202 399 B1 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 8

Leu 5

Gin

Asp

Arg

Asp Ser 10

Ala

Glu

Val

Leu

Gly 15

His

Met 1

Trp

Asn

Ala

Arg

Gin

Arg

Trp 20

Leu

Arg

Val

Gly

Thr Leu 25

Val

Leu

Ala

Leu 30

Thr

Gly

Thr

Phe

Leu 35

Ile

Gly

Phe

Leu

Phe 4 0

Gly Trp

Phe

Ile

Lys 45

Pro

Ser

Asn

Glu

Ala 5 0

Thr

Gly

Asn

Val

Ser 55

His

Ser Gly

Mer

Lys 60

Lys

Glu

Phe

Leu

His 65

G1 u

Leu

Lys

Ala

Glu 7 0

Asn

Ile

Lys Lys

Phe Ί 5

Leu

Tyr

Asn

Ph S

Thr 80

Arg

Thr

Pro

H i s

T.eu 85

Ala

Gly

Thr

Gin Asn 90

Asn

Phe

Glu

Leu

Aia 55

Lys

Gin

Ile

His

Asp 100

Gin

Trp

Lys

Glu

Phe Gly 105

Leu

Asp

Leu

Val I 10

Glu

Leu

Ser

His

Tyr 115

Asp

Val

Leu

Leu

Ser 120

Tyr Pro

Asn

Lys

Thr 125

His

Pro

Asn

Tyr

Ile 130

Ser

Ile

Ile

Asn

Glu 135

Asp

Gly Asn

Glu

Ile 14 0

Phe

Lys

Thr

Ser

Leu 14 5

Ser

Glu

Gin

Pro

Pro 150

Pro

Gly

Tyr Glu

Asn 155

Ile

Ser

Asp

Val

Val 160

' Pro

Pro

Tyr

Ser

Ala 165

Phe

Ser

Pro

Gin Gly 170

Tnr

Pro

Glu

Gly

Asp 15

Leu

Va i

Tyr

Val

Asn 180

Tyr

Ala

Arg

Thr

Giu Asp 185

Phe

Phe

Lys

Leu 190

Glu

Arg

Glu

Me t

Lys 195

Ile

Ser

Cys

Ser

Gly 200

Lys Ile

Vai

Ile

Ala 205

Arg

Tyr

Gly

Lys

Val 210

Phe

Arg

Gly

Asn

Met 215

Val

Lys Asn

Ala

Gin 220

Leu

Ala

Gly

Ala

Lys 225

Gly

Met

Ile

Leu

Tyr 230

Ser

Asp

Pro Ala

Asp 235

Tyr

Phe

Val

Pro

Ala 240

Val

Lys

Ser

Tyr

Pro 245

Asp

Gly

Trp

Asn Leu 250

Pro

Gly

Gly

Gly

Val 255

Gin

Arg

Gly

Asn

Val 260

Leu

Asn

Leu

Asn

Gly Ala 265

Gly

Asp

Pro

Leu 270

Thr

Pro

Gly

Tyr

Pro 27 5

Ala

Asn

Glu

His

Ala 280

Tyr Arg

His

Glu

Leu 285

Thr

Asn

Ala

Va i

Gly 290

Leu

Pro

Ser

Ile

Pro 295

Val

His Pro

Ile

G 1 V 30 C

Tyr

AS fi

Asp

Ala

Gin 305

Lys

Leu

Leu

Glu

His 310

Met

Gly

Gly Pro

Ala 315

Pro

Pro

Asp

Ser

Ser 320

Trp

Lys

Gly

Gly

Leu 325

Lys

Val

Pro

Tyr Asn 330

Val

Gly

Pro

Gly

Phe 335

Ala

PL 202 399 B1

Gly

Asn

Phe

Ser 34 0

Thr

Gin Lys

Val

Lys 345

Met

His

Ile

His

Ser 350

Tyr Thr

Lys

Val

Thr 355

Arg

Ile

Tyr Asn

Val 360

Ile

Gl;y

Thr

Leu

Lys 365

Gly

Ala Leu

Glu

Pro 370

Asp

Arg

Tyr

Val Ile 37 5

Leu

Gly

Gly

His

Arg 380

Asp

Ala

Trp Val

Phe 385

Gly

Gly

Ile

Asp

Pro Gin 3 90

Ser

Gly

Ala

Ala 395

Val

Val

His

Glu Ile 400

Val

Arg

Ser

Phe

Gly 405

Thr Leu

Lys

Lys

Lys 410

Gly

Arg

Arg

Pro

Arg Arg 415

Thr

Ile

Leu

Phe 420

Ala

Ser Trp

Asp

Ala ' 425

Glu

Glu

Phe

Gly

Leu 430

Leu Gly

Ser

Thr

Glu 435

Trp

Ala

Giu Glu

His 4 40

Ser

Arg

Leu

Leu

Gin 4 4 5

Glu

Arg G1y

Vai

Ala 450

Tyr

Ile

Asn

Ala Asp 4 55

Ser

Ser

Ile

Glu

Gry 4 60

A, s n

• i1

Thr Len

Arg 465

Val

Asp

Cys

Thr

Pro Leu 470

Met

Tyr

Ser

Leu 475

Va i

Tyr

Asn

Leu Thr 480

Lys

Glu

Leu

Gin

Ser 485

Pro Asp

GlU

Gly

Phe 490

Glu

Gly

Lys

Ser

Leu Tyr 495

Asp

Ser

Trp

Lys 500

Glu

Lys Ser

Pro

Ser 505

Pro

Glu

Phe

Ile

Gly 510

Met Pro

Ara

ile

Ser 515

Lys

Leu

Gly Ser

Gly 520

Asn

Asp

Phe

Glu

Va i 525

Phe

Phe G.1 n

Arg

Leu 530

Gly

Ile

Ala

Ser Gly 535

Arg

Ala

Arg

Tyr

Thr 540

Lys

Asn

Trp Lys

Thr 54 5

Asn

Lys

Vai

Ser

Ser Tyr 550

Pro

Leu

Tyr

His 555

Ser

V a I

Tyr

C-U Thr 560

Tyr

Glu

Leu

Val

Val 565

Lys Phe

Tyr

Asp

Pro 570

Thr

Phe

Lys

Tyr

His Leu 57 5

Thr

val

Ala

Gin 580

Val

Arg Gly

Ala

Met 585

Val

Pne

Glu

Leu

Ala 590

Asn Ser

Ile

Val

Leu 595

Pro

Phe

Asp Cys

Gin 600

Ser

Tyr

Ala

Val

Ala 605

Leu

Lys Lys

Tyr

Ala 610

Asp

Thr

Ile

Tyr Asn 615

Ile

Ser

Met

Lys

His 620

Pro

C-ln

Glu Met

Lys 62 5

Ala

Tyr

Met

Ile

Ser Phe 630

Asp

Ser

Leu

Phe 635

Ser

Ala

Val

Asn Asn 640

Phe

Thr

Asp

Val

Ala 64 5

Ser Lys

Phe

Asn

Gin 650

Arg

Leu

Gin

Glu

Leu Asp 655

-A's

A. s n

Pm 660

1 Lfc

me L-m

Ar g

Ile 665

Met

Asr

Asp

' j 11

6 7 0

Met Tyr

Lej

Glu

Arg

Ala

Phe

Ile Asp

Pro

Leu

Gly

Leu

Pro

Gly

Arg

Pro Phe

675 680 685

PL 202 399 B1

Tyr

Arg 690

His

Thr

Ile

Tyr

Ala 695

Pro

Ser

Ser

His

Asn 700

Lys

Tyr

Ala

Gly

Glu 705

Ser

Phe

Pro

Gly

Ile 710

Tyr

Asp

Ala

Leu

Phe 715

Asp

Ile

Ser

Ser

Lys 720

Vai

Asn

Ala

Ser

Lys 725

Ala

Trp

Asn

Gl u

Val 730

Lys

Arg

Gin

Ile

Ser 735

Ile

Ala

Thr

Phe

Thr

Val

Gin

Ala

Ala

Ala

Glu

Thr

Leu

Arg

Glu

Val

Ala

740 745 750 <210> 9 <211> 2082 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> CCS <2 2 2 > (1) .. (2082)

<4 Oi. atg Met 1

:> 9 ci ćt CJ Lys

aag Lys

gag Glu

ttt Phe 5

ttg Leu

cat His

gaa Glu

ttg Leu

doO η y s 10

g c L Ala

gag Glu

aac Asn

atc Ile

aaa Lys 1 5

S5S Toys

48

ttt

tta

tac

aat

ttc

aca

cgg

aca

cca

cac

ttg

gca

gga

aca

caa

aat

96

Phe

Leu

Tyr

Asn 20

Phe

Thr

Arg

Thr

Pro 25

His

Leu

Ala

Gly

Thr 30

Gin

Asn

aat

ttt

gag

ctt

gca

aag

caa

att

cat

gac

cag

tgg

aaa

gaa

tct

ggc

144

Asn

Phe

Glu 35

Leu

Ala

Lys

Gin

Ile 4 0

His

Asp

Gin

Trp

Lys 4 5

Glu

Phe

Gly

ctg

gat

ttg

gtt

gag

tta

tcc

cat

tac

gat

gtc

ttg

ctg

tcc

tat

cca

192

Leu

Asp 50

Leu

Val

Glu

Leu

Ser 55

. His

Tyr

Asp

Val

Leu 60

Leu

Ser

Tyr

Pro

aat

553

act

cat

cct

aac

tat

atc

tea

ata

att

aat

gaa

gat

gga

aa t

240

Asn 65

Lys

Thr

His

Pro

Asn 70

Tyr

Ile

Ser

Ile

Ile 75

Asn

Glu

Asp

Gly

Asn 80

gag

att

ttc

aaa

aca

tea

tta

tct

gaa

cag

cca

ccc

cca

gga

tat

gag

288

Glu

Ile

Phe

Lys

Thr 35

Ser

Leu

Ser

Glu

Gin 90

Pro

Pro

Pro

Gly

95

Glu

aat

ata

tea

gat

gta

gtg

cca

cca

tac

agr

g c c

ttc

tct

cca

caa

ggg

336

Asn

Ile

Ser

Asp 100

Va 1

Vai

Pro

Pro

Tyr 105

Ser

Ala

Phe

Ser

Pro 110

Gin

Giy

3C3

cca

gag

ggt

gat

eta

gtg

tat

gtc

aac

tat

gca

ega

act

gaa

gac

38 4

Thr

Pro

Glu 115

Gly

Asp

Leu

Val

Tyr 120

Val

Asn

Tyr

Ala

Arg 125

Thr

Glu

Asp

ttc

ttt

aaa

ctg

gaa

cgg

gaa

atg

aag

atc

agt

tgt

tct

ggg

aag

att

432

Phe

Phe 130

Lys

Leu

Glu

Arg

Glu 135

Met

Lys

Ile

Ser

Cys 140

Ser

Gly

Lys

Ile

gtg

att

gcc

aga

tat

ggg

aaa

gtg

ttc

aga

gga

aat

atg

gtt

aaa

aat

480

Vai 145

Ile

Ala

Arg

Tyr

Gly 150

Lys

Val

Phe

Arg

Gly 155

Asn

Met

Val

Lys

Asn 160

gct

caa

ctg

gca

ggg

gca

aaa

gga

atg

att

ctg

tac

tea

gac

cct

gct

528

PL 202 399 B1

Ala

Gin

Leu

Ala

Gly Ala 165

Lys

Gly

Met

Ile 170

Leu

Tyr

Ser

Asp

Pro 175

Ala

gac

tac

ttt

gtt

cct

gcg

gtg

aag

tcc

tat

cca

gat

ggc

tgg

aac

ctc

576

Asp

Tyr

Phe

Val

Pro

Ala

Val

Lys

Ser

Tyr

Pro

Asp

Gly

Trp

Asn

Leu

180

185

190

cct

gga

ggt

ggt

gtc

caa

cgt

gga

aat

gtc

tta

aat

ctt

aat

ggt

gca

624

Pro

Gly

Gly

Gly

Val

Gin

Arg

Gly

Asn

Val

Leu

Asn

Leu

Asn

Gly

Ala

195

200

205

ggt

gac

ccg

ctc

aca

cca

ggt

tac

cca

gca

aat

gaa

cat

gct

tat

agg

67 2

Gly

Asp

Pro

Leu

Thr

Pro

Gly

Tyr

Pro

Ala

Asn

Glu

His

A _t a

Tyr

Arg

210

215

220

cat

gag

ttg

aca

aac

gct

gtt

ggc

ctt

cca

agt

act

cct

gtc

cat

cct

720

His

Glu

Leu

Thr

Asn

Ala

Val

Gly

Leu

Pro

Ser

Ile

Pro

Val

His

Pro

225

230

235

240

att

gga

tat

gat

gat

gca

cag

aaa

ctc

tta

gaa

cac

atg

ggt

ggt

cca

768

Ile

Gly

Tyr

Asp

Asp

Ala

Gin

Lys

Leu

Leu

Glu

His

Met

Gly

Gly

Pro

24 5

250

255

gca

ccc

cct

gac

agt

agc

tgg

aag

gga

gga

tta

aaa

gtg

cct

tac

aac

816

A1 a

Pro

Pro

Asp

Ser

Ser

Trp

Lys

Gly

Gly

Leu

Lys

Val

Pro

Tyr

Asn

260

265

270

gtg

gga

cct

ggc

ttt

gct

gga

aac

ttt

tca

aca

C3S

aag

gtc

aag

atg

864

Val

Gly

Pro

Gly

Phe

Ala

Gly

Asn

Phe

Ser

Thr

Gin

Lys

Val

Lys

Met

275

280

285

Cc t

att

cac

tct

tac

act

aaa

gtg

aca

aga

atc

cat

aat

gtc

att

ggc

912

His

Ile

His

Ser

Tyr

Π- y.

Lys

Val

Thr

Arg

Ile

Tyr

As n

V du-

Ile

G1 y

2 90

295

300

acc

ctc

aaa

gga

gct

ctg

gaa

cca

gac

aga

L. Π. 7.

gtt

att

et t

gga

ggt

960

Thr

Leu

Lys

Gly

Ala

Leu

Glu

Pro

Asp

Arg

Tyr

Va 1

Tle

Leu

Gly

Gly

305

310

315

320

cac

ega

gac

gct

tgg

gta

ttt

ggt

ggc

att

gac

cct

cag

agt

gga

gca

1008

His Arg Asp Ala Trp Val Phe Gly Gly Tle Asp Pro Gin Ser Gly Ala

325 330 335

gct 1056

gtt

gtt

cat

gaa

att

gtg

cgg

agc

ttt

gga

acc

ctg

aag

aag

aaa

Ala

Val

Val

His 340

Glu

Ile

Val

Arg

Ser 34 5

Phe

Gly

Thr

Leu

Lys 350

Lys

Lys

gga 11 0 4

cgg

agg

cct

aga

agg.

aca

att

ttg

ttt

gca

agc

tgg

gat

gca

gaa

Gly

Arg

Arg

Pro

Arg

Arg

Thr

Ile

Leu

Phe

a:

S e r

Trp

Asp

Ala

Glu

355 350 . 365

gaa ttt 1152

ggc

ctt

ctt

ggt

tct

act

gag

tgg

gca

gag

gaa

Cdt

tca

aga

Glu Phe 370

Gly

Leu

Leu

Gly

Ser 375

Thr

Glu

Trp

Ala

Glu 380

Glu

His

Ser

Arg

ctc eta 1200

caa

gag

ega

ggt

gtg

gct

tat

att

aat

gct

gat

tct

tcc

ata

Leu Leu 385

Gin

Glu

Arg

Gly 390

Val

Ala

Tyr

Ile

Asn 395

Ala

Asp

Ser

Ser

Ile 400

gaa gga 1248

aat

tac

act

eta

aga

gtt

gat

tgc

aca

cca

ctg

atg

tac

agc

PL 202 399 B1

Glu	Gly	Asn	Tyr
tta 1296	gtg 1	tac	aac
Leu	Va 1	Tyr	Asn 420
gaa 1344	gga		tct
Glu	Gly	Lys 435	Ser
gag 1392	ttc	att	gga
Glu	Phe 450	Ile	Gly
ttt Ί44Ο	gaa	gtg	ttc
Phe 465	Giu	Val	Phe
tat 1488	act	aaa	aat
Tyr	Thr	Lys	Asn
cac 1536	agt	gtc	tat
His	Ser	Val	Tyr 500
aca 1584	ttt		tac
Thr	Phe	Lys	Tyr

1 5

Thr 405	Leu	Arg	Val
eta	aca	aaa	gag
Leu	Thr	Lys	Glu
ctt	tat	gac	agc
Leu	Tyr	Asp	Ser 440
atg	ccc	aga	att
Met	Pro	Arg 455	Ile
ttc	caa	aga	ctt
Phe	Gin 470	Arg	Leu
tgg	aaa	act	aac
Trp 485	Lys	Thr	Asn
gaa	aca	tat	gag
Glu	Thr	Tyr	Glu

ttt 163	gaa	Ctt	gcc
Phe	Giu 5 30	Leu	Ala

cac	C L C	uct	gtg
His	Leu	Thr	Val 2 0
aat	t ct	ata	gtg
Asn	Ser	Ile	Va i

Asp	Cys 410	Thr	Pro
ctg	caa	agc	cca
Leu 425	Gin	Ser	Pro
tgg	aaa	gaa	aag
Trp	Lys	Glu	Lys
agc	aag	ctg	ggg
Ser	Lys	Leu	Glv 4 60
gga	att	gct	tea
Gly	Ile	Ala 475	Ser
aaa	gtc	agc	agc
Lys	Val 4 90	Ser	Ser
ctg	gta	gta	ci ri 3
Leu 505	Val	Val	Lys
gcc	cag	gtt	ega
Ala	Gin	Val	Arg

Leu	Met	Tyr 415	Ser
gat	gaa	ggt	ttt
Asp	Glu 430	Gly	Phe
agt	cct	tea	cct
Ser 445	Pro	Ser	Pro
tct	ggc	aat	gat
Ser	Gly	Asn	Asp

ggc	aga	gcc	ega
Gly	Arg	Ala	Arq 480
tat	cct	ctc	tat
Tyr	Pro	Leu	Tyr

495

ttt	tat	gac	cca
Phe	Tyr 510	Asp	Pro
gga	gcg	atg	gta
Gly	Ala	Met	Val

535

gct	gta	gct	ctg
1680
Ala	Val	Ala	Leu
54 5
aaa	cat	cca	caa
1723
Lys	His	Pro	Gin

aag	aag	tat	gct
Lys	Lys 550	Tyr	Ala
gaa	atg	aag	gct
Glu	Met	Lys	Ala

Ctt	ccc	ttt	gac
Leu	Pro	The	Asp 54 0
gac	act	atc	tac
Asp	Thr	Ile	Tyr

555

5 tgc caa agt tat

Cys Gin Ser Tyr tac atg ata tca

Tyr Met Ile Ser 570

aat	att	tea	atg
Asn	Ile	Ser	Met 560
ttt	gat	tea	ctg
Phe	Asp	Ser	Leu

575

ttt 1 7 7 6	tct	gca	gtc
Phe	Ser	Ala	Val 580
aga 1824	c t g	caa	gag
Arg	Leu	Gin 595	Glu

65 aat aat ttt aca

Asn Asn Phe Thr

tta	gac aaa	agc
Leu	Asp Lys	Ser 600

gat	gtt	gca	tct
Asp 585	Val	Ala	Ser
aac	ccc	a t a	tta
As c	Pro	Ile	LSu

aag	ttc	aat	cag
Lys	Phe 590	Asn	Gin
ctg	aga	att	atg
Leu 605	Arg	Ile	Met

aat gac cag ctg atg tat ctg gaa cgt gca 1872

Asn Asp Gin Leu Met Tyr Leu Glu Arg Ala ttc att gat cct tta ggc Phe Ile Asp Pro Leu Gly

PL 202 399 B1

610 615 620

tta cca 1920

gga

agg

cct

ttc

tac

agg

cat

acc

atc

tat

get

cca

agc

agc

Leu Pro

Gly

Arg

Prc·

Phe

Tyr

Arg

His

Thr

Ile

Tyr

Ala

Pro

Ser

Ser

625

630

635

640

cac aac

aag

tat

gca

gga

gaa

tea

ttc

cct

ggg

att

tat

gat

gcc

ctt

1968 •His Asn

Lys

Tyr

Ala

Gly

Glu

Ser

Phe

Pro

Gly

Ile

Tyr

Asp

Ala

Leu

645

650

655

ttt gat 2016

ata

agt

agc

aaa

gtc

aat

get

tct

aag

gcc

tgg

aac

gaa

gtg

Phe Asp

Ile

Ser

Ser

Lys

Val

Asn

Ala

Ser

Lys

Ala

Trp

Asn

Glu

Val

660

665

670

aag aga 2064

cag

att

tct

att

gca

acc

ttt

aca

gtg

caa

get

gca

gca

gag

Lys Arg

Gin

Ile

Ser

Ile

Ala

Thr

Phe

Thr

Val

Gin

Ala

Ala

Ala

Glu

675

680

68 5

act ctg 2082

agg

gaa

gta

get

Thr Leu

Arg

Glu

Tai

Ala

9 0 <210> 10 <211> 694 <212> PRT <213> Mus rausculus <400> 10

Met 1

Lys

Lys

Glu

Pho 5

Leu

His

Glu

Leu

Lys 10

Ala

Glu

Asn

Ile

Lys 15

Lys

Phe

Leu

Tyr

Asn 20

Phe

Thr

Arg

Thr

Pro 25

His

Leu

Ala

Gly

Thr 30

Gin

Asn

Asn

Phe

Glu 35

Leu

A1 a

Lys

Gin

Ile 40

His

Asp

Gin

Trp

Lys 4 5

Glu

Phe

G1 y

Leu

s o - n

Leu

Va 1.

1 u

Leu

Ser 55

His

Tyr

Asp

Va 1

Leu 60

Leu

Ser

Tyr

Prc

Asr. 65

lys

Thr

His

Pro

Asn 70

Tyr

Ile

Ser

Ile

Ile 75

Asn

G1 u

Asp

Gly

Asn 80

Glu

Ile

Phe

Lys

Thr 85

Ser

Leu

Ser

Glu

Gin 90

Pro

Pro

Pro

Gly

Tyr 95

Glu

Asn

Ile

Ser

Asp 100

Val

Tal

Pro

Pro

Tyr 105

Ser

Ala

Phe

Ser

Pro 110

Gin

Gly

Thr

Pro

Glu 115

Gly

Asp

Leu

Val

Tyr 120

Val

Asn

Tyr-

Ala

Arg 125

Thr

Glu

Asp

Phe

Phe 130

Lys

Leu

Glu

Arg

Glu 135

Met

Lys

Ile

Ser

Cys 140

Ser

Gly

Lys

Ile

145

11 e

Ala

Arg

Tyr

Gly 150

Lys

Va 1

Phe

Arg

Gly 155

Asn

Met

Tal

Lys

Asn 160

Ala

Gin

Leu

Ala

Gly 165

Ala

Lys

Gly

Met

ile 170

Leu

Tyr

Ser

Asp

Pro 1 7 3

Ala

PL 202 399 B1

Asp

Tyr

Phe

Vai 180

Pro

Ala

Val

Lys

Ser 185

Tyr

Pro

Asp

Gly

Trp 190

Asn

Leu

Pro

Gly

Gly

Gly

Val

Gin

Arg

Gly

Asn

Val

Leu

Asn

Leu

Asn

Gly

Ala

195

200

205

Gly

Asp

Pro

Leu

Thr

Fro

Gly

Tyr

Pro

Ala

Asn

Glu

His

Ala

Tyr

Arg

r i p.

215

2 20

His

Glu

Leu

Thr

Asn

Ala

Val

dy

Leu

Pro

Ser

Ile

Pro

Val

His

Pro

225

230

2 35

240

Ile

Gly

Tyr

Asp

Asp

Ala

Gin

Lys

Leu

Leu

Glu

His

Met

Gly

Gly

Pro

245

250

255

Ala

Pro

Pro

Asp

Ser

Ser

Trp

Lys

Gly

Gly

Leu

Lys

Val

Pro

Tyr

Asn

260

265

270

Val

Gly

Pro

Gly

Phe

Ala

Gly

Asn

Phe

Ser

Thr

Gin

Lys

Val

Lys

Met

275

280

285

His

Ile

His

Ser

Tyr

Thr

Lys

Val

Thr

Arg

Ile

Tyr

Asn

Val

Ile

Gly

2 90

295

300

Thr

Leu

Lys

Gly

Ala

Leu

Glu

Pro

Asp

Arg

Tyr

V a 1

Ile

Leu

Gly

Gly

30 5

310

315

320

His

Arg

Asp

A1 a

Trp

V 3. _l

Phe

Gly

Giy

Ile

Asp

Pro

Gin

Ser

G1 v

Aid

325

330

335

Ala

Val

Val

His

Glu

Ile

Val

Arg

Ser

Phe

Gly

Thr

Leu

Lys

Lys

Lys

340

345

350

Gly

Arg

Arg

Pro

Arg

Arg

Thr

Ile

Leu

Phe

Ala

Ser

Trp

Asp

Ala

Giu

355

360

365

Glu

Phe

Gly

Leu

Leu

Gly

Ser

Thr

Glu

Trp

Ala

Glu

Glu

His

Ser

Arg

370

375

380

Leu

Leu

Gin

Glu

Arg

Gly

Val

Ala

Tyr

Ile

Asn

Ala

Asp

Ser

Ser

Ile

385

390

395

400

Glu

Gly

Asn

Tyr

Thr

Leu

Arg

Val

Asp

Cys

Thr

Pro

Leu

Met

Tyr

Ser

405

410

415

Leu

Val

Tyr

Asn

Leu

Thr

Lys

Glu

Leu

Gin

Ser

Pro

Asp

Glu

Gly

Phe

420

425

430

Glu

Gly

Lys

Ser

Le u

Tyr

Asp

Ser

Trp

Lys

Glu

Lys

Ser

Pro

Ser

Pro

4 .3 5

440

4 4 5

G1 u

Phe

I le

Giy

Met

Pro

Arg

Ile

Ser

Lys

Leu

Gly

Ser

Gly

Asn

Asp

4 50

455

460

Phe

Glu

Val

Phe

Phe

Gin

Arg

Leu

Gly

Ile

Ala

Ser

Gly

Arg

Ala

Arg

465

470

475

480

Tyr

Thr

Lys

Asn

Trp

Lys

Thr

Asn

Lys

Val

Ser

Ser

Tyr

Pro

Leu

Tyr

485

4 90

495

H i s

Ser

Va 1

Tyr

Glu

Thr

Tyr

Glu

Leu

Val

Val

Lys

Phe

Tyr

Asp

Pro

500

505

510

Thr

Phe

Lys

Tyr

His

Leu

Thr

Val

Ala

Gin

Val

Arg

Gly

Ala

Met

Val

515 520 525

PL 202 399 B1

Phe

Glu 530

Leu

Ala

Asn

Ser

Ile 535

Val

Leu

Pro

Phe

Asp 540

Cys

Gin

Ser

Tyr

Ala

Val

Ala

Leu

Lys

Lys

Tyr

Ala

Asp

Thr

Ile

Tyr

Asn

Ile

Ser

Met

545

550

555

560

Lys

His

Pro

Gin

Glu

Met

Lys

Ala

Tyr

Met

Ile

Ser

Phe

Asp

Ser

Leu

565

570

575

Phe

Ser

Ala

Val

Asn

Asn

Phe

Thr

Asp

Val

Ala

Ser

Lys

Phe

Asn

Gin

580

585

590

Arg

Leu

Gin

Glu

Leu

Asp

Lys

Ser

Asn

Pro

Ile

Leu

Leu

Arg

Ile

Met

595

600

60 5

Asn

Asp

'Gin

Leu

Met

Tyr

Leu

Glu

Arg

Ala

Phe

Ile

Asp

Pro

Leu

Gly

610

615

620

Leu

Pro

Gly

Arg

Pro

Phe

Tyr

Arg

His

Thr

Ile

Tyr

Ala

Pro

Ser

Ser

625

630

635

640

His

Asn

Lys

Tyr

Ala

Gly

G1 u

Ser

Phe

Pro

Cl v

Ile

Tur

Asp

Al 3

Leu

--/

- J -

645

650

655

Phe

Asp

Ile

Ser

Ser

Lys

Va 1

Asn

Ala

Ser

Lys

Ala

Trp

Asn

Glu

Val

660

665

570

Lys

Arg

Gin

Ile

Ser

Ile

Ala

Thr

Phe

Thr

Val

Gin

Ala

Ala

Ala

Glu

675

680

685

Thr Leu Arg C-lu Val Ala 6 90 <210> 11 <21L> 45 <212> DNA <213> Clostridium tetani <220>

<221> CDS <222> (1)..(45) <400> 11 ' cag tac atc aaa gct aac tcc aaa ttc atc ggt atc acc gag ctg 45

Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu

5 10 15 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Clostridium tetani.

<400> 12
Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly 1 5 10 '	1 ] t	? Thr Glu Leu 1 5

<210> 13 <211> 63 <212> DNA <213> Clostridium tetani

PL 202 399 B1 <220>

<22l> CDS <222> (1)..(63) <400> 13 ttc aac aac ttc acc gta agc ttc tgg ctg cgt gtt ccg aaa gtt agc 48

Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser

10 15 get agc cac ctg gaa 63

Ala Ser His Leu Glu

<210>	14
<211>	21
<212>	PRT
<213>	Ciostriduum tetani
<4 00>	14
Phe A.·	nu Asn Phe Thr Val Ser	Phe Trp Leu Arg Tal Prc Lys	; Tal Ser
1	5	10 ’ '	15
Ala Ser His Leu Glu

<210> 15 <2il> 25 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> , <223> Opis sekwencji sztucznej: Fuzja epitopu anatoksyny tężcowej i PSM <4 00> 15

Gin Glu Arg Gly Tal Gir. Tyr Ile Lys Ala Asn Per Lys Phe Ile Gi
ΐ £	10 15
Ile Thr Glu Leu Arg Tal	Asp Cys Thr
2 0	25

<210> 16 < 2 I i > 2 5 <212> PRT <2i3> Sekwencja sztuczna <220> . . . . ' <223> °P^1S sekwencji sztucznej: Fuzja epitopu anatoksyny tężcowej i PSM <400> 16

Ala Val Tal Leu Arg Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly ¹ 5 10 15

Ile Thr Glu Leu 3]u Ket Lys Thr Tyr 2 0 2 5 <2!0> 17

PL 202 399 B1 <211? 25 <212> PRT <2!3> Sekwencja sztuczna <223> Opis sekwencji sztucznej: Fuzja epitopu

	.anatoks	yny	tężcowej	i PSM ‘
<400> 17
Met	Phe Leu Glu	Arg	Gin Tyr Ile	Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly
1		5		10 15
Ile	Thr Glu Leu	His	Val Ile Tyr	Ala
	20			25

<210? 18 <211> 31 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Fuzja epitopu anatoksyny tężcowej i PSM

- 1 ···''.- i s ,

As n 1

Ser Arg

Leu

Leu 5

Phe

Asn

Asn

Phe

Thr 10

V a I

Se: Jhe

Trp

Leu 15

Vai

Pro Lys

Val 20

Ser

Ala

Ser

His

Leu 25

Glu

Vćii

Asp Cys

Thr 30

Pro

<210 15 .

<211> 31 .

<212> PRT .

<213> Sekwencja sztuczna <220> . , <223> Opis sekwencji sztucznej: Fuzja epitopu anatoksyny tężcowej i PSM <40019 '

vT ci i ' '3 1 Leu	Arg	Lys	Phe Ast	Ast. Phe	Thr Vhl 10	Ser Phe Trę Leu Ar 7 ·-
Vc. 1 Pro Lys	Val 20	Ser	Ala Ser	Pis Leu 25	Glu Ser	Phe Asp Ser Leu ' ' 30

<2 10 >	20
<21?. '	31
<212-	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220> < 2 2 3 >	Opis sekwencji sztucznej: Fuzja epitopu
	anatoksyny tężcowej i ΡΞΜ.
<· ij i) i'1 ?’ Leu	20 ' :h Phe Leu Glu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Ar
1	5 10 15

100

PL 202 399 B1

Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Pro Ser Ser His Asn 20 25 30 <210> 21 <2ll> 18 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> .

<223> Opis sekwencji sztucznej: Sztuczny znacznik His tag <220>

<221> CDS <222> (1) . . (18) <400> 21 cat cat cat cat cat cat 18

His His His His His His

5 <2l0> 22 <211> 6 <212> PRT <2i3>- sekwencja sztuczna <223> Opis sekwencji sztucznej: Sztuczny znacznik His tag <400> 22

His His His His His Pis

5

<210>	23
<211>	42
<212>	DNA '
<213>	Sekwencja sztuczna
<220> <22 3 >	Opis sekwencji sztucznej: Sztuczny znacznik His
	tag
<220> <221>	CDS
<222>	(1)..(42) . .
<400' atg at	i' j esc css esc caa esc ?i3<3 cat caa caa -.'ac css f.
Met Ją	':? His Gil His G J. n His Gin His Gin His Cln His Gin
1 ‘	5 10

<210>	24
<2 11 >	14
<212'·	PPT
<213?	Sekwencja sztuczna

<223'>opi_s sekwencji sztucznej: Sztuczny znacznik His tag .

<400> 24

Met Lys His Gin His Gin His Gin His Gin His Gin His Gin 1 5 10

PL 202 399 B1

101 <210> 25 <211> 69 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1)..(69) <400 25 atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg ctg ctg tgt gga 48

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

5 10 15 gca gtc ttc gtt teg ccc agc Ala Val Phe Val· Ser Pro Ser <210 26 <211> 23 ' <212> PRT <213> Mus musculus <400 26

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Cly 1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser ·

<210>	27
<211>	33
<212>	DNA
<213>	Home	sapi	ens
<220 <221>	CDS
<222>	(1) . .	(33)
<400	27
gćlcl C33 333	ctc	atc	tea	gaa	gag	gat	ctg	aat	3 3
Glu Gin Lys	Leu	Ile	Ser	Glu	Glu	Asp	Leu	Asn
1			5					10

<210 29 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens

102

PL 202 399 B1 <220> <221> COS <222> (1) .

(75) <400> 29 atg aag gat tcc tgc atc act gtg atg gcc atg gcg ctg ctg tct ggg Met Lys Asp Ser Cys Ile Thr Val Met Ala Met Ala Leu Leu Ser Gly

10 15 ttc ttt ttc ttc gcg ccg gcc teg agc Phe Phe Phe Phe Ala Pro Ala Ser Ser

25 <210> 30 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <iOOe 30

Met Lys Asp Ser Cys Ile Thr Val Met Ala Met Ala Leu Leu Ser Gly 1 5 10 .15

Phe Phe Phe Phe Ala Pro Ala Ser Ser 20 25

<210>	31
<211>	60
<212>	ONA
<2I3>	Mus	musculus
<220>
<221>	COS
<222>	(1! .	(60)
<400>	31

atg aga agg atg ctt ctg cac ttg agt gtt ctg act ctc agc tgt gtc

Met Arg Arg Met Leu Leu His Leu Ser Val Leu Thr Leu Ser Cys Val

5 10 15 tgg gcc act gcc Trp Ala Thr Ala

<210>	32
<211>	20
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	32

Met Arg Arg Met Leu Leu His Leu Ser Val Leu Thr Leu Ser Cys Val

Trp Ala Thr Ala <210> 33 <211> 20 <212:.- PRT <21 3> homo sapiens

PL 202 399 B1

103 <400> 33

Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala 15 10 15

Pro Asp Thr Arg

Claims (81)

1) fragment kwasu nukleinowego określony w zastrz. 65 lub wektor określony w zastrz. 66-70 i

1. Zastosowanie (a) adiuwanta i pierwszego analogu polipeptydowego antygenu związanego z komórką , który to analog obejmuje znane i przewidywane epitopy CTL rozpoznawane przez co najmniej 50% haplotypów MHC-I rozpoznających wszystkie znane i przewidywane epitopy CTL w antygenie polipeptydowym związanym z komórką pochodzącym od antygenu polipeptydowego związanego z komórką, który jest słabo immunogenny albo nieimunogenny u zwierzęcia, a ponadto ten pierwszy analog obejmuje co najmniej jeden pierwszy epitop limfocytu pomocniczego T (TH), który jest obcy dla zwierzęcia, i który jest wprowadzany do sekwencji aminokwasowej antygenu polipeptydowego związanego z komórką przez substytucję i/lub delecję i/lub insercję, lub (b) co najmniej jednego fragmentu kwasu nukleinowego kodującego epitop CTL pochodzący z antygenu polipeptydowego związanego z komórką, który jest słabo immunogenny albo nieimunogenny u zwierzęcia i co najmniej jednego pierwszego fragmentu kwasu nukleinowego kodującego epitop limfocytu pomocniczego T (TH), który jest obcy dla zwierzęcia, przy czym fragmenty kwasu nukleinowego kodujące epitopy CTL i TH są częścią tej samej cz ą steczki, epitopy CTL są rozpoznawane przez co najmniej 50% haplotypów MHC-I rozpoznających wszystkie znane i przewidywane epitopy CTL w antygenie polipeptydowym związanym z komórką lub (c) niepatogennego mikroorganizmu lub wirusa, który niesie fragment kwasu nukleinowego, który koduje i wyraża co najmniej jeden epitop CTL pochodzący z antygenu polipeptydowego związanego z komórką, który jest słabo immunogenny albo nieimunogenny u zwierzęcia, i co najmniej jeden pierwszy epitop limfocytu pomocniczego T (TH), który jest obcy dla zwierzęcia, przy czym, gdy te fragmenty kwasu nukleinowego kodujące epitopy CTL i TH są częścią tej samej cząsteczki, epitopy CTL są rozpoznawane przez co najmniej 50% haplotypów MHC-I rozpoznających wszystkie znane i przewidywane epitopy w antygenie polipeptydowym związanym z komórką, do wytwarzania immunogennej kompozycji do leczenia patologicznego procesu wybranego spośród nowotworu, infekcji wirusowej i infekcji wywołanej przez wewnątrzkomórkowego pasożyta lub bakterię, przez indukowanie swoistej odpowiedzi cytotoksycznego limfocytu T (CTL) u zwierzęcia przeciw komórkom niosącym antygen polipeptydowy związany z komórką na powierzchni lub w wewnątrzkomórkowym kompartmencie, po podaniu tej kompozycji, przy czym antygen polipeptydowy związany z komórką jest wybrany spośród antygenu polipeptydowego związanego z nowotworem, własnego białka, polipeptydowego antygenu wirusowego i polipeptydowego antygenu pochodzącego od wewnątrzkomórkowego pasożyta lub bakterii.

2) farmaceutycznie i immunologicznie dopuszczalny rozpuszczalnik i/lub podłoże i/lub adiuwant.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że zwierzęciem jest istota ludzka.

3. Zastosowanie według zastrz. 1 lub 2, znamienne tym, że w wariancie (a) znane i przewidywane epitopy CTL w sekwencji aminokwasowej co najmniej jednego pierwszego analogu są rozpoznawane przez co najmniej 90% haplotypów MHC-I rozpoznających wszystkie znane i przewidywane epitopy CTL w antygenie polipeptydowym związanym z komórką.

4. Zastosowanie według zastrz. 1 lub 2, znamienne tym, że w wariancie (a) zasadniczo wszystkie znane epitopy CTL antygenu polipeptydowego związanego z komórką są obecne w co najmniej jednym pierwszym analogu i/lub zasadniczo wszystkie przewidywane epitopy CTL antygenu polipeptydowego związanego z komórką są obecne w co najmniej jednym pierwszym analogu.

5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że w wariancie (a) antygen polipeptydowy związany z komórką obejmuje części, które są zewnątrzkomórkowe, przy czym co najmniej jeden pierwszy analog ponadto obejmuje część składającą się z modyfikacji struktury antygenu polipeptydowego związanego z komórką, powodującej w wyniku immunizacji zwierzęcia pierwszym analogiem indukowanie wytwarzania przeciwciał u zwierzęcia przeciw antygenowi polipeptydowemu związanemu z komórką .

6. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że w wariancie (a) antygen polipeptydowy związany z komórką obejmuje części, które są zewnątrzkomórkowe, a zastosowanie ponadto obejmu104

PL 202 399 B1 je zastosowanie co najmniej jednego drugiego analogu antygenu polipeptydowego albo fragmentu kwasu nukleinowego kodującego jeden drugi analog antygenu polipeptydowego lub co najmniej jednego niepatogennego mikroorganizmu lub wirusa niosącego fragment kwasu nukleinowego kodującego co najmniej jeden drugi analog antygenu polipeptydowego do wytwarzania immunogennej kompozycji do skutecznego prezentowania zwierzęcemu układowi odpornościowemu immunogennie skutecznej ilości co najmniej jednego drugiego analogu antygenu polipeptydowego, który zawiera modyfikację struktury antygenu polipeptydowego, której efektem jest indukowanie wytwarzania przeciwciał przeciw antygenowi polipeptydowemu związanemu z komórką po immunizacji zwierzęcia drugim analogiem.

7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że modyfikacja polega na tym, że co najmniej jeden drugi obcy epitop TH jest włączony do drugiego analogu.

8. Zastosowanie według zastrz. 6 lub 7, znamienne tym, że drugi analog obejmuje znaczną frakcję epitopów limfocytów B antygenu polipeptydowego związanego z komórką.

9. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że w wariancie (a) do pierwszego i/lub drugiego analogu(ów) jest włączone co najmniej jedno pierwsze ugrupowanie skutecznie kierujące analog do komórki prezentującej antygen (APC) i/lub co najmniej jedno drugie ugrupowanie stymulujące układ odpornościowy i/lub co najmniej jedno trzecie ugrupowanie optymalizujące prezentację analogu układowi odpornościowemu.

10. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że w wariancie (a) pierwszy i/lub drugi analog obejmuje podwojenie co najmniej jednego epitopu limfocytów B lub co najmniej jednego epitopu CTL antygenu polipeptydowego związanego z komórką.

11. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że w wariancie (a) co najmniej pierwszy i/lub drugi analog obejmuje wprowadzony hapten.

12. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że w wariancie (a) pierwszy i/lub drugi obcy epitop TH jest immunodominujący.

13. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że w wariancie (a) pierwszy i/lub drugi obcy epitop TH jest mieszany.

14. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że pierwszy i/lub drugi obcy epitop TH jest wybrany spośród naturalnego epitopu TH i sztucznej sekwencji peptydowej wiążącej MCH-II.

15. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że naturalny epitop TH jest wybrany z spośród epitopu toksoidu tężcowego, takiego jak P2 lub P30, epitopu toksoidu błonniczego, epitopu hemaglutyniny wirusa grypy i epitopu CS z P. falciparum.

16. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że pierwsze i/lub drugie i/lub trzecie ugrupowanie są obecne w postaci

- grup bocznych przyłączonych kowalencyjnie lub niekonwalencyjnie do odpowiednich grup chemicznych w sekwencji aminokwasowej antygenu polipeptydowego związanego z komórką lub jego podsekwencji i/lub

- partnerów fuzyjnych z sekwencją aminokwasową pochodzącą z antygenu polipeptydowego związanego z komórką.

17. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że pierwsze ugrupowanie jest zasadniczo specyficznym partnerem wiążącym dla specyficznego antygenu powierzchniowego APC, takim jak węglowodan, dla którego na powierzchni APC znajduje się receptor, np. mannan lub mannoza.

18. Zastosowanie według zastrz. 16 lub 17, znamienne tym, że drugie ugrupowanie jest cytokiną wybraną spośród interferonu γ (IFN-γ). Flt3L, interleukiny 1 (IL-1), interleukiny 2 (IL-2), interleukiny 4 (IL-4), interleukiny 6 (IL-6), interleukiny 12 (IL-12), interleukiny 13 (IL-13), interleukiny 15 (IL 15) i czynnika stymulującego kolonie granulocytów-makrofagów (GM-CSF) lub ich aktywnej części; białka szoku cieplnego wybranego spośród HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 i kalretikuliny (CRT) lub ich aktywnej części i hormonu.

19. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że trzecie ugrupowanie jest lipidem, takim jak grupa palmoilowa, grupa mirystylowa, grupa farnezylowa, grupa geranyl-geranyl, kotwicząca grupa GPI i grupa N-acylodiglicerydowa.

20. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że pierwszy i/lub, gdzie jest to odpowiednie, drugi analog ma zasadniczo ogólną strukturę trzeciorzędową części zewnątrzkomórkowych antygenu polipeptydowego związanego z komórką.

21. Zastosowanie według zastrz. 6 lub 7, znamienne tym, że z kompozycją podawana jest również immunologicznie skuteczna ilość co najmniej jednego drugiego analogu.

PL 202 399 B1

105

22. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że w wariancie (a) co najmniej jeden pierwszy i/lub drugi analog jest sformułowany razem z farmaceutycznie i immunologicznie akceptowalnym nośnikiem i/lub podłożem.

23. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że w wariancie (a) adiuwant ułatwia wychwyt przez APC, takie jak komórki dendrytyczne, co najmniej pierwszego i/lub drugiego analogu.

24. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że adiuwant jest wybrany z grupy składającej się z immunogennego adiuwanta kierującego; immunogennego adiuwanta modulującego, takiego jak toksyna, cytokina i pochodne z mykobakterii; preparatu olejowego; polimeru; adiuwanta tworzącego micele; saponiny; macierzy kompleksu immunostymulującego (macierz ISCOM); cząstki; DDA; adiuwantów glinowych; adjuwantów DNA, γ-inuliny i adiuwantów zamykających.

25. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że cytokina jest cytokiną określoną w zastrz. 18 lub jej skuteczną częścią, toksyna jest wybrana z grupy obejmującej listeriolicynę (LLO), lipid A (MPL, L180.5/RalLPS) i wrażliwą na ciepło enterotoksynę, pochodna z mykobakterii jest wybrana z grupy obejmującej muramylodipeptyd, kompletny adiuwant Freund'a, RIBI i diester trehalozy, taki jak TDM i TDE, a immunogenny adiuwant kierujący jest wybrany z grupy obejmującej ligand CD40, przeciwciała przeciw CD40 lub jego specyficznie wiążące fragmenty, mannozę, fragment Fab i CTLA-4, preparat olejowy zawiera skwalen lub niekompletny adiuwant Freund'a, polimer jest wybrany z grupy obejmującej węglowodany, takie jak dekstran, PEG, skrobia, mannan i mannoza; polimery stanowiące tworzywa sztuczne jako takie, i lateks, taki jak perełki lateksowe, saponiną jest saponina z Quillaja saponaria, Quil A i QS21, a cząstki stanowią lateks lub dekstran.

26. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że w wariancie (a) co najmniej jeden pierwszy analog w wytworzonej kompozycji jest podawany drogą wybraną spośród drogi doustnej i pozajelitowej, takiej jak śródskórna, podskórna, donabłonkowa, lub podnabłonkowa, dootrzewnowa, dopoliczkowa, podjęzykowa, nadtwardówkowa, dokręgowa, doodbytnicza i droga śródczaszkowa.

27. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że w wariancie (a) co najmniej jeden pierwszy analog w wytworzonej kompozycji jest podawany co najmniej raz w roku, tak jak przynajmniej 2, 3, 4, 5, 6 lub 12 razy w ciągu roku.

28. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że w wariancie (c) niepatogenny mikroorganizm lub wirus niesie co najmniej jeden fragment kwasu nukleinowego, który koduje i wyraża co najmniej pierwszy analog jak określony w zastrz. 1, 3-5 i 9-20.

29. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że w wariancie (c) epitop TH i/lub pierwsze i/lub drugie i/lub trzecie ugrupowanie jak określone w zastrz. 16-19 są obecne w postaci partnerów fuzyjnych z sekwencją aminokwasową pochodzącą z antygenu polipeptydowego związanego z komórką, a niepatogenny mikroorganizm lub wirus niesie co najmniej jeden fragment kwasu nukleinowego kodującego i wyrażającego pierwszy i/lub drugi analog.

30. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że w wariancie (c) niepatogenny mikroorganizm lub wirus niesie co najmniej jeden fragment kwasu nukleinowego kodującego i wyrażającego co najmniej drugi analog.

31. Zastosowanie według zastrz. 30, znamienne tym, że niepatogenny mikroorganizm lub wirus w kompozycji jest podawany zwierzęciu jeden raz.

32. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że w wariancie (b) co najmniej jeden fragment kwasu nukleinowego koduje i wyraża pierwszy analog jak określony w zastrz. 1,3-5 i 9-20.

33. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że w wariancie (b) epitop TH i/lub pierwsze i/lub drugie i/lub trzecie ugrupowanie są w postaci partnerów fuzyjnych z sekwencją aminokwasową pochodzącą z antygenu polipeptydowego związanego z komórką, a co najmniej jeden fragment kwasu nukleinowego koduje i wyraża pierwszy i/lub drugi analog.

34. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że w wariancie (b) ponadto obejmuje zastosowanie co najmniej jednego fragmentu kwasu nukleinowego kodującego i wyrażającego drugi analog określony w zastrz. 6-20 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do wprowadzania in vivo do APC co najmniej jednego fragmentu kwasu nukleinowego kodującego i wyrażającego drugi analog.

35. Zastosowanie według zastrz. 1 lub 2, znamienne tym, że wytwarza się kompozycję do podawania co najmniej dwóch fragmentów kwasu nukleinowego, z których jeden koduje i wyraża co najmniej jeden epitop CTL, a drugi koduje i wyraża co najmniej jeden pierwszy obcy epitop TH jak określony w zastrz. 1 i 12-15.

36. Zastosowanie według zastrz. 1 lub 32 lub 33 lub 34, znamienne tym, że w wariancie (b) wprowadzony fragment(y) kwasu nukleinowego jest/są wybrany spośród nagiego DNA, DNA sformu106

PL 202 399 B1 łowanego z lipidami posiadającymi lub nieposiadającymi ładunku, DNA zawartego w liposomach, DNA wbudowanego do wektora wirusowego, DNA sformułowanego z białkiem lub polipeptydem umożliwiającym transfekcję, DNA sformułowanego z białkiem lub polipeptydem kierującym, DNA sformułowanego z kierującym węglowodanem, DNA sformułowanego z czynnikami wytrącającymi wapń, DNA przyłączonego do obojętnej cząsteczki nośnika i DNA sformułowanego z adiuwantem.

37. Zastosowanie według zastrz. 36, znamienne tym, że adiuwant jest wybrany z grupy obejmującej adiuwanty określone w zastrz. 23-25.

38. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że w wariancie (b) tryb podania wytworzonej kompozycji jest określony w zastrz. 26 lub 27.

39. Sposób selekcji immunogennego analogu antygenu polipeptydowego związanego z komórką, który w zwierzęciu jest słabo imunogenny lub nieimmunogenny, zdolnego do indukcji w zwierzęciu odpowiedzi CTL przeciw komórkom prezentującym cząsteczkę MHC klasy I związaną z epitopem pochodzącym z antygenu polipeptydowego związanego z komórką, znamienny tym, że obejmuje

a) identyfikację przynajmniej jednej podsekwencji sekwencji aminokwasowej antygenu polipeptydowego związanego z komórką, która nie zawiera znanych lub przewidywanych epitopów CTL,

b) wytworzenie przynajmniej jednego potencjalnie immunogennego analogu antygenu polipeptydowego związanego z komórką, przez wprowadzenie do sekwencji aminokwasowej antygenu polipeptydowego związanego z komórką przynajmniej jednego obcego dla zwierzęcia epitopu TH, w miejsce w obrębie przynajmniej jednej podsekwencji zidentyfikowanej w punkcie a) i

c) selekcję tego/tych analogów wytworzonych w etapie b), które zostały zweryfikowane z uwagi na ich zdolność do wywoływania u zwierzęcia odpowiedzi CTL, przy czym antygen polipeptydowy związany z komórką jest wybrany spośród antygenu polipeptydowego związanego z nowotworem, własnego białka, antygenu polipeptydowego wirusowego, antygenu polipeptydowego pochodzącego z wewnątrzkomórkowego pasoż yta lub bakterii.

40. Zastosowanie według zastrz. 39, znamienne tym, że

i) podsekwencja zidentyfikowana w etapie a) nie zawiera też reszt cysteiny lub alternatywnie, epitop TH wprowadzony w etapie b) nie różni się zasadniczo wzorem reszt cysternowych i/lub ii) podsekwencja zidentyfikowana w etapie a) nie zawiera też znanych lub przewidywanych miejsc glikozylacji lub alternatywnie, wprowadzony w etapie b) epitop TH zasadniczo nie zmienia wzoru glikozylacji i/lub iii) podsekwencja zidentyfikowana w etapie a) przyczynia się znacząco do patofizjologicznego działania wywieranego przez antygen polipeptydowy związany z komórką i wprowadzony w etapie b) obcy epitop TH zmniejsza lub znosi to wspomniane działanie patofizjologiczne i/lub iv) podsekwencja zidentyfikowana w etapie a) jest homologiczna do sekwencji aminokwasowej innego antygenu białkowego zwierzęcia i wprowadzenie epitopu TH w etapie b) zasadniczo usuwa homologię i/lub

v) wprowadzenie w etapie b) obcego epitopu TH daje zachowanie zasadniczej frakcji epitopów limfocytów B antygenu polipeptydowego związanego z komórką.

41. Sposób według zastrz. 40, znamienny tym, że w wariancie v) analogi mają ogólną trzeciorzędową strukturę antygenu polipeptydowego związanego z komórką.

42. Sposób wytwarzania komórki wytwarzającej analog antygenu polipeptydowego związanego z komórką , znamienny tym, ż e obejmuje wprowadzenie do wektora sekwencji kwasu nukleinowego kodującej analog, który został wybrany sposobem określonym w zastrz. 39-41 i transformowanie wektorem odpowiedniej komórki gospodarza.

43. Sposób wytwarzania analogu antygenu polipeptydowego związanego z komórką, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki wytworzonej sposobem określonym w zastrz. 42 w warunkach ułatwiających ekspresję sekwencji kwasu nukleinowego kodującej antygen polipeptydowy związany z komórką i odzyskiwanie analogu z supernatantu hodowli lub z komórek.

44. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje etap oczyszczania odzyskanego analogu i ewentualnie poddania oczyszczonego produktu sztucznemu procesowi modyfikacji posttranslacyjnej, takiemu jak składanie, traktowanie enzymami, modyfikacja chemiczna i koniugacja.

45. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że słaby związany z komórką antygen jest wybrany z grupy obejmującej 5-alfa reduktazę, α-fetoproteinę, AM-1, APC, APRIL, BAGE, β-kateninę, Be12, bcr-abl (b3a2), CA-125, CASP-8/FLICE, katepsyny, CD19, CD20, CD21, CD23, CD22, CD33, CD35, CD44, CD45, CD46, CD5, CD52, CD55 (791Tgp72), CD59, CDC27, CDK4, CEA, c-myc, Cox-2,

PL 202 399 B1

107

DCC, DcR3, E6/E7, EGFR, EMBP, Ena78, transferazę farnezylową, FGF8a lub FGF8b, FLK-1/KDR, receptor kwasu foliowego, w G250, rodzinę GAGE, gastrynę 17, hormon uwalniający gastrynę (bombezyna), GD2/GD3/GM2, GnRH, GnTV, GP1, gp100/Pmel 17, gp-100-in4, gp15, gp75/TRP-1, hCG, heparanazę, Her2/neu, HMTV, Hsp70, hTERT (telomeraza), IGFR1, IL-13R, iNOS, Ki 67, KIAA0205, K-ras, H-ras, N-ras, KSA (CO17-1A), LDLR-FUT, rodzinę MAGE (MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, itp.), mammaglobinę, MAP17, Melan-A/MART-1, mezotelinę, MIC A/B, MT-MMP, Mox1, mucynę, taką jak MUC-1, MUC-2, MUC-3 i MUC-4, które są nieprawidłowo glikozylowane, MUM-1, NY-ESO-1, osteonektynę, p15, p170/MDR1, p53, p97/melanotransferynę, PAI-1, PDGF, plazminogen (uPA), PRAME, probazynę, progenipoetynę, PSA, PSM, RAGE-1, Rb, RCAS1, SART-1, rodzinę genu SSX, STAT3,

STn (towarzyszące mucynie), TAG-72, TGF-α, TGF-β, tymozynę β 15, TNF-α, TPA, TPI, TRP-2, tyrozynazę, VEGF, ZAG, p16INK4 i S-transferazę glutationową.

46. Zastosowanie według zastrz. 45, znamienne tym, że antygen polipeptydowy związany z komórkąjest ludzkim PSM.

47. Zastosowanie według zastrz. 46, znamienne tym, że obcy epitop limfocytu T jest wprowadzony do części sekwencji aminokwasowej PSM określonej przez SEK. ID. NR: 2 pozycje 16-52 i/lub

87-108 i/lub 210-230 i/lub 269-289 i/lub 298-324 i/lub 442-465 i/lub 488-514 i/lub 598-630 i/lub 643662 i/lub 672-699.

48. Zastosowanie według zastrz. 46 lub 47, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna jest stosowana do leczenia lub łagodzenia nowotworu prostaty.

49. Zastosowanie według zastrz. 45, znamienne tym, że antygen polipeptydowy związany z komórką jest czynnikiem wzrostu fibroblastu 8b (FGF8b).

50. Zastosowanie według zastrz. 49, znamienne tym, że obcy epitop limfocytu T jest wprowadzony do części sekwencji aminokwasowej FGF8b określonej przez SEK. ID. NR: 6 pozycje 1-54 i/lub 178/215 i/lub 55-58 i/lub 63-68 i/lub 72-76 i/lub 85-91 i/lub 95-102 i/lub 106-111 i/lub 115-120 i/lub 128-134 i/lub 138-144 i/lub 149-154 i/lub 158-162 i/lub 173-177, przy czym wprowadzenie korzystnie nie obejmuje zasadniczo aminokwasów 26-45 i aminokwasów 186-215.

51. Zastosowanie według zastrz. 49 lub 50, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna jest stosowana do leczenia lub łagodzenia nowotworu, takiego jak nowotwór stercza i nowotwór sutka.

52. Zastosowanie według zastrz. 45, znamienne tym, że antygenem polipeptydowym związanym z komórką jest Her2.

53. Zastosowanie według zastrz. 52, znamienne tym, że obcy epitop limfocytu T jest wprowadzony do części sekwencji aminokwasowej Her2 określonej przez SEK. ID. NR: 3 w pozycjach 5-25 i/lub 59-73 i/lub 103-117 i/lub 149-163 i/lub 210-224 i/lub 250-264 i/lub 325-339 i/lub 369-383 i/lub 465-479 i/lub 579-593 i/lub 632-652 i/lub 653-667 i/lub 661-675 i/lub 695-709 i/lub 710-730.

54. Zastosowanie według zastrz. 52 lub 53, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna jest stosowana do leczenia lub łagodzenia nowotworu sutka.

55. Analog ludzkiego PSM, który jest immunogenny u ludzi, znamienny tym, że obejmuje istotną część wszystkich znanych i przewidywanych CTL i epitopy limfocytu B z PSM i zawiera przynajmniej jeden obcy epitop TH jak określony w zastrz. 12-15.

56. Analog według zastrz. 55, znamienny tym, że przynajmniej jeden obcy epitop TH jest obecny jako wstawka w sekwencji aminokwasowej PSM lub jako podstawienie części sekwencji aminokwasowej PSM lub jako wynik delecji części sekwencji aminokwasowej PSM.

57. Analog według zastrz. 56, znamienny tym, że obcy epitop TH jest wprowadzony w pozycje określone w zastrz. 47.

58. Analog ludzkiego Her2, który jest immunogenny u ludzi, znamienny tym, że obejmuje istotną część wszystkich znanych i przewidywanych CTL i epitopy Her2 limfocyta B2 i zawiera przynajmniej jeden obcy epitop TH jak określony w zastrz. 12-15.

59. Analog według zastrz. 58, znamienny tym, że przynajmniej jeden obcy epitop TH jest obecny jako wstawka w sekwencji aminokwasowej Her2 lub jako podstawienie części sekwencji aminokwasowej Her2 lub jako wynik delecji części sekwencji aminokwasowej Her2.

60. Analog według zastrz. 59, znamienny tym, że obcy epitop TH jest wprowadzony w pozycje określone w zastrz. 53.

61. Analog ludzkiego/mysiego FGF8b, który jest immunogenny u ludzi, znamienny tym, że obejmuje istotną część wszystkich znanych i przewidywanych CTL i epitopy FGF8b limfocytu B i zawiera przynajmniej jeden obcy epitop TH jak określony w zastrz. 12-15.

108

PL 202 399 B1

62. Analog według zastrz. 61, znamienny tym, że przynajmniej jeden obcy epitop TH jest obecny jako wstawka w sekwencji aminokwasowej FGF8b lub jako podstawienie części sekwencji aminokwasowej FGF8b lub jako wynik delecji części sekwencji aminokwasowej FGF8b.

63. Analog według zastrz. 62, znamienny tym, że obcy epitop TH jest wprowadzony w pozycje określone w zastrz. 50.

64. Kompozycja immunogenna, znamienna tym, że zawiera jako skuteczny czynnik immunogenny analog określony w zastrz. 55 albo 58 albo 61 zmieszany z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub zaróbką i ewentualnie adiuwantem.

65. Fragment kwasu nukleinowego kodujący analog określony w zastrz. 55 lub 58 lub 61.

66. Wektor niosący fragment kwasu nukleinowego określony w zastrz. 65.

67. Wektor według zastrz. 66, znamienny tym, że jest zdolny do autonomicznej replikacji.

68. Wektor według zastrz. 66 lub 67, znamienny tym, że jest wybrany z grupy obejmującej plazmid, fag, kosmid, minichromosom i wirus.

69. Wektor według zastrz. 66, znamienny tym, że zawiera w kierunku 5' -3' przyłączony funkcjonalnie promotor kierujący ekspresją fragmentu kwasu nukleinowego określonego w zastrz. 65, ewentualnie sekwencję kwasu nukleinowego kodującą peptyd liderowy umożliwiający sekrecję lub wbudowanie do błony fragmentu polipeptydu, fragment kwasu nukleinowego określony w zastrz. 65 i ewentualnie sekwencję kwasu nukleinowego kodującą terminator.

70. Wektor według z zastrz. 66 lub 69, znamienny tym, że gdy jest wprowadzony do komórki gospodarza, integruje się z genomem komórki gospodarza lub nie jest zdolny do integracji z genomem komórki.

71. Stransformowana komórka niosąca wektor określony w zastrz. 66.

72. Kompozycja do indukowania wytwarzania przeciwciał przeciw PSM, Her2 lub FGF8b, znamienna tym, że zawiera

73. Stabilna linia komórkowa, znamienna tym, że niesie wektor określony w zastrz. 66 i który wyraża fragment kwasu nukleinowego określony w zastrz. 65 i która ewentualnie wydziela lub niesie na swojej powierzchni analog określony w zastrz. 55 albo 58 albo 61.

74. Sposób wytwarzania komórki określonej w zastrz. 73, znamienny tym, że obejmuje transformację in vitro komórki gospodarza fragmentem kwasu nukleinowego określonym w zastrz. 65 lub wektorem określonym w zastrz. 66.

75. Sposób według zastrz. 39 lub 42, znamienny tym, że słaby antygen związany z komórkąjest wybrany z grupy składającej się z 5-alfa reduktazy, α-fetoproteiny, AM-1, APC, APRIL, BAGE, β-kateniny, Be12, bcr-abl (b3a2), CA-125, CASP-8/FLICE, katepsyn, CD19, CD20, CD21, CD23, CD22, CD33, CD35, CD44, CD45, CD46, CD5, CD52, CD55 (791Tgp72), CD59, CDC27, CDK4, CEA, c-myc, Cox-2, DCC, DcR3, E6/E7, EGFR, EMBP, Ena78, transferazy farnezylowej, FGF8a lub FGF8b, FLK-1/KDR, receptora kwasu foliowego, G250, rodziny GAGE, gastryny 17, hormonu uwalniającego gastrynę (bombezyna), GD2/GD3/GM2, GnRH, GnTV, GP1, gp100/Pmel 17, gp-100-in4, gp15, gp75/TRP-1, hCG, heparanazy, Her2/neu, HMTV, Hsp70, hTERT (telomeraza), IGFR1, IL-13R, iNOS, Ki 67, KIAA0205, K-ras, H-ras, N-ras, KSA (CO17-1A), LDLR-FUT, rodzinę MAGE (MAGE-1, MAGE2, MAGE-3, itp.), mammaglobiny, MAP17, Melan-A/MART-1, mezoteliny, MIC A/B, MT-MMP, Mox1, mucyny, takiej jak MUC-1, MUC-2, MUC-3 i MUC-4, które są nienormalnie glikozylowane, MUM-1, NY-ESO-1, osteonektyny, p15, p170/MDR1, p53, p97/melanotransferyny, PAI-1, PDGF, plazminogenu (uPA), PRAME, probazyny, progenipoetyny, PSA, PSM, RAGE-1, Rb, RCAS1, SART-1, rodziny genu SSX, STAT3, STn (towarzyszące mucynie), TAG-72, TGF-α, TGF-β, tymozyny β 15, TNF-α, TPA, TPI, TRP-2, tyrozynazy, VEGF, ZAG, p16INK4 i S-transferazy glutationowej.

76. Sposób według zastrz. 75, znamienny tym, że antygen polipeptydowy związany z komórkąjest ludzkim PSM.

77. Sposób według zastrz. 76, znamienny tym, że obcy epitop limfocytu T jest wprowadzony w części sekwencji aminokwasowej PSM określonej w SEK. ID. NR: 2 w pozycjach 16-52 i/lub 87-108 i/lub 210-230 i/lub 269-289 i/lub 298-324 i/lub 442-465 i/lub 488-514 i/lub 598-630 i/lub 643-662 i/lub 672-699.

78. Sposób według zastrz. 75, znamienny tym, że antygenem polipeptydowym związanym z komórką jest czynnik wzrostu fibroblastów 8b (FGF8b).

PL 202 399 B1

109

79. Sposób według zastrz. 78, znamienny tym, że obcy epitop limfocytu T jest wprowadzony w części sekwencji aminokwasowej FGF8b okreś lonej w SEK. ID. NR: 6 w pozycjach 1-54 i/lub 178/215 i/lub 55-58 i/lub 63-68 i/lub 72-76 i/lub 85-91 i/lub 95-102 i/lub 106-111 i/lub 115-120 i/lub 128-134 i/lub 138-144 i/lub 149-154 i/lub 158-162 i/lub 173-177, przy czym wprowadzenie korzystnie nie dotyczy zasadniczo aminokwasów 26-45 i aminokwasów 186-215.

80. Sposób według zastrz. 75, znamienny tym, że antygenem polipeptydowym związanym z komórką jest Her2.

81. Sposób według zastrz. 80, znamienny tym, że obcy epitop limfocytu T jest wprowadzony w części sekwencji aminokwasowej Her2 okreś lonej przez SEK. ID. NR: 3 w pozycjach 5-25 i/lub 5973 i/lub 103-117 i/lub 149-163 i/lub 210-224 i/lub 250-264 i/lub 325-339 i/lub 369-383 i/lub 465-479 i/lub 579-593 i/lub 632-652 i/lub 653-667 i/lub 661-675 i/lub 695-709 i/lub 710-730.