PT2100618E

PT2100618E - Um anticorpo anti-pdgfr-alfa para o tratamento de cancro ósseo metastático

Info

Publication number: PT2100618E
Application number: PT90751025T
Authority: PT
Inventors: Nick Loizos; Nathan Graeme Dolloff; Alessandro Fatatis
Original assignee: Philadelphia Health & Educatio; Imclone Llc
Priority date: 2005-06-17
Filing date: 2006-06-19
Publication date: 2014-04-07
Also published as: EP2100614B8; EP2100614A3; JP2012179060A; PL2100618T3; RU2009115364A; IL188151A0; HUS1700015I1; CY1114603T1; LUC00012I2; KR20090027774A; CY2017013I2; RU2009115363A; DK2100618T3; CY1115076T1; US8574578B2; US8425911B2; CN101500597A; IL198870A; KR20090027773A; SI2100614T1

Description

ΡΕ2100618 1

DESCRIÇÃO

"UM ANTICORPO ΑΝΤΙ—PDGFR—ALFA PARA O TRATAMENTO DE CANCRO ÓSSEO METASTÁTICO"

Este pedido de patente reivindica o beneficio do Pedido Provisório U.S. No. 60/691,920.

CAMPO DA INVENÇÃO A divulgação proporciona métodos para o tratamento do cancro ósseo, em particular do cancro metastático ósseo, através da administração um antagonista de IGF-IR e/ou um antagonista de PDGFRa. A presente divulgação proporciona também anticorpos que se ligam a PDGFRa humanos e que neutralizam a activação dos receptores. A presente divulgação proporciona ainda um método para neutralizar a activação de PDGFRa, e um método de tratamento de um mamífero com uma doença neoplásica utilizando os anticorpos isoladamente ou em combinação com outros agentes.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O cancro de próstata é mais comum entre os homens, com cerca de 220000 casos e 29000 mortes por ano nos Estados Unidos da América. Uma proporção significativa ΡΕ2100618 dos homens diagnosticados com cancro de próstata têm doença metastática. Além disso, as metástases eventualmente se desenvolvem em muitos outros pacientes de cancro de próstata apesar do tratamento com cirurgia ou radioterapia. 0 osso é o local mais comum da metástase do cancro da próstata, e é também um local para onde o cancro do pulmão e o cancro da mama frequentemente metastizam. A maioria das metástases de próstata são androgénio-dependentes, de modo a que existe uma resposta rápida à castração cirúrgica ou médica, mas em virtualmente todos os pacientes, o tumor eventualmente se torna androgénio independente, conduzindo a uma morbilidade e mortalidade significativas. Assim que as metástases ósseas ocorrem, os tratamentos actualmente disponíveis têm um efeito limitado. A terapia mais eficaz aprovada que foi descrita para o cancro de próstata metastático (administração de docetaxel) prolonga a sobrevivência média em aproximadamente três meses. (Petrylak et al., 2004, N. Engl. J. Med. 351: 1513; Tannock et al., 2004, N. Engl. J. Med. 351: 1502) Assim, novas terapias para o cancro metastático ósseo são urgentemente necessárias. O receptor do factor de crescimento similar à insulina (IGF-IR) é um receptor de tirosina cinase transmembranar omnipresente que é essencial para o normal crescimento e desenvolvimento fetal e pós-natal. O IGF-IR está localizado na superfície celular da maioria dos tipos de células e serve como molécula sinalizadora para os factores de crescimento IGF-I e IGF-II (colectivamente 3 ΡΕ2100618 denominados doravante IGFs). 0 IGF-IR pode estimular a proliferação celular, diferenciação celular, alterações no tamanho das células, e proteger as células da apoptose. Foi também considerado como sendo quase obrigatório para transformação de células (revisão em Adams et al., Cell. Mol. Life Sei. 57: 1050-93 (2000); Baserga, Oncogene 19: 5574-81 (2000)). Elevados niveis de expressão de IGF-IR foram registados em amostras de tecidos de metástases ósseas do cancro da próstata. O osso contém a maior reserva de IGFs no corpo. O IGF-IR é um hetero-tetrâmero preformado contendo duas cadeias alfa e duas cadeias beta covalente-mente ligados por ligações dissulfureto. As subunidades de receptores são sintetizadas como parte de uma única cadeia polipeptidica de 180 kd, que é depois proteoliticamente transformada em subunidades alfa (130 kd) e beta (95 kd). A totalidade da cadeia alfa é extracelular e contém o local para a ligação ao ligando. A cadeia beta possui o domínio transmembranar, o domínio tirosina cinase, e uma extensão C-terminal que é necessária para a diferenciação celular e transformação, mas é dispensável para sinalização de mitogénio e protecção contra apoptose.

O IGF-IR é bastante semelhante ao receptor da insulina (IR), particularmente no interior da sequência da cadeia beta (70% de homologia). Devido a esta homologia, estudos recentes têm demonstrado que estes receptores podem formar híbridos contendo um dímero IR e um dímero IGF-IR 4 ΡΕ2100618 (Pandini et al., Clin. Canc. Res. 5: 1935-19 (1999)). A formação de híbridos ocorre tanto em células normais como transformadas e o conteúdo dos híbridos é dependente da concentração dos dois homo-dímeros receptores (IR e IGF-IR) no interior da célula. Embora os receptores híbridos sejam compostos de pares IR e IGF-IR, os híbridos ligam-se selectivamente a IGFs, com afinidade semelhante àquela do IGF-IR, e apenas se ligam fracamente à insulina (Siddle e Soos, The IGF System. Human Press, págs. 199-225. 1999). Como tal, esses híbridos podem se ligar a IGFs e converter sinais tanto em células normais como em transformadas.

Um segundo receptor IGF, IGF-IIR, ou receptor manose-6-fosfato (M6P), também se liga ao ligando IGF-II com alta afinidade, mas não apresenta actividade de tirosina cinase (Oates et al., Breast Câncer Res. Treat. 47: 269-81 (1998)). Dado que resulta na degradação da IGF-II, é considerado um sumidouro de IGF-II, antagonizando os efeitos de promoção do crescimento deste ligando. A perda do IGF-IIR em células tumorais pode aumentar o potencial de crescimento através da liberação de seu efeito antagonista na ligação do IGF-II com o IGF-IR (Byrd et al. J. Biol. Chem. 274: 24408-16 (1999))

Os receptores de factor de crescimento alfa e beta (PDGFRa e PDGFRP) derivados de plaquetas, são receptores tirosina cinases de tipo III. PDGFRa é crucial para o desenvolvimento e cumpre funções importantes na vida adulta. Por exemplo, ratinhos homozigóticos para uma 5 ΡΕ2100618 mutação nula morrem durante a embriogénese. Em fases posteriores de desenvolvimento, PDGFRa é expresso em muitas estruturas mesenquimais, enquanto que células epiteliais adjacentes produzem plaquetas derivadas dos factores de crescimento (PDGFs). Amostras de tecido de glândulas da próstata normais ou hiperplásicas testam negativo para PDGFRa, enquanto tumores primários de próstata e massas esqueléticas de indivíduos correspondentes expressam PDGFRa. Além disso, de linhagens celulares de próstata obtidas a partir de diferentes locais metastáticos, encontra-se PDGFRa em células PC3 derivadas de metástases óssea, mas não em linhagens celulares obtidas a partir de metástases dos gânglios linfáticos (LNCaP) e do cérebro (DU-145). A família de factores de crescimento derivada de plaquetas de factores de crescimento consiste em cinco diferentes dimeros ligados por ligações de dissulfureto, PDGF-AA, -BB, -AB, ;-CC, e -DD, que actuam através de PDGFRa e PDGFRP. Estes factores de crescimento são moléculas diméricas compostas por cadeias polipeptídicas ligadas por ligações dissulfureto que se ligam a duas proteínas receptoras simultaneamente e induzem a dime- rização, autofosforilação, e sinalização intracelular dos receptores. PDGFRa e PDGFRP são estruturalmente semelhantes e podem formar hetero-dímeros bem como homo-dímeros. Dado que PDGFRP não se liga à cadeia PDGF-A com grande afinidade, PDGF-AA apenas activa receptores dimeros αα, enquanto PDGF-AB e PDGF-CC activam receptores hetero-dímeros αα e ap. 6 ΡΕ2100618

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta divulgação refere-se ao tratamento de tumores primários e metástases ósseas, incluindo tumores originados na próstata, mama, pulmão e expressam o receptor do factor de crescimento I similar à insulina (IGF-IR) e/ou o receptor alfa do factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGFRa).

Os tumores a serem tratados podem ser dependentes de hormona/androgénio ou independentes de hormona/andro-génio, e podem ser originados, por exemplo, na próstata, mama, ou pulmão. A presente divulgação proporciona métodos para o tratamento de um indivíduo que tenha um tumor ósseo, bem como os métodos de inibir o crescimento de um tumor ósseo. Os métodos compreendem a administração de uma quantidade eficaz de um antagonista IGF-IR ou uma quantidade eficaz de um antagonista de PDGFRa. Os antagonistas dos receptores incluem anticorpos e fragmentos de anticorpos, bem como inibidores intracelulares de moléculas pequenas. A presente divulgação proporciona anticorpos anti-IGF-IR ou anti-PDGFRa que se ligam aos seus receptores alvo e inibem a ligação ao ligando. A divulgação fornece também anticorpos e outros antagonistas que neutralizam a activação de IGF-IR ou de PDGFRa. Além disso 7 ΡΕ2100618 certos anticorpos promovem uma inibição dos seus receptores alvo, por exemplo, por internalização e/ou degradação. Por conseguinte, os anticorpos e antagonistas de moléculas pequenas funcionam no sentido de inibir a activação de moléculas sinalizadoras a jusante, como Akt, p42/p44, e MAPK.

Os métodos incluem a utilização de antagonistas IGF-IR ou PDGFRa isoladamente, em combinação uns com os outros ou em combinação com outros tratamentos para o cancro, tais como quimioterapia e radioterapia. A presente divulgação proporciona também anticorpos e fragmentos de anticorpos que se ligam a PDGFRa, bem como nucleótidos e a célula hospedeira para a produção de anticorpos. Os anticorpos bloqueiam a ligação ao ligando e neutralizam a activação de receptores. A divulgação também proporciona a utilização dos anticorpos sozinhos, em combinação com outros antagonistas de receptores ou agentes antineoplásicos, ou como conjugados para o tratamento de doença neoplásica. Anticorpos anti-PDGFRa são utilizados para tratar, por exemplo, tumores de ovário, tumores de mama, tumores pulmonares, tumores hepatocelulares, tumores estromais gastrointestinais, melanomas, carcinoma das células renais, tumores da próstata, e sarcomas dos tecidos moles.

De acordo com a presente invenção, proporciona-se um antagonista de PDGFRa para utilização no tratamento de ΡΕ2100618 um indivíduo com cancro ósseo metastático, em que o referido antagonista PDGFRa é um anticorpo ou um seu fragmento que é específico para PDGFRa humano e que compreende SSSYY (SEQ ID NO:2) em CDRHl; SFFYTGSTYYNPSLRS (SEQ ID N0:4) em CDRH2; QSTYYYGSGNYYGWFDR (SEQ ID NO:6) em CDRH3; RASQSVSSYLA (SEQ ID NO:10) em CDRLl;DDASNRAT (SEQ ID NO:12) em CDRL2;De QQRSNWPPA (SEQ ID NO:14) em CDRL3.

Preferentemente, o antagonista de PDGFRa é um anticorpo ou um seu fragmento compreendendo um domínio variável de cadeia pesada com QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSSSYYWGWLRQSPGKGLEWIGSFFY TGSTYYNPSLRSRLTISVDTSKNQFSLMLSSVTAADTAVYYCARQSTYYYGSGNY YGWFDRWDQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 8) ou um domínio variável de cadeia leve com EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPAFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 16).

Mais preferentemente, o antagonista PDGFRa é um anticorpo ou um seu fragmento compreendendo um domínio variável de cadeia pesada com QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSSSYYWGWLRQSPGKGLEWIGSFFY TGSTYYNPSLRSRLTISVDTSKNQFSLMLSSVTAADTAVYYCARQSTYYYGSGNY YGWFDRWDQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 8) e um domínio variável de cadeia leve com EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPAFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 16). 9 ΡΕ2100618

Preferentemente, o antagonista PDGFRa é um anticorpo ou um seu fragmento compreendendo uma cadeia pesada com

MGWSCIILFLVATATGVHSQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSSSYYWG

WLRQSPGKGLEWIGSFFYTGSTYYNPSLRSRLTISVDTSKNQFSLMLSSVTAADT

AVYYCARQSTYYYGSGNYYGWFDRWDQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS

GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSS

SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP

KTDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN\VAVDGVEVI3NAKTKTREEQYNSTY

RVVSVLTVLHQDWLNGKJiYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR

EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:31) e uma cadeia leve com MGWSCIILFLVATATGVHSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQ QKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSN WPPAFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:33).

De acordo com outro aspecto da presente invenção, proporciona-se um antagonista PDGFRa para utilização no tratamento de um indivíduo com cancro ósseo mestastásico, em que o referido antagonista PDGFRa é um anticorpo ou um eu fragmento que é específico para PDGFRa humano, em que o anticorpo ou o fragmento de anticorpo compete pela ligação a PDGFRa com um anticorpo da presente invenção.

Preferentemente, o tumor é metastizado de um cancro da próstata, cancro da mama ou cancro do pulmão. 10 ΡΕ2100618 O antagonista PDGFRa da presente invenção é preferentemente um que inibe a ligação de PDGFRa ou neutraliza PDGFRa.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra o crescimento de xeno-enxertos de tumores subcutâneos LuCaP 35V em ratinhos SCID castrados durante um periodo de tratamento iniciado quando os tumores atingiram 150-200 mm3. Painel A: controlos não tratados; Painel B: os animais foram tratados durante quatro semanas com docetaxel (tanto 10 mg/kg como 20 mg/kg) isoladamente, ou em combinação com anticorpos anti-IGF-IR (40 mg/kg de IMC-A12); Painel C: niveis séricos de PSA em ratinhos SCID não tratados e tratados transportando xeno-enxertos subcutâneos de tumores LuCaP 35V. Os ratinhos tratados receberam docetaxel (20 mg/kg) isoladamente ou docetaxel (tanto 10 mg/kg como 20 mg/kg), em combinação com anticorpos anti-IGF-IR (40 mg/kg IMC-A12). O tratamento foi iniciado quando os tumores tinham atingido 150-200 mm3 e finalizado após quatro semanas. A Figura 2 mostra suspensões células isoladas de xeno-enxertos de tumores LuCaP 35V tratados com docetaxel (10 mg/kg) isoladamente (Grupo A) ou em combinação com anticorpos anti-IGF-IR (40 mg/kg IMC-A12) (Painel B) . O campo denominado Rl corresponde a células apoptóticas com ADN fragmentado (aumento de marcação com FITC). 11 ΡΕ2100618 A Figura 3 mostra a síntese de ADN (absorção de BrDu) nos xeno-enxertos de tumores após suspensão do tratamento com docetaxel (10 mg/kg ou 20 mg/kg) isoladamente, e em combinação com anticorpos anti-IGF-IR (40 mg/kg IMC-A12). A Figura 4 representa a expressão diferencial de genes associados com a agressividade do tumor da próstata (TUBB), a resistência à terapia de anti-androgénio (BIRC 5) , e indução da apoptose (IGFBP3) nas células tumorais da próstata em resposta ao tratamento com docetaxel e A12 e apenas docetaxel. A Figura 5 mostra níveis séricos de A12 após suspensão do tratamento. A Figura 6 mostra o peso corporal (uma medida de citotoxicidade geral), de animais saudáveis tratados continuamente com docetaxel (ou 10 mg/kg ou 20 mg/kg) isoladamente, ou em combinação com anticorpos anti-IGF-IR (40 mg/kg IMC-A12). A Figura 7 mostra o efeito do tratamento com um anticorpo anti-IGF-IR (IMC-A12), em PSA produzida por xeno-enxertos em ratinhos SCID enxertados com células LuCaP 23.1. A Figura 8 mostra uma série de fotografias de 12 ΡΕ2100618 raios-X de ratinhos SCID enxertados com células LuCaP 23.1. Os ratinhos A12 receberam 40 mg/mL de IMC-A12 i.p. três vezes por semana durante seis semanas. As fotografias raios-X foram realizadas no momento do sacrifício. A Figura 9 mostra níveis de PSA (a) e radiografias representativas (b) de ratinhos SCID com xeno-enxertos intratibiais de células de próstata humana LuCaP 23.1. A Figura 10 representa o efeito de aspirado da medula óssea humana sobre a actividade de Akt nas células cancerosas de próstata. Os lisados celulares foram submetidos a SDS-PAGE. Para a análise "Western blot", as membranas foram marcadas com anticorpos direccionados para fosfo-Akt (Ser-473, Cell Signaling Technology), PDGFRa (R&D Systems) e actina (Sigma). A ligação ao anticorpo primário foi detectada utilizando proteína A ou proteína G conjugada com HRP (Sigma). A Figura 11 ilustra a indução e a inibição da fosforilação de AKT em células PC3-ML. O painel A mostra a inibição de fosforilação de Akt dependente da dose de AG-1296 em células expostas a 30 ng/mL PDFG-BB. O Painel B mostra fosforilação de Akt de aspirado ósseo e inibição por 20 μΜ AG-1296. O Painel C mostra a potência do aspirado da medula óssea para induzir fosforilação de Akt em comparação com a potência de uma combinação de 100 pg/mL de PDGF-AA e 100 pg/mL de PDGF-BB. O Painel D compara as magnitudes da 13 ΡΕ2100618 fosforilação de Akt induzida pelo aspirado de medula óssea, a inibição da fosforilação de Akt induzida pelo aspirado de medula óssea por AG-1296, e a fosforilação de Akt induzida por PDFG-AA + PDFG-BB. A Figura 12 ilustra a inibição da fosforilação de Akt em células PC3-ML por antagonistas PDGFRa. 0 painel A mostra o efeito dependente de dose do anticorpo monoclonal IMC-3G3 sobre a fosforilação de Akt induzida por 30 ng/mL de PDGF-BB. Os Painéis B e C proporcionam uma comparação dos efeitos de IMC-3G3 e AG1296 na fosforilação de Akt induzida pela medula óssea. 0 Painel D mostra gue a inibição da fosforilação de Akt é dependente do tempo de pré-incubação de IMC-3G3. A Figura 13 mostra a ligação do anticorpo ao PDGFRa. A: ligação directa de anticorpos anti-PDGFRa ao domínio extracelular imobilizado de PDGFRa. B: inibição da ligação de [ 125I]PDGF-AA a PDGFRa imobilizado. A Figura 14 mostra a inibição especifica da fosforilação de PDGFRa e moléculas efectoras a jusante. A Figura 15 mostra a inibição da incorporação de [3H]timidina estimulada por PDGF-AA em células PAE Ra por mAbs. A Figura 16 mostra a inibição da activação de moléculas efectoras a jusante induzida por PDGF-AA em células SKLMS-5 1 (A) e U118 (B). 14 ΡΕ2100618 A Figura 17 mostra a inibição da incorporação de [3H]timidina estimulada por PDGF-AA em células U118 (A) e SKLMS-1 (B) por mAbs. A inibição da incorporação de [3H]timidina estimulada por PDGF-BB também é mostrada para células SKLMS-1 (C) e U118 (D). A Figura 18 mostra efeitos dependentes da dose para o tratamento xeno-enxertos tumorais estabelecidos de U118 (glioblastoma; painel A) e SKLMS-1 (leiomiossarcoma; painel B) em ratinhos imunossuprimidos. A Figura 19 mostra a redução da fosforilação de PDGFRa in vivo em tumores U118 tratados com anticorpo anti-PDGFRa, em comparação com o tratamento com IgG humano não especifico. A Figura 20 ilustra vectores de expressão GS utilizados para a clonagem de genes das regiões variáveis VH e Vk humanas derivadas de hibridoma e a expressão das proteínas de cadeia leve e pesada (IgGl) humanas completas. Os dois vectores foram recombinados como explicado nos Exemplos e o vector combinado foi transfectado em células NSO .

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente divulgação refere-se ao tratamento de tumores ósseos com anticorpos ou fragmentos de anticorpos ΡΕ2100618 que se ligam ao receptor de factor de crescimento I similar à insulina (IGF-IR). A expressão endócrina de IGF-I é primeiramente regulado pela hormona de crescimento e produzida no fígado, mas outros tipos de tecidos também são capazes de expressar IGF-I, incluindo os ossos, que contém uma grande reserva de factores de crescimento. Dependendo do tipo de célula tumoral, IGF-I está envolvida na regulação endócrina, parácrina, e/ou autócrina (Yu, H. e Rohan, J., J. Natl. Câncer Inst. 92: 1472-89 (2000)).

Descobriu-se que os anticorpos que se ligam a IGF-IR são úteis em terapias para o tratamento de tumores ósseos que expressam IGF-IR. Os anticorpos podem ser usados isoladamente, ou em combinação com outros tratamentos do cancro, particularmente quimioterapias. A terapia anti-IGF-IR, isoladamente ou em combinação com a terapia com um ou mais agentes antineoplásicos (como, por exemplo, quimioterapia ou radioterapia) , tem significativa eficácia terapêutica. A supressão de crescimento tumoral é muitas vezes acompanhada por um aumento na apoptose e persiste depois que todo o tratamento seja interrompido e os tumores tenham começado novamente a crescer em animais tratados apenas com quimioterapia.

Também foi descoberto que PDGFRa desempenha um papel importante no crescimento de tumores ósseos. Por exemplo, algumas linhagens de células tumorais que expressam PDGFRa preferencialmente metastizam para o osso. Essas linhagens celulares apresentam um aumento da 16 ΡΕ2100618 activação de PDGFRa e da fosforilação de moléculas sinalizadoras a jusante em resposta aos factores solúveis presentes na medula óssea. A activação de PDGFRa pela medula óssea é reduzida ou completamente inibida por antagonistas de PDGFRa, e a fosforilação de moléculas sinalizadoras a jusante que são comummente activadas por sinalização através de PDGFRa e outros sistemas receptores da tirosina cinase é muito reduzida. Alguns dados sugerem que a via de sobrevivência de PI3K/Akt é activada pela sinalização de PDGFRa, não só por ligandos que activam PDGFRa directamente, mas também por factores presentes na medula óssea que causam a transactivação do receptor.

Os tumores ósseos primários a serem tratados de acordo com a invenção incluem, mas não estão limitados a, osteossarcomas, condrossarcomas, fibrossarcomas, e hemangiossarcomas. Notavelmente, tumores secundários malignos (metastásicos) são muito mais comuns do que os tumores ósseos primários. Os tumores ósseos metastásicos a serem tratados de acordo com a invenção podem surgir a partir de uma variedade de fontes, as mais comum das quais são cancros da próstata, mama, ou pulmão. A origem de um cancro metastático ósseo geralmente será aparente a partir do histórico do paciente. Os tumores podem ser osteoblásticos ou osteoliticos. Os tumores podem ser dependentes de estimulação de IGF-IR quando eles surgem, ou podem transitar para dependência de IGF-IR. Por exemplo, cancro de próstata ou de metástases de cancro de próstata que são inicialmente hormona/androgénio-dependentes e 17 ΡΕ2100618 controláveis pelos tratamentos físicos ou químicos que suprimem a produção de androgénio ou hormonal, pode tornar-se hormona/androgénio-independentes através do aumento da sensibilidade à estimulação através de IGF-IR. Além disso, além de fornecer o tratamento hormona/androgénio-indepen-dente de tumores, a invenção pode ser útil no tratamento de tumores ósseos hormona/androgénio-dependente, sem dependência na supressão do androgénio ou da produção hormonal, por exemplo, através da co-administração de anticorpos IGF-IR com agentes antineoplásicos. Tais tumores incluiriam tumores ósseos metastásicos que são estimulados através de IFG-IR no ambiente rico em IGF do osso, que podem ser sensíveis à estimulação hormonal, mas não o suficientemente sensíveis para crescer sem envolvimento de IGF. A ablação da hormona poderá não ser necessária para tais tumores.

Os tumores ósseos que são dependentes de PDGF também podem ser tratados, assim como tumores que são dependentes da "medula óssea". Os tumores dependentes da medula óssea apresentam activação de PDGFRa em resposta a factores solúveis presentes na medula óssea. Por exemplo, como exemplificado aqui, uma linhagem celular cancerosa metastásica expressando PDGFRa humana sofre a activação de PDGFRa e fosforilação de Akt+ aquando da exposição ao aspirado de medula óssea. Um anticorpo anti-PDGFRa e um antagonista de molécula pequena de PDGFRa, cada um inibem a activação de PDGFRa e a fosforilação de Akt+ na linhagem celular. Os factores solúveis na medula óssea que activam PDGFRa incluem, mas não estão limitados a, PDGF-AA e -BB. ΡΕ2100618

Embora tal dependência da medula óssea envolva a sinalização através de PDGFRa, não pode envolver apenas a ligação da PDGFRa a um ligando PDGFRa. Por exemplo, como exemplificado aqui, deve-se notar que a activação de PDGFRa por ligandos definida (PDGF-AA-ou BB) é mais fraca do que a activação pelo aspirado de medula óssea. Além disso, observa-se que na presença de aspirado de medula óssea, a fosforilação de Akt+ diminui com o aumento do tempo de incubação. No seu conjunto, estes resultados sugerem que além de responder a ligação de PDGFs, PDGFRa pode ser transactivado (fosforilado) por outros elementos de transdução de sinal (por exemplo, outros receptores de tirosina cinase) sensíveis a outros componentes da medula óssea. Em qualquer caso, numa linhagem celular adequada para o crescimento do osso metastizado (isto é, uma linhagem celular que preferencialmente metastiza no osso), a activação de PDGFRa dependente da medula óssea é observada, a qual é inibida por antagonistas de PDGFRa. Além disso, o tratamento com um antagonista de PDGFRa inibe a estimulação induzida pela medula óssea da via anti-apoptótica de PI3K/Akt e da proteína cinase activada pelo mitogénio (MAPK).

Os tumores ósseos a serem tratados com um antagonista de PDGFRa podem surgir como metástases de células do cancro da próstata, e, como referido, podem ser dependentes de hormona/androgénio, ou terem feito a transição para independência de hormona/androgénio. Tais 19 ΡΕ2100618 tumores também podem surgir como metástases de cancro que não o de próstata. Alguém versado na técnica poderia facilmente ser capaz de diagnosticar tais condições e distúrbios usando testes convencionais conhecidos.

Tratamento significa qualquer tratamento de uma doença num animal e inclui: (1) impedir que a doença ocorra num mamífero que pode ter predisposição para a doença, mas ainda não experimenta ou apresenta sintomas da doença; por exemplo, a prevenção do surgimento de sintomas clínicos; (2) a inibição da doença, como por exemplo, interromper o seu desenvolvimento; ou (3) alívio da doença, como por exemplo, causando regressão dos sintomas da doença. A inibição do crescimento tumoral inclui retardar ou interromper o crescimento, bem como causar regressão tumoral. Uma quantidade eficaz para o tratamento de uma doença significa aquela quantidade que, quando administrada a um mamífero que dela necessite, é suficiente para conseguir o tratamento, conforme acima definido, para aquela doença. Os antagonistas de IGF-IR e o antagonista de PDGFRa podem ser administrados em isoladamente, em combinação com outro, ou em combinação com um ou mais agentes antineoplásicos, como, por exemplo, um agente quimioterapêutico ou radiológico.

Pode ser desejável determinar o nível de expressão de IGF-IR e/ou PDGFRa num tumor a ser tratado. Nesses casos, podem ser recolhidas biopsias tumorais e analisadas por métodos bem conhecidos na técnica. Um 20 ΡΕ2100618 antagonista de IGF-IR ou antagonista de PDGFRa é administrado com base no facto do receptor correspondente ser normalmente expresso ou activado num tipo de tumor particular ou invariavelmente torna-se expresso ou activado à medida que a doença progride.

Um antagonista de IGF-IR pode ser um antagonista extracelular ou um antagonista intracelular e mais do que um antagonista pode ser empregado. Os antagonistas extracelulares incluem, mas não estão limitados a proteínas ou outras moléculas biológicas que se ligam a IGF-IR ou a um ou mais dos seus ligandos (por exemplo, IGF-I e IGF-II são ligandos naturais de IGF-IR). Um antagonista extracelular inibe a ligação do IGF-IR aos seus ligandos. O antagonista é um anticorpo anti-IGF-IR, como, por exemplo, IMC-A12. O antagonista é um fragmento de IGF-IR solúvel de ligação ao ligando. Os antagonistas de IGF-IRs intracelulares podem ser moléculas biológicas, mas são geralmente moléculas pequenas. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, inibidor AG1024 de tirosina cinase (Calbiochem), inibidor de cinase do receptor do factor de crescimento-I do tipo insulina NVP-AEW541 (Novartis), e inibidor de receptor de factor de crescimento-l/insulina similar à insulina BMS-554417 (Bristol Myers Squibb). Será apreciado que uma molécula pequena útil para ser utilizada na invenção são inibidores de IGF-IR, mas não precisam ser totalmente específicos para IGF-IR.

Os anticorpos anti-IGF-IR a serem utilizados de 21 ΡΕ2100618 acordo com a presente divulgação apresentam uma ou mais das seguintes propriedades: 1) Os anticorpos ligam-se ao domínio externo do IGF-IR e inibem a ligação do IGF-I ou IGF-II a IGF-IR. A inibição pode ser determinada, por exemplo, através de um ensaio de ligação directa utilizando receptores purificados ou ligados à membrana. Na presente realização, os anticorpos ou os seus fragmentos ligam-se de preferência a IGF-IR, pelo menos tão fortemente quanto os ligandos naturais de IGF-IR (IGF-I e IGF-II). 2) Os anticorpos neutralizam IGF-IR. A ligação de um ligando, por exemplo, IGF-I ou IGF-II, a um domínio extracelular externo do IGF-IR estimula a autofosforilação da subunidade beta e das moléculas de sinalização a jusante, incluindo MAPK, Akt, e IRS-I. A neutralização de IGF-IR inclui inibição, diminuição, inactivação e/ou ruptura de uma ou mais dessas actividades normalmente associadas com transdução de sinal. A neutralização pode ser determinada in vivo, ex vivo, , in vitro ou utilizando, por exemplo, tecidos, células cultivadas, ou componentes celulares purificados. A neutralização inclui a inibição de heterodímeros de IGF-IR/IR bem como homodímeros de IGF-IR. Assim, a neutralização de IGF-IR tem vários efeitos, incluindo a inibição, diminuição, inactivação e/ou ruptura do crescimento (proliferação e diferenciação), angiogénese (recrutamento, invasão e metás- ΡΕ2100618 tase do vaso sanguíneo), e motilidade e metástase celular (adesão e invasividade celular).

Uma medida de neutralização de IGF-IR é a inibição da actividade do receptor tirosina cinase. A inibição de tirosina cinase pode ser determinada usando métodos bem conhecidos; por exemplo, através da medição do nível de autofosforilação de receptor de cinase recombi-nante, e/ou fosforilação de substratos naturais ou sintéticos. Assim, os ensaios de fosforilação são úteis na determinação de anticorpos de neutralização no contexto da presente invenção. A fosforilação pode ser detectada, por exemplo, usando um anticorpo especifico para fosfotirosina num ensaio ELISA ou num "Western blot". Alguns ensaios da actividade de tirosina cinase são descritos em Panek et al., J. Pharmacol. Exp. Thera. 283: 1433-44 (1997) e Batley et al., Life Sei. 62: 143-50 (1998). Os anticorpos da invenção provocam uma diminuição na fosforilação de tirosina IGF-IR de, pelo menos, cerca de 75%, de preferência, pelo menos, cerca de 85%, e preferencialmente, pelo menos, cerca de 90% nas células que respondem ao ligando.

Outra medida de neutralização de IGF-IR é a inibição da fosforilação de substratos a jusante de IGF-IR. Consequentemente, o nível de fosforilação da MAPK, Akt, ou IRS-I pode ser medido. A diminuição na fosforilação é, pelo menos, cerca de 40%, e pode ser, pelo menos, cerca de 60%, ou, pelo menos, cerca de 80%. 23 ΡΕ2100618

Além disso, os métodos de detecção de expressão de proteínas podem ser utilizados para determinar a neutralização de IGF-IR, em que as proteínas sendo medidas são reguladas pela actividade de tirosina cinase de IGF-IR. Estes métodos incluem imuno-histoquímica (IHC) para a detecção de expressão de proteínas, hibridização de fluorescência in situ (FISH) para detecção da amplificação de genes, ensaios de ligação competitiva de radioligandos, técnicas de "blotting" de matriz sólida, tais como a "Northern" e "Southern blots", reacção de cadeia de polimerase de transcriptase reversa (RT-PCR) e ELISA. Ver, por exemplo, Grandis et al., Câncer, 78: 1284-92 25 (1996); Shimizu et al., Japan J. Câncer Res., 85: 567-71 (1994); Sauter et al., Am. J. Path., 148: 1047-53 (1996); Collins, Glia 15: 289-96 (1995); Radinsky et al., Clin. Câncer Res. 1: 19-31 (1995); Petrides et al., Câncer Res. 50: 3934-39 (1990); Hoffmann et al., Anticancer Res. 17: 4419-26 (1997); Wikstrand et al., Câncer Res. 55: 3140-48 (1995).

Ensaios ex vivo podem também ser utilizados para determinar a neutralização de IGF-IR. Por exemplo, a inibição dos receptores de tirosina cinase pode ser observada por ensaios mitogénicos utilizando linhagens celulares estimuladas com ligandos do receptor na presença e ausência de inibidor. A linhagem celular de cancro de mama MCF7 (American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD) é uma linhagem celular tal que expressa IGF-IR e é estimulada por IGF-I ou IGF-II. Outro método envolve testes de inibição do crescimento de células tumorais que ΡΕ2100618 - 24 - expressam IGF-IR ou células transfectadas para expressar IGF-IR. A inibição também pode ser observada usando modelos tumorais, por exemplo, células tumorais humanas injectadas num ratinho.

Os anticorpos não são limitados por qualquer mecanismo particular de neutralização de IGF-IR. Os anticorpos anti-IGF-IR podem se ligar externamente a receptores de IGF-IR de superfície celular, bloquear a ligação do ligando (por exemplo, IGF-I ou IGF-II) e a subsequente transdução de sinal mediada por receptores associados a tirosina cinase, e evitar a fosforilação do IGF-IR e de outras proteínas a jusante na cascata de transdução de sinal. 3) Os anticorpos causam modulação negativa de IGF-IR. A quantidade de IGF-IR presente na superfície de uma célula depende da produção, internalização e degradação de receptores de proteína. A quantidade de IGF-IR presente à superfície de uma célula pode ser medida indirectamente, pela detecção da internalização do receptor ou de uma molécula ligada ao receptor. Por exemplo, a internalização do receptor pode ser medida pelo contacto com células que expressam IGF-IR com um anticorpo marcado. 0 anticorpo ligado à membrana é então retirado, recolhido e contado. 0 anticorpo internalizado é determinado pela lise das células e pela detecção do marcador nos lisados.

Outra maneira é medir directamente a quantidade 25 ΡΕ2100618 do receptor presente na célula após tratamento com um anticorpo anti-IGF-IR ou outra substância, por exemplo, por análise de classificação celular activada por fluorescência de células marcadas por expressão de superfície de IGF-IR. As células marcadas são incubadas a 37°C e a intensidade de fluorescência é medida ao longo do tempo. Como controlo, uma parte da população marcada pode ser incubada a 4°C (condições em que a internalização de receptor é interrompida). IGF-IR de superfície celular pode ser detectado e medido utilizando uma diferente anticorpo que é especifico para IGF-IR e que não bloqueia ou compete com a ligação do anticorpo a ser testado. (Burtrum, et al. Câncer Res. 63: 8912-21 (2003)). O tratamento de uma célula que expressa IGF-IR com um anticorpo resulta na redução de IGF-IR da superfície celular. Numa realização preferida, a redução é, no mínimo, cerca de 70%, preferentemente, pelo menos, cerca de 80%, e ainda mais preferentemente, pelo menos, cerca de 90% em resposta ao tratamento com um anticorpo. A diminuição significativa pode ser observada em tão pouco tempo como quatro horas.

Outra medida da modulação negativa é a redução da proteína receptora total presente numa célula, e reflecte a degradação dos receptores internos. Consequentemente, o tratamento de células (particularmente células cancerosas), com anticorpos resulta numa redução no total de células IGF-IR. Num aspecto preferido, a redução é, no mínimo, 26 ΡΕ2100618 cerca de 70%, preferentemente, pelo menos, cerca de 80%, e ainda mais preferentemente, pelo menos, cerca de 90%.

Para o tratamento de seres humanos, os anticorpos são preferencialmente humanos. Alternativamente, os anticorpos podem ser de primatas não humanos ou de outros mamíferos, ou podem ser anticorpos humanizados ou quiméricos. Um anticorpo anti-IGF-IR compreende uma, duas, três, quatro, cinco, e/ou seis regiões determinantes de complementaridade (CDRs) seleccionadas do grupo constituído por SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, e SEQ ID NO: 49 (CDRlH, CDR2H, CDR3H, CDRlL, CDR2L, CDR3L, respectivamente). O anticorpo anti-IGF-IR compreende uma, duas, três, quatro, cinco, e/ou seis regiões determinantes de complementaridade (CDRs) seleccionadas do grupo constituído por SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID 25 NO: 39, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, e SEQ ID NO: 59 (CDRlH, CDR2H, CDR3H, CDRlL, CDR2L, CDR3L, respectivamente). De preferência, os anticorpos (ou seus fragmentos) têm CDRs de cadeia pesada de SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 39. Alternativamente, e também de preferência, os presentes anticorpos incluindo os seus fragmentos, têm CDRs de cadeia leve de SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 49 ou SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 59. Um desses anticorpos anti-IGF-IR é o anticorpo IgGl humano IMC-A12 (W02005016970), com um domínio variável de cadeia pesada representado por SEQ ID NO: 41 e um domínio variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 51. Outro anticorpo humano preferido é IMC-2F8 (W02005016970), com um domínio variável de cadeia 27 ΡΕ2100618 pesada idêntico ao IMC-A12 e um domínio variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 61. Anticorpos úteis ainda incluem anticorpos anti-IGF-IRs que competem com MC-A12 ou IMC-2F8 para ligação a IGF-IR, bem como anticorpos que se ligam a outros epitopos (ou seja, anticorpos que se ligam a outros epitopos e exibem propriedades como anteriormente descritas como bloqueio do ligando, internalização do receptor, etc, mas não competem com IMC-A12 ou IMC-2F8).

Antagonistas de PDGFRa também podem ser usados para o tratamento. 0 antagonista de PDGFRa pode ser um antagonista extracelular ou um antagonista intracelular e mais de um antagonista podem ser empregues. Antagonistas extracelulares incluem, mas não estão limitados a, proteínas ou outras moléculas biológicas que se ligam a PDGFRa ou um ou mais dos seus ligandos (por exemplo, PDGF-AA, -AB, -BB, -CC) . Um antagonista extracelular inibe a ligação do PDGFRa aos seus ligandos. Num aspecto, o antagonista é um anticorpo anti-PDGFRa, como, por exemplo, IMC-3G3. Noutro aspecto, a proteína de ligação é um fragmento de PDGFRa solúvel de ligação ao ligando. Os antagonistas intracelulares de IGF-IRs podem ser moléculas biológicas, mas são geralmente moléculas pequenas. Num aspecto, o antagonista intracelular de PDGFRa é AG1296. AG1296 (Calbiochem) é um inibidor de PDGFa a, PDGFPs, e c-KIT, e também reage com Flt3. Outras moléculas pequenas dirigidas para PDGFRs incluem STI-571 (mesilato de imati-nib, Gleevec®, Novartis) e SU11248 (malato de sunitinib, SUTENT ®, Pfizer). 28 ΡΕ2100618

Um anticorpo anti-PDGFRa compreende uma, duas, três, quatro, cinco, e/ou seis regiões determinantes de complementaridade (CDRs) seleccionadas do grupo constituído por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, e SEQ ID NO: 14 (CDRlH, CDR2H, CDR3H, CDRlL, CDR2L, CDR3L, respectivamente). De preferência, os anticorpos (ou seus fragmentos) têm CDRs de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 6. Alternativamente, e também de preferência, os presentes anticorpos, ou seus fragmentos, têm CDRs de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 14. As sequências de aminoácidos da CDRs são definidas abaixo na Tabela 1.

Tabela 1 - CDRs de IMC- 3G3 Cadeia Pesada CDRl SSSYY SEQ ID NO: 2 CDR2 SFFYTGSTYYNPSLRS SEQ ID NO: 4 CDR3 QSTYYYGSGNYYGWFDR SEQ ID NO: 6 Cadeia Leve CDRl RASQSVSSYLA SEQ ID NO: 10 CDR2 DASNRAT SEQ ID NO: 12 CDR3 QQRSNWPPA SEQ ID NO: 14

Noutro aspecto, o anticorpo anti-PDGFRa, ou seu fragmento, tem uma região variável de cadeia pesada humana de SEQ ID NO: 8 e/ou de uma região variável humana de cadeia leve de SEQ ID NO: 16. IMC-3G3 é um anticorpo tal e é exemplificado na presente divulgação. 29 ΡΕ2100618

Preferentemente, os anticorpos, ou seus fragmentos neutralizam PDGFRa. A ligação de um ligando, por exemplo, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB ou PDGF-CC, a um dominio extracelular de PDGFRa estimula a dimerização do receptor, a autofosforilação, a activação do dominio interno citoplasmático do receptor da tirosina cinase, e inicio de diversas vias de transdução de sinal e transactivação envolvidas na regulação da síntese do ADN (activação genética) e progressão do ciclo celular ou divisão. As anticorpos anti-PDGFRa tipicamente bloqueiam a ligação aos ligandos e/ou dimerização do receptor, e inibem uma ou mais de autofosforilação, activação da actividade de tirosina cinase e transdução de sinal. Os anticorpos anti-PDGFRa podem ser específicos para a região de ligação ao ligando extracelular de PDGFRa e impedir a ligação de um ligando de PDGFRa. De preferência, esses anticorpos anti-PDGFRa, ou seus fragmentos, ligam-se a PDGFRa, pelo menos tão fortemente como os ligandos naturais de PDGFRa. Alternativamente ou adicionalmente, os anticorpos podem ser específicos para uma região do monómero receptor que, de outra formaria um dímero receptor de interface. Tais anticorpos bloqueiam a formação de dímero, embora a ligação de ligando a um monómero receptor pode ou não ser bloqueada.

Como descrito acima para os anticorpos anti-IGF-IRs, a neutralização de receptor pode ser determinada por uma variedade de métodos in vivo, in vitro, e ex vivo. Os anticorpos anti-PDGFRa reduzem a fosforilação de PDGFRa em, pelo menos, cerca de 75%. Noutro aspecto, a fosfo- 30 ΡΕ2100618 rilação é reduzida em, pelo menos, cerca de 85% ou, pelo menos, cerca de 90%. Como resultado da inibição da transdução do sinal de PDGFRa, a fosforilação ou um componente da via de transdução de sinal a jusante (por exemplo, Akt, p42/p44, etc) é reduzida em, pelo menos, cerca de 40%, pelo menos, cerca de 60%, ou, pelo menos, cerca de 80%. A neutralização do receptor pode ser determinada utilizando ligandos definidos (por exemplo, PDGF-AA, -AB, -BB, -CC), misturas de tais ligandos, ou preparações, tais como aspirado de medula óssea que compreendem PDGFs, bem como de outros factores de crescimento estimuladores. A neutralização de PDGFRa inclui a inibição, diminuição, inactivação e/ou ruptura de uma ou mais dessas actividades normalmente associadas com a transdução de sinal. Assim, neutralizar PDGFRa tem vários efeitos, incluindo a inibição, diminuição, inactivação e/ou perturbações do crescimento (proliferação e diferenciação), da angiogénese (recrutamento, invasão e metástases do vaso sanguíneo), motilidade e metástase celular (adesão e invasividade celular).

Ensaios ex vivo, como descritos acima, também podem ser utilizados para determinar a neutralização de PDGFR. Por exemplo, células de leiomiossarcoma SKLMS-1 (American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD; ATCC HTB-88™), ou células de glioblastoma U118 (ATCC HTB-15™) humanas estimuladas com PDGF-AA podem ser utilizadas para a avaliação da inibição de PDGFRa. A inibição do 31 ΡΕ2100618 crescimento pode ser determinada utilizando células tumorais humanas expressando PDGFRa injectadas num ratinho SCID. A presente divulgação não está limitada por qualquer mecanismo particular de neutralização de PDGFRa. Os anticorpos anti-PDGFRa ligam-se externamente ao receptor de superfície celular PDGFRa, bloqueiam a ligação do ligando (por exemplo, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC) , inibem a fosforilação de PDGFRa, inibem a transdução de sinal mediada através da tirosina cinase associada ao receptor, e modulam a actividade de componentes de tradução de sinal a jusante. 0 complexo receptor-anticorpo também pode ser internalizado e degradado, resultando na regulação negativa do receptor de superfície celular. As metaloproteinases de matriz, que funcionam na invasão e metástase da célula tumoral, que também podem ter regulação negativa pelos anticorpos. Além disso, os anticorpos podem apresentar inibição da produção do factor de crescimento e a angiogénese.

Como descrito acima, os antagonistas de PDGFRas são úteis para o tratamento dos tumores ósseos, incluindo tumores ósseos metastásicos. Outros tipos de tumores que expressam PDGFRa e podem ser tratados de acordo com a invenção incluem, mas não estão limitados a, tumores do ovário, tumores de mama, tumores pulmonares, tumores hepa-tocelulares, tumores estromais gastrointestinais, melanoma, carcinoma das células renais, tumores de próstata, e 32 ΡΕ2100618 sarcomas dos tecidos moles. Os sarcomas dos tecidos moles são originários de tecidos tais como gordura, músculos, nervos, tendões e vasos sanguíneos e linfáticos. Tipicamente, as células tumorais sobre-expressam PDGFRa. A expressão de PDGFRa pode ser determinada, por exemplo, através da análise histoquímica ou de ARN. Por exemplo, uma análise de Scatchard de ligação de IMC-3G3 marcado radioactivamente a células U118 e células tumorais SKLMS-1 indica que o número de moléculas de PDGFRa nas células é de cerca de 500 e 2500, respectivamente.

Os antagonistas de PDGFRa funcionam inibindo a transdução de sinal por PDGFRa expresso nas próprias células tumorais, ou pela inibição de PDGFRa expresso em células estromais circundantes que de outro modo sofrem estimulação paracrina por PDGFs expressos de células tumorais. Assim, anticorpos, como IMC-3G3 e outros antagonistas de PDGFRas são úteis para o tratamento dos tumores caracterizados por estimulação autócrina e/ou parácrina de PDGFRa.

Fragmentos de anticorpos podem ser produzidos clivando um anticorpo inteiro, ou por expressão de ADN que codifica para o fragmento. Fragmentos de anticorpos podem ser preparados por métodos descritos por Lamoyi et al., J. Immunol. Methods, 56: 235-243 (1983) e por Parham, J. Immunol. 131: 2895-2902 (1983). Tais fragmentos podem conter um ou ambos os fragmentos Fab ou o fragmento F(ab')2. Esses fragmentos podem também conter anticorpos de 33 ΡΕ2100618 região variável de fragmento de cadeia simples, isto é, scFv, diacorpos, ou outros fragmentos de anticorpos. Métodos de produção de tais equivalentes funcionais são divulgados no Pedido PCT WO 93/21319, Pedido de Patente Europeia No. EP 239400; Pedido PCT WO 89/09622; Pedido de Patente Europeia No. EP 338745; e Pedido de Patente Europeia No. EP 332424.

As células hospedeiras preferidas para a transformação de vectores e para a expressão dos anticorpos da presente invenção são células de mamíferos, por exemplo, células COS-7, células de ovário de hamster chinês (CHO), e linhagens celulares de origem linfóide, como células de linfoma, mieloma (por exemplo, NSO), ou hibridoma. Outros hospedeiros eucarióticos, tais como leveduras, podem ser utilizados como alternativa.

Sempre que for desejado expressar um gene construído em levedura, uma selecção genética adequada para uso na levedura é o gene trpl presente no plasmídeo de levedura YRp7. Stinchcomb et al. Nature, 282: 39 (1979);

Kingsman et al., Gene, 7: 141 (1979). O gene trpl proporciona uma marcador de selecção para uma estirpe mutante de levedura sem a capacidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 25 ou PEP4-1. Jones, Genetics, 85: 12 (1977). A presença da lesão trpl no genoma da célula hospedeira de levedura proporciona então um meio eficaz para detectar a transformação pelo crescimento na ausência de triptofano. Do mesmo modo, 34 ΡΕ2100618 estirpes de levedura deficientes em Leu2 (ATCC 20622 ou 38626) são complementadas por plasmídeos conhecidos que contêm o gene Leu2.

As células hospedeiras transformadas são cultivadas por métodos conhecidos na técnica num meio liquido contendo fontes de carbono assimiláveis (hidratos de carbono, como a glucose ou a lactose), azoto (aminoácidos, péptidos, proteínas ou os seus produtos de degradação, como peptonas, sais de amónio ou similares) , e sais inorgânicos (sulfatos, fosfatos e/ou carbonatos de sódio, potássio, magnésio e cálcio) . O meio ainda contém, por exemplo, substâncias promotoras do crescimento, tais como oligoele-mentos, por exemplo, ferro, zinco, manganês e similares.

Os anticorpos de alta afinidade anti-PDGFRa e anti-IGF-IRs, de acordo com a presente invenção podem ser isolados de uma biblioteca de apresentação de fagos construída a partir de genes de regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve humanas. Por exemplo, um domínio variável da invenção pode ser obtido a partir de um linfócito de sangue periférico que contém um gene de região variável rearranjado. Alternativamente, as porções de domínio variável, tais como regiões CDR e FW, podem ser obtidas a partir de diferentes fontes e recombinadas. Além disso, as porções do domínio variável (por exemplo, regiões FW) podem ser sequências de consenso sintéticas.

Os anticorpos e fragmentos dos anticorpos podem 35 ΡΕ2100618 ser obtidos, por exemplo, a partir de anticorpos de ocorrência natural, ou bibliotecas de apresentação de fagos Fab ou scFv. Entende-se que, para fazer um anticorpo de domínio único a partir de um anticorpo que inclua um domínio VH e VL, certas substituições de aminoácidos fora das CDRs podem ser pretendidas para reforçar a ligação, expressão ou solubilidade. Por exemplo, pode ser desejável modificar resíduos de aminoácidos que de outra forma seriam enterrados na interface VH-VL.

Além disso, anticorpos e fragmentos de anticorpos podem ser obtidos por tecnologia convencional de hibridomas (Harlow & Lane, ed., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 211-213 (1998)) utilizando ratinhos transgénicos (por exemplo, ratinhos KM de Medarex, San José, na Califórnia), que produzem as cadeias pesada gama e leve kapa da imunoglobulina humana. Num aspecto preferida, uma porção substancial do genoma de produção de anticorpos humanos é inserido no genoma do ratinho, e é tornado deficiente na produção de anticorpos murinos endógenos. Tais ratinhos podem ser imunizados por via subcutânea (s.c.), com PDGFRa (normalmente em adjuvante de Freund completo), com reforços conforme necessário. Os métodos de imunização são bem conhecidos na técnica. A proteína usada para identificar a ligação de IGF-IR aos anticorpos é preferencialmente IGF-IR e, ainda mais de preferência, é o domínio extracelular do IGF-IR. A proteína usada para identificar anticorpos que se ligam a 36 ΡΕ2100618 PDGFRa é preferencialmente PDGFRa e, ainda mais preferentemente, é o domínio extracelular de PDGFRa. Tais domínios extracelulares pode ser livres ou conjugados com outras moléculas. A presente divulgação fornece também polinu-cleótidos isolados que codificam para os anticorpos, ou seus fragmentos, descritos anteriormente. Detalhes do anticorpo IMC-A12 de anti-IGF-IRs são divulgados em W02005016970. A Tabela 2 expõe as sequências de ácidos nucleicos para MC-3G3.

Tabela 2 - Sequências de nucleótidos que codificam para CDRs de IMC-3G3 Cadeia Pesada SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 13 CDR1 agtagtagtt actac CDR2 agtttctttt atactgggag cacctactac aacccgtccc tcaggagt CDR3 cagtccacgt attactatgg ttcggggaat tattatggct ggttcgaccg c

Cadeia Leve CDR1 agggccagtc agagtgttag cagctactta gcc CDR2 gatgcatcca acagggccac t CDR3 cagcagcgta gcaactggcc tccggcg__ 0 ADN que codifica para anticorpos humanos pode ser obtido por recombinação do ADN humano que codifica para regiões constantes e regiões variáveis, que não as CDRs, derivado substancialmente ou exclusivamente das regiões de anticorpos humanos correspondente e ADN que codifica para CDRs resultantes de um humano (SEQ ID NOS: 1, 3, e 5 para CDRs de domínio variável de cadeia pesada e SEQ ID NOS: 9, 11, e 13 para CDRs de domínio variável de cadeia leve). 37 ΡΕ2100618

As fontes adequadas de ADNs que codificam para fragmentos de anticorpos incluem qualquer célula, tais como células de hibridoma e baço, que expressam o anticorpo completo. Os fragmentos podem ser utilizados por si só como anticorpos equivalentes, ou podem ser recombinados em equivalentes, tal como descrito acima. As deleções e recombinações de ADN descritas nesta seção podem ser realizadas por métodos conhecidos, tais como os descritos nas publicações acima listadas no que se refere aos equivalentes de anticorpos e/ou outra técnica convencional de ADN recombinante, tais como as descritas a seguir. Outra fonte de ADNs são os anticorpos de cadeia simples produzidos a partir de uma biblioteca de apresentação de fagos, como é conhecido na técnica.

Além disso, a presente divulgação proporciona vectores de expressão contendo as sequências polinu-cleotídicas anteriormente descritas operativamente ligadas a uma sequência de expressão, uma sequência promotora e uma potenciadora. Uma variedade de vectores de expressão para a síntese eficaz de polipéptidos anticorpos em procariotas, tais como bactérias e sistemas eucarióticos, incluindo, mas não limitado a, sistemas de cultura de leveduras e de células de mamíferos foram desenvolvidas. Os vectores da presente divulgação podem incluir segmentos de sequências de ADN cromossómico, não-cromossómico e sintético.

Qualquer vector de expressão adequado pode ser usado. Por exemplo, vectores de clonagem procariotas 38 ΡΕ2100618 incluem plasmídeos de E. coli, como colEl, pCRl, pBR322, pMB9, pUC, pKSM, e RP4. Vectores procariotas também incluem derivados de ADN de fago tais como M13 e outros fagos de ADN de uma única cadeia. Um exemplo de um vector útil em levedura é um plasmídeo 2μ. Vectores de expressão adequados para células de mamíferos incluem derivados bem conhecidos de SV4 0, adenovírus, sequências de ADN derivadas de retrovírus e vectores "shuttle" derivados da combinação de vectores funcionais de mamíferos, tais como aqueles descritos acima, e plasmídeos funcionais e ADN de fago.

Vectores de expressão eucariotas adicionais são conhecidos na técnica (por exemplo, P.J. Southern e P. Berg, J. Mol. Appl. Genet., 1, 327-341 (1982); Subramani et al., Mol. Cell. Biol., 1: 854-864 (1981); Kaufmann e Sharp, "Amplification And Expression of Sequences Cotransfected with a Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene," J. Mol. Biol. 159, 601-621 (1982); Kaufmann e Sharp, Mol. Cell. Biol. 159, 601-664 (1982); Scahill et al., "Expression And Characterization Of The Product Of A Human Immune Interferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells", Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 80, 4654-4659 (1983); Urlaub e Chasin, Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 77, 4216-4220, (1980).

Os vectores de expressão úteis na presente divulgação contêm pelo menos uma sequência de expressão controlo que é operativamente ligada à sequência de ADN ou fragmento a ser expresso. A sequência controlo é inserida no vector, de modo a controlar e regular a expressão da 39 ΡΕ2100618 sequência clonada de ADN. Exemplos de sequências de expressão de controlo úteis são o sistema lac, o sistema trp, o sistema tac, o sistema trc, as regiões principais operadores e promotoras do fago lambda, a região de controlo fd de proteína de revestimento, os promotores glicolíticos de leveduras, por exemplo, o promotor para 3-fosfoglicerato cinase, os promotores de ácido fosfatase de levedura, por exemplo, Pho5, os promotores de factores cruzamento alfa de levedura, e promotores derivados de polioma, adenovírus, retrovírus, e vírus símios, por exemplo, promotores prematuros e tardios ou SV40, e outras sequências conhecidas por controlarem a expressão de genes de procariotas ou células eucarióticas e seus vírus ou combinações dos mesmos. A presente divulgação fornece também células hospedeiras recombinantes contendo os vectores de expressão descritos anteriormente. Anticorpos podem ser expressos em linhagens celulares diferentes de hibridomas. Ácidos nucleicos, que compreendem uma sequência que codifica para um polipéptido podem ser usados para transformação de uma célula hospedeira mamífera adequada.

Linhagens celulares de especial preferência são seleccionadas com base no elevado nível de expressão, expressão constitutiva da proteína de interesse e contaminação mínima de proteínas do hospedeiro. As linhagens celulares de mamífero disponíveis como hospedeiras para expressão são bem conhecidas na técnica e 40 ΡΕ2100618 incluem muitas linhagens celulares imortalizadas, tais como, mas não limitadas a, células NSO de ovário de hamster Chinês (CHO), células de rim de hamster bebé (BHK) e muitas outras. Células eucariotas adicionais adequado incluem leveduras e outros fungos. Hospedeiros procariotas úteis incluem, por exemplo, E. coli, tais como E. coli SG-936, E. coli MP 101, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli DHI, e E. coli MRC1, Pseudomonas, Bacillus, tais como Bacillus subtilis, e Streptomyces.

Estas células hospedeiras recombinantes presentes podem ser utilizadas para produzir um anticorpo, ou seu fragmento, cultivando as células, em condições que permitam a expressão do anticorpo ou seu fragmento e purificar o anticorpo ou seu fragmento a partir da célula hospedeira ou do meio em torno da célula hospedeira. O direccionamento do anticorpo ou fragmento expresso para secreção nas células hospedeiras recombinantes pode ser facilitado pela inserção de uma sequência que codifica para um peptideo lider sinal ou secretor (ver, Shokri et al., Appl Microbiol Biotechnol. 60(6): 654-64 (2003), Nielsen et al., Prot. Eng. 10: 1-6 (1997) e von Heinje et al., Nucl. Acids Res. 14: 4683-4690 (1986)), na extremidade 5' do gene que codifica para o anticorpo de interesse. Estes elementos péptidos lider secretores podem ser obtidos a partir de sequências quer de procariotas ou de eucariotas. Assim sendo adequadamente, péptidos lider secretores são utilizados, sendo aminoácidos ligados à extremidade N-terminal de um polipéptido para direccionar o movimento do polipéptido para fora do citossol da célula hospedeira e secreção para o meio. 41 ΡΕ2100618

Os anticorpos desta divulgação podem ser fundidos a resíduos de aminoácido adicionais. Tais resíduos de aminoácidos podem ser um péptido marcador, talvez para facilitar o isolamento. Outros resíduos de aminoácidos para direccionar os anticorpos para órgãos ou tecidos específicos são também contemplados.

Noutro aspecto, um anticorpo da presente divulgação é feito pela expressão de um ácido nucleico que codifica para o anticorpo num animal transgénico, de tal forma que o anticorpo é expresso e pode ser recuperado. Por exemplo, os anticorpos podem ser expressos num tecido especifico de modo que facilite a recuperação e purificação. Numa destes aspectos, um anticorpo da invenção é expresso na glândula mamária de secreção durante o aleitamento. Animais transgénicos, incluem, mas não estão limitados a ratinhos, cabra, e coelho.

Anticorpos que podem ser usados incluem imuno-globulinas completas, fragmentos de imunoglobulinas de ligação a antigénio, bem como proteínas de ligação ao antigénio que compõem domínios de ligação a antigénio de imunoglobulinas. Fragmentos de imunoglobulinas de ligação a antigénio incluem, por exemplo, Fab, Fab', e F(ab')2· Outros formatos de anticorpos foram desenvolvidos que mantêm a especificidade de ligação, mas possuem outras características, que podem ser desejáveis, incluindo, por exemplo, biespecificidade, multivalência (mais de dois 42 ΡΕ2100618 sítios de ligação) , tamanho compacto (por exemplo, domínios de ligação isolados).

Anticorpos de cadeia única não têm alguns ou todos os domínios constantes do conjunto de anticorpos de que são derivados. Portanto, eles podem superar alguns dos problemas associados com o uso de anticorpos inteiros. Por exemplo, anticorpos de cadeia única tendem a ser livres de certas interacções indesejadas entre regiões constantes de cadeia pesada e outras moléculas biológicas. Além disso, anticorpos de cadeia única são consideravelmente menores do que qualquer anticorpo e podem ter uma maior permeabilidade do que qualquer anticorpo, permitindo que anticorpos de cadeia única se localizem e se liguem a locais de ligação do antigénio-alvo de forma mais eficiente. Além disso, a dimensão relativamente pequena dos anticorpos de cadeia única torna-os menos susceptíveis de provocar um comportamento indesejado resposta imunitária num receptor do que anticorpos completos. Múltiplos anticorpos de cadeia única, cada um com uma única cadeia VH e um domínio VL covalentemente ligado por um primeiro péptido ligante, pode ser covalentemente ligado, pelo menos, por um ou mais péptido ligante para formar um anticorpo multivalente de cadeia única, que pode ser monoespecífico ou multiespecífico. Cada cadeia de um anticorpo de cadeia única multivalente inclui um fragmento variável de cadeia leve e um fragmento variável de cadeia pesada, e está ligada por um péptido ligante para pelo 43 ΡΕ2100618 menos uma outra cadeia. 0 péptido ligante é composto de, pelo menos, quinze resíduos de aminoácidos. 0 número máximo de resíduos de aminoácidos é de cerca de cem. Dois anticorpos de cadeia única podem ser combinados para formar uma diacorpo, também conhecido como um dímero bivalente. Diacorpos têm duas cadeias e dois locais de ligação, e podem ser monoespecíficos ou biespecíficos. Cada cadeia de diacorpo inclui um domínio VH ligado a um domínio VL. Os domínios são ligados com ligantes que são suficientemente curtos para evitar emparelhamento entre domínios na mesma cadeia, assim dirigindo o emparelhamento entre os domínios complementares em diferentes cadeias de recriar os dois locais de ligação a antigénios.

Três anticorpos de cadeia única podem ser combinados para formar triacorpos, conhecidos também como trímeros trivalentes. Triacorpos são construídos com a extremidade de aminoácido de um domínio VL ou VH directamente fundidos à extremidade carboxilo de um domínio VL OU VH, ou seja, sem qualquer sequência ligante. 0 triacorpo tem três cabeças Fv com os polipéptidos arranj ados de um modo cíclico, de cabeça-, a-cauda. Uma possível conformação do triacorpo é planar com os três locais de ligação localizados num plano num ângulo de 120 graus entre si. Os triacorpos podem ser monoespecíficos, biespecíficos ou triespecíficos.

Assim, anticorpos da presente divulgação e seus fragmentos desse incluem, mas não estão limitados a, 44 ΡΕ2100618 anticorpos que ocorrem naturalmente, fragmentos bivalentes tais como (Fab')2, fragmentos monovalentes tais como Fab, anticorpos de cadeia única, Fv (scFV) de cadeia única), anticorpos de domínio único, anticorpos de cadeia única multivalentes, diacorpos, triacorpos, e semelhantes que se ligam especificamente aos antigénios.

Os anticorpos anti-IGF-IR e anti-PDGFRa ou fragmentos de anticorpos, que podem ser internalizados mediante ligação a células com IGF-IR (W02005016970) ou PDGFRa, podem ser quimicamente ou biossinteticamente ligados a agentes anti-tumorais. Agentes anti-tumorais ligados a este tipo de anticorpos incluem quaisquer agentes que destroem ou danificam um tumor ao qual o anticorpo se ligou ou no ambiente da célula ao qual o anticorpo se ligou. Por exemplo, um agente anti-tumoral é um agente tóxico, como um agente quimioterapêutico ou um radioisótopo. Agentes quimioterapêuticos adequados são conhecidos pelos peritos na técnica e incluem antraciclinas (ex. daunomicina e doxorrubicina), metotrexato, vindesina, neocarzinostatina, cis-platina, clorambucil, arabinósido de citosina, 5-fluoruridina, melfalano, rícino e cali-queamicina. Os agentes quimioterapêuticos são conjugados com o anticorpo utilizando métodos convencionais (Ver, por exemplo, Hermentin e Seiler, Behring Inst. Mitt. 82: 197-215 (1988)).

Radioisótopos adequados para uso como agentes anti-tumorais também são conhecidos por aqueles peritos na 45 ΡΕ2100618 técnica. Por exemplo, usa-se 131I ou 211At. Esses isótopos são ligados ao anticorpo utilizando técnicas convencionais (Ver, por exemplo, Pedley et al., Br. J. Câncer 68, 69- 73 (1993)) .

Alternativamente, o agente anti-tumoral que está ligado ao anticorpo é uma enzima que activa um profármaco. Desta forma, um profármaco é administrado que permanece na sua forma inactiva até que atinja o local alvo no qual é convertido para sua forma de citotoxina. Na prática, o conjugado anticorpo-enzima é administrado ao paciente e deixa-se localizar na região do tecido a ser tratado. 0 profármaco é então administrado ao paciente, para que a conversão para o fármaco citotóxico ocorra na região do tecido a ser tratado.

Outros agentes anti-tumorais incluem citocinas, como interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4) ou factor de necrose tumoral alfa (TNF-α). 0 anticorpo direcciona a citocina para o tumor, de modo que a citocina medeie os danos ou a destruição dos tecidos tumorais sem afectar outros tecidos. A citocina pode ser conjugada com o anticorpo ADN, utilizando técnicas convencionais de ADN recombinante.

Em certos aspectos, os anticorpos anti-IGF-IR ou anti-PDGFRa são administrados em combinação com um ou mais agentes antineoplásicos. Para exemplos de terapias de combinação, ver, por exemplo, Patente U.S. no. 6,217,866 46 ΡΕ2100618 (Schlessinger et al.) (Anti-EGFR antibodies in combination with anti-neoplastic agents) ; WO 99/60023 (Waksal et al.) (Anti-EGFR antibodies in combination with radiation). Qualquer agente antineoplásico adequado pode ser usado, tal como um agente quimioterapêutico, radiações ou combinações destes. O agente antineoplásico pode ser um agente alquilante ou um anti-metabolito. Exemplos de agentes alquilantes incluem, mas não estão limitados a, cisplatina, ciclofosfamida, melfalan, e dacarbazina. Exemplos de anti-metabolitos incluem, mas não se limitam a, doxorubicina, daunorubicina, e paclitaxel, gemcitabina.

Agentes antineoplásicos úteis também incluem inibidores de mitose, como taxanos, docetaxel e paclitaxil. Inibidores da topoisomerase são outra classe de agentes antineoplásicos que podem ser usados em combinação com anticorpos da invenção. Estes incluem inibidores da topoisomerase I ou topoisomerase II. Inibidores da topoisomerase I incluem irinotecano (CPT-11), aminocampto-tecina, camptotecina, DX-8951f, topotecano. Inibidores da topoisomerase II incluem etoposido (VP-16), e teniposido (VM-26). Outras substâncias estão actualmente a ser avaliadas em relação À actividade inibitória de topoisomerase e eficácia como agentes antineoplásicos. numa modalidade preferida, o inibidor da topoisomerase é irinotecano (CPT-11) .

Num aspecto particular um anticorpo anti-IGF-IR é administrado em combinação com docetaxel. Um anticorpo 47 ΡΕ2100618 anti-PDGFRa é administrado em combinação com doxor-rubicina.

Quando o agente antineoplásico é a radiação, a fonte de radiação pode ser tanto externa (terapia por feixe de radiação externo - EBRT) ou interna (braquiterapia - BT) relativamente ao paciente a ser tratado. A dose de agente antineoplásico administrada depende de vários factores, incluindo, por exemplo, o tipo de agente, o tipo e gravidade do tumor a ser tratado e da via de administração do agente. Deve-se enfatizar, no entanto, que a presente invenção não se limita a qualquer dose particular.

Os tratamentos com anticorpos (anti-IGF-IR ou anti-PDGFRa) e com anticorpos mais agente antineoplásico também podem ser utilizados para os pacientes que recebem terapia adjuvante hormonal (por exemplo, para o cancro da mama) ou terapia de privação de androgénio (por exemplo, cancro de próstata).

Antagonistas anti-IGF-IR e anti-PDGFRas podem ser co-administrados, ou administrados com antagonistas do receptor que neutralizam outros receptores envolvidos no crescimento tumoral ou na angiogénese. Por exemplo um anticorpo anti-IGF-IRs e um anticorpo anti-PDGFRa são co-administrados. Num aspecto em que uma célula tumoral alvo expressa tanto IGF-IR como PDGFRa, elementos da transdução de sinal comuns são activados por transdução de sinal através de cada receptor. Embora a inibição de um receptor 48 ΡΕ2100618 geralmente resulte na diminuição da activação dos componentes comuns a jusante, a inibição da activação de ambos os receptor vai diminuir ainda mais a activação. Noutro aspecto, certas células num tumor ou de um tecido circundante expressam quantidades significativas de um receptor, e outras células expressam quantidades significativos do segunda receptor. A co-administração dos antagonistas reduz o crescimento das células tumorais e a estimulação parácrina das células circundantes.

Um anticorpo bi-específico pode ser fornecido como uma alternativa à co-administração. A variedade de anticorpos bi-especificos que existem são concebidos para incorporar diversas características desejáveis. Por exemplo, diacorpos bi-especificos têm tamanho mínimo. Anticorpos bi-específicos com quatro locais de ligação a antigénios (dois para cada especificidade de ligação) têm avidez de ligação de que são semelhantes aos dos anticorpos naturais correspondentes. Certos anticorpos bi-especificos incorporam regiões Fc, assim mantendo funções efectoras (por exemplo, citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)), dos anticorpos naturais. WO 01/90192 descreve anticorpos tetravalentes similares a IgG W02006/020258 descreve um anticorpo tetravalente que integra dois diacorpos e mantém funções efectoras.

Noutro aspecto, um anticorpo anti-IGF-IR ou um anticorpo anti-PDGFRa ou outro antagonista é usado em 49 ΡΕ2100618 combinação com um antagonista de receptor que se liga especificamente a um receptor do factor de crescimento epidérmico (por exemplo, EGFR, Her2/erbB2, erbB3, erbB4). Especialmente preferidas são as proteínas de ligação ao antigénio que se ligam ao domínio extracelular do EGFR e bloqueiam a ligação de um ou mais dos seus ligandos e/ou neutralizam activação induzida por ligando do EGFR. Antagonistas de EGFR também incluem anticorpos que se ligam a um ligando de EGFR e inibem a ligação do EGFR ao seu ligando. Ligandos EGFR incluem, por exemplo, EGF, TGF-a, amfirregulina, EGF de ligação à heparina (HB-EGF) e betacelulina. Pensa-se que EGF e TGF-α sejam os principais ligandos endógenos que resultam na estimulação mediada por EGFR, embora TGF-α tenha mostrado ser mais potente na promoção da angiogénese. Os antagonistas de EGFR também incluem substâncias que inibem a dimerização de EGFR com outras subunidades de receptor de EGFR (ou seja, EGFR homo-dímeros) ou hetero-dimerização com outros receptores de factores de crescimento (por exemplo, HER2). Antagonistas de EGFR incluem ainda moléculas biológicas e moléculas pequenas, como os inibidores da cinase sintéticos que atuam directamente no domínio citoplasmático de EGFR para inibir a transdução de sinal mediada por EGFR. Erbitux® (o cetuximab) é um exemplo de um antagonista de EGFR que se liga ao EGFR e bloqueia a ligação do ligando. Um exemplo de uma molécula pequena antagonista de EGFR é IRESSA™ (ZD1939), que é um derivado de quinozalina que funciona como um mimético do ATP para inibir EGFR. Ver Patente US no. 5,616,582 (Zeneca Limited); WO 96/33980 (Zeneca 50 ΡΕ2100618

Limited) na p. 4; ver também, Rowinsky et al, Abstract 5 apresentado no 37th Annual Meeting of ASCO, São Francisco, CA, 12-15 de Maio de 2001; Anido et al, Abstract 1712 apresentado no 37th Annual Meeting of ASCO, São Francisco, CA, 12-15 de Maio de 2001. Outro exemplo um antagonista de EGFR de molécula pequena é Tarceva® (QSI-774) , que é um inibidor de EGFR derivado de 4-(fenilamina substituída)-quinozalina [cloridrato de 6,7-di(2-metoxi-etoxi)-quina-zolin-4-il]-(3-etinil-fenil)amina]. Ver WO 96/30347 (Pfizer Inc.) em, por exemplo, na página 2, linha 12, até a página 4, linha 34, página 19, linhas 14-17. Ver também Moyer et al. , Câncer Res., 57: 4838-48 (1997); Pollack et al., J. Pharmacol, 291: 739-48 (1999). Tarceva® pode funcionar através da inibição da fosforilação de EGFR e das suas vias de transdução de sinal de cinase a jusante Pl3/Akt e MAP (proteína activada pelo mitogénio) resultando na paragem do ciclo celular mediada por p27. Ver Hidalgo et al., Abstract 281 apresentado no 37th Annual Meeting of ASCO, São Francisco, CA, 12-15 de Maio de 2001.

Outras moléculas pequenas também foram relatadas que inibem, muitas das quais pensa-se serem especificas para o domínio tirosina cinase de um EGFR. Alguns exemplos desses antagonistas de EGFRs de molécula pequena são descritos em WO 91/116051, WO 96/30347, WO 96/33980, WO 97/27199 (Zeneca Limited) . WO 97/30034 (Zeneca Limited) , WO 97/42187 (Zeneca Limited), WO 97/49688 (Pfizer Inc.), WO 98/33798 (Warner Lambert Company), WO 00/18761 (American Cyanamid Company), e WO 00/31048 (Warner Lambert 51 ΡΕ2100618

Company). Exemplos específicos de antagonista de EGFRs de molécula pequena incluem Cl-1033 (Pfizer), que é uma quinozalina (N-[4-(3-cloro-4-fluoro-fenilamino)-7-(3-mor-folin-4-il-propoxi)-quinazolin-6-il]-acrilamida) inibidora da tirosina cinase, particularmente EGFR e é descrita em WO 00/31048 na página 8, linhas 22-6; PKI166 (Novartis), que é um inibidor pirrolopirimidina de EGFR e é descrito em WO 97/27199 nas páginas 10-12; GW2016 (Glaxo Smith Kline), que é um inibidor de EGFR e HER2; EKB569 (Wyeth) , que é relatado inibir o crescimento de células tumorais que sobre-expressam EGFR ou HER2 in vitro e in vivo; AG-1478 (Trifostina), que é uma quinazolina de molécula pequena que inibe a sinalização de ambos os EGFR e erbB-2; AG-1478 (Sugen), que é um inibidor de dois substratos que também inibe a proteína cinase CK2; PD 153035 (Parke-Davis), que é relatada inibir a actividade EGFR cinase e o crescimento tumoral, induz a apoptose nas células em cultura, e aumenta a citotoxicidade de agentes quimioterapêuticos citotóxicos; SPM-924 (Schwarz Pharma), que é um inibidor da tirosina cinase direccionado para o tratamento do cancro da próstata; CP-546.989 (OSI Pharmaceuticals), que é decla-radamente um inibidor da angiogénese para o tratamento de tumores sólidos; ADL-681, que é um inibidor da cinase EGFR direccionado para o tratamento do cancro; PD 158780, que é uma piridopirimidina que é relatada inibir a taxa de crescimento do tumor de xenoenxertos A4431 em ratinhos; CP-358774, que é uma quinazolina que é relatada inibir a autofosforilação em xenoenxertos HN5 em ratinhos; ZD 1839, que é uma quinazolina que é relatada a ter actividade anti- 52 ΡΕ2100618 tumoral em modelos de xenoenxertos em ratinhos incluindo os cancros vulvar, NSCLC, da próstata, do ovário, e colo-rectais; CGP 59326A, que é uma pirrolopirimidina que é relatada inibir o crescimento de xenoenxertos EGFR-positivos em ratinhos; PD 165557 (Pfizer); CGP54211 e CGP53353 (Novartis), que são dianilnoftalimidas. Inibidores de EGFR de tirosina cinase derivados naturalmente incluem qenisteina, herbimicina A, quercetina, e erbstatina.

Moléculas pequenas adicionais relatadas inibirem EGFR e são compostos triciclicos tais como os compostos descritos na Patente US No. 5,679,683; derivados de quinazolina, tais como os derivados descritos na Patente US No. 5,616,582; e compostos de indole tais como os compostos descritos na Patente US No. 5,196,446.

Outro receptor que pode ser direccionado em conjunto com IGF-IR ou PDGFRa é um receptor vascular do factor de crescimento do endotélio (VEGFR). Um anticorpo anti-IGF-IR ou anti-PDGFRa é usado em combinação com um antaqonista de VEGFR. Numa realização, um antagonista é usado que se liga especificamente ao receptor VEGFR-l/Flt-1. Noutro aspecto, o antagonista de VEGFR liga-se espe-cificamente ao receptor VEGFR-2/KDR. São particularmente preferidas proteínas que se ligam ao antigénio que se ligam ao domínio extracelular de VEGFR-1 ou VEGFR-2 e bloqueiam a ligação pelos seus ligandos (VEGFR-2 é mais fortemente estimulada por VEGF, VEGFR-1 é mais fortemente estimulada por PlGF, mas também por VEGF) e/ou neutralizam a activação 53 ΡΕ2100618 induzida pelo ligando. Por exemplo, IMC-1121 é um anticorpo humano que se liga a e neutraliza VEGFR-2 (WO 03/075840; Zhu) . Outro exemplo é MAb 6.12 que se liga a VEGFR-1 solúvel e expresso na superfície das células. ScFv 6,12 compreende os domínios VL e VH do anticorpo monoclonal de ratinho MAb 6.12. Uma linhagem de células de hibridomas produtores de MAb 6.12 foi depositada sob o número ATCC PTA-3344 ao abrigo das disposições do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para efeitos de Procedimento de Patentes e os regulamentos correspondentes (Tratado de Budapeste). Noutro aspecto, o antagonista de VEGFR liga-se a um ligando de VEGFR e bloqueia a activação de um VEGFR pelo ligando. Por exemplo, o Avastin® (bevacizumab) é um anticorpo que se liga ao VEGF.

Outros exemplos de receptores de factor de crescimento envolvidos na tumorogénese são o factor de crescimento nervoso (NGFR), e factor de crescimento de fibroblasto (FG-FR).

Em mais um aspecto alternativo, os anticorpos anti-IGF-IR e anti-PDGFRa tanto podem ser administrados em combinação com um ou mais adjuvantes adequados, tais como, por exemplo, citocinas (IL-10 e IL-13, por exemplo) como com outros estimuladores imunes, tais como, mas não limitado a, quimiocinas, antigénios associados a tumores, e péptidos. Ver, por exemplo, Larrivée et al., supracitado. Deverá ser apreciado, no entanto, que a administração de 54 ΡΕ2100618 apenas um anticorpo anti-IGF-IR ou anti-PDGFRa é suficiente para impedir, inibir, ou reduzir a progressão tumoral de modo terapeuticamente eficaz.

Numa terapia de combinação, o anticorpo anti-IGF-IR ou anti-PDGFRa é administrado antes, durante ou depois da terapia com um outro agente, bem como qualquer sua combinação, ou seja, antes e durante, antes e depois, durante e depois, ou antes, durante e depois do inicio Da terapia com o agente antineoplásico. Por exemplo, o anticorpo pode ser administrado entre 1 e 30 dias, de preferência 3 e 20 dias, mais preferentemente entre 5 e 12 dias antes de iniciar a terapia por radiação. Num aspecto preferido, a quimioterapia é administrado concomitantemente com ou, mais preferentemente, depois da terapia com anticorpo.

Qualquer método ou via adequados podem ser utilizados para administrar anticorpos da invenção e, opcionalmente, para co-administrar agentes antineoplásicos e/ou antagonistas de outros receptores. Os regimes de agente antineoplásico utilizados, de acordo com a invenção, incluem qualquer regime que se pensa ser melhor adequado para o tratamento da condição neoplásica do paciente. Diferentes doenças malignas podem exigir uso de anticorpos anti-tumorais específicos e de agentes antineoplásicos específicos, que será determinado de paciente para paciente. As vias de administração incluem, por exemplo, via oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, ou 55 ΡΕ2100618 intramuscular. A dose de antagonista administrada depende de vários factores, incluindo, por exemplo, o tipo de antagonistas, o tipo e a gravidade do tumor a ser tratado e da via de administração dos antagonistas. Deve-se enfatizar, no entanto, que a presente divulgação não se limita a um método particular ou à via de administração.

Alguém perito na técnica entenderá que as doses e a frequência do tratamento dependerão da tolerância do paciente individual e das propriedades farmacológicas e farmacocinéticas do agente de bloqueio ou inibidor utilizado. Idealmente, pretende-se alcançar uma farmacocinética saturável para o agente utilizado. A dose para ambos os anticorpos anti-IGF-IR e anti-PDGFRa pode variar, por exemplo, de cerca de 10 a cerca de 1000 mg/m2, de preferência a partir de cerca de 200 a cerca de 400 mg/m2. Isto pode ser seguido por várias outras dosagens diárias ou semanais variando, por exemplo, de cerca de 200 a cerca de 400 mg/m2. 0 paciente é monitorizado por efeitos secundários e o tratamento é interrompido quando tais efeitos colaterais são graves.

Alguém perito na técnica também saberá como acompanhar a evolução do tratamento, de modo a determinar uma dose eficaz. Para as metástases ósseas de cancro de próstata, uma tal maneira é acompanhar os níveis de PSA. Outras maneiras de acompanhar as metástases ósseas incluem varrimentos ósseos e IRM. 56 ΡΕ2100618

Para os pacientes para os quais a perda óssea induzida pelo tratamento do cancro (CTIBL) é um risco ou problemático (por exemplo, os pacientes que recebem terapia hormonal adjuvante para o cancro da mama ou terapia de privação de androgénio para cancro da próstata), qualquer tratamento supracitado pode ser suplementado pela administração dos agentes de prevenção de CTIBL, tais como bifosfonatos. Bisfosfonatos incluem, por exemplo, clodronato, risedronato, e ácido zoledrónico.

As descrições detalhadas dos métodos convencionais, tais como aqueles utilizados na construção de vectores e plasmideos, e expressão de anticorpos e fragmentos de anticorpos podem ser obtidos a partir de diversas publicações, incluindo Sambrook, J et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição., Cold Spring Harbor Laboratory Press; Coligan, J. et al. (1994) Current Protocols in Immunology, Wiley & Sons, Incorporated; Enna, SJ. et al. (1991) Current Protocols in Pharmacology, Wiley & Sons, Bonifacino, JS et al. (1999) Current Protocols in Cell Biology, Wiley & Sons.

EXEMPLOS

Exemplo 1 (APENAS PARA REFERENCIA)

Efeitos do IMC-A12 e do docetaxel sobre o crescimento tumoral. Pedaços de tumores (20 a 30 mm3) de LuCaP 35V independente do androgénio (AI) foram implantados 57 ΡΕ2100618 por via subcutânea (s.c.) em 32 ratinhos SCID castrados com seis semanas de idade respectivamente como descrito anteriormente (4). Quando a implantação tumoral foi observada atingir um volume de 150-200 mm3, os animais foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos para estudos de tratamento. Os animais do grupo 1 receberam tratamento com docetaxel numa dose de 20 mg/kg. Os animais do Grupo 2 receberam tratamento com docetaxel numa dose de 10 mg/kg. Os animais do Grupo 3 receberam tratamento combinado de 10 mg/kg de docetaxel e 40 mg/kg de A12. Os animais do Grupo 4 receberam tratamento combinado de 20 mg/kg de docetaxel e 40 mg/kg de A12. Todos os tratamentos foram administrados por via intraperitoneal (ip) . O docetaxel foi administrado uma vez por semana. Ο A12 foi administrado três vezes por semana. Todos os animais foram tratados durante quatro semanas e monitorizados durante quatro semanas adicionais antes do sacrifício. Os tumores foram medidos duas vezes por semana e volume tumoral foi calculado pela fórmula: Volume = L x W2/2. Seguindo o nosso protocolo de animais aprovado pelo IACUC da Universidade de Washington, alguns animais foram sacrificados uma mais cedo, quando o tumor atingiu um volume de 1000 mm3 ou quando a perda de peso corporal dos animais ultrapassou 20% de peso corporal inicial. Os animais foram pesados duas vezes por semana. Amostras de sangue foram recolhidas do seio orbital semanalmente. O soro foi separado e o nível de PSA foi determinado utilizando o IMx Total PSA Assay (Abott Laboratories, Abott Park, IL) . Injectou-se BrdU foi nos tumores 1 hora antes dos animais serem sacrificados para 58 ΡΕ2100618 avaliação da taxa de proliferação de células tumorais in vivo.

Após o sacrifício, os tumores foram recolhidos e divididos em dois. Uma porção dos tumores foi fixada em tampão neutro de formalina 10% (NFB), e incorporados em parafina. Seções de cinco microns foram preparadas para coloração imuno-histoquimica (IHC). A parte restante do tumor foi dividida mecanicamente em células únicas por trituração e filtradas através de peneiros de Nylon de 70 ym.

Conforme mostrado na Fig. 1, xenoenxertos LuCaP 35V cresceram agressivamente em ratinhos com uma taxa média de crescimento de 3 62,0 ± 72,0 mm3/semana sem qualquer tratamento. Todos os animais do grupo não-tratados tiveram de ser sacrificados no prazo de três semanas após o inicio do tratamento em grupos experimentais, devido ao volume tumoral exceder 1000 mm3. Quando os animais foram tratados com 40 yg/kg de A12 isoladamente, a taxa de crescimento tumoral foi reduzida a 192,7 ± 35,6 mm3/semana durante o tratamento. Quando o docetaxel foi administrado aos animais numa dose de 10 mg/kg, a taxa de crescimento de tumor LuCaP 35V foi reduzida para uma média de 29,6 ± 6,1 mm3/semana. Quando o docetaxel foi administrado em combinação com tratamento A12, a taxa de crescimento de tumor LuCaP 35V foi ainda reduzida a uma média de 7,9 ± 1,0 mm3/semana (Fig. lb) . O efeito inibitório do docetaxel combinado com A12 persistiu por mais de quatro semanas após o fim do 59 ΡΕ2100618 tratamento. Quando uma maior dose de docetaxel (20 mg/kg) foi dada aos animais, independentemente, com ou sem tratamento combinado com A12, o volume tumoral não aumentou durante o período de tratamento de quatro semanas; pelo contrário, uma tendência de redução do volume tumoral foi observada. Porém, nas quatro semanas seguintes após o tratamento, a redução do volume tumoral foi mantida no grupo de animais tratados com docetaxel combinado com A12. Pelo contrário, os volumes tumorais foram aumentando a uma taxa média de 27,0 ± 16,1 mm3/semana no grupo de animais tratados apenas com docetaxel. Estes resultados sugeriram que, numa determinada dose de docetaxel, o tratamento combinado com A12 pode aumentar o efeito inibitório do docetaxel sobre o crescimento tumoral durante o tratamento ou após acompanhamento do tratamento. PSA é um parâmetro clínico comummente utilizado para avaliar o crescimento tumoral na próstata. Os níveis de PSA no soro foram medidos em animais durante e após o tratamento. Conforme mostrado na Fig. lc, nos animais tratados com A12 e docetaxel ou 20 mg/kg apenas com docetaxel, nenhuma mudança significativa foi observada nos níveis séricos de PSA durante as quatro semanas de tratamento, compatível com o crescimento tumoral reprimido. Após o fim do tratamento, os níveis séricos de PSA apresentaram aumentos em animais tratados apenas com docetaxel e, pelo contrário, consistentes ou mesmo diminuídos em animais tratados com docetaxel em associação com A12 Estes dados são consistentes com a continuação da inibição 60 ΡΕ2100618 pós-tratamento do crescimento tumoral em animais tratados com docetaxel e A12.

Indução da apoptose por docetaxel combinado com anticorpo anti-IGF-IRs. O efeito combinado in vivo do tratamento com docetaxel e A12 no ciclo celular e sobrevivência das células no ponto final das experiências foi medido por ensaio de marcação da extremidade "nick" mediada por desoxinucleotidil transferase terminal (TUNEL) e marcação com propídio (PI) utilizando o Apop-Direct Kit (BioScience BD) , como descrito anteriormente. Resumidamente, lxlO6 células de uma suspensão de células individuais foram fixadas com tampão formalina neutro 10% (NBF), seguido por 70% de etanol a 20°C durante 30 minutos. Após várias lavagens, as células foram permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 e incubadas com dUTP conjugado com FITC e enzima desoxinucleotidil transferase terminal (TdT) a 37°C durante 1 hora, seguido de uma incubação com tampão PI/RNase (100 yg/mL de PI, 50 yg/mL de RNase) à temperatura ambiente durante 60 minutos. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo usando um FACscan da BD. Os dados foram analisados com o programa informático CellQuestPR0.

Quatro semanas após o fim do tratamento, a apoptose foi detectada numa percentagem significativa dos tumores de animais que foram tratados com docetaxel (66,7% no grupo tratado com 10 mg/kg de docetaxel e 77,8% no grupo tratado com 20 mg/kg de docetaxel), em combinação com A12 (Fig. 2b e Tabela 1), independentemente da dose de ΡΕ2100618 docetaxel usada. A média de eventos apoptóticos nestes tumores ocorreu a uma taxa de 15,0 ± 4,3%. Nenhuma apoptose em tumores foi detectada em animais que foram tratados apenas com docetaxel. Em vez disso, a maioria (88% em grupo tratado com 10 mg/kg de docetaxel e 100% no grupo tratado com 10 mg/kg de docetaxel) dos tumores procedeu ao ciclo celular normal (Fig. 2a e Tabela 3).

Tabela 3 - Ciclo celular tumoral e actividades de sobrevivência no notiento do sacrifício Tratamento Apoptose (%) Paragem G1 (%) Paragem G2 (%) Ciclo normal (%) Nenhum 0 0 0 100 Doc (20) 0 0 0 100 Doc (20) + AI2 66,7 33,3 0 0 Doc (10) 0 0 12 88 Doc (10) + AI2 77,8 0 0 12,2

Para avaliar ainda mais a capacidade de proliferação de células tumorais após o final de diferentes tratamentos, secções em parafina marcadas com anticorpo anti-BrDu. Amostras tumorais foram fixadas em 10% NBF, embebidas em parafina, e seccionadas a 5 ym em lâminas. Após remoção da parafina e reidratação, os antigénios foram recuperados com 0,01 M de ácido cítrico (pH 6,0) a 95°C durante 2x5 minutos. Deixou-se as lâminas arrefecer durante 30 minutos, seguindo-se por lavagem sequencial com PBS. A actividade de peroxidase endógena foi interrompida por uma incubação com 0,3% de H2O2 em metanol durante 15 minutos. Após o bloqueio com soro de cabra normal a 1,5% em PBS contendo 0,05% de Tween 20 (PBST) durante 1 h, as lâminas ΡΕ2100618 foram incubadas com o anticorpo anti-BrdU de ratinho (1 yg/mL) durante 1 hora seguida da incubação sequencial com IgG de cabra biotinilado anti-ratinho durante 30 minutos, avidina marcada com peroxidase durante 30 minutos (Santa Cruz Biotechnology) e diaminobenzidina (DAB)/substrato peróxido de hidrogénio cromogénio (Vector Laboratories, Burlingame, CA) durante 5-10 minutos. Todas as etapas de incubação foram realizadas à temperatura ambiente. As lâminas foram cotra-marcadas com hematoxilina (Sigma), e montadas com permount (Fisher Scientific, Fair Lawn, New Jersey). Para controlo negativo, usou-se IgG de ratinho (Vector Laboratories) em vez de anticorpo anti-BrdU primário. As lâminas foram examinadas sob um Microscópio Zeiss e imagens digitais foram obtidas. Números de núcleos marcados com BrdU e núcleos totais foram recolhidos de 10 vistas aleatórias de cada seção. O índice de proliferação foi calculado pelo número de núcleos BrdU-positivos dividido pelo número total de núcleos. Dez campos foram contados por lâmina. A marcação H&E foi realizada usando hematoxilina e eosina (Richard Allen, Kalamazoo, MI).

Nos animais que foram tratados com docetaxel e A12, a captação de BrDu foi significativamente menor do que naqueles tratados com a mesma dose de docetaxel isoladamente (Fig. 3). Esses dados de incorporação de BrDu são coerentes com as observações acima do ciclo celular e apoptose, sugerindo que A12 significativamente reforça a citotoxicidade do docetaxel. 63 ΡΕ2100618

Regulação diferencial da expressão génica em tumores tratados com docetaxel combinado com anticorpo anti-IGF-IRs vs. apenas docetaxel. Para determinar os mecanismos potenciais para o efeito do docetaxel nitidamente reforçado por A12, a expressão de IGF-IR foi analisada em todos os tumores recolhidos por análise imuno-histoquímica e citometria de fluxo. Não houve diferença na expressão de IGF-IR de superfície entre todos os grupos de tratamento ou em comparação com o grupo de controlo (dados não apresentados) . A expressão génica pós-tratamento foi analisada utilizando análises de "microarray" de cADN em tumores de animais que receberam 20 mg/kg de docetaxel e 20 mg/kg de docetaxel combinado com A12. Baseado em análise SAM, 49 genes foram identificados como diferentemente expressos em tumores que receberam o tratamento combinado de docetaxel e A12, em comparação com aqueles que receberam apenas docetaxel, com uma alteração superior a 2 vezes e menos de 10% de taxa de falsos positivos (FDR) (dados não apresentados). Treze genes foram identificados que estão potencialmente envolvidos na regulação do ciclo celular ou da apoptose (Tabela 4). Todos os 13 genes apresentaram uma diferença de pelo menos 2 vezes entre os dois tratamentos e tinham um FDR inferior a 0,02%. Nove genes estavam sub-expressos e quatro sobre-expressos em tumores tratados com docetaxel e A12, em comparação com tumores tratados com docetaxel isoladamente. 64 ΡΕ2100618

Tabela 4 - Expressão genética diferenciada pós-tratamento em tumores tratados com docetaxel + A12, em comparação com tumores tratados com docetaxel isoladamente. HUGO Nome Função GO Vezes de alteração FDR Genes com regulação negativa CDC2 Ciclo de divisão celular 2 citocinese; mitose; 3,0 <0,02% CDC6 Homólogo de ciclo de divisão celular 6 CDC6 regulação negativa da proliferação celular 2,2 <0,02% CCNA2 Ciclina A2 regulação da actividade de CDK 2,1 <0,02% MYBL2 Homólogo de oncogene virai de Mieloblastose V-myb do tipo (aviário) 2 anti-apoptose; desenvolvimento; regulação do ciclo celular; 3,2 <0,02% TUBB Polipéptido tubulina beta movimento baseado em microtúbulos resistência a taxano 2,3 <0,02% K-ALFA-1 Tubulina alfa ubíqua movimento baseado em microtúbulos resistência a taxano 2,5 <0,02% BIRC5 Baculoviral contendo repetição IAP 5 (survivina) anti-apoptose 2,5 <0,02% CDC25B Ciclo da divisão celular 25B regulação positiva da proliferação celular 2,0 <0,02% MYC Homólogo de oncogene virai de mielocitcmatose V-myb (aviária) Paragem do ciclo celular 2,5 <0,02% Genes ccm regulação negativa T0B1 Transdutor de ERBB21 regulação negativa da proliferação celular 2,2 <0,02% CCNG2 Ciclina G2 ponto de controlo do ciclo celular 2,1 <0,02% IGFBP3 Proteína de ligação ao factor de crescimento similar à insulina 3 regulação de crescimento celular, pró-apoptótico 2,0 <0,02% BIRC3 Baculoviral contendo repetição IAP 3 Anti-apoptose; transdução de sinal ligado ao receptor de superfície celular 2,2 <0,02% 65 ΡΕ2100618

Para genes seleccionados, os resultados foram confirmados por RT-PCR em tempo real. Um fragmento padrão de PCR de cADN alvo foi purificado. Uma série de diluições dos padrões de 10 ng/yL a 10“3 pg/yL de foi utilizada para RT-PCR em tempo real para gerar curvas padrão. Um yg de ARN total de cada grupo de tumor reunido foi utilizado para a síntese da primeira cadeia de cADN usando Superscript First Strand Synthesis System (Invitrogen). Realizou-se RT-PCR em tempo real em 20 yL de mistura reaccional contendo 1 yL da primeira cadeia de cADN, conjuntos específicos de iniciadores, e Lightcycler FastStart DNA Master Plus SYBR Green usando um Roche Lightcycler seguindo o protocolo do fabricante (Roche, Nutley, NJ). Os produtos de RT-PCR foram submetidos a análise de curvas de fusão utilizando o programa Lightcycler v3.5. Os tamanhos dos amplicões foram confirmados por electroforese em gel de agarose. Cada amostra foi testada em duplicado. Os resultados são apresentados na Fig. 4.

Dos genes com regulação negativa, mostrou-se que TUBB resultava em resistência ao docetaxel (Tanaka et al. 2004, Int. J. Câncer 111, 617-26), e verificou-se que o aumento da expressão de BIRC 5 (survivina) estava associado ao cancro de próstata agressivo e à resistência à terapia antiandrogénica (de Angelis et al. 2004, Int. J. Oncol. 24, 1279-88; Zhang et. al. 2005, Oncogene 24, 2474-82). Além disso, TUBB é um gene regulado por IGF-IR que está envolvido com a transformação mediada por IGF-IR (Loughran et al. 2005, Oncogene 24, 6185-93). Dos quatro genes com 66 ΡΕ2100618 regulação positiva, verificou-se que IGFBP3 inibia a sinalização de ligando de IGF, bem como induzia a apoptose nas células tumorais de próstata de forma dependente de ligando (Grimberg et al., 2000, J. Cell. Physiol. 183, 1-9) . Níveis séricos de A12 pós-tratamento. Os níveis séricos de A12 foram medidos em animais que receberam docetaxel havia combinado com a A12. Os níveis séricos de A12 diminuíram 100 vezes duas semanas após a interrupção do tratamento e foram detectados a um nível muito baixo quatro semanas após a interrupção do tratamento (Fig. 5).

Citotoxicidade Global. A citotoxicidade da co-administração de docetaxel e IMC-A12 foi examinada. Embora A12 tenha reactividade cruzada superior a 95% com IGF-IR murino, nenhuma alteração de actividade diária ou de comportamento anormal foi observada em animais tratados com docetaxel isoladamente ou reagentes combinados, em comparação com o animais portadores de tumores controlo. Nenhum efeito significativo sobre células renais foi observado em qualquer grupo de tratamento tanto por ensaios de ciclo celular como de apoptose (dados não apresentados). Nenhuma alteração significativa do peso corporal foi observada entre os grupos de tratamento (Fig. 6).

Terapia com anticorpo anti-IGF-IR para metástases ósseas. A eficácia do tratamento com anticorpos anti-IGF-IR sobre o crescimento metastásico do cancro da próstata em 67 ΡΕ2100618 células ósseas foi avaliada usando células de cancro da próstata injectadas directamente na tíbia de ratinhos SCID. Por este método, tumores metastásicos são estabelecidos directamente, sem dependência de invasão dependente de quimiotaxia pela circulação. Uma variedade de linhagens tumorais está disponível para estabelecer as metástases ósseas. Estes incluem células PC-3, LuCaP35, e LnCaP que produzem lesões osteolíticas e células LuCaP 23.1 que produzem lesões osteoblásticas. Células LuCaP 23.1, que expressam IGF-IR, têm um índice de incorporação de -80% no ambiente ósseo e resultam em reacções osteoblásticas. Em experiências preliminares, amostras de LuCaP 23.1 apresentaram um aumento significativo no volume de osso vs volume de tecido (%BV/TV) em tíbias tumorais vs. controlo (254-503% do controlo; p = 0,024) . Todos os tumores LuCaP 23.1 nas tíbias apresentaram novos tubérculos ósseos, que não estavam presentes nas amostras normais, e um elevado número de focos tumorais, que tinha substituído a medula óssea normal. Nalguns espécimes o crescimento tumoral e ósseo estendeu-se para fora do osso original. A %BV/TV aumentada de amostras LuCaP 23.1 também foi observada após a castração; a %BV/TV de tíbias com tumor foi 212-354% daquela de tíbias sem o tumor (p = 0, 024) . Os resultados observados para os xenoenxertos intra-tíbia de LuCaP 23.1 são indicativos da formação de osso de novo estimulada por células tumorais. Além disso, os tumores apresentam muitas semelhanças com amostras humanas de metástases ósseas 68 ΡΕ2100618 osteoblásticas, incluindo um grande número de focos tumorais e aumento da quantidade de osso mineralizado.

Para avaliar a eficácia do tratamento com IMC-A12, xenoenxertos de tumores LuCaP 23.1 foram enxertados em ratinhos SCID, e os níveis séricos de PSA foram medidos duas vezes por semana para avaliar o crescimento tumoral. Todos os animais foram castrados duas semanas antes do enxerto das células tumorais na tíbia. A administração de IMC-A12 para testar ratinhos foi iniciada quando os níveis séricos de PSA atingiram 5-10 ng/mL (indicando tumores estabelecidos). Injectou-se 40 mg/kg IMC-A12 ip três vezes por semana durante seis semanas. A densidade mineral óssea (DMO) da tíbias com tumores e das tíbias contra-laterais sem tumor foi medida por absorciometria dupla de raios-X (PIXImus Lunar densitometer) realizada numa área de 2,5 mm x 2,5 mm no local de injecção de células tumorais, ou o local correspondente da tíbia contra-lateral no momento do enxerto. A avaliação a cada duas semanas das lesões foi realizada pelas medições de PSA no soro. Todos os animais foram sacrificados quando as lesões ósseas no grupo de controlo tinha recorrido após castração baseada em níveis séricos de PSA (LuCaP 35 >60 ng/mL, LuCaP 23.1 >500 ng/mL), aparência radiográfica das lesões ósseas ou quando os animais se tornaram comprometidos. Uma hora antes de serem sacrificados, os animais foram injectados com BrdU para monitorizar a proliferação de células tumorais. As 69 ΡΕ2100618 radiografias foram tomadas antes do sacrifício (FaxitronX-ray MX-2 0) , e mediu-se a DMO de ambas as tíbias no momento do sacrifício.

Tabela 5 - Densidade mineral óssea (EMD) A12 Controlo Tratamento Perna ccm Perna sot Perna ccm Perna sem tumor tumor tumor tumor Média 0,060 0,045 0,098 0,053 Valor P em comparação ccm o tumor controlo 0,0057 Valor P em comparação ccm a perna sem tumor 0,0004 0,0049

Os níveis de PSA no soro foram significativamente mais baixos em ratinhos tratados com IMC-A12 (Fig. 7), e o aumento da DMO associados com o crescimento de tumores metastásicos osteoblásticos foi significativamente reduzido (Tabela 5). As medições de DMO das pernas sem tumor indicou que tratamento com IMC-A12 não provocou uma perda de densidade óssea (osteoporose) . Radiografias dos ratinhos tratados e não tratados com IMC-A12 mostram que a progressão tumoral foi significativamente reduzida ou impedida em ratinhos tratados (Fig. 8).

Combinação de anticorpo anti-IGF-IR e docetaxel para metástases ósseas. Ratinhos SCID são castrados 2 semanas antes das injecções de tumores na tíbia. As metástases ósseas são geradas por injecção directa de células de cancro de próstata LuCaP 23.1 na tíbia dos ratinhos, dando origem a lesões osteoblásticas. Os enxertos expressam IGF-IR. Os níveis séricos de PSA são medidos a 70 ΡΕ2100618 cada duas semanas para avaliar o crescimento tumoral. Quando os níveis séricos de PSA chegam a 5-10 ng/mL, indicando um tumor estabelecido, os animais são distribuídos aleatoriamente em quatro grupos.

Em dois grupos, 40 mg/kg de BVIC-A12 são injectados i.p. três vezes por semana durante seis semanas com um grupo recebendo IMC-A12 + Docetaxel 20 mg/kg i.p., uma vez por semana durante 6 semanas e um segundo grupo IMC-A12 + Docetaxel 10 mg i.p. três vezes por semana durante 6 semanas. Os grupos de controlo grupos recebem 10 ou 20 mg de docetaxel i.p. sem IMC-A12.

Os animais são monitorizados semanalmente com medições de PSA. Após o fim do tratamento, os animais continuam a ser monitorizados semanalmente com medições de PSA até que os tumores em grupos com apenas docetaxel mostrem ressurgimento tumoral. Com o aumento de valores de PSA de grupos de apenas docetaxel (embora a um ritmo mais lento que em animais não tratados) , os níveis de PSA em ratinhos tratados com IMC-A12 + docataxel estabilizam, e nalguns animais, começam a decrescer. Verifica-se que as reduções nos níveis de PSA continuam, mesmo após o final do tratamento às seis semanas.

Como indicado acima, as medições de DMO são realizadas no momento do enxerto e no sacrifício, e radiografias são tomadas apenas antes do sacrifício. Os grupos tratados com IMC-A12 + docataxel mostram pouco ou 71 ΡΕ2100618 nenhum aumento na DMO, e as radiografias mostram pouca ou nenhum sinal de actividade osteoblástica.

Combinação de anticorpo anti-IGF-IRs e docetaxel para metástases ósseas. Pedaços de tumor de próstata LuCaP 23.1 humano (20 a 30 mm3) foram mecanicamente digeridos. 2-5 x 105 de células viáveis LuCaP 23.1 foram injectadas nas tíbias de ratinhos SCID com 6-8 semanas de idade. 21 ratinhos distribuídos aleatoriamente em três grupos foram usados para o estudo. Após a injecção tumoral, a PSA no soro foi monitorizada semanalmente. 0 tratamento começou quando o nível sérico de PSA alcançou 5-10 ng/mL, uma indicação de crescimento tumoral. 0 grupo 1 recebeu veículo de tampão salino de controlo. 0 grupo 2 recebeu 20 mg/kg de docetaxel i.p., uma vez por semana durante 4 semanas. O grupo 3 recebeu 20 mg/kg de docetaxel, uma vez por semana e 40mg/kg de A12 i.p. três vezes por semana durante 4 semanas. Para determinar se a resposta ao tratamento foi osteoblástica ou osteolítica, mediu-se DMO por Dexa-scan e raios X dos animais no ponto final de todos os tratamentos.

Apenas docetaxel ou docetaxel combinado com A12 inibiram significativamente o crescimento tumoral de LuCaP 23.1 como reflectido pela supressão dos níveis séricos de PSA (Fig. 9), sem diferença significativa entre os dois tratamentos. No entanto, após a interrupção do tratamento, os níveis séricos de PSA começaram a aumentar nos animais que tinham sido tratados unicamente com docetaxel, indicando um recrescimento do tumor; enquanto que foi 72 ΡΕ2100618 observada uma supressão continuada dos níveis séricos de PSA nos animais que receberam o tratamento combinado, o que indica um período prolongado de pós-tratamento com quiescência do tumor. Verificou-se que os níveis séricos de PSA se correlacionavam com a densidade óssea (DMO) os tamanhos de ossos com tumores radiografados (Fig. 9b) . Na semana cinco, a densidade óssea média nos animais controlo e tratados com docetaxel 20, e docetaxel 20 combinado com A12 foi 0,112 ± 0,01, 0,09 ± 0,02, e 0,05 ± 0,009 (média ± EPM) , respectivamente. Houve uma aparente tendência para uma diminuição na densidade óssea com o tratamento.

Exemplo 2

Fosforilação de Akt induzida por aspirado de medula óssea. Amostras de medula óssea de doadores normais masculinos (idades 18-45), foram fornecidas por Cambrex (Poietics™ Donor Program). As amostras foram centrifugadas a 1500 rpm, de modo a separar as fases solúveis e celulares. O sobrenadante foi filtrado utilizando filtros 0,8 ym e 0,22 ym sucessivamente. 50 ug/mL de aspirado de medula óssea foi administrado a células em 1 mL de meio (1: 20 diluição final).

Para experiências realizadas na presença de soro, as células foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% FBS e 50 yg/mL de gentamicina durante 24 horas antes da exposição a medula óssea. Para experiências na ausência de soro (células subnutridas), as células foram lavadas duas 73 ΡΕ2100618 vezes com PBS, o meio de crescimento foi substituído com DMEM sem soro, e as células foram incubadas durante 4 horas antes da exposição ao preparado de medula óssea. Quando utilizado, AG-1296, um inibidor específico de receptores de PDGF (Rice et al., 1999, Amer. J. Path. 155, 213-21) foi adicionado às culturas 30 minutos antes da exposição ao aspirado de medula óssea. Administraram-se anticorpos IMC-3G3 anticorpos descrito nos tempos de pré-tratamento como indicado abaixo. A activação de Akt pela medula óssea foi detectada em células PC3-ML, que expressam PDGFRa, mas não em células DU-145, que não têm receptor. Numa experiência, para minimizar o efeito de componentes de soro na activação de Akt, as células foram pré-incubadas durante 4 horas em meio sem soro. A adição de extractos da medula óssea resultou numa fosforilação robusta de Akt nas células PC3-ML, mas não nas células DU-145 (Fig. 10A) . Para avaliar o significado da resposta, uma segunda experiência foi realizada com soro. Uma estimulação robusta da fosforilação de Akt em células PC3-ML pelo aspirado de medula óssea foi também observado na presença de soro (Fig. 10B). Apenas uma pequena resposta foi suscitada em células DU-145.

Fosforilação de Akt mediada por PDGFRa. Pensa-se que osteoblastos e osteoclastos, que secretam tanto PDGF-AA como PDGF-BB, proporcionam estes factores de crescimento no meio solúvel da medula óssea. Para determinar se a resposta das células PC3-ML aos extractos de medula óssea 74 ΡΕ2100618 era relacionada com a transdução de sinal através de PDGFRa, células PC3-ML foram expostas a aspirado de medula óssea na ausência ou presença de 20 μΜ AG-1296. Esta concentração de AG-1296 inibe totalmente a activação de Akt induzida por PDGF-BB (Fig. 11A). AG-1296 inibiu a activação de Akt induzida por aspirado de medula óssea em mais de 40%. (Fig. 11B e D) . Isto indica que a sinalização de PDGFRa é responsável por uma proporção significativa da activação de Akt induzida pela medula óssea. A contribuição directa de PDGF-AA e BB para a sinalização de PDGFRa em relação a outros componentes dos aspirados da medula óssea foi também avaliada. Foi determinado que as concentrações de PDGF-AA e BB nos aspirados de medula óssea provenientes de três doadores diferentes variou de 400 pg/mL a 2 ng/mL. Dada a diluição de 20 vezes do aspirado de medula óssea, as células em teste estavam realmente a ser expostas a PDGF-AA e BB em concentrações entre 20 e 100 pg/mL. Assim sendo, células PC3-ML foram tratadas com 100 pg/mL de cada uma das PDGF-AA e BB. A fosforilação de Akt foi inferior a 10% do que aquela obtida com a aspirados de medula óssea. (Fig. 3C e D) . Assim sendo, parece que a activação da via de Akt através da sinalização de PDGFRa pode envolver outros ligandos PDGFRas para além de PDGF-AA e BB e/ou outros mecanismos para além da activação de PDGFRa por ligação directa de um ligando.

Inibição da fosforilação de Akt por um anticorpo 75 ΡΕ2100618 anti- PDGFRa. 0 anticorpo neutralizante IMC-3G3, que é específico para PDGFRa humanos também foi testado na sua capacidade de inibir a fosforilação da Akt em células PC3-ML. Um tempo de pré-incubação de 30 minutos e uma concentração de 20 yg/mL neutralizaram o efeito estimulador de 30 ng/mL de PDGF-BB (Fig. 12A) . O tratamento com o anticorpo também resultou em cerca de 40% de inibição da fosforilação de Akt induzida por medula óssea (Fig. 12B e C). Também foi observado que o efeito inibitório do IMC-3G3 na fosforilação de Akt foi dependente da duração da pré- incubação, com um tempo de incubação de 120 minutos a ser significativamente mais eficaz (Fig. 12D) do que os 30 minutos de tempo de incubação (Fig. 12 B e C) . Uma explicação possível é que IMC-3G3 induz a internalização de PDGFRa, e que o seu efeito inibitório está relacionado não só com bloqueio de ligação ao ligando, mas também com a remoção do receptor da membrana plasmática.

Exemplo 3

Isolamento de Anticorpos Anti-PDGFRa Humanos.

Anticorpos monoclonais anti-PDGFRa humanos foram gerados por uma tecnologia convencional de hibridomas (Harlow & Lane, ed., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 211-213 (1998), que está incorporada neste documento por referência), utilizando ratinhos transgénicos (Medarex Inc., Sunnyvale, CA), que expressam cadeias de imunoglobulina gama pesada e kapa leve. 0 domínio extracelular humano PDGFRa (ECD), foi adquirido de 76 ΡΕ2100618 adquirido à R&D Systems (Minneapolis, MN). Ratinhos KM foram imunizados por via subcutânea (s.c.), com 3 x 107 células endoteliais aórticas suinas que expressam de forma estável PDGFRa (PAE Ra). Após 4 semanas, os ratinhos foram injectados s.c. com 50 yg de PDGFRa ECD em adjuvante completo de Freund mais 3 x 107 de células PAE Ra administradas i.p. Os ratinhos receberam reforços mais duas vezes, com intervalos de 3 semanas distante, com 25 yg de PDGFRa ECD em adjuvante incompleto de Freund.

Esplenócitos de ratinhos com elevados níveis séricos de ligação e bloqueio foram isolados e fundidos com células de mieloma. As culturas de hibridomas que apresentam actividade de bloqueio foram subclonadas e anticorpos destes hibridomas foram purificados por cromatografia com proteína G.

As IgGs foram avaliadas para a ligação a PDGFRa num ensaio de ligação directa. Imobilizou-se PDGFRa ECD em PBS numa placa de 96 poços (100 ng/poço) . As placas foram então lavadas com PBST (PBS + 0,05% Tween 20) e bloqueadas com PBSM (3% leite em PBS, 200 yL/cavidade) durante 2 horas a 25°C. IgGs diluídos em PBSM foram incubados com o PDGFRa ECD imobilizado durante lha 25°C, e as placas foram lavadas com PBST. Um anticorpo secundário (conjugado de F(aB')2 IgG anti-humano de cabra-peroxidase de rábano; BioSource International, Camarillo, CA) diluído 1:5000, em PBSM foram adicionados durante 1 hora a 25°C. Após as placas serem lavadas com PBST, um substrato TMB peroxidase (KPL, Gaithersburg, MD) foi adicionado e a reacção foi 77 ΡΕ2100618 interrompida com 100 yL de 1 mol/L H2S04. As placas foram lidas a A450 nm usando um leitor de microplacas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). O bloqueio de PDGF foi avaliado utilizando um ensaio de bloqueio de PDGF em fase sólida (ver Duan et al. 1991, J. Biol. Chem. 266:413-8, que é incorporado por referência). Diluiu-se PDGFRa ECD em PBS e revestiu-se em microplacas de 96 poços (Immulon 2HB de fundo plano 1 x 12 tiras Removawell de poliestireno de ligação a proteínas irradiado; Dynex Technologies, Chantilly, VA) . Cada poço foi revestido com 60 ng de PDGFRa durante 3 horas a 25°C num volume total de 100 pL. As placas foram então lavadas duas vezes e bloqueadas durante a noite a 4°C com 25 mmol/L HEPES (pH 7,45), 0,5% de gelatina, 100 mmol/L de NaCl, e 0,1% de Tween 20. As placas foram então aquecidas a 25°C durante 20 minutos e depois lavadas com uma vez com tampão de ligação (25 mmol/L HEPES (pH 7,45), 0,3% de gelatina, 100 mmol/L de NaCl, 0,01% de Tween 20). Cinquenta microlitros de IgGs foram adicionados a cada poço e incubados a 25°C durante 30 minutos. Diluiu-se PDGF iodado em tampão de ligação e adicionou-se (50 pL de uma solução de 1 nmol/L) a cada poço. As placas foram incubadas durante 2 horas a 25°C e de seguida lavadas cinco vezes com tampão de ligação. Cada poço foi contado num contador gama. O ensaio de bloqueio baseado em células foi realizado conforme descrito em Heldin et al., 1988, EMBO J. 7, 1387- 93. 78 ΡΕ2100618 A cinética de ligação de anticorpos a PDGFRa foi medido utilizando um instrumento BIAcore 3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). Imobilizou-se PDGFRaECD num chip de sensor e o anticorpo foi injectado em diversas concentrações. Obtiveram-se sensogramas a cada concentração e avaliou-se usando o programa BIA Evaluation 2.0 para determinar as constantes de velocidade. A constante de afinidade, Kd, foi calculada a partir da razão das constantes de velocidade Koff/Kon. A Fig. 13 mostra a ligação dependente de dose do anticorpo monoclonal humano IMC-3G3 ao PDGFRaECD imobilizado em ELISA. A concentração de anticorpo necessária para se atingir 50% do máximo de ligação a PDGFRa ECD foi de 0,06 nmol/L (Tabela 6) . A ED50 é coerente com a Kd para o anticorpo como determinado pela ressonância de plasmões de superfície num instrumento BIAcore (Tabela 1) . O anticorpo monoclonal também bloqueou a ligação de [125I] PDGF-BB ao receptor imobilizado, com um IC50 de 0,43 nmol/L. Os locais de ligação para PDGF-AA e PDGF-BB em PDGFRa não são estruturalmente coincidentes. Os dados sugerem que o epitopo para 3G3 sobrepõe-se espacialmente com ambos os locais de ligação a factores de crescimento.

Tabela 6 - Características de ligação de anticorpo PDGFRa Ligação de PDGFRa Bloqueio de PDGF Cinética de ligação (ED50, nmol/L) Fase sólida (IC50, nmol/L) Baseado em células (IC50, nmol/L) Kcn (105 mol/L_1s_1) iáff (104 s-1) (109 mol/L) 0,06 0,24 0,58 11,50 0,47 0,04 79 ΡΕ2100618

Inibição da activação e fosforilação do receptor de moléculas efectoras a jusante. Os efeitos sobre a sinalização intracelular induzidas por PDGF por IMC-3G3 foram determinados utilizando células PAE Ra. As células foram inoculadas em placas de cultura de tecidos Falcon de seis poços (250000 células por poço) e deixaram-se a crescer durante a noite. Os poços foram lavados e, de seguida, incubados em meio sem soro. Após uma noite de incubação para tornar as células quiescentes, as células foram tratadas com anticorpos durante 30 minutos a 37°C seguida da adição de PDGF-AA ou PDGF-BB e incubação, por um período adicional 10 minutos a 37°C. As células foram então separadas e lisadas em 200 pL de tampão de lise (50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0), Triton X-100 1%, NaCl 150 mmol/L, EDTA 1 mmol/L, SDS 0,1%, 1 mmol/L de ortovanadato de sódio, e inibidores de protease (Complete Mini, Roche, Mannheim, Alemanha)). Os lisados celulares foram analisados por SDS-PAGE e "Western blot" usando reagentes de quimiolumines-cência e Hyperfilm (Amersham Biosciences). O anticorpo foi testado para a capacidade de inibir fosforilação do receptor de tirosina induzida por ligando. PDGF-AA e PDGF-BB aumentam fosforilação de tirosina de PDGFRa em cerca de 5 vezes a concentrações de 1 e 3 nmol/L, respectivamente. Concentrações mais altas de ligando (10 nmol/L) resultaram em menos receptor fosfo-rilado possivelmente devido à degradação induzida pelo ligando. O anticorpo inibiu o receptor induzido por PDGF- 80 ΡΕ2100618 BB para níveis próximos dos níveis basais (Fig. 14A, linha superior). Dados similares foram obtidos usando PDGF-AA para induzir a fosforilação do receptor. PDGFs transduzem sinais mitogénicos e exercem efeitos anti-apoptóticos em células que expressam o receptor através de proteínas efectoras a jusante. Consequentemente, o anticorpo monoclonal foi testado para a sua capacidade de inibir a activação de MAPKs p44/p42 e Akt (envolvidos nas vias de crescimento celular e anti-apoptóticas, respectivamente). O anticorpo anti-PDGFRa inibiu a fosforilação de ambos MAPKs e Akt em resposta a PDGF-BB (Fig. 2A) e PDGF-AA (não apresentado). A inibição de fosforilação de PDGFRa foi dependente da dose, conseguindo-se 50% de obtida em 0,25 nmol/L (Fig. 14B).

Actividade anti-mitogénica. O anticorpo monoclonal anti-PDGFRa foi testado pela sua capacidade de bloquear a mitogénese induzida por PDGFAA de células PAE Ra. As células foram inoculadas em placas de cultura de tecidos de 96-poços (1 x 104 células por poço) e crescidas durante a noite em 100 yL de meio por poço. Os poços foram depois lavados com meio sem soro e as células foram mantidas sem soro durante a noite com 75 uL de sem soro adicionados a cada poço. A IgG foi adicionada (25 yL/poço) e as placas foram incubadas durante 30 minutos a 37°C. Em seguida adicionou-se PDGF-AA ou PDGF-BB (25 yL/poço), e as placas foram incubadas durante 18 a 20 horas a 37°C. As placas foram incubadas durante mais 4 horas após cada poço 81 ΡΕ2100618 ter recebido 0,25 yCi [3H]timidina (25 yL/poço). Anticorpo, PDGF, e [3H]timidina foram todos diluídos em meio sem soro. As células foram então lavadas com PBS mais 1% albumina de soro bovino e separadas por tratamento com tripsina (lOOyL/poço) . As células foram recolhidas num filtro e lavadas três vezes com água bi-destilada usando um dispositivo de recolha de células MACH III (Tomtec, Inc., Hamden, CT) . Após o processamento do filtro, a radioac-tividade incorporada no ADN foi determinada num contador de cintilações (Wallac Microbeta, modelo 1450).

Quando se adicionou MC-3G3 a células PAE Ra em abstinência de soro, a incorporação de timidina induzida por PDGF-AA foi especificamente inibida (Fig. 15), com uma EC5o de 8,3 nmol/L. O anticorpo também inibiu a mitogénese das células PAE Ra induzida por 3 nmol/L de PDGF-BB com uma EC50 de 1,25 nmol/L (dados não apresentados).

Inibição do crescimento de linhagens de células tumorais humanas que expressam PDGFRa. Linhagens de células tumorais humanas que expressam PDGFRa foram testadas para determinar a influência dos anticorpos anti-PDGFRa humanos no crescimento maligno em sistemas in vitro e in vivo. Duas dessas linhagens de células tumorais que expressam PDGFRa, conforme determinado por citometria de fluxo são SKLMS-1 (leiomiossarcoma) e U118 (glioblastoma). Estas linhagens celulares também respondem a ligandos em ensaios mitogénicos e formam tumores em ratinhos. SKLMS-1 tem o potencial não apenas para estimulação parácrina mas ΡΕ2100618 também autócrina. Verificou-se que SKLMS-1 expressa a proteína PDGF-AA quando cultivada em cultura usando uma técnica de imunoensaio enzimático em sanduíche quantitativo (R&D Systems).

Como se pode ver na Fig. 16A, IMC-3G3 inibiu a fosforilação de ambos Akt e MAPKs em resposta a estimulação por PDGF-AA de células SKLMS-1. A inibição da fosforilação de Akt foi 100% e a de MAPKs foi de cerca de 80%. 0 anticorpo é também um eficaz inibidor de fosforilação em células U118 (Fig. 16B). A mitogénese induzida por ligando de células tumorais também foi bloqueada. Quando o anticorpo anti-PDGFRa foi adicionado a células U118 em abstinência de soro, a incorporação de timidina induzida por PDGF-AA foi especificamente inibida (Fig. 17A) com uma EC50 de 3,4 nmol/L. O anticorpo também inibiu a resposta mitogénica induzida por PDGF-AA de células SKLMS-1 com uma EC50 de 5 nmol/L (Fig. 17B), bem como a resposta mitogénica induzida por PDGF-BB (Fig. 17C). Apenas a inibição parcial (40% a 66 nmol/L; Fig. 17D) de resposta mitogénica induzida por PDGF-BB foi observada para células U118. Isto é atribuído à expressão de ambos PDGFRa e PDGFRP nessas células (dados não apresentados).

Inibição de crescimento do xeno-enxerto tumoral.

Testou-se IMC-3G3 in vivo em modelos de xeno-enxerto de glioblastoma (U118) e leiomiossarcoma (SKLMS-1) por via subcutânea (s.c.) em ratinhos atímicos imunossuprimidos. Xenoenxertos tumorais s.c. foram estabelecidos através da ΡΕ2100618 injecção de 10 x 106 de células SKLMS-1 ou de células mistas U118 em Matrigel (Collaborative Research Biochemicals, Bedford, MA) em ratinhos fêmea atímicos imunossuprimidos (Cri:NU/NU-nuBR, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) . Deixou-se os tumores atingirem um volume tumoral médio (n/6 x comprimento maior x profundidade perpendicular2), de aproximadamente 400 mm3. Os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente em cinco grupos (N = 12) e tratados por injecção i.p. duas vezes por semana durante o período de estudo. Os ratinhos do Grupo 1 foram tratados com o veículo controlo (0,9% NaCl, USP para Irrigação, B/Braun) . Os ratinhos dos Grupos 2 a 4 foram tratados com 6, 20, e 60 mg/kg do anticorpo anti-PDGFRa presente. Os ratinhos do Grupo 5 foram tratados com 60 mg/kg IgG humana (Sigma). Os grupos tratados com 6, 20, ou 60 mg/kg de anticorpos anti-PDGFRa ou IgG humana foram administradas doses de carga de 21,4, 71,4, e 214 mg/kg, respectivamente. As doses de carga foram calculadas para atingir uma concentração plasmática em estado estacionário desde a primeira dose (meia-vida de eliminação, 7 dias), utilizando um esquema posológico de duas vezes por semana. Os volumes tumorais foram avaliados duas vezes por semana e o crescimento tumoral nos grupos de tratamento foi comparado com medições repetidas ANOVA.

Conforme mostrado na Fig. 18A, a IgG humana, não teve efeito sobre o crescimento de glioblastoma, em comparação com ratinhos tratados com solução salina (P = 0,74), enquanto que o anticorpo anti-PDGFRa inibiu 84 ΡΕ2100618 significativamente o crescimento tumoral em doses de 6 (P = 0,06), 20 (P = 0,03), e 60 (P = 0,0004) mg/kg. No estudo final de U118, os valores % T/C [(volume tumoral média para o grupo tratado com 3G3 na conclusão do estudo/volume tumoral médio no inicio do tratamento) / ( volume tumoral médio de grupo tratado com controlo na conclusão de estudo/volume tumoral médio no inicio do tratamento) x 100] foram 67%, 63%, e 35% para grupos tratados com 3G3 com doses de 6, 20, e 60 mg/kg, respectivamente. Além disso, a regressão tumoral foi observada em 4 de 12, 5 de 11, e 10 de 12 animais nos grupos de tratamento de 6, 20, e 60 mg/kg. Não houve regressão em qualquer grupo controlo. A Fig. 18 B mostra que o crescimento de leiomiossarcoma também foi significativamente inibido pelo tratamento a 6 (P=0,02), 20 (P=0,003), e 60 (P<0,0001) mg/kg. Os valores finais %T/C foram 66%, 57%, e 31% para os grupos de tratamento 6, 20, e 60 mg/kg, respectivamente, sem regressão tumoral. O exame histológico de enxertos no final do tratamento mostrou diferenças marcantes em tumores de animais tratados, em comparação com tumores de animais que receberam terapia controlo. Os tumores ressectados foram fixados em fixador QDL a 4°C durante 24 horas. Depois da incorporação em parafina e preparação de secções a 4 ym, as seções fixas com formalina foram coradas com H&E de Mayer (Richard Allen, Kalamazoo, MI). 85 ΡΕ2100618

No grupo U118 tratado com a dose mais alta (60 mg/kg) , menos células tumorais viáveis foram encontradas e observaram-se substancialmente mais regiões com células esparsas em comparação com o grupo de controlo com soro (Fig. 18C). Xenoenxertos SKLMS-1 tratados no dia 25 também mostraram uma redução na quantidade de células tumorais viáveis e empacotamento celular, em comparação com o grupo de controlo com soro (Fig. 18D).

Inibição in vitro de estimulação mediada por PDGFRa de uma linhagem de glioblastoma. O nível do receptor de fosfotirosina em tumores U118 foi avaliado uma semana após o tratamento com anticorpo anti-PDGFRa ou IgGt humana. Ratinhos com tumores U118 estabelecidos (500 mm3) foram tratados com uma dose de carga de 214 mg/kg seguida 72 horas mais tarde por uma dose de manutenção de 60 mg/kg de anticorpos. Os tumores foram recolhidos dos ratinhos uma semana (168 horas) após a primeira injecção de anticorpo (num momento antes da regressão tumoral ser observada em média; ver Fig. 18A) e homogeneizados num tampão de lise do ensaio de fosforilação (ver acima). Os lisados foram centrifugados duas vezes a 14000 rpm e a concentração em proteínas para o sobrenadante recolhido foi determinada (ensaio de proteína Bio-Rad, Bio-Rad, Hercules, CA) . O lisado (4 mg) de cada amostra foi imunoprecipitado utilizando anticorpos anti-PDGFRa. PDGFRa humanos imunoprecipitados foram então submetidos a "imunoblot" tanto com um anticorpo anti-PDGFR como anti-fosfotirosina. A Fig. 19 mostra que a administração de anticorpo anti- 86 ΡΕ2100618 PDGFRa resultou na redução do nível de fosfotirosina de PDGFRa relativa a um controlo de IgG humana nestes tumores.

Engenharia das linhagens celulares. Primeiro, os genes que codificam para os domínios variáveis de cadeia pesada e leve do anticorpo anti-PDGFRa humano foram clonados e sequenciados. Uma série de iniciadores foi obtida de MEDAREX que se ligam às sequências flanqueadoras 5' e 3' das sequências de região variável de imunoglobulina humana em hibridomas derivados de MEDAREX. A região variável de cadeia pesada amplificada com par de iniciadores AB88 (frente) e AB90 (reverso) (Tabela 7). Os produtos de cadeia leve foram amplificados com pares de iniciadores contendo o iniciador no sentido directo AB182 e o iniciador reverso AB16 (Quadro 7). Os produtos de 0,4kb destas reacções foram clonados no vector ZeroBlunt (Invitrogen) para produzir AB88-1 (VH) e AB 182-3 (VK) , e as inserções foram sequenciadas com iniciadores universais T7 e M13R.

Tabela 7 - Iniciadores para hibridomas MEDAREX Oligo Tamanho Sequência de ADN (5'-3') SEQ ID NO AB88 21 ATGAAACACCTGTGGTTCTTC 20 AB90 21 T GC CAGGGGGAAGACCGATGG 21 AB182 24 ATGGAA(G/A) CCCCAGCGCAGCTTCTC 22 ABI 6 20 C GGGAAGATGAAGACAGATG 23

De modo a gerar vectores plasmídicos para expressar o anticorpo IgGl completo, as regiões variáveis 87 ΡΕ2100618 clonadas foram amplificadas por PCR e ligadas em duas etapas em vectores de expressão contendo genes de região constante. A amplificação primária por PCR da cadeia pesada utilizou 25 ng de plasmideo AB88-1 como molde para iniciadores IPHF5 (directo) e IPHR5 (reverso) . A amplificação secundária por PCR da cadeia pesada utilizou 5 μΐ de reacção primária como molde e os iniciadores OPSIF e IPHR5. A combinação dos dois iniciadores directos adiciona uma sequência de 57 pares de base à extremidade 5' dos genes de imunoglobulina que codificam para uma sequência sinal de gene de cadeia pesada de 19 aminoácidos de ratinho (MGWSCIILFLVATATGVHS; SEQ ID NO: 24) para o processamento e secreção eficiente de imunoglobulina. Além disso, o iniciador directo OPSIF acrescenta uma sequência de consenso "Kozak" (J. Mol. Biol. 196: 947) para um inicio eficiente da tradução desses genes nas células de mamífero e um local de restrição de endonuclease 5' HindIII para clonagem do produto amplificado no vector de expressão adequado. 0 iniciador reverso da cadeia pesada contém um local Nhel em grelha para clonagem na região constante do vector.

Realizou-se a PCR em duas etapas utilizando o kit PCR Expand (Boehringer Mannheim Inc.), de acordo com especificações do fabricante utilizando o sistema Expand Buffer #3 em reacções de 50 yL com as seguintes condições de ciclo: ΡΕ2100618 88 1 ciclo 5 ciclos 20 ciclos 1 ciclo 94°, 94°, 48°, 68°, 94°, 65°, 68°, 68°, 2 minutos 20 segundos 60 segundos 2 minutos 20 segundos 60 segundos 2 minutos 5 minutos

Após duas rondas de PCR, o produto foi purificado seguindo electroforese em gel de agarose e clonado como um fragmento digerido HindIII-Nhel no vector pDFc (Fig. 8), que contém a região constante humana gama 1. A amplificação por PCR primária da cadeia leve utilizou 25 ng de plasmideo pABl82-3 como iniciadores molde IPLF4 (directo) e IPLR2 (reverso) . A amplificação por PCR secundária da cadeia leve utilizou 5 yL de reacção primária como molde e os iniciadores OPSIF e IPLR2. Quanto à cadeia pesada, os dois iniciadores directos fornecem uma sequência de sinal de secreção. O iniciador reverso da cadeia primária contém um local em grelha BsiWI para a clonagem na região constante kapa do vector pLck (Fig. 8). As reacções de PCR foram realizadas como para a cadeia pesada acima. Após duas rondas de PCR, o produto foi purificado seguindo electroforese em gel de agarose e clonado em pLck, que contém a região constante da cadeia leve kapa humana. 89 ΡΕ2100618

Tabela 8 - Iniciadores para vectores de expressão de VH e VK

Tabela 8 - Iniciadores pra os vectores de expressão de VH e VK Oligo Tamanho Sequência de ADN (5'-3') SEQ ID NO OPSIF 53 GAGAAGCTTGCCGCCACCATGGGATGGTCATGTATCAT 25 CCTTTTTCTAGTAGC IPHF5 58 TCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCA 26 CAGCTGCAGCTGCAGGACTC IPHR5 37 CGCGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTGG 27 IPLF4 58 TCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAG 28 AAATTGTGTTGACACAGTC IPLR2 37 GCGCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTGGCCG 29

Esta construção foi então utilizada para gerar uma linha de produção estável na linha de células de mieloma NSO. As células NSO foram transfectadas com o plasmideo de expressão através de electroporação usando o BioRad Gene Pulser II. Antes da transfecção, o ADN do plasmideo foi linearizado com Pvul, precipitado com etanol, e ressuspendido numa concentração de 0,4 mg/mL (40 ug em 100 ul de dtbO). As células foram electroporadas com os 40 pg de ADN num volume final de 800 uL por um único pulso de 250 Volt, 400 yFd. As células electroporadas foram dispersas em aliquotas de 50 yL em meio DMEM (JRH Biosciences Inc.), contendo soro de vitelo fetal dialisado a 10% (dFCS) (Hyclone, Lote#: AHA7675) e 2 mM de glutamina (Invitro-gen/Life Technologies) em poços de aproximadamente dezoito placas de 96 poços a uma densidade de 5000-10000 células por poço. A selecção de transfectantes positivos para a glutamina sintetase (GS) foi iniciada 24 horas depois por ΡΕ2100618 meio da adição de DMEM sem glutamina contendo dFCS 10% e suplementado com lx suplemento GS (JRH Biosciences Inc.). As células foram cultivadas durante 2-4 semanas a 37°C, 5% de CO2 para permitir o crescimento e a expansão das colónias. Mais de 300 colónias foram seleccionadas usando um ELISA de Fc (gama) anti-humana (detecção de peroxidase de rábano a A450nm). Clones que expressam anticorpos (58%) foram ampliados e reanalisados para a produtividade durante 3-5 dias de cultivo. Para adaptar células em meio livre de soro, as linhas celulares positivas foram expandidas por meio da adição de um volume igual meio de cultura GS-OS livre de soro em cada passagem. Positivos fortes, produzindo 25 ug/mL ou mais em culturas de 24 poços sub-confluentes em 3 dias, foram expandidos para uma análise mais aprofundada para adaptação completa ao meio sem soro.

Realizações adicionais incluem:

(a) Tratamentos com antagonistas IGF-IR

Um método para o tratamento de um indivíduo com um tumor ósseo que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um antagonista IGF-IR.

Um método para a inibição do crescimento de um tumor ósseo, o qual compreende a administração de uma quantidade eficaz de um antagonista IGF-IR. O tumor ósseo de acordo com estes métodos pode ser um tumor primário ou secundário. 91 ΡΕ2100618 0 crescimento das células tumorais pode ser dependente de androgénio ou independente de androgénio. 0 tumor pode ser metastizado de um cancro da próstata, um cancro da mama ou um cancro de pulmão.

Os antagonistas podem ser co-administrados com um segundo antagonista de receptor da tirosina cinase.

Os antagonistas podem ser co-administrados com uma quantidade eficaz de um agente antineoplásico. 0 agente antineoplásico pode ser docetaxel, doxorubicina ou radiação. 0 antagonista IGF-IR pode ser um anticorpo ou um fragmento de anticorpo. Tal anticorpo ou fragmento de anticorpo pode competir para a ligação a IGF-IR com um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada com SEQ ID NO: 41 e um domínio variável de cadeia leve com SEQ ID NO: 51. Alternativamente, o antagonista IGF-IR pode ser um inibidor intracelular de IGF-IR e pode ser seleccionado do grupo que consiste em AG1024, NVP-AEW541, e BMS-554417. 0 antagonista de IGF-IR pode inibir a ligação de IGF-I ou IGF-II a IGF-IR, neutralizar a activação de IGF-IR por IGF-I ou IGF-II, reduzir a concentração do receptor de superfície de IGF-IR, ou inibir a fosforilação de uma molécula de sinalização a jusante de IGF-IR. 92 ΡΕ2100618 0 antagonista IGF-IR pode ser um anticorpo que se liga a IGF-IR com uma Kd de cerca de 3 x 10~10 M_1 ou menos. 0 antagonista IGF-IR pode ser um anticorpo bi-específico. 0 anticorpo bi-especifico pode ser especifico para IGF-IR e PDGFRa; ou IGF-IR e EGFR. (b) Anticorpos PDGFRa

Um anticorpo ou fragmento de anticorpo humano isolado especifico para PDGFRa compreendendo uma ou mais regiões determinantes da complementaridade seleccionados do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2 a CDR1H; SEQ ID NO: 4 a CDRH2; SEQ ID NO: 6 a CDRH3; SEQ ID NO: 10 a CDRLl; SEQ ID NO: 12 a CDRL2; e SEQ ID NO: 14 a CDR3L. O anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende preferentemente: (a) SEQ ID NO: 2 a CDRlH; SEQ ID NO: 4 a CDRH2 ; SEQ ID NO: 6a CDRH3; ou (b) SEQ ID NO: 10 a CDRLl; SEQ ID NO: 12 a CDRL2; e SEQ ID NO: 14 a CDR3L. O anticorpo ou fragmento de anticorpo compreendendo mais preferentemente SEQ ID NO: 2a CDR1H; SEQ ID NO: 4a CDRH2; SEQ ID NO: 6 a CDRH3; SEQ ID NO: 10 a CDRLl; SEQ ID NO: 12 a CDRL2; e SEQ ID NO: 14 a CDR3L. 93 ΡΕ2100618 0 anticorpo ou fragmento de anticorpo pode compreender SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 16 e mais preferentemente compreende SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 12. O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode: (a) ligar-se selectivamente a PDGFRa; (b) inibir a ligação de PDGFRa a um ligando de PDGFRa; ou (c) neutralizar PDGFRa. 0 fragmento de anticorpo pode ser seleccionado do grupo que consiste num anticorpo de cadeia simples, um Fab, um Fv de cadeia simples, um diacorpo, e um triacorpo.

Uma realização adicional da invenção refere-se a um conjugado do anticorpo ou do fragmento de anticorpo discutido acima. 0 conjugado pode compreender um agente antineoplásico, uma porção alvo ou uma porção repórter.

Uma realização adicional da invenção refere-se a um polinucleótido que codifica para um anticorpo ou um fragmento de anticorpo e compreende uma ou mais sequências nucleotidicas seleccionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 a CDRlH; SEQ ID NO: 3a CDRH2; SEQ ID NO: 5a CDRH3; SEQ ID NO: 9a CDRLl; SEQ ID NO: 11 a CDRL2; e SEQ ID NO: 13 a CDR3L. 0 polinucleótido isolado pode compreender SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 15. 94 ΡΕ2100618

Ainda outra realização da invenção refere-se a um vector de expressão compreendendo o polinucleótido.

Ainda outra realização da invenção refere-se a uma célula hospedeira que compreende o vector de expressão. A célula hospedeira recombinante pode produzir: (a) um polipéptido compreendendo a SEQ ID NO: 8 e um polipéptido compreendendo a SEQ ID NO: 16; ou (b) um polipéptido compreendendo a SEQ ID NO: 8 e a SEQ ID NO: 16.

Ainda outra realização da invenção refere-se a uma quantidade eficaz do anticorpo descrito acima para utilização como um medicamento para a neutralização da activação de PDGFRa num mamífero.

Ainda outra realização da invenção refere-se a uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo descrito acima para utilização como um medicamento para a inibição do crescimento tumoral num mamífero. Preferen temente o anticorpo é usado para inibir o crescimento de um tumor que expressa ou sobre-expressa PDGFa. 0 tumor é preferentemente um tumor primário, um tumor metastásico, um tumor refractário ou um tumor vascularizado. Além disso, o tumor pode ser seleccionado do qrupo que consiste num tumor dos ovários, um tumor da mama, um tumor do pulmão, um tumor hepatocelular, um tumor estromal gastrointestinal, um melanoma, um carcinoma de células renais, um tumor da próstata, e um sarcoma dos tecidos moles. 95 ΡΕ2100618 0 anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser administrado em combinação com um agente antineoplásico. 0 agente antineoplásico é preferentemente um agente quimio-terapêutico. 0 agente antineoplásico pode também preferentemente ser doxorubicina ou radiação. 0 anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser administrado com um segundo antagonista de PDGFRa. 0 antagonista de PDGFRa é preferentemente um antagonista PDGFRa intracelular. 0 anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser administrado com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um receptor de factor de crescimento epitelial (EGFR) ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de receptor de factor de crescimento semelhante à insulina (IGF-IR).

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> ImClone Systems Incorporated, et al. <120> Antagonistas dos Receptores para o Tratamento do Cancro

Metastásico Ósseo <130> 11245/54076 <140> A ser atribuído <141> 2006-06-19 <150> 601691,920 <151> 2005-06-17 <160> 63 <170> Patenteln versão 3.3 96 ΡΕ2100618 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapien <22 0> <221> CDS <222> (D .. (15) <4 0 0> 1 agt agt agt tac tac Ser Ser ser Tyr Tyr 1 5

<210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Ser Ser Ser Tyr Tyr 1 5

<210> 3 <211> 48 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1) .. (48) <400> 3 agt ttc ttt tat act gqg age acc tac tac aac ccg tcc etc agg agt 48

Ser Phe Phe Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser. 1 5 10 15

<210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Ser Phe Phe Tyr Thr Gly ser Thr Tyr Tyr Asn pro Ser Leu Arg Ser 1 5 10 15 <210> 5 <211> 51 <212> DNA <213> Homo <22 0> <221> CDS <222> (D . <400> 5 97 ΡΕ2100618 cag tcc acg tat tac tat ggt tcg ggg aat tat tat ggc tgg ttc gac 48

Gin Sèr Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Asn Tyr Tyr Gly Trp Phe asd 1 5 10 15 cgc 51

Arg

<210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

Gin Ser Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Asn Tyr Tyr Gly Trp Phe Asp 1 5 10 15

Arg

<210> 7 <211> 381 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1) .. (381) <400> 7 cag ctg cag ctg cag gag tcg ggc cca ggá ctg gtg aag cct tcg gag 48 Gin Leu Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys pro ser Glu . 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt ggc tcc atC aac agt agt 96 Thr Leu ser Leu Thr cys Thr vai Ser Gly Gly ser ile Asn ser ser 20 25 30 agt tac tac tgg ggc tgg ctc cgc cag tcc cca 999 aag ggg ctg gag 144 Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Leu Arg Gin ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg Trp att ile ggg Gly agt ser ttc Phe ttt Phe tat Tyr act Thr ggg Gly age Ser acc Thr tac Tyr tac Tyr aac Asn ccg pro tcc Ser 192 50 55 60 ctc agg agt cga ctc acc ata tcc gta gac acg tcc aag aac cag ttc 240 Leu Arg Ser Arg Leu Thr Ile 5er vai Asp Thr· ser Lys Asn Gin phe 65 70 75 - 80 tcc ctg atg ctg agt tct gtg acc gcc gea gac acg gct gta tat tac 288 Ser Leu Met Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala val Tyr Tyr 85 90 95 tgt gcg aga cag tcc acg tat tac tat ggt tcg ggg aat tat tat ggc 336 Cys Ala Arg Gin 100 Ser Thr Tyr Tyr Tyr 105 Gly Ser Gly Asn Tyr 110 Tyr Gly tgg ttc gac cgc tgg gac cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tea 381 Trp Phe Asp Arg Trp Asp Gin Gly Thr Leu vai Thr val Ser ser 115 120 125

<210> 8 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens ΡΕ2100618 98 <400> 8 Gin Leu Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15

Thr Leu ser Leu Thr cys Thr vai ser Gly Gly ser lie Asn ser ser 20 25 50

Ser Tyr tyr Trp Gly Trp Leu Arg Gin 35 40

Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu 45

Trp lie Gly Ser Phe Phe Tyr,Thr Gly 50 55

Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro ser 60

Leu Ara Ser Arg Leu Thr ile Ser vai Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 80

Ser Leu Met Leu ser ser vai thr Ala Ala Asp Thr Ala vai Tyr Tvr 85 90 95

Cys Ala Arg Gin ser Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Asn Tyr Tyr Glv 100 105 110

Trp Phe Asp Arg Trp Asp Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser ser 115 120 125 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (D · - (33) <400> 9 agg gcc agt cag agt gtt age age tac tta gee Arg Ala Ser Gin ser Vai Ser ser Tyr Leu Ala 1 5 .10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Arg Ala Ser Gin Ser vai ser ser Tyr Leu Ála 1 5 10 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(21) <400> 11 99 ΡΕ2100618 gát gca tcc aac agg gcc act 21

Asp Ala ser Asn Arg Ala Thr <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 12 Asp Ala ser 1 Asn Arg Ala Thr 5 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (D . . (27) <4 0 0> 13 cag cag cgt Gin Gin Arg 1 age aac tgg Ser Asn Trp 5 cct Pro ccg gcg Pro Ala <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 14 Gin Gin Arg ser Asn Trp 5 Pro Pro Ala <210> 15 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (D . . (321) <4 0 0> 15 100 ΡΕ2100618 gaa att gtg ttg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48

Glu Ile vai Leu Thr Gin ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1.5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt age age tac 96

Glu Arg Ala Thr Léu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Tyr 20 25 30 tta gcc tgg tac caa cag aaá cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc ate 144

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu ile 35 40 45 tat gat gea tcc aac agg gcc act ggc ate cca gcc agg ttc agt ggc 192

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly ile Pro Ala Arg Phè ser Gly 50 55 60 agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc ate age age cta gag cct . 240

Ser Gly Ser Gly Thr Asp phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gea gtt tat tac tgt cag cag cgt age aac tgg cct ccg 288

Glu Asp Phe Ala vai Tyr Tyr cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 gcg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa ate aaa 321

Ala Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105

<210> 16 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 16

Glu ile vai Leu Thr Gin ser pro Ala Thr Leu ser Leu ser pro Gly 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser vai Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu ile 35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr ile ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95

Ala Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105

<210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> péptido sintético <400> 17

Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15 101 ΡΕ2100618

<210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Desconhecido <22 0> <223> péptido sintético <4 0 0> 18

Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> <211> 19 10 <212> <213> PRT Desconhecido <220> <223> péptido sintético <4 0 0> 19

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1.5 10 <210> <211> 20 21 <212> <213> DNA artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 20 atgaaacacc tgtggttctt c 21 <210> <211> 21 21 <212> <213> DNA artificial <220> <223> iniciador sintético <4 0 0> 21 tgccaggggg aagaccgatg g 21 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <22 0> <223> iniciador sintético <400> 22 102 ΡΕ2100618 atggaarccc cagcgcagct tctc 24 <210> <211> <212> <213> 23 20 DNA artificial <220> <223> iniciador sintético <4 0 0> 23 cgggaagatg aagacagatg 20 <210> <211> <212> <213> 24 19 PRT Mus musculus <4 0 0> 24

Met Gly Trp ser cys lie ile Leu Phe Leu.vai Ala Thr Ala Thr Gly 1 .5 10 .15 vai His ser <210> <211> <212> <213> 25 53 DNA artificial <220> <223> iniciador sintético <400> 25 gagaagcttg ccgccaccat gggatggtca tgtatcatcc tttttctagt age <210> <211> <212> <213> 26 58 DNA artificial <220> <223> iniciador sintético <400> 26 tcctttttct agtagcaact gcaactggag tacattcaca gctgcagctg caggagtc <210> <211> <212> <213> 27 37 DNA artificial <220> <223> synthetic <400> 27 cgcgctagct gaggagacgg tgaccagggt tccctgg 37 ΡΕ2100618 <210> 28 <211> 58 <212> DNA <213> artificial <220> <223> iniciador sintético Λ o o V 28 <210> 29 <211> 37 <212> DNA <213> artificial tcctttttct agtagcaact gcaactggag tacattcaga aattgtgttg acacagtc 58 <220> <223> sythetic primer <400> 29 gcgcgtacgt ttgatttcca ccttggtccc ttggccg 37 <210> 30 <211> 1431

<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1) .. (1431) <400> 30 atg gqa tgg tca tgt ate ate ctt ttt cta gta gea act gea act gga 48 Met Gly Trp Ser cys lie ile Leu Phe Leu vai Ala Thr Ala Thr GÍy 1 5 10 15 gta cat tca cag ctg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag 96 vai His ser Gin Leu Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 cct tcg gag acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tet ggt ggc tcc ate 144 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr cys Thr vai ser Gly Gly ser Ile 35 40 45 aac agt agt agt tac tac tgg ggc tgg ctc ege cag tcc cca ggg aag 192 Asn Ser Ser Ser Tyr Tyr Tfp Gly Trp Leu Arg Gin Ser Pro Gly Lys 50 55 60 ggg ctg gag tgg att ggg agt ttc ttt tat act ggg age acc tac tac 240 Gly Leu Glu Trp He Gly Ser Phe Phe Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 aac ccg tcc ctc agg agt cga ctc acc ata tcc gta gac acg tcc aag 288 Asn Pro ser Leu Arg ser Arg Leu Thr ile Ser vai ASp Thr Ser Lys 104 ΡΕ2100618 85 90 95 aac cag ttc tcc ctg atg ctg agt tet gtg acc gcc gea gac acg gçt 336 Asn Gin Phe ser Leu Met Leu Ser Ser val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 100 105 110 gta tat tac tgt gcg aga cag tcc acg tat tac tat ggt teg ggg aat 384 vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Gin Ser Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Asn 115 120 125 tat tat ggc tgg ttc gac ege tgg gac cag gga acc ctg gtc acc gtc 432 Tyr Tyr Gly Trp Phe Ásp Arg Trp Asp Gin Gly Thr Leu val Thr val 130 135 140 tcc tea gct age acc aag ggc cca teg gtc ttc ccc ctg gea ccc tcc 480 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro ser. val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 145 150 155 160 tcc aag age acc tet ggg ggc aca gçg gcc ctg ggc tgc ctg gtç aag 528 ser Lys ser Thr ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly cys Leu val Lys 165 170 175 gac taç ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg teg tgg aac tea ggc gçc ctg 576 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro val Thr val ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 180 185 190 acc age ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tea gga ctc 624 Thr Ser Gly val His Thr phe pro Ala val Leu Gin Ser Ser Gly Leu 195 200 205 tac Tyr tcc Ser ctc Leu age ser age ser 33 Sf acc Thr gtg val ccc Pro tcc ser age ser age ser ttg Leu ggc Gly acc Thr 672 210 215 220 cag acc tac ate tgc aac gtg aat cac aag ccc age aac acc aag gtg 720 Gin Thr Tyr lie Cys Asn val Asn HiS Lys Pro Ser Asn Thr Lys val 225 230 235 240 gac aag aga gtt gag ccc aaa tet tgt gac aaa act cac aca tgc cca 768 Asp Lys Arg vai Glu Pro Lys ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys pro 245 250 255 ccg tgc cca gea cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tea gtc ttc ctc ttc 816 pro cys pro Ala pro Glu Leu Leu Gly Gly pro ser Val Phe Leu Phe 260 265 270 ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg ate tcc cgg acc cct gag gtç 864 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu val 275 280 285 aca Thr tgc. cys 31? 33 33 gac ASP 33 age ser cac HÍS gaa Glu gac Asp cct Pro gag Glu gtc val aag Lys ttc Phe 912 290 295 300 aac Asn 305 tgg Trp tac Tyr 33 gac Asp ggc Gly 310 33 gag Glu 33 cat His aat Asn 315 gcc Ala aag Lys aca Thr aag Lys ccg Pro 320 960 cgg gag gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc age gtç ctc acc 1008 Arg Glu Glu Gin Tyr Asn ser Thr Tyr Arg val val ser val Leu Thr 325 330 335 gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc 1056 vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys vai 340 345 350 tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc ate gag aaa acc ate tcc aaa gee Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr ile Ser Lys Ala 1104 105 ΡΕ2100618 355 360 365 aaa 999 cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg 1152 Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin vat Tyr Thr Leu Pro Pro ser Arg 370 375 380 gag gag atg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc 1200 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin val ser Leu Thr Cys Leu val Lys Gly 385 390 395 400 ttc tat ccc age gac ate gee gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg 1248 Phe Tyr Pro ser Asp lie Ala vaT Glu Trp Glu ser Asn Gly Gin pro 405 410 415 gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc 1296 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 420 425 430 ttc ttc ctc tat age aag ctc acc gtg gac aag age agg tgg cag cag 1344 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr VaT Asp Lys ser Arg Trp Gin Gin 435 440 445 999 aac gtc ttc tea tgc tcc gtg atg cat gag gçt ctg cac aac cac 1392 Gly ASh vai Phe ser cys Ser val Met His Glu Ala Leu HiS Asn HiS 450 455 460 tac acg cag aag age ctc tcc ctg tcc ccg ggt aaa tga 1431 Tyr Thr Gin Lys ser Leu Ser Leu ser Pro Gly Lys 465 470 475 \—1 CM V 0> 31 \—1 CM V 1> 4 176 <212> PRT \—1 CM V 3> Homo sapiens O ^f1 V 0> 31 Met Gly Trp ser cys ile lie Leu Phe Leu val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 vai His ser Gin Leu Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu val Lys 20 25 30 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr val ser Gly Gly ser iíe 35 40 45 Asn Ser 50 Ser Ser Tyr Tyr Trp 55 Gly trp Leu Arg Gin 60 Ser pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Gly Ser Phe Phe Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 Asn pro Ser Leu Arg Ser Arg Leu Thr ile Ser val Asp Thr Ser Lys 85 90 95 Asn Gin Phe Ser Leu Met Leu Ser Ser val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 100 105 110 vai Tyr Tyr cys Ala Arg Gin ser Thr Tyr Tyr Tyr Gly ser Gly Asn 115 120 125 106 ΡΕ2100618

Tyr Tyr Gly Trp phe ASp Arg Trp Asp Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 130 135 140 ser ser Ala ser Thr Lys Gly Pro ser val Phe Pro Leu Ala Pro ser 145 150 155 160 Ser Lys ser Thr ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly cys Leu val Lys 165 170 175 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr val Ser Trp Asn Ser Gly Ala- Leu 180 185 190 Thr Ser Gly val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gl n ser Ser Gly Leu 19 5 200 205 Tyr ser Leu Ser Ser val val Thr val pro ser ser ser Leu GÍy Thr 210 215 220 Gin Thr Tyr ile cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys val 225 230 235 240 Asp Lys Arg val Glu Pro Lys Ser cys Asp Lys Thr His Thr cys Pro 245 250 255 Pro Cys pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser val Phe Leu Phe 260 265 270 Pro pro Lys pro Lys Asp Thr Leu Met Ile ser Arg Thr Pro Glu val 275 280 - 285 Thr ífo Vai val val Asp val 295 Ser His Glu Asp Pro 300 Glu val Lys Phe Asn 305 Trp Tyr val Asp Gly 310 val Glu val His Asn 315 Ala Lys Thr Lys Pro 320 Arg Glu Glu Gin Tyr Asn ser Thr Tyr Arg val val ser val Leu Thr 325 330 335 vai Leu His Gin ASp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys cys Lys val 340 345 350 ser Asn Lys Ala Leu pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr íle ser Lys Ala 355 360 365 Lys Gly Gin Pró Arg Glu Pro Gin val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 370 375 380 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin val Ser Leu Thr cys Leu val Lys Gly 385 390 395 400 107 ΡΕ2100618

Phe Tyr pro ser Asp lie Ala vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 405 410 415

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser 420 425 430

Phe Phe Leu Tyr ser. Lys Leu Thr vai Asp Lys ser Arg Trp Gin Gin 435 440 445

Gly Asn vai Phe Ser Cys Ser vai Met His Glu Ala Leu His Asn His 450 455 460

Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475

<210> 32 <211> 702 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1) .. (702) <40 0> 32 atg gga tgg tea tgt ate ate ctt ttt cta gta gea act gea act gga Met Gly Trp Ser Cys ile lie Leu Phe Leu vai Ala Thr. Ala Thr Gly 1 5 10 15 gta cat tea gaa att gtg ttg aca cag tct. cca gee acc ctg tct ttg vai His Ser GlU He vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu 20 25 30 tct cca ggg gaa aga gçc acc ctc tcc tgc agg gee agt cag agt gtt Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu ser cys Arg Ala ser Gin ser vai 35 40 45 age age tac tta 9« tgg tac caa cag aaa cct ggc cag 9« ccc agg Ser Ser 50 Tyr Leu Ala Trp Tyr 55 Gin Gin Lys Pro Gly 60 Gin Ala Pro Arg ctc ctc ate tat gat gea tcc aac agg gee act ggc ate cca gee agg. Leu Leu lie Tyr Asp Alá ser Asn Arg Ala Thr Gly ile Pro Ala Arg 65 70 75 80 ttc Phe agt Ser gqc Gly agt Ser ggg Gly tct ser ggg Gly aca Thr gac Asp ttc Phe act Thr ctc Leu acc Thr ate Ile age Ser age Ser 85 90 95 cta gag cct gaa gat ttt gea gtt tat tac tgt cag cag cgt age aac Leu Glu Pro Glu Asp Phe Alá vai Tyr Tyr cys Gin Gin Arg Ser Asn 100 105 110 tgg cct ceg gçg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa ate aaa cgt acg Trp Pro Pro Ala Phe Gly Gin Gly Thr Lys vaT Glu ile Lys Arg Thr 115 120 125 gta gct gea cca tct gtc ttc ate ttc ccg cca tct gat gag cag ttg vaT Ala Ala pro Ser vai phe lie Phe Pro pro ser Asp Glu Gin Leu 130 135 140 48 96 144 192 .240 288 336 384 432 108 ΡΕ2100618 aaa tet gga act gee tet gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc 480 Lys ser Gly Thr Ala ser val vai cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr pro 145 150 155 160 aga gag gçe aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gee ctc caa teg ggt 528 Arg Glu Al a Lys vai Gin Trp Lys val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly 165 170 175 aac tcc cag gag agt gtç aca gag cag gac age aag gac age acc tac. 576 Asn Ser Gin Glu Ser val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 age ctc age age acc ctg acg ctg age aaa gea gac tac gag aaa cac 624 ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 aaa gtç tac gçc tgc gaa gtç acc cat cag ggc ctg age teg ccc gtc 672 Lys val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro val 210 215 220 aca aag age ttc aac agg gga gag tgt tag 702 Thr 225 Lys ser Phe Asn Arg 230 Gly Glu cys <21 ( D> 33 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens O V D> 33 Met Gly Trp ser Cys He Ile Leu Phe Leu val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 vai His Ser Glu He val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu 20 25 30 Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser yal 35 40 45 ser ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys pro Gly Gin Ala Pro Arg 50 55 60 Leu Leu lie Tyr Asp Ala ser Asn Arg Ala Thr Gly ile pro Ala Arg .65 70 75 V 80 phe ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr ile Ser Ser - 85 90 95 Leu Glu Pro Glu ASp Phe Ala Val Tyr Tyr cys Gin Gin Arg Ser Asn 100 - 105 110 Trp Pro Pro Ala Phe Gly Gin Gly Thr Lys val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 vai Ala Ala Pro ser val Phe ile Phe pro Pro ser Asp GlU Gin Leu 130 135 140 109 ΡΕ2100618

Lys Ser Gly Thr Ala Ser vai vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160

Arg Glu Ala Lys vai Gin Trp Lys vai Asp Asn Ala Leu Gin ser Gly 165 170 175

Asn Ser Gin Glu Ser vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190

Ser Leu ser Ser Thr Leu Thr Leu ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205

Lys val Tyr Ala Cys Glu vai Thr His Gin Gly Leu Ser ser Pro vai 210 215 220

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 34 <211> 15

<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1)..(15) <400> 34 age tat gct ate age ser Tyr Ala lie Ser 1 5

<210> 35 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 ser Tyr Ala ile ser 1 5

<210> 36 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) .. (51) <400> 36

ggg ate ate cct ate dy lie Ile Pro Ile 1 5 ggc

Gly 110 ΡΕ2100618

<210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37

Gly lie lie ργο lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe Gin 1 5 10 15

Gly <210> 38 <211> 63 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (D .. (63) <4 0 0> 38 48 65 gcg cça tta cga ttt ttg gag tgg tcc acc caa gac cac tac tac tac Ala Pro Leu Arg Phe Leu Glu Trp Ser Thr Gin Asp His Tyr Tyr Tyr 1 5 10 15 tac tac atg gac gtc Tyr Tyr Met Asp vai 20

<210> 39 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39

Ala Pro Leii Arg Phe Leu Glu Trp Ser Thr Gin Asp His Tyr Tyr Tyr 1 5 10 .15

Tyr Tyr Met Asp vai 20

<210> 40 <211> 390 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1) .. (390) <400> 40 gag gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gta aag aag cct gqg tcc

Glu vai Gin Leu vai Gin ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly ser 1 5 10 15 48 111 ΡΕ2100618 tcg Ser aag Lys gtç Vai tcc Ser tgc cys aag Lys gçt Ala tet Ser gga Gly ggc Gly acc Thr ttc Phe age ser age Ser tat Tyr 96 20 25 30 gct ate age tgg gtg cga cag gee cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144 Ala ile Ser Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 gga 999 ate ate cct ate ttt ggt aca gça aac tac gea cag aag ttc 192 Gly Gly lie lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe. 50 55 60 cag ggc aga gtc acg att acc gcg gac aaa tcc acg age aca gçc tac 240 Gin Gly Arg vai Thr ile Thr Ala Asp Lys ser Thr ser Thr Ala lyr 65 70 75 80 atg gag ctg age age ctg aga tet gag gac acg gee gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ser ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala vai Tyr Tyr cys 85 90 95 gcg aga gcg cca tta cga ttt ttg gag tgg tcc acc caa gac cac tac 336 Ala Arg Ala pro Leu Arg Phe Leu Glu Trp ser Thr Gin Asp His Tyr 100 105 110 tac tac tac tac atg gac gtc tgg ggc aaa 999 acc acg gtc acc gtç 384 Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp vai Trp Gly Lys Gly Thr Thr vai Thr Val 115 120 125 tca age 390 Ser Ser 130

<210> 41 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41

Glu vai Gin Leu vai Gin ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly ser 1 5 10 15

Ser vai Lys vai Ser cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser ser Tyr 20 25 30

Ala lie Ser Trp Vai Arg Gin Ala pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Gly lie lie Pro ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala GTn Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg vai Thr ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu ser ser Leu Arg ser Glu Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ala Pro Leu Arg Phe Leu Glu Trp Ser Thr Gin Asp hís Tyr 100 105 lio

Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp vai Trp Gly Lys Gly Thr Thr Vai Thr vai 115 120 125

Ser ser 130 112 ΡΕ2100618 <210> 42 <211> 1440 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) .. (1440) <400> 42 atg gga tgg tea tgt ate ate ctt ttt cta qta gça act gea act gga 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile He Leu Phe Leu val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 qta cat tea gag gtc cag ctg gtg cag tet ggg gct gag gtg aag aag 96 val HlS Ser Glu val Gin Leu val Gin ser Gly Ala Glu vai Lys Lys 20 25 30 cct ggg tcc teg gtg aag gtc tcc tgc aag gçt tet gga ggc acc ttc 144 ΡΓΟ Gly ser Ser val Lys val Ser Cys Lys Ala ser Gly Gly Thr Phe 35 40 45 age age tat gct ate age tgg gtg cqa cag gee cct gga caa ggg ctt 192 Ser Ser Tyr Ala ile ser Trp val Arg Gin Ala pro Gly Gin Gly Leu 50 55 60 gag tqfl atq gga ggg ate ate cct ate ttt ggt aca qca aac tac gça 240 Glu Trp Met Gly Gly He ile Pro ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala 65 70 75 80 cag aag ttc cag ggc aga gtc acg att acc gcg gac aaa tcc acg age 288 Gin Lys Phe Gin Gly Arg val Thr Ile Thr Ala ASP Lys Ser Thr Ser , 85 90 95 aca gee tac atg gag ctg age age ctg aqa tet gag gac acg gçc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Ásp Thr Ala val 100 105 110 tat tac tgt gcg aga gcg cca tta cqa ttt ttg gag tgg tcc acc caa 384 Tyr Tyr cys Ala Arg Ala Pro Leu Arg Phe Leu Glu Trp ser Thr Gin 115 120 125 gac cac tac tac tac tac tac atg gac gtc tgg ggc aaa ggg acc acg 432 Asp HÍS Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp val Trp Gly Lys Gly Thr Thr 130 135 140 gíc acc gtc tea age qcc tcc acc aaq ggc cca teg gtc ttc ccc ctg 480 val Thr val ser ser Ala Ser Thr Lys Gly pro Ser val Phe pro Leu 145 150 155 160 gea ccc tcc tcc aag age acc tet ggg ggc aca gcg gee ctg ggc tgc 528 Ala Pro Ser ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 165 170 175 ctg Leu gíe val aag Lys gac Asp tac Tyr ttc phe ccc Pro gaa Glu ccg Pro acg Thr Sf teg ser tgg Trp aac Asn tea ser 576 180 185 190 113 ΡΕ2100618 ggc gee ctg acc age ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc 624 Gly Ala Leu Thr Ser Gly vai His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser 195 200 205 tea gga etc tac tcc ctc age age gtg gtg acc gtg ccc tcc age age 672 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val val Thr val Pro Ser Ser Ser 210' 215 220 ttg ggc acc cag acc tac ate tgc aac gtg aat cac aag ccc age aac 720 Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He' Cys Asn val Asn HÍS Lys Pro Ser Asn 225. 230 235 240 acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tet tgt gac aaa áct cac 768 Thr Lys vai Asp Lys Lys vai Glu Pro Lys ser cys Asp Lys Thr His 245 250 255 âCâ tgc cca ccg tgc cca yCâ cct Çjââ ctc ctg 999 gga ccg tCã gtc S16 Thr Cys Pro pro Cys pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser val 260 265 270 ttc etc ttc ccc, cCa aaa ccc aag gac acc ctc atg ate tcc cgg acc 864 phe Leu phe pro Pro Lys pro Lys Asp Thr Leu Met Ile ser Arg Thr 275 280 285 cct Pro gag Glu gtc vai aca Thr. tgc cys 83 83 83 gac Asp 83 age Ser cac His gaa Glu gac Asp cct Pro gag Glu 912 290 295 300 gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gee aag 960 vai Lys Phe Asn Trp Tyr vai Asp Gly val Glu val His Asn Ala Lys 305 310 315 320 aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac age acg tac cgg gtg 9tÇ age 1008 Thr Lys pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn ser Thr Tyr Arg Val val Ser 325 330 335 gtc etc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag 1056 vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 340 345 350 tgc aag gtc tcc aac aaa gee ctc cca gee ccc ate gag aaa acc ate 1104 cys Lys vai ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala pro lie Glu Lys Thr ile 355 360 365 tcc aaa gee aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc 1152 Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin val Tyr Thr Leu Pro 370 375 380 cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtç age ctg acc tgc ctg 1200 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin val Ser Leu Thr Cys Leu 385 390 395 400 gtc aaa ggc ttc tat ccc age gac ate gee gtg gag tgg gag age aat 1248 vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala val Glu Trp Glu Ser Asn 405 410 415 ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc 1296 Gly Gin pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro val Leu Asp Ser 420 425 430 gac ggc tcc ttc ttc ctc tac age aag ctc acc gtg gac aag age agg 1344 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr val Asp Lys Ser Arg 435 440 445 tgg cag cag ggg aac gtc ttc tea tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg 1392 Trp Gin Gin Gly Asn vai Phe. Ser Cys Ser val Met His Glu Ala Leu 450 455 460 cac aac cac tac acg cag aag age etc tcc ctg tet ccg ggt aaa tga 1440 His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro.GTy Lys 465 470 475 <210> 43 <211> 479 114 ΡΕ2100618

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43

Met Gly Trp Ser Cys Π e Ile Leu Phe Leu val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Vai His Ser Glu Val Gin Leu val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 ΡΓΟ Gly ser Ser val Lys val ser cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Ala lie Ser Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Gin Lys Phe Gin Gly Arg val Thr Ile Thr Ala Asp Lys ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Pro Leu Arg Phe . Léu Glu Trp Ser Thr Gin 115 120 125 Asp His Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp val Trp Gly Lys Gly Thr Thr 130 135 140 Vai Thr Val Ser Ser A] d ser ΤπΓ Lys Gly Pro Ser val Phe Pro Leu 145 150 155 160 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 165 170 175 Leu vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro val Thr val Ser Trp Asn ser 180 185 190 Gly Ala Leu Thr Ser Gly val His Thr Phe Pro Ala val Leu Gin Ser 195 200 205 Ser Gly Leu Tyr ser Leu Ser Ser Vãl val Thr val Pro Ser Ser Ser 210 215 220 115 ΡΕ2100618

Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn val Asn His Lys pro ser Asn 225 230 235 240 Thr Lys vai Asp Lys Lys val Glu pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr HÍS 245 250 255 Thr cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser val 260 265 270 Phe Leu phe pro pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met ile Ser Arg Thr 275 280 285 Pro Glu Vai Thr Cys val val val ASP val Ser His Glu Asp Pro Glu 290 295 300 vai Lys Phe Asn Trp Tyr val Asp Gly val Glu Val HÍS Asn Ala Lys 305 310 315 320 Thr Lys pro Arg Glu 325 Glu Gin Tyr Asn ser 330 Thr Tyr Arg val val 335 ser vai Leu Thr vai Leu HÍS Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 340 345 350 cys Lys vai ser Asn Lys Ala Leu pro Ala Pro He Glu Lys Thr He 355 360 365 ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 370 375 380 Pro ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin val Ser Leu Thr. Cys Leu 385 390 395 400 Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 405 410 415 Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr pro Pro val Leu Asp ser 420 425 430 ASp Gly ser 435 Phe Phe Leu Tyr Ser 440 Lys Leu Thr val Asp 445 Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn val Phe Ser cys Ser val Met HÍS Glu Ala Leu 450 455 460 His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser pro Gly Lys 465 470 475

<210> 44 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1) .. (33) <400> 44 116 ΡΕ2100618 caa gga gac age etc aga age tat tat gea acc 33

Gin Gly Asp ser Leu Arg ser Tyr Tyr Ala Thr 1 5 10

<210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45

Gin Gly Asp Ser Leu Arg ser Tyr Tyr Ala Thr 15 10

<210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0>

<221> CDS <222> (1) .. (21) <400> 46 ggt gaa aat aag cgg ccc tea 21

Gly Glu Asn Lys Arg Pro ser

<210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47

Gly Glu Asn Lys Arg Pro ser 1 5

<210> 48 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1) .. (33) <400> 48 aaa tet cgg gat ggc agt ggt caa cat ctg gtg 33

Lys ser Arg Asp Gly ser Gly Gin His Leu vai 1 5 10

<210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49

Lys ser Arg Asp Gly ser Gly Gin His Leu vai 1 5 10 117 ΡΕ2100618

<210> 50 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1) .. (327) <400> 50 tct tct gag ctg act cag gac cct gçt gtg tct gtg gee ttg gga cag 48 ser ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala Val Ser vai Ala Leu Gly Gin 1 5 10 15 aca gtc agg ate aca tgc caa gga gac age etc aga age tat tat gea 96 Thr Val Arg xle Thr cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 acc tgg tac cag cag aag cca gga cag gee cct att ctt gtc ate tat 144 Thr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro ile Leu val Ile Tyr 35 40 45 got gaa aat aag cgg ccc tea ggg ate cca gac cga ttc tct ggc tcc 192 Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 age tea gga aac aca gct tcc ttg acc ate act ggg gct cag gea gaa 240 ser ser Gly Asn Thr Ala ser Leu Thr ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu 65 70 75. 80 gat gag gct gac tac tat tgt aaa tct cgg gat ggc agt ggt caa cat 288 Asp Gl u Ala Asp Tyr 85 Tyr cys Lys Ser Arg 90 Asp Gly ser Gly Gin 95 His ctg. gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggt 327 Leu val Phe Gly Gly Gly •Thr Lys Leu Thr val Leu Gly 100 105

<210> 51 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51

Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Alá val Ser val. Ala Leu Gly Gin 1 5 10 15 Thr val Arg ile Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser ΤΓ Tyr Ala 20 25 30 Thr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Ile Leu val ile Tyr 35 40 45 Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser Gly ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly ser 50 55 60 Ser ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala ASP Tyr Tyr cys Lys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Gin HiS 85 90 95 Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr val Leu Gly 100 105 118 ΡΕ2100618 <210> 52 <211> 702

<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1) .. (702) <400> 52 atg gga tgg tea tgt ate ate ctt ttt cta gta gça act gça act gga 48 Met Gly Trp ser cys lie lie Leu Phe Leu val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 gta cat tea tct tct gag ctg act cag gac cct gçt gtg tct gtg gee 96 vai HÍS Ser Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp pro Ala Val ser val Ala 20 25 30 ttg gga cag aca gtc agg ate aca tgc caa gga gac age etc aga age 144 Leu Gly Gin Thr vai Arg lie Thr cys Gin Gly ASP Ser Leu Arg Ser 35 40 45 tat tat gea acc tgg tac cag cag aag cca gga çag gçc cct att ctt 192 ryr Tyr Ala Thr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala pro lie Leu 50 55 60 gtc ate tat ggt gaa aat aag cgg ccc tea ggg ate cca gac cga ttc 240 vai lie Tyr Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Asp Arg phe 65 70 75 80 tct ggc tcc age tea gga aac aca gçt tcc ttg acc ate act ggg gçt 288 Ser Gly ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr lie Thr Gly Ala 85 90 95 cag gea gaa. gat gag gçt gac tac tat tgt aaa tct cgg gat ggc agt 336 Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr cys Lys ser Arg Asp Gly Ser 100 105. 110 ggt caa cat ctg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtç cta ggt 384 Gly Gin His Leu vai Phe Gly Gly Giy Thr Lys Leu Thr val Leu Gly 115 120 125 cag ccc aag gçt gçc ccc teg gtç act ctg ttc ccg ccc tcc tct gag 432 Gin pro Lys Ala Ala pro ser val Thr Leu Phe pro Pro ser Ser Glu 130 135 140 gag ctt caa gçc aac aag gçc aca ctg gtg tgt etc ata agt gac ttc 480 Glu Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu val Cys Leu He Ser Asp phe 145 / 150 155 160 tac ceg gga gee gtg aca gtg gee tgg aag gea gat age age ccc gtc 528. Tyr Pro Gly Ala val Thr Val Ala Trp Lys Ala ASP Ser ser Pró Val 165 170 175 aag gcg gga gtg gag acc acc aca ccc tcc aaa caa age aac aac aag 576 Lys Ala Gly vaí Glu Thr Thr Thr pro ser Lys Gin ser Asn Asn Lys 180 ' 185 190 tac gcg gee age age tat ctg age ctg acg cct gag cag tgg aag tcc 624 Tyr Ala Ala ser ser Tyr Leu ser Leu Thr pro Glu Gin Trp Lys 5er 195 200 205 cac aga age tac age tgc cag gtc acg cat gaa ggg age acc gtg gag 672 HÍS Arg Ser Tyr ser cys Gin val Thr His Glu Gly ser Thr val Glu 210 215 220 1 aag aca gtg gçc cct gea gàa tgc tct tga 702 Lys THr Vai Ala Pro Ala Glu Cys Ser 225 230 <210> 53 119 ΡΕ2100618

<211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53

Met Gly Trp Ser Cys Ile lie Leu Phe Leu vai Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 vai His Ser ser ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala vai ser vai Ala 20 25 30

Leu Gly Gin Thr vai Arg ile Thr cys Gin Gly Asp ser Leu Arg ser 35 40 45

Tyr Tyr Ala Thr Trp Tyr Gin Gin Lys pro Gly Gin Ala Pro lie Leu 50 55 60

Vai lie Tyr Gly Glu Asn Lys Arg Pro ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe 65 70 75 80 ser Gly ser ser ser Gly Asn Thr Ala ser Leu Thr ile Thr Gly Ala 85 90 95

Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Arg Asp Gly Ser 100 105 110

Gly Gin His Leu vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr vai Leu Gly 115 120 125

Gin Pro Lys Ala Ala Pro ser vai Thr Leu Phe Pro Pro Ser ser Glu 130 135 140

Glu Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu vai Cys Leu líe Ser Asp Phe 145 150 155 160

Tyr Pro Gly Ala vai Thr vai Ala Trp Lys Ala Asp ser ser Pro vai 165 170 175

Lys Ala Gly vai Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Àsn Asn Lys 180 185 190

Tyr Ala Ala ser ser Tyr Leu ser Leu Thr pro Glu Gin Trp Lys ser 195 200 205

His Arg ser Tyr Ser Cys Gin vai Thr His Glu Gly Ser Thr vai Glu 210 215 220

Lys Thr vai Ala pro Ala Glu Cys ser 225 230

<210> 54 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0>

<221> CDS 33ΡΕ2100618 120 <222> (1)..(33) <400> 54 caa gga gac age etc aga age tat tat gea age Gin Gly Asp Ser ueu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 15 10 <210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Gl n Gly Asp 1 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Homo <22 0> <221> CDS <222> (1) .. (21) <400> 56ggt aaa aac aac cgg ccc tea Gly Lys Asn Asn Arg pro Ser 1 5

Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Sér 5 10 sapiens 21 <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser <210> 58 <211> 33 <212> DNA <213> Homo <22 0> <221> CDS <222> (D . <4 0 0> 58 aac tcc cgg gac aac agt gat aac cgt ctg ata Asn ser Arg Asp Asn ser Asp Asn Arg Leu Ile 15 10 <210> 59 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 33 121 ΡΕ2100618

Asn Ser Arg asd Asn Ser Asp Asn Arg Leu lie 1 5 10 <210> 60 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1) .. (327) <400> 60 tct tct gag ctg act cag gac cct gct gtg tct gtg gçc ttg gga cag 48 Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala vai ser val, Ala .Leu Gly Gin 1 5 10 15 aca gtc agg ate aca tgc caa gga gac age ctc aga age tat tat gea 96 Thr vai Arg ile 20 Thr Cys Gin Gly Asp 25 ser Leu Arg Ser Tyr 30 Tyr Ala age tgg tac cag cag aag cca gga cag gee cct gta ctt gtc ate tat 144 Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val ile Tyr 35 40 45 ggt aaa aac aac cgg ccc tea ggg ate cca gac cga ttc tct ggc tcc 192 Gly Lys 50 Asn Asn Arg prò ser 55 Gly ile pro Asp Arg 60 phe Ser Gly Ser age tea gga aac aca gct tcc ttg acc ate act ggg gct cag gçg gaa 240 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu 65 70 75 80 gat gag gçt gac tat tac tgt aac tcc cgg gac aac agt gat aac cgt 288 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr cys Asn ser Arg ASp Asn Ser Asp Asn Arg 85 90 95 ctg ata ttt ggc ggc ggg acc aag ctg acc gtc ctc agt 327 Leu Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr val Leii ser 100 105 <2H 0> 61 <211> 109

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 ΡΕ2100618 122

Ser ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala vai ser vai Ala Leu Gly Gin 1 5 10 15 Thr vai Arg Ilé Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tgr Tyr Ala 20 25

Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro vai Leu Vai Ile Tyr 35 40 45 Gly Lys Asn Asn Àrg pro ser Gly ile Pro asp Arg Phe ser Gly ser 50 55 60 Ser ser Gly Asn Thr Ala Sêr Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu 65 70 75

Asp Glu.Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Asn Ser Asp Asn Arg 85 90 95

Leu ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr vai Leu ser 100 105

<210> 62 <211> 702 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1)..(702) <400> 62 atg gga tgg Met Gly Trp cys 10 gta cat tca tct tct gag ctg act cag gac ect gct vai His ser Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala 20 25 35 40 gga cag Gly Gin 60 45 gea Ala act Thr gga Gly 48 15 tct ser gtg vai gee Ala 96 30 ctc aga age 144 Leu Àrg Ser cct gta ctt 192 Pro vai Leu 240 50 55 vaí ile Tyr cTy Lys Asn Asn Arg Pro ser Gly ile Pro Ãsp Arg Phe gtc ate tat ggt aaa aac aac cgg ccc tca g^g ate cca gac cga ttc 288ΡΕ2100618 123 65 70 75 80 tct ggc tcc age tea gga aac aca gct tcc ttg acc ate act ggg gçt Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr lie Thr Gly Ala 85 90 95 caq gcg gaa gat gag gçt gac tat tac tgt aac tcc cgg gac aac agt Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr cys Asn ser Arg Asp Asn ser 100 105 110 gat aac cgt ctg ata ttt ggc ggc ggg acc aaq ctg acc gtç ctc agt ASp Asn Arq Leu lie Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr val Leu sèr 115 120 12 S caq ccc aaq gçt gee ccc teg gtç act ctg ttc ccg ccc tcc tct gag Gin pro Lys Ala Ala Pro Ser val Thr Leu phe pro Pro ser ser Glu 130 135 140 gag ctt caa gee aac aaq gee aca ctg gtg tgt ctc ata agt gac ttc Glu Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu val Cys Leu lie sèr Asp Phe 145 150 155 160 tac ccg gga gçc gtg aca gtg gçc tgg aag qca gat age age ccc gtç Tyr Pro GÍy Ala val Thr val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser pro Val 165 170 175 aaq gcg gga gtg gag acc acc aca ccc tcc aaa caa age aac aac aag Lys Ala Gly val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin sèr Asn Asn Lys 180 185 190 tac gcg qcc age aqc tat ctg age ctg açg cct gag cag tgg aag tcc Tyr Ala Ala 195 ser sèr Tyr Leu Sèr 200 Leu Thr Pro Glu Gin 205 Trp Lys Ser cac aqa aqc tac age tgc caq gtç acg cat gaa ggg age acc gtg gag His Arg Ser Tyr sèr Cys Gin val Thr His Glu Gly Ser Thr val Glu 210 215 220 aag aca gtg gçc cct gea qaa tgc tct tqa Lys Thr Val Ala pro Ála Glu cys Ser 225 230 \—1 C\] V 3> 63 \—1 C\] V 1> 233 <212> PRT <213> Horao i sapiens <400> 63 Met 1 Gly Trp ser Cys 5 lie lie Leu Phe Leu 10 val Ala Thr Ala Thr 15 Gly val His ser ser ser Glu Leu Thr Gin Asp pro Ala val ser val Ala 20 25 30 Leu Gly Gin Thr val Arg lie Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg ser 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu 50 55 60 val 65, lie Tyr Gly Lys Asn 70 Asn Arg Pro Ser Gly 75 Xle Pro Asp Arg phe 80 336 384 432 480 528 576 624 672 702 ΡΕ2100618 124

Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala 90 95 Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Asn Ser 105 110 Gly Gly Thr Lys Leu Thr val Leu ser 120 125 val Thr Leu Phè Pro Pro Ser ser Glu 140 Thr Leu Val Cys Leu ile Ser Asp phe 155 160 Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 170 175 Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys 185 190 Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser 200 205 Val Thr HiS Glu Gly Ser Thr val Glu 220

Cys Ser ser Gly ser ser ser Gly Asn 85 Gin Ala Glu Asp Glu Ala ASp 100 Asp Asn Arg Leu Ile Phe Gly 115 Gin pro Lys Alá Ala Pro Ser 130 135 Glu Leu Gin Ala Asn Lys Ala 145 150 Tyr Pro Gly Ala vai Thr Val 165 Lys Ala Gly vai Glu Thr Thr 130 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu 195 HiS Arg Ser Tyr Ser Cys Gin 210 215 Ly.s Thr vai Ala Pro Ala Glu 225 230

Lisboa, 31 de março de 2 14

Claims

ΡΕ2100618 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um antagonista PDGFRa, em que o referido antagonista PDGFRa é um anticorpo ou um seu fragmento que é específico para PDGFRa humano e que compreende SSSYY (SEQ ID NO:2) em CDRHl; SFFYTGSTYYNPSLRS (SEQ ID NO:4) em CDRH2; QSTYYYGSGNYYGWFDR (SEQ ID NO:6) em CDRH3; RASQSVSSYLA (SEQ ID NO:10) em CDRLl; DASNRAT (SEQ ID NO:12) em CDRL2; e QQRSNWPPA (SEQ ID NO: 14) em CDRL3, para utilização no tratamento do cancro ósseo metastásico num indivíduo.
2. O antagonista de PDGFRa para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo ou o seu fragmento compreende um domínio variável de cadeia pesada com QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSSSYYWGWLRQSPGKGLEWIGSFFY TGSTYYNPSLRSRLTISVDTSKNQFSLMLSSVTAADTAVYYCARQSTYYYGSGNY YGWFDRWDQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 8) ou um domínio variável de cadeia leve com EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPAFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 16).
3. O antagonista PDGFRa para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo ou o seu fragmento compreende um domínio variável de cadeia pesada com 2 ΡΕ2100618 QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSSSYYWGWLRQSPGKGLEWIGSFFY TGSTYYNPSLRSRLTISVDTSKNQFSLMLSSVTAADTAVYYCARQSTYYYGSGNY YGWFDRWDQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 8) e um domínio variável de cadeia leve com EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPAFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 16).
4. O antagonista PDGFRa para utilização de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpo ou seu fragmento compreende uma cadeia pesada com MGWSCIILFLVATATGVHSQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSSSYYWG WLRQSPGKGLEWIGSFFYTGSTYYNPSLRSRLTISVDTSKNQFSLMLSSVTAADT AVYYCARQSTYYYGSGNYYGWFDRWDQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KTDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN\VAVDGVEVI3NAKTKTREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKJiYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:31) e uma cadeia leve com MGWSCIILFLVATATGVHSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQ QKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSN WPPAFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:33).
5. O antagonista PDGFRa para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em 3 ΡΕ2100618 que o tumor é metastizado de um cancro da próstata, de cancro a mama ou de cancro do pulmão.
6. 0 antagonista PDGFRa para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o anticorpo ou o seu fragmento inibe a ligação de PDGFRa ou neutraliza PDGFRa. Lisboa, 31 de março de 2014