CN101612399B - 用作治疗继发性骨肿瘤的抗PDGFRα抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通过给予IGF-IR拮抗剂和/或PDGFRα拮抗剂来治疗骨癌的方法，特别是治疗转移性骨癌的方法。本发明还提供了与人PDGFRα结合并中和该受体的活化的抗体。本发明还提供了中和PDGFRα的活化的方法，以及用该抗体单独治疗或与其它药物联合治疗哺乳动物的肿瘤疾病。

Description

用作治疗继发性骨肿瘤的抗PDGFRα抗体
本申请是2006年6月19日提交的中国国家申请号为200680028647.0，国际申请号为PCT/US2006/023856，发明名称为“治疗转移性骨癌的受体拮抗剂”的发明申请的分案申请。 
本申请要求保护美国临时申请第60/691,192号的权益。 
发明领域
本发明提供了通过给予IGF-IR拮抗剂和/或PDGFRα拮抗剂治疗骨癌尤其是转移性骨癌的方法。本发明还提供了与人PDGFRα结合并中和该受体的激活作用的抗体。本发明进一步提供了中和PDGFRα的激活作用的方法和单独使用该抗体或与其他药物联合使用治疗肿瘤疾病的方法。 
发明背景
前列腺癌是男性最普遍的癌症，美国每年约有220,000例前列腺癌，死亡29000例。很大一部分被诊断患有前列腺癌的男性都患有癌转移疾病。而且，尽管已接受了手术或放疗，但是许多前列腺癌患者最终还是会发生癌症转移。骨是前列腺癌最常见的转移位点，同时也是乳腺癌和肺癌的常见转移位点。许多前列腺癌转移是雄性激素依赖型，所以迅速产生了许多通过手术或药物去雄的治疗方法，但在几乎所有的病例中，这种癌症会最终变成非雄性激素依赖型，导致很高的发病率和死亡率。一旦发生了骨转移，现有疗法的作用是非常有限的。至今报道的最有效的并被认可的治疗转移性前列腺癌的疗法(给予多西他赛)可以将生存中值延长约三个月。(Petrylak等，2004，N.Engl.J.Med.351：1513；Tannock等.，2004，N.Engl.J.Med.351：1502)。因此，我们目前急需治疗转移性骨癌的方法。 
胰岛素样生长因子受体(IGF-IR)是一种普遍存在的跨膜酪氨 酸激酶受体，对正常胎儿期和出生后期的生长和发育是必需的。IGF-IR位于绝大多数类型细胞的表面，作为生长因子IGF-I和IGF-II(以下统称为IGFs)的信号转导分子。IGF-IR可以刺激细胞增殖、细胞分化、细胞大小的改变并阻止细胞凋亡。它被认为对细胞转化是近乎必需的(见下列综述Adams et al.，Cell.MoI.Life Sd.57：1050-93(2000)；Baserga，Oncogene 19：5574-81(2000))。有报道表明，前列腺癌骨转移瘤的组织样品中IGF-IR的表达水平高。骨中IGFs的储存量是人体最多的。 
IGF-IR是一种预先形成的异源四聚体，包含由二硫键共价连接的两个α链和两个β链。该受体的亚基作为一条180kd单多肽链的一部分被合成，这条多肽链再经过蛋白水解加工后生成α(130kd)和β(95kd)亚基。整个α链都位于细胞外并且包含与配体结合的位点。β链具有跨膜域、酪氨酸激酶域和一个C-末端延伸，该末端延伸对于细胞分化和转化是必需的，但是对于分裂素信号转导和阻止细胞凋亡并非必需。 
IGF-IR与胰岛素受体(IR)具有高度相似性，尤其是β链的序列(70％同源性)。正是由于这一同源性，近期许多研究都表明这些受体可以形成含有一个IR二聚体和一个IGF-IR二聚体的杂合体(Pandini et al.，Clin.Cane.Res.5：1935-19(1999))。在正常细胞和转化细胞中都会形成这种杂合体，并且该杂合体的含量取决于细胞中两种同型二聚体受体(IR和IGF-IR)的浓度。虽然杂合受体是由IR和IGF-IR成对组成的，但是该杂合体特异性地与IGFs结合，亲和力与IGF-IR的相似，与胰岛素的结合较弱(Siddle and Soos，The IGF System.Humana Press，pp.199-225.1999)。因此这些杂合体可以与IGFs结合并在正常细胞和转化细胞中传导信号。 
第二种IGF受体IGF-IIR或者称作甘露糖-6-磷酸(M6P)受体，也可以以高亲和力与IGF-II配体结合，但是却没有酪氨酸激酶活性(Oates et al.，Breast Cancer Res.Treat.47：269-81(1998))。这是由于它能 够导致IGF-II的降解，被认为是IGF-II的汇点，可以拮抗该配体的促生长作用。肿瘤细胞中IGF-IIR的减少可以通过发挥其对IGF-II与IGF-IR结合的拮抗作用促进生长。(Byrd et al.，J.Biol.Chem.274：24408-16(1999)). 
来源于血小板的α和β生长因子受体(PDGFRα和PDGFRβ)是III-型受体酪氨酸激酶。PDGFRα在发育中发挥关键作用并且在成年阶段也发挥重要的功能。例如，无效突变的小鼠纯合体会在胚胎形成时死亡。在发育后期PDGFRα在许多细胞间质结构中表达，而相邻的上皮细胞产生血小板来源的生长因子(PDGF)。正常或增生前列腺的组织样品中都检测不到PDGFRα，然而，对照受试者的原发前列腺癌组织和骨质中都表达PDGFRα。而且，从不同癌转移位点获得的前列腺细胞系中，骨转移来源的PC3细胞表达PDGFRα，但是从淋巴结(LNCaP)和脑(DU-145)组织转移灶获得的细胞系中不表达。 
生长因子的血小板来源的生长因子家族由五种不同的二硫键键合的二聚体组成，PDGF-AA、-BB、-AB、-CC和-DD，其通过PDGFRα和PDGFRβ发挥作用。这些生长因子是嵌合分子，由可同时结合两个受体蛋白的二硫键键合并诱导受体二聚化、自身磷酸化和细胞内信号转导的多肽链组成。PDGFRα和PDGFRβ结构上类似，并且能够形成异二聚体以及同二聚体。因为PDGFRβ与PDGF-A链的结合亲和力不强，PDGF-AA仅活化αα受体二聚体，而PDGF-AB和PDGF-CC则活化αα和αβ受体异二聚体。 
发明概述
本发明涉及对原发性和转移性骨肿瘤的治疗，包括源自前列腺、乳腺或肺并表达胰岛素样生长因子-I受体(IGF-IR)和/或来源于血小板的α生长因子受体(PDGFRα)的肿瘤。 
被治疗的肿瘤可以是激素/雄性激素依赖型或激素/雄性激素非依赖型，并且可以是源自前列腺，乳腺或肺的肿瘤。 
本发明提供了治疗骨肿瘤病人的方法以及抑制骨肿瘤生长的 方法。所述方法包括给予有效量的IGF-IR拮抗剂或有效量的PDGFRα拮抗剂。所述受体拮抗剂包括抗体和抗体片段以及细胞内小分子抑制剂。 
本发明提供了可以与其靶受体结合并抑制配体结合的抗-IGF-IR或抗-PDGFRα抗体。本发明还提供了可以中和IGF-IR或PDGFRα的激活的抗体和其他拮抗剂。另外某些抗体可以通过例如内化和/或降解作用对它们的靶受体进行下调。因此所述抗体和小分子拮抗剂的作用是抑制下游信号转导分子例如Akt、p42/p44和MAPK的激活。 
所述方法包括单独使用IGF-IR或PDGFRα拮抗剂，二者同时使用或与其他癌症疗法例如化疗药物和放疗联合使用。 
本发明还提供了可以与PDGFRα和核苷酸结合的抗体和抗体片段以及用于生产抗体的宿主细胞。所述抗体可以阻断配体的结合并中和受体的激活。本发明还提供了单独使用所述抗体、与其他受体拮抗剂或抗肿瘤药物联合使用或作为缀合物用于肿瘤疾病的治疗。抗-PDGFRα抗体可用于许多肿瘤的治疗，例如：卵巢肿瘤、乳腺肿瘤、肺癌、肝细胞癌、胃肠道间质瘤、黑素瘤、肾细胞癌、前列腺肿瘤和软组织肉瘤。 
附图说明
图1描述了在一个治疗阶段中去雄SCID小鼠LuCaP 35V皮下移植肿瘤的生长，该治疗从肿瘤达到150-200mm3时开始进行。A组：未接受治疗的对照组；B组：单独使用多西他赛(10mg/kg或20mg/kg)或与抗IGF-IR抗体(40mg/kg IMC-A12)联合使用对动物进行为期四周的治疗；C组：未接受治疗和接受治疗的荷载LuCaP 35V皮下移植肿瘤的小鼠血清PSA水平。被治疗的小鼠接受了多西他赛(20mg/kg)单独治疗或多西他赛(10mg/kg或20mg/kg)和抗IGF-IR抗体(40mg/kg IMC-A12)的联合治疗。治疗从肿瘤生长至150-200mm3时开始，四周后结束。 
图2表示多西他赛(10mg/kg)(A组)单独治疗或与抗IGF-IR抗体(40mg/kg IMC-A12)(B组)联合治疗后的LuCaP 35V移植肿瘤的单细胞悬液。标注R1的区域表示含有片段DNA的凋亡细胞(FITC标记升高)。 
图3表示多西他赛(10mg/kg或20mg/kg)单独治疗或与抗IGF-IR抗体(40mg/kg IMC-A12)联合治疗结束后移植肿瘤的DNA合成(BrDu吸收)。 
图4描述了用多西他赛与A12联合治疗和多西他赛单独治疗后，与前列腺肿瘤侵袭(TUBB)，抗雄性激素疗法抗性(BIRC 5)和细胞凋亡诱导相关基因的差异表达。 
图5表示治疗停止后A12的血清水平。 
图6表示未患有疾病的动物经过连续的多西他赛(10mg/kg或20mg/kg)单独治疗或与抗IGF-IR抗体(40mg/kg IMC-A12)联合治疗后的体重(一种总细胞毒性的测量方法)。 
图7表示抗IGF-IR抗体(IMC-A12)对移植LuCaP 23.1细胞的SCID小鼠中移植物产生的PSA的治疗作用。 
图8表示移植LuCaP 23.1细胞的SCID小鼠的一系列X线照片。A12小鼠腹腔注射40mg/mlIMC-A12，每周三次，持续六周。在处死动物时进行X线拍照。 
图9表示荷载胫骨内LuCaP 23.1人前列腺细胞移植肿瘤的SCID小鼠的PSA水平(a)和具有代表性的放射照片(b)。 
图10描述了人骨髓穿刺液对前列腺癌细胞Akt活性的作用。将细胞裂解物进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。在Western blot分析中，将薄膜用靶标为磷酸-Akt(Ser-473，细胞信号转导技术)，PDGFRα(R&D Sysstems)和肌动蛋白(Sigma)的抗体印迹。使用与HRP结合的蛋白A或蛋白G(Sigma)检测一抗的结合。 
图11描述了PC3-ML细胞中AKT-磷酸化的诱导和抑制。A组表示30ng/ml PDFG-BB存在下AG-1296对Akt磷酸化的剂量依 赖型抑制作用。B组表示骨髓穿刺液Akt磷酸化和20μMAG-1296的抑制作用。C组表示与100pg/ml PDGF-AA和100pg/ml PDGF-BB联合诱导有效性相比骨髓穿刺液诱导Akt磷酸化的有效性。D组比较了骨髓穿刺液诱导Akt磷酸化、AG-1296对骨髓穿刺液诱导的Akt磷酸化的抑制和PDFG-AA+PDFG-BB联合诱导的Akt磷酸化的大小。 
图12描述了PDGFRα拮抗剂对PC3细胞Akt磷酸化的抑制作用。A组表示单克隆抗体IMC-3G3对由30ng/ml PDGF-BB诱导的Akt磷酸化的剂量依赖型作用。B和C组比较了IMC-3G3和AG1296对骨髓穿刺液诱导的Akt磷酸化的作用。D组显示了对Akt磷酸化的抑制依赖于IMC-3G3的预温育时间。 
图13显示了抗体与PDGFRα的结合。A：抗-PDGFRα抗体直接与固定化PDGFRα胞外域结合。B：[125I]PDGF-AA与固定化PDGFRα结合的抑制。 
图14显示了对PDGFRα磷酸化和下游效应器分子的特异性抑制。 
图15显示了mAbs对PDGF-AA-激活的PAE Ra细胞[3H]-胸腺嘧啶核苷掺入的抑制。 
图16显示了对SKLMS-1(A)和U118(B)细胞中由PDGF-AA诱导的下游效应器分子激活的抑制。 
图17显示了mAbs对PDGF-AA-激活的U118(A)和SKLMS-I(B)细胞[3H]胸腺嘧啶核苷掺入的抑制。也显示了PDGF-BB激活的SKLMS-I(C)和U118(D)细胞[3H]胸腺嘧啶核苷掺入的抑制。 
图18显示了对裸鼠中已形成的U118(成胶质细胞瘤；A组)和SKLMS-I(平滑肌肉瘤；B组)移植肿瘤的的剂量依赖型治疗作用。 
图19显示了与使用非特异性人IgG治疗相比使用抗PDGFRα抗体治疗的U118肿瘤中体内PDGFRα磷酸化的降低。 
图20描述了用于克隆源自杂交瘤的人VH和Vκ可变区基因和 表达完整人重链(IgGl)和轻链蛋白的GS表达载体。这两个载体是按照实施例中的方法重组构建的并将重组载体转染至NSO细胞。 
发明详述
本发明涉及使用与胰岛素样生长因子-I受体(IGF-IR)结合的抗体或抗体片段治疗骨肿瘤。IGF-I的内分泌表达主要由生长激素调控并由肝脏生成，但是其他类型的组织也可以表达IGF-I包括储存有大量生长因子的骨。根据肿瘤细胞类型的不同，IGF-I可参与内分泌、旁分泌和/或自分泌调节(Yu，H.and Rohan，J.，J.Natl.Cancer Inst.92：1472-89(2000))。 
实验发现可以和IGF-IR结合的抗体可用于治疗表达IGF-IR的骨肿瘤。所述抗体可以单独使用或与其他癌症疗法联合使用，尤其是化疗药物。单独使用抗IGF-IR疗法或与其他包括一种或多种抗肿瘤药物(例如化疗或放疗)的疗法联合使用具有显著功效。对肿瘤生长的抑制常常伴随细胞凋亡的增加，并可持续至所有治疗结束，然而只进行了化疗的动物肿瘤又开始生长。 
研究也发现PDGFRα在骨肿瘤的生长中发挥重要作用。例如，某些表达PDGFRα的肿瘤细胞系优先转移至骨。与骨髓中出现可溶性因子相对应，这些细胞系显示出PDGFRα激活和下游信号转导分子磷酸化增强。骨髓对PDGFRα的激活被PDGFRα拮抗剂降低或完全抑制，在通常状况下可被经PDGFRα的信号转导和其他受体酪氨酸激酶体系激活的下游信号转导分子的磷酸化也被大大降低。一些数据显示，PDGFRα传导不仅可以通过直接激活PDGFRα的配体，也可以通过骨髓中存在的可以反式激活该受体的因子来激活PI3K/Akt生存路径。 
依据本发明可被治疗的原发性骨肿瘤包括但不限于骨肉瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤和血管肉瘤。值得注意的是，恶性继发性(转移性)肿瘤比原发性骨肿瘤更加常见。依据本发明可被治疗的骨转移瘤可以有多种来源，最常见的是前列腺癌、乳腺癌和肺癌。转移性骨癌的来 源从病史中可以明显看出。所述肿瘤可能是成骨性的也可能是溶骨性的。肿瘤发生时可能依赖于IGF-IR的激活，或之后转为IGF-IR依赖型。例如，起始为激素/雄性激素依赖型并可以通过对雄性激素或激素生成具有抑制作用的物理或化学疗法控制的前列腺癌或前列腺癌转移可能通过对IGF-IR激活的敏感性增强转变成非激素/雄性激素依赖型。除了提供激素/和雄性激素依赖型肿瘤的疗法，本发明还可应用于治疗激素/和雄性激素依赖型肿瘤而不需要依赖于对雄性激素或激素的抑制，例如可以通过同时给予IGF-IR抗体和抗肿瘤药物。这些肿瘤包括在骨中富含IGF-IR的环境中通过IGF-IR激活的骨转移肿瘤，它们可能对激素刺激敏感但是还没有敏感到在不含有IGF的环境中生长的程度。对于这样的肿瘤不一定需要去除激素。 
PDGF-依赖型骨肿瘤和“骨髓”依赖型肿瘤也可以依据本发明进行治疗。与骨髓中出现可溶性因子相应，骨髓依赖型肿瘤中会出现PDGFRα激活。例如这里所举例说明的，当一种转移性并表达PDGFRα的人癌细胞系与骨髓穿刺液接触后会出现PDGFRα激活和Akt磷酸化。一种抗PDGFRα抗体和一种小分子PDGFRα拮抗剂可以分别抑制细胞系中PDGFRα激活和Akt磷酸化。可以激活PDGFRα的可溶性骨髓因子包括但是不限于PDGF-AA和BB。 
虽然这种骨髓依赖性涉及到经PDGFRα的信号转导，但也有可能并不仅仅是一种PDGFRα配体与PDGFRα的结合。例如这里举例说明的，人们注意到特定的配体(PDGF-AA和BB)对PDGFRα激活弱于骨髓穿刺液的激活作用。而且，观察发现当骨髓穿刺液存在时，随着温育时间的延长Akt磷酸化降低。综合考虑这些结果表明除了对与FDGFs的结合作出反应之外，PDGFRα也可能被对其他骨髓成份敏感的其他信号转导元件(例如其他受体酪氨酸激酶)反式激活(磷酸化)。在任何一种情况下，在适于转移至骨生长的细胞系(例如，优先转移至骨的细胞系)中都可以观察到骨髓依赖型PDGFRα的激活，该激活可被PDGFRα拮抗剂抑制。而且，使用PDGFRα拮 抗剂进行治疗可以抑制骨髓诱导的PI3K/Akt抗凋亡途径的激活和由促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)。 
使用PDGFRα拮抗剂治疗的骨肿瘤可以是转移自前列腺癌细胞，并且如上所述可能是激素/雄性激素依赖型或转变成激素/雄性激素非依赖型。这些肿瘤也可以转移自非前列腺癌细胞。本领域技术人员可以很容易地使用已知的传统检测方法对这些状态和病症作出诊断。 
治疗意味着对动物某一种疾病的任何治疗，包括：(1)在容易感染某种疾病但是还未罹患或表现出该疾病任何症状的哺乳动物中预防疾病的发生，例如预防临床症状的出现；(2)抑制疾病，例如使疾病停止发展或(3)缓解疾病，例如使疾病症状消退。抑制肿瘤生长包括减缓或停止生长以及使肿瘤消退。治疗疾病的有效量指当给予需要进行治疗的哺乳动物时可以按上述要求足以达到对这种疾病的治疗效果的量。本发明的IGF-IR拮抗剂和PDGFRα拮抗剂可以单独使用，也可以联合使用或与其他一种或多种的抗肿瘤药物(例如化疗或放疗药物)联合使用。 
在本发明的一个实施方案中，可能需要测定被治疗的肿瘤中IGF-IR和/或PDGFRα的表达水平。在这种情况下，可以收集肿瘤活组织并使用本技术领域的常规方法进行分析。在本发明的另一个实施例中，在相应受体在某种类型的肿瘤中普遍表达或被激活或在疾病进行过程中一定会被表达或被激活的基础上给予IGF-IR拮抗剂或PDGFRα拮抗剂。 
IGF-IR拮抗剂可以是胞外拮抗剂或胞内拮抗剂并且可能使用的拮抗剂不止一种。胞外拮抗剂包括但是不限于可以和IGF-IR或一种或多种IGF-IR配体(例如IGF-I和IGF-II是IGF-IR的天然配体)相结合的蛋白质或其他生物分子。在本发明的一个实施方案中，胞外拮抗剂抑制IGF-IR与其配体的结合。在一个实施方案中，所述拮抗剂是一种抗IGF-IR抗体，例如IMC-A12。在另一个实施方案中，所 述拮抗剂为可以与IGF-IR片段结合的可溶性配体。胞内IGF-IR拮抗剂可以是生物分子，但是常常为小分子。这样的例子包括但不限于酪氨酸激酶抑制剂AG1024(Calbiochem)、胰岛素样生长因子-I受体激酶抑制剂NVP-AEW541(Novartis)和胰岛素样生长因子-I/胰岛素受体抑制剂BMS-554417(Bristol Myers Squibb)。应当理解的是本发明中可用的小分子是IGF-IR的抑制剂，但是并不需要对IGF-IR具有完全特异性。 
根据本发明使用的抗-IGF-IR抗体具有下列性质的一种或多种。 
1)所述抗体与IGF-IR的胞外域结合并抑制IGF-I或IGF-II与IGF-IR的结合。可以使用纯化的或膜结合受体通过直接结合分析法测定抑制作用。在这一实施方案中，本发明中所述抗体或它们的片段与IGF-IR优先结合的强度至少应与IGF-IR的天然配体(IGF-I和IGF-II)相当。 
2)所述抗体可中和IGF-IR。配体(例如IGF-I和IGF-II)与IGF-IR胞外域的结合可以激活其β亚基和下游信号转导分子包括MAPK、Akt和IRS-1的自身磷酸化。 
对IGF-IR的中和作用包括抑制、降低、灭活和/或破坏一种或多种这些与信号转导相关的活性。可以使用例如组织、培养细胞或纯化的细胞组分检测体内、先体外后体内(ex vivo)或体外中和作用。中和包括对IGF-IR/IR异型二聚体和IGF-IR同型二聚体的抑制。因此，对IGF-IR的中和具有多种作用，包括抑制、降低、灭活和/或破坏生长(增殖和分化)、血管生成((血管再生、侵袭和转移)和细胞的运动性和转移(细胞粘附和侵袭力) 
对IGF-IR中和作用的一个量度标准是对该受体的酪氨酸激酶活性的抑制。可以使用常见的方法测定酪氨酸激酶的抑制，例如通过测定重组激酶受体的自身磷酸化水平和/或天然或合成底物的磷酸化。因此，在本发明背景下磷酸化分析对于测定抗体的中和是非常有 用的。例如可以使用一种对磷酸酪氨酸具有特异性的抗体在ELASA检测法或蛋白质印迹法中测定磷酸化。Panek等.，J.Pharmacol.Exp.Thera.283：1433-44(1997)和Batley等.，Life Sd.62：143-50(1998)描述了一些酪氨酸激酶活力的测定方法。本发明的抗体可以将与配体反应的细胞中IGF-IR的酪氨酸磷酸化降低至少75％，优选85％，更优选至少约为90％。 
IGF-IR中和的另一量度标准是IGF-IR下游底物磷酸化的抑制。相应地可以测定MAPK、Akt或IRS-I的磷酸化水平。磷酸化至少降低约40％，可以达到至少约60％或至少80％。 
除此之外可以应用检测蛋白表达的方法测定IGF-IR中和，其中被检测的蛋白是受IGF-IR酪氨酸激酶活性调节的。这些方法包括免疫组织化学(IHC)法检测蛋白质表达，荧光素原位杂交法(FISH)检测基因扩增，竞争放射性配体结合分析法，固相基质印迹技术例如蛋白质印迹法和DNA印迹法，逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)和ELISA。见以下参考文献：Grandis等.，Cancer，78：1284-92(1996)；Shimizu等.，Japan J.Cancer Res.，85：567-71(1994)；Sauter等.，Am.J.Path.，148：1047-53(1996)；Collins，GHa 15：289-96(1995)；Radinsky等.，Clin.Cancer Res.1：19-31(1995)；Petrides等.，Cancer Res.50：3934-39(1990)；Hoffmann等.，Anticancer Res.17：4419-26(1997)；Wikstrand等.，Cancer Res.55：3140-48(1995)。 
也可以使用先体外后体内分析测定IGF-IR中和。例如可以在存在抑制剂和不存在抑制剂的情况下使用被受体的配体激活的细胞系通过促分裂分析法观察受体酪氨酸激酶的抑制。MCF7乳腺癌细胞系(美国模式培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD)就是如上所述表达IGF-IR并可以被IGF-I或IGF-II激活的细胞系。另外一种方法涉及到检测表达IGF-IR的肿瘤细胞或转染后表达IGF-IR的细胞的生长抑制。也可以使用肿瘤模型观察抑制作用，例如将人肿瘤细胞注射入小鼠。 
本发明中涉及的抗体并不局限于IGF-IR中和的任何具体机制。本发明的抗-IGF-IR抗体可以胞外结合IGF-IR细胞表面受体，阻断配体结合(例如IGF-I和IGF-II)和之后通过受体结合性酪氨酸激酶介导的信号转导以及阻止IGF-IR和信号转导级联中下游蛋白质的磷酸化。 
3)所述抗体可以下调IGF-IR。细胞表面IGF-IR的数量取决于受体蛋白的产生、内化和降解。细胞表面IGF-IR的数量可以通过检测该受体或与该受体结合的分子的内化间接测定。例如，可以通过使表达IGF-IR的细胞与被标记抗体接触来测定受体内化。使膜结合受体脱离，收集并计数。通过将细胞裂解并检测裂解物中的被标记抗体测定内化抗体。 
另一种方法是在使用抗-IGF-IR抗体或其他物质进行治疗之后直接测定细胞表面受体的数量。例如可以通过荧光激发细胞分选分析法测定被染色细胞表面的IGF-IR表达。将染色细胞在37℃下温育。检测不同时间的荧光强度。可以将被染色细胞的一部分置于4℃温育(此条件下无受体内化)作为对照。 
可以使用一种不同的抗体来检测和测量细胞表面的IGF-IR，这种抗体对IGF-IR具有特异性并且不会阻断或竞争被检测抗体的结合。(Burtrum，等.Cancer Res.63：8912-21(2003))用本发明的抗体治疗表达IGF-IR的细胞可以降低细胞表面的IGF-IR。在一个优选的实施方案中，用本发明的抗体治疗后，这种降低至少可以达到约70％，优选至少约80％，更优选至少90％。在短至四小时的时间内，可观察到显著降低。 
下行调节的另一个量度标准是细胞中所有受体蛋白的减少，这一量度标准反应了内部受体的降解。因此，用本发明抗体处理细胞(尤其是癌细胞)可以引起细胞总IGF-IR量的减少。在一个优选的实施方案中，这一降低可以达到至少约70％，优选至少约80％，更优选至少约90％。 
对人类受试者的治疗，依据本发明优选人源性抗体。所述抗体也可以来自于非人类的灵长类或是人源化的或嵌合抗体。在本发明的一个实施方案中，抗IGF-IR抗体可以有一个、两个、三个、四个、五个和/或六个互补决定区(CDRs)，这些互补决定区选自：SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：49(这些序列分别位于CDR1H、CDR2H、CDR3H、CDR1L、CDR2L、CDR3L)。在另一个实施方案中，抗-IGF-IR抗体可以包含一个、两个、三个、四个、五个和/或六个互补决定区(CDRs)，这些互补决定区选自：SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：59(这些序列分别位于CDR1H、CDR2H、CDR3H、CDR1L、CDR2L、CDR3L)。本发明所述抗体(或其片段)优选含有SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37和SEQID NO：39的重链CDRs。或者这些抗体(包括其片段)优选含有SEQID NO：45、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：55、SEQID NO：57和SEQ ID NO：59的轻链CDRs。人IgGl抗体IMC-A12(WO2005016970)就是这样的一种抗体，含有用SEQ ID NO：41表示的重链可变域和用SEQ ID NO：51表示的轻链可变域。另一优选人源抗体是IMC-2F8(WO2005016970)，含有与IMC-A 12相同的重链可变域和以SEQ ID NO：61为代表的轻链可变域。可用的抗体还包括可以与MC-A12或IMC-2F8竞争结合IGF-IR的抗-IGF-IR抗体以及可以和其他抗原决定簇结合的抗体(例如可以和其他抗原决定簇结合并且表现出如前所述的配体阻断，受体内化等性质但是不与IMC-A12或IMC-2F8竞争的抗体)。 
依据本发明，PDGFRα拮抗剂也可以用于治疗。PDGFRα拮抗剂可以是胞外拮抗剂或胞内拮抗剂，并且可以使用不止一种拮抗剂。胞外拮抗剂包括但不限于与PDGFRα或其一种或多种其配体相结合的蛋白质或生物分子(例如PDGF-AA、-AB、-BB、-CC)。在本发明的一个实施方案中，胞外拮抗剂抑制PDGFRα与其配体的结合。在一 个实施方案中，所述拮抗剂为抗-PDGFRα抗体，例如IMC-3G3。在另一个实施方案中，所述结合蛋白是可与PDGFRα片段结合的可溶性配体。胞内IGF-IR拮抗剂可以是生物分子，但常常是小分子。在一个实施方案中，所述胞内PDGFRα拮抗剂为AG1296。AG1296(Calbiochem)是PDGFα、PDGFβs和c-KIT的一种抑制剂，也可以与Flt3反应。其他作用于PDGFRs的小分子包括STI-571(imatinibmesylate、 
Figure G2009101264326D00141
Novartis)和SU11248(sunitinib malate、 
Figure G2009101264326D00142
Pfizer)。 
在本发明的一个实施方案中，抗-PDGFRα抗体可以包含一个、两个、三个、四个、五个和/或六个互补决定区(CDRs)，这些互补决定区选自：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14(分别位于CDR1H/CDR2H、CDR3H、CDR1L、CDR2L、CDR3L)。本发明所述抗体(或其片段)优选具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的CDRs。或者本发明抗体及其片段优选具有SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：12的SEQ ID NO：14的CDRs。CDRs的氨基酸序列见表1。 
Figure G2009101264326D00143
在另一个实施方案中，抗PDGFRα抗体或其片段具有SEQ IDNO：8的人重链可变区和/或SEQ ID NO：16的人轻链可变区。IMC-3G3就是这样一种抗体并在本发明中举例说明。 
本发明的抗体或其片段优选中和PDGFRα。配体如PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB或PDGF-CC与PDGFRα胞外域的结合可以激活该受体二聚体的形成、自身磷酸化、激活该受体内部的胞质酪氨酸激酶域并启动参与调节DNA合成(基因激活)和细胞周期进程或分裂的多重信号转导和反式激活途径。抗PDGFRα抗体通常可以阻断配体结合和/或受体二聚体化并抑制一种或多种自身磷酸化，激活赖氨酸激酶活性和信号传导。本发明的抗-PDGFRα抗体可以特异性地与PDGFRα的胞外配体结合区域结合并阻止PDGFRα配体的结合。这种抗-PDGFRα抗体或其片段与PDGFRα的结合力优选至少与PDGFRα天然配体相同。另一种情况或除此之外，所述抗体可以特异性与受体单体的某一区域结合，否则这一区域就会形成二聚体的界面。虽然可能阻断或不阻断配体与受体单体的结合，但是这种抗体可以阻断二聚体的形成。 
如上对抗-IGF-IR抗体所述，可以通过各种体内、先体外后体内和体外方法测定受体中和。在本发明的一个实施方案中，抗-PDGFRα抗体可以将PDGFRα磷酸化至少降低约75％。在其他实施方案中，磷酸化至少降低了约85％或至少约90％。在本发明的一个实施方案中，由于PDGFRα信号转导受到抑制，磷酸化或下游信号转导途径元件(例如Akt、p42/p44等)被至少降低约40％或至少约60％或至少约80％。可以使用特定配体(例如PDGF-AA、-AB、-BB、-CC)、这些配体的混合物或包含PDGFs和其他激活生长因子的骨髓穿刺液等制剂测定受体中和。 
PDGFRα的中和包括对一种或多种与信号转导相关活性的抑制、降低、灭活和/或破坏。因此，中和PDGFRα具有多种作用包括对生长(增殖和分化)、血管形成(血管再生、侵袭和转移)、细胞运 动性和转移性(细胞粘附和侵袭性)的抑制、降低、灭活和/或破坏。 
如上所述的先体外后体内检测也可以应用于测定PDGFRα的中和。例如，人SKLMS-平滑肌肉瘤细胞(美国模式培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD；ATCC HTB-88TM)或由PDGF-AA激活的U118胶质瘤细胞(ATCC HTB-15TM)可以用于分析PDGFRα抑制。可以用注射入SCID小鼠的表达PDGFRα的人肿瘤细胞确定生长抑制。 
本发明不受任何PDGFRα中和机制的限制。本发明的抗-PDGFRα抗体与PDGFRα细胞表面受体的胞外域结合，阻断配体结合(例如PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC)，抑制PDGFRα的磷酸化，抑制由受体相关型酪氨酸激酶介导的信号转导并调节下游信号转导元件的活性。所述受体-抗体复合物也可以被细胞内化并降解，导致细胞表面受体下调。在肿瘤细胞侵袭和转移过程中发挥作用的基质金属蛋白酶也可以被本发明的抗体下调。而且，本发明的抗体可能对生长因子的产生和血管生成显示出抑制作用。 
如上所述，本发明的PDGFRα拮抗剂可用于治疗骨癌，包括骨转移性癌。其他表达PDGFRα并可依据本发明被治疗的肿瘤包括但是不局限于卵巢肿瘤、乳腺癌、肺癌、肝细胞癌、胃肠道间质癌、肾细胞癌、前列腺肿瘤和软组织肉瘤。软组织肉瘤来自以下组织：脂肪、肌肉、神经、腱、血管和淋巴组织。通常情况下，所述肿瘤组织过度表达PDGFRα，可以使用例如组织化学法或RNA分析法测定PDGFRα的表达量。例如对放射性标记的IMC-3G3对U118细胞和SKLMS-I肿瘤细胞结合的scatchard分析可以表明细胞表面的PDGFRα数量分别为500和2500。 
PDGFRα拮抗剂通过抑制经肿瘤细胞自身表达的PDGFRα介导的信号转导或通过抑制周围基质细胞表达的PDGFRα(否则这些细胞会被肿瘤细胞表达的PDGFRα旁分泌激活)发挥作用。因此，例如IMC-3G3这样的抗体和其他PDGFRα拮抗剂可用于治疗具有 PDGFRα自分泌和/或旁分泌激活特性的肿瘤。 
本发明中的抗体片段可以通过分裂完整的抗体或表达编码所述片段的DNA制备。可以使用下列文章中描述的方法制备抗体片段Lamoyi等.，J.Immunol.Methods，56：235-243(1983)和Parham，J.Immunol.131：2895-2902(1983)。这种片段可能包括一个或两个Fab片段或F(ab′)2片段。这种片段也可能包括单链片段可变区抗体，即scFv、双抗体或其他抗体片段。以下专利中都有公开制备这些功能等价物的方法：PCT申请号WO 93/21319，欧洲专利申请号.EP239400；PCT申请号WO 89/09622；欧洲专利申请号EP 338745；和欧洲专利申请号EP 332424。 
用于载体转化和表达本发明抗体的宿主细胞优选哺乳动物细胞，例如COS-7细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和淋巴样来源的细胞系，例如淋巴瘤、骨髓瘤(例如NSO)或杂交瘤细胞。也可以使用其他真核宿主例如酵母。 
如果需要在酵母中表达基因构建体，一种适用于酵母的选择基因为质粒YRp7中的trpl基因，见Stinchcomb et al.Nature，282：39(1979)；Kingsman等.，Gene，7：141(1979)。trpl基因能够为在色氨酸中不能生长的突变酵母株提供选择标记，例如ATCC编号44076或PEP4-1.见Jones，Genetics，85：12(1977)。酵母宿主细胞基因组中的trpl基因被损害后可以提供一种通过在色氨酸缺乏环境中的生长来检测转化的有效方法。同样，可以用已知的含有Leu2基因的质粒与Leu2缺陷酵母株(ATCC 20，622或38，626)互补。 
根据本技术领域的已知方法可在含有可同化的碳源(碳水化合物例如葡萄糖核乳糖)、氮源(氨基酸、多肽、蛋白质或其降解产物例如蛋白胨，铵盐或其它)和无机盐(类似物硫酸盐，磷酸盐和/或钠、钾、镁和钙的碳酸盐)的液体基质中培养被转化的宿主细胞。所述基质还可包括促生长物质例如微量元素(如铁、锌、镁及其它)。 
依据本发明可以从由人重链和轻链可变区基因构建而来的噬 菌体展示文库中分离高亲和性的抗-PDGFRα和抗IGF-IR抗体。例如，本发明的一个可变区可以从含有重排的可变区基因的外周血淋巴细胞中获得。或是从不同来源获得可变区域部分例如CDR和FW区并进行重组。此外，可变区域部分(例如FW区)还可以是人工合成的共有序列。 
本发明的抗体和抗体片段可从例如天然存在的抗体或Fab或scFv的噬菌体展示文库中获得。应当理解的是为了从由一个包含VH和VL域的抗体中得到单域抗体，应将CDRs之外的某些氨基酸进行替换以增强结合、表达或溶解性。例如，有必要对那些可能被埋藏在VH-VL界面中的氨基酸残基进行修饰。 
此外，本发明的抗体和抗体片段可以通过标准杂交瘤技术(Harlow&Lane，ed.，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，211-213(1998)这里作为文献引用)使用可生产人免疫球蛋白γ重链和κ轻链的转基因小鼠(例如来自Medarex，San Jose，Calif.的KM小鼠)获得。在一个优选的实施方案中，将生产人抗体的基因组的重要部分插入小鼠的基因组中使其内源性鼠抗体生产不足。用PDGFRα皮下免疫(S.C)这些小鼠(通常使用完全弗氏佐剂)，在需要的情况下强化免疫。免疫方法为本技术领域常用的方法。 
本发明中用于鉴定IGF-IR结合抗体的蛋白优选IGF-IR，更优选IGF-IR的胞外域。本发明中用于鉴定PDGFRα结合抗体的蛋白质优选PDGFRα，更优选PDGFRα的胞外域。这些胞外域可以是游离的也可以与其他分子相结合。 
本发明还提供了编码如前所述的抗体或其片段的多核苷酸。IMC-A12抗-IGF-IR抗体的详细信息公开在WO2005016970中。表2为MC-3G3的核苷酸序列。 
Figure G2009101264326D00191
可以通过重组编码人恒定区和可变区的大部分或全部来源于对应的人抗体区域的DNA(而不是的CDRs基因)和人源的编码CDRs的基因(用于重链可变域CDRs的SEQ ID NOS：1、3和5，以及用于轻链可变域的CDRs的SEQ ID NOS：9、11和13)获得编码人源抗体的DNA。 
编码抗体片段DNAs的适合来源包括任何表达全长抗体的细胞，例如杂交瘤细胞和脾细胞。如上所述，这些片段自身可以用作抗体等价物或重组成等价物。本部分所描述的DNA缺失和重组可以根据已知方法实施，例如以上列举的出版物中描述的关于抗体等价物和/或其他重组DNA标准技术(如下所述)的方法，例如下面描述的方法。正如本专业技术领域人员所知，另一个DNAs的来源是由噬菌体展示文库生产的单链抗体。 
此外，本发明还提供了含有如前所述的核苷酸序列并可操作性的连接于表达序列、启动子和增强子序列的表达载体。已经开发了许多可以在原核中有效合成抗体多肽的表达载体，例如细菌和包括但不局限于酵母和哺乳细胞培养体系在内的真核体系。本发明的载体可以包括染色体、非染色体和合成DNA序列的片段。 
可以使用任何适合的表达载体。例如原核克隆载体，包括E.coli 的质粒，例如colE1、pCR1、pBR322、pMB9、pUC、pKSM和RP4。原核载体也包括噬菌体DNA例如MI3和人其他丝状单链DNA噬菌体的衍生物。例如在酵母中可以使用2μ质粒。适用在哺乳细胞中表达的载体包括广为人知的SV40衍生物，腺病毒，来自于逆转录病毒的DNA序列、将如上所述的功能哺乳动物细胞载体重组后衍生而来的穿梭载体和功能质粒和噬菌体DNA。 
还有其他的本技术领域人员熟知的真核表达载体(例如，PJ.Southern.P.Berg，J.MoI.Appl.Genet.，I，327-341(1982)；Subramani等.，MoI.Cell.Biol.，1：854-864(1981)；Kaufmann and Sharp，″Amplification And Expression of Sequences Cotransfected with aModular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene(模块二氢叶酸脱氢酶互补DNA基因共转染序列的扩增和表达)，″J.MoI.Biol.159，601-621(1982)；Kaufmann and Sharp，MoI.Cell.Biol.159，601-664(1982)；Scahill et al.，″Expression And Characterization Of TheProduct Of A Human Immune Interferon DNA Gene In Chinese HamsterOvary Cells(一种人免疫干扰素DNA基因在中国仓鼠卵巢细胞中产物的表达和特征)″Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 80，4654-4659(1983)；Urlaub and Chasin，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 77，4216-4220，(1980))。 
本发明中可用的表达载体至少包含一个与待表达的DNA序列或片段可操作性连接在一起的表达控制序列。将该控制序列插入所述载体来控制和调节被克隆DNA序列的表达。可用的表达控制序列包括：lac系统、trp系统、tac系统、trc系统、噬菌体λ的主要操纵基因和启动子区、fd外壳蛋白的控制区、酵母的糖酵解启动子(例如3-磷酸甘油酸酯激酶启动子)、酵母酸性磷酸酯酶启动子(例如Pho5)、酵母α交配因子启动子和来源于多瘤、腺病毒、逆转录病毒和猿猴病毒(例如SV40的早期和晚期启动子)的启动子和其他已知的可以控制原核或真核细胞和其病毒或者它们的组合的表达的序列。 
本发明也提供了含有如前所述的表达载体的重组宿主细胞。本 发明的抗体可以在细胞系中而不是杂交瘤中表达。含有编码本发明中多肽链序列的核苷酸可用于转化合适的哺乳动物宿主细胞。 
根据高表达量、相关蛋白组成性表达和来自宿主蛋白污染最低等标准筛选优选细胞系。可作为宿主用于表达的哺乳细胞系在本专业技术领域已广为人知，包括许多无限增殖细胞系，例如但不局限于NSO细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)以及其他。其他适合的真核细胞包括酵母和其他真菌。适用的原核宿主包括：大肠杆菌(例如大肠杆菌SG-936、大肠杆菌HB 101、大肠杆菌W3110、大肠杆菌X1776、大肠杆菌X2282、大肠杆菌DHI和大肠杆菌MRCl)、假单胞菌属菌属、杆菌属(例如枯草芽孢杆菌)和链霉菌属。 
这些重组宿主细胞可用于生产抗体或其片段，通过在允许抗体或其片段表达的条件下进行细胞培养并从宿主细胞或宿主细胞周围的培养基中纯化抗体或其片段。可以通过在编相关抗体基因的5’端插入编码信号肽或分泌引导肽的序列(见Shokri等.，Appl MicrobiolBiotechnol.60(6)：654-64(2003)，Nielsen等.，Prot.Eng.10：1-6(1997)和von Heinje等.，Nucl.Acids Res.14：4683-4690(1986))使抗体或其片段在宿主细胞内定向分泌表达。这些分泌引导肽元件可以来自于原核或真核序列。根据上述方法使用了适当的分泌引导肽后，可以使氨基酸与一种多肽的N端结合并引导该氨基酸向宿主细胞细胞胶质外运动并分泌至培养基中。 
本发明的抗体可与其他氨基酸残基融合。这样的氨基酸残基可以是一种可能有助于分离纯化的多肽标签。也可以考虑使用其他可以使抗体靶向于特定器官或组织的氨基酸残基。 
在另一个实施方案中，通过在转基因动物中表达编码所述抗体的核苷酸制备该抗体，这样可以表达并回收抗体。例如可以组织特异性表达抗体，有利于抗体的回收和纯化。在一个这样的实施方案中，在乳腺中表达本发明的一种抗体，可以在泌乳时分泌。转基因动物包 括但不局限于小鼠、山羊和家兔。 
依据本发明可以使用的抗体包括完整的免疫球蛋白、与抗体结合的免疫球蛋白片段以及含有免疫球蛋白抗原结合域的抗原结合蛋白。与抗原结合的免疫球蛋白包括例如Fab、Fab′和F(ab′)2。还有其他已开发的抗体模式，不仅保留了结合的特异性还具有其他有用的特性，例如双特异性、多价性(多于2个结合位点)和紧密的结构(例如只有结合域)。 
单链抗体缺少部分或完全缺乏与其相应的完整抗体的恒定区。因此它们可以克服一些与使用完整抗体相关的问题。例如，单链抗体不会出现重链恒定区和其他生物分子之间发生某些不利的反应。此外，单链抗体远小于完整抗体并比完整抗体具有更强的渗透性，这样就使得单链抗体可以更有效地定位并与目标抗原结合位点结合。而且，单链抗体相对较小的体积使其在接受者体内引起不良免疫应答的可能性小于完整受体。 
多单链抗体(每一条单链抗体含有由一个连接肽共价连接的一个VH和一个VL域)可以通过至少一种或多种的连接肽共价联接形成多价单链抗体，这种抗体可以是单特异性的也可以是多特异性的。多价单链抗体的每一条链都包括一个轻链可变区片段和一个重链可变区片段，并且通过连接肽与其他一条或更多的单链抗体连接。连接肽至少由15个氨基酸残基组成。最大氨基酸残基数约为100。 
两条单链抗体可以组合形成双抗体，也被成为二价二聚体。双抗体有两条链和两个结合位点，可以是单特异性也可以是双特异性。双抗体的每一条链都含有一个与VL域连接的VH域。域之间的连接肽都足够短以防止同一条链的域发生配对，从而促进不同抗体链的互补域配对并重新形成两个抗原结合位点。 
三条单链抗体可以组合形成三抗体，也称作三价三聚体。三抗体由一个VL或VH域的氨基酸末端与一个VL或VH域的碳末端直接融合构建而来，例如，没有任何联接肽序列。三抗体有三个Fv 头部，多肽链以环状头尾相连的形式排列。三抗体一种可能的构象是平面的，三个结合位点在同一平面上互相成120度角。三抗体可以是单特异性、双特异性或三特异性。 
因此，本发明的抗体及其片段包括但是不局限于天然抗体、二价片段例如(Fab′)2、单价片段例如Fab、单链抗体、单链Fv(scFv)、单域抗体、多价单链抗体、双抗体、三抗体和其他与抗原特异性结合的类似物质。 
可以通过化学反应或生物合成的方法将抗-IGF-IR和抗-PDGFRα抗体或抗体片段(这些抗体和片段在与表达IGF-IR(WO2005016970)或PDGFRα的细胞结合时可能会被内化)与抗肿瘤药物连接。与这样一种抗体联接的抗肿瘤药物包括可以破坏或损害该抗体所结合的肿瘤或该抗体所结合细胞所处环境中的肿瘤的任何药物。例如，这种抗肿瘤药物可以是一种细胞毒性药物例如化疗药物或放射性同位素。本专业技术领域人员都了解这些适合的化疗药物，包括蒽环类抗生素(例如柔红霉素和阿霉素)、甲氨喋呤、长春花碱酰胺、新制癌菌素、顺铂、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、5-氟尿苷、苯丙氨酸氮芥、篦麻毒素和刺孢霉素。使用传统方法将所述化疗药物与所述抗体结合(例如见Hermentin和Seiler，Behring Inst.Mitt.82：197-215(1988))。 
本专业技术人员也熟知可用做抗肿瘤药物的放射性同位素。例如可以使用131I或211At。使用传统技术将这些同位素与所述抗体连接(例如见Pedley等.，Br.J.Cancer 68，69-73(1993))。 
另外一种选择是将可以激活前体药物的酶作为抗肿瘤药物与所述抗体连接。在这一方法中，给予的前提药物一直保持非活性形式直至到达靶位点并在那里被转化成细胞毒素形式。在具体操作中，给予病人抗体-酶复合物并使其定位于需要治疗的组织区域。然后给予病人前体药物，这样就会在需要治疗的组织区域发生向细胞毒性药物的转化。 
其他的抗肿瘤药物包括细胞因子，例如白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)或肿瘤坏死因子α(TNF-α)。所述抗体将细胞因子定向于肿瘤从而使细胞因子发挥对肿瘤的损害或破坏作用而不影响其他的组织。使用传统的重组DNA技术可以使细胞因子在DNA水平与所述抗体结合。 
在本发明的某一个实施方案中，将抗IGF-IR或抗-PDGFRα抗体与一种或多种抗肿瘤药物联合使用。例如联合疗法，见以下专利：美国专利号6,217,866(Schlessinger等)(抗-EGFR抗体与其他抗肿瘤药物联合使用)；WO 99/60023(Waksal等)(抗-EGFR抗体与放射联合使用)。可以使用任何一种适当的抗肿瘤药物，例如化疗药物、放疗药物或它们的组合。所述抗肿瘤药物可以是一种烷化剂或一种抗代谢物。烷化剂的例子包括但是不局限于顺铂、环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥和氮烯咪胺。抗代谢物的例子包括但是不局限于阿霉素、柔红霉素和紫杉醇、吉西他滨(2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷)。 
可用的抗肿瘤药物也包括促分裂抑制剂例如紫杉烷类、多西他赛和紫杉醇TAX。拓扑异构酶抑制剂是另一类可与本发明中抗体结合的抗肿瘤药物。它们包括扑异构酶I抑制剂和扑异构酶II抑制剂。扑异构酶I抑制剂包括依立替康(CPT-11)、氨基喜树碱、喜树碱、DX-8951f和托泊替康。扑异构酶II抑制剂包括鬼臼乙叉甙(VP-16)和鬼臼噻吩甙(VM-26)。目前正在评价其他一些物质的扑异构酶抑制活性和作为抗肿瘤药物的有效性。在一个优选的实施方案中，所使用的扑异构酶抑制剂为依立替康(CPT-11)。 
在一个特殊的实施方案中，将抗-IGF-IR抗体与多西他赛联合使用。在本发明的另一个实施方案中将抗-IGF-IR抗体与阿霉素联合使用。 
如果抗肿瘤药物为放射线，放射线的来源可以在被治疗病人的体外(外线束放射疗法-EBRT)或体内(近距离放射疗法-BT)。抗肿瘤药物的给予剂量取决于多种因素例如包括药物类型、被治疗肿瘤 的类型和严重程度和该药物的给药方式。应当强调的是本发明并不局限于任何具体的剂量。 
所述抗体(抗-IGF-IR或抗-PDGFRα)和抗体加抗肿瘤药物疗法也可用于接受辅助性激素疗法(例如乳腺癌)或去雄疗法(例如前列腺癌)的病人。 
本发明的抗-IGF-IR和抗-PDGFRα拮抗剂可以联合使用或与可以中和其他参与肿瘤生长或血管发生的受体的受体拮抗剂联合使用。例如在本发明的一个实施方案中，将一种抗-IGF-IR抗体和一种抗-PDGFRα抗体联合使用。在一个实施方案中，目标肿瘤细胞表达IGF-IR和PDGFRα，普通信号转导元件可被经每一种受体的信号转导激活。虽然对一种受体的抑制会普遍引起普通下游元件激活减少，但是对两种受体的同时抑制会进一步减少激活。在另一个实施方案中肿瘤或周围组织的某些细胞显著表达一种受体，另外的细胞显著表达另一种受体。将拮抗剂联合使用可以减少肿瘤细胞的生长和周围细胞的旁分泌刺激。 
双特异性抗体可以作为联合用药的另一选择。有许多被设计成能包含各种所需特性的双特异性抗体。例如双特异性抗体具有最小的体积。具有4个抗原结合位点的双特异性抗体(每一种结合专一性有2个位点)与相应的天然抗体具有类似的结合亲和力。某些双特异性抗体包括Fc区，因此保留了天然抗体的效应器功能(例如，补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC))。WO 01/90192中描述了IgG样四价抗体，WO2006/020258中描述了一种包含两个双抗体并保留了效应器功能的四价抗体。 
在另一个实施方案中，将一种抗IGF-IR抗体或一种抗-PDGFRα抗体或其他拮抗剂与一种可以和表皮生长因子受体特异性结合的受体拮抗剂(例如EGFR、Her2/erbB2、erbB3、erbB4))联合使用。尤其优选可以与EGFR的胞外域结合并阻断一种或多种配体结合或中和配体诱导的EGFR激活的抗原结合蛋白。EGFR拮抗剂也包 括例如EGF、TGF-α、双调蛋白、肝素结合-EGF(HB-EGF)和β-细胞调节素。尽管TGF-α表现出更强的促血管形成作用，但是EGF和TGF-α被认为是引起EGFR-介导激活的主要外源性配体。EGFR拮抗剂也包括可以抑制EGFR与其他EGFR受体亚基(即EGFR同型二聚体)发生二聚体化或与其他生长因子受体(例如HER2)发生异二聚体化的物质。EGFR拮抗剂还包括生物分子和小分子，例如可以直接作用于EGFR胞质域并抑制EGFR介导的信号转导的合成激酶抑制剂。 
Figure G2009101264326D00261
(cetuximab)就是可以与EGFR结合并阻断配体结合的EGFR拮抗剂。IRESSATM(ZD1939)是小分子EGFR拮抗剂，它是喹唑啉衍生物可以作为一种类ATP抑制EGFR。见美国专利5,616,582(Zeneca Limited)；WO 96/33980(Zeneca Limited)第4页；也可见，Rowinsky等，旧金山第37届美国临床肿瘤学会年度会议中发表的摘要5，旧金山，CA，2001年5月12-15日；Anido等，旧金山第37届美国临床肿瘤学会年度会议中发表的摘要1217，旧金山，CA，2001年5月12-15日。 
Figure G2009101264326D00262
(OSI-774)是另一种小分子EGFR拮抗剂，它是4-(取代苯胺)喹唑啉衍生物[6，7-双(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔-苯)胺氢氧化物]EGFR抑制剂。见WO 96/30347(PfizerInc.)，例如从第二页第12行至第4页第34行和第19的14-17行。也可见Moyer等，Cancer Res.，57：4838-48(1997)；Pollack等，J.Pharmacol，291：739-48(1999).。 
Figure G2009101264326D00263
可能通过抑制EGFR磷酸化及其下游的PI3/Akt和MAP(有丝分裂原激活蛋白)激酶信号转导途径发挥功能，导致p27介导的细胞周期停止。见Hidalgo等，旧金山第37届美国临床肿瘤学会年度会议中发表的摘要281，旧金山，CA，2001年5月12-15日。 
许多其他已报道的可以抑制EGFR的小分子都被认为对EGFR的酪氨酸激酶域具有特异性。关于小分子EGFR拮抗剂的例子描述可见WO 91/116051、WO 96/30347、WO 96/33980、WO 97/27199(ZenecaLimited)。WO 97/30034(Zeneca Limited)、WO 97/42187(Zeneca Limited)、WO 97/49688(Pfizer Inc.)、WO 98/33798(Warner LambertCompany)、WO 00/18761(American Cyanamid Company)和WO00/31048(Warner Lambert Company)。特异性小分子EGFR拮抗剂的例子包括Cl-1033(Pfizer)，它是酪氨酸激酶的喹唑啉(N-[4-(3-氯-4-氟-苯基氨基)-7-(3-吗啉-4-基-丙氧基)-喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺)的抑制剂，以下专利对EGFR进行了描述，WO 00/31048第8页第22-26行描述了一种EGFR吡咯并嘧啶抑制剂PKIl 66(Novartis)，WO97/27199第10至12也对该抑制剂进行了描述；GW2016(GlaxoSmithKline)是一种EFGR和HER22的抑制剂；EKB569(Wyeth)可以在体内和体外抑制表达EFGR或HER22细胞的生长；AG-1478(Tryphostin)是一种可以抑制来自EGFR和erbB-2的信号转导的喹唑啉小分子；AG-1478(Sugen)是一种也可以抑制蛋白质激酶CK2的双底物抑制剂；被报道可以抑制EGFR酶活性和肿瘤生长的PD153035(Parke-Davis)可以诱导培养细胞的凋亡并增强细胞毒性化疗药物的细胞毒性。SPM-924(Schwarz Pharma)是一种酪氨酸激酶抑制剂可用于前列腺癌的靶向治疗；CP-546,989(OSI Pharmaceuticals)被报道是一种血管形成抑制剂可用于实体瘤的治疗。ADL-681是一种EGFR激酶抑制剂可用于癌症的靶向治疗；PD 158780是一种吡咯并嘧啶并被报道可以抑制小鼠A4431移植肿瘤的生长；CP-358,774是一种被报道可以抑制小鼠HN5移植物自身磷酸化的喹唑啉；ZD 1839是一种被报道的对小属移植肿瘤模型包括外阴癌、NSCLC、前列腺癌、卵巢癌和结肠直肠癌具有抗癌活性的喹唑啉；CGP 59326A是一种被报道的对小鼠EGFR阳性移植肿瘤的生长具有抑制作用的吡咯并嘧啶；PD165557(Pfizer)；CGP54211和CGP53353(Novartis)为二苯胺基邻苯二甲酰亚胺(dianilnophthalimides)。天然EGFR酪氨酸抑制剂包括5，7，4′-三羟基异黄酮、除莠霉素、橡黄素和三羟异黄酮。 
其他已报道的可以抑制EGFR并因此也属于本发明范围的小分子是三环类化合物如美国专利号5,679,683中描述的化合物；喹唑 啉衍生物，例如美国专利号5,616,582中所述衍生物和吲哚化合物，例如美国专利号5,196,446中描述的化合物。 
另一种可与IGF-IR或PDGFRα一起做为作用靶的受体为血管内皮生长因子受体(VEGFR)。在本发明的一个实施方案中，将一种抗-IGF-IR抗体或抗-PDGFRα抗体与一种VEGFR拮抗剂联合使用。在一个实施方案中使用了与VEGFR-I/FIt-I受体特异性结合的拮抗剂。在另一个实施方案中，所述VEGFR拮抗剂与VEGFR-2/KDR受体特异性结合。尤其优选可与VEGFR-I或VEGFR-2胞外域结合并通过它们的配体(VEGF对VEGFR-2的激活力最强；PlGF对VEGFR-I的激活力最强但也可被VEGF激活)阻断和/或中和配体诱导激活的抗原结合蛋白。例如，IMC-1121是一种可以与VEGFR-2结合并将其中和的人源抗体(WO 03/075840；Zhu)。另一个例子为MAb 6.12，它可以与可溶性的并表达于细胞表面的VEGFR-I结合。ScFv 6.12包括小鼠单克隆抗体MAb 6.12的VL和VH域。一种生产MAb 6.12的杂交瘤细胞系已按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约及其相关规定保存，ATCC编号为PTA-3344。在另一个实施方案中，所述VEGFR拮抗剂与一种VEGFR配体结合并阻断配体对VEGFR的激活。例如， 
Figure G2009101264326D00281
(bevacizumab)就是一种可以结合VEGF的抗体。 
其他与肿瘤形成有关的肿瘤生长因子受体有神经生长因子受体(NGFR)和成纤维细胞生长因子受体(FGFR)。 
在另一种可选择的实施方案中，所述抗-IGF-IR和抗-PDGFRα抗体可以与一种或多种的辅助药物联合使用，例如细胞因子(例如IL-10和IL-13)或其他免疫激活剂，例如(但不局限于)趋化因子、肿瘤相关抗原和多肽。例如见Larrivee等，出处同上。应当理解的是只给予一种抗-IGF-IR或抗-PDGFRα抗体已足以预防、抑制或降低肿瘤的生长进程，达到有效治疗。 
在一种联合疗法中，在用另一种药物开始治疗之前、治疗中和 治疗后给予抗-IGF-IR或抗-PDGFRα抗体，也可以在任何时间组合给予，例如在使用抗肿瘤药物疗法开始治疗前和治疗中、治疗前和治疗后、治疗中和治疗后或治疗前、中、后。例如，所述抗体可以在放疗开始前1至30天给予，优选第3至20天，更优选第5至12天。在一个优选的实施方案中化疗可与抗体疗法同时或优选在抗体疗法之后联合使用。 
在本发明中，可使用任何适当地方法或途径给予本发明抗体或选择性地联合给予抗肿瘤药物和/或其他受体拮抗剂。依照本发明可使用的抗肿瘤药物包括任何被认为治疗病人肿瘤的最适疗法。不同的恶性肿瘤要求使用特异性的抗肿瘤抗体和特异性的抗肿瘤药物，这些取决于病人的个体情况。给药途径包括例如口服、静脉注射、腹膜内注射、皮下注射或肌肉注射。拮抗剂的给药剂量取决于许多因素，包括例如拮抗剂类型、被治疗肿瘤的类型和严重程度、拮抗剂的给药途径。应当强调的是本发明并不局限于任何具体的方法或给药途径。 
本专业领域技术人员会理解治疗的剂量和频率取决于病人个体的耐受力和所使用的阻断剂或抑制剂的药理学和药代学性质。理想状态下我们希望达到所用药物的饱和药代学。例如，抗-IGF-IR和抗-PDGFRα抗体的负荷剂量可以为10至约1000mg/m2，优选200-400mg/m2。之后可以再给予几天或几周的附加剂量，例如200-400mg/m2。监控病人副作用的发生，当发生严重副作用时停止治疗。 
本专业领域技术人员也知道如何监控治疗过程以确定有效剂量。对于转移自前列腺的骨转移，一种方法是监控PSA的浓度。其他监控骨转移的方法包括骨扫描和核磁共振。 
对于癌症诱导骨丢失(CTIBL)会引起危险或产生问题的病人(例如接受辅助激素疗法治疗乳腺癌或去雄疗法治疗前列腺癌的病人)以上提及的任何治疗都可以补充给予可以防止CTIBL的药物，例如二膦酸盐。二膦酸盐包括例如氯膦酸盐、利塞膦酸盐和唑来膦酸在内的物质。 
在整个申请中，各种出版物、参考文章、教科书、技术手册、专利和专利应用均作为参考。这些出版物、专利、专利应用和其他文件的教义和公开内容都完整地以引用形式包含在本申请中以更全面地描述本发明相关技术的状态。 
应当理解和预见的是本专业领域技术人员可以对在此公开的本发明原理进行各种变化但是这些变体也属于本发明范畴。 
以下实施例对本发明进行进一步阐明，但是并不限制本发明的范围。从许多出版物中都可以获得传统实验方法的详细描述，例如构建体和质粒、表达抗体和抗体片段所使用的方法。这些出版物包括Sambrook，J等，(1989)分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社；Coligan，J.等.(1994)免疫学实验室指南，Wiley&Sons，Incorporated；Enna，SJ.等.(1991)药理学实验室指南，Wiley&Sons；Bonifacino，J.S.等.(1999)生物学实验室指南，Wiley&Sons。这里提到的参考书均以完整的包含在本申请中。实施例 
实施例1 
IMC-A12和多西他赛对肿瘤生长的作用。如前所述(4)将雄性激素依赖型(AI)LuCaP 35V肿瘤小块(20-30mm3)分别皮下移植(s.c.)至32个6周大的去雄SCID小鼠。当观察到被移植肿瘤的体积达到150-200mm3时，将动物随机分成4组进行治疗研究。第一组动物接受20mg/kg多西他赛的治疗。第二组动物接受10mg/kg多西他赛的治疗。第三组动物接受10mg/kg多西他赛和40mg/kg A12的联合治疗。第四组动物接受20mg/kg多西他赛和40mg/kg A12的联合治疗。所有的治疗均为腹膜内给药(ip)。多西他赛每周给药1次。A12每周给药3次。所有动物均接受4周治疗并且在实施安乐死之前进行四周的监控。每周对肿瘤进行2次测量，肿瘤的体积根据下列公式计算：体积＝L X W2/2。根据我们华盛顿大学IACUC批准的动物实验规程，当肿瘤体积达到1000mm3之前或者动物的体重减少超过了原 始体重的20％时将一些动物提前处死。每两周将动物称重一次。每周进行眼窝窦取血采样。分离血清并使用EVIx Total PSA Assay(AbottLaboratories，Abott Park，IL)测定PSA水平。在将小鼠处死前1h向肿瘤中注射BrdU以评价体内肿瘤细胞的生长速率。 
将小鼠处死之后收集肿瘤并分成两份。一部分肿瘤固定在10％的中性缓冲液福尔马林(NFB)中并用液体石蜡包埋。制备5微米大小的切片并进行免疫组织化学(IHC)染色。剩余部分的肿瘤通过研磨和过70μm尼龙筛分离制备成单细胞。 
如图1所示，LuCaP 35V移植肿瘤在小鼠中生长迅速，在不进行任何治疗的情况下平均生长速率为362.0±72.0mm/周。在实验组开始治疗后三个星期内所有非治疗组的动物都必须处死，因为此时它们的肿瘤体积都超过了1000mm3。当单独使用40μg/kg A12治疗动物时，治疗过程中肿瘤的生长速率降低至192.7±35.6mm3/周。当给予动物10mg/kg的多西他赛时LuCaP 35V肿瘤的生长速率降低至平均29.6±6.1mm3/周。当使用多西他赛和A12联合治疗时LuCaP 35V肿瘤的生长速率进一步降低至平均7.9±1.0mm3/周(图Ib)。多西他赛和A12联合使用的抑制效果可以持续至治疗结束后第四个星期。如果给予动物更高剂量的多西他赛(20mg/kg)，不论是否与A12联合使用，肿瘤体积在为期四周的治疗期内没有增加，相反，还观察到肿瘤体积有减小的趋势。但是在治疗结束后的四个星期中，使用多西他赛和A12联合治疗的动物组中肿瘤体积进一步减小。相比之下，单独使用多西他赛治疗的动物组肿瘤体积的平均增长速率为27.0±16.1mm3/周。这些结果表明在给定的多西他赛剂量下，联合使用A12可以增强多西他赛在治疗过程中或治疗之后对肿瘤生长的抑制作用。 
PSA是普遍使用的评价前列腺肿瘤生长的临床参数。在治疗中和治疗后测定动物的血清PSA水平。如图Ic所示，使用A12和多西他赛或单独使用20mg/kg多西他赛治疗的动物，血清PSA水平没有发生明显变化，与肿瘤生长受到抑制相一致。在治疗结束之后，单独 使用多西他赛治疗的动物血清PSA水平增加，相比之下，使用多西他赛和A12联合治疗的动物PSA水平保持不变甚至降低。这些数据都表明使用多西他赛和A12联合治疗可在治疗结束后仍然保持对肿瘤生长的抑制作用。 
多西他赛与抗-IGF-IR抗体联合使用诱导细胞凋亡。使用如前所述的末端脱氧核苷酸基转移酶介导的缺口标记技术(TUNEL)和使用Apop-Direct kit(BD BioScience)进行碘化丙锭(PI)染色测定多西他赛和A12对实验结束点的细胞周期和细胞存活率的体内作用。基本过程如下：将单细胞悬液中1×106细胞固定于10％的中性缓冲液福尔马林中，然后再用70％的乙醇-20℃下固定30分钟。冲洗数次之后，用0.1％的Triton X-100渗透细胞并与结合FITC的dUTP和末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)于37℃温育1h。之后用PI/RNase缓冲液(100μg/ml的PI，50μg/ml RNase)于室温下温育60分钟。使用流式细胞仪BD FACscan分析样品。使用CellQuestPRO软件分析数据。 
治疗结束后四个星期，在使用多西他赛(使用10mg/kg多西他赛治疗的动物组为66.7％，使用20mg/kg多西他赛治疗的动物组为77.8％)和A12联合治疗的动物肿瘤中观察到显著比例的细胞凋亡(图.2b和表1)，与多西他赛的使用剂量无关。这些肿瘤中细胞凋亡事件的平均发生率为15.0±4.3％。在单独使用多西他赛治疗的动物组中没有检测到细胞凋亡。反而，大多数(使用10mg/kg多西他赛的治疗组为88％，使用20mg/kg多西他赛的治疗组为100％)肿瘤进入正常的细胞周期(图.2a和表3) 
Figure G2009101264326D00321
为了进一步评价治不同疗结束后肿瘤细胞的增殖能力，将石蜡 切片用抗BrDu抗体染色(paraffin-section of stained with anti-BrDuantibody)。将肿瘤样品用10％的NBF固定并包埋在液体石蜡中，切成5μm的薄片。在去掉石蜡和再水化之后，用0.01M的柠檬酸(pH 6.0)于95℃下回收抗体2×5min。将薄片冷却30分钟，然后用PBS连续润洗。用0.3％的H2O2甲醇溶液温育使内源性过氧化物酶失活。用1.5％常规山羊血清在含有0.05％Tween 20的PBS溶液中封闭1小时后，将薄片与小鼠抗-BrdU抗体(1μg/ml)温育1小时。然后依次与生物素化的羊抗-小鼠IgG温育30分钟，与过氧化酶标记的卵白素(Santa Cruz Biotechnology)温育30分钟，与二氨基联苯胺(DAB)/过氧化氢色原体底物(Vector Laboratories，Burlingame，CA)温育5-10分钟。所有的温育过程均在室温下进行。用苏木精(Sigma)将薄片反染色，并用封片剂(Fisher Scientific，Fair Lawn，New Je rsey)封存。对于阴性对照，用小鼠IgG(Vector Laboratories)代替一级抗-BrdU抗体。在Zeiss显微镜下观察薄片并获得数字图象。计算每一个切片的10个随机视野中BrdU标记细胞核数和总细胞核数。用BrdU阳性细胞核数除以总细胞核数就可计算得到增殖率。每一薄片计数10个区域。使用苏木精和伊红(Richard Allen，Kalamazoo，MI)进行H&E染色。 
使用用多西他赛和A12联合治疗的动物中BrDu摄入明显少于单独用多西他赛治疗的动物(图3)。这些BrDu掺入数据与以上对细胞周期和细胞凋亡的观察结果一致，这表明A12显著增强了多西他赛的细胞毒性。 
用多西他赛和抗-IGF-IR-抗体联合治疗的肿瘤与单独使用多西他赛治疗的肿瘤基因表达差异调控的比较。为了确定A12对多西他赛显著增强作用的潜在机制，使用免疫组织化学和流式细胞仪分析法检测所有收获肿瘤中IGF-IR的表达。所有治疗组之间或与对照组相比(数据未显示)表面IGF-IR的表达量没有差异。使用cDNA微阵列分析法检测接受20mg/kg多西他赛治疗和接受20mg/kg多西他赛和A12联合治疗的动物肿瘤中治疗后的基因表达。基于SAM分 析，与单独使用多西他赛治疗的肿瘤相比，在使用多西他赛和A12联合治疗的肿瘤中鉴定出49种基因差别表达，这种差异大于2倍并且错误发现率小于(FDR)10％(数据未显示)。鉴定出13种基因可能参与了细胞凋亡或细胞周期的调控(表4)。两种治疗之间所有13个基因至少存在2倍差异并且FDR小于0.02％。与单独使用多西他赛治疗的肿瘤相比，使用多西他赛和A12联合治疗的肿瘤种有9种基因下调，4种基因上调。 对于所筛选的基因，所述结果已被实时RT-PCR验证。纯化目标cDNA的标准PCR片段。将该标准片段进行一系列的稀释，从 10ng/μl至10-3pg/μl并进行实时RT-PCR绘制标准曲线。使用Superscript第一链合成体系(Invitrogen)，用1μg的每一组合并的肿瘤样品总RNA进行cDNA第一链的合成。在含有1μl cDNA第一链、特异性引物组和Lightcycler FastStart DNA Master Plus SYBR Green的20μl反应体系中根据使用说明使用Roche Lightcycler进行实时PT-PCR(Roche，Nutley，NJ)。使用Lightcycler软件v3.5对RT-PCR产物进行解链曲线分析。用琼脂糖凝胶电泳验证扩增量。每一种样品分一式两份进行分析。结果见图4。 
在下调基因中，TUBB表现出多西他赛抗性(Tanaka等.，2004，Int.J.Cancer 111，617-26)并且BIRC 5(存活素)表达量的增加显示出与侵袭性前列腺癌和雄性激素疗法抗性的相关性(de Angelis等，2004，Int.J.Oncol.24，1279-88；Zhang等.，2005，Oncogene 24，2474-82)。此外，TUBB是一种IGF-IR调节基因并参与IGF-IR介导的转化(Loughran et al.，2005，Oncogene 24，6185-93)。在四种上调基因中，IGFBP3表现出对IGF-配体信号转导的抑制作用和对前列腺癌细胞凋亡的诱导作用。(Grimberg等，2000，J.Cell.Physiol.183，1-9)。 
治疗后血清A12的水平。测定接受多西他赛和A12联合治疗的动物血清A12水平。在治疗结束2周后血清A12水平下降了100倍，而且在治疗结束四周后检测到的水平更低(图5)。 
总细胞毒性。测定多西他赛和IMC-A12联合使用的细胞毒性。虽然A12与鼠IGF-IR的交叉反应性大于95％，接受联合药物治疗或接受多西他赛单独治疗的动物与对照荷瘤动物相比并未观察到不正常的日间活动或行为。在任何治疗组中对细胞周期和细胞凋亡的分析均未观察到对肾脏细胞的显著作用(数据未显示)。并未观察到治疗组之间体重的明显差异(图6)。 
抗-IGF-IR抗体疗法治疗骨转移。将前列腺癌细胞直接注入SCID小鼠的胫骨评价抗-IGF-IR抗体疗法对前列腺癌细胞在骨中转移生长的治疗效果。通过这一方法可以直接生成转移性肿瘤而不需依 赖于来自循环的趋化依赖性侵袭。许多细胞系都可用于建立骨转移。这些包括可以引起溶骨性病变的PC-3、LuCaP35和LnCaP细胞，还有可以引起成骨性病变的LuCaP 23.1细胞。 
LuCaP 23.1细胞可以表达IGF-IR，在骨环境中的成活率为～80％并引起成骨性反应。在预实验中，肿瘤胫骨与对照胫骨相比，LuCaP23.1细胞样品表现出骨体积与组织体积比值的显著增加(对照的254-503％，p＝0.024)。胫骨中所有的LuCaP 23.1肿瘤均出现新生的骨小梁，但是正常样品中并未出现，还有大量的肿瘤点取代了正常的骨髓。在一些样品中肿瘤和骨的生长延伸至原始骨之外。去雄之后也观察到LuCaP 23.1样品％BV/TV增加；有肿瘤生长的胫骨％BV/TV为无肿瘤胫骨的212-354％(p＝0.024)。对胫骨内LuCaP 23.1移植物的观察结果表明存在肿瘤细胞激活的骨从头形成。而且，这些肿瘤表现出许多与人成骨细胞转移样品的相似性，包括大量的肿瘤点和矿化骨数量的增加。 
为了评价IMC-A12疗法的有效性，将LuCaP 23.1肿瘤移植入SCID小鼠并每两周检测血清PSA水平以评价肿瘤生长。在移植胫骨肿瘤细胞之前两个星期将所有动物去雄，当血清PSA水平达到5-10ng/ml(表明已形成了肿瘤)时给予实验小鼠IMC-A12。每周三次皮下注射40mg/kg IMC-A12，持续6周。 
使用双X-射线吸光光度法(PIXImus Lunar光密度计)在移植肿瘤时的肿瘤细胞注射位点2.5mm×2.5mm的范围内或对侧胫骨的对应位置测定肿瘤胫骨和无肿瘤的对侧胫骨的骨矿物质密度。通过测定血清PSA水平每两周评价一次损害。当对照组在去雄之后依据血清PSA水平(LuCaP 35＞60ng/ml，LuCaP 23.1＞500ng/ml)判断再次发生了骨损害、X线摄影显示出骨损害或动物情况恶化(comprimise)时将所有动物处死。在处死动物前一个小时注射BrdU以监控肿瘤细胞增殖。处死之前进行X光照相(FaxitronX-ray MX-20)并在处死时测定两边胫骨的BMD。 
Figure G2009101264326D00371
接受IMC-A12治疗的小鼠血清PSA水平显著较低(图7)并且与成骨性转移肿瘤相关的BMD增高也出现了显著降低(表5)。无肿瘤胫骨的BMD测量结果显示IMC-A12疗法并未引起骨密度的降低(骨质疏松)。接受IMC-A12治疗小鼠和未接受治疗小鼠的X光照片表明接受治疗小鼠的肿瘤进程被明显减少或抑制(图8)。 
抗-IGF-IR抗体和多西他赛联合治疗骨转移。在胫骨肿瘤注射两周之前将SCID小鼠去雄。将LuCaP 23.1前列腺癌细胞直接注射入小鼠胫骨以生成骨转移，从而增加成骨性损害。该转移物表达IGF-IR。当血清PSA水平达到5-10ng/ml时表明肿瘤形成，然后将动物随机分成4组。 
两组动物每周腹腔注射三次40mg/kg IMC-A12，持续六周，其中一组每周腹腔注射一次IMC-A12+20mg/kg多西他赛并持续六周，另一组每周腹腔注射三次IMC-A12+10mg/kg多西他赛并持续六周。对照组腹腔注射10或20mg多西他赛并且不使用IMC-A12。 
每周监测动物的PSA测定值。在治疗结束后，继续每周监测动物的PSA测定值直至单独使用多西他赛治疗的动物组出现肿瘤再生。单独使用多西他赛治疗的动物组PSA水平上升(虽然比未治疗动物组的速度更慢)，接受IMC-A12+多西他赛治疗的小鼠中PSA水平停止上升，甚至在某些动物中开始下降。观察结果显示PSA水平持续降低甚至持续至六周治疗结束后。 
如上所示，在移植肿瘤和处死动物时测定BMD，并在处死之前进行X线拍照。接受IMC-A12+多西他赛治疗的动物组BMD增 加很小或没有增加，X线照片显示的成骨细胞活性很小或无。 
抗-IGF-IR抗体和多西他赛联合治疗骨转移。机械消化LuCaP23.1人前列腺肿瘤小块(20-30mm3)。将2-5×105有活力的LuCaP 23.1细胞注射入6-8周大的SCID小鼠胫骨内。将21只小鼠随机分成三组进行研究。注射肿瘤细胞之后每个星期监测一次血清PSA水平。当血清PSA水平达到5-10ng/ml时表明肿瘤开始生长。第一组使用对照生理盐水缓冲液。第二组每周腹腔注射一次20mg/kg多西他赛并持续四周。第三组每周腹腔注射三次40mg/kg多西他赛并持续四周。在所有治疗结束时用Dexa-扫描和X-射线测定BMD以确定治疗引起的效应是成骨性还是溶骨性。 
血清PSA水平受抑制可反应出(图.9a)单独使用多西他赛或联合使用多西他赛和A12都可以抑制LuCaP 23.1肿瘤的生长并且两种治疗之间不存在显著性差异。但是在治疗结束之后，单独使用多西他赛治疗的动物血清PSA水平开始上升，表明肿瘤再次生长；然而在使用联合疗法的动物中观察到对血清PSA水平的持续抑制，表明治疗后肿瘤静止期的延长。血清PSA水平表现出与骨密度(BMD)和X照片所显示的骨肿瘤体积的相关性(图9b)。在第五周，对照组、多西他赛20和多西他赛20+A12治疗组动物的平均骨密度分别为0.112±0.01、0.09±0.02和0.05±0.009(均值±SEM)。在治疗中骨密度表现出明显的降低趋势。 
实施例2 
骨髓穿刺液诱导Akt磷酸化。正常男性捐赠人的骨髓样品由Cambrex(PoieticsTM Donor Program)提供。将样品于1,500rpm离心，分离可溶相与细胞相。将上清依次用0.8μm和0.22μm的滤膜过滤。将50μl的骨髓穿刺液给予1ml培养基中的细胞(1∶20终稀释度)。 
对于血清存在下进行的实验，在暴露于骨髓之前将细胞在含有10％FBS和50μg/ml庆大霉素的DMEM中培养24小时。对于无血清存在下进行的实验(饥饿细胞)用PBS将细胞冲洗两遍，将生长 培养基替换为无血清的DEME并在加入骨髓穿刺液之前将细胞温育4小时。使用时，在加入骨髓穿刺液之前向培养基中加入一种PDGF受体的特异性抑制剂AG-1296(Rice等.，1999，Amer.J.Path.155，213-21)。在预实验时按照下述方法加入IMC-3G3抗体。 
在表达FDGFRα的PC3-ML细胞中检测到骨髓穿刺液对Akt的激活作用，但是在缺乏该受体的DU-145细胞中未检测到。在一例实验中为了将血清组分对Akt的激活作用最小化，将细胞在不含血清的培养基中预培养4小时。加入骨髓穿刺液引起PC3-ML细胞中强烈的Akt磷酸化，但是在DU-145细胞中没有引起这样的效应(图.10A)。为了评价该效应的显著性，在血清存在下进行第二次实验。在血清存在的条件下也观察到了PC3-ML细胞中强烈的Akt磷酸化(图.10B)。而DU-145细胞中引发的效应很小。 
PDGFRα介导的Akt磷酸化。成骨细胞和破骨细胞都分泌PDGF-AA和PDGF-BB，它们在骨髓的可溶性环境中提供这些生长因子。为了确定PC3-ML细胞对骨髓穿刺液的反应性是否与经PDGFRα的信号转导有关，在存在或不存在20μM AG-1296的条件下在PC3-ML细胞中加入骨髓穿刺液。这一浓度的AG-1296可以完全抑制PDFG-BB诱导的Akt激活(图11A)。AG-1296对骨髓穿刺液诱导的Akt激活的抑制大于40％(图11B和D)。这表明PDGFRα信号转导与骨髓诱导的Akt激活有显著关系。 
评价PDGF-AA和BB对与骨髓穿刺液其他成份相关的PDGFRα信号转导的直接作用。经测定，三位不同捐赠者骨髓穿刺液中PDGF-AA和BB的浓度在400pg/ml至2ng/ml的范围内。如果将骨髓穿刺液稀释20倍，那么被检测细胞事实上暴露于浓度范围在20至100pg/ml的PDGF-AA和BB中。因此，用100pg/ml的PDGF-AA和-BB处理PC3-ML细胞。Akt磷酸化程度小于骨髓穿刺液诱导的磷酸化程度的10％。(图3C和D)因此，PDGFRα信号转导对Akt途径的激活可能涉及到PDGFRα配体而不是PDGF-AA和 -BB和/或其他机制而不是通过配体直接结合激活PDGFRα。 
一种抗-PDGFRα抗体对Akt磷酸化的抑制。具有中和作用的抗体IMC-3G3对人PDGFRα具有特异性，检测该抗体对PC3-ML细胞中Akt磷酸化的抑制。30分钟预温育和20μg/ml的浓度可以中和30ng/ml PDGF-BB的刺激作用(图.12A)。使用该抗体进行治疗也可以将骨髓诱导的Akt磷酸化抑制约40％(图.12B和C)。同时也发现IMC-3G3对Akt磷酸化的抑制作用依赖于预温育的时间，温育120分钟(图12D)比30分钟(图.12B和C)效果更加显著。这一现象可能的一种解释就是IMC-3G3诱导PDGFRα内化，其抑制作用不仅与阻断配体结合相关而且与消除细胞膜受体相关。 
实施例3 
分离纯化人抗PDGFRα抗体。通过标准杂交瘤技术(Harlow&Lane，ed.，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，211-213(1998)，在这里被完整引用)使用表达人免疫球蛋白γ重链和κ轻链的转基因小鼠(Medarex Inc.，Sunnyvale，CA)生产人抗PDGFRα抗体。人PDGFRα胞外域(ECD)购自R&D Systems(Minneapolis，MN)。用数量为3×107稳定表达PDGFRα(PAE Ra)的猪主动脉内皮细胞皮下免疫(s.c)KM小鼠。四周后使用完全弗氏佐剂皮下注射50μg PDGFRαECD和腹腔注射3×107PAE Ra以强化免疫。使用完全弗氏佐剂注射25μgPDGFRαECD继续免疫强化两次，间隔三周。 
分离具有高血清结合和阻断滴度的小鼠脾细胞并与骨髓瘤细胞融合。亚克隆培养具有阻断活性的杂交瘤培养物并使用G蛋白色谱仪纯化这些杂交瘤的抗体。 
在直接结合分析中评价IgGs与PDGFRα的结合力。将PBS溶液中的PDGFRαECD固定于96孔板中(100ng/孔)。用PBST(PBS+0.05％吐温)洗板并用PBSM(含有3％牛奶的PBS，200μL/孔)于25℃下封闭2小时。将用PBSM稀释的IgGs与固定化PDGFRαECD于25℃下温育1小时并用PBST洗板。将二抗(羊F(ab′)2抗人 IgG-辣根过氧化物酶结合物(BioSource International，Camarillo，CA)用PBSM以1∶5000稀释，在25℃下加入1小时。用PBST洗板后加入TMB过氧化物酶底物(KPL，Gaithersburg，MD)，用100μL 1mol/LH2SO4终止反应。用酶标仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在A450处读板。 
用固相PDGF阻断分析法评价PDGF阻断(见Duan等，1991，J.Biol.Chem.266：413-8，在这里被完整引用)。用PBS稀释PDGFRαECD并涂布在96孔微量滴定板中(Immulon 2HB平底1×12Removawell放射蛋白结合聚苯乙烯条；Dynex Technologies，Chantilly，VA)。25℃下，每一个孔包被60ng PDGFRα，持续3小时，总体积为100μL。洗板两次并用25mmol/L HEPES(pH 7.45)、0.5％明胶、100mmol/L NaCl和0.1％吐温20于4℃封闭过夜。将滴定板升温至25℃并维持20分钟，然后用结合缓冲液(25mmol/LHEPES(pH7.45)、0.3％明胶、100mmol/L NaCl、0.01％吐温20)洗板一次。在每一个孔中加入50μL的IgGs并于25℃温育30分钟。用结合缓冲液稀释碘化PDGF并在每一孔中加入50μL1nmol/L的溶液。将滴定板于25℃温育2小时，然后用结合缓冲液洗5次。用γ计数器对每一孔进行计数。根据Heldin等，1988，EMBO J.7，1387-93中描述的方法进行基于细胞的阻断分析。 
用BIAcore 3000instrument(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)测定抗体与PDGFRα结合的动力学。将PDGFRαECD固定于传感芯片上并注射不同浓度的抗体。得到每一浓度下的感应图谱并使用程序BIAEvaluation 2.0进行评价以测定速率常数。根据速率常数Koff/Kon的比值计算亲和常数Kd。 
图13表示ELISA实验中人单克隆抗体IMC-3G3与固定化PDGFRαECD的剂量依赖型结合。达到最大PDGFRαECD结合50％的抗体浓度为0.06nmol/L(表6)。BIAcore instrument表面等离子体共振检测表明ED50与抗体的Kd一致。所述单克隆抗体也可以阻断 [125I]PDGF-BB与固定化受体的结合，IC50为0.43nmol/L。PDGFRα上与PDGF-AA和PDGF-BB的结合位点在结构上不是共存的。所得数据显示3G3的表位在空间上与两种生长因子的结合位点重叠。 
Figure G2009101264326D00421
受体磷酸化的抑制和下游效应器分子的激活。用PAE Ra细胞测定IMC-3G3对PDGF诱导的胞内信号转导的作用。将细胞接种至6孔Falcon组织培养板(每孔含有细胞250000个)并过夜培养。然后用无血清培养基润洗并温育。过夜培养之后使细胞处于休眠状态，用抗体于37℃处理细胞30分钟然后加入PDGF-AA或PDGF-BB并在37℃下继续温育10分钟。将细胞脱离并溶解于200μL的裂解缓冲液中(50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、1％Triton X-100、150mmol/LNaCl、1mmol/L EDTA、0.1％SDS、1mmol/L原钒酸钠和蛋白酶抑制剂(Complete Mini，Roche，Mannheim，Germany))。用SDS-PAGE和蛋白质印迹法(使用增强化学发光试剂和Hyperfilm(AmershamBiosciences))分析细胞裂解物。 
检测抗体对配体诱导的受体酪氨酸磷酸化的抑制能力。浓度分别为1和3nmol/L的PDGF-AA和PDGF-BB可以将PDGFRα酪氨酸磷酸化增强5倍。更高浓度的配体(10nmol/L)会导致更少的受体磷酸化，这可能是由于配体诱导的降解作用。被抗体抑制的PDGF-BB-诱导的受体与背景水平接近(图14A，顶行)。用PDGF-AA诱导受体磷酸化得到相似的数据。 
PDGFs转导丝裂信号并通过下游效应器蛋白发挥对表达相应受体细胞的抗凋亡作用。因此，测定单克隆抗体对MAPKs p44/p42和Akt(分别参与细胞生长和抗凋亡途径)的抑制。抗-PDGFRα抗 体响应PDGF-BB(图.2A)和PDGF-AA(未显示)，抑制MAPKs和Akt两者的磷酸化。对PDGFRα磷酸化的抑制不是剂量依赖型，0.25nmol/L可以达到50％的抑制率(图.14B)。 
抗促细胞分裂活性。测定抗-PDGFRα抗体阻断PDGFAA诱导的PAE Ra细胞有丝分裂的能力。将细胞接种至96孔组织培养板(每孔含有1×104个细胞)并在每孔加入100μL的培养基过夜培养。用无血清培养基润洗培养孔并在每个孔中加入75μL无血清培养基使细胞血清饥饿过夜。加入IgG(25μL/孔)并将培养板置于37℃下温育30分钟。加入PDGF-AA或PDGF-BB(25μL/孔)并将培养板置于37℃下温育18-20小时。向每个孔中加入0.25μCi[3H]胸腺嘧啶核苷(25μL/孔)后将培养板继续温育4小时。用无血清培养基稀释抗体、PDGF和[3H]胸腺嘧啶核苷。用含有1％牛血清白蛋白的PBS冲洗细胞然后用胰蛋白酶(100/xL/孔)处理使细胞脱离。用MACH III细胞收集器将细胞收集至滤器中并用双蒸水洗涤三次(Tomtec，Inc.，Hamden，CT)。对滤器进行处理后在闪烁计数器(Wallac Microbeta，model 1450)上测定DNA的掺入放射活性。 
向血清饥饿的PAE Ra细胞中加入IMC-3G3可以特异性抑制PDGF-AA诱导的胸腺嘧啶核苷掺入(图15)，EC50为8.3nmol/L。该抗体还可以抑制3nmol/L PDGF-BB-诱导的PAE Ra细胞有丝分裂，EC50为1.25nmol/L(数据未显示)。 
表达PDGFRα的人肿瘤细胞系的生长抑制。检测表达PDGFRα的人肿瘤细胞系以测定人抗-PDGFRα抗体对体内和体外系统恶性增长的作用。经流式细胞仪测定，两种表达PDGFRα的肿瘤细胞系分别是SKLMS-I(平滑肌肉瘤)和U118(成胶质细胞瘤)。这些细胞系也可以响应有丝分裂检测中的配体并可以在小鼠中形成肿瘤。SKLMS-I既可以旁分泌激活也可以自分泌激活。定量三明治酶免疫测定法(R&D Systems)显示SKLMS-I在培养基中生长时会表达PDGF-AA。 
从图16A中可以看出PDGF-AA刺激SKLMS-I细胞后，引起IMC-3G3抑制Akt和MAPKs的磷酸化。对Akt磷酸化的抑制为100％，对MAPKs的抑制为80％。该抗体也可以有效抑制U118细胞中的磷酸化。配体诱导的肿瘤细胞的有丝分裂也被阻断。向血清饥饿的U118细胞中加入抗-PDGFRα抗体时PDGF-AA诱导的胸腺嘧啶核苷掺入被特异性抑制(图17A)，EC50为3.4nmol/L。该抗体还可以抑制PDGF-AA-诱导的SKLMS-I细胞的促有丝分裂反应(图17B)，EC50为5nmol/L，以及PDGF-BB刺激的促有丝分裂反应(图17C)。在U118细胞中只观察到对PDGF-BB诱导的促有丝分裂反应的部分抑制作用(66nmol/L为40％；图17D)。这是由于这些细胞表达PDGFRα和PDGFRβ两者(数据未显示)。 
对肿瘤移植物生长的抑制。在无胸腺裸鼠成胶质细胞瘤(U118)和平滑肌肉瘤(SKLMS-I)皮下移植模型中对IMC-3G3进行体内检测。通过向雌性无胸腺裸鼠(Crl：NU/NU-nuBR，Charles RiverLaboratories，Wilmington，MA)注射与基质胶(Collaborative ResearchBiochemicals，Bedford，MA)混合的10×106SKLMS-1或U118细胞进行皮下肿瘤移植。允许肿瘤的平均体积(π/6×最长长度×垂直宽度2)达到约400mm3。将小鼠随机分成5组(n＝12)并每周进行两次腹腔注射。第一组动物为溶剂对照组(0.9％NaCl，USP for Irrigation，B/Braun)。第2至4组动物接受6、20和60mg/kg恒定抗-PDGFRα抗体的治疗。第5组小鼠接受60mg/kg人IgG(Sigma)的治疗。接受6、20或60mg/kg抗-PDGFRα抗体或人IgG治疗的小鼠组的负荷剂量分别为21.4、71.4和214mg/kg。计算负荷剂量，使按照每周两次的给药方案从第一次给药(消除半衰期为7天)开始就可以达到稳态血药浓度。每两周测定一次肿瘤体积并通过重复测量ANOVA将治疗组的肿瘤生长进行比较。 
如图18.A所示，与盐溶液处理(P＝0.74)的小鼠相比，人IgG对成胶质细胞瘤的生长没有作用，然而剂量为6(P＝0.06)、20(P＝ 0.03)和60(P＝0.0004)mg/kg的抗-PDGFRα抗体显著抑制了肿瘤的生长。在U118研究结束时，6、20和60mg/kg 3G3处理组的％T/C值[(研究结束时3G3处理组的平均肿瘤体积/治疗开始时的平均肿瘤体积)/(研究结束时对照处理组的平均肿瘤体积/治疗开始时的平均肿瘤体积)×100]分别为67％、63％和35％。而且在6、20和60mg/kg3G3处理组中分别在12只小鼠中的4只、11只中的5只和12只中的11只中观察到肿瘤退化。在所有对照组中都没有出现退化。 
图18B表明6(P＝0.02)、20(P＝0.003)和60(P＜0.0001)mg/kg的治疗显著抑制了平滑肌肉瘤的生长。6、20和60mg/kg治疗组的最终％T/C值分别为66％、57％和31％并且没有肿瘤退化。 
治疗结束时对移植物的组织学检查表明接受对照治疗的动物组肿瘤与接受治疗的动物肿瘤存在显著差异。将切除的肿瘤于4℃在QDL固定剂中固定24小时。用石蜡包埋后切成4μm的薄片，用Mayer′s H&E(Richard Allen，Kalamazoo，MI)染色福尔马林固定的样品。 
与盐溶液-对照组相比，用最高剂量(60mg/kg)治疗的U118组中有活力的肿瘤细胞更少并且存在更多的细胞疏松区域(图.18C)。与盐溶液-对照组相比，被治疗的SKLMS-I移植物在第25天也出现有活力肿瘤细胞数量和细胞填充的减少。 
对PDGFRα介导的成胶质细胞瘤系激活的体外抑制。在使用抗PDGFRα抗体或人IgG抗体进行治疗前一周评价U118细胞中受体的磷酸化水平。U118肿瘤(500mm3)小鼠接受治疗的负荷剂量为214mg/kg抗体，72小时之后再给予60mg/kg维持剂量的抗体。第一次注射抗体一周(168小时)后(在未观察到肿瘤退化之前；见图18A)从小鼠体内收获肿瘤并在磷酸化检测裂解缓冲液(见上述内容)中进行均质处理。将裂解物14000rpm离心两次并测定所收集上清中的蛋白质浓度(Bio-Rad protein assay，Bio-Rad，Hercules，CA)。将每一份样品的裂解物(4mg)用抗-PDGFRα抗体进行免疫沉淀。然后使免疫沉 淀后的人PDGFRα与抗PDGFRα抗体或抗磷酸酪氨酸抗体形成免疫印迹。图19表示在这些肿瘤中，与人IgG对照组相比给予抗-PDGFRα抗体引起PDGFRα磷酸酪氨酸水平的降低。 
细胞系工程。首先，克隆编码人抗-PDGFRα抗体重链和轻链可变区的基因并测序。从MEDAREX获得可以与来源于MEDAREX的杂交瘤中的人免疫球蛋白可变区序列的5’和3’侧翼序列退火结合的引物系列。引物对AB88(正向)和AB90(反向)用于扩增重链可变区(表7)。包括正向引物AB182和反向引物AB16的引物对(表7)可用于扩增轻链产物。将这些反应的0.4kb产物克隆在载体ZeroBlunt(Invitrogen)中以生产AB88-1(VH)和AB 182-3(Vκ)，所插入序列可使用通用引物T7和M13R进行测序。 
Figure G2009101264326D00461
为了得到表达完整IgG1抗体的质粒载体，通过PCR扩增已克隆的可变区并通过两步联接形成包括恒定区基因在内的表达载体。初次PCR扩增重链时使用25ng的质粒AB88-1作为引物IPHF5(正向)和IPHR5(反向)的模版。二次PCR扩增重链时使用5μl的初次反应液作为模版和引物OPSIF和IPHR5。两个正向引物联合使用可以在编码含有19个氨基酸的鼠重链基因信号序列(MGWSCIILFLVATATGVHS；SEQ ID NO：24)的免疫球蛋白基因的5’端增加57个碱基对，使免疫球蛋白可以被有效处理和分泌。此外，正向引物OPSIF可以增加一个共有″Kozak″序列(J MoI.Biol.196：947)，使得这些基因在哺乳动物细胞中可以被有效翻译，还可以增加一个5′HindIII限制性内切酶位点克隆被扩增产物至适当的载体中。重链反向引物包括结构内Nhel位点，用于克隆入恒定区载体。 
根据使用说明使用Expand PCR kit(Boehringer Mannheim Inc.)中的Expand Buffer system#3在50μl的反应体系中根据下列循环条件进行PCR： 一次循环    94°2分钟 五次循环    94°20秒             48°60秒             68°2分钟 20次循环    94°20秒             65°60秒             68°2分钟1次循环     68°5分钟 经过两轮PCR之后纯化产物并进行琼脂糖凝胶电泳，将HindIII-Nhel消化后的片段克隆至载体pDFc(图.8)，该载体含有人γ1恒定区。 
第一次PCR扩增轻链使用25ng的pAB182-3质粒作为模版引物IPLF4(正向)和IPLR2(反向)。第二次PCR扩增轻链使用5μl的初级反应液作为模版和引物OPSIF和IPLR2。对于重链而言，两个正向引物提供分泌信号序列。轻链反向引物包括一个结构内BsiWI位点用于克隆进入κ恒定区载体pLck(图.8)。根据上述重链扩增方法进行PCR反应。经过两轮PCR之后，纯化产物并进行琼脂糖凝胶电泳，将产物克隆至pLck，该载体含有人κ轻链恒定区。 
为了得到可以稳定转染的单个质粒载体，将含有CVM启动子、重链编码区和polyA元件的重链表达盒作为Notl-Sall消化片段(图20)克隆至轻链载体。 
这一构建体可用于在骨髓瘤细胞系NSO细胞中产生可以稳定生产的细胞系。用BioRad Gene Pulser II进行电穿孔并用表达质粒转染NSO细胞。在转染之前，用PvuI将质粒DNA线性化，乙醇沉淀并重悬成浓度为0.4mg/ml的溶液(100ul dH2O中含有40ug)。使用250伏400μFd单脉冲将细胞与40ugDNA在800ul的终体积内电穿孔。将电穿孔后的细胞分散在含有10％经过透析的小牛血清(dFCS)(Hyclone，Lot#：AHA7675)和2mM谷氨酰胺(Invitrogen/LifeTechnologies)的DEME培养基(JRH Biosciences Inc.)中的50ul等分试样中，移入大约18个96空板的孔中，每孔密度为5,000-10,000个细胞。24小时之后通过加入不含谷氨酰胺但是含有10％小牛血清(dFCS)和补充有Ix GS supplement(JRH Biosciences Inc.)的DEME开始筛选谷氨酰胺合成酶(GS)阳性转化子。将细胞在37℃下培养2-4周，5％的CO2可以使菌落生长并扩张。用抗-人Fc(γ)ELISA(辣根过氧化物酶于A450nm处检测)筛选了300多个克隆。扩增表达抗体的克隆(58％)并检测经过3-5天培养后的生产力。通过在每次传代时加入相等体积的无血清GS-OS培养基扩增阳性细胞系使细胞适应无血清培养基。扩增经过三天亚融合(sub-confluent)24孔培养后可以生产25ug/ml或更多的强阳性细胞用于进一步的分析使其完全适应无血清培养基。 
应当理解和预见的是本专业领域技术人员可以生产本发明中公开的任何原理的变体，而这些修改都属于本发明的范畴。 序列表
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Claims (5)

1.用作治疗继发性骨肿瘤患者的药物的抗体，其中所述抗体对人PDGFRα是特异性的，并且其中所述抗体的CDRH1的序列为SSSYY(SEQ ID NO：2)；所述抗体的CDRH2的序列为SFFYTGSTYYNPSLRS(SEQ ID NO：4)；所述抗体的CDRH3的序列为QSTYYYGSGNYYGWFDR(SEQ ID NO：6)；所述抗体的CDRL1的序列为RASQSVSSYLA(SEQ ID NO：10)；所述抗体的CDRL2的序列为DASNRAT(SEQ ID NO：12)；并且所述抗体的CDRL3的序列为QQRSNWPPA(SEQ ID NO：14)。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含重链可变域或轻链可变域，其中重链可变域由：
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSSSYYWGWLRQSPGKGLEWIGSFFYTGSTYYNPSLRSRLTISVDTSKNQFSLMLSSVTAADTAVYYCARQSTYYYGSGNYYGWFDRWDQGTLVTVSS(SEQID NO：8)组成；
轻链可变域由：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPAFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：16)组成。
3.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含重链可变域和轻链可变域，其中重链可变域由：
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSSSYYWGWLRQSPGKGLEWIGSFFYTGSTYYNPSLRSRLTISVDTSKNQFSLMLSSVTAADTAVYYCARQSTYYYGSGNYYGWFDRWDQGTLVTVSS(SEQID NO：8)组成；
轻链可变域由：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPAFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：16)组成。
4.权利要求3的抗体，其中所述抗体由重链和轻链组成，其中重链由：
MGWSCIILFLVATATGVHSQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSSSYYWGWLRQSPGKGLEWIGSFFYTGSTYYNPSLRSRLTISVDTSKNQFSLMLSSVTAADTAVYYCARQSTYYYGSGNYYGWFDRWDQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：31)组成；
轻链由：
MGWSCIILFLVATATGVHSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPAFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：33)组成。
5.权利要求1-3中任一项的抗体，其中所述肿瘤转移自前列腺癌、乳腺癌或肺癌。
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