KR20090027773A - 전이성 골암 치료를 위한 수용체 길항제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 IGF-ⅠR 길항제 및/또는 PDGFRα 길항제를 투여함으로써 골암, 특히 전이성 골암 치료의 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 인간 PDGFRα에 결합하여 수용체의 활성을 중화시키는 항체들을 제공한다. 본 발명은 나아가 항체만 또는 다른 제제와의 조합으로 사용하여 PDGFRα의 활성화를 중화시키는 방법, 및 종양성 질병을 가진 포유류를 치료하는 방법을 제공한다.

IGF-ⅠR길항제, PDGFRα 길항제, 항체, 항체 단편, 항암

Description

전이성 골암 치료를 위한 수용체 길항제 {RECEPTOR ANTAGONISTS FOR TREATMENT OF METASTATIC BONE CANCER}

이 출원은 미국 가 출원 제 60/691,920호의 이익을 주장한다.

본 발명은 IGF-IR 길항제 및/또는 PDGFRα 길항제를 투여함으로써 골암 치료, 특히 전이성 골암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 인간 PDGFRα에 결합하여 그 수용체의 활성을 중화시키는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 나아가 PDGFRα의 활성을 중화시키는 방법, 및 항체만을 사용하거나 다른 제제와 조합하여 사용함으로써 종양성 질병을 가진 포유류의 치료방법을 제공한다.

전립선암은 남성들에게 가장 흔한 암으로서, 미국에서 연간 약 220,000명의 환자와 29,000명의 사망자를 낳고 있다. 전립선암으로 진단된 남성의 대다수가 전이성 질환을 보인다. 나아가 많은 다른 전립선암 환자에 있어서 수술 또는 방사선 치료에도 불구하고 전이상태는 결국 발전한다. 뼈는 전립선암 전이의 가장 흔한 병소일 뿐만 아니라 유방암과 폐암이 전이되는 가장 흔한 장소이다. 대부분의 전립선암 전이는 안드로겐-의존적(androgen-dependent)이므로, 외과적 또는 내과적 거세로 빠른 효과를 보이나, 실질적으로 모든 환자에 있어서, 종양은 결국 안드로겐-비 의존적(androgen-independent)이 되어, 높은 사망률을 보인다. 한번 골 전이가 일어나면, 현재로서 가능한 치료로는 한계가 있다. 전림선암 전이에 있어서 가장 효과적이라 인정된 치료(도세탁셀(docetaxel)의 투여)로도 약 3개월의 평균수명을 연장하는 효과밖에 없다(Petrylak et al., 2004, N. Engl. J. Med. 351:1513; Tannock et al.,2004,N. Engl. J. Med. 351:1502). 따라서, 전이성 골암의 새로운 치료법이 시급히 요구된다.

IGF-IR(The insulin-like growth factor receptor)은 유비쿼터스 막횡단 타이로신 키나제 수용체(ubiquitous transmembrane kinase receptor)로서, 태아와 산후 성장 및 발달에 중요한 역할을 한다. IGF-IR은 대부분의 세포 타입의 표면에 존재하며, 성장인자(growth factors) IGF-Ⅰ과 IGF-Ⅱ를 위한 시그널링 분자(signaling molecule)로서 작용한다(이들은 이후 IGFs로 통칭된다).IGF-IR은 세포 증식및 분화를 촉진할 수 있고, 세포 크기를 변화시키며, 세포사멸로부터 세포를 보호할 수 있다.또한 세포 형질전환(cell transformation)을 위한 쿼시-오블리게이토리(quasi-obligatory)로 여겨지고 있다(reviewed in Adams et al., Cell. Mol. Life Sci. 57:1050-93(2000); Baserga, Oncogene 19:5574-81(2000)). 전립선암 골전이 조직 샘플에서 IGF-IR가 높은 수준으로 발현된다고 보고되고 있다. 뼈는 몸속에서 IGFs의 가장 큰 저장소이다.

IGF-IR은 두개의 알파체인과 두개의 베타체인을 갖는 미리-형성된 헤테로 테트라머 로서, 이황화결합으로 공유결합되어 있다. 이 수용체 소단위체들(subunits)은 180kd의 단일 폴리펩티드 체인의 한 부분으로 합성되는데, 그 후 단백질 가수분해 과정을 거쳐 알파(130kd)와 베타(95kd) 소단위체가 된다. 알파 체인 전체는 세포밖에 존재하며 리간드(ligand) 결합 부위를 포함하고 있다. 베타 체인은 막횡단 도메인(transmembrane domain), 타이로신 키나제 도메인(tyrosine kinase domain)과 세포 분화 및 형질전환에 필수적인 C-말단 익스텐션(C-terminal extension)을 가지고 있으나, 이는 미토겐 시그널링(mitogen signaling)과 세포사멸로부터 보호하는데 까지 필요한 것은 아니다.

IGF-IR은 IR(insulin receptor)과 매우 유사하며, 특히 베타 체인 서열에서 그렇다(70%의 상동성(homology)). 이러한 상동성에 기인하여, 최근 연구는 이러한 수용체가 하나의 IR 이합체와 하나의 IGF-IR 이합체를 포함한 하이브리드(hybrids)를 형성할 수 있다는 것을 보여주고 있다(Pandini et al., Clin. Canc. Res. 5:1935-19(1999)). 하이브리드의 형성은 정상과 형질전환된 세포 모두에서 일어나고, 하이브리드의 양은 세포 내 두 호모다이머(homodimer) 수용체들(IR과 IGF-IR)농도에 의해 결정된다. 하이브리드 수용체들은 IR과 IGF-IR 쌍으로 구성되지만, 이러한 하이브리드들은 IGF-IR의 그것과 유사한 높은 친화력을 갖는바, IGFs에 선택적으로 결합하고, 인슐린(insulin)과는 약하게 결합할 뿐이다(Siddle and Soos, The IGF System. Humana Press. pp. 199-225.(1999)). 그러므로 이러한 하이브리드들은 IGFs에 결합할 수 있고 정상 및 형질전환된 세포들 모두에서 신호를 변환할 수 있다.

두번째 IGF 수용체, IGF-ⅡR, 즉 M6P(mannose-6-phosphate) 수용체는, IGF-Ⅱ 리간드와 높은 친화력을 가지고 결합하나, 타이로신 키나제 활성이 결여되어있다(Oates et al., Breast Cancer Res. Treat. 47:269-81(1998)). 이는 IGF-Ⅱ의 분해를 초래하기 때문에 IGF-Ⅱ에 대한 하수구(sink)로 여겨지며, 이 리간드의 성장 촉진 효과를 상쇄시킨다. 종양 세포에서 IGF-ⅡR의 손실은 IGF-ⅠR에 IGF-Ⅱ가 결합되는 결과를 가져오는 바, 그 길항 효과로 인해 종양 세포의 잠재적 성장능력을 증가시킬 수 있다(Byrd et al., J. Biol. Chem. 274:24408-16(1999)).

PDGFRα와 PDGFRβ(혈소판 유래 성장인자 수용체 알파 및 베타: Platelet-derived growth factor receptors alpha and beta)는 타입 Ⅲ 수용체 타이로신 키나제(type Ⅲ receptor tyrosine kinases)이다. PDGFRα는 발달에 필수 불가결하며, 성인기에서 중요한 기능을 수행한다. 예를 들어 눌 돌연변이(null mutation)시킨 동형접합성(homozygous) 쥐는 배분화(embryogenesis) 과정에서 사멸한다. 그 이후의 발달 단계에 있어서, PDGFRα는 많은 간엽 구조(mesenchymal structures)에서 발현되는데 반하여, 상피 근처의 세포들(adjacent epithelial cells)은 PDGFs(platelet derived growth factors)를 생산한다. 정상 조직 또는 전립선 세포 과형성(hyperplastic prostate glands) 조직 샘플은 PDGFRα에 음성 반응을 보인다. 반면 1차 전립선 종양과 부합하는 대상으로부터의 골격질량은 PDGFRα를 발현 시킨다. 나아가 서로 다른 전이성 병소로부터 수득된 전립선 세포주(cell line)의 PDGFRα는 골 전이-유도된 PC3 세포에서 발견되나, 림프절(LNCaP)과 뇌(DU-145) 전이로부터 수득한 모든 세포주에서 발견되는 것은 아니다.

성장인자인 PDGF군은 5개의 서로 다른 이황화 결합으로 연결된 다이머들 PDGF-AA, -BB, -CC, 및 -DD로 구성되는데, 이들은 PDGFRα 및 PDGFRβ를 통해 작용한다. 이러한 성장인자들은 이황화 결합으로 연결된 폴리펩티드 체인들로 구성된 이합체 분자들인데, 이들은 동시에 두 수용체에 결합하여, 수용체의 이량체화 (dimerization), 자가인산화 (autophosphorylation), 및 세포 내 시그널링(intracellular signaling)을 유도한다. PDGFRα와 PDGFRβ는 구조적으로 유사하며, 호모다이머(homodimer) 뿐만 아니라 헤테로다이머(heterodimer)도 형성할 수 있다. PDGFRβ는 PDGF-A 체인과 잘 결합하지 않기 때문에, PDGF-AA는 오직αα수용체 다이머를 활성화시키는 반면, PDGF-AB와 PDGF-CC는 αα와αβ 수용체 헤테로다이머를 활성화시킨다.

본 발명의 목적은 IGF-ⅠR 길항제 및/또는 PDGFRα 길항제를 투여함으로써 골암, 특히 전이성 골암 치료의 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 또한 인간 PDGFRα에 결합하여 수용체의 활성을 중화시키는 항체들을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 항체만으로 또는 다른 제제와의 조합으로 사용하여 PDGFRα의 활성화를 중화시키는 방법, 및 종양성 질병을 가진 포유류를 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 초기 및 전이성 골 종양의 치료와 관련된 것으로써, 전립선, 유방, 또는 폐에서 기인하여, IGF-IR(insulin-like growth factor-Ⅰ receptor) 및/또는 PDGFRα(the alpha platelet derived growth factor receptor)의 발현시키는 종양을 포함한다. 치료된 종양은 안드로겐-의존적 호르몬 또는 안드로겐-비의존적 호르몬일 수 있는데, 이러한 종양의 예를 들면, 전립선, 유방 또는 폐에서부터 기원한 것일 수 있다.

본 발명은 골 종양을 가진 대상을 치료하는 방법과 골 종양의 성장을 저해하는 방법에 관한 것이다. 이는 IGF-IR 길항제의 유효량 또는 PDGFRα 길항제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법이다. 수용체 길항제는 세포내 소분자 억제제 뿐만 아니라 항체 및 항체 단편을 포함한다.

본 발명은 표적 수용체(target receptor)와 결합하여, 리간드 결합을 억제하는 항 IGF-ⅠR(anti-IGF-ⅠR)과 PDGFRα항체에 대한 것이다. 본 발명은 또한 IGF-ⅠR또는 PDGFRα의 활성을 중화시키는 다른 길항제와 항체들을 제공한다. 나아가 특정 항체는 그들은 표적 수용체의 하향-조절(down-regulation)을 촉진하는데, 그 예로 내부이행(internalization)과 분해(degradation)를 들 수 있다. 따라서, 항체와 소분자 길항제들은 Akt, p42/p44와 MAPK와 같은 다운스트림 신호전달분자(downstream signaling molecules)의 활성을 억제하는 기능을 한다.

본 방법은 IGF-ⅠR 또는 PDGFRα 길항제를 단독으로 사용하는 방법뿐 아니라, 그들 서로 간의 조합 또는 화학치료요법과 방사선 같은 다른 암 치료요법에의 사용을 포함한다.

본 발명은 항체의 생산을 위한 숙주 세포 및 뉴클레오티드 뿐만 아니라 PDGFRα과 결합하는 항체 및 항체 단편을 제공한다. 이러한 항체들은 리간드 결합을 막고, 수용체 활성을 중화시킨다. 본 발명은 또한 항체 단독의 사용뿐만 아니라 다른 수용체 길항제 또는 항신생물제와 결합하여 사용하는 경우, 종양 질병의 치료를 위해 복합적으로 사용하는 경우를 포함한다. 항-PDGFRα 항체는 예를 들어 난소 종양(ovarian tumors), 유선종양(breast tumors), 폐 종양(lung tumors), 간세포 종양(hepatocellular tumors), 위장관 기질 종양(gastrointestinal stromal tumors), 흑색종(melanomas), 신장 세포 암(renal cell carcinomas), 전립선 종양(prostate tumors), 연조직 육종(soft tussue sarcomas)등의 치료에 사용된다.

본 발명은 인슐린 유사 성장인자 Ⅰ 수용체(IGF-ⅠR(insulin-like growth factor-Ⅰ receptor))에 결합하는 항체 또는 항체 단편을 사용한 골 종양의 치료에 관한 것이다. IGF-Ⅰ의 내분비 발현은 주로 성장 호르몬(growth hormone)에 의해 조절되며, 간에서 생성되나, 성장 인자의 커다란 저장소인 뼈를 포함한 다른 타입의 조직에서도 IGF-Ⅰ이 발현될 수 있다. 종양 세포 타입에 따라 다르지만, IGF-Ⅰ은 엔도크린(endocrine), 파라크린(paracrine), 오토크린(autocrine) 조절을 포함한다.

IGF-ⅠR과 결합하는 항체가 발견되고 있는데, 이는 IGF-ⅠR를 발현하는 골 종양의 치료에 매우 유용하다. 항체는 단독으로 사용되기도 하고, 다른 암 치료요법, 특히 화학요법과 함께 사용될 수 있다. 항-IGFⅠR 치료는 단독으로 또는 하나 또는 그 이상의 항신생물제(예를 들면 화학요법 또는 방사선 치료)와 병용하여 사용되는데, 이는 치료적 효과가 매우 뛰어나다. 종양의 성장 억제는 많은 경우에 있어서 세포사멸의 증가를 수반하며 모든 치료가 끝난 후에도 지속되나, 화학요법 단독으로 치료한 동물에서는 종양이 다시 성장하기도 한다.

PDGFRα가 골 종양의 성장에 매우 중요한 역할을 수행한다는 사실이 알려지고 있다. 예를 들어, PDGFRα을 발현하는 특정 종양 세포 주는 우선적으로 뼈로 전이된다. 이러한 세포주는 PDGFRα 활성을 증가시키고, 골수(bone marrow)에 존재하는 수용 인자들(soluble factors)에 반응하는 다운스트림 신호분자의 인산화를 증가시킨다. PDGFRα 길항제에 의해 골수에 의한 PDGFRα의 활성은 감소되거나 완전히 억제되고, PDGFRα와 다른 수용체 타이로신 키나제 시스템을 통한 시그널링에 의해 일반적으로 활성화되는 다운스트림 신호분자의 인산화도 감소 또는 완전히 억 제된다.

특정 데이타는 PDGFRα 신호에 의한 PI3K/Akt 생존경로(PI3K/Akt survival pathway)의 활성화를 암시하는데, 이러한 PDGFRα신호는 PDGFRα를 직접적으로 활성화하는 리간드에 의한 신호뿐만 아니라, 수용체의 교차활성(transactivation)을 야기하는 골수 내의 다른 인자에 의하기도 한다.

본 발명의 치료에 의하는 1차 골 종양은 골육종(osteosarcomas), 연골육종(chondrosarcomas), 섬유종(fibrosarcomas), 혈관종(hemangiosarcomas) 등을 포함하며, 이는 특정 골 종양에 제한되지 않는다. 특히, 악성 2차 (전이성) 종양은 1차 골 종양보다 훨씬 더 흔하다. 본 발명의 치료에 의하는 전이성 골 종양은 다양한 근원에서 기인할 수 있으며, 가장 흔한 곳으로서 전립선, 유방, 폐에의 암을 들 수 있다. 전이성 골암의 근원은 일반적으로 환자의 병력으로써 식별할 수 있다. 종양은 조골세포성(osteoblastic) 또는 골용해성(osteolytic)일 수 있다. 종양이 시작될 때 그 종양은 IGF-ⅠR 자극에 의존적일 수 있고, 의존적으로 변화할 수도 있다. 예를 들어 전립선암 또는 전립선암 전이는 처음에는 호르몬/안드로겐 의존적으로 시작되고, 따라서 안드로겐 또는 호르몬 생산을 억제하는 물리적 혹은 화학적 치료로 통제할 수 있다. 다만, IGF-ⅠR을 통한 자극에 민감성이 증가하는 것을 통하여 호르몬/안드로젠-비의존적이 될 수 있다. 본 발명은 호르몬/안드로겐-비의존적 종양의 치료방법을 제시하는 것에서 나아가, 안드로겐 또는 호르몬 생성 억제를 통하지 않고 호르몬/안드로겐-의존적 종양을 치료하는데 사용될 수 있는데, 예를 들면 항신생물제와 IGF-ⅠR를 함께 투여하는 것이다. 특정 종양들은 전이성 골 종 양을 포함하는데, 이러한 골 종양은 뼈에 IGF-풍부(IGF-rich) 환경일때 IGF-ⅠR을 통해 자극되는 전이성 골 종양을 포함할 것이나, 이는 호르몬 자극에는 민감할 수 있으나, IGF의 관여 없이 성장할 만큼 충분히 민감하지는 않다. 이러한 종양에서는 호르몬의 제거가 반드시 필요하지는 않다.

본 발명에 따르면, "골수" 의존적인 종양뿐만 아니라, PDGF-의존적인 골 종양도 치료될 수 있다. 골수 의존적 종양은 골수에 나타난 수용성 인자에 대한 PDGFRα 활성을 나타낸다. 여기에 제시된 예로서, 인간 전이성 PDGFRα-발현 암 세포주는 골수 천자(bone marrow aspirate)에 노출되면 PDGFRα활성과 Akt+ 인산화를 수행한다. 항-PDGFRα 항체와 소분자 PDGFRα 길항제 각각은 세포주에서 PDGFRα활성과 Akt+ 인산화를 억제한다. PDGFRα를 활성화하는 수용성 골수 인자들은 PDGF-AA 와 -BB를 포함하나, 이들에 국한된 것은 아니다.

이러한 골수 의존성은 PDGFRα를 통한 시그널링을 포함하지만, PDGFRα 리간드의 PDGFRα 결합만을 포함하지 않을 수 있다. 여기에 제시된 예로, 정의된 리간드(PDGFR-AA or -BB)에 의한 PDGFRα활성화는 골수 천자에 의한 활성화보다 약하다. 더 나아가, 골수 천자의 존재에서 Akt+ 인산화는 배양 시간(incubation time)이 증가함에 따라 감소되는 것이 관찰된다. 리간드와 골수 천자를 함께 넣은 경우 PDGFs와의 결합 외에도, PDGFRα는 다른 골수 구성성분에 민감한 신호 변환 요소(signal transduction elements)(예로, 다른 수용체 타이로신 키나제)에 의해 교차활성(transactivated)(인산화)된다 여겨진다. 어떤 경우에 있어서는, 뼈의 전이성 성장에 적합한 세포주에서(즉, 우선적으로 뼈로 전이되는 세포주) 골수-의존 적 PDGFRα 활성이 관찰되는데, 이는 PDGFRα 길항제에 의해 억제된다. 나아가 PDGFRα 길항제를 이용한 치료는 PI3K/Akt 항-세포사멸 경로 및 MAPK(mitogen-activated protein kinase)의 촉진을 유도하는 골수를 억제한다.

PDGFRα 길항제를 이용한 치료에서의 골 종양은 전립선 암 세포의 전이에서 생길 수 있고, 위에서 언급한 바와 같이 호르몬/안드로겐 의존적일 수 있거나 또는 호르몬/안드로겐 독립적으로 변화될 수 있다. 이러한 종양들은 물론 전립선암이 아닌 경우에 있어서의 전이에서도 생길 수 있다. 당업계에 알려진 편리한 검사들을 사용하여 이러한 상태 및 병을 쉽게 진단할 수 있다.

치료는 동물에 있어서 질병의 다양한 형태의 치료를 의미하며, 다음을 포함한다:(1)아직 경험하지는 않았으나 병에 걸리기 쉬운 경우 또는 병의 징후를 나타내는 경우에 있어서 포유류에 대한 병의 예방; 예, 임상징후의 급증으로부터의 예방; (2)병의 억제, 예, 그 발달의 저지; 또는 (3) 병의 완화, 예, 병 증상의 퇴화를 야기. 종양 성장의 억제는 종양 퇴화를 야기할 뿐만 아니라, 그 성장을 멈추거나 성장속도를 늦추는 것을 포함한다. 병의 치료를 위한 유효량이란 위에서 정의한 것과 같이 해당 질병에 대한 효과적 치료에 충분한 양을 의미하며, 이는 필요한 시기에 포유류에게 투여되어야 한다. 본 발명의 IGF-ⅠR 길항제와 PDGFRα 길항제는 단독으로 투여될 수도 있으며, 다른 하나와 결합하여 사용될 수도, 또는 화학요법 또는 방사성 제제(radologic agent)등과 같은 하나 또는 그 이상의 항신생물제와 결합하여 사용될 수도 있다.

본 발명의 한 양태로서, 치료될 종양에 있어서 IGF-ⅠR 및/또는 PDGFRα의 발현 수준을 확정하는 것이 바람직하다. 어떤 경우, 종양 검사는 기술적으로 잘 알려진 방법에 의해 조절 및 분석될 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태로서, IGF-ⅠR 길항제 또는 PDGFRα 길항제는 대응하는 수용체를 기초로 투여되는데, 이러한 수용체는 주로 특정 종양 타입에서 활성화 또는 발현되기도 하고, 병이 진행됨에 따라 항상 활성화 또는 발현되기도 한다.

IGF-ⅠR 길항제는 세포 밖 길항제(extracellular antagonist) 또는 세포 내 길항제(intracellular antagonist) 일 수 있고, 하나 이상의 길항제가 관여할 수도 있다. 세포 밖 길항제는 단백질, IGF-ⅠR에 결합하는 생물학적 분자들, 또는 IGF-ⅠR에 대한 하나 또는 그 이상의 리간드(예, IGF-Ⅰ과 IGF-Ⅱ는 IGF-ⅠR의 자연적 리간드이다)를 포함하나, 이것에 국한되지는 않는다. 본 발명의 하나의 양태로서, 세포 밖 길항제는 IGF-ⅠR의 리간드가 IGF-ⅠR과 결합하는 것을 억제한다. 하나의 구체적 양태로서, 길항제는 IMC-A12 같은 항-IGF-ⅠR 항체이다. 다른 구체적 양태로서, 길항제는 IGF-ⅠR의 수용성 리간드 결합 단편이다. 세포 내 IGF-ⅠR 길항제는 생물학적 분자일 수 있으나, 항상 소분자인 것은 아니다. 그 예로는 타이로신 키나제 억제제 AG1024(Calbiochem), 인슐린-유사 성장 인자-Ⅰ 수용체 키나제 억제제 NVP-AEW541(Novartis), 및 인슐린-유사 성장 인자-Ⅰ/인슐린 수용체 억제제 BMS-554417(Bristol Myers Squibb)를 포함하나, 여기에 국한되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용되는 유용한 소분자들은 IGF-ⅠR 억제제로 사용되나, 반드시 IGF-ⅠR에 완전히 특이적이어야 하는 것은 아니다.

본 발명에 따르면 사용되는 항-IGF-ⅠR 항체는 다음과 같은 특징을 하나 또는 그 이상 갖는다.

1)항체는 IGF-ⅠR의 외부 도메인(external domain)에 결합하여 IGF-Ⅰ 또는 IGF-Ⅱ가 IGF-ⅠR에 결합하는 것을 억제한다. 억제작용은 예를 들어, 정제된 또는 막에 붙어있는 수용체를 사용한 것을 사용한 직접 결합 분석(a direct binding assay)으로써 확인할 수 있다. 구체적 양태로, 본 발명의 항체들, 또는 그 단편들은 자연적 리간드(IGF-Ⅰ 및 IGF-Ⅱ)가 IGF-ⅠR에 결합하는 세기보다 더 강하게 IGF-ⅠR와 결합한다.

2)항체는 IGF-Ⅰ을 중화시킨다. IGF-Ⅰ 또는 IGF-Ⅱ와 같은 리간드의 결합으로, IGF-ⅠR의 세포 밖 도메인은 MAPK, Akt, 및 IRS-1을 포함한 베타 소단위체 다운스트림 신호 분자의 자가인산화를 촉진한다.

IGF-ⅠR의 중화는 신호전달과 일반적으로 연계된 활성 중 하나 또는 그 이상의 억제, 감소, 비활성화 및/또는 붕괴를 포함한다. 이는 조직(tissue), 배양된 세포(cultured cell), 또는 정제된 세포 구성성분(purified cellular components)을 사용하여 생체 내(in vivo), 생체 외(ex vivo), 또는 시험관 내(in vitro)에서 중화를 확인할 수 있다. 중화는 IGF-ⅠR 호모다이머 뿐만 아니라 IGF-ⅠR/IR 헤테로다이머의 억제를 포함한다. 그러므로, IGF-ⅠR을 중화함으로써, 성장증식 및 분화), 신생혈관형성(angiogenesis)(혈관 유도, 침입, 전이), 및 세포 운동 및 전이(세포 응집 및 침투에 대한 억제, 감소, 비활성 및/또는 정지를 포함한 다양한 효과를 가져온다.

IGF-ⅠR 중화의 한 측정 방법은 수용체의 타이로신 키나제 활성을 억제시키 는 것이다. 타이로신 키나제 억제는 잘 알려진 방법을 사용한다; 예를 들어, 재조합 키나제 수용체의 자가인산화 수준을 측정하고/측정하거나 자연적 또는 합성 기질의 인산화 정도를 측정하는 것이 그것이다. 그러므로, 인산화 분석 (phosphorylation assays)은 본 발명의 내용에서 항체를 중화시키는 것을 확인하는데 유용하다. 예를 들면, ELISA 분석 또는 웨스턴 블롯(western blot)에서 인산화 타이로신(phosphotyrosine)에 특이적인 항체를 사용하면 인산화 정도를 측정할 수 있다. 타이로신 키나제 활성을 측정하는 몇몇 분석은 Panek et al., J. Pharmacol. Exp. Thera. 283:1433-44 (1997)과 Batley et al., Life Sci. 62:143-50 (1998)에 서술되어 있다. 리간드에 반응하는 세포에 있어서, 본 발명의 항체들은 적어도 75% 정도의 IGF-ⅠR의 타이로신 인산화를 감소시키며, 바람직하게는 적어도 약 85% , 더 바람직하게는 적어도 90%정도의 감소를 야기한다.

IGF-ⅠR 중화를 측정하는 또 다른 방법으로 IGF-ⅠR 다운스트림 기질들의 인산화를 억제하는 것이다. 이에 따르면 MAPK, Akt, 또는 IRS-1의 인산화 수준이 측정될 수 있다. 인산화의 감소는 적어도 40% 정도이며, 적어도 약 60%, 적어도 약 80%이다.

단백질 발현을 측정하는 방법은 IGF-ⅠR 중화를 확인하는데 이용할 수 있고, 측정된 단백질은 IGF-ⅠR 타이로신 키나제 활성으로써 조절될 수 있다. 이러한 방법은 단백질의 발현을 측정하는 IHC(immunohistochemistry), 유전자 증폭(gene amplification)을 측정하는 FISH(fluorescence in sity hybridization), 길항적 방사성 리간드 결합 분석(competitive radioligand binging assays), 노던 및 서던 블롯(Northern and Southern blots)과 같은 고형의 매트릭스 블롯팅(solid matrix blotting), RT-PCR(reverse transcriptase polymerase chain reaction) 및 ELISA를 포함한다. Grandis et al., Cancer, 78:1284-92(1996); Shimizu et al., Japan J. Cancer Res., 85:567-71(1994); Sauter et al., Am. J. Path., 148:1047-53(1996); Collins,Glia 15:289-96(1995); Radinsky et al., Clin. Cancer Res. 1:19-31(1995); Petrides et al., Cancer Res. 50:3934-39(1990); Hoffmann et al., Anticancer Res. 17:4419-26(1997); Wikstrand et al., Cancer Res. 55:3140-48(1995).

생체 외 분석은 IGF-ⅠR 중화 확인에도 이용될 수 있다. 예를 들면, 수용체 타이로신 키나제 억제는 미토게닉 분석(mitogenic assays)을 통해 관찰될 수 있는데, 이 분석은 억제제(inhibitor)의 존재 또는 결여 하에서 수용체 리간드가 자극된 세포주를 이용하는 방법이다. MCF7 유방암 세포주(American Type Culture Collection(ATCC), Rockville,MD)는 IGF-Ⅰ또는 IGF-Ⅱ에 의해 자극되고, IGF-ⅠR을 발현하는 세포주이다. 또한 억제는 쥐에 주입한 인간 종양 세포와 같은 종양 모델을 이용하여 관찰 수도 있다.

본 발명의 항체들은 IGF-ⅠR 중화의 어떤 특정한 메카니즘(mechanism)에 국한되지 않는다. 본 발명의 항-IGF-ⅠR 항체들은 IGF-ⅠR 세포 표면 수용체에 외부적으로 결합할 수 있으며, 리간드의 결합(예, IGF-Ⅰ또는 IGF-Ⅱ)과 수용체-연계된 타이로신 키나제를 통해 매개되는 그 후의 신호전달체계를 막으며, IGF-ⅠR의 인산화 및 신호전달체계의 연쇄반응(signal transduction cascade)에서의 다른 다운스 트림 단백질의 인산화를 저해한다.

3)항체들은 IGF-ⅠR을 하향조절한다(down modulate). 세포 표면의 IGF-ⅠR 존재량은 수용체 단백질 생산, 내부이행(internalization), 및 분해에 의존된다. 세포 표면에 존재하는 IGF-ⅠR의 양은 간접적으로 측정될 수 있는데, 이는 수용체와 결합하는 분자 또는 수용체의 내부이행을 검출함으로써 가능하다. 예를 들면, 표지된 항체와 IGF-ⅠR을 발현하는 세포들의 결합으로써 수용체 내부이행이 측정될 수 있다. 그 후 막-결합 항체를 분리, 수득하여 그 수를 측정한다. 세포를 용해시키고, 분리된 용해물에서 표지를 검출함으로써 내부이행된 항체를 확인할 수 있다.

다른 방법은 세포에 존재하는 수용체의 양을 직접적으로 측정하는 방법으로 항-IGF-ⅠR 항체 또는 다른 물질과 함께 다음의 처리를 수행하는데, 그 예로, IGF-ⅠR의 표면 발현을 위해 착색된 세포의 형광-활성화된 세포-구분 분석(fluorescence-activated cell-sorting analysis) 방법이다. 착색된 세포는 37℃에서 배양되고 시간 변화에 따른 형광 세기가 측정된다. 대조군으로서, 착색 집단의 일부는 4℃에서 배양될 수 있다(수용체 내부이행이 정지되는 조건).

세포 표면 IGF-ⅠR은 IGF-ⅠR에 특이적인 항체 및 검사된 항체의 결합을 막거나 경쟁하지 않는 다른 항체를 사용함으로써 측정되고 검출될 수 있다(Burtrum, et al. Cancer Res. 63:8912-21(2003)). 본 발명의 항체와 IGF-ⅠR 발현 세포의 처리는 세포 표면 IGF-ⅠR의 감소를 가져온다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 항체로 처리하는 경우, 적어도 약 70% 정도, 더 바람직하게는 적어도 약 80%, 더욱더 바람직하게는 적어도 약 90% 정도 감소된다. 현저한 감소는 적어도 네 시간 안에 관찰 될 수 있다.

하향조절(down-modulation)의 또 다른 척도는 세포 내에 존재하는 전체 수용체 단백질의 감소이고, 이는 내부 수용체의 분해를 반영한다. 따라서, 본 발명의 항체를 이용한 세포의 처리(특히 암세포)는 전체 세포 IGF-ⅠR의 감소를 가져온다. 바람직한 양태에서, 감소는 약 70% 정도이며, 더 바람직하게는 적어도 약 80%정도, 그리고 더욱더 바람직하게는 적어도 약 90% 정도이다.

인간 대상의 치료를 위해, 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 사람의 것이다. 대안으로서, 항체는 사람이 아닌 영장류로부터 또는 다른 포유류로부터 가져올 수 있고, 또는 인간화하거나 융합 항체(chimeric antibodies)일 수 있다. 본 발명의 양태로서, 항-IGF-ⅠR 항체는 SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, 및 SEQ ID NO:49(각각, CDR1H, CDR2H, CDR3H, CDR1L, CDR2L, CDR3L)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 및/또는 여섯의 CDRs(complementarity determining regions)로 이루어진다. 또 다른 양태로서, 항-IGF-ⅠR 항체는 SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, 및 SEQ ID NO:59(각각, CDR1H, CDR2H, CDR3H, CDR1L, CDR2L, CDR3L)로 구성된 군으로부터 선택된 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 및/또는 여섯의 CDRs로 이루어진다. 바람직하게, 본 발명의 항체(또는 그 단편)는 SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, 및 SEQ ID NO:39의 중사슬(heavy chain) CDRs을 갖는다. 대안적이고 또한 바람직하게는, 그 단편을 포함한 항체는 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, 및 SEQ ID NO:49 또는 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, 및 SEQ ID NO:59의 경사슬(light chain) CDRs를 갖는다. 그러한 항-IGF-ⅠR 항체중 하나는 인간 IgG1 항체 IMC-A12이고(WO2005016970), SEQ ID NO:41에 의해 제시되는 중사슬 가변 도메인(variable domain)과 SEQ ID NO:51에 의해 제시되는 경사슬 가변도메인을 갖는다. 또다른 선택된 인간 항체는 IMC-2F8이고(WO2005016970), IMC-A12와 동일한 중사슬 가변 도메인 및 SEQ ID NO:61에 의해 제시되는 경사슬 가변 도메인을 갖는다. 유용한 항체는 다른 에피토프(epitopes)에 결합하는 항체들뿐만 아니라, IGF-ⅠR 에 결합하기 위한 IMC-A12 또는 IMC-2F8과 경쟁하는 항-IGF-ⅠR 항체를 더 포함한다(즉, 전술한 바와 같이 리간드를 막고, 수용체 내부이행을 하는 등의 특성을 나타내며 다른 에피토프와 결합하는 항체, 그러나 IMC-A12 또는 IMC-2F8과 경쟁하지는 않음).

본 발명에 따르면, PDGFRα 길항제는 또한 치료에 쓰일 수 있다. PDGFRα 길항제는 세포밖 길항제 또는 세포내 길항제일 수 있고, 하나 또는 그 이상의 길항제와 함께 사용될 수 있다. 세포밖 길항제는, PDGFRα 또는 하나 혹은 그 이상의 리간드(예, PDGF-AA, -AB, -BB, -CC)에 결합하는 단밸질 혹은 다른 생체분자를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 양태로서, 세포밖 길항제는 PDGFRα가 그의 리간드에 결합하는 것을 억제한다. 하나의 구체적 예로, 길항제는 IMC-3G3와 같은 항-PDGFRα 항체이다. 또 다른 양태로서, 결합 단백질은 PDGFRα의 수용성 리간드 결합 단편이다. 세포내 PDGFRα 길항제는 생체 분자일 수 있으나, 일반적으로 소분자들이다. 구체적으로, 세포내 PDGFRα길항제는 AG1296이다. AG1296(Calbiochem)은 PDGFRα, PDGFRβs, 및 c-KIT의 억제제이고, 또한 Flt3와 반응할 수 있다. PDGFRα을 표적으로 하는 다른 소분자들은 STI-571(imatinib mesylate, Gleevec®, Novartis)과 SU11248(sunitinib malate, SUTENT®, Pfizer)을 포함한다.

본 발명의 구체적 양태로서, 항-PDGFRα항체는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14(각각, CDR1H, CDR2H, CDR3H, CDR1L, CDR2L, CDR3L)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 및/또는 여섯인 CDRs로 이루어져 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체(또는 그의 단편)는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, 및 SEQ ID NO:6 의 CDRs를 갖는다. 대안으로써 또한 바람직하게, 항체 또는 그의 단편은 SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, 및 SEQ ID NO:14의 CDRs를 갖는다. CDRs의 아미노산 서열은 표1에 설명되어 있다.

또 다른 양태로서, 항-PDGFRα 항체, 또는 그의 단편은, SEQ ID NO:8의 인간 중사슬 가변 부위 및/또는 SEQ ID NO:16의 인간 경사슬 가변부위를 가진다. IMC-3G3가 그러한 항체이며, 이는 본 발명에 예시되어 있다.

바람직하게, 본 발명의 항체, 또는 그의 단편은 PDGFRα를 중화시킨다. PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB 또는 PDGF-CC와 같은 리간드와 PDGFRα의 세포 밖 도메인의 결합은 수용체 이량체화(dimerization), 자가인산화, 수용체 내부 활성, 세포질 타이로신 키나제 도메인, 및 복합적 신호전달의 개시 및 DNA 합성(유전자 활성)의 조절과 관련된 경로의 교차활성(transactivation) 그리고 세포 주기의 발달 또는 분열 등을 촉진한다. 본 발명의 항-PDGFRα 항체는 PDGFRα의 세포 밖 리간드 결합 부위에 특이적일 수 있고 PDGFRα의 리간드 결합으로부터 보호한다. 바람직하게는, 이러한 항-PDGFRα 항체들 또는 그 단편들은 적어도 PDGFRα의 자연적 리간드만큼은 강하게 결합한다. 달리 말해 또는 덧붙여, 항체들은 수용체 다이머(dimer) 경계를 다르게 형성하는 수용체 모노머(monomer) 부위에 특이성이 있다. 수용체 모노머에 리간드가 결합하는 것이 차단되든, 되지 않든 간에, 이러한 항체들은 다이머 형성을 차단한다.

항-IGF-ⅠR에 대한 상기 서술과 같이, 수용체 중화는 생체 내, 시험관 내, 및 생체 외 방법 등, 다양한 방법을 통해 확인할 수 있다. 본 발명의 한 양태로서, 항-PDGFRα 항체들은 적어도 약 75% 정도의 PDGFRα의 인산화를 감소시킨다. 또 다른 구체적 예로, 인산화는 적어도 약 85% 정도 또는 적어도 약 90% 정도가 감소된다. 본 발명의 구체적 양태로, PDGFRα 신호 전달의 억제 결과로서, 인산화 또는 다운스트림 신호전달 경로 구성성분(예, Akt, P42/p44, 등)은 적어도 약 40% 정도, 적어도 약 60% 정도, 또는 적어도 약 80% 정도 감소된다. 수용체 중화는 정의된 리간드들(예, PDGF-AA, -AB, -BB, -CC), 이들의 혼합물, 또는 다른 자극성 성장인자(stimulatory growth factors) 뿐만 아니라 PDGFs를 포함하는 골수 천자 같은 표본을 사용하여 확인할 수 있다.

PDGFRα의 중화는 억제, 감소, 비활성화 및/또는 신호전달과 연계된 일반적인 하나 또는 그 이상의 이러한 활성의 붕괴를 포함한다. 그러므로 PDGFRα를 중화시키는 것은 억제, 감소, 비활성화 및/또는 성장(증식 및 분화)의 붕괴, 신생혈관형성(angiogenesis)(혈관의 유도, 침투, 및 전이), 그리고 세포 운동 및 전이(세포 응집 및 침투)를 포함한 다양한 효과를 가진다.

상술한 바와 같이, 생체 외 분석(Ex vivo assays)은 PDGFRα 중화 확인에 이용될 수 있다. PDGF-AA에 의해 자극되는 인간 SKLMS-1 평활근육종(leiomyosarcoma) 세포(American Type Culture Collection(ATCC), Rockville,MD;ATCC HTB-88™) 또는 U118 신경교아종(glioblastoma) 세포(ATCC HTB-15™)는 PDGFRα 억제 분석에 이용될 수 있다. 성장 억제는 SCID 쥐에 주입한 PDGFRα-발현 인간 종양 세포를 사용하여 확인할 수 있다.

본 발명은 PDGFRα 중화의 특정 메카니즘에 의해 국한되지 않는다. 본 발명의 항-PDGFRα 항체는 PDGFRα 세포 표면 수용체에 외부적으로 결합하고, 리간드(예, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC)의 결합을 막으며, PDGFRα의 인산화를 억제하고, 수용체-연계된 타이로신 키나제를 통해 매개되는 신호전달을 억제한다. 수용체-항체 복합체는 내부이행될 수도 있고, 분해될 수도 있으며, 세포 표면 수용체의 하향조절을 가져온다. 매트릭스 메탈로프로테이나제(Matrix metalloproteinases)는 종양 세포내에서 침입 및 전이 기능을 하는데, 이것 또한 본 발명의 항체에 의해 하향조절된다. 더욱이, 본 발명의 항체들은 성장인자의 생산과 신생혈관형성(angiogenesis)의 억제를 나타낸다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 PDGFRα 길항제는 전이성 골 종양을 포함한, 골 종양의 치료에 유용하다. PDGFRα를 발현하고 본 발명에 따라 치료될 수 있는 다른 종양 타입은 난소 종양(ovarian tumors), 유선종양(breast tumors), 폐 종양(lung tumors), 간세포 종양(hepatocellular tumors), 위장관 기질 종양(gastrointestinal stromal tumors), 흑색종(melanomas), 신장 세포 암(renal cell carcinomas), 전립선 종양(prostate tumors), 연조직 육종(soft tussue sarcomas)을 포함하나 여기에만 국한되는 것은 아니다. 연조직 육종은 지방, 근육, 신경, 힘줄, 및 혈액과 림프액 등에서 기원한다. 일반적으로 종양 세포는 PDGFRα를 과발현한다. PDGFRα 발현은 예를 들어 히스토케미스트리(histochemistry) 또는 RNA분석 등을 통해 확인될 수 있다. 예를 들어, U118 세포와 SKLMS-1 종양 세포에 방사성 표지된 IMC-3G3가 결합하는 스캣처드 분석(scatchard analysis)은 세포 상에서 각각 약 500과 2500개의 PDGFRα 분자의 수를 나타낸다.

종양 세포 자체에 발현된 PDGFRα에 의한 신호전달의 억제제로서, 또는 종양 세포로부터 발현된 PDGFs에 의해 파라크린 촉진을 수행하는 기질 세포 주변에 발현된 PDGFRα의 억제제로서 PDGFRα 길항제가 작용한다. 그러므로 IMC-3G3 및 다른 PDGFRα 길항제와 같은 항체는 PDGFRα의 오토크린 및/또는 파라크린 촉진에 특징적인 종양을 치료하는데 유용하다.

본 발명에 따른 항체 단편은 전체 항체를 조각내거나, 단편을 코딩하는 DNA을 발현시킴으로써 생산될 수 있다. 항체의 단편은 Lamoyi et al., J. Immunol. Methods, 56:235-243(1983) 및 Parham,J. Immunol. 131:2895-2902(1983)에 기술된 방법으로 제조될 수 있다. 이런 단편들은 한쪽 또는 양쪽의 Fab 단편들, 또는 F(ab')₂ 단편을 가질 수 있다. 이러한 단편들은 또한 scFv(single-chain fragment variable region antibodies), 다이바디(dibodies), 또는 다른 항체 단편을 포함할 수 있다. 이런 기능적 당량을 생산하는 방법은 국제 공개 특허 제 WO93/21319호, 유럽 등록 특허 제 EP 239400호; 및 국제 공개 특허 제 WO 89/09622; 유럽 등록 특허 EP 338745호; 및 유럽 등록 특허 제 EP332424호에서 공개되었다.

본 발명의 항체들의 발현 및 벡터의 형질전환을 위한 선택된 숙주세포는 포유류의 세포이고, 예를 들면, COS-7 세포, CHO(Chinese hamster ovary) 세포, 및 림프종(lymphoma), 골수종(myeloma)와 같은 림포이드 기원(lymphoid origin) 세포주이다. 이스트(yeasts)와 같은 다른 진핵세포 세포주는 대안적으로 사용될 수 있다.

이스트에서 유전자 구성물을 발현시키는 것이 바람직한 경우, 이스트에서의 사용을 위한 적절한 선택 유전자는 이스트 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1유전자이다. Stinchcomb et al. Nature, 282:39(1979); Kingsman et al., Gene, 7:141(1979). trp1 유전자는 트립토판(tryptophan)의 성장 능력을 결손시키는 이스트 변이주(mutant strain)를 위한 선택 마커(selection marker)를 제공하는데, 예를 들면, ATCC No.44076 또는 PEP4-1이다 Jones,Genetics,85:12(1977). 이스트 숙주 세포 게놈(genome)에서 trp1의 손상은 트립토판 결손하의 성장으로써 형질전환을 검출하는데 효과적인 환경을 제공한다. 이와 비슷하게, Leu2-결손 이스트 균주(ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 갖는다고 알려진 플라스미드(plasmid)로써 보완될 수 있다.

형질 전환된 숙주 세포는 탄소(글루코스(glucose)또는 락토오스(lactose)와 같은 탄수화물), 질소(아미노산(amino acids), 펩티드(peptides), 단백질(proteins) 또는 펩톤(peptones), 암모늄염(ammonium salts) 또는 이와 유사한 그들의 분해물), 및 무기염류(황산염(sulfates), 인산염(phosphates) 및/또는 탄산나트륨, 탄산칼륨, 탄산마그네슘 및 탄산칼슘(carbonates of sodium, potassium, magnesium and calcium))등의 동화가능한 양분을 포함한 액상 배지에서 기술적으로 알려진 방법에 의해 배양된다. 배지는 나아가, 예를 들면 철, 아연, 망간 및 이와 유사한 소량 원소(trace elements) 같은 성장-촉진 물질(growth-promoting substances)을 더 포함한다.

본 발명에 따른 높은 친화성 항-PDGFRα 및 항-IGFⅠR 항체들은 인간 중사슬 및 경사슬 가변 부위 유전자로 구성된 파아지 디스플레이 라이브러리(phage display library)로부터 분리될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 가변 도메인은 가변 부위 유전자를 포함하는 말초혈액 림프구로부터 수득할 수 있다. 다른 대안으로, CDR 및 FW 부위와 같은 가변 도메인 일부는 다른 소스(source) 및 재조합으로부터 수득될 수 있다. 나아가, 가변 도메인 일부(예, FW 부위)는 공통 서열(consensus sequences)을 합성할 수 있다.

본 발명의 항체 및 항체 단편은, 예를 들면 자연적으로 생긴 항체들로부터, 혹은 Fab 또는 scFv 파지 디스플레이 라이브러리로부터 수득할 수 있다. V_H 및 V_L 도메인으로 이루어진 항체로부터 단일 도메인(single domain) 항체를 만들기 위해서, CDRs 바깥영역의 특정 아미노산의 대체가 결합, 발현 또는 용해도를 증가시킴이 바람직할 수 있다는 것은 말할 것도 없다. 예를 들면, V_H-V_L 결합부위에 매립되어 있는 아미노산 잔기를 변형함이 바람직 할 수 있다.

나아가, 본 발명의 항체 및 항체 단편들은 인간 면역글로불린 감마 중사슬 및 카파 경사슬(immunoglobulin gamma heavy and kappa light chains)을 생산하는 형질전환 생쥐(transgenic mice)를 이용한 표준 융합 기술(standard hybridoma technology)로써 수득할 수 있다. 구체적으로, 인간 항체 생산 게놈의 상당 부분은 생쥐의 게놈에 삽입되고, 내인성 쥐(endogenous murine) 항체의 생산에서 결손된다. 이러한 생쥐는 필요에 따른 상승으로 PDGFRα에 피하에(subcutaneously, s.c) 면역될 수 있다. 면역과 방법은 기술적으로 잘 알려져 있다.

본 발명의 IGF-ⅠR 결합 항체들을 동정하기 위해 사용되는 단백질은 바람직하게는 IGF-ⅠR 이고, 더 바람직하게는, IGF-ⅠR의 세포 밖 도메인이다. 본 발명의 PDGFRα 결합 항체를 동정하기 위해 사용되는 단백질은 바람직하게는 PDGFRα이고, 더 바람직하게는 PDGFRα의 세포 밖 도메인이다. 이러한 세포 밖 도메인은 다른 분자에 융합되거나, 단독으로 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 상술한 항체 혹은 그 단편을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. IMC-A12 항-IGF-ⅠR 항체의 세부내용은 WO 20005016970에 공개된다. 표2는 IMC-3G3에 대한 핵산(nucleic acid) 서열을 보여준다.

인간 항체를 코딩하는 DNA는 인간 불변영역(constant region)과 가변영역(variable region)을 코딩하는 재조합 DNA로부터 마련될 수 있는데, 인간으로 부터 얻은 CDRs를 코딩하는 DNA와 인간 항체 부위에 대응하는 CDRs와는 실질적으로 다르다.(중사슬 가변 도메인 CDRs를 위한 SEQ ID NOS:1,3, 및 5 와 경사슬 가변 도메인 CDRs를 위한 SEQ ID NOS:9,11, 및 13)

항체들의 단편을 코딩하는 DNAs의 적절한 소스는 하이브리도마(hybridomas)) 와 비장 세포(spleen cells) 같이, 전체-길이(full-length) 항체를 발현할 수 있는 어떤 종류의 세포도 포함한다. 상술한 바와 같이, 단편은 항체 균등물로서 그 자체로 이용될 수도 있고, 또는 균등물에 재조합되어 이용될 수도 있다. 이 부분에서 서술된 DNA 결실 또는 재조합은 알려진 방법으로 수행될 수 있는데, 위에 서술한 참고자료 목록에 있는 항체의 균등물에 관한 방법 및/또는 아래 서술된 바와 같은 다른 표준 재조합 DNA 기술에 관한 방법이 그것이다. DNAs의 다른 소스로는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 생산된 단일사슬 항체인데, 이는 기술적으로 알려져 있다.

덧붙여, 본 발명은 발현 서열, 프로모터(promoter), 및 인핸서(enhancer) 서열에 연결된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 박테리아와 같은 원핵생물 및 진핵생물에서 항체 폴리펩티드의 효과적인 합성을 위한 발현 벡터의 다양성은 개발되고 있는 이스트와 포유류 세포 배양 시스템을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 벡터는 염색체 부분(segments of chromosomal), 비-염색체 부분(segments of non-chromosomal) 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있다.

어떤 적절한 발현 벡터라도 사용될 수 있다. 예를 들어, 원핵생물 클로닝 벡터(prokaryotic cloning vectors)는 colE1, pCR1, pBR322, pMB9, pUC, pKM, 및 RP4와 같은 E.coli로부터의 플라스미드(plasmid)를 포함한다. 원핵생물 벡터는 또한 M13 같은 파아지 DNA의 유도체(derivatives) 및 다른 필라멘트형(filamentous)의 단일-사슬 DNA 파지를 포함한다. 이스트에서 유용한 벡터의 예는 2μ 플라스미드이다. 포유류 세포에서의 발현을 위한 적절한 벡터는 잘 알려진 SV40, 아데노파이러스(adenovirus), DNA 서열을 유도하는 레트로바이러스(retrovirus-derived DNA sequences), 기능적인 포유류 벡터의 조합으로부터 유도된 셔틀 벡터(shuttle vector)의 유도체 및 위에서 서술한 바와 같이 기능성 플라스미드와 파지 DNA를 포함한다.

부가된 진핵생물 발현 백터는 당업계에 잘 알려져 있다(예, P.J.Southern and P.Berg, J.Mol.Appl. Genet 1, 327-341(1982); Subramani et al., Mol. Cell. Biol., 1:854-864(1981); Kaufmann and Sharp, "Amplification And Expression of Sequences Cotransfected sith a Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene," J.Mol. Biol. 159, 601-621(1982); Kaufmann and Sharp, Mol. Cell. Biol. 159, 601-644(1982); Scahill et al., "Expression and Characterization Of The Product Of A Human Immune Interferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells, "Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 80, 4654-4659(1983); Urlaub and Chasin, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77, 4216-4220(1980)).

본 발명에서 유용한 발현 벡터는 적어도 하나의 발현되기 위한 DNA 서열 또는 단편과 연결된 발현 제어 서열을 포함한다. 제어 서열(control sequence)은 복제된 DNA 서열의 발현을 조절 및 제어하기 위해 벡터 내에 삽입된다. 유용한 발현 제어 서열의 예는 lac 시스템, trp 시스템, tac 시스템, trc 시스템, 람다파아지(phage lambda)의 주요 오퍼레이터(operator) 및 프로모터(promoter) 부위, fd coat 단백질의 제어 부위, 이스트의 글라이코라이틱 프로모터(gllycolytic promoters)등이며, 예로, 3-포스포글리세레이트 키나제(3-phosphoglycerate kinase)의 프로모터, 이스트 에시드 포스파타아제(yeast acid phosphtase)의 프로모터, 예로, Pho5, 이스트 알파-메이팅 인자(yyeast alpha-mating factors)의 프로모터, 및 폴리오마(polyoma), 아데노파이러스(adenovirus), 레트로바이러스(retrrovirus) 및 시미안 바이러스(simian virus)에서 유도된 프로모터, 예로, 초기 및 후기 프로모터 또는 SV40, 및 원핵, 진핵 세포 유전자의 발현을 제어하는 것으로 알려진 다른 서열들 그리고 그들의 바이러스들 또는 그 조합등이 있다.

본 발명은 또한 앞에서 서술된 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 항체는 하이브리도마에서와는 다른 세포주에서 발현될 수 있다. 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산은, 적절한 포유류 숙주 세포의 형질전환을 위해 이용될 수 있다.

특정 선호 세포주는 높은 수준의 발현, 원하는 단백질의 구조적 발현 및 숙주 단백질로부터의 최소 오염에 기초하여 선택될 수 있다. 발현을 위해 숙주로서 가능한 포유류 세포주는 당업계에 잘 알려져 있고, NS0 세포, CHO(Chinese Hamster Oary) 세포, BHK(Baby Hamster Kidney) 세포 및 많은 다른 세포들과 같이 많은 불멸화된(immortalized) 세포주를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 유용한 원핵생물 세포주는 E.coli SG-936, E.coli HB191, E.coli W3110, E.coli X1776, E.coli X2282, E.coli DHI, 및 E.coli MRCI와 같은 E.coli 및 슈도모나ㅅ스seudomonas), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 와 같은 바실러스(Bacillus) 및 스트렙토마이시스(Streptomyces)와 같은 예를 포함한다.

이러한 재조합 세포주는 숙주 세포를 둘러싼 배지 또는 숙주 세포로부터 항체 또는 그 단편을 분리하고, 항체 또는 그 단편의 발현될 수 있는 조건 하에서 배양함으로써 항체 또는 그 단편을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 재조합 세포에서 분비를 위한 발현된 항체 또는 단편의 타켓팅(targeting)은 원하는 항체를 코딩하는 유전자의 5' 말단에 신호 또는 분비성 리더 펩티드를 코딩하는 서열(secretory leader peptide-encoding sequence)을 삽입함으로써 유용할 수 있다(Shokri et al., Appl Microbiol Biotechnol. 60(6):654-64(2003), Nielsen et al., Prot. Eng. 10:1-6(1997) 및 von Heinje et al., Nucl. Acids Res. 14:4683-4690(1986)을 보라). 이러한 분비성 리더 펩티드는 원핵생물 또는 진핵생물 모두에서 유도될 수 있다. 따라서 적절하게, 숙주 세포 세포질을 벗어나 배지에 바로 분비되도록 폴리펩티드의 N-말단과 결합하는 아미노산인 분비성 리더 펩티드가 사용된다.

이 발명의 항체들은 다른 아미노산기가 융합될 수 있다. 이러한 아미노산 잔기는 아마도 분리를 용이하게 하기 위한 펩티드 표지일 것이다. 특정 기관 또는 조직으로 가기 위한 다른 아미노산 잔기도 고려될 수 있다.

다른 구체적 양태로서, 본 발명의 항체는 형질전환 동물(transgenic animal)에서 항체를 코딩하는 핵산을 발현함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어 항체는 검출하고 분리하기 용이한 조직 특이적인 방법으로 발현될 수 있다. 이러한 하나의 구체적인 양태로, 본 발명의 항체는 수유기 동안의 분비를 위한 유선(mammary gland)에서 발현된다. 형질전환 동물은 생쥐, 염소 및 토끼를 포함하나 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 항체는 완전한 면역글로불린(immunoglobulins), 면역글로불린의 항원결합 단편, 뿐만 아니라 면역글로불린의 항원결합 도메인을 포함하는 항원결합 단백질을 포함한다. 면역글로불린의 항원 결합 단편은 예를 들면, Fav, Fab', 및 F(ab')₂ 를 포함한다. 결합 특이성을 유지하나, 예를 들면 이특이성(bispecificity), 다면성(둘 이상의 결합 부위를 갖는), 작은 크기(예, 결합 도메인 자체만) 등의 특성도 갖는 다른 항체 형태들이 개발되고 있다.

단일 사슬 항체들은 유도된 전체 항체 불변 도메인의 일부 또는 전부가 결여된다. 그러므로 항체들은 전체 항체들의 사용과 연계된 몇몇의 문제점을 극복할 수 있다. 예를 들면, 단일-사슬 항체들은 중사슬 불변 부위와 다른 생체분자들 사이의 특정 기대되지 않은 결합으로부터 자유로운 경향이 있다. 더욱이, 단일-사슬 항체들은 전체 항체보다 훨씬 작아서, 단일-사슬 항체들이 전체 항체보다 더 큰 투과성을 갖고, 표적 항원-결합 부위에 더 효과적으로 위치하고 결합하도록 한다. 또한 단일-사슬 항체들의 작은 크기는 수용 개체에서 원하지 않는 면역 반응을 유발할 확률이 전체 항체보다 적다.

첫 펩타이드 연결자에 의해 공유결합으로 연결되어 있는 하나의 V_H와 하나의 V_L 도메인을 같은 각 단일 사슬인 다양한 단일 사슬 항체는 다면적(multivalent)인 단일 사슬 항체들을 형성하기 위해 적어도 하나 또는 그 이상의 펩티드 연결자와 공유결합적으로 연결될 수 있는데, 이는 단특이성(monospecific) 또는 다특이성(multispecific)일 수 있다. 다면적 단일 사슬 항체의 각 사슬은 다양한 경사슬 단편과 다양한 중사슬 단편을 포함하며, 펩티드 연결자에 의해 적어도 다른 하나의 사슬에 연결되어 있다. 펩티드 연결자는 적어도 15개의 아미도산 잔기로 구성되어 있다. 아미노산 잔기의 최대 수는 약 100개 정도이다.

두 개의 단일 사슬 항체들은 디아바디(diabody)를 형성하며 결합될 수 있는데, 이는 또한 양면적 다이머(bivalent dimer)로써 알려져 있다. 디아바디의 양 사슬은 V_L 도메인과 연결된 V_H 도메인을 포함한다. 이 도메인들은 동일 사슬에서 도메인 내부 결합을 막기에 충분히 짧은 연결자로 연결되어 있으므로, 두 항원-결합 부위를 만들어 서로 다른 사슬상의 도메인간 결합을 이끈다.

세 개의 단일 사슬 항체는 트리아바디(triabodies)를 형성하며 결합될 수 있는데, 이 또한 삼면적 트라이머(trivalent trimers)로써 알려져 있다. 트리아바디는 V_L 또는 V_H 도메인 카르복실 말단(carboxyl terminus)에 직접적으로 융합된 V_L 또는 V_H 도메인의 아미노산 말단으로 구성되는데, 즉, 다른 연결자 서열이 없음을 의미한다. 트리아바디는 머리-꼬리 형태로서, 환형(cyclic) 배열된 폴리펩티드인 세 F_V 머리부분을 갖는다. 트라이바디의 가능한 형태로는 하나가 다른 하나와 120도의 각을 이루는 평면으로 존재하는 세 결합 부위를 갖는 평면이다. 트리아바디는 단특이성(monospecific), 이특이성(bispecific) 또는 삼특이성(trispecific)일 수 있다.

그러므로, 본 발명의 항체 및 그의 단편은 자연적으로 형성된 항체, (Fab')₂ 와 같은 양면적 단편, Fab와 같은 단면적 단편, 단일사슬 항체, 단일 사슬 Fv(scFv), 단일 도메인 항체들, 다면적 단일 사슬 항체들, 디아바디, 트리아바디 및 항원과 특이적으로 결합하는 그 유사체들을 포함하나 이에 국한된 것은 아니다.

IGF-ⅠR(WO2005016970) 또는 PDGFRα를 갖는 세포에 결합하여 내부흡수될 수 있는 항-IGF-ⅠR 및 항-PDGFRα 항체들 또는 항체 단편들은 화학적으로 또는 생화학적으로 항-종양제제일 수 있다. 이러한 항체와 연결된 항-종양 제제는 항체가 결합하고 있는 종양, 또는 항체가 결합하는 세포 환경에서 종양을 해하고 파괴하는 다른 제제를 포함한다. 예를 들어, 항-종양 제제는 화학 요법 제제 또는 방사성동위원소 같은 독성제제이다. 적절한 화학 요법제제는 당업계에 알려져 있고, 안트라사이클린(anthracyclines)(예, 도노마이신(daunomycin) 및 독소루비신(doxorubicin)), 메토트렉세이트(methotrexate), 빈데신(vindesine), 네오카지노스태틴(neocarzinostatin), 시스-백금(cis-platinum), 클로람부실(chlorambucil), 시토신 아라비노사이드(cytosine arabinoside), 5-플로오로리딘(5-fluorouridine), 멜팔란(melphalan), 리신(ricin) 및 칼리케마이신(calicheamicin)을 포함한다. 화학요법 제제는 종래의 방법을 사용하여 항체와 융합된다(예, Hermentin and Seiler, Behring Inst. Mitt. 82:197-215(1988)을 보라).

항-종양 제제로 사용되기 위한 적절한 방사성 동위원소 또한 당업계에 알려져 있다. 예를들어, ¹³¹I 또는 ²¹¹At가 쓰인다. 이러한 동위원소들은 종래의 기술을 사용하여 항체에 붙여진다(예, Pedley et al., Br.J. Cancer 68,69-73(1993)을 보라).

대안으로, 항체에 붙여지는 항-종양 제제는 프로드럭(prodrug)을 활성화하는 효소이다. 이 방법은, 프로드럭이 세포독성 형태로 전환되어야 하는 표적 부위에 도착할 때까지는 비활성화된 상태로 투여된다. 실험적으로 항체-효소 융합체는 환자에게 투여되고 처리된 조직부위에 편재된다. 처리된 조직의 해당부위에 독소제제로 전환이 일어나기 때문에 프로드럭은 그 이후 환자에게 투여된다.

다른 항-종양 제제는 IL-2(interleukin-2), IL-4(interleukin-4) 또는 TNF-α(tumor necrosis factor alpha)와 같은 사이토카인(cytokines)을 포함한다. 사이토카인은 다른 조직에 영향을 주지 않고 종양을 파괴하거나 해를 끼치도록 매개해 주기 때문에 항체는 사이토카인이 종양에 가도록 한다. 사이토카인은 편리한 재조합 DNA 기술을 사용하여 DNA 수준에서 항체와 융합될 수 있다.

본 발명의 양태로서, 항-IGF-ⅠR 또는 항-PDGFRα 항체들은 하나 또는 그 이상의 항-신생물제와 조합하여 투여된다. 병용 치료의 예로, 미국 등록 특허 제 6,217,866호(Schlessinger et al.)(항-신생물제와 조합된 항-EGFR 항체); 국제공개 특허 WO99/60023(Waksal et al.)(방사선과 조합된 항-EGFR 항체)를 보라. 어떤 적절한 항-신생물제는 화학요법 제제, 방사성 또는 그들의 조합으로 사용될수 있다. 항-신생물제는 알킬화 제제(alkylating agent) 또는 항-대사성물(anti-metabolite)일 수 있다. 알킬화 제제의 예로 시스플라틴 (cisplatin), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 멜팔란(melphalan), 및 다카바진(dacarbazine)을 포함하나 이에 국한되는 것은 아니다. 항-대사성물의 예로는 독소루비신(doxorubicin), 도노노루비신(daunorubicin), 및 파클리탁셀(paclitaxel), 젬시타빈(gemcitabine)을 포함하나 이에 국한 되는 것은 아니다.

유용한 항-신생물제는 또한 탁산(taxanes), 도세탁셀(docetaxel) 및 파클리탁실(paclitaxil)유사분열 억제제를 포함한다. 토포아이소머레이즈(topoisomerase) 억제제는 본 발명의 항체와 조합하여 쓰여질 수 있는 항신생물제의 다른 부류이다. 이것들은 토포아이소머레이즈Ⅰ 또는 토포아이소머레이즈Ⅱ의 억제제를 포함한다. 토포아이소머레이즈Ⅰ 억제제는 이리노테칸(irinotecan(CRT-11)), 아미노캠프토테신(aminocamptothecin), 캠프토테신(camptothecin), DX-8951f, 토포테칸(topotecan)을 포함한다. 토포아이소머레이즈Ⅱ 억제제는 에토포시드(etoposide(VP-16)), 및 테니포시드(teniposide(VM-26))를 포함한다. 다른 물질들은 항-신생물제로서 토포아이소머레이즈 억제 활성 및 효과에 대해 일반적으로 평가되고 있다. 보다 구체적 양태로서, 아이소머레이즈 억제제는 이리노테칸(irinotecan(CPT-11))이다.

본 발명의 구체적 양태로서, 항-IGF-ⅠR 항체는 도세탁셀과 함께 투여된다. 본 발명의 다른 구체적 양태로, 항-PDGFRα항체는 독소루비신과 함께 투여된다.

항신생물제가 방사선일때, 환자에게 처리되는 방사선은 외부적(external beam radiation therapy, EBRT) 또는 내부적(brachytherapy - BT) 모두 일수 있다. 투여되는 항신생물제의 양은, 예를 들어 제제의 종류, 치료되는 종양 종류와 정도, 및 제제의 투여 경로 등을 포함한 많은 인자들에 따라 정해진다. 그러나 강조할 것은, 본 발명은 특정량에 국한되지 않는다는 점이다.

항체 (항-IGF-ⅠR 및 항-PDGFRα) 와 항신생물제 처리가 더해진 항체는 애쥬번트 호르몬 치료(예, 유방암을 위한 치료)를 받거나 안드로겐-제거 치료(예, 전립선 암을 위한 치료)를 받은 환자에게 이용될 수 있다.

본 발명의 항-IGF-ⅠR 및 항-PDGFRα 길항제는 함께 투여되거나 종양의 성장이나 신생혈관형성에서 포함되는 다른 수용체를 중화시키는 수용체 길항제와 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 양태로서, 항-IGF-ⅠR 항체 및 항-PDGFRα 항체는 함께 투여될 수 있다. 다른 양태로서, 표적 종양에서 세포는 IGF-ⅠR과 PDGFRα를 함께 발현시키는데, 일반적 신호전달 요소들은 각 수용체를 통해 신로전달됨으로써 활설화 된다. 일반적 다운스트림 구성요소의 감소된 활성화에서 일반적으로 하나의 수용체는 억제되지만, 두 수용체 모두가 억제되는 것은 그 활성을 더욱 감소시킬 것이다. 다른 구체적 양태로서, 종양 또는 조직 주변의 특정 세포는 한 수용체의 상당한 양을 발현한다. 그리고 다른 세포는 두 번째 수용체의 상당한 양을 발현한다. 길항제들을 병용투여(coadministration)하는 것은 종양의 성장과 주변 세포의 파라크린 자극을 감소시킨다.

이특이적 항체는 병용투여에 대한 대안으로 제공될 수 있다. 이특이적 항체의 다양성은 다양한 바람직한 특징을 함께 갖도록 디자인되어 있다. 예를 들면, 이특이적 디아바디는 크기가 작다. 네 가지 항원의 결합부위(각 결합 특이성에 대해 두개씩)를 갖는 이특이적 항체는 자연적 항체에 대응하는 비슷한 결합능력을 갖는다. 특정 양면적 항체는 Fc 부위를 포함하므로, 자연적 항체의 효과기 기능(effector functions)을 유지한다 (예, CDC(complement dependent cytoxicity) 및 ADCC(antibody dependent cellular cytoxicity)). 국제공개특허 제 WO 01/90192호는 IgG-유사 사면적 항체(IgG-like tetravalent antibodies)를 기술하며, 국제공개특허 WO 2006/020258은 두개의 디아바디를 포함하고 효과기 기능을 유지하는 사면체 항체를 기술하고 있다.

다른 구체적 양태로서, 항-IGF-ⅠR 항체 또는 항-PDGFRα 항체 또는 다른 길항제는 상피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 수용체 길항제와 함께 사용된다(예, EGFR, Her2/erbB2, erbB3, erbB4). 특히 선호되는 것은 EGFR의 세포 밖 도메인에 결합하고 그 리간드들 하나 또는 그 이상의 결합을 막고/또는 EGFR의 리간드-유도된 활성을 중화시키는 항원-결합 단백질이다. EGFR 길항제는 또한 EGFR의 리간드에 결합하여 그 리간드의 EGFR 결합을 억제하는 항체들을 포함한다. EGFR의 리간드들은 EGF, TGF-α, 암피레귤린(amphiregulin), HB-EGF(heparin-binding EGF)및 베타셀룰린(betacellulin)등을 포함한다. EGF와 TGF-α는 EGFR-매개된 촉진을 유도하는 주요 내생적 리간드로 여겨지만, TGF-α는 신생혈관형성을 촉진하는 더 강력한 인자로 보여지고 있다. EGFR 길항제는 또한 다른 EGFR 수용체 소단위체(즉, EGFR 호모다이머(homodimer))과 함께 EGFR 이량체화 하는것 또는 다른 성장인자 수용체(즉, HER2)와 함께 이형이량체화(heterodimerization) 하는 것를 억제하는 물질들을 포함한다. EGFR 길항제는 나아가 생체분자들과 소분자들을 포함하는데, 그 예로 EGFR-매개된 신호 전달을 억제하기 위해 EGFR의 세포질 도메인상에 직적접으로 작용하는 합성 키나제 억제제(synthetic kinase inhibitors)가 있다. Erbitux^® (cetuximab)은 EGFR에 결합하여 리간드 결합을 막는 EGFR 길항제의 예이다. 소분자 EGFR 길항제의 하나의 예로 IRESS™(ZD1939)가 있는데, 이는 EGFR을 억제하기 위해 ATP-모방체로서 기능하는 퀴노잘린 유사체(quinozaline derivative)이다.미국 등록 특허 제 5.616.582호(Zeneca Limited); 국제공개특허 제 WO 96/33980호(Zeneca Limited) p.4를 보라; 또한, Rowinsky et al., Abstract 5 presented at the 37th Annual Meeting of ASCO, San Francisco, CA, 12-15 May 2001;Anido et al., Abstract 1712 presented at the 37th Annual Meeting of ASCO, San Francisco, CA, 12-15 May 200.을 보라. 소분자 EGFR 길항제의 또다른 예는 Tarceva^® (OSI-774)인데, 이는 4-(대체된페닐아미노)퀴노잘린(4-(substitutedphenylamino) quinozaline) 유사체 [6,7-Bis(2-methowy-ethoxy-quinazolin-4-yl]-(3-ethynyl-phenyl)amine hydrochloride]EGFR 억제제이다. 국제 공개특허 제 96/30347호(Pfizer Inc.) 예로, 2페이지 12줄에서 4페이지 34줄까지, 및 19페이지 14에서 17줄까지를 보라. 또한 Moyer et al., Cancer Res., 57:4838-48(1997);Pollack et al., J. Pharmacol., 291:739-48(1999)를 보라. Tarceva^® 는 p27-매개된 세포-주기 억류(cell-cycle arrest)를 가져오는 다운스트림의 PI2/Akt 및 MAP(mitogen activated protein) 키나제 신호 전달 경로의 인산화를 억제함으로써로써 기능할 것이다. Hidalgo et al., Abstract 2814 presented at the 37thh Annual Meeting of ASCO, San Francisco, CA, 12-15 May 2001을 보라.

다른 소분자들 또한 EGFR을 억제할 수 있다고 보고되는데, 이것들 중 많은 수가 EGFR의 타이로신 키나제 도메인에 특이적인 것으로 여겨진다. 이러한 소분자 EGFR 길항제의 몇몇 예로는 국제공개특허 제 WO 91/116051호, 국제공개특허 제 96/30347호, 국제공개특허 제 WO 96/33980호, 국제공개특허 제 WO 97/27199호(Zeneca Limited)에 기술되어 있다. 국제공개특허 제 WO 97/30034호(Zeneca Limited), 국제공개특허 제 WO 97/42187호(Zeneca Limited), 국제공개특허 제 WO49688호(Pfizer Inc.), 국제공개특허 제 WO 98/33798호(Warner Lambert Company), 국제공개특허 제 WO 00/18761호(American Cyanamid Company), 및 국제공개특허 제 WO 00/31048(Warner Lambert Company)호. 특정 소분자 EGFR 길항제의 예로는 Cl-1033(Pfizer)를 포함하는데, 이는 타이로신 키나제의 퀴노잘린(quinozaline(N-[4-3-cholro-4-fluoro-phenylamino)-7-(3-morpholin-4-yl-propoxy)-quinazolin-6-yl]-acrylamide) 억제제로, 특별히 EGFR에 특이적이고 이는 국제공개특허 제 WO 00/31048호의 8페이지 22-6줄에 기술되어 있다; PKI166(Novartis)는, EGFRdml 피롤로피리미딘(pyrrolopyrimidine) 억제제이고 국제공개특허 제 WO 97/27199호의 10-12페이지에 기술되어 있다; GW2016 (GlaxoSmithKline)은, EGFR와 HER2의 억제제이다; EKB569(Wyeth)는, 시험관 내 및 생체 내에서 EGFR 또는 HER2를 과발현하여 종양 세포의 성장을 억제한다고 보고된다; AG-1478(Tryphstin)은, EGFR 과 erbB-2 모두로부터의 신호를 억제하는 퀴노졸린 소분자이다; AG-1478(Sugen)은, 단백질 키나제 CK2를억제하는 양면기질(bisubstrate) 억제제이다; PD 153035(Parke-Davis)는, EGFR 키나제 활성 및 종양 성장을 억제하고, 배양된 세포에서의 세포사멸을 유도하고, 세포독성 화학치료요법 제제의 세포독성능을 향샹시킨다고 보고된다; SPM-924(Schwarz Pharma)는, 전립선암의 치료제로서 표적된 타이로신 키나제이다; CP-546,989(OSI Pharmaceuticals)는, 고형 종양(solid tumor)의 치료를 위한 신생혈관생성을 억제한다고 보고된다; ADL-681은 암의 치료를 위해 표적된 EGFR 키나제 억제제이다; PD158780은, 쥐의 A4431 이식(A4431 xenografts)에서 종양 성장률을 억제한다고 보고되는 피리도피리미딘(puridopyrimidine)이다; CP-358,744는, 쥐의 HN5 이식에서 자가인산화를 억제한다고 보고되는 퀸졸린(quinzoline)이다; ZD1839는 외음부(vulvar), NSCLC, 전립선, 난소, 및 결장(colorectal) 암를 포함하는 쥐 이식 모델에서 항 종양 활성을 가진다고 보고되는 퀸졸린(quinzoline)이다; CGP 59326A는, 쥐의 EGFR-양성 이식의 성장을 억제한다고 보고되는 피롤로피리미딘(pyrrolopyrimidine)이다; PD 165557(Pfizer); CGP54211 및 CGP53353(Novartis)는, 다이마닐노프탈이미드(dianilnophthalimides)이다. 자연적으로 유도된 EGFR 타이로신 키나테 억제제는 제니스타인(genistein), 허비마이신A(herbimycin A), 퀘르세틴(quercetin), 및 에브스태틴(erbstatin)을 포함한다.

EGFR을 억제한다고 보고되는바, 본 발명의 영역 내에 속하는 더 작은 분자들은 미국 등록 특허 제 5,679,683호에 기술되어 있는 것과 같은 삼환복합체 (tricyclic compounds); 미국 등록 특허 제 5,616,582호에 기술되어 있는 유사체와같은 퀴나졸린(quinazoline) 유사체; 그리고 미국 등록 특허 제 5,196,446호에 기술되어 있는 복합체와 같은 인돌 복합물(indole compounds)이다.

IGF-ⅠR 또는 PDGFRα를 따라 표적될 수 있는 또다른 수용체는 VEGFR(vascular endothelial growth factor receptor)이다. 본 발명의 양태로서, 항-IGFⅠR 항체 또는 항-PDGFRα 항체는 VEGFR 길항제화 함께 사용된다. 구체적 양태로서, 길항제는 VEGFR-1/Flt-1 수용체에 특이적으로 결합하여 사용된다. 또 다른 양태로서, VEGFR 길항제는 VEGFR-2/KDR 수용체에 특이적으로 결합한다. 특히 선호되는 것은 VEGFR-1 또는 VEGFR-2의 세포 밖 도메인에 결합하고, 그들의 리간드(VEGFR-2는 VEGF에 의해 가장 강하게 촉진된다; VEGFR-1은 P1GF에 의해 가장 강하게 촉진되고, VEGF에 의해서고 그렇다) 결합을 막으며/막거나 리간드-유도된 유도 활성을 중화시키는 항원-결합 단백질이다. 예를 들면, IMC-1121은 VEGFR-2에 결합하여 이를 중화시키는 인간 항체(국제 공개 특허 제WO 03/075840호;Zhu)이다. 또 다른 예는 수용성이고 세포 표면-발현된 VEGFR-1에 결합하는 MAb 6.12이다. ScFv 6.12는 생쥐 단일클론 항체 MAb 6.12의 V_L과 V_H 도메인으로 이루어져 있다. MAb 6.12를 생산하는 하이브리도마 세포주는 부다페스트 조약의 조항에 의해 PTA-3344호 ATCC로 기탁되어 있다(특허 절차 및 규제를 위한 미생물 기탁의 국제적 승인(Budapest Treaty)). 또다른 구체적 양태로서, VEGFR 길항제는 VEGFR 리간드에 결합하고 리간드에 의한 VEGFR의 활성을 저해한다. 예를 들면, Avastin^® (bevacizumab)은 VEGF에 결합하는 항체이다.

암발생(tumorigenesis)에 관여하는 성장 인자 수용체의 다른 예로 NGFR(nerve growth factor)과 FGFR(fibroblast growth factor)가 있다.

덧붙여 다른 구체적 양태로서, 항-IGF-ⅠR과 항-PDGFRα 항체들은 하나 또는 그 이상의 적절한 애쥬번트(adjuvants)와 함께 투여될 수 있는데, 예를 들면 싸이토카인(cytokines(예를 들면, IL-10 및IL-13) 또는 케모카인(chemokine), 암-연관 항원, 및 펩티드와 같은 것을 포함하나 이에 국한되지는 않는 다른 면역 촉진제등이 그것이다. 예로, Larrivee et al., supra.를 보라. 하지만, 다행히도 오직 항-IGF-ⅠR또는 항-PDGFRα 항체만을 투여하는 것은 치료요법적으로 효과적인 방법으로서 종양의 진행을 예방, 억제 또는 감소에 충분하다.

복합 치료방법으로, 그들의 어떠한 조합은 물론, 또 다른 제제로 치료를 개시한 후에, 또는 그 동안, 항-IGF-ⅠR 또는 항-PDGFRα 항체는 먼저 투여된다. 즉, 항신생물제 처리를 개시한 후나 그동안, 전과 그동안, 전과 후, 그동안과 후, 또는 전을 의미한다. 예를 들어, 항체는 방사성 치료를 개시하기 전에 1에서 30일 사이에 투여될 수 있고, 바람직하게는 3에서 20일, 더욱 바람직하게는 5에서 12일 사이에 투여될 수 있다. 본 발명의 구체적 양태로서, 화학요법은 동시에 함께, 또는 더 바람직하게는 항체 치료 후에 투여된다.

본 발명에서 어떠한 적절한 방법이나 경로도 본 발명의 항체를 투여하기 위해 사용될 수 있고, 항신생물제 및/또는 다른 수용체의 길항제를 병용투여를 최적으로할 수 있다. 본 발명에 따라 이용되는 항신생물제의 처방 계획은, 환자의 종양 상태의 처리를 위해 최상으로 적절하다고 여겨지는 어떠한 처방 계획도 포함한다. 다른 악성 종양들은 항-종양 항체 및 특이적 항신생물제의 사용이 요구될 수 있는데, 이러한 항신생물제는 환자마다 다르게 결정된다. 투여의 경로는 예를 들어 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 또는 근육내 투여를 포함한다. 투여되는 길항제의 양은 많은 인자들에 의해 결정되는데, 예를 들어 길항제의 타입, 치료되는 종양의 타입 및 정도 및 길항제의 투여의 경로를 포함한다. 하지만 강조할 것은, 본 발명이 투여의 특정 경로나 방법에 의해 제한되는 것은 아니라는 점이다.

당업계의 기술중 하나로, 환자 각각의 내성 및 사용되는 억제제의 약제학(phrmacological)및 약동학적 특성(pharmacokinetic porperties)에 따라 결정되는 처방의 빈도와 양을 결정하는 것이다. 이상적으로는, 제제가 사용되기 위해 포화가능한 약동학(saturable pharmacokinitics)을 달성하는 것이 바람직하다. 항-IGF-ⅠR 과 항-PDGFRα 항체를 투여하는 양은 일정 범위 일 수 있는데, 예를 들면, 약 10 에서 약 1000㎎/㎡ 일 수 있고, 바람직하게는 약 200에서 약 400㎎/㎡일 수 있다. 예를 들면 약 200 에서 약 400㎎/㎡ 의 투여는 더 추가적인 매일 또는 매주 투약 범위일 수 있다. 환자는 부작용 여부에 대해 체크되고, 부작용이 심각한 경우, 치료는 중단된다.

효과적인 양을 결정하기 위한 치료과정을 체크하는 방법에 대해서는 당업계에서 하나의 기술로 알려져 있다. 전립 암으로부터의 골 전이를 위해, 이런 방법 중 하나는 PSA 수준의 검사이다. 골 전이 여부을 검사하는 다른 방법은 뼈 스캔(bone scans)과 MRI를 포함한다.

CTIBL(cancer-treatment-induced bone loss)을 가진 환자는 위험성이 있고 치료가 어려우며(예, 유방암에의 애쥬번트 호르몬을 투여받은 환자 또는 전립선암에의 안드로겐-제거 치료를 받은 환자), 앞에서 언급한 치료는 CTIBL의 예방을 위한 제제, 예를 들면 비스포스포네이트(bisphosphonates)와 같은 제제의 투여 등이 추가될 수 있다. 비스포스포네이트는 예를 들면 클로드로네이트(clodronate), 리제드로네이트(risedronate), 및 졸레드로닉산(zoledronic acid)를 포함한다.

이 출원서 전체를 통해 다양한 출판물, 참고 문헌, 교과서, 기술서, 특허 및 특허출원이 언급되고 있다. 이들 출판물, 특허, 특허출원 및 다른 문헌에 개시되거나 교시된 사항들은 본 발명이 보유하는 기술을 더 잘 표현하기 위해서 전체로서 이 출원서의 참고문헌으로 여기에 포함된다.

여기에 나타난 발명의 원리에 의한 변형은 당업계에 알려진 기술로부터 제조될 수 있고, 이러한 변형은 본 발명의 영역 내에 포함되는 것임을 밝힌다.

다음의 예들은 발명을 더 구체적으로 설명하는 것이지만, 어떤 방법으로도 발명의 영역을 제한하지는 않는다. 벡터와 플라스미드를 제조하여 도입하는 방법, 및 항체와 항체 단편들의 발현과 같은 편리한 방법의 구체적인 기술은 수많은 출판물에 제시되어 있다. 이러한 출판물들에는 Sambrook, J et al.,(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press; Coligan, J. et al.(1994) Current Protocols in Immunology, Wiley & Wons, Incorporated; Enna, S.J. et al.(1991) Current Protocols in Pharmacology, Wiley & Sons, Bonifacino, J.S. et al.(1999) Current Protocols in Cell Biology, Wiley & Sons.를 포함한다. 여기에 언급된 모든 참고 문헌들은 그들 전체로서 본 명세서에 포함된다.

본 발명에서 제공하는 IGF-ⅠR 길항제 및/또는 PDGFRα 길항제 및 인간 PDGFRα에 결합하여 수용체의 활성을 중화시키는 항체는 골암, 특히 전이성 골암 치료에 유용하다.

실시예1

종양 성장에 있어서 IMC-A12와 도세탁셀(docetaxel)의 효과

앞에 기술된 바와 같이 안드로겐-비의존적 (AI)LuCaP 35V의 종양 조각(20 에서 30㎣)은 32마리의 6주된 SCID 제거된 생쥐 피하에(subcutaneously(s.c.)) 이식되었다(4). 이식된 종양이 150-200㎣의 부피에 이르게 되는 것을 관찰하고, 동물들을 치료 연구를 위해 무작위적으로 네 그룹으로 나눈다. 그룹 1 동물들은 도세탁셀 20㎎/㎏을 투여받는다. 그룹 2 동물들은 도세탁셀 10㎎/㎏을 투여받는다. 그룹 3 동물들은 10㎎/㎏의 도세탁셀과 40㎎/㎏의 A12를함께 투여받는다. 그룹 4의 동물들은 20㎎/㎏의 도세탁셀과 40㎎/㎏의 A12를 투여받는다. 모든 처리는 복막내(intraperitoneally(i.p.) 투여된다. 도세탁셀은 일주일에 한 번 투여된다. A12는 일주일에 세 번 투여된다. 모든 동물들은 사주 간 처리되며 전에 안락사 전에 사주 간 더 관찰된다. 종양은 주단 2번씩 측정되며 종양의 부피는 다음 공식에 의해 측정된다. 부피 = L X W²/2. University of Washington IACUC에 따른 동물처리 계획에 따라, 몇몇의 동물은 종양의 부피가 1000㎣에 이를 때, 또는 동물의 무게가 처음의 최대 20%이하로 감소한 때 안락사 된다. 동물 무게는 일주일에 두 번 측정된다. 혈액 샘플들은 매주 오비탈 시너스(orbital sinus)로부터 채취된다. 혈청(serum)이 분리되고, IMx 전체 PSA분석(the IMx Total PSA Assay)을 사용하여 PSA 수준이 결정된다(Abott Laboratories, Abott Park, IL). 생체내 종양 세포 증식률의 측정을 위해 동물들이 안락사 되기 1시간 전에 종양에 BrdU가 주입된다.

안락사시킨 후, 종양이 수집되고 반으로 나누어진다. 종양의 일부는 10% NFB(neutral buffer formalin) 및 파라핀(paraffin)에 고정된다. 5 마이크론 절단부분들(five micron sections)은 IHC(immunohistochemistry) 염색을 위해 준비된다. 종양의 나머지 부분은 기술적으로 잘리고 70㎛ 나일론 체를 통해 걸러짐으로써 단일 세포로 분리된다.

도.1 에서 보듯이, LuCaP 35V 이식종은 어떤 처리도 하지 않은 경우 평균 362.0±72.0㎣/week의 성장률로 쥐에서 매우 공격적으로 성장했다. 아무 처리도 하지 않은 군의 모든 동물들은, 최대 1000㎣ 부피의 종양으로 인해, 실험군 처리 시작 후 3주 내에 희생되었다. 동물들이 40㎎/㎏의 A12만으로 처리되었을 때에는, 그 처리 기간 동안 종양의 성장률이 192.7±35.6㎣/week으로 감소하였다. 도세탁셀을 10㎎/㎏ 양으로 동물에게 투여할 경우, LuCaP 35V 종양 성장률은 평균 29.6±6.1㎣/week로 감소하였다. 도세탁셀이 A12 처리와 병용 투여된 경우, LuCaP 35V 종양 성장률은 더욱 감소하여 평균 7.9±1.0 ㎣/week가 되었다(도.1b). A12와 병용 투여된 도세탁셀의 억제 효과는 처리 종료 후 4주간 지속되었다. 도세탁셀의 양을 늘려(20㎎/㎏) 동물에게 투여한 경우, A12와의 병용투여 여부에 관계가 없었고, 종양의 부피는 4주의 처리기간 동안 증가하지 않았다; 반면 감소되는 종양 부피의 경향은 관찰되었다. 그러나, 4주 동안의 치료가 종료된 후, 도세탁셀과 A12를 병용투여한 동물군에서 종양 부피의 감소는 계속되었다. 반면, 도세탁셀만을 처리한 동물 군에서는 종양 부피가 평균 27.0±16.1㎣/week의 비율로 계속 성장하였다. 이러한 결과로 볼 때, 투여되는 도세탁셀의 양에, A12의 처리를 병용하는 것은 이들의 처리기간 동안 또는 처리 후에 종양 성장에 있어서 도세탁셀의 억제효과를 향상시킨다는 것을 알 수 있다.

PSA는 전립선 종양 성장을 평가하는 임상적 기준(clinical parameter)으로 흔히 사용된다. 처리 후 또는 처리 동안 동물에서 혈청 PSA 수준이 측정된다. 도 1c에서 보여주는 바와 같이, 4주 처리기간 동안 A12와 도세탁셀로 처리한 동물군 또는 20㎎/㎏의 도세탁셀만 처리한 동물군에 있어서는 PSA 혈청 수준에 큰 변화는 없고, 종양 성장의 억제가 일관되게 일어난다. 처리 종료 후에는, 도세탁셀로만 처리한 동물군에 있어서는 혈청 PSA 수준이 증가되는 반면, A12와 도세탁셀을 병용하여 처리한 동물군에 있어서는 일관되게 유지되거나 혹은 더욱 감소하는 것으로 나타난다. 도세탁셀 및 A12 처리된 동물군의 종양 성장의 후-처리 억제에 있어서 이러한 데이타가 지속적으로 유지된다.

항-IGF-ⅠR 항체와 병용되는 도세탁셀에 의한 세포사멸의 유도. 세포주기 및 세포 생존에 있어서, 실험적 최종 목적인 도세탁셀과 A12 처리의 생체 내 결합 효과는, 앞에서 언급한 바와 같이 TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labeling) 분석 및 Apop-dirct kit(BD BioScience)를 사용한 PI 염색등으로 측정될 수 있다. 간단히 말해, 단일-세포 현탁액(single-cell suspension)으로부터 1x10⁶ 세포를 10% NBF(neutral buffer formalin)에 고정시킨 다음, 20℃에서 30분간 70% 에탄올 알코올(ethanol alchol)로 처리한다. 몇 번 세척한 후, 세포는 0.1% Triton X-100에 투과시키고, 37℃에서 1시간 동안 FITC-융합된 dUTP와 TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase enzyme)에 배양한 후, 60분간 실온(room temperature)에서 PI/RNase(PI의 200㎍/㎖, 50㎍/㎖의 RNase 버퍼에 배양한다. 샘플들은 BD FACscan을 이용한 유세포분석기(flow cytometry)에 의해 분석된다. 데이타는 CellQuest^PRO 소프트웨어(software)로 분석된다.

처리 종료 후 4주, A12와 함께 도세탁셀로 처리해 온 동물군의 종양은 사용된 도세탁셀의 양와 관계없이, 현저한 비율로 세포 사멸이 관찰된다(10㎎/㎏의 도세탁셀 처리 군에서는 66.7%, 20㎎/㎏의 도세탁셀 처리 군에서는 77.8%)(도. 2b 및 표 1). 이러한 종양군에서 일어나는 평균적 세포사멸 현상 비율은 15.0±4.3%이다. 도세탁셀만을 처리한 동물군의 종양에서는 세포사멸이 관찰되지 않는다. 대신, 대다수의(10㎎/㎏ 도세탁셀이 처리된 군의 88% 및 20㎎/㎏ 도세탁셀이 처리된 군의 100%) 종양들은 일반적 세포주기과정을 수행한다(도.2a 및 표3).

서로 다른 처리 종료 후 종양세포 증식 능력을 더 잘 측정하기 위해, 항-BrDu 항체로 염색된 파라핀-섹션(paraffin-section)이 사용된다. 종양 샘플들은 10% NBF에 고정되고, 파라핀에 박혀, 5㎛ 크기로 슬라이드 위에 절단된다. 파라핀화된 것을 제거하고(deparaffinazation), 재수화(rehydration)한 후, 95℃에서 2 X 5분동안 0.01M 의 시트르산(citric acid(pH 6.0))으로 항원을 재수거한다. 슬라이드는 30분간 차갑게 보관되고, 이어 PBS로 씻어준다. 메탄올(methanol)내 0.3% H₂O₂ 로 15분간 배양함으로써 내인성 페록시다아제(endogenous peroxidase) 활성이 억제된다. 1시간 동안 PBST(PBS contatining 0.05% Tween 20)내 1.5% 정상 염소 혈청으로 억제한 뒤,슬라이드는 쥐의 항-BrdU 항체(1㎍/㎖)와 함께 1시간 동안 배양된 다음, 비오틴화된(biotinylated) 염소 항-쥐 IgG와 함께 30분, 페록시다아제-표지된 아비딘(peroxidase-labeled avidin)에 30분(Santa Cruz Biotechnology) 및 DAB(diaminobenzidine)/과산화수소(hydrogen peroxide) 크로모젠(chromogen) 기질(Vector Laboratories, Burlingame, CA)에 5-10분간 배양하였다. 모든 배양 과정은 실온에서 수행되었다. 슬라이드는 헤마토자일린(hematoxylin(Sigma))을 사용하여 대비염색제로 착색되었고, 퍼마운트(permount(Fisher Scientific,Fair Lawn, New Jersey))로 고정되었다. 대조군으로, 초기 항-BrdU 항체 대신 쥐의 IgG(Vector Laboratories)가 사용되었다. 슬라이드는 짜이즈 현미경(Zeiss Microscope)로 검토되었고, 전자 이미지를 얻어내었다. 각 섹션 중 10개 표본을 무작위적으로 관찰하여 BrdU-표지된 핵의 수와 전체 핵의 수를 계산하였다. BrdU-양성 핵의 수를 전체 핵의 수로 나누어 증식 정도(Proliferation index)를 계산하였다. 슬라이드 당 10개 영역에서 계산되어 졌다. 헤마토자일린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)을 사용하여 H&E 염색이 수행되었다.

도세탁셀과 A12로 처리한 동물들에 있어서, 동량의 도세탁셀만을 처리한 동물들에 비해 BrDu 흡수가 현저히 적었다(도3). BrDu 결합의 이러한 데이타는 위의 세포주기 및 세포사멸의 관찰에 있어서도 유지되며, A12가 도세탁셀의 세포 독성을 현저히 향상시킴을 시사한다.

항-IGF-ⅠR과 도세탁셀을 함께 처리한 경우와 도세탁셀만을 처리한 종양 내에서 유전자 발현의 분화조절. A12에 의한 도세탁셀의 현저한 상승효과에 대해 가능한 메카니즘을 확인하기 위해, 도세탁셀 20㎎/㎏을 투여한 동물들과 A12와 함께 도세탁셀 20㎎/㎏을 투여한 동물들의 종양에 cDNA 마이크로어레이(microarray) 분석을 사용한 IGF-ⅠR 발현이 조사되었다. SAM 분석에 기초하여, 도세탁셀만을 처리한 종양과 비교하여 A12와 도세탁셀이 함께 처리된 종양 세포에서만 발현되는 49 유전자가 분석되었고, 두 그룹간에 2배 이상 차이가 났고, FDR(false discovery rate)은 10%보다 낮은 값을 나타냈다(데이타는 제시되지 않는다). 세포사멸 또는 세포주기의 조절에 대해 잠재적으로 관여하는 13개 유전자들이 분석되었다(표4). 13개 유전가 모두가 두 처리 군에서 적어도 2배 이상 차이가 났고 0.02%보다 낮은 FDR값을 나타냈다. 도세탁셀만을 처리한 종양과 비교해, 도세탁셀과 A12를 함께 처리한 종양에서 9개의 유전자는 하향-조절(down-regulated)하고 4개의 유전자는 상승-조절(up-regulated)함을 알 수 있었다.

선택된 유전자들은, 실시간 RT-PCR에 의해 확인되었다. 표적 cDNA의 표준 PCR 단편이 정제되었다. 10ng/㎕에서 10^-3 pg/㎕의 표준 희석 시리즈(series)는 표준 곡선(standard curves)를 만들기 위해 실시간 RT-PCR에 사용된다. Superscript First Strand Synthesis System(Invitrogen)을 이용한 첫-표준 cDNA 합성을 위해 풀링된(pooled) 종양의 각 그룹으로부터 전체 BNA의 1㎍이 사용된다. 실시간 RT-PCR은 cDNA 첫 표본의 1㎕를 포함한 반응 혼합물 20㎕, 특정 프라이머 세트(primers sets), 및 Lightcycler FastStart DNA Master Plus SUBR Green using a Roche Lightcycler following the manuufacturer's protocol(Roche, Nutley, NJ) 에서 수행되었다. RT-PCR 생산물은 Lightcycler 소프트웨어 v3.5를 사용하여 멜팅 커브 분석(melting curve analysis)되었다. 앰플리콘(amplicon) 크기는 겔 전기영동(gel elecrphoresis)에 의해 정해진다. 각 샘플은 듀플리케이트(duplicate)로 분석된다. 결과는 도.4에 나타나 있다.

하향-조절 유전자 중 TUBB는 도세탁셀 저항성을 보이고 있으며(Tanaka et al., 2004, Int. J. Cncer 111,617-26), BIRC 5(survivin)의 증가된 발현은 공격적 전립선암과 항안드로겐 치료의 저항이 연관되어 있다고 여겨지고 있다(de Angelis et al., 2004, Int. J. Oncol. 2, 1297-88; Zhang et al., 2005, Oncogene 24, 2474-82). 나아가, TUBB는 형질전환을 매개하는 IGF-ⅠR에 포함되는 IGF-ⅠR-조절 유전자이다(Loughran et al., 2005, Oncogene 24, 6185-93). 네 개의 상승-조절 유전자의 IGFBP3은 리간드 의존적 방법에서, 전립선 종양 세포의 세포사멸을 유도하는 IGF-리간드 신호전달을 억제한다고 보여지고 있다(Grimberg et al., 2000, J. Cell. Physiol. 183,1-9).

A12의 혈청 수준에서의 후-치료. A12의 혈청은 A12와 도세탁셀을 투여한 동물들에서 측정된다. 혈청에서의 A12는 처리 중지 후 2주간 100배 감소 되었고, 처리 중지 후 4주간 매우 낮은 수준으로 관찰되었다(도.5).

전체적인 세포독성. 도세탁셀과 IMC-A12의 병용투여에 대한 세포독성이 실험되었다. 대조군인 종양을 같는 동물군과 비교할 때, 도세탁셀만을 투여하거나 다른 제제를 병용투여하여 처리한 동물군에서 A12는 생쥐의 IGF-ⅠR의 95% 교차 활성보다 더 크지만, 비정상적으로 매일 활성 또는 행동의 변화가 관찰되지는 않았다. 세포 주기 및 세포사멸 분석에 의할 때, 어떤 처리 그룹에서도 신장 세포의 현저한 효과는 관찰되지 않았다(데이타는 제시되지 않았다). 처리 그룹 사이에서 현저한 몸무게의 변화도 관찰되지 않았다(도.6).

골 전이를 위한 항-IGF-ⅠR 항체 치료. 전립선 암 세포에 의한 뼈에서의 전이성 성장에서 항-IGF-ⅠR 항체로 처리한 효과는 SCID 쥐의 정강이(tibia)에 직접적으로 주입한 전립선 암 세포를 이용해 측정되었다. 이 방법에 의하면, 전이성 종양은 혈액 순환(circulation)으로부터 주화성 의존적 침투(chemotaxis dependent invasion)에 관계없이 직접적으로 전이된다. 종양 주(tumor lines)의 다양성은 뼈 전이를 함으로써 가능하다. 이러한 것은 골용해성 결손을 생산하는 PC-3, LuCaP35, 및 LnCaP 세포 그리고 조골 세포성 결손을 생산하는 LuCaP 23.1 세포를 포함한다.

IGF-ⅠR을 생산하는 LuCaP 23.1 세포들은, 뼈 환경에서 80%에 이르는 흡수율(take rate)을 가지며 osteoblastic 반응을 일으킨다. 예비적 실험으로, LuCaP 23.1 샘플은 대조군 경골(대조군의 254-503%, p=0.024)과 비교할 때, 종양 내의 조직 부피(%BV/TV)에 대해 뼈 부피에서 현저하게 증가하였다. 경골 내의 모든 LuCaP 23.1 종양은 정상 샘플에서는 나타나지 않는 새로운 골질 섬유주(bony trabeculae)에서 나타났고, 정상 골수를 대체하는 종양 중심에서도 많은 수로 나타났다. 몇몇 종에서 종양과 뼈 성장은 원래의 뼈 밖으로까지 신장하였다. 또한 제거 후에는 LuCaP 23.1 샘플의 증가된 %BV/TV가 관찰되었다; 종양화된 경골의 %BV/TV는 종양화되지 않는 경골(p=0.024)의 그것에 비해 212-354%를 나타냈다. LuCaP 23.1의경골 내 이식은 새로운 뼈 형성을 촉진하는 종양 세포를 암시하는 것임이 관찰되었다. 더 나아가, 종양세포는 조골 세포성 골 전이의 인간 샘플과 많은 유사성을 보이는데, 여기에는 종양 중심에서의 많은 수와 무기물을 함유한 뼈 양의 증가등을 포함한다.

IMC-A2, LuCaP 23.1로 처리한 효과를 측정하기 위해,이식 종양은 SCID 쥐에 융합시키고, 종양 성장 정도를 측정하기 위해 격주로 혈청 PSA 수준을 측정하였다. 모든 동물들은 경골 종양 세포 융합 전 2주 전에 거세되었다. 혈청 PSA 수준이 5-10 ng/㎖(종양이 이식되었음을 알 수 있는 수준)가 되었을 때 실험 쥐에게 IMC-A12의 투여가 시작되었다. 6주 동안 일주일에 3회씩 40㎎/㎏의 IMC-A12를 i.p.에 주입하였다.

종양화된 경골 및 종양이 없는 반대쪽 경골의 BMD(bone mineral density)는 종양 세포 주입 부위, 또는 융합시 반대쪽 경골에 대응하는 부위 2.5㎜ x 2.5㎜ 영역을 Dual X-ray absorptiometry(PIXImus Lunas densitrometer)로 측정한다. 혈청 PSA 수준, 뼈 손실의 X-ray 양상(radiographical appearance)에 기초하여 거세된 후에도 대조군의 뼈 손실이 다시 나타나는 경우, 또는 동물의 면역기능 등이 제대로 발휘되지 못하는 경우 모든 동물들은 희생되었다. 동물들을 희생시키기 전 한 시간은 BrdU를 주입하여, 종양 세포 증식을 관찰하였다. X-ray는 희생시키기 전에 촬영하였고(FaxitronX-ray), 양 경골의 BMD는 희생될 때 측정하였다.

혈청 PSA 수준은 IMC-A12-처리된 쥐에서 현저하게 감소하며(도.7), 조골 세포성 전이성 종양의 성장과 연관된 BMD의 증가도 현저하게 감소하였다(표5). 종양-없는 다리의 BMD 수치로 IMC-A12 치료가 뼈 밀도의 감소 (골다공증(osteoporosis))를 야기하지 않는다는 것을 알 수 있었다. IMC-12-처리된 쥐와 처리되지 않은 쥐의 X-ray는 처리된 쥐에 있어서 종양 진행이 현저하게 감소하고 보호된다는 사실을 보여준다(도.8).

골 전이를 위한 항-IGF-ⅠR 항체와 도세탁셀의 병용. SCID 쥐는 경골 종양 주입 2주 전에 거세된다. 골 전이는 LuCaP 23.1 전립선 암 세포를 쥐의 경골에 직접 주입, 조골 세포 손실이 증가하면서 발생된다. 이종이식종은 IGF-ⅠR을 발현시킨다. 혈청 PSA 수준은 종양 성장을 측정하기 위해 격주로 측정된다. 종양이 정착되었다고 알 수 있는 수준인, 혈청 PSA 수준이 5-10ng/㎖에 이를 때, 동물들을 무작위적으로 4 그룹으로 나눈다.

한 그룹은 IMC-A12 + 도세탁셀 20㎎/㎏을 i.p.(복강내)에 일주일에 한 번 6주 동안, 그리고 두 번째 그룹은 IMC-A12 + 도세탁셀 10㎎/㎏을 일주일에 세 번 6주 동안, 그리고 두 그룹은 IMC-A12 40㎎/㎏을 i.p.에 일주일에 3번씩 6주 동안 주입하였다. 대조군은 IMC-A12없이 10 또는 20㎎/㎏ 도세탁셀만을 i.p.에 주입하였다.

동물들은 매주 PSA를 측정하였다. 처리 종료 후에, 도세탁셀만을 투여한 그룹에서 종양이 다시 자라는 것으로 보일 때까지 계속적으로 매주 PSA를 측정하였다. 도세탁세만을 처리한 그룹에서의 PSA 값이 증가함에 따라(처리하지 않은 동물에서보다 더 느린 비율이기는 하지만), IMC-A12 + 도세탁셀 처리된 쥐 수준 감소, PSA 수준과 다른 동물들에서의 PSA 수준은, 떨어지기 시작한다. PSA 수준의 감소는 계속적으로 측정되며, 처리가 끝난 뒤 6주 후에도 그러하다.

위에서 제시된 바와 같이, BMD 값은 이종 이식때, 희생될 때, 및 희생되기 바로 직전 X-ray 촬영시에 측정되었다. IMC-A12 + 도세탁셀 처리된 그룹에서 BMD 값은 거의 증가하지 않거나 전혀 증가가 없고, X-ray 촬영은 조골 세포성 활성에 대한 조짐도 거의 보이지 않거나, 전혀 보이지 않는다.

골 전이를 위한 항-IGF-ⅠR 항체와 도세탁셀의 병용. LuCaP 23.1 인간 전립선 종양 조각(20에서 30㎣)은 기계적으로 잘려진다. 21마리의 쥐를 무작위적으로 세 그룹으로 나누어 연구에 사용하였다. 종양 주입 후, 혈청 PSA는 매주 측정되었다. 종양 성장을 알리는 기준인, 혈청 PSA 수준 5-10ng/㎖일 때 치료가 시작되었다. 그룹 1은 통제 용액 살린 버퍼(control vehicle saline buffer)를 준다. 그룹 2는 도세탁셀 20㎎/㎏을 i.p.에 일주일에 한 번씩 4주간 투여한다. 그룹 3은 도세탁셀 20㎎/㎏을 일주일에 한 번, 및 A12 40㎎/㎏을 일주일에 세 번씩 4주간 투여한다. 치료에 대한 반응이 조골세포성인지 골용해성인지를 확인하기 위해, 모든 치료군의 마지막에 동물들의 Dexa-scan과 x-ray를 촬영함으로써 BMD를 측정한다.

도세탁셀만으로 처리, 또는 도세탁셀과 A12를 병용하는 처리는 혈청 PSA 수준을 억제함으로써 LuCaP 23.1 종양 성장을 현저하게 억제하고(도.9a), 두 처리에 있어서 현격한 차이는 없었다. 그러나 처리 중단 후, 도세탁셀만으로 처리했던 동물에서는 혈청 PSA가 증가하기 시작하여, 종양의 성장을 알린다; 반면에 도세탁셀과 A12를 병용하여 처리하였던 동물에서는 혈청 PSA 수준이 계속적으로 억제되는 것을 관찰할 수 있었고, 이는 처리-후 종양 정지의 기간이 계속적으로 유지됨을 의미한다. 혈청 PSA 수준은 BMD(bone density)와 x-ray 촬영된 종양화된 뼈의 크기간에 상관관계가 있음을 보여주었다(도.9b). 5주째, 대조군에서의 평균 골밀도, 도세탁셀 20, 및 A12와 병용되는 도세탁셀 20 처리된 동물군은 각각, 0.112±0.01, 0.09±0.02, 및 0.05±0.009(mean±SEM)이었다. 치료에 있어서 골밀도의 감소는 뚜렷한 경향이다.

실시예2

골수 천자-유도된 Akt 인산화. 정상 남성 제공자(18-45세)로부터의 골수 샘플은 Cambrex(Poietics™ Donor Program)에 의해 공급된다. 샘플들은 수용상(soluble phases) 및 세포상(celluar phases)을 분리하기 위해 1500rpm에서 원심분리된다. 상층액은 0.8㎛와 0.22㎛의 필터를 사용하여 분리된다. 1㎖ 배지에 있는 세포에 골수 천자액 50㎕이 투여된다(1:20 최종 희석).

혈청의 존재하에 수행된 실험에서, 골수에 노출되기 전 24시간 동안 10% FBS와 50㎍/㎕ 겐타마이신(gentamycin)이 보충된 DMEM에 세포가 배양되었다. 혈청 결핍하의 실험(영양결핍된 세포, (starved cells))에서, PBS로 두 번 세포를 세척하였고, 혈청-결핍 DMEM(serum-free DMEM) 성장배지로 교체하였으며, 골수에 노출시키기 전 4시간 동안 배양되었다. Whenused, AG-1296, a specific inhibitor of PDGF 수용체의 특이적인 억제제는(Rice et al., 1999, Amer. J. Path. 155, 213-21) 골수 천자에 노출 되기 30분 전 첨가되었다. IMC-3G3 항체는 이하에서 언급한 바와 같이 사전-처리 기간에 기술된 바와 같이 투여되었다.

Akt의 골수활성은 PC3-ML에서 관찰되는데, 이는 PDGFRα를 발현시키는 세포로, DU-145 세포에서는 관찰되지 않는다. 한 실험으로, Akt 활성하에서의 혈청 구성 성분 효과의 감소를 위해, 혈청 결핍 배지에서 4시간 동안 미리 배양되었다. PC3-ML 세포에서 골수 추출물의 추가는 건강한 Akt 인산화를 가져왔으나, DU-145는 그렇지 않았다(도.10A). 반응의 현저성을 측정하기 위해, 혈청을 포함한 두 번째 실험이 수행되었다. 혈청의 존재하에 골수 천자에 의한 PC3-ML 세포에서 Akt 인산화의 왕성한 촉진도 관찰되었다(도.10B). DU-145 세포에서는 작은 반응만 유도되었다.

PDGFRα-매개된 Akt 인산화. PDGF-AA 및 PDGF-BB를 모두 분비하는 조골세포(osteoblast) 및 파골세포(osteoclast)는 골수의 용해성 환경에서 이러한 성장 인자를 제공하는 것으로 여겨진다. 골수 추출물에 대한 PC3-ML 세포의 대응성이 PDGFRα을 통한 신호 전달과 연관관계가 있는지 여부를 알아보기 위해, PC3-ML 세포는 20μM의 AG-1296의 존재 또는 결핍 상태에서 골수 천자에 노출된다. AG-1296의 이러한 농도는 PDGF-BB 유도된 Akt 활성을 완전히 억제한다(도.11A). AG-1296은 40%이상으로 골수천자 유도된 Akt 활성을 억제한다. 이러한 현상으로 볼 때 PDGFRα 신호는 골수 유도된 Akt 활성에 매우 중요한 역할을 한다는 사실을 알 수 있다.

골수천자의 다른 구성성분과 관계된 PDGFRα신호에 대한 PDGF-AA 및 -BB의 직접적 기여도 연구되었다. 서로 다른 세 개의 주개들로부터 골수천자에 있는 PDGF-AA 및-BB의 농도는 400pg/㎖에서 2ng/㎖의 범위임이 확인되었다. 골수천자의 20배 희석액을 주었을 때, 테스트 세포들은 20에서 100pg/㎖ 사이의 PDGF-AA 및-BB 농도에 노출되었다. 따라서 PC3-ML 세포들은 PDGFR-AA 및-BB 각각 100pg/㎖로 처리되었다. Akt 인산화는 골수 천자로 획득된 것의 10% 이하였다(도.3C 및 D). 따라서, PDGFRα 신호에 의한 Akt 경로의 활성은, PDGF-AA 및-BB와는 다른 PDGFRα리간드가 포함되고/포함되거나 리간드에 직접적으로 결합함으로써 PDGFRα의 활성이 나타나는 것과는 다른 메카니즘이 포함될 수 있다는 사실을 알 수 있다.

항-PDGFRα 항체에 의한 Akt 인산화의 억제. 인간 PDGFRα에 특이적인 항체인 IMC-3G3를 중화하는 것은, PC3-ML 세포에서의 Akt 인산화를 억제시키는 능력도 갖는다는 사실이 연구되었다. 30분의 사전-배양과 20㎍/㎖의 농도는 PDGF-BB 30ng/㎖의 자극효과를 중화시켰다(도.12A). 항체와 함께 처리한 경우 골수 유도된 Akt 인산화의 약 40% 억제를 가져왔다(도. 12B 및C). Akt 인산화에서 IMC-3G3의 억제 효과는 사전 배양의 기간에 좌우되고, 30분 배양 시간(도.12B 및 C)에 비해 120분 배양시간인 경우 가장 현저한 효과를 나타내었다(도.12D). IMC-3G3가 PDGFRα의 내부이행을 유도한다는 설명이 가능하며, 억제 효과는 리간드 결합을 억제하는 것 뿐만 아니라 원형질막(plasma membrane)으로부터의 수용체를 제거하는 것으로도 가능할 수 있다는 설명이 가능하다.

실시예3

인간 항-PDGFRα항체의 분리. 인간 항- PDGFRα 단일클론 항체는 인간 감마 면역글로불린 중사슬 및 카파 면역글로불린 경사슬을 발현할 수 있는 형질 도입 쥐(Medarex Inc., Sunnyvale, CA)를 이용한 표준 하이브리도마 기술로부터 제조 되었다(Harlow & Lane, ed., Antibodies: aA Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 211-213(1998), 여기의 참고문헌과 함께 보라). 인간 PDGFRα ECD(extracellular domain)은 R&D System(Minneapolis, MN)에서 구입하였다. KM 쥐는 피하에(s.c.) 3 x 10⁷ PAE Rα(porcine aortic endothelial cells stably expresssing PDGFRα)로 면역화 되었다. 4주후, 완전한 프로인즈 애쥬번트 (complete Freund's adjuvant)와 복강내(i.p.) 주어진 3 x 10⁷PAE Rα상태에 PDGFRα ECD 50㎍를 쥐의 피하에 주입하였다. 쥐에게 2번 더 투여되었고, 3주간 격리되었으며, 투여는 불완전 프로인즈 애쥬번트에 25㎍ PDGFRα ECD 였다.

높은 혈청에서 쥐로부터의 스플레노사이트(splenocytes)결합 및 티터(titers)의 저해. 쥐에서의 스플레노사이트는 골수종(myeloma)세포와 융합하여 분리되었다. 활성 억제를 나타내는 하이브리도마 배양이 서브클론(subcloned)되고, 이러한 하이브리도마로부터의 항체들은 단백질 G 크로마토크래피(protein G chromatography)에 의해 정제된다.

IgG들은 직접 결합 분석에서 PDGFRα에 결합됨으로써 측정되었다. PBS에서 PDGFRα ECD를 96-웰 플레이트에 고정하였다(100ng/웰). 플레이트는 그 후 PBST(PBS + 0.05 % Tween 20)로 세척되었고, PBSM(PBS에 3% milk, 200μL/웰)으로 25℃에서 1시간 동안 차단되었으며, PBST로 플레이트가 세척되었다. PBSM에서 1:5000으로 희석된 두번째 항체(염소의 F(ab')₂ 항-인간 IgG-양고추냉이 페록시다아제(horseradish peroxidase) 융합체; BioSource International, Camarillo, CA)가 25℃에서 1시간 동안 추가되었다. PBST로 플레이트를 세척한 후, TMB 페록시다아제 기질(KPL, Gaithersburg, MD)가 추가되었고, 1 mol/L H₂SO₄ 100μL로 반응이 종료되었다. 플레이트는 마이크로 플레이트 리더(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 A450nm에서 읽었다.

PDGF 억제는 고형-상 PDGF 억제 분석(solid-phase PDGF blocking assay(이와 연계된 다른 참고문헌 포함한 Duan et al., 1991, J.Biol. Chem. 266:413-8을 보라)). PDGFRα ECD는 PBS에서 희석되었고, 96-웰 마이크로 티터 플레이트(Immulon 2HB flat-bottomed 1 x 12 Removawell strips of irradiated protein binding polystyrene; Dynex Technologies, Chantilly, VA)에 덮여졌다. 각 웰은 전체 부피 100μL에서 25℃에 3시간 동안 60ng PDGFRα로 덮여졌다. 그후 플레이트는 두 번 세척되었고, 하룻밤(overnight)동안 25mmol/L HEPES(pH 7.45), 0.5% 젤라틴, 10mmol/L NaCl, 및0.1% Tween 20로 4℃에서 차단되었다. 그 후, 플레이트를 20분 동안 25℃로 유지시키고, 결합 버퍼(25mmol/L HEPES(pH 7.45), 0.3% 젤라틴, 100mmol/L NaCl, 0.01% Tween 20)로 한번 세척하였다. IgG들의 50 마이크로리터가 각 웰에 추가되었고, 25℃에서 20분동안 배양되었다. 요오드화된 PDGF는 결합버퍼에 희석되었고, 각 웰에 추가(1nmol/L 용액의 50μL)되었다.플레이트는 25℃에서 2시간동안 배양되었고, 그 후 결합 버버로 5번 세척되었다. 각 웰은 감마 카운터에 의해 계산되었다. 세포-기반의 억제 분석은 Heldin et al., 1988, EMBO J. 7, 1387-93에 기술된 대로 수행하였다.

PDGFRα에 결합하는 항체의 동역학은 BIAcore 3000 기기(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)를 사용하여 측정된다. PDGFRα ECD는 센서 칩에 고정되고 항체는 다양한 농도에 주입된다. 센소그램(sensogram)은 각 농도에서 획득되었고, 비례상수를 구하기 위해 BIA Evaluation 2.0 프로그램을 이용하여 측정되었다. 친화력 상수, K_d는 K_off/K_on 비례상수의 비율로 계산되었다.

ELISA에서 PDGFRα ECD을 고정하기 위한 인간 단일클론 항체 IMC-3G3의 양-의존적 결합은 도.13에 나타나 있다. PDGFRαECD에 최대 50% 결합하기 위한 항체 농도는 0.06nmol/L였다(표6). ED₅₀ 은 BIAcore 기기상의 표면 플라스몬(plasmon) 공명에 의해 확인되는 항체의 K_d 값과 같다(표1). 단일클론 항체는 또한 0.43nmol/L의 IC₅₀에서 고정된 수용체에 결합하는 [¹²³I]PDGF-BB 를 억제하였다. PDGFRα상의 PDGF-AA과 PDGF-BB 결합 부위는 구조적으로 일치하지 않는다. 3G3의 에피토프는 성장 인자 결합 부위 양쪽 모두에 겹쳐지는 것(overlap)을 데이타를 통해 알 수 있다.

수용체 인산화의 억제와 다운스트림 효과기 분자의 활성. IMC-3G3에PDGF- 의한 유도된 분자 내 신호 상의 효과는 PAE Rα 세포를 사용하여 확인되었다. 세포는 6-웰 팔콘(Falcon) 조직 배양 플레이트(웰 당 250,000 세포들)에 덮여지고, 하룻밤 동안 자라게 된다. 웰들은 그 후 세척되고, 혈청-결핍 배지에 배양된다. 세포를 고정하기 위해 하룻밤의 배양 후, 세포들은 37℃에서 30분간 항체로 처리되고, PDGF-AA 또는 PDGF-BB를 첨가하였으며, 37℃에서 10분간 더 배양하였다. 그 후 세포들을 떼어내고, 200μL 용해 버퍼(50mmol/L Tris-HCL(pH.8.0), 1% Triton X-100, 150mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, 0.1% SDS, 1 mmol/L 소듐 오쏘바나데이트(sodium orthovanadate), 및 프로테아제 억제제(complete Mini, Roche, Mannheim, Germany))에 용해시켰다. 세포 용해물은 향상된 화학발광 시약(chemiluminescence reagents)와 Hyperfilm을 이용한 웨스턴 블로팅(Western blotting) 및 SDS-PAGE로 분석되었다(Amersham Biosciences).

리간드-유도된 수용체 타이로신 인산화를 억제하는 능력에 관한 항체 실험을 수행하였다. PDGF-AA 과 PDGF-BB 는 각각, 1 및 3nmol/L 농도에서 약 5배로 PDGFRα 타이로신 인산화를 증가시킨다. 더 높은 농도(10 nmol/L)의 리간드는, 리간드-유도된 분해를 가능하게 하기 때문에 인산화된 수용체를 감소시켰다.

PDGFs는 다운스트림 효과기 단밸질을 통한 수용체 발현 세포들에 있어서, 유사분열 신호를 도입하고 항세포사멸(antiapoptotic)의 효과를 가져온다. 따라서 단일클론 항체는 MAPKs p44/p42 및 Akt(세포성장 및 항세포사멸 경로 각각을 포함한다)의 활성을 억제하는 능력에 관한 실험을 수행하였다. 항-PDGFRα 항체는 PDFG-BB(도.2A) 및 PDGF-AA(도면 없음)에 반응하는 MAPKs와 Akt 모두의 인산화를 억제하였다. 0.25nmol/L에 50% 억제됨을 보이는바, PDGFRα 인산화의 억제는 양에 의존성을 보였다(도.14B).

항미토게닉(antimitogenic) 활성. PAE Rα 세포의 PDGFAA 유도된 미토게네시스를 억제하는 능력에 관한 항-PDGFRα 단일클론 항체 실험을 수행하였다. 세포는 96-웰 조직 배양 플레이트(웰 당 1 x 10⁴의 세포)에 덮여지고 웰 당 100μL 배지에 하룻밤 동안 길렀다. 그 후 혈청-결핍 배지로 세척되었고, 각 웰에 추가된 75μL의 혈청-결핍 배지에 하룻밤 배양하였다. IgG가 (25μL/웰) 첨가되었고 플레이트는 37℃에서 30분 동안 배양되었다. PDGF-AA 또는 PDGF-BB(25μL/웰)는 그 후 첨가되고 플레이트는 37℃에서 18시간 에서 20시간 동안 배양되었다. 각 웰에 0.25μCi [³H] 티미딘(thymidine)(25μL/웰)로 처리된 플레이트는 추가적으로 4시간 더 배양되었다. 항체, PDGF, 및 [³H] 티미딘은 전부 혈청-결핍 배지에 희석되었다. 그 후 세포를 PBS 와 1% 보바인(bovine) 혈청 알부민으로 세척하고 트립신 처리로 떼어내었다. 필터 상에서 세포가 수집되고 MACHⅢ 세포 하베스터(harvester)(Tomtec,Inc., Hamden, CT)를 사용하여 두 번 증류된 물로 세 번 세척하였다. 필터를 거친 후, 방사능 결합된 DNA는 신틸레이션 검출기(scintillation counter(Wallac Microbeta, model 1450))상으로 확인된다.

IMC-3G3가 혈청-결핍 PAE Rα에 첨가될 때, 티미딘 결합이 유도된 PDGF-AA는 8.3nmol/L의 EC₅₀로 선택적으로 억제된다(도.15). 항체는 또한 1.25nmol/L의 EC₅₀으로 3nmol/L PDGF-BB-유도된 미토게네시스를 억제한다(데이터는 세시되지 않았다).

PDGFRα를 발현하는 인간 종양 세포 주의 성장 억제. PDGFRα을 발현하는 인간 종양 세포 주는, 시험관 내 및 생체 내에서 악성으로 성장하는 인간 항-PDGFRα 항체의 효과를 확인하는 검사가 수행된다. 플로우 사이토메트리(flow cytometry)에 의해 확인되는 PDGFRα를 발현하는 이러한 두 종양 세포 주는 SKLMS-1(평활근육종)과 U118(교아세포종)이다. 이러한 세포주는 미토게닉 분석에서 리간드에 반응하고 쥐에서 종양을 형성한다. SKLMS-1은 파라크린 뿐만 아니라 오토크린 자극에도 잠재성을 갖는다. SKLMS-1은 양적 샌드위치 효소 역 분석 기술(quantitative sandwich enzyme immunoassay technique(R&D System))을 사용한 배지내에서 자랄 때 PDGF-AA 단백질 발현을 보여준다.

도.16A에서 볼 수 있듯이, SKLMS-1 세포의 PDGF-AA 촉진에 대해 IMC-3G3는 Akt와 MAPKs 모두의 인산화를 억제하였다. Akt 인산화 억제는 100%였으며, MAPKs에 대한 인산화 억제는 80%였다. 항체는 또한 U118 세포에서 효과적인 인산화 억제제이다(도.16B). 리간드-유도된 종양 세포의 미토게네시스 또한 억제되었다. 항-PDGFRα 항체에 혈청-결핍된 U118 세포가 첨가되었을 때, PDGF-AA-유도된 티미딘 혼합물은 3.4 nmol/L의 EC₅₀ 으로 특이적으로 억제되었다(도.17A). 항체는 또한 SKLMS-1 세포의 PDGF-AA-유도된 미토게닉 반응을 5nmol/L의 EC₅₀ 을 억제하였다(도.17C). U118 세포에서는 PDGF-BB-촉진된 미토게닉 반응의 부분적 억제(66nmol/L에서 40%; 도.17D)만이 관찰되었다. 그 세포들에서 PDGFRα와 PDGFRβ 모두의 발현이 이러한 현상을 가능하게 한다(여기에 데이타는 보이지 않음).

종양 이종이식 성장의 억제. 교아세포(U118)와 평활근육종(SKLMS-1) 피하(s.c.) 이종이식 모델에서 생체 내 IMC-3G3 실험이 수행되었다. S.c. 종양 이종 이식은 Matrigel(Collaborative Research Biochemicals, Bedford, MA)에서 10 x 106 SKLMS-1 또는 U118 세포를 여성(athymic nude mice(Crl:NU/NU-nuBR, Charles River Laboratories, Wilmington, MA)) 주입함으로써 제조되었다. 종양은 약 400㎣의 목적 종양 부피(π/6 x 가장 긴 길이 x 수직 폭²)에 이르렀다. 쥐는 무작위적으로 다섯 그룹으로 나뉘었고(n=12), 실험 기간 동안 일주일에 두번씩 i.p. 주입 처리 되었다. 그룹 1 쥐들은 매개자(vehicle) 제한(0.9% NaCl, USP for Irrigation, B/Braun)으로 처리되었다. 그룹 2에서 4의 쥐들은 순간적 항-PDGFR 항체 6, 20, 및 60 mg/kg으로 처리하였다. 그룹 5 쥐들은 60 mg/kg 인간 IgG(Sigma)로 처리하였다. 그룹들은 각각 6, 20, 또는 60 mg/kg 항-PDGFR 항체 또는 21.4, 71.4, 및 214 mg/kg의 인간 IgG로 처리되었다. 일주일에 두 번씩의 처방량을 이용, 최초 양으로 부터 완만한 형태의 혈장 농도를 이루기 위해 첨가량이 계산되었다(반감기 배재, 7일 동안). 종양 부피는 일주일에 두번씩 측정되었고, 처리 그룹에서의 종양 성장이 리피티드 메져 아노바(repeated measures ANOVA)로 비교되었다.

도.18A에서 보는 바와 같이, 살린(saline) 처리된 쥐와 비교할 때 교아세포 성장에서 인간 IgG는 효과가 없다(P = 0.74), 반면 항-PDGFRα 항체는 6(P = 0.06), 20(P = 0.03), 및 60(P = 0.0004)mg/kg 양에서 종양 성장을 현저하게 억제하였다. U118 연구의 결과에서, %T/C[(연구의 결과에서 3G3-처리된 그룹에 대한 평균 종양 부피 / 처리의 시작시 평균 종양 부피) / (연구의 결과에서 대조군-처리된 그룹의 평균 종양 부피 / 처리의 시작시 평균 종양 부피) x 100] 값은 6, 20, 및 60 mg/kg 3G3-처리된 양 그룹에서 각각 67%, 63%, 및 35%였다. 나아가 6, 20, 및 60mg/kg 처리 그룹에서 12 마리 중 4, 11마리 중 5, 및 12마리 중 10의 동물들에서 종양 퇴화가 관찰되었다. 양 대조군에서는 퇴화가 관찰되지 않았다.

도.18B는 평활근육종 성장 또한 6(P = 0.02), 20(P = 0.003), 및 60(P < 0.0001)mg/kg의 처리에 의해 현저하게 억제되었다. 6, 20, 및 60mg/kg 처리 그룹에서 최종 %T/C값은 각각 66%, 57% 및 31%였고, 종양 퇴화는 없었다.

치료의 결과로 이종이식의 조직학 실험은 대조군 치료를 받은 동물에서의 종양과 비교하여 치료를 받은 동물에서의 종양은 현저한 차이를 보였다. 잘라낸 종양은 QDL 고정액에서 4℃, 24시간 동안 고정되었다. 파라핀 고정과 4μm 절단 후, 포르말린-고정된 절단부위들은 Mayer's H&E에의해 염색되었다(Richard Allen, Kalamazoo, MI).

가장 많은 양(60mg/kg)으로 처리된 U118 그룹에서, 가시적인 종양 세포들이 더 적게 관찰되었고, 살린-대조군에 비해 세포가 더 드문드문 존재하였다(도.18C). SKLMS-1 처리된 이종이식에서는, 25일째에 살린-대조군과 비교할 때 가시적 종양 세포량 및 세포 패킹량의 감소를 보였다(도.18D).

시험관내 신경교아세포주의 PDGFRα-매개된 촉진 억제. U118 종양에서 수용체 인산타이로신의 수준은 PDGFRα 항체 또는 인간 IgGt의 처리 후 일주일에 측정되었다. U118 종양(500㎣)이 정착된 쥐는 항체 214mg/kg 양으로 처리되고 72시간 후 60mg/kg으로 유지하여 처리하였다. 종양은 처음 항체 주입 후 일주일(168시간)에 쥐로부터 수득하였고(평균적으로 관찰되는 종양이 퇴화되는 시점 이전에; 도.18A를 보라); 인산화 분석 용해 버퍼에서 균질화하였다(상술한 내용을 보라). 용해물은 14,000rpm에서 두 번 원형질 분리하였고, 수득된 상청액에서의 단백질 농도를 측정하였다(Bio-Rad protein assay, Bio-Rad, Hercules, CA). 각 샘플로부터의 용해물(4mg)은 항-PDGFRα 항체를 이용하여 면역침전(immunoprecipitation)되었다. 면역침전된 인간 PDGFRα는 이후 항-PDGFRα 또는 항-인산타이로신 항체로 이뮤노블롯팅 되었다. 도.19를 보면, 항-PDGFRα 항체는 이러한 종양에서 인간 IgG 조절과 연관된 PDGFRα 인산 타이로신 수준의 감소를 가져온다는 사실을 알 수 있다.

세포주 공학. 먼저, 인간 항-PDGFRα 항체의 중사슬 및 경사슬 가변 도메인을 코딩하는 유전자는 클론되고 시퀀싱된다. 프라이머(primer) 시리즈는, MEDAREX-유래된 하이브리도마에서 인간 면역글로불린 가변 부위의 5' 및 3' 옆 서열을 가열냉각한 MEDAREX로부터 획득되었다. 경사슬 가변 부위는 AB88(정방향) 및 AB90(역방향)의 프라이머 쌍으로 증폭되었다(표7). 경사슬 생산은 정방향 프라이머 AB182 와 역방향 프라이머 AB16을 포함한 프라이머 쌍으로부터 증폭되었다(표7). 이러한 반응에 의한 0.4kb생성물은 AB88-1(V_H) 및에AB182-3(V_κ)를 생산하는 벡터 ZeroBlunt(Invitrogen)에서 클론되었고, 삽입체는 유니버설 T7과 M13R 프라이머로 시퀸스되었다.

완전한 IgG1 항체를 발현하는 플라스미드 벡터를 제조하기 위하여, 클론된 가변 부위는, 불변 부위 유전자를 포함하는 발현 벡터에서 두 단계로 증폭, 결합되는 PCR을 수행하였다. 첫 PCR 중사슬 증폭은 프라이머 IPHF5(정방향) 및 IPHR5(역방향)을 위한 주형으로 플라스미드 AB88-1 25ng이 이용되었다. 두 번째 PCR 중사슬 증폭은 OPSIF 및IPHR5가 프라이머 및 주형으로서 5㎖ 초기 반응으로 이용되었다. 두 정방향 프라이머의 조합은, 19 아미노산 쥐 중사슬 유전자 신호서열을 코딩하는 면역글로불린 유전자의 5' 말단에 57 염기쌍 서열이 첨가되었다(MGWSCILFLVATATGVHS; SEQ ID NO:24), 이 첨가서열은 효과적인 면역글로불린 수행 및 분비를 위함이다. 덧붙여, 포유류 세포에서 이러한 유전자의 효과적인 번역 시작을 위해 공통의 "코작(Kozak)" 서열 및 적정한 발현 벡터에서 증폭된 생성물의 클로닝을 위한 5' 힌드Ⅲ(HindⅢ) 제한 엔도뉴클리에이즈 부위를 정방향 프라이머 OPSIF에 첨가한다(J. Mol. Biol. 196:947). 중사슬 역방향 프라이머는 불변부위 벡터에 클로닝 하기 위해 인프레임 NheⅠ 부위를 포함한다.

PCR은, 다음의 사이클링 조건으로 50㎕ 반응에서 확장 버퍼 시스템 #3을 사용하는 생산자의 특성에 따라 확장 PCR 키트를 이용하여 두 번의 과정으로 수행되었다(Boehringer Manngeim Inc.)

1 사이클 94℃, 2분

5 사이클 94℃, 20분

48℃, 60분

68℃, 2분

20 사이클 94℃, 20분

65℃, 60분

68℃, 2분

1 사이클 68℃, 5분 두 번의 PCR 과정을 거친 후, 생성물은 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 정제되고, 벡터 pDFc에 HindⅢ-NheⅠ분해된 조각으로 클론되었는데(도.8), 이는 인간 감마 1 불변 부위를 포함한다.

첫 PCR 경사슬 증폭은 프라이머 IPLF4(정방향) 및 IPLR2(역방향)을 주형으로서 pAB182-3 플라스미드 25ngdmf 이용하였다. 두번째 PCR 경사슬 증폭은 첫 반응의 5㎕를 주형으로 하고, OPSIF 및IPLR2 프라이머를 이용하였다. 중사슬로써, 주 정방양 프라이머는 신호 서열의 분비를 제공한다. 경사슬 역방향 프라이머는 카파 불변 부위 벡터 pLck에 인프레임 BsiWⅠ부위를 포함한다(도.8). PCR 반응은 위의 중사슬의 경우와 같이 수행되었다. 두 번의 PCR 과정 수행 후, 생성물은 아가로스 겔 전기영동에 따라 정제되었고, pLck에 클론되었는데, 이는 인간 카파 경사슬 불변부위를 포함하고 있다.

안정적인 트랜스펙션을 위한 단일 플라스미드 벡터를 제조하기 위해, CMV 프로모터, 중사슬 코딩 부위, 폴리A 구성인자(polyA element)를 포함하는 중사슬 발현 카세트(cassette)는, NotⅠ-SalⅠ 단편으로써 경사슬 벡터에 클론되었다(도.20).

이러한 구조는 그 후 골수종(myeloma) 세포주 NS0 세포에서 안정한 생산 주를 제조하기 위해 사용되었다. NS0 세들은 BioRad Gene PulserⅡ를사용한 전기영동을 거쳐 발현벡터로 감염된다. 감염시키기 전, 플라스미드 DNA는 PvuⅠ, 에탄올 침전으로 직선화되고, 0.4mg/ml 농도에 재현탁시킨다(100ul dH₂O에 40ug). 세포들은 250볼트, 400μFd의 단일 파동으로, 800ul 부피중 최종적으로 DNA 40ug으로 전기영동되었다. 전기영동된 세포들은 10% dFCS(dialysed fetal calf serum(Hyclone, Lot#:AHA7675))과 2mM 글루타민(Invitrogen/Life Technologies)를 포함하는 DMEM 배지(JRH Biosciences Inc.)에 50ul씩 나누어 웰당 5,000 - 10,000개 셀의 밀도로 분리하였다. 글루타민 합성효소(glutamine synthetase(GS)) 양성의 감염체만을 선택하여10%dFCS를 포함하는 글루타민 없는 DMEM의 첨가로써 24시간 후에 개시되었고, 1 x GS 보충물(JRH Biosciences Inc.)로 보충되었다. 세포들은콜로니의 확장과 성장을 위해 2-4주간 37℃, 5% CO₂에서 배양되었다. 300개가 sjag는 콜로니들이 항-인간 Fc(gamma) ELISA(Horseradish peroxidase detection at A450nm)를사용하여 스크린 되었다. 항체 발현 클론들(58%)은 화장되었고 3-5일 배양 후 생산량을 재실험하였다. 혈청 결핍 배지에 세포들이 적응하기 위해, 양성 세포 주는 각 기간에 동 부피의 혈청 결핍 GS-0S 배양 배지 첨가에 의해 확장되었다. 3일내 하위-융합 24 웰 배양된 25un/ml 또는 그 이상을 생산한 강한 양성세포들은 혈청 결핍 배지에의 적응을 완전하게 하기 위해 더 분석을 위해 확장되었다.

여기에 제시된 발명의 원리의 다양한 양태는 당업계에 알려진 하나의 기술로서 제조되어 질 수 있고, 그러한 변형은 본 발명의 영역에 포함됨을 명시한다.

도1은 종양이 150-200㎣에 이르렀을때 시작된 처리기간 동안, 거세된 SCID 쥐에서 LuCaP 35V 피하 이종이식 종양의 성장을 나타내었다. 도표 A : 처리되지 않은 대조군; 도표 B: 도세탁셀(10mg/kg 또는 20 mg/kg)으로 4주동안 처리한 동물군; 도표C: 피하의 LuCaP 35V 이종이식 종양을 갖는 치료되지 않은 SCID 쥐 및 치료된 SCID 쥐에서의 혈청 PSA 수준. 치료된 쥐는 도세탁셀(20mg/kg)만을 투여하였거나 또는 도세탁셀(10mg/kg 또는 20 mg/kg 모두)과 항-IGF-ⅠR 항체(40mg/kg IMC-A12)를 병용투여하였다. 치료는 종양이 150-200㎣에 이르렀을때 시작되었고, 4주후에 종료하였다.

도2는 도세탁셀(10mg/kg)만을 투여한(도표A) 또는 항-IGF-ⅠR(40mg/kg IMC-A12)를 병용투여한(도표B) LuCaP 35V 이종이식 종양의 단일 세포 현탁액을 나타내었다. R1으로 표시된 부분은 단편 DNA와 세포사멸 세포들에 대응하는 부분이다(FITC 표지를 증가시킨다).

도3은 도세탁셀(10mg/kg 또는 20mg/kg)만의 투여종료 및 항-IGF-ⅠR 항체(40mg/kg IMC-A12)와의 병용투여를 종료함에 따른 종양 이종이식에서 DNA 합성(BrDu 흡수)을 나타낸다.

도4는, 전립선 종양 세포의 도세탁셀과 A12의 병용치료 및 도세탁셀만으로의 치료에 있어서 ,전립선 종양 공격성(TUBB), 안드로겐 치료에의 대항성(BIRC 5) 및 세포 사멸 유도(IGFBP3)와 연관된 유전자의 분화 발현을 나타낸다.

도5는 치료 중단에 따르는 A12 혈청 수준을 나타낸다.

도6은 도세탁셀(10mg/kg 또는 20mg/kg 모두)만의 계속적인 치료 또는 항-IGF-ⅠR(40mg/kg IMC-A12)의 병용 치료에 의해 병에 걸리지 않는 동물군의 몸무게(전체 세포독성의 정도)를 나타낸다.

도7은 LuCaP 23.1 세포와 융합한 SCID 쥐에서 이종이식-생산된 PSA상, 항-IGF-ⅠR 항체(IMC-A12)로 치료한 효과를 나타낸다.

도8은 LuCaP 23.1 세포와 융합한 SCID 쥐의 엑스레이(X-ray) 사진 시리즈를 나타낸다. A12 쥐는 40mg/ml IMC-A12 i.p.(복강내) 일주일에 3번씩 6주간 투여받았다. 엑스레이 사진은 희생되기 전 촬영되었다.

도9는 LuCaP 23.1 인간 전립선 세포의 내경골(intratibial) 이종이식 SCID 쥐로부터의 PSA 혈청 수준(a) 및 대표 방사선(b)를 나타낸다.

도10은 전립선 암세포의 Akt 활성에서 인간 골수천자의 효과를 나타낸다. 세포용해물은 SDS-PAGE를 거쳤다. 웨스턴 블롯 분석으로, 막은 인산-Akt를 표적으로 하는 항체(Ser-473, 세포 시그널링 기술)와 액틴(actin(Sigma))으로 블롯팅되었다. 첫 항체 결합은 HRP-융합 단백질 A 또는 단백질 G(Sigma)를 사용하여 확인되었다.

도11은 PC3-ML 세포에서 Akt-인산화의 유도 및 억제를 나타낸다. 도표A는 30ng/ml PDGF-BB에 노출된 세포에서 AG-1296 양 의존적 Akt 인산화를 나타낸다. 도표B는 20μM AG-1296에 의한 골 천자 Akt 인산화 및 억제를 나타낸다. 도표 C는 100pg/ml PDGF-AA 및100pg/ml PDGF-BB의 병용의 능력과 비교한 Akt 인산화를 유도하는 골수 천자의 능력을 나타낸다. 도표D는 Akt-인산화 유도된 골수천자의 크기, AG-1296에 의한 Akt-인산화 유도된 골수의 억제, 및 PDGF-AA + PDGF-BB에 의해 유 도된 Akt-인산화를 비교한다.

도 12는 PDGFRα 길항제에 의한 PC3-ML 세포에서 Akt 인산화 억제를 나타낸다. 도표A는 PDGF-BB 30ng/ml에 의해 유도된 Akt 인산화에서, 단일클론 항체 IMC-3G3의 양 의존적 효과를 나타낸다. 도표 B와 C는 Akt 인산화를 유도하는 골수의 IMC-3G3 와 AG1296 효과를 비교한다. 도표 D는 Akt 인산화의 억제는 IMC-3G3 사전배양시간에 의존적임을 나타낸다.

도13은 PDGFRα에의 항체 결합을 나타낸다. A: 고정된 PDGFRα의 세포밖 도메인과 항-PDGFRα 항체의 직접적 결합. B: 고정된 PDGFRα에 결합하는 [¹²⁵I]PDGF-AA의 억제

도 14는 PDGFRα와 다운스트림 효과기 분자의 인산화의 특이적 억제를 나타낸다.

도 15는 mAbs에 의한 PAE Rα세포에서 PDGF-AA-촉진된 [³H]티미딘 결합의 억제를 나타낸다.

도 16은 SKLMS-1(A) 및U118(B) 세포에서 PDGF-AA-유도된 다운스트림-효과기 분자 활성의 억제를 나타낸다.

도 17은 mAbs에 의한 U118(A) 및SKLMS-1(B) 세포에서 PDGF-AA-촉진된 [³H]티미딘 결합의 억제를 나타낸다.

도 18은 누드 쥐의 U118 (blioblastoma; 도표A) 및 SKLMS-1 (평활근육종; 도표B) 종양 이종이식에서 수립된 치료에서 양 의존적 효과를 나타낸다.

도 19는 특이성 없는 인간 IgG로 처리된 것과 비교하여, 항-PDGFRα 항체로 처리한 U118 종양에서 생체 내 PDGFRα 인산화의 감소를 나타낸다.

도20은 인간 V_H 및Vκ 가변 부위 유전자에서 유도된 클로닝 하이브리도마 및 완전한 인간 중사슬(IgG1)과 경사슬 단백질을 발현하는데 사용되는 GS 발현 벡터를 나타낸다. 두 벡터는 실시예에서 설명한 바와 같이 재조합 되었고, 재조합 벡터는 NS0 세포에 감염시켰다.

<110> ImClone Systems Incorporated, et al. <120> Receptor Antagonists for Treatment of Metastatic Bone Cancer <130> IPA070783 <150> US60/691,920 <151> 2005-06-17 <160> 63 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(15) <400> 1 agt agt agt tac tac 15 Ser Ser Ser Tyr Tyr 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Ser Ser Tyr Tyr 1 5 <210> 3 <211> 48 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(48) <400> 3 agt ttc ttt tat act ggg agc acc tac tac aac ccg tcc ctc agg agt 48 Ser Phe Phe Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser 1 5 10 15 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Phe Phe Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser 1 5 10 15 <210> 5 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(51) <400> 5 cag tcc acg tat tac tat ggt tcg ggg aat tat tat ggc tgg ttc gac 48 Gln Ser Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Asn Tyr Tyr Gly Trp Phe Asp 1 5 10 15 cgc 51 Arg 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Asp Ser Asp Gly Ser 420 425 430 ttc ttc ctc tat agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag 1344 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 435 440 445 ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac 1392 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 450 455 460 tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tcc ccg ggt aaa tg a 1431 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475 <210> 31 <211> 476 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile 35 40 45 Asn Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Leu Arg Gln Ser Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Phe Phe Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 Asn Pro Ser Leu Arg Ser Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys 85 90 95 Asn Gln Phe Ser Leu Met Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Ser Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Asn 115 120 125 Tyr Tyr Gly Trp Phe Asp Arg Trp Asp Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 130 135 140 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 145 150 155 160 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 165 170 175 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 180 185 190 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 195 200 205 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 210 215 220 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 225 230 235 240 Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 245 250 255 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 260 265 270 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 275 280 285 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 290 295 300 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 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cat tca gaa att gtg ttg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg 96 Val His Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu 20 25 30 tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt 144 Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val 35 40 45 agc agc tac tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg 192 Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 50 55 60 ctc ctc atc tat gat gca tcc aac agg gcc act ggc atc cca gcc agg 240 Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg 65 70 75 80 ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agc 288 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 cta gag cct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag cag cgt agc aac 336 Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn 100 105 110 tgg cct ccg gcg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgt acg 384 Trp Pro Pro Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag ttg 432 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc 480 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt 528 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175 aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac 576 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa cac 624 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc 672 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt t ag 702 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 33 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens 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<213> Homo sapiens <400> 39 Ala Pro Leu Arg Phe Leu Glu Trp Ser Thr Gln Asp His Tyr Tyr Tyr 1 5 10 15 Tyr Tyr Met Asp Val 20 <210> 40 <211> 390 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(390) <400> 40 gag gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc 48 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga ggc acc ttc agc agc tat 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 gct atc agc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 gga ggg atc atc cct atc ttt ggt aca gca aac tac gca cag aag ttc 192 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 cag ggc aga gtc acg att acc gcg gac aaa tcc acg agc aca gcc tac 240 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga gcg cca tta cga ttt ttg gag tgg tcc acc caa gac cac tac 336 Ala Arg Ala Pro Leu Arg Phe Leu Glu Trp Ser Thr Gln Asp His Tyr 100 105 110 tac tac tac tac atg gac gtc tgg ggc aaa ggg acc acg gtc acc gtc 384 Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val 115 120 125 tca agc 390 Ser Ser 130 <210> 41 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Pro Leu Arg Phe Leu Glu Trp Ser Thr Gln Asp His Tyr 100 105 110 Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr 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ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gcg aga gcg cca tta cga ttt ttg gag tgg tcc acc caa 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Pro Leu Arg Phe Leu Glu Trp Ser Thr Gln 115 120 125 gac cac tac tac tac tac tac atg gac gtc tgg ggc aaa ggg acc acg 432 Asp His Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr 130 135 140 gtc acc gtc tca agc gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg 480 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 145 150 155 160 gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc 528 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 165 170 175 ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca 576 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 180 185 190 ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc 624 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 195 200 205 tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc 672 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 210 215 220 ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac 720 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 225 230 235 240 acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac 768 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 245 250 255 aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc 816 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 260 265 270 ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc 864 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 275 280 285 cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag 912 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 290 295 300 gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag 960 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 305 310 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Val Leu Asp Ser 420 425 430 gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg 1344 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 435 440 445 tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg 1392 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 450 455 460 cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1437 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475 tga 1440 <210> 43 <211> 479 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser 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<211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Thr 1 5 10 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(21) <400> 46 ggt gaa aat aag cgg ccc tca 21 Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 48 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(33) <400> 48 aaa tct cgg gat ggc agt ggt caa cat ctg gtg 33 Lys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Gln His Leu Val 1 5 10 <210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Lys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Gln His Leu Val 1 5 10 <210> 50 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(327) <400> 50 tct tct gag ctg act cag gac cct gct gtg tct gtg gcc ttg gga cag 48 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 aca gtc agg atc aca tgc caa gga gac agc ctc aga agc tat tat gca 96 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 acc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct att ctt gtc atc tat 144 Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Ile Tyr 35 40 45 ggt gaa aat aag cgg ccc tca ggg atc cca gac cga ttc tct ggc tcc 192 Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act ggg gct cag gca gaa 240 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 gat gag gct gac tac tat tgt aaa tct cgg gat ggc agt ggt caa cat 288 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Gln His 85 90 95 ctg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggt 327 Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 51 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Gln His 85 90 95 Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 52 <211> 702 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(699) <400> 52 atg gga tgg tca tgt atc atc ctt ttt cta gta gca act gca act gga 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 gta cat tca tct tct gag ctg act cag gac cct gct gtg tct gtg gcc 96 Val His Ser Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala 20 25 30 ttg gga cag aca gtc agg atc aca tgc caa gga gac agc ctc aga agc 144 Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser 35 40 45 tat tat gca acc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct att ctt 192 Tyr Tyr Ala Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu 50 55 60 gtc atc tat ggt gaa aat aag cgg ccc tca ggg atc cca gac cga ttc 240 Val Ile Tyr Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe 65 70 75 80 tct ggc tcc agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act ggg gct 288 Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala 85 90 95 cag gca gaa gat gag gct gac tac tat tgt aaa tct cgg gat ggc agt 336 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Arg Asp Gly Ser 100 105 110 ggt caa cat ctg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggt 384 Gly Gln His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 115 120 125 cag ccc aag gct gcc ccc tcg gtc act ctg ttc ccg ccc tcc tct gag 432 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 130 135 140 gag ctt caa gcc aac aag gcc aca ctg gtg tgt ctc ata agt gac ttc 480 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 145 150 155 160 tac ccg gga gcc gtg aca gtg gcc tgg aag gca gat agc agc ccc gtc 528 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 165 170 175 aag gcg gga gtg gag acc acc aca ccc tcc aaa caa agc aac aac aag 576 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 180 185 190 tac gcg gcc agc agc tat ctg agc ctg acg cct gag cag tgg aag tcc 624 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 195 200 205 cac aga agc tac agc tgc cag gtc acg cat gaa ggg agc acc gtg gag 672 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 210 215 220 aag aca gtg gcc cct gca gaa tgc tct t ga 702 Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 225 230 <210> 53 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala 20 25 30 Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser 35 40 45 Tyr Tyr Ala Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu 50 55 60 Val Ile Tyr Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala 85 90 95 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Arg Asp Gly Ser 100 105 110 Gly Gln His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 115 120 125 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 130 135 140 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 165 170 175 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 180 185 190 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 195 200 205 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 210 215 220 Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 225 230 <210> 54 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(33) <400> 54 caa gga gac agc ctc aga agc tat tat gca agc 33 Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 1 5 10 <210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 1 5 10 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(21) <400> 56 ggt aaa aac aac cgg ccc tca 21 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 58 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(33) <400> 58 aac tcc cgg gac aac agt gat aac cgt ctg ata 33 Asn Ser Arg Asp Asn Ser Asp Asn Arg Leu Ile 1 5 10 <210> 59 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Asn Ser Arg Asp Asn Ser Asp Asn Arg Leu Ile 1 5 10 <210> 60 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(327) <400> 60 tct tct gag ctg act cag gac cct gct gtg tct gtg gcc ttg gga cag 48 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 aca gtc agg atc aca tgc caa gga gac agc ctc aga agc tat tat gca 96 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 agc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct gta ctt gtc atc tat 144 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 ggt aaa aac aac cgg ccc tca ggg atc cca gac cga ttc tct ggc tcc 192 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act ggg gct cag gcg gaa 240 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc cgg gac aac agt gat aac cgt 288 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Asn Ser Asp Asn Arg 85 90 95 ctg ata ttt ggc ggc ggg acc aag ctg acc gtc ctc agt 327 Leu Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser 100 105 <210> 61 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Asn Ser Asp Asn Arg 85 90 95 Leu Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser 100 105 <210> 62 <211> 702 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(699) <400> 62 atg gga tgg tca tgt atc atc ctt ttt cta gta gca act gca act gga 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 gta cat tca tct tct gag ctg act cag gac cct gct gtg tct gtg gcc 96 Val His Ser Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala 20 25 30 ttg gga cag aca gtc agg atc aca tgc caa gga gac agc ctc aga agc 144 Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser 35 40 45 tat tat gca agc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct gta ctt 192 Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu 50 55 60 gtc atc tat ggt aaa aac aac cgg ccc tca ggg atc cca gac cga ttc 240 Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe 65 70 75 80 tct ggc tcc agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act ggg gct 288 Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala 85 90 95 cag gcg gaa gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc cgg gac aac agt 336 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Asn Ser 100 105 110 gat aac cgt ctg ata ttt ggc ggc ggg acc aag ctg acc gtc ctc agt 384 Asp Asn Arg Leu Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser 115 120 125 cag ccc aag gct gcc ccc tcg gtc act ctg ttc ccg ccc tcc tct gag 432 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 130 135 140 gag ctt caa gcc aac aag gcc aca ctg gtg tgt ctc ata agt gac ttc 480 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 145 150 155 160 tac ccg gga gcc gtg aca gtg gcc tgg aag gca gat agc agc ccc gtc 528 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 165 170 175 aag gcg gga gtg gag acc acc aca ccc tcc aaa caa agc aac aac aag 576 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 180 185 190 tac gcg gcc agc agc tat ctg agc ctg acg cct gag cag tgg aag tcc 624 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 195 200 205 cac aga agc tac agc tgc cag gtc acg cat gaa ggg agc acc gtg gag 672 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 210 215 220 aag aca gtg gcc cct gca gaa tgc tct t ga 702 Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 225 230 <210> 63 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala 20 25 30 Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu 50 55 60 Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala 85 90 95 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Asn Ser 100 105 110 Asp Asn Arg Leu Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser 115 120 125 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 130 135 140 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 165 170 175 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 180 185 190 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 195 200 205 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 210 215 220 Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 225 230

Claims (29)

1. PDGFRα 길항제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 골 종양을 가진 대상을 치료하는 방법.
2. PDGFRα 길항제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 골 종양의 성장을 억제하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 골 종양은 1차 종양인 방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 골 종양은 2차 종양인 방법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 종양 세포의 성장은 안드로겐-의존적(androgen-dependent)인 것인 방법.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 종양 세포의 성장은 안드로겐 비의존적(androgen-independent)인 것인 방법.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 종양은 전립선 암으로부터 전이된 것인 방법.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 종양은 유방암으로부터 전이된 것인 방법.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 종양은 폐암으로부터 전이된 것인 방법.
10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 PDGFRα 길항제는 항체 또는 항체 단편인 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 PDGFRα에 결합하기 위해 서열번호 8을 포함하는 중사슬 가변 도메인과 서열번호 16을 포함하는 경사슬 가변 도메인을 포함하는 항체와 경쟁하는 것인 방법.
12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 PDGFRα 길항제는 PDGFRα의 세포내 억제제인 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 세포내 PDGFRα 억제제는 AG1296, STI-571 및 SU11248로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
14. 제10항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 사람의 것인 방법.
15. 제10항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 인간화된 것인 방법.
16. 제10항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 키메릭(chimeric)인 방법.
17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 PDGFRα 길항제는 PDGFRα에 혈소판 유래 성장 인자(platelet derived growth factor)의 결합을 억제하는 것인 방법.
18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 PDGFRα 길항제는 PDGFRα의 활성화를 중화시키는 것인 방법.
19. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 PDGFRα 길항제는 PDGFRα 표면 수용체의 농도를 감소시키는 것인 방법.
20. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 PDGFRα 길항제는 약 10 ^-9 M^-1 또는 그 이하의 Kd값으로 IGF-ⅠR에 결합하는 항체인 방법.
21. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 PDGFRα 길항제는 PDGFRα의 시그널링 분자 다운스트림의 인산화를 억제하는 것인 방법.
22. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 PDGFRα 길항제는 Akt의 골수 유도된 활성화를 억제하는 것인 방법.
23. 제1항 또는 제2항에 있어서, 2차 수용체 타이로신 키나제 길항제(tyrosine kinase antagonist)를 병용 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
24. 제1항 또는 제2항에 있어서, PDGFRα 길항제는 이특이적 항체인 방법.
25. 제24항에 있어서, 상기 이특이적 항체는 PDGFRα및 EGFR에 특이적인 것인 방법.
26. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항신생물제(anti-neoplastic agent) 유효량을 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
27. 제1항에 있어서, 상기 항신생물제는 도세탁셀(docetaxel)인 방법.
28. 제1항에 있어서, 상기 항신생물제는 독소루비신(doxorubicin)인 방법.
29. 제1항에 있어서, 상기 항신생물제는 방사선인 방법.

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