BRPI0622074A2

BRPI0622074A2 - anticorpos de pdgfralfa

Info

Publication number: BRPI0622074A2
Application number: BRPI0622074-6A
Authority: BR
Inventors: Stephen R Plymate; Nick Loizos; Jim Huber; Alessandro Fatatis; Dale L Ludwig
Original assignee: Imclone Systems Inc; Univ Washington; Philadelphia Health & Educatio
Priority date: 2005-06-17
Filing date: 2006-06-19
Publication date: 2011-07-19
Also published as: WO2006138729A2; JP2009102444A; US20120034244A1; CY1115076T1; EP2100618A2; KR101246428B1; CY2017013I2; IL198870A0; HUS1700015I1; ES2452115T3; IL198870A; EP2100618B1; KR20080047529A; RU2455026C2; JP2012179060A; US20090110678A1; CN101613409A; CA2680945C; US8574578B2; PL2100618T3

Abstract

ANTICORPOS DE PDGFR<244>. A invenção fornece usos de um antagonista IGF-IR e/ou PDGFR<244> na fabricação de medicamentos para tratar câncer ásseo, em particular o câncer ósseo metastático. A invenção fornece também anticorpos que se ligam aos PDGFR<244> humanos e neutralizam a ativação dos receptores. A invenção ainda fornece um método para neutralizar a ativação de PDGFR<244>, e um uso do anticorpo isoladamente ou em combinação com outros agentes na fabricação de medicamentos para tratar uma doença neoplásica.

Description

"ANTICORPOS DE PDGFRa"

Dividido do PI0611984-0 depositado em 19/06/2006.

Campo da Invenção

A invenção fornece métodos de tratamento do câncer ósseo, em particular do cân-cer metastático ósseo, por administrar um antagonista IGF-IR e/ou um antagonista de PDG-FRar. A invenção fornece também anticorpos que se ligam aos PDGFRa humanos e neutra-lizam a ativação dos receptores. A invenção ainda fornece um método para neutralizar aativação de PDGFRa, e um método de tratamento de um mamífero com uma doença neo-plásica utilizando os anticorpos isoladamente ou em combinação com outros agentes.

Histórico da Invenção

O câncer de próstata é mais comum entre os homens, com cerca de 220.000 casose 29.000 mortes por ano nos Estados Unidos. Uma proporção significativa dos homens di-agnosticados com câncer de próstata têm doença metastática. Além disso, eventualmente, ametástase se desenvolve em muitos outros pacientes de câncer de próstata, apesar do tra-tamento com cirurgia ou radioterapia. O osso é o local mais comum da metástase do câncerda próstata, e é também um local para onde o câncer pulmonar e câncer de mama freqüen-temente metastatizem. A maioria das metástases de próstata são androgênio-dependentes,de modo a que haja uma resposta rápida à castração cirúrgica ou médica, mas em quasetodos os pacientes, a tumoral eventualmente torna-se androgênio-independente, levando asignificativa morbilidade e mortalidade. Uma vez que as metástases ósseas ocorrem, ostratamentos atualmente disponíveis têm um efeito limitado. A terapia mais eficaz aprovadaque foi descrita para o câncer de próstata metastático (administração de docetaxel) prolongaa sobrevivência média em aproximadamente três meses. (Petrylak et ai, 2004, N. Engl. J.Med. 351:1513; Tannock et a!., 2004, N. Engl. J. Med. 351:1502) Assim, novas terapias parao câncer metastático ósseo são urgentemente necessárias.

O receptor do fator de crescimento similar à insulina (IGF-IR) é um receptor de tiro-sina quinase transmembrana onipresente que é essencial para o crescimento e o desenvol-vimento normal fetal e pós-natal. IGF-IR está localizado na superfície celular da maioria dostipos de células e serve como molécula sinalizadora para os fatores de crescimento IGF-I eIGF-II (coletivamente denominado doravante IGFs). O IGF-IR pode estimular a proliferaçãocelular, diferenciação celular, mudanças no tamanho das células, e proteger as células deapoptose. Ele também foi considerado como sendo quase obrigatório para transformação decélulas (revisto em Adams et ai, CeIL Mol. Life Sd. 57:1050-93 (2000); Baserga, Oncogene19:5574-81 (2000)). Altos níveis de expressão de IGF-IR foram relatados em amostras detecido metástase óssea de câncer de próstata. O osso contém o maior estoque de IGFs nocorpo.

O IGF-IR é um hetero-tetrâmero pré-formado contendo duas cadeias alfa e versãobeta covalentemente ligados por alças dissulfureto. As subunidades de receptores são sinte-tizadas como parte de um único polipeptídeo de cadeia de 180kd, que depois é proteolitica-mente transformado em subunidades alfa (130kd) e beta (95kd). Toda a cadeia alfa é extra-celular e contém o local para a ligação ao ligante. A cadeia beta possui o domínio trans-membrana, o domínio tirosina quinase, e uma extensão C-terminal que é necessária para adiferenciação celular e transformação, mas é dispensável para sinalização de mitógeno eproteção contra apoptose.

IGF-IR é muito semelhante ao receptor da insulina (IR), em especial na seqüênciada cadeia beta (70% homologia). Devido a esta homologia, estudos recentes têm demons-trado que estes receptores podem formar híbridos contendo um dímero IR e um dímero IGF-IR (Pandini et a!., Clin. Canc. Res. 5:1935-19 (1999)). A formação de híbridos ocorre tantoem células normais como transformadas e o conteúdo dos híbridos é dependente da con-centração dos dois homodímeros receptores (IR e IGF-IR) dentro da célula. Embora os hí-brido receptores sejam compostos de pares IR e IGF-IR, os híbridos se ligam seletivamentea IGFs, com afinidade semelhante a do IGF-IR, e se ligam a insulina apenas fracamente(Siddle e Soos, The IGF System. Human Press, págs. 199-225. 1999). Esses híbridos, por-tanto podem se ligar a IGFs e converter sinais tanto em células normais como em transfor-madas.

Um segundo receptor IGF, IGF-IIR, ou receptor manose-6-fosfato (M6P), tambémse liga ao ligante IGF-II com alta afinidade, mas não apresenta atividade tirosina quinase(Oates et ai, Breast Câncer Res. Treat. 47:269-81 (1998)). Porque resulta na degradaçãoda IGF-II1 é considerado um escoadouro de IGF-II, antagonizando o crescimento promoven-do efeitos deste ligante. A perda do IGF-IIR em células tumorais pode aumentar o potencialde crescimento através da liberação de seu efeito antagonista sobre a ligação do IGF-II como IGF-IR (Byrd et ai, J. Biol. Chem. 274:24408-16 (1999 )).

Os receptores de fator de crescimento alfa e beta (PDGFRa e PDGFR/?) derivadosde plaquetas, são receptores tirosina quinase de tipo III. PDGFRa é crucial para o desenvol-vimento e cumpre funções importantes na vida adulta. Por exemplo, camundongos homozi-góticos para uma mutação nula morrem durante embriogênese. Em fases posteriores dedesenvolvimento, PDGFRa é expresso em muitas estruturas mesenquimais, enquanto célu-las epiteliais adjacentes produzem plaquetas derivadas do fatores de crescimento (PDGFs).As amostras de tecido normal ou glândulas hiperplásicas da próstata testam negativo paraPDGFRa, enquanto tumores primários de próstata e massas esqueléticas de indivíduos cor-respondentes expressam PDGFRa. Além disso, de linhagens celulares de próstata obtidas apartir de diferentes sítios metastáticos, PDGFRa é encontrado em células PC3 derivadas demetástases óssea, mas não em linhagens celulares obtidas a partir de metástases dos gân-glios linfáticos (LNCaP) e cérebro (DU-145).A família de fatores de crescimento derivada de plaquetas de fatores de crescimen-to consiste em cinco diferentes dímeros ligados por sulfureto, PDGF-AA, -BB, -AB1 -CC, e -DD, que agem através de PDGFRa e PDGFRß. Estes fatores de crescimento são moléculasdiméricas compostas de cadeias polipeptídicas ligadas por dissulfureto que se ligam a doisreceptores de proteínas simultaneamente e induzem a dimerização, autofosforilação, e sina-lização intracelulares de receptores. PDGFRa e PDGFRß são estruturalmente semelhantese podem formar heterodímeros bem como homodímeros. Porque PDGFR/? não se liga acadeia de PDGF-A com grande afinidade, PDGF-AA apenas ativa receptores dímeros ctct,enquanto PDGF-AB e PDGF-CC ativam receptores heterodímeros ctct e aß.

Breve Resumo da Invenção

Esta invenção se refere ao tratamento de tumores primários e metástases ósseas,incluindo tumores originados de próstata, mama, pulmão ou receptor do fator de crescimen-to I similar à insulina (IGF-IR) e/ou receptor alfa do fator de crescimento derivado de plaque-tas (PDGFRct).

Os tumores a serem tratados podem ser hormônio/androgênio-dependentes ouhormônio/androgênio independente, e pode ser originado, por exemplo, de próstata, mama,ou pulmão.

A invenção fornece métodos de tratamento de um indivíduo que tenha um tumorósseo, bem como os métodos de inibir o crescimento de um tumor ósseo. Os métodos com-preendem administrar uma quantidade eficaz de antagonista IGF-IR ou uma quantidade efi-caz de um antagonista de PDGFRct. Os antagonistas dos receptores incluem anticorpos efragmentos de anticorpos, bem como inibidores intracelulares de moléculas pequenas.

A invenção fornece anticorpos anti-IGF-IR ou anti-PDGFRc/ que se ligam aos seusreceptores alvo e inibem a ligação ao ligante. A invenção fornece também anticorpos e ou-tros antagonistas que neutralizam a ativação do IGF-IR ou PDGFRct. Outros certos anticor-pos promovem infra-regulação dos seus receptores alvo, por exemplo, por internalizaçãoe/ou degradação. Por conseguinte, os anticorpos e anatagonistas de moléculas pequenasfuncionam inibindo a ativação de moléculas sinalizadoras abaixo, como Akt, p42/p44, eMAPK.

Os métodos incluem o uso de antagonistas IGF-IR ou PDGFRcts sozinhos, emcombinação uns com os outros ou em combinação com outros tratamentos para o câncer,como quimioterapia e radioterapia.

A invenção fornece também anticorpos e fragmentos de anticorpos que se ligam aPDGFRct, bem como nucleotídeos e célula hospedeira para a produção de anticorpos. Osanticorpos bloqueiam a ligação ao ligante e neutralizam a ativação de receptores. A inven-ção também fornece a utilização dos anticorpos sozinhos, em combinação com outros anta-gonistas de receptores ou agentes antineoplásicos, ou como conjugados para o tratamentode doença neoplásica. Anticorpos anti-PDGFRa são utilizados para tratar, por exemplo, tu-mores de ovário, tumores de mama, tumores pulmonares, tumores hepatocelulares, tumoresestromais gastrintestinais, melanomas, carcinoma de células renais, tumores de próstata, esarcomas dos tecidos moles.

Descrição das Figuras

A Figura 1 mostra o crescimento de tumores subcutâneos enxertados LuCaP 35Vem camundongos SCDD castrados durante um período de tratamento iniciado quando ostumores tenham atingido 150-200 mm3. O Painel A: controles não tratados; Painel B: os a-nimais foram tratados durante quatro semanas com docetaxel (tanto 10 mg/kg como 20mg/Kg) isoladamente, ou em combinação com anticorpos anti-IGF-IR (40 mg/Kg IMC-A12);Painel C: níveis séricos de PSA em camundongos SCID não tratados e tratados transpor-tando tumores subcutâneos enxertados LuCaP 35V. Os camundongos tratados receberamdocetaxel (20 mg/Kg) isoladamente ou docetaxel (ou 10 mg/kg ou 20 mg/Kg), em combina-ção com anticorpo anti-IGF-IRs (40 mg/Kg EV1C-A12). O tratamento foi iniciado quando ostumores tinham atingido 150-200 mm3 e encerrado após quatro semanas.

A Figura 2 mostra suspensões de uma única célula de tumores enxertados LuCaP35V tratados com docetaxel (10 mg/Kg) sozinho (Grupo A) ou em combinação com anticor-pos anti-IGF-IR (40 mg/Kg IMC-A12) (Painel Β). O campo denominado R1 corresponde acélulas apoptóticas com DNA fragmentado (aumento de marcação FITC).

A Figura 3 mostra a síntese de DNA (absorção de BrDu) nos tumores enxertadosapós suspensão do tratamento com docetaxel (10 mg/kg ou 20 mg/Kg) sozinho, e em com-binação com anticorpo anti-IGF-IRs (40 mg/Kg BVIC-A12).

A Figura 4 descreve a expressão diferencial de genes associados com agressivida-de com tumor de próstata (TUBB), a resistência à terapia de anti-androgênio (BIRC 5), eindução da apoptose (IGFBP3) na células tumorais da próstata em resposta ao tratamentocom docetaxel e A12 e apenas docetaxel.

A Figura 5 mostra níveis séricos de A12 após suspensão do tratamento.

A Figura 6 mostra o peso corporal (uma medida de citotoxicidade geral), de animaissaudáveis tratados continuamente com docetaxel (ou 10 mg/kg ou 20 mg/Kg) isoladamente,ou em combinação com anticorpo anti-IGF-IRs (40 mg/Kg MC-A12).

A Figura 7 mostra o efeito do tratamento com um anticorpo anti-IGF-IR (MC-A12),em PSA produzido em enxertos em camundongos SCID enxertados com células LuCaP23.1.

A Figura 8 mostra uma série de fotografias de raios-X de camundongos SCID en-xertados com Células LuCaP 23.1. Os camundongos A12 receberam 40 mg/mL de BVIC-A12 IP três vezes por semana durante seis semanas. As fotografias raios-X foram feitas nomomento do sacrifício.A Figura 9 mostra níveis de PSA (a) e radiografias representantes (b) de camun-dongos SCID com enxertos intratibiais de células de próstata humana LuCaP 23.1.

A Figura 10 ilustra o efeito da aspiração da medula óssea humana sobre a atividadede Akt nas células cancerosas de próstata. Os Iisados celulares foram submetidos a SDS-PAGE. Para a análise Western blot, as membranas foram borradas com anticorpos alvejan-do fosfo-Akt (Ser-473, tecnologia de sinalização celular), PDGFRa (R & D Systems) e actina(Sigma). A ligação ao anticorpo primário foi detectada utilizando proteína A ou proteína Gconjugada a HRP (Sigma).

A Figura 11 ilustra indução e inibição da fosforilação de AKT em células PC3-ML. Opainel A mostra a inibição de fosforilação de Akt dependente da dose de AG-1296 em célu-las expostas a 30 ng/mL PDFG-BB. O Painel B mostra fosforilação de Akt e inibição de 20//M AG-1296 em aspirado ósseo. O Painel C mostra a potência do aspirado da medula ós-sea para induzir fosforilação de Akt em comparação com a potência de uma combinação de100 pg/mL de PDGF-AA e 100 pg/mL de PDGF-BB. O Painel D compara a magnitude dafosforilação de Akt induzida pelo aspirado de medula óssea, a inibição por AG-1296 da fos-forilação de Akt induzida pelo aspirado de medula óssea, e fosforilação de Akt induzida porPDFG-AA + PDFG-BB.

A Figurai 12 ilustra a inibição da fosforilação de Akt em células PC3-ML por antago-nistas PDGFRas. Um painel mostra o efeito dependente de dose de anticorpo monoclonalEVIC-3G3 sobre a fosforilação de Akt induzida por 30 ng/mL de PDGF-BB. Os Painéis BeCproporcionam uma comparação dos efeitos de BVIC-3G3 e AG1296 na fosforilação de Aktinduzida por medula óssea. O Painel D mostra que a inibição da fosforilação de Akt é de-pendente do tempo de preincubação de IMC-3G3.

A Figura 13 mostra a ligação do anticorpo ao PDGFRa. A: ligação direta de anticor-pos anti-PDGFRa ao domínio extracelular imobilizado do PDGFRa. B: inibição de [125I]PDGF-AA ligado a PDGFRa imobilizado.

A Figura 14 mostra a inibição específica da fosforilação de PDGFRa e moléculasefetoras abaixo.

A Figura 15 mostra inibição de modalidade de [3H] timidina estimulada por PDGF-AA em células PAE Ra por mAbs.

A Figura 16 mostra a inibição da ativação de moléculas efetoras induzida porPDGF-AA abaixo em células SKLMS-1 (A) e U118 (B).

A Figura 17 mostra a inibição da modalidade de [3H] timidina estimulada por PDGF-AA em células U118 (A) e SKLMS-1 (B) por mAbs. A inibição da modalidade de [3H] timidinaestimulada por PDGF-AA também é mostrada para células SKLMS-1 (C) e U118 (D).

A Figura 18 mostra efeitos de tratamento dependente da dose de U118 estabeleci-da (glioblastoma; painel A) e SKLMS-1 (leiomiosarcoma; painel B) tumores enxertados emcamundongos sem pêlo.

A Figura 19 mostra a redução da fosforilação de PDGFRct in vivo em tumores U118tratados com anticorpo anti-PDGFRo, em comparação com o tratamento com IgG humanainespecífica.

A Figura 20 ilustra vetores de expressão GS utilizados para a clonagem de VH deri-vado de hibridoma humano e genes de regiões variáveis VK e expressão de proteínas com-pletas humanas de cadeia pesada (IgGI) e leve. Os dois vetores foram recombinados comoexplicado nos Exemplos e o vetor combinado foi transfectado em células NSO.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção se refere ao tratamento de tumores ósseos com anticorpos oufragmentos de anticorpos que se ligam ao receptor de fator de crescimento I similar à insuli-na (IGF-IR). A expressão endócrina de IGF-I é primeiramente regulado pelo hormônio docrescimento e produzido no fígado, mas outros tipos de tecidos também são capazes deexprimir IGF-I1 incluindo os ossos, que contém um grande armazenamento de fatores decrescimento. Dependendo do tipo de célula tumoral, IGF-I está envolvida na regulação en-dócrina, parácrina, e/ou autócrina (Yu, H. e Rohan, J., J. Natl. Câncer Inst. 92:1472-89(2000)).

Foi descoberto que os anticorpos que se ligam a IGF-IR são úteis em terapias parao tratamento de tumores ósseos que expressam IGF-IR. Os anticorpos podem ser usadossozinhos, ou em combinação com outros tratamentos do câncer, particularmente quimiote-rápicos. A terapia anti-IGF-IR, isoladamente ou em combinação com a terapia com um oumais agentes anti-neoplásicos (como, por exemplo, quimioterapia ou radioterapia), tem sig-nificativa eficácia terapêutica. A supressão de crescimento tumoral é muitas vezes acompa-nhada por um aumento na apoptose e persiste depois que todo o tratamento é interrompidoe os tumores começam novamente a crescer em animais tratados apenas com quimioterapia.

Também foi descoberto que PDGFRct desempenha um papel importante no cres-cimento de tumores ósseos. Por exemplo, algumas linhagens de células tumorais que ex-pressam PDGFRct preferencialmente metastatizam para o osso. Essas linhagens celularesexibem aumento da ativação e fosforilação de PDGFRct em moléculas sinalizadoras abaixoem resposta aos fatores solúveis presentes na medula óssea. A ativação de PDGFRct pelamedula óssea é reduzida ou completamente inibida por antagonistas de PDGFRcts, e a fos-forilação de moléculas sinalizadoras abaixo que são comumente ativadas por sinais atravésde PDGFRct e outros sistemas receptores de tirosina quinase é muito reduzida. Alguns da-dos sugerem que a via de sobrevivência do PI3K/Akt é ativada pela sinalização de PDGFRct,não só por Iigantes que ativam PDGFRct diretamente, mas também por fatores presentes namedula óssea que causam transativação do receptor.Os tumores ósseos primários a serem tratados de acordo com a invenção incluem,mas não estão limitados a, osteosarcomas, condrosarcomas, fibrosarcomas, e hemangio-sarcomas. Notavelmente, tumores secundários malignos (metastásticos) são muito maiscomuns do que os tumores ósseos primários. Os tumores ósseos metastásticos a seremtratados de acordo com a invenção podem surgir a partir de uma variedade de fontes, asmais comum das quais são cânceres da próstata, mama, ou pulmão. A origem de um câncermetastático ósseo geralmente será aparente a partir do histórico do paciente. Os tumorespodem ser osteoblásticas ou osteolíticos. Os tumores podem ser dependente de estimula-ção de IGF-IR quando eles surgirem, ou podem transitar para dependência de IGF-IR. Porexemplo, câncer de próstata ou de metástases de câncer de próstata que são inicialmentehormônio/androgênio-dependentes e controláveis pelos tratamentos físicos ou químicos quesuprimem a produção de androgênio ou hormonal, pode tornar-se hormônio/androgênio-independentes através do aumento da sensibilidade à estimulação através de IGF-IR. Alémdisso, além de fornecer o tratamento hormônio/androgênio-independente de tumores, a in-venção pode ser útil no tratamento de tumores ósseos hormônio/androgênio-dependente,sem dependência de repressão do androgênio ou produção hormonal, por exemplo, co-administrando IGF-IR com anticorpos agentes anti-neoplásicos. Tais tumores metastáticosincluiriam tumores ósseos que são estimulados através de IFG-IR no ambiente rico em IGFdo osso, que podem ser sensíveis a sensível estimulação hormonal, mas não o suficientepara crescer sem envolvimento de IGF. A ablação do hormônio poderá não ser necessáriapara esses tumores.

Os tumores ósseos que são PDGF-dependentes também podem ser tratados deacordo com a invenção, assim como tumores, que são "medula óssea"-dependentes. Ostumores medula óssea-dependentes exibem ativação de PDGFRa em resposta a fatoressolúveis presentes na medula óssea. Por exemplo, como exemplificado aqui, uma linhagemcelular cancerosa metastática expressando PDGFRa humana sofre a ativação de PDGFRae fosforilação de Akt+ após exposição ao aspirado de medula óssea. Um anticorpo antí-PDGFRa e um antagonista de molécula pequena de PDGFRa, cada um, inibem a ativaçãode PDGFRa e fosforilação de Akt+ na linhagem celular. Os fatores solúveis na medula ós-sea que ativam PDGFRa incluem, mas não estão limitados a, PDGF-AA e -BB.

Embora tal dependência da medula óssea envolva a sinalização através de PDG-FRa ela não pode dizer respeito apenas a ligação da PDGFRa de um Iigante PDGFRa. Porexemplo, como exemplificado aqui, deve-se observar que a ativação de PDGFRa definidapor ligantes (PDGF-AA-ou BB), é mais fraca do que ativação pelo aspirado de medula ós-sea. Além disso, observa-se que na presença de aspirado de medula óssea, a fosforilaçãode Akt+ diminui com o aumento do tempo de incubação. No seu conjunto, estes resultadossugerem que além de responder a ligação de PDGFs, PDGFRa pode ser transativado (fos-forilado) por outros elementos de tradução de sinal (por exemplo, outros receptores de tiro-sina quinase) sensíveis a outros componentes da medula óssea. Em qualquer caso, emuma linhagem celular adequada para o crescimento do osso metastizado (isto é, uma linha-gem celular que preferencialmente metastasize ao osso), a ativação de PDGFRct medulaóssea-dependente é observada, a qual é inibida por antagonistas de PDGFRct. Além disso,o tratamento com um antagonista de PDGFRct inibe a estimulação induzida pela medulaóssea de via anti-apoptótica de PI3K/Akt e proteína quinase mitógeno-ativada (MAPK).

Os tumores ósseos a serem tratados com um antagonista de PDGFRct pode surgircomo metástases de células do câncer da próstata, e, como referido, pode ser hormônio/androgênio-dependentes, ou ter transferida para hormônio/ androgênio-independência. Taistumores também podem surgir como metástases de câncer que não o de próstata. Alguémversado na técnica poderia facilmente ser capaz de diagnosticar estas condições e enfermi-dades usando testes convencionais conhecidos.

Tratamento significa qualquer tratamento de uma doença em um animal e inclui: (1)impedir que a doença ocorra em um mamífero que pode ter predisposição para a doença,mas ainda não experimenta ou exibe sintomas da doença; por exemplo, a prevenção dosurgimento de sintomas clínicos; (2) a inibição da doença, como por exemplo, interromper oseu desenvolvimento; ou (3) alívio da doença, como por exemplo, causando regressão dossintomas da doença. Inibição do crescimento tumoral inclui retardar ou interromper o cres-cimento, bem como causar regressão tumoral. Uma quantidade eficaz para o tratamento deuma doença significa que a quantidade que, quando administrada a um mamífero na neces-sidade da mesma, é suficiente para efeito do tratamento, conforme acima definido, para a-quela doença. Os antagonistas de IGF-IR e o antagonista de PDGFRct da invenção podemser administrados em monoterapia, em combinação com uma outra, ou em combinação comum ou mais agentes antineoplásicos, como, por exemplo, um agente quimioterápico ou radioterápico.

Em uma modalidade da invenção, pode ser desejável determinar o nível de expres-são de IGF-IR e/ou PDGFRct em um tumor a ser tratada. Nesses casos, as biópsias tumo-rais podem ser recolhidos e analisadas pelos métodos bem conhecidos na técnica. Em outramodalidade da invenção, o antagonista de IGF-IR ou antagonista de PDGFRct é administra-do com base no fato do receptor correspondente ser comumente expresso ou ativado emum determinado tipo de tumor ou invariavelmente torna-se expresso de ativado a medidaque a doença progride.

O antagonista de IGF-IR pode ser um antagonista extracelular ou um antagonistaintracelular e mais de um antagonista pode ser empregado. Os antagonistas extracelularesincluem, mas não estão limitados a, proteínas ou outras moléculas biológicas que se ligamao IGF-IR ou a um ou mais dos seus Iigantes (por exemplo, IGF-I e IGF-II são Iigantes natu-rais de IGF-IR). Em uma modalidade da invenção, um antagonista extracelular inibe a liga-ção do IGF-IR para seus ligantes. Em uma modalidade, o antagonista é um anticorpo anti-IGF-IR, como, por exemplo, IMC-A12. Em outra modalidade, o antagonista é um fragmentode IGF-IR solúvel de ligação ao ligante. Os antagonista de IGF-IRs intracelulares podem sermoléculas biológicas, mas são geralmente moléculas pequenas. Exemplos incluem, masnão estão limitados a, inibidor AGI 024 de tirosina quinase (Calbiochem), inibidor de receptorde fator de crescimento tipo insulina-l quinase NVP-AEW541 (Novartis), bem como inibidorde receptor fator de crescimento-l similar à insulina/insulina BMS-554417 (Bristol MyersSquibb). Será apreciado que uma molécula pequena útil para ser utilizada na invenção sãoos inibidores de IGF-IR, mas não precisam ser totalmente específicos para IGF-IR.

Os anticorpos anti-IGF-IR a serem utilizados de acordo com o presente invençãoapresentam uma ou mais das seguintes propriedades:

1) Os anticorpos ligam-se ao domínio externo do IGF-IR e inibem a ligação do IGF-Iou Il de IGF-IGF-IR. A inibição pode ser determinada, por exemplo, através de um ensaio deligação direta utilizando receptores purificados ou ligados à membrana, na presente modali-dade, os anticorpos da presente invenção, ou fragmentos dos mesmos, de preferência seligam a IGF-IR, pelo menos, tão fortemente como os ligantes naturais de IGF-IR (IGF-I eIGF-II).

2) Os anticorpos neutralizam IGF-IR. A ligação de um ligante, por exemplo,, IGF-Iou IGF-II, a um domínio extracelular externo do IGF-IR estimula autofosforilação da subuni-dade beta e moléculas sinalizadoras abaixo, incluindo MAPK, Akt, e IRS-I.

A neutralização de IGF-IR inclui inibição, diminuição, inativação e/ou ruptura deuma ou mais dessas atividades normalmente associadas com tradução de sinal. A neutrali-zação pode ser determinada in vivo, ex-vivo,, in vitro ou utilizando, por exemplo, tecidos,células cultivadas, ou componentes celulares purificados. A neutralização inclui a inibição deheterodímeros IGF-IR/IR bem como homodímeros IGF-IR. Assim, a neutralização de IGF-IRtem vários efeitos, incluindo á inibição, diminuição, inativação e/ou ruptura do crescimento(proliferação e diferenciação), angiogênese (escolha de vaso sangüíneo, invasão e metásta-ses), e motilidade e metástase celular (aderência e invasividade celular).

Uma medida de neutralização de IGF-IR é a inibição da atividade do receptor tirosi-na quinase. A inibição de tirosina quinase pode ser determinada usando métodos bem co-nhecidos, por exemplo, através da medição do nível de autofosforilação de receptor de qui-nase recombinante, e/ou fosforilação de substratos naturais ou sintéticos. Assim, os ensaiosde fosforilação são úteis na determinação de anticorpos de neutralização no contexto dapresente invenção. Fosforilação pode ser detectada, por exemplo, usando um anticorpo es-pecífico para fosfotirosina em um ensaio ELISA ou em um Western blot. Alguns ensaios daatividade de tirosina quinase são descritos em Panek et ai, J. Pharmacol. Exp. Eles. 283:1433-44 (1997) e Batley et ai, Life Sd. 62:143-50 (1998). Os anticorpos da invenção provo-cam uma diminuição na fosforilação de tirosina IGF-IR de, pelo menos, cerca de 75%, depreferência, pelo menos, cerca de 85%, e mais de preferência, pelo menos, cerca de 90%nas células que respondem ao ligante.

Outra medida de neutralização de IGF-IR é a inibição da fosforilação de substratosde IGF-IR abaixo. Consequentemente, o nível de fosforilação da MAPK, Akt, ou IRS-I podeser medido. A diminuição na fosforilação é, pelo menos, cerca de 40%, e pode ser, pelo me-nos, cerca de 60%, ou, pelo menos, cerca de 80%.

Além disso, os métodos de deteção de expressão de proteínas pode ser utilizadopara determinar a neutralização de IGF-IR, onde as proteínas sendo medidas são regula-mentadas pela atividade de tirosina quinase de IGF-IR. Estes métodos incluem imuno-histoquímica (IHC) para a deteção de expressão de proteínas, hibridização de fluorescênciain loco (FISH), para deteção de amplificação de genes, ensaios de ligação competitiva deradioligantes, técnicas de blot de matriz sólida, como a Northern e Southern blots, reação decadeia de polimerase de transcriptase reversa (RT-PCR) e ELISA. Ver, por exemplo, Gran-dis et ai, Câncer, 78:1284-92 (1996); Shimizu et ai, Japan J. Câncer Res., 85:567-71(1994); Sauter et ai, Am. J. Path., 148:1047-53 (1996); Collins, GHa 15:289-96 (1995); Ra-dinsky et ai, Clin. Câncer Res. 1:19-31 (1995); Petrides et ai, Câncer Res. 50:3934-39(1990); Hoffmann et al., Anticancer Res. 17:4419-26 (1997); Wikstrand et al., Câncer Res.55:3140-48(1995).

Ensaios ex vivo também podem ser utilizados para determinar a neutralização deIGF-IR. Por exemplo, a inibição dos receptores de tirosina quinase pode ser observada pormitogenic ensaios utilizando linhagens celulares estimuladas com receptores ligante na pre-sença e ausência de inibidor. A linhagem celular de câncer de mama MCF7 (American TypeCulture Collection (ATCC), Rockville, MD) é uma linhagem celular que expressa IGF-IR e éestimulada por IGF-IGF-I ou II. Outro método envolve testes de inibição do crescimento decélulas tumorais expressando IGF-IR ou células transfectadas para expressar IGF-IR. A ini-bição também pode ser observada usando modelos tumorais, por exemplo, células tumoraishumanas injetadas um camundongo.

Os anticorpos da presente invenção não estão limitados por qualquer mecanismoespecial de neutralização de IGF-IR. Os anticorpos anti-IGF-IR da presente invenção podemse ligar externamente a receptores de IGF-IR de superfície celular, bloqueando a ligação doligante (por exemplo, IGF-IGF-I ou II) e posterior tradução de sinal mediada por receptoresassociados a tirosina quinase, e evitar a fosforilação do IGF-IR e de outras proteínas abaixona cascata de tradução de sinal..

3) Os anticorpos infra-modulam IGF-IR. A quantidade de IGF-IR presente na super-fície de uma célula depende da produção de receptores de proteína, internalização e degra-dação. A quantidade de IGF-IR presente na superfície de uma célula pode ser medida indi-retamente, pela deteção da intemalização do receptor ou uma molécula ligada ao receptor.Por exemplo, a intemalização do receptor pode ser medida pelo contato com células queexpressam IGF-IR marcadas com um anticorpo. O anticorpo ligado à membrana é entãoretirado, recolhido e contado. O anticorpo internalizado é determinado pela Iise das células edeteção do marcador no lisado.

Outra maneira é medir diretamente a quantidade do receptor presente na célula a-pós tratamento com um anticorpo anti-IGF-IR ou outra substância, por exemplo, por análisede ordenação de célula ativada por fluorescência de células marcadas por expressão desuperfície de IGF-IR. As células marcadas são incubadas a 37°C e a intensidade de fluores-cência á medida ao longo do tempo. Como um controle, uma parte da população marcadapode ser incubada a 4°C (condições em que a intemalização de receptor é interrompida).

IGF-IR de superfície celular pode ser detectado e medido utilizando uma diferenteanticorpo que é específico para IGF-IR e que não bloqueia ou compete com a ligação doanticorpo sendo testado. (Burtrum, et al. Câncer Res. 63:8912-21 (2003)) O tratamento deuma célula expressando IGF-IR com um anticorpo da invenção resulta na redução da super-fície celular de IGF-IR. Em uma modalidade preferida, a redução é, no mínimo, cerca de70%, mais de preferência, pelo menos, cerca de 80%, e ainda mais de preferência, pelomenos, cerca de 90% na resposta ao tratamento com um anticorpo da invenção. A diminui-ção significativa pode ser observada em menos de quatro horas.

Outra medida da infra-modulação é a redução do total de proteína receptora pre-sente em uma célula, e reflete a degradação dos receptores internos. Consequentemente, otratamento de células (particularmente as células cancerosas), com anticorpos da invençãoresulta em uma redução no total de células IGF-IR. Em uma modalidade preferida, a redu-ção é, no mínimo, cerca de 70%, mais de preferência, pelo menos, cerca de 80%, e aindamais de preferência, pelo menos, cerca de 90%.

Para o tratamento de seres humanos, os anticorpos de acordo com a invenção sãopreferencialmente humanos. Alternativamente, os anticorpos podem ser de primatas nãohumanos ou de outros mamíferos, ou seja anticorpos humanizados ou quiméricos. Em umamodalidade da invenção, um anticorpo anti-IGF-IR compreende uma, duas, três, quatro,cinco, e/ou seis regiões de determinação de complementaridade (CDRs) selecionadas dogrupo constituído por SEQ ID NO: 35, SEO ID NO : 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 45,SEQ ID NO: 47, e SEQ ID NO: 49 (CDR1H, CDR2H, CDR3H, CDR1L, CDR2L, CDR3L, res-pectivamente).. Em outra modalidade, o anticorpo anti-IGF-IR compreende uma, duas, três,quatro, cinco, e/ou seis regiões de determinação de complementaridade (CDRs) seleciona-dos do grupo constituído por SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO: 57, e SEQ ID NO: 59 (CDR1H, CDR2H, CDR3H, CDR1L, CDR2L, CDR3L,respectivamente). De preferência, os anticorpos (ou fragmentos deles) da presente invençãotêm CDRs de cadeia pesada de SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 39. Alterna-tivamente, e também de preferência, os anticorpos presentes incluindo fragmentos, tenhamCDRs de cadeia leve de SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 49 ou SEQ ID NO:55, SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO : 59. Um desses anticorpos anti-IGF-IR é o anticorpo IgGIhumana IMC-A12 (W02005016970), com um domínio variável de cadeia pesada represen-tado por SEQ ID NO: 41 e um domínio variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO:51. Outro anticorpo humano preferido é IMC-2F8 (W02005016970), com um domínio variá-vel de cadeia pesada idêntico ao IMC-A12 e um domínio variável de cadeia leve representa-do por SEQ ID NO: 61. Anticorpos úteis ainda incluem anticorpos anti-IGF-IRs que compe-tem com MC-A12 ou IMC-2F8 para ligação a IGF-IR, bem como anticorpos que se ligam aoutros epítopos (ou seja, anticorpos que se ligam a outros epítopos e exibem propriedadescomo anteriormente descrita como bloqueio do ligante, internalização do receptor, etc, masnão competem com BVIC-A12 ou IMC-2F8).

De acordo com a invenção, antagonistas de PDGFRcts também podem ser usadospara o tratamento. A antagonista de PDGFRct pode ser um antagonista extracelular ou umantagonista intracelular e mais de um antagonista podem ser empregados. Antagonistasextracelulares incluem, mas não estão limitados a, proteínas ou outras moléculas biológicasque se ligam a PDGFRct ou de um ou mais dos seus Iigantes (por exemplo, PDGF-AA, -AB,-BB, -CC). Em uma modalidade da invenção, um antagonista extracelular é inibido pela liga-ção do PDGFRct aos seus ligantes. Em uma modalidade, o antagonista é um anticorpo anti-PDGFRct, como, por exemplo, IMC-3G3. Em outra modalidade, a ligação é uma proteínasolúvel a ligação ao ligante fragmento de PDGFRct. Os antagonistas intracelulares de IGF-IRs podem ser moléculas biológicas, mas são geralmente moléculas pequenas. Em umamodalidade, o antagonista intracelular de PDGFRct é AG1296. AG1296 (CaIbiochem) é uminibidor da PDGF a, PDGFISs, e c-KIT, e também reage com Flt3. Outras moléculas pe-quenas que o alvo PDGFRs incluir STI-571 (o imatinib mesilato, Gleevec ®, Novartis) e SUI1248 (sunitinib malate, SUTENT Pfizer).

Em uma modalidade da invenção, um anticorpo anti-PDGFRff compreende uma,duas, três, quatro, cinco, e/ou seis regiões de determinação de complementaridade (CDRs)selecionadas do grupo constituído por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ IDNO: 10, SEQ ID NO: 12, e SEQ ID NO: 14 (CDR1H/CDR2H, CDR3H, CDR1L, CDR2L,CDR3L, respectivamente). De preferência, os anticorpos (ou fragmentos deles) da presenteinvenção têm CDRs de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 6. Alternativamente, etambém de preferência, os anticorpos presentes, ou fragmentos dos mesmos, tenham CDRsde SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 14. As seqüências de aminoácidos daCDRs são definidos abaixo na Tabela 1..Tabela 1-CDRs do IMC-3G3

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Em outra modalidade, o anticorpo anti-PDGFRa, ou fragmento do mesmo, tem umaregião variável humana de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8 e/ou de uma região variávelhumana de cadeia leve de SEQ ID NO: 16. IMC-3G3 é um tal anticorpo e é exemplificado napresente invenção.

De preferência, os anticorpos, ou fragmentos dos mesmos, da presente invençãoneutralizam PDGFRa. A ligação de um ligante, por exemplo, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB ou PDGF-CC, de um domínio extracelular do PDGFRa estimula dimerização do receptor,autofosforilação, ativação do domínio interno citoplasmático do receptor da tirosina quinase,e início de diversas vias de tradução de sinal e transativação envolvidas na regulação dasíntese do DNA (ativação genética) e progressão do ciclo celular ou divisão. As anticorposanti-PDGFRa tipicamente bloqueiam a ligação aos Iigantes e/ou dimerização do receptor, einibem uma ou mais de autofosforilação, ativação da atividade de tirosina quinase e tradu-ção de sinal. Os anticorpos anti-PDGFRa da presente invenção podem ser específica para oregião ligante de ligação extracelular de PDGFRa e impedir a ligação de um ligante dePDGFRa. De preferência, esses anticorpos ànti-PDGFRa, ou fragmentos dos mesmos, seligam a PDGFRa, pelo menos, tão fortemente como os Iigantes naturais de PDGFRa. Comoalternativa ou adicionalmente, os anticorpos podem ser específicos para uma região do mo-nômero receptor que, de outra forma uma interface dímero receptor. Esses anticorpos blo-queia a formação de dímero, embora a ligação ao ligante de um monômero receptor podeou não ser bloqueada.

Como descrito acima para anticorpo anti-IGF-IRs, receptor neutralização pode serdeterminada por uma variedade de in vivo, sendo, in vitro, e ex vivo métodos. Em uma mo-dalidade da invenção, o anticorpos anti-PDGFRa reduzem a fosforilação de PDGFRa de,pelo menos, cerca de 75%. Em outras modalidades, fosforilação seja reduzida em, pelo me-nos, cerca de 85% ou, pelo menos, cerca de 90%. Em uma modalidade da invenção, comoresultado da inibição da tradução de sinal de PDGFRa, a fosforilação ou um componente davia de tradução de sinal abaixo (por exemplo, Akt, p42/p44, etc) é reduzida em, pelo menos,cerca de 40%,, pelo menos, cerca de 60%, ou, pelo menos, cerca de 80%. A neutralizaçãodo receptor pode ser determinada utilizando ligantes definidos (por exemplo, PDGF-AA, -AB,-BB, -CC), misturas de tais ligantes, ou preparações, como aspirado de medula óssea quecompõem PDGFs, bem como de outros fatores de crescimento estimuladores.

A neutralização de PDGFRct inclui a inibição, diminuição, inativação e/ou ruptura deuma ou mais dessas atividades normalmente associados com a tradução de sinal. Assim,neutralizar PDGFRa tem vários efeitos, incluindo a inibição, diminuição, inativação e/ou per-turbações do crescimento (proliferação e diferenciação), angiogênese (escolha do vasosangüíneo, invasão e metástases), motilidade e metástase celular (aderência celular e inva-sividade).

Ensaios ex vivo, como descrito acima, também pode ser utilizado para determinar aneutralização dé PDGFRa. Por exemplo, células de Ieiomiosarcoma SKLMS-1 (AmericanType Culture Collection (ATCC), Rockville, MD; ATCC HTB-88 ™), ou células de glioblasto-ma U118 (ATCC HTB-15 ™) humanas estimuladas com PDGF-AA podem ser utilizadaspara o doseamento da inibição de PDGFRa. A inibição do crescimento pode ser determina-da utilizando células tumorais humanas expressando PDGFRa injetadas em um camundon-go SCID.

A presente invenção não está limitada por qualquer mecanismo especial de neutra-lização de PDGFRa. Os anticorpos anti-PDGFRa da presente invenção se ligam externa-mente ao Receptor de superfície celular de PDGFRa, bloqueiam a ligação do Iigante (porexemplo, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC), inibem fosforilação Do PDGFRa,inibir a tradução de sinal mediada pelo tirosina quinase associada ao receptor, e modulam aatividade de componentes do sinal de tradução abaixo. Os complexo receptor-anticorpotambém pode ser internalizado e degradado, resultando na infra-regulação do receptor desuperfície celular. As metaloproteínases de matriz, que funcionam na invasão e metástaseda célula tumoral, que também podem ser infra-reguladas pelos anticorpos da presente in-venção. Além disso, os anticorpos da presente invenção podem apresentar inibição da pro-dução e angiogênese do fator de crescimento.

Como descrito acima, os antagonistas de PDGFRas da invenção são úteis para otratamento dos tumores ósseos, incluindo tumores ósseos metastáticos. Outros tipos detumores que expressam PDGFRa e podem ser tratados de acordo com a invenção incluem,mas não estão limitados a, tumores do ovário, tumores de mama, tumores pulmonares, tu-mores hepatocelulares, tumores estromais gastríntestinais, melanoma, carcinoma das célu-las renais, tumores de próstata, e sarcomas dos tecidos moles. Os sarcomas dos tecidosmoles são originários de tecidos tais como gordura, músculos, nervos, tendões e vasos san-güíneos e linfáticos. Tipicamente, as células tumorais superexpressam PDGFRa. A expres-são de PDGFRa pode ser determinada, por exemplo, através da análise histoquímica ou deRNA. Por exemplo, um análise de scatchard de ligação de células IMC-3G3 de U118 e célu-las tumorais SKLMS-1 radiomarcadas indica que o número de moléculas de PDGFRct nascélulas é de cerca de 500 e 2500, respectivamente.

Os antagonista de PDGFRas funcionam inibindo a tradução de sinal por PDGFRaexpresso sobre as células tumorais, ou pela inibição de PDGFRa, expresso em células es-tromais circundantes que de outro modo sofrem estimulação parácrina por PDGFs expressode células tumorais. Assim, anticorpos, como IMC-3G3 e outros antagonistas de PDGFRassão úteis para o tratamento dos tumores caracterizados por estimulação autócrina e/ou pa-rácrina do PDGFRa.

Fragmentos de anticorpos, de acordo com a invenção pode ser produzidos clivandoum anticorpo inteiro, ou por expressão de DNA que codifica o fragmento. Fragmentos deanticorpos podem ser preparados por métodos descritos por Lamoyi et ai, J. Immunol. Me-thods, 56: 235-243 (1983) e por Parham, J. Immunol. 131: 2895-2902 (1983). Esses frag-mentos podem conter um ou ambos fragmento Fab ou fragmento F(aB')2. Esses fragmentospodem também conter anticorpos de região variável de fragmento de cadeia única, ou seja,scFv, dicorpos, ou outros fragmentos de anticorpos. Métodos de produção de tais equivalen-tes funcionais são divulgados no Pedido PCT WO 93/21319, Pedido de Patente EuropéiaNo. EP 239400; Pedido PCT WO 89/09622; Pedido de Patente Européia No. EP 338745; ePedido de Patente Européia No. EP 332424.

As células hospedeiras preferidaspara a transformação de vetores e expressão dosanticorpos da presente invenção são células de mamíferos, por exemplo, células COS-7,células de ovário de hamster chinês (CHO), e linhagens celulares de origem linfóide, comocélulas de linfoma, mieloma (ex NSO), ou hibridoma. Outros anfitriões eucarióticos, tais co-mo leveduras, podem ser utilizados como alternativa.

Sempre que for desejado expressar um gene construído na levedura, uma seleçãogenética adequada para uso na levedura é o gene trpl presente no plasmídeo de leveduraYRp7. Stinchcomb Et al. Nature, 282: 39 (1979); Kingsman et ai, Gene, 7: 141 (1979). Ogene trpl proporciona uma seleção marcadora para uma cepa mutante de levedura sem acapacidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1. Jones, Ge-netics, 85: 12 (1977). A presença da lesão trpl no genoma da célula hospedeira de levedura,em seguida, fornece um meio eficaz para detectar a transformação pelo crescimento na au-sência de triptofano. Do mesmo modo, cepas de levedura deficientes em Leu2 (ATCC20622 ou 38626) são complementadas por plasmídeos conhecidos que contenham o geneLeu2.

As células hospedeiras transformadas são cultivadas por métodos conhecidos natécnica em um meio líquido contendo fontes assimiláveis de carbono (carboidratos, como aglicose ou de lactose), nitrogênio (amínoácidos, peptídeos, proteínas ou os seus produtos dedegradação, como peptonas, sais de amônio ou similares), e sais inorgânicos (sulfatos, fos-fatos e/ou carbonatos de sódio, potássio, magnésio e cálcio). O médio ainda contém, porexemplo, promover o crescimento-substâncias, como os oligoelementos, por exemplo, ferro,zinco, manganês e similares.

Os anticorpos de alta afinidade anti-PDGFRa e anti-IGF-IRs, de acordo com a pre-sente invenção podem ser isolados de uma biblioteca de exibição de fagos construída a par-tir de genes de regiões variáveis humanas de cadeia pesada e leve. Por exemplo, um domí-nio variável da invenção pode ser obtido a partir de um linfócitos de sangue periférico quecontém um gene de região variável rearranjado. Alternativamente, as porções de domíniovariável, como regiões CDR e FW1 podem ser obtidas a partir de diferentes fontes e recom-binadas. Além disso, as porções do domínio variável (por exemplo, regiões FW) podem serseqüências sintéticas consensuais.

Os anticorpos e fragmentos dos anticorpos presentes invenção pode ser obtido, porexemplo, a partir de anticorpos de ocorrência natural, ou bibliotecas de exibição de fagosFab ou scFv. Entende-se que, para fazer um anticorpo de domínio único de um anticorpoque inclua um domínio MP e VL, certas substituições de aminoácidos fora das CDRs podemser pretendida para reforçar a ligação, expressão ou solubilidade. Por exemplo, pode serdesejável modificar resíduos de aminoácidos que de outra forma seriam enterradas na inter-face VH-VL.

Além disso, anticorpos e fragmentos de anticorpos da invenção podem ser obtidospor tecnologia padrão de hibridomas (Harlow & Lane, edição., Antibodies: A Laboratory Ma-nual, Cold Spring Harbor, 211-213 (1998), que está incorporada neste documento por refe-rência), utilizando camundongos transgênicos (por exemplo, camundongos KM de Medarex,San Jose, na Califórnia), que produzem imunoglobulina humana de cadeia pesada gama eleve kapa, em uma modalidade preferida, uma parte substancial do genoma de produção deanticorpos humanos é inserido no genoma do camundongo, e se torna deficiente na produ-ção de anticorpos murinos endógenos. Esses camundongos podem ser imunizados por viasubcutânea (sc), com PDGFRff (normalmente em adjuvante de Freund completo), com im-pulsos, conforme necessário. Os métodos de imunização são bem conhecidos na técnica.As proteínas usadas para identificar a ligação de IGF-IR aos anticorpos da invenção é prefe-rencialmente IGF-IR e, ainda mais de preferência, é o domínio extracelular do IGF-IR. Asproteínas usadas para identificar a ligação de PDGFRa aos anticorpos da invenção é prefe-rencialmente PDGFRa e, ainda mais de preferência, é o domínio extracelular do PDGFRff.Esses domínios extracelulares pode ser livres ou conjugados com outras moléculas..

A presente invenção fornece também polinucleotides isolados codificando os anti-corpos, ou fragmentos dos mesmos, descrito anteriormente. Detalhes de anticorpos IMC-A12 anti-IGF-IRs são divulgados em W02005016970. A Tabela 2 expõe as seqüências deácidos nucleicos para MC-3G3.

Tabela 2 - Seqüências de Nucleótidos Codificando CDRs do IMC-3G3

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O DNA codificando anticorpos humanos pode ser obtido por recombinação do DNAhumano codificando regiões constantes e regiões variáveis, que não as CDRs1 derivadosubstancialmente ou exclusivamente das regiões de anticorpos humanos correspondente eDNA codificando CDRs resultantes de um humano (SEQ ID NOS: 1, 3, E 5 para CDRs dedomínio variável de cadeia pesada e SEQ ID NOS: 9, 11, e 13 para CDRs de domínio variá-vel de cadeia leve).

As fontes adequadas de DNAs que codificam fragmentos de anticorpos incluemqualquer célula, como células de hibridoma e baço, que expressam o anticorpo completo.Os fragmentos podem ser utilizados por si sós como anticorpos equivalentes, ou podem serrecombinados em equivalentes, como descrito acima. As supressões e recombinações deDNA descritas nesta seção podem ser realizadas por métodos conhecidos, tais como osdescritos nas publicações acima listadas no que se refere às equivalências de anticorpose/ou outra técnica padrão recombinante de DNA, tais como as descritas a seguir. Outra fon-te de DNAs são os anticorpos de cadeia única produzidos a partir de uma biblioteca de exi-bição de fagos, como é conhecido na técnica.

Além disso, a presente invenção proporciona vetores de expressão contendo asseqüências polinucleotídicas anteriormente descritas operavelmetne Iigadaa a uma seqüên-cia de expressão, uma seqüência promotora e uma melhoradora. Uma variedade de vetoresde expressão para a síntese eficaz de anticorpos polipeptídeo em procariotas, tais comobactérias e sistemas eucarióticos, incluindo, mas não limitado a, cultura de células de leve-dura e sistemas mamíferos foram desenvolvidas. Os vetores da presente invenção podemincluir segmentos de seqüências de DNA cromossômico, não-cromossômico e sintético.

Qualquer vetor de expressão adequado pode ser usado. Por exemplo, vetores declonagem procariotas incluem plasmídeos de E. Coli, como colEI, pCRI, pBR322, pMB9,pUC, pKSM, e RP4. Vetores procariotas também incluir derivados de fago DNA tais como Ml3 e outros filamentosa único-ociosos DNA fagos. Um exemplo de um vector útil em levedura é um plasmídeo de 2 μ. Vetores de expressão adequados nas células dos mamíferos inclu-em derivados bem conhecidos de S V40, adenovirus, seqüências de DNA derivadas de re-trovírus e vetores de iniciação derivados de combinação de vetores funcionais mamíferos,tais como os acima descritas, e plasmídeos funcionais e DNA de fago.

Vetores de expressão eucariotas adiconais são conhecidos na técnica (por exem-plo, PJ. Southern and P. Berg1 J. Mol. Appl. Genet., I, 327-341 (1982); Subramani et ai, Mol.Cell. Biol., 1: 854-864 (1981); Kaufmann and Sharp, "Amplification And Expression of Se-quences Cotransfected with a Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNAGene," J. Mol. Biol. 159, 601-621 (1982); Kaufmann and Sharp, Mol. Cell. Biol. 159, 601-664(1982); Scahill et ai, "Expression And Characterization Of The Product OfA Human ImmuneInterferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells," Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 80, 4654-4659 (1983); Urlaub and Chasin, Proc. Nat1I Acad. Sei. USA 77, 4216-4220, (1980).

Os vetores de expressão úteis na presente invenção contem pelo menos uma se-qüência de expressão controle que é operativamente ligada a seqüência de DNA ou frag-mento a ser expresso. A seqüência controle é inserida no vetor, a fim de controlar e de regu-lar a expressão da seqüência clonada de DNA. Exemplos de seqüências de expressão con-trole úteis são o sistema lac, o sistema trp, o sistema tac, o sistema tre, regiões Iambda defago operador e promotor principais, a região de controle fd de proteína de revestimento, opromotores glicolíticos de leveduras, por exemplo, o promotor para 3-fosfoglicerato quinase,os promotores de ácido fosfatase de levedura, por exemplo, Pho5, os promotores de fatoresmating alfa de levedura, promotores e derivados de polioma, adenovirus, retrovírus, e vírussímios, por exemplo, promotores prematuros e tardios ou SV40, e outras seqüências conhe-cidas por controlar a expressão de genes de procariotas ou células eucariotas e seus vírusou combinações dos mesmos.

A presente invenção fornece também células hospedeiras recombinante contendoos vetores de expressão descritos anteriormente. Anticorpos da presente invenção podemser expresso em linhagens celulares diferentes de hibridomas. Ácidos nucleicos, que com-preendem uma seqüência que codifica um polipeptídeo de acordo com a invenção, podemser usados para transformação de uma célula hospedeira mamífera adequada.

Linhagens celulares de especial preferência são selecionadas com base no alto ní-vel de expressão, expressão constitutiva da proteína de interesse e contaminação mínimade proteínas de acolhimento. As linhagens celulares mamíferas disponíveis como hospedei-ras para expressão são bem conhecidas na técnica e incluem muitas linhagens celularesimortalizadas, tais como, mas não limitado a, células NSO de Ovário de Hamster Chinês(CHO) células, células de rim de filhotes de Hamster (BHK) e muitas outras. Células eucario-tas adicionais adequado incluem leveduras e outros fungos. Anfitriões procariotas úteis in-cluem, por exemplo, E Coli, tais como E Coli SG-936, E Coli MP 101, E. Coli W3110, EColi X1776, E CoIiX2282, E Coli DHI, e E Coli MRCI, Pseudomonasl Bacillusl tais comoBacillus subtilis, e Streptomyces.

Essas células hospedeiras recombinantes presentes podem ser utilizadas para pro-duzir um anticorpo, ou fragmento do mesmo, cultivando as células, em condições que permi-tam a expressão do anticorpo ou fragmento do mesmo e purificar o anticorpo ou fragmentodo mesmo a partir da célula hospedeira ou meio em torno da célula hospedeira. O alveja-mento do anticorpo expresso ou fragmento para secreção nas células hospedeiras recombi-nantes pode ser facilitado pela inserção de uma seqüência codificando um peptídeo lídersinal ou secretor (ver, Shokri et ai, Appl Microbiol Biotechnol. 60(6):654- 64 (2003), Nielsenet al., Prot. [Epsilon]ng. 10:1-6 (1997) e von Heinje et ai, Nucl. Acids Res. 14:4683-4690(1986)), na extremidade 5' do gene de codificação do Anticorpo de interesse. Estes elemen-tos peptídeos líder secretores podem ser obtidos a partir quer procariotas ou eucariotas se-qüências. Assim sendo devidamente, peptídeos líder secretores são utilizados, sendo osaminoácidos ligados à extremidade N-terminal de um polipeptídeo para direcionar o movi-mento do polipeptídeo para fora do citosol da célula hospedeira e secreção no meio.

Os anticorpos desta invenção podem ser fundidos a resíduos de aminoácido adi-cionais. Tais resíduos de aminoácidos podem ser um peptídeo marcador, talvez para facilitaro isolamento. Outros resíduos de aminoácidos para abrigar os anticorpos específicos paraórgãos ou tecidos são também contemplados.

Em outra modalidade, um anticorpo da presente invenção é feito expressando umácido nucleico codificando o anticorpo em um animais transgênicos, de tal forma que o anti-corpo é expressa e podem ser recuperados. Por exemplo, os anticorpos podem ser expres-sos em um tecido específico forma que facilite a recuperação e purificação. Em uma dessasmodalidade, um anticorpo da invenção é expresso na glândula mamária de secreção duran-te o aleitamento. Animais transgênicos, incluem, mas não estão limitados a camundongos,cabra, e coelho..

Anticorpos que podem ser usados de acordo com a invenção incluem imunoglobuli-nas completas, fragmentos de imunoglobulinas de ligação a antígeno, bem como proteínasde ligação a antígeno que compõem domínios de ligação a antígeno de imunoglobulinas.Fragmentos de imunoglobulinas de ligação a antígeno incluem, por exemplo, Fab, Fab', eF(aB')2. Outros formatos anticorpos foram desenvolvidos que mantêm a ligação especifici-dade, mas possuem outras características, que podem ser desejáveis, incluindo, por exem-plo, biespecíficoidade, multivalência (mais de dois sítios de ligação), tamanho compacto (porexemplo, domínios de ligação sozinhos).Anticorpos de cadeia única não tem alguns ou todos os domínios constantes doconjunto de anticorpos que são derivados. Portanto, eles podem superar alguns dos pro-blemas associados com o uso de qualquer anticorpos. Por exemplo, anticorpos de uma ca-deia tendem a ser livres de certas interações indesejadas entre regiões constantes de ca-deia pesada e outras moléculas biológicas. Além disso, anticorpos de uma cadeia são con-sideravelmente menores do que qualquer anticorpo e pode ter uma maior permeabilidade doque qualquer anticorpo, permitindo que anticorpos de cadeia única se localizem e se liguema sítios de ligação do antígeno-alvo de forma mais eficiente. Além disso, a dimensão relati-vamente pequena dos anticorpos de cadeia única torna-os menos susceptíveis de provocarum comportamento indesejado resposta imunitária em um receptor de todo anticorpos.

Diversos anticorpos de cadeia única, cada um com uma única cadeia VH e um domínio VL covalentemente ligados por um primeiro peptídeo ligante, pode ser covalentementeligado, pelo menos, por uma ou mais peptídeo ligante para formar um anticorpo multivalentede cadeia única, que pode ser monoespecífico ou multiespecífico. Cada cadeia de um anti-corpo de cadeia única multivalente inclui uma variável cadeia leve fragmento e um fragmen-to variável de cadeia pesada, e está ligado por um peptídeo ligante para pelo menos umaoutra cadeia. O peptídeo ligante é composto de, pelo menos, quinze aminoácido resíduos. Onúmero máximo de aminoácido resíduos é de cerca de cem. Dois anticorpos de cadeia úni-ca podem ser combinados para formar uma diacorpo, também conhecido como um bivalentedímero. Diacorpos têm duas cadeias e dois sítios obrigatório, e pode ser monoespecífico oubiespecífico. Cada cadeia de diacorpo inclui um domínio VH conectado a um domínio VL.

Os domínios estão relacionados com Iigantes que são suficientemente curtos para evitaremparelhamento entre domínios na mesma cadeia, assim dirigindo o emparelhamento entreos domínios complementares sobre diferentes cadeias de recriar os dois locais de ligação aantígenos.

Três anticorpos de cadeia única podem ser combinados para formar triacorpos, co-nhecido também como trímeros trivalentes. Triacorpos são construídos com a extremidadede aminoácido de um domínio VL ou VH diretamente ou fundidos para a extremidade de umdomínio VL ou VH carboxila, ou seja, sem qualquer seqüência ligadora. O triacorpo tem trêscabeças Fv com os polipeptídeos arranjados em uma cíclico, de modo cabeça-a-cauda.Uma possível conformação do triacorpo é planar com os três sítios de ligação localizadosem um plano em um ângulo de 120 graus entre si. Triacorpos pode ser monoespecíficos,biespecíficos ou triespecíficos.

Assim, anticorpos da invenção e fragmentos desse incluem, mas não estão limita-dos a, naturalmente anticorpos, tais como fragmentos bivalente (Fab')2, monovalentes, co-mo fragmentos Fab, anticorpos de cadeia única, Fv cadeia única (scFv), único domínio Anti-corpos, multivalent anticorpos de cadeia única, diacorpos, triacorpos, bem como os que seligam especificamente com antígenos.

Os anticorpos anti-IGF-IR e anti-PDGFRa ou fragmentos de anticorpos, que podemser internalizados mediante ligação a células carregando IGF-IR (W02005016970) ou PDG-FRa1 podem ser quimicamente ou biosinteticamente ligados a agentes anti-tumorais. Agen-tes anti-tumorais ligados a este tipo de anticorpos incluem quaisquer agentes que destroemou danificam um tumor para que o anticorpo tem ligação ou no ambiente da célula para oqual o anticorpo tem ligação. Por exemplo, um agente anti-tumoral é um agente tóxico, co-mo um agente quimioterápico ou de um radioisótopo. Agentes quimioterapêuticos adequa-dos são conhecidos por aqueles versados na técnica e incluem antraciclinas (ex daunomici-na e doxorrubicina), metotrexato, víndesina, neocarzinostatina, cisplatina, clorambucil, citosinaarabinosideo, 5-fluoruridina, melfalano, ricina e caliqueamicina. Os agentes quimioterapêuticossão conjugados com o anticorpo utilizando métodos convencionais (Ver, por exemplo, Her-mentin e Seiler, Behring lnst. Mitt. 82:197-215 (1988)).

Radioisótopos adequados para uso como agentes anti-tumoral também são conhe-cidos por aqueles hábeis na técnica. Por exemplo, eu 131 ou 211At é usado. Esses isótopossão anexados ao anticorpo utilizando técnicas convencionais (Ver, por exemplo, Pedley etai, Br. J. Câncer 68, 69- 73(1993)).

Alternativamente, o agente anti-tumoral que está ligado ao anticorpo é uma enzimaque ativa um pró-fármaco. Desta forma, um pró-fármaco é administrado para permanecerem sua forma inativa até que ele atinja a meta local onde é convertido para sua forma decitotoxina. Na prática, o conjugado anticorpo-enzima é administrado ao paciente e permitiu alocalização na região do tecido a ser tratado. O pró-fármaco é então administrado ao pacien-te, para que a conversão para o fármaco citotóxico ocorra na região do tecido a ser tratado.

Outros agentes anti-tumorais medicamentos incluem citocinas, como interleucina-2(IL-2), interleucina-4 (IL-4) ou fator de necrose tumoral alfa (TNF-σ). O anticorpo alveja acitocina ao tumor, a fim de que a citocina mediem os danos ou destruição dos tecidos tumo-rais sem afetar os demais. A citocina pode ser conjugado com o anticorpo no DNA, utilizan-do técnicas convencionais de DNA recombinante.

Em certas modalidades da invenção, o anti-IGF-IR ou anticorpos anti-PDGFRa sãoadministrados em combinação com um ou mais agentes anti-neoplásicos. Para exemplos deterapias de combinações, ver, por exemplo, Patente US n°. 6.217.866 (Schlessinger et ai)(Anti-EGFR antibodies in combination with anti-neoplastic agents); WO 99/60023 (Waksal etai) (Anti-EGFR antibodies in combination with radiation). Qualquer agente anti-neoplásicaadequado pode ser usado, como um agente quimioterápico, as radiações ou combinaçõesdos mesmos. O agente anti-neoplásico pode ser um agente alquilante ou um anti-metabólito. Exemplos de agentes alquilantes incluem, mas não estão limitados a, cisplatina,ciclofosfamida, melfalan, e dacarbazina. Exemplos de anti-metabólitos incluem, mas não selimitando a, doxorubicina, daunorubicin, e paclitaxel, gemcitabina.

Agentes anti-neoplásicos úteis também incluem inibitores de mitose, como taxanos,docetaxel e paclitaxil. Inibidores da topoisomerase são outra classe de agentes anti-neoplásicos medicamentos que podem ser usados em combinação com anticorpos da in-venção. Estes incluem inibidores da topoisomerase I ou topoisomerase II. Inibidores da to-poisomerase I incluem irinotecano (CPT-11), aminocamptotecina, camptotecina, DX-8951f,topotecano. Inibidores da topoisomerase Il incluem etoposido (VP-16), e teniposido (VM-26).Outras substâncias estão atualmente a ser avaliadas em relação a atividade inibitória detopoisomerase e eficácia como agentes antineoplásicos. Em uma modalidade preferida, oinibidor da topoisomerase é irinotecano (CPT-II). Em um determinado corporificação da in-venção, um anticorpo anti-IGF-IR é administrado em combinação com docetaxel. Em outramodalidade da invenção, um anticorpo anti-PDGFRcr é administrado em associação comdoxorrubicina.

Quando o agente anti-neoplásico direito é radiação, a fonte de radiação pode sertanto externa (feixe externo de radiação terapia-EBRT) ou interna (braquiterapia-BT), para opaciente a ser tratado. A dose de agente anti-neoplásico administrada depende de váriosfatores, incluindo, por exemplo, o tipo de agente, o tipo e gravidade tumoral a ser tratado eda via de administração do agente. Deve-se enfatizar, no entanto, que a presente invençãonão se limita a uma determinada dose.

Os tratamentos com anticorpos (anticorpos anti-IGF-IR ou anti-PDGFRa) e anticor-pos mais agente anti-neoplásico também podem ser utilizados para os pacientes que rece-bem terapia adjuvante hormonal (por exemplo, para o câncer da mama) ou terapia de priva-ção de androgênio (por exemplo, câncer de próstata).

Antagonistas anti-IGF-IR e anti-PDGFRas da invenção podem ser co-administrados, ou administrados com antagonistas do receptor que neutraliza outros recep-tor envolvidos no crescimento tumoral ou angiogênese. Por exemplo, em uma modalidadeda invenção, um anticorpo anti-IGF-IRs e um anticorpo anti-PDGFRa são coadministrados,em uma modalidade, em que uma célula tumoral alvo manifesta tanto IGF-IR e PDGFRa,elementos comuns da tradução de sinal são ativados por tradução de sinal através de cadareceptor. Embora a inibição de um receptor geralmente resulte em diminuição da ativaçãodos componentes comuns abaixo, a inibição da ativação ambos os receptor vai diminuir ain-da mais. Em outra modalidade, certas células tumorais ou de um tecido circundante exprimirquantidades significativas de um receptor, e outras células expressam valores significativosda segunda receptor. A co-administração dos antagonistas reduz o crescimento das célulastumorais e parácrina estimulação das células circundantes..

Um anticorpo biespecífico podem ser fornecidos como um alternatativa a co-administração. A variedade de anticorpos biespecíficos que existem são concebidos paraincorporar diversas características desejáveis. Por exemplo, diacorpos biespecíficos têmtamanho mínimo. Anticorpos biespecíficos com quatro sítios de ligação a antígenos (doispara cada especificidade de ligação) têm carácter de aviditivos de ligação de que são seme-lhantes aos dos anticorpos naturais correspondentes. Certas regiões de anticorpos biespecí-ficos incorporam Fc1 assim mantendo efetoras funções (por exemplo, completar citotoxicida-de dependente (CDC) e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)), de anticor-pos naturais. WO 01/90192 descreve anticorpos tetravalente similares a IgGW02006/020258 descreve um anticorpo tetravalente que integra dois diacorpos e mantémfunções efetoras.

Em outra modalidade, um anticorpo anti-IGF-IR ou um anticorpo anti-PDGFRa ououtro antagonista é usado em combinação com um antagonista de receptor que se liga es-pecificamente a um receptor do fator de crescimento epidérmico (por exemplo, EGFR,Her2/erbB2, erbB3, erbB4). Especialmente preferidas são as ligaçãos antígeno-proteínasque se ligam ao domínio extracelular do EGFR e bloqueam a ligação de um ou mais dosseus Iigantes e/ou neutralizam ativação induzida por Iigante do EGFR. Antagonistas deEGFR também incluem anticorpos que se ligam a um Iigante de EGFR e inibe a ligação doEGFR a seu ligante. Ligantes EGFR incluem, por exemplo, EGF, TGF-σ, amfiregulina, EGFde ligação a heparina (HB-EGF) e betacelulina. Pensa-se que EGF e TGF-σ sejam os prin-cipais ligantes endógenos que resultam em estimulação EGFR-mediada, embora TGF-σ temmostrado ser mais potente na promoção da angiogênese. Antagonista de EGFRs tambémincluir as substâncias que inibem dimerização de EGFR com outras subunidades de recep-tor de EGFR (ou seja, EGFR homodímeros) ou heterodimerização com outros receptor fatordo crescimento (por exemplo, HER2). Antagonista de EGFRs incluir novas moléculas bioló-gicas e moléculas pequenas, como o sintético quinase inibidores que atuam diretamente nodomínio citoplasmático do EGFR para inibir EGFR-mediada tradução de sinal. Erbitux ® (ocetuximab) é um exemplo de que se liga ao Antagonista de EGFR EGFR e bloqueia a liga-ção ao ligante. Um exemplo de uma molécula pequena antagonista EGFR é IRESSA ™(ZD1939), que é um quinozaline derivativo que funciona como um ATP-mimético para inibirEGFR. Veja Patente US n°. 5.616.582 (Zeneca Limited); WO 96/33980 (Zeneca Limited) nap. 4; veja também, Rowinsky et al, Abstract 5 apresentado no 37th Annual Meeting of ASCO,São Francisco, CA, 12-15 de maio de 2001; Anido et al, Abstract 1712 apresentado no 37thAnnual Meeting of ASCO, São Francisco, CA, 12-15 de maio de 2001. Outro exemplo deuma molécula pequena antagonista de EGFR é Tarcevá ® (OSI-774), que é um derivado de4-(fenilamina-substituída)quinozalina [cloridrato de 6,7-Di(2-metoxi-etoxi)-quinazolin-4-il]-(3-etinil-fenil)amina] inibidor de EGFR. Veja WO 96/30347 (Pfizer Inc.) em, por exemplo, na página2, IinhAI2, até a página 4, linha 34, página 19, linhas 14-17. Veja também Moyer et al., Cân-cer Res.., 57: 4838-48 (1997); Pollack et al., J. Pharmacol, 291: 739-48 (1999). Tarceva ®pode funcionar através da inibição da fosforilação de EGFR e suas vias de tradução de sinalabaixo PI3/Akt e MAP (proteína mitógena ativada) quinase resultando em p27-mediada célu-la-ciclo detenção. Veja Hidalgo et al-Abstract 281 apresentado no 37th Annual Meeting ofASCO, São Francisco, CA1 12-15 de Maio de 2001.

Outras moléculas pequenas também foram relatadas por inibir EGFR, muitas dasquais pensa-se serem específicas para o domínio tirosina quinase de um EGFR. Algunsexemplos desses pequenos molécula Antagonista de EGFRs são descritos no WO91/116051, WO 96/30347, WO 96/33980, WO 97/27199 (Zeneca Limited). WO 97/30034(Zeneca Limited), WO 97/42187 (Zeneca Limited), WO 97/49688 (Pfizer Inc.), WO 98/33798(Warner Lambert Company), WO 00/18761 (American Cyanamid Company), e WO00/31048 (Warner Lambert Company). Exemplos específicos de antagonista de EGFRs demolécula pequena incluir CI-1033 (Pfizer), que é uma quinozalina (N-[4-(3-cloro-4-flúor-fenilamino)-7-(3-morfolin-4-il-propoxi)-Quinazolin-6-il]-acrilamida) inibidora da tirosina quinase, par-ticularmente EGFR e é descrita em WO 00/31048 na página 8, linhas 22-6; PKII 66 (Novar-tis), que é uma pirrolopirimidina inibidor do EGFR e é descrito Em WO 97/27199 às páginas10-12; GW2016 (GIaxoSmithKIine), o qual é um inibidor do EGFR e HER2; EKB569 (Wyeth),que é relatada por inibir o crescimento de células tumorais que superexpressam EGFR ouHER2 in vitro e in v/Vo; AG-1478 (Trifostina), que é uma quinazolina de molécula pequenaque inibe a sinalização de ambos os EGFR e erbB-2; AG-1478 (Sugen), que é um bisubstra-to inibidor que também inibe a proteína quinase CK2; PD 153035 (Parke -Davis ), que é rela-tada por inibir atividade EGFR quinase e crescimento tumoral, induzir a apoptose nas célu-las em cultura, e valorizar a citotoxicidade de agentes quimioterapêuticos citotóxicos; SPM-924 (Schwarz Pharma), que é um inibidor da tirosina quinase direcionado para o tratamentodo câncer de próstata; CP-546.989 (OSI Pharmaceuticals), que é declaradamente um inibi-dor da angiogênese para o tratamento de tumores sólidos; ADL-681, que é um inibidor daquinase EGFR direcionados para o tratamento do câncer; PD 158780, que é um piridopiri-midine que é relatado para inibir a taxa de crescimento do tumor A4431 enxertado em ca-mundongos; CP-358774, que é um quinzoline que é relatado para inibir autofosforilação emHN5 enxertado em camundongos; ZD 1839, que é uma quinzolina que é relatada a ter ativi-dade antitumoral no camundongo enxertado modelos incluindo os cânceres vulvar, NSCLC,próstata, ovário, e colo-retais; CGP 59326A, que é uma pirrolopirimidina que é relatada parainibir o crescimento do EGFR-positivos enxertado em camundongos; PD 165557 (Pfizer);CGP54211 e CGP53353 (Novartis), que são dianilnoftalimidas. Derivados naturalmente deinibidores de EGFR de tirosina quinase incluem genisteina, herbimicina A, quercetina, eerbstatina.

Outras moléculas pequenas relatadas por inibir EGFR e que são, portanto, dentrodo âmbito da presente invenção são compostos tricíclicos tais como os compostos descritosna Patente US n°. 5679683; derivados de quinazolina, como os derivados descritos na Pa-tente US n°. 5616582; e compostos de indol tais como os compostos descritos na PatenteUS n°.5196446.

Outro receptor que podem ser direcionados ao longo de IGF-IR ou PDGFRa é umreceptor vascular do fator de crescimento do endotélio (VEGFR). Em uma modalidade dapresente invenção, um anticorpo anti-IGF-IR ou anti-PDGFRa Anticorpo é usado em combi-nação com um antagonista de VEGFR. Em uma modalidade, um antagonistis usados queliga-se especificamente ao receptor de VEGFR-l/FIt-l. Em outra modalidade, o VAntagonistade EGFR liga-se especificamente ao VEGFR-2/KDR receptor. Especialmente preferidos sãoa ligaçãos antígeno-proteínas que se ligam ao domínio extracelular do VEGFR-I ou VEGFR-2 e bloqueiam a ligação pelos seus Iigantes (VEGFR-2 é mais fortemente estimulada peloVEGF, VEGFR-I é mais fortemente estimulada pelo PIGF1 mas também Por VEGF) e/ouneutralizar induzida por Iigante induzido ativação. Por exemplo, IMC-1121 é um anticorpoque se liga aos humanos e neutraliza VEGFR-2 (WO 03/075840; Zhu). Outro exemplo éMAb 6,12 que se liga a VEGFR-I solúvel expresso na superfície das células e ScFv 6,12compreende os domínios VL e VH do camundongo anticorpo monoclonal MAb 6,12. A linha-gem de células de hibridomas produtores MAb 6,12 tenha sido depositado no ATCC númeroPTA-3344 ao abrigo das disposições do Tratado de Budapeste sobre o ReconhecimentoInternacional do Depósito de Microrganismos para efeitos de Procedimento de Patentes e osregulamentos correspondentes (Budapest Treaty). Em outra modalidade, o VAntagonista deEGFR liga-se a uma VEGFR Iigante e blocos ativação de um VEGFR pela ligante. Por e-xemplo, Avastina (bevacizumab) ® é um anticorpo que se liga ao VEGF.

Outros exemplos de receptores de fator de crescimento envolvidos na tumorigêne-se são fator de crescimento nervoso (NGFR), e fator de crescimento de fibroblasto (FGFR).

Em mais uma modalidade alternativa, os anticorpos anti-IGF-IR e anti-PDGFRa tan-to podem ser administrados em combinação com um ou mais adjuvantes adequados, taiscomo, por exemplo, citocinas (IL-10 e IL-13, para Exemplo) como de outros estimuladoresimunes, tais como, mas não limitado a, quimiocina, antígenos tumorais associados, e peptí-deos. Ver, por exemplo, Larrivee et ai, Supracitado. Deverá ser apreciado, no entanto, quea administração de apenas um anticorpo anti-IGF-IR ou anti-PDGFRa é suficiente para im-pedir, inibir, ou reduzir a progressão tumoral de modo terapeuticamente eficaz.

Em uma terapia combinada, o anticorpo anti-IGF-IR ou anti-PDGFRa é administra-do antes, durante ou depois da terapia com um outro agente, bem como qualquer combina-ção, ou seja, antes e durante, antes e depois, Durante e depois, ou antes, durante e depoisinicia o processo agente anti-neoplásico terapia. Por exemplo, o anticorpo pode ser adminis-trado entre 1 e 30 dias, de preferência 3 e 20 dias, mais de preferência entre 5 e 12 diasantes de iniciar a terapia por radiação. Em uma modalidade preferida da invenção, é admi-nistrado concomitantemente com quimioterapia ou, ainda mais de preferência, para posteriorterapia com anticorpo.

Na presente invenção, qualquer método adequado ou rota pode ser utilizado paraadministrar anticorpos da invenção e, opcionalmente, para co-administrar agentes anti-neoplásicos e/ou de outros antagonistas dos receptor. O agente anti-neoplásico regimesutilizado, de acordo com a invenção, incluem qualquer regime que se pensa ser melhor a-dequado para o tratamento da condição do paciente neoplásica. Diferentes malignas podemexigir uso de antitumor anticorpos específicos e de anticorpos específicos agentes anti-neoplásica, que será determinado em função de um paciente para paciente. As vias de ad-ministração incluem, por exemplo, por via oral, intravenosa, intraperitonial, subcutânea, ouintramuscular. A dose administrada depende do antagonista de vários fatores, incluindo, porexemplo, o tipo de antagonistas, o tipo e gravidade tumoral a ser tratado e da via de admi-nistração dos antagonistas. Deve-se enfatizar, no entanto, que a presente invenção não selimita a um método específico ou à via de administração.

Alguém versado na técnica entenderia que as doses e a freqüência do tratamentodependerá da tolerância do paciente individual e sobre os farmacológicos e farmacocinéti-cos porperties de bloqueio ou inibitória agente utilizado. Idealmente, uma vontade de alcan-çar saturável farmacocinética para o agente utilizado. A dose para ambos os anti-IGF-IR eanti-PDGFRff Anticorpos pode variar, por exemplo, de cerca de 10 para cerca de 1000 mgde V/m2, de preferência a partir de cerca de 200 para cerca de 400 mg de V/m2. Isto podeser seguido por vários outros diários ou semanais dosagens variando, por exemplo, de cer-ca de 200 para cerca de 400 mg de V/m2. O paciente é monitorado por efeitos secundários eo tratamento é interrompido quando tais efeitos colaterais são graves.

Alguém versado na técnica também é necessário saber como acompanhar a evolu-ção do tratamento, a fim de determinar uma dose eficaz. Para as metástases ósseas decâncer de próstata, uma tal maneira é acompanhar níveis de PSA. Outras maneiras de a-companhar as metástases ósseas incluem varreduras óssea e IRM.

Para os pacientes para os quais o tratamento de câncer induziu perda óssea(CTIBL) é um risco ou problemático (por exemplo, os pacientes que recebem terapia adju-vante hormôniois para o câncer da mama ou privação androgênio-terapia para câncer depróstata), qualquer tratamento supracitado pode ser completado pela administração dosagentes de prevenção de CTEBL, tais como bifosfonatos. Bisfosfonatos incluem, por exem-plo, clodronato, risedronato, e ácido zoledrônico..

Ao longo de todo este pedido, publicações diversas, textos de referência, livros,manuais técnicos, patentes, patentes e pedidos foram referidos. Os ensinamentos e divul-gações dessas publicações, patentes, pedidos de patentes e outros documentos em seusintegridades são incorporadas por referência a esse pedido para mais plenamente descrevero estado da técnica para a qual o presente invento pertence.

Deve ser compreendido e esperado que as variações nos princípios da invençãoaqui divulgados podem ser feitos por alguém versado na técnica e pretende-se que essasmodificações devam ser incluídas no âmbito da presente invenção.

Os seguintes exemplos ilustram melor a invenção, mas não devem ser interpreta-dos de forma a limitar o âmbito da invenção de forma alguma. As descrições detalhadas dosmétodos convencionais, tais como as pessoas que trabalham na construção de vetores eplasmídeos, e expressão de anticorpos e fragmentos de anticorpos podem ser obtidos apartir de diversas publicações, incluindo Sambrook, J et ai, (1989) Molecular Cloning: A La-boratory Manual, 2a edição., Cold Spring Harbor Laboratory Press; Coligan, J. et ai (1994)Current Protocols em Imunologia, Wiley & Sons, lncorporated; Enna, SJ. Al ET. (1991) Cur-rent Protocols em Farmacologia, Wiley & Sons, Bonifacino, JS Al ET. (1999) Current Proto-cols em Cell Biology1 Wiley & Sons. As referências aqui mencionados são incorporadas naíntegra.

Exemplos

Exemplo 1

Efeitos do IMC-A12 e docetaxel sobre o crescimento tumoral.

Pedaços de tumores (20 a 30 mm3), de LuCaP 35V androgênio-independentes (Al)foram implantados por via subcutânea (sc) em camundongos SCID castrados com 32 seissemanas de idade respectivamente como descrito anteriormente (4). Quando a implantaçãotumoral foi observada para atingir um volume de 150-200 mm3, os animais foram distribuí-dos aleatoriamente em quatro grupos de estudos de tratamento. Os animais do grupo 1 re-ceberam tratamento com docetaxel na dose de 20 mg/Kg. Os animais do Grupo 2 recebe-ram tratamento com docetaxel em uma dose de 10 mg/kg. Os animais do Grupo 3 recebe-ram tratamento combinado de 10 mg/kg docetaxel e 40 mg/Kg A12. Os animais do Grupo 4receberam tratamento combinado de 20 mg/kg docetaxel e 40 mg/Kg A12. Todos os trata-mentos foram administrados por via intraperitoneal (IP). O docetaxel foi administrado umavez por semana. A12 foi administrado três vezes por semana. Todos os animais foram tra-tados durante quatro semanas e monitorados por quatro semanas suplementares antes dosacrifício. Os tumores foram medidos duas vezes por semana e volume tumoral foi calcula-do pela fórmula: Volume = Lx P2/2. Seguindo o nosso protocolo de animais da Universidadede Washington aprovado pelo IACUC, alguns animais foram sacrificados uma hora maiscedo, quando o tumor atingiu um volume de 1000 mm3 ou quando a perda de peso corporaldos animais ultrapassou 20% de peso inicial corporal. Os animais foram pesados duas ve-zes por semana. Amostras de sangue foram coletadas do seio orbital semanalmente. Sorofoi separado e o nível de PSA foi determinado utilizando o Ensaio EVIx Total PSA (AbottLaboratories, Abott Park, IL). BrdU foi injetado no tumores 1 hora antes de os animais seremsacrificados para avaliação da taxa de proliferação de células tumorais in vivo.

Após o sacrifício, os tumores foram recolhidos e rduzidos à metade. Uma parte dostumores foi fixada em tampão neutro de formalina 10% (NFB)1 e incorporados em parafina.Seções de cinco microns foram preparadas para coloração imuno-histoquímica (IHC). A par-te restante do tumor foi dividida mecanicamente em células únicas pela trituração e filtradasatravés de peneiras de Nylon de 70 μm).

Conforme mostrado na figura. 1, enxertos LuCaP 35V cresceram agressivamenteem camundongos com uma taxa média de crescimento de 362,0±72,0 mm3/semana semqualquer tratamento. Todos os animais do grupo não-tratados tiveram de ser sacrificados noprazo de três semanas após o início do tratamento em grupos experimentais, devido a tumo-ral volumes excede 1000 mm3. Quando os animais foram tratados com 40 yug/kg de A12isoladamente, o crescimento tumoral taxa foi reduzida para 192,7±35,6 mm3/semana duran-te o tratamento. Quando docetaxel foi administrao aos animais em uma dose de 10 mg/kg, ataxa de crescimento de tumor LuCaP 35V foi reduzida para uma média de 29,6±6,1mm3/semana. Quando docetaxel foi administrado em combinação com tratamento A12, ataxa de crescimento de tumor LuCaP 35V foi ainda reduzida a uma média de 7,9± 1,0mm3/semana (Fig. Ib). O efeito inibitório do docetaxel combinado com A12 persistiu por maisde quatro semanas após o fim do tratamento. Quando uma maior dose de docetaxel(20mg/kg), foi dado aos animais, independentemente, com ou sem combinado tratamentoA12, volume tumoral não aumentou durante o período de tratamento de quatro semanas;em contrapartida, uma tendência de redução do volume tumoral foi observada. Porém, nasquatro semanas seguintes ao fim do tratamento, a redução do volume tumoral foi mantidano grupo de animais tratados com docetaxel combinado com A12. Em contraste, volumestumorais foram aumentando a uma taxa média de 27,0±16,1 mm3/semana no grupo de ani-mais tratados com docetaxel em monoterapia. Estes resultados têm sugerido que, em umadeterminada dose de docetaxel, o tratamento combinado com A12 pode aumentar o efeitoinibitório do docetaxel sobre o crescimento tumoral durante o tratamento ou após o trata-mento Acompanhamento.

PSA é um parâmetro clínico comumente utilizado para avaliar o crescimento tumo-ral próstata. Serum PSA níveis foram medidos em animais durante e após o tratamento.Conforme mostrado na figura. Ic, nos animais tratados com A12 e docetaxel ou 20 mg/kgapenas docetaxel, nenhuma mudança significativa foi observada nos níveis séricos de PSAdurante as quatro semanas de tratamento, compatível com o crescimento tumoral reprimido.Após o fim do tratamento, os níveis séricos de PSA foi demonstrados aumentados em ani-mais tratados apenas com docetaxel e, em contrapartida, coerentes ou mesmo diminuídosem animais tratados com docetaxel em associação com a A12. Estes dados são consisten-tes com a continuação do tratamento pós-inibição do crescimento tumoral em animais trata-dos com docetaxel e A12.

Indução da apoptose por docetaxel combinado com anticorpo anti-IGF-IRs

O efeito in vivo combinado do docetaxel e A12 tratamento no ciclo celular e sobre-vivência de célula nos pontos finais experimentais foi medido por ensaio de marcação daextremidade nick mediada por desoxinucleotidil transferase (TÚNEL) e marcação com pro-pídio (PI) utilizando o Apop-Diret Kit (BioScience BD), como descrito anteriormente. Resu-midamente, 1x106 células de suspensão de única célula foram fixadas com tampão formali-na neutro 10% (NBF), seguidos por 70% de etanol em álcool 20 0C por 30 minutos. Apósvárias lavagens, as células foram permeablizadas com 0,1% Triton X-100 e incubadas comconjugado FITC-dUTP e enzima terminal desoxinucleotidil tranferase (TdT) a 37°C durante 1hora, a que se seguiu uma incubação com PI/RNase tampão ( 100 /vg/mL de PI, 50 /yg/mLde RNase) à temperatura ambiente durante 60 minutos. As amostras foram analisadas pelofluxo citometria usando uma BD FACscan. Os dados foram analisados com CellQuestPROsoftwares.

Quatro semanas após o fim do tratamento, apoptose foi detectada em uma percen-tagem significativa dos tumores de animais que tinham sido tratados com docetaxel (66,7%em grupo tratado com Docetaxel 10 mg/Kg e 77,8% em grupo tratado com Docetaxel20mg/kg), em combinação com a A12 ( Fig. 2b e Tabela 1), independentemente da dose dedocetaxel sendo usada. A média de eventos apoptoticos nestes tumores ocorreu a uma taxade 15,0±4,3%. Nenhuma apoptose em tumores foi detectada em animais que foram tratadosapenas com docetaxel. Em vez disso, a maioria (88% em grupo tratado com Docetaxel 10mg/Kg e 100% em grupo tratado com Docetaxel 20mg/kg) dos tumores procedeu ao normalciclo celular (Fig. 2a e Tabela 3).

Tabela 3 - Ciclo celular tumoral e atividades de sobrevivência no momento do sa-crifício

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Para avaliar ainda mais a capacidade de proliferação de células tumorais após umfinal de tratamento diferente, secção em parafina de anticorpos anti-BrDu corados. Amostrastumorais foram fixadas em 10% NBF1 embebidas em parafina, e seccionadas em 5-//milhõesem lâminas. Após retirda da parafina e reidratação, antígenos foram recuperadas com 0,01M ácido cítrico (pH 6,0) a 95°C durante 2X5 minutos. As lâminas foram autorizados a arre-fecer durante 30 minutos, seguida por lavagem seqüencial com PBS. A atividade de peroxi-dase endógena foi interrompida por uma incubação com 0,3% de H202 em metanol durante15 minutos. Após o bloqueio com soro de cabra normal 1,5% em PBS contendo 0,05% deTween 20 (PBST) durante 1 hora, lâminas foram incubadas com o camundongo medidasanti-BrdU anticorpo (1 μμ g/mL) por 1 horas seguidas de incubação seqüencial com biotinacabra IgG anti-camundongo de 30 minutos, peroxidase -rotulada avidin durante 30 minutos(Santa Cruz Biotechnology) e diaminobenzidina (DAB)/substrato peróxido de hidrogêniocromogênio (Vector Laboratories, Burlingame, CA) durante 5-10 minutos. As etapas de in-cubação foram realizadas em temperatura ambiente. As lâminas foram cotra-marcadas comhematoxilina (Sigma), e montadas com permount (Fisher Scientific, Fair Lawn, New Jersey).

Para controle negativo, IgG de camundongo (Vector Laboratories), foi utilizada em vez deanticorpo anti-BrdU primário. As lâminas foram examinadas no âmbito de um MicroscópioZeiss e imagens digitais foram obtidas. Números de BrdU-rotulada núcleo núcleo e total fo-ram coletados de 10 aleatória opiniões de cada seção. O índice de proliferação foi calculadopelo número de núcleos BrdU-positivos dividido pelo número total de núcleos. Dez camposforam contadas por deslize. A marcação H & E foi realizada usando hematoxilina e eosina(Richard Allen, Kalamazoo, Ml).

Nos animais que foram tratados com docetaxel e A12, a captação de BrDu foi signi-ficativamente menor do que os tratados com a mesma dose de docetaxel em monoterapia(Fig. 3). Esses dados de incorporação de BrDu são coerentes com as observações acima dociclo celular e apoptose, sugerindo que A12 significativamente reforce a citotoxicidade dedocetaxel.

Regulação diferencial da expressão do gene em tumores tratados com docetaxelcombinado com anticorpo anti-IGF-IRs versus apenas docetaxel

Para determinar os mecanismos potenciais para o efeito do docetaxel nitidamentereforçada pela A12, IGF-IR expressão foi analisada em todas colhidas tumores por análiseimunológica e fluxo citometria. Não houve diferença na superfície IGF-IR expressão entretodos os grupos de tratamento ou, em comparação com o grupo controle (dados não apre-sentados). Pós-tratamento expressão genética foi analisado utilizando cDNA microarrayanálises em tumores de animais que tinham receberam 20 mg/kg de docetaxel e 20 mg/Kgde docetaxel combinado com A12. Baseado em análise SAM, 49 genes foram identificadoscomo diferentemente expressos em tumores que receberam o tratamento combinado dedocetaxel e A12, em comparação com aqueles recebeu apenas docetaxel, com mais de 2vezes mudança e menos de 10% falsa descoberta taxa (FDR) (dados não Mostrada). Trezegenes foram identificados que são potencialmente envolvidos na regulação do ciclo celularou apoptose (Tabela 4). Todos os 13 genes foram, pelo menos, 2 vezes diferentes entre osdois tratamentos e tinha um FDR com menos de 0,02%. Nove genes estabelece-se regula-mentado e quatro foram até genes-regulamentado em tumores tratados com docetaxel eA12, em comparação com tumores tratados com docetaxel em monoterapia.

Tabela 4 - Expressão genética diferenciada pós-tratamento em tumores tratadoscom docetaxel + A12, em comparação com tumores tratados com docetaxel em monotera-pia.

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Para genes selecionados, os resultados foram confirmados pelo RT-PCR de temporeal. Um fragmento padrão de PCR de DNAc alvo foi purificado. Uma série de diluições pa-drão de 10 ng/uL a 10~3 pg/uL de foram utilizados para RT-PCR de tempo real para gerarcurvas padrão. Um μg de RNA total de cada grupo de tumor agrupado foi utilizado para sín-tese de DNAc de primeira fita usando Superscript First Strand Synthesis System (Invitro-gen). RT-PCR de tempo real foi realizada em 20 μL de mistura de reação contendo 1 μL deDNAc de primeira fita, conjuntos cd iniciadores específicos, e Lighteycler FastStart DNAMaster Plus SYBR Green usando um Roche Lightcycler seguindo o protocolo do fabricante(Roche, Nutley, NJ). Os produtos de RT-PCR foram submetidos a fusão curva análise utili-zando o programa Lightcycler v3.5. Os tamanhos de amplicons foram confirmados por ele-troforese em gel de agarose. Cada amostra foi doseada em dobro. Os resultados são apre-sentados na Fig. 4.

Dos genes infra-regulados, TUBB foi mostrado para resultar em resistência ao do-cetaxel (Tanaka et al. De 2004, Int. J. Câncer 111, 617-26), e o aumento da expressão deBIRC 5 (survivina) tem demonstrado ser associado com câncer de próstata agressivo e re-sistência à terapia antiandrogênica (de Angelis et al. De 2004, Int. J. Oncol. 24, 1279-88;Zhang et al. De 2005, Oncogene 24, 2474-82) Além disso, TUBB é um gene regulamentadopor IGF-IR que está envolvido com a transformação mediada por IGF-IR (Loughran et al. De2005, Oncogene 24, 6185-93). Dos quatro genes supra-regulados, IGFBP3 foi demonstradopor inibir a sinalização de ligante-IGF, bem como por induzir apoptose nas células tumoraisde próstata em um Iigante de forma dependente (Grimberg et al. De 2000, J. Cell. Physiol.183, 1-9).

Níveis séricos pós-tratamento de A12

Os níveis séricos de A12 foram medidos em animais que receberam docetaxel ha-via combinado com a A12. Os níveis séricos de A12 diminuíram 100 vezes duas semanasapós a interrupção do tratamento, e foram detectados a um nível muito baixo quatro sema-nas após a interrupção do tratamento (Fig. 5).

Citotoxicidade Geral

A citotoxicidade da co-administração de docetaxel e IMC-A12 foi examinada. Embo-ra A12 tenha reatividade cruzada superior a 95% com murino IGF-IR, nenhuma atividade oucomportamento anormal diário de mudanças foi observado em animais tratados com doce-taxel isoladamente ou reagentes combinados, em comparação com o animais portadores detumores controle. Nenhum efeito significativo sobre células renais foi observado em qual-quer grupo de tratamento tanto por ensaios de ciclo celular como apoptose (dados não a-presentados). Nenhuma alteração significativa do peso corporal foi observada entre os gru-pos de tratamento (Fig. 6).

Terapia com anticorpo anti-IGF-IR para metástase óssea

A eficácia do tratamento com anticorpo anti-IGF-IR sobre o crescimento metastáticado câncer da próstata em células ósseas foi avaliada usando células de próstata injetadadiretamente na tíbia de camundongos SCID. Por este método, tumores metastáticos sãoestabelecidas diretamente, sem dependência de quimiotaxia dependentes de invasão dacirculação. Uma variedade de linhagens tumorais está disponível para estabelecer as me-tástases ósseas. Estes incluem células PC-3, LuCaP35, e LnCaP que produzem lesões os-teolíticas e céulas LuCaP 23.1 que produzem lesões osterblásticas.

Céulas LuCaP 23.1, que expressam IGF-IR, tem um índice de -80% no ambienteósseo e resultam em reações osteoblásticas, em experimentos preliminares, amostras Lu-CaP 23.1 apresentavam um aumento significativo na quantidade vs tecido ósseo de volume(BV%/TV) em tumoral versus tíbias controle (254-503% de controle; ρ = 0,024). AU a LuCaP23.1 tumores em tíbias exibiu nova ósseas trabeculae, que não estiveram presentes nasamostras normais, e um elevado número de focos tumorais, que tinha substituído o normalmedula óssea. Em alguns espécimes o crescimento tumoral e osso fora prorrogado o origi-nal osso. Aumentou% BV/TV de LuCaP 23.1 amostras também foi observado após a castra-ção; o% BV/TV de tíbias o tumor foi 212-354% do que a de tíbias sem o tumor (p = 0,024).

Os resultados observados para o comércio intra-tíbia enxertos de LuCaP 23.1 indicam aexistência de nova formação óssea estimulada por células tumorais. Além disso, os tumoresapresentam muitas semelhanças com amostras humanas de metástases ósseas osteoblás-ticas, incluindo um grande número de focos tumorais e aumento da quantidade de osso mi-neralizado.

Para avaliar a eficácia do tratamento com o IMC-A12, enxertos de tumores LuCaP23.1 foram enxertados em camundongos SCID, e níveis séricos de PSA foram medidos bi-weekly para avaliar o crescimento tumoral.. Todos os animais foram castrados duas sema-nas antes da tíbia enxerto de células tumorais. Administração de EVIC-A12 para testar ca-mundongos foi iniciada quando níveis séricos de PSA atingiu 5-10 ng/mL (indicando tumoresestabelecidos). 40 mg/Kg IMC-A12 foi injetado ip três vezes por semana durante seis sema-nas.

A densidade mineral óssea (DMO) da tíbias com tumores e tíbias contralateraissem tumor foi medida por absorciometria dupla de raios-X (PIXImus Lunar densitometer)realizada em uma área de 2,5 mm χ 2,5 mm na célula tumoral injeção, ou o local correspon-dente de O contra-tíbia no momento do enxerto. A avaliação a cada duas semanas das le-sões foi feita pelas medições de soro PSA. Todos os animais foram sacrificados quando aslesões ósseas no grupo de controle tinha recorreram após castração baseada em níveisséricos de PSA (LuCaP 35 >60 ng/mL, ng/mL, LuCaP 23.1 >500 ng/mL), aparência radio-gráfica das lesões ósseas ou quando os animais se tornaram comprometidos. Uma horaantes de serem sacrificados, os animais foram injetados com BrdU para controlar a prolife-ração de células tumorais. As radiografias foram tomadas antes do sacrifício (FaxitronX rai-os-MX-20), e de ambas as tíbias DMO foram medidos no momento do sacrifício.

Tabela 5 - Densidade Mineral Óssea (DMO)

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Os níveis de PSA sérico foram significativamente mais baixos em camundongostratados com IMC-A12 (Fig. 7), e ao aumento da DMO associados com o crescimento detumores metastáticos osteoblásticas foi significativamente reduzida, bem (Tabela 5). As me-dições de DMO da pernas sem tumor indicou que tratamento com IMC-A12 não provocouuma perda de densidade óssea (osteoporose). Radiografias do IMC-A12-tratadas e não tra-tadas camundongos mostram que a progressão tumoral foi significativamente reduzida ouimpedida em camundongos tratados (Fig. 8).

Combinação de anticorpo anti-IGF-IRs e docetaxel para metástases ósseas, ca-mundongos SCID são castrados 2 semanas antes da tíbia tumoral injetáveis. Metástasesósseas são gerados por injeção direta de células de câncer de próstata LuCaP 23.1 na tíbiados camundongos, dando origem a lesões osteoblásticas. O enxertos expressam IGF-IR.Níveis séricos de PSA são medidos a cada duas semanas para avaliar o crescimento tumo-ral. Quando níveis séricos de PSA chegam a 5-10 ng/mL indicando estabelecido tumoral, osanimais são distribuídos aleatoriamente em quatro grupos.

Em dois grupos, 40 mg/kg de BVIC-A12 são injetados IP Três vezes por semanadurante seis semanas com um grupo recebendo IMC-A12 + Docetaxel 20 mg/Kg IP1 umavez por semana durante 6 semanas e um segundo grupo, o IMC-A12 + Docetaxel 10 mg deIP Três vezes por semana durante 6 semanas. Controle grupos receivelO ou 20 mg de do-cetaxel IP Sem IMC-A12.

Animais são monitorados semanalmente com medições de PSA. Após o fim do tra-tamento, os animais continuam a ser monitoridos semanalmente com medições de PSA atéque os tumores em grupos de apenas docetaxel mostrem ressurgimento tumoral. Comoaumento de valores de PSA de grupos de apenas docetaxel (embora a um ritmo mais lentoque em animais não tratados), níveis de PSA em camundongos tratados com IMC-A12 +docataxel se nivelam e, em alguns animais, começam a decrescer. As reduções nos níveisde PSA são observadas por continuar, mesmo após o encerramento do tratamento em seissemanas.

Como indicado acima, as medições de DMO são feitas no momento do enxerto eno sacrifício, e radiografias são tomadas apenas antes do sacrifício. Os grupos tratados comIMC-A12 + docataxel- mostram pouco ou nenhum aumento na DMO, e radiografias mostrampouco ou nenhum sinal de atividade osteoblástica.

Combinação de anticorpo anti-IGF-IRs e docetaxel para metástases ósseas

Pedaços de tumor de próstata LuCaP 23.1 humano (20 a 30 mm3) foram mecani-camente digeridos. 2-5 χ 105 de céulas viáveis LuCaP 23.1 foram injetadas nas tíbias decamundongos SCID com 6-8 semanas de idade. 21 camundongos distribuídos aleatoria-mente em três grupos foram usados para o estudo. Após a injeção tumoral, soro PSA foimonitorizada semanalmente. O tratamento começou quando nível sérico de PSA alcançado5-10 ng/mL, uma indicação de crescimento tumoral. Grupo 1 recebeu veículo de salina tam-pão controle. Grupo 2 recebeu 20 mg/Kg de docetaxel IP, uma vez por semana durante 4semanas. Grupo 3 recebeu 20mg/kg de docetaxel, uma vez por semana e 40mg/kg de A12IP Três vezes por semana durante 4 semanas. Para determinar se a resposta ao tratamentofoi osteoblástica ou osteolítica, DMO foi medido por Dexa-scan e raios X dos animais noponto final de todos os tratamentos.

Apenas docetaxel ou docetaxel combinado com A12 significativamente inibiu cres-cimento tumoral LuCaP 23.1 como refletido pela supressão dos níveis séricos de PSA (Fig.9), sem diferença significativa entre os dois tratamentos. No entanto, após a interrupção dotratamento, os níveis séricos de PSA começaram a aumentar nos animais que tinham sidotratados com docetaxel em monoterapía, indicando uma re -crescimento das tumoral; quecontinuou supressão dos níveis séricos de PSA foram observados nos animais que recebe-ram o tratamento combinado, o que indica um período prolongado De pós-tratamento tumo-ral quiescence. Níveis séricos de PSA foram mostrados para correlacionar com a densidadeóssea (DMO) e radiografados os tamanhos de ossos tumorais (Fig. 9b). Na semana cinco, amédia densidade óssea no controle, o docetaxel 20, e docetaxel 20 combinado com animaistratados A12 foi 0,112±0,01, 0,09±0,02, e 0,05±0,009 (média±SEM), respectivamente. Hou-ve uma aparente tendência para uma diminuição na densidade óssea com o tratamento.

Exemplo 2

Fosforilacão de Akt induzida por aspirado de medula óssea

Amostras de medula óssea de doadores normais masculinos (idades 18-45), foramfornecidas por Cambrex (Poietics ™ Donor Program). As amostras foram centrifugadas em1500 RPM, de modo a separar as fases solúveis e celulares. O sobrenadante foi filtrado uti-lizando 0,8 //m E 0,22 /vm filtros em sucessão. 50 /vg/ml_ de aspirado de medula óssea foiadministrado a células em 1 mL de meio (1: 20 diluição final).

Para experimentos realizados na presença de soro, as células foram cultivadas emDMEM suplementado com 10% FBS e 50 //g/mL de gentamicina durante 24 horas antes daexposição a medula óssea. Para experimentos na ausência de soro (starved células), ascélulas foram lavadas duas vezes com PBS, o crescimento médio foi substituído com soro-Iivre DMEM, e as células foram incubadas por 4 horas antes da exposição ao preparado demedula óssea. Quando utilizado, AG-1296, um inibidor específico da PDGF receptor (Rice etai, 1999, Amer. J. Path. 155, 213-21) foi adicionado ao culturas 30 minutos. Antes da expo-sição ao osso marrowaspirate. IMC-3G3 anticorpos foram administradas conforme descritono pré-tratamento vezes como indicado abaixo.

Ativação dw Akt por medula óssea foi detectada em células PC3-ML, que expres-sam PDGFRct , mas não em células DU-145, o que falta a receptor. Em um experimento,para minimizar o efeito de componentes de soro em ativação de Akt de células foram prein-cubadas durante 4 horas em meio livre de soro. A adição de extratos da medula óssea re-sultou em fosforilação robusta de Akt nas células PC3-ML, mas não células DU-145. (Fig.10A). Para avaliar o significado da resposta, um segundo experimento foi realizado com so-ro. Uma estimulação robusta da fosforilação de Akt no PC3-ML por células da aspirado demedula óssea também foi observado na presença de soro. (Fig. 10B). Apenas uma pequenaresposta foi suscitada em células DU-145..

Fosforilacão de Akt mediada por PDGFRq.

Imagina-se que osteoblastos e osteoclastos, que secretam tanto PDGF-AA ePDGF-BB, proporcionam o crescimento destes fatores solúveis no meio de medula óssea.Para determinar se a resposta do células PC3-ML de medula óssea extractos foi relacionadacom a tradução de sinal através PDGFRa, células PC3-ML foram expostas a aspirado demedula óssea a ausência ou presença de 20 //M AG-1296. Esta concentração de AG-1296inibe totalmente ativação de Akt. induzida por PDGF-BB (Fig. 1 IA) AG-1296 inibiu a ativa-ção de Akt induzida por aspirado de medula óssea por mais de 40%. (Fig. 1 IB e D). Istoindica que a sinalização de PDGFRct é responsável por uma proporção significativa da ati-vação de Akt induzida pela medula óssea.

A contribuição direta de PDGF-AA e BB-para PDGFRct sinalização em relação aoutros componentes da medula óssea aspirates também foi avaliada. Foi decidido que asconcentrações de PDGF-AA e BB-na medula óssea aspirates provenientes de três diferen-tes doadores variou de 400 pg/mL a 2 ng/mL. Dada a diluição de 20 vezes do aspirado demedula, células teste estavam realmente sendo expostas a PDGF-AA e BB em concentra-ções entre 20 e 100 pg/mL de. Assim sendo, células PC3-ML foram tratados com 100 pg/mLde cada uma das PDGF-AA e BB-. fosforilação de Akt foi inferior a 10% do que o obtido coma medula óssea aspirates. Fig. 3 C e D). Assim sendo, parece que a ativação da Akt atravésde sinalização de PDGFRa pode envolver Iigantes PDGFRcts com exceção de PDGF-AA eBB-e/ou outros mecanismos de ativação de PDGFRct por ligação direta de um ligante.

Inibicão da fosforilação de Akt por um anticorpo anti-PDGFRCT.

O anticorpo neutralizante IMC-3G3, que é específico para humanos PDGFRct tam-bém foi testado na sua capacidade de inibir a fosforilação da Akt no células PC3-ML. A pré-incubação tempo de 30 minutos e uma concentração de 20 yug/mL de simuladora neutraliza-dos os efeitos de 30 ng/mL de PDGF-BB. (Fig. 12A) O tratamento com o anticorpo tambémresultou em cerca de 40% de inibição da fosforilação de Akt induzida por medula óssea (Fig.12B e C). Também foi observado que o efeito inibitório do IMC-3G3 sobre fosforilação deAkt foi dependente da duração do preincubation, com 120 minutos de incubação tempo aser significativamente mais eficaz (Fig. 12D) do que os 30 minutos de incubação tempo (Fig.12 B, C). Uma explicação possível é que o IMC-3G3 induz a internalização dos PDGFRct, eque o seu efeito inibitório está relacionado não só com bloqueio de ligação ao ligante, mastambém para a remoção do receptor da membrana plasmática.

Exemplo 3

Isolamento de Antibodies Anti-PDGFRq Humanos

Anticorpos monoclonais anti-PDGFRq humanos foram gerados por uma tecnologiapadrão de hibridomas (Harlow & Lane, edição., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold S-pring Harbor, 211-213 (1998), que está incorporada neste documento por referência), utili-zando camundongos transgênicos (Medarex Inc., Sunnyvale, CA), que expressam humanosgama pesados e leves kapa imunoglobulina cadeias. Domínio extraçelular humano PDGFRa(ECD), foi adquirido de adquirido de R & D Systems (Minneapolis, MN). Camundongos KMforam imunizados por via subcutânea (sc), com 3 χ 107 células aórticas suínas endoteliaisexpressando estavelmente PDGFRa (PAE Ra). Após 4 semanas, os camundongos foraminjetados sc Com 50 pg de PDGFRct ECD em adjuvante completo de Freund mais 3 χ 10"7 decélulas PAE Ra determinado IP os camundongos foram injetados mais duas vezes, 3 sema-nas distante, com 25 ugramas PDGFRa ECD em adjuvante incompleto de Freund.

Esplenócitos de camundongos com elevados níveis séricos a ligação e bloqueandotiters foram isolados e fundidos com mieloma células. As culturas de hibridomas exibindobloqueio atividade foram subclonadas e anticorpos destes hibridomas foram purificados porcromatografia de proteína G.

IgGs foram avaliados para a ligação a PDGFRa em um ensaio de ligação direta.PDGFRa ECD em PBS foi imobilizado em uma placa de 96 poços (100 ng/poço). Placasforam então lavadas com PBST (PBS + 0,05% Tween 20) e bloqueadas com PBSM (3%leite em PBS, 200 uL/cavidade) por 2 horas a 25 °C. IgGs diluído em PBSM foram incuba-das com o PDGFRa ECD imobilizado de 1 h às 25 °C, e as placas foram lavadas comPBST. Um anticorpo secundário (conjugado de F(aB')2 IgG antihumana de cabra-peroxidasede rábano; BioSource International, Camarillo, CA) diluído 1:5000, em PBSM foi introduzidodurante 1 hora a 25°C. Após as placas foram lavadas com PBST, um substrato TMB peroxi-dase (KPL, Gaithersburg, MD) foi adicionado e a reação foi interrompida com 100 μL de 1mol/L H2S04. As placas foram lidas em A450 executado usando um leitor de microplacas(Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

O bloqueio de PDGF foi avaliada utilizando um ensaio de fase sólida de bloqueio dePDGF (ver Duan et al.-1991, J. Biol. Chem. 266:413-8, que será incorporada por referência).PDGFRa ECD foi diluída em PBS e revestidos, em 96 poços microtiter placas (Immulon 2HBde fundo plano 1x12 Removawell tiras de irradiados ligação às proteínas poliestireno; Dy-nex Technologies, Chantilly1 VA). Cada poço foi revestido com 60 ng PDGFRa durante 3horas a 25°C em um volume total de 100 μL. Placas foram então lavadas duas vezes e blo-queadas durante a noite a 4 0C com 25 mmol/L HEPES (pH 7.45), 0,5% gelatina, 100mmol/L NaCI, e 0,1% Tween 20. Placas foram então aquecido a 25°C durante 20 minutos edepois lavados com carácter a ligação tampão (25 mmol/L HEPES (pH 7.45), 0,3% gelatina,100 mmol/L NaCI, 0,01% Tween 20). Cinqüenta microlitros de IgGs foram adicionados acada poço e incubados a 25°C por 30 minutos. Iodinated PDGF foi diluído em tampão a Iiga-ção e acrescentou (50 //L de um 1 nmol/L solução), a cada poço. Placas foram incubadasdurante 2 horas a 25°C e em seguida lavadas cinco vezes com tampão a ligação. Cada po-ço foi contado em um contador gama. O ensaio de bloqueio baseado em célula foi feito con-forme descrito em Heldin et ai, 1988, EMBO J. 7, 1387-93.

A cinética de ligação a anticorpos para PDGFRa foi medido utilizando um BIAcore3000 instrumento (BlAcore, Inc., Piscataway, NJ). PDGFRaECD foi imobilizado em um chipsensor e o anticorpo foi injetado em diversas concentrações. Sensograms foram obtidos emcada concentração e avaliada usando o programa BIA Evaluation 2.0 para determinar asconstantes de taxa. A afinidade constante, Kd1 foi calculada a partir da razão das constantesde taxa KoffZKon.

A Fig. 13 mostra a ligação dose-dependente do anticorpo monoclonal humanoDVIC-3G3 para PDGFRa ECD imobilizadas em ELISA. A concentração de anticorpo exigidapara 50% no máximo de ligação para PDGFRa ECD foi 0,06 nmol/L (Tabela 6). O ED50 écoerente com a Kd para o anticorpo como determinado pela ressonância de superfície deplasmon em um instrumento BIAcore (Tabela 1). O anticorpo monoclonal também bloqueia[125I] PDGF-BB a ligação para receptor imobilizado, com um IC50 de 0,43 nmol/L. Os locaisde ligação para PDGF-PDGF-AA e BB em PDGFRa estruturalmente não são coincidentes.

Os dados sugerem que o epítopo para 3G3 sobrepõem espacialmente ambos os locais deligação a fator de crescimento.

Tabela 6 - características de ligação de anticorpo anti-PDGFRa

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Inibicão da ativação e fosforilacão do receptor de moléculas efetoras abaixo.

Os efeitos sobre a sinalização intracelular induzidas por PDGF pelo IMC-3G3 foramdeterminados utilizando células PAE Ra. As células foram semeadas em placas Falcon decultura de tecido de seis poços (250.000 células por poço), e deixadas a crescer durante anoite. Os poços foram lavados e, em seguida, incubados em meio livre de soro. Após umanoite de incubação para tornar as células quiescentes, as células foram tratadas com anti-corpos durante 30 minutos a 37°C seguido de adição de PDGF-AA ou PDGF-BB e incuba-ção, por um período adicional 10 minutos a 37°C. As células foram então separadas e Iysedem 200 μl Iise (50 mmol/L Tris-HCI (pH 8,0), Triton X-100 1%, NaCI 150 mmol/L, EDTA 1mmol/L, SDS 0,1%, 1 mmol/L de ortovanadato de sódio, e os inibidores de protease (Com-plete Mini, Roche, Mannheím, Alemanha)). Os Iisados celulares foram analisados por SDS-PAGE e Western blot usando reagentes de quimioluminescência reforçada e Hyperfilm (A-mersham Biosciences).

O anticorpo foi testado para a capacidade de inibir fosforilação de receptor de tiro-sina induzida por ligante. PDGF-AA e PDGF-BB aumentam fosforilação de tirosina PDGFRaem cerca de 5 vezes em concentrações de 1 e 3 nmol/L, respectivamente. Concentraçõesmais altas de ligante (10 nmol/L) resultou em menos fosforilado receptor possivelmente de-vido à degradação induzida por ligante. O anticorpo inibida PDGF-BB-induzida receptor paraníveis próximos de fundo (Fig. 14A, linha superior). Dados similares foram obtidos usandoPDGF-AA para induzir a fosforilação receptor.

PDGFs traduzem sinais mitogênicos e exercem efeitos antiapoptóticos sobre prote-ínas espressando receptor através de células efetoras abaixo. Consequentemente, o anti-corpo monoclonal foi testado na sua capacidade de inibir a ativação de MAPKs p44/p42 eAkt (envolvidos no crescimento das células e precursores antiapoptóticos, respectivamente).As anticorpos anti-PDGFRa inibida fosforilação de ambos MAPKs e Akt em resposta aPDGF-BB (Fig. 2A) e PDGF-AA (não mostrada). Inibição de fosforilação de PDGFRo foi de-pendente da dose, com 50% inibição obtida em 0,25 nmol/L (Fig. 14B).

Atividade antimitoqênica

O anticorpo monoclonal anti-PDGFRo foi testado pela sua capacidade de bloquermitogênese induzida por PDGFAA de células PAE Ra. As células foram semeadas em pla-cas de cultura de tecido de 96-poços (1 ? 104 células por poço) e crescidas rapidamente em100 µL de meio por bem. Os poços foram depois lavados com meio livre de soro e as célu-las foram mantidas sem soro durante a noite com 75 µL de meio livre de soro adicionados acada poço. IgG foi adicionada (25 µl/cavidade) e as placas foram incubadas durante 30minutos a 37°C. Em seguida foi adicionado PDGF-AA ou PDGF-BB (25 //L/cavidade), e asplacas foram incubadas durante 18 a 20 horas a 37°C. As placas foram incubadas por mais4 horas após cada poço ter recebido 0,25 //Ci [3H] timidina (25 /vL/poço). Anticorpo, PDGF, e[3H] timidina foram todos diluídos em meio livre de soro. As células foram então lavadas comPBS mais 1% albumina sérica bovina e separadas por tratamento com tripsina(100/xL/poço). As células foram recolhidas em um filtro e lavado thrice com dupla-água des-tilada usando uma célula harves MACH Ill (Tomtec, Inc., Hamden, CT). Após o processa-mento do filtro, a radioatividade do DNA incorporado foi determinada em um contador decintilação (Wallac Microbeta, modelo 1450).

Quando MC-3 G3 foi adicionado a células PAE Ra em abstinência de soro, incorpo-ração de timidina induzida por PDGF-AA foi especificamente inibida (Fig. 15), com umaEC50 de 8,3 nmol/L. O anticorpo também inibiu o 3 nmol/L PDGF-BB-induzida mitogenesisdo células PAE Ra com uma EC50 de 1,25 nmol/L (dados não apresentados).

Inibição do crescimento de linhagens de células tumorais humanas expressandoPDGFRg

Linhagens celulares tumorais humanas expressando PDGFRct foram testadas paradeterminar a influência dos anticorpo anti-PDGFRa humano sobre o crescimento em siste-mas malignos, in vitro e in vivo. Duas dessas linhagens de células tumorais que expressamPDGFRct, conforme determinado pelo fluxo de citometria são SKLMS-1 (Ieiomiosarcoma) eU118 (glioblastoma). Estas linhagens celulares também respondem a Iigantes em ensaiosmitogênicos e formam tumores em camundongos. SKLMS-1 tem o potencial não apenaspara estimulação parácrina mas também autócrina. SKLMS-1 foi mostrado por expressarproteína PDGF-AA, quando cultivada em cultura usando uma técnica de imunoensaio desanduíche de enzima quantitativa (R & D Systems).

Como se pode ver na figura. 16 A, IMC-3G3 inibiu a fosforilação de ambos Akt eMAPKs em resposta a PDGF-AA estimulação do SKLMS-1 células. A inibição da fosforila-ção de Akt foi 100% e a de MAPKs foi de cerca de 80%. O anticorpo é também um eficazinibidor de fosforilação em células U118 (Fig. 16B). Ligand-induzida mitogenesis de célulastumorais também foi bloqueado. Quando o anticorpo anti-PDGFRa foi adicionado a célulasU118 em abstinência de soro, a incorporação de timidina induzida por PDGF-AAfoi especi-ficamente inibida (Fig. 17A), com um EC50 de 3,4 nmol/L. O anticorpo também inibiu a res-posta mitogênica induzida por PDGF-AA de SKLMS-1 células com uma EC50 de 5 nmol/L(Fig. 17B), bem como a resposta mitogênica induzida por PDGF-BB (Fig. 17C). Apenas ainibição parcial (40% a 66 nmol/L; Fig. 17D) de resposta mitogênica induzida por PDGF-BBfoi observada para células U118. Isto é atribuído à expressão de ambos PDGFRct ePDGFR/? nessas células (dados não apresentados).

Inibição de crescimento de tumor enxertado

IMC-3G3 foi testada in vivo em glioblastoma (U118) e Ieiomiosarcoma (SKLMS-1)por via subcutânea (sc) modelos enxertados em camundongos atímicos sem pêlo. Enxertostumorais Sc foram estabelecidos através da injeção de 10 χ 106 SKLMS-1 ou células mistasU118 em Matrigel (Collaborative Research Biochemicals, Bedford, MA) em camundongosfêmea atímicos sem pêlo (Cri: NU/NU-nuBR, Charles River Laboratories, Wilmington, MA).Tumores foram deixados atingir uma volume tumoral médio (π/6 χ maior comprimento χ pro-fundidade perpendicular2), de aproximadamente 400 mm3. Os camundongos foram distribuí-dos aleatoriamente em cinco grupos (N = 12) e tratado por Injeção ip duas vezes por sema-na durante o período de estudo. Os camundongos do Grupo 1 foram tratados com o veículocontrole (0,9% NaCI, USP para Irrigação, B/Braun). Os camundongos dos Grupos 2 a 4 fo-ram tratados com 6, 20, e 60 mg/kg de instantâneas anticorpos anti-PDGFRa. Os camun-dongos do Grupo 5 foram tratados com 60 mg/Kg IgG humana (Sigma). Os grupos tratadoscom 6, 20, ou 60 mg/kg anticorpos anti-PDGFRa ou IgG humana foram dadas 21,4, 71,4, e214 mg/Kg de dose de carregamento, respectivamente. As doses de carregamento foramcalculadas para atingir um uma concentração plasmática em estado estacionário da primeiradose (meia-vida de eliminação, 7 dias), utilizando um esquema posológico de duas vezespor semana. Tumorais volumes foram avaliadas duas vezes por semana e crescimento tu-moral nos grupos de tratamento foi comparado com um ANOVA de medidas repetidas.

Conforme mostrado na figura. 18 A, IgG humana, não teve efeito sobre o cresci-mento de glioblastoma, em comparação com camundongos tratados com salina (P = 0,74),enquanto que o anticorpo anti-PDGFRa significativamente inibiu o crescimento tumoral em 6(Ρ = 0,06), 20 (Ρ = 0,03), e 60 (Ρ = 0,0004) mg/Kg dose. No estudo final de U118, os valores% T/C [(média tumoral volumes para o grupo tratado com 3G3 na conclusão do estu-do/volume tumoral médio no início do tratamento)/(tumoral volume médio de grupo tratadocom controle em conclusão de estudo/volume tumoral médio no início do tratamento) χ 100]foram 67%, 63%, e 35% para grupos tratados com 3G3 doses de 6, 20, e 60 mg/kg, respec-tivamente. Além disso, a regressão tumoral foi observada em 4 de 12, 5 dos 11, e 10 de 12animais no 6, 20, e 60 mg/kg grupos de tratamento. Não houve regressões em qualquergrupo controle.

A Fig. 18 B mostra que o crescimento de Ieiomiosarcoma também foi significativa-mente inibido pelo tratamento em 6 (P=0,02), 20 (P=0,003), e 60 (P<0,0001) mg/Kg. Os va-lores finais % de T/C foram 66%, 57%, e 31% para os grupos de tratamento 6, 20, e 60mg/kg, respectivamente, sem regressões tumorais.

O exame histológico de enxertos no final do tratamento mostrou diferenças marcan-tes em tumores de animais tratados, em comparação com tumores de animais que recebe-ram terapia controle. Os tumores resectados foram fixados em QDL fixador em 4 0C durante24 horas. Depois de incorporação em parafina e seção em 4 μιη, seções fixas com formalinaforam coradas com Mayer's H & E (Richard Allen, Kalamazoo, Ml).

No grupo U118 tratado com a dose mais alta (60 mg/Kg), menos células tumoraisviáveis foram encontradas e lá foram substancialmente mais regiões com células esparsas,em comparação com o grupo controle com soro (Fig. 18C). Enxertos SKLMS-1 tratadas nodia 25 também mostraram uma redução na quantidade de células tumorais viáveis e emba-lagem celulares, em comparação com o grupo controle com soro (Fig. 18D).

Inibicão in vitro de estimulacão mediada por PDGFRa de uma linhagem de qlioblastoma

O nível do receptor fosfotirosina em tumores U118 foi avaliadoso uma semana apóso tratamento com anticorpo anti-PDGFRa ou IgGt humana. Camundongos com U118 tumo-res establizados(500 mm3) foram tratados com uma dose de carga de 214 mg/Kg seguida72 horas mais tarde por uma dose de manutenção de 60 mg/Kg de anticorpos. Tumoresforam colhidos dos camundongos uma semana (168 horas) após a primeira injeção de anti-corpo (em um momento antes da regressão tumoral ser observada em média; ver Fig. 18A)e homogeneizadas em tampão de Iise de ensaio de fosforilação (ver acima). Os Iisados fo-ram centrifugados duas vezes em 14000 RPM e a concentração de proteínas para o sobre-nadante colhido foi determinada (ensaio de proteína Bio-Rad, Bio-Rad, Hercules, CA). Iisado(4 mg) de cada amostra foi imunoprecipitado utilizando anticorpos anti-PDGFRa. PDGFRahumanos imunoprecipitados foram então submetidos a imunoblot tanto com um anticorpoanti-PDGFR como anti-fosfotirosina. A Fig. 19 mostra que a administração de anticorpo anti-PDGFRa resültou na redução do nível de PDGFRa fosfotirosina relativa a um controle deIgG humana nestes tumores.

Engenharia de Linhagem Celular

Primeiro, os genes codificando os domínios variáveis de cadeia pesada e leve doanticorpo anti-PDGFRa humano foram clonados e sequenciados. Uma série de iniciadoresfoi obtida de MEDAREX que anneals as seqüências de flanco 5' e 3' das seqüências de re-gião variável de imunoglobulina humana em hibridomas derivados de MEDAREX. A regiãovariável de cadeia pesada amplificada com par de iniciadores AB88 (frente) e AB90 (rever-so) (Tabela 7). Os produtos de cadeia leve foram ampliados com pares de iniciadores con-tendo o iniciador de avanço AB 182 e o iniciador reverso AB 16 (Quadro 7). Os produtos de0,4kb destas reações foram clonados no vetor ZeroBIunt (Invitrogen) para produzir AB88-1(VH) e AB 182-3 (VK), e as inserções foram sequenciadas com T7 e M13R iniciadores uni-versais.

Tabela 7 - Iniciadores para hibridomas MEDAREX

<table>table see original document page 44</column></row><table>

A fim de gerar vetores plasmídeos para exprimir a anticorpos IgGI completos, as re-giões variáveis clonadas foram amplificadas com PCR e ligadas em duas etapas em genesde constante região contendo vetores de expressão. A amplificação com PCR primário decadeia pesada utilizou 25 ng de plasmídeos AB88-1 como modelo para iniciadores IPHF5(frente) e IPHR5 (verso). A amplificação com PCR secundário cadeia pesada utilizada 5 μ\de reação primária como modelo e os iniciadores OPSIF e IPHR5. A combinação dos doisem frente iniciadores adicionar um 57 básico par seqüência a extremidade 5' dos genes deimunoglobulina codificando uma seqüência sinal de gene de cadeia pesada de 19 aminoáci-dos de camundongo (MGWSCIILFLVATATGVHS; SEQ ID NO: 24) para o processamento esecreção eficiente de imunoglobulina. Além disso, o balanço primário OPSIF acrescentauma seqüência consensual "Kozak" (J Mol. Biol. 196:947) para eficiente início de traduçãodesses genes nas células de mamíferos e um local de restrição de endonuclease 5' Hindlllpara clonagem do produto amplificado no vetor de expressão adequado. O iniciador reversode cadeia pesada contém um local Nhel inframe para clonagem na região constante do ve-tor. PCR foi realizada em duas etapas utilizando o kit PCR Expand (Boehringer MannheimInc.), de acordo com especificações do fabricante utilizando sistema Expand Buffer # 3 em50 μl de reações com os seguintes condições de ciclo:

<table>table see original document page 44</column></row><table>5 ciclos 94°, 20 segundo

48°, 60 segundos

68°, 2 minutos

20 ciclos 94°, 20 segundo

65°, 60 segundos

68°, 2 minutos

1 ciclo 68°, 5 minutos

Após duas rodadas de PCR1 o produto foi purificado seguindo eletroforese em gelde agarose e clonado como um fragmento digerido Hindlll-Nhel em vetor pDFc (Fig. 8), quecontém a região constante humana gama 1.

A amplificação DE PCR primário de cadeia leve utilizou 25 ng de plasmídeopAB 182-3 como iniciador modelo IPLF4 (frente) e IPLR2 (verso). A amplificação DE PCRsecundário de cadeia leve utilizou 5 μ\ de reação primária como modelo e os iniciadoresOPSIF e IPLR2, Quanto à cadeia pesada, os dois iniciadores de avanço fornecem uma se-qüência de sinal de secreção. A cadeia leve reversa primária contém uma local BsiWI infra-me para a clonagem na vetor de região constante kapa pLck (Fig. 8). As reações de PCRforam realizadas como a cadeia pesada acima. Após duas rodadas de PCR1 o produto foipurificado seguindo eletroforese em gel de agarose e clonado em pLck, que contém a regiãode cadeia leve constante humana kapa.

Tabela 8 - Iniciadores para vetores de expressão de VH e VK

<table>table see original document page 45</column></row><table>

A fim de gerar um único vetor plasmídeo de estável transfecção, a fita de expressãode cadeia pesada, contendo o promotor CMV1 região de codificação de cadeia pesada, eelemento polyA foram clonados no vetor de cadeia leve como um fragmento Notl-Sall (Fig. 20).

Esta construção foi então utilizada para gerar uma linha de produção estável de Ii-nhagem de células de mieloma de células NSO. As células NSO foram transfectadas com aplasmídeo de expressão através eletroporação usando o BioRad Gene Pulser II. Antes datransfecção, o DNA do plasmídeo foi Iinearizado com Pvul1 precipitado com etanol, e res-suspenso em uma concentração de 0,4 mg/mL (40 μg em 100 μΙ dH20). as células forameletroporadas com a 40 /yg de DNA em um volume final de 800 μΐ por um único pulso de250 V, 400 /vFd. As células eletroporadas estavam dispersas em alíquotas de 50 μΐ emmeio DMEM (JRH Biosciences Inc.), contendo soro de bezerro a 10% dialisados fetais(dFCS) (Hyclone, Lote #: AHA7675) e 2mM glutamina (Invitrogen/Life Technologies) em po-ços de aproximadamente dezoito placas de 96 poços a uma densidade de 5000-10000 célu-las por bem. A seleção de transfectantes positivo de glutamina sintetase (GS) foi iniciada 24horas depois por meio da adição de DMEM livre de glutamina contendo dFCS 10% e com-plementadas com 1x GS suplemento (JRH Biosciences Inc.). As células foram cultivadas por2-4 semanas a 37 0C, C02 5% para permitir o crescimento e a expansão das colônias. Maisde 300 colônias foram selecionados através de um Fc anti-humana (gama) ELISA (deteçãode peroxidase de rábano picante em A450nm). Clones expressando anticorpos (58%) foramampliados e reanalisados para a produtividade durante 3-5 dias de cultivo. Para adaptarcélulas em meio livre de soro, positivo as linhagens celulares foram expandidas por meio daadição de um volume igual de soro livre GS-OS cultivo médio em cada passagem. Positivosfortes, produzindo 25 //g/mL ou mais em culturas de 24 poços sub-confluentes em 3 dias,foram expandidos para uma análise mais aprofundada para adaptação completa ao meiolivre de soro.

Entende-se e espera-se que as variações nos princípios da invenção aqui divulga-dos possam ser feitas por alguém versado na técnica e pretende-se que essas modificaçõesdevam ser incluídas no âmbito de aplicação da presente invenção.-

Lista de Seqüência

<110> ImCIone Systems Incorporated, et al.

<120> Antagonistas dos Receptores para o Tratamento do Câncer Metastático Ósseo

<130> 11245/54076

<140> A ser determinado

<141 >2006-06-19

<150> 601691,920

<151 >2005-06-17

<160> 63

<170> Versão de Patente 3.3

<210> 1

<211> 15

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(15)

<400> 1

agt agt agt tac tac 15

Ser Ser Ser Tyr Tyr1 5

<210> 2<211> 5<212> PRT<213> Homo sapiens<400>2

Ser Ser Ser Tyr Tyr

1 5

<210> 3

<211 >48

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221 > CDS

<222> (1 )..(48)

<400>3

agt ttc ttt tat act ggg age acc tac tac aac ccg tcc ctc agg agt 48Ser Phe Phe Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser

1 5 10 15

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400>4

Ser Phe Phe Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser15 10 15

<210> 5<211> 51<212> DNA<213> Homo sapiens<220><221 > CDS<222> (1)..(51)<400>5

cag tcc acg tat tac tat ggt tcg ggg aat tat tat ggc tgg ttc gac 48Gln Ser Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Asn Tyr Tyr Gly Trp Phe Asp15 10 15

cgc 51

Arg<210> 6<211> 17<212> PRT<213> Homo sapiens<400>6

Gln Ser Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Asn Tyr Tyr Gly Trp Phe Asp

1 5 10 15

Arg

<210> 7<211 >381<212> DNA<213> Homo sapiens<220><221 > CDS<222> (1)..(381)<400>7

cag ctg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag 48Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu1 5 10 15

acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt ggc tcc ate aac agt agt 96Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Ser Ser

20 25 30

agt tac tac tgg ggc tgg ctc cgc cag tcc cca ggg aag ggg ctg gag 144Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Leu Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

tgg att ggg agt ttc ttt tat act ggg age acc tac tac aac ccg tcc 192Trp Ile Gly Ser Phe Phe Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

ctc agg agt cga ctc acc ata tcc gta gac acg tcc aag aac cag ttc 240Leu Arg Ser Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe65 70 75 80

tcc ctg atg ctg agt tct gtg acc gcc gea gac acg get gta tat tac 288Ser Leu Met Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

tgt gcg aga cag tcc acg tat tac tat ggt tcg ggg aat tat tat ggc 336Cys Ala Arg Gln Ser Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Asn Tyr Tyr Gly

100 105 110

tgg ttc gac cgc tgg gac cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 381Trp Phe Asp Arg Trp Asp Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 8<211> 127<212> PRT<213> Homo sapiens<400>8

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Ser Ser

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Leu Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ser Phe Phe Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser50 55 60

Leu Arg Ser Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe65 70 75 80

Ser Leu Met Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gln Ser Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Asn Tyr Tyr Gly

100 105 110

Trp Phe Asp Arg Trp Asp Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 9<211 >33<212> DNA<213> Homo sapiens<220><221> CDS<222> (1)..(33)<400>9

agg gcc agt cag agt gtt age age tac tta gcc 33

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala1 5 10

<210> 10<211> 11<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 10

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala1 5 10

<210> 11<211> 21<212> DNA<213> Homo sapiens<220><221 > CDS<222> (1)..(21)<400> 11

gat gea tcc aac agg gcc act 21

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr1 5

<210> 12<211>7<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 12

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1 5

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(27)

<400> 13

cag cag cgt age aac tgg cct ccg gcg 27

Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Ala

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Ala1 5

<210> 15<211> 321<212> DNA<213> Homo sapiens<220><221 > CDS<222>(1)..(321)<400> 15

gaa att gtg ttg aca cag tet cca gcc acc ctg tet ttg tet cca ggg 48Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly15 10 15gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt age age tac 96Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag get ccc agg ctc ctc ate 144Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

tat gat gea tcc aac agg gcc act ggc ate cca gcc agg ttc agt ggc 192Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

agt ggg tet ggg aca gac ttc act ctc acc ate age age cta gag cct 240Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80

gaa gat ttt gea gtt tat tac tgt cag cag cgt age aac tgg cct ccg 288Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro

85 90 95

gcg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa ate aaa 321

Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 16<211> 107<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 16

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro

85 90 95

Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210> 17<211> 15<212> PRT

<213> não-identificado<400> 17

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 15

<210> 18<211> 5<212> PRT

<213> não-identificado<400> 18

Gly Gly Gly Gly Ser1 5

<210> 19<211> 10<212> PRT

<213> não-identificado<400> 19

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10

<210> 20<211> 21<212> DNA<213> artificial<220>

<223> Iniciador sintético<400> 20

atgaaacacc tgtggttctt c 21

<210>21

<211 >21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Iniciador sintético<400> 21

tgccaggggg aagacagatg g 21<210> 22<211> 24<212> DNA<213> artificial<220>

<223> Iniciador sintético<400> 22

atggaarccc cagcgcagct tctc 24

<210> 23<211> 20<212> DNA<213> artificial<220>

<223> Iniciador sintético<400> 23

cgggaagatg aagacagatg 20

<210> 24

<211> 19

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 24

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

15 10 15

Val His Ser

<210> 25

<211> 53

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Iniciador sintético<400> 25

gagaagcttg ccgccaccat gggatggtca tgtatcatcc tttttctagt age<210> 26<211> 58<212> DNA<213> artificial<220><223> Iniciador sintético<400> 26

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165 170 175

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

180 185 190

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

195 200 205

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

210 215 220

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro SerAsn225 230 235 240

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

245 250 255

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

260 265 270

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

275 280 285

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

290 295 300

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys305 310 315 320

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

325 330 335

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

340 345 350

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

355 360 365

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

370 375 380

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu385 390 395 400

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

405 410 415

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser420 425 430Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

435 440 445

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

450 455 460

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys465 470 475

<210> 44<211> 33<212> DNA<213> Homo sapiens<220><221 > CDS<222> (1)..(33)<400> 44

caa gga gac age ctc aga age tat tat gea acc 33

Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Thr

1 5 10

<210> 45

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 45

Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Thr1 5 10

<210> 46<211> 21<212> DNA<213> Homo sapiens<220><221 > CDS<222> (1)..(21)<400> 46

ggt gaa aat aag cgg ccc tca 21

Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser1 5

<210> 47<211> 7<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 47

Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser1 5

<210> 48<211 >33<212> DNA<213> Homo sapiens<220><221 > CDS<222>(1)..(33)<400> 48

aaa tct cgg gat ggc agt ggt caa cat ctg gtg 33

Lys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Gln His Leu Val

1 5 10

<210> 49

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 49

Lys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Gln His Leu Val

1 5 10

<210> 50

<211 >327

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221 > CDS

<222>(1)..(327)

<400> 50

tct tct gag ctg act cag gac cct get gtg tct gtg gcc ttg gga cag 48Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15

aca gtc agg ate aca tgc caa gga gac age ctc aga age tat tat gea 96Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30acc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct att ctt gtc ate tat 144Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Ile Tyr

35 40 45

ggt gaa aat aag cgg ccc tca ggg ate cca gac cga ttc tet ggc tcc 192Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

age tca gga aac aca get tcc ttg acc ate act ggg get cag gea gaa 240Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80

gat gag get gac tac tat tgt aaa tet cgg gat ggc agt ggt caa cat 288Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Gln His

85 90 95

ctg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggt 327

Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105

<210> 51<211>109<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 51

Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala

20 25 30

Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Gln His

85 90 95

Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105

<210> 52<211> 702<212> DNA<213> Homo sapiens<220><221>CDS<222> (1 )..(702)<400> 52

gta cat tca tet tet gag ctg act cag gac cct get gtg tet gtg gcc 96Val His Ser Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala

20 25 30

ttg gga cag aca gtc agg ate aca tgc caa gga gac age ctc aga age 144Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser

35 40 45

tat tat gea acc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct att ctt 192Tyr Tyr Ala Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu

50 55 60

gtc ate tat ggt gaa aat aag cgg ccc tca ggg ate cca gac cga ttc 240Val Ile Tyr Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe65 70 75 80

tet ggc tcc age tca gga aac aca get tcc ttg acc ate act ggg get 288Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala

85 90 95

cag gea gaa gat gag get gac tac tat tgt aaa tet cgg gat ggc agt 336Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Arg Asp Gly Ser

100 105 110

ggt caa cat ctg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggt 384Gly Gln His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

115 120 125

cag ccc aag get gcc ccc tcg gtc act ctg ttc ccg ccc tcc tet gag 432Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

130 135 140

gag ctt caa gcc aac aag gcc aca ctg gtg tgt ctc ata agt gac ttc 480Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe145 150 155 160

tac ccg gga gcc gtg aca gtg gcc tgg aag gea gat age age ccc gtc 528Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val165 170 175

aag gcg gga.gtg gag acc acc aca ccc tcc aaa caa age aac aac aag 576Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

180 185 190

tac gcg gcc age age tat ctg age ctg acg cct gag cag tgg aag tcc 624Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

195 200 205

cac aga age tac age tgc cag gtc acg cat gaa ggg age acc gtg gag 672His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

210 215 220

aag aca gtg gcc cct gea gaa tgc tet tga 702

Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser225 230

<210> 53<211 >233<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 53

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15

Val His Ser Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala

20 25 30

Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser

35 40 45

Tyr Tyr Ala Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu

50 55 60

Val Ile Tyr Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe65 70 75 80

Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala

85 90 95

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Arg Asp Gly Ser

100 105 110

Gly Gln His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

115 120 125

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

130 135 140

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe145 150 155 160

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

165 170 175

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

180 185 190

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

195 200 205

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

210 215 220

Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser225 230

<210> 54<211 >33<212> DNA<213> Homo sapiens<220><221> CDS<222>(1)..(33)<400> 54

caa gga gac age ctc aga age tat tat gea age 33

Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser1 5 10

<210> 55<211> 11<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 55

Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser1 5 10

<210> 56<211> 21<212> DNA<213> Homo sapiens<220><221 > CDS<222> (1)..(21)<400> 56ggt aaa aac aac cgg ccc tca 21

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser

1 5

<210> 57

<211>7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 57

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser

1 5

<210> 58

<211 >33

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221 > CDS

<222>(1)..(33)

<400> 58

aac tcc cgg gac aac agt gat aac cgt ctg ata 33

Asn Ser Arg Asp Asn Ser Asp Asn Arg Leu Ile1 5 10

<210> 59<211> 11<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 59

Asn Ser Arg Asp Asn Ser Asp Asn Arg Leu Ile1 5 10

<210> 60<211 >327<212> DNA<213> Homo sapiens<220><221 > CDS<222> (1 )..(327)<400> 60

tct tct gag ctg act cag gac cct get gtg tct gtg gcc ttg gga cagSer Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15

aca gtc agg ate aca tgc caa gga gac age ctc aga age tat tat gea 96Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala

20 25 30

age tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct gta ctt gtc ate tat 144Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

ggt aaa aac aac cgg ccc tca ggg ate cca gac cga ttc tet ggc tcc 192Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

age tca gga aac aca get tcc ttg acc ate act ggg get cag gcg gaa 240Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80

gat gag get gac tat tac tgt aac tcc cgg gac aac agt gat aac cgt 288Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Asn Ser Asp Asn Arg

85 90 95

ctg ata ttt ggc ggc ggg acc aag ctg acc gtc ctc agt 327

Leu Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser

100 105

<210> 61<211> 109<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 61

Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Asn Ser Asp Asn Arg85 90 95Leu Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser

100 105

<210> 62<211 >702<212> DNA<213> Homo sapiens<220><221 > CDS<222>(1)..(702)<400> 62

atg gga tgg tca tgt ate ate ctt ttt cta gta gea act gca.act gga 48Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15

gta cat tca tet tet gag ctg act cag gac cct get gtg tet gtg gcc 98Val His Ser Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala

20 25 30

ttg gga cag aca gtc agg ate aca tgc caa gga gac age etc aga age 144Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser

35 40 45

tat tat gea age tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct gta ctt 192Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu

50 55 60

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85 90 95

cag gcg gaa gat gag get gac tat tac tgt aac tcc cgg gac aac agt 336Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Asn Ser

100 105 110

gat aac cgt ctg ata ttt ggc ggc ggg acc aag ctg acc gtc ctc agt 384Asp Asn Arg Leu Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser

115 120 125

cag ccc aag get gcc ccc tcg gtc act ctg ttc ccg ccc tcc tet gag 432Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu130 135 140gag ctt caa gcc aac aag gcc aca ctg gtg tgt ctc ata agt gac ttc 480Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe145 150 155 160

tac ccg gga gcc gtg aca gtg gcc tgg aag gca gat age age ccc gtc 528Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

165 170 175

aag gcg gga gtg gag acc acc aca ccc tcc aaa caa age aac aac aag 576Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

180 185 190

195 200 205

210 215 220

aag aca gtg gcc cct gca gaa tgc tet tga 702

Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser225 230

<210> 63<211 >233<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 63

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala

20 25 30

Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu

50 55 60

Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe65 70 75 80

Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala

85 90 95

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Asn Ser100 105 110Asp Asn Arg Leu Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser

115 120 125

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

130 135 140

GIu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile SerAsp Phe145 150 155 160

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

165 170 175

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

180 185 190

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

195 200 205

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

210 215 220

Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser225 230

Claims

1. Anticorpo ou fragmento de anticorpo humano isolado específico para PDGFRff1CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma ou mais regiões de determinação decomplementaridade selecionada a partir do grupo consistindo em de SEQ ID n°:2 emCDRH1; SEQ ID n°:4 em CDRH2; SEQ ID n°:6 em CDRH3; SEQ ID n°:10 em CDRL1; SEQID n°:12 em CDRL2; e SEQ ID n°:14 em CDRL3.

2. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de compreender SEQ ID n°:2 em CDRH1; SEQ ID n°:4 emCDRH2; e SEQ ID n°:6 em CDRH3.

3. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de compreender SEQ ID n°: 8.

4. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de compreender SEQ ID n°: 10 em CDRL1; SEQ ID n°:12 emCDRL2; e SEQ ID n°:14 em CDRL3.

5. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de compreender SEQ ID n°: 16.

6. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de compreender SEQ ID n°:2 em CDRH1; SEQ ID n°:4 emCDRH2; SEQ ID n°:6 em CDRH3; SEQ ID n°:10 em CDRL1; SEQ ID n°:12 em CDRL2; eSEQ ID n°:14em CDRL3.

7. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de compreender SEQ ID n°:8 e SEQ ID n°: 16.

8. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que liga seletivamente um PDGFRa.

9. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que inibe a ligação de PDGFRff a um Iigantede PDGFRff.

10. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que neutraliza PDGFRff.

11. Fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7,CARACTERIZADO pelo fato de que é selecionado a partir do grupo consistindo em um an-ticorpo de cadeia única, Fab, Fv de cadeia única, um diacorpo, e um triacorpo.

12. Conjugado do anticorpo ou fragmento de anticorpo, CARACTERIZADO pelo fa-to de que está de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

13. Conjugado, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato decompreender um agente anti-neoplásico, uma fração alvo ou uma fração repórter.

14. Polinucleotídeo isolado, CARACTERIZADO pelo fato de codifica um anticorpoou fragmento de anticorpo e compreende uma ou mais seqüências de nucleotídeos selecio-nadas a partir do grupo consistindo em SEQ ID n°: 1 em CDRH1; SEQ ID n°:3 em CDRH2;SEQ ID n°:5 em CDRH3; SEQ ID n°:9 em CDRL1; SEQ ID n°:11 em CDRL2; e SEQ ID n°:13em CDRL3.

15. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADOpelo fato de compreender SEQ ID n°:7.

16. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADOpelo fato de compreender SEQ ID n°:15.

17. Vetor de expressão, CARACTERIZADO pelo fato de compreender o polinucleo-tídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 14 a 16.

18. Célula hospedeira recombinante, CARACTERIZADA pelo fato de compreendero vetor de expressão, conforme definido na reivindicação 17.

19. Célula hospedeira recombinante, de acordo com a reivindicação 18,CARACTERIZADA pelo fato de produzir um polipeptídeo compreendendo SEQ ID n°:8 e umpolipeptídeo compreendendo SEQ ID n°: 16.

20. Célula hospedeira recombinante, de acordo com a reivindicação 18,CARACTERIZADA pelo fato de produzir um polipeptídeo compreendendo SEQ ID n°:8 eSEQ IDn0: 16.

21. Uso do anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a-11, CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de um medicamento para neutralizara ativação de PDGFRa em um mamífero.

22. Uso do anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a-11, CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de um medicamento para inibir ocrescimento de um tumor em um mamífero.

23. Uso, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que otumor expressa PDGFRa.

24. Uso, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que otumor super-expressa PDGFRa.

25. Uso, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que otumor é um tumor primário.

26. Uso, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que otumor é um tumor metastático.

27. Uso, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que otumor é um tumor refratário.

28. Uso, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que otumor é um tumor vascularizado.

29. Uso, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que otumor é selecionado a partir do grupo consistindo em um tumor de ovário, um tumor de ma-ma, um tumor de pulmão, um tumor hepatocelular, um tumor estromal gastrointestinal, ummelanoma, um carcinoma celular renal, um tumor próstata, e um sarcoma de tecido macio.

30. Uso, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que oanticorpo ou fragmento de anticorpo é administrado em associação com um agente anti-neoplásico.

31. Uso, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que oagente neoplásico é um agente quimioterápico.

32. Uso, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que oagente neoplásico é doxorubicina.

33. Uso, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que oagente neoplásico é radiação.

34. Uso, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que oanticorpo ou fragmento de anticorpo é administrado com um secundo antagonista de PDG-FRa.

35. Uso, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que oantagonista de PDGFRct é um antagonista intracelular de PDGFRct.

36. Uso, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que a-inda compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anta-gonista de receptor do fator de crescimento epitelial (EGFR).

37. Uso, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que a-inda compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anta-gonista de receptor do fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-IR).