CN104761644A - 大肠杆菌表达的融合蛋白mbp-mart-1及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌表达的融合蛋白MBP-MART-1及其制备和应用，该蛋白是通过以下方法制备得到的：将人MART-1基因的扩增产物连接到pMAL-p5x载体中，得重组载体，将重组载体转化入大肠杆菌中，培养，鉴定，得到含重组载体的阳性大肠杆菌；将该阳性大肠杆菌落接种于培养基中，培养，用IPTG诱导表达后，将菌液离心弃上清，将菌体裂解后，离心取上清，对上清进行纯化，检测，得到该蛋白。该蛋白可用于制备MART-1抗体中。本发明可快速简便地获得大量大肠杆菌表的MART-1可溶性蛋白，解决了其它方法获得大肠杆菌表达的MART-1可溶性蛋白需要大量诱导并要透析的复杂过程。

Description

大肠杆菌表达的融合蛋白MBP-MART-1及其制备和应用

技术领域

本发明涉及一种大肠杆菌表达的重组蛋白及其制备和应用，特别是涉及一种大肠杆菌表达的融合蛋白MBP-MART-1及其制备和应用。

背景技术

MART-1（melanoma antigen recognized by T-cells1，又名Melan-A）是人类黑色素细胞分化抗原，在正常黑色素细胞和几乎所有黑色素瘤肿瘤细胞中表达，在其他组织或细胞中不表达。MART-1上有多个免疫优势表位，它们在体内外被诱导产生特异性T细胞免疫应答，在黑色素瘤特异性免疫治疗中拥有良好的应用前景。

重组MART-1蛋白的表达、纯化在表位肽的发现及鉴定等发面发挥着重要作用。一方面,重组MART-1蛋白可直接由树突状细胞摄取、加工后,提呈天然表位,刺激T细胞。获得的特异性T细胞在HLA分型相符的前提下可直接用于免疫治疗,进一步研究可鉴定得到其所识别的表位肽序列。另一方面,重组MART-1蛋白可用于对人工合成MART-1表位肽的鉴定。同时，利用重组蛋白免疫后得到的抗体在黑色素肿瘤研究中将起到重要作用。

然而，目前对于利用大肠杆菌表达MART-1可溶性蛋白的制备方法还有待提高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种大肠杆菌表达的融合蛋白MBP（Maltose-bindingprotein）-MART-1及其制备和应用。本发明解决了很难快速简便获得大量大肠杆菌表达的MART-1可溶性蛋白的难题。

为解决上述技术问题，本发明的大肠杆菌表达的融合蛋白MBP-MART-1（即重组蛋白MBP-MART-1），是通过以下方法制备得到的：

通过PCR方法得到人MART-1基因的扩增产物，将其连接到pMAL-p5x载体（质粒）中，得到MART-1-pMAL-p5x重组载体，并将MART-1-pMAL-p5x重组载体转化入大肠杆菌中，经25～37℃培养16～20小时后，经PCR鉴定，得到含MART-1-pMAL-p5x重组载体的阳性大肠杆菌；

将该阳性大肠杆菌落接种于LB培养基中，25～37℃培养至OD₆₀₀=0.6～0.8，用IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）诱导表达3～4h后，将菌液离心弃上清，将菌体用细菌裂解液裂解后，离心取上清，并对上清进行直链淀粉树脂纯化，经SDS-PAGE电泳检测，得到融合蛋白MBP-MART-1。

上述大肠杆菌表达的融合蛋白MBP-MART-1的制备方法，包括步骤：

1）通过PCR方法得到人MART-1基因的扩增产物，将其连接到pMAL-p5x载体中，得到MART-1-pMAL-p5x重组载体（即含MART-1基因的pMAL-p5x载体）；

2）将MART-1-pMAL-p5x重组载体转化入大肠杆菌中，在25～37℃培养16～20小时后，经PCR鉴定，得到含MART-1-pMAL-p5x重组载体的阳性大肠杆菌（即转化子）；

3）将含MART-1-pMAL-p5x重组载体的阳性大肠杆菌的单菌落接种于LB培养基中，25～37℃培养至OD₆₀₀=0.6～0.8，用IPTG诱导表达3～4h后，将菌液离心弃上清，将菌体用细菌裂解液裂解后，离心取上清，并对上清进行直链淀粉树脂纯化，经SDS-PAGE电泳检测，得到融合蛋白MBP-MART-1。

所述步骤1）中，PCR方法中的上下游引物分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

所述步骤2）中，大肠杆菌包括：大肠杆菌BL21（DE3）；IPTG的用量为0.1～0.5mM；细菌裂解液的配方为：每1000mL溶液中含有5～10mM咪唑、500～700mM氯化钠、20～30mMTris和曲拉通X-100 10mL。

所述步骤3）中，进行直链淀粉树脂纯化的操作包括：用柱缓冲液（Column Buffer）洗直链淀粉树脂柱，用含10～30mM麦芽糖的柱缓冲液洗脱蛋白，经SDS-PAGE电泳检测，得到融合蛋白MBP-MART-1；其中，柱缓冲液配方为：20～30ml 1.0-1.5M Tris-HCl、11.7g氯化钠和2.0ml0.5M EDTA的混合物；融合蛋白MBP-MART-1的纯度为95%以上。

本发明还公开了大肠杆菌表达的融合蛋白MBP-MART-1的应用，其中，所述融合蛋白MBP-MART-1在制备MART-1抗体中的应用。

另外，本发明还提供一种表达融合蛋白MBP-MART-1的大肠杆菌，其中，所述大肠杆菌含MART-1-pMAL-p5x重组载体。

优选地，所述大肠杆菌是含MART-1-pMAL-p5x重组载体的大肠杆菌BL21（DE3）。

本发明中，MBP是Maltose-binding protein的缩写，可译为麦芽糖结合蛋白，它是本发明中所用到的载体pMAL-p5x上带有的蛋白标签，以便于纯化。

本发明可以快速简便的获得大量大肠杆菌表的MART-1可溶性蛋白，解决了其它方法获得大肠杆菌表达的MART-1可溶性蛋白需要大量诱导并要透析的复杂过程。

附图说明

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1是MART-1基因的PCR结果图，其中，1为标记（Marker），2、3为MART-1基因；

图2是含重组载体的菌落鉴定PCR结果，其中，1、2为含重组载体的菌落，3为标记（Marker）；

图3是质粒鉴定PCR结果，其中，1为标记（Marker），2为MART-1基因；

图4是表达和纯化MART-1的电泳图，其中，M为标记（Marker），BI为表达菌诱导前蛋白条带（即诱导前），AI为表达菌诱导后蛋白条带（即诱导后），S为上清，FT为上清上样的流穿（即穿透Ni柱的蛋白），E1为用Column Buffer洗脱的第一管洗脱液的蛋白条带【即0.18g/ml(3ml）洗脱液】，E2为用Column Buffer洗脱的第二管洗脱液的蛋白条带【即1.25mg/ml(5ml）洗脱液】，E3为用Column Buffer洗脱的第三管洗脱液的蛋白条带【即4.79mg/ml(4ml）洗脱液】，E4为用Column Buffer洗脱的第四管洗脱液的蛋白条带【即8.09mg/ml(3ml）洗脱液】；

图5是MBP-MART-1重组蛋白酶切结果，M为Mark；1为Factor Xa：重组蛋白=2:100；2为Factor Xa：重组蛋白=4:100；3为Factor Xa：重组蛋白=6:100；4为Factor Xa：重组蛋白=8:100。

具体实施方式

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

另外，实验中涉及的试剂如未特别说明，则是商业化产品。

实施例1

1.重组载体MART-1-pMAL-p5x的构建

1.1按下列体系配制反应混合液：

模板DNA（Template DNA，购自Template DNA open biosystem公司）0.5-0.8μg，10×PCRbuffer5.0μl，上下游引物各2.0μl，dNTPs（2.5mM）4.0μl，pfu聚合酶（5U/μl）0.5μl，增加ddH₂O至50.0μl，9000rpm离心5秒。

其中，dNTPs、pfu聚合酶、10×PCR buffer均购买于北京博海众诚生物科技有限公司；

上游引物序列为：CCGGAAGGATTTCAATGCCAAGAGAAGATG（SEQ ID NO.1）；下游引物序列为：CCCAAGCTTTTAAGGTGAATAAGGTG（SEQ ID NO.2）。

1.2PCR反应循环条件：

94℃3分钟1个循环

72℃10分钟1个循环。

1.3加6μl 10×Loading buffer（购于美国THERMO公司），混匀，全部PCR产物电泳。

1.4将10μl UltraPower（购于北京百泰克生物技术有限公司）加入50ml 0.8%的琼脂糖凝胶中。点样电泳25min左右，紫外观察，结果如图1所示。由该图可见，得到了350bp大小的条带，说明已成功获得了MART-1基因，该基因的序列为ATGCCAAGAGAAGATGCTCACTTCATCTATGGTTACCCCAAGAAGGGGCACGGCCACTCTTACACCACGGCTGAAGAGGCCGCTGGGATCGGCATCCTGACAGTGATCCTGGGAGTCTTACTGCTCATCGGCTGTTGGTATTGTAGAAGACGAAATGGATACAGAGCCTTGATGGATAAAAGTCTTCATGTTGGCACTCAATGTGCCTTAACAAGAAGATGCCCACAAGAAGGGTTTGATCATCGGGACAGCAAAGTGTCTCTTCAAGAGAAAAACTGTGAACCTGTGGTTCCCAATGCTCCACCTGCTTATGAGAAACTCTCTGCAGAACAGTCACCACCACCTTATTCACCTTAA（SEQ ID NO.3）。

1.5使用胶回收试剂盒（购于上海捷锐生物工程有限公司）回收PCR产物50μl。

1.6PCR产物双酶切：PCR产物（DNA）0.5μg，HindIII0.5μl，XmnI0.5μl，10×fastDigestbuffer 2μl，增加ddH₂O至20.0μl，混匀，9000rpm离心5秒，37℃酶切30min。其中，HindIII、XmnI、10×fastDigest buffer均购于美国THERMO公司。

1.7载体双酶切：pMAL-p5x载体（购自NEB公司，catalog#800）≤2μg，HindIII1μl，XmnI1μl，10×fastDigest buffer5μl，增加ddH₂O至50.0μl，混匀，9000rpm离心5秒，37℃酶切1h。

1.850μl载体（质粒）双酶切产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳25min左右。20μl PCR双酶切产物于80℃灭活5分钟，得MART-1-DNA片段。

1.9使用试剂盒回收载体双酶切产物。取5μl酶切产物加2μl10×Loading buffer，1.0%琼脂糖凝胶（含EB）电泳30min，经回收，得到pMAL-p5x载体的酶切产物。

1.10连接反应（10μl体系）：MART-1-DNA片段7.5μl，pMAL-p5x载体的酶切产物1μl，10×T4连接酶buffer1μl，T4连接酶(3U/μl)0.5μl，混匀，9000rpm离心5秒，16℃连接5小时，得到连接产物，即重组载体MART-1-pMAL-p5x。

其中，10×T4连接酶buffer、T4连接酶购于美国THERMO公司。

2.转化大肠杆菌感受态细胞

2.1取出制备好的大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞（购自invitrogen公司），放在冰水上融化。

2.2每100μl感受态细胞加上述连接产物（重组载体MART-1-pMAL-p5x）10μL、ddH2O1μL（阴性对照），用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30min。

2.3将离心管放置42℃水浴，热激90s。

2.4快速将离心管转移至冰浴，放置2min。

2.5每管加500μL LB培养基，在37℃摇床温和摇动（150rpm）温育1h，使细菌复苏。4000rpm离心2min，弃去约500μL上清，细胞重悬。

2.6将连接后转化产物100μL，阴性对照100μL，均匀涂布于含有50μg/mL氨苄青霉素的平板上。

2.7倒置培养皿，于37℃培养过夜，得到转化子。

3.转化子的鉴定

3.1挑取2-3个克隆，转移至新的LB平板，并做菌落PCR鉴定。

菌落PCR体系及条件（20μl体系，温度和时间根据片段大小适当调整）：

混匀，9000rpm离心5秒。

PCR反应条件：

95℃ 3-5′                           1循环

95℃ 30″  55-60℃  30″  72℃ 30′  30循环

72℃ 10′                            1循环

3.2取10μl菌落PCR产物，0.8%琼脂糖凝胶电泳30min，紫外观察，结果如图2。由该图可见，得到了350bp大小的条带，说明MART-1已成功克隆入载体中。

3.3挑取鉴定为阳性菌落，接种于25ml LB（含50μg/mL氨苄青霉素）液体培养基中，37℃ 250rpm培养过夜。

3.4取4ml菌液，使用质粒抽提试剂盒（购于美国Biomiga公司）抽提质粒，即获得了重组载体的质粒，并保留菌种。

对所提质粒进行PCR鉴定：

混匀，9000rpm离心5秒。

PCR反应条件：

94℃ 3′                            1循环

94℃ 30″  55℃  30″  72℃ 1′     30循环

72℃ 5′                            1循环

3.5电泳检测：取10μl质粒PCR鉴定产物，点样于0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外观察，拍下电泳结果。如图3。由图可见，得到了350bp大小的片段，证明MART-1基因已成功插入载体中。

4.MBP-MART-1重组蛋白表达与纯化

4.1转化表达菌感受态细胞

4.1.1制备选择性培养基平板。

4.1.2取出1管制备好的大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，置于冰水上融化。

4.1.3取1.5ml的离心管分别编号，取100μl感受态细胞加入1μl重组载体

MART-1-pMAL-p5x。另取100μl感受态细胞加入1μl ddH₂O为阴性对照，分别用移液器轻轻吸收打匀，在冰上放置30min。同时将LB选择性平板放入37℃培养箱预热。

4.1.4将离心管放置42℃，热激90s。注意：勿摇动离心管。

4.1.5快速将离心管转移至冰浴，放置2min。

4.1.6每管加500μl LB（细菌培养液）培养基，在37℃摇床温和摇动（150rpm）温育1h，使细菌复苏。4000rpm离心2分钟，弃去700μl上清，细胞重悬。

4.1.7将转化产物100μl均匀涂布于含50μg/mL氨苄青霉素的平板上。

4.1.8倒置培养皿，于37℃培养12-18h。

4.2IPTG诱导蛋白表达

4.2.1取单菌落接种至25mlLB培养基中(含AMP)，于37℃，200～250rpm培养过夜。

4.2.2将培养菌液按1：1000转接至500mlLB培养基中(含50μg/mL氨苄青霉素)中，37℃、200～250rpm。

培至OD达到0.6，取400μL菌液作BI即细菌诱导前样品。

4.2.3每瓶加250μL 1M IPTG至终浓度为0.1-0.5mM。37℃ 240rmp诱导表达3h。取400μL菌液作AI即细菌诱导后样品。

4.2.4菌液6000rpm 5min离心，弃上清，向收集到的菌体中加入25mL细菌裂解液（取咪唑0.34g、氯化钠29.22g、Tris2.42g和曲拉通X-10010mL，加水至1000mL），重悬菌体。

4.2.4工作5s、间歇10s、600W超声25次后，13000rpm离心15min。取上清进行纯化，上清即为S。

4.3蛋白纯化

4.3.1将直链淀粉树脂加到柱子里，用8倍柱体积的柱缓冲液（Column Buffer，其配方为：20ml 1.0MTris-HCl、11.7g氯化钠和2.0ml 0.5M EDTA的混合物）洗柱子。

4.3.2将上清上样，流速为1mL/min。收集流穿即为FT。

4.3.3用12倍柱体积的Column Buffer洗柱子，洗至核酸蛋白检测仪显示蛋白峰降至水平。

4.3.4用含10mM麦芽糖的Column Buffer洗脱蛋白即为E；核酸蛋白检测仪出现洗脱峰后开始收集，待峰趋平缓后停止收集，得到含融合蛋白MBP-MART-1的洗脱液，并进行后述的SDS-PAGE电泳检测。

4.3.5依次用5倍柱体积的含10mM麦芽糖的Column Buffer、3倍柱体积的水、3倍柱体积的0.1%SDS溶液（0.1g十二烷基磺酸钠/100ml水）、1倍柱体积的水、3倍柱体积ColumnBuffer清洗柱子后，保存到体积浓度为20%的乙醇溶液中。

5.MBP标签的切除

5.1酶切40μL体系

融合蛋白MBP-MART-1（即重组蛋白MBP-MART-1）40μg，Facator Xa母液浓度1mg/ml（购于美国NEB公司）。

Factor Xa：融合蛋白MBP-MART-1（质量比）=2:100或4:100或6:100或8:100；

酶切缓冲液的配方为：20Mm Tris-HCl+100mM NaCl+2Mm CaCl₂+0.05%SDS；

取5个离心管，每管中加入重组蛋白40μg，Factor Xa分别加0.8μL、1.6μL、2.4μL、3.2μL加酶切缓冲液至40μL，25℃酶切4小时。5管分别取样进行下述的SDS-PAGE检测。

6.检测：SDS-PAGE

6.1胶板准备

浓缩胶：4%凝胶

分离胶：12%凝胶

6.2步骤：

样品处理：将待测样品中加入5×上样缓冲液【配方为：取1MTris-HCl（pH6.8）1.25ml、甘油2.5ml、SDS固体粉末0.5g、溴酚兰25mg，加入去离子水溶解后，定容至5ml】后，煮沸5min，然后，12000rpm离心5min；加电泳缓冲液（称取Tris粉末15.1g、甘氨酸94g、SDS5.0g加水至1000ml）：将胶板上的电工胶带撕去，小心拔去梳子，用自来水冲洗后置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，加满内槽，外槽没过长形条孔；

上样：根据需要点入蛋白Marker和相应的样品；

电泳：设定条件80v，待样品进入分离胶之后转换电压至120v，在整个电泳过程中，应间断观察样品的泳动情况和电泳缓冲液有无渗漏。电泳的时间应根据不同的目标分子量大小作相应调整。可根据预染Marker和溴酚蓝的泳动情况来选择何时终止电泳；实验完毕，关闭电源。结果如图4。

如图4可见，在E1、E2、E3、E4中均有单一的大小为45KD左右的蛋白条带。蛋白的纯度达到95%以上，浓度分别为0.18g/ml、1.25mg/ml、4.79mg/ml、8.09mg/ml，体积分别为3ml、5ml、4ml、3ml，共获得融合蛋白MBP-MART-1 50.22mg。

6.3按上述同样步骤将MBP酶切样品进行电泳，结果如图5。图5中，Factor Xa分解为2条链即Factor Xa I、Factor Xa II，分别为15KD和27KD，而MBP-MART-1蛋白被酶切为MART-1和MBP蛋白，分别为10.15KD和35KD（理论上的大小为40KD）。证明成功得到了MBP-MART-1蛋白。

按照上述实验操作，能大量获得大肠杆菌表达的MBP-MART-1蛋白，而且能纯度达到95%以上，解决了其它方法获得大肠杆菌表达的MART-1可溶性蛋白需要大量诱导并要透析的复杂过程，而且通过本发明的MBP-MART-1蛋白免疫小鼠或兔子，能制备MART-1抗体，用于检测疾病或用于科学研究。

Claims (9)

1.一种大肠杆菌表达的融合蛋白MBP-MART-1，其特征在于，所述融合蛋白MBP-MART-1是通过以下方法制备得到的：

通过PCR方法得到人MART-1基因的扩增产物，将其连接到pMAL-p5x载体中，得到MART-1-pMAL-p5x重组载体，并将MART-1-pMAL-p5x重组载体转化入大肠杆菌中，经25～37℃培养16～20小时后，经PCR鉴定，得到含MART-1-pMAL-p5x重组载体的阳性大肠杆菌；

将该阳性大肠杆菌落接种于LB培养基中，25～37℃培养至OD₆₀₀=0.6～0.8，用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达3～4h后，将菌液离心弃上清，将菌体用细菌裂解液裂解后，离心取上清，并对上清进行直链淀粉树脂纯化，经SDS-PAGE电泳检测，得到融合蛋白MBP-MART-1。

2.一种如权利要求1所述的大肠杆菌表达的融合蛋白MBP-MART-1的制备方法，其特征在于，包括步骤：

1）通过PCR方法得到人MART-1基因的扩增产物，将其连接到pMAL-p5x载体中，得到MART-1-pMAL-p5x重组载体；

2）将MART-1-pMAL-p5x重组载体转化入大肠杆菌中，在25～37℃培养16～20小时后，经PCR鉴定，得到含MART-1-pMAL-p5x重组载体的阳性大肠杆菌；

3）将含MART-1-pMAL-p5x重组载体的阳性大肠杆菌的单菌落接种于LB培养基中，25～37℃培养至OD₆₀₀=0.6～0.8，用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达3～4h后，将菌液离心弃上清，将菌体用细菌裂解液裂解后，离心取上清，并对上清进行直链淀粉树脂纯化，经SDS-PAGE电泳检测，得到融合蛋白MBP-MART-1。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，PCR方法中的上下游引物分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤2）中，大肠杆菌包括：大肠杆菌BL21（DE3）；

异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的用量为0.1～0.5mM；

细菌裂解液的配方为：每1000mL溶液中含有5～10mM咪唑、500～700mM氯化钠、20～30mM Tris和曲拉通X-10010mL。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤3）中，进行直链淀粉树脂纯化的操作包括：用柱缓冲液洗直链淀粉树脂柱，用含10～30mM麦芽糖的柱缓冲液洗脱蛋白，经SDS-PAGE电泳检测，得到融合蛋白MBP-MART-1；

其中，柱缓冲液配方为：20～30ml 1.0-1.5M Tris-HCl、11.7g氯化钠和2.0ml0.5M EDTA的混合物。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤3）中，融合蛋白MBP-MART-1的纯度为95%以上。

7.一种如权利要求1所述的大肠杆菌表达的融合蛋白MBP-MART-1的应用，其特征在于：所述融合蛋白MBP-MART-1在制备MART-1抗体中的应用。

8.一种表达融合蛋白MBP-MART-1的大肠杆菌，其特征在于：所述大肠杆菌含权利要求2所述的MART-1-pMAL-p5x重组载体。

9.如权利要求8所述的大肠杆菌，其特征在于：所述大肠杆菌是含MART-1-pMAL-p5x重组载体的大肠杆菌BL21（DE3）。