CN102229941B - 一种肝细胞癌相关蛋白hsp70的表达纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种肝细胞癌相关蛋白HSP70的表达纯化方法。该方法包括以下步骤：合成目的基因HSP70；将基因与质粒载体分别用EcoRI与XhoI进行双酶切后连接转化感受态细胞DH5α，提取重组质粒后转化感受态细胞BL21，诱导表达目的蛋白，然后纯化。该纯化后的蛋白可以用来免疫小鼠以制备相应的单克隆抗体。

Description

一种肝细胞癌相关蛋白HSP70的表达纯化方法

技术领域

本发明属于基因重组技术领域，具体涉及一种肝细胞癌相关蛋白HSP70的表达纯化方法。 

背景技术

肝细胞癌是世界范围内常见的恶性肿瘤，由于早期肝细胞癌不易发现，一旦出现症状，多已到达晚期。因此发现肝细胞癌早期诊断的肿瘤标志物至关重要。有研究报道HSP70基因在早期肝细胞癌中表达阳性率明显高于癌旁组织，并且细胞内HSP70表达增加与肝细胞癌发生、发展有关，且可能是肝细胞癌发展恶化的重要标志(引自1、Wang SM，Ooi LL，Hui KM，et al.Identification and validation of a novel gene signature associated with the recurrence of human hepatocellular carcinoma[J].Clin Cancer Res，2007，13(21)：6275-6283.；2、Looi KS，Nakayasu ES，Diaz RA，et al.Using proteomic approach to identify tumor-associated antigens as markers in hepatocellular carcinoma[J].J proteome Res，2008，7(9)：4004-4012.)其中HSP70为热休克蛋白的一种，热休克蛋白是一类在生物进化中高度保守，广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质，是生物细胞应激反应的诱导产物。HSP70家族在进化上高度保守，种属间同源性高(引自蒋业贵，王宇明，李奇切.热休克蛋白70在肝细胞癌中的表达及其意义.免疫学杂志，2002；18(1)：64-66)。通过制备肝细胞癌相关蛋白HSP70，可作为抗原免疫小鼠制备相应的单克隆抗 体，最终应用于临床作为早期肝细胞癌诊断的生物标志物之一。在实践上拥有巨大的应用潜力，是当前生物医药研究的热点之一。 

本发明需要解决的技术问题是通过生物学软件进行分析成功选取HPS70抗原性强的部分设计引物后合成此目的片段后构建重组质粒以及重组蛋白的表达以及纯化方法。 

发明内容

本发明的目的在于制备肝细胞癌相关蛋白HSP70作为抗原制备相应的抗体，最终作为早期肝细胞癌诊断的指标，以克服现有技术的不足。 

本发明提供了一种肝细胞癌相关蛋白HSP70的表达纯化方法，包括以下步骤： 

(1)目的基因HSP70的合成； 

(2)分别双酶切HSP70基因与载体，连接构建重组质粒，转化宿主菌，构建HSP70基因工程菌； 

(3)培养HSP70基因工程菌，诱导表达目的蛋白； 

(4)纯化所得融合蛋白；其中， 

上述步骤(1)所述的目的基因的合成为： 

设计上游引物CGGAATTCCACGGCAAGGTGGAGA 

下游引物为CCCTCGAGTTACTGCGAGTCGTTGAAGTA。 

从Hela细胞系中提取总RNA进行逆转录后所得cDNA为模板进行PCR反应，PCR扩增条件为：94℃预变性8min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，最后72℃后延伸8min。 

上述步骤(2)所述载体为pET32a及pGEX-4T-1，所用的限制性内切酶为EcoRI和XhoI，所用宿主菌为大肠杆菌。 

上述步骤(3)所述的培养工程菌的培养基为LB液体培养基，诱导温度为30℃，诱导时间为4h。 

上述步骤(4)所述的纯化方法为将诱导后的菌液分装在离心管中4℃离心，2164g，10min。用PBS缓冲液重悬加入蛋白酶抑制剂(PMSF)后反复冻融8次，进行超声处理至SDS-PAGE显示沉淀中蛋白纯度＞80％。将沉淀最后用6M尿素溶解。 

另一方面，本发明还提供了上述表达纯化方法制得的肝细胞癌相关蛋白HSP70的单克隆抗体用作肝细胞癌早期诊断的生物标志物的用途。 

本发明的优点为所选取的序列为HSP70的人源序列且通过生物学软件分析后使用的是与小鼠同源性低，免疫原性好的区域，这样最后表达出的HSP70蛋白可以用来免疫，制备相应的单克隆抗体。目前HSP70的表达方法一般为选取目的片段后经过酶切与只有一种HIS标签的PET32a载体质粒相连接，然后将重组质粒转化大肠杆菌BL21，诱导结束后，超声破碎，离心收集，将收集的上清液按法玛西亚公司的HISTrap纯化试剂盒操作说明进行纯化。并且需要摸索纯化的最佳条件。而本专利所采用的是分别与带有两种标签的表达载体相连接，一种可以用来免疫，一种可以用来筛选，解决了后续单抗筛选中抗标签抗体的干扰。本专利中纯化蛋白所用的方法相对于目前应用的方法比较简单，并且节约成本，不需要购买纯化试剂盒，只需反复冻融后在冰浴中超声，最后离心用6M尿素溶解即可获得纯度大于80％的纯化蛋白可以用于小鼠的免疫。 

与现有的技术相比，本发明有如下优点： 

(1)通过相关的生物学软件选取与小鼠同源性低且免疫原性好的区域进行特异的引物设计，通过原核表达目的蛋白且将其纯化后的融合蛋白作为抗原免疫小鼠制备相应的单克隆抗体为后续制备肝细胞癌早期诊断试剂盒提供原料，奠定基础。 

(2)本专利中所述的HSP70蛋白纯化方法简单，所需成本低，且HSP70蛋白经纯化后的纯度可以用来免疫小鼠用于单克隆抗体的制备。 

附图说明

图1示出的是本发明选取的HSP70基因序列表。 

图2示出了人HSP70基因PCR扩增结果的电泳图。其中，1：HSP70PCR产物，M：DNA Marker。 

图3示出了重组质粒的双酶切鉴定的电泳图。 

其中，1：pET32a-HSP70重组质粒双酶切，2：pGEX-4T-1-HSP70重组质粒双酶切，M：DNA Marker。 

图4示出了pET32a-HSP70重组蛋白的SDS-PAGE图。 

其中，M：Marker，1，3，5，7：诱导前菌液SDS-PAGE图，2，4，6，8：诱导后重组蛋白的SDS-PAGE图，9：空BL21菌SDS-PAGE图。 

图5示出了pGEX-4T-1-HSP70重组蛋白SDS-PAGE图。 

其中，M：Marker，1，3，5，7：诱导前菌液SDS-PAGE图，2，4，6，8：诱导后重组蛋白的SDS-PAGE图，9：空BL21菌SDS-PAGE图。 

图6是重组蛋白经纯化后的SDS-PAGE图 

其中，1：纯化后重组蛋白，M：Marker。 

具体实施方式

HSP70的核苷酸序列为： 

CACGGCAA  GGTGGAGATC  ATCGCCAACG  ACCAGGGCAA  CCGCACCACC  CCCAGCTACG 

TGGCCTTCAC  GGACACCGAG  CGGCTCATCG  GGGATGCGGC  CAAGAACCAG  GTGGCGCTGA 

ACCCGCAGAA  CACCGTGTTT  GACGCGAAGC  GGCTGATCGG  CCGCAAGTTC  GGCGACCCGG 

TGGTGCAGTC  GGACATGAAG  CACTGGCCTT  TCCAGGTGAT  CAACGACGGA  GACAAGCCCA 

AGGTGCAGGT  GAGCTACAAG  GGGGAGACCA  AGGCATTCTA  CCCCGAGGAG  ATCTCGTCCA 

TGGTGCTGAC CAAGATGAAG GAGATCGCCG AGGCGTACCT GGGCTACCCG GTGACCAACG 

CGGTGATCAC CGTGCCGGCC TACTTCAACG ACTCGCAG 

HSP70的氨基酸序列为： 

HGKVEIIA NDQGNRTTPS YVAFTDTERL IGDAAKNQVA LNPQNTVFDA KRLIGRKFGD 

PVVQSDMKHW PFQVINDGDK PKVQVSYKGE TKAFYPEEIS SMVLTKMKEI AEAYLGYPVT 

NAVITVPAYF NDSQ 

根据蛋白质的氨基酸序列初步估算蛋白质的分子量为14.7kDa，则含有HIS标签的蛋白分子量为14.7+20＝34.7kDa，如图4中所示，含有GST标签的蛋白分子量大约为14.7+26＝40.7kDa。如图5所示。最终证明经诱导后所获得的蛋白的确是HSP70蛋白。 

实施例1 

重组质粒pET32a-HSP70及pGEX-4T-1-HSP70的构建： 

1.目的基因HSP70的合成：设计上游引物CGGAATTCCACGGCAAGGTGGAGA下游引物为CCCTCGAGTTACTGCGAGTCGTTGAAGTA。从Hela细胞系中提取总RNA进行逆转录后所得cDNA为模板进行PCR反应，PCR扩增条件为：94℃预变性8min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，最后72℃后延伸8min。 

2.分别双酶切HSP70基因与pET32a及pGEX-4T-1载体，连接构建重组质粒，转化宿主菌，构建HSP70基因工程菌； 

实施例2 

HSP70融合蛋白的表达纯化 

1培养HSP70基因工程菌，IPTG诱导表达目的蛋白；诱导温度为30℃，诱导时间为4h。 

2纯化所得融合蛋白：将诱导后的菌液分装在离心管中4℃离心，2164g，10min。用PBS缓冲液重悬加入蛋白酶抑制剂(PMSF)后反复冻融8次，进行超声处理至SDS-PAGE显示沉淀中蛋白纯度＞80％。将沉淀最后用6M尿素溶解。序列表

<110>唐晓波，李淑珍，单瑞辉，陈莉，李新禹，吴红

<120>一种肝细胞癌相关蛋白HSP70的表达纯化方法

<140>201110143695.5

<141>2011-05-31

<160>2 

<160>2 

<210>1 

<211>396 

<212>DNA 

<213>人

<213>人 

<400>1 

cacggcaagg tggagatcat cgccaacgac cagggcaacc gcaccacccc cagctacgtg       60 

gccttcacgg acaccgagcg gctcatcggg gatgcggcca agaaccaggt ggcgctgaac       120 

ccgcagaaca ccgtgtttga cgcgaagcgg ctgatcggcc gcaagttcgg cgacccggtg        180 

gtgcagtcgg acatgaagca ctggcctttc caggtgatca acgacggaga caagcccaag         240

gtgcaggtga gctacaaggg ggagaccaag gcattctacc ccgaggagat ctcgtccatg          300

gtgctgacca agatgaagga gatcgccgag gcgtacctgg gctacccggt gaccaacgcg        360 

gtgatcaccg tgccggccta cttcaacgac tcgcag                                          396 

<210>2 

<211>132 

<212>PRT 

<213>人 

<400>2 

His Gly Lys Val Glu Ile Ile Ala Asn Asp Gln Gly Asn Arq Thr Thr 

1                         5                            10                           15 

Pro Ser Tyr Val Ala Phe Thr Asp Thr Glu Arg Leu Ile Gly Asp Ala 

                     20                            25                            30 

Ala Lys Asn Gln Val Ala Leu Asn Pro Gln Asn Thr Val Phe Asp Ala 

              35                             40                             45 

Lys Arg Leu Ile Gly Arg Lys Phe Gly Asp Pro Val Val Gln Ser Asp 

        50                           55                           60 

Met Lys His Trp Pro Phe Gln Val Ile Asn Asp Gly Asp Lys Pro Lys 

65                              70                              75                           80 

Val Gln Val Ser Tyr Lys Gly Glu Thr Lys Ala Phe Tyr Pro Glu Glu 

                          85                            90                            95 

Ile Ser Ser Met Val Leu Thr Lys Met Lys Glu Ile Ala Glu Ala Tyr 

                 100                           105                           110 

Leu Gly Tyr Pro Val Thr Asn Ala Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe 

              115                          120                          125 

Asn Asp Ser Gln 

        130 

Claims (2)

1.一种肝细胞癌相关蛋白HSP70的表达纯化方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）目的基因HSP70的合成；

（2）分别双酶切HSP70基因与载体，连接构建重组质粒，转化宿主菌，构建HSP70基因工程菌；

（3）培养HSP70基因工程菌，诱导表达目的蛋白；

（4）纯化所得融合蛋白；

其中，上述步骤（1）所述的目的基因的合成为：

设计上游引物CGGAATTCCACGGCAAGGTGGAGA

下游引物为CCCTCGAGTTACTGCGAGTCGTTGAAGTA

从Hela细胞系中提取总RNA进行逆转录后所得cDNA为模板进行PCR反应，PCR扩增条件为：94℃预变性8min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，最后72℃后延伸8min；

上述步骤（2）所述载体为pET32a及pGEX-4T-1，所用的限制性内切酶为EcoRI和XhoI，所用宿主菌为大肠杆菌；

上述步骤（3）所述的培养工程菌的培养基为LB液体培养基，诱导温度为30℃，诱导时间为4h；

上述步骤（4）所述的纯化方法为将诱导后的菌液分装在离心管中4℃离心，2164g，10min；用PBS缓冲液重悬加入蛋白酶抑制剂后反复冻融8次，进行超声处理至SDS-PAGE显示沉淀中蛋白纯度＞80%；将沉淀最后用6M尿素溶解。

2.如权利要求1所述的肝细胞癌相关蛋白HSP70的表达纯化方法，其特征在于，所述的蛋白酶抑制剂为PMSF。

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