JP7303750B2

JP7303750B2 - 癌における非古典的ｈｌａ－ｉおよびネオ抗原を含む複合体を標的とするための方法および組成物

Info

Publication number: JP7303750B2
Application number: JP2019560066A
Authority: JP
Inventors: ヴァイダンツ，ジョン
Original assignee: ベーリンガーインゲルハイムファーマシューティカルズインコーポレイテッド
Priority date: 2017-01-24
Filing date: 2018-01-24
Publication date: 2023-07-05
Anticipated expiration: 2038-01-24
Also published as: JP2020506962A; CN110809580A; EP3573997A4; WO2018140525A1; JP2023134503A; US20190071502A1; EP3573997A1

Description

＜相互参照＞
本出願は、２０１７年１月２４日に出願された米国仮出願第６２／４４９，９５４；および、２０１７年２月１７日に出願された米国仮出願第６２／４６０，５８５の利益を主張し、参照によってその全体が本明細書に組込まれる。
＜配列表＞

本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含んでいる。２０１８年１月２３日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、５０６２６－７０１＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔと題され、１５，１１２バイトのサイズである。

いくつかの実施形態では、癌における非古典的ＨＬＡ－Ｉおよびネオ抗原を含む複合体を標的とするための方法および組成物が本明細書で開示される。いくつかの実施形態では、該方法および組成物は、非古典的ＨＬＡ－Ｉおよびネオ抗原を含む複合体に選択的に結合する抗体を含み、それによって、癌細胞に対する免疫反応を調節する。

ある実施形態では、非古典的ＨＬＡ－Ｉおよびペプチドを含む複合体に選択的に結合する抗体が本明細書に開示される。いくつかの例では、抗体は、（ｉ）非古典的ＨＬＡ－Ｉのみ；または（ｉｉ）ペプチドのみに対して、結合親和性を有していない。いくつかの例では、ペプチドは、抗原処理機構（ＡＰＭ）能力のある細胞によって発現される。いくつかの例では、ペプチドは、ＴＡＰ１／２能力のある細胞によって発現される。いくつかの例では、ペプチドは、抗原処理機構（ＡＰＭ）欠損細胞によって発現される。いくつかの例では、ペプチドは、ＴＡＰ１／２欠損細胞によって発現される。

いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３（ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３（ＶＭＡＰＲＴＬＩＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４（ＶＭＰＰＲＴＬＬＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１（ＶＭＡＰＲＴＬＶＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９（ＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０（ＡＩＳＰＲＴＬＮＡ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１（ＳＱＡＰＬＰＣＶＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５（ＹＬＬＥＭＬＷＲＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６（ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２（ＱＭＲＰＶＳＲＶＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３（ＡＬＡＬＶＲＭＬＩ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４（ＳＱＱＰＹＬＱＬＱ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５（ＡＭＡＰＩＫＴＨＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６（ＡＭＡＰＩＫＶＲＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７（ＹＬＬＰＡＩＶＨＩ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７（ＩＬＤＱＫＩＮＥＶ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８（ＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９（ＫＶＬＥＹＶＩＫＶ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８（ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０（ＹＬＥＰＧＰＶＴＶ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２（ＳＬＬＥＫＳＬＧＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２（ＱＭＲＰＶＳＲＶＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３（ＷＩＡＡＶＴＩＡＡ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４（ＴＳＤＭＰＧＴＴＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５（ＭＬＡＬＬＴＱＶＡ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６（ＱＭＦＥＧＰＬＡＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３７（ＶＬＷＤＲＴＦＳＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３８（ＴＬＦＦＱＱＮＡＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１（ＧＬＡＤＫＶＹＦＬ）、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２（ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。

いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３（ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３（ＶＭＡＰＲＴＬＩＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４（ＶＭＰＰＲＴＬＬＬ）、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３１（ＶＭＡＰＲＴＬＶＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．３（ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。

いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２（ＳＬＬＥＫＳＬＧＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２（ＱＭＲＰＶＳＲＶＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３（ＷＩＡＡＶＴＩＡＡ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４（ＴＳＤＭＰＧＴＴＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５（ＭＬＡＬＬＴＱＶＡ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６（ＱＭＦＥＧＰＬＡＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３７（ＶＬＷＤＲＴＦＳＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３８（ＴＬＦＦＱＱＮＡＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１（ＧＬＡＤＫＶＹＦＬ）、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２（ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５（ＭＬＡＬＬＴＱＶＡ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１（ＧＬＡＤＫＶＹＦＬ）、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２（ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．３５（ＭＬＡＬＬＴＱＶＡ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．１（ＧＬＡＤＫＶＹＦＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．２（ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。

いくつかの例では、非古典的ＨＬＡ－Ｉは、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、またはＨＬＡ－Ｈである。いくつかの例では、非古典的ＨＬＡ－ＩはＨＬＡ－Ｅである。いくつかの例では、ＨＬＡ－ＥはＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１またはＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３である。いくつかの例では、抗体は、ＨＬＡ－Ｅおよびペプチドを含む複合体に選択的に結合する。いくつかの例では、抗体は：（ａ）ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびペプチド；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３およびペプチド；または、（ｃ）ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびペプチド、ならびにＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３およびペプチドを含む複合体に選択的に結合する。

いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）、ＨＬＡ－ＥおよびＶＭＡＰＲＴＬＩＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）、ＨＬＡ－ＥおよびＶＭＰＰＲＴＬＬＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）、ＨＬＡ－ＥおよびＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９）、ＨＬＡ－ＥおよびＡＩＳＰＲＴＬＮＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２０）、ＨＬＡ－ＥおよびＳＱＡＰＬＰＣＶＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２１）、ＨＬＡ－ＥおよびＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５）、ＨＬＡ－ＥおよびＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）、ＨＬＡ－ＥおよびＱＭＲＰＶＳＲＶＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２）、ＨＬＡ－ＥおよびＡＬＡＬＶＲＭＬＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）、ＨＬＡ－ＥおよびＳＱＱＰＹＬＱＬＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４）、ＨＬＡ－ＥおよびＡＭＡＰＩＫＴＨＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２５）、ＨＬＡ－ＥおよびＡＭＡＰＩＫＶＲＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６）、ＨＬＡ－ＥおよびＹＬＬＰＡＩＶＨＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）、ＨＬＡ－ＥおよびＩＬＤＱＫＩＮＥＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７）、ＨＬＡ－ＥおよびＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２８）、ＨＬＡ－ＥおよびＫＶＬＥＹＶＩＫＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）、ＨＬＡ－ＥおよびＳＬＬＭＷＩＴＱＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）、ＨＬＡ－ＥおよびＹＬＥＰＧＰＶＴＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０）、ＨＬＡ－ＥおよびＳＬＬＥＫＳＬＧＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３２）、ＨＬＡ－ＥおよびＱＭＲＰＶＳＲＶＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２）、ＨＬＡ－ＥおよびＷＩＡＡＶＴＩＡＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）、ＨＬＡ－ＥおよびＴＳＤＭＰＧＴＴＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３４）、ＨＬＡ－ＥおよびＭＬＡＬＬＴＱＶＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３５）、ＨＬＡ－ＥおよびＱＭＦＥＧＰＬＡＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３６）、ＨＬＡ－ＥおよびＶＬＷＤＲＴＦＳＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３７）、ＨＬＡ－ＥおよびＴＬＦＦＱＱＮＡＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３８）、ＨＬＡ－ＥおよびＧＬＡＤＫＶＹＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、またはＨＬＡ－ＥおよびＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を含む。

いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）、ＨＬＡ－ＥおよびＶＭＡＰＲＴＬＩＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）、またはＨＬＡ－ＥおよびＶＭＰＰＲＴＬＬＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ．３）を含む。

いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＳＬＬＥＫＳＬＧＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３２）、ＨＬＡ－ＥおよびＱＭＲＰＶＳＲＶＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２）、ＨＬＡ－ＥおよびＷＩＡＡＶＴＩＡＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）、ＨＬＡ－ＥおよびＴＳＤＭＰＧＴＴＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３４）、ＨＬＡ－ＥおよびＭＬＡＬＬＴＱＶＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３５）、ＨＬＡ－ＥおよびＱＭＦＥＧＰＬＡＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３６）、ＨＬＡ－ＥおよびＶＬＷＤＲＴＦＳＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３７）、ＨＬＡ－ＥおよびＴＬＦＦＱＱＮＡＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３８）、ＨＬＡ－ＥおよびＧＬＡＤＫＶＹＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、またはＨＬＡ－ＥおよびＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＭＬＡＬＬＴＱＶＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３５）、ＨＬＡ－ＥおよびＧＬＡＤＫＶＹＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、またはＨＬＡ－ＥおよびＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＭＬＡＬＬＴＱＶＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ．３５）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＧＬＡＤＫＶＹＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ．１）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ．２）を含む。

いくつかの例では、抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ラクダ科抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｂｏｄｙ）、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。いくつかの例では、抗体は、Ｔ細胞受容体様（ＴＣＲ様）抗体である。いくつかの例では、抗体は単一ドメイン抗体である。いくつかの例では、単一ドメイン抗体はラクダ科単一ドメイン抗体である。いくつかの例では、抗体は多重特異性抗体である。いくつかの例では、抗体は多機能性抗体である。いくつかの例では、抗体は、複合治療部分（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｍｏｉｅｔｙ）をさらに含む。

いくつかの例では、非古典的ＨＬＡ－Ｉおよびペプチドを含む複合体に対する抗体の選択的結合は、細胞中の免疫反応を誘発する。いくつかの例では、免疫反応はＴ細胞の活性化を含む。いくつかの場合では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの例では、免疫反応は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性化を含む。いくつかの例では、細胞は癌細胞である。

ある実施形態では、個体の癌を処置する方法が本明細書に開示され、該方法は、非古典的ＨＬＡ－Ｉおよびネオ抗原を含む複合体に選択的に結合する抗体を個体に投与する工程を含む。いくつかの例では、抗体は、（ｉ）非古典的ＨＬＡ－Ｉのみ；または（ｉｉ）ネオ抗原のみに対して、結合親和性を有していない。いくつかの例では、ネオ抗原は、抗原処理機構（ＡＰＭ）能力のある細胞によって発現される。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＴＡＰ１／２能力のある細胞によって発現される。いくつかの例では、ネオ抗原は、抗原処理機構（ＡＰＭ）欠損細胞によって発現される。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＴＡＰ１／２欠損細胞によって発現される。

いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３（ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３（ＶＭＡＰＲＴＬＩＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４（ＶＭＰＰＲＴＬＬＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１（ＶＭＡＰＲＴＬＶＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９（ＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０（ＡＩＳＰＲＴＬＮＡ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１（ＳＱＡＰＬＰＣＶＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５（ＹＬＬＥＭＬＷＲＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６（ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２（ＱＭＲＰＶＳＲＶＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３（ＡＬＡＬＶＲＭＬＩ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４（ＳＱＱＰＹＬＱＬＱ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５（ＡＭＡＰＩＫＴＨＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６（ＡＭＡＰＩＫＶＲＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７（ＹＬＬＰＡＩＶＨＩ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７（ＩＬＤＱＫＩＮＥＶ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８（ＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９（ＫＶＬＥＹＶＩＫＶ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８（ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０（ＹＬＥＰＧＰＶＴＶ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２（ＳＬＬＥＫＳＬＧＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２（ＱＭＲＰＶＳＲＶＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３（ＷＩＡＡＶＴＩＡＡ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４（ＴＳＤＭＰＧＴＴＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５（ＭＬＡＬＬＴＱＶＡ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６（ＱＭＦＥＧＰＬＡＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３７（ＶＬＷＤＲＴＦＳＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３８（ＴＬＦＦＱＱＮＡＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１（ＧＬＡＤＫＶＹＦＬ）またはＳＥＱＩＤＮＯ：２（ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。

いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３（ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３（ＶＭＡＰＲＴＬＩＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４（ＶＭＰＰＲＴＬＬＬ）、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３１（ＶＭＡＰＲＴＬＶＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３（ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。

いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２（ＳＬＬＥＫＳＬＧＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２（ＱＭＲＰＶＳＲＶＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３（ＷＩＡＡＶＴＩＡＡ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４（ＴＳＤＭＰＧＴＴＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５（ＭＬＡＬＬＴＱＶＡ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６（ＱＭＦＥＧＰＬＡＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３７（ＶＬＷＤＲＴＦＳＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３８（ＴＬＦＦＱＱＮＡＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１（ＧＬＡＤＫＶＹＦＬ）、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２（ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５（ＭＬＡＬＬＴＱＶＡ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１（ＧＬＡＤＫＶＹＦＬ）またはＳＥＱＩＤＮＯ：２（ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３５（ＭＬＡＬＬＴＱＶＡ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１（ＧＬＡＤＫＶＹＦＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．２（ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。

いくつかの例では、非古典的ＨＬＡ－Ｉは、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、またはＨＬＡ－Ｈである。いくつかの例では、非古典的ＨＬＡ－ＩはＨＬＡ－Ｅである。いくつかの例では、ＨＬＡ－ＥはＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１またはＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３である。いくつかの例では、抗体は、ＨＬＡ－Ｅおよびネオ抗原を含む複合体に選択的に結合する。いくつかの例では、抗体は：（ａ）ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびネオ抗原；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３およびネオ抗原；または、（ｃ）ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびネオ抗原、ならびにＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３およびネオ抗原を含む複合体に選択的に結合する。

いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）、ＨＬＡ－ＥおよびＶＭＡＰＲＴＬＩＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）、ＨＬＡ－ＥおよびＶＭＰＰＲＴＬＬＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）、ＨＬＡ－ＥおよびＶＭＡＰＲＴＬＶＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１）、ＨＬＡ－ＥおよびＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９）、ＨＬＡ－ＥおよびＡＩＳＰＲＴＬＮＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２０）、ＨＬＡ－ＥおよびＳＱＡＰＬＰＣＶＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２１）、ＨＬＡ－ＥおよびＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５）、ＨＬＡ－ＥおよびＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）、ＨＬＡ－ＥおよびＱＭＲＰＶＳＲＶＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２）、ＨＬＡ－ＥおよびＡＬＡＬＶＲＭＬＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）、ＨＬＡ－ＥおよびＳＱＱＰＹＬＱＬＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４）、ＨＬＡ－ＥおよびＡＭＡＰＩＫＴＨＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２５）、ＨＬＡ－ＥおよびＡＭＡＰＩＫＶＲＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６）、ＨＬＡ－ＥおよびＹＬＬＰＡＩＶＨＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）、ＨＬＡ－ＥおよびＩＬＤＱＫＩＮＥＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７）、ＨＬＡ－ＥおよびＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２８）、ＨＬＡ－ＥおよびＫＶＬＥＹＶＩＫＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）、ＨＬＡ－ＥおよびＳＬＬＭＷＩＴＱＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）、ＨＬＡ－ＥおよびＹＬＥＰＧＰＶＴＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０）、ＨＬＡ－ＥおよびＳＬＬＥＫＳＬＧＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３２）、ＨＬＡ－ＥおよびＱＭＲＰＶＳＲＶＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２）、ＨＬＡ－ＥおよびＷＩＡＡＶＴＩＡＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）、ＨＬＡ－ＥおよびＴＳＤＭＰＧＴＴＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３４）、ＨＬＡ－ＥおよびＭＬＡＬＬＴＱＶＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３５）、ＨＬＡ－ＥおよびＱＭＦＥＧＰＬＡＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３６）、ＨＬＡ－ＥおよびＶＬＷＤＲＴＦＳＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３７）、ＨＬＡ－ＥおよびＴＬＦＦＱＱＮＡＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３８）、ＨＬＡ－ＥおよびＧＬＡＤＫＶＹＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、またはＨＬＡ－ＥおよびＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を含む。

いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）、ＨＬＡ－ＥおよびＶＭＡＰＲＴＬＩＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）、ＨＬＡ－ＥおよびＶＭＰＰＲＴＬＬＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）、またはＨＬＡ－ＥおよびＶＭＡＰＲＴＬＶＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ．３）を含む。

いくつかの例では、抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ラクダ科抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。いくつかの例では、抗体はＴＣＲ様抗体である。いくつかの例では、抗体は単一ドメイン抗体である。いくつかの例では、単一ドメイン抗体はラクダ科単一ドメイン抗体である。いくつかの例では、抗体は多重特異性抗体である。いくつかの例では、抗体は多機能性抗体である。いくつかの例では、抗体は、複合治療部分をさらに含む。

いくつかの例では、非古典的ＨＬＡ－Ｉおよびネオ抗原を含む複合体への抗体の選択的な結合は、免疫反応を誘発する。いくつかの例では、免疫反応はＴ細胞の活性化を含む。いくつかの場合では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの例では、免疫反応は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性化を含む。

いくつかの例では、抗体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１４、１５、２８、３０日間、またはそれ以上、連続的に投与される。いくつかの例では、抗体は、予め決められた時間間隔で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１４、１５、２８、３０日間以上投与される。いくつかの例では、抗体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１４、１５、２８、３０日間、またはそれ以上、断続的に投与される。いくつかの例では、抗体は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、またはそれ以上で投与される。いくつかの例では、抗体は、治療上有効な量で投与される。

いくつかの例では、癌は、乳癌、腎臓癌、肺癌、卵巣癌、または大腸癌である。いくつかの例では、癌はＢ細胞悪性腫瘍である。

ある実施形態では、個体の癌を処置する方法が本明細書に開示され、該方法は、ＨＬＡ－Ｅおよびネオ抗原を含む複合体に選択的に結合する抗体を個体に投与する工程を含む。いくつかの例では、抗体は、（ｉ）ＨＬＡ－Ｅのみ；または（ｉｉ）ネオ抗原のみに対して、結合親和性を有していない。いくつかの例では、ネオ抗原は、抗原処理機構（ＡＰＭ）能力のある細胞によって発現される。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＴＡＰ１／２能力のある細胞によって発現される。いくつかの例では、ネオ抗原は、抗原処理機構（ＡＰＭ）欠損細胞によって発現される。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＴＡＰ１／２欠損細胞によって発現される。

いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２（ＳＬＬＥＫＳＬＧＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２（ＱＭＲＰＶＳＲＶＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３（ＷＩＡＡＶＴＩＡＡ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４（ＴＳＤＭＰＧＴＴＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５（ＭＬＡＬＬＴＱＶＡ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６（ＱＭＦＥＧＰＬＡＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３７（ＶＬＷＤＲＴＦＳＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３８（ＴＬＦＦＱＱＮＡＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１（ＧＬＡＤＫＶＹＦＬ）、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２（ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５（ＭＬＡＬＬＴＱＶＡ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１（ＧＬＡＤＫＶＹＦＬ）、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２（ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３５（ＭＬＡＬＬＴＱＶＡ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１（ＧＬＡＤＫＶＹＦＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．２（ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。

いくつかの例では、ＨＬＡ－ＥはＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１またはＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３である。いくつかの例では、抗体は：（ａ）ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびネオ抗原；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３およびネオ抗原；または、（ｃ）ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびネオ抗原、ならびにＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３およびネオ抗原を含む複合体に選択的に結合する。

いくつかの例では、ＨＬＡ－Ｅおよびネオ抗原を含む複合体への抗体の選択的な結合は、免疫反応を誘発する。いくつかの例では、免疫反応はＴ細胞の活性化を含む。いくつかの場合では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの例では、免疫反応は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性化を含む。

いくつかの例では、抗体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１４、１５、２８、３０日間、またはそれ以上、連続的に投与される。いくつかの例では、抗体は、予め決められた時間間隔で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１４、１５、２８、３０日間、またはそれ以上投与される。いくつかの例では、抗体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１４、１５、２８、３０日間、またはそれ以上、断続的に投与される。いくつかの例では、抗体は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、またはそれ以上で投与される。いくつかの例では、抗体は、治療上有効な量で投与される。

ある実施形態では、非古典的ＨＬＡ－Ｉおよびペプチドを含む複合体に選択的に結合するラクダ科抗体を生成する方法が本明細書に開示され、該方法は：（ａ）免疫反応の誘発するために治療上有効な量の免疫原をラクダ科動物に投与する工程であって、ここで、該免疫原は、非古典的ＨＬＡ－Ｉおよびペプチドの組換え発現した複合体を含む工程と；（ｂ）抗体ライブラリーを構築する工程と；（ｃ）抗体を選択するために抗体ライブラリーを分析する工程と；（ｄ）抗体を単離させる工程とを含む。いくつかの例では、抗体は、（ｉ）非古典的ＨＬＡ－Ｉのみ；または（ｉｉ）ペプチドのみに対して、結合親和性を有していない。いくつかの例では、ペプチドは、抗原処理機構（ＡＰＭ）能力のある細胞によって発現される。いくつかの例では、ペプチドは、ＴＡＰ１／２能力のある細胞によって発現される。いくつかの例では、ペプチドは、抗原処理機構（ＡＰＭ）欠損細胞によって発現される。いくつかの例では、ペプチドは、ＴＡＰ１／２欠損細胞によって発現される。

いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３（ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３（ＶＭＡＰＲＴＬＩＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４（ＶＭＰＰＲＴＬＬＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１（ＶＭＡＰＲＴＬＶＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９（ＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０（ＡＩＳＰＲＴＬＮＡ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１（ＳＱＡＰＬＰＣＶＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５（ＹＬＬＥＭＬＷＲＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６（ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２（ＱＭＲＰＶＳＲＶＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３（ＡＬＡＬＶＲＭＬＩ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４（ＳＱＱＰＹＬＱＬＱ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５（ＡＭＡＰＩＫＴＨＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６（ＡＭＡＰＩＫＶＲＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７（ＹＬＬＰＡＩＶＨＩ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７（ＩＬＤＱＫＩＮＥＶ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８（ＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９（ＫＶＬＥＹＶＩＫＶ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８（ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０（ＹＬＥＰＧＰＶＴＶ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２（ＳＬＬＥＫＳＬＧＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２（ＱＭＲＰＶＳＲＶＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３（ＷＩＡＡＶＴＩＡＡ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４（ＴＳＤＭＰＧＴＴＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５（ＭＬＡＬＬＴＱＶＡ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６（ＱＭＦＥＧＰＬＡＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３７（ＶＬＷＤＲＴＦＳＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３８（ＴＬＦＦＱＱＮＡＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１（ＧＬＡＤＫＶＹＦＬ）またはＳＥＱＩＤＮＯ：２（ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。

いくつかの例では、非古典的ＨＬＡ－Ｉは、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、またはＨＬＡ－Ｈである。いくつかの例では、非古典的ＨＬＡ－ＩはＨＬＡ－Ｅである。いくつかの例では、ＨＬＡ－Ｅは、ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１またはＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３である。いくつかの例では、抗体は、ＨＬＡ－Ｅおよびペプチドを含む複合体に選択的に結合する。いくつかの例では、抗体は：（ａ）ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびペプチド；（ｂ）ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３およびペプチド；または、（ｃ）ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびペプチド、ならびにＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３およびペプチドを含む複合体に選択的に結合する。

いくつかの例では、抗体はＴＣＲ様抗体である。いくつかの例では、抗体は単一ドメイン抗体である。いくつかの例では、抗体は多重特異性抗体である。いくつかの例では、抗体は多機能性抗体である。いくつかの例では、抗体は、複合治療部分をさらに含む。

いくつかの例では、免疫原は単量体である。いくつかの例では、免疫原は四量体である。いくつかの例では、四量体はアビジンまたはその誘導体を含む。いくつかの例では、免疫原は、大腸菌においてＨＬＡ－Ｉ重鎖およびＨＬＡ－Ｉ軽鎖を別々に組み換え発現させ、次に、ＨＬＡ－Ｉ重鎖および軽鎖をインビトロでペプチドを用いてリフォールディングすることによって生成される。いくつかの例では、ラクダ科動物はラマである。いくつかの例では、抗体ライブラリーは、ファージディスプレイライブラリーである。いくつかの例では、抗体ライブラリーは、バクテリオファージディスプレイライブラリーである。いくつかの例では、抗体ライブラリーは、イスートディスプレイライブラリーである。いくつかの例では、抗体ライブラリーは、単一ドメイン抗体ライブラリーである。

ある実施形態では、本明細書に開示される抗体と；薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む医薬組成物が本明細書に開示される。

本発明の新規な特徴は、とりわけ添付の特許請求の範囲において説明される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が用いられる実施形態を説明する以下の詳細な説明と、以下の添付図面とを引用することによって得られるであろう。
タンパク質抗原は、代替的処理経路と同様に、従来の処理経路を介して処理されることを例証する。代替的処理経路を介して処理されたタンパク質は、非古典的ＨＬＡ－Ｅおよび古典的ＨＬＡクラスＩアレルに結合する。ネオペプチドの結合は真性のネオエピトープ表し、免疫療法の開発のために疾病特異的標的を提供する。癌中のＨＬＡ－Ｅの臨床的および免疫学的有意性を例証する。生理学的条件下での、ＨＬＡ－ＥによるペプチドのＴＡＰ依存性提示を例証し、これは、ＨＬＡ－Ｅに結合するペプチド（出現順で、それぞれＳＥＱＩＤＮＯＳ５６－５８および３１）のための５つの処理ステップを含む。生理学的条件下での、ＨＬＡ－Ｅによって結合されるＭＨＣクラスＩ分子からのリーダー配列ペプチドの構造を例証する。リーダー配列は、ＨＬＡ－Ｅペプチドポケットから突出するペプチドの５および８位置のアミノ酸を用いてＨＬＡ－Ｅに結合する。図５Ａ－図５Ｄは、ＴＣＲ様ターゲティングを有する二重特異性ｓｃＦｖ、および特異的かつ強固にＴ細胞を活性化するＣＤ３ε結合モチーフを例証する。ＭＨＣクラスＩ：ペプチド複合体を結合し、近位のＴ細胞を活性化する二重特異性ｓｃＦｖの描写である。ウェルは（１）ＭＨＣクラスＩ：ペプチド単量体で覆われ、（２）活性化すると、別個の二重特異性分子とインキュベートされ、および（３）ナイーブＴ細胞で共培養され、（４）ＩＬ－２が産生された。図５Ａ－図５Ｄは、ＴＣＲ様ターゲティングを有する二重特異性ｓｃＦｖ、および特異的かつ強固にＴ細胞を活性化するＣＤ３ε結合モチーフを例証する。図５ＡからのＴ細胞によるＩＬ－２生成のＥＬＩＳＡ検出を例証する。図５Ａ－図５Ｄは、ＴＣＲ様ターゲティングを有する二重特異性ｓｃＦｖ、および特異的かつ強固にＴ細胞を活性化するＣＤ３ε結合モチーフを例証する。二重特異性によって結合された標的を提示する腫瘍細胞の描写であり、順にＴ細胞を活性化した。ウェルは、（１）特異的ＭＨＣクラスＩ：ペプチドを発現するＥＬ４腫瘍細胞、（２）二重特異性治療薬、および（３）抗原ナイーブＴ細胞を与えられた。図５Ａ－図５Ｄは、ＴＣＲ様ターゲティングを有する二重特異性ｓｃＦｖ、および特異的かつ強固にＴ細胞を活性化するＣＤ３ε結合モチーフを例証する。図５ＣからのＴ細胞によるＩＬ－２生成のＥＬＩＳＡ検出を例証する。癌特異的ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド標的のために使用される検証ストラテジーを例証する。１）患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）モデルから単離された冷凍保存された腫瘍組織、患者生検、または新たに単離された血液癌細胞は、液体窒素で冷凍保管される。２）材料のサンプルは、５～１０ｍｌの溶解緩衝液中で単離および再懸濁され、氷上で１０秒間、均質化される。氷上での１時間のインキュベーション後、サンプルは４０，０００ｇで２０分間遠心分離する。３）ＨＬＡ－Ｅへの抗体４Ｄ１２または別の抗体を使用してアフィニティーカラムが調製される。精製された抗－ＨＬＡ－Ｅ抗体が、ＣＮ－Ｂｒ－活性化セファロースビーズに結合される。その後、澄まされた上清は、アフィニティーカラムに適用される。アフィニティーカラムはＰＢＳで洗浄され、続いて、水で２回目の洗浄を行い、およびサンプルが０．１ＭグリシンｐＨ３．０で溶出された。４）集めたサンプルは直ちに、ＮＨ４ＨＣＯ３の添加により中和された。重鎖およびβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の除去は、５ｋＤａ濾過膜を使用して行なわれ、より少ない分子ペプチドが膜を通過し、５）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＯｒｂｉｔｒａｐ）における分析のために集められる。６）合成ペプチドはＬＣ／ＭＳ／ＭＳにおいて精製され、インシリコで発見したペプチドプロファイルと比較されて、特異的ペプチド標的（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９）の腫瘍の存在を検証する。図７Ａ－図７Ｃは、ＰＤＸ肺腫瘍組織中で発現したＨＬＡ－Ｅ分子から単離されたペプチドＧＬＡＤＫＶＹＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ検証プロファイルを例証する。ペプチドＧＬＡＤＫＶＹＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）のＬＣ保持時間を例証する。図７Ａ－図７Ｃは、ＰＤＸ肺腫瘍組織中で発現したＨＬＡ－Ｅ分子から単離されたペプチドＧＬＡＤＫＶＹＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ検証プロファイルを例証する。図７Ｂは、ＧＬＡＤＫＶＹＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）ペプチドの質量／電荷比を例証し、図７Ｃは、合成ペプチド標準のＭＳ断片化プロファイルをＰＤＸ肺癌サンプルからのＨＬＡ－Ｅから単離されたペプチドＧＬＡＤＫＶＹＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）と整列させる。図７Ａ－図７Ｃは、ＰＤＸ肺腫瘍組織中で発現したＨＬＡ－Ｅ分子から単離されたペプチドＧＬＡＤＫＶＹＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ検証プロファイルを例証する。図７Ｂは、ＧＬＡＤＫＶＹＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）ペプチドの質量／電荷比を例証し、図７Ｃは、合成ペプチド標準のＭＳ断片化プロファイルを、ＰＤＸ肺癌サンプルからのＨＬＡ－Ｅから単離されたペプチドＧＬＡＤＫＶＹＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）と整列させる。図８Ａ－図８Ｃは、ＰＤＸ肺腫瘍組織中で発現したＨＬＡ－Ｅ分子から単離されたペプチドＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ検証プロファイルを例証する。ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）ペプチドのＬＣ保持時間を例証する。図８Ａ－図８Ｃは、ＰＤＸ肺腫瘍組織中で発現したＨＬＡ－Ｅ分子から単離されたペプチドＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ検証プロファイルを例証する。図８Ｂは、ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）ペプチドの質量／電荷比を例証し、図８Ｃは、合成ペプチド標準のＭＳ断片化プロファイルを、ＰＤＸ肺癌サンプルからのＨＬＡ－Ｅから単離されたペプチドＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）と整列させる。図８Ａ－図８Ｃは、ＰＤＸ肺腫瘍組織中で発現したＨＬＡ－Ｅ分子から単離されたペプチドＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ検証プロファイルを例証する。図８Ｂは、ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）ペプチドの質量／電荷比を例証し、図８Ｃは、合成ペプチド標準のＭＳ断片化プロファイルを、ＰＤＸ肺癌サンプルからのＨＬＡ－Ｅから単離されたペプチドＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）と整列させる。図９Ａ－図９Ｄは、組み換えＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＨＬＡ－Ｇシグナルペプチド）タンパク質の生成および特性評価を例証する。ペプチドＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）を使用してリフォールディングされたＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１から結果としてもたらされる産物の分離プロファイルを例示する。リフォールディングされたタンパク質材料は、ＮＧＣＴＭ中圧液体クロマトグラフィーシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して、ＦＰＬＣＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（ＧＥ）上で実行された。リフォールディングピークとして明示される第２のピークは、正確に再結合された機能的なＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ複合体を含む。図９Ａ－図９Ｄは、組み換えＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＨＬＡ－Ｇシグナルペプチド）タンパク質の生成および特性評価を例証する。ｂ－Ｖ－００２５－Ｅ（０１０１）として指定されたレーン中の１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルにおいて実行された後、ピーク２（図９Ａ）からのＨＬＡ－Ｅ重鎖（３３ｋＤ）およびβ２ミクログロブリン（１１ｋＤ）のバンドを明らかにするクーマシーブルー染色されたゲルを例証する。図９Ａ－図９Ｄは、組み換えＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＨＬＡ－Ｇシグナルペプチド）タンパク質の生成および特性評価を例証する。ＷａｔｅｒｓＸｂｒｉｄｇｅＢＥＨのサイズ排除カラムにおいて実行された、ピーク２（図９Ａ）の１０ｍｇを有するＨＰＬＣ（島津製作所２０２０）プロファイルを例証する。適切にリフォールディングされたＨＬＡ－Ｅペプチド複合体の存在を裏付ける、６．３８４分の予測された保持時間が確認された。図９Ａ－図９Ｄは、組み換えＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＨＬＡ－Ｇシグナルペプチド）タンパク質の生成および特性評価を例証する。固定化されたビオチン標識ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ピーク２図９Ａ）に結合する、３Ｄ１２抗体（１０μｇ／ｍｌ）を例証する。簡潔に言えば、バイオネティックプレート（共鳴センサ）は、ビオチン標識ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体を捕らえるために、ニュートラアビジン（１０μｇ／ｍｌ）で覆われた。ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド立体構造依存性３Ｄ１２抗体の結合は、経時的（分）なピコメーターシフトとしてＲｅｓｏＳｅｎｓ機器（共鳴センサ）を使用して決定された。図１０Ａ－図１０Ｄは、組み換えＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＨＬＡ－Ｇシグナルペプチド）タンパク質の生成および特性評価を例証する。ペプチドＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）を使用してリフォールディングされたＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３から結果としてもたらされる産物の分離プロファイルを例証する。リフォールディングされたタンパク質は、ＮＧＣＴＭ中圧液体クロマトグラフィーシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して、ＦＰＬＣＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（ＧＥ）において実行された。リフォールディングピークとして明示される第２のピークは、正確に再結合された機能的なＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ複合体を含む。図１０Ａ－図１０Ｄは、組み換えＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＨＬＡ－Ｇシグナルペプチド）タンパク質の生成および特性評価を例証する。ｂ－Ｖ－００２５－Ｅ（０１０３）として指定されたレーン中の１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルにおいて実行された、ピーク２（図１０Ａ）からのＨＬＡ－Ｅ重鎖（３３ｋＤ）およびβ２ミクログロブリン（１１ｋＤ）のバンドを明らかにするクーマシーブルー染色されたゲルを例証する。図１０Ａ－図１０Ｄは、組み換えＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＨＬＡ－Ｇシグナルペプチド）タンパク質の生成および特性評価を例証する。ＷａｔｅｒｓＸｂｒｉｄｇｅＢＥＨのサイズ排除カラムにおいて実行された１０μｇのピーク２（図１０Ａ）を有するＨＰＬＣ（島津製作所２０２０）プロファイルを示す。適切にリフォールディングされたＨＬＡ－Ｅペプチド複合体の存在を裏付ける、６．３８４分の予測された保持時間が確認された。図１０Ａ－図１０Ｄは、組み換えＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＨＬＡ－Ｇシグナルペプチド）タンパク質の生成および特性評価を例証する。固定化されたビオチン標識ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ピーク２図１０Ａ）に結合する３Ｄ１２抗体（１０μｇ／ｍｌ）を示す。簡潔に言えば、バイオネティックプレート（共鳴センサ）は、ビオチン標識ＨＬＡ－Ｅ－ペプチドを捕らえるために、ニュートラアビジン（１０μｇ／ｍｌ）で覆われた。ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体への立体構造依存性３Ｄ１２抗体の結合は、経時的（分）なピコメーターシフトとしてＲｅｓｏＳｅｎｓ機器（共鳴センサ）を使用して決定された。図１１Ａ－図１１Ｄは、組み換えＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＧＬＡＤＫＶＹＦＬ（ＣＡＤタンパク質）の生成および特性評価を例証する。ペプチドＧＬＡＤＫＶＹＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）を使用してリフォールディングされたＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３から結果としてもたらされる産物の分離プロファイルを例証する。リフォールディングされたタンパク質は、ＮＧＣＴＭ中圧液体クロマトグラフィーシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して、ＦＰＬＣＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（ＧＥ）において実行された。リフォールディングピークとして明示される第２のピークは、正確に再結合された機能的なＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＧＬＡＤＫＶＹＦＬ複合体を含む。図１１Ａ－図１１Ｄは、組み換えＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＧＬＡＤＫＶＹＦＬ（ＣＡＤタンパク質）の生成および特性評価を例証する。ｂ－Ｖ－００１１－Ｅとして指定されたレーン中の１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルにおいて実行された後、ピーク２（図１１Ａ）からのＨＬＡ－Ｅ重鎖（３３ｋＤ）およびβ２ミクログロブリン（１１ｋＤ）のバンドを明らかにするクーマシーブルー染色されたゲルを例証する。図１１Ａ－図１１Ｄは、組み換えＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＧＬＡＤＫＶＹＦＬ（ＣＡＤタンパク質）の生成および特性評価を例証する。ウォータースＸｂｒｉｄｇｅＢＥＨのサイズ排除カラムにおいて実行された１０μｇのピーク２（図１１Ａ）を有するＨＰＬＣ（島津製作所２０２０）プロファイルを例証する。適切にリフォールディングされたＨＬＡ－Ｅペプチド複合体の存在を裏付ける、６．３８４分の予測された保持時間が確認された。図１１Ａ－図１１Ｄは、組み換えＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＧＬＡＤＫＶＹＦＬ（ＣＡＤタンパク質）の生成および特性評価を例証する。固定化されたビオチン標識ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＧＬＡＤＫＶＹＦＬ（ピーク２図１１Ａ）に結合する３Ｄ１２抗体（１０μｇ／ｍｌ）を例証する。簡潔に言えば、バイオネティックプレート（共鳴センサ）は、ビオチン標識ＨＬＡ－Ｅ－ペプチドを捕らえるために、ニュートラアビジン（１０μｇ／ｍｌ）で覆われた。ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体への立体構造依存性３Ｄ１２抗体の結合は、経時的（分）なピコメーターシフトとしてＲｅｓｏＳｅｎｓ機器（共鳴センサ）を使用して決定された。図１２Ａ－図１２Ｄは、組み換えＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（ＫＩＦ１１タンパク質）の生成および特性評価を例証する。ペプチドＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を使用してリフォールディングされた、ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３から結果としてもたらされる産物の分離プロファイルを例証する。リフォールディングされたタンパク質は、ＮＧＣ（登録商標）中圧液体クロマトグラフィーシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して、ＦＰＬＣＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（ＧＥ）において実行された。リフォールディングピークとして明示される第２のピークは、正確に再結合され機能的なＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ複合体を含む。図１２Ａ－図１２Ｄは、組み換えＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（ＫＩＦ１１タンパク質）の生成および特性評価を例証する。ｂ－Ｖ－０００１３－Ｅとして指定されたレーン中の１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルにおいて実行された後、ピーク２からの（図１２Ａ）ＨＬＡ－Ｅ重鎖（３３ｋＤ）およびβ２ミクログロブリン（１１ｋＤ）のバンドを明らかにするクーマシーブルー染色されたゲルを例証する。図１２Ａ－図１２Ｄは、組み換えＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（ＫＩＦ１１タンパク質）の生成および特性評価を例証する。ＷａｔｅｒｓＸｂｒｉｄｇｅＢＥＨのサイズ排除カラムにおいて実行される１０μｇのピーク２（図１２Ａ）を有する、ＨＰＬＣ（島津製作所２０２０）プロファイルを例証する。適切にリフォールディングされたＨＬＡ－Ｅペプチド複合体の存在を裏付ける、６．３８４分の予測された保持時間が確認された。図１２Ａ－図１２Ｄは、組み換えＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（ＫＩＦ１１タンパク質）の生成および特性評価を例証する。固定化されたビオチン標識ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（ピーク２図１２Ａ）に結合される３Ｄ１２抗体（１０μｇ／ｍｌ）を例証する。簡潔に言えば、バイオネティックプレート（共鳴センサ）は、ビオチン標識ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体を捕らえるために、ニュートラアビジン（１０μｇ／ｍｌ）で覆われた。ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体への立体構造依存性３Ｄ１２抗体の結合は、経時的（分）なピコメーターシフトとしてＲｅｓｏＳｅｎｓ機器（共鳴センサ）を使用して決定された。高親和性抗体を生成するために使用される抗体発見サイクルの例示的な模式図である。図１３はＳＥＱＩＤＮＯ：６０を開示する。図１４Ａ－図１４Ｄは、ＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬへの抗体の発見を例証する。バクテリオファージによって表示されるナイーブ半合成ヒト抗体ライブラリーから発見された単一クローンを例証する。４回の選択を使用して、非常に特異的なクローンを同定する。１－３ラウンド目は、ＨＬＡ－Ａ２のネガティブ標的で遮断および枯渇し、続いて、ＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬを使用して正の選択を行った。４ラウンド目の選択は、厳格なＨＬＡ－Ｅネガティブ標的（ＨＬＡ－Ｅ－ＹＬＬＰＡＩＶＨＬ）を用いた遮断および枯渇、それに続く、正の選択を含んだ。図１４Ａ－図１４Ｄは、ＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬへの抗体の発見を例証する。免疫化されたマウス・ファージディスプレイライブラリーから単離された６つの固有のクローンを例証する。簡潔に言えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスは、５０μｇのＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬタンパク質を用いて、３回ｘ２週間隔で免疫化された。尾静脈を介した最終の注射の後、単一マウスからの脾臓が採取され、全ＲＮＡは、ｃＤＮＡ合成およびライブラリー構築のために単離された。クローン選択は、ヒト抗体ライブラリーに関して図１４Ａに記載されるのと類似する設計に従った。図１４Ａ－図１４Ｄは、ＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬへの抗体の発見を例証する。免疫化されたラマからＶＨＨ単一ドメインライブラリーを構築するためのＰＣＲ増幅結果を説明する。図１４Ａ－図１４Ｄは、ＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬへの抗体の発見を例証する。免疫化されたラマから単離されるＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬへの１５ＶＨＨ抗体クローンを例証する。簡潔に言えば、ラマは、１００μｇの四量体化されたＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ複合体を用いて、６週間にわたって毎週免疫化された。最終力価を決定した後に、血液が取り除かれ、全ＲＮＡを採取するためにＢ細胞が単離された。単一ドメインライブラリーがファージ中の抗体表示のために構築された。選択は、図１４Ａおよび図１４Ｂに記載されるプロトコルに従った。免疫化されたライブラリーからのＨＬＡ－Ｅ－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩペプチド複合体のへのマウスｓｃＦｖクローンの特異的結合に関する、モノクローナルファージＥＬＩＳＡからの結果を例証する。簡潔に言えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスは、５０μｇのＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩペプチド複合体を用いて２週間間隔で３回免疫化され、続いて、尾静脈を介して最終の１０μｇの抗原注射を行った。４日後に脾臓が採取され、全ＲＮＡを単離してｃＤＮＡを合成した。ＶＨおよびＶＬの遺伝子は、プライマーを使用してｃＤＮＡ鋳型から増幅され、ファージミドベクターにクロー二ングするための重複ＰＣＲによってｓｃＦｖ遺伝子が生成された。ファージミド中の連結されたｓｃＦｖ遺伝子は、ＴＧ１コンピテント大腸菌細胞に電気形質転換されて、末端ライブラリーを作成した。ファージディスプレイｓｃＦｖタンパク質は、標準方法を使用してヘルパーファージＭ１３ＫＯ７の助けを借りてパッケージングされた。ライブラリーは、３０のクローン中３０がｓｃＦｖ挿入を伴い、ライブラリーの多様性が５．５ｘ１０８だったことを示した。３ラウンドの選択の後、ＤＮＡ配列決定のために４０のクローンが提出され、合計６つの固有のクローンが同定された。６つのｓｃＦｖファージクローンを増殖させ、標的抗原ＨＬＡ－Ｅ－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩへの特異的結合についてＥＬＩＳＡによって試験した。図１６Ａ－図１６Ｃは、４回の濃縮後のマウスｓｃＦｖを表示する酵母ライブラリーの結合特異性を例証する。１μＭの特異的標的ＨＬＡ－Ｅ－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩのための酵母ディスプレイライブラリーの結合優先度を例証する。ゲート領域（Ｑ２で囲まれた）の事象は、ＨＬＡ－Ｅ－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩを標的とする酵母結合を表し、ＦＡＣＳアリアＩＩ選別機を使用して選別された。回収された酵母は、図１６Ｂに示されるような抗原を用いて再び染色する前に拡張され、ｓｃＦｖ発現を誘発した。図１６Ａ－図１６Ｃは、４回の濃縮後のマウスｓｃＦｖを表示する酵母ライブラリーの結合特異性を例証する。１００ｎＭの抗原を使用して、酵母ディスプレイライブラリーは、ＨＬＡ－Ｅ－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩの特異的標的（１ｎＭ）のみへの結合を示す。図１６Ａ－図１６Ｃは、４回の濃縮後のマウスｓｃＦｖを表示する酵母ライブラリーの結合特異性を例証する。クローン３は、Ａ５４９ＴＡＰ１Ｋ／Ｏ細胞の有意な染色を示すことを例証する。精製されたクローン３（ＨＬＡ－Ｅ－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ複合体に結合するヒトＩｇＧ１）を１ｕｇ／ｍｌで使用して、Ａ５４９およびＡ５４９のＴＡＰ１Ｋ／Ｏ細胞を染色した。図１７Ａ－図１７Ｃは、ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ複合体へのＲ４ヒト抗体クローンの結合特異性を例証する。大腸菌中のｓｃＦｖＲ４ヒト抗体の発現、ならびにＥＬＩＳＡによる５０ｎＭおよび５ｎＭの両濃度のＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ標的に対する結合特異性を例証する。生産されたｓｃＦｖタンパク質はＮｉＮＴＡカラムにおいて精製され、５μｇの精製されたサンプルが、還元条件下で１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で実行された。クーマシーブルー染色によって、～３０ｋＤの正確なサイズの単一バンドが明らかになった。図１７Ａ－図１７Ｃは、ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ複合体へのＲ４ヒト抗体クローンの結合特異性を例証する。全長ＩｇＧ１Ｒ４ヒト抗体の発現および特異的結合を例証する。Ｒ４ＩｇＧ１はＨＥＫ－２９３細胞で発現し、プロテインＡカラムにおいて精製された。抗体は、還元条件下で１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて実行され、クーマシーブルーで染色された。脱染されたゲルによって、～５０ｋＤおよび２５ｋＤの正確なサイズの２本の優性バンドが明らかになった。Ｒ４ＩｇＧ１は異なる濃度（０、０．５、１、および４ｎＭ）のＥＬＩＳＡで使用され、標的複合体（ＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ）への結合の特異性を決定した。図１７Ａ－図１７Ｃは、ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ複合体へのＲ４ヒト抗体クローンの結合特異性を例証する。オクテット（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）および標準プロトコルを使用して、Ｒ４クローン（ｓｃＦｖ形式）についての結合動態および親和定数を例証する。ＲｅｓｏＳｅｎｓフリーラベルテクノロジーを使用して、ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ複合体を標的とするＲ４ＩｇＧ１ヒト抗体の結合特異性の予備エピトープマッピングを例証する。簡潔に言えば、様々なペプチドで生産されたＨＬＡ－Ｅのビオチン標識単量体を、ニュートラアビジンを含むバイオネティックプレート上で捕らえた。ＨＬＡ－Ｅペプチド複合体を作成するために使用されたペプチドは、：ＶＭＡＰＱＡＬＬＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）（ＡＢＩ－Ｖ－００４０）、ＶＭＡＰＲＴＬＬＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）（ＡＢＩ－Ｖ－００４２）、ＶＭＡＰＲＴＬＴＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）（ＡＢＩ－Ｖ－００４３）、ＶＭＡＰＲＴＶＬＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）（ＡＢＩ－Ｖ－００４４）、ＶＴＡＰＲＴＶＬＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）（ＡＢＩ－Ｖ－００４６）、ＶＭＡＰＲＴＬＹＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）（ＡＢＩ－Ｖ－００４７）、ＶＭＡＰＲＴＬＷＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）（ＡＢＩ－Ｖ－００４８）、およびＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）（ＡＢＩ－Ｖ－００２５）の配列を含む。ペプチドＡＢＩ－Ｖ－００４７およびＡＢＩ－Ｖ－００４８は、自然界では発見されず、コントロールとして使用された。Ｒ４ＩｇＧ１抗体は、ＲｅｓｏＳｅｎｓ機器を使用して、バイオネティックプレート上で実行された。ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体への抗体結合（Ｙ軸）は、洗浄前（洗浄前結合）、および洗浄後（洗浄後結合）に決定された。Ｒ４ＩｇＧ１は、ｐ８中に芳香環構造を含む高度に保存されたアミノ酸残基を有するペプチドＶＭＡＰＲＴＬＹＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）、ならびにＶＭＡＰＲＴＬＷＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）、およびＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬについての良好な結合特異性を示す。図１９Ａ－図１９Ｂは、ＲｅｓｏＳｅｎｓフリーラベルテクノロジーを用いた、ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬおよびＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ複合体の両方へのＲ４ＩｇＧ１ヒト抗体結合を例証する。簡潔に言えば、ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）ペプチドを負荷したＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１および＊０１０３のビオチン標識単量体は、ニュートラアビジンを含むバイオネティックプレート（ｂｉｏｎｅｔｉｃｐｌａｔｅ）上で捕らえられた。ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬに結合するＲ４ＩｇＧ１抗体（１０μｇ／ｍｌ）を例証する。図１９Ａ－図１９Ｂは、ＲｅｓｏＳｅｎｓフリーラベルテクノロジーを用いた、ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬおよびＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ複合体の両方へのＲ４ＩｇＧ１ヒト抗体結合を例証する。簡潔に言えば、ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）ペプチドを負荷したＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１および＊０１０３のビオチン標識単量体は、ニュートラアビジンを含むバイオネティックプレート（ｂｉｏｎｅｔｉｃｐｌａｔｅ）上で捕らえられた。ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ複合体に結合するＲ４ＩｇＧ１抗体（１０μｇ／ｍｌ）を例証する。Ｒ４ＩｇＧ４抗体を用いた洗浄前および洗浄後の結合は、同様のオンレートおよびオフレートを明らかにし、Ｒ４抗体を示す全体の共鳴シフトユニット（ｐＭｅｔｅｒ）は、ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）ペプチドを表すＨＬＡ－Ｅアレルの両方について同様の結合優先度を示す。マウスＩｇＧ１抗体３Ｄ１２（抗－ＨＬＡ－Ｅ、上パネル）およびＲ４ＩｇＧ１ヒト抗体（下パネル）を有する腫瘍細胞の染色を例証する。示されるように、上パネルは３Ｄ１２での染色を示し、下パネルはＲ４抗体での染色を示す（１μｇ／ｍｌの使用）。示されるように、上下パネルは、アイソタイプコントロール抗体（マウスＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ１）での腫瘍細胞の染色をそれぞれ示す。一次抗体結合の検出は、ＬＳＲＦＡＣＳアナライザー（ＢＤ）を用いたフローサイトメトリー分析によって、ならびに、３Ｄ１２とマウスアイソタイプコントロールのための二次ヤギ抗マウスＩｇＧＦＩＴＣ（上パネル）、およびＲ４とヒトアイソタイプコントロール抗体のための二次ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＡＰＣ（下パネル）で染色することによって決定された。図２１Ａ－図２１Ｃは、３Ｄ１２、抗－ＨＬＡ－ＥおよびＲ４ＩｇＧ１、抗－ＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ抗体を有する腫瘍細胞の染色を例証する。ＩＦＮｇで４８時間処置され、かつ１ｕｇ／ｍｌの３Ｄ１２およびＲ４抗体で染色された、ＴＡＰ１タンパク質を発現するか、またはＴＡＰ１タンパク質を欠いている（ＴＡＰ１遺伝子Ｋ／Ｏ）、ヒト大腸細胞株であるＨＣＴ－１１６を例証する。一次抗体結合は、二次ヤギ抗マウス抗体ＦＩＴＣ抱合体（上パネル）、または二次ヤギ抗ヒト抗体－ＡＰＣ抱合体（下パネル）を用いた、ＦＡＣＳ（ＬＳＲ、ＢＤ）によって検出された。図２１Ａ－図２１Ｃは、３Ｄ１２、抗－ＨＬＡ－ＥおよびＲ４ＩｇＧ１、抗－ＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ抗体を有する腫瘍細胞の染色を例証する。１μｇ／ｍｌの３Ｄ１２およびＲ４抗体で染色された、ＴＡＰ１タンパク質を発現するか、ＴＡＰ１タンパク質を欠いている（ＴＡＰ１遺伝子Ｋ／Ｏ）ヒトＮＳＣＬＣ細胞株であるＡ－５４９を例証する。一次抗体結合は、二次ヤギ抗マウス抗体ＦＩＴＣ抱合体（上パネル）、または二次ヤギ抗ヒト抗体－ＡＰＣ抱合体（下パネル）を用いた、ＦＡＣＳ（ＬＳＲ、ＢＤ）によって検出された。ＨＬＡ－Ｅに結合するＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）ペプチドは、ＴＡＰ１タンパク質の存在に依拠する。Ｒ４抗体は、ＴＡＰ陽性ＨＣＴ－１１６およびＡ－５４９細胞株の両方を染色するが、ＴＡＰ１タンパク質を欠いている細胞株は染色しない。図２１Ａ－図２１Ｃは、３Ｄ１２、抗－ＨＬＡ－ＥおよびＲ４ＩｇＧ１、抗－ＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ抗体を有する腫瘍細胞の染色を例証する。ＩＦＮ－γ処置を行った細胞株ＨＣＴ－１１６およびＡ－５４９中のＨＬＡ－Ｇタンパク質の時間経過発現プロファイルを例証する。細胞可溶化物は調整され、１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で実行された。電気泳動の完了後、サンプルはニトロセルロース膜に移され、抗－ＨＬＡ－Ｇ抗体を用いて調べられた。Ｂアクチンタンパク質への抗体は、負荷コントロールとして使用された。ヒト腫瘍組織におけるＨＬＡ－Ｅタンパク質の広範な発現を例証する。ヒト卵巣癌サンプルにおける抗－ＨＬＡ－Ｅ抗体染色を例証する。データは、ＭＥＭ－Ｅ０／２ａｎｔｉ－ＨＬＡ－Ｅ抗体が卵巣腫瘍組織を染色することを示す（ｎ＝４８）。染色されたおよそ９０％の腫瘍サンプルは、ＨＬＡ－Ｅ発現に対して陽性であり、６０％の腫瘍が中～高程度のＨＬＡ－Ｅタンパク質発現を示した。ヒト大腸癌組織（ｎ＝４８）中のＨＬＡ－Ｅ発現を例証する。ヒト大腸腫瘍の９０％以上は、抗－ＨＬＡ－Ｅ抗体であるＭＥＭ－Ｅ０／２で陽性染色を示した。さらに、およそ６５％の腫瘍は、中～高程度のＨＬＡ－Ｅタンパク質発現を有した。図２５Ａ－図２５Ｂは、ヒト癌におけるＨＬＡ－Ｅタンパク質を検出するための、ＭＥＭ－Ｅ／０２抗体を用いた代表的な染色パターンを例証する。ヒト乳腺腫瘍におけるＨＬＡ－Ｅタンパク質の膜染色を例証する。図２５Ａ－図２５Ｂは、ヒト癌におけるＨＬＡ－Ｅタンパク質を検出するための、ＭＥＭ－Ｅ／０２抗体を用いた代表的な染色パターンを例証する。ヒト乳癌組織の膜上および細胞質内のＨＬＡ－Ｅタンパク質の検出を例証する。ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド標的を活用し、破壊および除去のために免疫系を腫瘍に向け直すためのストラテジーの模式図を例証する。図２７Ａ－図２７Ｆは、ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体が、腫瘍学の用途のための新しいドラッガブル（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）標的であることを例証する。標的腫瘍細胞破壊のためのＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体を標的とするために使用される代表的な二重特異性抗体Ｔ細胞エンゲージャー（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｙＴｃｅｌｌｅｎｇａｇｅｒ）（ＢｉＴＥ）形式を例証する。ＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬペプチド複合体を認識するＲ４抗体は、ＶＨリンカーＶＬｓｃＦｖ分子としてクローニングされ、および（ＧＧＧＳ）４リンカー（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）を介してＯＫＴ３からのＶＬ－ＶＨｓｃＦｖ、抗ヒトＣＤ３抗体に共有結合的に連結された。ＢｉＴＥのＣ末端端部は、下流精製および検出のための６－ｈｉｓタグ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）を含んでいた。図２７Ａは、出現順に、ＳＥＱＩＤＮＯＳ６１－６２、６１、および１２をそれぞれ開示する。図２７Ａ－図２７Ｆは、ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体が、腫瘍学の用途のための新しいドラッガブル（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）標的であることを例証する。ＮｉＮＴＡクロマトグラフィー濃縮ＢｉＴＥ８６－２のクーマシーブルー染色およびクロマトグラフィーおよびウエスタンブロット分析を例証する。図２７Ａ－図２７Ｆは、ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体が、腫瘍学の用途のための新しいドラッガブル（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）標的であることを例証する。Ｔリンパ球における精製された８６－２ＢｉＴＥ染色ＣＤ３マーカーおよび右の青いピークへとシフトする赤いピークによって示されるＣｏｌｏ２０５癌細胞におけるＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ標的を例証する。図２７Ａ－図２７Ｆは、ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体が、腫瘍学の用途のための新しいドラッガブル（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）標的であることを例証する。ジャーカットＴ細胞およびＣＯＬＯ２０５腫瘍細胞を培養するための、ＢｉＴＥ８６－２のＴ細胞添加のＩＬ－２生成を例証する。ＢｉＴＥ８６－２の不在下では、ＩＬ－２サイトカインはほとんど検出されない。ウェルを培養するためのＢｉＴＥの添加後に、機能的ＢｉＴＥ分子は、ジャーカット細胞によってＩＬ－２の活性化および生成を誘発するジャーカット細胞上のＣＤ３および腫瘍細胞上のＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬペプチドに結合する。図２７Ａ－図２７Ｆは、ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体が、腫瘍学の用途のための新しいドラッガブル（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）標的であることを例証する。ＰＢＭＣ＋ＢｉＴＥ８６－２は、コントロール群（ＢｉＴＥ分子なしで７．４１％）の腫瘍細胞傷害性と比較して、ＣＯＬＯ２０５腫瘍細胞死滅（２０．２％）を媒介する。図２７Ａ－図２７Ｆは、ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体が、腫瘍学の用途のための新しいドラッガブル（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）標的であることを例証する。ＢｉＴＥ８６－２分子で処置されたＮＣＩＨ－１５６３肺癌細胞の用量依存性の向け直されたＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性（減少した生存率）を例証する。

ある実施形態では、非古典的ＨＬＡ－Ｉおよびネオ抗原を含む複合体に選択的に結合する抗体が本明細書に開示される。ある実施形態では、非古典的ＨＬＡ－Ｉおよびネオ抗原を含む複合体に選択的に結合する抗体を投与することによって、癌を処置する方法がさらに本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、非古典的ＨＬＡ－Ｉおよびネオ抗原を含む複合体に選択的に結合する抗体は、癌細胞に対する免疫反応を調節し、それによって癌を処置する。

癌を処置するための従来の方法は手術、放射線、化学療法、およびホルモン療法を含む。しかし、そのような治療は、それら自体では効果的であると証明されていない。癌を治療および／または予防するための代替的療法の開発は非常に重要である。より最近では、抗体およびＴリンパ球を利用する免疫療法ならびに遺伝子治療方法が、癌を処置するための新しく有望な方法として出現している。

ヒト中のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と呼ばれる主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子は、身体の疾病の認識ならびに癌および侵入抗原に対する結果としてもたらされる免疫反応において重大な役割を果たす。ＨＬＡ遺伝子ファミリーは２つのサブグループ（すなわち、ＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ－Ｉ）およびＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ－ＩＩ））に分けられ、ＨＬＡ－Ｉは、古典的ＨＬＡ－Ｉおよび非古典的ＨＬＡ－Ｉへとさらに分けられる。各ＨＬＡ分子は、細胞内部からの１つのペプチドを有する複合体を形成する。癌細胞において、これらの細胞を認識し殺すための免疫系を可能にする一部のペプチド／ＨＬＡ複合体がユニークに示される。これら固有のペプチド／ＨＬＡ複合体で装飾された細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によって認識され殺される。癌細胞は、古典的ＨＬＡ－Ｉ発現でダウンレギュレーションを示すが、非古典的ＨＬＡ－Ｉ発現（例えばＨＬＡ－Ｅ）ではアップレギュレーションを示す。したがって、癌細胞においてアップレギュレートされたユニークに提示された非古典的ＨＬＡ－Ｉ－ペプチド複合体は、癌の処置の革新的な免疫療法を開発するための新しい標的である。

＜特定の用語＞
別段の定めのない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、主張される主題が属する当該技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。前述の一般的な記載および以下の詳細な記載が典型的かつ説明的なものに過ぎず、いかなる本願の主題を限定するものではないことが理解されよう。本明細書に使用される段落の見出しは、組織化するためのものに過ぎず、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。

本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明白に示さない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば、「抗体」への言及は複数の抗体を含み、および、いくつかの実施形態における「抗体」への言及は、複数の抗体などを含む。

本明細書で使用されるように、すべての数値または数値範囲は、文脈が明白にそうでないことを示さない限り、値のそのような範囲および分数内のあるいはそれを包含する整数全体、もしくは範囲内のあるいは包含する整数を含む。したがって、例えば、９０－１００％の範囲への言及は、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％など、ならびに９１．１％、９１．２％、９１．３％、９１．４％、９１．５％など、９２．１％、９２．２％、９２．３％、９２．４％、９２．５％などを含む。別の例では、１－５，０００倍の範囲への言及は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍など、ならびに、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５倍など、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５倍などを含む。

本明細書で使用されるように、「約」数値は、その数を含み、およびその数の１０％下からその数の１０％上までの範囲を指す。「約」範囲は、その範囲の下限の１０％下からその範囲の上限の１０％上までを指す。

本明細書で使用されるように、用語「ＭＨＣ」は、主要組織適合抗原を指定する遺伝子座位の１セットである主要組織適合複合体を指す。本明細書で使用されるように、用語「ＨＬＡ」は、ヒト中に見られる組織適合抗原であるヒト白血球抗原を指す。本明細書で使用されるように、「ＨＬＡ」は、「ＭＨＣ」のヒト形態であり、それらの用語は交換可能に使用される。

本明細書で使用されるように、「抗体」は、特異性抗原に対する結合特異性を示す糖タンパク質を指す。本明細書の抗体はまた、抗原に結合可能な抗体の「抗原結合部分」または断片を含む。該用語は、限定されないが、所望の生物活性を示す限り、ポリクローナルの、モノクローナルの、単一特異性の、多特異性の（例えば、二重特異性抗体）、天然の、ヒト化の、ヒトの、キメラの、合成の、組み換え体の、変異した、混成の、移植した抗体断片（例えば、全長抗体の一部、一般に、その抗原結合または可変領域、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント）、ならびにインビトロで生成された抗体が挙げられる。該用語はまた、可変重鎖および可変軽鎖が（直接またはペプチドリンカーを介して）一緒に連結されて連続ポリペプチドを形成する、一本鎖抗体（例えば一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖまたはｓｃＦｖ）抗体）を含む。

本明細書で使用されるように、任意の結合剤（例えば、抗体）の文脈における用語「選択的に結合する」は、高親和性などで抗原またはエピトープに特異的に結合し、他の無関係な抗原またはエピトープを有意に結合しない結合剤を指す。

本明細書で使用されるように、用語「ネオ抗原」または「ネオペプチド」は、交換可能に使用され、病気の細胞またはストレスを受けた細胞（例えば、癌細胞）によって発現されるペプチドを指す。

本明細書で使用されるように、用語「免疫原」は、免疫反応を誘発し、被験体に随意に投与され得る部分を指す。

用語「レシピエント」、「個体」、「被験体」、「宿主」、および「患者」は、本明細書で交換可能に使用され、ならびに場合によっては、診断、処置、または治療が望まれる任意の哺乳動物の被験体、特にヒトを指す。これらの用語のいずれも、医療関係者の監督を必要としない。

本明細書で使用されるように、用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などは、場合によっては、効果を得る目的で薬剤を投与するか、または処置を行なうことを指す。効果は疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防するという点で予防的であり、および／または疾患ならびに／あるいはその疾患の症状の部分的なもしくは完全な治癒をもたらすという点で治療的であり得る。本明細書で使用されるように、「処置」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾病または疾患（例えば、癌）の処置を含む場合もあり：（ａ）疾患にかかりやすい素因を有し得るが、まだ疾患を患っていると診断されていない被験体において発症する疾患または疾患の症状の予防（例えば、原疾患に関連するか、または原疾患によって引き起こされ得る疾患を含む）；（ｂ）疾患を阻害すること、つまり、その発達を妨げること；および、（ｃ）疾患を軽減すること、つまり、その疾患の退行を引き起こすことを含む。治療は、癌の処置または回復あるいは予防の成功の任意の兆候を指すことができ、軽減；寛解；症状を減少するか、または病状を患者にとってより許容できるようにすること；変性または衰弱の速度を遅らせること；または、変性の最終ポイントを衰弱させにくくすることなどの、任意の客観的なパラメーターまたは主観的なパラメーターを含む。症状の処置あるいは改善は、１以上の客観的または主観的なパラメーターに基づき；医師による診察の結果を含む。従って、用語「処置する」は、疾病（例えば、癌）に関連する症状または状態の発達を軽減し、予防しあるいは遅れさせ、もしくは、妨げ、または阻害するために、本発明の化合物または薬剤の患者への投与を含む。用語「治療効果」は、被験体における疾病、疾病の症状、または疾患の副作用の減少、除去、または予防を指す。

＜主要組織適合複合体（ＭＨＣ）またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）＞
ヒトにおけるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも呼ばれる、主組織適合複合体（ＭＨＣ）は、細胞の健康状態への洞察を提供することによってチップを走査するプロテオミクスとして機能する有核細胞の表面上に発現される糖タンパク質である。それらは、正常な宿主細胞蛋白質、癌細胞、炎症性の細胞および細菌性、ウイルス性および寄生虫感染細胞からペプチドを連続的にサンプリングし、ならびに、Ｔリンパ球による認識のための細胞の表面上の短鎖ペプチドを提示する。提示されたペプチドはまた、フレーム外のタンパク質またはイントロンに埋め込まれた配列、あるいは翻訳が従来のメチオニンコドンである、ＡＴＧ以外のコドンで開始されるタンパク質に由来することもある。

マウスおよびヒトにおけるＭＨＣの２つのクラス、すなわち、ＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩが存在する。ＭＨＣＩは、古典的および非古典的ＭＨＣＩサブグループを含む。

＜古典的主組織適合複合体Ｉ（ＭＨＣＩ）またはＨＬＡ－Ｉ＞
古典的ＭＨＣＩ分子は、ヒトにおけるＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃを、ならびにマウスにおけるＨ－２－Ｋ、Ｈ－２－Ｄ、Ｈ－２－ＢおよびＨ－２－Ｌを含む。古典的ＭＨＣＩ分子は、ＨＬＡ－Ａの２，７３５対立遺伝子、ＨＬＡ－Ｂの３，４５５の対立遺伝子およびＨＬＡ－Ｃの２，２５９の対立遺伝子を超える非常に多形である。古典的ＭＨＣＩは、すべての有核細胞の表面上で発現され、ＣＤ８Ｔリンパ球にペプチドを提示する。細胞機構中のタンパク質の３０％は急速に分解され、古典的ＭＨＣＩ抗原提示のための主要な基質である。

ペプチドが古典的ＭＨＣＩ分子によって提示されるために、タンパク質は、プロテアソームで始まる従来の処理経路（ユビキチン・プロテアソーム・システム）を介して最初に処理される。分解産物（２～２５アミノ酸残基長さ）が、細胞質ゾルに放出される。次に、選択された細胞質ゾルのペプチドは、トランスポーター関連タンパク質（ＴＡＰ）複合体を介して小胞体に輸送される。ＴＡＰは、ヘテロ二量体サブユニットであるＴＡＰ１およびＴＡＰ２からなり、およびその両方がタパシンと呼ばれる膜貫通型アダプターシャペロン糖タンパク質に結合する。該小胞体中の小胞体アミノペプチダーゼ（ＥＲＡＡＰ）は、ＴＡＰによって送達されたアミノ末端で拡張される前駆体を整えて、古典的ＭＨＣＩ分子上に負荷する全長８－１０アミノ酸のペプチドを生成する。したがって、従来の処理経路は、プロテアソーム中のタンパク質分解および小胞体（ＥＲ）へのペプチドのＴＡＰ依存性輸送で開始し、ならびにＨＬＡペプチド結合ポケットへのペプチドの負荷で終了する（図１）。従来の処理経路に寄与するタンパク質は、集合的に抗原処理機構（ＡＰＭ）として知られており、プロテアソーム、トランスポーター関連タンパク質（ＴＡＰ）複合体、タパシン、小胞体アミノペプチダーゼ（ＥＲＡＡＰ）、結合免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ）、カルネキシンおよびカルレティキュリンを含む。プロテアソームサブユニット、ＴＡＰ１／２、ＥｒＰ５７、またはカルレティキュリンのいずれかを欠く細胞は、その表面上の古典的ＭＨＣＩ分子の数を減少させる。

＜非古典的ＭＨＣＩまたはＨＬＡ－Ｉ＞
非古典的ＭＨＣＩ分子は、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－ＦおよびＨＬＡ－Ｇを含み、多型を制限している。それらは、自然免疫反応および適応免疫反応を調整する役割を果たす。非古典的ＭＨＣＩ分子は、健康状態および疾患状態で従来の処理経路および代替的処理経路の両方によって生成されるペプチドを提示し、疾患状態（例えば癌）で標的とするためのマーカーの新しいセットを表わす。

＜ＨＬＡ－Ｅ＞
非古典的ＭＨＣクラスＩ分子であるＨＬＡ－Ｅは、非多形である。自然界で、１３ＨＬＡ－Ｅ対立遺伝子は、２つの機能的な変異体、すなわちＨＬＡＥ^＊０１０１、ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３のみで同定されている。ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１（ＨＬＡ－^{Ｅ１０７Ｒ}）と^＊０１０３（ＨＬＡ－^{Ｅ１０７Ｇ}）との差異は、ペプチド結合ポケットの外側にある位置１０７での単一のアミノ酸の違いである。古典的ＭＨＣＩ分子と同様に、ＨＬＡ－Ｅは、核を有するすべての細胞中で発現するが、通常は低いレベルである。細胞中および組織中のＨＬＡ－Ｅ分子発現は、一般にストレスおよび疾病の間に増加する。

正常細胞において、ＨＬＡ－Ｅは、古典的ＭＨＣ分子および非古典的ＨＬＡ－Ｇ分子に由来するペプチドを提供し、ＮＫ細胞および受容体ＣＤ９４／ＮＫＧ２への関与を通じてＣＤ８Ｔ細胞のサブセットの活性を阻害または刺激する（図２）。ＨＬＡ－Ｅによって提示された特定のペプチドに応じて、ＨＬＡ－Ｅ複合体は、それぞれＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡまたはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃのいずれかに関与し、ＮＫ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞のサブセットを阻害または活性化する。

古典的ＭＨＣＩ分子に由来するペプチドは、全長タンパク質からシグナルペプチドを切断するシグナルペプチターゼで開始する５ステップのプロセスで生成される（図３）。遊離したシグナルペプチドは、追加のトリミングのためにプロテアソームに輸送される前に、特定のシグナルペプチドペプチダーゼによってさらに整えられる。工程４では、通常ナノマー（ｎａｎｏｍｅｒ）であるペプチドは、ＴＡＰ１およびＴＡＰ２によって小胞体の管腔に輸送され、ここで、首尾よく輸送されたシグナルペプチドは、ＥＲの管腔内の定義されたシャペロンのセットによってＨＬＡ－Ｅに負荷される。古典的ＨＬＡに由来するＨＬＡ－Ｅペプチド結合剤の一例は、ＨＬＡ－Ｃｗ^＊０２（ＶＭＡＰＲＴＬＬＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５））である。ペプチド立体構造の微細な変化は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＮＫ細胞受容体によるＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体の認識に影響する。

正常細胞では、ＨＬＡ－Ｅは通常９－１１アミノ酸長さであるペプチドを結合し、高度の疎水性を示す。通常、ペプチド配列内に２つまたは３つのアンカー残基を有する古典的ＭＨＣＩ分子に結合するペプチドとは異なり、非古典的ＨＬＡ－Ｅは、５つのアンカー位置、すなわちｐ２、３、６、７、および９を介する相互作用によりペプチドを結合する（図４）。ＨＬＡ－Ｅに結合するペプチド複合体は、結合ポケットから突出するＰ５およびＰ８でのアミノ酸を示す。さらに、ペプチドのより多くの残基はアンカーペプチドであり、ペプチド結合を伴うＨＬＡ－Ｅの結合ポケットは、小さく非常に特異的結合分子によって標的とされ得るいくつかの深いポケットを有する。対照的に、２つの突出するアミノ酸（ｐ５およびｐ８）は、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセットの両方のＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体と相互作用する。ペプチドのさらなる例としては、ＶＭＡＰＲＴＬＩＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）、ＨＬＡ－Ｃｘ０３およびＶＭＰＰＲＴＬＬＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）からのペプチド、ＨＬＡ－Ｂ^＊８００１からのペプチドが挙げられる。

古典的ＨＬＡ－Ｉ分子から生成されるシグナルペプチドに共通の特徴を有する他のシグナルペプチドは、非古典的ＨＬＡ－Ｇから生成されるシグナルペプチドである。正常な生理的条件下でのＨＬＡ－Ｇ発現は厳しく規制され、発現の制限が体内の比較的少ない組織および細胞中で見られる。ＨＬＡ－Ｇは免疫寛容分子としての重要な役割を果たし、その発現は癌の組織／細胞中で観察される。さらに、ＨＬＡ－Ｇからのシグナルペプチドは従来の抗原処理経路によって処理され、ペプチドトランスポーターＴＡＰによって小胞体に送達される。いくつかの例では、シグナルペプチドはＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）である。

＜癌細胞におけるＨＬＡ－Ｅ発現およびペプチド提示＞

抗原処理機構（ＡＰＭ）の１以上の要素（例えば、プロテアソーム、タパシン、またはＴＡＰ）が欠損している細胞は、ＡＰＭ依存の従来の処理経路とは独立した代替的処理経路を介してペプチドをＭＨＣクラスＩ分子に負荷する。ＡＰＭ欠損細胞は、その表面上の古典的ＭＨＣＩ分子の数を減少させるだけでなく、提示されたペプチドのレパートリーの増加と同様にＨＬＡ－Ｅ分子の細胞表面密度の増加を示す。代替的処理経路は常時活性化され、正常な細胞および異常な細胞の両方においてペプチドを生成する。しかしながら、これらのペプチドは正常細胞によって提示されず；代わりに、それらは病的な細胞またはストレスを受けた細胞においてのみ提示される。したがって、「障害性ペプチド処理に関連するＴ細胞エピトープ」（ＴＥＩＰＰ）としても知られるＡＰＭ欠損細胞によって生成される様々なペプチドレパートリーは、癌細胞に固有の新しい標的を表わし、癌の処置における治療法の開発のための理想的な標的を表わす。

ＨＬＡ－Ｅは、細胞ストレス、つまり感染または癌の間にＴＥＩＰＰを提示する（表１）。これらのＨＬＡ－Ｅ結合ペプチドのいくつかは、ＨＬＡ－Ａ^＊０２０１およびＨＬＡ－Ｃｗ２結合モチーフを有すると確認される。ＨＬＡ－Ｅにさらに結合する４つのＨＬＡ－Ａ^＊０２０１ペプチド結合剤は、ＥＢＶＬＭＰ１ペプチドＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５）、ＨＰＶペプチドＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）、宿主タンパク質ＲＮＡヘリカーゼｐ６８ペプチドＹＬＬＰＡＩＶＨＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）、および古典的腫瘍抗原ペプチドＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）を含む。

＜ＭＨＣＩＩまたはＨＬＡ－ＩＩ＞
ヒトにおけるＭＨＣＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＲを含み、およびマウスにおけるＭＨＣＩＩ分子は、Ｈ－２Ｉ－ＡおよびＨ－２Ｉ－Ｅを含む。ＭＨＣＩＩ発現は、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、活性化Ｔ細胞、および胸腺上皮細胞に制限され、ＭＨＣＩＩ分子はＣＤ４リンパ球にペプチドを提示する。

＜ＨＬＡ－Ｅ／癌ペプチドを標的とする抗体＞
ＭＨＣ／ペプチド複合体を標的とするために使用される現在のアプローチおよび技術は、限定されないが、以下のものを含むいくつかの制限を有する：（１）既に前臨床および臨床開発にあるＭＨＣ／ペプチド標的に対するモノクローナル薬剤は、多くの癌においてダウンレギュレートされることが示されている古典的ＭＨＣクラスＩ分子に特異的であり、（２）古典的ＭＨＣＩ分子は、これらの標的化剤の集団適用範囲を制限する非常に多形であり、（３）腫瘍細胞株および直説法を使用して予め同定された大半のペプチドは、来の抗原処理経路に由来するペプチドを明らかにし；たとえ多くの腫瘍細胞がＡＰＭ要素に欠損があることが知られていても、（４）正しい抗原を選ぶことは困難であり、（５）以前報告された古典的ＭＨＣ／ペプチド標的の低いコピー数の発現は、効果的な治療法を開発するための技術的障害を潜在的に作り出し、（６）従来の抗体およびＴＣＲ分子の大きなかさばったサイズは、より容易でより費用対効果の高い生産のための、非常に可溶性で安定した分子である単一ドメイン結合剤などの非常に小さくそれほどかさばらない分子によって認識され得る、隠されている有用なエピトープの同定を妨害し、ならびに（７）第一世代抗ＭＨＣ／ペプチド薬剤は単一のＭＨＣ／ペプチド複合体を標的とし、腫瘍エスケープを生じやすくする。理想的な標的の同定は、ペプチド存在量、提示、癌細胞対正常細胞への特異性、および腫瘍細胞における発現の不均一性を考慮する必要がある。

ラクダ科動物の単一ドメイン抗体は、ラクダ、ラマ、およびアルパカに由来し、重鎖抗体または一般的なＩｇＧの１つの可変ドメイン（ＶＨ）を含むおよそ１１０のアミノ酸で構成される。ラクダ科動物の抗体は、小さく～１２ＫＤであり、高親和性で結合する傾向があるＶＨＨまたは単一ドメイン抗体を含む。さらに、これらの抗体は、良好な可溶性および安定性を有しており、容易にヒト化される。ラクダ科動物由来の単一ドメイン抗体は、全体の抗体、例えば、酵素の活性部位にアクセス可能でない潜伏抗原に結合することができる。ＶＨＨ抗体は、従来の抗体でよく見られるより凹面のパラトープとは対照的な突出または凸面のパラトープを有する。ラマからのＶ_ＨＨ抗体の凸面状の性質およびその小さいサイズは、狭い溝および深いポケットを認識することができる有用な結合剤をもたらす。ペプチドを有するＨＬＡ－Ｅペプチド結合ポケットは、その小さいサイズおよび突出したパラトープゆえにＶ_ＨＨ抗体が認識するのに適している小さな深い溝をポケットに有する。さらに、低分子質量は組織におけるより良い透過性につながり、これらの抗体分子の腫瘍への浸透性を場合によってはより良くする。さらに、その小さいサイズは、多特異性および多価性分子として非常に助けになる。

ある実施形態では、非古典的ＨＬＡ－Ｉおよびネオ抗原を含む複合体を標的とする組成物、およびその使用の方法が本明細書に開示される。いくつかの例では、組成物は抗体を含む。いくつかの例では、抗体は、マウスおよび人間のライブラリーからのｓｃＦｖｓである。いくつかの例では、抗体は、免疫化されたラマに由来する単一ドメイン抗体である。

ある実施形態では、非古典的ＨＬＡ－Ｉおよびペプチドを含む複合体に選択的に結合する抗体が本明細書に開示される。いくつかの例では、抗体は、非古典的ＨＬＡ－Ｉのみに対して結合親和性を有していない。いくつかの例では、抗体は、ペプチドのみ対して結合親和性を有していない。いくつかの例では、抗体は、非古典的ＨＬＡ－Ｉおよび非関連ペプチドを含む複合体に対して結合親和性を有していない。

いくつかの例では、ペプチドは、抗原処理機構（ＡＰＭ）能力のある細胞によって発現される。いくつかの例では、ペプチドは、ＴＡＰ１／２能力のある細胞によって発現される。いくつかの例では、ペプチドは、抗原処理機構（ＡＰＭ）欠損細胞によって発現される。いくつかの例では、ペプチドは、ＴＡＰ１／２欠損細胞によって発現される。

いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３（ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３（ＶＭＡＰＲＴＬＩＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４（ＶＭＰＰＲＴＬＬＬ）、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３１（ＶＭＡＰＲＴＬＶＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。

いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２（ＳＬＬＥＫＳＬＧＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２（ＱＭＲＰＶＳＲＶＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３（ＷＩＡＡＶＴＩＡＡ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４（ＴＳＤＭＰＧＴＴＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５（ＭＬＡＬＬＴＱＶＡ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６（ＱＭＦＥＧＰＬＡＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３７（ＶＬＷＤＲＴＦＳＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３８（ＴＬＦＦＱＱＮＡＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１（ＧＬＡＤＫＶＹＦＬ）、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２（ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。

いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．３（ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．１３（ＶＭＡＰＲＴＬＩＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．１４（ＶＭＰＰＲＴＬＬＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．３１（ＶＭＡＰＲＴＬＶＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．１９（ＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．２０（ＡＩＳＰＲＴＬＮＡ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．２１（ＳＱＡＰＬＰＣＶＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．１５（ＹＬＬＥＭＬＷＲＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．１６（ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．２２（ＱＭＲＰＶＳＲＶＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．２３（ＡＬＡＬＶＲＭＬＩ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．２４（ＳＱＱＰＹＬＱＬＱ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．２５（ＡＭＡＰＩＫＴＨＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．２６（ＡＭＡＰＩＫＶＲＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．１７（ＹＬＬＰＡＩＶＨＩ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．２７（ＩＬＤＱＫＩＮＥＶ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．２８（ＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．２９（ＫＶＬＥＹＶＩＫＶ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．１８（ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．３０（ＹＬＥＰＧＰＶＴＶ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．３２（ＳＬＬＥＫＳＬＧＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．２２（ＱＭＲＰＶＳＲＶＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．３３（ＷＩＡＡＶＴＩＡＡ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．３４（ＴＳＤＭＰＧＴＴＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．３５（ＭＬＡＬＬＴＱＶＡ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．３６（ＱＭＦＥＧＰＬＡＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．３７（ＶＬＷＤＲＴＦＳＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．３８（ＴＬＦＦＱＱＮＡＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．１（ＧＬＡＤＫＶＹＦＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ．２（ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。

いくつかの例では、非古典的ＨＬＡ－Ｉは、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、またはＨＬＡ－Ｈである。いくつかの例では、非古典的ＨＬＡ－ＩはＨＬＡ－Ｅである。いくつかの場合では、ＨＬＡ－ＥはＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１である。いくつかの場合では、ＨＬＡ－ＥはＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３である。

いくつかの例では、抗体は、ＨＬＡ－Ｅおよびペプチドを含む複合体に選択的に結合する。いくつかの例では、抗体は、ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびペプチドを含む複合体に選択的に結合する。いくつかの例では、抗体は、ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３およびペプチドを含む複合体に選択的に結合する。いくつかの例では、抗体は、ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびペプチドを含む複合体、ならびにＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３およびペプチドを含む複合体に選択的に結合する。

いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）、ＨＬＡ－ＥおよびＶＭＡＰＲＴＬＩＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）、ＨＬＡ－ＥおよびＶＭＰＰＲＴＬＬＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）、またはＨＬＡ－ＥおよびＶＭＡＰＲＴＬＶＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１）を含む。

いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＳＬＬＥＫＳＬＧＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３２）、ＨＬＡ－ＥおよびＱＭＲＰＶＳＲＶＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２）、ＨＬＡ－ＥおよびＷＩＡＡＶＴＩＡＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）、ＨＬＡ－ＥおよびＴＳＤＭＰＧＴＴＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３４）、ＨＬＡ－ＥおよびＭＬＡＬＬＴＱＶＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３５）、ＨＬＡ－ＥおよびＱＭＦＥＧＰＬＡＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３６）、ＨＬＡ－ＥおよびＶＬＷＤＲＴＦＳＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３７）、ＨＬＡ－ＥおよびＴＬＦＦＱＱＮＡＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３８）、ＨＬＡ－ＥおよびＧＬＡＤＫＶＹＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、またはＨＬＡ－ＥおよびＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を含む。

いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ．３）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＶＭＡＰＲＴＬＩＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ．１３）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＶＭＰＰＲＴＬＬＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ．１４）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＶＭＡＰＲＴＬＶＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ．３１）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ．１９）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＡＩＳＰＲＴＬＮＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ．２０）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＳＱＡＰＬＰＣＶＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ．２１）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ．１５）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ．１６）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＱＭＲＰＶＳＲＶＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ．２２）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＡＬＡＬＶＲＭＬＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ．２３）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＳＱＱＰＹＬＱＬＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ．２４）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＡＭＡＰＩＫＴＨＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ．２５）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＡＭＡＰＩＫＶＲＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ．２６）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＹＬＬＰＡＩＶＨＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ．１７）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＩＬＤＱＫＩＮＥＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ．２７）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ．２８）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＫＶＬＥＹＶＩＫＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ．２９）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＳＬＬＭＷＩＴＱＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ．１８）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＹＬＥＰＧＰＶＴＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ．３０）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＳＬＬＥＫＳＬＧＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ．３２）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＱＭＲＰＶＳＲＶＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ．２２）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＷＩＡＡＶＴＩＡＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ．３３）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＴＳＤＭＰＧＴＴＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ．３４）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＭＬＡＬＬＴＱＶＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ．３５）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＱＭＦＥＧＰＬＡＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ．３６）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＶＬＷＤＲＴＦＳＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ．３７）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＴＬＦＦＱＱＮＡＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ．３８）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＧＬＡＤＫＶＹＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ．１）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ．２）を含む。

いくつかの例では、抗体はマウス抗体である。いくつかの例では、抗体はキメラ抗体である。いくつかの例では、抗体はラクダ科抗体である。いくつかの例では、抗体はヒト化抗体である。いくつかの例では、抗体はヒト抗体である。いくつかの例では、抗体はＴＣＲ様抗体である。いくつかの例では、抗体は単一ドメイン抗体である。いくつかの例では、単一ドメイン抗体はラクダ科単一ドメイン抗体である。いくつかの例では、抗体は多重特異性抗体である。いくつかの例では、抗体は多機能性抗体である。

いくつかの例では、抗体は、複合治療部分をさらに含む。いくつかの例では、非古典的ＨＬＡ－Ｉおよびペプチドを含む複合体への抗体の選択的な結合は免疫反応を誘発する。いくつかの例では、免疫反応はＴ細胞の活性化を含む。いくつかの例では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの例では、免疫反応は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性化を含む。

いくつかの例では、細胞は癌細胞である。いくつかの例では、癌細胞は乳癌細胞である。いくつかの例では、癌細胞は腎臓癌細胞である。いくつかの例では、癌細胞は肺癌細胞である。いくつかの例では、癌細胞は卵巣癌細胞である。いくつかの例では、癌細胞は大腸癌細胞である。いくつかの例では、癌細胞はＢ細胞悪性腫瘍癌細胞である。

＜処置の方法＞
いくつかの実施形態では、個体の癌を治療する方法が本明細書に開示され、該方法は、非古典的ＨＬＡ－Ｉおよびネオ抗原を含む複合体に選択的に結合する抗体を個体に投与することを含む。いくつかの例では、抗体は、非古典的ＨＬＡ－Ｉのみに対して結合親和性を有していない。いくつかの例では、抗体は、ネオ抗原のみに対して結合親和性を有していない。いくつかの例では、抗体は、非古典的ＨＬＡ－Ｉおよび非関連ネオ抗原を含む複合体に対して結合親和性を有していない。

いくつかの例では、ネオ抗原は、抗原処理機構（ＡＰＭ）能力のある細胞によって発現される。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＴＡＰ１／２能力のある細胞によって発現される。いくつかの例では、ネオ抗原は、抗原処理機構（ＡＰＭ）欠損細胞によって発現される。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＴＡＰ１／２欠損細胞によって発現される。

いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３（ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３（ＶＭＡＰＲＴＬＩＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４（ＶＭＰＰＲＴＬＬＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１（ＶＭＡＰＲＴＬＶＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９（ＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０（ＡＩＳＰＲＴＬＮＡ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１（ＳＱＡＰＬＰＣＶＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５（ＹＬＬＥＭＬＷＲＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６（ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２（ＱＭＲＰＶＳＲＶＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３（ＡＬＡＬＶＲＭＬＩ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４（ＳＱＱＰＹＬＱＬＱ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５（ＡＭＡＰＩＫＴＨＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６（ＡＭＡＰＩＫＶＲＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７（ＹＬＬＰＡＩＶＨＩ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７（ＩＬＤＱＫＩＮＥＶ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８（ＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９（ＫＶＬＥＹＶＩＫＶ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８（ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０（ＹＬＥＰＧＰＶＴＶ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２（ＳＬＬＥＫＳＬＧＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２（ＱＭＲＰＶＳＲＶＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３（ＷＩＡＡＶＴＩＡＡ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４（ＴＳＤＭＰＧＴＴＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５（ＭＬＡＬＬＴＱＶＡ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６（ＱＭＦＥＧＰＬＡＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３７（ＶＬＷＤＲＴＦＳＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３８（ＴＬＦＦＱＱＮＡＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１（ＧＬＡＤＫＶＹＦＬ）、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２（ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。

いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３（ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３（ＶＭＡＰＲＴＬＩＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４（ＶＭＰＰＲＴＬＬＬ）、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３１（ＶＭＡＰＲＴＬＶＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。

いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２（ＳＬＬＥＫＳＬＧＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２（ＱＭＲＰＶＳＲＶＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３（ＷＩＡＡＶＴＩＡＡ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４（ＴＳＤＭＰＧＴＴＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５（ＭＬＡＬＬＴＱＶＡ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６（ＱＭＦＥＧＰＬＡＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３７（ＶＬＷＤＲＴＦＳＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３８（ＴＬＦＦＱＱＮＡＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１（ＧＬＡＤＫＶＹＦＬ）、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２（ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。

いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３（ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１３（ＶＭＡＰＲＴＬＩＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１４（ＶＭＰＰＲＴＬＬＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３１（ＶＭＡＰＲＴＬＶＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１９（ＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．２０（ＡＩＳＰＲＴＬＮＡ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．２１（ＳＱＡＰＬＰＣＶＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１５（ＹＬＬＥＭＬＷＲＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１６（ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．２２（ＱＭＲＰＶＳＲＶＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．２３（ＡＬＡＬＶＲＭＬＩ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．２４（ＳＱＱＰＹＬＱＬＱ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．２５（ＡＭＡＰＩＫＴＨＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．２６（ＡＭＡＰＩＫＶＲＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１７（ＹＬＬＰＡＩＶＨＩ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．２７（ＩＬＤＱＫＩＮＥＶ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．２８（ＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．２９（ＫＶＬＥＹＶＩＫＶ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１８（ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３０（ＹＬＥＰＧＰＶＴＶ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３２（ＳＬＬＥＫＳＬＧＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．２２（ＱＭＲＰＶＳＲＶＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３３（ＷＩＡＡＶＴＩＡＡ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３４（ＴＳＤＭＰＧＴＴＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３５（ＭＬＡＬＬＴＱＶＡ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３６（ＱＭＦＥＧＰＬＡＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３７（ＶＬＷＤＲＴＦＳＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３８（ＴＬＦＦＱＱＮＡＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１（ＧＬＡＤＫＶＹＦＬ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。いくつかの例では、ネオ抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．２（ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ）の配列を含むか、この配列から本質的なるか、あるいはなる。

いくつかの例では、抗体は、ＨＬＡ－Ｅおよびネオ抗原を含む複合体に選択的に結合する。いくつかの例では、抗体は、ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびネオ抗原を含む複合体に選択的に結合する。いくつかの例では、抗体は、ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３およびネオ抗原を含む複合体に選択的に結合する。いくつかの例では、抗体は、ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびネオ抗原を含む複合体、ならびにＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３およびネオ抗原の複合体に選択的に結合する。

いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）、ＨＬＡ－ＥおよびＶＭＡＰＲＴＬＩＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）、ＨＬＡ－ＥおよびＶＭＰＰＲＴＬＬＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）、またはＨＬＡ－ＥおよびＶＭＡＰＲＴＬＶＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１）を含む。いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＳＬＬＥＫＳＬＧＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３２）、ＨＬＡ－ＥおよびＱＭＲＰＶＳＲＶＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２）、ＨＬＡ－ＥおよびＷＩＡＡＶＴＩＡＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）、ＨＬＡ－ＥおよびＴＳＤＭＰＧＴＴＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３４）、ＨＬＡ－ＥおよびＭＬＡＬＬＴＱＶＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３５）、ＨＬＡ－ＥおよびＱＭＦＥＧＰＬＡＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３６）、ＨＬＡ－ＥおよびＶＬＷＤＲＴＦＳＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３７）、ＨＬＡ－ＥおよびＴＬＦＦＱＱＮＡＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３８）、ＨＬＡ－ＥおよびＧＬＡＤＫＶＹＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、またはＨＬＡ－ＥおよびＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）である。

いくつかの例では、抗体は、複合治療部分をさらに含む。いくつかの例では、非古典的ＨＬＡ－Ｉおよびネオ抗原を含む複合体への抗体の選択的な結合は、免疫反応を誘発する。いくつかの例では、免疫反応はＴ細胞の活性化を含む。いくつかの例では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの例では、免疫反応は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性化を含む。

いくつかの例では、抗体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１４、１５、２８、３０日間、またはそれ以上連続的に投与される。いくつかの例では、抗体は、予め決められた時間間隔で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１４、１５、２８、３０日間、またはそれ以上投与される。いくつかの例では、抗体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１４、１５、２８、３０日間、またはそれ以上、断続的に投与される。いくつかの例では、抗体は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、またはそれ以上で投与される。いくつかの例では、抗体は、治療上有効な量で投与される。

いくつかの例では、癌は乳癌である。いくつかの例では、癌は腎臓癌である。いくつかの例では、癌は肺癌である。いくつかの例では、癌は卵巣癌である。いくつかの例では、癌は大腸癌である。いくつかの例では、癌はＢ細胞悪性腫瘍である。

いくつかの実施形態では、個体の癌を処置する方法が本明細書に開示され、該方法は、個ＨＬＡ－Ｅおよびネオ抗原を含む複合体に選択的に結合する抗体を体に投与することを含む。いくつかの例では、抗体は、非古典的ＨＬＡ－Ｉのみに対して結合親和性を有していない。いくつかの例では、抗体は、ネオ抗原のみに対して結合親和性を有していない。いくつかの例では、抗体は、非古典的ＨＬＡ－Ｉおよび非関連ネオ抗原を含む複合体に対して結合親和性を有していない。

いくつかの場合では、ＨＬＡ－ＥはＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１である。いくつかの場合では、ＨＬＡ－ＥはＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３である。いくつかの例では、抗体は、ＨＬＡ－Ｅおよびネオ抗原を含む複合体に選択的に結合する。いくつかの例では、抗体は、ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびネオ抗原を含む複合体に選択的に結合する。いくつかの例では、抗体は、ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３およびネオ抗原を含む複合体に選択的に結合する。いくつかの例では、抗体は、ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびネオ抗原を含む複合体、ならびにＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３およびネオ抗原を含む複合体に選択的に結合する。

いくつかの例では、複合体は、ＨＬＡ－ＥおよびＳＬＬＥＫＳＬＧＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３２）、ＨＬＡ－ＥおよびＱＭＲＰＶＳＲＶＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２）、ＨＬＡ－ＥおよびＷＩＡＡＶＴＩＡＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）、ＨＬＡ－ＥおよびＴＳＤＭＰＧＴＴＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３４）、ＨＬＡ－ＥおよびＭＬＡＬＬＴＱＶＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３５）、ＨＬＡ－ＥおよびＱＭＦＥＧＰＬＡＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３６）、ＨＬＡ－ＥおよびＶＬＷＤＲＴＦＳＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３７）、ＨＬＡ－ＥおよびＴＬＦＦＱＱＮＡＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３８）、ＨＬＡ－ＥおよびＧＬＡＤＫＶＹＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、またはＨＬＡ－ＥおよびＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）である。

＜医薬組成物と製剤＞
非古典的ＨＬＡ－Ｉおよびペプチドを含む複合体に選択的に結合する、本明細書に開示される抗体を含む医薬組成物；ならびに薬学的に許容可能な担体または賦形剤が本明細書でさらに開示される。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物と共に使用するための賦形剤は、マレイン酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、酢酸、炭酸水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、ヒスチジン、グリシン、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化亜鉛、水、デキストロース、Ｎ－メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、および界面活性剤ポリオキシエチレン－ソルビタンモノオレアートを含む。

いくつかの実施形態では、組成物は追加の治療剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、治療剤は化学療法剤である。いくつかの実施形態では、化学療法剤は、とりわけ、細胞毒性薬、抗代謝産物薬剤（例えば、葉酸拮抗剤、プリンアナログ、ピリミジンアナログなど）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、カンプトテシン誘導体、アントラセンジオン、アントラサイクリン、エピポドフィロトキシン、キノリンアルカロイド、など）、抗微小管薬剤（例えば、タキサン、ビンカアルカロイド）、タンパク質合成阻害薬（例えば、セファロタキシン、カンプトテシン誘導体、キノリンアルカロイド）、アルキル化薬（例えば、スルホン酸アルキル、エチレンイミン、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、プラチナ誘導体、トリアゼンなど）、アルカロイド、テルペノイド、およびキナーゼ阻害剤を含む。

いくつかの実施形態では、抗体および治療剤は同じ製剤中にある。いくつかの実施形態では、抗体および治療剤は異なる製剤中にある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体は、別の治療剤の投与に先立って使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体は、別の治療剤の投与と同時に使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体は、別の治療剤の投与後に使用される。

いくつかの実施形態では、医薬製剤は、特定の局所的、局地的、または全身投与、あるいは送達経路に互換性があるように作られる。したがって、医薬製剤は、特定の経路による投与に適した担体、希釈液、または賦形剤を含む。本明細書の組成物の投与の経路の特定の非限定的な例は、例えば、静脈内、動脈内、皮内、筋肉内、皮下、胸膜内、経皮的（局所的）、口腔粘膜内、頭蓋内、髄腔内、眼内、直腸への非経口投与、経口（食事性）投与、粘膜投与、および処置方法または投与プロトコルに適した任意の他の製剤である。

いくつかの実施形態では、の非経口用途に使用される溶液または懸濁液は：注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの無菌の希釈液；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝剤；および、塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度調節のための薬剤を含む。いくつかの実施形態では、ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整される。

注射用の医薬製剤は、無菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および無菌注射用溶液または分散液の即席の準備のための滅菌粉末を含む。静脈内投与のための適切な担体は、生理食塩水、静菌性の水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。いくつかの実施形態では、担体は、溶媒または分散媒、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、またはその適切な混合物である。いくつかの実施形態では、流動度は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合に必要とされる粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持される。抗菌剤および抗真菌剤としては、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールが挙げられる。いくつかの実施形態では、等張剤（例えば、糖）；マンニトールまたはソルビトールなどの多価アルコール；あるいは、塩化ナトリウムが組成物に含まれる。場合によっては、吸収を遅らせる薬剤がさらに含まれ、いくつかの実施形態では、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンが注入可能な組成物の吸収を延長する。

いくつかの実施形態では、無菌注射可能製剤は、上記成分の１つまたは組み合わせと共に必要とされる量の活性組成物を適切な溶媒に組み込むことによって調製される。通常、分散液は、基礎的な分散媒および任意の他の成分を含む滅菌ビヒクルに活性組成物を組み込むことによって調製される。無菌注射用溶液の調製について滅菌粉末の場合には、調製法は、例えば、活性成分の粉末およびその予め調製された溶液から任意の追加の所望の成分をもたらす真空乾燥ならびに凍結乾燥を含む。

経粘膜的または経皮的投与の場合、浸透する障壁に適切な浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は、当技術分野において既知であり、例えば、口腔粘膜投与、洗浄剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体を含む。いくつかの実施形態では、口腔粘膜投与は、鼻内噴霧、吸入装置（例えば、アスピレーター）または坐薬の使用を介して達成される。経皮投与の場合、活性化合物は、軟膏、軟膏、ゲル、クリーム、またはパッチへと製剤化される。

いくつかの実施形態では、医薬製剤は、制御放出製剤またはモノステアリン酸グリセリンまたはステアリン酸グリセリル等の時間遅延物質など、身体からの急速な排出を防ぐ担体と共に調製される。いくつかの実施形態では、製剤はまた、局所的送達、局地的送達または全身送達、あるいは放出制御または徐放を達成するために、植込錠などの製品およびマイクロカプセル化送達システムを使用して送達される。

＜医薬組成物にための治療レジメン＞
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、治療用途のために投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は１日当たり一度、１日当たり２度、１日当たり３度、またはそれ以上投与される。医薬組成物は、毎日、１日おき、週５日、週１日、１週おき、１か月当たり２週、１か月当たり３週、月１回、月２回、１か月当たり３回、またはそれ以上投与される。医薬組成物は、少なくとも１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１８か月、２年、３年、またはそれ以上の間投与される。

患者の状態が改善する場合、医師の裁量により組成物の投与が継続的に行われ；代替的に、投与されている組成物の用量は、一時的に減少されるか、または特定の期間一時的に中断される（つまり、「休薬期間」）。ある場合には、休薬期間の長さは、ほんの一例として、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、１５日、２０日、２８日、３５日、５０日、７０日、１００日、１２０日、１５０日、１８０日、２００日、２５０日、２８０日、３００日、３２０日、３５０日、または３６５日を含む、２日から１年の間で変わる。休薬日中の投与量の減少は、ほんの一例として、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、あるいは１００％を含む、１０％－１００％である。

いったん患者の状態が改善すると、必要に応じて維持量が投与される。その後、いくつかの例において、投与量または投与頻度、あるいはその両方は、症状の関数として、改善された疾病、疾患または状態が保持されるレベルまで減少することができる。

いくつかの実施形態では、そのような量に対応する所与の薬剤の量は、特定の組成、疾患の重症度、処置を必要とする被験体または宿主の同一性（例えば、体重）などの要因に応じて変わるが、それにもかかわらず、例えば、投与される特定の薬剤、投与経路、治療される被験体または宿主を含む、症例を取り巻く特定の状況に従って、当技術分野において既知の様式で慣例的に決定される。いくつかの例では、所望の投与量は一回量で、あるいは、例えば、１日当たり２、３、あるいは４以上の下位用量として、同時に（または短時間にわたって）あるいは適切な間隔を置いて投与される分割量として都合よく提示される。

個々の処置レジメンに関する変数の数が大きいため、前述の範囲は単なる示唆的なものに過ぎず、これらの推奨値からかなり逸脱することは珍しいことではない。そのような投与量は、使用される組成物の活性、処置される疾患または疾病、投与形態、個々の被験体の要件、治療される疾患または疾病の重症度、および専門家の判断に制限されない変数の数に応じて変更される。いくつかの実施形態では、こうした治療レジメンの毒性と治療の有効性は、限定されないが、ＬＤ５０（集団の５０％までの致死投与量）と、ＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な投与量）の決定を含む、細胞培養または実験動物における標準的な製薬手順によって決定される。毒性と治療効果との間の用量比が治療指数であり、これはＬＤ５０とＥＤ５０との間の比率として表される。高い治療指数を示す組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトで使用される一連の投与量を製剤するのに使用される。そのような組成物の投与量は、最小の毒性を有するＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にあるのが好ましい。投与量は、使用された剤形と利用される投与経路に応じてこの範囲内で変わる。

＜抗体を生成する方法＞
いくつかの実施形態では、非古典的ＨＬＡ－Ｉおよびネオ抗原を含む複合体を標的とする組成物およびそのような組成物を生成する方法が本明細書に開示される。いくつかの例では、組成物は抗体を含む。いくつかの例では、抗体はラクダ科動物の抗体である。

いくつかの実施形態では、非古典的ＨＬＡ－Ｉおよびペプチドを含む複合体に選択的に結合するラクダ科動物の抗体を生成する方法が本明細書に開示され、該方法は：（ａ）免疫反応の誘発するために治療上有効な量の免疫原をラクダ科動物に投与する工程であって、ここで、該免疫原は、非古典的ＨＬＡ－Ｉおよびペプチドの組換え発現した複合体を含む工程と；（ｂ）抗体ライブラリーを構築する工程と；（ｃ）抗体を選択するために抗体ライブラリーを分析する工程と；（ｄ）抗体を単離させる工程とを含む。いくつかの例では、抗体は、非古典的ＨＬＡ－Ｉのみに対して結合親和性を有していない。いくつかの例では、抗体は、ペプチドのみ対して結合親和性を有していない。いくつかの例では、抗体は、非古典的ＨＬＡ－Ｉおよび非関連ペプチドを含む複合体に対して結合親和性を有していない。

いくつかの例では、抗体は、ＨＬＡ－Ｅおよびペプチドを含む複合体に選択的に結合する。いくつかの例では、抗体は、ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびペプチドを含む複合体に選択的に結合する。いくつかの例では、抗体は、ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３およびペプチドを含む複合体に選択的に結合する。いくつかの例では、抗体は、ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびペプチドを含む複合体、ならびにＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３およびペプチド複合体に選択的に結合する。

いくつかの例では、抗体はＴＣＲ様抗体である。いくつかの例では、抗体は単一ドメイン抗体である。いくつかの例では、単一ドメイン抗体はラクダ科単一ドメイン抗体である。いくつかの例では、抗体は多重特異性抗体である。いくつかの例では、抗体は多機能性抗体である。

いくつかの例では、免疫原は単量体である。いくつかの例では、免疫原は四量体である。いくつかの例では、四量体はアビジンまたはその誘導体を含む。いくつかの例では、免疫原は、大腸菌においてＨＬＡ－Ｉ重鎖およびＨＬＡ－Ｉ軽鎖を別々に組み換え発現させ、次に、ＨＬＡ－Ｉ重鎖および軽鎖をインビトロでペプチドを用いてリフォールディングすることによって生成される。

いくつかの例では、ラクダ科動物はラマである。いくつかの例では、抗体ライブラリーは、ファージディスプレイライブラリーである。いくつかの例では、抗体ライブラリーは、バクテリオファージディスプレイライブラリーである。いくつかの例では、抗体ライブラリーは、酵母ディスプレイライブラリーである。いくつかの例では、抗体ライブラリーは、単一ドメイン抗体ライブラリーである。

＜ネオ抗原／ネオペプチドを発見する方法＞
ある実施形態では、ネオ抗原／ネオペプチドを発見する方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣＩ分子によって提示されるペプチドは、間接法によって同定される。いくつかの例では、候補ペプチドは、患者の血液から分離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）との反応性について試験される。いくつかの例では、間接法により同定されるＭＨＣ／ペプチド複合体は、活性化Ｔ細胞によって認識されるものである。いくつかの実施形態では、ＭＨＣＩ分子によって同定されるペプチドは、直接法によって同定される。いくつかの例では、ＭＨＣ／ペプチド複合体は、ＭＨＣ分子から溶出し、内因的に負荷されたペプチドを同定することによって、直接法によって同定される。

＜間接的な発見＞
いくつかの実施形態では、標的古典的ＭＨＣ／ペプチド複合体の間接的な発見は、ゲノムデータ、プロテオミクスデータ、あるいは免疫学的データを使用して、癌、感染、または他の疾患状態中の特定のＭＨＣ分子によって示されるペプチドを推測する。いくつかの例では、間接的なアプローチは、ゲノム技術またはプロテオミクス技術を使用して、疾患状態でユニークに発現または過剰発現するタンパク質を同定する。遺伝子中心のアプローチは、限定されないが、リアルタイムＰＣＲ、遺伝子突然変異分析、ディファレンシャルディスプレイ分析、マイクロアレイ実験、および他のゲノムの発現プロファイリング方法を含む。タンパク質中心のアプローチは、限定されないが、２Ｄ電気泳動、細胞画分の質量分析、および疾病関連タンパク質を同定するための他のプロテオミクス技術を含む。疾病関連遺伝子および疾病関連タンパク質が同定された後、アルゴリズムまたは実験的ペプチド結合アッセイは、候補ペプチドを選択する。発現プロファイリングは候補タンパク質を同定し、代表的なペプチドは合成され、インビトロでＭＨＣへの結合について試験される。

いくつかの例では、免疫中心のアプローチは、ＣＴＬへのそれらの提示について候補抗原を試験する。異常細胞からの細胞画分は、抗原処理および提示のために樹状細胞（ＤＣ）に供給される。その後、これらのＤＣはＣＴＬを刺激するために使用される。いくつかの例では、ＤＣがＣＴＬ反応を呼び起こすために利用する抗原は、さらなる開発のための候補とみなされる。

いくつかの例では、免疫中心のアッセイは、候補ＭＨＣ／ペプチド複合体の免疫学的可能性を評価するために利用される。患者または健康的な個体から単離されたバルクＰＢＭＣ集団（インビトロの刺激に続く）は、合成重複ペプチドライブラリまたは合成候補ペプチドのいずれかを含むＭＨＣ／ペプチド複合体のプールとのＣＴＬ反応性について評価される。一旦、最小のエピトープが同定されると、ＭＨＣ／ペプチド複合体に特異的なＣＴＬクローンがバルクＰＢＭＣから生成される。異常細胞または細胞株へのＴ細胞クローンの反応性は、５１Ｃｒ放出を介した標的細胞溶解、酵素結合免疫吸着剤スポットアッセイによって、または細胞内のサイトカイン染色によって検出されるようなインターフェロンガンマ放出によって確認される。

＜従来の直接的な発見＞
いくつかの実施形態では、直接的なアプローチは、ＭＨＣ／ペプチド複合体からペプチド直接溶出させ、異常細胞に特異的なペプチドを同定する。いくつかの例では、直接的な発見アプローチは、細胞株のＭＨＣ分子によって提示されるペプチドを同定する。ＭＨＣ／ペプチド複合体は、最初に細胞溶解物からアフィニティー精製される。ＭＨＣ／ペプチド複合体が精製された後、直接的な発見方法は、典型的にペプチドを溶出させ、質量分析によって疾患特異的ペプチドを同定する。

＜キット／製品＞
ある実施形態において、本明細書に記載される１つ以上の方法とともに使用されるキットおよび製品が本明細書で開示される。このようなキットは、バイアル、チューブなどの１以上の容器を収容するために仕切られた運搬装置、包装または容器を含み、各容器は本明細書中に記載されている方法を使用するための分けられた要素の１つを備える。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管を含む。一実施形態では、容器は、ガラスまたはプラスチックのような様々な材料から形成される。

本明細書で提供される製品は包装材料を含む。製薬用包装材料の例としては、限定されないが、ブリスターパック、瓶、チューブ、バッグ、容器、瓶、および選択された製剤と意図した投与および処置のモードに適する任意の包装材料が挙げられる。

例えば、容器は、本明細書に開示される１以上の追加の治療剤を随意に有する抗体を含む。そのようなキットは、識別用の記載またはラベル、あるいは本明細書に記載される方法における使用に関する説明書を随意に含む。

キットは典型的には、使用される内容物および／または説明書を列挙するラベルと、使用される説明書を備えた添付文書とを含んでいる。１セットの説明書も典型的に含まれる。

１つの実施形態では、ラベルは容器上にあるか容器に付随する。１つの実施形態では、ラベルを形成する文字、数字または他の表示が、容器自体に貼り付けられるか、成形されるかまたは刻まれている場合は、ラベルは容器上に取付けられる。ラベルは、例えば添付文書として容器を保持するレセプタクルまたは運搬装置内に存在するとき、容器に付随する。１つの実施形態において、ラベルは、内容物が特定の治療用途に用いられるべきものであるということを示すために用いられる。ラベルは、例えば、本明細書に記載の方法で、内容物を用いる使用するための指示を示すように使用されてもよい。

ある実施形態では、医薬組成物は、本明細書で提供される組成物を含有する１以上の単位の剤形を含むパックまたはディスペンサー装置において提示される。例えば、パックは、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含む。一実施形態において、パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が添付してある。一実施形態において、パックまたはディスペンサーには、医薬品の製造、使用または販売を制御する政府機関によって規定された形態の容器に付属の通知書が添付してあり、この通知書は、ヒトまたは動物の投与のための薬物の形態についての、政府機関の承認を反映するものである。例えば、このような通知書は、処方薬または承認された生成物の挿入に関して、米国食品医薬品局により承認されたラベルである。一実施形態では、互換性がある医薬担体において製剤化される本明細書で提供される抗体を含む組成物はまた、調製され、適切な容器に入れられ、および示された状態の処置のために標識される。

以下の例は、本発明の様々な実施形態を例証する目的で与えられ、いかなるやり方でも本発明を制限することを意図していない。本明細書に記載される方法とともに、本実施例は、好ましい実施形態の代表例である且つ典型的なものであり、本発明の範囲を限定するものとして意図されない。請求項の範囲によって定義される本発明の精神内に包含されるその変化および他の使用が、当業者に想定される。

＜実施例１－ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３に結合するためのＨＬＡ－Ａ２ペプチドのスクリーニング＞
戦略は、ＨＬＡ－Ａ^＊０２０１を結合する既知のペプチドの既知のペプチドからＨＬＡ－Ｅペプチド結合剤を同定することである。タンパク質ＲＮＡヘリカーゼからのＹＬＬＰＡＩＶＨＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）およびタンパク質ＮＹ－ＥＳＯ－１からのＳＬＬＭＷＩＴＱＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）についてのＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３ペプチド結合が示され、およびＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３／ペプチドを安定した単量体複合体へとうまくリフォールディングするために両方のペプチドを使用した。ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３についての追加のペプチド結合剤を同定するために、ペプチド結合研究およびペプチド／ＨＬＡ－Ｅリフォールディングアッセイを行った。ペプチドの２つのリストを生成した：リスト１は、従来の処理経路に由来するＨＬＡ－Ａ^＊０２０１結合ペプチドからなる。リスト２は、代替的手段処理経路に由来するＨＬＡＡ^＊０２０１結合モチーフを有するペプチド結合剤を示す。このリストからのペプチドを、ウシヘルペスウイルス－１のＵＬ４９．５遺伝子を含むレトロウイルスと共に形質導入されたＴＡＰ欠損細胞株Ｋ５６２．ＨＬＡ－Ｅ．Ｂ８から同定した。合計で、各リストから２００より多いペプチドをスクリーニングした。

＜ＨＬＡ－Ｅペプチド結合アッセイ＞
ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３に対するペプチドの結合親和性を、組み換えＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３を使用する無細胞の競合ベースのリフォールディングアッセイで決定した。簡潔に言えば、ＨＬＡ－Ｅ（ＶＭＡＰＣ（ＦＬ）ＴＬＬＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３９））の蛍光標識された天然リガンドを標準として使用し、溶出されたペプチドを競争物として使用した。１５ピコモルベータ２Ｍおよび１００フェントモルの蛍光標識された標準ペプチド、ならびに一連の濃度の溶出されたペプチドを用いて、ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３をＲＴ（ｐＨ７）で９６ウェルプレート中で２４時間インキュベートした。ＨＬＡペプチド複合体をゲルろ過を介して遊離ペプチドから分離し、放射を５２８ｎｍで測定した。ペプチド結合の割合を計算し、５０％の阻害（ＩＣ５０）をもたらすペプチドの濃度を用量反応曲線から推定した。このアッセイにおけるＨＬＡ－Ｅ参照ペプチドは、記載される最適な結合剤であり、比較的高いＩＣ５０値を結果としてもたらす。ポジティブコントロールとして、ＨＬＡ－Ａ２からのリーダーペプチド（ＶＭＡＰＲＴＬＶＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１））を使用した。

＜ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３ペプチドリフォールディングアッセイ＞
ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３の細胞外ドメインおよびβ２ｍを大腸菌中の封入体として生成し、両方のペプチドリストからの各ペプチドを用いてリフォールディングした。リフォールディング後、適切にリフォールディングされた複合体のパーセントをＳｕｐｅｒｄｅｘ７５サイジングカラムで評価した。両方のリストからのペプチドを有するリフォールディングされたＨＬＡ－Ｅ単量体の効率を、ペプチドＶＭＡＰＲＴＬＶＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１）を用いてリフォールディングされたコントロールＨＬＡ－Ｅ単量体と比較した。

＜実施例２－ＨＬＡ－Ｅペプチド結合剤のインシリコでの予測＞
高い回転率を有するハウスキーピングタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ）を計算および情報科学を使用して調べて、代替的処理経路によるペプチド形成を予測した。人体の主要な器官および組織をすべて表わすサンプルのトランスクリプトーム分析は、ハウスキーピングタンパク質の発現に関与する８５８８のタンパク質コード化遺伝子を同定した（ＨｕｍａｎＰｒｏｔｅｏｍｅ）。ウェブベースのＭＨＣエピトープ予測ツールおよび方法（ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ）、免疫のエピトープデータベースおよび分析資源（ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ）、ＩＭＧＴ／ＨＬＡ配列データベース（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ．ｉｍｇｔ／ｈｌａ／）、Ｂｉｍａｓ（ｗｗｗ－ｂｉｍａｓ．ｃｉｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ）、ならびにＰｒｏｅａｓｏｍａｌ切断のための予測アルゴリズム（ｗｗｗ．ｐａｐｒｏｃ．ｄｅ）を、ＨＬＡ－Ａ^＊０２０１ペプチド結合剤を予測するために使用する。同定されたペプチドを、ＨＬＡ－Ａ^＊０２０１についての予測された親和性に基づいてランク付けする。ワークフローは、ＨＬＡ－Ａ^＊０２０１のための「最も高い」親和性ペプチドのリストを作成し、その後、ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３結合アッセイでペプチドを選択し、合成し、スクリーニングすることである。各ＨＬＡ－Ｅ対立遺伝子への最良の結合剤をリフォールディング反応において評価し、およびＨＬＡ－Ｅ単量体リフォールディング反応で使用されるコントロールペプチドＶＭＡＰＲＴＬＶＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１）と比較することによって、リフォールディング効率を決定した。ＨＬＡ－Ａ^＊０２０１ペプチド結合モチーフを、ＨＬＡ－Ｅへのペプチド結合剤を予測するために使用した。

＜実施例３－ＨＬＡ－Ｅネオペプチドのデノボ発見＞
既存の腫瘍および内皮細胞株（ＴＡＰ依存性およびＴＡＰ非依存性ならびに古典的ＨＬＡＩ対立遺伝子の陽性細胞株および陰性細胞株）は、遺伝子導入（つまり、ＨＬＡ－Ｅ遺伝子を導入すること）によって、または遺伝子での部分的または完全な機能の欠損（ＬＯＦ）変異の生成を含む標的遺伝子欠失（つまり、ＴＡＰ遺伝子）を有する細胞株を発達させるための技術（つまり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）を使用することによって設計される他のものと同様に使用される。
・ＩＦＮ－ガンマの不在下および存在下におけるｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルにおける古典的ＨＬＡ、ＡＰＭおよび非古典的ＨＬＡＥ発現のソースヒト腫瘍細胞株。例えば、ＭＨＣクラスＩおよびＴＡＰ－２ｍＲＮＡの発現下での前立腺腫瘍細胞株ＰＰＣ－１。ＴＡＰではなくＭＨＣクラスＩの発現下でのＬＮＣａＰ。ＨＬＡ－Ｅはモノクローナル抗体３Ｄ１２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して検出される。
・ＡＰＭ成分の抗体と同様にＨＬＡ－Ｅおよび古典的ＨＬＡ対立遺伝子への抗体を使用して、新たに単離されたヒト腫瘍組織において免疫組織化学的検査を行う。同じ標的に対してＰＣＲ解析を用いた並行研究を行う。ヒト腫瘍組織からの洗浄剤可溶化のＨＬＡ－Ｅ／ペプチド複合体をアフィニティー精製し、およびぺプチドの特性評価のための標準ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ技術を使用した下流分析のために、ＨＬＡ－Ｅ分子に含まれるペプチドを酸溶出した。
・ＨＬＡ－Ｅ発現レベルのためのソース正常ヒト組織、ｉＰＳＣ（誘導性多能性幹細胞）由来内皮細胞（ＨＬＡ－Ｅ＋）およびＰＢＭＣ（ＨＬＡ－Ｅ＋）。ｉＰＳＣ誘発内皮細胞およびＰＢＭＣの場合、洗浄剤可溶化の細胞膜からＨＬＡ－Ｅ／ペプチド複合体をアフィニティー精製し、および酸処理によってペプチドを溶出し、ペプチド特性評価に使用される標準ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ技術によって評価する。これによって、ＨＬＡ－Ｅのためのペプチド結合剤のベースラインがもたらされる。
・プラスミドを用いてＴ２、Ｋ５６２および他の腫瘍細胞をトランスフェクトして、全長（固定された細胞膜）ＨＬＡ－Ｅ^＊０１：０１または０１：０３を発現する。ＬＣＬ７２１細胞は、内因性ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３を発現する。
・ＴＡＰ－１欠損細胞株の産生。従来の抗原処理経路を抑制するために、ＣＰＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集技術を使用して、様々な腫瘍形成性のおよび非腫瘍形成性のヒト細胞株においてＴＡＰ－１、タパシンおよびＬＭＰ２（プロテアソーム欠損）のための標的遺伝子ノックアウトを生成する。細胞表面ＨＬＡ－Ｅを発現する変異した細胞株は、１０^１１の細胞を超えるまで増える。アフィニティーキャプチャークロマトグラフィーを使用して洗浄剤可溶化細胞からのＨＬＡ－Ｅ／ペプチド複合体を単離し、および濃縮ＨＬＡ－Ｅ／ペプチド複合体を酸処理して、下流ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ評価のためにペプチドを放出する。ＨＬＡ－Ｅのために発見されたペプチド結合剤を、腫瘍組織においてさらに検証する。
・プラスミドを用いてＴ２、Ｋ５６２、ＬＣＬ７２１．１７４細胞および他の腫瘍細胞をトランスフェクトして、ＨＬＡ－Ａ^＊０２０１または他の古典的ＨＬＡＩ対立遺伝子を発現する。選択された細胞はＴＡＰ非依存性であるか、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して編集される。
・古典的ＨＬＡ対立遺伝子によって提示されるネオペプチド（Ｔ細胞エピトープ障害性の提示の処理；ＴＥＩＰＰ）のデノボ発見。ＨＬＡ－Ａ^＊０２０１に結合する代替的処理経路から発見されたネオペプチドは、ＴＡＰ１／２における欠損を用いて設計された腫瘍細胞株を用いて同定される。

＜ＨＬＡ－Ｅ／ペプチド標的発見のための方法論＞
セファロースビーズを用いて溶解物を事前に除去した後、抗体Ｗ６／３２を使用して、アフィニティークロマトグラフィーによって１０^１１の細胞からＨＬＡ－Ｉ／ペプチド複合体を精製した。酢酸溶出液の１０ｋＤろ過後、ハウス中に充填された１５ｃｍ×２００ｃｍのＲＰ－Ｃ１８カラムを使用して複合ペプチドプールを分画した。４５分で０％から５０％の溶媒Ｂ（１０／９０／０．１、ｖ／ｖ／ｖ、常水／アセトニトリル／ギ酸）で勾配を実行した。画分をプレカラム上に注入し、分析用ナノ－ＨＰＬＣカラムを用いて溶出した。９０分で０％から５０％の溶媒Ｂ（１０／９０／０．１、ｖ／ｖ／ｖ、常水／アセトニトリル／ギ酸）で勾配を実行した。ナノ－ＨＰＬＣカラムをおよそ５μｍの先端まで引っ張り、ＭＳソースのエレクトロスプレイニードルとして機能した。質量分析法の場合、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳの取得を自動的に切り替えるデータ依存性モードで動作するＬＴＱ－ＦＴＵｌｔｒａ質量分析計を使用した。すべての画分を、ＦＴＭＳ測定でのＳＩＭ走査を適用する厳密な前駆体質量許容差（２ｐｐｍ）で２回記録した。マスコット２．２．０４（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）を使用してタンデム質量スペクトルをＩＰＩｈｕｍａｎｖ３．７２と対抗させ、スキャフォールド２．２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｏｍｅｓｏｆｔｗａｒｅ．ｃｏｍ）を使用して分類した。ＨＬＡ－Ｅの結合モチーフについては、３５を超えるマスコットイオンスコアを有する８－１３量体ペプチドおよび５％の誤検出率（ＦＤＲ）のみが選択される、より厳格な方法を行なった。

＜実施例４－標的検証＞
パートＡ－実施例１－３でＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３に結合すると同定されたすべてのペプチドを、腫瘍組織または原発腫瘍細胞および正常組織または原発性正常細胞（つまり、ｉＰＳＣに由来する細胞）を使用して検証する。実施例３に記載される単離方法論を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる分析のために腫瘍および正常組織／細胞からＨＬＡ－Ｅ結合ペプチドを抽出するために適用する。同定されたペプチドを、実施例１－３で発見されたペプチドと比較する。

パートＢ－ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用する直接的なペプチド確認アプローチに加えて、特定のＨＬＡ－Ｅ／ペプチド単量体を有する動物を免疫化することによって生成される特定のＴＣＲ様抗体を使用して、ＨＬＡ－Ｅ／ペプチド標的もまた検証する（実施例５を参照）。このために、特定のＨＬＡ－Ｅ／ペプチド標的に対して作成されたＴＣＲ様抗体を使用するための標準サンプル処理および調製プロトコルを用いて染色するために、組織または細胞を調製する。

ＴＣＲ様抗体およびマウスアイソタイプコントロール抗体を使用して、ＨＬＡ－Ａ２および／またはＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１あるいはＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３陽性癌細胞株を用いて免疫細胞化学実験を行う。サイトスピン調製およびメタノール（５％）固定された癌細胞（５３１０４）を、ＴＣＲ様抗体と共に０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で３０分間インキュベートし、洗浄し、ならびに抗体抱合ヤギ抗マウス－ローダミン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）と共に０．５ｍｇ／ｍｌで３０分間インキュベートする。ＮｉｋｏｎＥｃｌｉｐｓｅ２０００、単純ＰＣＩスイートソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を備えた倒立ディコンボリューション顕微鏡を使用して、染色されたサンプルを蛍光について分析した。ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を対比染色として核に使用した。

各患者からの腫瘍サンプルを、Ｃｒｙｏｍｏｌｄ（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に入れ、ＯＣＴ培地で覆い、イソペンタンおよびドライアイスを使用して急速冷凍し、使用するまで２８０°Ｃで保管した。組織切片を５ｍｍサイズで作成し、５％のメタノールを使用して固定し、および組織の非特異的な染色を防ぐために、１．０％のウマ血清を含む希釈液中で１ｍｇ／ｍｌで１時間ＴＣＲ様抗体ならびにコントロール抗体で染色した。基質色原体（３、３９ジアミノベンジジン［ＤＡＢ］；ベクター）の存在下で、光学顕微鏡検査法を用いてＡｇ／Ａｂ結合場所を視覚化するための指示薬系（褐色沈殿物の形成）を提供する、ヤギ抗マウスＩｇＨＲＰ（ＩｍｍＰＲＥＳＳ抗マウスＩｇペルオキシダーゼキット、ベクター）を使用して、一次抗体結合の検出を決定した。ヘマトキシリンＱＳを核対比染色（ベクター）として使用した。細胞形態および組織中に存在する腫瘍細胞を評価するために、Ｈ＆Ｅ染色（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用した。光学顕微鏡検査法（ＮｉｋｏｎＥｃｌｉｐｓｅＴＥ２０００、単純ＰＣＩスイートソフトウェアを備えた倒立ディコンボリューション顕微鏡）を使用して組織切片を分析した。

全体の細胞染色および強度を正確に反映するためにヒト組織のＴＣＲ様抗体染色をスコアリングし、ＴＣＲ様抗体のための組織内スコアリングプロトコルを実行して従った。このようにして、染色の割合（０－４）および染色の強度（０－４）からなるスクリーニング法を確立した。０の染色スコアの割合は染色がないこと表し、１＋は領域中の１００の細胞の陽性染色した平均１－２５の細胞を表し（１－２５％）、２＋は１００の細胞の平均２６－５０の細胞を表し（２６－５０％）、３＋スコアは１００の細胞の平均５１－７５の細胞を表し（５１－７５％）、および４＋は染色された１００の細胞の平均７６－１００の細胞を表す（７６－１００％）。強度スコアは、形成された褐色の沈殿物の程度を表す０－４のスケールに基づいており、それは、０が陰性、１＋は弱い褐色、２＋は中間の褐色、３＋は強い褐色、および４＋は非常に濃い褐色である。最後に、合計点数（０－８）を、染色の割合および染色の強度のスコアを加えることによって決定した。組織切片を、ＴＣＲ様抗体およびアイソタイプコントロールと共に１ｍｇ／ｍｌで染色した。染色の割合および染色の強度のスコアは、各組織サンプルのための５つの領域からの平均として報告された。

＜実施例５－ビオチン化ＭＨＣペプチド複合体の生成＞
可溶性ＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体を、ＨＬＡ－Ａ２重鎖（ＨＣ）および大腸菌中の組換えタンパク質としてのベータ２ミクログロブリンの過剰発現、ならびに１０ｕＭの特異的なペプチドの存在下での後続のインビトロでのリフォールディングおよび構築によって生成した。可溶性ＭＨＣ／ペプチド複合体を得るために、ＨＣ配列を突然変異誘発して、細胞質ゾルおよび細胞膜貫通領域を取り除いた。リフォールディングされた単量体ＭＨＣ／ペプチド複合体を特異的にビオチン化するために、ＨＣは、Ｃ末端で特異的なビオチン標識部位を含む融合タンパク質として発現された。これらの短い配列は、ビオチンタンパク質リガーゼＢｉｒＡを使用して、この配列内の単一リシン残基の酵素学的なインビトロでのビオチン標識に十分である。

＜実施例６－免疫化のための免疫原＞
対象のペプチドの同定を含む方法によってＴ細胞受容体様抗体を生産し、ここで、対象のペプチドがＭＨＣＩ分子によって提示されることができ、かつ、特にペプチド／ＨＬＡ－Ｅ複合体であり、ならびにここで、ワクチン組成物が対象のペプチドを含む。その後、１つのペプチド／ＭＨＣ複合体の単量体を含む免疫原が形成され、ここで、ペプチド／ＭＨＣ複合体のペプチドは対象のペプチドである。その後、免疫反応を誘発するために有効量の免疫原を宿主に投与し、ここで、ＭＨＣ分子の結合溝中のペプチドの三次元提示に対する免疫反応を誘発するのに十分な期間にわたって免疫原がその三次元形態を保持する。その後、宿主から集めた血清を分析して、ＭＨＣ分子の結合溝中のペプチドの三次元提示を認識する所望の抗体が生成されているか否かを判定し、ここで、所望の抗体がＭＨＣ分子のみ、対象のペプチドのみ、およびＭＨＣおよび無関係のペプチドの複合体からのペプチド／ＭＨＣ複合体を同定する。次に、Ｂ細胞を免疫化された動物から単離し、バクテリオファージまたは酵母あるいは他のディスプレイシステムを使用して抗体ライブラリーを構築する。

有効量の免疫原を、ストレプトアビジンおよびニュートラアビジンなどのアビジンまたはアビジンの誘導体とともにビオチン化単量体を用いて形成されたペプチド／ＨＬＡ－Ｅ四量体を使用して形成し、ペプチド／ＨＬＡ－Ｅの四量体複合体を形成する。例えばＱｕｉｌ－Ａであるアジュバントを用いて免疫原を調製し、免疫反応を誘発するために動物に皮下投与し、ここで、ＨＬＡ－ＥＭＨＣＩ分子の結合溝中のペプチドの三次元提示に対する免疫反応を誘発するのに十分な期間にわたって、免疫原がそのペプチド／ＨＬＡ－Ｅ複合体の三次元形態を保持する。次に、Ｂ細胞を免疫化された動物から単離し、抗体ライブラリーをバクテリオファージまたは酵母あるいは他のディスプレイシステムを使用して構築する。

＜実施例７－ライブラリー構築およびビオチン化した非古典および古典的ＨＬＡ／ペプチド複合体におけるファージの選択＞
ファージディスプレイライブラリーを、免疫化されたマウスおよびラマから作る。ｓｃＦｖの免疫化されたライブラリーまたは単一ドメインＶ_ＨＨ抗体を逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応によって構築し、および１００－１０００のクローンを含むｓｃＦｖのライブラリーまたは単一ドメイン抗体を規則的に生成する。すべての抗体ライブラリーは、ファージミドにおけるｐＩＩＩ融合としてｓｃＦｖまたは単一ドメインのＶＨＨ抗体を発現する。バイオパニングのためのファージ粒子を生成するためにＭ１３ＫＥファージを使用する。ｓｃＦｖおよび単一ドメインＶ_ＨＨファージディスプレイライブラリーは、およそ１ｘ１０９の独立したクローンを含んでおり、選択に使用される。

＜ヒトｐ６８ＲＮＡヘリカーゼ複合体（無関係のペプチド）からのＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１、ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３、およびＨＬＡ－Ａ^＊０２０１／ペプチドＹＬＬＰＡＩＶＨＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）におけるファージの選択＞
１ｍｌのＰＢＳ中のストレプトアビジン常磁性ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（３０ｕｌ；Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）および１５０ｕｇのビオチン化されていないＨＬＡ－Ａ２－Ｉ／ＹＬＬＰＡＩＶＨＩまたはＨＬＡＥ^＊０１０１／^＊０１０３／ＹＬＬＰＡＩＶＨＩ（無関係の複合体）とともにファージを最初にプレインキュベートして、ストレプトアビジンまたはＨＬＡ－Ａ２およびＨＬＡ－Ｅの一般的なフレームワークに結合する抗体を発現したいかなるファージも取り除く。

続いて、磁石を使用してＤＹＮＡＢＥＡＤＳを捕らえ、上清（ファージおよび無関係の複合混合物）を７．５μｇのビオチン化されたＨＬＡ－Ａ２／ＹＬＬＰＡＩＶＨＩまたはＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１／^＊０１０３／ＹＬＬＰＡＩＶＨＩ（ヒトｐ６８ＲＮＡヘリカーゼからの）ならびに７．５ｕｇのビオチン化したＨＬＡ－Ａ２－ＫＶＡＥＬＶＨＦＬペプチドまたはＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１／^＊０１０３／ＫＶＡＥＬＶＨＦＬ（ＭＡＧＥ－Ａ３）を含む別々の管に移し、およびＲＴで１時間インキュベートした。その後、最終混合物（１ｍｌ）を、（２％の乳を用いてプレインキュベートし、ＰＢＳを用いて洗浄した）２００μｌのＤＹＮＡＢＥＡＤＳに加え、内容物を連続回転でＲＴで１５分間混合した。そして、ビーズをＰＢＳ／０．１％ＴＷＥＥＮを用いて１０回およびＰＢＳを用いて３回洗浄し、ならびに１ｍｇ／ｍｌのトリプシンを使用してＤＹＮＡＢＥＡＤＳから結合ファージをＰＢＳ（０．５ｍｌ）においてＲＴで１５分間溶出した。

その後、２０ｍｌのＬＢ中でＥＲ２７３８大腸菌（対数期で成長する）を感染させるために３７℃で１時間ファージを使用する。続いて、１０１２のＭ１３ＫＥヘルパーファージを混合物に加え、追加の３０分間さらにインキュベートし、および細胞を遠心分離（３０００ｒｐｍで１０分間）を使用してペレット状にした。結果としてもたらされる細胞ペレットを２００ｍｌのＬＢ＋アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）＋カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）において再懸濁し、一晩３０℃でインキュベートした。

翌朝、一晩の培養を３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、前ラウンドの選択からの増幅ファージを沈殿させるように、上清（１８０ｍｌ）をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と氷上で１時間混合した。その後、ＰＥＧ／ファージ混合物を３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、結果としてもたらされるファージペレットの一部を続くパニングのラウンドに使用し、残りを１５％のグリセロールにおいて－８０℃で冷凍した。ＤＹＮＡＢＥＡＤの洗浄工程の増加および選択に使用されるビオチン化した複合体の量の減少を伴う上記と同じプロトコルを使用して続くパニングのラウンドを行った。

抗体選択の最終ラウンド後に、ＥＲ２７３８およびＨＢ２１５１大腸菌の両方を感染させるために溶出されたファージを使用し；ＥＲ２７３８細胞を上記のように一晩培養し、ＴＹＥ＋アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）寒天板上にＨＢ２１５１細胞を蒔いた。翌朝、寒天板からの個々のコロニーを採取し、４００ｕｌＬＢ＋アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）／ウェルを含む４８ウェルプレートの個々のウェルを播種するために使用した。３７℃で３－６時間インキュベートした後、２００ｕｌの５０％のグリセリン溶液を各ウェル加え、プレートをモノクローナル保存培養として－８０℃で保存した。

＜ＨＬＡ－Ａ２ペプチドおよびＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１／^＊０１０３の特異的ペプチド複合体におけるファージの選択＞
少しの修正を伴う上記方法と同様に選択を行う。ストレプトアビジン常磁性ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（５０ｕｌ；Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）および２０μｇのビオチン化されていないＨＬＡ－Ａ２－ＹＬＬＰＡＩＶＨＩまたは１ｍｌのＰＢＳ中のＨＬＡ－Ｅ／ＹＬＬＰＡＩＶＨＩペプチド（無関係の複合体）と共に３ｘ１０１２ファージを最初にプレインキュベートして、ストレプトアビジンおよびＨＬＡ－Ａ２結合剤またはＨＬＡ－Ｅ結合剤を枯渇させる。続いて、磁石を使用してＤＹＮＡＢＥＡＤＳを捕捉し、上清（ファージおよび無関係の複合混合物）を５μｇのビオチン化したＨＬＡ－Ａ２／特異的ペプチドまたはＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１／^＊０１０３／特異的ペプチドを含む別の管に移し、およびＲＴで１時間インキュベートした。その後、最終混合物（１ｍｌ）を１００μｌのＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（２％の乳と共にプレインキュベートし、ＰＢＳと共に洗浄した）に加え、および内容物をＲＴで連続的回転で３０分間混合した。次に、ビーズをＰＢＳ／０．１％のＴＷＥＥＮを用いて１０回、ＰＢＳを用いて３回洗浄し、およびＰＢＳ（０．５ｍｌ）中の１ｍｇ／ｍｌのトリプシンを使用して結合ファージをＤＹＮＡＢＥＡＤＳからＲＴで２０分間溶出した。続く工程はすべて上記のように行なった。

ＮＧＳ技術を使用するディープシーケンシングによって、１００万よりも多い結合剤から特有のクローンを同定する。無細胞抽出液を使用して最大１０，０００の固有の結合剤を発現させ、次に、ＲｅｓｏＳｅｎｓフリーラベルテクノロジーを使用してスクリーニングして、ハイスループットスクリーニングを行い、結合動態に基づいて特定の結合剤をランク付けする。

＜実施例８－選択性アッセイ＞
バイオネティックプレートの表面上のＨＬＡ－Ａ２／ペプチドまたはＨＬＡ－Ｅ／ペプチド（＞１，０００の無関係の無作為のペプチド）の固定された単量体を有するハイスループットスクリーニングアッセイで、結合選択性について主要なスクリーンおよび順位フィリングから判定された上位１，０００の結合剤を試験する。抗体結合剤は、９６ウェルプレート上で固定された＞１，０００の異なるペプチド／ＨＬＡ－ＡまたはＨＬＡ－Ｅ標的に対するオフターゲット反応性で特性評価される。無関係のペプチド／ＨＬＡ－Ｅ複合体の単量体を含む各ウェルに特異抗体結合剤を加え、リアルタイム結合をフリーラベルテクノロジーを使用して観察する。さらなる分析のために、無関係のペプチド／ＨＬＡ－Ｅ複合体の単量体に結合しない候補抗体結合剤を選択する。

＜実施例９－可溶性ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質の発現および精製＞
タンパク質Ａ／Ｇアフィニティークロマトグラフィー培地（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、可溶性ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質を含む上清または単一ドメインＶＨＨＦｃ融合タンパク質を精製する。最初に、１．５ｍｌのタンパク質Ａ／Ｇ樹脂をカラム上に負荷し、２０ｍｌのＰＢＳを用いて活性化した。およそ１ｍｌ／分の流量で蠕動ポンプを使用して、上清をカラムに負荷する。続いて、フロースルーが０．０５より少ないＯＤ２８０を記録するまで、４０ｍｌのＰＢＳを使用してカラムを洗浄する。次に、１０ｍｌのクエン酸塩緩衝剤（ｐＨ２．０）を使用して、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質を、樹脂から中和のために１０ｍｌの１ＭＴｒｉｓへと直接溶出する。５０，０００のＭＷＣＯＶＩＶＡＳＰＩＮ遠心管（ＳａｒｔｏｒｉｕｓＳｔｅｄｉｍ）を使用して、溶出されたｓｃＦｖ－Ｆｃを続いて濃縮し、ＥＬＩＳＡおよびＢＩＡＣＯＲＥＴｗ００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して組み換え抗原に結合するその能力について試験し、ならびにフローサイトメトリーを使用して細胞表面上にＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡＩ対立遺伝子または古典的ＨＬＡ対立遺伝子を発現するペプチドパルスＴ２細胞を検出する。

＜実施例１０－結合動態解析＞
ＢＩＡＣＯＲＥＴ２００（ＧＥＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する表面プラズモン共鳴による反応速度測定の第２ラウンド目を行う。簡潔に言えば、ＨＢＳ－ＥＰラニング緩衝剤（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のＴＷＥＥＮ２０）標準アミンカップリング試薬を用いて、ＣＭ５チップ（ＧＥＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の最初の２つのフローセルを活性化し、ｓｃＦｖ－Ｆｃまたは単一ドメインＦｃ融合タンパク質の精製されたクローンでフローセル２を固定化する。その後、抗体クローンの標的、ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１またはＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３およびペプチド単量体、ならびにＨＬＡ－Ａ２ペプチド単量体（２２２ｎＭ－１３．８７５ｎＭ）を、２０μｌ／分で１２０秒間、第１（参照）および第２の両方のフローセル上に注入し、続いて、ラニング緩衝剤をさらに１８０秒間添加する。ＢＩＡＣＯＲＥＴ２００評価ソフトウェア２．０および１：１結合モデル（ｌｏｃａｌＲｍａｘ）を使用して動態値を決定した。

＜実施例１１－フローサイトメトリー＞
プラスチックポリスチレン円底管（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＬａｂｗａｒｅ）にペプチドパルスＴ２細胞を移し、ＰＢＳを用いて洗浄する。続いて、５ｕｇの標的化されたまたは非特異性の精製されたｓｃＦｖあるいはｓｃＦｖ－Ｆｃまたは単一ドメインＶ_ＨＨ、もしくは単一ドメイン－Ｆｃ抗体のいずれかと共に、該細胞を氷上で４０分間インキュベートする。ＰＢＳを用いて細胞を洗浄し、次に、１ｕｇのビオチン化したマウス抗－ｍｙｃ抗体（クローン９Ｅ１０；ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）またはビオチン化されたマウス抗ヒトＩｇＧＦｃ特異性（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に氷上で３０分間インキュベートする。ＰＢＳを用いて細胞を洗浄し、次に、ストレプトアビジン－ＰＥ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共にインキュベートする。最後に、ＰＢＳを用いて細胞をもう一度洗浄し、ＢＤＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで分析した。

＜実施例１２－アラニンスキャ二ングを使用するエピトープマッピング＞
同系統のＨＬＡ－Ｅ／ペプチドについて＞
１０ｎＭの高親和性を有する抗体結合剤は、アラニン置換ペプチド／ＨＬＡ－Ｅ複合体についての結合優先度についてマッピングする。

＜実施例１３－二重特異性ＴＣＲ様抗体＞
ＲＡＨ（４９－５７）／Ｈ－２Ｄｂ複合体に対するＲＡＨＴＣＲ様抗体として指定されたＴＣＲ様抗体クローンを生成した。ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４０）（４９－５７）ペプチドは、ＨＰＶＥ７タンパク質の免疫優性エピトープとして実証され、マウスＭＨＣＩ、Ｈ－２Ｄのコンテキストにおいて提示されることが知られている。このペプチドは、マウス腫瘍細胞の表面上で直接同定した。ＲＡＨＴＣＲ様抗体は、関連ペプチド／ＭＨＣＩ（ＲＡＨ（４９－５７）／Ｈ－２Ｄｂ）複合体のみに反応するが、ＥＬＩＳＡおよびフローベールアッセイを使用する他のいかなるペプチド／ＭＨＣＩ複合体には反応しないその能力で特性評価され、および検証される。加えて、初めて、このＴＣＲ様抗体を利用して、ＴＣ－１およびＣ３．４３であるマウス腫瘍細胞の表面上で自然に処理されたＲＡＨ（４９－５７）／Ｈ－２Ｄｂ複合体のレベルを調べた。

重鎖および軽鎖のＲＡＨのＴＣＲ様抗体のクローンを作った。簡潔に言えば、ＲＡＨハイブリドーマ細胞ｍＲＮＡを単離し、次の軽鎖／重鎖可変領域プライマー（ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を使用してマウス抗体配列に対するＰＣＲを行った。使用されたプライマーは、軽鎖フォワードであった：ＬＣＶＰ－Ｋ－５ＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４１）および軽鎖リバース：ＬＣＣＰ－Ｋ－１ＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４２）および前方に使用した重鎖について：ＨＣＶＰＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３）および重鎖リバース：ＨＣＣＰ１ＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＴＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＧＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４）。ＶＬ＆ＶＨ遺伝子はともに連結されて、伸長ＰＣＲの上のスプライシングを用いてＲＡＨｓｃＦｖを形成した。次の外部プライマーを使用した重複伸長ＰＣＲによって、軽鎖および重鎖をともに連結して単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を形成する：
ＨｉｎｄＩＩＩを有する軽鎖可変プライマー（Ｎｏ．５）
５’－－ＡＧＴＣＡＴ－－ＡＡＧＣＴＴ－－ＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴ－－３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５）
ＨｉｎｄＩＩＩ
ＸｈｏＩを有する重鎖定常プライマー
５’－－ＡＧＴＣＡＴ－ＣＴＣＧＡＧ、ＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＴＣＡＧＡＴＧＧ－－３’（（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６）
ＸｈｏＩ

増幅断片を大腸菌に形質転換されたｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒシステムに連結し、配列分析のためのクローンを選んで、本物の配列を同定した。

＜二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーの構築＞
ＲＡＨｓｃＦｖ＆マウス抗ＣＤ３ｓｃＦｖをｐＳｅｃＴａｇ２ＨｙｇｒｏＢベクターにクローン化した。ＮＥＢ５－αコンピテント大腸菌細胞（ＮＥＢ）を形質転換するために、組み立てられた二重特異性プラスミドを使用した。形質転換されたコロニーは、アンピシリンを含むＬＢプレートから採取され、膨張され、配列決定検証（ＩｇＧｋリーダー配列、二重特異性抗体およびＭｙｃ／６ＸＨｉｓｔａｇ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）を含むプラスミド）のために送られた。エレクトロポレーション（ＮｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒｋｉｔＬｏｎｚａＶＣＡ－１００３）を使用して、ＣＨＯＫ１細胞をトランスフェクトするために、ｐＳｅｃＴａｇ２ベクター中の二重特異性ＲＡＨＴＣＲ様抗体ｓｃＦｖｘ抗－ＣＤ３ｓｃＦｖを使用した。

６－Ｈｉｓ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）アフィニティーカラムを使用して二重特異性抗体を精製し、インビトロの活性について精製された二重特異性抗体を評価した。図５で例証されるように、ＲＡＨＴＣＲ様ターゲティングを有する二重特異性ｓｃＦｖおよびマウスＣＤ３ｅ結合モチーフはＴ細胞を活性化する。

＜実施例１４－ＴＣＲ様免疫毒素／ＡＤＣ有効性は標的コピー数に依存する＞
ｍＲＬ６ＡおよびｍＲＬ２１Ａ結合に特異的な特定のペプチド／ＨＬＡコピー数発現について、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株を分析した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞致死は、コピー数発現に関係するように見えた。

抗体薬物複合体としてのＴＣＲ様抗体の役割を研究するために、および標的コピー数にその活性を関連させるために、１、１０、および２０μｇ／ｍｌのＨＬＡ－Ａ２ペプチドＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３）（ＫＩＦ）で、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を３時間にわたってペプチドパルスした。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、ＴＣＲ様抗体に対して自然に強い反応性を示さない。ペプチドパルスＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞への二次的なＡＤＣ策略として、Ｍａｂ－Ｚａｐを使用した。ＴＣＲ様抗体によってより多くの腫瘍細胞ペプチド／ＨＬＡ標的が特異的に結合されると、２０μｇ／ｍｌＫＩＦペプチド負荷について、ＥＣ５０値は０．１０２ｎＭおよび０．１２２ｎＭでそれぞれ類似したが、細胞の生存率は減少した。１ｕｇ／ｍｌＫＩＦのペプチドパルス化条件下で、ＴＣＲ様抗体のおよそ２１，０００の分子はＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を結合し、蛋白質合成の抑制を介して生存率が８０％近くに減少した。一旦、ＴＣＲ様抗体が１つの細胞当たり４７，０００の分子を超える腫瘍細胞を結合すると、標的生存率は約６０％まで減少した。

強力な小分子薬剤に直接抱合したＴＣＲ様抗体を使用して、インビトロでの標的細胞死を誘発するために必要とされる最小面結合ペプチド／ＨＬＡ－Ａ２発現を判定するために、ＴＣＲ様抗体はＤＮＡアルキル化分子デュオカルマイシンに結合され、ＫＩＦペプチドの様々な濃度でペプチドパルスされたＭＤＡ－ＭＢＡ－２３１細胞と共にインキュベートした。示されるように、１つの細胞当たりたった３５０のＫＩＦ／ＨＬＡ－Ａ２分子を内部に持つＭＤＡＭＢＡ－２３１細胞は、培養中で容易に殺され得る。要するに、これらの結果は、観察可能な腫瘍細胞死を刺激するための、閾値レベルの標的ペプチド／ＨＬＡを結合するＴＣＲ様免疫毒素／ＡＤＣの重要性を確証する。臨床材料で慣例的に観察された生理的レベルのＴＡ／ＨＬＡ複合体（１つの細胞当たり＜１，０００のコピー）を標的とする場合に、選択ＴＣＲ様ＡＤＣも巧みに腫瘍増殖を最小限にした。

＜実施例１５－癌細胞のＨＬＡ－Ｅに結合するペプチドの発見および検証＞
癌細胞のＨＬＡ－Ｅに結合されたネオペプチドを発見および検証するために２段階の過程を用いた。ペプチドをＨＬＡ－Ｅ複合体に負荷するための、代替的抗原処理経路に由来するネオペプチドを予測するために、インシリコ発見学習を使用した。その後、直接患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）組織を使用して、同定された標的を検証した。

癌細胞および感染因子から報告されたＨＬＡ－Ｅ結合ペプチドを含む予め報告されたペプチド配列に加えて、ＨＬＡ－Ｅペプチド結合ポケットをモデル化する新しく発展した予測的アルゴリズムを使用してＨＬＡ－Ｅに結合するために予測されたペプチドを使用した。いくつかのアルゴリズムは、パブリックドメイン（つまり、ＮＥＴＭＨＣ４．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣ－４．０／）およびＩＥＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ）において利用可能であり、ならびに古典的ＨＬＡ－Ｉ対立遺伝子に結合するペプチドを予測するのに有用であり、癌細胞中のＨＬＡ－Ｅに結合するペプチドを高精度予測することは困難であり、かつ新しい予測的アルゴリズムの開発を必要とする。

＜ＨＬＡ－Ｅに結合する癌ペプチドを予測するための新規アプローチ－癌に適用されるタンパク質選択＞
簡潔に言えば、ｍＲＮＡ発現データをがん細胞株百科事典（ＣＣＬＥ）からダウンロードし、および各癌組織について、＞＝９の細胞株にわたって平均発現を示した遺伝子（８～１２の範囲）を保持した。がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）から遺伝子発現データおよび臨床データを入手し、患者情報は、いくつかの癌の種類（肺癌、乳癌、結腸直腸癌、黒色腫性癌および肝臓癌）の遺伝子発現と一致した。ＴＣＧＡデータを使用して、Ｃｏｘ回帰を用いてすべての遺伝子の生存率分析を行ない、＞＝１．１のハザード比（ＨＲ）および＜＝０．０５のｐ値を用いて各癌の種類の遺伝子を選択した。その後、患者予後不良を予測する癌細胞株中で最終リストが高度に発現した遺伝子のみを有するように、ＣＣＬＥおよびＴＣＧＡの遺伝子を交差させた。選択された遺伝子から、レビューされたヒト蛋白質配列のリストをＵｎｉｐｒｏｔからダウンロードした。

＜タンパク質ドッキングおよびペプチドの順位＞
ＩｎｔｅｒｎａｌＣｏｏｒｄｉｎａｔｅＭｅｃｈａｎｉｃｓ（ＩＣＭ）ドッキング方法に従って、各分類された結合剤の仮想スクリーニングおよびスコアリングを行った。ＩＣＭのスコア関数はリガンドと受容体との間の自由エネルギーを結合する良好な近似を提供し、力場に基づく様々なエネルギー用語と相関する。関数は、（ｉ）リガンドの力場エネルギー（ｉｉ）結合状態と非結合の状態間のリガンドのエントロピー欠損、（ｉｉｉ）リガンド受容体水素結合相互作用、（ｉｖ）結合状態と非結合状態間の極性・無極性の溶媒和エネルギーの差、（ｖ）静電エネルギー、（ｖｉ）疎水性エネルギー、および（ｖｉｉ）水素結合供与体またはアクセプター脱溶媒和のパラメーター毎に重みが加えられる。ＩＣＭスコアが低いほど、リガンドが結合剤であるという可能性が高い。

ＨＬＡ－Ｅ結合ペプチドをランク付けするためのＩＣＭスコアを使用したドッキングシミュレーションを、文献で見つかったペプチドＶＭＡＰＲＴＬＩＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）ならびに結核菌に由来するＩＥＤＢおよびＨＬＡ－Ｅ結合剤を用いて試験した（表２）。結合の最適な自由エネルギー（最も負のＩＣＭスコア）を有するＶＭＡＰＲＴＬＩＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）は、ドッキングシミュレーション実験で結合ポケットに最も適合する。

＜予測されたペプチドのリスト＞
表３は、タンパク質選択法、プロテアソーム分解分類、ＨＬＡ－Ｅペプチド分類、およびドッキングモデル化を適用した後の、様々な癌組織に存在するタンパク質に由来する予測されたペプチドを示す。タンパク質およびペプチドの位置の一般的な情報に加えて、表は、ＩＣＭスコア、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）データおよびプロテオミクスデータを含む。ヒトタンパク質アトラスからＩＨＣデータを入手した。乳癌、大腸癌、肺癌、リンパ腫癌、および皮膚癌からのＩＨＣ染色を判定した。データは、高、中、低の３つレベルで検出された事例の数、または未検出（ＮＤ）を示す。ＮＣＩ－６０プロテオームソースからプロテオミクスデータをダウンロードした。ＮＣＩ－６０パネルは、９つの異なる組織（脳、血液および骨髄、乳房、結腸、腎臓、肺、子房、前立腺、および皮膚）に由来する５９の個々の癌細胞株を含み、それを、対数１０タンパク質強度スケールでのタンパク質のＬＦＱおよびｉＢＡＱ定量化を含む様々なアプローチによって分析した。

＜標的検証＞
表３で示される予測されたペプチドを、患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）組織サンプルを使用して検証した。ＨＬＡ－Ｅ複合体に結合されたペプチドの下流分析のために、肺癌患者からのＰＤＸ組織をＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体の単離のために処理した（図６）。ＰＤＸモデルＬＵ５１３９は以下の特徴を有する：

さらに、腫瘍組織は以下のＨＬＡアロタイプを有する：Ａ^＊０２：０１、Ａ^＊０２：０１、Ｂ^＊０７：０５、Ｂ^＊０７：０５、Ｃ^＊０３：０３、およびＣ^＊０７：０２。

ＰＤＸ肺腫瘍組織はＣｒｏｗｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入し、ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体の抽出に使用した。簡潔に言えば、冷凍保存されたＰＤＸ組織を、１０ｍｌの溶解緩衝剤（０．２ｍＭのヨードアセトアミド、１ｍＭＥＤＴＡ、１：２００のプロテアーゼ阻害剤カクテルの稀釈液、１ｍＭのＰＭＳＦ、および１％のオクチル－β－Ｄ－グルコピラノシド）に加え、氷上で１０秒間均質化し、４℃で１時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、サンプルを４０，０００ｇで２０分間遠心分離して、上清を澄ました。サンプルの上清の一定分量を取り除き、タンパク質濃度をＢＣＡアッセイによって決定した。

ＨＬＡ－Ｅに特異的なマウスＩｇＧ１モノクローナル抗体を産出する４Ｄ１２ハイブリドーマ（ＡＴＣＣ）を、生ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体の濃縮のためのアフィニティーカラムを生成するために使用した。簡潔に言えば、処理した腫瘍組織からの澄まされた上清をカラムに加え、カラム上で４℃で２時間、連続的に再循環した。その後、カラムを１ＸＰＢＳを用いて洗浄し、続いて、２つのカラム体積の滅菌精製水（ＭｉｌｌｉＱｗａｔｅｒ）を用いて洗浄した。次に、アフィニティーカラムを１０ｍｌの０．１Ｍのグリシン緩衝剤ｐＨ３．０で処理し、１ｍｌのサンプル一定分量を集めてタンパク質について評価した。０．１ｍｌの０．１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３を用いて、サンプルを直ちに中和した。タンパク質サンプルを含む管をプールし、乾燥に先立って濾過（５ｋＤａＭＷカットオフ）および脱塩カラムを使用して＜１ｍｌまで濃縮した。

ＯａｓｉｓＨＬＢ溶出液プレート（Ｗａｔｅｒｓ）を用いてペプチド混合物サンプルに固相抽出クリーンナップを行い、および最終の３０００ＲＳＬＣナノ液体クロマトグラフィーシステム（Ｄｉｏｎｅｘ）に結合されたＯｒｂｉｔｒａｐＦｕｓｉｏｎＬｕｍｏｓ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ）を使用して、結果としてもたらされるサンプルをＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。サンプルを内径７５μｍ、長さ５０ｃｍのＥａｓｙＳｐｒａｙカラム（Ｔｈｅｒｍｏ）に注入し、０－２８％の緩衝剤Ｂの勾配で６０分間にわたって溶出した。緩衡剤Ａは、水中に２％（ｖ／ｖ）のＡＣＮおよび０．１％のギ酸を含んでおり、緩衡剤Ｂは、水中に８０％（ｖ／ｖ）のＡＣＮ、１０％（ｖ／ｖ）のトリフルオロエタノール、および０．１％のギ酸を含んでいた。２．２ｋＶの電源電圧および２７５℃のイオン転送管温度で、質量分析計を正イオン形態で動作した。ＭＳ走査は、Ｏｒｂｉｔｒａｐにおいて１２０，０００解像度で取得し、および最大１０のＭＳ／ＭＳのスペクトルを、電荷１－３を有するイオンのより高いエネルギーの衝突解離（ＨＣＤ）を使用して取得した各フルスペクトルのためのイオントラップで得た。フラグメンテーションのためのイオンが選択された後、動的排除を２５秒間設定した。

表４で示されるのは、肺ＰＤＸ組織で検出された３つのペプチドである。ペプチドＧＬＡＤＫＶＹＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）およびＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）についてのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ結果は、図７Ａ－７Ｃおよび図８Ａ－８Ｃにそれぞれ示される。

＜実施例１６－ペプチドを含む組み換えＨＬＡ－Ｅ単量体の生成＞
ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）およびＨＬＡ－Ｅ（^＊０１０１および^＊０１０３）の細胞外のドメインは、大腸菌中で封入体を生成し、および１０μＭのペプチドでリフォールディングした。重鎖遺伝子配列を変異誘発することによって、可溶性ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体を得て、細胞質ゾルおよび細胞膜貫通領域を取り除いた。リフォールディングされた単量体ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体を特異的にビオチン化するために、Ｃ末端に特異的なビオチン標識部位を含む重鎖（ＨＬＡ－Ｅ）が融合タンパク質として発現された。これらの短い配列は、ビオチンタンパク質リガーゼＢｉｒＡ（Ａｖｉｄｉｔｙ，ＣＯ）を使用した、この配列内の単一のリシン残基の酵素的インビトロでのビオチン標識に十分である。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５サイジングカラムの上で実行した後に、ＮＧＣ（登録商標）中圧液体クロマトグラフィーシステム（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、リフォールディングされた材料を集めた。図９Ａ、図１０Ａ、図１１Ａ、および図１２Ａにおいて、クロマトグラムからの第２のピークは、正確にリフォールディングされたＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体を表す。還元条件下でのＳＤＳ－ゲル電気泳動による適切にリフォールディングされた材料（ピーク２）の確認が、図９Ｂ、図１０Ｂ、図１１Ｂ、および図１２Ｂで示される。～３３ｋＤおよび～１１Ｋｄで移動する２本のバンドが、ＨＬＡ－Ｅ重鎖およびＢ２Ｍタンパク質の存在をそれぞれ示すことに留意すべきである。その後、完全な複合体（ＨＬＡ－Ｅ、Ｂ２Ｍおよびペプチド）として関連する材料の割合を評価するために、ＨＰＬＣ分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用した。完全な複合体の予期された保持時間は、Ｘ－ＢｒｉｄｇｅＳＥＣを使用して～６．３８４分であるべきである。最後に、リフォールディングされた材料を、ＲｅｓｏＳｅｎｓフリーラベルテクノロジーシステム（ＲＳＩ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＴＸ）で評価した。次に、ニュートラアビジン被覆バイオネティックプレートを、１０μｇ／ｍｌのビオチン標識ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体と共にインキュベートした。無標識のバイオネティックプレート（ＲＳＩ）上で固定されたＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体に対する立体構造依存性抗－ＨＬＡ－Ｅ抗体である３Ｄ１２（Ａｂｃａｍ）の結合によって、正確にリフォールディングされた組み換えＨＬＡ－Ｅ－ペプチドを決定した。

＜実施例１７－ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体に対するＴＣＲ様抗体の発見＞
現在開示および主張される発明概念にしたがって利用されたＴ細胞受容体様抗体を、対象のペプチドを同定することを含む多くの方法によって生産し、ここで、対象のペプチドは、非古典的ＭＨＣＩ分子によって提示され得、および、特にペプチド／ＨＬＡ－Ｅ複合体である。ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体に対する抗体を生成するために使用される全体的な抗体の発見工程が図１３で例証される。２つの標準のインビトロのディスプレイテクノロジー（すなわち、ファージディスプレイと酵母ディスプレイ）を、ナイーブヒトおよび免疫マウス、ならびにラマライブラリーと共に使用した。選択工程（つまり、正と負の選択および枯渇、ならびにブロッキング分子）を、対象のＨＬＡ－Ｅ－ペプチド標的に対する結合剤を発見するために最適化した。

＜抗体ファージディスプレイライブラリーに使用される標準プロトコルの概要：＞
１ｍｌのＰＢＳ中で、ストレプトアビジン常磁性ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（３０ｕｌ；Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）および１５０ｕｇのビオチン化されていないＨＬＡ－Ａ２ペプチドおよびＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体（無関係の複合体）と共に、ファージを最初にプレインキュベートして、ストレプトアビジンまたはＨＬＡ－Ａ２およびＨＬＡ－Ｅの一般的なフレームワークに結合する抗体を発現したあらゆるファージも取り除いた。

続いて、磁石を使用してＤＹＮＡＢＥＡＤＳを捕捉し、７．５ｕｇのビオチン化したＨＬＡ－Ｅ－ペプチド（対象のＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体）を含む別々の管に上清（ファージおよび無関係の複合混合物）を移し、ＲＴで１時間インキュベートした。その後、２００ｕｌのＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（２％の乳と共にプレインキュベートし、ＰＢＳを用いて洗浄した）に最終混合物（１ｍｌ）を加え、内容物をＲＴで連続的な循環で１５分間混合した。次に、ビーズを、ＰＢＳ／０．１％ＴＷＥＥＮを用いて１０回およびＰＢＳを用いて３回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌのトリプシンを使用してＤＹＮＡＢＥＡＤＳから結合ファージをＰＢＳ（０．５ｍｌ）においてＲＴで１５分間溶出した。

２０ｍｌのＬＢ中で３７℃で大腸菌（対数期で増殖する）のＴＧ１菌株を１時間感染させるためにファージを使用した。続いて、１０１２のＭ１３ＫＯヘルパーファージを混合物に加え、追加の３０分間さらにインキュベートし、および遠心分離（３０００ｒｐｍで１０分間）を使用して細胞をペレット状にした。結果としてもたらされる細胞ペレットを２００ｍｌのＬＢ＋アンピシリン（１００ｕｇ／ｍｌ）＋カナマイシン（５０ｕｇ／ｍｌ）で再懸濁し、３０℃で一晩インキュベートした。

翌朝、一晩の培養を３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、前ラウンドの選択からの増幅ファージを沈殿させるように、上清（１８０ｍｌ）をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と氷上で１時間混合した。その後、ＰＥＧ／ファージ混合物を３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、結果としてもたらされるファージペレットの一部を続くパニングのラウンドに使用し、残りを１５％のグリセロールにおいて－８０℃で冷凍した。ＤＹＮＡＢＥＡＤ洗浄工程の増加および選択に使用されるビオチン化した複合体の量の減少を伴う上記と同じプロトコルを使用して続くラウンドのパニングを行った。

抗体選択最終ラウンド後、ＨＢ２１５１細胞をアンピシリン（１００ｕｇ／ｍｌ）寒天板上に蒔きながら、上記のＴＧ１株を感染させるためにファージを使用した。翌朝、寒天板からの個々のコロニーを採取し、４００ｕｌＬＢ＋アンピシリン（１００ｕｇ／ｍｌ）／ウェルを含む４８ウェルプレートも個々のウェルを播種するために使用した。３７℃で３－６時間インキュベートした後、２００ｕｌの５０％のグリセリン溶液を各ウェル加え、プレートをモノクローナル保存培養として－８０℃で保存した。

＜あらかじめ作られたヒト半合成抗体ライブラリーからの抗体結合剤の発見＞：
ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＶＭＡＬＲＴＬＦＬに対する単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ＨＬＡ－Ｇ由来のシグナルペプチドを発見し、ファージディスプレイ・ヒト半合成ｓｃＦｖライブラリーから分離させた。ｐＩＸ融合による単一ディスプレイを使用するファージライブラリーを、半合成ＶＨおよびＶＬ遺伝子を使用してｓｃＦｖ形式で構築して、１．４２ｘ１０^９の全多様性を作成した。Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージと共に大腸菌ＴＧ１宿主株を使用して、ライブラリーを繁殖した。

＜標的ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＶＭＡＬＲＴＬＦＬの溶液中バイオパニング＞：
ライブラリーを使用する前直前に、ファージサンプルを沈殿させ、５，０００ｇで１０分間遠心分離し、２％のＭ－ＰＢＳ中でペレット状のサンプルを再懸濁した。その後、１ｍｌ－Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＴ１）にライブラリーを連続して加え、室温での１時間のインキュベーション後、管を磁石ラックに１分間置いて、ビーズを有する非特異的結合ファージを取り除いた。その後、ファージを含む吸引された上清をブロッキング緩衝剤、２％のＭ－ＰＢＳを含むビーズに加え、および＃１からの工程（１ｍｌ－Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＴ１）と共にインキュベーション）を繰り返した。最後に、ファージを含む上清をストレプトアビジン被覆ビーズと混合し、４つのビオチン化された標的（すべてのＨＬＡ－Ａ２ペプチド複合体）と共にインキュベートし、非特異的結合ファージを枯渇させる。工程３は、ブロッキング試薬として使用されたビオチン化されていないＨＬＡ－Ａ２ペプチドを含んでいた。

標的特異性を有するｓｃＦｖファージ粒子を単離させるために、ビオチン化したＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＶＭＡＬＲＴＬＦＬでストレプトアビジンビーズをコーティングした。バイオパニング工程は、ブロッキング分子として使用されるビオチン化されていない無作為のＨＬＡ－Ａ２ペプチドの添加を含んでいた。濃縮因子は、標的であるＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬＦに対する第１ラウンドのバイオパニングにおいて２．７３ｘ１０^６であった。

出力ファージを増幅し、２ラウンド目のバイオパニングにさらした。ＨＬＡ－Ａ２ペプチド複合体の混合物を使用する前のように、枯渇およびプレブロッキングする工程を実行し、次に、ライブラリーをＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬに対してスクリーニングした。濃縮要因は、標的に対する２ラウンド目のバイオパニングにおいて４．０３×１０^２であった。加えて、標的スクリーニングは、ＨＬＡ－Ｅのネガティブコントロール（ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＹＬＬＰＡＩＶＨＩ）といかなる標的でもコーティングされていないウェルとの違いを示した。

標的抗原に結合するファージ抗体をさらに濃縮するために、３ラウンド目のバイオパニングを行なった。ネガティブコントロール（ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３ペプチド）およびコーティングなしと比較して、２．３１×１０^２の濃縮要因を得た。さらに、標的としてＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬおよびＨＬＡ－Ａ２ペプチド混合物を使用して、ポリクローナルのファージＥＬＩＳＡを実行した。ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬでコーティングされるウェルは、ＨＬＡ－Ａ２ペプチド混合物でコーティングされるウェルよりも非常に大きなＯＤ４５０ｎｍ値を有し、標的であるＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬペプチドに結合するｓｃＦｖファージ結合の成功した濃縮を示唆する。

最終ラウンドのバイオパニングを、ＨＬＡ－Ａ２ペプチド混合物の代わりにビオチン化されたＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＹＬＬＰＡＩＶＨＩペプチドを使用するという変更を伴って行ない、ＨＬＡ－Ｅの交差反応性ファージ抗体を除去した。加えて、ビオチン化されていないＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＹＬＬＰＡＩＶＨＩペプチドを、ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ標的を含むビーズでプレブロッキングするために使用した。

第４ラウンドのバイオパニングの出力から４０のクローンを選んだ。モノクローナルのファージＥＬＩＳＡを、図１４Ａに示されるように行なった。遺伝子配列によって決定された１つの固有のクローンを同定し、続いて、それを大腸菌中のｓｃＦｖとしておよび下流特性評価のためのＨＥＫ２９３細胞中のＩｇＧ１として発現させた。図１４Ａ－図１４Ｄは、Ｒ４についてのヒト化抗体ｓｃＦｖＥＬＩＳＡデータ、ＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬに対するマウスｓｃＦｖライブラリーおよびＶＨＨライブラリーを例証する。

＜免疫化マウスファージライブラリーからの抗体結合剤の発見＞：
最初にマウスを免疫化することによって、続いて、バクテリオファージによるディスプレイのための抗体ライブラリーを構築することによって、Ｔ細胞受容体様抗体を生成した。１つのペプチド／ＨＬＡ－Ｅ複合体の単量体を含む有効量の免疫原（ここで、ペプチドは対象のペプチドである）の免疫反応を誘発するために宿主に投与し、ここで、ＨＬＡ－Ｅ分子の結合溝でのペプチドの三次元提示に対する免疫反応を誘発するのに十分な期間、免疫原がその三次元形態を保持した。その後、宿主から集められた血清を分析して、ＨＬＡ－Ｅ分子の結合溝でのぺプチドの三次元提示を認識する所望の抗体が生成されているか否かを判定し、ここで、所望の抗体が、ペプチド／ＨＬＡ－Ｅ複合体を、ＨＬＡ－Ｅ分子のみ、対象のペプチドのみ、ならびにＨＬＡ－Ｅおよび無関係のペプチドの複合体と区別する。次に、マウス脾臓を免疫化された動物から単離し、抗体ライブラリーをバクテリオファージまたは酵母、あるいは他のディスプレイシステムを使用して構築した。

一般的に、４匹の雌のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｂｋ／６、ＣＤ－１、およびＣＦＷなどのマウス系統も使用する）を免疫化し、最良のレスポンダーからの脾臓をライブラリー構築のために選択した。簡潔に言えば、マウスに３週間の間隔で皮下に３回免疫化し、１回あたり５０μｇの単量体形態の抗原ＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬの注射を受け取った。最後の注射の１週間後に、免疫化されたマウスからの血清を集めて、ＥＬＩＳＡによってＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬに対する抗体応答を試験した。いくつかの免疫化されたマウスにおいて達成された力価は、１：１０２，０００より大きく、および最良の反応性マウスからの脾臓を取り除いて、ｓｃＦｖ抗体ファージライブラリーを構築するために使用した。ＴｒｉＺｏｌ方法を使用して全ＲＮＡを単離し、その後、ゲル電気泳動によってＲＮＡの品質を評価した。

マウスＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子のＰＣＲ増幅を次に行なった。簡潔に言えば、マウス特異的プライマーを使用して、ｃＤＮＡ鋳型からＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を増幅した。重複ＰＣＲによってｓｃＦｖカセットを組み立てた。制限酵素を使用してｓｃＦｖ遺伝子およびファージミド（ｐＨＥＮ１）を消化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと一緒に連結させた。ＴＧ１大腸菌コンピテント細胞を電気形質転換するために使用する前に、ライゲーション混合物を蒸留水中で脱塩および再懸濁して、最終ライブラリーを構築した。最後に、ｓｃＦｖタンパク質を表示するファージを、標準方法に従ってヘルパーファージＭ１３ＫＯ７でパッケージングした。

標準プロトコルを使用するＱＣ－ＰＣＲによって、ライブラリーの品質を評価した。ＰＣＲ評価からの結果は、３０のクローンのうち３０のクローンがｓｃＦｖ挿入を保持し、および配列決定に提出された２１のクローンは、完全なｓｃＦｖ遺伝子の固有の配列データを有することを明らかにした。更に、末端ライブラリーは、５．５ｘ１０^８の多様性を有すると判定した。

＜ライブラリースクリーニング＞：

標的ＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬを用いた免疫化を介して生成されたｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーを、溶液中バイオパニング技術を使用して特異的な結合剤を選択するために使用した。ライブラリーを使用する直前に、ファージサンプルを沈殿させ、５，０００ｇで１０分間遠心分離し、およびペレット状のサンプルを２％のＭ－ＰＢＳで再懸濁した。その後、ライブラリーを１ｍｌ－Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＴ１）に連続して加え、室温で１時間インキュベートした後、管を磁気ラックに１分間置いて、ビーズを有する非特異的結合ファージを取り除いた。次に、吸引されたファージを含む上清をブロッキング緩衝剤である２％のＭ－ＰＢＳを含むビーズに加え、および＃１からの工程（１ｍｌ－Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＴ１））を繰り返した。最後に、ファージを含む上清をストレプトアビジン被覆ビーズと混合し、４つのビオチン化された標的（すべてのＨＬＡ－Ａ２ペプチド複合体）と共にインキュベートし、非特異的結合ファージを枯渇させた。工程３は、ブロッキング試薬として使用されたビオチン化されていないＨＬＡ－Ａ２ペプチドを含んでいた。

最初の２つのラウンドのバイオパニングにおいて、ビオチン標識されていないＨＬＡ－Ａ２ペプチド混合物を使用するブロッキング戦略の封入体に加えて、ビオチン標識ＨＬＡ－Ａ２ペプチドを使用して枯渇を行ない、ライブラリー中の非特異的ｓｃＦｖ発現ファージの結合を除去および防いだ。この工程に続いて、ビオチン標識ＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬを使用して標的についてポジティブパニングを行なった。平行して、コーティングされていないグループ（抗原なし）およびビオチン標識ＨＬＡ－Ａ２ペプチドでコーティングされたグループに対する、同じ免疫性ｓｃＦｖファージライブラリーのパニングを行った。標的グループとネガティブコントロールのスクリーニンググループとの間の差を伴う、ある程度の濃縮を観察した。次に、枯渇およびプレブロッキングのために、ビオチン標識ＨＬＡ－Ｅ－ＹＬＬＰＡＩＶＨＩを使用して、３ラウンド目のバイオパニングを行なった。その後、ビオチン標識ＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬのポジティブパニングを行なった。平行して、２つのコントロールグループに対してライブラリーを再びパニングした：コーティングされていないグループおよびビオチン標識ＨＬＡ－Ｅ－ＹＬＬＰＡＩＶＨＩでコーティングされたグループ。標的グループおよびコントロールスクリーニンググループの間で濃縮を観察した。濃縮の特異性を検証するために３ラウウンド目の溶出液出力から４０のクローンを選択し、ポジティブ標的ＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬに結合された１３のクローンおよびそのグループからの６つのクローンが固有の配列を有した（図１４Ｂ）。

異なる免疫化されたマウスｓｃＦｖライブラリーからの抗体結合剤も発見した。４匹の雌のＢａｌｂ／ｃマウスを３週間の間隔で皮下に３回免疫化し、１回あたり５０μｇの単量体形態の抗原ＨＬＡ－Ｅ－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩの注射を受け取った。最後の注射の１週間後に、免疫化されたマウスから血清を集めて、ＥＬＩＳＡによって抗体応答を試験した。いくつかの免疫化されたマウスにおいて達成された力価は、１：１０２，０００より大きく、および最良の反応性マウスからの脾臓を取り除いて、ｓｃＦｖ抗体ファージライブラリーを構築するために使用した。ＴｒｉＺｏｌ方法を使用して全ＲＮＡを単離し、その後、ゲル電気泳動によってＲＮＡを評価した。

次にＰＣＲ増幅を行なった。簡潔に言えば、マウス特異的プライマーを使用して、ｃＤＮＡ鋳型からＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を増幅した。重複ＰＣＲによってｓｃＦｖカセットを組み立てた。制限酵素を使用してｓｃＦｖ遺伝子およびファージミド（ｐＨＥＮ１）を消化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと一緒に連結させた。ＴＧ１大腸菌コンピテント細胞を電気形質転換するために使用する前に、ライゲーション混合物を蒸留水中で脱塩および再懸濁して、最終ライブラリーを構築した。最後に、標準方法に従って、ヘルパーファージＭ１３Ｋｏ７の助けを借りてｓｃＦｖタンパク質を表示するファージをパッケージングした。

ライブラリーの品質をＱＣ－ＰＣＲによって評価した。この評価からの結果は、３０のクローンのうち３０クローンがｓｃＦｖ挿入を保持し、配列決定に提出された２１のクローンが完全なｓｃＦｖ遺伝子を有し、およびすべて固有であったことを明らかにした。更に、末端ライブラリーは、５．５ｘ１０８の多様性を有すると判定した。

＜ライブラリースクリーニング＞：

標的ＨＬＡ－Ｅ－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩを用いた免疫化を介して生成されたｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーを、特異的な結合剤を選択するために使用した。最初の２ラウンドのバイオパニングにおいて、ビオチン標識されていないＨＬＡ－Ａ２－ＭＬＣＫＭＧＦＡＶペプチドを使用するブロッキング戦略の封入体に加えて、ビオチン標識ＨＬＡ－Ａ２－ＭＬＣＫＭＧＦＡＶペプチドを使用して枯渇を行ない、ライブラリー中の非特異的ｓｃＦｖ発現ファージの結合を除去および防いだ。この工程に従って、標的ビオチン標識ＨＬＡ－Ｅ－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩのポジティブパニングを行なった。平行して、コーティングされていないグループ（抗原なし）およびビオチン標識ＨＬＡ－Ａ２－ＭＬＣＫＭＧＦＡＶペプチドでコーティングされたグループに対する同じｓｃＦｖファージライブラリーのパニングを行った。標的グループおよびコントロールスクリーニンググループの間で明らかな違いを有する、明らかな濃縮を観察した（入力：８ｘ１０^１１；出力：ＨＬＡ－Ｅ－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ＝１．５ｘ１０^７；ＨＬＡ－Ａ２－ＭＬＣＫＭＧＦＡＣ＝８．０ｘ１０^５；抗原なし－１．１ｘ１０^６）。次に、枯渇およびプレブロッキングのために、ビオチン標識ＨＬＡ－Ｅ－ＭＬＡＬＬＴＱＶＡおよびＨＬＡ－Ｅ－ＧＬＡＤＫＶＹＦＬを使用して、３ラウンド目のバイオパニングを行なった。その後、ビオチン標識ＨＬＡ－Ｅ－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩのポジティブパニングを行った。平行して、２つのコントロールグループに対してライブラリーを再びパニングした；コーティングされていないグループおよびビオチン標識ＨＬＡ－Ｅ－ＭＬＡＬＬＴＱＶＡおよびＨＬＡ－Ｅ－ＧＬＡＤＫＶＹＦＬでコーティングされたグループ。標的グループとコントロールスクリーニンググループとの間の良好な違いを有する明らかな濃縮を観察した（入力－７．０ｘ１０^１１；出力：ＨＬＡ－Ｅ－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ＝３．８ｘ１０^７；ＨＬＡ－Ｅ－ＭＬＡＬＬＴＱＶＡ＋ＨＬＡ－Ｅ－ＧＬＡＤＫＶＹＦＬ＝４．１ｘ１０^６；抗原なし＝３．０ｘ１０^６）。濃縮の特異性を検証するために、３のラウンド目の溶出液出力から４０のクローンを選択し、ポジティブ標的ＨＬＡ－Ｅ－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩに結合する２１のクローンおよびそのグループからの６つのクローンが固有の配列を有した（図１５）。

＜免疫化されたラマ抗体ライブラリー＞：
免疫化されたラマファージライブラリーからの単一ドメイン抗体も生成した。ラマはＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ四量体で免疫化され、ファージディスプレイライブラリーおよびイスートディスプレイライブラリーの両方を構築した。図１４Ｄは、ＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ標的に対する結合剤の発見を例証する。

ストレプトアビジンおよびニュートラアビジンなどのアビジンまたはアビジンの誘導体を有するビオチン化された単量体使用して形成されるペプチド／ＨＬＡ－Ｅ四量体を用いて、有効量の免疫原も形成して、ペプチド／ＨＬＡ－Ｅの四量体複合体を形成した。免疫原をＭａｇｉｃ（登録商標）アジュバント（ＣｒｅａｔｉｖｅＢｉｏＬａｂｓ）を用いて調製し、および免疫反応を誘発するために動物の皮下に投与し、ここで、ＨＬＡ－ＥＭＨＣＩ分子の結合溝中のペプチドの三次元提示に対する免疫反応を誘発するのに十分な期間、免疫原がそのペプチド／ＨＬＡ－Ｅ複合体の三次元形態を保持する。ＶＨＨ単一ドメイン抗体を生成する場合には、２００μｇのＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ四量体（６：１の比率でストレプトアビジンに加えられたリフォールディングされたビオチン標識単量体）を用いて、ラマを６週間毎週免疫化し、および、免疫化に先立って、ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド材料をマジックアジュバント用いて１：１に希釈した。

免疫前および免疫後血清を集めて、ＥＬＩＳＡによって抗体応答をモニターした。ＨＬＡＥ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ標的に対する力価は、＞１００，０００であった。２００ｍｌの血液を取り除き、ＴｒｉＺｏｌ方法を使用して全ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡをゲル電気泳動によって評価し、高品質であることが示された。固有のフォワードプライマーを使用して、逆転写の後に、ＶＨＨ遺伝子を２つのラウンドのＰＣＲによって増幅した：
ＶＨＨ１．１：
５’ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＡＣＴＣＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧ－３’（ｓｆｉｌ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０）；
ＶＨＨ１．２：
５’ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＡＣＴＣＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＴＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧ－３’（ｓｆｉｌ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１）；
ＶＨＨ１．４：
５’－ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＡＣＴＧＣＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＧＧＧ－３’（ｓｆｉｌ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２）および後方のプライマーＣＨ２：
第１のＰＣＲ反応のための５’－ＣＧＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＡＣＣＡＧＴＴＧＡ－３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３）
第２ラウンドの増幅のために、同じフォワードプライマーをバックプライマーＪＨと共に使用した：
５’－ＣＣＡＣＧＡＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣ（ＡＧ）ＧＴＧＡＣＣＴＧＧＧＴＣＣ－３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４）（Ｉではない）。

ＰＣＲ結果は、図を１４Ｃに示される。ＰＣＲ産物およびファージミドＤＮＡ（ｐＨＥＮ１）を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと一緒に連結される前に、個別に制限酵素で切断した。ライゲーション混合物を脱塩し、宿主としての大腸菌ＴＧ１とともに電子形質転換にさらした。ＶＨＨタンパク質をパッケージングし、表示するためにＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージを使用した。ライブラリーは１．２×１０^８の多様性を有すると判定され、４８のクローンが選ばれ、標的遺伝子の挿入率を検出するためにＰＣＲ解析を行なった。４７／４８のクローンがＶＨＨ遺伝子挿入を有すると判定した。末端ライブラリーからのクローンをＤＮＡ配列決定にさらし、配列の十分な分析のために整列させた。すべてのクローンが、高度な多様性ライブラリーの構築を示す固有の配列を提示することを発見した。

＜ライブラリースクリーニング＞：

免疫原ＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬに対する結合剤を選択するために、ＶＨＨライブラリーを使用した。最初の２つのラウンドのバイオパニングについて、ビオチン標識されていないＨＬＡ－Ａ２－ＭＬＣＫＭＧＦＡＶペプチドを使用するブロッキング工程の封入体に加えて、ビオチン標識ＨＬＡ－Ａ２－ＭＬＣＫＭＧＦＡＶペプチドを使用して枯渇を行い、ライブラリー中の非特異的ＶＨＨ発現ファージの結合を除去および防いだ。この工程に従って、標的ビオチン標識ＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬについてのポジティブパニングを行った。平行して、コーティングされていないグループ（抗原なし）およびビオチン標識ＨＬＡ－Ａ２－ＭＬＣＫＭＧＦＡＶペプチドでコーティングされたグループに対するファージライブラリーのパニングを行った。標的グループおよびコントロールスクリーニンググループの間の明らかな違いを有する、明らかな濃縮を観察した（入力：６ｘ１０^１１；出力：ＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬＦ＝３．６ｘ１０^７；ＨＬＡ－Ａ２－ＭＬＣＫＭＧＦＡＣ＝８．５ｘ１０^６；抗原なし－８．０ｘ１０^６）。次に、枯渇およびプレブロッキングのために、ビオチン標識ＨＬＡ－Ｅ－ＹＬＬＰＡＩＶＨＩを使用して３ラウンド目のバイオパニングを行なった。その後、ビオチン標識ＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬのポジティブパニングを行なった。平行して、２つのコントロールグループに対してライブラリーを再びパニングした：コーティングされていないグループおよびビオチン標識ＨＬＡ－Ｅ－ＹＬＬＰＡＩＶＨＩでコーティングされたグループ。標的グループおよびコントロールスクリーニンググループとの間のわずかな違いを有する濃縮を観察した（入力－８ｘ１０^１１；出力：ＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬＦ＝６．９ｘ１０^８；ＨＬＡ－Ａ２－ＭＬＣＫＭＧＦＡＣ＝４．３５ｘ１０^８；抗原なし＝２．３５ｘ１０^８）。濃縮の特異性を検証するために溶出液出力の３ラウンド目から４０のクローンを選択し、ポジティブ標的ＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬに結合する２３のクローンおよびグループからの１５のクローンが固有の配列を有した（図１４Ｄ）。

その後、同定された特有のクローンを、結合動態および結合特異性に基づいて、ＲｅｓｏＳｅｎｓラベルフリーテクノロジーランク付け特異的結合剤（ＲｅｓｏＳｅｎｓｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｒａｎｋ－ｏｒｄｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃｂｉｎｄｅｒｓ）を使用してスクリーニングした。

＜酵母抗体ライブラリー構築およびＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体の一般的な選択スキーム＞：
マウスおよびラマをそれぞれ、ＨＬＡ－Ｅ－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩペプチド複合体の単量体を用いて免疫化し、ならびにＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬペプチド複合体を四量体化した。Ｖ遺伝子の逆転写およびＰＣＲ増幅によって、ｓｃＦｖまたは単一ドメインのＶＨＨ抗体を構築した。抗体ライブラリーをｓｃＦｖまたは単一ドメインのＶＨＨ抗体として酵母の表面上に表示した。マウスライブラリーおよびラマライブラリーの両方は、ｃ－末端ＦＬＡＧタグと共に表示される抗体を有した。標準手続に従って、抗体ライブラリーのサイズを決定した。

形質転換した免疫酵母ライブラリーの大きさは、マウスライブラリーおよびラマのライブラリーでそれぞれ、～５×１０^８および３．５×１０^８であった。

初期ラウンドの選択をストレプトアビジン被覆はＭＡＣＳビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて行ない、後期ラウンドの選択はＦＡＣＳソーターを用いて行った。

＜１ラウンド目の選択＞：
簡潔に言えば、２ｍｌの５００ｎＭのビオチン化されたＨＬＡ－Ｅ－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩまたはＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬペプチド複合体を、マウスライブラリーまたはラマライブラリーからの１０^１０酵母菌（達成されたライブラリーサイズの１０倍より大きい）と共に室温で２０分間インキュベートした。細胞を遠心機でスピンダウンし、４５ｍｌのＰＢＳ＋０．１％のＢＳＡ（ＰＢＳＢ）を用いて２回洗浄した。酵母菌を４０ｍｌのＰＢＳ＋０．１％のＢＳＡ（ＰＢＳＢ）で再懸濁し、懸濁された細胞に０．５ｍｌのＭＡＣＳビーズを加え、４℃で１５分間インキュベートした。細胞を、ＭＡＣＳカラムを通過する前に、ＰＢＳＢでの２回の洗浄を行った。磁界からＭＡＣＳカラムを取り除くことによって、酵母菌をプランジャーの助けを借りてカラムから押し出すことによって、カラムに結合された酵母結合を溶出した。その後、細胞を５０ｍｌの選択培地で一晩増殖させた。

＜２ラウンド目の選択＞：
ストレプトアビジンの非特異的な結合剤およびＨＬＡペプチド複合体の一般的なフレームワークを除去するために、マウス免疫化ライブラリーおよびラマ免疫化ライブラリーからの１ラウンド目選択の１０^９の細胞を１ｕＭのビオチン化したＨＬＡ－Ａ２ペプチド複合体（ネガティブコントロール）と共にインキュベートし、その後、洗浄およびＭＡＣＳビーズと共にインキュベートし、続いて細胞をＭＡＣＳカラムに通した。フロースルー酵母菌を集めて、それぞれマウス免疫ライブラリーおよびラマの免疫ライブラリーからの２５０ｎＭのビオチン化したＨＬＡ－Ｅ－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩまたはＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬペプチド複合体（標的複合体）と共に、室温で２０分間インキュベートした。１ラウンド目選択のように、洗浄、ＭＡＣＳビーズとのインキュベーション、ＭＡＣＳカラムからの溶出の同様の工程を行った。両方のライブラリーからの細胞を５０ｍｌの選択培地で一晩増殖させた。

＜３ラウンド目の選択＞：
２ラウンド目のマウスライブラリーおよびラマライブラリーからの５×１０^７酵母菌を、１００ｎＭビオチン化したＨＬＡ－Ｅ－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（マウスライブラリー）またはＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ラマライブラリー）と共に２０分間インキュベートした。ｓｃＦｖまたはＶＨＨ単一ドメイン抗体の発現をモニタリングするためのビオチン化した抗原および抗－ＦＬＡＧ－ＦＩＴＣの検出のために、細胞を洗浄し、ＥＡ－ＰＥ（エクストラアビジンフィコエリトリン）またはＳＡ－６３３（ストレプトアビジンａｌｅｘａ－６３３）と共にインキュベートした。抗原を有していないが二次試薬を有する個別の酵母サンプルを、ネガティブコントロールとして使用した。結合剤を集めるために適切なソーティングゲートを引いた。

＜４ラウンド目の選択＞：
３ラウンド目からの、マウスライブラリーおよびラマライブラリー両方からの５×１０^７酵母菌を含むサンプルを、１００ｎＭビオチン化したＨＬＡ－Ｅ－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（マウスライブラリー）またはＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ラマライブラリー）ペプチド複合体のいずれかと共に２０分間インキュベートした。ｓｃＦｖまたはＶＨＨ単一ドメイン抗体の発現をモニタリングするためのビオチン化した抗原および抗－ＦＬＡＧ－ＦＩＴＣ検出のために、細胞を洗浄し、ＥＡ－ＰＥまたはＳＡ－６３３と共にインキュベートした。３ラウンド目で言及されるようなネガティブコントロールサンプルに加えて、別の酵母サンプルを、ネガティブコントロール、１００ｎＭビオチン化したＨＬＡ－Ａ２ペプチド、ならびに他のＨＬＡ－Ｅ－ペプチドと共にインキュベートした（例えば、マウスライブラリーのためのネガティブコントロールとしてＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬペプチド複合体を使用し、ラマライブラリーのためのネガティブコントロールとしてＨＬＡ－Ｅ－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩペプチド複合体を使用した）。ポジティブサンプルからの事象のみがゲートの内部で表示されるように、ＦＡＣＳのソーティングゲートを利用し、特異的な標的結合剤を保証した。図１６Ａ－図１６Ｂは、４つのラウンドの選択後、標的についての結合特異性を表示するｓｃＦｖ結合剤、ＨＬＡ－Ｅ－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩペプチド複合体を表示する、マウス免疫ライブラリーからの酵母を例証する。

全長ｈＩｇＧ１抗体としての発現のために３つのクローンを選択する。クローン３（抗－ＨＬＡ－Ｅ－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩ複合体）からの重鎖および軽鎖をｐＣＤＮＡ３．２ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローン化し、ならびに、重鎖および軽鎖の遺伝子を含むプラスミドをＥｘｐｉ２９３（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に同時導入して、プロテインＡカラム上での精製のために可溶性クローン３ｈＩｇＧ１抗体を一時的に発現した。精製されたサンプル調製を、還元条件下でのＳＤＳ－ゲル電気泳動によって評価した。完了後、ゲルをクーマシーブルーで染色し、単一重鎖（～５０ｋＤ）および軽鎖（２５ｋＤ）を明らかにした。次に、Ａ５４９肺癌細胞を染色するために精製されたクローン３を使用した。簡潔に言えば、細胞を、採取する４８時間前に０．１ｎＭのＩＦＮで処理した。細胞を数え、１ｘ１０^７細胞／ｍＬで再懸濁し、１００ｕＬの細胞を１ｕｇ／ｍｌのクローン３－ｈＩｇＧ１と共に４℃で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／１０％ＦＢＳ中で３回洗浄し、続いて、３回洗浄する前にＡＰＣに結合された抗ヒトＦｃの１：１０００の稀釈液で３０分間インキュベートし、およびフローサイトメトリー（ＬＳＲ）によって分析した。クローン３抗体の結合特異性をフリーラベルテクノロジーによって評価し、特異的な標的であるＨＬＡ－Ｅ－ＩＬＳＰＴＶＶＳＩを結合することが示された。本実施例では、クローン３は、Ａ５４９肺癌細胞（ＫＩＦＩＩ抗原ポジティブ）に対して弱く染色する；しかしながら、クローン３結合は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９技術を使用する遺伝子編集を介して、ＴＡＰ１遺伝子を有するＡ５４９細胞に対して非常に強く染色する（図１６Ｃ）。ＴＡＰＫ／Ｏ細胞は、３Ｄ１２抗体を用いて染色することによって示されるようなＨＬＡ－Ｅを発現する（実施例１８を参照）。しかし、ＴＡＰ欠損細胞は代替的に処理されたペプチドをＨＬＡ－Ｅ結合溝に負荷し、ＴＡＰ欠損癌細胞において、代替的処理経路に由来するペプチドがＨＬＡ－Ｅに結合し、標的とするために細胞表面上で表示されることを示す。

＜実施例１８－ＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ複合体に対するＴＣＲ様抗体の特性評価＞
あらかじめ作られたヒトライブラリー（実施例１７を参照）から単離されたヒト抗体（Ｒ４）を、ｓｃＦｖおよび全長ＩｇＧ１として生成し、精製し、ならびに、結合特異性、親和性、および細胞染色についての特性を明らかにした。

Ｒ４ヒト抗体発現、精製および結合特異性の結果は、図１７Ａ－図１７Ｃで例証される。ＮｉＮＴＡカラム上でのペリプラズム発現および可溶性ｓｃＦｖの精製のために、Ｒ４ｓｃＦｖ－ｈｉｓ－ｔａｇ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）構築をｐＥＴ２５Ｂプラスミドにクローン化し、Ｌｅｍｏ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞大腸菌（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂ）に電気形質転換した（図１７Ａ）。Ｒ４からの重鎖および軽鎖をｐＣＤＮＡ３．２ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローン化し、重鎖および軽鎖の遺伝子を含むプラスミドをＥｘｐｉ２９３（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に同時導入し、プロテインＡカラム上の精製のために可溶性Ｒ４ＩｇＧ１抗体を一時的に発現させた。両方の精製されたサンプル調製を還元条件下でＳＤＳ－ゲル電気泳動によって評価した。完了後、ゲルをクーマシーブルーで染色し、ｓｃＦｖ（図１７Ａ）および重鎖（～５０ｋＤ）および軽鎖（２５ｋＤ）（図１７Ｂ）で観察された単一の～３０ＫＤバンドを明らかにした。さらに、両方のＲ４抗体形態の結合特異性をＥＬＩＳＡによって評価し、標的であるＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬに特異的な抗体結合を示す。図１７Ｃにおいて、製造業者の標準プロトコルに従ってＯｃｔｅｔフリーラベルテクノロジー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用することによって、およびストレプトアビジン被覆プローブを使用することによって、Ｒ４ヒト抗体の親和性を判定した。Ｒ４ヒト抗体の親和性は４．１ｘ１０^－７Ｍであり、ｋ－オフレートは６．６ｘ１０^－２（分^－１）であった。、突然変異をＣＤＲ３Ｈ領域に導入することによって、Ｒ４抗体親和性をさらに最適化し、ＫＤ＝８．３×１０^－９Ｍの結合親和性および２．８２ｘ１０^－４ｍｉｎ^－１のｋオフレートを有するクローン＃２の同定が結果としてもたらされた。

次の工程はＲ４ＩｇＧ１抗体の優れた結合特異性の特性を明らかにすることであった。標的ペプチドＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）に類似するペプチド配列で負荷されたビオチン標識ＨＬＡ－Ｅ複合体を固定化することによって、結合特異性を実施した。使用される類似のペプチドは、単一のアミノ酸置換または１を超えるアミノ酸置換のいずれかを有した。さらに、ペプチド中の（ｐ５）および（ｐ８）の位置におけるアミノ酸のＲ４結合優先度を決定するために、研究を行なった。２つのコントロールペプチド、つまりＶＭＡＰＲＴＬＹＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）およびＶＭＡＰＲＴＬＷＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）を、組み換えＨＬＡ－Ｅ複合体を生成するために使用した。位置ｐ８において高度に保存されたアミノ酸の違いを有するこれらの２つのペプチドは、自然界では存在しない。それらを合成のために選択して、ペプチドの位置ｐ８にペプチドを含む芳香環の必要性を評価した。Ｒ４抗体は、特異的なペプチド標的であるＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）ならびに２つの密接に関連するペプチドであるＶＭＡＰＲＴＹＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５）およびＶＭＡＰＲＴＬＷＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）に結合するが、他のペプチドには結合しないことを示す。これは、いくつかの例において、Ｒ４抗体ＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬペプチド複合体に結合するＲ４抗体が、位置ｐ８で芳香族環構造を含むアミノ酸残基を有することに依存することを示す（図１８）。

結果はまた、両方のＨＬＡ－Ｅ対立遺伝子（ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３）を生成し、同じペプチド、ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）を負荷することを例証する。さらに、図１９Ａ－図１９Ｂは、ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）ペプチドを負荷したＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３に等しく結合するＲ４抗体を例証する。簡潔に言えば、ビオチン標識ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１および０１０３－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ複合体を、バイオネティックプレートでコーティングされたニュートラアビジン上で固定化した。その後、１０ｕｇ／ｍｌのＲ４ＩｇＧ１抗体をバイオネティックプレートのウェルに加え、および共鳴シフトユニット（ｐＭｅｔｅｒｓ）において６０分間にわたって結合を観察した。その後、ウェルをＰＢＳを用いて洗浄し、残りの結合したＲ４を検出した（洗浄後の結合）。ほぼ１００％のホモ・サピエンスがＨＬＡ－Ｅ対立遺伝子の１つまたはその両方を発現するため、ＨＬＡ－Ｅ^＊０１０１およびＨＬＡ－Ｅ^＊０１０３の対立遺伝子で提示される同じペプチドに反応する抗体は広い集団適用範囲を提供する。

図２０は、腫瘍細胞を染色するために使用されているＲ４抗体を例証する。Ｒ４ＩｇＧ１抗体は、ＨＬＡ－ＥおよびＨＬＡ－Ｇタンパク質を発現する腫瘍細胞に結合し、それゆえに、ＨＬＡ－Ｇからのシグナルペプチドが存在し、ＨＬＡ－Ｅに負荷される。これに対して、ＨＬＡ－Ｇを発現しない腫瘍細胞はＲ４抗体で染色されない。さらに、図２１Ａ－図２１Ｃで例証されるように、Ｒ４抗体はＨＣＴ１１６大腸癌細胞を発現するＨＬＡ－Ｅ／ＧおよびＡ５４９肺癌細胞に結合し、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９技術を使用した遺伝子編集を介してノックアウトされたＴＡＰ１遺伝子を有する同じ細胞には結合しない。ＴＡＰＫ／Ｏ細胞は、３Ｄ１２抗体で染色することによって示されるようなＨＬＡ－Ｅを発現する（上パネル）。しかし、欠損ＴＡＰは、ＨＬＡ－Ｅ結合溝に負荷するために、細胞がもはやＨＬＡ－ＧシグナルペプチドをＥＲに輸送しないことを意味する。これは、本明細書に開示される抗体を用いて標的とするために、ＴＡＰ欠損癌細胞において代替的処理経路由来のペプチドがＨＬＡ－Ｅに結合し、細胞表面上に表示されることを意味する。

＜実施例１９－ヒト腫瘍組織における全ＨＬＡ－Ｅタンパク質発現およびＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体特異的発現の検出＞
全ＨＬＡ－Ｅタンパク質発現（提示されたペプチド非依存性）を決定するために、免疫細胞化学染色を、モノクローナル抗体ＭＥＭ－Ｅ／０２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびホルマリン固定パラフィン包埋ヒト腫瘍組織マイクロアレイ（ＯｒｉｇｅｎｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓａｎｄＵＳＢｉｏＭａｘ）を使用して行なった。ＭＥＭ－Ｅ／０２結合の検出を、抗マウスＨＲＰ抱合抗体（Ａｂｃａｍ）を使用して決定し、３、３’ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質キット（Ａｂｃａｍ）を使用して発展させた。図２２－図２４は、肺癌、乳癌、卵巣癌、および大腸癌を含む様々な癌におけるＨＬＡ－Ｅ発現を例証する。さらに、図２５Ａ－図２５Ｂにおいて、ＭＥＭ－Ｅ／０２抗体は乳癌サンプルの膜上のＨＬＡ－Ｅを染色する。ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド標的の膜発現は、ＴＣＲ様抗体ベースの薬物の開発および細胞内標的を標的とするために必須である。

ＴＣＲ様抗体標的ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体を評価するために、冷凍されたヒト腫瘍組織アレイを米国のＢｉｏＭａｘおよびＯｒｉｇｅｎｅから購入した。５ｍｍの厚さに作られた凍結組織切片を５％のメタノールを使用して固定し、ならびに１．０％のウマ血清を含む希釈液中で１μｇ／ｍｌのＴＣＲ様抗体およびコントロール抗体で１時間染色して、組織の非特異的染色を防いだ。基質色原体（ＤＡＢ）の存在下において、光学顕微鏡検査法を使用してＡｇ／Ａｂ結合の場所を視覚化するための指示薬系（褐色沈殿の形成）を提供する、ヤギ抗マウスＩｇＨＲＰ（ＩｍｍＰＲＥＳＳ抗マウスＩｇペルオキシダーゼキット、ベクター）を使用して、一次Ａｂ結合の検出を決定する。ヘマトキシリンＱＳを核対比染色（ベクター）として使用する。Ｈ＆Ｅ染色（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、細胞形態および組織における腫瘍細胞の存在を評価するために使用する。光学顕微鏡検査法（ＮｉｋｏｎＥｃｌｉｐｓｅＴＥ２０００、単純ＰＣＩスイートソフトウェアを備えた倒立ディコンボリューション顕微鏡）を使用して組織切片を分析した。

全細胞染色および強度を正確に反映するためにヒト組織のＴＣＲ様抗体染色をスコアリングして、ＴＣＲ様抗体のための組織内スコアリングプロトコルを実行し従った。このようにして、染色の割合（０－４）および染色の強度（０－４）から成るスクリーニング方法を確立した。０の染色スコアの割合は染色がないことを表わし、１＋は、領域中の１００の細胞の平均１－２５の陽性染色された細胞を表し（１－２５％）、２＋は１００の細胞の平均２６－５０の細胞を表し（２６－５０％）、３＋スコアは１００の細胞の平均５１－７５の細胞を表し（５１－７５％）、および、４＋は染色された１００の細胞の平均７６－１００の細胞を表す（７６－１００％）。強度スコアは０－４のスケールに基づき、形成される褐色沈殿の程度を表わし、０は陰性、１＋は弱い褐色、２＋は中間の褐色、３＋は強い褐色、４＋は非常に濃厚な褐色である。最後に、染色の割合および染色の強度のためのスコアを加えることによって、合計スコア（０－８）を決定した。組織切片を、１μｇ／ｍｌのＴＣＲ様抗体およびアイソタイプコントロールで染色する。染色の割合および染色の強度のスコアは、各組織サンプルのための５つの領域からの平均として報告された。

＜実施例２０－ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体はドラッガブル癌標的である＞
二重特異性ＴＣＲ様抗体：
図２６は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）分子を生成するための例示的な概略図を例証する。ＢｉＴＥ８６－２として指定されたクローンを組換えＤＮＡ技術によって構築し、トランスフェクトされた２９３のＥｘｐｉ細胞からの上清を精製した。コバルト樹脂クロマトグラフィーカラムを使用して、ＢｉＴＥｓの精製を行った。ＢｉＴＥ８６－２を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合抗Ｈｉｓ抗体（Ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用するウエスタンブロットによって、およびクーマシー染色によって検証した（図２７Ａ－図２７Ｅ）。細胞を標的とするＢｉＴＥの特異的結合を、Ａｌｅｘａ６４７抱合抗ＨｉｓＴａｇ抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用するフローサイトメトリーによって評価した。ジャーカット細胞、一次ＰＢＭＣ、およびＣｏｌｏ２０５への結合を分析した。１×１０^４の標的細胞（Ｃｏｌｏ２０５腫瘍細胞）を含む、丸底９６ウェルプレートにおいて共培養アッセイを実行した。精製されたＢｉＴＥおよび３×１０^４ジャーカットをプレートに加えた。１４時間後、ＩＬ－２放出評価のために上清を集め、それは、製造業者の指示に従って、ＥＬＩＳＡ（ＩＬ－２ＨｕｍａｎＥＬＩＳＡＫｉｔ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって実施された（図２７Ｄ）。細胞傷害性アッセイの場合、ＲＰＭＩにおいて、ＰＢＭＣを１０ｍＬの体積で、室温で、１分間、０．０５μＭカルセインＡＭで染色した。その後、細胞を完全培地中で２回染色し、フローサイトメトリーベースの細胞傷害性アッセイで使用した。精製されたＢｉＴＥおよび１５×１０^４ＰＢＭＣをプレートに加えた。１４時間後、追加のウェルを自発的アポトーシスの評価のために使用した（標的細胞のみおよび最大標的細胞死（１００μＬの完全培地＋１００μＬの１００％エタノールにおける標的細胞のみ））。取得１０分前に、１μＬの５μＭのＳＹＴＯＸレッド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各管に加えた（図２７Ａ－図２７Ｅ）。共培養フローサイトメトリーアッセイの場合、データをＡｔｔｕｎｅＮＴＸフローサイトメーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で捕捉し、およびＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗｊｏＬＬＣ）を使用して分析した。

別の研究では、ＢｉＴＥ８６－２および関連するクローン５（Ｓｐ３４（ａ－ＣＤ３ｅ）ＶＨ－ＶＬ－Ｒ４ＶＬ－ＶＨ）を、ＮＣＩＨ－１５６３、肺癌細胞を殺すために使用した。これらのアッセイの場合、ＮＣＩＨ－１５６３腫瘍細胞をカルセインＡＭで標識し、および１０ｘ１０^４ヒト精製ＣＤ８＋細胞（Ｅ：Ｔ＝５）と共にインキュベートした。精製されたＢｉＴＥ８６－２を１０ｕｌ（～１．５ｕｇ／ｍｌ）、２５ｕｌ（３．７５ｕｇ／ｍｌ）、および５０ｕｌ（７．５ｕｇ／ｍｌ）でウェルに加え、ならびにＢｉＴＥ５を含む培養液上清を特定のウェルに加えた。すべてのサンプルを四通り試験した。アッセイを１６時間インキュベートし、プレートリーダーを使用して腫瘍細胞生存率を４８５ｎｍの励起で蛍光を読み取ることによって決定した（図２７Ｆ）。

＜実施例２１－化ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体およびヒトＣＤ３イプシロンを標的とする単一ドメイン抗体（ＶＨＨまたはヒトの単一ドメインＡｂ）＞
単一ドメイン抗体を生成するために、ラマを、ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド複合体の単量体、四量体、または多量体の製剤を用いて免疫化した。続いて、結合剤の選択のために、ファージを使用する抗体ライブラリーおよび酵母ディスプレイテクノロジーを構築した。ＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬペプチド複合体に特異的な、同定された結合剤を、大腸菌中でＶＨＨ分子として、ならびに酵母および哺乳類細胞中でＶＨＨ－Ｆｃ二量体として発現させた。ＨＬＡ－Ｅ－ＶＭＡＰＲＴＬＦＬペプチド標的に対するいくつかの固有の（配列データに基づく）ＶＨＨ抗体を発見し、ＶＨＨ遺伝子をＶＨＨ－Ｆｃ構築としてｐＣＤＮＡ３．２ベクターにクローン化し、二量体分子の生成のためにＥｘｐｉ２９３細胞をトランスフェクトした。プロテインＡアフィニティカムを使用してＶＨＨ－Ｆｃ抗体分子を精製した。ＶＨＨを、重鎖のヒンジおよびＦｃ（ＣＨ１を欠く）ドメインに連結し、および、二量体として発現させることによって、修飾抗体は従来のｍＡｂ（１５０ｋＤ）のおよそ半分の大きさ（７５ｋＤ）になる。より少ない分子量は、腎クリアランスを増加させることなく、組織のより良い浸透性へとつながり、これらの抗体分子の腫瘍への浸透を良くする。さらに、従来のＨ鎖およびＬ鎖の抗体に対するそれらの小さいサイズは、多重特異性および多価性の分子として非常に助けになる。

ＶＨＨ抗体をＶＨＨ－Ｆｃ（二価染色体）分子として発現し、ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド標的に対する結合特異性を試験した。ＶＨＨ分子もまた、Ｈｉｓ－ｔａｇを含む単一ドメイン抗体として、または多重特異性および多機能性分子として発現させる。２つの同一のＶＨＨ抗体の縦列融合によって、二価二量体を作る。２つのＶＨＨ抗体の組み合わせは、二価の構築および二重特異性分子へとつながる。最後に、サイズが小さく、したがって、腫瘍浸透能力が優れているために、ＶＨＨおよびＶＨＨ－Ｆｃ分子は、望ましい担体のための細胞障害性薬物（抗体薬物複合体）として役立つ。

すべてのＶＨＨ単一ドメイン抗体への親和性および初期結合特異性を、ＥＬＩＳＡおよび無標識アッセイを使用して行う。最後に、精製された分子を腫瘍組織を染色するために使用する。特に、結合反応性について患者の腫瘍組織に対して、抗－ＨＬＡ－Ｅ－ペプチド抗体候補をスクリーニングする。高度に特異的な結合プロファイルを実証する単一ドメインＴ－細胞様抗体を、癌の処置のための多重特異性分子を発展させるために使用した。これらの分子を抗体薬物複合体として、および二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーとして細胞設計し、抗腫瘍活性について評価した。

本発明の好ましい実施形態が本明細書で示され記載されているが、こうした実施形態がほんの一例として提供されているに過ぎないということは当業者にとって明白である。当業者であれば、多くの変更、変化、および置換が、本発明から逸脱することなく思いつくだろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用されることもあることを理解されたい。以下の請求項は本発明の範囲を定義するものであり、この請求項とその均等物の範囲内の方法および構造体がそれによって包含されるものであるということが意図されている。

Claims

抗体であって、当該抗体は複合体に選択的に結合するＴＣＲ様抗体であり、
前記複合体は、
（ａ）癌細胞によって発現されるＨＬＡ－Ｅと、
（ｂ）前記癌細胞によって発現されるネオ抗原は、ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）、ＶＭＡＰＲＴＬＷＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）、ＶＭＡＰＲＴＹＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５）およびＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
ここで、前記ＴＣＲ様抗体は、前記複合体中の前記ＨＬＡ－Ｅおよび前記ネオ抗原に選択的に結合する、抗体。
前記抗体は、（ｉ）前記ＨＬＡ－Ｅのみ、または（ｉｉ）前記ネオ抗原のみに対して、結合親和性を有していない、請求項１に記載の抗体。
前記ＨＬＡ－Ｅは、ＨＬＡ－Ｅ＊０１０１またはＨＬＡ－Ｅ＊０１０３である、請求項１に記載の抗体。
前記抗体は、
（ａ）前記ＨＬＡ－Ｅ＊０１０１および前記ネオ抗原、
（ｂ）前記ＨＬＡ－Ｅ＊０１０３および前記ネオ抗原、または、
（ｃ）前記ＨＬＡ－Ｅ＊０１０１および前記ネオ抗原と、前記ＨＬＡ－Ｅ＊０１０３および前記ネオ抗原、
を含む前記複合体に選択的に結合する、請求項３に記載の抗体。
個体において癌細胞に対する免疫反応を誘発するための薬剤の製造における抗体の使用であって、前記抗体はＴＣＲ様抗体であり、
前記ＴＣＲ様抗体は複合体に選択的に結合し、
前記複合体は、
（ａ）癌細胞によって発現されるＨＬＡ－Ｅと
（ｂ）前記癌細胞によって発現されるネオ抗原は、ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）、ＶＭＡＰＲＴＬＷＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）、ＶＭＡＰＲＴＹＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５）およびＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
ここで、前記ＴＣＲ様抗体は、前記複合体中の前記ＨＬＡ－Ｅおよび前記ネオ抗原に選択的に結合する、使用。
前記抗体は、（ｉ）前記ＨＬＡ－Ｅのみ、または（ｉｉ）前記ネオ抗原のみに対して、結合親和性を有していない、請求項５に記載の使用。
前記ＨＬＡ－Ｅは、ＨＬＡ－Ｅ＊０１０１またはＨＬＡ－Ｅ＊０１０３である、請求項５に記載の使用。
前記抗体は、
（ａ）前記ＨＬＡ－Ｅ＊０１０１および前記ネオ抗原、
（ｂ）前記ＨＬＡ－Ｅ＊０１０３および前記ネオ抗原、または、
（ｃ）前記ＨＬＡ－Ｅ＊０１０１および前記ネオ抗原と、前記ＨＬＡ－Ｅ＊０１０３および前記ネオ抗原、
を含む前記複合体に選択的に結合する、請求項７に記載の使用。
前記免疫反応はＴ細胞の活性化を含む、請求項５に記載の使用。
個体において癌細胞に対する免疫反応を誘発するために使用される医薬組成物であって、
前記医薬組成物は、
（ｉ）複合体に選択的に結合するＴＣＲ様抗体であって、
前記複合体は、
（ａ）癌細胞によって発現されるＨＬＡ－Ｅと、
（ｂ）前記癌細胞によって発現されるネオ抗原は、ＶＭＡＰＲＴＬＦＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）、ＶＭＡＰＲＴＬＷＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）、ＶＭＡＰＲＴＹＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５）およびＩＬＳＰＴＶＶＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
ここで、前記ＴＣＲ様抗体は、前記ＨＬＡ－Ｅおよび前記ネオ抗原に選択的に結合する、抗体、および
（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体、
を含む、医薬組成物。