CN117529492A - 用于治疗的t细胞 - Google Patents

用于治疗的t细胞 Download PDF

Info

Publication number
CN117529492A
CN117529492A CN202280023436.5A CN202280023436A CN117529492A CN 117529492 A CN117529492 A CN 117529492A CN 202280023436 A CN202280023436 A CN 202280023436A CN 117529492 A CN117529492 A CN 117529492A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
cell
tcr
cells
engineered
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280023436.5A
Other languages
English (en)
Inventor
J·E·M·A·德贝茨
D·M·哈默尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Erasmus University Medical Center
Original Assignee
Erasmus University Medical Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Erasmus University Medical Center filed Critical Erasmus University Medical Center
Publication of CN117529492A publication Critical patent/CN117529492A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464414—CD74, Ii, MHC class II invariant chain or MHC class II gamma chain
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464484—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/812—Breast
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/27—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by targeting or presenting multiple antigens
    • A61K2239/28—Expressing multiple CARs, TCRs or antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/49—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明特别提供了一种经工程改造的T细胞，其中所述T细胞经工程改造以表达T细胞受体(TCR)或与人ropporin‑1A(ROPN1)或人ropporin‑1B(ROPN1B)的T细胞表位结合的基于抗体的受体；其中所述T细胞表位选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:24。

Description

用于治疗的T细胞
技术领域
本发明属于T细胞治疗领域。更具体地，本发明涉及人ropporin-1A(ROPN1)和/或人ropporin-1B(ROPN1B)的T细胞表位、对ROPN1和ROPN1B具有结合特异性的T细胞受体(TCR)或基于抗体的受体，以及经工程改造(遗传修饰)的T细胞，其经工程改造以表达(迫使表达)与ROPN1和/或ROPN1B的表位结合(或对其具有结合特异性)的T细胞受体或基于抗体的受体。工程改造的T细胞可用于免疫疗法，例如治疗实体瘤，如乳腺癌、皮肤癌或血液肿瘤，如骨髓瘤或淋巴瘤。
背景技术
过继T细胞疗法(AT)通常依赖于从患者血液中分离T细胞，插入编码具有预定抗原特异性的嵌合抗原受体(CAR)或TCR的基因，扩增这些细胞，以及将工程改造的自体T细胞产物重新输注到患者体内。该策略已应用于不同的肿瘤类型，其成功率各不相同，主要取决于肿瘤类型、靶抗原和受体(Debets等人，Semin Immunol.28(1):10-21(2016)，doi:10.1016/j.sim.2016.03.002；Johnson等人，Cell Res.27(1)：38-58(2017)，doi:10.1038/cr.2016.154；以及Sadelain等人，Nature.545(7655):423-431(2017)，doi:10.1038/nature22395)。
CAR T细胞治疗被认为是B细胞恶性肿瘤的突破(客观有效率(OR)：95％)，靶向CD19的CAR T细胞产品(即Kymriah、Yescarta、Tecartus)最近已被FDA和EMA批准用于治疗这些恶性肿瘤。不幸的是，CAR T细胞治疗实体瘤的疗效明显落后于对血液系统恶性肿瘤的疗效。值得注意的是，CAR识别细胞外靶标(即覆盖所有靶标的约30％)，而TCR识别细胞外和细胞内靶标(即涵盖所有靶标的100％)。事实上，在某些情况下，TCR工程改造的T细胞在用于治疗实体瘤和血液肿瘤类型时显示出明确的临床反应(Kunert等人，Front Immunol.4(11月):1-16(2013)，doi:10.3389/fimmu.2013.00363；和Johnson等人，Cell Res.27(1):38-58(2017)，doi:10.1038/cr.20.16.154)。例如，在黑色素瘤、滑膜肉瘤和多发性骨髓瘤中，已经观察到AT的OR分别为55％、61％和80％，其中T细胞表达NY-ESO1-特异性TCR(Robbins等人，Clin Can Res doi:10.1158/1078-0432；Rapport等人，Nat Med.21(8):914-921(2015)，doi:10.1038/nm.3910)。
尽管取得了一些临床成功，但工程改造的T细胞治疗的一个主要挑战是预防治疗相关的毒性，无论是CAR还是TCR T细胞。这种毒性包括定靶毒性(即，工程改造的T细胞识别肿瘤组织外的相同靶标)和脱靶毒性(即工程改造的T细胞识别与肿瘤组织外同源靶标高度相似的靶标)(Debets等人，Semin Immunol.28(1):10-21(2016)，doi:10.1016/j.smim.2016.03.002)。与治疗相关的毒性通常取决于靶抗原和TCR的选择。例如，靶向CAIX抗原的CAR导致严重的定靶毒性(Lamers等人，Mol Ther.21(4):904-912(2013)，doi:10.1038/mt.2013.17)；而靶向MAGE-A3抗原的亲和力增强的TCR伴随着严重的脱靶毒性(Cameron等人,Sci Transl Med.5(197):197ra103-197ra103(2013),doi:10.1126/scitranslmed.3006034；和Morgan等人,JImmunother.36(2):133-151(2014),doi:10.1097/CJI.0b013e3182829903.Cancer)。
另一项挑战，特别是对于实体瘤的治疗，是靶抗原在肿瘤组织中的异质性表达，涉及几个到许多肿瘤细胞，这可能限制AT的功效(Majzner等人，癌症Discov.8(10):1219-1226(2018)，doi:10.158/2159-8290.CD-18-0442)。
同样与实体瘤治疗有关的最后一项挑战是目前缺乏能够治疗大量患者的靶标，这是由于对细胞内抗原目前进行的研究不足。
综合以上挑战，本领域显然需要鉴定和利用肿瘤选择性和免疫原性靶抗原、其表位和相应的TCR。选择靶标、表位和TCR以避免治疗相关毒性，同时保证T细胞对免疫原性和均匀表达的靶标和表位的反应，从而能够治疗大量癌症患者，这一点至关重要。
本发明的目的是提供来源于在某些癌症类型中均匀且频繁表达的靶抗原的肿瘤选择性和免疫原性T细胞表位，并用工程改造以表达具有严格表位特异性(即，对其他高度相似的表位没有交叉反应性)的TCR的T细胞靶向这些表位。
发明内容
本发明提供了一种工程改造的T细胞，其中所述T细胞经工程改造以表达T细胞受体(TCR)或基于抗体的受体，例如嵌合抗原受体(CAR)，其结合人ropporin-1A(ROPN1)和/或人ropporin-1B(ROPN1B)的T细胞表位；其中所述T细胞表位由选自SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:24之一的氨基酸序列组成。
本发明还提供了一种工程改造的T细胞，其中所述T细胞经工程改造以表达T细胞受体(TCR)或基于抗体的受体(如嵌合抗原受体(CAR))，其结合人ropporin-1B(ROPN1B)和/或人ropporin-1A(ROPN1)的T细胞表位，如表位1-11中的一个或多个，优选表位4(FLY-A表位)，10(FLY-B表位)或11(EVI表位)，更优选表位4(FLY-A)。
本发明人已鉴定人ropporin-1A(ROPN1)和ropporin-1B(ROPN1B)为具有肿瘤限制性表达的T细胞靶抗原，其在乳腺癌(如三阴性乳腺癌(TNBC))和皮肤癌(如皮肤黑色素瘤(SKCM))(参见实施例1和图1和图2)中，也在一些血液恶性肿瘤中也有表达，例如骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤(MM))中具有高且均匀的表达。本发明人鉴定了一组11个具有肿瘤选择性和安全性的人ROPN1和ROPN1B T细胞表位(即不是除ROPN1和ROPN1B以外的任何蛋白质的一部分)(实施例1，图3，表1)，在进一步筛选后，其减少为一组9个的人ROPN1或ROPN1B T细胞表位。这些ROPN1和ROPN1B表位是高度免疫原性的，如针对所述表位产生的T细胞反应所证明的(表2)。此外，本发明人分离出与ROPN1B的表位SEQ ID NO:1结合的TCR(MLN表位(表位1))，并测定TCRα链和β链的序列(实施例1，图4和SEQ ID NO:10-19，21，22)。进一步证实，该TCR是功能性的，并且当经工程改造入T细胞时特异性识别MLN表位(实施例1，图5)。
本发明人还鉴定了另外两个ROPN1B表位(SEQ ID NO:23(也称为“FLY-B表位”或“表位10”)和SEQ ID NO:24(也称为“EVI表位”或“表位11”))。本发明人进一步鉴定了与表位4(SEQ ID NO:4，也称为“表位4”或“FLY-A表位”)、10和11结合的T细胞受体(TCR)。当这些TCR转导到T细胞中时，提供了基因工程改造的T细胞，其导致对同源表位的敏感和特异性识别，并导致有效的肿瘤细胞杀伤(实施例2，图7+)。经基因工程改造以表达与表位4(FLY-A)、10(FLY-B)和11(EVI)结合的TCR(转)基因的T细胞以及TCR本身是本发明高度优选的实施方式。
在本发明的工程改造的T细胞的优选实施方式中，所述T细胞经工程改造以表达结合SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:33的T细胞表位的TCR；其中所述TCR包括：(i)T细胞受体α链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO:37的CDR3，和(ii)T细胞受体β链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO：42的CDR3；并且其中所述T细胞受体α和β链的所述高变区还包含CDR1和CDR2。
在本发明工程改造的T细胞的另一个优选实施方式中，所述TCRα链的高变区包括：
-SEQ ID NO:35的CDR1；-SEQ ID NO:36的CDR2；-SEQ ID NO:37的CDR3；并且其中所述T细胞受体β链的所述高变区包括：-SEQ ID NO:40的CDR1；-SEQ ID NO:41的CDR2；-SEQID NO:42的CDR3。
在本发明的工程改造的T细胞的另一个优选实施方式中，所述T细胞受体α链包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，并且其中所述T细胞受体β链包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；优选其中所述T细胞受体α链包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列(任选地不具有如图14所示的前导序列或具有另选前导序列)，并且其中所述T细胞受体β链包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列(任选地不具有如图14所示的前导序列或具有另选前导序列)。
在另选实施方式中，所述T细胞经工程改造以表达与SEQ ID NO:23和/或SEQ IDNO:56的T细胞表位结合的TCR；并且其中所述TCR包括：(i)T细胞受体α链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO:50的CDR3，和(ii)T细胞受体β链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO：55的CDR3；并且其中所述T细胞受体α和β链的所述高变区还包含CDR1和CDR2。
在本发明所述工程改造的T细胞的一个优选实施方式中，所述TCRα链的高变区包括：
-SEQ ID NO:48的CDR1；-SEQ ID NO:49的CDR2；-SEQ ID NO:50的CDR3；并且其中所述T细胞受体β链的所述高变区包括：-SEQ ID NO:53的CDR1；-SEQ ID NO:54的CDR2；-SEQID NO:55的CDR3。
在本发明所述工程改造的T细胞的另一个优选实施方式中，所述T细胞受体α链包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，并且其中所述T细胞受体β链包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；优选其中所述T细胞受体α链包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列(任选地不具有如图14所示的前导序列或具有另选前导序列)，并且其中所述T细胞受体β链包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列(任选地不具有如图14所示的前导序列或具有另选前导序列)。
在另一个另选实施方式中，所述T细胞经工程改造以表达与SEQ ID NO:24的T细胞表位结合的TCR；并且其中所述TCR包括：(i)T细胞受体α链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO:63的CDR3，和(ii)T细胞受体β链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO：68的CDR3；并且其中所述T细胞受体α和β链的所述高变区还包含CDR1和CDR2。
在本发明所述工程改造的T细胞的一个优选实施方式中，所述TCRα链的高变区包括：
-SEQ ID NO:61的CDR1；-SEQ ID NO:62的CDR2；-SEQ ID NO:63的CDR3；并且其中所述T细胞受体β链的所述高变区包括：-SEQ ID NO:66的CDR1；-SEQ ID NO:67的CDR2；-SEQID NO:68的CDR3。
在本发明所述工程改造的T细胞的另一个优选实施方式中，所述T细胞受体α链包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列，并且其中所述T细胞受体β链包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；优选其中所述T细胞受体α链包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列(任选地不具有如图14所示的前导序列或具有另选前导序列)，并且其中所述T细胞受体β链包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列(任选地不具有如图14所示的前导序列或具有另选前导序列)。
在本发明的T细胞的另一个实施方式中，所述T细胞受体α链包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列和/或所述T细胞受体β链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；优选其中所述T细胞受体α链是SEQ ID NO:11的链(任选地不具有如图6所示的前导序列或具有另选前导序列)和/或其中所述T细胞受体β链是SEQ ID NO:16的链(任选地不具有图6所述的前导序列或者具有另选前导序列)。
在本发明所述工程改造的T细胞的另一个优选实施方式中，所述T细胞表位与人主要组织相容性复合物(MHC)分子，优选HLA-A*02分子形成复合物。
在本发明的工程改造的T细胞的优选实施方式中，所述T细胞额外经工程改造以表达(i)编码胞内膜表达或分泌(例如分泌)蛋白的另一种(例如，非TCR或非CAR)转基因(参见例如Kunert等人，Oncoimmunol，7(1):e1378842(2017))。例如，所述工程改造的T细胞可以额外工程改造以表达与不同T细胞表位结合的另外的TCR或另外的基于抗体的受体(即双重靶向)，或者所述工程改造的T细胞可以额外经工程改造来表达非TCR或抗体的可分泌蛋白。
在另一个方面，本发明提供了TCR蛋白或基于抗体的受体蛋白，其中所述TCR蛋白或者基于抗体的受体蛋白包含如本发明的工程改造的T细胞的任何一个方面和/或实施方式中所定义的TCR或者基于抗体的受体；优选其中所述TCR具有本文公开的T细胞受体α链和T细胞受体β链；优选其中所述TCR蛋白或基于抗体的受体蛋白是抗体-药物偶联物(ADC)的一部分或是可溶性TCR(的一部分)。
在另一个方面，本发明提供了一种T细胞受体(TCR)蛋白，其中所述TCR蛋白具有如本发明的工程改造的T细胞的任何一个方面和/或实施方式中所定义的T细胞受体α链和T细胞受体β链。
在实施方式中，TCR蛋白或基于抗体的受体蛋白是膜表达的、可溶的或较大可溶性化合物的一部分，例如抗体-药物偶联物，例如TCR样抗体-药物偶联物。本发明还提供抗体-药物偶联物，例如TCR样抗体-药物偶联物，其包含本发明的TCR蛋白或基于抗体的受体蛋白。
在另一个方面，本发明提供了T细胞受体(TCR)α链或β链蛋白，其中所述TCRα链蛋白或β链蛋白质如本发明工程改造的T细胞的任何一个方面和/或实施方式中所定义。
在另一个方面，本发明提供了一种T细胞受体(TCR)蛋白或基于抗体的受体，例如嵌合抗原受体(CAR)，其结合人ropporin-1A(ROPN1)和/或人ropporin-1B(ROPN1B)的T细胞表位；其中所述T细胞表位由选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:24之一的氨基酸序列组成。
在另一个方面，本发明提供一种核酸分子，其包含编码(i)T细胞受体α链和/或T细胞受体β链或(ii)如本发明的经工程改造的T细胞的任何一个方面和/或实施方式中所定义的TCR蛋白或基于抗体的受体的核酸序列。
在另一个方面，本发明提供了一种核酸分子，其包含编码TCR或基于抗体的受体(例如CAR)的核酸序列，所述TCR或基于抗体的受体对T细胞表位特异性或与其结合，所述T细胞表位由选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:24之一的氨基酸序列组成。
在另一个方面，本发明提供了一种TCR转基因，其经修饰(例如通过在跨膜和/或胞内结构域中添加、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基)而不影响本文公开的TCR可变α和β链的氨基酸序列(例如Govers等人，J Immunol，193(10):5315-26(2014))。
在另一个方面，本发明提供了一种核酸分子，其包含编码TCR或基于抗体的受体(例如CAR)的核酸序列，所述蛋白对本文公开的任何表位，优选表位4、10或11是特异性的。
在本发明所述核酸分子的优选实施方式中，所述核酸分子是表达载体例如质粒的一部分。
在本发明所述核酸分子的另一个优选实施方式中，所述核酸分子是逆转录病毒质粒表达载体，例如pMP71载体的一部分。
在实施方式中，将本文公开的所述核酸分子转染到T细胞中，例如从待治疗的对象获得的T细胞。
在本发明的T细胞的优选实施方式中，所述T细胞经基因工程改造表达编码所述TCR或所述基于抗体的受体的构建体，其结合人ROPN1B和/或ROPN1的所述T细胞表位。
在本发明的T细胞的另一个优选实施方式中，所述T细胞经基因工程改造以表达编码所述结合人ROPN1B和/或ROPN1的所述T细胞表位的TCR或所述基于抗体的受体(例如CAR)的核苷酸序列(所述核苷酸序列优选以核苷酸构建体的形式，例如DNA构建体，其任选地包含在表达载体中，例如允许将所述核苷酸序列整合到宿主染色体DNA中的表达载体或保持染色体外的表达载体)。
在本发明的T细胞的另一个优选实施方式中，所述T细胞经基因工程改造以表达结合人ROPN1B和/或ROPN1的T细胞表位的所述TCR，其中所述TCR具有或不具有修饰(例如其中所述修饰是一个或多个氨基酸残基的添加、缺失和/或取代)以增强所述TCR的表面表达和/或表位特异性功能。
在本发明所述T细胞的另一个优选实施方式中，所述T细胞表位是肽，其与人主要组织相容性复合物(MHC)分子，优选HLA-A*02分子形成复合物。
在本发明的T细胞的另一个优选实施方式中，所述T细胞表位由选自SEQ ID NO:1-9、20、23-32、43或56之一(优选SEQ ID NO:4、23、24、43或56之一)的氨基酸序列和与其具有至少70％或至少80％序列相同性的序列组成。在SEQ ID NO:20，43和56的表位基序中，“X”可以是任何氨基酸残基，例如丙氨酸。
在本发明的T细胞的一个实施方式中，所述T细胞表位由选自SEQ ID NO:1及其修饰的氨基酸序列组成，其中SEQ ID NO:1的位置6(Glu)、位置8(Glu)和/或位置9(Val)的氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代。在更优选的实施方式中，所述T细胞表位由选自SEQ IDNO:4的氨基酸序列及其修饰的氨基酸序列组成，其中SEQ ID NO:4的位置1(F)、位置2(L)和/或位置9(V)处的氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代。在另一个优选实施方式中，所述T细胞表位由选自SEQ ID NO:23的氨基酸序列及其修饰的氨基酸序列组成，其中SEQ IDNO:23的位置1(F)和/或位置9(V)处的氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代。
在本发明的T细胞的另一个优选实施方式中，所述T细胞是CD8+T细胞。优选所述T细胞经基因工程改造以表达所述TCR。优选本发明的T细胞表达所述TCR，优选在所述T细胞的表面上表达。所述TCR由此能够特异性地与本文公开的ROPN1和/或ROPN1B表位反应。
在本发明的T细胞的另一个优选实施方式中，所述T细胞是人T细胞。
在另一个方面，本文公开的所述T细胞用于自体T细胞治疗。
在另一个方面，本发明提供了一种T细胞的集合，包括本文公开的多种T细胞。
在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本文公开的工程改造的T细胞和药学上可接受的赋形剂，例如运载体或稀释剂。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗或用作药物的本发明的工程改造的T细胞、本发明的药物组合物、本发明的TCR蛋白或本发明的核酸分子。
在另一个方面，本发明提供了如本文所公开的(基因工程改造的)T细胞，其用于治疗，例如自体T细胞治疗，优选用于治疗实体瘤或液体瘤。
在优选实施方式中，本发明的工程改造的T细胞、药物组合物、TCR蛋白或核酸分子用于治疗肿瘤，优选实体瘤或液体瘤。更优选地，肿瘤是恶性的，即癌症。
在用于本发明的T细胞、药物组合物、TCR蛋白或核酸分子的优选实施方式中，所述肿瘤包含表达人ROPN1和/或ROPN1B的肿瘤细胞，优选其中所述肿瘤包括肿瘤细胞，所述肿瘤细胞包含与本文公开的T细胞表位复合或结合的MHC分子，优选的T细胞表位选自SEQ IDNO:4、23、24、43或56，更优选其中所述T细胞表位为SEQ ID NO:4。
在用于本发明的T细胞、药物组合物、TCR蛋白或核酸分子的另一个优选实施方式中，所述实体瘤是乳腺癌，优选三阴性乳腺癌(TNBC)，或皮肤癌，优选黑色素瘤，例如皮肤黑色素瘤(SKCM)。
在用于本发明的T细胞、药物组合物、TCR蛋白或核酸分子的另一个优选实施方式中，所述液体瘤是骨髓瘤，优选多发性骨髓瘤、白血病，优选急性髓系白血病或淋巴瘤。
在另一个方面，本发明提供了如在与本发明的T细胞相关的先前或后续方面和/或实施方式中的任何一个中所定义的T细胞受体(TCR)蛋白或基于抗体的受体蛋白(例如CAR蛋白)。以相同的方式，本发明提供了本发明的T细胞受体(TCR)蛋白的TCRα链和/或TCRβ链蛋白。
在本发明的TCR蛋白或基于抗体的受体蛋白的优选实施方式中，所述TCR蛋白或者基于抗体的受体蛋白结合人ropporin-1B(ROPN1B)和/或人ropporin-1A(ROPN1)的T细胞表位，优选其中所述T细胞表位由SEQ ID NO:1-9、20、23-32、43或56(优选SEQ ID NO:4、23、24、43或56中的一个)的氨基酸序列或与其具有至少70％或至少80％序列同一性的序列组成。
在本发明的TCR蛋白或基于抗体的受体蛋白的另一个优选实施方式中，所述TCR蛋白或所述基于抗体的受体蛋白与T细胞表位结合，所述T细胞表位由选自如下的氨基酸序列组成：(i)SEQ ID NO:1及其修饰的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的位置6(Glu)、位置8(Glu)和/或位置9(Val)被另一个氨基酸残基取代，(ii)SEQ ID NO:4或其修饰的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:4的位置1(F)、位置2(L)和/或位置9(V)处的氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代，(iii)SEQ ID NO:23或其修饰的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:23的位置1(F)和/或位置9(V)处的氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代，或(iv)SEQ ID NO：24。
在本发明的TCR蛋白的一个实施方式中，所述TCR蛋白包含：(i)T细胞受体α链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO:14的CDR3，和(ii)T细胞受体β链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO：19的CDR3，其中所述T细胞受体α和β链的所述高变区还包含CDR1和CDR2。
在本发明的TCR蛋白的另一个实施方式中，所述TCRα链的所述高变区包括：-SEQID NO:12的CDR1；-SEQ ID NO:13的CDR2；-SEQ ID NO:14的CDR3；和/或其中所述T细胞受体β链的所述高变区包括：-SEQ ID NO:17的CDR1；-SEQ ID NO:18的CDR2；和-SEQ ID NO:19的CDR3。
在本发明的TCR蛋白的另一个实施方式中，所述T细胞受体α链包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列和/或所述T细胞受体β链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；优选其中所述T细胞受体α链是SEQ ID NO:11的氨基酸序列和/或其中所述T细胞受体β链是SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在本发明的TCR蛋白的优选实施方式中，所述TCR包括：(i)T细胞受体α链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO:37的CDR3，和(ii)T细胞受体β链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO：42的CDR3；并且其中所述T细胞受体α和β链的所述高变区还包含CDR1和CDR2。
在本发明的TCR蛋白的另一个优选实施方式中，所述TCRα链的所述高变区包括：-SEQ ID NO:35的CDR1；-SEQ ID NO:36的CDR2；-SEQ ID NO:37的CDR3；并且其中所述T细胞受体β链的所述高变区包括：-SEQ ID NO:40的CDR1；-SEQ ID NO:41的CDR2；-SEQ ID NO:42的CDR3。
在本发明的TCR蛋白的另一个优选实施方式中，所述T细胞受体α链包含SEQ IDNO:44的氨基酸序列，并且其中所述T细胞受体β链包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；优选其中所述T细胞受体α链包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，并且其中所述T细胞受体β链包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
在另一个本发明的TCR蛋白的优选实施方式中，所述TCR包括：(i)T细胞受体α链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO:50的CDR3，和(ii)T细胞受体β链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO：55的CDR3；并且其中所述T细胞受体α和β链的所述高变区还包含CDR1和CDR2。
在本发明的TCR蛋白的另一个优选实施方式中，所述TCRα链的所述高变区包括：
-SEQ ID NO:48的CDR1；-SEQ ID NO:49的CDR2；-SEQ ID NO:50的CDR3；并且其中所述T细胞受体β链的所述高变区包括：-SEQ ID NO:53的CDR1；-SEQ ID NO:54的CDR2；-SEQID NO:55的CDR3。
在本发明的TCR蛋白的另一个优选实施方式中，所述T细胞受体α链包含SEQ IDNO:57的氨基酸序列，并且其中所述T细胞受体β链包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；优选其中所述T细胞受体α链包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列，并且其中所述T细胞受体β链包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列。
在另一个本发明的TCR蛋白的优选实施方式中，所述TCR包括：(i)T细胞受体α链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO:63的CDR3，和(ii)T细胞受体β链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO：68的CDR3；并且其中所述T细胞受体α和β链的所述高变区还包含CDR1和CDR2。
在本发明的TCR蛋白的另一个优选实施方式中，所述TCRα链的所述高变区包括：-SEQ ID NO:61的CDR1；-SEQ ID NO:62的CDR2；-SEQ ID NO:63的CDR3；并且其中所述T细胞受体β链的所述高变区包括：-SEQ ID NO:66的CDR1；-SEQ ID NO:67的CDR2；-SEQ ID NO:68的CDR3。
在本发明的TCR蛋白的另一个优选实施方式中，所述T细胞受体α链包含SEQ IDNO:69的氨基酸序列，并且其中所述T细胞受体β链包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；优选其中所述T细胞受体α链包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，并且其中所述T细胞受体β链包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列。
在本发明的基于抗体的受体，例如CAR蛋白的优选实施方式中，所述基于抗体的受体蛋白结合SEQ ID NO:4的表位；优选其中所述基于抗体的受体蛋白包含选自SEQ ID NO:35、36、37、40、41和42的一个或多个CDR，优选全部。在本发明的所述基于抗体的受体蛋白的其他实施方式中，存在至少SEQ ID NO:37和/或SEQ ID NO:42。
在本发明的基于抗体的受体，例如CAR蛋白的优选实施方式中，所述基于抗体的受体蛋白结合SEQ ID NO:23的表位；优选其中所述基于抗体的受体蛋白包含选自SEQ ID NO:48、49、50、53、54和55的一个或多个CDR，优选全部。在本发明的所述基于抗体的受体蛋白的其他实施方式中，存在至少SEQ ID NO:50和/或SEQ ID NO:55。
在本发明的基于抗体的受体，例如CAR蛋白的优选实施方式中，所述基于抗体的受体蛋白结合SEQ ID NO:24的表位；优选其中所述基于抗体的受体蛋白包含选自SEQ ID NO:61、62、63、66、67和68的一个或多个CDR，优选全部。在本发明的所述基于抗体的受体蛋白的其他实施方式中，存在至少SEQ ID NO:63和/或SEQ ID NO:68。
在本发明的TCR蛋白或基于抗体的受体蛋白的优选实施方式中，所述TCR蛋白或者基于抗体的受体蛋白是分离或纯化的TCR蛋白或者基于抗体受体蛋白。
在本发明的T细胞或TCR蛋白的一个实施方式中，所述TCRα链和β链由一个或多个核苷酸序列编码，所述核苷酸序列例如但不限于分别在SEQ ID NO:10和15中提供的核苷酸序列，并且翻译的蛋白包含SEQ ID NO:11的TCRα链可变序列和SEQ ID NO：16的TCRβ链可变序列。在本发明的工程改造的T细胞或TCR蛋白的一个优选实施方式中，所述TCRα链和β链由一个或多个核苷酸序列编码，所述核苷酸序列例如但不限于分别在SEQ ID NO:33和38中提供的核苷酸序列，并且翻译的蛋白包含SEQ ID NO:44的TCRα链可变序列和SEQ ID NO：45的TCRβ链可变序列。在本发明的T细胞或TCR蛋白的另一个优选实施方式中，所述TCRα链和β链由一个或多个核苷酸序列编码，所述核苷酸序列例如但不限于分别在SEQ ID NO:46和51中提供的核苷酸序列，并且翻译的蛋白包含SEQ ID NO:57的TCRα链可变序列和SEQ ID NO：58的TCRβ链可变序列。在本发明的T细胞或TCR蛋白的另一个优选实施方式中，所述TCRα链和β链由一个或多个核苷酸序列编码，所述核苷酸序列例如但不限于分别在SEQ ID NO:59和64中提供的核苷酸序列，并且翻译的蛋白包含SEQ ID NO:69的TCRα链可变序列和SEQ ID NO：70的TCRβ链可变序列。
本发明还提供了分离或纯化的人ropporin-1B(ROPN1B)和/或人ropporin-1A(ROPN1)的肽(T细胞表位)，其与人主要组织相容性复合物(MHC)分子，优选HLA-A*02分子形成复合物。
在本发明所述分离或纯化的肽的优选实施方式中，所述肽由SEQ ID NO:4、SEQ IDNO：43、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:24中任一氨基酸序列组成。
在本发明的肽的一个实施方式中，所述肽由SEQ ID NO:1-9、20、23-32、43或56中任一(优选SEQ ID NO:4、23、24、43或56中任一)的氨基酸序列或与其具有至少70％或至少80％序列同一性的序列组成，或由如上定义的SEQ ID NO:1、4、23和24的修饰氨基酸序列组成。
本发明还提供了与本发明的人ropporin-1B(ROPN1B)和/或人ropporin-1A(ROPN1)的肽(T细胞表位)复合的分离或合成的人MHC分子。
本发明还提供一种免疫原性组合物，其包含本发明的人ropporin-1B(ROPN1B)和/或人ropporin-1A(ROPN1)的肽和/或本发明的MHC分子，所述组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂；所述组合物任选地进一步包含佐剂；优选其中所述组合物用于疫苗接种，更优选用于对象对本文公开的肿瘤如乳腺癌或皮肤癌的疫苗接种。
本发明还提供了工程改造的细胞，优选工程改造的癌细胞，其中所述细胞经工程改造以表达人ropporin-1B(ROPN1B)和/或人ropporin-1A(ROPN1)。
本发明还提供了编码本发明的TCR蛋白或基于抗体的受体蛋白的TCRα和/或TCRβ链的核酸，所述核酸具有或不具有增强表面表达和/或表位特异性功能的修饰，或编码本发明人ropporin-1B(ROPN1B)和/或人ropporin-1A(ROPN1)的肽的核酸。
还提供了一种治疗患有或疑似患有肿瘤的对象的方法，包括以下步骤：-给予有需要的对象治疗有效量的本发明的T细胞或本发明的药物组合物。
本发明还提供了一种在患有或疑似患有实体瘤的对象中将本文公开的T细胞与本文公开的T细胞表位结合的方法，该方法包括以下步骤：给予所述对象本文公开的T细胞。在这些实施方式中，所述对象中的实体瘤在其表面上表达表位，例如作为表面抗原。本发明还提供了一种产生表位特异性T细胞的方法，其中所述表位是本文公开的人ropporin-1B(ROPN1B)和/或人ropporin-1A(ROPN1)表位，所述方法包括以下步骤：通过将表达表位的细胞与T细胞群接触，所述表达表位的细胞在细胞表面呈递ROPN1B和/或ROPN1表位，任选呈递HLA，其中所述T细胞群是自体宿主T细胞群或同种异体宿主T细胞；选择与呈递ROPN1B和/或ROPN1表位的细胞结合的T细胞，优选CD8+T细胞，并任选地富集和/或增殖由此提供的所选T细胞。此外，该方法可包括对编码TCR的基因进行测序，并在受体T细胞中克隆所述基因作为转基因，以提供表达ROPN1B和/或ROPN1表位特异性TCR的基因工程改造的T细胞的步骤。
本发明还提供了本发明的T细胞、本发明的药物组合物、本发明TCR蛋白、本发明基于抗体的受体蛋白或本发明核酸分子在制备用于治疗对象的肿瘤(例如实体瘤或液体瘤)的药物中的用途。
本发明还提供了一种工程改造的T细胞，其表达与人ropporin-1B(ROPN1B)的T细胞表位结合的T细胞受体(TCR)，其中所述TCR包括：(i)T细胞受体α链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO:14的CDR3，和(ii)T细胞受体β链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO：19的CDR3；并且其中所述T细胞受体α和β链的所述高变区还包含CDR1和CDR2。
本发明还提供了一种工程改造的T细胞，其表达与人ropporin-1B(ROPN1B)和/或人ropporin-1A(ROPN1)的T细胞表位结合的T细胞受体(TCR)或基于抗体的受体(例如CAR)。
在另一个方面，本发明提供了一种(任选分离或纯化的)免疫细胞，例如T细胞，其中所述T细胞表达与人ropporin-1A(ROPN1)和/或人ropporin-1B(ROPN1B)的T细胞表位结合的T细胞受体(TCR)；其中所述T细胞表位由选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:24之一的氨基酸序列组成。在所述方面的一个实施方式中，免疫细胞，优选T细胞，不经工程改造以表达所述T细胞受体(TCR)，而是例如天然表达所述TCR，例如本文公开的所述TCR蛋白。
在其他实施方式中，免疫细胞优选T细胞，可以额外地，例如除了所述TCR转基因之外，经工程改造以表达不同的(即非TCR)转基因，和/或所述TCR转基因可以被修饰(例如通过在不影响所述TCR-α和β可变结构域的情况下添加、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基)，以使所述T细胞的抗肿瘤反应增强(参见Govers等人，J Immunol.，193(10):5315-26(2014))。
在另一个方面，本发明提供了一种包含所述免疫细胞的药物组合物。
附图说明
图1：ROPN1和ROPN1B在健康组织中不表达。A.柱状图显示健康组织中根据TPM值并基于6个不同健康组织数据库的RNAseq的ROPN1和ROPN1B基因表达(实心框表示数据库中存在组织，详见实施例1，材料和方法)，橙色虚线显示用作阈值的NY-ESO1的表达。B.点(叠加)显示根据使用健康组织样品的cDNA文库的qPCR，在48个健康组织中ROPN1和ROPN1B的基因表达，表示成与GAPDH相比的倍数变化。C图显示了在组织微阵列(TMA，n＝63)上使用ROPN1抗体(检测ROPN1和ROPN1B)对健康组织的代表性免疫染色。在基因和蛋白质表达分析中，将NY-ESO1作为对照。
图2：ROPN1和ROPN1B在TNBC中表现出高且均匀的表达。A.柱状图显示了具有弱(TPM 1-10)、中等(TPM 10-100)和强(TPM>100)ROPN1和ROPN1B基因表达的TNBC肿瘤的部分(TCGA，RNAseq，n＝122，详见实施例1，材料和方法)。B.柱状图显示了具有ROPN1和ROPN1B的弱、中等和强免疫染色的TNBC肿瘤的部分(TMA，n＝338)；如实施例1材料和方法中所述进行评分。C：柱状图显示了具有1-9％、10-25％、26-50％或51-100％的肿瘤细胞对ROPN1和ROPN1B蛋白呈阳性的TNBC肿瘤的部分。D图代表具有ROPN1和ROPN1B的弱、中等和强免疫染色的TNBC肿瘤。E+F。柱状图显示了14种肿瘤类型中ROPN1B基因表达弱、中等和强的肿瘤部分(如图A，TCGA，RNAseq数据，n＝6670)。在基因和蛋白质表达分析中，将NY-ESO1作为对照。缩写BLCA，膀胱尿路上皮癌；BRCA，乳腺癌；COAD，结肠腺癌；GBM，多型胶质母细胞瘤；KIRC，肾透明细胞癌；LIHC，肝细胞癌；LUAD，肺腺癌；LUSC，肺鳞状细胞癌；OV，卵巢浆液性囊腺癌；PAAD，胰腺腺癌；PRAD，前列腺腺癌；SKCM，皮肤黑色素瘤；THCA，甲状腺癌；UCEC，子宫体子宫内膜癌。
图3：预测和选择具有免疫原性、安全性并与HLA-A2结合的ROPN1和ROPN1B表位。A.基于计算机预测、肽洗脱和检查非交叉反应性和HLA-A2结合的ROPN1和ROPN1B肽选择的流程图(关于每种工具/测定的详细信息，参见实施例1，材料和方法，关于表位的非交叉反应的详细信息，参见表1)。B.具有和不具有ROPN1B过表达的MDA-MB231 TNBC细胞系的ROPN1B染色，其旋转培养(左侧，细胞旋转染色)或悬浮培养(右侧，流式细胞术，红色表示过表达细胞系的GFP阳性细胞的％，蓝色表示阴性对照)。直方图显示从MDA-MB231-ROPN1B+GFP细胞洗脱的肽的总数(y轴)及其长度(x轴)(如下)。C.HLA-A2结合稳定性的独特(非交叉反应)表位的头对头比较。使用单一肽浓度(25μM)进行测试；结果表示为抗HLA-A2-PE的中值荧光强度(MFI)相对于基线(没有添加肽的T2细胞)的倍数变化，n＝6。使用滴定量(范围从31nM到31μM)测试与无肽相比倍数变化>1.1的肽。Gp100肽YLE用作阳性对照，NY-ESO肽SLL用作参考肽。代表性的滴定曲线如D所示。E.表位评级的一览表。输入包括对照/参考肽；14ROPN1和ROPN1B肽，其在免疫原性或洗脱预测和交叉反应性测试后获得(见图A)。该表从左到右依次包括：每种工具的计算机评分(以等级提供)；HLA-A2结合参数，如最小稳定性、幅度(校正基线点的最高数据点)和EC50值(M，用GraphPad软件5计算)；以及表位的最终评级(阈值为：参考肽YLE幅度的一半；EC50值低于1E-05)。未达到阈值的肽根据其EC50值进行排名。
图4：ROPN1和ROPN1B表位特异性CD8+T细胞及其TCR的富集。A.流程图显示了从T细胞富集到TCR基因鉴定的各个步骤。B.箱形图显示IFNy产生表位1(SEQ ID NO:1)刺激的T细胞，所述T细胞在与负载表位1的aAPC共培养4或5个周期后富集(详见实施例1，材料和方法)。C.代表性肽：与负载表位1的aAPC共培养5个周期后，T细胞的MHC染色。pMHC+CD8 T细胞基于荧光扣除(fluorescence minus one)(FMO，其包含除pMHC之外的所有标志物)进行门控。D.流式细胞术图显示来自图B的T细胞用pMHC(MLN/A2复合物)(对照)染色，以及来自IFNy捕获后的不同克隆的T细胞(克隆1-8，详见实施例1，材料和方法)的染色。黄色方块的样品(克隆2和克隆8)用于5’RACE PCR和TCR测序。E.流式细胞术图显示在用MLN/A2-pMHC多聚体以及相应的荧光扣除(FMO)对照进行FACS分选之后，用pMHC对来自图B的T细胞进行染色。黄色方块样品用于5’RACE PCR和测序。F.凝胶显示TCRα和β基因的5’RACE产物条带。+表示阳性PCR对照；α和β表示来自极限稀释的克隆2和8以及pMHC-FACS分选(F)群体的TCRα和β基因的RACE产物。右侧凝胶显示了使用嵌套引物的额外扩增步骤。G.鉴定的T细胞受体V-α(根据IMGT命名法的TRAV和J；黄色)和β基因(TRBV、D和J；蓝色)以及从来自图E和F的T细胞克隆的相应C基因(起始和终止氨基酸)；百分比反映了所有已鉴定集落的比例。
图5：经基因工程改造以表达ROPN1(B)MLN TCR的T细胞的严格表位特异性。A.来自2个健康供体的T细胞中MLN-TCR1和MLN-TCR2(MLN-TCR2是具有SEQ ID NO:11的α链和SEQID NO：16的β链的TCR)的基因转移，以及通过流式细胞术测定的MLN/A2-pMHC多聚体的结合。B.来自2个健康供体的MLN-TCR2 T细胞的MACS分选；图显示在用pMHC进行MACS分选之前(左)和之后(右)MLN/A2-pMHC的结合。C.MLN-TCR2 T细胞(2个供体中的一个)在用滴定量的表位1(MLN)和gp100肽(n＝3)刺激时的代表性IFNγ反应。D.条形图显示，当识别来自ROPN1B的表位1(MLN)时，MLN-TCR2T细胞产生IFNγ，但当表位来源于ROPN1时，没有产生IFNg(n＝3的代表性图)。E.条形图显示了MLN-TCR2 T细胞响应同源肽产生IFNγ，该同源肽在相对于未突变的同源肽的每个单独位置具有丙氨酸突变(n＝3的代表性图)。
图6：SEQ ID NO:10、11、15和16，对不同区域进行注释。显示了SEQ ID NO:10(核苷酸序列)和11(氨基酸序列)的TCRα链的前导序列、TRAV、TRAJ和TRAC结构域。显示了SEQ IDNO:15(核苷酸序列)和16(氨基酸序列)的TCRβ链的前导序列、TRBV、TRBD、TRBJ和TRBC结构域。CDR1-3区域以粗体显示。
图7(图3的扩充)。根据免疫原性、安全性和与HLA-A2的结合选择预测和洗脱的ROPN1和ROPN1B表位。A.流程图，基于计算机预测，肽洗脱(总n＝28)，以及非交叉反应性检查(n＝19)，HLA-A2的最小结合特性(n＝11)的ROPN1和ROPN1B肽选择，以及根据HLA-A2结合的幅度进行排序(关于每种工具/测定的详细信息，参见实施例1，材料和方法，关于表位的非交叉反应性的详细信息参见表3)。B.HLA-A2结合的独特(非交叉反应)表位的头对头比较。使用单一表位浓度(31μM)进行测试；结果表示为结合的抗HLA-A2-PE的中值荧光强度(MFI)相对于基线(没有添加表位的T2细胞)的倍数变化，n＝每个表位2/3。C.使用滴定量(范围从31nM到31μM)进一步用T2细胞测试与无表位相比倍数变化>1.1的表位。显示了代表性滴定曲线。Gp100肽(YLE)用作参考表位。D：表位的概况以及其(从左至右)：计算机评分(以等级提供)；HLA-A2结合评分(即最小稳定性(见上))、幅度(相对于参考表位的幅度)和EC50值(M，用GraphPad软件5计算)；以及表位的最终评级。当表位符合以下3个标准时，并显示(1)相对于无肽，HLA-A2结合稳定性>1.1；(2)EC50＜5x10-5M；和(3)相对于参考肽YLE的结合幅度＞0.5(参见图B和C)，然后根据幅度值对剩余的表位(n＝11)进行排序。
图8：从富集ROPN1和ROPN1B特异性CD8+T细胞到测试相应TCR的敏感性和特异性的各个步骤的流程图。卡通示意图分8个步骤说明了如何回收ROPN1N和ROP1NB特异性CD8+T细胞，根据敏感性和特异性的体外和体内测定鉴定和测试相应的TCR。每一步，显示表位特异性T细胞或TCR进入下一步所需达到的纳入标准。那些针对到达每个步骤的表位的T细胞或TCR以粗体突出显示。
图9(图4和图5的扩充)。ROPN1和ROPN1B表位特异性CD8+T细胞的富集以及相应TCR的鉴定和基因转移。图3D中评级的ROPN1和ROPN1B表位用于启动表位特异性CD8+T细胞的富集。具有SEQ ID NO:1至9、23和24的表位垂直定位，结果水平定位。每个表位的结果(从左到右)是：(i)表位特异性IFNg产生和(ii)CD8+T细胞的肽：MHC结合；FAC分选的CD8+T细胞的克隆TCR序列；和(iv)TCR在基因转移到T细胞后的表面表达。IFNg水平(以pg/ml为单位)在用负载同源或随机表位的T2细胞刺激T细胞后24小时通过ELISA测定。pMHC与CD8+T细胞的结合(％)在用肽：MHC四聚体染色和流式细胞术分析后测定。TCR-V-α(TRAV和J，根据IMGT命名法；黄色)和β基因(TRBV、D和J；蓝色)在来自FAC分选的pMHC+T细胞的cDNA的5’RACE PCR后测序；百分比反映了所有已鉴定集落的比例。在用TCR基因逆转录病毒转导的健康供体T细胞中测定TCR表达，之后用肽：MHC染色T细胞。显示了代表性流程图(2个供体中的1个)。在表位11(SEQ ID NO:24)的情况下：特异性肽：MHC复合物在检测TCR T细胞时表现出不敏感，并被针对TCR-Vb7.1和CD137的抗体染色所取代(后者在用负载同源表位的BSM细胞刺激48小时后)。显示的是显示CD137应答的抗表位11TCRab。详见：图8，表4和实施例1，材料和方法。NA表示不适用，即T细胞或TCR未达到前一步骤的纳入标准。
图10(图5的扩充)。对经基因工程改造表达ROPN1和B限制性TCR的T细胞同源表位的敏感性。图5中显示TCR表面表达的ROPN1和ROPN1B表位用于测试对同源表位的敏感性。具有SEQ ID NO:1、4、8、23和24的表位垂直定位，结果水平定位。每个表位的结果(从左到右)是用以下刺激后的IFNg产生：(i)ROPN1或ROPN1B-转染的乳腺癌细胞系；和(ii)负载有滴定量的同源表位的BSM细胞。IFNg水平通过ELISA测定(单位为pg/ml)。(i)的对照包括负载同源或随机表位的BSM细胞。TCR T细胞对用ROPN1或ROPN1B转染的TNBC细胞系MM231的反应性提供了表位在内源性抗原加工和呈递后被识别的量度(换句话说，该表位不代表人工表位)。(ii)中，BSM细胞负载范围为1nM-30μM的同源表位。EC50值以摩尔浓度表示，并用GraphPad软件5计算，表示TCR T细胞对同源表位的敏感性。Gp100肽(YLE)用作参考表位。详见：图8，表4和实施例1，材料和方法。NA表示不适用，即T细胞或TCR未达到前一步骤的纳入标准。
图11(扩展到图5)。经基因工程改造以表达ROPN1和B限制性TCR的T细胞的严格表位特异性。使用对图6中的同源表位显示敏感性TCR T细胞反应的ROPN1和ROPN1B表位来测试对同源表位的特异性。SEQ ID NO:4和23的表位垂直定位，结果水平定位。每个表位的结果(从左到右)是用以下刺激产生IFNg：(i)在单个氨基酸位置突变的同源表位；和(ii)HLA-A2洗脱肽的文库。BSM细胞负载10mM表位，并用ELISA测量24小时上清液中的IFNg水平(单位为pg/ml)。在(i)中TCR T细胞用同源表位或具有单一丙氨酸置换的表位刺激(在原始表位中为丙氨酸的情况下，然后为甘氨酸置换)。IFNg水平显示为相对于对非突变同源表位反应的平均％±SEM(n＝3)。反应<50％(虚线)表示对TCR识别至关重要的氨基酸(识别基序：下划线氨基酸)。使用ScanProSite对照人类蛋白质数据库查询同源基序；这对于测试的TCR没有产生非同源匹配。在(ii)中，用114种不同的HLA-A2洗脱肽刺激TCR T细胞。同源表位作为阳性对照。IFNg水平显示为平均值±SEM(n＝3)。对于细节见：图8，表4和实施例1，材料和方法。NA表示不适用，即T细胞或TCR未达到前一步骤的纳入标准。
图12：TCR工程改造的T细胞对ROPN1A和B阳性3D乳腺类肿瘤的识别。显示出对图7中同源表位的特异性TCR T细胞反应的ROPN1和ROPN1B表位用于测试对3D乳腺类肿瘤的反应性。SEQ ID NO:4和23的表位垂直定位，结果水平定位。每个表位的结果包括在乳腺癌细胞的三维类肿瘤模型中实时跟踪和监测TCR T细胞。类肿瘤来源于ROPN1或ROPN1B转染的MM231细胞，并在胶原基质中生长，之后将TCR T细胞直接添加到类肿瘤的顶部。肿瘤细胞用GFP(与ROPN1或ROPN1B偶联；提供绿色)转染，TCR T细胞用Hoechst标记，然后添加到类肿瘤顶部(提供蓝色)，PI标记用于监测细胞死亡(提供红色)。通过荧光显微镜在不同时间点监测TCR T细胞和类肿瘤细胞之间的共培养。代表性图像表示t＝0、24和48小时；并且图显示GFP和PI在48小时相对于0小时的信号差异。对于细节见：图8，表4和实施例1，材料和方法。NA表示不适用，即T细胞或TCR未达到前一步骤的纳入标准。
图13：在免疫缺陷小鼠中过继转移TCR工程改造的T细胞后ROPN1阳性乳腺肿瘤的消退。将基质胶中的ROPN1阳性乳腺癌细胞(MM321)皮下移植到NSG小鼠的右侧。当肿瘤可触及(约200mm3)时，腹腔注射白消安(第-3天)和环磷酰胺(第-2天)对小鼠进行预处理。在第0天和第3天，小鼠分别静脉注射2次15×106TCR或空白-工程改造的人T细胞，然后连续8天皮下注射IL-2(每组n＝4)。新鲜转导T细胞(第0天转移)并用IL15和IL21维持(第7天转移)。A.瀑布图(第10天相对于第0天)。B.具有代表性的宏观例子。
图14：对ROPN1和ROPN1B表位4(SEQ ID NO:4)、10(SEQ ID NO:23)和11(SEQ IDN0:24)特异性的TCR序列，注释了不同区域。显示了SEQ ID NO:33、46、59(核苷酸序列)和34、47、60(氨基酸序列)的TCRα链的前导序列、TRAV、TRAJ和TRAC结构域。显示了SEQ ID NO:38、51、64(核苷酸序列)和39、52、65(氨基酸序列)的TCRβ链的前导序列、TRBV、TRBD、TRBJ和TRBC结构域。CDR1-3区域以粗体显示。
具体实施方式
本文中使用的与T细胞有关的术语“工程改造的”包括从其天然存在的形式修饰的T细胞。所述修饰优选为遗传修饰，例如，其中T细胞包含工程改造的核酸序列，所述工程改造的核酸序列提供相对于天然存在的分子具有至少一个氨基酸缺失、插入或取代的蛋白质，或者包含异源核酸序列。工程改造的T细胞优选表达本文公开的TCR转基因。工程改造的T细胞显然不是天然存在的T细胞。术语“工程改造的”可以与“重组的”互换使用，“重组的”意味着通过基因工程改造而产生。如本文所用，术语“工程改造的细胞”或“基因工程改造的细胞”用于指示包含至少一种核酸分子的细胞，所述一种核酸分子未在相应的野生型细胞中发现，或在基因组中插入于野生型细胞中不存在的位置。例如，工程改造的细胞可以包含或携带核酸表达载体，所述核酸表达载体整合到细胞基因组中或作为染色体外遗传元件存在。
如本文中关于工程改造的T细胞所使用的短语“工程改造以表达T细胞受体(TCR)或基于抗体的受体”包括TCR或基于抗体受体被遗传修饰(例如通过一个或多个氨基酸残基的添加、缺失和/或取代)(参见Govers等人，J Immunol，193(10):5315-26(2014))或是转基因的可能性，并且包括TCR或基于抗体的受体亲和力增强与否的可能性，并且包括经工程改造以表达TCR或基于抗体的受体的细胞进一步表达一个或多个额外的TCR或基于抗体的受体，例如以转基因形式表达的可能性。除了TCR或基于抗体的受体外，工程改造的T细胞还可以表达编码胞内、膜表达或可分泌蛋白的(转)基因(例如Kunert等人，Oncoimmunology，7(1):e1378842(2017))。例如，可以表达与不同表位结合的另外的TCR(转)基因或另外的基于抗体的受体(转)基因。
此处使用的术语“天然存在”包括对自然界中存在的物体的引用。
本文中使用的术语“T细胞”包括参与各种细胞介导的免疫反应的胸腺来源的淋巴细胞。该术语包括T辅助细胞(CD4+T细胞)和细胞毒性T细胞(CTL、CD8+T细胞，例如溶细胞性T细胞)及其各种亚群。优选地，但并非排他地，T细胞是CD3+、CD8+T细胞。在实施方式中，在用本文公开的TCR转基因转染之前，T细胞或T细胞的集合通常但不唯一地分离或纯化自健康个体或癌症患者的外周血。术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可以互换使用。T细胞属于一组被称为淋巴细胞的白细胞，在细胞介导的免疫中发挥着核心作用。它们可以通过细胞表面存在一种称为T细胞受体(TCR)的受体而与其他淋巴细胞类型(如B细胞和自然杀伤细胞)区分开来。优选地，T细胞是人T细胞，例如存在于血液(外周血单核细胞，PBMC)或肿瘤组织(肿瘤浸润T淋巴细胞，TIL)中的那些细胞。
T细胞是任选地在适当修饰后，例如在经工程改造以表达TCR后，能够产生或介导免疫反应，例如针对TCR所针对的表位的细胞免疫反应的细胞。优选的T细胞是被迫使或修饰为缺乏TCR内源表达的T细胞，并且其可以被修饰为在细胞表面上表达TCR转基因，以使T细胞能够重定向到感兴趣的表位，即癌症细胞选择性表达的表位，如本文公开的T细胞表位。
已经发现了几种不同的T细胞亚群。辅助T细胞在免疫过程中协助其他白细胞，包括B细胞成熟为浆细胞、细胞毒性T细胞和巨噬细胞的活化等功能。这些细胞通常被称为CD4+T细胞，因为它们在其表面表达CD4蛋白，并且可以在表型和功能上区分为各种亚群，例如T辅助1、2、17型等。当T辅助细胞被抗原呈递细胞(APC)表面表达的MHC II类分子(也称为HLA-DP、DQ、DR)呈递表位时，它们被活化。一旦被活化，辅助T细胞就会迅速分裂，分泌称为细胞因子的小蛋白和/或表面表达受体，调节或协助主动免疫反应。细胞毒性T细胞破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞。这些细胞也被称为CD8+T细胞，因为它们在其表面表达CD8，并且在表型和功能上也可以区分为各种亚群，例如T细胞毒性1、2、17型等。这些细胞通过与存在于身体每个有核细胞表面的MHC I类分子(也称为HLA-A、B、C)相关的表位结合来识别其靶标。
本领域技术人员可以使用标准实验室程序常规分离和制备T细胞，通常在体外或离体。例如，可以使用众所周知的细胞分离系统从对象的骨髓、外周血、肿瘤块中分离T细胞。在实施方式中，T细胞存在于来自对象的外周血单核细胞(PBMC)的样品中。优选本文公开的T细胞通常是活化的T细胞(例如用抗CD3和CD28抗体活化)，用TCR转基因逆转录，并在细胞因子如IL-15和IL-21存在下扩增(描述于Lamers等人，Hum Gene Ther Methods，25(6):345-357(2014))。
本文使用的术语“T细胞受体(TCR)”包括指包含至少两条独立肽链的蛋白质复合物，所述肽链由T细胞受体α和β基因产生，称为α和β-TCR链，并且可以与CD3分子天然复合以提供TCR的表面表达和功能。TCR-ab的结构类似于免疫球蛋白抗原结合片段(Fab)，由抗体的重链和轻链构成，每个由一个恒定结构域和一个可变结构域组成。TCR的每条链都是免疫球蛋白超家族的成员，并且具有一个N-末端免疫球蛋白(Ig)可变(V)结构域、一个Ig恒定(C)结构域，一个跨膜/细胞膜跨越区，以及在C末端的短胞质尾。本文使用的术语“T细胞受体的可变区”包括TCR链的可变结构域，并且由可变(V)和连接(J)区段(在TCRα的情况下，由相应的V和Jα基因区段编码，分别编号为1-43和1-58)和可变(V)，多样性(D)和连接(J)区段(在TCRβ的情况下，由相应Vβ基因区段编码，编号为1-42，与Dβ1(1个基因区段)和Jβ1(6个基因区段)或Dβ2(1个基因区段)和Jβ2(7个基因区段)组合)构成。TCRα链和β链的可变区都有三个高变或互补决定区(CDR)，它们因与肽：MHC复合物(TCR的天然配体)结合而被识别。CDR1和2由TCR-V区段构成(在TCRα和β两者的情况下)，而CDR3由TCR-V、J(在TCR-α的情况下)和TCR-V、D、J区段(在TCR-β的情况下)的融合物构成，包括核苷酸缺失和插入。CDR1和2主要结合MHC本身，CDR3是任何TCR最独特的，主要结合肽：MHC复合物。优选地，TCR是在跨膜和胞内结构域中具有或不具有修饰(不影响TCR-V结构域)以增强所述TCR的表面表达和/或表位特异性功能的人TCR(如在Govers等人，JImmunol，2014193(10)，p.5315-5326(2014)中进行的)。
如本文所使用的术语“CDR”涉及本领域众所周知的“互补决定区”。CDR是免疫球蛋白或抗原结合受体(例如CAR和TCR)的一部分，其确定所述分子的特异性并与特定配体接触。CDR是分子中变化最大的部分，有助于这些分子的抗原结合多样性。在每个V结构域中有三个CDR区CDR1、CDR2和CDR3。Ig衍生区的CDR区可以如“Rabat”(《免疫学感兴趣的蛋白质序列》，第5版)，NIH出版物号91-3242，美国健康和人类服务部(1991)；ChothiaJ.Mol.Biol.196(1987),901-917)或“Chothia”(Nature 342(1989),877-883)中所述进行测定。优选本文所述的CDR是(人)T细胞CDR，例如T细胞CDR1、T细胞CDR2或T细胞CDR3。
优选地，本文所指的抗原结合受体是TCR，但不排除使用任何其他受体，例如基于抗体的受体。在基于抗体的受体的情况下，本发明特别涉及对肽：MHC复合物具有特异性的抗体片段(Fab)或单链可变片段(scFv)(如在Chames等人，J Immunol，169(2)，p.1110-11182002中获得和描述的)。本文公开的基于抗体的受体优选为TCR样抗体，即结合肽：MHC复合物的抗原结合受体。优选地，基于抗体的受体是(TCR样)CAR。
在一些方面和实施方式中，本发明提供了工程改造的T细胞，其中所述T细胞经工程改造以表达(亲和力增强的)TCR或基于抗体的受体，例如CAR，其结合如本文所公开的人ropporin-1B(ROPN1B)和/或人ropporin 1-A(ROPN1)的T细胞表位。在实施方式中，所述基于抗体的受体包含抗体片段(Fab)或单链可变片段(scFv)形式的结合结构域。在实施方式中，所述亲和力增强的TCR或基于抗体的受体不一定包含：(i)SEQ ID NO:12的CDR1；SEQ IDNO:13的CDR2和SEQ ID NO-14的CDR3；或SEQ ID NO:17的CDR1；SEQ ID NO:18的CDR2；和SEQID NO:19的CDR3，(ii)SEQ ID NO:35的CDR1；SEQ ID NO:36的CDR2；SEQ ID NO:37的CDR3；和/或SEQ ID NO:40的CDR1；SEQ ID NO:41的CDR2；SEQ ID NO:43的CDR3；(iii)SEQ ID NO:48的CDR1；SEQ ID NO:49的CDR2；SEQ ID NO:50的CDR3；和/或SEQ ID NO:53的CDR1；SEQ IDNO:54的CDR2；SEQ ID NO:55的CDR3，或(iv)SEQ ID NO:61的CDR1；SEQ ID NO:62的CDR2；SEQ ID NO:63的CDR3；和/或SEQ ID NO:66的CDR1；SEQ ID NO:67的CDR2；SEQ ID NO:68的CDR3。换句话说，上述CDR序列(例如上述CDR3序列)可以包括一个、两个或三个氨基酸残基的添加、取代和/或缺失，以增强受体对表位的亲和力。这些变体也被称为亲和力增强的变体，并且是本发明的一部分。
本文中使用的术语“结合”包括“抗原相互作用位点”和抗原之间的结合(相互作用)。术语“抗原相互作用位点”定义了多肽的基序，其显示出与特定抗原或特定抗原组的特异性相互作用的能力。所述结合/相互作用也被理解为定义“特异性识别”，如上在TCRab可由6个CDR区(TCRα的CDR1-3和TCRβ的CDR1-3)定义的情况下所述。根据本发明，术语“特异性识别”是指受体能够与本文公开的ROPN1和/或ROPN1B表位特异性相互作用和/或结合。TCR的抗原结合部分可以识别、相互作用和/或结合于不同的表位，尽管具有不同的结合强度。这涉及TCR的特异性，即其在本文公开的抗原分子的特定区域之间进行区分的能力。抗原相互作用位点与其特异性抗原的特异性相互作用可导致胞内信号的启动，例如，由于TCR的低聚。因此，抗原相互作用位点的氨基酸序列中的特定基序和抗原由于其一级、二级或三级结构以及所述结构的二次修饰而彼此结合。因此，术语“结合”不仅涉及线性表位，还可能涉及由靶分子或其部分的两个区域组成的构象表位、结构表位或不连续表位。在本发明的上下文中，构象表位是由在一级序列中分离的两个或更多个离散氨基酸序列定义的，当多肽折叠成天然蛋白质时，这些序列在分子表面上结合在一起(Sela，Science 166(1969)，1365和Laver，Cell 61(1990)，553-536)。此外，术语“结合于……”在本发明的上下文中可与术语“相互作用”互换使用。TCR的抗原结合部分结合特定靶抗原决定簇的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术来测量，例如表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等，Glyco J 17323-329(2000))，和传统的结合测定法(Heeley，Endocr Res28217-229(2002))。在一个实施方式中，TCR与不相关表位的结合程度小于所述TCR与靶表位(或同源表位)的结合的约10％，如通过SPR测量的。在某些实施方式中，与靶抗原结合的抗原结合部分的解离常数(KD)为≤1mM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M-10-13M，例如10-9M-10-13M)。根据本发明使用的术语“特异性结合”是指本发明中使用的分子不与或基本上不与类似结构的(多)肽发生交叉反应。例如，可以通过评估TCR工程改造的T细胞的肽：MHC结合或表位特异性反应来测试正在研究的TCR组的交叉反应性(参见Kunert A，J Immunol，2016，和Kunert A，Clin Cancer Res，2017)，使用不相关的肽和在单个氨基酸位置突变的肽作为对照。只有那些与感兴趣的表位结合但不或基本上不与无关表位结合的TCR才被认为对感兴趣表位(因此对抗原)具有特异性，并根据本文提供的方法选择用于进一步研究。证明关键的氨基酸位置越多(基于突变肽的分析)，TCR的抗原结合位点就越严格和特异性。这些方法尤其可以包括与结构和/或功能紧密相关和/或突变肽的结合研究、阻断和竞争研究。结合和功能研究还包括流式细胞术分析、表面等离子体共振(SPR，例如使用)、放射性标记的配体结合测定和/或使用TCR工程改造T细胞的刺激测定。/>
表位也称为抗原决定簇，是免疫系统识别，特别是T细胞识别的抗原部分。例如，表位是TCR结合的抗原的特定部分。虽然表位通常是非自身蛋白质，但可识别的来源于宿主的序列(如在自身免疫性疾病或癌症的情况下)也是表位。基于其结构和与TCR的相互作用，本文所述的蛋白质抗原的表位可以是构象表位或线性表位。
如本文所用，术语“结合”包括涉及TCR-肽：MHC特异性结合，其中TCR对T细胞表位或包含所述表位的抗原具有结合特异性，或具有结合该表位的能力，优选当抗原或表位存在于MHC分子上时。本领域技术人员理解，该措辞并不意味着TCR(已经)与T细胞表位或靶抗原结合。
如本文所用，术语“抗原”包括涉及包含表位的试剂，针对该表位将引发和/或引导免疫应答。在本公开中，抗原优选是蛋白质分子，其任选地在加工后诱导免疫应答，该免疫应答对于表达和/或呈递抗原或其衍生表位的细胞或抗原是特异性的。术语“抗原”包括特定蛋白质和肽。
如本文所用，术语“表位”包括提及分子中的抗原决定簇，例如抗原，即分子中的一部分或片段，例如蛋白质，其被免疫系统识别，例如被T细胞识别，特别是当在MHC分子的情况下被呈递时。蛋白质如人ROPN1和/或ROPN1B的表位可包含所述蛋白质的连续或不连续部分，并且当与MHC I类或II类结合时，其长度优选为8-11或15-24个氨基酸残基。例如，表位的长度可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个氨基酸残基。本文公开的表位优选为T细胞表位。
本文中使用的术语“ROPN1和/或ROPN1B”包括与男性生育能力相关的蛋白质。ROPN1(本文中也称为ropporin-1A)和/或ROPN1B(本文中也称为ropporin-1B)参与调节纤维鞘完整性和精子活力等功能，并在精子获能所需的PKA依赖性信号转导过程中发挥作用。优选在本公开中，ROPN1和/或ROPN1B是人ROPN1和ROPN1B，并且优选例是人ROPN1A/ROPN1及其同种型ROPN1B。人ROPN1的氨基酸序列可在UniProtKB登录号Q9HAT0-1下获得(最后修改：2001年10月1日-v2)。人ROPN1B的氨基酸序列可在UniProtKB登录号Q9BZX4-1下获得(最后修改：2001年6月1日-v1)。所有鉴定的T细胞表位(表1-4，SEQ ID NO:1-9、20、23-32、43和56)都存在于人ROPN1和/或ROPN1B的氨基酸序列中。一些鉴定的T细胞表位仅存在于人ROPN1B的氨基酸序列中，而不存在于人ROPN1的氨基酸序列，反之亦然。
本文中使用的术语“免疫反应”包括对抗原的综合身体反应，优选地是指细胞免疫反应或细胞以及体液免疫反应。免疫反应可以是保护性/防范性/预防性和/或治疗性的。
本文中使用的术语“细胞免疫应答”包括指在MHC I类或II类的背景下，针对呈递抗原(抗原表位)的细胞的细胞应答。
优选地，在本文公开的医学方法中，免疫应答的靶标是表达人ROPN1和/或ROPN1B的细胞(即靶细胞)，优选肿瘤或癌细胞。优选所述细胞在对象中。例如，所述细胞是表达人ROPN1和/或ROPN1B并且在其细胞表面上显示或呈递与MHC分子(例如MHC I类分子(例如HLA-A，例如HLA-A*02分子)复合的T细胞表位的细胞，优选地，其中所述T细胞表位是SEQ IDNO:1-9、20、23-32、43和56之一，优选SEQ ID NO:4、23、24、43或56之一，更优选SEQ ID NO:4、23或24之一，甚至更优选SEQ ID NO:4。
本文使用的术语“主要组织相容性复合物”和相应的缩写“MHC”包括指MHC I类和MHC II类分子。MHC分子与所有脊椎动物中都存在的基因复合物有关。MHC分子是重要的蛋白质，能够使T细胞在免疫反应中识别抗原呈递细胞或患病细胞，并活化T细胞。MHC分子结合表位，如肽，并将其呈递给TCR识别。MHC编码的蛋白质在细胞表面表达，并对T细胞展示自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如，入侵微生物的片段或曾经是自身抗原的异常分子)。MHC分子分为三个亚群，I类、II类和III类。MHC I类蛋白通常已知向细胞毒性T细胞呈递抗原决定簇。通常，已知MHC II类蛋白向T辅助细胞呈递抗原决定簇。在人类中，MHC基因通常称为人白细胞抗原(HLA)基因，而MHC分子通常称为HLA分子。HLA基因编码9个经典组：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA和HLA-DRB1。
优选地，在本公开中，MHC分子是HLA分子。在实施方式中，HLA分子(蛋白质)是HLA-A分子，更优选HLA-A*02分子。优选地，本文公开的TCR是结合HLA-A分子，更优选HLA-A*02分子的TCR。
如本文中关于T细胞所使用的术语“集合”包括指一组T细胞，所述T细胞经工程改造以表达如本文所公开的相同TCR或如本文所公开的不同TCR。例如，所述集合可包含经工程改造以表达结合SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:20的表位的TCR的T细胞，且所述集合还可包含经工程改造以表达与SEQ ID NO:2等的表位结合的TCR的T细胞。如本领域技术人员所理解的，T细胞的集合可以药物组合物的形式给予，所述药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂，例如药学上可接收的运载体或稀释剂。
本文中使用的术语“肿瘤”包括良性、癌前、恶性或转移性的异常细胞生长。优选肿瘤是恶性肿瘤，即癌症。肿瘤可以是诸如癌症的实体瘤或诸如淋巴瘤、骨髓瘤或白血病的血液(液体)瘤。优选地，肿瘤是实体瘤，更优选地，该肿瘤是以表达人ROPN1和/或ROPN1B的肿瘤细胞为特征的实体瘤，优选地，并且在所公开的TCR的上下文中，人ROPN1或ROPN1B。在优选实施方式中，所述实体瘤是乳腺癌，例如TNBC，或皮肤癌，例如黑色素瘤，更优选皮肤黑色素瘤(SKCM)。
如本文所用，术语“癌症”包括(但不限于)指以存在癌症细胞为特征的癌症，所述细胞选自以下的细胞：肾上腺肿瘤、AIDS相关癌症、腺泡状软组织肉瘤、星形细胞瘤、膀胱癌(鳞状细胞癌和移行细胞癌)、骨癌(釉质瘤、动脉瘤样骨囊肿、骨软骨瘤、骨肉瘤)、脑和脊髓癌症(神经胶质瘤)、转移性脑肿瘤、乳腺癌症、颈动脉体瘤、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤(dhordoma)、嫌色肾细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结直肠癌、皮肤良性纤维组织细胞瘤、促结缔组织增生性小圆细胞瘤、脑膜突细胞瘤、尤文氏瘤、骨骼外黏液样软骨肉瘤、骨骼纤维生成不良、骨纤维发育不全、胆囊或胆管癌、胃癌、妊娠滋养细胞病、生殖细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌(肾母细胞瘤、乳头状肾细胞癌)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肉瘤/恶性脂肪瘤、肝癌(肝母细胞瘤，肝细胞癌)、淋巴瘤、肺癌、髓母细胞瘤和黑色素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤、多发骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、神经母细胞瘤，神经内分泌肿瘤、和卵巢癌、胰腺癌、甲状腺乳头状癌、甲状旁腺肿瘤、儿童癌症、外周神经鞘肿瘤、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、前列腺癌、后发性黑色素瘤、罕见血液病、肾转移性癌、横纹肌样肿瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃部癌症、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移性癌症和子宫癌(宫颈癌、子宫内膜癌和平滑肌瘤)，或任何其他恶性组织。
本文中使用的术语“对象”或“患者”包括指患有或疑似患有肿瘤的个人。换句话说，术语“对象”或“患者”可用于表示患有癌症等肿瘤的个人。优选地，对象是哺乳动物，更优选灵长类动物，最优选人类。
本文中使用的术语“核酸”包括DNA和RNA，包括mRNA或cDNA，以及它们的合成同源物。核酸可以是天然的、重组的或合成的核酸。
本文中使用的术语“氨基酸”包括蛋白质的天然存在的单体及其合成同源物。氨基酸残基可以是天然的、重组的或合成的氨基酸残基。
术语“％序列相同性”在本文中定义为包括在对齐序列并在必要时可选地引入缺口以实现最大序列相同性百分数后，与所关注的核酸或氨基酸序列中的核苷酸或氨基酸残基相同的核酸序列中的核苷酸或氨基酸序列中的氨基酸残基的百分数。用于比对的方法和计算机程序在本领域中是众所周知的。序列相同性是基于感兴趣的氨基酸序列的几乎整个长度上计算的，优选整个(完整)长度。本领域技术人员理解，将一个氨基酸序列中的连续氨基酸残基与另一个氨基酸序列中的连续氨基酸残基进行比较。
T细胞表位：
本发明人发现了一组人ropporin-1B(ROPN1B)和/或人ropporin-1A(ROPN1)T细胞表位，其可用作本文公开的TCR工程改造T细胞的靶标。这组人ropporin-1B(ROPN1B)和/或人ropporin-1A(ROPN1)T细胞表位列于表1-4中，并作为SEQ ID NO:1-9、20、23-32、43和56列出，并且形成本发明的一部分。优选的T细胞表位标为SEQ ID NO:4(FLY-A表位)、23(FLY-B表位)和24(EVI表位)，43或56，更优选SEQ ID NO:4、23或24之一，甚至更优选SEQ ID NO:4。
因此，本发明提供了分离或纯化的人ropporin-1B(ROPN1B)和/或人ropporin-1A(ROPN1)肽，其与人主要组织相容性复合物(MHC)分子，优选HLA-A*02分子形成复合物，其中所述肽由SEQ ID NO:1-9、20、23-32、43和56中任一氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，肽由SEQ ID NO:1-9、20、23-32、43和56中任一氨基酸序列或与其具有至少70％或至少80％序列同一性的序列组成。在实施方式中，肽由(i)SEQ ID NO:1的修饰的氨基酸序列组成，其中SEQ ID NO:1的位置6(Glu)、位置8(Glu)和/或位置9(Val)的氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代，(ii)SEQ ID NO:4的修饰的氨基酸序列，其中SEQID NO:4的位置1(F)、位置2(L)和/或位置9(V)处的氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代，(iii)SEQ ID NO：23的修饰的核酸序列，其中SEQ ID NO:23的位置1的(F)和/或者位置9的(V)上的氨基酸残基被另一氨基酸残基取代。
在相同情况下，本发明还提供了与本发明的人ropporin-1B(ROPN1B)和/或人ropporin-1A(ROPN1)的肽(T细胞表位)复合的分离或合成的人MHC分子。
本发明还提供了(i)如本文所公开的人ropporin-1B(ROPN1B)和/或人ropporin-1A(ROPN1)T细胞表位，或(ii)与如本文所披露的人ropporin-1B(ROPN1B)和/或人ropporin-1A(ROPN1A)T细胞抗原表位复合的人MHC分子用于鉴定、筛选、纯化、富集和/或亲和成熟T细胞的用途。
选择和验证ROPN1和/或ROPN1B衍生的T细胞表位的步骤总结
ROPN1B蛋白由210个氨基酸组成，与ROPN1有95％的序列重叠。MHC-I肽的长度绝大多数为8-11个氨基酸，导致共有814个理论表位可能来源于ROPN1和/或ROPN1B。
在肿瘤免疫学领域，大多数研究是根据单一的计算机预测工具来选择T细胞表位的。相比之下，发明人通过使用多种计算机工具(具有自行设计的截留值)结合MHC-I洗脱表位的免疫肽组分析来选择独特的ROPN1和/或ROPN1B T细胞表位。筛选所有抗原表位，以确定其与其他蛋白质中存在的任何表位的非同源性，随后使用HLA-A2表达细胞和健康供体的原始T细胞刺激在体外验证MHC-I结合以及免疫原性。
更详细地说，ROPN1和/或ROPN1B表位的选择和验证遵循以下6个步骤。
1.使用多种公众可得的工具预测HLA-A2:01的表位呈递，根据截止值，产生n＝17个免疫原性表位(详见图3)。
2.免疫肽组分析(即，对来自表达HLA-A2的癌细胞系的MHC-I结合肽的质谱分析)，其产生n＝2个额外表位(预测与HLA-A2:01结合的11聚表位和预测与HLA-B40:01结合的10聚表位)。
3.筛选表位的非同源性(>2个氨基酸与非来源于ROPN1和/或ROPN1B的任何肽序列不同)，这将非交叉反应表位的数量缩小到14个。
4.结合HLA-A2:01的能力评估，使用我们的最小HLA-A2结合阈值，将表位的数量缩小到11个。
5.评估与HLA-A2:01结合的强度(亲和力)，这是诱发T细胞反应的一个重要特征，并将表位数量缩小到9(见图3E，表2和SEQ ID NO:1-9)。
6.评估从健康供体中获得的表位特异性T细胞的富集能力，这被认为是表位免疫原性的一种度量。迄今为止，在负载肽的抗原呈递细胞与来自健康供体PBMC的自体原初T细胞的共同培养物中观察到T细胞对所有测试表位的反应(表2)。
实施例2和图7-14提供了选择和验证T细胞表位和T细胞受体的进一步步骤。
TCR的识别与选择
在识别作为过继性T细胞治疗的靶抗原的ROPN1和/或ROPN1B及其如本文所公开的表位之后，本领域技术人员将理解如何制备表达ROPN1和/或ROPN1B表位的细胞，其随后可用于生成和/或富集包含ROPN1和/或ROPN1B表位特异性TCR的宿主T细胞。下面的实验部分描述了这些方法的细节。
简言之，表位特异性T细胞可通过与荧光标记的HLA分子复合的所述表位染色和分选，或通过用抗-IFNg和磁性标记的捕获抗体染色和分选，从健康供者血液或实体癌患者的血液或肿瘤组织中分离。在上述染色和分离之前，可通过与人工或自体抗原呈递细胞(例如树突状细胞(CD11c+))或遗传修饰的B细胞(例如K562细胞)共培养来富集此类T细胞。还参见实施例1和实施例2“材料和方法”，了解更多详细信息和参考资料。
TCR工程改造的T细胞
本发明上下文中的工程改造的细胞为免疫细胞，例如T细胞或NK细胞，但优选为T细胞。根据本发明的肿瘤抗原特异性T细胞的产生，所述T细胞优选地具有杀伤肿瘤细胞的特异性和能力，可通过采用本领域中一般已知的一种或多种不同策略来执行。
在一个实施方式中，可如上所述识别和选择肿瘤反应性宿主T细胞，并在外周血单核细胞(PBMC)或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体中生长。一旦产生和分离了这些细胞，它们就可以扩增以供使用。在一个实施方式中，研究此类肿瘤反应性宿主T细胞以揭示其癌抗原特异性TCR的核酸序列。
或者，或依次地，在相同或另一实施方式中可通过遗传修饰宿主T细胞以表达本文所公开或通过使用上述TCR选择方法所识别的一个或多个肿瘤特异性TCR来修饰宿主T细胞以使其成为肿瘤反应性。这种基因修饰可以通过转染或转导发生，优选通过转导发生，例如通过使用逆转录病毒技术。
本发明上下文中的宿主T细胞优选人T细胞，更优选人CD8+T细胞，并且可以是自体或同种异体宿主细胞，优选自体细胞。
如本文所用，“自体”指源自同一供体的基因相同的细胞，例如，源自患者的细胞经处理以靶向癌症且随后将细胞给回患者身体，而术语“同种异体”指源自基因不相同的供体的细胞。
细胞的遗传修饰可通过用编码抗原结合受体(例如TCR)或如本文所公开的基于抗体的受体(优选TCR)的重组DNA或RNA构建物转导细胞(优选基本上均一的细胞组合物)来完成。载体，优选逆转录病毒载体(γ逆转录病毒或慢病毒)可用于将编码TCR的重组DNA或RNA构建物引入宿主细胞基因组。例如，编码如本文所述结合ROPN1和/或ROPN1B的表位的TCR的多核苷酸可克隆到逆转录病毒载体中，并且可由其内源性启动子、逆转录病毒长末端重复或从替代性内部启动子驱动表达。也可使用非病毒载体或RNA。可以使用随机染色体整合或靶向整合(例如，使用核酸酶、转录活化物样效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)和/或成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR))或转基因表达(例如，使用天然或化学修饰的RNA)。
优选地，用核酸构建物修饰所述工程改造的细胞，所述核酸构建物包含调控如本文所公开的TCR或基于抗体的受体表达的启动子核酸序列，其中所述启动子可操作连接到编码如本文所公开的TCR的核酸。
为了对细胞进行遗传修饰以提供肿瘤抗原特异性细胞，优选使用逆转录病毒载体，然而任何其它合适的病毒载体或非病毒递送系统可用于用肿瘤抗原反应性TCR转导细胞。优选地，所选载体表现出高感染效率和稳定的整合和表达。可使用的其它病毒载体包括例如腺病毒、慢病毒和腺相关病毒载体、痘苗病毒、牛乳头瘤病毒或疱疹病毒，例如EB病毒。逆转录病毒载体是特别成熟的，并已在临床上使用了几十年。
非病毒方法也可用于细胞中蛋白质的表达。例如，可通过转染将核酸分子引入细胞中，例如通过在存在脂质感染的情况下给予核酸、无唾液酸单体类黏蛋白聚赖氨酸偶联或通过在外科条件下的显微注射，所有这些均为本领域所知的。其他非病毒的基因转移方法包括使用磷酸钙、DEAE-葡聚糖、电穿孔和原生质体融合进行体外转染。脂质体也可能有利于DNA或RNA进入细胞。还可以使用转座酶或靶向核酸酶(例如，转录活化物样效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)和/或成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR))衍生或获得重组受体。RNA电穿孔可获得瞬时表达。
所得修饰的细胞可在与未修饰细胞相似的条件下生长，由此可扩增修饰的细胞以提供根据本发明的可用于治疗的T细胞。
在本发明中，还设想了如本文所公开的TCR的功能变体，例如以下TCR，其中如本文所公开的CDR1、CDR2和/或CDR3(例如CDR1和CDR2；CDR1和CDR3；CDR2和CDR3；或CDR1、CDR2和CDR3)被修饰或改变，其中有1、2、3、4或5个氨基酸残基的添加，取代和/或缺失，同时至少保持(或改善)所述CDR和/或包含所述CDR的TCR的结合特异性和/或结合特性。
以相同方式，关于包含如本文所公开的VDJ、VJ、α链和/或β链氨基酸序列(例如SEQID NO:11、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:39、SEQID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQID NO:60、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70)的T细胞受体，本文设想其功能变体，其与本文公开的所述VDJ、所述VJ、所述α链和/或所述β链氨基酸序列具有至少70％、80％或至少90％的序列相同性，同时至少保持(或改善)(包含如本文所公开的所述VDJ、所述VJ、所述α链和/或所述β链氨基酸序列的TCR)的结合特异性和/或结合特性。
例如，本发明提供一种工程改造的T细胞，其中所述T细胞经工程改造以表达与人ropporin-1A(ROPN1)和/或人ropporin-1B(ROPN1B)的T细胞表位结合的T细胞受体(TCR)，其中所述TCR包括：(i)T细胞受体α链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO:14、SEQID NO:37、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:63(优选SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:63)的CDR3或其功能变体，例如添加、取代和/或缺失1、2、3、4或5个氨基酸残基的SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:63的变体，同时至少保持(或改善)(SEQID NO:14、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:63的所述CDR3和/或包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:63的所述CDR3的TCR)的结合特异性和/或结合特性，和/或(ii)T细胞受体β链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:68(优选SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:68)的CDR3或其功能变体，例如添加、取代和/或缺失1、2、3、4或5个氨基酸残基的SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:68的变体，在至少保持(或改善)(SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:68的所述CDR3和/或包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:68的所述CDR3的TCR)的结合特异性和/或结合特性；其中所述T细胞受体α和β链的所述高变区还可包含CDR1和CDR2。
本领域技术人员通常从图6和图14中了解哪些CDR组合以及它们的功能变体归为一类。
以相同方式，本发明提供例如工程改造的T细胞，其中所述T细胞经工程改造以表达与人ropporin-1A(ROPN1)和/或人ropporin-1B(ROPN1B)的T细胞表位结合的T细胞受体(TCR)，其中所述T细胞受体的所述高变区包含：
-SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:61(优选SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:61)的CDR1或其功能变体，例如添加、取代和/或缺失1、2、3、4或5个氨基酸残基的SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:61的变体，其同时至少保持(或改善)(SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:61的所述CDR1和/或包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:61的所述CDR1的TCR)的结合特异性和/或结合特性；
-SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:62(优选SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:62)的CDR2或其功能变体，例如添加、取代和/或缺失1、2、3、4或5个氨基酸残基的SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:62的变体，其同时至少保持(或改善)(SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:62的所述CDR2和/或包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:62的所述CDR2的TCR)的结合特异性和/或结合特性；
-SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:63(优选SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:63)的CDR3或其功能变体，例如添加、取代和/或缺失1、2、3、4或5个氨基酸残基的SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:63的变体，其同时至少保持(或改善)(SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:63的所述CDR3和/或包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:63的所述CDR3的TCR)的结合特异性和/或结合特性；和/或
其中，所述T细胞受体β链的所述高变区包括：
-SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:66(优选SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:66)的CDR1或其功能变体，例如添加、取代和/或缺失1、2、3、4或5个氨基酸残基的SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:66的变体，其同时至少保持(或改善)(SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:66的所述CDR1和/或包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:66的所述CDR1的TCR)的结合特异性和/或结合特性；
-SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:67(优选SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:67)的CDR2或其功能变体，例如添加、取代和/或缺失1、2、3、4或5个氨基酸残基的SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:67的变体，其同时至少保持(或改善)(SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:67的所述CDR2和/或包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:67的所述CDR2的TCR)的结合特异性和/或结合特性；
-SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:68(优选SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:68)的CDR3或其功能变体，例如添加、取代和/或缺失1、2、3、4或5个氨基酸残基的SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:68的变体，其同时至少保持(或改善)(SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:68的所述CDR3和/或包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:55或SEQ IDNO:68的所述CDR3的TCR)的结合特异性和/或结合特性。
以相同方式，本发明提供一种工程改造的T细胞，其中所述T细胞经工程改造以表达与人ropporin-1A(ROPN1)和/或人ropporin-1B(ROPN1B)的T细胞表位结合的T细胞受体(TCR)，其中所述TCR包括：
(i)T细胞受体α链，其包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:57或SEQ IDNO:69(优选SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:69)的氨基酸序列或其与SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:69(优选SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:69)具有至少70％、至少80％或至少90％序列相同性的功能变体，同时至少保持(或改善)(SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:69的蛋白质和/或包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:69的氨基酸序列的TCR)的结合特异性和/或结合特性；或T细胞受体α链，其包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:47或SEQ ID NO:60(优选SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:60)的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:60具有至少70％、至少80％或至少90％序列相同性的功能变体，同时至少保持(或改善)(SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:60的蛋白质和/或包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:60的氨基酸序列的TCR)的结合特异性和/或结合特性；和/或
(i)T细胞受体β链，其包含SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:58或SEQ IDNO:70(优选SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:70)的氨基酸序列或其与SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:70(优选SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:70)具有至少70％、至少80％或至少90％序列相同性的功能变体，同时至少保持(或改善)(SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:70的蛋白质和/或包含SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:70的氨基酸序列的TCR)的结合特异性和/或结合特性；或T细胞受体β链，其包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:52或SEQ ID NO:65(优选SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:65)的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:65具有至少70％、至少80％或至少90％序列相同性的功能变体，同时至少保持(或改善)(SEQ IDNO:16、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:65的蛋白质和/或包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:65的氨基酸序列的TCR)的结合特异性和/或结合特性。
治疗
本发明进一步提供如本文所公开的T细胞，其中所述T细胞用于治疗。优选地，T细胞用于治疗对象中的实体或液体肿瘤，优选癌症。
以相同方式，本发明提供一种治疗患有或怀疑患有实体或液体肿瘤的对象的方法，包括以下步骤：-向所述对象给予治疗有效量的如本文所公开的T细胞。本发明还提供了一种在患有或疑似患有实体瘤或液体瘤的对象中将本文公开的T细胞与本文公开的T细胞表位结合的方法，该方法包括以下步骤：给予所述对象本文公开的T细胞。
以相同方式，本发明提供如本文所公开的T细胞在制备用于治疗对象的实体或液体瘤的药物中的用途。
如本文所使用的术语“治疗有效量”包括指当作为所需剂量方案的一部分给予(哺乳动物，优选人)时根据待治疗疾病或状况的临床可接受标准减轻症状、改善状况或减缓疾病状况的T细胞量，例如，适用于任何医疗的合理收益/风险比率。对象的精确有效量将取决于对象的大小和健康、疾病的性质和程度，并且可由本领域技术人员以常规方式确定。
如本文所使用的术语“治疗中”和“治疗”包括逆转、减少和/或抑制疾病的症状、临床体征和/或潜在病理学，以改善或稳定对象的状况。
在实施方式中，实体瘤包含表达人ROPN1和/或ROPN1B的肿瘤细胞。从本发明中可以明显看出，本文所公开的T细胞和TCR特异性结合人ROPN1和/或ROPN1B，优选人ROPN1B的T细胞表位。
包含表达人ROPN1和/或ROPN1B的肿瘤细胞(优选人ROPN1B)的实体瘤的两个优选实例为乳腺癌，例如三阴性乳腺癌(TNBC)和皮肤癌，例如黑色素瘤，例如皮肤黑色素瘤(SKCM)。优选地，对象患有或被怀疑患有三阴性乳腺癌或黑色素瘤，例如皮肤黑色素瘤(SKCM)。
三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer，TNBC)是一种侵袭性乳腺癌亚型，占所有乳腺癌(breast cancer，BC)病例的15-20％。TNBC的特点是缺乏雌激素和孕激素受体，缺乏人表皮生长因子受体2(HER2)，因此对目前的激素受体或HER2靶向治疗没有反应。尽管最近批准了PD-L1阳性TNBC的免疫检查点抑制剂(ICI)，但大多数患者对这种治疗没有反应。
优选地，本文所公开的T细胞用于过继T细胞治疗，例如用TCR工程改造的T细胞治疗。过继性T细胞治疗包括从对象中分离T细胞以及所述T细胞的体外或离体扩增。然后将T细胞输注到患有肿瘤的患者体内，尝试使免疫系统能够通过T细胞战胜剩余的肿瘤，T细胞可以攻击并杀伤癌症。有多种形式的T细胞可用于过继T细胞疗法以治疗癌症：肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，特别是T细胞或克隆，以及已经工程改造为识别和攻击肿瘤的T细胞。
优选地，本文公开的T细胞是自体T细胞并且用于自体T细胞治疗。在这种情况下，自体指的是从待治疗的对象身上获得T细胞。
工程改造的T细胞受体(TCR)T细胞治疗包括从患者身上提取T细胞，但没有活化和扩增可用的抗肿瘤T细胞，而是在T细胞上加载了一种新的(重组)TCR，使其能够靶向特定的癌症抗原。
本发明还提供了包含本文公开的T细胞和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本文中使用的术语“药物组合物”包括在适合哺乳动物，优选人类给药的条件下制备的组合物，例如在GMP条件下制得的组合物。本发明的药物组合物可包含药学上可接受的赋形剂，例如但不限于稳定剂、填充剂、缓冲剂、运载体、稀释剂、载剂、增溶剂和粘合剂。本领域技术人员理解，适当运载体或稀释剂的选择取决于给药途径和剂型，以及活性成分和其他因素。根据本发明的药物组合物优选适于胃肠外给药。
本文公开的T细胞可以任何合适的药物组合物形式给药。
所提及的药物组合物优选是无菌的，并且含有治疗有效量的本文公开的T细胞和药学上可接受的赋形剂，例如运载体或稀释剂。药物组合物可以是可注射的溶液或悬液形式。
本文公开的T细胞可以通过注射或输注给药，优选其中本文公开的T细胞包含在液体中，例如水性液体。示例性给药途径包括胃肠外给药，例如静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下、动脉内和脑内给药。
包含本发明的T细胞的细胞群可以系统地或直接提供给对象用于治疗肿瘤。在一个实施方式中，将本发明的T细胞直接注射到感兴趣的器官(例如，受肿瘤影响的器官)中。或者，本发明的T细胞及其组合物被间接提供给感兴趣的器官，例如，通过给药进入循环系统(并提供进入肿瘤脉管系统的途径)。可以在给予细胞和组合物之前、期间或之后提供扩增和分化剂和/或免疫调节剂，以在体外或体内增加T细胞的产生。
根据本发明，T细胞和包含它们的药物组合物可以以任何生理上可接受的载剂和对任何可接受的部位给药，通常是血管内给药，尽管它们也可以被引入骨骼或其他方便的部位，在那里细胞可以找到再生和分化的合适的小生境(例如胸腺)。通常，至少会给予1×107个细胞，最终达到1×1010或更多。包括T细胞的细胞群体可以包括纯化的细胞群体。本领域技术人员可以使用各种众所周知的方法，例如流式细胞术，容易地确定群体中TCR工程改造T细胞的百分比。包含TCR工程改造的T细胞的群体中优选纯度范围为约5％至约70％。更优选纯度为约20％至约80％。本领域技术人员可以容易地调整剂量(例如，纯度的降低可能需要剂量的增加)。可以通过注射、导管或类似方式引入细胞。如果需要，还可以包括因子，包括但不限于白介素，例如IL-2、IL-15和/或IL-21，以及其他白介素。
本发明的组合物包括药物组合物，其包含表达ROPN1和/或ROPN1B特异性TCR的T细胞和药学上可接受的运载体。T细胞可以是自体的，也可以是非自体的。例如，可从一个对象获得T细胞及包含其的组合物，并给予同一对象或不同的相容对象。本发明的外周血来源的T细胞或其子代(例如，体内、离体或体外来源的)可以通过局部注射给药，包括导管给药、全身注射、局部注射、静脉注射或胃肠外给药。当给予本发明的治疗组合物时，其通常以单位剂量的可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)配制并静脉内给予。
根据本发明，包括T细胞的细胞群和包括T细胞在内的组合物可以方便地作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散剂或粘性组合物，其可以缓冲至选定的pH。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。此外，液体组合物在某种程度上更便于给予，特别是通过注射。另一方面，粘性组合物可以配制在适当的粘度范围内，以提供与特异组织更长的接触时间。液体或粘性组合物可包括运载体，其可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、盐水、磷酸缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)及以上合适的混合物。
无菌可注射溶液可以通过根据需要将包含T细胞的组合物以所需量的适当溶剂与各种量的其他成分结合来制备。这样的组合物可以与合适的运载体、稀释剂或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖、葡聚糖等混合。组合物还可以冻干。根据给药途径和所需制剂，组合物可含有辅助物质，如润湿剂、分散剂或乳化剂(如甲基纤维素)、pH缓冲剂、凝胶或增粘添加剂、防腐剂、调味剂、色素等。可参考标准方案，如1985年第17版《雷明顿药物科学》“REMINGTON’SPHARMACEUTICAL Sciences”(通过引用并入本文)中的标准方案，以制备合适的制剂，而无需过度实验。
可以添加各种增强组合物稳定性和无菌性的添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。也可通过各种抗菌剂和抗真菌剂(如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)确保防止微生物的作用。可通过使用延迟吸收的物质(如单硬脂酸铝和明胶)延长可注射药物形式的吸收。然而根据本发明，所使用的任何载剂、稀释剂或添加剂都必须与本发明的T细胞相容。
组合物可以是等渗的，即它们可以具有与血液和泪液相同的渗透压。本发明组合物的所需等渗性可以使用氯化钠或其他药学上可接受的试剂如葡萄糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其他无机或有机溶质来实现。氯化钠是优选的，特别是对于含有钠离子的缓冲剂。
如果需要，可以使用药学上可接受的增稠剂将组合物的粘度保持在选定的水平。甲基纤维素是优选的，因为它容易获得且成本经济，并且易于使用。其他合适的增稠剂包括例如，黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的优选浓度将取决于所选择的试剂。重要的一点是使用可达到所选粘度的量。
显然，合适运载体和其他添加剂的选择将取决于精确的给药途径和特定剂型的性质，例如液体剂型(例如，是否将组合物配制成溶液、悬浮液、凝胶或其他液体形式，例如时间释放型或液体填充型)。
本领域技术人员将认识到，所述组合物的组分应选择为化学惰性且不会影响如本发明所述的T细胞的活性或功效。这对化学和药学原理领域的技术人员来说没有问题，或者通过参考标准方案或通过简单实验(不涉及过度实验)可以容易地避免来自本公开和本文引用的文件的问题。
关于本发明的T细胞的治疗用途的一个考虑是达到最佳效果所需的细胞数量。根据临床试验设计和方案，待给药的细胞数量因治疗对象而异。在一个实施方式中，将本发明的107至1010个T细胞给予人对象。更有效的细胞可以更少的数量给药。有效剂量的精确确定可能基于各种对于治疗计划特异性的因素(即单一或组合治疗)和每个对象的个体因素，包括其大小、年龄、性别、体重和特定对象的状况。本领域技术人员可以从本公开内容和本领域知识容易地确定剂量。
本领域技术人员可以容易地确定将在本发明方法中给予的细胞和可选添加剂、载剂、组合物中的运载体和/或共处理的量。通常，任何添加剂(除了活性细胞和/或试剂)以0.001至50％(重量)的量存在于磷酸缓冲盐水溶液中，并且活性成分以微克至毫克的范围存在，例如约0.0001至约5wt％，优选约0.0001至约1wt％，仍然更优选约0.0001至约0.05wt％或约0.001至约20wt％，优选约0.01至约10wt％，并且仍然更优选约0.05至约5wt％。
出于清楚和简洁的目的，各特征在本发明中被描述为相同或单独的实施方式的一部分，然而，应理解公开内容包括具有所有或一些所述特征的组合的实施方式。
本文所指文献的内容通过引用并入本文。
编号的实施方式也是本发明的一部分：
实施方式1.一种工程改造的T细胞，其中所述T细胞经工程改造以表达与人ropporin-1B(ROPN1B)的T细胞表位结合的T细胞受体(TCR)，其中所述TCR包括：
(i)T细胞受体α链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO:14的CDR3，和
(ii)T细胞受体β链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO：19的CDR3，
其中所述T细胞受体α和β链的所述高变区还包含CDR1和CDR2。
实施方式2.如实施方式1所述的工程改造的T细胞，其中所述TCRα链的所述高变区包括：
-SEQ ID NO:12的CDR1；
-SEQ ID NO:13的CDR2；
-SEQ ID NO:14的CDR3；和/或
其中，所述T细胞受体β链的所述高变区包括：
-SEQ ID NO:17的CDR1；
-SEQ ID NO:18的CDR2；
-SEQ ID NO:19的CDR3。
实施方式3.如实施方式1或实施方式2所述的工程改造的T细胞，其中所述T细胞受体α链包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列和/或所述T细胞受体β链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；优选其中所述T细胞受体α链是SEQ ID NO:11的氨基酸序列和/或其中所述T细胞受体β链是SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
实施方式4.一种工程改造的T细胞，其中所述T细胞经工程改造以表达T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)，其结合人ropporin-1A(ROPN1)和/或人ropporin1B(ROPN1B)的T细胞表位。
实施方式5.如前述实施方式中任一所述的工程改造的T细胞，其中所述T细胞表位是肽，其与人主要组织相容性复合物(MHC)分子，优选HLA-A*02分子形成复合物。
实施方式6.如前述实施方式中任一所述的工程改造的T细胞，其中所述T细胞表位由选自SEQ ID NO：1-9和20之一的氨基酸序列组成。
实施方式7.如前述实施方式中任一所述的工程改造的T细胞，其中所述T细胞表位由选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列及其经修饰的氨基酸序列组成，其中SEQ ID NO:1的位置6(Glu)、位置8(Glu)和/或位置9(Val)处的氨基酸残基被另一氨基酸残基取代。
实施方式8.一种药物组合物，其包含根据前述任一实施方式的工程改造的T细胞和药学上可接受的赋形剂。
实施方式9.如实施方式1-7中任一所述的T细胞，其中所述T细胞用于治疗，优选用于治疗实体或液体(血液)肿瘤。
实施方式10.如实施方式9所述使用的T细胞，其中所述实体瘤包含表达人ROPN1B和/或ROPN1的肿瘤细胞，优选其中所述实体瘤包含肿瘤细胞，所述肿瘤细胞包含MHC分子，所述MHC分子与实施方式1-7中任一所述的T细胞表位复合或结合。
实施方式11.如实施方式9或实施方式10所述使用的T细胞，其中所述实体瘤是乳腺癌，优选三阴性乳腺癌，或皮肤癌，优选黑色素瘤。
实施方式12.一种TCR蛋白，其中所述TCR蛋白包含：
(i)T细胞受体α链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO:14的CDR3，和
(ii)T细胞受体β链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO：19的CDR3，
其中所述T细胞受体α和β链的所述高变区还包含CDR1和CDR2。
实施方式13.一种分离或纯化的人ropporin-1B(ROPN1B)和/或人ropporin-1A(ROPN1)肽，其与人主要组织相容性复合物(MHC)分子，优选HLA-A*02分子形成复合物，其中所述肽由SEQ ID NO:1-9和20中任一氨基酸序列组成。
实施方式14.一种工程改造的细胞，优选工程改造的癌细胞，其中所述细胞经工程改造以表达人ropporin-1B(ROPN1B)和/或人ropporin-1A(ROPN1)。
实施方式15.一种治疗患有或疑似患有实体瘤的对象的方法，包括以下步骤：-向需要治疗的对象给予治疗有效量的如实施方式1-7任一所述的T细胞。
实施例
实施例1.识别和验证AT的肿瘤限制性抗原靶点、它们的表位、它们对应的TCR和工程改造的T细胞。
材料和方法
细胞系和T细胞的产生与培养
为了制备ROPN1过表达的三阴性乳腺癌(TNBC)细胞，通过GeneArt(Regensburg，Germany)订购ROPN1B+GFP cDNA片段(氨基酸序列可根据UniProtKB登录号Q9BZX4-1获得)(ROPN1B-2A-GFP)，并使用带有基因特异性的引物PCR扩增，所述引物包含与PiggyBacPB510B-1载体末端同源的15bp延伸。利用In Fusion克隆试剂盒(Takara)将扩增片段克隆到PiggyBac载体(荷兰鹿特丹Erasmus MC的P.J.French博士友情赠送)中。随后，使用Lipofectamine(Invitrogen)和转座酶表达载体DNA(System Biosciences)将PiggyBacROPN1B+GFP DNA稳定转染到MDA-MB-231细胞系(ECACC目录号92020424，TNBC细胞系模型)。将转染的MDA-MB-231细胞系进行GFP的FAC分选，然后通过PCR和细胞离心涂片免疫组化染色(使用抗ROPN1抗体，见图3B)确认ROPN1B的表达。将MDA-MB-231野生型细胞及其ROPN1B过表达变体细胞分别培养在添加10％FBS、200mM L-谷氨酰胺和1％抗生素的RPMI培养基中，不添加或添加2μg/mL嘌呤霉素。包装细胞系293T和Phoenix-Ampho在添加10％FBS、200mML-谷氨酰胺、非必需氨基酸和1％抗生素的DMEM(DMEM完全)中培养。T2细胞和BSM细胞在添加10％FBS、200mM L-谷氨酰胺和1％抗生素的RPMI培养基中培养。
通过Ficoll Isopaque(密度＝1.077g/cm3；Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)离心，从健康人供体(荷兰阿姆斯特丹Sanquin)的PBMC中获得T细胞，并在添加25mM HEPES、6％人血清(荷兰阿姆斯特丹Sanquin)、200mM L-谷氨酰胺和1％抗生素(T细胞培养基)和360U/ml人rIL-2(Proleukin；Chiron，荷兰阿姆斯特丹市)的RPMI培养基中培养，每2周用经辐照的同种异体饲养细胞的混合物刺激一次，如其他地方所述(Van deGriend等人，Transplantation，38(4)：401-406(1984))。
患者群组、数据库和行为准则
TNBC群组1：具有RNAseq的BC(n＝347，其中n＝66TNBC，geTMM标准化)，所述RNAseq可通过欧洲基因组-表型组数据库EGAS0001001178(基础群组)访问。
TNBC群组2：具有微阵列数据(U133)的淋巴结阴性疾病的原发性BC，未接受辅助全身治疗(n＝867，其中n＝183TNBC)。数据检索自基因表达综合数据库GSE2034、GSE5327、GSE11121、GSE2990和GSE7390。合并群组的详细信息已在前面描述过(Hammerl等人，ClinCancer Res.2019。
doi:10.1158/1078-0432.CCR-19-0285)。
TCGA：从USCS Xena浏览器检索泛癌RNAseq数据以及样本注释数据(n＝10495，其中1211BC和122TNBC，TPM标准化)。
健康组织：从表达图谱(TPM标准化)下载6个数据库的RNAseq数据，包括66个健康组织(Uhlen实验室:n＝122名个体，n＝32个组织；GTEx:n＝1315名个体，n＝63个组织；Illumina身体图:n＝32名个体，n＝17个组织；人蛋白组学图:n＝30名个体，n＝26个组织；Synders实验室:n＝210名个体，n＝32个组织)。
本研究是根据赫尔辛基宣言和医学科学学会联合会(FMSF)的“荷兰人体组织二次使用规范”(2002年版，2011年更新版)进行的，后者与授权使用编码备用组织进行研究一致。数据分析和体外分析由Erasmus MC医学伦理委员会批准(分别为MEC.02.953和MEC-2020-0090)。根据国家指南，本研究无需知情同意。
表达分析
基因表达(RNAseq、微阵列和qPCR)
在健康组织和肿瘤组织中分析239种肿瘤种系抗原的表达(GCA，如Ct数据库，Ludiwig学院，http://www.cta.lncc.br/)。在5个不同健康组织群组中评估ROPN1和ROPN1B的表达，并且当至少2个群组中的TPM值达到TPM>0.2的阈值时，认为ROPN1和ROPN1B在组织中表达(图1A)。肿瘤中的表达(TCGA)分类如下：1-9、10-100和>100的TPM值分别为低、中、高表达(图2A、E)。在geTMM标准化RNAseq数据(TNBC群组1)或微阵列数据(TNBC群组2)的情况下，表达阈值设置在所有CGA的第三个四分位，并根据基于该阈值的阳性肿瘤百分比对CGA进行排序。
使用MX3000在正常人体组织cDNA组图(OriGene Technologies，Rockville，MD)上进行定量PCR(qPCR)，以定量48个健康人体组织的ROPN1(TaqMan探针：Hs00250195_m1)、ROPN1B(TaqMan探针：Hs00250195_m1)和GAPDH(TaqMan探针：Hs02758991_g1)mRNA表达(图1B)。将感兴趣基因的Ct值归一化为GAPDH的Ct值，并通过2-dCt分析相对表达。
免疫组织化学染色
IHC染色采用健康组织的大核心(直径2mm)，覆盖2-6名个体的16个主要组织(来自尸检或切除，n＝62)(图1C)，以及覆盖338名患者的TNBC肿瘤组织的FFPE组织微阵列，如之前所述(图2B-D)。在95℃下热诱导抗原回收20分钟后，使用抗-ROPN1抗体(检测ROPN和ROPN1B蛋白)进行染色。冷却至RT后，通过抗小鼠EnVision+系统-HRP(DAB)(DakoCytomation，Glostrup，丹麦)观察染色。以人睾丸组织作为阳性对照组织。由3名研究人员独立使用Distiller(SlidePath)软件手动根据阳性肿瘤细胞的强度和百分比对染色进行评分。
表位的识别、选择和排序
预测和免疫肽组学
根据多种计算机方法，根据高排名选择肽，以预测免疫反应的不同方面(Hammerl等人,Trends Immunol.2018；xx:1-16,doi:10.1016/j.it.2018.09.004)(即NetMHCpan(Hoof等人,Immunogenetics；61(1):1-13(2009)doi:10.1007/s00251-008-0341-z)；NetCTLpan(Stranzl等人,Immunogenetics；62(6):357-368(2010),doi:10.1007/s00251-010-0441-437)；SYFPEITHI(Rammensee等人,Immunogenetics；50(3-4):213-219(1999),doi:10.1007/s002510050595)；和RANKPEP(Reche等人,Hum Immunol；63(9):701-709(2002),doi:10.1016/S0198-8859(02)00432-9；Reche等人,Immunogenetics；56(6):405-419(2004),doi:10.1007/s00251-004-0709-7；and Reche等人,Methods Mol Biol；409:185-200(2007),doi:10.1007/978-1-60327-118-9_13)。对于免疫肽组学，用IFNγ处理过表达ROPN1B的MDA-MB231细胞(3x108)24小时，并在MHC I类分子免疫沉淀之前使用EDTA收获。如前所述，用质谱法洗脱和测量肽。检查每个工具的前10种预测肽(n＝17种独特肽)以及从免疫肽组学中检索到的独特肽(n＝2)与Expitope的交叉反应性(见表1)，并将具有多达2个氨基酸错配的肽排除在进一步分析之外。选择的肽(n＝14；见图3A)订购于ThinkPeptides(ProImmune，Oxford，United Kingdom)处，溶解在50-75％的二甲基亚砜中，并在-20℃下储存直至使用。
HLA-A2稳定测定及表位排序
使用T2细胞进行HLA-A2稳定测定，如Miles等人Mol Immunol；48(4)：728-732(2011)，doi:10.1016/j.molim.2010.11.004所述。简言之，将0.15x106T2细胞(LCLxT淋巴母细胞样杂交细胞系0.1743CEM.T2)与滴定量的肽在补充有3μg/mLβ2-微球蛋白(Sigma)的无血清培养基中于37℃孵育3小时。使用HLA-A2 mAb BB7.2(BD Pharmingen，1:20)通过流式细胞术测量表面表达的HLA-A2分子。为此，洗涤T2细胞，并使用荧光标记的抗体染色，避光在冰上孵育25分钟，并将其溶解在含有1％FBS的PBA中。使用流式细胞术对细胞的活力进行门控，并在FACSCanto流式细胞仪上获取事件，并使用FlowJo软件(TreeStar，Ashland，OR)进行分析。使用没有肽的T2细胞作为基线。在第一次筛选中，将浓度在25ug/ml时诱导与基线相比>1.1倍变化的肽(14个中有11个，见图3C)从0.316进一步滴定至31.6μg/ml。根据剂量滴定曲线(图3D)，我们计算了HLA-A2结合亲和力的两个参数：(1)幅度，即最高浓度和基线之间的荧光强度差异；和(2)使用GraphPad软件计算的半最大有效浓度(EC50)。这两个参数的阈值是：gp100 YLE对照肽幅度的一半；EC50＜1E-5M。随后根据EC50值对剩余的ROPN1和ROPN1B T细胞表位(n＝9)进行排序(图3E)。
T细胞富集
ROPN1表位特异性CD8 T细胞的富集
根据Butler等人，Clin Cancer Res.；13(6):1857-1867(2007),doi:10.1158/1078-0432所描述的方案进行表位特异性CD8 T细胞的富集，但包括以下修改：根据CD8分离试剂盒(Miltenyi Biotec)，通过磁性活化细胞分选(MACS)从PBMC中收集CD8+T淋巴细胞。随后将纯度>95％的CD8+T细胞在补充有IL-2(36IU/mL；但不含庆大霉素)的T细胞培养基中培养1天，之后开始扩增周期。使K562ABC细胞(由宾夕法尼亚大学Bruce Levine教授友情提供)负载10μg/ml ROPN1和/或ROPN1B肽，并在无血清培养基中在RT下孵育5小时，之后用0.1％多聚甲醛洗涤并固定细胞。洗涤后，以0.1x106/mL悬浮K562ABC细胞，并以1:20的比例与T细胞共培养。在共培养开始后的第1天和第3天添加IL-2(36IU/mL)和IL-15(20ng/μL)，6天后，计数T细胞，以2x106/mL悬浮并放置1天，然后开始下一个周期(该计划持续4或5个周期)。在4和5个周期后，用pMHC多聚体(HLA*0201/MLN，Immudex，Copenhagen，Denmark)对T细胞进行染色。pMHC-PE在RT下预孵育10分钟，然后与7AAD、抗-CD3-FITC和抗-CD8-APC孵育20分钟。用1％多聚甲醛固定细胞，并用流式细胞术测量TCR表达，用FlowJoX软件分析。图4A示意性地描述了富集表位特异性T细胞并获得相应TCR基因的程序。
对富集的T细胞进行ROPN1和/或ROPN1B表位特异性IFNγ生产的测试。为此，用肽(20ng/mL)加载T2细胞(4x106/mL)30分钟。将T细胞(2x105)与T2细胞在圆底96孔板中以1:1的比例培养，第二天收集上清液，并根据制造商的方案用酶联免疫吸附测定法(ELISA，Invitrogen)测量IFN-γ的产生(图4B)。包括不含肽的T2细胞作为阴性对照；葡萄球菌肠毒素B(0.1μg，Sigma)用作阳性对照。
为了获得ROPN1和/或ROPN1B表位特异性TCR，富集的T细胞(图4C)在IFNy分泌后单细胞稀释(Milentyi Biotec)或用pMHC多聚体进行FAC分选(例如参见图4D，E)。对于前一种程序，用辐照的BSM细胞刺激T细胞，并根据制造商的建议捕获分泌IFNγ的细胞。
TCR克隆和序列鉴定
使来自任一程序的CD8 T细胞暴露于SMARTerTM RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)以鉴定ROPN1和/或ROPN1B表位特异性TCRα-和β-链。简言之，通过旋转柱纯化(NucleoSpin，Macherey-Nagel)分离RNA，之后如Kunert等人，J Immunol；197(6):2541-2552(2016),doi:10.4049/jimmunol.1502024,中所述制备5’RACE-就绪cDNA，并进行PCR以扩增TCR-V编码区(图4F)。通过嵌套PCR重新扩增初始产物，将其克隆到TOPO 2.1载体(Invitrogen)中，并进行DNA测序。TCRα和TCRβ序列在至少12个集落中得到验证。使用IMGT数据库和HighV-QUEST工具(http://www.imgt.org)，TCR V、D和J序列根据Lefranc命名法进行注释(见图4G)。
TCR基因转移及体外检测
已鉴定的TCRα和TCRβ基因经过密码子优化(GeneArt，Regensburg，德国)，并使用两侧为NotI和EcoRI限制性位点的TCRβ-2A-TCRα盒克隆到pMP71载体(Wolfgang Uckert教授友情馈赠，MDC，德国柏林)中。在用抗-CD3mAb OKT3活化后，用编码TCR的逆转录病毒(pMP71)或通过293T和Phoenix-Ampho包装细胞的共培养产生的空载体转导来自健康供体的PBMC，如先前Lamers等人，Cancer Gene Ther.；13(5):503-509(2006),doi:10.1038/sj.cgt.7700916,和Straetemans G,Clin Dev Immunol,2012所述。如上所述对表面表达的TCR转基因进行染色(图5A，B)。
转导的T细胞(96孔板中的6×104/孔)与BSM细胞(负载1pM至1μM的肽浓度)或肿瘤细胞(2×104/孔)在总体积为200μl的T细胞培养基中在37℃下共培养24小时。使用GraphPad Prism 5软件计算T细胞产生IFN-γ所需的ROPN1、ROPN1B和gp100对照肽的反应和EC50(图5C)。
在T2细胞的共培养物中确定识别动机，所述T2细胞负载有在同源ROPN1B肽的每个单个位置含有作为替代物的单个丙氨酸的肽。临界位置被确定为与同源肽相比，IFNγ产生减少50％以上。使用ScanProsite工具对得到的动机进行扫描，以确定其是否出现在人蛋白质组中(https://prosite.expasy.org/scanprosite/)(图5C和SEQ ID NO:20)。
结果
ROPN1和ROPN1B在健康组织中不存在，并且在>80％的TNBC中显示出丰富且均匀的 表达
为了鉴定用于过继性T细胞治疗(AT)的TNBC特异性靶抗原，询问了所有目前已知的CGA(n＝239)的基因表达值；在涵盖来自总共1735个人的66个健康组织的5个数据库中，以及在涵盖14种实体瘤类型的447名TNBC患者和6670名癌症患者的大型数据库中。随后通过qPCR和免疫组织化学(IHC)验证这些基因表达(或其缺失)。使用该工作流程(详见材料和方法(M&M))，根据以下结果，将ROPN1和ROPN1B确定为AT治疗TNBC的目标：首先，ROPN1或其同种型ROPN1B在除睾丸外的任何健康组织中均未表达(根据基因表达数据库，图1A)。参考CGA NY-ESO1(CTAG1B)在健康组织(免疫豁免部位除外，如睾丸、胎盘和附睾)中的基因表达水平被设定为表达阈值(TPM≤0.2)，因为该抗原已被TCR工程改造的T细胞成功靶向，而没有治疗相关毒性(Rapoport等人,Nat Med.21(8):914-921(2015),doi:10.1038/nm.3910；和Robbins等人.,Clin Cancer Res.2015,doi:10.1158/1078-0432.CCR-14-2708)。ROPN1同种型和NY-ESO1在主要健康组织中的缺失表达通过qPCR得到证实，qPCR使用从10个供体汇集的48个健康组织的商业获得的cDNA文库(图1B)，以及包含2-6名个体的16个主要健康组织的组织微阵列的IHC染色(图1C)。其次，84％的TNBC患者(图2A)和93％的皮肤黑色素瘤患者高表达ROPN1和ROPN1B，但在许多其他实体瘤类型中表达程度要低得多(图2E:UCEC:3％，LUSC:5％，GBM:3％)。在另外两个基因表达数据集中证实了TNBC中的高ROPN1和ROPN1B基因表达(TNBC群组1:86％阳性，n＝66名患者；TNBC群组2:77％阳性，n＝259名患者)。相比之下，≤14％的TNBC患者表达NY-ESO1，且表达水平普遍较低(图2E)。除了基因表达外，通过肿瘤组织微阵列的免疫组织化学(IHC)染色，88％的TNBC中也有ROPN1和ROPN1B蛋白表达(n＝338)(图2B)。第三，83％的蛋白质表达是均匀的，而只有13％的ROPN1和ROPN1B阳性TNBC中观察到不均匀表达(<50％的肿瘤细胞对ROPN1和ROPN1B呈阳性)，而NY-ESO1在18％的NY-ESO1-阳性TNBC上均匀表达，82％的NY-ESO 1-阳性TNBC中呈不均匀表达(图2C，D)。
预测和洗脱的ROPN1和ROPN1B表位与HLA-A2紧密结合
为了选择免疫原性T细胞表位，我们首先使用以下工具进行了一系列的计算机预测：NetMHC、NetCTLpan、RANKPEP和SYFPEITHI倾向于表位的各种定性方面，如切割位点的存在、结合蛋白转运的亲和力(TAP)和与HLA结合的亲和力(表位表征和选择概述见图3A，预测特征详见Hammerl等人，Trends Immunol.2018；xx:1-16。doi:10.1016/j.it.2018.09.04)。每个工具对预测的表位进行排序，并对每个工具的前10种肽进行加权和排序，得到17种独特的肽。其次，我们使用过表达ROPN1B的MDA-MB-231细胞(一种具有高HLA-A2表达的TNBC细胞系)作为免疫肽组学的来源。我们已经通过免疫染色和流式细胞术验证了ROPN1B-GFP的表达(图3B)。所有MHC I类结合肽的质谱分析产生了2个额外的独特表位(图3B)。使用EXPITOPE算法对一组独特的表位(n＝19)进行筛选，以确定其与人类蛋白质组中存在的其他肽序列的非同源性，该算法产生了14种免疫原性、非交叉反应性ROPN1和/或ROPN1B肽(即，与任何其他肽相比具有>2个错配的肽，表1)。这14种肽与参考肽和对照肽NY-ESO1(SLLMWITQV)和gp100(YLEPGPVTA)一起在体外测试与HLA-A2的结合。在使用饱和浓度(25μg/ml)的第一次并排筛选中，选择了比基线诱导>1.1倍变化的肽(被认为是HLA-A2的最小稳定性，图3C)。三种预测的肽没有达到这个阈值。有趣的是，AELTPELLKI(10聚体，来源于免疫肽组)不与HLA-A2结合(并在计算机上定位为HLA-B40:01)，并且LIIRAEELAQM(11聚体，也来源于免疫肽组)确实以高亲和力与HLA-A2相结合(与最高预测的HLA-A2结合物相当)。值得注意的是，后一种肽未被预测与HLA-A2结合。通过剂量滴定分析剩余的11种肽(图3D)，并在与gp100肽相比显示一半或更少的最大结合(即幅度)或显示小于1E-5M的EC50时排除。9种肽在这些标准后留下，并根据EC50值进行排序(图3E；SEQ ID NO:1-9)。
ROPN1B表位特异性CD8 T细胞富集自健康供体T细胞
我们使用了5个排名最高的表位(FQFLYTYIA,EC50:3.3μM；KTLKIVCEV,EC50:4.4μM；FLALACSAL,EC50:5.1μM；MLNYIEQEV,EC50:6.6μM；FLYTYIAEV,EC50:1.1mM)，与NY-ESO1肽(SLLMWITQV,EC50:5μM))相比，所有表位在T细胞和人工抗原呈递细胞(aAPC，过表达HLA-A2、CD80和CD86的K562ABC)的共培养物中都具有相似的EC50值(根据Butler等人，Sci-Transl Med.3(80):80ra34-80ra34(2011)，doi:10.126/scitranslmed.3002207)。T细胞是分离的健康供体，并在4-5个富集周期后测试表位特异性IFNγ的产生(有关T细胞富集程序的概述，见图4A)。测试了两个HLA-A2阳性供体，我们在1个健康供体中富集了迄今为止的MLN表位特异性T细胞(图4B)。富集的T细胞在4个和5个周期后分别携带20％和62％的结合MLN/HLA-A2复合物(图4C)。这些T细胞要么在IFNy捕获后通过限制性稀释进行克隆(图4D)，要么使用相应的pMHC多聚体通过FACS进行分选(图4E)，随后通过5’RACE PCR用于鉴定表位特异性TCR基因(图4F)。MLN-TCR基因包含2个编码可变TCRα链(TRVA)的基因和1个编码可变TCPRβ链(TRVB)的基因(图4G)。
MLN表位特异性TCR由T细胞功能性表达
对MLN-TCR-αβ组合进行密码子优化，并将其克隆到pMP71中。对来自2名健康供体的外周T细胞的表面表达的测试表明，MLN TCR2(图5A，B)导致MLN肽:HLA-A2的结合。在随后的实验中，使用pMHC复合物对MLN TCR2 T细胞进行MACS分选，并且该TCR被证明介导识别ROPN1B表位而不是无关表位，具有11nM的亲和力(图5C)。此外，该TCR特异性识别来源于ROPN1B(MLNYIEQEV)而非ROPN1(MLNYMEQEV)的MLN表位，只有单个氨基酸差异(图5C)，并通过丙氨酸扫描显示出严格的识别基序(详见材料和方法部分)。除了位置6和8处的谷氨酸和位置9处的缬氨酸外，每种氨基酸对TCR识别都至关重要(图5C)，由此产生的识别基序：M-L-N-Y-I-x-Q-x-x不存在于人类蛋白质组的任何其他已知序列中。
讨论
在目前的研究中，我们利用计算机和实验室工具的工作流程来鉴定肿瘤选择性和免疫原性靶抗原、相应的T细胞表位和用于治疗TNBC的TCR。重要的是，通过这一工作流程，我们旨在解决AT领域的三个挑战，即：T细胞相关毒性；靶抗原的异质性表达；以及选择次优T细胞表位。
使用工程改造T细胞的AT最突出的挑战是T细胞相关毒性的风险，即中靶和脱靶毒性。我们采用了一种旨在将这些毒性风险降至最低的方法。首先，我们选择了一种具有肿瘤限制性表达的靶抗原。换句话说，筛选ROPN1和ROPN1B在健康组织中的缺失表达，但睾丸和附睾除外，其中ROPN1和ROPN1B在精子的纤维鞘中正常表达。后一种组织具有免疫豁免性，在女性中不存在，从而进一步将女性TNBC患者的中靶毒性风险降至最低。其次，筛选ROPN1和ROPN1B表位与人类蛋白质组中的其他肽/蛋白质序列的非同源性(使用EXPITOPE算法)。第三，通过一系列体外试验筛选TCR的表位特异性和对类似表位无交叉反应性。AT的另一个挑战是靶抗原普遍低而异质性的表达，这被认为是由于抗原阴性肿瘤细胞克隆的生长而导致缺乏持续反应或导致复发的重要原因。ROPN1和ROPN1B不仅具有肿瘤选择性，而且在>80％的TNBC中高表达，其中大多数具有严格的同源表达，这表明ROPN1和ROPN1B预期不仅是AT的安全靶点，而且是AT的有效靶点。第三个挑战是选择真正的免疫原性表位，为此我们使用了多种计算机和实验室工具。我们的数据显示不同技术之间几乎没有一致性。例如，我们已经通过免疫肽组分析鉴定了一种天然存在的HLA-A2结合表位(LIIRAEELAQM)，该表位未被预测与HLA-A2结合。反之，我们观察到健康供体对免疫肽组分析未检索到的预测9聚体(MLNYIEQEV)的T细胞反应。这些观察结果强调了多种工具准确识别免疫原性表位的相关性。此外，我们认为HLA体外结合的验证是排除错误预测的表位和确保免疫原性的先决条件。事实上，表位对HLA-A2的高结合亲和力增强了通过抗原呈递细胞的交叉呈递，这已被证明对于有效的抗肿瘤T细胞应答是重要的(Engels等人,Cancer Cell.23(4):516-526(2013),doi:10.1016/j.ccr.2013.03.018；和Kammertoens等人,Cancer Cell.23(4):429-431(2013),doi:10.1016/j.ccr.2013.04.004)。总之，我们的数据表明，需要连续使用多种预测工具，结合免疫肽组学来识别独特的免疫原性表位。
一旦选择了靶抗原和表位，下一步包括富集表位特异性T细胞及其TCR。从健康供体PBMC获得表位特异性TCR通常遇到这种T细胞频率非常低的挑战。总之，我们能够在2个供体之一中富集ROPN1B特异性T细胞，需要几个富集周期以鉴定相应的TCR基因。使用不同方法鉴定相同的TCR基因表明抗原特异性反应源自单个T细胞。因此，需要大量PBMC来富集来自健康供体的肿瘤抗原特异性T细胞，基于我们的结果，代表了这种T细胞的可能来源。
到目前为止，还没有在TNBC中使用AT和TCR工程改造细胞进行研究。针对酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)治疗TNBC的嵌合抗原受体(CAR)T细胞目前正在进行临床试验(Specht等人，Cancer Res 79(增刊4)：P2-09-13LP-P2-09-13(2019)，doi:10.158/1538-7445.SABCS18-P2-09-13)。临床前研究表明，ROR1 CAR可以识别并杀死TNBC细胞，TNBC细胞经常过表达ROR1。然而，ROR1在各种健康组织中表达，我们认为ROR1作为T细胞靶标存在增加的中靶毒性风险。
结论
本文建立和利用的是一种有效的工作流程，用于识别和验证AT的肿瘤限制性抗原靶点、其表位、其相应的TCR和工程改造的T细胞。除其他外，我们确定ROPN1和ROPN1B是AT的肿瘤靶点，在多个健康组织中缺乏表达，这意味着中靶毒性的风险最小。此外，我们分离了一种ROPN1B特异性和HLA-A2限制性TCR，该TCR在来自健康供体的外周T细胞中表达，介导对MLNYIEQEV表位而不是无关表位的识别，并显示出在任何其他人类蛋白质中都不存在的严格识别基序，这意味着脱靶毒性的风险最小。这些结果表明，ROPN1B以及预期的ROPN1，代表了一种极好的靶抗原，并且ROPN1B-TCR对于展示ROPN1B的T细胞表位的癌症提供了新的治疗机会，这在>80％的TNBC患者中都存在。
表1.已鉴定的ROPN1和ROPN1B表位及其非交叉反应性概述(粗体)
/>
实施例2.鉴定和验证AT的肿瘤限制性抗原靶标、其表位、其相应的TCR和工程改造的T细胞的进一步步骤(对实施例1的扩展)。
对实施例1扩展的材料和方法
细胞系和T细胞的产生与培养
为了制备ROPN1或ROPN1B过表达的三阴性癌症(TNBC)细胞，通过GeneArt(Regensburg，德国)订购ROPN1+GFP或ROPN1B+GFP cDNA片段(可在UniProtKB登录号Q9BZX4-1获得氨基酸序列)(ROPN1-2A-GFP或ROPN1B-2A-GFP)，并使用包括与PiggyBacPB510B-1载体末端同源的15bp延伸的基因特异性引物进行PCR扩增。利用In Fusion克隆试剂盒(Takara)将扩增片段克隆到PiggyBac载体(荷兰鹿特丹Erasmus MC的P.J.French博士友情馈赠)中。随后，使用Lipofectamine(Invitrogen)和转座酶表达载体DNA(SystemBiosciences)将PiggyBac-ROPN1+GFP或ROPN1B+GFP DNA稳定转染到MDA-MB-231细胞系(ECACC目录号92020424，TNBC细胞系模型)。对转染的MDA-MB-231细胞系进行GFP的FAC分选，之后通过PCR和细胞离心涂片的免疫组织化学染色(使用基因特异性引物和抗ROPN1抗体)确认ROPN1或ROPN1B的表达。将MDA-MB-231野生型细胞及其ROPN1或ROPN1B过表达变体细胞分别培养在添加10％FBS、200mM L-谷氨酰胺和1％抗生素的RPMI培养基中，不添加或添加2μg/mL嘌呤霉素。包装细胞系293T和Phoenix-Ampho在添加10％FBS、200mM L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和1％抗生素的DMEM(DMEM完全)中培养。T2细胞和BSM细胞在添加10％FBS、200mM L-谷氨酰胺和1％抗生素的RPMI培养基中培养。
T细胞富集
ROPN1和1B表位特异性CD8 T细胞的富集
通过将原初T细胞与负载肽的CD11c阳性细胞共培养来富集表位特异性T细胞。PBMC通过细胞滤器(70μm)，用于分离原初T细胞和CD11c细胞。为了分离CD11c阳性细胞(通常是树突状细胞，DC)，用Fc-block(10μL/107PBMC，BD Pharmingen，Vianen，荷兰)在4℃下对PBMC染色10分钟，之后用CD11c-PE抗体(10μL/107PBMC、BD Pharmingen)在4℃下对细胞染色30分钟，洗涤，并与PE珠(10μL/107PBMC，Miltenyi Biotech，Bergisch Gradbach，德国)在4℃下再孵育15分钟。洗涤后，将细胞溶解在磁性活化细胞分选(MACS)缓冲液中，并通过MACS LS柱(Miltenyi Biotec)阳性选择CD11c细胞。选择后，用30Gy照射CD11c细胞，并在补充有1％人血清(Sanquin)、1％抗生素、200mM L-谷氨酰胺、DC成熟混合物(GM-CSF(10ng/mL，ImmunoTools，德国)、IL-4(10ng/mL，Immuno Tools)、LPS(100ng/mL，Invitrogen，瑞典)和IFNγ(10ng/mL，Preprotech，英国伦敦)的混合物)，以及肽(10μg/mL)的RPMI培养基中在24孔板(1x106/mL)培养过夜。根据厂商方案，使用原初T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)分离原初T细胞，并悬浮在补充有5％人血清(Sanquin)、1％抗生素、200mM L-谷氨酰胺和IL-7(5ng/mL，BD Pharmingen)的RPMI培养基中。冷冻原初T细胞选择的流穿液并用于表位特异性T细胞的再刺激。CD11c细胞成熟后，将这些细胞与原初T细胞(1x106/mL)在24孔板中在低水平IL-7(5ng/mL)存在下共培养72小时。在第6天和第8天，添加IL-7和IL-15(10ng/mL)，并进一步培养T细胞直到第12天，之后在无刺激细胞的情况下使这些细胞静置24小时。第二天，在IL-7和IL-15的存在下，以1:1的比例添加负载肽的经辐照PBMC(再刺激1)。每种肽使用2至7个供体进行4次富集循环(即3次再刺激循环)。
富集后，对T细胞进行ROPN1和/或ROPN1B表位特异性IFNγ生产的测试。为此，用肽(20ng/mL)负载T2细胞(1x106/mL)30分钟，之后将T细胞(1x105)与T2细胞在圆底96孔板中以1:1的比例培养18小时。根据制造商的方案，收集上清液并使用酶联免疫吸附测定法(ELISA，BioLegend)测量IFN-γ的产生(图9A)。包括负载有非相关肽的T2细胞作为阴性对照。在水平超过200pg/ml的情况下，T细胞IFNg的产生被认为是表位特异性的，并且水平至少是非相关肽的两倍(参见标准的完整列表，图8)。用肽：MHC(pMHC)四聚体对满足这些标准的T细胞进行染色，以确定表位特异性T细胞的频率。将空的可负载HLA四聚体(5μL，Tetramer shop，Kongens Lyngby，丹麦)与0.5μL肽(200μM)在冰上孵育30分钟。离心pMHC复合物(3300g，5分钟)，并在37℃避光与0.1x106T细胞孵育15分钟。接下来，添加含有CD3-FITC(1:30，BD)和CD8-APC(1:300，eBiosciences)的抗体混合物，并避光在4℃下额外孵育30分钟。最后，洗涤T细胞两次，用1％多聚甲醛(PFA)固定，然后用FACSCelesta(BD)采集事件，用FlowJoX软件进行分析。如果在CD3阳性细胞群中观察到超过0.5％的细胞中存在pMHC的T细胞结合(图8)，则使用pMHC多聚体FACS分选T细胞(参见例如图9B)。
TCR克隆和序列鉴定
下一步，将CD8 T细胞暴露于SMARTerTM RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)中以鉴定ROPN1和/或ROPN1B表位特异性TCRα-和β-链。简言之，通过旋转柱纯化(NucleoSpin，Macherey-Nagel)分离RNA，之后如Kunert等人，J Immunol；197(6):2541-2552(2016),doi:10.4049/jimmunol.1502024,中所述制备5’RACE-就绪cDNA，并进行PCR以扩增TCR-V编码区)。通过嵌套PCR重新扩增初始产物，将其克隆到TOPO 2.1载体(Invitrogen)中，并进行DNA测序。TCRα和TCRβ序列在至少12个集落中得到验证。使用IMGT数据库和HighV-QUEST工具(http://www.imgt.org)，TCR V、D和J序列根据Lefranc命名法进行注释。对于给定的表位，TCRa或b序列代表相应TCR链所有功能序列的30％或更多(即>30％克隆序列，图8；图9C中的示例)，然后这些TCR与其他TCR链匹配并用于基因转移。
TCR基因的鉴定与转移
TCRα和TCRβ基因经过密码子优化(GeneArt，Regensburg，德国)，并使用两侧为NotI和EcoRI限制性位点的TCRβ-2A-TCRα盒克隆到pMP71载体(Wolfgang Uckert教授友情馈赠，MDC，德国柏林)中。在用抗-CD3 mAb OKT3活化后，用编码TCR的逆转录病毒(pMP71)或通过293T和Phoenix-Ampho包装细胞的共培养产生的空载体转导来自健康供体的PBMC，如先前Lamers等人，Cancer Gene Ther.；13(5):503-509(2006),doi:10.1038/sj.cgt.7700916,和Straetemans G,Clin Dev Immunol,2012所述。如上所述，对表面表达的TCR转基因进行染色。如果在至少2个供体的CD3阳性细胞群(图8)中观察到TCR表面表达超过5％，则将TCR暴露于进一步测试中(图9D中的示例)。注意，对于单个表位(EVI；SEQ IDNO:24)，pMHC复合物对检测TCR T细胞不敏感，并用针对TCR-Vb7.1和CD137的抗体染色代替。用负载EVI表位的BSM细胞刺激48小时后测定CD137的表达，并且纳入阈值还是至少2个供体中CD3阳性细胞群中5％以上的细胞表达。符合这些标准的TCR T细胞是使用pMHC复合物或根据上调的CD137表达用MACS分选的，并用于体外试验。
检测TCR的敏感性和特异性
在第一系列体外试验中，TCR转导的T细胞(96孔板中6×104/孔)与ROPN1或ROPN1B过表达的MDA-MB231肿瘤细胞(2×104/孔)在总体积为200μl的T细胞培养基中于37℃共培养24小时。ROPN1或ROPN1B过表达的肿瘤细胞如“细胞系和T细胞的产生和培养”(见上文)所述产生，并且肿瘤细胞在与T细胞共培养前用IFN-γ预处理48小时。当水平超过200pg/ml时，证明T细胞识别内源性处理的表位，并且水平至少是野生型MDA-MB231肿瘤细胞的两倍(图8)。评估满足这些标准的T细胞(图10A中的示例)对其同源表位的敏感性。为此，TCR T细胞与负载1pM至30μM浓度的肽的BSM细胞共培养以确定EC50值(图10B中的示例)。使用GraphPad Prism 5软件计算EC50值。
接下来，使用TCR T细胞和BSM细胞之间的共培养物测定TCR的识别基序，所述BSM细胞负载有在同源ROPN1或ROPN1B表位的每单个位置处含有独立丙氨酸的肽(即10μM)作为替代物。关键氨基酸位置定义为当与同源肽相比时丙氨酸变体的IFNγ产生量减少50％以上的氨基酸位置。使用ScanProsite工具扫描得到的识别基序在人类蛋白质组中的出现情况(https://prosite.expasy.org/scanprosite/)(图11A中的示例)。此外，筛选TCR T细胞对114种HLA-A2洗脱的非同源肽缺乏反应性(图11B中的示例)。用上述基因转导的T细胞也称为FLY-A、FLY-B和EVI表位特异性TCR。
晚期模型中的TCR测试
在随后的一系列试验中，TCR T细胞在乳腺癌细胞的三维类肿瘤模型中进行跟踪和监测。ROPN1或ROPN1B过表达的MDA-MB231肿瘤细胞分化为类肿瘤。用显微注射器将一种肿瘤细胞悬浮液注射到胶原基质中形成类肿瘤过夜。将TCR T细胞直接加入类肿瘤顶部。肿瘤细胞表达GFP(与ROPN1或ROPN1B基因偶联)，TCR T细胞在加入类肿瘤前用Hoechst标记，肿瘤和T细胞均用PI标记以监测细胞死亡。在添加TCR T细胞后的几个时间点，通过荧光显微镜记录图像(图12中的示例)。
最后检测TCR T细胞对荷瘤免疫缺陷小鼠的抗肿瘤作用。为此，将2.5x106 ROPN1过表达的MDA-MB231肿瘤细胞悬浮于基质胶中，皮下移植到NSG小鼠体右侧(NOD.CgCharles River Laboratories，法国巴黎)。当肿瘤可触及时(肿瘤移植后3-4周，约200mm3)，用白消安(腹膜内，16.5mg/kg，第-3天)预处理小鼠，然后用环磷酰胺(腹膜内，200mg/kg，第-2天)预处理小鼠。第0天和第3天，小鼠接受2次静脉移植，每次移植15×106TCR或空白(无TCR)人T细胞。T细胞在移植前第0天新鲜转导，并在移植前第3天用5ng/ml IL-15和IL-21维持；T细胞移植前在无细胞因子的条件下静置24小时。小鼠在第二次移植T细胞后连续8天接受皮下IL-2注射(1x105 IU)。在第10天，测量相对于第0天的肿瘤消退，并比较TCR与空白T细胞治疗(图13中的示例)。
对实施例1扩展的结果
预测和洗脱的ROPN1和ROPN1B表位与HLA-A2紧密结合
在对实施例1的扩展中，已用现有表位重复实验，并且已经用新表位开始实验。图7提供了实施例1和2中当前数据的概述。
当与实施例1相比时，使用如实施例1所述的类似工具预测新的ROPN1或ROPN1B表位，或在洗脱肽的公用数据库中搜索，其产生10个额外的表位。根据ROPN1或ROPN1B抗原中的独特存在以及HLA-A2的显著结合，筛选了表位全集(n＝28)(概述如图7A所示)。首先，使用算法EXPITOPE筛选肽与人类蛋白质组中存在的其他肽序列的非同源性，该算法提供了19种免疫原性、无交叉反应性ROPN1和/或ROPN1B肽的短列表(即，与任何其他肽相比，具有>2个错配的肽，表3)。其次，这19种肽与参考肽和对照肽NY-ESO1(SLLMWITQV)和gp100(YLEPGPVTA)一起在体外测试与HLA-A2的结合。在以下情况下，表位被认为与HLA-A2结合：(1)与无肽时相比，结合稳定性至少高1.1倍(图7B)；(2)EC50至少为5x10-5 M；(3)结合幅度至少为参考肽YLE的50％(图7B和C)。其余11种表位根据幅度值排列(图7D；SEQ ID NO:1-9、23、24)。
ROPN1和ROPN1B表位特异性CD8 T细胞富集自健康供体T细胞
整个选择过程，包括需要遵循的标准表位及其相应的TCR，以及通过每个步骤的表位和/或其相应的TCR如图8所示，并在材料和方法中描述。我们使用了11个排名靠前的表位来检索表位特异性T细胞。在4个富集周期后，检测T细胞表位特异性IFNγ产生和pMHC结合。11个ROPN1或ROPN1B肽中有9个显示了表位特异性T细胞的富集(图9A和B)。
T细胞功能性表达ROPN1和ROPN1B表位特异性TCR
用pMHC多聚体对ROPN1或ROPN1B表位特异性T细胞进行FAC分选，并用5'RACE PCR鉴定TCR基因。对于9个表位中的6个表位，相应的TCR基因表现为寡或单克隆性(图9C)，并对匹配的TCR-ab组合进行密码子优化，并克隆到pMP71中。根据pMHC的结合评估外周T细胞的表面表达，或者，如果这种pMHC复合物不能得到，则评估上调CD137的表达(详情见材料和方法)。TCRab对6个表位中的5个表位具有特异性，证明功能性表达(MLN、FLY-A、AQM、FLY-B、EVI；SEQ ID NO:1、4、8、23、24；图9D)。
FLY-A、FLY-B和EVI表位特异性TCR产生敏感和特异的T细胞反应
表4列出了用于T细胞富集的所有表位和/或其相应TCR的结果清单。在首次关键实验中，TCR T细胞已经测试了它们对由肿瘤细胞加工和呈递的肽的反应性。未通过这一步骤的TCR很可能是那些对预测的非天然肽具有特异性的TCR，并且(在选择过程的早期)被排除在进一步测试之外。我们的结果表明，FLY-A、FLY-B和EVI TCR而不是MLN和AQM TCR，能够在表达ROPN1或ROPN1B的MDA-MB231肿瘤细胞刺激下介导T细胞IFNg(图10A)。对于FLY-A、FLY-B和EVI特异性的TCR T细胞(SEQ ID NO：4、23、24)，根据剂量滴定测定T细胞对同源表位反应的敏感性。FLY-A、FLY-B和EVI-TCR T细胞的EC50值分别为：0.1、1.2和18.1mM，这意味着TCR T细胞以该顺序显示从高到低的亲合力(图10B)。
通过上述试验的转导TCRα和TCRβ基因的编码氨基酸序列如SEQ ID NO:34和39(结合FLY-A表位/表位4)、SEQ ID NO:47和52(结合FLY-B表位/表位10)和SEQ ID NO:60和65(结合EVI表位/表位11)所示，并用于后续试验。
在接下来的实验中，检测FLY-A和FLY-B TCR T细胞对同源表位的特异性；EVI TCRT细胞的检测正在进行。针对任一FLY表位的TCR T细胞显示这些表位具有严格的识别基序(详见材料和方法)，即：X-X-Y-T-Y-I-A-K-X(FLY-A)和X-L-Y-T-Y-I-A-E-X(FLY-B)(图11A)。事实上，这些基序并没有出现在任何其他已知的人类蛋白质组序列中。此外，两种TCR均不识别HLA-A2洗脱的非同源肽(图11B)。
FLY-A和FLY-B表位特异性TCR在晚期肿瘤模型中产生高效的T细胞反应
为了进一步挑战FLY-A和FLY-B TCR T细胞，在3D类肿瘤模型中对其进行了测试。两种TCR均介导对过表达ROPN1或ROPN1B的MDA-MB231乳腺癌细胞的杀伤。将TCR T细胞添加到类肿瘤后，显微镜检图像显示肿瘤细胞丧失(即GFP信号)和细胞死亡增加(即PI信号)，以及GFP和PI信号的实时定量(图12A和B)证明了这一点。最后，作为示例性实施方式，在免疫缺陷小鼠模型中测试FLY-A TCR。携带ROPN1过表达的MDA-MB231细胞产生的可触及皮下肿瘤的小鼠，经FLY-A TCR T细胞(而非空白T细胞)治疗后，第10天肿瘤大小的减小在60到90％之间(图13A和B)。
实施例1的扩展讨论
我们提出，根据治疗安全性和有效性的标准，选择过继T细胞治疗的靶抗原、表位以及相应的TCR需要逐步方法和严格筛选。据此，选择ROPN1和ROPN1B作为靶抗原，其在TNBC中的表达是选择性的(即在正常组织中不存在)，并且高且均一(即，即使不是所有的肿瘤细胞，也明显存在于大多数肿瘤细胞中)(见图1和图2)。除了实体瘤如TNBC和皮肤黑色素瘤外，ROPN1/1B在血液系统恶性肿瘤如多发性骨髓瘤中也有表达。例如，我们发现ROPN1(B)基因在5个不同患者群组的多发性骨髓瘤患者的骨髓样本中表达率高达55％(数据未显示)。来自ROPN1和ROPN1B的表位是通过预测或免疫肽组学获得的，并过滤其独特性(即除ROPN1或ROPN1B外不存在于人类蛋白质组中)以及与HLA-A2的结合特性(参见结果概述和标准，图7)。本次筛选将我们最初的28个表位缩小到11个表位，用于富集表位特异性T细胞，以及检索和测试相应的TCR在体外和体内挑战性模型中的敏感性、特异性和抗肿瘤疗效(参见结果概述和标准，图8)。TCR的筛选证实了40多个TCRab中有3个TCRab具有较高的治疗价值；这些TCR针对表位FLY-A、FLY-B或EVI(SEQ ID NO:4、23、24(表位，用aa表示)；33、34、38、39、46、47、51、52、59、60、64、65(TCRa和b，用nt和aa序列表示)。
使用能够从外周血中存在的低起始频率中检索表位特异性T细胞的灵敏方案，我们能够检测到9个(从11个中)表位的T细胞富集频率；检索到6个表位的TCRab序列；其中5个表位的TCRab序列在基因转移入T细胞时表面表达(图9)。评估这些TCRab对肿瘤细胞加工和呈递的肽的反应性；通过这种方式，早期排除预测的非天然肽的特异性TCR，以避免进一步检测。在5个表位中，针对MLN和AQM表位的TCR不识别内源加工的表位，而针对FLY-A、FLY-B或EVI表位的TCR识别内源加工的表位(图10)。值得注意的是，实施例2覆盖了实施例1关于MLN TCR T细胞的早期发现，因为该试验多次重复证明，该TCR不会介导对内源性呈递的ROPN1B过表达的肿瘤细胞的T细胞IFNg的产生(11次重复中的9次)。FLY-A、FLY-B或EVI TCRT细胞对同源表位的敏感性范围为0.1(FLY-A)至18mM(EVI)(图10)，特别是FLY-A或FLY-BTCR T细胞的亲合力在NY-ESO1 TCR T细胞(即0.7mM)范围内，该范围已有效用于临床治疗黑素瘤和肉瘤患者(Robbins P，J Immunol，2008；Robbins P，J Clin Oncol，2011)。重要的是，FLY-A或FLY-B TCR T细胞根据其识别基序对其同源表位的特异性(即9个氨基酸中的6个连续氨基酸对识别至关重要)以及测试非同源表位库(图11)。当在更高级的肿瘤模型中挑战剩余的TCR T细胞时，我们证明迄今为止测试的TCR(FLY-A TCR是最远的)在体外显示出显著的杀伤ROPN1阳性三维类肿瘤的能力，以及在移植到小鼠上时杀死ROPN1阳性肿瘤的能力(图12和13)。
总之，我们鉴定并验证了针对ROPN1或ROPN1B的FLY-A、FLY-B和EVI表位的三种具有较高治疗价值的TCR。参见TCR序列SEQ ID NO：33、34、38、39、46、47、51、52、59、60、64、65；以及标注的序列，如图14所示。用这些TCR基因工程改造的T细胞计划用于治疗TNBC或其他ROPN1(B)阳性癌症患者的试验。
实施例1扩展的结论
本文建立和利用的是一种有效的工作流程，用于识别和验证AT的肿瘤限制性抗原靶点、其表位、其相应的TCR和工程改造的T细胞。除其他外，我们确定ROPN1和ROPN1B是AT的肿瘤靶点，在多个健康组织中缺乏表达，这意味着中靶毒性的风险最小。此外，我们还分离了3个ROPN1和/或ROPN1B特异性和HLA-A2限制性TCR，这些TCR在健康供者的外周T细胞中表达，介导识别其内源性呈递表位表位，而不是无关表位。此外，其中两个TCR(FLY-A和FLY-BTCR)显示了一个严格识别基序，该基序不存在于任何其他人类蛋白质中，这意味着发生脱靶毒性的风险最小。此外，FLY-A和FLY-B TCR在三维类肿瘤模型中显示出明显的抗肿瘤效力，FLY-A TCR在小鼠模型中显示出明显的肿瘤消退。这些结果表明，ROPN1和ROPN1B是一种很好的靶抗原，ROPN1和/或ROPN1B TCR为展示ROPN1和/或ROPN1B T细胞表位的癌症提供了一种新的治疗机会，这占了80％以上的TNBC患者。
表3.已鉴定的ROPN1和ROPN1B表位及其非交叉反应性概述(粗体)
/>
/>
序列
SEQ ID NO：1：表位1(MLN)
MLNYIEQEV
SEQ ID NO：2：表位2
FLALACSAL
SEQ ID NO：3：表位3
KTLKIVCEV
SEQ ID NO：4：表位4(FLY-A)
FLYTYIAKV
SEQ ID NO：5：表位5
LIIRAEELAQM
SEQ ID NO：6：表位6
FQFLYTYIA
SEQ ID NO：7：表位7
ALACSALGV
SEQ ID NO：8：表位8
AQMWKVVNL
SEQ ID NO：9：表位9
KMLKEFAKA
SEQ ID NO：10：表位1(MLN)-特异性TCRα链未修饰的核苷酸序列
ATGAAGACATTTGCTGGATTTTCGTTCCTGTTTTTGTGGCTGCAGCTGGACTGTATGAGTAGAGGAGAGGATGTGGAGCAGAGTCTTTTCCTGAGTGTCCGAGAGGGAGACAGCTCCGTTATAAACTGCACTTACACAGACAGCTCCTCCACCTACTTATACTGGTATAAGCAAGAACCTGGAGCAGGTCTCCAGTTGCTGACGTATATTTTTTCAAATATGGACATGAAACAAGACCAAAGACTCACTGTTCTATTGAATAAAAAGGATAAACATCTGTCTCTGCGCATTGCAGACACCCAGACTGGGGACTCAGCTATCTACTTCTGTGCAGAGGACGGAGGAGGAAGCTACATACCTACATTTGGAAGAGGAACCAGCCTTATTGTTCATCCGTATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGA
SEQ ID NO：11：表位1(MLN)-特异性TCRα链氨基酸序列
MKTFAGFSFLFLWLQLDCMSRGEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEDGGGSYIPTFGRGTSLIVHPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO：12：表位1(MLN)-特异性TCRα链CDR1
DSSSTY
SEQ ID NO：13：表位1(MLN)-特异性TCRα链CDR2
IFSNMDM
SEQ ID NO：14：表位1(MLN)-特异性TCRα链CDR3
AEDGGGSYIPT
SEQ ID NO：15：表位1(MLN)-特异性TCRβ链未修饰的核苷酸序列
ATGGTTTCCAGGCTTCTCAGTTTAGTGTCCCTTTGTCTCCTGGGAGCAAAGCACATAGAAGCTGGAGTTACTCAGTTCCCCAGCCACAGCGTAATAGAGAAGGGCCAGACTGTGACTCTGAGATGTGACCCAATTTCTGGACATGATAATCTTTATTGGTATCGACGTGTTATGGGAAAAGAAATAAAATTTCTGTTACATTTTGTGAAAGAGTCTAAACAGGATGAATCCGGTATGCCCAACAATCGATTCTTAGCTGAAAGGACTGGAGGGACGTATTCTACTCTGAAGGTGCAGCCTGCAGAACTGGAGGATTCTGGAGTTTATTTCTGTGCCAGCAGCCCCGGCCCTGGGCAGAATTCACCCCTCCACTTTGGGAATGGGACCAGGCTCACTGTGACAGAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTCTGA.
SEQ ID NO：16：表位1(MLN)-特异性TCRβ链氨基酸序列
MVSRLLSLVSLCLLGAKHIEAGVTQFPSHSVIEKGQTVTLRCDPISGHDNLYWYRRVMGKEIKFLLHFVKESKQDESGMPNNRFLAERTGGTYSTLKVQPAELEDSGVYFCASSPGPGQNSPLHFGNGTRLTVTEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
SEQ ID NO：17：表位1(MLN)-特异性TCRβ链CDR1
SGHDN
SEQ ID NO：18：表位1(MLN)-特异性TCRβ链CDR2
FVKESK
SEQ ID NO：19：表位1(MLN)-特异性TCRβ链CDR3
ASSPGPGQNSPLH
SEQ ID NO：20：基序表位1(MLN)
MLNYIXQXX
SEQ ID NO：21：SEQ ID NO:11的TRAV和TRAJ结构域
GEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMK QDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEDGGGSYIPTFGRGTSLIVHP
SEQ ID NO：22：SEQ ID NO:16的TRBV、TRBD和TRBJ结构域
EAGVTQFPSHSVIEKGQTVTLRCDPISGHDNLYWYRRVMGKEIKFLLHFVKESKQD ESGMPNNRFLAERTGGTYSTLKVQPAELEDSGVYFCASSPGPGQNSPLHFGNGTRLTVTSEQ ID NO：23：表位10(FLY-B)
FLYTYIAEV
SEQ ID NO：24：表位11(EVI)
EVIGPDGLITV
SEQ ID NO：25：表位12
GLPRIPFST
SEQ ID NO：26：表位13
HVSRMLNYI
SEQ ID NO：27：表位14
RLIIRAEEL
SEQ ID NO：28：表位15
YIEVDGEI
SEQ ID NO：29：表位16
AELTPELLKI
SEQ ID NO：30：表位17
GVTITKTLK
SEQ ID NO：31：表位18
LPRIPFSTF
SEQ ID NO：32：表位19
SALGVTITK
SEQ ID NO:33:表位4(FLY-A)-特异性TCRα链未修饰的核苷酸序列
atgatgaaatccttgagagttttactagtgatcctgtggcttcagttgagctgggtttggagccaacagaaggaggtggagcagaattctggacccctcagtgttccagagggagccattgcctctctcaactgcacttacagtgaccgaggttcccagtccttcttctggtacagacaatattctgggaaaagccctgagttgataatgtccatatactccaatggtgacaaagaagatggaaggtttacagcacagctcaataaagccagccagtatgtttctctgctcatcagagactcccagcccagtgattcagccacctacctctgtgccgtgaacggggatagcagctataaattgatcttcgggagtgggaccagactgctggtcaggcctgATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGA
SEQ ID NO:34:表位4(FLY-A)-特异性TCRα链氨基酸序列
MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVNGDSSYKLIFGSGTRLLVRPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:35:表位4(FLY-A)-特异性TCRα链CDR1
DRGSQS
SEQ ID NO:36:表位4(FLY-A)-特异性TCRα链CDR2
IYSNGD
SEQ ID NO：37：表位4(FLY-A)-特异性TCRα链CDR3
AVNGDSSYKLI
SEQ ID NO：38：表位4(FLY-A)-特异性TCRβ链未修饰的核苷酸序列
atgagcatcggcctcctgtgctgtgcagccttgtctctcctgtgggcaggtccagtgaatgctggtgtcactcagaccccaaaattccaggtcctgaagacaggacagagcatgacactgcagtgtgcccaggatatgaaccatgaatacatgtcctggtatcgacaagacccaggcatggggctgaggctgattcattactcagttggtgctggtatcactgaccaaggagaagtccccaatggctacaatgtctccagatcaaccacagaggatttcccgctcaggctgctgtcggctgctccctcccagacatctgtgtacttctgtgccagcagttactccctaggggatggctacaccttcggttcggggaccaggttaaccgttgtagAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTCTGA
SEQ ID NO：39：表位4(FLY-A)-特异性TCRβ链氨基酸序列
MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYSLGDGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
SEQ ID NO：40：表位4(FLY-A)-特异性TCRβ链CDR1
MNHEY
SEQ ID NO：41：表位4(FLY-A)-特异性TCRβ链CDR2
SVGAGI
SEQ ID NO：42：表位4(FLY-A)-特异性TCRβ链CDR3
ASSYSLGDGYT
SEQ ID NO：43：基序表位4(FLY-A)
XXYTYIAKX
SEQ ID NO：44：SEQ ID NO:34的TRAV和TRAJ结构域
QKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVNGDSSYKLIFGSGTRLLVRP
SEQ ID NO:45:SEQ ID NO:39的TRBV,TRBD和TRBJ结构域
NAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYSLGDGYTFGSGTRLTVV
SEQ ID NO:46:表位10(FLY-B)-特异性TCRα链未修饰核苷酸序列
atggaaactctcctgggagtgtctttggtgattctatggcttcaactggctagggtgaacagtcaacagggagaagaggatcctcaggccttgagcatccaggagggtgaaaatgccaccatgaactgcagttacaaaactagtataaacaatttacagtggtatagacaaaattcaggtagaggccttgtccacctaattttaatacgttcaaatgaaagagagaaacacagtggaagattaagagtcacgcttgacacttccaagaaaagcagttccttgttgatcacggcttcccgggcagcagacactgcttcttacttctgtgctacggacgctagggccagactcatgtttggagatggaactcagctggtggtgaagcccaATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGa
SEQ ID NO:47:表位10(FLY-B)-特异性TCRα链氨基酸序列
METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDARARLMFGDGTQLVVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:48:表位10(FLY-B)-特异性TCRα链CDR1
TSINN
SEQ ID NO:49:表位10(FLY-B)-特异性TCRα链CDR2
IRSNERE
SEQ ID NO：50：表位10(FLY-B)-特异性TCRα链CDR3
ATDARARLM
SEQ ID NO：51：表位10(FLY-B)-特异性TCRβ链未修饰核苷酸序列
atggactcctggaccctctgctgtgtgtccctttgcatcctggtagcaaagcacacagatgctggagttatccagtcaccccggcacgaggtgacagagatgggacaagaagtgactctgagatgtaaaccaatttcaggacacgactaccttttctggtacagacagaccatgatgcggggactggagttgctcatttactttaacaacaacgttccgatagatgattcagggatgcccgaggatcgattctcagctaagatgcctaatgcatcattctccactctgaagatccagccctcagaacccagggactcagctgtgtacttctgtgccagcagtttggggggggggacgaggcccctacctaattcacccctccactttgggaacgggaccaggctcactgtgacagAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTCtga
SEQ ID NO：52：表位10(FLY-B)-特异性TCRβ链氨基酸序列
MDSWTLCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHDYLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSLGGGTRPLPNSPLHFGNGTRLTVTEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
SEQ ID NO：53：表位10(FLY-B)-特异性TCRβ链CDR1
SGHDY
SEQ ID NO：54：表位10(FLY-B)-特异性TCRβ链CDR2
FNNNVP
SEQ ID NO：55：表位10(FLY-B)-特异性TCRβ链CDR3
ASSLGGGTRPLPNSPLH
SEQ ID NO：56：基序表位10(FLY-B)
XLYTYIAEX
SEQ ID NO：57：SEQ ID NO:47的TRAV和TRAJ结构域
SQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREK HSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDARARLMFGDGTQLVVKP
SEQ ID NO:58:SEQ ID NO:52的TRBV,TRBD和TRBJ结构域
DAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHDYLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSLGGGTRPLPNSPLHFGNGTRLTVT
SEQ ID NO:59:表位11(EVI)-特异性TCRα链未修饰核苷酸序列
atgctcctgctgctcgtcccagcgttccaggtgatttttaccctgggaggaaccagagcccagtctgtgacccagcttgacagccaagtccctgtctttgaagaagcccctgtggagctgaggtgcaactactcatcgtctgtttcagtgtatctcttctggtatgtgcaataccccaaccaaggactccagcttctcctgaagtatttatcaggatccaccctggttaaaggcatcaacggttttgaggctgaatttaacaagagtcaaacttccttccacttgaggaaaccctcagtccatataagcgacacggctgagtacttctgtgctgctcggacgggaggaggaaacaaactcacctttgggacaggcactcagctaaaagtggaactcaATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGASEQ IDNO:60:表位11(EVI)-特异性TCRα链氨基酸序列
MLLLLVPAFQVIFTLGGTRAQSVTQLDSQVPVFEEAPVELRCNYSSSVSVYLFWYVQYPNQGLQLLLKYLSGSTLVKGINGFEAEFNKSQTSFHLRKPSVHISDTAEYFCAARTGGGNKLTFGTGTQLKVELNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:61:表位11(EVI)-特异性TCRα链CDR1
SSVSVY
SEQ ID NO:62:表位11(EVI)-特异性TCRα链CDR2
YLSGSTLV
SEQ ID NO：63：表位11(EVI)-特异性TCRα链CDR3
AARTGGGNKLT
SEQ ID NO：64：表位11(EVI)-特异性TCRβ链未修饰核苷酸序列
atgggctgcaggctgctctgctgtgcggttctctgtctcctgggagcagttcccatagacactgaagttacccagacaccaaaacacctggtcatgggaatgacaaataagaagtctttgaaatgtgaacaacatatggggcacagggctatgtattggtacaagcagaaagctaagaagccaccggagctcatgtttgtctacagctatgagaaactctctataaatgaaagtgtgccaagtcgcttctcacctgaatgccccaacagctctctcttaaaccttcacctacacgccctgcagccagaagactcagccctgtatctctgcgccagcagccaagaagggctagcgggagtaccccagtacttcgggccaggcacgcggctcctggtgctcgAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCtga
SEQ ID NO：65：表位11(EVI)-特异性TCRβ链氨基酸序列
MGCRLLCCAVLCLLGAVPIDTEVTQTPKHLVMGMTNKKSLKCEQHMGHRAMYWYKQKAKKPPELMFVYSYEKLSINESVPSRFSPECPNSSLLNLHLHALQPEDSALYLCASSQEGLAGVPQYFGPGTRLLVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
SEQ ID NO：66：表位11(EVI)-特异性TCRβ链CDR1
MGHRA
SEQ ID NO：67：表位11(EVI)-特异性TCRβ链CDR2
YSYEKL
SEQ ID NO：68：表位11(EVI)-特异性TCRβ链CDR3
ASSQEGLAGVPQY
SEQ ID NO：69：SEQ ID NO:60的TRAV和TRAJ结构域
AQSVTQLDSQVPVFEEAPVELRCNYSSSVSVYLFWYVQYPNQGLQLLLKYLSGSTLVKGINGFEAEFNKSQTSFHLRKPSVHISDTAEYFCAARTGGGNKLTFGTGTQLKVEL
SEQ ID NO:70:SEQ ID NO:65的TRBV、TRBD和TRBJ结构域
DTEVTQTPKHLVMGMTNKKSLKCEQHMGHRAMYWYKQKAKKPPELMFVYSYEKLSINESVPSRFSPECPNSSLLNLHLHALQPEDSALYLCASSQEGLAGVPQYFGPGTRLLVL

Claims (22)

1.一种工程改造的T细胞，其中所述T细胞经工程改造以表达T细胞受体(TCR)或基于抗体的受体，其结合人ropporin-1A(ROPN1)和/或人ropporin-1B(ROPN1B)的T细胞表位；其中所述T细胞表位由选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:56和SEQ IDNO:24之一的氨基酸序列组成。
2.如权利要求1所述的工程改造的T细胞，其中所述T细胞经工程改造以表达结合由SEQID NO:4和/或SEQ ID NO:33组成的T细胞表位的TCR；和其中所述TCR包括：
(i)T细胞受体α链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO:37的CDR3，和
(ii)T细胞受体β链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO：42的CDR3；
和其中所述T细胞受体α和β链的所述高变区还包含CDR1和CDR2。
3.如权利要求2所述的工程改造的T细胞，其中所述T细胞受体α链的所述高变区包含：
-SEQ ID NO:35的CDR1；
-SEQ ID NO:36的CDR2；
-SEQ ID NO:37的CDR3；和/或
其中，所述T细胞受体β链的所述高变区包含：
-SEQ ID NO:40的CDR1；
-SEQ ID NO:41的CDR2；
-SEQ ID NO:42的CDR3。
4.如权利要求2或3所述的工程改造的T细胞，
其中所述T细胞受体α链包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列和其中所述T细胞受体β链包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；优选其中所述T细胞受体α链包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列和其中所述T细胞受体β链包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的工程改造的T细胞，其中所述T细胞经工程改造以表达结合由SEQID NO:23和/或SEQ ID NO:56组成的T细胞表位的TCR；和其中所述TCR包括：
(i)T细胞受体α链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO:50的CDR3，和
(ii)T细胞受体β链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO：55的CDR3；
和其中所述T细胞受体α和β链的所述高变区还包含CDR1和CDR2。
6.如权利要求5所述的工程改造的T细胞，其中所述T细胞受体α链的所述高变区包含：
-SEQ ID NO:48的CDR1；
-SEQ ID NO:49的CDR2；
-SEQ ID NO:50的CDR3；和/或
其中，所述T细胞受体β链的所述高变区包含：
-SEQ ID NO:53的CDR1；
-SEQ ID NO:54的CDR2；
-SEQ ID NO:55的CDR3。
7.如权利要求5或权利要求6所述的工程改造的T细胞，其中所述T细胞受体α链包含SEQID NO:57的氨基酸序列和所述T细胞受体β链包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；优选其中所述T细胞受体α链包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列和其中所述T细胞受体β链包含SEQ IDNO:52的氨基酸序列。
8.如权利要求1所述的工程改造的T细胞，其中所述T细胞经工程改造以表达结合SEQID NO:24的T细胞表位的TCR；和其中所述TCR包括：
(i)T细胞受体α链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO:63的CDR3，和
(ii)T细胞受体β链，其包含高变区，所述高变区包含SEQ ID NO：68的CDR3；
和其中所述T细胞受体α和β链的所述高变区还包含CDR1和CDR2。
9.如权利要求8所述的工程改造的T细胞，其中所述T细胞受体α链的所述高变区包含：
-SEQ ID NO:61的CDR1；
-SEQ ID NO:62的CDR2；
-SEQ ID NO:63的CDR3；和/或
其中，所述T细胞受体β链的所述高变区包含：
-SEQ ID NO:66的CDR1；
-SEQ ID NO:67的CDR2；
-SEQ ID NO:68的CDR3。
10.如权利要求8或权利要求9所述的工程改造的T细胞，其中所述T细胞受体α链包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列和所述T细胞受体β链包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；优选其中所述T细胞受体α链包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列和其中所述T细胞受体β链包含SEQID NO:65的氨基酸序列。
11.如前述权利要求中任一项所述的工程改造的T细胞，其中所述T细胞表位与人主要组织相容性复合物(MHC)分子，优选HLA-A*02分子形成复合物。
12.一种药物组合物，其包含如前述权利要求中任一项所述的工程改造的T细胞及药学上可接受的赋形剂。
13.一种TCR蛋白或基于抗体的受体蛋白，其中所述TCR蛋白或者基于抗体的受体蛋白包含如权利要求1-10中任一项所述的TCR或者基于抗体的受体；优选其中所述TCR具有权利要求2-10中任一项所述的T细胞受体α链和T细胞受体β链；优选其中所述TCR蛋白或基于抗体的受体蛋白是抗体-药物偶联物(ADC)的一部分或是可溶性TCR(的一部分)。
14.一种核酸分子，其包含编码(i)如权利要求2-10中任一项所述的T细胞受体α链和/或如权利要求2-10中任一项所述的T细胞受体β链的核酸序列。
15.如权利要求1-11中任一项所述的工程改造的T细胞、如权利要求12所述的组合物、如权利要求13所述的TCR蛋白或基于抗体的受体蛋白或如权利要求14所述的核酸分子，用于治疗。
16.如权利要求15所述使用的工程改造的T细胞、组合物、TCR蛋白、基于抗体的受体蛋白或核酸分子，其中所述工程改造的T细胞、组合物、TCR蛋白、基于抗体的受体蛋白或核酸分子用于治疗肿瘤，优选实体瘤或液体瘤。
17.如权利要求16所述使用的工程改造的T细胞、组合物、TCR蛋白、基于抗体的受体蛋白或核酸分子，其中所述肿瘤包含表达人ROPN1和/或人ROPN1B的肿瘤细胞，优选其中所述肿瘤包含肿瘤细胞，所述肿瘤细胞包含MHC分子，其与如权利要求1所定义的T细胞表位复合或结合。
18.如权利要求16或17所述使用的工程改造的T细胞、组合物、TCR蛋白、基于抗体的受体蛋白或核酸分子，其中所述实体瘤为乳腺癌，优选三阴性乳腺癌，或皮肤癌，优选黑色素瘤。
19.如权利要求16或17所述使用的工程改造的T细胞、组合物、TCR蛋白、基于抗体的受体蛋白或核酸分子，其中所述液体瘤为骨髓瘤，优选多发性骨髓瘤、白血病，优选急性髓系白血病或淋巴瘤。
20.一种人ropporin-1A(ROPN1)或人ropporin-1B(ROPN1B)的分离或纯化肽，其与人主要组织相容性复合物(MHC)分子，优选HLA-A*02分子形成复合物，其中所述肽由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:24中任一种的氨基酸序列组成。
21.一种工程改造的细胞，优选工程改造的癌细胞，其中所述细胞经工程改造以表达人ropporin-1A(ROPN1)和/或人ropporin-1B(ROPN1B)。
22.一种治疗患有或疑似患有肿瘤的对象的方法，包括给予有需要的对象治疗有效量的如权利要求1-11中任一项所述的工程改造的T细胞、如权利要求12所述的组合物、如权利要求13所述的TCR蛋白或基于抗体的受体蛋白或如权利要求14所述的核酸分子的步骤。
CN202280023436.5A 2021-01-21 2022-01-21 用于治疗的t细胞 Pending CN117529492A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP21152822 2021-01-21
EP21152822.9 2021-01-21
PCT/NL2022/050028 WO2022158977A1 (en) 2021-01-21 2022-01-21 T cells for use in therapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117529492A true CN117529492A (zh) 2024-02-06

Family

ID=74205682

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280023436.5A Pending CN117529492A (zh) 2021-01-21 2022-01-21 用于治疗的t细胞

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20240131155A1 (zh)
EP (1) EP4281469A1 (zh)
JP (1) JP2024504690A (zh)
KR (1) KR20230147078A (zh)
CN (1) CN117529492A (zh)
AU (1) AU2022209669A1 (zh)
BR (1) BR112023014628A2 (zh)
CA (1) CA3205170A1 (zh)
IL (1) IL304496A (zh)
WO (1) WO2022158977A1 (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001055321A2 (en) * 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
GB201520562D0 (en) * 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
CA3021159A1 (en) * 2016-04-21 2017-10-26 Immatics Biotechnologies Gmbh Immunotherapy against melanoma and other cancers
CN112888707A (zh) * 2018-08-16 2021-06-01 百欧恩泰美国公司 T细胞受体构建体及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
CA3205170A1 (en) 2022-07-28
BR112023014628A2 (pt) 2023-10-03
IL304496A (en) 2023-09-01
JP2024504690A (ja) 2024-02-01
KR20230147078A (ko) 2023-10-20
EP4281469A1 (en) 2023-11-29
AU2022209669A1 (en) 2023-08-10
US20240131155A1 (en) 2024-04-25
WO2022158977A1 (en) 2022-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Akahori et al. Antitumor activity of CAR-T cells targeting the intracellular oncoprotein WT1 can be enhanced by vaccination
JP6767931B2 (ja) Ｔ細胞受容体ベータ定常領域に対する抗原結合ドメインを有するキメラ抗原抗体（ｃａｒ）
AU2017203511B2 (en) T cell receptor-like antibodies specific for a WT1 peptide presented by HLA-A2
JP7013243B2 (ja) 微細特異性を有する親和性結合体
JP6712261B2 (ja) Ｗｔ−１に特異的なｔ細胞免疫治療
US12012458B2 (en) Genetically modified natural killer cells for CD70-directed cancer immunotherapy
JP2021521776A (ja) Ｍａｇｅ−ｂ２特異性を有するｔ細胞受容体およびその使用
KR20170087514A (ko) 입양 세포 치료를 위한 방법 및 조성물
CA2899679A1 (en) High avidity antigen recognizing constructs
EP3095792A1 (en) T cell receptor with specificity for myeloperoxidase peptide and uses thereof
Matsuzaki et al. A rare population of tumor antigen-specific CD4+ CD8+ double-positive αβ T lymphocytes uniquely provide CD8-independent TCR genes for engineering therapeutic T cells
KR20220101641A (ko) 세포 선택 및/또는 자극 장치 및 사용 방법
CN113195526A (zh) 针对过继性t细胞疗法中的突变myd88l265p蛋白表位的特异性t细胞受体
CN117529492A (zh) 用于治疗的t细胞
Ivanov et al. UTY‐specific TCR‐transfer generates potential graft‐versus‐leukaemia effector T cells
JP2022513321A (ja) 固形腫瘍を治療するための遺伝子操作しているγδ－Ｔ細胞及び遺伝子操作していないγδ－Ｔ細胞に関する組成物及び方法
CA3233480A1 (en) Modified binding proteins and therapeutic uses thereof
Wang Development of class II-agnostic CAR T cell therapy targeting WT1 Peptide Presented by Diverse HLA class II Molecules
WO2023240120A2 (en) Novel treatments for cardiovascular related disease
WO2023081925A1 (en) Adoptive cell therapy combination treatment and compositions thereof
CN118265721A (zh) 靶向ndc80抗原的肽和经改造t细胞受体及使用方法
EP3765053A2 (en) Antigenic peptides deriving from urocortin 3 and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
WO2019175380A2 (en) Antigenic peptides deriving from secretogranin v and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination