CN118265721A - 靶向ndc80抗原的肽和经改造t细胞受体及使用方法 - Google Patents

Abstract

本公开内容提供了经改造T细胞受体(TCR)、包含TCR的细胞以及制备和使用TCR的方法。本公开内容涉及特异性识别来自肿瘤抗原NDC80CT的表位的TCR。因此，本公开内容的一些方面涉及经改造T细胞受体(TCR)、编码TCR的核酸、以及包含核酸和TCR的细胞。还提供了包含本公开内容的细胞、核酸或经改造TCR的组合物，制备细胞的方法，以及使用本公开内容的一些实施方案用于治疗性处理的方法。

Description

靶向NDC80抗原的肽和经改造T细胞受体及使用方法

本申请要求于2021年10月18日提交的美国临时专利申请No.63/256,982的优先权，其在此通过引用整体并入。

序列表

本申请包含按照ST.26格式制作并在此通过引用整体并入的序列表。所述序列表创建于2022年10月11日，命名为MDACP1311WO，并且大小为25,004字节。

发明背景

技术领域

本发明涉及癌症治疗领域。

背景技术

过继性T细胞治疗是一种用于癌症的潜在强效治疗，其通过对天然T细胞进行遗传修饰以使它们具有肿瘤特异性并提高它们破坏肿瘤细胞的能力。经遗传修饰的T细胞能够表达嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)或T细胞受体(T-cell receptor，TCR)，这在多项临床试验中显示出令人印象深刻的结果。TCR经改造T(TCR-T)细胞已显示出针对肿瘤的巨大前景。TCR的效力取决于其与肽-主要组织相容性复合体(peptide-majorhistocompatibility complex，pMHC)的相互作用，所述复合体通过肽与MHC结合而形成。胞内抗原被切割成肽链并由MHC分子呈现以形成pMHC。待由I类MHC蛋白表达的胞质蛋白(其中大多数为缺陷型核糖体翻译产物)通过蛋白水解被切割成肽链。然后，这些肽与I类MHC蛋白结合，所述I类MHC蛋白在所有有核细胞的细胞表面上表达。一些称为抗原呈递细胞(antigen-presenting cell，APC)的细胞表达II类MHC蛋白。它们通过内吞作用将外来物质蛋白内化，并将所述外来物质蛋白切割成肽链，以与来自T细胞的II类MHC蛋白T细胞受体结合，其必须与患者的人白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)等位基因匹配，识别这些pMHC并导致癌细胞杀伤。(人I类MHC蛋白从3个基因区域表达：HLA-A、HLA-B和HLA-C，并且人II类MHC蛋白也从3个基因区域表达：HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ。)需要针对癌症特异性抗原并可用于治疗癌症的TCR的改造。

发明内容

本公开内容提供了组合物和方法，其包括肽、经改造T细胞受体(TCR)、包含肽和TCR的细胞、以及制备和使用肽和TCR的方法。本公开内容涉及TCR，其特异性识别NDC80 CT抗原，例如具有GLNEEIARV(SEQ ID NO：15)的氨基酸序列的肽。

因此，本公开内容涉及包含抗原结合可变区的多肽，所述抗原结合可变区包含含有与AVQAGSSASKII(SEQ ID NO：8)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。还描述了包含抗原结合可变区的多肽，所述抗原结合可变区包含含有与ASSLSGGIYEQY(SEQ IDNO：14)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。

本公开内容还提供了T细胞受体(TCR)和经改造TCR，例如包含TCR-a多肽和TCR-b多肽的TCR，其中TCR-a多肽包含含有与AVQAGSSASKII(SEQ ID NO：8)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，并且TCR-b多肽包含含有与ASSLSGGIYEQY(SEQ ID NO：14)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。TCR-a多肽可包含含有与AVQAGSSASKII(SEQ IDNO：8)具有或具有至少60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR3，并且TCR-b多肽可包含含有与ASSLSGGIYEQY(SEQ ID NO：14)具有或具有至少60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR3。TCR-a多肽可包含含有AVQAGSSASKII(SEQ ID NO：8)的氨基酸序列的CDR3，并且TCR-b多肽可包含含有ASSLSGGIYEQY(SEQ ID NO：14)的氨基酸序列的CDR3。

还描述了包含本公开内容的TCR和CD3结合区的融合蛋白。CD3结合区可包含CD3特异性抗原结合片段(fragment antigen binding，Fab)、单链可变片段(single chainvariable fragment，scFv)、单结构域抗体或单链抗体。示例性CD3特异性抗原结合片段(Fab)是本领域已知的。例如，通过引用并入本文的US20180222981公开了与CD3特异性结合的可变区，其可用于本公开内容的一些方面。抗CD3抗体和可变区公开于US20180117152中，其也通过引用并入。

本公开内容还涉及相对于SEQ ID NO：15的肽包含至少66％序列同一性的肽。还公开了包含本公开内容的肽的多肽。肽或多肽可与SEQ ID NO：15具有或具有至少60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性。

本公开内容还涉及包含本公开内容的肽或多肽以及MHC多肽的分子复合物。本公开内容还涉及产生肽特异性免疫效应细胞的方法，其包括：(a)获得起始免疫效应细胞群；和(b)使起始免疫效应细胞群与本公开内容的肽接触，从而产生肽特异性免疫效应细胞。本公开内容还描述了根据本公开内容的方法产生的肽特异性经改造T细胞和TCR。另一些方面涉及体外分离的树突细胞，其包含本公开内容的肽、多肽、核酸或表达载体。

还提供了用于对患者进行预后或用于在患者中检测T细胞应答的方法，所述方法包括：使来自患者的生物样品与本公开内容的组合物、肽或多肽接触。又一些方面涉及肽特异性结合分子，其与本公开内容的肽结合或与肽-MHC复合物结合。示例性结合分子包括抗体、TCR模拟抗体、scFv、纳米抗体、适配体和DARPIN。相关方法提供了这样的方法，其包括使包含至少一种MHC多肽以及本公开内容的肽或多肽的组合物与包含T细胞的组合物接触，并通过对检测标签进行检测来检测具有结合的肽和/或MHC多肽的T细胞。

另一些方面涉及包含本公开内容的肽、多肽、核酸、表达载体或组合物的药盒。另一些方法方面涉及克隆T细胞受体(TCR)的方法，所述方法包括(a)获得起始免疫效应细胞群；(b)使起始免疫效应细胞群与本公开内容的肽接触，从而产生肽特异性免疫效应细胞；(c)纯化对肽具有特异性的免疫效应细胞，以及(d)从所纯化的免疫效应细胞中分离TCR序列。另一些方面涉及制备细胞的方法，其包括将本公开内容的核酸或表达载体转移到细胞中。另一些方面涉及用于制备治疗性T细胞疫苗的体外方法，其包括将T细胞与本公开内容的肽共培养。

本公开内容的核酸包含编码本文中所述的CDR区、可变区、经改造TCR、多肽、TCR-a多肽、TCR-b多肽、肽、多肽和融合蛋白的那些。核酸可以是RNA。核酸也可以是编码肽或多肽或者肽或多肽的互补物的DNA或cDNA。核酸可包含SEQ ID NO：1、2或其片段之一。核酸可包含与SEQ ID NO：1、2或其片段之一具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的核苷酸。还提供了包含本公开内容的多肽、细胞、核酸或经改造TCR的组合物。另一些方面涉及制备经改造细胞的方法，其包括将本公开内容的核酸或载体转移到细胞中。另一些方面涉及用于在对象中治疗癌症的方法，其包括向有此需要的对象施用多肽、组合物、细胞、核酸或经改造TCR。方法还包括降低肿瘤负荷的方法；裂解癌细胞的方法；杀伤肿瘤/癌细胞的方法；提高总存活的方法；降低患癌症或患肿瘤的风险的方法；提高无复发存活的方法；预防癌症的方法；和/或降低、消除或减少癌症扩散或转移的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用多肽、组合物、细胞、核酸或经改造TCR。方法还包括降低肿瘤负荷的方法；裂解癌细胞的方法；杀伤肿瘤/癌细胞的方法；提高总存活的方法；预防或降低癌症复发风险的方法；促进癌症缓解的方法；提高对另一些或另外的癌症治疗的敏感性的方法；降低患癌症或患肿瘤的风险的方法；提高无复发存活的方法；预防癌症的方法；和/或降低、消除或减少癌症扩散或转移的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用多肽、组合物、细胞、核酸或经改造TCR。

本公开内容的多肽或TCR-a多肽可包含含有与SEQ ID NO：8具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR3。多肽可包含含有SEQID NO：8的氨基酸序列的CDR3。本公开内容的多肽或TCR-b多肽可包含含有与SEQ ID NO：14具有至少或恰好75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR3。本公开内容的多肽或TCR-b多肽可包含含有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR3。经改造TCR可包含：TCR-a多肽，其包含具有SEQ ID NO：8的氨基酸的CDR3；以及TCR-b多肽，其包含含有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR3。

多肽可包含含有来自TCR-a多肽和/或TCR-b多肽的CDR1、CDR2和CDR3的可变区。可变区可包含与VSGLRG(SEQ ID NO：6)具有至少80％序列同一性的CDR1。可变区可包含与SEQID NO：6具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的CDR1。可变区可包含与LYSAGEE(SEQ ID NO：7)具有至少80％序列同一性的CDR2。可变区可包含与SEQ IDNO：7具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的CDR2。可变区可包含含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR1和/或含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR2。可变区可包含与SEQ ID NO：4具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。可变区可包含与SEQID NO：4具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。可变区可包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。多肽可包含T细胞受体α(TCR-a)可变区。多肽可包含TCR-a可变区和恒定区。多肽还可包含信号肽。信号肽可包含与SEQ ID NO：5具有至少80％同一性的氨基酸序列。信号肽可包含与SEQ ID NO：5具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。信号肽可包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。可变区可包含CDR1、CDR2和/或CDR3。

可变区可包含与SGHDT(SEQ ID NO：12)具有至少80％序列同一性的CDR1。可变区可包含与SEQ ID NO：12具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的CDR1。可变区可包含与YYEEEE(SEQ ID NO：13)具有至少80％序列同一性的CDR2。可变区可包含与SEQ ID NO：13具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的CDR2。可变区可包含含有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR1和/或含有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR2。可变区可包含与SEQ ID NO：10具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。可变区可包含与SEQ ID NO：10具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。可变区可包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。多肽可包含T细胞受体β(TCR-b)可变区。多肽可包含TCR-b可变区和恒定区。多肽可包含或还包含信号肽。信号肽可包含与SEQ ID NO：11具有至少80％同一性的氨基酸序列。信号肽可包含与SEQ ID NO：11具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。信号肽包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。可变区可包含CDR1、CDR2和/或CDR3。

TCR可包含：TCR-a多肽，其包含含有CDR1、CDR2和CDR3的可变区；以及TCR-b多肽，其包含含有CDR1、CDR2和CDR3的可变区。TCR-a多肽可包含与SEQ ID NO：6具有至少80％序列同一性的CDR1，和/或TCR-b多肽可包含与SEQ ID NO：12具有至少80％序列同一性的CDR1。TCR-a多肽可包含与SEQ ID NO：6具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的CDR1，和/或TCR-b多肽可包含与SEQ ID NO：12具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的CDR1。TCR-a多肽可包含含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR1，并且TCR-b多肽可包含含有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR1。TCR-a多肽可包含与SEQ ID NO：7具有至少80％序列同一性的CDR2，并且TCR-b多肽包含与SEQ ID NO：13具有至少80％序列同一性的CDR2。TCR-a多肽可包含与SEQ ID NO：7具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的CDR2，并且TCR-b多肽包含与SEQ ID NO：13具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的CDR2。TCR-a多肽可包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR2，并且TCR-b多肽包含含有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR2。TCR-a多肽的CDR1、CDR2和CDR3可分别包含SEQ ID NO：6、7和8的氨基酸序列，并且其中TCR-b多肽的CDR1、CDR3和CDR3可分别包含SEQ ID NO：12、13和14的氨基酸序列。TCR-a可变区可包含与SEQ ID NO：4具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且TCR-b可变区包含与SEQ ID NO：10具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。TCR-a可变区可包含与SEQ ID NO：4具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列，并且TCR-b可变区包含与SEQ ID NO：10具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。TCR-a多肽可包含与SEQ ID NO：3具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且TCR-b多肽包含与SEQ ID NO：9具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。TCR-a多肽可包含与SEQ ID NO：3具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列，并且TCR-b多肽包含与SEQ ID NO：9具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。TCR-a和/或TCR-b多肽可包含信号肽。信号肽可包含SEQ ID NO：5或11。信号肽可包含与SEQ ID NO：5或11具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。

TCR可包含修饰或者是嵌合的。TCR的可变区可与TCR恒定区融合，所述TCR恒定区不同于与本公开内容的肽特异性结合的克隆的TCR的恒定区。

TCR-a多肽和TCR-b多肽可以可操作地连接。术语“可操作地连接”可以指共价连接，例如肽键(例如两个元件是多肽并且位于同一多肽上)，或非共价连接，例如范德华力(Van der Waals force)(例如，两个多肽对彼此具有一定程度的特异性结合亲和力)。TCR-a多肽和TCR-b多肽通过肽键可操作地连接。TCR-a多肽和TCR-b多肽位于同一多肽上，并且其中TCR-b在TCR-a的氨基近端。多肽可进一步限定为单链TCR。TCR-a多肽和TCR-b多肽可位于同一多肽上，并且其中TCR-a在TCR-b的氨基近端。TCR可包含在TCR-a与TCR-b多肽之间的接头。接头可包含甘氨酸和丝氨酸残基。接头可仅由甘氨酸和丝氨酸残基构成(甘氨酸-丝氨酸接头)。接头可以是柔性接头。一些示例性的柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括，例如，(GS)n、(GSGGS-SEQ ID NO：18)n、(G₄S)n和(GGGS-SEQ ID NO：19)n，其中n是至少1的整数。“n”可至少、至多或恰好为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10(或其中可推导出的任何范围)。甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的另一些柔性接头，可用作本公开内容的多肽中的接头。一些示例性的接头可包含以下或由以下组成：GGSG(SEQ ID NO：20)，GGSGG(SEQ ID NO：21)，GSGSG(SEQ ID NO：22)，GSGGG(SEQ IDNO：23)，GGGSG(SEQ ID NO：24)，GSSSG(SEQ ID NO：25)等。本文中描述了可用于本公开内容的多肽和TCR的另一些接头。当第一区域连接到第二区域的羧基末端时，第一区域在第二区域的羧基近端。在第一区域与第二区域之间可以有其他插入氨基酸残基。因此，除非特别说明没有插入氨基酸残基，否则这些区域不需要紧邻。术语“氨基近端”类似地定义为当第一区域连接到第二区域的氨基末端时，第一区域在第二区域的氨基近端。类似地，除非另有说明，否则在第一区域与第二区域之间可以有其他插入氨基酸残基。

CDR还可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、16、18、19、20、21、22、23个或更多个(或其中可推导出的任何范围)连续氨基酸残基，其位于特定CDR序列的一侧或两侧侧翼；因此，在特定CDR序列的N末端或C末端可以有一个或更多个另外的氨基酸，例如SEQ ID NO：6至8和12至14中所示的那些。作为替代或组合地，CDR还可以是本文中所述CDR的片段，并且可以从特定CDR序列的C末端或N末端缺失至少1、2、3、4或5个氨基酸。

TCR或融合蛋白可与检测或治疗剂缀合。所述检测或治疗剂可包含荧光分子、放射性分子或毒素。TCR或融合蛋白可与本文中所述的剂缀合。

本公开内容还提供了核酸，所述核酸编码：TCR-a多肽，其包含含有与AVQAGSSASKII(SEQ ID NO：8)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3；和/或TCR-b多肽，其包含含有与ASSLSGGIYEQY(SEQ ID NO：14)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。核酸可编码：TCR-a多肽，其包含含有与SEQ ID NO：8具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR3；和/或TCR-b多肽，其包含含有与SEQ ID NO：14具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列的CDR3。核酸可编码包含CDR1、CDR2和CDR3的TCR-a多肽和/或包含CDR1、CDR2和CDR3的TCR-b多肽。核酸可编码包含与SEQ ID NO：6具有至少80％序列同一性的CDR1的TCR-a和/或包含与SEQ ID NO：12具有至少80％序列同一性的CDR1的TCR-b。核酸可编码包含与SEQ IDNO：6具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的CDR1的TCR-a，和/或包含与SEQ ID NO：12具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的CDR1的TCR-b。核酸可编码包含与SEQ ID NO：7具有至少80％序列同一性的CDR2的TCR-a和/或包含与SEQ ID NO：13具有至少80％序列同一性的CDR2的TCR-b。核酸可编码包含与SEQ ID NO：7具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的CDR2的TCR-a，和/或包含与SEQ ID NO：13具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的CDR2的TCR-b。核酸可编码包含与SEQ ID NO：4具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的TCR-a可变区和/或包含与SEQ ID NO：10具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的TCR-b可变区。核酸可编码包含与SEQ ID NO：4具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列的TCR-a可变区，和/或包含与SEQ ID NO：10具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列的TCR-b可变区。核酸可编码包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的TCR-a多肽链和/或包含SEQ ID NO：10的氨基酸的TCR-b链。核酸可包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2。核酸可包含与SEQ ID NO：1具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性和/或与SEQ ID NO：2具有或具有至少75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的核酸序列。

核酸可包含TCR-a(TRA)和TCR-b(TRB)基因。核酸可以是多顺反子的。核酸还可包含内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)或P2A接头。核酸可包含编码TCR-a和/或TCR-b基因的cDNA。核酸可编码或还编码包含CD3结合区的多肽。CD3结合区可包含CD3特异性抗原结合片段(Fab)、单链可变片段(scFv)、单结构域抗体或单链抗体。

肽可包含SEQ ID NO：15的肽的至少6个连续氨基酸。肽可包含以下、由以下组成或包含以下：SEQ ID NO：15的肽的至少4、5、6、7、8或9个连续氨基酸。肽可包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列或由SEQ ID NO：15的氨基酸序列组成。肽的长度可为13个氨基酸或更短。肽可具有至少、至多、恰好6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸(或其中可推导出的任何范围)，或者由6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸(或其中可推导出的任何范围)组成。肽可由9个氨基酸组成。肽可由8个氨基酸组成。肽可由7个氨基酸组成。肽可由6个氨基酸组成。肽可被限定为是免疫原性的。术语免疫原性可以是指免疫应答，例如保护性免疫应答的产生。肽可以是经修饰的。修饰可包含与分子的缀合。分子可以是抗体、脂质、佐剂或检测部分(标签)。肽可相对于SEQ ID NO：15的肽包含100％序列同一性。本公开内容的肽还包括与SEQ ID NO：15的肽具有或具有至少55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％序列同一性的那些。肽可以与SEQ ID NO：15的肽具有或具有至少77％序列同一性。肽可以与SEQ ID NO：15的肽具有或具有至少88％序列同一性。本公开内容的肽相对于SEQ ID NO：15的肽可具有1、2或3个替换。该肽相对于SEQ ID NO：15的肽可具有至少或具有至多1、2、3、4或5个替换。

组合物可被配制成用于肠胃外施用、静脉内注射、肌内注射、吸入或皮下注射。肽可包含在脂质体、含脂质的纳米粒或在基于脂质的载体中。本公开内容的组合物可被配制为疫苗。组合物还可包含佐剂。

树突细胞可包含成熟树突细胞。细胞可以是具有HLA-A型的细胞。HLA可以是HLA-A、HLA-B或HLA-C。细胞可以是HLA-A02型。细胞可以是HLA-A0201型。细胞可以是HLA-A01、HLA-A02、HLA-A11、HLA-A24、HLA-B07、HLA-B08、HLA-B15或HLA-B40。

方法还可包括分离所表达的肽或多肽。T细胞可包含CD8+ T细胞。T细胞可以是CD4+ T细胞、Th1、Th2、Th17、Th9或Tfh T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、中枢记忆T细胞或效应记忆T细胞。

载体可包含TCR-a和TCR-b基因二者。载体可包含指导核酸表达的启动子。启动子可包含鼠干细胞病毒(murine stem cell virus，MSCV)启动子。

细胞可包含干细胞、祖细胞、免疫细胞或自然杀伤(natural killer，NK)细胞。细胞可包含造血干细胞或祖细胞、T细胞、分化自间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)或诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)的细胞。细胞可分离自或来源于外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中。T细胞可包含细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、恒定NK T(iNKT)细胞、γ-δT细胞、NKT细胞或调节性T细胞。细胞可从癌症患者中分离。细胞可从非癌性患者中分离。细胞可从健康患者中分离。细胞可以是冷冻的或是从未冷冻过的。细胞可以在细胞培养物中。细胞可缺乏TCR基因的内源性表达。细胞还可包含嵌合抗原受体(CAR)。

组合物可以是已被确定为无血清、无支原体、无内毒素和/或无菌的组合物。方法可包括或进一步包括在培养基中培养细胞，在允许细胞分裂的条件下孵育细胞，筛选细胞，和/或冷冻细胞。

对象可以是已被诊断为患有癌症，例如本文中所述的癌症的对象。癌症可包含实体瘤。对象可以是先前已针对该癌症进行过治疗的对象。对象可以是已被确定为对先前的治疗具有抗性的对象。该方法可包括或进一步包括施用另外的治疗。癌症可被进一步限定为实体瘤。癌症也可以是血癌，例如白血病。癌症可以是本文中所述的癌症。癌症可以是I期、II期、III期或IV期癌症。癌症可包含转移性和/或复发性癌症。癌症可包含NDC80CT抗原+癌症。癌症可包含表达SEQ ID NO:15的肽的癌症。对象或患者可以是已被确定为具有NDC80 CT抗原+癌细胞或对SEQ ID NO:15的表位呈阳性的癌细胞的对象或患者。癌症可以是NDC80 CT抗原过表达的癌症，例如与非癌性对象相比过表达的癌症。对象或患者可以是已被确定为在生物样品中具有NDC80 CT抗原过表达的对象或患者。生物样品可包含癌细胞或活检物。对象可以是哺乳动物。对象可以是实验室测试动物，例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、马或猪。对象可以是人对象。对象可以是已被确定为HLA-A2阳性和/或HLA-A*0201阳性的对象。

本公开内容的组合物可被配制为疫苗。本公开内容的组合物和方法提供了预防性治疗以预防癌症。本公开内容的组合物和方法提供了治疗性治疗以治疗现有癌症，例如对患有癌症的患者的治疗。组合物可包含或还包含佐剂。佐剂是本领域已知的，并包括例如TLR激动剂和铝盐。

本公开内容的方法可包括或进一步包括筛选细胞的一种或更多种细胞特性，例如TCR表达、编码TCR基因的核酸的并入，或免疫原性特性，例如TCR与癌症抗原(例如NDC80 CT抗原或SEQ ID NO:15的肽)的结合。

方法可包括或进一步包括施用细胞或包含细胞的组合物，并且其中细胞包含自体细胞。细胞可包含非自体细胞。细胞还可以是同种异体的或异种的。

组合物可包含MHC多肽和本公开内容的肽，并且其中MHC多肽和/或肽与检测标签缀合。因此，合适的检测标签包括但不限于放射性同位素、荧光色素、化学发光化合物、染料和蛋白质，包括酶。标签可进行简单检测或者其可被量化。进行简单检测的响应通常包括其存在仅被确认的响应，而进行量化的响应通常包括具有可量化(例如，数值可报告)值的响应，例如强度、偏振和/或其他特性。在发光或荧光测定中，可直接使用与实际参与结合的测定组分相关的发光团或荧光团，或者间接使用与另外的(例如，报道物或指示剂)组分相关的发光团或荧光团来产生可检测的响应。产生信号的发光标签的一些实例包括但不限于生物发光和化学发光。合适的荧光标签的一些实例包括但不限于荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、赤藓红、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀石绿(Malacite green)、茋、萤虫黄、Cascade Blue.TM.和德克萨斯红(Texas Red)。另一些合适的光学染料描述于Haugland,Richard P.(1996)Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(6th)中。检测标签还包括链霉亲和素或其结合配偶体生物素。

MHC多肽和肽可以是有效连接的。术语“有效连接”是指其中两种组分组合或能够组合以形成复合物的情况。例如，组分可共价连接和/或在同一多肽上，例如在融合蛋白中，或者组分可对彼此具有一定程度的结合亲和力，例如通过范德华力产生的结合亲和力。因此，MHC多肽和肽可通过肽键有效连接。MHC多肽和肽可通过范德华力有效连接。肽-MHC可有效连接以形成pMHC复合物。至少两个pMHC复合物可有效连接在一起。另一些方面包括、包括至少、或包括至多2、3、4、5、6、7、8、9或10个彼此有效连接的pMHC复合物。至少两个MHC多肽可与一个肽连接。MHC多肽与肽的平均比率可以为1:1至4:1。比率或平均比率可以为至少、至多或约1、2、3、4、5或6至约1、2、3、4、5或6(或其中可推导出的任何范围)。

肽可与MHC复合。MHC可包含HLA-A、HLA-B或HLA-C型。肽可被负载到树突细胞、淋巴母细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、人工抗原呈递细胞(artificial antigenpresentation cell，aAPC)或人工抗原呈递表面上。人工抗原呈递表面可包含与表面缀合或连接的MHC多肽。示例性表面包括珠、微板、玻璃载片或细胞培养板。

本公开内容的方法可进一步包括对与肽和/或MHC结合的T细胞的数目进行计数。包含T细胞的组合物可分离自对象。对象可以是如本文中所限定的对象，例如人对象。该方法可进一步包括对与肽和/或MHC结合的T细胞的数目进行分选。本公开内容的方法还可包括或进一步包括对来自与肽和/或MHC结合的T细胞的一个或更多个TCR基因进行测序。该方法可包括或进一步包括对来自TCR(例如与本公开内容的肽结合的TCR)的TCR α和/或TCRβ基因进行测序。该方法还可包括或进一步包括通过互补位(paratope)热点的淋巴细胞相互作用分组(grouping of lymphocyte interactions by paratope hotspots，GLIPH)分析。这进一步描述于Glanville et al.,Nature.2017Jul 6；547(7661):94–98中，其通过引用并入本文。

本公开内容的组合物可以是无血清、无支原体、无内毒素和/或无菌的。该方法可进一步包括在培养基中培养本公开内容的细胞，在允许细胞分裂的条件下孵育细胞，筛选细胞和/或冷冻细胞。该方法还可进一步包括从本公开内容的细胞中分离所表达的肽或多肽。

本公开内容的方法可包括或进一步包括针对一种或更多种细胞特性筛选树突细胞。该方法可进一步包括使细胞与一种或更多种细胞因子或生长因子接触。一种或更多种细胞因子或生长因子可包含GM-CSF。细胞特性可包含CD86、HLA和CD14中一者或更多者的细胞表面表达。树突细胞可来源于CD34+造血干细胞或祖细胞。

本公开内容的方法中的接触可进一步限定为使起始免疫效应细胞群与抗原呈递细胞(APC)共培养，其中APC在其表面上呈递肽。APC可以是树突细胞。树突细胞可来源于外周血单个核细胞(PBMC)。树突细胞可分离自PBMC。树突细胞或DC来源于其的细胞通过白细胞去除术(leukaphereses)分离出。

本公开内容的肽-MHC(pMHC)复合物可通过使本公开内容的肽与MHC复合物接触来制备。肽可在细胞中表达并与内源性MHC复合物结合以形成pMHC。肽交换可用于制备pMHC复合物。例如，可切割肽，例如光可切割肽，可被设计成与MHC结合并稳定MHC。除非在存在“拯救肽”的情况下进行UV暴露，否则肽的切割(例如通过针对光切割肽的辐照)使肽与HLA复合物解离，并产生快速分解的空HLA复合物。因此，本公开内容的肽可在肽交换过程中用作“拯救肽”。本公开内容还描述了包含本公开内容的肽的pMHC复合物。pMHC复合物可以与固体支持物有效连接，或者可以与可检测部分例如荧光分子、放射性同位素或抗体附接。本公开内容还描述了肽-MHC多聚体复合物，其包含、包含至少或包含至多1、2、3、4、5或6个彼此有效连接的肽-MHC分子。连接可以是共价的(例如通过肽键)，或者是非共价的。pMHC分子可以与生物素分子结合。这样的pMHC分子可通过与链霉亲和素分子结合而被多聚化。pMHC多聚体可用于检测在组合物中或在组织中的抗原特异性T细胞或TCR分子。多聚体可用于在原位中或在活检样品中检测肽或肽特异性T细胞。多聚体可以结合到固体支持物上或沉积在固体支持物上，例如阵列或载片上。然后可将细胞添加至载片，并可进行pMHC多聚体与细胞之间的结合的检测。因此，本公开内容的pMHC分子和多聚体可用于在对象中检测和诊断癌症，或用于在患有癌症的个体中确定免疫应答。

如本文中所述方法中所限定的，获得可包括或进一步包括从外周血单个核细胞(PBMC)中分离起始免疫效应细胞群。起始免疫效应细胞群可获自对象。本公开内容的方法可包括或进一步包括在共培养之前将肽或编码肽的核酸引入到树突细胞中。肽的引入可通过用编码肽的核酸转染或感染树突细胞，或者通过将肽与树突细胞一起孵育来完成。可通过电穿孔引入肽或编码肽的核酸。转移核酸的另一些方法是本领域已知的，所述方法例如脂质体转染、磷酸钙转染、用DEAE-右旋糖酐转染、显微注射和病毒介导的转导，并且可用于本公开内容的方法中以用于将本公开内容的核酸转移到细胞中。可通过将肽或编码肽的核酸添加至树突细胞培养基来引入肽或编码肽的核酸。可将免疫效应细胞与其中已引入肽或编码肽的核酸的第二树突细胞群共培养。在共培养之后，可从免疫效应细胞中纯化CD4阳性或CD8阳性和肽MHC四聚体阳性T细胞群。CD4阳性或CD8阳性和肽MHC四聚体阳性T细胞群可通过荧光激活细胞分选(fluorescence activated cell sorting，FACS)进行纯化。可通过限制或连续稀释，随后通过快速扩增方案扩增单个克隆来产生肽特异性免疫效应细胞的克隆群。

纯化还可包括通过限制或连续稀释分选细胞，随后通过快速扩增方案扩增单个克隆来产生肽特异性免疫效应细胞的克隆群。本公开内容的方法可包括或进一步包括从肽特异性免疫效应细胞的克隆群中克隆T细胞受体(TCR)。本公开内容方法中的术语“分离”可限定为或进一步限定为从肽特异性免疫效应细胞的克隆群中克隆T细胞受体(TCR)。克隆TCR可包括克隆TCR α链和TCR β链。可使用5’-cDNA末端快速扩增(Rapid amplification ofcDNA end，RACE)方法克隆TCR。可使用5’-cDNA末端快速扩增(RACE)方法克隆TCR α和β链。所克隆的TCR可被亚克隆到表达载体中。表达载体可包含在TCRα序列与TCRβ序列之间的接头结构域。表达载体可以是逆转录病毒或慢病毒载体。载体也可以是本文中所述的表达载体。接头结构域可包含编码一个或更多个肽切割位点的序列。一个或更多个切割位点可以是弗林蛋白酶切割位点和/或P2A切割位点。TCR α序列和TCRβ序列可通过IRES序列连接。

本公开内容的宿主细胞可用表达载体转导以产生表达TCRα和/或β链的经改造细胞。宿主细胞可以是免疫细胞。免疫细胞可以是T细胞，并且经改造细胞可被称为经改造T细胞。T细胞可以是本文中所述的T细胞类型，例如CD8⁺ T细胞、CD4+ T细胞或γδT细胞。起始免疫效应细胞群可获自患有癌症的对象，并且宿主细胞与该对象是同种异体的或自体的。肽特异性T细胞可以是自体的或同种异体的。CD4阳性或CD8阳性和肽MHC四聚体阳性的经改造T细胞群可以是从转导的宿主细胞中纯化的。可通过限制或连续稀释，随后通过快速扩增方案扩增单个克隆来产生肽特异性的经改造T细胞的克隆群。本公开内容方法中的纯化可限定为在共培养之后从免疫效应细胞中纯化CD4阳性或CD8阳性和肽MHC四聚体阳性T细胞群。

肽可与固体支持物连接。肽可与固体支持物缀合或者与缀合于固体支持物的抗体结合。固体支持物可包含微板、珠、玻璃表面、载片或细胞培养皿。固体支持物可包含纳米流体芯片。检测T细胞应答可包括或进一步包括检测肽与T细胞或TCR的结合。检测T细胞应答可包括ELISA、ELISPOT或四聚体测定。

本公开内容的方法还可用于确定疫苗(例如癌症疫苗)的效力。

“治疗”或其变形可指对哺乳动物中疾病的任何治疗，包括：(i)预防疾病，即通过在诱发疾病之前施用保护性组合物使疾病的临床症状不发生；(ii)遏止(suppress)疾病，即通过在诱发事件之后但在疾病临床出现或再次出现之前施用保护性组合物而使疾病的临床症状不发生；(iii)抑制疾病，即通过在临床症状最初出现之后施用保护性组合物来阻止临床症状的发展；和/或(iv)缓解疾病，即通过在临床症状最初出现之后施用保护性组合物使临床症状消退。治疗可不包括疾病的预防。

在本申请通篇，术语“约”根据其在细胞和分子生物学领域中的清晰且普通含义使用，以指示值包含用于确定该值所采用的装置或方法的误差的标准偏差。

当与术语“包含/包括”结合使用时，未用数量词限定的名词的使用可意指“一个/种”，但其也符合“一个/种或更多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义。

本文中使用的术语“或/或者”和“和/或/或者”用于描述彼此组合或彼此排斥的多个组分。例如，“x、y和/或z”可以是指单独的“x”，单独的“y”，单独的“z”，“x、y和z”，“(x和y)或z”，“x或(y和z)”或者“x或y或z”。特别预期了x、y或z可被特别地排除在实施方案或方面之外。

词语“包含”(及其任何变化形式)、“具有”(及其任何变化形式)、“包括”(及其任何变化形式)、“特征为”(及其任何变化形式)或“含有”(及其任何变化形式)是包括性的或开放式的，并且不排除另外的未记载的要素或方法步骤。

组合物和方法根据其用途可“包含/包括”在本说明书通篇公开的任何成分或步骤、“基本上由其组成”或“由其组成”。短语“由......组成”排除未指定的任何要素、步骤或成分。短语“基本上由......组成”将所述主题的范围限制为指定的物质或步骤以及不实质上影响其基本和新的特征的那些物质或步骤。预期了在术语“包含/包括”的情况下描述的一些实施方案和方面也可在术语“由......组成”或“基本上由......组成”的情况下实施。

在治疗性、诊断性或生理性目的或作用的背景下的任何方法也可以以“用途”权利要求语言描述，例如本文所讨论的任何化合物、组合物或药剂用于实现或实施所述治疗性、诊断性或生理性目的或作用“的用途”。

可基于本文中所述的任何方法使用一种或更多种序列或组合物的用途。本申请通篇讨论了另一些实施方案。关于本公开内容的一个方面所讨论的任何实施方案或方面也适用于本公开内容的另一些方面，反之亦然。

特别预期了关于本发明的一个实施方案或方面所讨论的任何限制均可应用于本发明的任何其他实施方案或方面。此外，本发明的任何组合物均可用于本发明的任何方法中，并且可使用本发明的任何方法来产生或利用本发明的任何组合物。在实施例中阐述的实施方案的一些方面也是可在不同实施例中的其他地方或在本申请中的其他地方(例如在发明内容、具体实施方式、权利要求书和附图说明中)讨论的一些实施方案的背景下实施的实施方案。

根据以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应理解的是，详细描述和具体实例虽然指示了本发明的一些具体实施方案和一些方面，但是其仅通过举例说明的方式给出，因为从该详细描述中，本发明的精神和范围内的多种变化和修改对本领域技术人员而言将变得明显。

附图说明

以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过结合本文中给出的具体实施方案的详细描述来参考这些附图中的一个或更多个可以更好地理解本发明。

图1：人正常组织中的NDC80表达水平(GTEx数据库)。

图2：人癌症组织中的NDC80表达水平(TCGA数据库)。

图3：NDC80 HLA-A0201限制性肽MS鉴定。使用免疫沉淀(immuno-precipitation，IP)方法从K562-A2细胞系裂解物中分离MHC/肽。使用乙酸洗脱肽。将所洗脱的肽用HPLC分离并用质谱(mass spectrometry，MS)鉴定。发现了来自NDC80的一种HLA-A0201限制性肽-NDC80-330(GLNEEIARV-SEQ ID NO：15)，其具有高离子评分(离子评分＝44)。

图4：NDC80-330 HLA-A0201限制性肽(GLNEEIARV)CTL的产生。将NDC80-330(GLNEEIARV)肽脉冲至成熟树突细胞，并随后与来自HLA-A0201阳性健康供体的自体PBMC共培养。在两轮刺激之后，从每个孔中收集部分T细胞以用于四聚体检测。然后，对四聚体+/CD8+群进行分选并用快速扩增方案(rapid expansion protocol，REP)进行扩增。在REP进行两周之后，观察到高纯度CTL(四聚体+群超过90％)。

图5A至J：NDC80-330肽特异性CTL细胞系的功能验证。(A)将用多种浓度的NDC80-330肽脉冲的T2细胞用作靶标。用Cr51释放测定(Cr51 release assay，CRA)检测NDC80-330CTL细胞系的裂解能力。效应物与靶标(E：T)的比率为20：1。将(B)正常肺细胞系HSAEC2-KT，(C至F)胶质母细胞瘤细胞系U87MG、T98G、LN-18和M059K作为靶标，以使用CRA测试NDC80-330 CTL系识别。(G至J)将胰腺癌细胞系PANC-1、Panc02.13、Panc03.27和CFPAC-1作为靶标，以使用CRA测试NDC80-330 CTL细胞系识别。

图6A至D：用于验证NDC80-330特异性CTL的识别特异性的冷靶标抑制测定。用51Cr标记的胶质母细胞瘤细胞系LN-18(A)和胰腺癌细胞系PANC-1、Panc03.27、CFPAC-1(B至D)被用作热靶标。在没有51Cr标记的情况下用NDC80-330肽脉冲的T2细胞作为冷靶标。用无关肽M26脉冲的T2细胞作为对照冷靶标。E∶T是20∶1。冷靶标∶热靶标为10∶1或20∶1。用CRA检测冷靶标对NDC80-330 CTL细胞系的杀伤抑制。

图7：NDC80-330特异性TCR-T的产生。将全长TCR克隆到逆转录病毒载体pMSGV1中并产生重组逆转录病毒。用重组逆转录病毒感染来自HLA-A0201健康供体的PBMC。在感染之后，对四聚体+/CD8+群进行分选和扩增。在扩增之后，得到高纯度的NDC80-330特异性TCR-T。

图8A至J：用杀伤测定进行的NDC80-330特异性TCR-T功能验证。(A)将用多种浓度的NDC80-330肽脉冲的T2细胞用作靶标。用Cr51释放测定(CRA)检测NDC80-330 TCR-T的裂解能力。效应物与靶标(E：T)的比率为20∶1。将(B)永生化正常肺细胞系HSAEC2-KT，(C至F)胶质母细胞瘤细胞系U87、T98G、LN-18和M095K以及(G至J)胰腺癌细胞系PANC-1、Panc02.13、Panc03.27和CFPAC-1作为靶标，以用CRA测试对NDC80-330 TCR-T的识别。效应物与靶标(E:T)的比率为40:1至1.25:1。

图9：用胞内细胞因子染色(intracellular cytokine staining，ICS)测定对NDC80-330 TCR-T进行的功能检测。将NDC80-330 TCR-T细胞系与T2+M26肽、M2+NDC80-330肽、正常肺细胞系HSAEC2-KT、肿瘤靶标A375、U87MG、LN-18、T98G、M059K、PANC-1、Panc02.13、Panc03.27和CFPAC-1以E:T＝10:1的比率共培养。在共培养过夜之后，用ICS测定来检测TCR途径下游激活标志物CD137、CD69、IFN-γ和TNF-α。

具体实施方式

本公开内容提供了T细胞受体(TCR)，其识别来自具有氨基酸序列GLNEEIARV(SEQID NO:15)的肿瘤抗原NDC80 CT的HLA-A2限制性表位。本公开内容还提供了：编码该TCR的核苷酸序列；包含该核苷酸序列的表达载体，其可用于修饰细胞(例如外周血单个核细胞)以产生NDC80 CT特异性T细胞。本公开内容还提供了NDC80 CT特异性T细胞用于针对HLA-A2阳性癌症患者的过继性免疫治疗的用途，所述癌症患者的恶性细胞表达NDC80 CT抗原。

I.经改造T细胞受体

T细胞受体包含通过二硫键连接的两条不同的多肽链，称为T细胞受体α(TCRα)和β(TCRβ)链。这些α:β异二聚体在结构上与免疫球蛋白分子的Fab片段非常相似，并且它们解释了大多数T细胞的抗原识别。少数T细胞携带由一对不同的多肽链(命名为γ和δ)构成的另一种但结构相似的受体。两种类型的T细胞受体均不同于充当B细胞受体的膜结合免疫球蛋白：T细胞受体只有一个抗原结合位点，而B细胞受体有两个，并且T细胞受体从不分泌，而免疫球蛋白可以作为抗体分泌。

T细胞受体的两条链均具有与免疫球蛋白V结构域具有同源性的氨基末端可变(variable，V)区、与免疫球蛋白C结构域具有同源性的恒定(constant，C)区，以及含有形成链间二硫键的半胱氨酸残基的短的铰链区。每条链通过疏水跨膜结构域跨越脂质双层，并以短的胞质尾终止。

T细胞受体的三维结构已经确定。该结构确实与抗体Fab片段的结构相似，这一点在对编码其的基因的早期研究中被怀疑。T细胞受体链的折叠方式与Fab片段的折叠方式非常相似，但是最终结构看起来更短一点且更宽一点。然而，T细胞受体与Fab片段之间存在一些明显的差异。最显著的差异在于Cα结构域，其中折叠不同于任何其他免疫球蛋白样结构域。与Cβ结构域并置的一半结构域形成了与其他免疫球蛋白样结构域中存在的β折叠类似的β折叠，但另一半结构域由松散堆积的链和短的α螺旋区段形成。分子内二硫键在免疫球蛋白样结构域中通常连接两条β链，在Cα结构域中将β链与该α螺旋区段连接。

结构域相互作用的方式也存在差异。两条T细胞受体链的V与C结构域之间的界面比抗体中的更广泛，其可能会使结构域之间的铰链连接更不灵活。并且，在碳水化合物的辅助下，Cα与Cβ结构域之间的相互作用是独特的，其中来自Cα结构域的糖基团形成了与Cβ结构域的许多氢键。最后，可变结合位点的比较表明，虽然互补决定区(complementarity-determining region，CDR)环与抗体分子的环非常紧密地对齐，但是相对于抗体分子的环存在一些位移(displacement)。这种位移在VαCDR2环中特别明显，其取向与抗体V结构域中的等同环大致成直角，这是将环的一端从结构域的一个面锚定至另一个面的β链的移动的结果。链位移还导致结构已知的七个Vβ结构域中的两个中的VβCDR2环的取向发生变化。迄今为止，七种T细胞受体的晶体结构已得以在这个分辨水平求解。

本公开内容的一些方面涉及经改造T细胞受体。术语“经改造”是指具有接枝到TCR恒定区上的TCR可变区以制备与本公开内容的肽和抗原结合的嵌合多肽的T细胞受体。在某些方面中，TCR包含这样的间插序列，其用于构建体的克隆、增强表达、检测或者用于构建体的治疗性对照，但是不存在于内源性TCR例如多克隆位点、接头、铰链序列、经修饰铰链序列、经修饰跨膜序列、检测多肽或分子、或者可允许选择或筛选包含TCR的细胞的治疗性对照中。

在一些方面中，TCR包含非TCR序列。因此，某些方面涉及具有并非来自TCR基因的序列的TCR。在一些方面中，TCR是嵌合的，因为其除包含通常在TCR基因中存在的序列之外，还包含来自自然界中不一定一起存在的至少两个TCR基因的序列。

在一些方面中，本公开内容的经改造TCR包含如下所示的变量：

下表涉及TCR-a方面的特征：

下表涉及TCR-b方面的特征：

II.蛋白质组合物

本文中使用的“蛋白质”、“肽”或“多肽”是指包含至少五个氨基酸残基的分子。本文中使用的术语“野生型”是指在生物体中天然存在的分子的内源形式。在一些方面中，使用蛋白质或多肽的野生型形式，然而，在本公开内容的许多方面中，使用经修饰的蛋白质或多肽来产生免疫应答。上述术语可互换使用。“经修饰蛋白质”或“经修饰多肽”或“变体”是指其化学结构、特别是其氨基酸序列相对于野生型蛋白质或多肽发生改变的蛋白质或多肽。在一些方面中，经修饰/变体蛋白质或多肽具有至少一种经修饰的活性或功能(识别蛋白质或多肽可具有多种活性或功能)。特别设想了经修饰/变体蛋白质或多肽可在一种活性或功能方面改变，但在另一些方面(例如免疫原性)仍保留野生型活性或功能。

在本文中具体提及蛋白质的情况下，其通常是指天然(野生型)或重组(经修饰)蛋白质，或任选地，其中已去除任何信号序列的蛋白质。蛋白质可从其天然来源的生物体中直接分离，通过重组DNA/外源表达方法产生，或通过固相肽合成(solidphase peptidesynthesis，SPPS)或其他体外方法产生。在一些具体方面中，存在并入编码多肽(例如，抗体或其片段)的核酸序列的分离的核酸区段和重组载体。术语“重组”可与多肽或特定多肽的名称联合使用，并且这通常是指由已在体外操作的核酸分子或者是这样的分子的复制产物产生的多肽。

在某些方面中，蛋白质或多肽(野生型或经修饰)的尺寸可包括但不限于5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，210，220，230，240，250，275，300，325，350，375，400，425，450，475，500，525，550，575，600，625，650，675，700，725，750，775，800，825，850，875，900，925，950，1000，1200，1400，1600，1800，或2000个氨基酸残基或核酸残基或更多，以及其中可推导出的任何范围，或本文中所述或提及的相应氨基酸序列的衍生物。考虑了多肽可通过截短发生突变，使它们比其相应野生型形式更短，此外，它们可通过融合或缀合具有特定功能(例如，用于靶向或定位、用于增强免疫原性、用于纯化目的等)的异源蛋白质或多肽序列而改变。

本公开内容的多肽、蛋白质或者编码这样的多肽或蛋白质的多核苷酸可包含1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，或50(或其中可推导出的任何范围)个或更多个变体氨基酸或核酸替换，或者与SEQ ID NO：1至17的至少或至多3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，300，400，500，550，1000个或更多个连续氨基酸或核酸(或其中可推导出的任何范围)具有至少60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％(或其中可推导出的任何范围)的相似性、同一性或同源性。在一些具体方面中，肽或多肽是人序列或是基于人序列的。在某些方面中，肽或多肽不是天然存在的和/或者在肽或多肽的组合中。

在一些方面中，蛋白质、多肽或核酸可包含SEQ ID NO：1至17的第1至2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，306，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，或320(或其中可推导出的任何范围)位氨基酸或核苷酸。

在一些方面中，蛋白质、多肽或核酸可包含SEQ ID NO：1至17的第1至2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，306，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，或320(或其中可推导出的任何范围)位氨基酸或核苷酸，并且与SEQID NO：1至17之一具有或具有至少60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性。

在一些方面中，蛋白质、多肽或核酸可包含、包含至少或者包含至多SEQ ID NO：1至17的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，306，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，或320(或其中可推导出的任何范围)个连续氨基酸或核酸。

在一些方面中，多肽、蛋白质或核酸可包含至少、至多或恰好SEQ ID NO：1至17的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268v269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，306，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，或320(或其中可推导出的任何范围)个连续氨基酸，其与SEQ ID NO：1至17之一具有至少、至多或恰好60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％(或其中可推导出的任何范围)的相似性、同一性或同源性。

在一些方面中，存在这样的核酸分子或多肽，其起始于SEQ ID NO：1至17中任一者的第1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，306，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424，425，426，427，428，429，430，431，432，433，434，435，436，437，438，439，440，441，442，443，444，445，446，447，448，449，450，451，452，453，454，455，456，457，458，459，460，461，462，463，464，465，466，467，468，469，470，471，472，473，474，475，476，477，478，479，480，481，482，483，484，485，486，487，488，489，490，491，492，493，494，495，496，497，498，499，500，501，502，503，504，505，506，507，508，509，510，511，512，513，514，515，516，517，518，519，520，521，522，523，524，525，526，527，528，529，530，531，532，533，534，535，536，537，538，539，540，541，542，543，544，545，546，547，548，549，550，551，552，553，554，555，556，557，558，559，560，561，562，563，564，565，566，567，568，569，570，571，572，573，574，575，576，577，578，579，580，581，582，583，584，585，586，587，588，589，590，591，592，593，594，595，596，597，598，599，600，601，602，603，604，605，606，607，608，609，610，611，612，613，614，615，616，617，618，619，620，621，622，623，624，625，626，627，628，629，630，631，632，633，634，635，636，637，638，639，640，641，642，643，644，645，646，647，648，649，650，651，652，653，654，655，656，657，658，659，660，661，662，663，664，665，666，667，668，669，670，671，672，673，674，675，676，677，678，679，680，681，682，683，684，685，686，687，688，689，690，691，692，693，694，695，696，697，698，699，700，701，702，703，704，705，706，707，708，709，710，711，712，713，714，715，716，717，718，719，720，721，722，723，724，725，726，727，728，729，730，731，732，733，734，735，736，737，738，739，740，741，742，743，744，745，746，747，748，749，750，751，752，753，754，755，756，757，758，759，760，761，762，763，764，765，766，767，768，769，770，771，772，773，774，775，776，777，778，779，780，781，782，783，784，785，786，787，788，789，790，791，792，793，794，795，796，797，798，799，800，801，802，803，804，805，806，807，808，809，810，811，812，813，814，815，816，817，818，819，820，821，822，823，824，825，826，827，828，829，830，831，832，833，834，835，836，837，838，839，840，841，842，843，844，845，846，847，848，849，850，851，852，853，854，855，856，857，858，859，860，861，862，863，864，865，866，867，868，869，870，871，872，873，874，875，876，877，878，879，880，881，882，883，884，885，886，887，888，889，890，891，892，893，894，895，896，897，898，899，900，901，902，903，904，905，906，907，908，909，910，911，912，913，914，915，916，917，918，919，920，921，922，923，924，925，926，927，928，929，930，931，932，933，934，935，936，937，938，939，940，941，942，943，944，945，946，947，948，949，或950位，并且包含SEQ ID NO：1至17中任一者的至少、至多或恰好2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142.143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，306，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424，425，426，427，428，429，430，431，432，433，434，435，436，437，438，439，440，441，442，443，444，445，446，447，448，449，450，451，452，453，454，455，456，457，458，459，460，461，462，463，464，465，466，467，468，469，470，471，472，473，474，475，476，477，478，479，480，481，482，483，484，485，486，487，488，489，490，491，492，493，494，495，496，497，498，499，500，501，502，503，504，505，506，507，508，509，510，511，512，513，514，515，516，517，518，519，520，521，522，523，524，525，526，527，528，529，530，531，532，533，534，535，536，537，538，539，540，541，542，543，544，545，546，547，548，549，550，551，552，553，554，555，556，557，558，559，560，561，562，563，564，565，566，567，568，569，570，571，572，573，574，575，576，577，578，579，580，581，582，583，584，585，586，587，588，589，590，591，592，593，594，595，596，597，598，599，600，601，602，603，604，605，606，607，608，609，610，611，612，613，614，615，616，617，618，619，620，621，622，623，624，625，626，627，628，629，630，631，632，633，634，635，636，637，638，639，640，641，642，643，644，645，646，647，648，649，650，651，652，653，654，655，656，657，658，659，660，661，662，663，664，665，666，667，668，669，670，671，672，673，674，675，676，677，678，679，680，681，682，683，684，685，686，687，688，689，690，691，692，693，694，695，696，697，698，699，700，701，702，703，704，705，706，707，708，709，710，711，712，713，714，715，716，717，718，719，720，721，722，723，724，725，726，727，728，729，730，731，732，733，734，735，736，737，738，739，740，741，742，743，744，745，746，747，748，749，750，751，752，753，754，755，756，757，758，759，760，761，762，763，764，765，766，767，768，769，770，771，772，773，774，775，776，777，778，779，780，781，782，783，784，785，786，787，788，789，790，791，792，793，794，795，796，797，798，799，800，801，802，803，804，805，806，807，808，809，810，811，812，813，814，815，816，817，818，819，820，821，822，823，824，825，826，827，828，829，830，831，832，833，834，835，836，837，838，839，840，841，842，843，844，845，846，847，848，849，850，851，852，853，854，855，856，857，858，859，860，861，862，863，864，865，866，867，868，869，870，871，872，873，874，875，876，877，878，879，880，881，882，883，884，885，886，887，888，889，890，891，892，893，894，895，896，897，898，899，900，901，902，903，904，905，906，907，908，909，910，911，912，913，914，915，916，917，918，919，920，921，922，923，924，925，926，927，928，929，930，931，932，933，934，935，936，937，938，939，940，941，942，943，944，945，946，947，948，949，或950(或其中可推导出的任何范围)个连续氨基酸或核苷酸。

多种基因的核苷酸以及蛋白质、多肽和肽序列已经在先前公开，并且可在公认的计算机数据库中找到。两个常用的数据库是国家生物技术信息中心基因库(NationalCenter for Biotechnology Information’s Genbank)和GenPept数据库(在万维网上的ncbi.nlm.nih.gov/处)以及全球蛋白质资源(UniProt；在万维网上的uniprot.org处)。这些基因的编码区可使用本文公开的技术或本领域普通技术人员已知的技术进行扩增和/或表达。

预期在本公开内容的组合物中，每ml存在约0.001mg至约10mg的总多肽、肽和/或蛋白质。组合物中蛋白质的浓度可以为约、至少约或至多约0.001，0，010，0.050，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0mg/ml或更多(或其中可推导出的任何范围)。

以下是关于改变蛋白质的氨基酸亚基以产生等同的、或甚至改善的第二代变体多肽或肽的讨论。例如，某些氨基酸可替换蛋白质或多肽序列中的其他氨基酸，而与结构(例如如抗体的抗原结合区或底物分子上的结合位点)的相互作用结合能力有或没有明显的损失。由于是蛋白质的相互作用能力和性质决定了该蛋白质的功能性活性，因此可在蛋白质序列及其相应的DNA编码序列中进行某些氨基酸替换，但仍会产生具有相似或所期望特性的蛋白质。因此，本发明人预期可在编码蛋白质的基因的DNA序列中进行多种改变，而不会明显损失其生物学效用或活性。

本文中使用的术语“功能等同的密码子”是指编码相同氨基酸的密码子，例如精氨酸的六个不同密码子。还考虑了“中性替换”或“中性突变”，这是指编码生物等同氨基酸的一个或更多个密码子的改变。

本公开内容的氨基酸序列变体可以是替换、插入或缺失变体。与野生型相比，本公开内容的多肽中的变化可影响蛋白质或多肽的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，个或更多个非连续或连续氨基酸(或其中可推导出的任何范围)。变体可包含与本文提供或引用的任何序列具有至少50％、60％、70％、80％或90％(包括其间的所有值和范围)同一性的氨基酸序列。变体可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个替换氨基酸。

还应当理解，氨基酸和核酸序列可分别包含另外的残基，例如另外的N或C末端氨基酸，或者5’或3’序列，并且仍与在本文中公开的序列之一中所示的基本上相同，只要该序列符合以上提出的标准即可，所述标准包括在涉及蛋白质表达的情况下维持生物学蛋白质活性。末端序列的添加特别适用于这样的核酸序列，其可例如包含位于编码区的5’或3’部分侧翼的多个非编码序列。

缺失变体通常缺少天然或野生型蛋白质的一个或更多个残基。可以缺失单个残基，或者可以缺失许多个连续氨基酸。终止密码子可以被引入(通过替换或插入)到编码核酸序列中以产生截短的蛋白质。

插入突变体通常涉及在多肽的非末端点添加氨基酸残基。这可包括插入一个或更多个氨基酸残基。也可以产生末端添加，并且其可以包含融合蛋白，所述融合蛋白是本文中所述或提及的一种或更多种肽或多肽的多聚体或多联体。

替换变体通常包含在蛋白质或多肽内的一个或更多个位点处的一个氨基酸与另一个氨基酸的交换，并且可被设计成在损失或不损失其他功能或特性的情况下调节多肽的一个或更多个特性。替换可以是保守的，即一个氨基酸被具有类似化学特性的一个氨基酸替换。“保守氨基酸替换”可涉及一个氨基酸类别的成员与同一类别的另一成员的交换。保守替换在本领域中是公知的，并包括例如以下改变：丙氨酸到丝氨酸；精氨酸到赖氨酸；天冬酰胺到谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸到谷氨酸；半胱氨酸到丝氨酸；谷氨酰胺到天冬酰胺；谷氨酸到天冬氨酸；甘氨酸到脯氨酸；组氨酸到天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸到亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸到缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸到精氨酸；甲硫氨酸到亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸到酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸到苏氨酸；苏氨酸到丝氨酸；色氨酸到酪氨酸；酪氨酸到色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸到异亮氨酸或亮氨酸。保守氨基酸替换可涵盖非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而不是通过在生物系统中的合成来并入。这些包括肽模拟物或其他反转或倒转形式的氨基酸部分。

或者，替换可以是“非保守的”，使得多肽的功能或活性受到影响。非保守变化通常涉及用化学上相异的氨基酸残基替换氨基酸残基，例如用极性或带电荷的氨基酸替换非极性或不带电荷的氨基酸，反之亦然。非保守替换可涉及将一种氨基酸类别的成员替换为来自另一类别的成员。

本领域技术人员可使用公知技术确定本文中所示的多肽的合适变体。本领域技术人员可通过靶向被认为对活性不重要的区域来鉴定可被改变而不破坏活性的分子的合适区域。本领域技术人员还将能够鉴定在类似蛋白质或多肽中保守的氨基酸残基和分子部分。在另一些方面中，对生物活性或对结构可能重要的区域可进行保守氨基酸替换而不显著改变生物活性或者对蛋白质或多肽结构没有不利影响。

在进行这样的改变时，可考虑氨基酸的亲水指数(hydropathic index)。蛋白质的亲水特性是通过为每个氨基酸分配一个数值(“亲水指数”)并随后沿肽链重复地平均化这些值来计算的。每个氨基酸已基于其疏水性和电荷特性分配了一个值。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用的生物学功能中的重要性在本领域中是公知的(Kyte et al.,J.Mol.Biol.157:105-131(1982))。公认的是，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质或多肽的二级结构，其转而限定了该蛋白质或多肽与其他分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。还已知某些氨基酸可替换具有类似亲水指数或评分的其他氨基酸，并且仍保留类似的生物活性。在某些方面中，在基于亲水指数进行改变时，包括其亲水指数在±2内的氨基酸的替换。在本发明的一些方面中，包括在±1内的那些，并且在本发明的另一些方面中，包括在±0.5内的那些。

本领域中还理解的是，可基于亲水性有效地进行类似氨基酸的替换。美国专利4,554,101(通过引用并入本文)声称：蛋白质的最大局部平均亲水性(如受其邻近氨基酸的亲水性控制)与该蛋白质的生物学特性相关。在某些方面中，蛋白质的最大局部平均亲水性(如受其邻近氨基酸的亲水性控制)与其免疫原性和抗原结合相关，即，作为该蛋白质的生物学特性。已将以下亲水值分配给这些氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；和色氨酸(-3.4)。在某些方面中，在基于类似的亲水值进行改变时，包括其亲水值在±2内的氨基酸的替换，在另一些方面中，包括在±1内的那些，并且在另一些方面中，包括在±0.5内的那些。在一些情况下，也可基于亲水性从一级氨基酸序列中鉴定表位。这些区域也被称为“表位核心区”。应当理解，氨基酸可替换具有类似亲水值的另一氨基酸并仍产生生物学上等同和免疫学上等同的蛋白质。

另外，本领域技术人员可回顾在类似多肽或蛋白质中鉴定对活性或结构重要的残基的结构-功能研究。鉴于这样的比较，可预测蛋白质中氨基酸残基的重要性，所述氨基酸残基对应于类似蛋白质中对活性或结构重要的氨基酸残基。本领域技术人员可为这样的经预测的重要氨基酸残基选择化学上类似的氨基酸替换。

本领域技术人员还可分析与类似蛋白质或多肽中的结构相关的三维结构和氨基酸序列。鉴于这样的信息，本领域技术人员可预测抗体的氨基酸残基相对于其三维结构的排列。本领域技术人员可选择不对被预测为在蛋白质表面上的氨基酸残基进行改变，因为这样的残基可能涉及与其他分子的重要相互作用。此外，本领域技术人员可产生在每个期望的氨基酸残基处包含单个氨基酸替换的测试变体。然后可使用针对结合和/或活性的标准测定筛选这些变体，从而获得从这样的常规实验中收集的信息，这可使本领域技术人员确定这样的氨基酸位置：在这里应避免单独或与其他突变组合的另外的替换。可用于确定二级结构的多种工具可在万维网在expasy.org/proteomics/protein structure上找到。

在本发明的一些方面中，进行这样的氨基酸替换，所述氨基酸替换：(1)降低对蛋白水解的易感性，(2)降低对氧化的易感性，(3)改变对形成蛋白质复合物的结合亲和力，(4)改变配体或抗原结合亲和力，和/或者(5)赋予或修饰这样的多肽的其他物理化学或功能特性。例如，可在天然存在的序列中进行单个或多个氨基酸替换(在某些方面中，保守氨基酸替换)。可在位于形成分子间接触的结构域之外的抗体部分中进行替换。在这样的方面中，可使用不显著改变蛋白质或多肽的结构特征的保守氨基酸替换(例如，一个或更多个不破坏表征天然抗体的二级结构的替代氨基酸)。

III.核酸

在某些方面中，核酸序列可以以多种情况存在，例如：编码抗体的一条或两条链，或其片段、衍生物、突变蛋白或变体的并入序列或重组多核苷酸的分离区段和重组载体，足以用作杂交探针的多核苷酸，用于鉴定、分析、突变或扩增编码多肽的多核苷酸的PCR引物或测序引物，用于抑制多核苷酸表达的反义核酸，以及本文前述的互补序列。还提供了编码本文提供的某些抗体所针对的表位的核酸。还提供了编码包含这些肽的融合蛋白的核酸。核酸可以是单链或双链的，并且可包含RNA和/或DNA核苷酸及其人工变体(例如，肽核酸)。

术语“多核苷酸”是指重组的或已从总基因组核酸中分离的核酸分子。术语“多核苷酸”中包括寡核苷酸(长度为100个残基或更少的核酸)，重组载体，包括例如质粒、黏粒、噬菌体、病毒等。在某些方面中，多核苷酸包括基本上从其天然存在的基因或蛋白质编码序列中分离出来的调节序列。多核苷酸可以是单链(编码链或反义链)或双链的，并且可以是RNA、DNA(基因组、cDNA或合成的)、其类似物，或其组合。另外的编码或非编码序列可以但不一定存在于多核苷酸内。

在此方面中，术语“基因”、“多核苷酸”或“核酸”用于指编码蛋白质、多肽或肽的核酸(包括合适的转录、翻译后修饰或定位所需的任何序列)。如本领域技术人员将理解的，该术语涵盖表达或可适合于表达蛋白质、多肽、结构域、肽、融合蛋白和突变体的基因组序列、表达盒、cDNA序列和更小的经改造核酸区段。编码多肽的全部或一部分的核酸可包含编码这样的多肽的全部或一部分的连续核酸序列。还考虑了可通过包含具有轻微不同的核酸序列的变化，但是仍编码相同的或基本上相似的蛋白质的核酸来编码特定的多肽。

在某些方面中，存在与本文公开的序列具有基本同一性的多核苷酸变体；使用本文中所述的方法(例如，使用标准参数的BLAST分析)与本文中提供的多核苷酸序列相比，包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性(包括其间的所有值和范围)的那些序列。在某些方面中，分离的多核苷酸将包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽在序列的整个长度上与本文中所述的氨基酸序列具有至少90％，优选95％及以上的同一性；或与所述分离的多核苷酸互补的核苷酸序列。

无论编码序列自身的长度如何，核酸区段可与另一些核酸序列(例如启动子、多腺苷酸化信号、另外的限制性酶位点、多克隆位点、另一些编码区段等)组合，使得其总长度可以有很大变化。核酸可以是任何长度的。它们的长度可以是例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1000、1500、3000、5000个或更多个核苷酸，和/或者可包含一个或更多个另外的序列(例如调节序列)，和/或者是更大的核酸(例如载体)的一部分。因此考虑了可使用几乎任何长度的核酸片段，其总长度优选受制备的方便性和在预期的重组核酸方案中的用途的限制。在一些情况下，核酸序列可与另外的异源编码序列一起编码多肽序列，例如以允许纯化多肽、转运、分泌、翻译后修饰或者治疗益处例如靶向或效力。如以上所讨论，可将标签或其他异源多肽添加至经修饰的多肽编码序列，其中“异源”是指与经修饰的多肽不同的多肽。

A.杂交

核酸在特定杂交条件下与其他核酸杂交。用于杂交核酸的方法是本领域公知的。参见例如，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。如本文中所限定的，适度严格的杂交条件使用：包含以下的预洗涤溶液：5×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.5％ SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)；杂交缓冲液：约50％甲酰胺、6×SSC；以及55℃的杂交温度(或其他类似的杂交溶液，例如包含约50％甲酰胺的杂交溶液，杂交温度为42℃)，以及在0.5×SSC、0.1％ SDS中60℃的洗涤条件。严格的杂交条件在6×SSC中在45℃下进行杂交，然后在0.1×SSC、0.2％ SDS中在68℃下进行一次或更多次洗涤。此外，本领域的技术人员可操作杂交和/或洗涤条件来提高或降低杂交的严格性，使得包含与彼此具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列的核酸通常维持与彼此杂交。

影响杂交条件选择的参数和设计合适条件的指南由以下示出：例如Sambrook,Fritsch,and Maniatis(Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,第9和11章(1989)；Current Protocols inMolecular Biology,Ausubel et al.,eds.,John Wiley and Sons,Inc.,第2.10和6.3至6.4节(1995)，这两篇文献出于所有目的通过引用整体并入本文)并且可由本领域普通技术人员基于例如DNA的长度和/或碱基组成容易地确定。

B.突变

可通过突变向核酸中引入变化，从而导致其编码的多肽(例如，抗体或抗体衍生物)的氨基酸序列的变化。可使用本领域已知的任何技术引入突变。在一个方面中，使用例如定点诱变方案改变一个或更多个特定的氨基酸残基。在另一个方面中，使用例如随机诱变方案改变一个或更多个随机选择的残基。无论如何制备，突变体多肽都可被表达并筛选出期望的特性。

可在核酸中引入突变，而不显著改变其编码的多肽的生物活性。例如，可进行核苷酸替换，导致非必需氨基酸残基处的氨基酸替换。或者，可在核酸中引入一个或更多个突变，其选择性地改变该核酸编码的多肽的生物活性。参见例如Romain Studer et al.,Biochem.J.449:581-594(2013)。例如，突变可定量或定性地改变生物活性。定量改变的实例包括提高、降低或消除活性。定性改变的实例包括改变抗体的抗原特异性。

C.探针

在另一方面中，核酸分子适合用作检测核酸序列的引物或杂交探针。核酸分子可仅包含编码全长多肽的核酸序列的一部分，例如，可用作探针或引物的片段或编码给定多肽的活性部分的片段。

在另一方面中，核酸分子可用作特定抗体序列的探针或PCR引物。例如，核酸分子探针可用于诊断方法中，或者核酸分子PCR引物可用于扩增DNA区域，所述DNA区域尤其可用于分离用于产生抗体可变结构域的核酸序列。参见例如，Gaily Kivi et al.,BMCBiotechnol.16:2(2016)。在一个优选的方面中，核酸分子是寡核苷酸。在一个更优选的方面中，寡核苷酸来自目的抗体或TCR的重链和轻链或α链和β链的高度可变区。在一个甚至更优选的方面中，寡核苷酸编码CDR或TCR中一个或更多个的全部或部分。

基于所期望核酸序列的探针可用于检测核酸或类似核酸，例如编码目的多肽的转录物。探针可包含标记基团，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。这样的探针可用于鉴定表达多肽的细胞。

IV.多肽表达

在一些方面中，存在编码本公开内容的多肽或肽的核酸分子(例如TCR基因)。这些可通过本领域已知的方法产生，例如从已免疫接种和分离的小鼠的B细胞中分离，噬菌体展示，在任何合适的重组表达系统中表达并允许组装以形成抗体分子，或者通过重组方法产生。

A.表达

核酸分子可用于表达大量多肽。如果核酸分子来源于非人、非转基因动物，则核酸分子可用于TCR基因的人源化。

B.载体

在一些方面中，预期的是包含编码所期望序列的多肽或其部分(例如，含有一个或更多个CDR或一个或更多个可变区结构域的片段)的核酸分子的表达载体。包含核酸分子的表达载体可编码重链、轻链、α链、β链或其抗原结合部分。在一些方面中，包含核酸分子的表达载体可编码融合蛋白、经修饰的抗体、抗体片段及其探针。除了控制转录和翻译的控制序列之外，载体和表达载体还可包含用于其他功能的核酸序列。

为了表达本公开内容的多肽或肽，将编码所述多肽或肽的DNA插入表达载体中，使得基因区域与转录和翻译控制序列有效连接。在一些方面中，对编码功能完整的人CH或CL免疫球蛋白序列或者TCR序列(具有适当限制性位点)的载体进行改造，使得任何可变区序列都可容易地插入和表达。在一些方面中，对编码功能完整的人TCRα或TCRβ序列(具有适当限制性位点)的载体进行改造，使得任何可变序列或CDR1、CDR2和/或CDR3可容易地插入和表达。通常，在任何宿主细胞中使用的表达载体包含用于质粒或病毒维持以及用于外源核苷酸序列的克隆和表达的序列。统称为“侧翼序列”的这样的序列通常包含以下有效连接的核苷酸序列中的一种或更多种：启动子、一种或更多种增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完整内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、多腺苷酸化序列、用于插入编码待表达多肽的核酸的多接头区、以及选择标记元件。这样的序列和使用它们的方法是本领域中公知的。

C.表达系统

存在许多表达系统，其包含以上所讨论表达载体的至少一部分或全部。基于原核生物和/或真核生物的系统可用于与一个方面一起使用以产生核酸序列或其同源多肽、蛋白质和肽。商业上和广泛可用的系统包括但不限于细菌、哺乳动物、酵母和昆虫细胞系统。不同的宿主细胞具有用于蛋白质的翻译后加工和修饰的特征性和特定机制。可选择适当的细胞系或宿主系统以确保所表达的外来蛋白质的正确修饰和加工。本领域技术人员能够使用合适的表达系统来表达载体以产生核酸序列或其同源多肽、蛋白质或肽。

V.基因转移方法

用于核酸递送以实现组合物表达的合适方法被认为实际上包括可将核酸(例如，DNA，包括病毒和非病毒载体)引入细胞、组织或生物体中的任何方法，如本文中所述或如本领域普通技术人员已知的。这样的方法包括但不限于直接递送DNA，例如通过注射(美国专利5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，各自通过引用并入本文)，包括显微注射(Harland and Weintraub,1985；美国专利5,789,215，通过引用并入本文)；通过电穿孔(美国专利No.5,384,253，通过引用并入本文)；通过磷酸钙沉淀(Graham and Van Der Eb,1973；Chen and Okayama,1987；Rippe et al.,1990)；通过使用DEAE-葡聚糖，随后使用聚乙二醇(Gopal,1985)；通过直接声加载(Fechheimer et al.,1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau and Sene,1982；Fraley et al.,1979；Nicolau et al.,1987；Wong et al.,1980；Kaneda etal.,1989；Kato et al.,1991)；通过微粒轰击(PCT申请No.WO 94/09699和95/06128；美国专利5,610,042；5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，并且各自通过引用并入本文)；通过与碳化硅纤维一起搅拌(Kaeppler et al.,1990；美国专利5,302,523和5,464,765，各自通过引用并入本文)；通过土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化(美国专利5,591,616和5,563,055，各自通过引用并入本文)；或者通过PEG介导的原生质体的转化(Omirulleh et al.,1993；美国专利4,684,611和4,952,500，各自通过引用并入本文)；通过干燥/抑制介导的DNA摄取(Potrykus et al.,1985)。另一些方法包括病毒转导，例如通过慢病毒或逆转录病毒转导的基因转移。

A.宿主细胞

在另一个方面中，预期使用已导入重组表达载体的宿主细胞。抗体可在多种细胞类型中表达。可根据本领域已知的多种方法将编码抗体的表达构建体转染到细胞中。可通过常规转化或转染技术将载体DNA导入原核或真核细胞中。一些载体可采用允许其在原核和真核细胞二者中均复制和/或表达的控制序列。在某些方面中，抗体表达构建体可置于与T细胞活化相关的启动子的控制下，例如受NFAT-1或NF-κB控制的，NFAT-1或NF-κB这两者都是在T细胞活化时可被激活的转录因子。对抗体表达的控制使T细胞(例如肿瘤靶向T细胞)能够感知其周围环境，并对T细胞本身和周围内源性免疫细胞二者中的细胞因子信号传导进行实时调节。本领域技术人员将理解在其下孵育宿主细胞以维持它们并允许载体复制的条件。还理解和知晓的是允许大规模产生载体以及产生由载体编码的核酸及其同源多肽、蛋白质或肽的技术和条件。

为了稳定转染哺乳动物细胞，已知根据所用的表达载体和转染技术，只有一小部分细胞可将外源DNA整合到其基因组中。为了鉴定和选择这些整合体，通常将选择标记(例如，用于抗生素抗性)与目的基因一起引入宿主细胞中。用引入的核酸稳定转染的细胞可通过药物选择(例如，已并入选择标记基因的细胞将存活，而其他细胞将死亡)以及本领域已知的其他方法鉴定。

B.分离

编码抗体或TCR的整条重链、轻链、α链和β链或其可变区中的一者或两者的核酸分子可从产生抗体的任何来源获得。分离编码抗体的mRNA的方法是本领域公知的。参见例如上文的Sambrook et al.。人重链和轻链恒定区基因的序列也是本领域已知的。参见例如上文的Kabat et al.,1991。然后，编码全长重链和/或轻链的核酸分子可在引入了它们的细胞中表达，并分离抗体。

VI.另外的治疗

A.免疫治疗

在一些方面中，所述方法包括施用另外的治疗。在一些方面中，另外的治疗包含癌症免疫治疗。癌症免疫治疗(有时称为免疫肿瘤学，缩写IO)是利用免疫系统来治疗癌症。可将免疫治疗分类为主动的、被动的或混合的(主动的和被动的)。这些方法运用了以下事实：癌细胞通常在其表面具有可被免疫系统检测到的分子，称为肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)；它们通常是蛋白质或其他大分子(例如碳水化合物)。主动免疫治疗通过靶向TAA引导免疫系统攻击肿瘤细胞。被动免疫治疗增强现有的抗肿瘤应答，并包括使用单克隆抗体、淋巴细胞和细胞因子。免疫治疗是本领域中已知的，并且一些如下所述。

1.检查点抑制剂和组合治疗

本公开内容的一些方面可包括免疫检查点抑制剂的施用，这将在下面进一步描述。

a.PD-1、PDL1和PDL2抑制剂

PD-1可在其中T细胞遇到感染或肿瘤的肿瘤微环境中发挥作用。活化的T细胞上调PD-1并继续在外周组织中将其表达。细胞因子(例如IFN-γ)诱导上皮细胞和肿瘤细胞上PDL1的表达。PDL2在巨噬细胞和树突细胞上表达。PD-1的主要作用是在免疫应答期间限制外周中效应T细胞的活性并防止对组织的过度损伤。本公开内容的抑制剂可阻断PD-1和/或PDL1活性的一种或更多种功能。

“PD-1”的替代名称包括CD279和SLEB2。“PDL1”的替代名称包括B7-H1、B7-4、CD274和B7-H。“PDL2”的替代名称包括B7-DC、Btdc和CD273。在一些方面中，PD-1、PDL1和PDL2是人PD-1、PDL1和PDL2。

在一些方面中，PD-1抑制剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在一个具体方面中，PD-1配体结合配偶体是PDL1和/或PDL2。在另一个方面中，PDL1抑制剂是抑制PDL1与其结合配偶体结合的分子。在一个具体方面中，PDL1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。在另一个方面中，PDL2抑制剂是抑制PDL2与其结合配偶体结合的分子。在一个具体方面中，PDL2结合配偶体是PD-1。抑制剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。示例性抗体描述于美国专利No.8,735,553、8,354,509和8,008,449，其全部通过引用并入本文。用于本文中提供的方法和组合物中的其他PD-1抑制剂是本领域已知的，例如描述于美国专利申请No.US2014/0294898、US2014/022021和US2011/0008369中，其全部通过引用并入本文。

在一些方面中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些方面中，抗PD-1抗体选自：纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)和皮地利珠单抗(pidilizumab)。在一些方面中，PD-1抑制剂是免疫黏附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PDL1或PDL2的胞外部分或PD-1结合部分的免疫黏附素)。在一些方面中，PDL1抑制剂包含AMP-224。纳武单抗(也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和)是描述于WO2006/121168中的抗PD-1抗体。派姆单抗(也称为MK-3475、Merck 3475、兰洛利珠单抗(lambrolizumab)、和SCH-900475)是描述于WO2009/114335中的抗PD-1抗体。皮地利珠单抗(也称为CT-011、hBAT或hBAT-1)是描述于WO2009/101611中的抗PD-1抗体。AMP-224(也称为B7-DCIg)是描述于WO2010/027827和WO2011/066342中的PDL2-Fc融合可溶性受体。另外的PD-1抑制剂包括MEDI0680，也称为AMP-514和REGN2810。

在一些方面中，免疫检查点抑制剂是PDL1抑制剂，例如度伐单抗(Durvalumab)，也称为MEDI4736；阿特珠单抗(atezolizumab)，也称为MPDL3280A；阿维单抗(avelumab)，也称为MSB00010118C、MDX-1105、BMS-936559；或其组合。在某些方面中，免疫检查点抑制剂是PDL2抑制剂，例如rHIgM12B7。

在一些方面中，抑制剂包含纳武单抗、派姆单抗或皮地利珠单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个方面中，抑制剂包含纳武单抗、派姆单抗或皮地利珠单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及纳武单抗、派姆单抗或皮地利珠单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个方面中，抗体与上述抗体竞争PD-1、PDL1或PDL2上相同表位的结合和/或与之结合。在另一个方面中，抗体与上述抗体具有至少约70、75、80、85、90、95、97或99％(或其中可推导出的任何范围)的可变区氨基酸序列同一性。

b.CTLA-4、B7-1和B7-2

在本文中提供的方法中可靶向的另一免疫检查点是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列具有Genbank登录号L15006。CTLA-4存在于T细胞表面，并且当与抗原呈递细胞表面上的B7-1(CD80)或B7-2(CD86)结合时充当“关闭”开关。CTLA4是免疫球蛋白超家族的成员，其在辅助性T细胞的表面上表达并向T细胞传递抑制信号。CTLA4与T细胞共刺激蛋白CD28类似，并且这两个分子均与抗原呈递细胞上的B7-1和B7-2结合。CTLA-4向T细胞传递抑制信号，而CD28传递刺激信号。胞内CTLA-4也存在于调节性T细胞中并且对其功能可能是重要的。通过T细胞受体和CD28的T细胞活化导致CTLA-4(B7分子的抑制性受体)的表达提高。本公开内容的抑制剂可阻断CTLA-4、B7-1和/或B7-2活性的一种或更多种功能。在一些方面中，抑制剂阻断CTLA-4与B7-1相互作用。在一些方面中，抑制剂阻断CTLA-4与B7-2相互作用。

在一些方面中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。

适用于本公开内容的方法中的抗人CTLA-4抗体(或来源于其的VH和/或VL结构域)可使用本领域中公知的方法来产生。或者，可使用本领域中公认的抗CTLA-4抗体。例如，公开于以下中的抗CTLA-4抗体可用于本文中公开的方法中：US 8,119,129、WO 01/14424、WO98/42752；WO 00/37504(CP675,206，也称为曲美木单抗(tremelimumab)，先前称为ticilimumab)，美国专利No.6,207,156；Hurwitz et al.,1998。每个上述出版物的教导在此通过引用并入。也可使用与这些本领域公认的抗体中任一者竞争与CTLA-4结合的抗体。例如，人源化CTLA-4抗体描述于国际专利申请No.WO2001/014424、WO2000/037504和美国专利No.8,017,114中；所有均通过引用并入本文。

在本公开内容的方法和组合物中可用作检查点抑制剂的另外的抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(ipilimumab)(也称为10D1、MDX-010、MDX-101和)或者其抗原结合片段和变体(参见，例如WO01/14424)。

在一些方面中，抑制剂包含曲美木单抗或伊匹单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个方面中，抑制剂包含曲美木单抗或伊匹单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及曲美木单抗或伊匹单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个方面中，抗体与上述抗体竞争PD-1、B7-1或B7-2上相同表位的结合和/或与之结合。在另一个方面中，抗体与上述抗体具有至少约70、75、80、85、90、95、97或99％(或其中可推导出的任何范围)的可变区氨基酸序列同一性。

2.共刺激分子的抑制

在一些方面中，免疫治疗包含共刺激分子的抑制剂。在一些方面中，抑制剂包括以下的抑制剂：B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD28、ICOS、OX40(TNFRSF4)、4-1BB(CD137；TNFRSF9)、CD40L(CD40LG)、GITR(TNFRSF18)，及其组合。抑制剂包括抑制性抗体、多肽、化合物和核酸。

3.树突细胞治疗

树突细胞治疗通过使树突细胞将肿瘤抗原呈递给淋巴细胞来引发抗肿瘤应答，这使它们活化，引发它们杀伤呈递抗原的其他细胞。树突细胞是哺乳动物免疫系统中的抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)。在癌症治疗中，它们有助于靶向癌症抗原。基于树突细胞的细胞癌症治疗的一个实例是sipuleucel-T。

诱导树突细胞呈递肿瘤抗原的一种方法是通过用自体肿瘤裂解物或短肽(对应于癌细胞上蛋白质抗原的小部分蛋白质)进行疫苗接种。这些肽通常以与佐剂(高免疫原性物质)组合来给予，以提高免疫和抗肿瘤应答。其他佐剂包括吸引和/或活化树突细胞的蛋白质或其他化学物质，例如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophagecolony-stimulating factor，GM-CSF)。

树突细胞也可通过使肿瘤细胞表达GM-CSF在体内被活化。这可通过对肿瘤细胞进行遗传改造以产生GM-CSF来实现，或通过用表达GM-CSF的溶瘤病毒感染肿瘤细胞来实现。

另一策略是从患者的血液中去除树突细胞并在身体外部活化它们。树突细胞在存在肿瘤抗原的情况下被活化，肿瘤抗原可以是单个肿瘤特异性肽/蛋白质或肿瘤细胞裂解物(分解肿瘤细胞的溶液)。这些细胞(与可选的佐剂)被输注并引发免疫应答。

树突细胞治疗包括使用与树突细胞表面上的受体结合的抗体。抗原可添加至抗体，并且可诱导树突细胞成熟并提供对肿瘤的免疫。树突细胞受体例如TLR3、TLR7、TLR8或CD40已被用作抗体靶标。

4.CAR-T细胞治疗

嵌合抗原受体(CAR，也称为嵌合免疫受体、嵌合T细胞受体或人工T细胞受体)是经改造受体，其将新的特异性与免疫细胞组合以靶向癌细胞。通常，这些受体将单克隆抗体的特异性接枝到T细胞上。该受体被称为嵌合的，因为其由来自不同来源的部分融合。CAR-T细胞治疗是指使用这样的经转化细胞以进行癌症治疗的治疗。

CAR-T细胞设计的基本原理涉及组合了抗原结合和T细胞活化功能的重组受体。CAR-T细胞的一般前提是人工产生靶向癌细胞上存在的标志物的T细胞。科学家可从人中取出T细胞，对其进行遗传改变，并将其放回患者中，以使其攻击癌细胞。一旦T细胞被改造变成CAR-T细胞，其就可充当“活跃的药物”。CAR-T细胞在胞外配体识别结构域与胞内信号传导分子之间建立联系，进而活化T细胞。胞外配体识别结构域通常是单链可变片段(scFv)。CAR-T细胞治疗安全性的一个重要方面是如何确保仅靶向癌性肿瘤细胞，而不靶向正常细胞。CAR-T细胞的特异性由对所靶向的分子的选择决定。

示例性CAR-T治疗包括Tisagenlecleucel(Kymriah)和Axicabtagene ciloleucel(Yescarta)。在一些方面中，CAR-T治疗靶向CD19。

5.细胞因子治疗

细胞因子是由在肿瘤内存在的许多类型的细胞产生的蛋白质。它们可调节免疫应答。肿瘤经常运用它们来使其生长并降低免疫应答。这些免疫调节作用使得它们被用作引发免疫应答的药物。两种常用的细胞因子是干扰素和白介素。

干扰素由免疫系统产生。它们通常参与抗病毒应答，但对于癌症也有用途。它们分为三组：I型(IFNα和IFNβ)、II型(IFNγ)和III型(IFNλ)。

白介素具有一系列免疫系统作用。IL-2是示例性的白介素细胞因子治疗。

6.过继性T细胞治疗

过继性T细胞治疗是通过输注T细胞(过继性细胞转移)的被动免疫接种的一种形式。它们存在于血液和组织中，并且通常当它们发现外来病原体时会活化。具体地，当T细胞的表面受体遇到在其表面抗原上显示出部分外来蛋白质的细胞时，它们就会活化。这些可以是感染的细胞，或是抗原呈递细胞(APC)。它们存在于正常组织中和肿瘤组织中，在那里它们被称为肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)。它们在存在APC(例如呈递肿瘤抗原的树突细胞)的情况下被活化。尽管这些细胞可攻击肿瘤，但肿瘤内的环境是高度免疫抑制的，这阻止免疫介导的肿瘤死亡。

已经开发了产生和获得靶向肿瘤的T细胞的多种方式。对肿瘤抗原具有特异性的T细胞可从肿瘤样品(TIL)中除去，或从血液过滤。随后的活化和培养离体进行，并将所得物进行再输注。活化可通过基因治疗或通过将T细胞暴露于肿瘤抗原来进行。

B.化学治疗

在一些方面中，另外的治疗包含化学治疗。合适的化学治疗剂类别包括：(a)烷化剂，例如氮芥类(例如，二氯甲基二乙胺、环磷酰胺(cylophosphamide)、异环磷酰胺、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺类(例如，六甲基三聚氰胺、噻替派)、烷基磺酸酯类(例如白消安(busulfan))、亚硝基脲类(例如，卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、氯脲菌素(chlorozoticin)、链脲菌素)和三嗪类(例如，达卡巴嗪(dicarbazine))；(b)抗代谢物，例如叶酸类似物(例如，甲氨蝶呤)、嘧啶类似物(例如，5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、氮尿苷)以及嘌呤类似物和相关物质(例如，6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、喷司他丁(pentostatin))；(c)天然产物，例如长春花生物碱(例如，长春花碱、长春新碱)、表鬼臼毒素(epipodophylotoxin)(例如，依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide))、抗生素(例如，放线菌素D、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、博来霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicamycin)和米托蒽醌(mitoxanthrone))、酶(例如，L-天冬酰胺酶)，和生物响应调节剂(例如，干扰素-α)；以及(d)其他药剂，例如铂配位复合物(例如，顺铂、卡铂)、经替换脲(例如，羟基脲)、甲基肼(methylhydiazine)衍生物(例如，丙卡巴肼(procarbazine))，和肾上腺皮质抑制剂(adreocortical suppressant)(例如，泰素(Taxol)和米托坦(mitotane))。在一些方面中，顺铂是特别合适的化学治疗剂。

顺铂已被广泛用于治疗癌症，例如如转移性睾丸癌或卵巢癌、晚期膀胱癌、头颈癌、宫颈癌、肺癌或其他肿瘤。顺铂不经口吸收并因此必须通过其他途径例如如静脉内、皮下、瘤内或腹膜内注射来递送。顺铂可单独使用或与其他药剂组合使用，在某些方面中，预期在临床应用中使用的有效剂量包括：约15mg/m2至约20mg/m2持续每三周5天，总共三个疗程。在一些方面中，与包含与编码治疗性多肽的多核苷酸可操作地连接的Egr-1启动子的构建体联合递送至细胞和/或对象的顺铂的量少于单独使用顺铂时将递送的量。

其他合适的化学治疗剂包括抗微管剂，例如紫杉醇(“泰素”)和盐酸多柔比星(“多柔比星”)。确定通过腺病毒载体递送的Egr-1启动子/TNFα构建体与多柔比星的组合在克服对化学治疗和/或TNF-α的抗性方面是有效的，这表明构建体与多柔比星的组合治疗克服了对多柔比星和TNF-α二者的抗性。

多柔比星吸收差，并且优选静脉内施用。在某些方面中，对于成人，合适的静脉内剂量包括：约60mg/m2至约75mg/m2，以约21天的间隔；或者约25mg/m2至约30mg/m2，以约3周至约4周的间隔，以连续2或3天中的每一者重复；或者约20mg/m2，每周一次。在年长患者中，当存在由先前化学治疗或肿瘤性骨髓浸润(neoplastic marrow invasion)导致的先前骨髓抑制或者当药物与其他骨髓生成抑制药物组合时，应使用最低剂量。

氮芥类是可用于本公开内容方法中的另一合适的化学治疗剂。氮芥类可包括但不限于二氯甲基二乙胺(HN2)、环磷酰胺和/或异环磷酰胺、美法仑(L-溶肉瘤素)和苯丁酸氮芥。环磷酰胺(可从Mead Johnson获得，而可从Adria获得)是另一合适的化学治疗剂。对于成人，合适的经口剂量包括：例如约1mg/kg/天至约5mg/kg/天，静脉内剂量包括：例如，最初在约2天至约5天的时间内约40mg/kg至约50mg/kg的分剂量，或者约每7天至约10天约10mg/kg至约15mg/kg，或者每周两次约3mg/kg至约5mg/kg，或者约1.5mg/kg/天至约3mg/kg/天。由于不利的胃肠道作用，因此优选静脉内途径。药物有时也通过渗透或进入体腔内而肌内施用。

另外的合适的化学治疗剂包括嘧啶类似物，例如阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside))、5-氟尿嘧啶(氟尿嘧啶；5-FU)和氟尿苷(氟脱氧尿苷；FudR)。5-FU可以以约7.5至约1000mg/m2之间的任何剂量施用于对象。此外，5-FU给药方案可以是多种时间段，例如长至六周，或由本公开内容所属领域的普通技术人员确定。

另一种合适的化学治疗剂吉西他滨(gemcitabine)二磷酸(EliLilly&Co.，“吉西他滨”)被推荐用于治疗晚期和转移性胰腺癌，并且因此也将可用于本公开内容以用于这些癌症。

递送至患者的化学治疗剂的量可以是可变的。在一个合适的方面中，当化学治疗与构建体一起施用时，化学治疗剂可以以有效地在宿主中引起癌症的停止或消退的量来施用。在另一些方面中，化学治疗剂可以以是化学治疗剂的化学治疗有效剂量的1/2至1/10,000倍少之间的任何量来施用。例如，化学治疗剂可以以是化学治疗剂的化学治疗有效剂量的约1/20倍少、约1/500倍少或甚至约1/5000倍少的量来施用。本公开内容的化学治疗剂可在体内与构建体组合测试用于期望的治疗活性，以及用于确定有效剂量。例如，这样的化合物在于人中测试之前可在合适的动物模型系统中测试，所述动物模型系统包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔等。如实施例中所述，也可使用体外测试来确定合适的组合和剂量。

C.放射治疗

在一些方面中，另外的治疗或先前的治疗包括辐射，例如电离辐射。本文中使用的“电离辐射”意指包含通过核相互作用具有足够能量或可产生足够能量以产生电离(电子的获得或损失)的粒子或光子的辐射。一个示例性和优选的电离辐射是x辐射。用于将x辐射递送至靶组织或细胞的手段是本领域中公知的。

D.手术

在一些方面中，另外的治疗包括手术。约60％患有癌症的人将经历一些类型的手术，其包括预防性、诊断性或阶段性、治愈性和姑息性手术。治愈性手术包括切除术，其中将全部或部分的癌性组织物理地去除、切除和/或破坏，并且可与其他治疗，例如本发明的一些方面的治疗、化学治疗、放射治疗、激素治疗、基因治疗、免疫治疗和/或替代治疗联合使用。肿瘤切除术是指物理去除至少部分的肿瘤。除肿瘤切除术之外，通过手术的治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微控制的手术(莫氏手术(Mohs’surgery))。

在切除部分或全部癌性细胞、组织或肿瘤之后，可在体内形成腔。治疗可通过灌注、直接注射或在该区域局部施加另外的抗癌治疗来完成。这样的治疗可例如每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周，或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月(或其中可推导出的任何范围)重复进行。这些治疗也可具有多种剂量。

VII.检测和治疗剂

在本公开内容的一些方面中，对本公开内容的TCR或融合蛋白进行可检测或治疗性标记将是有用的。用于使多肽与这些试剂缀合的方法是本领域已知的。仅出于举例说明的目的，多肽可以用例如放射性原子、发色团、荧光团等的可检测部分标记。这样的经标记多肽在体内、或者在分离的受试样品中、或者在本文中所述方法中可用于诊断技术。

本文中使用的术语“标记”是指直接或间接可检测的化合物或组合物，其与待检测的组合物(例如，多核苷酸或蛋白质，例如抗体)直接或间接缀合，从而产生“经标记”组合物。所述术语还包括与多核苷酸缀合的序列，所述多核苷酸在插入序列(例如绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)等)表达时提供信号。所述标记可以是自身可检测的(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标记的情况下，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学变化。所述标记可适用于小规模检测，或者更适用于高通量筛选。因此，合适的标记包括但不限于放射性同位素、荧光色素、化学发光化合物、染料和蛋白质，包括酶。标记可仅进行检测或可被量化。仅进行检测的响应通常包括其存在仅被确认的响应，而进行量化的响应通常包括具有可量化(例如，数值可报告)值的响应，例如强度、偏振和/或其他特性。在发光或荧光测定中，可直接使用与实际参与结合的测定组分相关的发光团或荧光团，或者间接使用与另外的(例如，报道物或指示剂)组分相关的发光团或荧光团来产生可检测的响应。

产生信号的发光标记的一些实例包括但不限于生物发光和化学发光。可检测的发光响应通常包括发光信号的变化或出现。用于发光标记测定组分的合适方法和发光团是本领域已知的，并描述于例如Haugland,Richard P.(1996)Handbook of FluorescentProbes and Research Chemicals(第6版)中。发光探针的一些实例包括但不限于水母发光蛋白和萤光素酶。

合适的荧光标记的一些实例包括但不限于荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、赤藓红、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀石绿(Malacite green)、茋、萤虫黄、CascadeBlue.TM.和德克萨斯红(Texas Red)。另一些合适的光学染料描述于Haugland,Richard P.(1996)Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(第6版)中。

在另一方面中，荧光标记被官能化以促进与存在于细胞或组织中或者存在于细胞或组织表面上的细胞组分例如细胞表面标志物的共价连接。合适的官能团包括但不限于异硫氰酸盐/酯基团、氨基、卤乙酰基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺酯和磺酰卤，所有这些都可用于将荧光标记连接至第二分子。荧光标记官能团的选择将取决于与接头、试剂、标志物或第二标记试剂的连接位点。

荧光标记可直接连接至细胞组分或化合物，或者替代地，可通过接头连接。用于将荧光标记间接连接至中间体的合适结合对包括但不限于抗原/多肽，例如罗丹明/抗罗丹明、生物素/亲和素、和生物素/链霉亲和素。

多肽与低分子量半抗原的偶联可提高测定中抗体的灵敏度。然后可通过第二反应特异性检测半抗原。例如，通常使用半抗原例如与亲和素反应的生物素，或可与特异性抗半抗原多肽反应的二硝基苯酚、吡哆醛和荧光素。参见，上文的Harlow and Lane(1988)。

可使用大量可用方法中的任一种，将缀合剂直接或间接连接至多肽。例如，可使用交联剂例如N-琥珀酰基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)通过二硫键形成，或者通过抗体的Fc区中的碳水化合物部分，将试剂连接至还原的抗体组分的铰链区(Yu et al.,1994；Upeslacis et al.,1995；Price,1995)。

使试剂与多肽缀合的技术是公知的(Amon et al.,1985；Hellstrom et al.,1987；Thorpe,1985；Baldwin et al.,1985；Thorpe et al.,1982)。

本公开内容的多肽或其抗原结合区可与另外的功能性分子连接，所述另外的功能性分子例如配体、细胞毒性分子、化学治疗剂或被描述为另外的治疗剂的其他药剂。

VIII.细胞的培养和配制

在一些具体方面中，本公开内容的细胞可被特别配制和/或者它们可在特定培养基中培养。细胞可以以适于递送至接受体而无有害作用的方式配制。

在某些方面中，培养基可使用用于培养动物细胞的培养基作为其基础培养基来制备，例如以下中的任一种：AIM V、X-VIVO-15、NeuroBasal、EGM2、TeSR、BME、BGJb、CMRL1066、Glasgow MEM、经改良MEM锌选择(Improved MEM Zinc Option)、IMDM、199培养基、EagleMEM、αMEM、DMEM、Ham、RPMI-1640和Fischer培养基，及其任意组合，但是培养基可不特别限于此，只要其可用于培养动物细胞即可。特别地，培养基可以是不含异源的或是化学限定的。

培养基可以是含血清培养基或无血清培养基或无异源(xeno-free)培养基。从防止异源动物来源组分污染的角度来看，血清可与干细胞来源于同一动物。无血清培养基是指不具有未经加工或未经纯化血清的培养基，并且因此可包括具有经纯化血液来源组分或动物组织来源组分(例如生长因子)的培养基。

培养基可包含或可不包含血清的任何替代品。血清的替代品可包括适当地包含以下的材料：白蛋白(例如富含脂质的白蛋白、牛白蛋白、白蛋白替代物例如重组白蛋白或人源化白蛋白、植物淀粉、右旋糖酐和蛋白质水解物)、转铁蛋白(或其他铁转运蛋白)、脂肪酸、胰岛素、胶原前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’-硫代甘油(3’-thiolgiycerol)，或其等同物。血清的替代品可通过例如国际公开No.98/30679中公开的方法制备(其整体并入本文)。或者，可使用任何可商购获得的材料以获得更多便利。可商购获得的材料包括敲除血清替代品(knockout Serum Replacement，KSR)、化学限定的脂质浓缩物(Gibco)和Glutamax(Gibco)。

在某些方面中，培养基可包含以下中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种或更多种：维生素，例如生物素；DLα生育酚乙酸酯；DLα-生育酚；维生素A(乙酸酯)；蛋白质，例如BSA(牛血清白蛋白(bovine serum albumin))或人白蛋白；脂肪酸游离级分V；过氧化氢酶；人重组胰岛素；人转铁蛋白；超氧化物歧化酶；其他组分例如皮质酮；D-半乳糖；乙醇胺HCl；谷胱甘肽(还原型)；左旋肉碱HCl；亚油酸；亚麻酸；孕酮；腐胺2HCl；亚硒酸钠；和/或T3(三碘-I-甲腺原氨酸(triodo-I-thyronine))。在一些具体方面中，这些中的一个或更多个可被明确排除。

在一些方面中，培养基还包含维生素。在一些方面中，培养基包含以下中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种(和其中可推导出的任何范围)：生物素、DLα-生育酚乙酸酯、DLα-生育酚、维生素A、氯化胆碱、泛酸钙、泛酸、叶酸烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺、肌醇、维生素B12，或者培养基包含其组合或其盐。在一些方面中，培养基包含以下或基本上由以下组成：生物素、DLα-生育酚乙酸酯、DLα-生育酚、维生素A、氯化胆碱、泛酸钙、泛酸、叶酸烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺、肌醇和维生素B12。在一些方面中，维生素包含以下或基本上由以下组成：生物素、DLα-生育酚乙酸酯、DLα-生育酚、维生素A，或其组合或盐。在一些方面中，培养基还包含蛋白质。在一些方面中，蛋白质包括白蛋白或牛血清白蛋白、BSA的级分、过氧化氢酶、胰岛素、转铁蛋白、超氧化物歧化酶，或其组合。在一些方面中，培养基还包含以下中的一种或更多种：皮质酮、D-半乳糖、乙醇胺、谷胱甘肽、L-肉毒碱、亚油酸、亚麻酸、孕酮、腐胺、亚硒酸钠或三碘-I-甲腺原氨酸，或其组合。在一些方面中，培养基包含以下中的一种或更多种：补充剂、无异源补充剂、GS21TM补充剂，或其组合。在一些方面中，培养基包含或还包含氨基酸、单糖、无机离子。在一些方面中，氨基酸包含精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸或缬氨酸，或其组合。在一些方面中，无机离子包含钠、钾、钙、镁、氮或磷，或其组合或盐。在一些方面中，培养基还包含以下中的一种或更多种：钼、钒、铁、锌、硒、铜或锰，或其组合。在某些方面中，培养基包含一种或更多种本文讨论的维生素和/或一种或更多种本文讨论的蛋白质和/或以下中的一种或更多种，或者基本上由其组成：皮质酮、D-半乳糖、乙醇胺、谷胱甘肽、L-肉毒碱、亚油酸、亚麻酸、孕酮、腐胺、亚硒酸钠、或三碘-I-甲腺原氨酸、补充剂、无异源补充剂、GS21TM补充剂、氨基酸(例如精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸或缬氨酸)、单糖、无机离子(例如钠、钾、钙、镁、氮和/或磷)或其盐、和/或钼、钒、铁、锌、硒、铜或锰。在一些具体方面中，这些中的一种或更多种可被明确排除。

培养基还可包含一种或更多种外部添加的脂肪酸或脂质、氨基酸(例如非必需氨基酸)、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂物质、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂、和/或无机盐。在一些具体方面中，这些中的一种或更多种可被明确排除。

一种或更多种培养基组分可以以以下浓度添加：至少、至多或约0.1、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、180、200、250ng/L、ng/ml、μg/ml、mg/ml，或其中可推导出的任何范围。

在一些具体方面中，具体配制本公开内容的细胞。它们可被配制成细胞悬液，或可不配制成细胞悬液。在特定情况下，它们以单剂量形式配制。它们可被配制成用于全身施用或局部施用。在一些情况下，细胞被配制成用于在使用之前储存，并且细胞制剂可包含一种或更多种冷冻保存剂，例如DMSO(例如，在5％ DMSO中)。细胞制剂可包含白蛋白，包括人白蛋白，特定制剂包含2.5％人白蛋白。细胞可被配制成特别用于静脉内施用；例如，它们被配制成用于静脉内施用持续少于1小时。在一些具体方面中，细胞处于配制的细胞悬液中，所述细胞悬液从解冻时起在室温下稳定1、2、3或4小时或更长时间。

在一些具体方面中，本公开内容的细胞包含外源性TCR，其可具有确定的抗原特异性。在一些方面中，TCR可基于对预期接受者的同种异体反应性的不存在或降低来对其进行选择(一些实例包括某些病毒特异性TCR、异源特异性TCR或癌-睾丸抗原特异性TCR)。在其中外源性TCR为非同种异体反应性的实例中，在T细胞分化期间，外源性TCR通过称为等位基因排斥的发育过程抑制内源性TCR基因座的重排和/或表达，产生仅表达非同种异体反应性外源性TCR并因此为非同种异体反应性的T细胞。在一些方面中，外源性TCR的选择可不必然基于同种异体反应性的缺乏来限定。在一些方面中，内源性TCR基因已通过基因组编辑进行修饰，使得其不表达蛋白质。基因编辑方法例如使用CRISPR/Cas9系统的方法在本领域中是已知的并在本文中描述。

在一些方面中，本公开内容的细胞还包含一种或更多种嵌合抗原受体(CAR)。CAR可针对的肿瘤细胞抗原的一些实例包括例如至少5T4、8H9、αvβ6整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CA9、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR家族包括ErbB2(HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、ERBB3、ERBB4、ErbB3/4、EPCAM、EphA2、EpCAM、叶酸受体-a、FAP、FBP、胎儿AchR、FRα、GD2、G250/CAIX、GD3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、Her2、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、KDR、MAGE、MCSP、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSC1、PSCA、PSMA、ROR1、SP17、存活蛋白、TAG72、TEM、癌胚抗原、HMW-MAA、AFP、CA-125、ETA、酪氨酸酶、MAGE、层黏连蛋白受体、HPV E6、E7、BING-4、钙-激活的氯离子通道2、细胞周期蛋白-B1、9D7、EphA3、端粒酶、SAP-1、BAGE家族、CAGE家族、GAGE家族、MAGE家族、SAGE家族、XAGE家族、NY-ESO-1/LAGE-1、PAME、SSX-2、Melan-A/MART-1、GP100/pmel17、TRP-1/-2、P.多肽、MC1R、前列腺特异性抗原、β-连环蛋白、BRCA1/2、CML66、纤维黏连蛋白、MART-2、TGF-βRII、或VEGF受体(例如，VEGFR2)。CAR可以是第一代、第二代、第三代或更多代CAR。CAR可对任何两种非同一性抗原具有双特异性，或者其也可对超过两种的非同一性抗原具有特异性。

IX.治疗性组合物的施用

本文中提供的治疗可包括施用治疗剂(例如第一癌症治疗和第二癌症治疗)的组合。可以以本领域已知的任何合适的方式施用治疗。例如，第一和第二癌症治疗可顺序(在不同时间)或同时(在同一时间)施用。在一些方面中，第一和第二癌症治疗以单独的组合物施用。在一些方面中，第一和第二癌症治疗在同一组合物中。

本公开内容的一些方面涉及组合物和方法，其包含治疗性组合物。不同的治疗可以以一种组合物或多于一种组合物，例如2种组合物、3种组合物或4种组合物施用。可使用药剂的多种组合。

本公开内容的治疗性组合物可通过相同的施用途径或通过不同的施用途径来施用。在一些方面中，癌症治疗经静脉内、肌内、皮下、表面、经口、经皮、腹膜内、眼眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。在一些方面中，抗生素经静脉内、肌内、皮下、表面、经口、经皮、腹膜内、眼眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。合适剂量可基于待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和进程、个体的临床状况、个体的临床病史和对治疗的响应以及主治医师的判断来确定。

治疗可包括多种“单位剂量”。单位剂量被定义为包含预定量的治疗性组合物。待施用的量以及特定途径和制剂在临床领域技术人员的技能决定范围内。单位剂量不需要作为单次注射施用，但可包括在设定时间段内连续输注。在一些方面中，单位剂量包括单个可施用剂量。

治疗性组合物的确切量还取决于从业者的判断并且对每个个体是特有的。影响剂量的因素包括患者的身体和临床状态、施用途径、预期的治疗目标(症状的减轻与治愈)，以及对象可能正在经历的特定治疗性物质或其他治疗的效力、稳定性和毒性。

适于治疗的癌症包括但不限于所有类型、位置、尺寸和特征的肿瘤。在一些方面中，癌症包含实体瘤。在一些方面中，该方法涉及减小肿瘤体积或者治疗复发性和/或转移性癌症。本公开内容的方法和组合物适用于治疗例如胰腺癌、结肠癌、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、儿童小脑或脑基底细胞癌、胆管癌、肝外膀胱癌、骨癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、脑干胶质瘤、脑肿瘤、小脑星形细胞瘤脑肿瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤脑肿瘤、室管膜瘤脑肿瘤、髓母细胞瘤脑肿瘤、幕上原始神经外胚瘤脑肿瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤、乳腺癌、淋巴癌、支气管腺瘤/类癌、气管癌、肺癌、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、类癌瘤、儿童类癌瘤、不明原发性胃肠癌、中枢神经系统淋巴瘤、原发性小脑星形细胞瘤、儿童脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、儿童宫颈癌、儿童癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增生性病症、皮肤T细胞淋巴瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因氏病(Ewing’s)、儿童性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼内黑素瘤眼癌、视网膜母细胞瘤、胆癌、胃(gastric)(胃(stomach))癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)、生殖细胞瘤：颅外、性腺外或卵巢、妊娠滋养层肿瘤、脑干胶质瘤、胶质瘤、儿童脑星形细胞瘤、儿童视觉通路和下丘脑胶质瘤、胃类癌、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、下咽癌、下丘脑和视觉通路胶质瘤、儿童眼内黑素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤(kaposi sarcoma)、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、白血病、急性淋巴母细胞白血病(也称为急性淋巴细胞白血病)、急性髓性白血病(也称为急性髓细胞性白血病)、慢性淋巴细胞白血病(也称为慢性淋巴细胞白血病)、慢性髓细胞性白血病(也称为慢性髓性白血病)、毛细胞唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌(原发性)、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(除霍奇金淋巴瘤之外的所有淋巴瘤的旧分类)、原发性中枢神经系统淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrommacroglobulinemia)、骨/骨肉瘤恶性纤维组织细胞瘤、儿童髓母细胞瘤、黑素瘤、眼内(眼)黑素瘤、梅克尔细胞癌(merkel cell carcinoma)、成人恶性间皮瘤、儿童间皮瘤、转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、慢性髓细胞性白血病、成人急性髓性白血病、儿童急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、慢性骨髓增生性病症、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/恶性、骨纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮-间质瘤)、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低恶性潜能瘤、胰腺癌、胰岛细胞鼻旁窦及鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚瘤、儿童垂体腺瘤、浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、儿童唾液腺癌肉瘤、尤因氏家族肿瘤、卡波西肉瘤、软组织肉瘤、子宫塞扎里综合征肉瘤(uterine sezary syndrome sarcoma)、皮肤癌(非黑素瘤)、皮肤癌(黑素瘤)、皮肤癌、梅克尔细胞小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、隐匿性原发性鳞状颈癌、转移性胃癌、幕上原始神经外胚瘤、儿童T细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤、儿童胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、子宫内膜肉瘤、阴道癌、视觉通路和下丘脑胶质瘤、儿童外阴癌和肾母细胞瘤(肾癌)。

X.药盒

本发明的某些方面还涉及包含本公开内容的组合物或实施本发明的方法的组合物的药盒。在一些方面中，药盒可用于评价一种或更多种生物标志物或HLA类型。在某些方面中，药盒包含、包含至少或包含至多1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，100，500，1,000种或更多种探针、引物或引物组、合成分子或抑制剂、或从其中可推导出的任何值或范围和组合。

药盒可包含组分，所述组分可单独包装或放置在容器，例如管、瓶、小瓶、注射器或其他合适的容器装置中。

单个组分也可以以浓缩量在药盒中提供；在一些方面中，组分单独提供，其浓度与其在含其他组分的溶液中的浓度相同。组分的浓度可提供为1×、2×、5×、10×或20×或更高。

在某些方面中，阴性和/或阳性对照核酸、探针和抑制剂包含在一些药盒方面中。另外，药盒可包含作为一种或更多种生物标志物甲基化的阴性或阳性对照的样品。

预期本文中所述的任何方法或组合物可相对于本文中所述的任何其他方法或组合物来实施，并且不同的方面可被组合。原始提交的权利要求书旨在涵盖多重依赖于任何提交的权利要求或提交的权利要求的组合的权利要求书。

XI.实施例

包括以下实施例以说明本公开内容的一些优选实施方案。本领域技术人员应理解，在以下实施例中公开的技术代表本发明人发现在本公开内容的实践中发挥良好作用的技术，并因此可被认为构成了用于本公开内容实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应理解，在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下，可在所公开的具体实施方案中进行许多改变并且仍然获得相同或类似的结果。

实施例1：NDC80-330肽(GLNEEIARV)抗原特异性CTL的产生和TCR-T的开发

先前，本发明人已建立了设计良好的系统，其可用四聚体引导分选和快速扩增方案(REP)从外周血中富集、分离和扩增自体抗原特异性T细胞。如果已鉴定了所限定的T细胞表位，本发明人可在6至8周内离体产生患者的自身抗原特异性T细胞，以描述用该系统进行有效的基于免疫的治疗的要求。此外，在操作免疫调节参数的情况下，本发明人可增强这些经扩增的抗原特异性T细胞的效应功能和体内长期持久性。基于已鉴定的HLA限制性NDC80肽和相应的功能性CTL、以及TCR改造T细胞(TCR-T)，本发明人计划在非随机化剂量寻求I/II期研究中评价靶向NDC80抗原的过继性T细胞治疗对于患有晚期或复发性癌症的患者的安全性和效力。基于之前获得的结果，他们将使用患者的自身外周血单个核细胞(PBMC)来产生并扩增针对NDC80肽的抗原特异性CTL或TCR-T。在功能检测(表型、杀伤能力等)之后，将T细胞以剂量逐步增加策略输注至患者以评价安全性。如果未出现严重的剂量限制毒性(dose limited toxicity，DTL)，则将通过分期评价进一步确定抗肿瘤效力，并将其注明为完全响应(complete response，CR)、部分响应(partial response，PR)或进行性疾病(progressive disease，PD)(RECIST标准)。在此期间，将确定转移的CTL的持续时间。还将确定无进展存活，虽然这不是I期研究的主要终点。如果未出现严重的副作用并观察到初级临床响应，我们将计划实施II期研究来以较大的晚期癌症患者组群进一步评价过继性T细胞治疗的效力。

***

根据本公开内容，本文中公开和要求保护的所有方法无需过度实验即可进行和实施。尽管已根据一些优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员来说明显的是，可对本文中所述的方法以及所述方法的步骤或步骤顺序作出改变而不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地，将明显的是，可用某些在化学和生理学两个方面均相关的试剂代替本文中所述的试剂，同时实现相同或类似的结果。对于本领域技术人员明显的所有这样的类似替代和改变被视为在由所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念内。

Claims (198)

1.多肽，其包含抗原结合可变区，所述抗原结合可变区包含含有与AVQAGSSASKII(SEQID NO：8)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。

2.权利要求1所述的多肽，其中所述CDR3包含AVQAGSSASKII(SEQ ID NO：8)的氨基酸序列。

3.权利要求1或2所述的多肽，其中所述可变区包含CDR1、CDR2和/或CDR3。

4.权利要求3所述的多肽，其中所述可变区包含与VSGLRG(SEQ ID NO：6)具有至少80％序列同一性的CDR1。

5.权利要求3或4所述的多肽，其中所述可变区包含与LYSAGEE(SEQ ID NO：7)具有至少80％序列同一性的CDR2。

6.权利要求4或5所述的多肽，其中所述可变区包含含有VSGLRG(SEQ ID NO：6)的氨基酸序列的CDR1和/或含有LYSAGEE(SEQ ID NO：7)的氨基酸序列的CDR2。

7.权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中所述可变区包含与SEQ ID NO：4具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

8.权利要求7所述的多肽，其中所述可变区包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

9.权利要求1至8中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含T细胞受体α(TCR-a)可变区。

10.权利要求9所述的多肽，其中所述多肽包含TCR-a可变区和恒定区。

11.权利要求1至10中任一项所述的多肽，其中所述多肽还包含信号肽。

12.权利要求11所述的多肽，其中所述信号肽包含与SEQ ID NO：5具有至少80％同一性的氨基酸序列。

13.权利要求12所述的多肽，其中所述信号肽包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。

14.多肽，其包含抗原结合可变区，所述抗原结合可变区包含含有与ASSLSGGIYEQY(SEQID NO：14)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。

15.权利要求14所述的多肽，其中所述CDR3包含ASSLSGGIYEQY(SEQ ID NO：14)的氨基酸序列。

16.权利要求14或15所述的多肽，其中所述可变区包含CDR1、CDR2和/或CDR3。

17.权利要求16所述的多肽，其中所述可变区包含与SGHDT(SEQ ID NO：12)具有至少80％序列同一性的CDR1。

18.权利要求16或17所述的多肽，其中所述可变区包含与YYEEEE(SEQ ID NO：13)具有至少80％序列同一性的CDR2。

19.权利要求17或18所述的多肽，其中所述可变区包含含有SGHDT(SEQ ID NO：12)的氨基酸序列的CDR1和/或含有YYEEEE(SEQ ID NO：13)的氨基酸序列的CDR2。

20.权利要求14至19中任一项所述的多肽，其中所述可变区包含与SEQ ID NO：10具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

21.权利要求20所述的多肽，其中所述可变区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

22.权利要求14至21中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含T细胞受体β(TCR-b)可变区。

23.权利要求22所述的多肽，其中所述多肽包含TCR-b可变区和恒定区。

24.权利要求14至23中任一项所述的多肽，其中所述多肽还包含信号肽。

25.权利要求24所述的多肽，其中所述信号肽包含与SEQ ID NO：11具有至少80％同一性的氨基酸序列。

26.权利要求25所述的多肽，其中所述信号肽包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。

27.经改造T细胞受体(TCR)，其包含TCR-a多肽和TCR-b多肽，其中所述TCR-a多肽包含含有与AVQAGSSASKII(SEQ ID NO：8)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，并且所述TCR-b多肽包含含有与ASSLSGGIYEQY(SEQ ID NO：14)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。

28.权利要求27所述的TCR，其中所述TCR-a多肽包含含有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDR3，并且所述TCR-b多肽包含含有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR3。

29.权利要求27或28所述的TCR，其中所述TCR包含：TCR-a多肽，其包含含有CDR1、CDR2和CDR3的可变区；以及TCR-b多肽，其包含含有CDR1、CDR2和CDR3的可变区。

30.权利要求29所述的TCR，其中所述TCR-a多肽包含与SEQ ID NO：6具有至少80％序列同一性的CDR1，和/或所述TCR-b多肽包含与SEQ ID NO：12具有至少80％序列同一性的CDR1。

31.权利要求30所述的TCR，其中所述TCR-a多肽包含含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR1，并且所述TCR-b多肽包含含有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR1。

32.权利要求29至31中任一项所述的TCR，其中所述TCR-a多肽包含与SEQ ID NO：7具有至少80％序列同一性的CDR2，并且所述TCR-b多肽包含与SEQ ID NO：13具有至少80％序列同一性的CDR2。

33.权利要求32所述的TCR，其中所述TCR-a多肽包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR2，并且所述TCR-b多肽包含含有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR2。

34.权利要求29至33中任一项所述的TCR，其中所述TCR-a多肽的CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO：6、7和8的氨基酸序列，并且其中所述TCR-b多肽的CDR1、CDR3和CDR3分别包含SEQ ID NO：12、13和14的氨基酸序列。

35.权利要求29至34中任一项所述的TCR，其中所述TCR-a多肽包含与SEQ ID NO：4具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且所述TCR-b多肽包含与SEQ ID NO：10具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

36.权利要求35所述的TCR，其中所述TCR-a多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，并且所述TCR-b多肽包含与SEQ ID NO：10具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

37.权利要求27至36中任一项所述的TCR，其中所述TCR包含修饰或者是嵌合的。

38.权利要求27至37中任一项所述的TCR，其中所述TCR-a多肽和TCR-b多肽可操作地连接。

39.权利要求38所述的TCR，其中所述TCR-a多肽和TCR-b多肽通过肽键可操作地连接。

40.权利要求38所述的TCR，其中所述TCR是单链TCR。

41.权利要求39或41所述的TCR，其中所述TCR-a多肽和TCR-b多肽位于同一多肽上，并且其中所述TCR-b在所述TCR-a的氨基近端。

42.权利要求39或41所述的TCR，其中所述TCR-a多肽和TCR-b多肽位于同一多肽上，并且其中所述TCR-a在所述TCR-b的氨基近端。

43.权利要求39至42中任一项所述的TCR，其中所述TCR包含在所述TCR-a与TCR-b多肽之间的接头。

44.权利要求39至43中任一项所述的TCR，其中所述接头包含甘氨酸和丝氨酸残基。

45.肽，其相对于SEQ ID NO:15包含至少66％序列同一性。

46.权利要求45所述的肽，其中所述肽包含SEQ ID NO:15。

47.权利要求45所述的肽，其中所述肽包含SEQ ID NO:15的至少6个连续氨基酸。

48.权利要求45所述的肽，其中所述肽包含SEQ ID NO:15的至少7个连续氨基酸。

49.权利要求45所述的肽，其中所述肽包含SEQ ID NO:15的至少8个连续氨基酸。

50.权利要求45至49中任一项所述的肽，其中所述肽相对于SEQ ID NO:15包含至少77％序列同一性。

51.权利要求45至50中任一项所述的肽，其中所述肽相对于SEQ ID NO:15包含至少88％序列同一性。

52.权利要求45至51中任一项所述的肽，其中所述肽由7个氨基酸组成。

53.权利要求45至51中任一项所述的肽，其中所述肽由8个氨基酸组成。

54.权利要求45至51中任一项所述的肽，其中所述肽由9个氨基酸组成。

55.权利要求45所述的肽，其中所述肽由SEQ ID NO:15组成。

56.权利要求45至55中任一项所述的肽，其中所述肽是免疫原性的。

57.权利要求45至56中任一项所述的肽，其中所述肽是经修饰的。

58.权利要求57所述的肽，其中所述修饰包含与分子缀合。

59.权利要求57或58所述的肽，其中所述分子包含抗体、脂质、佐剂或检测部分。

60.权利要求45至59中任一项所述的肽，其中所述肽相对于SEQ ID NO:15的肽具有1、2或3个替换。

61.多肽，其包含权利要求45至60中任一项所述的肽。

62.组合物，其包含至少一种MHC多肽以及权利要求45至61中任一项所述的肽或多肽。

63.权利要求62所述的组合物，其中所述MHC多肽与检测标签缀合和/或肽与检测标签缀合。

64.权利要求62或63所述的组合物，其中所述MHC多肽和肽有效连接。

65.权利要求64所述的组合物，其中所述MHC多肽和肽通过肽键有效连接。

66.权利要求64所述的组合物，其中所述MHC多肽和肽通过范德华力有效连接。

67.权利要求62至66中任一项所述的组合物，其中至少两个MHC多肽与一个肽连接。

68.权利要求62至67中任一项所述的组合物，其中MHC多肽与肽的平均比率为4:1。

69.分子复合物，其包含权利要求45至61中任一项所述的肽或多肽以及MHC多肽。

70.肽特异性结合分子，其中所述分子与权利要求45至61中任一项所述的肽或多肽或者权利要求69所述的分子复合物特异性结合。

71.权利要求70所述的结合分子，其中所述结合分子是抗体、TCR模拟抗体、scFV、纳米抗体、适配体或DARPIN。

72.产生肽特异性免疫效应细胞的方法，其包括：

(a)获得起始免疫效应细胞群；和

(b)使所述起始免疫效应细胞群与权利要求45至61中任一项所述的肽或多肽或者权利要求69所述的分子复合物接触，从而产生肽特异性免疫效应细胞。

73.权利要求72所述的方法，其中接触进一步限定为将所述起始免疫效应细胞群与抗原呈递细胞(APC)、人工抗原呈递细胞(aAPC)或人工抗原呈递表面(aAPS)共培养；其中所述APC、aAPC或aAPS在其表面上呈递所述肽。

74.权利要求73所述的方法，其中所述APC是树突细胞。

75.权利要求72至74中任一项所述的方法，其中所述免疫效应细胞是T细胞、外周血淋巴细胞、NK细胞、恒定NK细胞、NKT细胞。

76.权利要求72至75中任一项所述的方法，其中所述免疫效应细胞分化自间充质干细胞(MSC)或诱导多能干(iPS)细胞。

77.权利要求76所述的方法，其中所述T细胞是CD8⁺T细胞、CD4⁺T细胞或γδT细胞。

78.权利要求76所述的方法，其中所述T细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。

79.权利要求72至78中任一项所述的方法，其中获得包括从外周血单个核细胞(PBMC)中分离所述起始免疫效应细胞群。

80.权利要求72至79中任一项所述的方法，其中所述起始免疫效应细胞群获自对象。

81.权利要求80所述的方法，其中所述对象是人。

82.权利要求80所述的方法，其中所述对象患有癌症。

83.权利要求82所述的方法，其中所述癌症包含NDC80 CT抗原阳性癌症。

84.权利要求83所述的方法，其中所述癌症包含对SEQ ID NO:15的肽呈阳性的癌细胞。

85.权利要求82至84中任一项所述的方法，其中所述对象已被确定为患有NDC80 CT抗原阳性癌症。

86.权利要求85所述的方法，其中所述对象已被确定为具有对SEQ ID NO:15的肽呈阳性的癌细胞。

87.权利要求82至86中任一项所述的方法，其中所述对象已被诊断出患有所述癌症。

88.权利要求72至87中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述共培养之前将所述肽或编码所述肽的核酸引入到所述树突细胞中。

89.权利要求88所述的方法，其中所述肽或编码所述肽的核酸通过电穿孔引入。

90.权利要求88所述的方法，其中所述肽或编码所述肽的核酸通过将所述肽或编码所述肽的核酸添加至树突细胞培养基来引入。

91.权利要求72至90中任一项所述的方法，其中所述免疫效应细胞与已引入所述肽或编码所述肽的核酸的第二树突细胞群共培养。

92.权利要求72至91中任一项所述的方法，其中在所述共培养之后，从所述免疫效应细胞纯化CD8或CD4阳性和肽MHC四聚体阳性T细胞群。

93.权利要求92所述的方法，其中通过限制或连续稀释，随后是通过快速扩增方案扩增单个克隆来产生肽特异性免疫效应细胞的克隆群。

94.权利要求93所述的方法，其中所述方法还包括从所述肽特异性免疫效应细胞的克隆群克隆T细胞受体(TCR)。

95.权利要求94所述的方法，其中克隆所述TCR是克隆TCRα链和TCRβ链。

96.权利要求94或权利要求95所述的方法，其中所述TCR是使用5’-cDNA末端快速扩增(RACE)方法来克隆的。

97.权利要求96所述的方法，其中所克隆的TCR被亚克隆到表达载体中。

98.权利要求97所述的方法，其中所述表达载体是逆转录病毒载体或慢病毒载体。

99.权利要求97或98所述的方法，其中所述方法还包括用所述表达载体转导宿主细胞以产生表达所述TCR的经改造细胞。

100.权利要求99所述的方法，其中所述宿主细胞是免疫细胞。

101.权利要求72至100中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞并且所述经改造细胞是经改造T细胞。

102.权利要求101所述的方法，其中所述T细胞是CD8⁺T细胞、CD4+T细胞或γδT细胞并且所述经改造细胞是经改造T细胞。

103.权利要求72至102中任一项所述的方法，其中所述起始免疫效应细胞群获自患有癌症的对象并且所述宿主细胞与所述对象是同种异体的或自体的。

104.权利要求99至103中任一项所述的方法，其中从经转导的宿主细胞纯化CD8或CD4阳性和肽MHC四聚体阳性的经改造T细胞群。

105.权利要求72至104中任一项所述的方法，其中通过限制或连续稀释，随后是通过快速扩增方案扩增单个克隆来产生肽特异性的经改造T细胞的克隆群。

106.克隆T细胞受体(TCR)的方法，所述方法包括：

(a)获得起始免疫效应细胞群；

(b)使所述起始免疫效应细胞群与权利要求45至61中任一项所述的肽或多肽接触，从而产生肽特异性免疫效应细胞；

(c)纯化对所述肽具有特异性的免疫效应细胞，

(d)从所纯化的免疫效应细胞中分离TCR序列。

107.权利要求106所述的方法，其中接触进一步限定为将所述起始免疫效应细胞群与抗原呈递细胞(APC)共培养，其中所述APC在其表面上呈递所述肽。

108.权利要求107所述的方法，其中所述APC是树突细胞。

109.权利要求106至108中任一项所述的方法，其中所述免疫效应细胞是T细胞、外周血淋巴细胞、NK细胞、恒定NK细胞、NKT细胞。

110.权利要求106至109中任一项所述的方法，其中所述免疫效应细胞分化自间充质干细胞(MSC)或诱导多能干(iPS)细胞。

111.权利要求109或110所述的方法，其中所述T细胞是CD8⁺T细胞、CD4⁺T细胞或γδT细胞。

112.权利要求109至111中任一项所述的方法，其中所述T细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。

113.权利要求106至112中任一项所述的方法，其中获得包括从外周血单个核细胞(PBMC)中分离所述起始免疫效应细胞群。

114.权利要求106至113中任一项所述的方法，其中所述起始免疫效应细胞群获自对象。

115.权利要求114所述的方法，其中所述对象是人。

116.权利要求114或115所述的方法，其中所述对象患有癌症。

117.权利要求116所述的方法，其中所述癌症包含NDC80 CT抗原阳性癌症。

118.权利要求117所述的方法，其中所述癌症包含对SEQ ID NO:15的肽呈阳性的癌细胞。

119.权利要求114至118中任一项所述的方法，其中所述对象已被确定为患有NDC80 CT抗原阳性癌症。

120.权利要求119所述的方法，其中所述对象已被确定为具有对SEQ ID NO:15的肽呈阳性的癌细胞。

121.权利要求106至120中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述共培养之前将所述肽或编码所述肽的核酸引入到所述树突细胞中。

122.权利要求121所述的方法，其中所述肽或编码所述肽的核酸通过电穿孔引入。

123.权利要求121所述的方法，其中所述肽或编码所述肽的核酸通过将所述肽或编码所述肽的核酸添加至所述树突细胞的培养基来引入。

124.权利要求108至123中任一项所述的方法，其中所述免疫效应细胞与已引入所述肽或编码所述肽的核酸的第二树突细胞群共培养。

125.权利要求106至124中任一项所述的方法，其中纯化限定为在所述共培养之后从所述免疫效应细胞中纯化CD8阳性和肽MHC四聚体阳性T细胞群。

126.权利要求125所述的方法，其中所述CD8阳性和肽MHC四聚体阳性T细胞群通过荧光激活细胞分选(FACS)来纯化。

127.权利要求126所述的方法，其中纯化还包括通过限制或连续稀释分选的细胞，随后是通过快速扩增方案扩增单个克隆来产生肽特异性免疫效应细胞的克隆群。

128.权利要求127所述的方法，其中所述方法还包括从所述肽特异性免疫效应细胞的克隆群克隆T细胞受体(TCR)。

129.权利要求106至128中任一项所述的方法，其中所述方法还包括对TCRα基因和/或TCRβ基因进行测序和/或进行通过互补位热点对淋巴细胞相互作用分组(GLIPH)分析。

130.权利要求128或129所述的方法，其中克隆所述TCR是克隆TCRα链和TCRβ链。

131.权利要求130所述的方法，其中所述TCRα链和TCRβ链是使用5’-cDNA末端快速扩增(RACE)方法来克隆的。

132.权利要求131所述的方法，其中所克隆的TCR被亚克隆到表达载体中。

133.权利要求132所述的方法，其中所述表达载体包含在TCRα序列与TCRβ序列之间的接头结构域。

134.权利要求133所述的方法，其中所述接头结构域包含编码一个或更多个肽切割位点的序列。

135.权利要求134所述的方法，其中所述一个或更多个切割位点是弗林蛋白酶切割位点和/或P2A切割位点。

136.权利要求135所述的方法，其中所述TCRα序列和TCRβ序列通过IRES序列连接。

137.权利要求132至136中任一项所述的方法，其中所述表达载体是逆转录病毒载体或慢病毒载体。

138.权利要求137所述的方法，其中用所述表达载体转导宿主细胞以产生表达所述TCRα链和TCR β链的经改造细胞。

139.权利要求138所述的方法，其中所述宿主细胞是免疫细胞。

140.肽特异性的经改造T细胞，其根据权利要求72至139中所述的方法中的任一种来产生。

141.TCR，其通过权利要求106至139中任一项所述的方法产生。

142.融合蛋白，其包含权利要求27至44或141中任一项所述的TCR以及CD3结合区。

143.权利要求45所述的融合蛋白，其中所述CD3结合区包含CD3特异性抗原结合片段(Fab)、单链可变片段(scFv)、单结构域抗体或单链抗体。

144.权利要求27至44中任一项所述的TCR或者权利要求142或143所述的融合蛋白，其中所述TCR或融合蛋白与检测剂或治疗剂缀合。

145.权利要求144所述的TCR或融合蛋白，其中所述剂包含荧光分子、放射性分子或毒素。

146.核酸，其编码权利要求1至26或61中任一项所述的多肽、权利要求27至44、141、144或145中任一项所述的TCR、权利要求42至63中任一项所述的肽或者权利要求142至145中任一项所述的融合蛋白。

147.权利要求146所述的核酸，其中所述核酸是RNA。

148.权利要求146所述的核酸，其中所述核酸是编码所述肽或多肽或者所述肽或多肽的互补物的DNA或cDNA。

149.权利要求146所述的核酸，其中所述核酸与SEQ ID NO:1、2或其片段之一具有至少70％序列同一性。

150.核酸表达载体，其包含权利要求146至149中任一项所述的核酸。

151.权利要求150所述的载体，其中所述载体包含指导所述核酸的表达的启动子。

152.权利要求151所述的载体，其中所述启动子包含鼠干细胞病毒(MSCV)启动子。

153.权利要求150至152中任一项所述的载体，其中所述载体包含TCR-a和TCR-b基因。

154.细胞，其包含权利要求1至26或61中任一项所述的多肽、权利要求27至44、141、144或145中任一项所述的TCR、权利要求142至145中任一项所述的融合蛋白、权利要求146至149中任一项所述的核酸或者权利要求150至153中任一项所述的载体。

155.权利要求154所述的细胞，其中所述细胞包含干细胞、祖细胞、免疫细胞或自然杀伤(NK)细胞。

156.权利要求155所述的细胞，其中所述细胞包含造血干细胞或祖细胞、T细胞、分化自间充质干细胞(MSC)或诱导多能干细胞(iPSC)的细胞。

157.权利要求155或156所述的细胞，其中所述细胞分离自或来源于外周血单个核细胞(PBMC)。

158.权利要求156或157所述的细胞，其中所述T细胞包含细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、CD8⁺T细胞、CD4⁺T细胞、恒定NK T(iNKT)细胞、γ-δT细胞、NKT细胞或调节性T细胞。

159.权利要求154至158中任一项所述的细胞，其中所述细胞分离自癌症患者。

160.体外分离的树突细胞，其包含权利要求45至60或61中任一项所述的肽或多肽、权利要求146至149中任一项所述的核酸或者权利要求150至153中任一项所述的载体。

161.权利要求160所述的树突细胞，其中所述树突细胞是成熟树突细胞。

162.权利要求160或161所述的树突细胞，其中所述细胞是HLA-A、HLA-B或HLA-C型的细胞。

163.组合物，其包含权利要求1至26或61中任一项所述的多肽、权利要求27至44、141、144或145中任一项所述的TCR、权利要求142至145中任一项所述的融合蛋白、权利要求146至149中任一项所述的核酸、权利要求150至153中任一项所述的载体或者权利要求154至162中任一项所述的细胞。

164.权利要求163所述的组合物，其中所述组合物被配制成用于肠胃外施用、静脉内注射、肌内注射、吸入或皮下注射。

165.权利要求163或164所述的组合物，其中所述肽包含在脂质体、含有脂质的纳米粒或基于脂质的载体中。

166.权利要求163至165中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制为疫苗。

167.权利要求163至166中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含佐剂。

168.权利要求163至167中任一项所述的组合物，其中所述组合物已被确定为无血清、无支原体、无内毒素和/或无菌。

169.制备经改造细胞的方法，其包括将权利要求146至149中任一项所述的核酸或者权利要求150至153中任一项所述的载体转移到细胞中。

170.权利要求169所述的方法，其中所述方法还包括在培养基中培养所述细胞、在允许所述细胞分裂的条件下孵育所述细胞、筛选所述细胞和/或冷冻所述细胞。

171.用于在对象中治疗癌症的方法，其包括向有此需要的对象施用权利要求163至170中任一项所述的组合物或者权利要求140或154至159中任一项所述的细胞。

172.用于在对象中治疗或预防癌症的方法，其包括向有此需要的对象施用权利要求163至168中任一项所述的组合物或者权利要求140或154至159中任一项所述的细胞。

173.在对象中刺激免疫应答的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用权利要求163至168中任一项所述的组合物或者权利要求140或154至159中任一项所述的细胞。

174.权利要求171至173中任一项所述的方法，其中所述对象是人对象。

175.权利要求171至174中任一项所述的方法，其中所述细胞是自体的。

176.权利要求171至174中任一项所述的方法，其中所述细胞是同种异体的。

177.权利要求171至176中任一项所述的方法，其中所述对象先前已针对所述癌症进行过治疗。

178.权利要求177所述的方法，其中所述对象已被确定为对先前的治疗具有抗性。

179.权利要求171至178中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用另外的治疗。

180.权利要求171至179中任一项所述的方法，其中所述癌症包含I期、II期、III期或IV期癌症。

181.权利要求171至180中任一项所述的方法，其中所述癌症包含转移性和/或复发性癌症。

182.权利要求171至181中任一项所述的方法，其中所述癌症是NDC80 CT抗原阳性癌症。

183.权利要求171至182中任一项所述的方法，其中所述对象已被确定为具有NDC80 CT抗原阳性癌细胞。

184.权利要求171至182中任一项所述的方法，其中所述对象已被确定为具有表达SEQID NO:15的肽的癌细胞。

185.权利要求171至184中任一项所述的方法，其中所述对象是HLA-A2阳性和/或已被确定为HLA-A2阳性。

186.权利要求171至182所述的方法，其中所述对象是HLA-A0201阳性和/或已被确定为HLA-A0201阳性。

187.用于对患者进行预后或用于在患者中检测T细胞应答的方法，所述方法包括：使来自所述患者的生物样品与权利要求45至60中任一项所述的肽或多肽或者权利要求69所述的分子复合物接触。

188.权利要求187所述的方法，其中所述生物样品包含血液样品或其级分。

189.权利要求188所述的方法，其中所述生物样品包含淋巴细胞。

190.权利要求189所述的方法，其中所述生物样品包含含有淋巴细胞的分级样品。

191.权利要求187至190中任一项所述的方法，其中所述肽与固体支持物连接。

192.权利要求191所述的方法，其中所述肽与所述固体支持物缀合或者与缀合至所述固体支持物的抗体结合。

193.权利要求191所述的方法，其中所述固体支持物包含微板、珠、玻璃表面、载片或细胞培养皿。

194.权利要求187至193中任一项所述的方法，其中检测T细胞应答包括检测所述肽与所述T细胞或TCR的结合。

195.药盒，其在容器中包含权利要求45至61中任一项所述的肽或多肽。

196.权利要求195所述的药盒，其中所述肽包含在药物制剂中。

197.权利要求196所述的药盒，其中所述药物制剂被配制成用于肠胃外施用或吸入。

198.权利要求195所述的药盒，其中所述肽包含在细胞培养基中。