ES2933825T3 - El dominio central de las anexinas y sus usos en el transporte de antígenos y la vacunación - Google Patents

Abstract

La presente descripción proporciona composiciones inmunogénicas, tales como vacunas, incluidas las vacunas de ADN, y usos de las mismas, por ejemplo, que incluyen un dominio central de anexina para mediar en la entrega eficiente de antígenos y la presentación de antígenos para inducir una respuesta inmune específica de antígeno y/o para tratar o prevenir enfermedades infecciosas y/o cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

El dominio central de las anexinas y sus usos en el transporte de antígenos y la vacunación

La presente divulgación proporciona composiciones inmunogénicas, tales como vacunas, incluidas vacunas de ADN, y sus usos según el conjunto de reivindicaciones adjunto, por ejemplo, que incluyen un dominio central de la anexina para mediar en el transporte eficiente de antígenos y la presentación de antígenos con el fin de inducir una respuesta inmunitaria específica de antígeno y/o para tratar o prevenir enfermedades infecciosas y/o cáncer.

Antecedentes de la invención

La invención se define por las reivindicaciones. Cualquier materia que quede fuera del ámbito de las reivindicaciones se proporciona únicamente a título informativo.

Las células presentadoras de antígenos ("antigen presenting cells", APC) profesionales son fundamentales para el inicio de una respuesta inmunitaria adaptativa, ya que muestran péptidos derivados de antígenos unidos a complejos MHC de clase I y clase II en su superficie celular (Verboogen, Dingjan et al., 2016). Mientras que las proteínas citosólicas son degradadas por el proteasoma y son cargadas en complejos MHC de clase I reconocidos por las células T CD8+, la endocitosis de proteínas exógenas (por ejemplo, procedentes de bacterias fagocitadas o células apoptóticas) conduce a la degradación endosómica/lisosómica y a la presentación en complejos MHC de clase II presentados a las células T CD4+. Además, las APC, como las células dendríticas ("dendritic cells", DC), son capaces de transportar péptidos derivados de proteínas introducidas por endocitosis también a la vía del MHC de clase I para presentarlos a las células T CD8+, un proceso denominado presentación cruzada (Segura y Amigorena, 2015). Entre los diferentes tipos de células descritas para cumplir funciones similares a las de las APC, las DC se consideran las más eficientes (Kambayashi y Laufer, 2014). Tras las interacciones APC:células T, la unión a los receptores de células T ("T-cell receptors", t Cr ) conduce a la activación inicial de las células T (cebado), caracterizada, por ejemplo, por la secreción de citocinas como la interleucina (IL)-2 y el interferón-rn (Grakoui, Bromley et al., 1999). Las células T activadas procederán a dividirse y diferenciarse en diferentes tipos de células T efectoras, que pueden clasificarse en dos linajes principales, las células T cooperadoras (Th) CD4+ y las células T citotóxicas CD8+. Las células T citotóxicas inducen directamente la apoptosis en las células diana, mientras que las células Th dirigen las respuestas inmunitarias mediante la producción de citocinas y se han clasificado en los subconjuntos principales Th1, Th2 y Th17 (Lutz, 2016). Resumiendo sus funciones efectoras, las células Th1 son necesarias para activar la inmunidad celular, mientras que las Th2 inducen respuestas inmunitarias humorales. Se cree que las células Th17 participan en la inmunidad contra patógenos extracelulares como los hongos. En cuanto a las respuestas inmunitarias antitumorales, la inducción de una respuesta eficiente de células T CD8+ se ha considerado fundamental para el rechazo del tumor, y muchos regímenes de vacunación contra tumores no consiguen inducir respuestas antitumorales de células T CD8+ (Buhrman y Slansky, 2013). Así pues, la presentación eficaz de antígenos por parte de las APC desempeña un papel fundamental en la inducción de la inmunidad adaptativa.

Las anexinas comprenden una familia de proteínas de unión a calcio y fosfolípidos. Se han descubierto más de 20 miembros en todos los reinos eucariotas, así como en plantas y animales, con la excepción de los hongos. Las anexinas tienen pesos moleculares que oscilan entre 30 y 40 kDa (solo la anexina VI tiene 66 kDa) y poseen características estructurales sorprendentes. Los dominios amino-terminales de las anexinas son diversos en cuanto a su secuencia y longitud (entre 11 y 196) en cada miembro de la anexina. En cambio, las regiones carboxi-terminales, que constan de cuatro (ocho solo en el caso de la anexina VI) dominios a-helicoidales compuestos por unos 70 restos aminoácidos, están bien conservadas entre las anexinas. Los sitios de unión al calcio y a los fosfolípidos se encuentran en los dominios carboxi-terminales. Las similitudes de unión al Ca2+ de todas las anexinas se deben a su estructura primaria común, un dominio N-terminal distintivo (la "cola") y el dominio C-terminal conservado (el "dominio central"). A excepción de la anexina VI, el dominio C-terminal conservado siempre está compuesto por 4 repeticiones (la anexina VI tiene 8) de -70 aminoácidos que contienen una región de mayor homología llamada "pliegue de endonexina". Además del dominio central C-terminal, las anexinas contienen una cabeza N-terminal significativamente más variable. Es este dominio el que dota a cada anexina de funciones distintivas en una amplia gama de procesos celulares, como la endo- y exocitosis, la regulación del citoesqueleto y la conductancia y organización de la membrana. Dada su implicación en tal diversidad de procesos, no es sorprendente que también se haya implicado a las anexinas en una serie de patologías. Aunque no hay ningún estado de enfermedad singular que se atribuya directamente a una desregulación en la función de las anexinas, se sugiere que las anexinas modifican varios trastornos patológicos. Fatimathas y Moss (Fatimathas y Moss, 2010) analizan discuten las crecientes evidencias del papel de las anexinas en la progresión del cáncer, la diabetes y el trastorno autoinmunitario del síndrome antifosfolipídico.

En todas las anexinas, la unión a los lípidos está mediada por el dominio central C-terminal altamente conservado entre todos los miembros de la familia de las anexinas (Gerke y Moss, 2002; Moss y Morgan, 2004). En cambio, los N-terminales de las anexinas varían en su secuencia. Se ha demostrado que los péptidos correspondientes al N-terminal de AnxA1 se unen a los miembros de la familia de receptores de péptidos de N-formilo (FPR), lo que provoca una reducción de la transmigración de neutrófilos en varios modelos de inflamación aguda y crónica (Walther, Riehemann et al., 2000; Strausbaugh y Rosen, 2001; Ernst, Lange et al., 2004; Perretti y Dalli, 2009). La transducción de señales en etapas posteriores inducida por la unión de los péptidos N-terminales de AnxA1 a los miembros de la familia FPR provoca la activación de ERK, pero no de p38 o JNK (Hayhoe, Kamal et al., 2006; Pupjalis, Goetsch et al., 2011). La presencia de múltiples miembros de la familia de las anexinas en todos los eucariotas superiores sugiere un papel fundamental de las anexinas en la biología celular. Sin embargo, los ratones deficientes en miembros individuales de la familia de anexinas no presentan un fenotipo grave, lo que sugiere que varias anexinas tienen funciones (parcialmente) superpuestas (Gerke y Moss, 2002; Farber, De Rose et al., 2003). De hecho, se ha demostrado la redundancia funcional de las anexinas en el contexto del tráfico de membrana, la inhibición de la actividad de PLA² y la coagulación sanguínea (Gerke y Moss, 2002).

El documento US 2002-052358 describe un método para tratar a un sujeto con artritis o una enfermedad artrítica o para prevenir la artritis o la enfermedad artrítica en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente que atenúa la función de la anexina. También se proporcionan diversos métodos de selección de agentes.

El documento WO 01/10199 describe un ratón transgénico con genes inactivados ("knockout") que contiene un alelo no funcional del gen supresor de tumores, anexina VII. Este ratón se utiliza como modelo de selección de posibles agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de tumores que se originan de una enfermedad supresora de tumores de anexina.

El documento JP 2014-095643 se describe la selección de un compuesto eficaz en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, basada en la inhibición de la unión entre la anexina a 2 y ADAM17.

El documento WO 2014/126127 describe un método para la selección de un ingrediente activo para el tratamiento del enantema severo, el eritema cutáneo, la erosión de la superficie corporal, las ampollas y la excoriación como enfermedades relacionadas con la necroptosis inducida por el receptor 1 del péptido de formilo. Se dice que el ingrediente activo que se va a seleccionar es una sustancia capaz de inhibir la necroptosis que es inducida por la unión del receptor 1 del péptido de formilo a la anexina A1.

El documento WO 02/17857 divulga métodos para inhibir la angiogénesis en las células endoteliales e inducir selectivamente la apoptosis en las células endoteliales mediante compuestos que se unen a la anexina II. Estos compuestos y los métodos para utilizarlos se consideran útiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos caracterizados por una angiogénesis no deseada. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto que se une a la anexina II y un vehículo farmacéuticamente aceptable, así como métodos para identificar dichos compuestos.

El documento WO 2005/027965 divulga anticuerpos antianexina y sus usos, así como usos de sus ligandos, las anexinas. Dichas anexinas y anticuerpos antianexina son útiles para detectar la apoptosis y para la producción de composiciones farmacéuticas para el diagnóstico y/o tratamiento del cáncer, las enfermedades autoinmunitarias, las enfermedades cardiovasculares y/o vasculares.

El documento US 2014/0322214 divulga composiciones y métodos para la unión de la dectina-1 a las células inmunitarias con anticuerpos específicos contra la dectina-1, o sus fragmentos capaces de activar las células inmunitarias, así como métodos para el tratamiento o la prevención de una infección de gripe en un sujeto que lo necesita, que comprenden la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende un anticuerpo contra la dectina-1 fusionado a un antígeno de la gripe. La tesis de Connie Hesse, "CLEC7A/Dectin-1 attenuates the immune response against dying and dead cells", Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nürnberg, 2011, analiza el papel de las lectinas de tipo C CLEC4L/DC-SIGN, CLEC9A/DNGR1 y CLEC7A/dectina-1 en el reconocimiento y la captación de células apoptóticas y necróticas y/o sus efectos sobre la inmunogenicidad de las células moribundas y muertas.

El documento WO2006/130525 A2 divulga una proteína de fusión que comprende un antígeno de células endoteliales vasculares tumorales ("tumour vascular endothelial cell antigen", TVECA) y un ligando CD40.

El documento EP3045470 divulga proteínas de fusión que comprenden un dominio central de la anexina con al menos un antígeno.

La proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad-1 (LRP-1) es un receptor de membrana que presenta funciones tanto de captación barrido como de transducción de señales. La gran diversidad de ligandos extracelulares y de proteínas citoplasmáticas de andamiaje y transducción de señales que interactúan con la PRL-1 le confiere un papel importante no solo en procesos fisiológicos, como la embriogénesis y el desarrollo, sino también en situaciones patológicas críticas, como el cáncer y los trastornos neurológicos (Emonard, Theret et al., 2014). La anexina VI de la superficie celular puede actuar como sitio de unión o receptor de pH ácido y también puede funcionar como correceptor con LRP-1 a pH neutro en el contexto del reconocimiento de la alfa 2-macroglobulina (Ling, Chen et al., 2004).

Arur y colegas (Arur, Uche et al., 2003), así como Tzelepis et al. (Tzelepis, Verway et al., 2015) describen un papel de la anexina A1 en el proceso de la fagocitosis de células apoptóticas, que se considera inmunológicamente silencioso y que no conduce a una respuesta de las células T. En la misma publicación, Tzelepis y colegas describieron además un papel para la anexina A1 endógena en el proceso de presentación cruzada. Esta publicación describe la anexina A1 como un mediador que actúa en el citosol de las células dendríticas. Por lo tanto, esta publicación no permite el uso del dominio central de la anexina como mediador exógeno para unir la presentación del antígeno y la presentación cruzada.

Andersen y colegas (Andersen, Xia et al., 2016) describen la unión de la anexina A2 al receptor de tipo Toll (TLR) 2. Al activar el TLR2, la anexina A2 puede actuar como adyuvante de vacunas, potenciando la activación de los DC mediada por el TLR y procesos como la regulación positiva de las moléculas de superficie coestimuladoras y la presentación cruzada de antígenos. Esta publicación no menciona el transporte de antígenos hacia el interior de las DC.

Tzelepis et al. (en: Tzelepis et al., Annexin1 regulates DC efferocytosis and cross-presentation during Mycobacterium tuberculosis infection, J. Clin. Invest., febrero de 2015, 125(2):752-768, Epub 22 de diciembre de 2014) revelan que durante la infección por Mycobacterium tuberculosis (Mtb), el ligando de endocitosis de anexina 1 es un importante mediador en la presentación cruzada de DC que aumenta la eferocitosis en DC y mejora intrínsecamente la capacidad de la maquinaria de presentación de antígenos de DC. Los ratones deficientes en anexina 1 eran muy susceptibles a la infección por Mtb y mostraban una respuesta alterada de las células T CD8+ específicas para el antígeno de Mtb.

Por último, Weyd y colegas (Weyd, Abeler-Dorner et al., 2013; Linke, Abeler-Dorner et al., 2015) revelan que en ratones, la anexina A1, la anexina A5, la anexina A13 y el dominio central de la anexina impidieron el desarrollo de DC inflamatorias y suprimieron la respuesta inmunitaria celular contra el antígeno modelo ovoalbúmina (OVA) expresado en células apoptóticas.

Los reactivos que reaccionan específica o preferentemente con las DC y median en la presentación de antígenos tienen un gran potencial como agentes de transporte dirigido para inducir respuestas inmunitarias potentes a antígenos tumorales o de enfermedades infecciosas. Estos agentes dirigidos a células específicas también podrían diseñarse para transportar toxinas con el fin de eliminar las células presentadoras de antígenos potentes (por ejemplo, las CD) en los trasplantes de médula ósea y de órganos o en otros trastornos autoinmunitarios. Por lo tanto, estos agentes de unión específicos de DC poseen un gran valor terapéutico y de diagnóstico.

Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar tales reactivos nuevos y emplear estos reactivos en el desarrollo de terapias nuevas y eficaces. Otros objetos y aspectos de la presente invención resultarán evidentes para la persona experta en la materia al leer la siguiente descripción de la invención.

La presente invención se refiere a un conjugado de proteína o proteína de fusión que comprende (i) un dominio central de la anexina que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada entre:

(a) los aminoácidos 41-344 de SEQ ID NO: 1,

(b) los aminoácidos 14-317 de SEQ ID NO: 2,

(c) los aminoácidos 13-316 de SEQ ID NO: 3,

(d) los aminoácidos 41-344 de SEQ ID NO: 6,

(e) los aminoácidos 12-315 de SEQ ID NO: 7,

(f) los aminoácidos 14-317 de SEQ ID NO: 8,

o (i-a) un dominio central de la anexina aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de (a) a (f); y (ii) al menos un péptido antigénico que es presentado por el MHC (preferentemente HLA). El péptido antigénico puede proceder de un tumor o un agente infeccioso, un patógeno o una proteína endógena. La presente invención también proporciona las respectivas vacunas que comprenden fusiones y/o conjugados y otras composiciones terapéuticas.

En ciertas realizaciones, el conjugado de proteína o la proteína de fusión de la invención comprende un enlace covalente entre el dominio central de la anexina y dicho al menos un péptido antigénico que puede ser presentado por el MHC. También se engloban los conjugados o la proteína de fusión de la invención en los que el enlace covalente incluye una molécula de conector o un péptido. La selección de las moléculas de conector adecuadas está bien establecida en la técnica pertinente. En algunas realizaciones de la invención, el conector comprende una secuencia de aminoácidos del conector como se muestra en la figura 10 (SEQ ID NO: 15), o una secuencia que tiene al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de conector mostrada en la figura 10B (SEQ ID NO: 15).

En algunos aspectos y realizaciones de la presente invención, la proteína de fusión está codificada por el ácido nucleico mostrado en SEQ ID NO: 13, o por una variante de ácido nucleico del mismo que tenga al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 13. Preferentemente, la proteína de fusión de la invención comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, o de una variante de la misma que tenga al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 14.

La expresión "proteína de fusión", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una construcción proteica artificial y significa una proteína que comprende al menos dos secuencias de aminoácidos diferentes que se definen por su origen y/o por funciones especiales. En este aspecto, la proteína de fusión de la invención comprende la secuencia de aminoácidos del dominio central de la anexina condensada con la segunda secuencia de aminoácidos de otra proteína que no es la anexina, y que es antigénica en el sentido de que dicha segunda proteína, o sus fragmentos, se presentan en una célula a través del complejo MHC. Además, la expresión proteína de fusión según la presente invención incluye además dichas proteínas de fusión que también contienen moléculas no proteicas, como ácidos nucleicos, azúcares o marcadores para el marcaje radiactivo o fluorescente.

Sorprendentemente, se descubrió que las construcciones según la presente invención tienen un efecto inmunoestimulante (potenciador). Por lo tanto, las composiciones de la invención que contienen el complejo del dominio central de la anexina y/o la fusión pueden utilizarse en una diversidad de terapias dirigidas a las d C, por ejemplo, para mejorar la presentación de antígenos y/o inducir respuestas de células T, tales como respuestas de células T citotóxicas ("cytotoxic T cells", CTL), contra una diversidad de patógenos o células diana, o para tratar enfermedades mediadas por células presentadoras de antígenos (APC). La invención descubrió sorprendentemente que la combinación de una molécula antigénica, como un péptido antigénico, con un dominio central de la anexina, como se describe en el presente documento, aumenta significativamente los efectos inmunomoduladores de dicha secuencia antigénica. Sin estar atado a una teoría concreta, el acoplamiento de un dominio central de la anexina a una molécula antigénica potencia el procesamiento del antígeno y la presentación por MHC de las células presentadoras de antígenos, como las células dendríticas. Por lo tanto, la invención permite, en términos generales, un producto y un método para mejorar la presentación de moléculas antigénicas a través del MHC, preferentemente el MHC humano (HLA).

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "antígeno" se refiere a una sustancia capaz de provocar una respuesta inmunitaria, por ejemplo, una respuesta inmunitaria mediada por células T mediante la presentación del antígeno sobre proteínas celulares del complejo principal de histocompatibilidad ("Major Histocompatibility Complex", MHC) y provocar una respuesta de las células T específica del antígeno. En el caso de una respuesta de las células T reguladoras (Treg) al antígeno, se produce una disminución o mejora de la respuesta inmunitaria por parte de otras células efectoras, por ejemplo, las células T cooperadoras (Th) y/o las células T citotóxicas (Tc). El inmunólogo experto reconocerá que cuando se habla de antígenos que se procesan para su presentación a las células T, el término "antígeno" se refiere a aquellas porciones del antígeno (por ejemplo, un fragmento de péptido) que es un epítopo de células T presentado por el MHC al receptor de células T. Cuando el término "antígeno" está modificado con el prefijo auto-, se refiere a los antígenos propios o autoantígenos que suelen estar presentes en las moléculas del MHC, pero que también desencadenan una respuesta de las células T. Cuando se utiliza en el contexto de una respuesta inmunitaria mediada por células B en forma de un anticuerpo que es específico para un "antígeno", la porción del antígeno que se une a las regiones determinantes de la complementariedad de los dominios variables del anticuerpo (ligero y pesado), la porción unida puede ser un epítopo lineal o tridimensional. En ciertos casos, los antígenos transportados por la vacuna o la proteína de fusión o el conjugado de proteína de la presente invención son internalizados y procesados por las células presentadoras de antígenos antes de la presentación, por ejemplo, mediante la escisión de una o más porciones del anticuerpo o la proteína de fusión.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "péptido antigénico" se refiere a la porción de un antígeno polipeptídico que es reconocida específicamente por las células B y/o las células T. Los linfocitos B responden a los determinantes antigénicos extraños mediante la producción de anticuerpos, mientras que los linfocitos T median en la inmunidad celular. Así, los péptidos antigénicos en una respuesta de células T son aquellas partes de un antígeno que son reconocidas por los receptores de células T específicos del antígeno en el contexto del MHC.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "epítopo" se refiere a cualquier determinante de proteína capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o de ser presentado por una proteína del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) (por ejemplo, de clase I o de clase II) a un receptor de células T. Los determinantes epitópicos son generalmente péptidos cortos de 5 a 30 aminoácidos de longitud que encajan en el surco de la molécula del MHC que presenta ciertos grupos laterales de aminoácidos hacia el receptor de células T y tiene otros residuos en el surco, por ejemplo, debido a las características de carga específicas del surco, los grupos laterales del péptido y el receptor de células T. En general, un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es de 1 mM, 100 nM o incluso 10 nM.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "células presentadoras de antígeno" (APC) son células que son capaces de activar las células T, e incluyen, entre otras, ciertos macrófagos, células B y células dendríticas. Las "células dendríticas" (DC) se refieren a cualquier miembro de una población diversa de tipos de células morfológicamente similares que se encuentran en los tejidos linfoides o no linfoides. Estas células se caracterizan por su morfología distintiva, altos niveles de expresión de MHC de clase II en la superficie (Steinman, et al., Ann. Rev. Immunol., 9:271 (1991)). Estas células pueden ser aisladas de una serie de fuentes de tejido, y convenientemente, de la sangre periférica, o pueden ser diferenciadas de la médula ósea murina, como se describe en el presente documento. Las proteínas de unión a células dendríticas se refieren a cualquier proteína cuyos receptores se expresan sobre una célula dendrítica. Algunos ejemplos son los ligandos GM-CSF, IL-1, TNF, IL-4, CD40L, CTLA4, CD28 y FLT-3. Un péptido antigénico comprende una secuencia peptídica capaz de ser presentada por moléculas HLA (MHC de clase I y/o MHC de clase II) y que induce una respuesta de células T, como la respuesta de células T citotóxicas (CTL). Normalmente, estos péptidos tienen una longitud de entre 8 y 30, preferentemente de entre 8 y 24 aminoácidos, los péptidos del MHC de clase I suelen tener una longitud de entre 8 y 10, y los péptidos del MHC de clase II suelen tener una longitud de entre 21 y 25 aminoácidos. Los métodos para identificar ("seleccionar") estos péptidos antigénicos también son conocidos y pueden implicar tanto métodos in vivo o in vitro como informáticos.

Los métodos para preparar los respectivos conjugados (es decir, que comprenden enlaces no covalentes o covalentes introducidos entre componentes diferentes, es decir, la anexina y el péptido) del dominio central de la anexina y el péptido antigénico, así como para preparar las respectivas proteínas de fusión (es decir, la expresión de una proteína después de la clonación recombinante de los componentes) son bien conocidos en la técnica.

En el contexto de la presente invención, la expresión "dominio central de la anexina" se entenderá que indica/representa el fragmento mínimo del polipéptido de la anexina (o sus homólogos), que es necesario y suficiente para mediar en la presentación del antígeno (véase también más adelante). Algunos dominios centrales de la anexina preferidos se han definido anteriormente en el presente documento. Esta capacidad (función biológica) puede ser ensayada con una serie de métodos conocidos en la técnica como se describe en el presente documento, y, por ejemplo, en los ejemplos, a continuación. Esta capacidad puede ser ensayada además con una serie de métodos conocidos en la técnica como se describe en la bibliografía respectiva. Como ejemplos de dominios centrales de la anexina, véase también la figura 7, a continuación. Además, la expresión comprenderá en concreto el gen y/o la proteína y/o el ARNm de la anexina de vertebrados, en concreto de mamíferos (en concreto de seres humanos) y/o el fragmento central (dominio central) como se describe en el presente documento. La expresión también abarca el dominio central de la anexina en diferentes preparaciones, tal como en el contexto celular, una célula que expresa recombinantemente dicho dominio central, el dominio central purificado de la célula y sus fracciones, en concreto sus facciones biológicamente activas.

Se sabe que los agregados de proteínas potencian las respuestas inmunitarias. El mecanismo por el que los agregados de proteínas median en estas potentes respuestas de los anticuerpos no se conoce del todo. Sin embargo, se cree que la potencia se debe, al menos en parte, a la capacidad de la proteína multivalente para entrecruzar ampliamente los receptores de la superficie celular, como las inmunoglobulinas de las células B, y activar las células B. Por lo tanto, en el contexto de la invención, una realización incluye agregar el conjugado de proteína o la proteína de fusión de la invención para potenciar aún más las respuestas inmunitarias. Esto puede lograrse utilizando péptidos antigénicos multiméricos en los que la molécula antigénica se multimeriza directamente o a través de una secuencia de conector para formar un péptido poliantigénico con una secuencia antigénica repetida para la fusión con el dominio central de la anexina según la invención. Como alternativa, la proteína de fusión de la invención puede comprender además un resto que induce la agregación del conjugado de proteína o de la proteína de fusión, tal como un dominio de multimerización de la proteína o un dominio de dimerización, que está unido covalentemente a la proteína de fusión. Un ejemplo especialmente favorable de tal dominio de multimerización de proteínas es un dominio de superhélice, tal como un dominio de cremallera de isoleucina que estimula la trimerización de múltiples polipéptidos que tienen tal dominio. Otro ejemplo favorable de modificación para la multimerización de proteínas es el uso de biotina conjugada o una secuencia de biotinilación junto con la proteína estreptavidina. Otra opción en el contexto de la invención proporciona composiciones de la proteína de fusión de la invención en combinación con el agente para la agregación de proteínas.

Las proteínas de fusión también pueden fabricarse a nivel de codificación de ácidos nucleicos colocando, en línea y en el marco de codificación correcto, las dos o más secuencias de las porciones de las proteínas o péptidos, es decir, del dominio central de la anexina y del respectivo antígeno o péptido antigénico. Las proteínas de fusión se sintetizan por métodos conocidos por los expertos en la materia, incluida, por ejemplo, la síntesis de proteínas en fase sólida, y por técnicas moleculares que permiten la manipulación del ADN in vitro, incluida la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la mutagénesis dirigida por oligonucleótidos.

En el contexto de la presente invención, los términos y expresiones "receptor de lectina de tipo C", "dectina-1", "DC-SIGN" y "LRP-1" se entenderán como indicación/representación del fragmento mínimo del receptor o receptores, que es necesario y suficiente para unirse a un dominio central de la anexina como se describe y se ha ensayado en los ejemplos, y, por ejemplo, en Hesse como se ha mencionado anteriormente para las proteínas de fusión lectina-Fc. Esta capacidad puede ser ensayada además con una serie de métodos conocidos en la técnica como se describe en la bibliografía respectiva. Asimismo, los términos y expresiones comprenderán el homólogo de mamífero (en concreto de ratón) del gen y/o la proteína y/o el ARNm del receptor humano y/o el fragmento (parte de unión, fragmento o dominio) como se describe en el presente documento. Los términos y expresiones también abarcan los receptores y/o el fragmento mínimo de los receptores en diferentes preparaciones, tales como en el contexto celular, una célula que expresa (recombinantemente) dichos receptores y/o el fragmento mínimo de los receptores, purificado de la célula, y sus fracciones.

Con la dectina-1 y DC-SIGN como miembros de la familia de receptores de lectinas de tipo C y LRP-1, se pudieron identificar nuevos receptores de superficie de DC que se unen con alta afinidad al dominio central de todas las anexinas estudiadas. Esto indica que la dectina-1, DC-SIGN y LRP-1 son responsables de los efectos mediados por la anexina sobre la respuesta inmunitaria y la inducción de la presentación de antígenos.

El efecto de las anexinas sobre las DC a través de receptores específicos es un mecanismo molecular novedoso de presentación de antígenos, que da lugar a una multitud de posibilidades novedosas tanto para la terapia de cánceres y tumores como para las enfermedades infecciosas en mamíferos, tales como los ratones y los seres humanos.

El documento WO 2009/049892 describe un primer polipéptido (A) que comprende un polipéptido reclutador (a) que comprende al menos un dominio central de la anexina o una de sus variantes funcionales, un polipéptido cebo (b) y un luminóforo. La composición según la invención puede utilizarse para medir las interacciones proteína-proteína dentro y/o entre complejos de multiproteínas completos. Se describe el uso del método según la invención para la identificación de un compuesto de ensayo en un banco de compuestos de ensayo que modula una interacción proteína-proteína médicamente importante, sin que se divulgue ningún contexto de enfermedad concreto. El documento WO 2009/049892 no menciona ninguna interacción de la anexina con dectinaa-1, DC-SIGN y/o LRP-1, y tampoco permite la selección de compuestos y/o composiciones terapéuticamente importantes.

El documento WO 2005/027965 indica que la anexina I y otras anexinas están relacionadas con receptores específicos, que podrían ser estimulados o bloqueados por la unión de una de las anexinas o uno de sus fragmentos o un anticuerpo contra este receptor. Por lo tanto, las anexinas y/o sus fragmentos funcionales y/o las proteínas de fusión que comprenden una anexina o sus fragmentos funcionales se analizan para ser utilizadas para modular el sistema inmunitario. El documento WO 2005/027965 no dice nada sobre el uso del propio dominio central de la anexina para mediar en la presentación del antígeno y, por lo tanto, tampoco permite la selección de compuestos y/o composiciones terapéuticamente importantes.

La exposición de DC derivadas de la médula ósea ("bone marrow-derived DC", BMDC) a una proteína de fusión que comprende el dominio central de la anexina y el antígeno modelo ovoalbúmina (OVA) in vitro produjo una intensa presentación de péptidos derivados de OVA en las moléculas de la superficie de MHC de clase I (figura 1), así como a una estimulación específica fuertemente amplificada de las células T. tanto CD8+ como CD4+ (figuras 2 y 3). Estos resultados sugieren que el dominio central de la anexina tiene un papel no apreciado hasta ahora en la presentación de antígenos y en la presentación cruzada de los mismos. Por lo tanto, la manipulación de la presentación de antígenos mediada por el dominio central de la anexina puede resultar útil a la hora de diseñar estrategias de vacunación y, en consecuencia, ser beneficiosa para los pacientes con cáncer (vacunación con antígenos tumorales) o enfermedades infecciosas. Cabe destacar que este mecanismo, en el que el dominio central de la anexina media en el transporte y la presentación de antígenos cuando se administra exógenamente a las CD y se une a un antígeno, es intrínsecamente diferente de las funciones endógenas y citosólicas descritas de la anexina A1 (Tzelepis, Verway et al., 2015). Este mecanismo también es diferente de la función adyuvante de vacuna descrita de la unión de la anexina A2 al receptor 2 tipo Toll (Andersen, Xia et al., 2016), porque el dominio central de la anexina, tal como se describe en el presente documento, no media en la estimulación de las DC a través de los TLR, sino que media en el transporte de antígenos y la presentación (cruzada) de los mismos.

Se prefiere un conjugado de proteína o una proteína de fusión según la presente invención, en el que dicho péptido antigénico que es presentado por el MHC se obtenga de una proteína seleccionada del grupo que consiste en phCG, gp100 o Pmel17, HER2/neu WT1, mesotelina, CEA, gp100, MART1, TRP-2, NY-BR-1, NY-CO-58, MN (gp250), idiotipo, tirosinasa, telomerasa, SSX2, MUC-1, MART1, melano-A, NY-ESO-1, MAGE-1, MAGE-3, MAGE-A3, p53 y el antígeno asociado al melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA).

Otros péptidos antigénicos para su uso con la presente invención incluyen péptidos de cáncer seleccionados de antígenos asociados a tumores, por ejemplo, antígenos de cáncer autólogos obtenidos de un paciente. Los ejemplos no limitantes de antígenos de cáncer incluyen antígenos de leucemias y linfomas; tumores neurológicos, como astrocitomas o glioblastomas; melanoma; cáncer de mama; cáncer de pulmón; cáncer de cabeza y cuello; tumores gastrointestinales; cáncer gástrico; cáncer de colon; cáncer de hígado; cáncer de páncreas; tumores genitourinarios, como de cérvix; de útero; cáncer de ovario; cáncer vaginal; cáncer testicular; cáncer de próstata o de pene; tumores óseos; tumores vasculares; o cánceres de labio; nasofaringe; faringe y cavidad oral; esófago; recto; vesícula biliar; árbol biliar; laringe; pulmón y bronquios; vejiga; riñón; cerebro y otras partes del sistema nervioso; tiroides; enfermedad de Hodgkin; linfoma no hodgkiniano; mieloma múltiple y leucemia. En un aspecto específico, la composición comprende además péptidos antigénicos seleccionados de antígenos asociados a tumores se seleccionan de CEA; antígeno específico de próstata (PSA); HER-2/neu; BAGE; GAGE; MAGE 1-4; 6 y 12; MUC (mucina) (por ejemplo; MUC-1, MUC-2, etc.); gangliósidos GM2 y GD2; ras; myc; tirosinasa; MART (antígeno de melanoma); MARCO-MART; ciclina Bl; ciclina D; Pmel 17(gp100); secuencia del intrón V de GnT-V (secuencia V del intrón V de la N-acetilglucoaminiltransferasa); Ca psm de próstata; antígeno sérico de próstata (PSA); PRAME (antígeno de melanoma); p-catenina; MUM-1-B (producto génico mutado ubicuo del melanoma); GAGE (antígeno del melanoma) 1; BAGE (antígeno del melanoma) 2-10; C-ERB2 (Her2/neu); EBNA (antígeno nuclear del virus de Epstein-Barr) 1-6; gp75; virus del papiloma humano (VPH) E6 y E7; p53; proteína de resistencia pulmonar (PRL); Bcl-2; y Ki-67.

Otros péptidos o antígenos antigénicos para su uso en el contexto de la presente invención se seleccionan entre los antígenos virales. La expresión "antígeno viral" incluye cualquier sustancia que provoca una respuesta inmunitaria contra un virus. Los ejemplos incluyen Retroviridae, en particular el VIH-I y el VIH-LP; Picornaviridae, en concreto el virus de la poliomielitis y el virus de la hepatitis A; enterovirus, en concreto el virus Coxsackie humano, el rinovirus, el echovirus; Calciviridae, en concreto las cepas que causan gastroenteritis; Togaviridae, en concreto el virus de la encefalitis equina y el virus de la rubeola; Flaviridae, en concreto el virus del dengue, el virus de la encefalitis y el virus de la fiebre amarilla; Coronaviridae, en concreto el coronavirus; Rhabdoviridae, en concreto el virus de la estomatitis vesicular y el virus de la rabia; Filoviridae, en concreto el virus del Ébola o y el virus de Marburgo; Paramyxoviridae, en concreto el virus de la parainfluenza, el virus de las paperas, el virus del sarampión y el virus sincitial respiratorio; Orthomyxoviridae, en concreto el virus de la gripe; Bungaviridae, en concreto el virus Hantaan, el virus bunga, el flebovirus y el virus Nairo; Arenaviridae, en concreto el virus de la fiebre hemorrágica; Reoviridae, en concreto el reovirus, el orbivirus y el rotavirus; Birnaviridae; Hepadnaviridae, en concreto el virus de la hepatitis B; Parvoviridae, en concreto el parvovirus; Papovaviridae, en concreto el virus del papiloma, el virus de simio 40 (SV40) y el virus del polioma; Adenoviridae; Herpesviridae, en concreto el virus del herpes simple (HSV) 1 y 2, el virus de la varicela zoster, el citomegalovirus (CMV), el virus del herpes; Poxviridae, en concreto el virus de la viruela y el virus de vaccinia; e Iridoviridae, en concreto el virus de la peste porcina africana; la hepatitis C, y el VPH L6, el v Ph L7, sus fragmentos y derivados.

Otros antígenos o péptidos antigénicos para su uso en el contexto de la presente invención se seleccionan entre los antígenos bacterianos. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "antígeno bacteriano" incluye cualquier sustancia que provoca una respuesta inmunitaria contra una bacteria. Los ejemplos incluyen especies de Helicobacter, en concreto Helicobacter pyloris; especies de Borelia, en concreto Borelia burgdorferi; especies de Legionella, en concreto Legionella pneumophilia; especies de Mycobacteria, en concreto M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. gordonae; especies de Staphylococcus, en concreto Staphylococcus aureus; especies de Neisseria, en concreto N. gonorrhoeae, N. meningitidis; especies de Listeria, en concreto Listeria monocytogenes; especies de Streptococcus, en concreto S. pyogenes, S. agalactiae; S. faecalis; S. bovis, S. pneumoniae; especies anaerobias de Streptococcus; especies patógenas de Campylobacter; especies de Enterococcus; especies de Haemophilus, en concreto Haemophilus influenzae; especies de Bacillus, en concreto Bacillus anthracis; especies de Corynebacterium, en concreto Corynebacterium diphtheriae; especies de Erysipelothrix, en concreto Erysipelothrix rhusiopathiae; especies de Clostridium, en concreto C. perfringens, C. tetani; especies de Enterobacter, en concreto Enterobacter aerogenes, especies de Klebsiella, en concreto Klebsiella pneumoniae; especies de Pasturella, en concreto Pasturella multocida; especies de Bacteroides; especies de Fusobacterium, en concreto Fusobacterium nucleatum; especies de Streptobacillus, en concreto Streptobacillus moniliformis; especies de Treponema, en concreto Treponema pertenue; Leptospira; especies patógenas de Escherichia; y especies de Actinomyces, en concreto Actinomyces israelii.

Se prefiere además un conjugado de proteína o una proteína de fusión según la presente invención, en el que dicho conjugado o dicha proteína de fusión además se conjuga/condensa con una molécula coestimuladora, o uno de sus fragmentos inmunogénicos, o una segunda secuencia peptídica coestimuladora.

Otro aspecto de la presente invención se refiere entonces a un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión o el conjugado de proteína según la presente invención. Preferentemente, la secuencia codificante codifica un péptido antigénico que es presentado por el MHC originado de una proteína seleccionada del grupo que consiste en phCG, gp100 o Pmel17, HER2/neu, WT1, mesotelina, CEA, gp100 MARTI, TRP-2, NY-BR-1, NY-CO-58, MN (gp250), idiotipo, tirosinasa, telomerasa, SSX2, MUC-1, MARTI, melano-A, NY-ESO-1, MAGE-1, MAGE-3, MAGE-A3, p53 y antígeno asociado al melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA). Más preferentemente, dicha secuencia codificante está condensada con al menos una secuencia de ácido nucleico estimuladora de la DC (adicional). También es posible utilizar fusiones de múltiples péptidos antigénicos, por ejemplo múltiples secuencias descubiertas en una enfermedad tumoral, o antígenos específicos del paciente descubiertos en un tumor individual.

Otro aspecto de la presente invención se refiere entonces a un vector de expresión recombinante que expresa el ácido nucleico según la invención.

El término "contacto" en la presente invención significa cualquier interacción entre las sustancias/antígenos potencialmente de unión con el dominio central de la anexina, por lo que cualquiera de los dos componentes pueden estar independientemente entre sí en una fase líquida, por ejemplo en solución, o en suspensión o pueden estar unidos a una fase sólida, por ejemplo, en forma de una superficie prácticamente plana o en forma de partículas, esferas o similares.

También se proporciona un método no reivindicado para fabricar una composición farmacéutica para tratar o prevenir enfermedades infecciosas o cánceres, que comprende la etapa de mezclar el conjugado de proteína o la proteína de fusión según la presente invención, o el ácido nucleico según la presente invención, o el vector de expresión según la presente invención, con un agente o vehículo adecuado.

Así, los compuestos de la invención pueden ser mezclados con sustancias auxiliares y/o aditivos adecuados. Dichas sustancias comprenden sustancias farmacológicamente aceptables, que aumentan la estabilidad, la solubilidad, la biocompatibilidad o la semivida biológica del compuesto que interactúa, o comprenden sustancias o materiales que deben incluirse para determinadas vías de aplicación como, por ejemplo, solución intravenosa, aerosoles, tiritas o píldoras.

Los vehículos, excipientes y estrategias para formular una composición farmacéutica, por ejemplo, para ser administrada de modo sistémico o por vía tópica, por cualquier vía convencional, en concreto por vía entérica, por ejemplo por vía oral, en forma de comprimidos o cápsulas, por vía parenteral, por ejemplo en forma de soluciones o suspensiones inyectables, por vía tópica, por ejemplo en forma de lociones, geles, pomadas o cremas, o en forma nasal o de supositorio, son bien conocidos los expertos y se describen en la bibliografía respectiva.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad infecciosa o cáncer en un sujeto, que comprende el conjugado de proteína o la proteína de fusión según la presente invención, o el ácido nucleico según la presente invención, o el vector de expresión según la presente invención, y un vehículo. Una realización se refiere a la composición farmacéutica para su uso, en la que la composición farmacéutica se utiliza como una vacuna.

La administración de un agente, por ejemplo, el complejo o la fusión, puede llevarse a cabo por cualquier método que permita que el agente llegue a las células diana. Estos métodos incluyen, por ejemplo, la inyección, el depósito, la implantación, los supositorios, la ingestión oral, la inhalación, la administración tópica o cualquier otro método de administración en el que se obtenga el acceso del agente a las células diana. Las inyecciones pueden ser, por ejemplo, intravenosas, intradérmicas, subcutáneas, intramusculares o intraperitoneales. La implantación incluye la inserción de sistemas implantables de administración de fármacos, por ejemplo, microesferas, micropartículas recubiertas, hidrogeles, depósitos poliméricos, matrices de colesterol, sistemas poliméricos, por ejemplo, sistemas de erosión y/o difusión de matrices, y sistemas no poliméricos, por ejemplo, gránulos comprimidos, fusionados o parcialmente fusionados. Los supositorios incluyen los de glicerina. Las dosis para la ingestión oral pueden estar recubiertas entéricamente. La inhalación incluye la administración del agente con un aerosol en un inhalador, ya sea solo o unido a un vehículo que pueda ser absorbido. El agente puede estar suspendido en un líquido, por ejemplo, en forma disuelta o coloidal. El líquido puede ser un disolvente, un disolvente parcial o un no disolvente. En muchos casos, se puede utilizar agua o un líquido orgánico.

En ciertas realizaciones, el compuesto (activador o inhibidor) se administra al sujeto mediante la administración de un ácido nucleico recombinante, como, por ejemplo, un ARN de antígeno o de dominio central de la anexina. Preferentemente, el ácido nucleico recombinante es un vector de terapia génica.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método o uso como el descrito en el presente documento, en el que la composición farmacéutica comprende además ingredientes farmacéuticamente activos adicionales para tratar o prevenir enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias crónicas, alergias o cáncer, es decir, agentes quimioterapéuticos.

También se proporciona un método no reivindicado para tratar o prevenir enfermedades infecciosas o cánceres en un paciente, que comprende administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de un dominio central de la anexina aislado; un complejo o fusión de un dominio central de la anexina con al menos un antígeno o compuesto alergénico; un anticuerpo activador, opcionalmente acoplado al menos a un antígeno o compuesto alergénico; o una composición farmacéutica obtenida por el método según la presente invención.

En general, el médico responsable basará un tratamiento en el compuesto identificado, y opcionalmente también en otros datos individuales del paciente (datos clínicos, antecedentes familiares, ADN, etc.), y también se puede realizar un tratamiento basado en la combinación de estos factores. Este método de la presente invención implica, por ejemplo, la integración de los datos inmunológicos de diagnóstico individuales con la información clínica del paciente y las estadísticas generales de asistencia sanitaria para permitir, por ejemplo, la aplicación de la medicina personalizada al paciente. También se puede utilizar información importante sobre la eficacia de los medicamentos, las interacciones farmacológicas y otras condiciones del estado del paciente.

Se prefiere un método terapéutico según la presente invención, en el que dicho mamífero a tratar es un ratón, una rata o un ser humano.

Preferentemente, un agente activo de la invención (el conjugado de proteína o la proteína de fusión de la invención) se administra en forma de una composición farmacéutica que comprende un agente activador como se ha descrito anteriormente, como un anticuerpo, un nucleótido o un compuesto de unión activador, para la unión del receptor/dominio central de la anexina. Preferentemente, dicho paciente es un ser humano. El tratamiento incluye, por ejemplo, la prevención, el tratamiento, la reducción de los síntomas o la curación de la enfermedad o condición, es decir, de las enfermedades inmunológicas como la inmunodeficiencia, las enfermedades infecciosas o el cáncer.

En general, el médico responsable basará un tratamiento en el compuesto identificado, y opcionalmente también en otros datos individuales del paciente (datos clínicos, antecedentes familiares, ADN, etc.), y también se puede realizar un tratamiento basado en la combinación de estos factores. Este método de la presente invención implica, por ejemplo, la integración de los datos de diagnóstico individual del cáncer con la información clínica del paciente y las estadísticas generales de asistencia sanitaria para conseguir, por ejemplo, la aplicación de la medicina personalizada al paciente.

También se puede utilizar información importante sobre la eficacia de los medicamentos, las interacciones farmacológicas y otras condiciones del estado del paciente.

Se prefiere un método terapéutico según la presente invención, en el que dicho mamífero a tratar es un ratón, una rata o un ser humano.

Más preferentemente, el cáncer a tratar es un tumor sólido, seleccionado, por ejemplo, de cáncer de mama, hueso, ovario, hígado, riñón y pulmón.

Preferentemente, un agente activo se administra en forma de una composición farmacéutica, como un conjugado de proteína o una proteína de fusión de la invención, y dicho paciente es un ser humano. El tratamiento incluye, por ejemplo, la prevención, el tratamiento, la reducción de los síntomas o la curación de la enfermedad o condición, es decir, del cáncer. El tratamiento generalmente implica la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del conjugado de proteína o de la proteína de fusión de la invención al sujeto que necesita el tratamiento.

Se proporciona además el método no reivindicado para la vacunación de un sujeto que comprende la administración del conjugado de proteína o la proteína de fusión de la invención al sujeto que necesita la vacunación. El conjugado de proteína o la proteína de fusión de la invención se presenta preferentemente en forma de composición vacunal y comprende además al menos un vehículo y/o excipiente y/o adyuvante vacunal.

Las composiciones farmacéuticas y, en concreto, las composiciones vacunales divulgadas en el presente documento comprenden preferentemente uno o más compuestos inmunoestimulantes, como los adyuvantes. Un "adyuvante" es un agente que potencia la producción de una respuesta inmunitaria de forma no específica. Los adyuvantes comunes incluyen suspensiones de minerales (alumbre, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio) sobre los que se adsorbe la proteína de fusión de la invención; emulsiones, incluidas de agua en aceite y aceite en agua (y sus variantes, incluidas las emulsiones dobles y las emulsiones reversibles), liposacáridos, lipopolisacáridos, ácidos nucleicos inmunoestimulantes (como oligonucleótidos CpG), liposomas, agonistas de los receptores de tipo Toll (en concreto, agonistas de TLR2, TLR4, TLR7/8 y TLR9), y diversas combinaciones de dichos componentes.

Una "cantidad eficaz" es una cantidad del compuesto o compuestos o de la composición farmacéutica descrita en el presente documento que aumenta la presentación del antígeno. La cantidad alivia los síntomas que se presentan para la enfermedad y/o trastorno.

El paciente mamífero puede ser una rata, un ratón, una cabra, un conejo, una oveja, un caballo, un mono o un ser humano; se prefiere un ratón, una rata o un ser humano.

Otro aspecto preferido de la presente invención se refiere entonces a un kit, que comprende materiales para la vacunación según la presente invención como se describe en el presente documento, en uno o varios recipientes, que preferentemente comprende una herramienta de selección según la presente invención. Opcionalmente, el kit comprende instrucciones para llevar a cabo un método según la presente invención como se describe en el presente documento.

El kit puede comprender además uno o más de (iii) un tampón, (iv) un diluyente, (v) un filtro, (vi) una aguja, o (v) una jeringa. El recipiente es preferentemente una botella, un vial, una jeringa o un tubo de ensayo; y puede ser un recipiente multiuso. El recipiente puede estar fabricado con una variedad de materiales, como el vidrio o el plástico. Preferentemente, el kit y/o el envase contienen instrucciones en el envase o asociadas a él que indican las instrucciones de reconstitución y/o uso.

Se prefiere un kit según la presente invención, en el que dicho kit comprende materiales para un método seleccionado del grupo de transferencias Western y/o ensayo de inmunoadsorción enzimática ("Enzyme-Linked Immunosorbent Assay", ELISA). Por ejemplo, el marcador puede indicar que la formulación liofilizada debe ser reconstituida a ciertas concentraciones de anticuerpo que sean adecuadas para los métodos mencionados, como el ELISA.

Se prefiere además el uso según la presente invención, en el que dicho kit comprende anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, específicos para el dominio central de la anexina y/o partes funcionales y variantes del mismo como se describe en el presente documento.

Las siguientes figuras, secuencias y ejemplos sirven simplemente para ilustrar la invención y no deben interpretarse para restringir el alcance de la invención a las realizaciones concretas de la invención descritas en los ejemplos.

La figura 1 demuestra que una proteína de fusión que contiene el dominio central de la anexina y el antígeno modelo ovoalbúmina (Anx-OVA) conduce a una presentación cruzada del antígeno altamente mejorada en las moléculas MHC de clase I sobre las células dendríticas (DC) en comparación con el antígeno OVA solo. A) Presentación esquemática del experimento. Los DC derivados de la médula ósea murina se incubaron con OVA o Anx-OVA. El péptido derivado de OVA presentado de forma cruzada SIINFEKL (SEQ ID NO: 4) dentro de las moléculas MHC I sobre las DC se detectó mediante un anticuerpo específico (anti-MHC-SIINFEKL, anticuerpo 25-D1.16, eBioscience). B) Representación de las DC positivas para el péptido SIINFEKL derivado de OVA presentado de forma cruzada, tal como se detectó en la citometría de flujo tras la incubación con cantidades iguales (500 nM) de OVA o Anx-OVA durante 12 h. N = 3.

La figura 2 demuestra que la incubación de DC con una proteína de fusión que contiene el dominio central de la anexina y el antígeno modelo ovoalbúmina (Anx-OVA) conduce a una activación de células T CD8+ altamente mejorada en comparación con la incubación con el antígeno OVA solo. A) Presentación esquemática del experimento. Los DC derivados de la médula ósea murina se incubaron con OVA o Anx-OVA. La activación de las células T CD8+ se detectó utilizando células T CD8+ OT-I portadoras de un receptor transgénico de células T específico para el péptido SIINFEKL derivado de OVA (SEQ ID ⁿ O:4). La activación de las células T se detectó mediante la secreción de Interferón-^ (IFN-^). B) Las DC derivadas de la médula ósea murina se incubaron con cantidades iguales de OVA o Anx-OVA, o con el péptido SIINFEKL purificado como control positivo. Tras 12 horas de incubación, las DC se cocultivaron durante otros 3-5 días con células T OT-I. La activación de células T OT-I se detectó midiendo la secreción de IFN-^ en ELISA. N = 3.

La figura 3 demuestra que la incubación de DC con una proteína de fusión que contiene el dominio central de la anexina y el antígeno modelo ovoalbúmina (Anx-OVA) conduce a una activación de células T CD4+ altamente mejorada en comparación con la incubación con el antígeno OVA solo. A) Presentación esquemática del experimento. Los DC derivados de la médula ósea murina se incubaron con OVA o Anx-OVA. La activación de las células T CD4+ se detectó utilizando células T CD4+ OT-II portadoras de un receptor transgénico de células T específico para el péptido ISQAVHAAHAEINEAGR derivado de OVA (SEQ ID NO: 5) y se detectó la activación de las células T mediante la secreción de interleucina-2 (IL-2). B) Las DC derivadas de la médula ósea murina se incubaron con cantidades iguales de OVA o Anx-OVA. Tras 12 h de incubación, las DC se cocultivaron durante 1 día con células T OT-II. La activación de células T OT-II se detectó midiendo la secreción de IL-2 en ELISA.

La figura 4 demuestra que la incubación de DC con una proteína de fusión que contiene el dominio central de la anexina y el antígeno modelo ovoalbúmina (Anx-OVA) conduce a una activación de células T CD4+ altamente mejorada en comparación con la incubación con el antígeno OVA solo. A) Presentación esquemática del experimento. Los DC derivados de la médula ósea murina se incubaron con OVA o Anx-OVA. La activación de las células T CD4+ se detectó utilizando células T CD4+ OT-II portadoras de un receptor transgénico de células T específico para el péptido ISQAVHAAHAEINEAGR derivado de OVA (SEQ ID NO: 5) y se detectó la activación de las células T mediante la secreción de interferón-^ (IFN-n). B) Las DC derivadas de la médula ósea murina se incubaron con cantidades iguales de OVA o Anx-OVA. Tras 12 horas de incubación, las DC se cocultivaron durante 3-5 días más con células T OT-II. La activación de células T OT-II se detectó midiendo la secreción de IFN-^ en ELISA.

La figura 5 demuestra que diversas anexinas se unen al receptor LRP-1 con alta afinidad. La unión de las anexinas recombinantes indicadas y del dominio central de la anexina A1 a la LRP-1 inmovilizada se detectó mediante una microbalanza de cristal de cuarzo. Las anexinas recombinantes se analizaron a 3 concentraciones diferentes. Se muestran las curvas de unión ajustadas de las anexinas indicadas y del dominio central de la anexina A1 a LRP-1. Las afinidades calculadas para todas las anexinas y el dominio central de la anexina A1 oscilan entre 50 y 300 nM. Anexina A1 murina (mAnxA1): círculos negros; dominio central de la anexina A1 murina (dominio central de mAnxA1): círculos blancos; anexina A5 murina (mAnxA5): cuadrados negros; anexina A13 murina (mAnxA13): cuadrados blancos.

La figura 6 demuestra que varias anexinas se unen al receptor dectina-1 con alta afinidad. A) Análisis de la unión de la anexina A1 recombinante (anexina I) y la anexina A5 (anexina V) a las moléculas de lectina tipo C inmovilizadas indicadas en ELISA. B) Sensogramas de espectroscopía de resonancia de plasmón superficial de la unión de la anexina A1 murina, la anexina A5, la anexina A13 y el dominio central de la anexina A1 a la molécula de superficie dectina-1. Se dejó que las concentraciones indicadas de las anexinas recombinantes indicadas se unieran a la dectina-1 inmovilizada y se midieron las moléculas unidas mediante resonancia de plasmón superficial. Se ha calculado que la afinidad de la anexina por la dectina-1 se encuentra en el intervalo nanomolar (aproximadamente 100 nM).

La figura 7 muestra las estructuras de dominio de proteínas de anexina representativas. Los ortólogos de las 12 anexinas humanas mostradas en otros vertebrados tienen las mismas estructuras, con una conservación estricta de las cuatro repeticiones en la región central (negro) y una variación en la longitud y la secuencia en las regiones aminoterminales (sombreado). Las ANXA1 y ANXA2 humanas se muestran como dímeros, con el miembro de la familia de proteínas S100 con el que interactúan. Las estructuras de los dominios de otros organismos modelo se han obtenido de los datos públicos puestos a disposición por los correspondientes proyectos de secuenciación del genoma. Características: S100Ax, sitios de unión del miembro indicado de la familia S100 de proteínas de unión al calcio; P, sitios de fosforilación conocidos; K, sinapomorfía KGD (una característica conservada y heredada de las proteínas); I, inserciones de codones (+x indica el número de codones insertados); S-A/b, polimorfismos de codificación no sinónimos (SNP) con el aminoácido en la variante principal (A) y el aminoácido en la variante secundaria (b); N, sitios putativos de unión a nucleótidos; D, deleciones de codones (-x indica el número de codones delecionados); A, exones empalmados de modo alternativo; Mir, miristoilación. La longitud total de cada proteína se indica a la derecha. Tomado de Moss y Morgan. The annexins, Genome Biol., 2004, 5(4): 219.

La figura 8 muestra los números de registro en formato FASTA y un alineamiento de las secuencias de proteína de las anexinas A1, A5 y A13 humanas y murinas. La secuencia conservada del dominio central de las anexinas está recuadrada. Un * (asterisco) indica las posiciones que tienen un único resto totalmente conservado. A : (dos puntos) indica la conservación entre grupos de propiedades muy similares. A . (punto) indica la conservación entre grupos de propiedades débilmente similares.

La figura 9 demuestra que la vacunación con una proteína de fusión que contiene el dominio central de la anexina y el antígeno modelo ovoalbúmina (Anx-OVA) mejora intensamente la eficacia de la vacunación en comparación con el antígeno OVA solo. A) Presentación esquemática del experimento. Se inmunizaron ratones C57BL/6 wt con 400 pMol de OVA o Anx-OVA por animal. La inducción de células T CD8+ específicas del antígeno (OVA) se detectó 7 días después de la vacunación utilizando tetrámeros SIINFEKL-MHC de clase I marcados con fluorescencia. B) y C) Resultados que indican la frecuencia de células T CD8+ específicas de OVA dentro de todas las células T CD8+ después de las vacunaciones indicadas como promedio de 3 ratones por grupo (B) y para cada animal individualmente (C). OVA: ovoalbúmina, Anx-OVA: Proteína de fusión que contiene el dominio central de la anexina, una secuencia de conectora y ovoalbúmina. - : sin vacunación

La figura 10 muestra la secuencia de ADN [SEQ ID NO: 13] (A) y la secuencia de aminoácidos [SEQ ID NO: 14] (B) de la proteína de fusión Anx-OVA utilizada para la vacunación. Sombreado gris claro: dominio central de anexina A1 humana; sin sombreado: secuencia conectora; sombreado gris oscuro: ovoalbúmina (OVA). Las SEQ ID NO:1 a 3 y 6 a 8 muestran las secuencias de la anexina humana y de ratón 1, 5 y 13, respectivamente, tal como se utilizan en el contexto de la presente invención.

Las SEQ ID NO:4 y 5 muestran secuencias de péptidos tal como se utilizan en el contexto de la presente invención. Las SEQ ID NO: 9 a 12 muestran las secuencias de cebadores tal como se utilizan en la presente invención.

Ejemplos

Secuencias

Las secuencias son las siguientes:

Ratones.

Los ratones C57BL/6 se adquirieron en el Jackson Laboratory. Todos los ratones se mantuvieron en instalaciones libres de patógenos específicos.

Células.

Para la diferenciación de los precursores de BM a BMDC utilizando GM-CSF murino recombinante, se sembraron 1 * 106 células a una densidad de 1 * 106 células/ml en medio completo RPMI 1640 (FCS al 10 %, penicilina/estreptomicina 10 U/ml, L-glutamina 300 mg/l, GM-CSF 20 ng/ml (Immunotools)) en una placa de 24 pocillos. Después de 2 días, el medio se sustituyó por un medio fresco. Después de 4 días, se retiró la mitad del medio y se sustituyó por medio fresco. Los experimentos se realizaron 7-8 días después de la diferenciación.

Generación de la proteína de fusión antígeno-dominio central recombinante.

El plásmido de ratón (m)AnxA1-OVA-pET41a se generó clonando ovoalbúmina de pollo (OVA; NM_205152 o NP_990483, respectivamente, a partir del aminoácido 140) en una versión modificada de pET41a que porta un marcador FLAG C-terminal, un sitio de corte de la proteasa de Precisión y un marcador de proteína A. Además, se introdujeron dos conectores flexibles y un sitio de corte del virus del grabado del tabaco (TEV) entre mAnxA1 y OVA. Se realizaron sucesivas PCR utilizando los siguientes cebadores:

Directo_1: 5' GGCGGAGGTTCAGGAGGTTCAGCAAGCATC 3'; (SEQ ID NO: 9),

Directo_2: 5' GAAAACTTGTATTTCCAGGGCGGCGGAGTTCAGG 3'; (SEQ ID NO: 10),

Directo_3: 5' GGATCCGGCGGAGGTTCAGGCGGAGGTTCAGAAAACTTGTATTTCCAGGGCGG 3' (SEQ ID NO: 11) e

Inverso: 5' GGATCCAGGGGAAACATCTGCCAAAG 3' (SEQ ID NO: 12).

El producto final de la PCR se subclonó utilizando el sistema de vectores pGEM® -T easy de Promega. Se utilizó la cepa de Escherichia coli BL21(DE3)pLysS (Promega) para expresar la proteína de fusión. Se utilizaron cultivos nocturnos de E. coli transformados con el vector descrito anteriormente para inocular 4 L de LB que contenían kanamicina 50 pg/ml y cloranfenicol 34 pg/ml. Los cultivos se agitaron a 180 rpm hasta que la A600nm alcanzó 0,6. La expresión se indujo utilizando isopropil-D-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM durante 4 horas a 37 °C. Las células se recolectaron por centrifugación y se conservaron congeladas a 20 °C. Los sedimentos celulares que contenían la proteína de fusión recombinante marcada con la proteína A se resuspendieron en tampón de lisis bacteriano nativo y se disociaron mediante seis ciclos de congelación y descongelación. El extracto celular se cargó en esferas IgG Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare). La eliminación del LPS se logró mediante un lavado con TBS que contenía Triton X-114 al 0,1 % (Sigma-Aldrich), como se ha descrito anteriormente (Reichelt, Schwarz et al., 2006; Zimmerman, Petit Frere et al., 2006). El Tritón X-114 se eliminó lavando con TBS que contenía Tween-20 al 0,05 %. Después de escindir la proteína de fusión con proteasa Protease (GE Healthcare) y de eliminar la proteasa PreScission utilizando esferas de glutatión Sepharose 4B (Amersham Biosciences), la proteína recombinante se dializó contra PBS. Tras la filtración estéril, se midió la concentración de proteínas mediante el ensayo BCA (Pierce) y se determinó el contenido de LPS mediante el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (Lonza).

Las proteínas recombinantes se expresaron en la cepa de Escherichia coli BL21(DE3)pLysS (Promega) a partir del vector pET41a (Novagen). Los productos de la PCR que codifican una proteína de fusión del dominio central de la anexina A1 y la ovoalbúmina de pollo de longitud completa se clonaron en pET41a, que porta un marcador FLAG C-terminal, un sitio de corte de la proteasa PreScission y un marcador de proteína A. Los lisados bacterianos (10000 * g, 4 °C durante 40 minutos) se cargaron en esferas IgG Sepharose 6 Fast Flow preequilibradas (GE Healthcare). La eliminación del LPS se logró mediante un lavado con TBS que contenía Triton X-114 al 0,1 % (Sigma). El Tritón X_114 se eliminó lavando con TBS que contenía Tween-20 al 0,05 % (Gerbu). Tras escindir la proteína de fusión con la proteasa PreScission (GE Healthcare) y eliminar la proteasa PreScission, la proteína recombinante se dializó contra PBS. Se determinó que el contenido de LPS en todas las preparaciones de anexina A1 era inferior a 5 EU/mg utilizando el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (Lonza) según las instrucciones del fabricante.

Detección de la presentación de antígenos in vitro.

Se incubaron 2 * 105 BMDC de ratones C57BL/6 de tipo salvaje con 500 nM o la cantidad indicada de ovoalbúmina recombinante (OVA, Sigma) o con la proteína de fusión de dominio central de la anexina-OVA. Tras 8-12 h, las DC se lavaron con PBS y se incubaron con un anticuerpo marcado con fluorescencia contra el péptido SIINFEKL derivado del OVA en el m Hc de clase I (anticuerpo 25-D1.16, eBioscience). Las células positivas a SIINFEKL se detectaron con FACS (FACS-Canto, Becton-Dickinson).

Cocultivo de DC y células T y activación de células T.

Se incubaron 2 * 105 BMDC de ratones C57BL/6 de tipo salvaje con 500 nM o la cantidad indicada de ovoalbúmina recombinante (OVA, Sigma) o con la proteína de fusión de dominio central de la anexina-OVA. Tras 12 horas, se añadieron a los cultivos de DC 1 * 106 células T CD8+ o CD4+ purificadas magnéticamente (Easysep, Stemcell Technologies) procedentes de bazos de ratones OT-I u OT-II, respectivamente. Al cabo de 1-2 días (interleucina-2) o 3-5 días (interferón-^) se determinaron las citocinas indicadas en los sobrenadantes del cultivo mediante ELISA (Becton-Dickinson).

Medición de la afinidad de la unión entre la anexina y LRP-1.

Para medir la afinidad de la unión de LRP-1 a diferentes anexinas (anexina A1, A5 y A13), se utilizó el dispositivo A100 (ATTANA). La LRP-1 se inmovilizó sobre un carboxichip de LNB según las instrucciones del fabricante. Para ello, primero se activó el chip con EDC/SulfoNHS según las instrucciones del fabricante, y luego se inyectó LRP1 purificada (5-15 pg/ml) en un tampón acetato de sodio (pH 4,0) en el chip hasta alcanzar un aumento de la frecuencia a 70-100 Hz. A continuación, se saturaron los puntos de unión restantes en el chip mediante dos inyecciones de etanolamina, y se tamponó el chip en PBS. Para la incubación con las diferentes anexinas, se prepararon en seis concentraciones diferentes en PBS con calcio 2 mM, y se midieron por triplicado. Después de cada inyección de anexina, el chip se regeneró con EDTA/PBS 5 mM y NaCl 3 M antes de la siguiente inyección de anexina.

Medición de la unión de la anexina a diferentes receptores mediante ELISA.

Para comprobar la unión a las anexinas, se inmovilizan moléculas receptoras putativas, sus fragmentos o proteínas de fusión (por ejemplo, LRP-11, dominios individuales de LRP-1 o proteína Fc de dectina-1) sobre una placa ELISA a 10 |jg/ml en tampón de recubrimiento (carbonato-bicarbonato -1,5 g de Na² CO³ ; 2,93 g de NaHCOa; agua destilada, 1 litro, pH hasta 9,6). Tras el lavado (3x PBS Tween al 0,01%) y el bloqueo (caseína al 1 % en PBS), se incubaron diferentes concentraciones de anexinas recombinantes en los pocillos durante 2h, seguido de 5 etapas de lavado (PBS-Tween al 0,05 %). A continuación, las anexinas unidas se detectaron mediante reactivos secundarios adecuados (por ejemplo, anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa de rábano (HRP) o anticuerpos secundarios marcados con biotina más HRP marcada con estreptavidina) a las proteínas de anexina recombinantes y se midieron por reactividad con un sustrato adecuado (por ejemplo, OPD) en un lector de placas ELISA. El ensayo también puede realizarse inmovilizando diferentes anexinas sobre una placa y sondeando con moléculas receptoras recombinantes, sus fragmentos o proteínas de fusión (por ejemplo, LRP-11, dominios individuales de LRP-1 o proteína Fc de dectina-1).

Mediciones de afinidad de unión para anexina-dectina 1 mediante resonancia de plasmón superficial.

La resonancia de plasmón superficial (SPR) es una herramienta valiosa para analizar las interacciones de los ligandos con los receptores en tiempo real y para proporcionar información sobre la afinidad y la cinética de la unión. La SPR es una técnica para medir la cinética de asociación y disociación del ligando, denominado analito, con un receptor. El analito o el receptor pueden ser inmovilizados sobre un chip detector que lleva una película de oro. La asociación del analito y del receptor con uno u otro, dependiendo de cuál esté inmovilizado, induce un cambio en el índice de refracción de la capa en contacto con la película de oro. Esto se mide como un cambio en el índice de refracción en la capa superficial y se registra como la señal SPR en unidades de resonancia (RU). Para la preparación de las superficies recubiertas con dectina-1, se inmovilizó la dectina-1 a un caudal de 10 jl/min. El chip CM5 se activó mediante la inyección de una mezcla de N-etil-N'-(dietilaminopropil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) durante 10 minutos y se funcionalizó mediante la inyección de aectina-1 100 jg/m L y 10 jg/m L en tampón acetato de pH 5,5 durante 7 minutos. A continuación, los grupos carboxilos activados restantes se bloquearon mediante la inyección de etanolamina 1 M durante 10 minutos. Las células de flujo de control fueron tratadas con EDC/NHS, seguido de etanolamina como se ha descrito. Se inyectaron gradientes de concentración de las diferentes anexinas sobre las superficies funcionalizadas con dectina-1 a 10 jL/min, permitiendo 60 segundos para el contacto y 300 segundos para los tiempos de disociación, seguidos de la regeneración utilizando metil-a-D-manopiranósido 100 mM a 30 jL/min durante 30 segundos. Los datos experimentales se analizaron con el software de evaluación Biacore S20 T100. Los análisis cinéticos basados en un modelo de interacción 1:1 para la interacción de los complejos de anexinadectina-1 se realizaron utilizando Scrubber2 (BioLogic Software, Campbell, Australia).

En la figura 9 un experimento in vivo demuestra que la vacunación con una proteína de fusión que contiene el dominio central de la anexina y el antígeno modelo ovoalbúmina (Anx-OVA) mejora intensamente la eficacia de la vacunación en comparación con el antígeno OVA solo.

Referencias bibliográficas citadas

Andersen, B. M., J. Xia, A. L. Epstein, J. R. Ohlfest, W. Chen, B. R. Blazar, C. A. Pennell y M. R. Olin (2016), "Monomeric annexin A2 is an oxygen-regulated toll-like receptor 2 ligand and adjuvant", J. Immunother. Cancer, 4: 11.

Arur, S., U. E. Uche, K. Rezaul, M. Fong, V. Scranton, A. E. Cowan, W. Mohler y D. K. Han (2003), "Annexin I is an endogenous ligand that mediates apoptotic cell engulfment", Dev. Cell, 4(4): 587-598.

Buhrman, J. D. y J. E. Slansky (2013), "Improving T cell responses to modified peptides in tumor vaccines", Immunol. Res., 55(1-3): 34-47.

Emonard, H., L. Theret, A. H. Bennasroune y S. Dedieu (2014), "Regulation of LRP-1 expression: make the point", Pathol. Biol. (París), 62(2): 84-90.

Ernst, S., C. Lange, A. Wilbers, V. Goebeler, V. Gerke y U. Rescher (2004), "An annexin 1 N-terminal peptide activates leukocytes by triggering different members of the formyl peptide receptor family", J. Immunol., 172(12): 7669-7676.

Farber, S. A., R. A. De Rose, E. S. Olson y M. E. Halpern (2003), "The zebrafish annexin gene family", Genome Res., 13(6A): 1082-1096.

Fatimathas, L. y S. E. Moss (2010), "Annexins as disease modifiers", Histol. Histopathol. 25(4): 527-532.

Gerke, V. y S. E. Moss (2002), "Annexins: from structure to function", Physiol. Rev., 82(2): 331-371.

Grakoui, A., S. K. Bromley, C. Sumen, M. M. Davis, A. S. Shaw, P. M. Alien y M. L. Dustin (1999), "The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation", Science, 285(5425): 221-227. Hayhoe, R. P., A. M. Kamal, E. Solito, R. J. Flower, D. Cooper y M. Perretti (2006), "Annexin 1 and its bioactive peptide inhibit neutrophil-endothelium interactions under flow: indication of distinct receptor involvement", Blood, 107(5): 2123-2130.

Kambayashi, T. y T. M. Laufer (2014), "Atypical MHC class II-expressing antigen-presenting cells: can anything replace a dendritic cell?", Nat. Rev. Immunol., 14(11): 719-730.

Ling, T. Y., C. L. Chen, Y. H. Huang, I. H. Liu, S. S. Huang y J. S. Huang (2004), "Identification and characterization of the acidic pH binding sites for growth regulatory ligands of low density lipoprotein receptorrelated protein-1", J. Biol. Chem., 279(37): 38736-38748.

Linke, B., L. Abeler-Dorner, V. Jahndel, A. Kurz, A. Mahr, S. Pfrang, L. Linke, P. H. Krammer y H. Weyd (2015), "The tolerogenic function of annexins on apoptotic cells is mediated by the annexin core domain", J. Immunol., 194(11): 5233-5242.

Lutz, M. B. (2016), "Induction of CD4(+) Regulatory and Polarized Effector/helper T Cells by Dendritic Cells", Immune. Netw., 16(1): 13-25.

Moss, S. E. y R. O. Morgan (2004), "The annexins", Genome Biol., 5(4): 219.

Perretti, M. y J. Dalli (2009), "Exploiting the Annexin A1 pathway for the development of novel antiinflammatory therapeutics", Br. J. Pharmacol., 158(4): 936-946.

Pupjalis, D., J. Goetsch, D. J. Kottas, V. Gerke y U. Rescher (2011), "Annexin A1 released from apoptotic cells acts through formyl peptide receptors to dampen inflammatory monocyte activation via JAK/STAT/SOCS signalling", EMBO Mol. Med., 3(2): 102-114.

Reichelt, P., C. Schwarz y M. Donzeau (2006), "Single step protocol to purify recombinant proteins with low endotoxin contents", Protein Expr. Purif., 46(2): 483-488.

Segura, E. y S. Amigorena (2015), "Cross-Presentation in Mouse and Human Dendritic Cells", Adv. Immunol., 127: 1-31.

Strausbaugh, H. J. y S. D. Rosen (2001), "A potential role for annexin 1 as a physiologic mediator of glucocorticoid-induced L-selectin shedding from myeloid cells", J. Immunol., 166(10): 6294-6300.

Tzelepis, F., M. Verway, J. Daoud, J. Gillard, K. Hassani-Ardakani, J. Dunn, J. Downey, M. E. Gentile, J. Jaworska, A. M. Sánchez, Y. Nedelec, H. Vali, M. Tabrizian, A. S. Kristof, I. L. King, L. B. Barreiro y M. Divangahi (2015), "Annexin1 regulates DC efferocytosis and cross-presentation during Mycobacterium tuberculosis infection", J. Clin. Invest., 125(2): 752-768.

Verboogen, D. R., I. Dingjan, N. H. Revelo, L. J. Visser, M. ter Beest y G. van den Bogaart (2016), "The dendritic cell side of the immunological synapse", Biomol. Concepts., 7(1): 17-28.

Walther, A., K. Riehemann y V. Gerke (2000), "A novel ligand of the formyl peptide receptor: annexin I regulates neutrophil extravasation by interacting with the FPR", Mol. Cell, 5(5): 831-840.

Weyd, H., L. Abeler-Dorner, B. Linke, A. Mahr, V. Jahndel, S. Pfrang, M. Schnolzer, C. S. Falk y P. H. Krammer (2013), "Annexin A1 on the surface of early apoptotic cells suppresses CD8+ T cell immunity", PLoS One, 8(4): e62449.

Zimmerman, T., C. Petit Frere, M. Satzger, M. Raba, M. Weisbach, K. Dohn, A. Popp y M. Donzeau (2006), "Simultaneous metal chelate affinity purification and endotoxin clearance of recombinant antibody fragments", J. Immunol. Methods, 314(1-2): 67-73.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. - Un conjugado de proteína o una proteína de fusión que comprende (i) un dominio central de la anexina aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada entre:

(a) los aminoácidos 41-344 de SEQ ID NO: 1,

(b) los aminoácidos 14-317 de SEQ ID NO: 2,

(c) los aminoácidos 13-316 de SEQ ID NO: 3,

(d) los aminoácidos 41-344 de SEQ ID NO: 6,

(e) los aminoácidos 12-315 de SEQ ID NO: 7,

(f) los aminoácidos 14-317 de SEQ ID NO: 8,

o (i-a) un dominio central de la anexina aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de (a) a (f); y (ii) al menos un péptido antigénico que es presentado por el MHC, preferentemente HLA.

2. - El conjugado de proteína o proteína de fusión según la reivindicación 1, en el que dicho péptido antigénico que es presentado por el MHC se obtiene de una proteína seleccionada del grupo que consiste en phCG, gp100 o Pmel17, HER2/neu, WT1, mesotelina CEA, gp100, MART1, TRP-2, NY-BR-1, NY-CO-58, MN (gp250), idiotipo, tirosinasa, telomerasa, SSX2, MUC-1, MART1, melano-A, NY-ESO-1, MAGE-1, MAGE-3, MAGE-A3, p53 y el antígeno asociado al melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA).

3. - El conjugado de proteína o la proteína de fusión según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho conjugado o dicha proteína de fusión se conjuga/condensa además con una molécula coestimuladora o uno de sus fragmentos inmunogénicos o una segunda secuencia peptídica coestimuladora.

4. - Un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. - El ácido nucleico según la reivindicación 4, en el que la secuencia codificante del antígeno codifica un péptido antigénico que es presentado por MHC obtenido de una proteína seleccionada del grupo que consiste en phCG, gp100 o Pmel17, HER2/neu, WT1, mesotelina, CEA, gp100, MART1, TRP-2, NY-BR-1, NY-CO-58, MN (gp250), idiotipo, tirosinasa, telomerasa, SSX2, MUC-1, MART1, melano-A, NY-ESO-1, MAGE-1, MAGE-3, MAGE-A3, p53 y el antígeno asociado al melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA).

6. - El ácido nucleico según la reivindicación 4 o 5, en el que dicha secuencia codificante está condensada con al menos una secuencia de ácido nucleico estimulador de las DC.

7. - Un vector de expresión recombinante que expresa el ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

8. - Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad infecciosa o un cáncer en un sujeto, que comprende el conjugado de proteína o la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o el ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, o el vector de expresión según la reivindicación 7, y un vehículo.

9. - La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 8, en la que la composición farmacéutica se utiliza como vacuna.

10. - Un conjugado de proteína o una proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad infecciosa o un cáncer en un sujeto.