ES2272537T3

ES2272537T3 - Metodos y composiciones para inhibir la angiogenesis.

Info

Publication number: ES2272537T3
Application number: ES01968398T
Authority: ES
Inventors: Mahesh C. Sharma; George P. Tuszynski
Original assignee: Philadelphia Health and Education Corp
Current assignee: Philadelphia Health and Education Corp
Priority date: 2000-09-01
Filing date: 2001-09-04
Publication date: 2007-05-01
Anticipated expiration: 2021-09-04
Also published as: EP1313504A4; CA2421503A1; EP1313504A2; DK1313504T3; WO2002017857A2; DE60124927T2; EP1313504B1; JP2004507482A; ATE346607T1; DE60124927D1; WO2002017857A3; AU2001288648A1

Abstract

Un método in vitro para identificar un compuesto o una composición que modula la angiogénesis en una célula o un tejido que comprende la determinación del nivel de unión de la angiostatina a la anexina II en dicha célula o dicho tejido, tanto en presencia como ausencia del compuesto o de la composición, en donde un aumento o una reducción en la unión de la angiostatina y la anexina II se asocia con una modulación de la angiogénesis.

Description

Métodos y composiciones para inhibir la angiogénesis.

Antecedentes de la invención

Existen muchos indicios que demuestran que la angiogénesis, el proceso de crecimiento de nuevos vasos sanguíneos, es fundamental para el crecimiento de los tumores sólidos y sus metástasis. Los capilares sanguíneos están compuestos principalmente de células endoteliales que son inactivas en condiciones fisiológicas normales. En respuesta a estímulos externos, las células endoteliales inactivas pueden degradar la membrana basal a través de proteasas de la matriz extracelular que permite que se extravasen las células endoteliales e invadan el espacio estromal y la membrana basal. Estas células son capaces luego de cambiar su morfología y de proliferar para formar neovasos (Folkman, J. y Y. Shing. 1992. J. Biol. Chem. 267:10931-10934). Para estimular la angiogénesis, los tumores inducen varios factores, entre ellos el factor de crecimiento de fibroblastos (bBGF) y el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF). Sin embargo, muchos tumores malignos también generan inhibidores de la angiogénesis, entre ellos la angiostatina y la endostatina (O'Reilly, M.S. et al. 1994. Cell 79:315-328; O'Reilly M.S. et al. 1997. Cell 88:277-285). Este proceso complejo implica la presencia de múltiples controles que pueden encenderse y apagarse en un período corto de tiempo para regular el proceso angiogénico.

El proceso de angiogénesis se regula de forma estrecha mediante factores de retroalimentación tanto negativa como positiva, lo que resulta en una situación homeostática. El desequilibrio de estos factores en condiciones patológicas puede conducir al desarrollo y la progresión de procesos patológicos tales como el crecimiento tumoral, la retinopatía diabética, la disfunción de tejidos y órganos, y trastornos cardiovasculares (Folkman, J. 1995. Nat. Med. 1:27-31). La angiostatina es un regulador negativo potente de la angiogénesis y tiene el potencial de inhibir el crecimiento de los tumores primarios y metástasis en ratones (Sim, B.K. et al. 1997. Cancer Res. 57:1329-1334).

La angiostatina se purificó de la orina de ratones que llevaban un carcinoma pulmonar Lewis y se identificó como un fragmento interno de kDa de plasminógeno (aminoácidos 98-440) que comprendió los primeros cuatro kringles de la molécula. La angiostatina puede generarse también in vitro mediante la proteolisis restringida de plasminógeno. Se ha demostrado que la angiostatina producida por varios métodos invierte el crecimiento tumoral en ratones (Gately, S. et al. 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10868-10872; Gately, S. et al. 1996. Cancer Res. 56:4887-4890; Stathakis, P. et al. 1997. J. Biol. Chem. 272:20641-20645; Dong, Z. et al. 1997. Cell 88:801-810). Al hacer el ensayo in vivo, se ha mostrado que la angiostatina inhibe la proliferación y migración celular y la formación en tres dimensiones de tubos capilares en geles de colágeno, todos pasos esenciales en la angiogénesis. In vivo, la angiostatina se genera mediante la hidrólisis de plasminógeno con un número de enzimas, entre ellas, la metaloproteinasa de los macrófagos, la reductasa de la plasmina, MMP-7 (metaloproteinasa de matriz 7), la gelatinasa B/las colagenasas tipo IV, MMP-9 (metaloproteinasa de matriz 9), y la elastasa pancreática. También se ha mostrado que la angiostatina inhibe de forma eficaz el crecimiento de un amplio espectro de modelos de tumor en ratones (O'Reilly, M.S. et al. 1996. Nat. Med. 2:689-692; O'Reilly, M.S. et al. 1994. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 59:471-482; Wu, Z. et al. 1997. Biochem. Biophys. Res. Commun. 236:651-654; Griscelli, F. et al. 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6367-6372) mediante la inhibición de la neovascularización del tumor, mientras que el plasminógeno mismo no pudo inhibir la angiogénesis e inducir la regresión del tumor. Estos datos indican que la conformación específica del dominio kringle es importante para la actividad antiangiogénica de la angiostatina.

A pesar de su valor como un agente anticanceroso potente, el mecanismo de acción de la angiostatina no está bien definido.

La anexina II es uno de los receptores fibrinolíticos para el plasminógeno y el activador de plasminógeno más abundantes en las células endoteliales (Hajjar, K.A. et al. 1994. J. Biol. Chem. 269:21191-21197; Kang, H.M. et al. 1999. Trends Cardiovasc. Med. 9:92-102). La anexina II organiza el ensamblaje del activador de plasminógeno de tejido y de plasminógeno en la superficie celular. Este ensamblaje trimolecular en las células endoteliales puede producir plasmina a una eficacia máxima en el lecho vascular (Hajjar, K.A. et al. 1994. J. Biol. Chem. 269: 21191-21197; Felez, J. et al. 1996. Thromb. Haemost. 76:577-584; Kassam, G. et al. 1998. Biochemistry 37:16958-16966). Esta plasmina producida en la superficie de la célula se protege de la desactivación. La plasmina es una serina proteasa parecida a la tripsina con un amplio espectro de acción que degrada la fibrina y varias proteínas de la matriz de las células endoteliales tales como la laminina, la tromboespondina y los colágenos. La degradación proteolítica de la matriz extracelular y la disolución de la membrana basal son necesarias para que las células endoteliales y tumorales invadan, migren y promuevan la angiogénesis y la metastasis (Kang, H.M. et al. 1999 Trends Cardiovasc. Med. 9:92-102).

Resumen del estado de la técnica

El documento WO9948916A describe las secuencias polinucleótidas y polipeptídicas de dos genes humanos inducibles por hipoxia y los métodos de utilizar éstas en el tratamiento de patologías relacionadas con la hipoxia.

El documento WO0011033A describe las secuencias que codifican una proteína de fusión de la inmunoglobulina Fc y una proteína que inhibe la angiogénesis.

El documento US-A-5792845 describe los nucleótidos que codifican la proteína angiostatina y los métodos de su utilización.

O'Reilly, Michael S: Cell, Vol. 79, 315-328 describen un inhibidor de angiogénesis que medía la supresión de las metástasis.

El documento US-A-5051364 describe anticuerpos monoclonales que son específicos bien para la lipocortina-I humana bien para la lipocortina-II humana pero no para ambas y los cultivos de hibridomas y otros tipos de células que producen dichos anticuerpos.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a métodos para identificar las composiciones que inhiben la angiogénesis mediante su interacción con la anexina II y/o la angiostatina. Estos métodos se basan en la identificación de la anexina II como un receptor altamente específico de unión de angiostatina. Los compuestos capaces de inhibir la angiogénesis pueden ahora identificarse mediante una inspección de su capacidad para unirse a la anexina II. Los inhibidores preferidos de la angiogénesis competen con la angiostatina para unirse a la anexina II. Se cree que los moduladores de la interacción entre la angiostatina y la anexina, especialmente los agentes que competen con o mimetizan la unión de angiostatina a la anexina II, inhiben la angiogénesis mediante la estimulación de actividad apoptótica de las células endoteliales.

Por lo tanto, se proporciona un método para identificar un compuesto o una composición que modula la angiogénesis en una célula o un tejido que comprende determinar el nivel de unión de la angiostatina a la anexina II en dicha célula o dicho tejido tanto en presencia como ausencia del compuesto o de la composición, en el que un incremento o una reducción en la unión entre la angiostatina y la anexina II se asocia con una modulación de la angiogénesis.

Descripción detallada de la invención

Ahora, el receptor específico de angiostatina se ha identificado y purificado de las células endoteliales. El receptor es una proteína de 35 kDa que tiene una secuencia idéntica a la anexina II, un receptor conocido de plasminógeno. Se ha demostrado que la unión de la angiostatina a este receptor en las células endoteliales es tanto específica como de alta afinidad. La identificación de este receptor de angiostatina en las células proporciona un mecanismo que es susceptible a la explotación para la identificación de inhibidores nuevos de la angiogénesis así como para un método para regular la angiogénesis en las células.

La angiostatina se generó mediante la digestión limitada del plasminógeno humano con elastasa pancreática bovina. La proteína se purificó en un paso único mediante cromatografía de afinidad en lisina-sefarosa hasta una homogeneidad del casi 95% tal como de determinó mediante SDS-PAGE. Se combinó la fracción homogénea, se concentró, se dializó, y se esterilizó mediante filtración. A continuación, la fracción purificada se caracterizó en cuanto a su inmunoreactividad con anticuerpos monoclonales anti-Kringle 1-3 (KL-3). La angiostatina purificada inmunoreaccionó fuertemente con los anticuerpos monoclonales anti-KL-3 específicos para la estructura. Para demostrar aún más que la proteína purificada fue angiostatina, la banda de 38 kDa se transfirió a la membrana de PVDF y se tiñó con el amido negro. La banda teñida se recortó de la membrana y se secuenció desde el extremo N. Se generó una secuencia de aminoácidos YLSEKKGGNGKN (Sec. Id. No. 4) que es homóloga a la secuencia publicada de angiostatina (Kl-4). Una búsqueda de la base de datos suiza de proteínas indicó que las secuencias coincidieron sólo con la porción kringle 1-4 del plasminógeno. A continuación, se descubrió que la angiostatina purificada fue activa tal como se había descrito antes para la proliferación de células endoteliales en el mismo intervalo de concentración (O'Reilly M.S. et al. 1994. Cell 79:315-328). La angiostatina altamente purificada y bioactiva se utilizó en experimentos posteriores para identificar una proteína que se une a la angiostatina o el receptor de la angiostatina.

Se llevaron a cabo pruebas inmunocitoquímicas en células endoteliales aórticas bovinas en cultivo en un portaobjetos para tejidos de 4 cámaras. Las células se fijaron y se permeabilizaron con etanol al 95% y se incubaron con anticuerpo anti-K1-3 o anticuerpo secundario conjugado a HRP como control. La cámara del ensayo se incubó con la angiostatina seguido del anticuerpo monoclonal anti-K1-3 y el anticuerpo secundario. Sólo existió una tinción específica de las células endoteliales, mientras que los controles, sin la adición de la angiostatina o del anticuerpo primario, no se tiñeron.

Para determinar si las células endoteliales en cultivo se unieron a la angiostatina a través de la anexina II, lisados de células endoteliales se ensayaron para la unión de angiostatina mediante la transferencia de ligandos. Las CEABs se cultivaron hasta una confluencia del 90%. Las células se recogieron, se lavó el sedimento y se resuspendió en PBS. Las células se sometieron a ultrasonido y la parte insoluble, que representaba la fracción total de la membrana celular, se analizó sobre SDS-PAGE y se transfirió a nitrocelulosa. La membrana se bloqueó con leche desnatada y desecada al 5% y se incubó con angiostatina purificada (1 \mug/ml) durante una hora. La membrana se lavó y se incubó de nuevo con el anticuerpo anti-K1-3 (1:100) durante una hora, y a continuación con IgG de ratón conjugado con HRP, y se desarrolló con ECL. La inmunotransferencia de ligandos identificó una única banda de proteína con un peso molecular de aproximadamente 35 kDa, que concordaba con él de la anexina II. Se llevó a cabo además un control de inmunotransferencia en paralelo de acuerdo con las condiciones descritas anteriormente con la excepción de la adición de angiostatina; el control no mostró ninguna unión.

Para evaluar la localización subcelular de la proteína de unión angiostatina, los organelos subcelulares de las células endoteliales se fraccionaron y aproximadamente 10 microgramos de proteína se resolvió en SD-PAGE al 12% y se sometió a un análisis de transferencia de ligandos. Este análisis de transferencia de ligandos localizó la proteína de unión angiostatina de 35 kDa en la fracción de la membrana microsomal. La transferencia de control otra vez no mostró ninguna unión.

A continuación, se llevaron a cabo experimentos para purificar la proteína de unión de angiostatina. Se empleó un procedimiento de purificación progresiva con cromatografía en columna. Una única banda principal se aisló del procedimiento de cromatografía por afinidad que tenía un peso molecular de 35 kDa. La unión de angiostatina de estas fracciones se investigó más mediante un análisis de transferencia de ligandos. Las fracciones purificadas se separaron en SDS-PAGE al 12% en dos geles distintos y se sometieron a un análisis de transferencia de ligandos. Una transferencia no se incubó con la angiostatina y sirvió de control. El segundo ensayo de transferencia se incubó a continuación con angiostatina a un 1 \mug/ml. Únicamente el segundo ensayo de transferencia mostró unión con la angiostatina. El control no exhibía unión de angiostatina.

Los fragmentos trípticos de la proteína purificada proporcionaron la secuencia SLYYYIQQDTK (Sec. Id. No.: 1), SYSPYDMLESIK (Sec. Id. No.: 2), y ALLYLXGGDD (Sec. Id. No.: 3), que eran 100% idénticas con los aminoácidos 314-324, 234-245, y 330-339, respectivamente, de los 339 residuos de la anexina II. Partiendo de los resultados de la secuencia de aminoácidos, la proteína de unión angiostatina de 35 kDa se identificó como anexina II.

Para determinar la especificidad de la unión de anexina II, los lisados celulares de CEAB, NIH3T3, CECUH, y A431 se prepararon y aproximadamente 10 microgramos de proteína se sometieron al análisis de transferencia de ligandos. Se demostró que la unión de la angiostatina se limita a las células endoteliales. La anexina II se unió a la angiostatina en las líneas CEAB y CECUH, aunque se detectó poca unión o no unión de angiostatina en las células A431 o en los fibroblastos. Estos resultados se confirmaron mediante el análisis por inmunotransferencia con anticuerpos monoclonales anti-anexina II. El anticuerpo de la anexina II reconoce la misma banda de proteína observada en los experimentos de ligandos por transferencia, mientras que los fibroblastos no mostraron ninguna unión del antígeno de la anexina II. Las células A431 mostraron poca unión y poca expresión de anexina II. Estos experimentos indicaron que la anexina II funciona como un receptor de la angiostatina.

La adición de angiostatina radiomarcada a la anexina II inmovilizada en las placas de micropocillos demostró una interacción de unión específica con una afinidad alta. La unión se inhibió en casi el 80% y el 55% con angiostatina no marcada y el anticuerpo anti-anexina II, respectivamente. Se utilizó BSA como control y sólo se detectó unión insignificante. Se demostró que la interacción entre la angiostatina y la anexina II dependía del sitio de unión de lisina mediante la inmunoprecipitación con el anticuerpo monoclonal anti-anexina II. Cuando la angiostatina se incubó con la anexina II en presencia de 100 nM de \varepsilon-ACA, se bloqueó la unión de angiostatina por completo, lo que indica que la unión dependía de la lisina.

Para una caracterización adicional de las interacciones de la angiostatina, el plasminógeno y la anexina II, se analizó la unión de la angiostatina a la anexina II en un gel de sefarosa-proteína A. Se inmovilizó la anexina II y el complejo del anticuerpo anti-anexina II en el gel de sefarosa-proteína A y se incubó con concentraciones crecientes de angiostatina o plasminógeno radiomarcados. La unión de angiostatina o plasminógeno dependía de la concentración y se llegó a saturar con un K_{d} aparente de 164 nM y 101 nM, respectivamente. En los experimentos de control, el máximo de la unión al gel de la angiostatina radiomarcada fue del 5 al 10 por cierto en el mismo intervalo de concentraciones sin que se detectara la unión de la proteína. Para una caracterización más profunda de la unión de angiostatina a su receptor, la anexina II, se eluyó con angiostatina radiomarcada unida y se confirmó su identidad mediante SDS-PAGE seguido de una autorradiografía. La especificidad de la angiostatina y la unión de anexina II se demostró con más detalle comprobando que un exceso molar de 100 de angiostatina no marcada inhibió aproximadamente el 80% de la unión radiomarcada. Estos datos mostraron que la angiostatina y el plasminógeno interaccionaron con la anexina II con una afinidad y especificad alta.

También se determinó la unión de angiostatina radiomarcada y de plasminógeno a las células endoteliales. La unión tanto de la angiostatina como el plasminógeno dependía de la concentración y se llegó a saturar con un K_{d} de 83 nM y 125 nM, respectivamente. El valor de K_{d} obtenido en el experimento in vivo de unión estaba dentro de un factor de dos del valor in vitro, lo que indica que la angiostatina se une a la anexina II en la superficie endotelial.

Para demostrar con más detalle que la anexina II es el receptor para la angiostatina en las células endoteliales, se examinó el efecto del anticuerpo monoclonal anti-anexina II en la unión de angiostatina y de plasminógeno a células endoteliales. El anticuerpo monoclonal anti-anexina II inhibió la unión de angiostatina y de plasminógeno en un 68% y un 62%, respectivamente. Excesos de ambos ligandos radiomarcados competieron con la unión del otro, lo que demuestra la especificidad de la reacción de unión. Estos resultados apoyaron la conclusión de que la anexina II es el receptor para la angiostatina y el plasminógeno en las células endoteliales.

El significado funcional de la interacción de la angiostatina-anexina II se estableció en los experimentos en los cuales la actividad apoptótica de angiostatina sobre las células endoteliales se bloqueó con anticuerpos anti-anexina II. Se halló que los anticuerpos anti-anexina II mimetizaron el efecto de la angiostatina en la viabilidad celular de forma dependiente de la dosis. Se observó la muerte celular mediada por anticuerpos con un anticuerpo monoclonal contra la región nuclear de la anexina II así como con un anticuerpo policlonal preparado contra la molécula entera. Es más, la inmunoglobulina IgG no ejerció ningún efecto, lo que indica que la actividad apoptótica mediada por anticuerpos fue específica. De acuerdo con esto, estos resultados indican que la unión dirigida de anexina II a los anticuerpos de la angiostatina o a la anti-anexina II es una señal de muerte celular.

La consecuencia funcional de la interacción entre la angiostatina y la anexina II se comprobó adicionalmente con la angiostatina purificada incubada con anexina II purificada. A continuación, se investigó la actividad apoptótica en las células endoteliales del complejo resultante de la anexina II unida a la angiostatina. Se descubrió que el receptor purificado de la anexina II abrogó por completo la actividad apoptótica de la angiostatina. De acuerdo con la función de la anexina II como receptor de la angiostatina, se descubrió también que el tratamiento de las CEABs con un exceso de lisina-plasminógeno, que se había mostrado competir en la unión de la angiostatina a las CEABs, inhibió completamente la actividad de la angiostatina.

Se demostró también que el anticuerpo monoclonal anti-anexina II inhibía el crecimiento tumoral in vivo. En estos experimentos, la actividad anti-tumoral se evaluó en ratones con implantación subcutánea del carcinoma pulmonar de Lewis (O'Reilly et al. Cell 1994 79:315-28). El crecimiento tumoral en este modelo animal depende mucho de la angiogénesis. Diez ratones se inyectaron por vía subcutánea en el costado con 10^{6} células del carcinoma pulmonar de Lewis. Después de 9 días, cuando se había desarrollado un tumor detectable al palpitar, se dividieron los ratones en dos grupos, con 5 animales por grupo. Se trató un grupo de ratones con una única dosis del anticuerpo monoclonal anti-anexina II diluida en tampón salino de fosfato (60 \mug/ml de volumen sanguíneo), administrada por vía intravenosa. El otro grupo, de ahora en adelante, los animales control, se trató únicamente con tampón salino de fosfato. El volumen relativo del tumor, definido como la longitud x la anchura^{2}/2, se determinó en ratones antes del tratamiento. A continuación, los ratones se trataron durante 7 días y luego se sacrificaron. En los animales tratados con el anticuerpo monoclonal anti-anexina II, los tumores no se desarrollaron de forma apreciable más allá del tamaño detectable al palpitar en el día 1. En cambio, los animales control exhibieron un crecimiento exponencial de los tumores. Una comparación de los dos grupos distintos reveló una reducción de aproximadamente el 600% en el crecimiento del tumor en los animales tratados con anticuerpos en comparación con los controles. Es más, no se observaron ningunos signos visibles de toxicidad del anticuerpo monoclonal en los animales tratados. No hubo grandes cambios en el peso de los animales antes y después del tratamiento con los anticuerpos. Los tejidos tales como el corazón, los pulmones, el hígado, los riñones, el bazo, el cerebro, el páncreas y el intestino parecieron normales en los animales control y tratados.

En su conjunto, estos experimentos demuestran que la anexina II es un receptor fisiológico de la angiostatina y que desempeña un papel central en los procesos angiogénicos, incluidos los que están implicados en el crecimiento tumoral.

De acuerdo con esto, la presente invención proporciona métodos para identificar compuestos y composiciones que inhiben la angiogénesis mediante su interacción con la anexina II y/o la angiostatina. Por lo tanto, dichas composiciones son útiles en el tratamiento de varias enfermedades o trastornos asociados con una angiogénesis no deseada, entre ellos el cáncer, la degeneración macular, la retinopatía diabética y la artritis reumatoide.

Compuestos ejemplares útiles en la inhibición de la angiogénesis y la inducción de apoptosis en células endoteliales basados en su interacción con la anexina II y/o la angiostatina incluyen anticuerpos contra la anexina II, formas solubles de la anexina II, los péptidos o fragmentos de péptidos que mimetizan uno o más de los 4 dominios kringle que comprenden la angiostatina, y moléculas orgánicas pequeñas que se unen a la anexina II, y formas inmunogénicas de la anexina II que son capaces de inducir la producción de anticuerpos contra la anexina. Los métodos para convertir una proteína tal como la anexina II en inmunogénica son bien conocidos en el estado de la técnica y alguien experto en el campo los podría llevar a cabo. También son bien conocidos los métodos para formular vacunas con las proteínas inmunogénicas.

Para los fines de la presente invención, el término "anticuerpo" pretende incluir a los anticuerpos policlonales, monoclonales, omniclonales, y anticuerpos preparados mediante técnicas de biología molecular, así como fragmentos de anticuerpos y aptámeros y oligonucleótidos monocatenarios tales como aquellos derivados de un protocolo de evolución in vitro llamado SELEX conocido por los expertos del campo. El término "anticuerpo", tal como se emplea en el presente documento, también pretende incluir a los anticuerpos quiméricos, monocatenarios y humanizados, así como fragmentos Fab, o el producto de una biblioteca de expresión de Fab. Varios procedimientos conocidos en el estado de la técnica pueden utilizarse para la producción de dichos anticuerpos.

Otros compuestos que interaccionan con la anexina II y/o la angiostatina pueden ser identificados rutinariamente por aquellos expertos en la técnica siguiendo la información del presente documento. En una realización, los compuestos pueden ensayarse para determinar su capacidad de unirse a los receptores de anexina II. Los compuestos identificados con la capacidad para unirse a los receptores de anexina II pueden a continuación someterse a ensayos adicionales para determinar su actividad en el ensayo anti-angiogénico y su capacidad de inducir la apoptosis en las células endoteliales. Más preferiblemente, los compuestos pueden ensayarse para su capacidad de competir con la angiostatina para la unión a la anexina II. Se anticipa que los compuestos que desplazan la angiostatina o compiten de forma eficaz con la angiostatina para unirse a la anexina II mimeticen la actividad antiangiogénica y la capacidad de inducir la apoptosis en la células endoteliales.

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A continuación, puede hacerse que las células endoteliales estén en contacto con una cantidad efectiva de un compuesto que se une a la anexina II con tal de inhibir la angiogénesis en las células endoteliales y de inhibir de forma selectiva la apoptosis en las células endoteliales. Al referirse a una "cantidad efectiva", se quiere decir una concentración de compuesto que es capaz de inhibir la angiogénesis y de inducir de forma selectiva la muerte celular de las células endoteliales. Los expertos en la técnica pueden determinar estas concentraciones de forma rutinaria mediante ensayos in vitro tales como los descritos en el presente documento así como mediante ensayos angiogénicos conocidos en el estado de la técnica. Se pueden utilizar varias vías de administración, que incluyen pero no se limitan a vías oral, intravenosa, tópica, intratumoral, e intramuscular o subcutánea, y la elección dependerá de las propiedades farmacocinéticas, la biodisponibilidad del compuesto a administrar, y la enfermedad que se está tratando.

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Ejemplos Ejemplo 1 Generación de angiostatina y su purificación

Se generó la angiostatina mediante la digestión proteolítica restringida de plasminógeno humano con elastasa pancreática bovina tal como se describió O'Reilly et al. (1994. Cell 79:315-328). En una reacción típica, el plasminógeno se escindió en dos fragmentos de aproximadamente 38 y 19 kDa, y dichos fragmentos los reconoció el anticuerpo anti-K1-3. La mezcla de digestión de elastasa se aplicó a una columna de lisina-sefarosa. La columna cargada se lavó exhaustivamente con 10 volúmenes de columna del tampón salino de fosfato (PBS), lo que eliminó la elastasa y otras proteínas no absorbidas. A continuación, la columna se lavó de nuevo con 5 volúmenes de columna de 100 nM de
NaCl para eliminar las proteínas unidas de baja afinidad. El fragmento que se une a la lisina con una alta afinidad se eluyó específicamente con 200 mM de ácido cáprico e-amino (ACA) en 100 mM de NaCl. Todas las fracciones se analizaron en SDS-PAGE y se tiñeron con Coumassie así como con plata y se consiguió una confirmación adicional mediante el análisis de la transferencia Western para comprobar la pureza y homogeneidad. Las fracciones homogéneas que dio una reacción cruzada con los anticuerpos anti-plasminógeno se reunieron, se concentraron mediante diálisis de presión, y se dializaron exhaustivamente contra un litro de PBS durante tres días con cinco cambios de tampón.
La preparación final se esterilizó haciéndola pasar por un filtro de 0,22 micros, se alicuotó y se almacenó a -70ºC.

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Ejemplo 2 Cultivo de células

Las células endoteliales aórticas bovinas (CEABs) y células endoteliales de cordón umbilical humano (CECUH) se mantuvieron en medio de Ham F-12 K (Sigma Chemical Co.), suplementado con 1% de glutamina, 10% de FBS, 50 U/ml de penicilina, 50 \mug de estreptomicina, y 50 \mug/ml de gentamicina. Para identificar las proteínas que se unen a la angiostatina, las células se rascaron con un bloque de goma y se lavaron 3 veces con PBS enfriado antes de homogeneizar. Las células de fibroblastos se cultivaron en DMEM que contenía FBS al 10% y antibióticos.

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Ejemplo 3 El ensayo de proliferación de células endoteliales

La bioactividad de la angiostatina se caracterizó mediante la inhibición de la proliferación de células endoteliales. Las células endoteliales aórticas bovinas (CEAB) se obtuvieron y cultivaron tal como se ha descrito anteriormente (Qian, X. et al. 1997. Exp. Cell Res. 235:403-412). Para los ensayos de proliferación, las células se lavaron con PBS y se dispersaron mediante un tratamiento con una disolución de tripsina al 0,05%. A continuación, las células se transfirieron a una placa de cultivo de 96 micropocillos que contenían FBS al 2% en el medio de Ham F12-K a una densidad de 10.000 células/pocillo durante 24 horas a 37ºC. A continuación, el medio se reemplazó con el medio de Ham F-12K que contenía BSA al 0,1% y las células se cultivaron durante 24 horas más para sincronizar el cultivo. Después de 24 horas, se añadieron diferentes concentraciones de angiostatina, y después de 20 minutos, se añadió bFGF (1 ng/ml). Los cultivos se incubaron durante 36 horas. Se consideró que las células tratadas con bFGF sólo tuvieron una actividad del 100%. La viabilidad de las células control y tratadas se midió con un equipo de ensayo colorimétrico de Promega. El ensayo determina la actividad metabólica de las células vivas mediante un enzima deshidrogenasa que convierte el reactivo de Owen en formazan soluble.

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Ejemplo 4 El ensayo de ligandos por inmunotransferencia

El lisado de las CEABs se preparó mediante la homogeneización de las células con un homogeneizador Dounce o mediante la destrucción con ultrasonidos. Se determinó la concentración total de proteínas. Las proteínas de las células endoteliales se separaron mediante SDS-PAGE al 12%. Las proteínas resueltas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa a un voltaje constante de 100 V durante una hora. Se lavó la membrana y se la bloqueó durante una hora en leche en polvo desnatada al 5% a temperatura ambiente. A continuación, las membranas se incubaron durante la noche a 4ºC con la angiostatina a 1 \mug/ml. Después de un lavado exhaustivo con un tampón salino con Tris que contenía Tween 20 al 0,2% (TBST), la membrana se incubó de nuevo con el anticuerpo monoclonal anti-Kringle 1-3 (K1-3) a una dilución de 1:100 durante una hora a temperatura ambiente. La transferencia se desarrolló con IgG anti-ratón marcado con HRP y se potenció la quimioluminiscencia según las indicaciones del fabricante. La angiostatina se incluyó como un control positivo en la primera pista del gel para asegurar la exactitud y la validez.

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Ejemplo 5 Estudios de unión de radioligandos en fase sólida

A los ligandos de la angiostatina y del plasminógeno, se les trató con bolitas de yodo radiomarcado hasta conseguir una actividad específica de 5,2 x 10^{6} cpm/\mug y 6,6 x 10^{6} cpm/\mug, respectivamente (Pierce, Rockford, IL) y la angiostatina y el plasminógeno marcados se sometieron a una purificaron adicional mediante la filtración sobre gel. El yodo radiomarcado no unido se eliminó mediante diálisis contra PBS a pH 7,4 y la pureza de la angiostatina marcada y del plasminógeno se comprobó mediante SDS-PAGE antes de que se utilizaran los ligandos en estudios de unión. Placas de plástico se revistieron de 100 ng de anexina II en PBS agitando a temperatura ambiente durante 24 horas. Las placas con la anexina II inmovilizada se bloquearon con BSA al 1% en PBS durante 1 hora. Las placas revestidas de anexina II se incubaron con 1 \muM de angiostatina y de plasminógeno marcados con ^{125}I en 100 \mul de PBS durante 3 a 4 horas con agitación continúa. Después de la incubación, los pocillos se lavaron con TBST y la radioactividad restante se cuantificó mediante el recuento de radiación gamma. La unión no específica se midió en presencia de BSA al 1%.

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Ejemplo 6 Análisis cinético de la unión de angiostatina a la anexina II inmovilizada

El anticuerpo monoclonal anti-anexina II (40 \mug) se incubó con 40 \mug de anexina II purificada en un volumen de reacción de 200 \mul con PBS durante una hora a 4ºC. Un mililitro de sefarosa-proteína A se añadió durante la noche a la mezcla de reacción con agitación suave. Más del 98% del anticuerpo anti-anexina II y del complejo de anexina II se unieron a la sefarosa-proteína A según los resultados de SDS-PAGE. El gel de sefarosa-proteína A se centrifugó a 2000-3000 rpm durante 5 minutos. Los sobrenadantes se eliminaron y los geles se lavaron de 3 a 4 veces para eliminar cualquier proteína no unida. El gel de sefarosa-proteína A se incubó con BSA al 0,1% durante 1 hora para bloquear los sitios de unión no específicos. El BSA se eliminó mediante centrifugación y los geles se lavaron y se suspendieron de nuevo en PBS. Los geles con anexina II inmovilizada (10 \mul) se incubaron con concentraciones crecientes de angiostatina marcada con ^{125}I en un volumen final de 100 \mul. La unión no específica se determinó en experimentos paralelos empleando sólo el anticuerpo anti-anexina II inmovilizado sobre un gel de sefarosa-proteína A. Después de la incubación, los geles se separaron mediante centrifugación a 3000 rpm durante 5 minutos, y después de este periodo, se eliminó el sobrenadante y, a continuación, los geles se lavaron rápidamente 3 a 4 veces con PBS para eliminar el material no unido específicamente. La cantidad de angiostatina marcada unida se calculó en base al nivel de radioactividad presente en los geles.

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Ejemplo 7 Determinación de la especificidad de unión

Para caracterizar la especificad de unión, un exceso molar de 100 veces de ligando no marcado se incubó durante 30 minutos antes de añadir la angiostatina y el plasminógeno marcados con ^{125}I. La radioactividad asociada con el gel se cuantificó mediante un contador de radiación gamma LKB. Para caracterizar la proteína unida a la anexina II inmovilizada, los geles se suspendieron en 25 \mul de SDS-PAGE, y los geles se secaron y se procesaron para autoradiografía.

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Ejemplo 8 Unión a células endoteliales

Las CEABs suspendidas en el medio de Ham F12 K con FBS al 2% a una densidad de 10.000 células/pocillo se transfirieron a placas de 96 micropocillos. A continuación, el medio se reemplazó con el medio de Ham F12 K que contenía BSA al 0,1% y las células se cultivaron durante 24 horas adicionales para sincronizar el cultivo. Después de 24 horas, las células se lavaron y se incubaron con 1 \muM de angiostatina o plasminógeno marcado con ^{125}I en un volumen total de 100 \mul de tampón de unión (PBS que contenía 3 mM de CaCl_{2}, 1 mM de MgCl_{2}, y 5 mg/ml de BSA) durante 45 minutos a 4ºC con agitación suave. Después de la incubación, las células se lavaron rápidamente 5 veces para eliminar el material no unido específicamente. Las células se solubilizaron en SDS al 1%, NaOH al 0,5 M y EDTA al 0,01 M. Las alícuotas se transfirieron a viales de recuento y se contaron en un contador de radiación gamma. Los recuentos no específicos se restaron de los recuentros de unión totales. Los datos se analizaron utilizando la cinética Michaelis-Menton no linear con software Prizm (San Diego, CA).

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Ejemplo 9 Inmunoprecipitación del ligando

La angiostatina purificada y la anexina II se incubaron durante 2 a 3 horas a 4ºC con agitación suave. A continuación, se permitió que el complejo se uniese al anticuerpo monoclonal anti-anexina II a 4ºC durante 3 a 4 horas. El complejo tri-molecular se inmovilizó en el gel de sefarosa-proteína A a 4ºC durante la noche. El gel se centrifugó y se lavó para eliminar cualquier proteína no unida. El gel se suspendió en 50 \mul de tampón de carga de SDS y se calentó a 37ºC durante 10 a 15 minutos y luego se separó mediante centrifugación. A continuación, la proteína eluída se trasfirió a un gel de SDS-PAGE al 12% y se separó a 100 V. El gel se sometió a una electrotransferencia a una membrana de nitrocelulosa y se sondeó con un anticuerpo anti-Kringle 1-3 seguido de un anticuerpo secundario conjugado con HRP con desarrollo por quimioluminiscencia.

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Ejemplo 10 Inmunocitoquímica

La inmunocitoquímica se llevó a cabo con las CEABs cultivadas en portaobjetos de cuatro cámaras para el cultivo de tejidos. Las células se fijaron y se permeabilizaron con etanol al 95% y se incubaron con angiostatina (1 \mug/ml) durante 2 horas y se lavaron de forma exhaustiva con PBS y, a continuación, se incubaron de nuevo con anticuerpo monoclonal anti-Kringle durante 1 hora (1:100). Las células control se incubaron con la angiostatina o el anticuerpo solo. La tinción se realizó con el anticuerpo secundario conjugado indicado seguido de tratamiento con HRP avidina biotina tal como se ha descrito anteriormente (Tuszynski, G.P. y R.F. Nicosia. 1994. Lab. Invest. 70:228-233). Las células se contratiñeron con hematoxilina y se fotomicrografiaron bajo un microscopio de campo luminoso.

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Ejemplo 11 Purificación del receptor de angiostatina

Las CEAB libres de micoplasma se cultivaron a gran escala (aproximadamente 100 botellas de gran superficie) en el National Cell Culture Facility (Cellex Biosciences, Minneapolis, MN). Un volumen concentrado de células endoteliales (15 ml) se lavó en PBS enfriado y se homogeneizó en tampón Tris-sucrosa, pH 7,4, que contenía los inhibidores de proteasa leupeptina (4,2 \mum), anti-pain (3,3 \muM), y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (0,57 mM), y se fraccionó según el método de Sharma y Shapiro (1995. Arch. Biochem. Biophys. 316:478-484). La fracción de membrana microsomal de plasma purificada y ultracentrifugada se solubilizó en un tampón homogeneizante y se almacenó a 4ºC antes de una purificación adicional. Antes de empezar la purificación, todas las fracciones se comprobaron para la unión de angiostatina mediante un análisis de transferencia de ligandos. La fracción de anexina II se solubilizó mediante la adición gota a gota del tampón de lisis Triton X-100 al 0,5% con inhibidores de proteasa. La fracción de la membrana solubilizada se sometió a una centrifugación adicional a 105.000 x g durante 30 minutos para eliminar cualquier material soluble. El sobrenadante se dializó de forma exhaustiva contra el tampón A (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, ditiotreitol al 0,1 mM, colamidopropildimetilo amónico-1-propan sulfonato 0,1%, EDTA al 1 mM, y glicerol al 5% durante 2 días para eliminar todo el Triton X-100 sobrante.

La purificación adicional se llevó a cabo a 4ºC a no ser que se indique lo contrario. El dializado derivado de las membranas microsomales de plasma solubilizadas se aplicó a una columna de intercambio de aniones fuertes Fractogel (2,5 x 20 cm) a un flujo de 0,2 ml/minuto anteriormente equilibrada con 10 volúmenes de columna del tampón A. Después de aplicar la muestra, la columna se lavó primero con 10 volúmenes de columna del tampón A hasta conseguir una absorción a 280 nm de entre 0 y 0,050 unidades de absorción. La columna se eluyó con un gradiente lineal de KCl a 0-1 M en el tampón B. Los eluidos de la columna se monitorizaron a 280 nm y los picos se analizaron para la proteína que une la angiostatina (anexina II) mediante la unión de ligandos. Las fracciones enriquecidas para la unión de angiostatina se unieron, se concentraron por diálisis de presión y se dializaron durante la noche con cuatro cambios contra Tris-HCl a 10 nM, pH 7,4, que contenía glicero al 5%, EDTA al 0,1 mM y ditiotreitol al 0,1 mM. La fracción dializada se sometió a un proceso de cromatografía adicional en una columna hidroxilapatito seguido de cromatografía de afinidad a angiostatina. Las proteínas se eluyeron con un gradiente linear del 1 a 100% del tampón A-B, respectivamente. Los eluidos de la columna se monitorizaron a 280 nm y los picos se analizaron mediante un análisis de transferencia de ligandos de angiostatina. Las fracciones de unión se combinaron, se concentraron, y se dializaron contra 10 mM de tampón de fosfato de potasio, pH 7,4, que contenía ditiotreitol al 0,1 mM y EDTA al 0,1 mM. La pureza de la fracción dializada se determinó mediante SDS-PAGE. El gel se tiñó con Coumassie azul así como con plata para detectar cualquier contaminación leve. Cualquier proteína contaminante se eliminó mediante la cromatografía de afinidad a la angiostatina. El producto final de proteínas homogéneas se caracterizó mediante un análisis de transferencia de ligandos de angiostatina y, a continuación, la proteína se almacenó a -80ºC.

Ejemplo 12 Microsecuenciación de proteínas

Aproximadamente 30 pmoles de la proteína endotelial purificada se resolvieron en SDS-PAGE y se tiñeron con Comumassie azul. La banda de la proteína se raspó del gel y se sometió a una digestión con tripsina. Los fragmentos resultantes del péptido se separaron mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y se caracterizaron adicionalmente mediante espectroscopia de masas. Se secuenciaron tres fragmentos mediante la degradación de Edman.

<110> Philadelphia Health and Education Corporation

\hskip1cm

Sharma, Mahesh C

\hskip1cm

Tuszynski, George P

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<120> Métodos y composiciones para inhibir la angiogénesis

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<130> MCP-0051

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<140>

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<141>

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<150> 60/229,667

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<151> 2000-09-01

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<150> 60/227,204

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<151> 2001-03-20

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<160> 4

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: sintética

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<400> 1

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\sa{Ser Leu Tyr Tyr Tyr Ile Gln Gln Asp Thr Lys}

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<210> 2

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: sintética

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<400> 2

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\sa{Ser Tyr Ser Pro Tyr Asp Met Leu Glu Ser Ile Lys}

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<210> 3

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: sintética

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<400> 3

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\sa{Ala Leu Leu Tyr Leu Xaa Gly Gly Asp Asp}

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<210> 4

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: sintética

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<400> 4

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\sa{Tyr Leu Ser Glu Lys Lys Gly Gly Asn Gly Lys Asn}

Claims

1. Un método in vitro para identificar un compuesto o una composición que modula la angiogénesis en una célula o un tejido que comprende la determinación del nivel de unión de la angiostatina a la anexina II en dicha célula o dicho tejido, tanto en presencia como ausencia del compuesto o de la composición, en donde un aumento o una reducción en la unión de la angiostatina y la anexina II se asocia con una modulación de la angiogénesis.

2. Un método según la reivindicación 1, en donde la célula es una célula endotelial.